專利名稱：當歸多糖鐵及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用藥物及其制備方法，具體涉及治療貧血的多糖鐵復合物及其制備方法。
背景技術：
當歸[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]是一味常用的傳統(tǒng)中藥，功能補血活血、調經止痛。這些功能已經得到研究的證實?；A研究表明，當歸還有抗絞痛、平喘、鎮(zhèn)痛、抗風濕等功能。這些功能取決于當歸中所含的香豆素、植物甾醇、多糖、類黃酮等藥理活性成分。大量藥理學研究表明當歸能用作補血藥物，其補血活血的作用，主要是由于當歸中的多糖成分刺激紅細胞的生成、促進造血祖細胞和多能造血干細胞的增殖和分化、從而提高造血水平的結果；換言之，當歸多糖是當歸補血活血的主要活性成分。
缺鐵性貧血(IDA)是一種常見的世界性貧血癥狀，由于鐵缺乏不能滿足機體對鐵的需求而引起。長期以來臨床上主要應用硫酸亞鐵的各種制劑治療缺鐵性貧血。硫酸亞鐵雖然鐵含量較高，吸收較好，在一定程度上可以緩解鐵缺乏和貧血癥狀，但研究表明，這種補鐵劑存在許多副作用刺激胃腸道，造成惡心、嘔吐、腹瀉，導致胃不適、便秘等消化道不良反應；當靜脈注射給藥時，可引起過敏反應，產生局部疼痛和皮膚色素沉著。而且，已經有研究證實，二價鐵離子在體內可催化產生OH自由基，引起細胞毒性和生物體系的損傷。事實證明，現(xiàn)有技術所廣泛使用的以硫酸亞鐵或其他亞鐵鹽作為治療缺鐵性貧血補鐵劑的治療效果并不理想。
近年來有研究表明，有機高價鐵復合物也能被胃腸道吸收，且生物利用度并不低于硫酸亞鐵，多糖鐵復合物作為補鐵劑用于缺鐵性貧血的治療，不僅具有較理想的穩(wěn)定性、水溶性和吸收率等，而且副作用少；并且，配體多糖由于具有多方面的生物活性，如調節(jié)血糖、降血壓、促進血循環(huán)等，亦可被機體吸收、利用，從而發(fā)揮相應的效應。因此，多糖鐵復合物已被證實為治療缺鐵性貧血的理想的補鐵劑。目前已經有多糖鐵復合物，如右旋糖苷鐵，廣泛應用于缺鐵性貧血的治療。

發(fā)明內容
本發(fā)明的任務是提供一種當歸多糖鐵，為生產多糖高價鐵復合物補血劑提供新的原料。同時提供一種用當歸多糖與高價鐵配合生成當歸多糖鐵的方法。
本發(fā)明提供的當歸多糖鐵的制備方法是按重量比4∶1的比例稱取當歸多糖和檸檬酸三鈉，溶于蒸餾水中，當歸多糖和檸檬酸三鈉與蒸餾水的重量體積比g/ml為1∶20-30，優(yōu)選1∶24，置于約70℃水浴中加熱并不斷攪拌；攪拌過程中，在不斷攪拌的同時，滴加堿液調pH值至8～9，即使溶液呈堿性，并緩緩滴加含F(xiàn)e3+溶液，所述的堿液可以是20％氫氧化鈉溶液，所述的含F(xiàn)e3+溶液可以是2mol/L三氯化鐵溶液，重復上述滴加堿液和滴加Fe3+溶液的操作，直至反應液中出現(xiàn)有紅棕色不溶物質；繼續(xù)在70℃水浴中加熱、攪拌約1小時，停止攪拌后，離心除去沉淀，收集紅棕色離心液，離心液中加入約兩倍量的無水乙醇，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，將沉淀用無水甲醇、95％乙醇、無水乙醇、乙醚洗滌，然后將沉淀物真空干燥，得紅棕色當歸多糖鐵粉末。
上述方法中所用當歸多糖的制備方法是以當歸為原料采用水提醇沉法提取當歸多糖，具體操作方法是稱取當歸250g，置于2000ml水中浸泡2小時，加熱煎煮1小時，趁熱過濾；重復提取1次，合并兩次所得濾液得當歸多糖水提取液；滴加10％的氫氧化鈣溶液調節(jié)該多糖水提取液的pH值至pH＞10；放置過夜后，用紗布濾除非堿溶性雜質，得多糖堿提取液；加3mol/L的硫酸溶液調堿提取液至pH值至5～6；過濾，將濾液濃縮至約200ml，然后加入約兩倍量的無水乙醇，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，揮去殘留乙醇，將沉淀真空干燥，得深褐色當歸多糖約15g。
當歸多糖鐵的鑒別中國藥典收載的鐵鹽的有關鑒別試驗。
鑒別試驗一取供試品溶液，加亞鐵氰化鉀試液，即生成深藍色沉淀，該沉淀不溶于稀鹽酸，但加遇氫氧化鈉試液，即分解成棕色沉淀。
鑒別試驗二取供試品溶液，加硫氰酸鉀試液，即顯血紅色。
取當歸多糖鐵粉末，配制成供試品溶液，進行上述鐵鹽的兩個鑒別試驗加亞鐵氰化鉀試液無沉淀出現(xiàn)，亦未見其他變化發(fā)生；加硫氰酸鉀試液不顯血紅色，亦未見其他變化發(fā)生。
由此可得到證明，本發(fā)明制備的當歸多糖鐵中的鐵并不以游離鐵的形式存在，而與當歸多糖生成了穩(wěn)定的復合物。
取當歸多糖鐵供試品溶液5ml，置具塞錐形瓶中，加水至20ml，加鹽酸5ml，加熱煮沸約5分鐘，得橙黃色溶液，該橙黃色溶液顯示鐵鹽的定性鑒別反應加亞鐵氰化鉀試液產生深藍色沉淀，加硫氰酸鉀試液立即顯血紅色。
以上實驗說明，在強酸并加熱的條件下，當歸多糖鐵被破壞，三價鐵游離出來，因此顯示三價鐵鹽的定性鑒別反應，這一性質可為當歸多糖鐵的定性鑒別和定量分析提供方法依據(jù)。
本發(fā)明的實驗資料一、材料1.儀器Diamond差示掃描量熱儀(PerkinElmer公司)、JEM-100CXII電子顯微鏡(日本JEOL公司)、MERCURY-PLUS400超導核磁共振譜儀(美國VARIAN公司)、AVATA360傅立葉紅外光譜儀(NICOLET公司)、Vario ELIII CHNSO元素分析儀(ELEMENTAR公司)(核磁共振譜儀NuclearMagnetic Resonance Spectrometer，透射電子顯微鏡JEM-100CX II Transmission ElectronMicroscope)2.藥品及試劑當歸由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科提供，經湖北省藥檢所鑒定。
所有用到的溶液均以分析純級別的試劑配置氫氧化鈣、硫酸、檸檬酸三鈉、三氯化鐵、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、高錳酸鉀、碘化鉀、硫代硫酸鈉、淀粉。
二、方法與結果1.歸多糖的提取、分離和純化以當歸為原料采用水提醇沉法提取當歸多糖，具體方法如下稱取當歸Angelica sinensis250g，置于2000ml水中浸泡2小時，加熱煎煮1小時，趁熱過濾；重復提取1次，合并兩次所得濾液得多糖水提取液aqueous extract。滴加10％的氫氧化鈣calcium hydroxide溶液調水提取液至pH＞10。放置過夜后，用紗布濾除非堿溶性雜質，得多糖堿提取液alkali extract。加3mol/L的硫酸sulfuric acid溶液調堿提取液至pH5～6；過濾，將濾液濃縮至約200ml，然后加入約兩倍量的無水乙醇absolute ethanol，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，揮去殘留乙醇，將沉淀真空干燥，得深褐色當歸多糖約15g。
2.當歸多糖鐵的制備稱取當歸多糖2g，檸檬酸三鈉sodium citrate0.5g，溶于60ml蒸餾水中，置約70℃水浴water bath中加熱并不斷攪拌。攪拌過程中，先逐滴加入20％氫氧化鈉sodium hydroxide溶液調pH8～9，然后緩緩滴加2mol/L三氯化鐵ferric chloride溶液；重復上述操作，直至反應液中出現(xiàn)有紅棕色不溶物質。繼續(xù)在70℃水浴中加熱、攪拌約1小時。停止攪拌后，離心除去沉淀，收集紅棕色離心液。離心液中加入約兩倍量的無水乙醇，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，沉淀分別用無水甲醇、95％乙醇、無水乙醇、乙醚洗滌，然后將沉淀真空干燥，得紅棕色當歸多糖鐵粉末約2g。按上述方法，制備當歸多糖鐵5批。
3.當歸多糖鐵的鐵含量的測定參考中國藥典2000年版第二部第116頁中記載的測定Fe3+的方法，測定本發(fā)明方法制備的當歸多糖鐵的鐵含量，具體方法如下取當歸多糖鐵干燥粉末約0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水30ml和硫酸2ml，加熱至溶液顯橙黃色，放冷后滴加高錳酸鉀試液至溶液恰顯粉紅色并持續(xù)5秒鐘，加鹽酸30ml和碘化鉀試液30ml(溶液變?yōu)樯詈稚?，密塞，于暗處靜置3分鐘使反應完全，加水50ml稀釋后，用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定，將近終點時，加淀粉指示劑(starch)2ml，繼續(xù)滴定至藍色消失。每1ml硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當于5.585mg的Fe。按上述方法測定所制備的三批當歸多糖鐵樣品并計算各批樣品的鐵含量，鐵含量計算公式鐵含量(％)＝F*V*5.585/S，式中，F(xiàn)＝硫代硫酸鈉滴定液實際濃度/0.1，V為滴定消耗的硫代硫酸鈉滴定液體積，S為取樣量，結果見表1。
表1 當歸多糖鐵的鐵含量

4.當歸多糖鐵的差示掃描量熱分析(DSC Study of APC)以Diamond差示掃描量熱儀測定當歸多糖鐵的DSC溫譜圖，結果見附圖1。約在50℃處出現(xiàn)吸熱曲線，此時發(fā)生失水。接下來是兩個約在240℃和330℃處出現(xiàn)的可以忽略的放熱峰，由此可以得出結論，在50-390℃范圍內，當歸多糖鐵非常穩(wěn)定，不發(fā)生分解。隨后由于當歸多糖鐵發(fā)生熔融(相變)，在約450℃處出現(xiàn)一個很明顯的吸熱峰，熔融的起始溫度大約在390℃。最后在約490℃時，當歸多糖鐵發(fā)生分解。
5.當歸多糖鐵的電子顯微結構(Electron Microscopy of APC)在JEM-100CX II電子顯微鏡下以150目銅網(wǎng)Formvar膜觀察當歸多糖鐵的微觀結構，結果見附圖2。有關研究表明，在堿性條件下，三價鐵發(fā)生聚合反應，生成一種可溶性聚合物，該聚合物含有一個通過O橋和OH橋連接的聚合鐵核參見1.Spiro TG，Pape L.Saltman P.Thehydrolytic polymerization of ferric citrate.I.The chemistry of the polymer[J].J Am Chem Soc，1967，895555-5559；2.Spiro TG，Bates G，Saltman P.The hydrolytic polymerization of ferriccitrate.II.The influence of excess citrate[J].J Am Chem Soc，1967，895559-5562]。其他多糖鐵復合物的有關研究表明，這種聚合鐵核可能是β-FeOOH[參見Cox J，Kennedy GR，King J，etal.Structure of an iron-dextran complex[J].J Pharm Pharmac，1972，24513-517]。當歸多糖鐵的電鏡照片(見圖2)顯示出的直徑在60～80nm的電子致密的球狀膠體顆粒，應為聚合鐵核β-FeOOH；一層電子稀疏的當歸多糖則包繞于鐵核周圍。因此可以推測，在制備過程中，三價鐵在堿性條件下先聚合成聚合鐵核β-FeOOH，然后當歸多糖即以此鐵核為中心配合到鐵核表面，從而生成當歸多糖鐵。
6.當歸多糖鐵的光譜分析和元素分析6.1當歸多糖鐵的紅外光譜(Infrared Spectra of APC)以KBr壓片用AVATA360傅立葉紅外光譜儀在4000～400cm-1波長范圍內測定當歸多糖鐵和當歸多糖的紅外光譜。
結果表明，兩者的紅外光譜均顯示有如下的吸收峰和對應的化學基團3400cm-1附近處的寬峰為-OH和-NH的伸縮振動，2930cm-1附近為-C-H的伸縮振動，1620cm-1附近為酰胺羰基的-C-O振動，1400cm-1附近為羧基的-C-O振動，1050cm-1附近為C-O-H和C-O-C振動，這些吸收峰均為多糖典型的特征吸收峰。但這兩者紅外光譜之間同時也存在明顯的差異當歸多糖鐵比當歸多糖多出了855cm-1和680cm-1波長處的吸收峰，根據(jù)文獻Marshall PR，Rutherford D.Physical investigation on colloidal iron-dextran complexes[J].JColloid Interface Sci，1971，37(2)390-402.的報導，這兩波長處的吸收峰正是聚合鐵核β-FeOOH的特征吸收。
6.2當歸多糖鐵的核磁共振氫譜(1H-NMR of APC)以D20為溶劑，DSS為參考標準，用MERCURY-PLUS400超導核磁共振譜儀對當歸多糖鐵和當歸多糖進行核磁共振氫譜掃描。結果表明，兩者的核磁共振氫譜差異顯著。當歸多糖氫譜在δ0～5.5ppm位移之間，顯示出典型的多糖類物質的核磁共振信號；而在當歸多糖鐵氫譜中，同樣在δ0～5.5ppm位移之間，除了δ4.756ppm位移處出現(xiàn)了一個很強的共振吸收峰之外，其他對應于當歸多糖存在共振吸收峰的位移處，由于受到聚合鐵核β-FeOOH的屏蔽作用，這些吸收峰都消失了。
6.3當歸多糖鐵的元素分析(Elemental Analysis of APC)
用Vario ELIII CHNSO元素分析儀測定當歸多糖鐵和當歸多糖的C、N、H元素含量，結果見表2。
表2 當歸多糖鐵和當歸多糖的C、N、H元素含量

比較表中所列數(shù)據(jù)可知，當歸多糖鐵由于鐵的存在，其N、C、H元素含量明顯低于當歸多糖的N、C、H元素含量。
當歸多糖鐵的鐵含量可用置換碘量法進行測定，因為三價鐵可定量地將碘化鉀氧化為碘，生成的碘用硫代硫酸鈉滴定液滴定，由此即可間接地測定三價鐵的含量。有關反應為2Fe3++2I-＝2Fe2++I2；I2+2S2O32-＝2I-+S4O62-。
當歸多糖鐵的鐵含量介于10~40％之間。各批樣品的鐵含量不一，甚至彼此相差較大，可能是因為當歸多糖與三價鐵之間的絡合反應沒有明確的定量關系；也可能是因為鐵含量與反應條件有關，例如反應溫度、反應時間、滴加氫氧化鈉溶液和三氯化鐵溶液的速度、攪拌的速度等等。當歸多糖鐵的水溶性與其鐵含量密切相關，鐵含量過高則不易溶于水，鐵含量過低，則極易溶于水。
當歸多糖鐵可溶于水，但不溶于有機溶劑如甲醇、乙醇、乙醚等；其水溶液為深紅棕色溶液，該溶液有丁達爾現(xiàn)象，這表明當歸多糖鐵溶液也是一種膠體溶液。根據(jù)我們的觀察，這種膠體溶液相當穩(wěn)定，室溫下放置數(shù)月未見聚沉現(xiàn)象發(fā)生。
根據(jù)所有上述研究結果，包括當歸多糖鐵的顯微結構、光譜特征以及元素分析等各項研究，我們可以合理地得出結論當歸多糖鐵是由三價鐵在堿性條件下聚合而成的聚合鐵核膠粒(β-FeOOH)構成，而起穩(wěn)定化親水作用的當歸多糖則以一定方式配合于聚合鐵核表面。


圖1為當歸多糖鐵的DSC譜圖。
圖2為當歸多糖鐵的電鏡照片(放大2.9萬倍)。
具體實施例方式
實施例1稱取當歸多糖2g，檸檬酸三鈉0.5g，溶于60ml蒸餾水中，置約70℃水浴中加熱并不斷攪拌，攪拌過程中，先逐滴加入20％氫氧化鈉溶液調pH值至8~9，然后緩緩滴加2mol/L三氯化鐵溶液；重復上述滴加氫氧化鈉溶液和滴加三氯化鐵溶液的操作，直至反應液中出現(xiàn)有紅棕色不溶物質；繼續(xù)在70℃水浴中加熱、攪拌約1小時，停止攪拌后，離心除去沉淀，收集紅棕色離心液，離心液中加入約兩倍量的無水乙醇，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，將沉淀用無水甲醇、95％乙醇、無水乙醇、乙醚洗滌，然后將沉淀物真空干燥，得紅棕色當歸多糖鐵粉末約2g。
實施例2稱取當歸250g，置于2000ml水中浸泡2小時，加熱煎煮1小時，趁熱過濾；重復提取1次，合并兩次所得濾液得當歸多糖水提取液；滴加10％的氫氧化鈣溶液調節(jié)該多糖水提取液的pH值至pH＞10；放置過夜后，用紗布濾除非堿溶性雜質，得多糖堿提取液；加3mol/L的硫酸溶液調堿提取液至pH值至5～6；過濾，將濾液濃縮至約200ml，然后加入約兩倍量的無水乙醇，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，揮去殘留乙醇，將沉淀真空干燥，得深褐色當歸多糖約15g。
權利要求
1.當歸多糖鐵，其特征在于，它的紅外光譜顯示有如下的吸收峰和對應的化學基團3400cm-1附近處的寬峰為-OH和-NH的伸縮振動，2930cm-1附近為-C-H的伸縮振動，1620cm-1附近為酰胺羰基的-C-O振動，1400cm-1附近為羧基的-C-O振動，1050cm-1附近為C-O-H和C-O-C振動，855cm-1和680cm-1波長處的吸收峰。
2.根據(jù)權利要求1所述的當歸多糖鐵，其特征在于，以Diamond差示掃描量熱儀對其進行測定的DSC溫譜圖顯示約在50℃處出現(xiàn)吸熱曲線，在50～390℃范圍內，當歸多糖鐵非常穩(wěn)定，不發(fā)生分解，隨后由于當歸多糖鐵發(fā)生熔融，在約450℃處出現(xiàn)一個很明顯的吸熱峰，熔融的起始溫度大約在390℃，在約490℃時發(fā)生分解。
3.根據(jù)權利要求2所述的當歸多糖鐵，其特征在于，在約240℃和330℃處出現(xiàn)很微小的放熱峰。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的當歸多糖鐵，其特征在于，它的核磁共振氫譜掃描結果顯示與當歸多糖的核磁共振氫譜所顯示的典型的多糖類物質的核磁共振信號相比較，當歸多糖鐵在δ0～5.5ppm位移之間，僅在δ4.756ppm位移處出現(xiàn)一個很強的共振吸收峰，其他對應于當歸多糖存在共振吸收峰的位移處的吸收峰都消失了。
5.當歸多糖鐵的制備方法，其特征在于包括以下步驟按重量比4∶1的比例稱取當歸多糖和檸檬酸三鈉，溶于蒸餾水中，當歸多糖和檸檬酸三鈉與蒸餾水的重量體積比g/ml為1∶20-30，置于約70℃水浴中加熱并不斷攪拌；攪拌過程中，在不斷攪拌的同時，滴加堿液調pH值至8～9，即使溶液呈堿性，并緩緩滴加含F(xiàn)e3+溶液，重復上述滴加堿液和滴加Fe3+溶液的操作，直至反應液中出現(xiàn)有紅棕色不溶物質；繼續(xù)在70℃水浴中加熱、攪拌約1小時，停止攪拌后，離心除去沉淀，收集紅棕色離心液，離心液中加入約兩倍量的無水乙醇，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，將沉淀用無水甲醇、95％乙醇、無水乙醇、乙醚洗滌，然后將沉淀物真空干燥，得紅棕色當歸多糖鐵粉末。
6.根據(jù)權利要求5所述的當歸多糖鐵的制備方法，其特征在于當歸多糖和檸檬酸三鈉與蒸餾水的重量體積比g/ml為1∶24。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的當歸多糖鐵的制備方法，其特征在于所述的堿液是20％氫氧化鈉溶液，所述的含F(xiàn)e3+溶液是2mol/L三氯化鐵溶液。
8.根據(jù)權利要求7所述的當歸多糖鐵的制備方法，其特征在于，稱取當歸多糖2g，檸檬酸三鈉0.5g，溶于60ml蒸餾水中，置約70℃水浴中加熱并不斷攪拌，攪拌過程中，先逐滴加入20％氫氧化鈉溶液調pH值至8～9，然后緩緩滴加2mol/L三氯化鐵溶液；重復上述滴加氫氧化鈉溶液和滴加三氯化鐵溶液的操作，直至反應液中出現(xiàn)有紅棕色不溶物質；繼續(xù)在70℃水浴中加熱、攪拌約1小時，停止攪拌后，離心除去沉淀，收集紅棕色離心液，離心液中加入約兩倍量的無水乙醇，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，將沉淀用無水甲醇、95％乙醇、無水乙醇、乙醚洗滌，然后將沉淀物真空干燥，得紅棕色當歸多糖鐵粉末約2g。
9.根據(jù)權利要求5所述的當歸多糖鐵的制備方法，其特征在于所述的當歸多糖的制備方法是以當歸為原料采用水提醇沉法提取當歸多糖。
10.根據(jù)權利要求9所述的當歸多糖鐵的制備方法，其特征在于所述的以當歸為原料采用水提醇沉法提取當歸多糖的方法是稱取當歸250g，置于2000ml水中浸泡2小時，加熱煎煮1小時，趁熱過濾；重復提取1次，合并兩次所得濾液得當歸多糖水提取液；滴加10％的氫氧化鈣溶液調節(jié)該多糖水提取液的pH值至pH＞10；放置過夜后，用紗布濾除非堿溶性雜質，得多糖堿提取液；加3mol/L的硫酸溶液調堿提取液至pH值至5～6；過濾，將濾液濃縮至約200ml，然后加入約兩倍量的無水乙醇，同時不斷攪拌；放置過夜后，傾去上清液，揮去殘留乙醇，將沉淀真空干燥，得深褐色當歸多糖約15g。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種當歸多糖鐵，為生產多糖高價鐵復合物補血劑提供新的原料，本發(fā)明提供的當歸多糖鐵，是以水煎煮法從當歸中提取當歸多糖，進而在堿性條件下，向當歸多糖水溶液中滴入三氯化鐵溶液制備當歸多糖鐵復合物，它的紅外光譜顯示有如下的吸收峰和對應的化學基團3400cm
文檔編號A61P7/00GK1995068SQ20051013711
公開日2007年7月11日 申請日期2005年12月31日 優(yōu)先權日2005年12月31日
發(fā)明者王凱平 申請人:華中科技大學