專利名稱：一種聚合血紅蛋白修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種聚合血紅蛋白修飾方法。
背景技術(shù)：
以輸入全血為主要手段的傳統(tǒng)輸血方式在醫(yī)療救護(hù)方面發(fā)揮了極為重要的作用，但同時(shí)其自身也存在難以克服的各種缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)在輸入前需進(jìn)行交叉配型、存在多種病毒交叉感染的危險(xiǎn)、血源緊張、貯存期較短且需要特殊的設(shè)施。為了解決上述矛盾，人們?cè)缭?9世紀(jì)末就開始了有關(guān)紅細(xì)胞代用品的研究。紅細(xì)胞代用品是指具有擴(kuò)充血容積、維持血管內(nèi)外滲透壓平衡并且有載氧功能，用以代替人紅細(xì)胞的各種氧載體的總稱。血液代用品的研制經(jīng)歷了從最初無(wú)載氧功能的血管擴(kuò)容劑，如高滲鹽溶液、羥乙基淀粉溶液、明膠等到目前具有攜氧功能的各種載體溶液。目前正在研制的各類產(chǎn)品與全血比較具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如來(lái)源廣泛、安全潔凈、可長(zhǎng)期保存、輸入人體前無(wú)需進(jìn)行交叉配型，特別適用于戰(zhàn)爭(zhēng)、自然災(zāi)害、以及其他突發(fā)事件中大量出血病人的急救。血紅蛋白是人體內(nèi)的物質(zhì)，它的溶液作為紅細(xì)胞代用品比化學(xué)合成物質(zhì)更具優(yōu)越性。但是，未經(jīng)修飾的血紅蛋白溶液也存在一些問題，如一是未經(jīng)修飾的血紅蛋白在體內(nèi)由四聚體裂解為二聚體和單體并從腎臟濾過(guò)，形成血紅蛋白尿，造成腎損害；二是在血紅蛋白的提取過(guò)程中，由于2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的丟失，使血紅蛋白的氧結(jié)合力提高，不利于向組織有效供氧；三是未修飾的血紅蛋白在血漿中膠體滲透壓較高，而且循環(huán)半衰期短。
以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代替品的研究主要集中于延長(zhǎng)循環(huán)半衰期、降低氧結(jié)合力和穩(wěn)定四聚體結(jié)構(gòu)等方面。通常采用交聯(lián)、聚合、脂質(zhì)體包埋和化學(xué)修飾等方法或?qū)追N方法結(jié)合在一起達(dá)到此目的。美國(guó)Northfield公司用5‘-磷酸吡哆醛(PLP)修飾后，用戊二醛聚合的產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入III期臨床實(shí)驗(yàn)。Shirley L.等人，在HemoglobinPolymerization，Methods in enzymology，V(231)，287-308，中指出交聯(lián)聚合會(huì)使血紅蛋白對(duì)氧結(jié)合力大大提高，而修飾則會(huì)降低氧結(jié)合力，所以終產(chǎn)品對(duì)氧的結(jié)合力將是這兩種作用平衡之后的結(jié)果。
在體內(nèi)，2，3-DPG顯著影響血紅蛋白對(duì)氧的結(jié)合力。血紅蛋白結(jié)合2，3-DPG后O2的結(jié)合力降低，氧結(jié)合曲線右移，P50增至26mmHg以上。紅細(xì)胞內(nèi)的2，3-DPG有著重要的生理意義，對(duì)血紅蛋白的運(yùn)O2有重要貢獻(xiàn)，血紅蛋白對(duì)O2的結(jié)合力與紅細(xì)胞內(nèi)的2，3-DPG濃度成反比，因而，紅細(xì)胞中2，3-DPG濃度愈高，血液流經(jīng)組織毛細(xì)血管時(shí)釋放的O2量也愈多，結(jié)合O2能力降低反而有利于輸送O2，人體可通過(guò)紅細(xì)胞中2，3-DPG濃度改變來(lái)調(diào)節(jié)組織的獲氧量，這對(duì)人體在某些缺氧情況下的代償有重要意義。
在體外，在純化過(guò)程中2，3-DPG大量丟失，而且聚合過(guò)程也會(huì)使血紅蛋白對(duì)氧結(jié)合力大大增加，采用PLP化學(xué)修飾血紅蛋白是解決2，3-DPG丟失、氧結(jié)合增加的方法之一，從四十年代到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了幾十年。目前已發(fā)現(xiàn)并合成了許多修飾交聯(lián)劑和方法，磷酸吡哆醛(PLP)是其中的一種，它是2，3-DPG的類似物，可以與血紅蛋白β-亞基N-末端的纈氨酸(Val)反應(yīng)生成希夫堿，降低血紅蛋白的結(jié)合力，提高了血紅蛋白的P50。
5‘-磷酸吡哆醛(PLP)可與Hb的亞基N末端的纈氨酸發(fā)生羥醛縮合生成亞胺，再經(jīng)NaBH4還原生成胺鍵。反應(yīng)如圖1。
據(jù)報(bào)道，PLP修飾無(wú)基質(zhì)純化血紅蛋白后，可將其P50從10-12mmHg提高到30-32mmHg，這說(shuō)明用PLP修飾后可降低血紅蛋白的氧結(jié)合力，提高其P50，恢復(fù)其給組織供氧的能力。但所查閱文獻(xiàn)中對(duì)血紅蛋白的PLP修飾都放在聚合步驟之前(前修飾)，無(wú)人嘗試過(guò)將修飾步驟放在聚合步驟之后(后修飾)。由于PLP售價(jià)很高，前修飾比后修飾用量大5-10倍左右，因此在保證血紅蛋白對(duì)氧的結(jié)合力的條件下改進(jìn)工藝，將會(huì)節(jié)省成本，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種聚合血紅蛋白修飾方法，它針對(duì)上述情況，發(fā)明一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、高效的修飾工藝。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特征在于它包括以下步驟(1)在0～4℃條件下，以天然紅細(xì)胞為原料得到純化血紅蛋白，在通氮及加還原劑保護(hù)下，先經(jīng)同型雙功能試劑進(jìn)行聚合，再用修飾劑進(jìn)行修飾；(2)加入修飾劑后加入谷胱甘肽等還原劑防止高鐵血紅蛋白生成。
上述步驟(1)中制備所用的原料天然紅細(xì)胞來(lái)源為人胎盤血或過(guò)期的庫(kù)存人血。
上述步驟(1)中先對(duì)純化血紅蛋白進(jìn)行聚合，所用雙功能試劑為戊二醛。
上述步驟(1)中對(duì)聚合后血紅蛋白進(jìn)行修飾，所用修飾劑為5’-磷酸吡哆醛(PLP)。
上述步驟(1)中5’-磷酸吡哆醛與血紅蛋白的摩爾比為4-8∶1。
上述步驟(2)中，加入5’-磷酸吡哆醛反應(yīng)0.5-1.5小時(shí)之后，再加入谷胱甘肽。
上述步驟(2)中，加入谷胱甘肽濃度為2％。
上述步驟(2)中，加入谷胱甘肽終濃度按重量/體積比為0.1～0.5％。
本發(fā)明的工作原理為通過(guò)對(duì)比研究血紅蛋白先用PLP修飾后聚合，以及先聚合后PLP修飾兩種工藝所得產(chǎn)品的P50，從而找出一種合適的修飾工藝。而且，在此過(guò)程中加入還原劑以抑制高鐵血紅蛋白的生成，但還原劑的加入順序也會(huì)顯著影響PLP的修飾效果。
本發(fā)明的技術(shù)效果在于在優(yōu)選合適修飾工藝上做了大量研究，結(jié)果表明，前修飾與后修飾P50分別為13.80mmHg和15.07mmHg，無(wú)顯著差別，但PLP用量后者比前者少5-10倍。谷胱甘肽等還原物質(zhì)在PLP之前加入及之后加入P50分別為14.50mmHg和22.11mmHg，兩種加入方式高鐵血紅蛋白含量分別為6.8％和6.6％，而在修飾前高鐵血紅蛋白含量分別為7.8％和8.0％，可以看出，在加入PLP之前和之后加入還原物質(zhì)對(duì)高鐵無(wú)顯著影響，但后加入組P50顯著提高。因此，在總結(jié)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們提出將PLP修飾放于聚合之后，而且在加入PLP之后將防止高鐵生成的還原物質(zhì)加入，這樣既能控制高鐵血紅蛋白的生成，又能保證P50值在合適范圍，而且能大大降低生產(chǎn)成本。


圖1為5‘-磷酸吡哆醛(PLP)可與Hb的亞基N末端的纈氨酸發(fā)生羥醛縮合生成亞胺，再經(jīng)NaBH4還原生成胺鍵的圖示。
具體實(shí)施例方式以下將通過(guò)具體實(shí)施方式
的形式再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于以下的具體實(shí)施方式
，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1PLP前修飾和后修飾I將從胎盤血(或成人外周血)中純化出的血紅蛋白，在0～4℃的低溫條件下，通入不含氧的高純氮等惰性氣體，流量為每分鐘1～5L，持續(xù)15～30分鐘，并按10萬(wàn)～100萬(wàn)單位/1000毫升量加入青霉素和/或鏈霉素等常規(guī)抑菌藥物并充分混合均勻；將PLP用1M的Tris-Hcl溶解，濃度為2％，PH＝7.3-7.4，按與血紅蛋白摩爾比4∶1-8∶1加入，繼續(xù)通高純氮等惰性氣體反應(yīng)0.5-1.5小時(shí)后，按重量/體積比為0.1～0.5％加入2％濃度的谷胱甘肽作為抗氧化劑，再通高純氮等惰性氣體反應(yīng)1-2小時(shí)后，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氫氧化鈉)終止，反應(yīng)3-6個(gè)小時(shí)。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為10KD的超濾膜按常規(guī)方式進(jìn)行超濾處理，使?jié)舛戎?-6g/dl，0.22um除菌過(guò)濾。按5-9∶1加入1％的戊二醛，通氮反應(yīng)0.5小時(shí)，用10-15倍體積等滲PBS(PH＝7.3-7.4)進(jìn)行以截留分子量為100KD的超濾膜按常規(guī)方式進(jìn)行超濾處理，濃縮至10-12g/dl，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氫氧化鈉)終止，反應(yīng)3-6個(gè)小時(shí)。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為100KD的超濾膜按常規(guī)方式進(jìn)行超濾處理，使?jié)舛戎?-6g/dl，0.22um除菌過(guò)濾，取樣進(jìn)行P50檢測(cè)。
II將從胎盤血(或成人外周血)中純化出的血紅蛋白，在0～4℃的低溫條件下，通入不含氧的高純氮等惰性氣體，流量為每分鐘1～5L，持續(xù)15～30分鐘，并按10萬(wàn)～100萬(wàn)單位/1000毫升的量加入青霉素和/或鏈霉素等常規(guī)抑菌藥物并充分混合均勻，再通高純氮等惰性氣體0.5-1小時(shí)。按5-9∶1加入1％的戊二醛，通氮反應(yīng)0.5小時(shí)，用10-15倍體積等滲PBS(PH＝7.3-7.4)進(jìn)行以截留分子量為100KD的超濾膜按常規(guī)方式進(jìn)行超濾處理，濃縮至10-12g/dl，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氫氧化鈉)終止，反應(yīng)3-6個(gè)小時(shí)。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為100KD的超濾膜按常規(guī)方式進(jìn)行超濾處理，濃縮至8-10g/dl，0.22um除菌過(guò)濾。將PLP用1M的Tris-Hcl溶解，濃度為2％，PH＝7.3-7.4，按與血紅蛋白摩爾比4∶1-8∶1加入，繼續(xù)通高純氮等惰性氣體反應(yīng)1-2小時(shí)后，按重量/體積比為0.1～0.5％加入2％濃度的谷胱甘肽作為抗氧化劑，再通高純氮等惰性氣體反應(yīng)1-2小時(shí)后，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氫氧化鈉)終止，反應(yīng)3-6個(gè)小時(shí)。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為100KD的超濾膜按常規(guī)方式進(jìn)行超濾處理，使?jié)舛戎?-6g/dl，0.22um除菌過(guò)濾。取樣進(jìn)行P50檢測(cè)。
實(shí)施例2谷胱甘肽的加入順序I將從胎盤血(或成人外周血)中純化出的血紅蛋白，在0～4℃的低溫條件下，通入不含氧的高純氮等惰性氣體，流量為每分鐘1～5L，持續(xù)15～30分鐘，按10萬(wàn)～100萬(wàn)單位/1000毫升的量加入青霉素和/或鏈霉素等常規(guī)抑菌藥物并充分混合均勻，再通高純氮等惰性氣體0.5-1小時(shí)按重量/體積比為0.1～0.5％加入2％濃度的谷胱甘肽作為抗氧化劑。將PLP用1M的Tris-HCl溶解，濃度為2％，PH＝7.3-7.4，按與血紅蛋白摩爾比4∶1-8∶1加入，繼續(xù)通高純氮等惰性氣體反應(yīng)2-3小時(shí)。按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氫氧化鈉)終止反應(yīng)3-6個(gè)小時(shí)。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為10KD的超濾膜按常規(guī)方式進(jìn)行超濾處理，濃縮至8-10g/dl，0.22um除菌過(guò)濾，取樣進(jìn)行P50檢測(cè)。
II將從胎盤血(或成人外周血)中純化出的血紅蛋白，在0～4℃的低溫條件下，通入不含氧的高純氮等惰性氣體，流量為每分鐘1～5L，持續(xù)15～30分鐘，并按10萬(wàn)～100萬(wàn)單位/1000毫升的量加入青霉素和/或鏈霉素等常規(guī)抑菌藥物并充分混合均勻，再通高純氮等惰性氣體0.5-1小時(shí)。將PLP用1M的Tris-Hcl溶解，濃度為2％，PH＝7.3-7.4，按與血紅蛋白摩爾比4∶1-8∶1加入，繼續(xù)通高純氮等惰性氣體反應(yīng)1-2小時(shí)后，按重量/體積比為0.1～0.5％加入2％的谷胱甘肽作為抗氧化劑，再通高純氮等惰性氣體反應(yīng)1-2小時(shí)后，按與血紅蛋白摩爾比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氫氧化鈉)終止，反應(yīng)3-6個(gè)小時(shí)。再將血紅蛋白溶液以截留分子量為10KD的超濾膜按常規(guī)方式進(jìn)行超濾處理，濃縮至8-10g/dl，0.22um除菌過(guò)濾，取樣進(jìn)行P50檢測(cè)。
由上述方法制備的血紅蛋白P50檢測(cè)結(jié)果如表1所示。
表1 血紅蛋白P50檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于聚合血紅蛋白修飾的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)在0～4℃條件下，以天然紅細(xì)胞為原料得到純化血紅蛋白，在通氮及加還原劑保護(hù)下，先經(jīng)同型雙功能試劑進(jìn)行聚合，再用修飾劑進(jìn)行修飾；(2)加入修飾劑后，加入谷胱甘肽等還原劑防止高鐵血紅蛋白生成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特征在于制備所用的原料天然紅細(xì)胞來(lái)源為人胎盤血或過(guò)期的庫(kù)存人血。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特征在于先對(duì)純化血紅蛋白進(jìn)行聚合，所用雙功能試劑為戊二醛。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特征在于對(duì)聚合后血紅蛋白進(jìn)行修飾，所用修飾劑為5’-磷酸吡哆醛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特征在于在加入5’-磷酸吡哆醛之后再加入谷胱甘肽等還原劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特征在于PLP與血紅蛋白的摩爾比為4-8∶1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特征在于在加入5’-磷酸吡哆醛反應(yīng)0.5-1.5小時(shí)之后再加入谷胱甘肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種聚合血紅蛋白修飾方法，其特征在于加入谷胱甘肽終濃度按重量/體積比為0.1～0.5％。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是用于聚合血紅蛋白的修飾方法，其特征在于在0～4℃及通氮等條件下，由天然紅細(xì)胞得到純化血紅蛋白，將其先經(jīng)同型雙功能試劑聚合，再用5’－磷酸吡哆醛修飾。修飾過(guò)程中，谷胱甘肽應(yīng)在加入PLP之后0.5－1.5小時(shí)之后加入。此工藝既能控制高鐵血紅蛋白的生成，又能保證P
文檔編號(hào)A61P7/08GK1990039SQ20051013602
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者楊成民, 李鳳娟, 張鴻輝, 梁偉光, 李洪英, 許麗麗, 李燊, 王勁峰, 楊曉明 申請(qǐng)人:天津協(xié)和生物科技發(fā)展有限公司