專利名稱:用咖啡酸苯乙酯衍生物、辣椒素和樹脂毒素抑制NF-kB的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明總地涉及核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的抑制劑以及這些抑制劑在治療人體內(nèi)病理性病征的應(yīng)用。具體地說,本發(fā)明涉及用咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的5,6-二羥基雙環(huán)衍生物、CAPE的2,5-二羥基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺(nonenamide))和樹脂毒素來抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的方法,以及這些抑制劑在治療病理性病征(如中毒性休克、急性炎癥、急性時象反應(yīng)(phase response)、動脈粥樣硬化和癌癥)中的應(yīng)用方法。
背景技術(shù):
核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB是一種對B細胞具有特異性的蛋白質(zhì),它與免疫球蛋白輕鏈к基因座增強子區(qū)域中的特異性DNA序列結(jié)合?,F(xiàn)已確定,轉(zhuǎn)錄因子NF-кB家族成員存在于各種生物體(包括從蠅到哺乳動物)中(參見Nolan等,Curr.Opin.Genet.Dev.2211-20(1992);Liou等,Curr.Opin.Genet.Dev.5477-87(1993);和Baeuerle和Henkel,Annu.Rev.Immunol.12141-79(1994))。該轉(zhuǎn)錄因子家族各成員間有35至61%的同源性,并且有約300氨基酸的Rel同源結(jié)構(gòu)域。
在哺乳動物中,分布最廣的кB結(jié)合因子是由P50和P65(Rel-A)蛋白組成的異二聚物。該轉(zhuǎn)錄因子在各種應(yīng)答中起主要作用,它通過迅速誘導(dǎo)基因表達來引起宿主防御。特別是,它控制參與腫瘤轉(zhuǎn)移的各種炎性細胞因子、主要的組織適合性復(fù)合基因和粘著分子的表達。NF-кB以及依賴于NF-кB的基因的調(diào)節(jié)異常與各種病理性病征相關(guān),它們包括中毒/膿毒性休克、移植物抗宿主反應(yīng)、急性炎癥、急性時象反應(yīng)、病毒復(fù)制、放射性損傷、動脈粥樣硬化和癌癥(參見Baeuerle和Henkel,Annu.Rev.Immunol.12141-79(1994);和Siebenlist等,Annu.Rev.Cell.Biol.10405-55(1994))。
與其它轉(zhuǎn)錄因子不同,NF-кB蛋白被稱為IкBa的抑制性亞基束縛在細胞質(zhì)中呈無活性狀態(tài)。IкB的磷酸化以及其后的降解使得NF-кB轉(zhuǎn)運到到胞核上。該活化過程由多種因素誘導(dǎo),如炎性細胞因子(如腫瘤壞死因子(TNF)、淋巴毒素(LT)和白細胞介素(IL)-1)、促細胞有絲分裂劑、細菌產(chǎn)物、蛋白合成抑制劑、氧化應(yīng)力(H2O2)、紫外光和佛波酯。能下調(diào)NF-кB活化作用的試劑可用來治療這些病理性病征。本發(fā)明涉及一些這樣的試劑。
一種試劑是咖啡酸(3,4-二羥基肉桂酸)苯乙酯(CAPE),它是蜂巢蠟?zāi)z中活性成分類黃酮的結(jié)構(gòu)類似物。它具有抗病毒、抗炎和調(diào)節(jié)免疫的性能,并且表現(xiàn)出能抑制不同類轉(zhuǎn)化細胞的生長(參見Grunberger等,Experientia 44230-32(1988);Burke等,J.Med.Chem.384171-78(1995);Su等,Cancer Res.541865-70(1994);Su等,Mol.Carcinog.4231-42(1991);Hlandon等,Arzneim.-Forsch./Drug Res.301847-48(1980);和Guarini,L.等,Cell.Mol.Biol.38513-27(1992))。在轉(zhuǎn)化的細胞中,CAPE改變了氧化還原狀態(tài)并誘導(dǎo)了細胞程序死亡。而且,已經(jīng)報道了CAPE有抑制脂質(zhì)過氧化的作用,具有抗氧化劑活性,并能抑制鳥氨酸脫羧酶、蛋白酪氨酸激酶和脂肪氧化酶的活性。CAPE也能抑制佛波酯誘導(dǎo)H2O2生成和誘發(fā)腫瘤增生(參見Bhimani等,Cancer Res.534528-33(1993)和Frenkel等,Cancer Res.531255-61(1993))。
本文中公開的另一種這樣的下調(diào)劑是辣椒素。辣椒素是高香草酸衍生物(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺),分子量為305.42。它是辣椒屬紅辣椒中的活性成分,并已用于人體局部治療束狀頭痛、帶狀皰疹和血管舒縮性鼻炎(參見Holzer,P.,Pharmacol.Rev.43143(1994);Sicuteri等,Med.Sci.Res.161079(1988);Waston等,Pain 33333(1988);Marabini等,Regul.Pept.221(1988))。辣椒素能在體外調(diào)節(jié)細胞的生長、膠原酶的合成以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液細胞(synoviocyte)分泌前列腺素(參見Matucci-Cerinic等,Ann.Rheum.Dis.49598(1990))。辣椒素也具有免疫調(diào)節(jié)性,這表現(xiàn)為它能調(diào)節(jié)淋巴細胞的增殖、抗體的產(chǎn)生和嗜中性細胞趨化作用(參見Nilsson等,J.Immunopharmac.10747(1988);Nilsson等,J.Immunopharmac.1321(1991);和Eglezos等,J.Neuroimmunol.26131(1990))。這些作用在辣椒素治療關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用中起重要作用。另外,辣椒素能誘導(dǎo)線粒體腫脹、抑制NADH氧化酶、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細胞的細胞程序死亡、刺激腺苷酸環(huán)化酶、激活蛋白激酶C、抑制超氧化物陰離子的產(chǎn)生,以及改變細胞的氧化還原狀態(tài)。
辣椒素的各種作用是通過一種與樹脂毒素(resiniferatoxin)共享的稱為類似香草堿(vanilloid)受體的特異性細胞受體來介導(dǎo)的。與辣椒素一樣,樹脂毒素是從大戟屬植物中獲得的生物堿。樹脂毒素是辣椒素的結(jié)構(gòu)同系物(見
圖1)。樹脂毒素在結(jié)構(gòu)上也與佛波酯(佛波醇肉豆寇酸·乙酸酯(phorbol myristate acetate))相似,該佛波酯能與不同的結(jié)合部位相互作用并激活蛋白激酶C(參見Szallasi等,Neurosci.30515(1989);和Szallasi和Blumberg,Neurosci.30515(1989))。與樹脂毒素不同,辣椒素與佛波醇肉豆寇酸·乙酸酯并不同系,但是它能象樹脂毒素一樣激活蛋白激酶C,這說明后一活化并不是由于樹脂毒素中的類似佛波酯的部分引起的。已經(jīng)知道,樹脂毒素能模擬許多辣椒素的作用。
因此,用咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的2,5-二羥基衍生物、CAPE的5,6-二羥基雙環(huán)衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)和樹脂毒素來抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的方法是已有技術(shù)中未知的。抑制NF-кB是治療由炎性細胞因子、促細胞有絲分裂劑、氧化應(yīng)力、佛波酯及其它試劑活化NF-кB引起的各種病理性病征中重要的步驟。本發(fā)明滿足了治療這些病理性病征領(lǐng)域中長期存在的需求和希望。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供用各種抑制劑來抑制NF-кB活化的方法。
在本發(fā)明的一個實施例中,提供的抑制劑是咖啡酸苯乙酯(CAPE)。
在本發(fā)明的另一個實施例中,提供的NF-кB的抑制劑是咖啡酸苯乙酯(CPAE)的2,5-二羥基衍生物。
在本發(fā)明的另一個實施例中,提供的NF-кB的抑制劑是咖啡酸苯乙酯(CAPE)的5,6-二羥基雙環(huán)衍生物。
在本發(fā)明的另一個實施例中,提供的抑制劑是辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)。
在本發(fā)明的還有一個實施例中,提供了樹脂毒素作為NF-кB的抑制劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療由個體內(nèi)NF-кB活化而引起的病理性病征的方法,該方法包括對待治療的個體給予咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的5,6-雙環(huán)二羥基衍生物、CAPE的2,5-二羥基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)或樹脂毒素。
本發(fā)明這方面的各種實施例包括提供治療諸如中毒/膿毒性休克、移植物抗宿主反應(yīng)、急性炎癥、急性時象反應(yīng)、病毒感染、放射性損傷易感性、動脈粥樣硬化和癌癥之類的病理性病征的方法,該方法包括對待治療的個體給予咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的2,5-二羥基衍生物、CAPE的5,6-雙環(huán)二羥基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)或樹脂毒素。
本發(fā)明的其它方面、特征和優(yōu)點可以從下述的本發(fā)明較佳實施例中明顯獲得。給出這些實施例的目的只是為了公開本發(fā)明。
附圖簡述圖1示出了CAPE抑制依賴于TNF的NF-кB的劑量-反應(yīng)方式和動力學(xué)。1A使U937細胞(2×106/ml)與指定濃度的CAPE 37℃預(yù)培育2小時,然后與0.1nM TNF一起培育15分鐘。
1B上圖為了對NF-кB活化進行超移動(supershift)和特異性分析,從未處理過的或TNF(0.1nM)處理過的細胞中制得核抽提物,與抗體一起培育30分鐘,然后測定NF-кB。
1B下圖使細胞與25μg/ml CAPE在37℃預(yù)培育不同的時間,然后測定不用或用0.1nM TNF 37℃15分鐘后NF-кB的活化情況。(-)表示在加入TNF前有CAPE存在,(0)表示CAPE與TNF共同培育,(+)表示在TNF后加入CAPE。在這些處理后,制得核抽提物并測定NF-кB。任意單位表示各條帶中放射性的相對量。
圖2證明了CAPE對佛波酯肉豆蔻酸·乙酸酯、神經(jīng)酰胺、岡田酸和H2O2介導(dǎo)的NF-кB活化有(抑制)作用。使U937細胞(2×106/ml)與CAPE(25μg/ml)37℃預(yù)培育120分鐘,然后在37℃用佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯(100ng/ml,60分鐘)、H2O2(0.5mM,30分鐘)、神經(jīng)酰胺C8(10μM,30分鐘)或?qū)锼?500nM,30分鐘)處理,再測定NF-кB的活化情況。另外再對佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯介導(dǎo)的活化進行電泳遷移率變動測定。
圖3示出了CAPE對NF-кB與DNA結(jié)合的(抑制)作用。對于圖3A,將從經(jīng)TNF激活的U937細胞中制得的核抽提物與指定濃度的CAPE在37℃培育30分鐘,然后分析NF-кB的活化情況。對于圖3B,在有或沒有指定濃度的CAPE存在下,用脫氧膽酸處理未經(jīng)處理的細胞的胞質(zhì)抽提物,分析NF-кB的活化情況。
圖4示出了CAPE對AP-1、Oct-1和TFII D轉(zhuǎn)錄因子的影響。用25μg/ml的CAPE在37℃處理細胞2小時,制得核抽提物用于電泳遷移率變動測定。
圖5
示出了CAPE對TNF誘導(dǎo)的IкBa降解以及對胞質(zhì)和胞核中p65水平的影響。使經(jīng)過或未經(jīng)CAPE(25μg/ml)37℃預(yù)處理2小時的U937細胞(2×106/ml)與和不與TNF(0.1nM)一起培育不同的時間,然后測定IкBa(上圖)。對于p65(下圖),使經(jīng)或未經(jīng)CAPE(25μg/ml)37℃預(yù)處理2小時的細胞,與和不與TNF(0.1nM)一起培育15分鐘,制得細胞核和細胞質(zhì)抽提物,用western印跡法測定p65。
圖6表示DTT、BME和DMP對CAPE誘導(dǎo)的NF-кB活化抑制的影響。在CAPE(25μg/ml)存在或不存在下,使U937細胞(2×106/ml)與DTT(100μM)、BME(142μM)或DMP(100μM)一起培育2小時,用TNF(0.1nM)活化15分鐘,然后測定NF-кB的活化情況。
圖7顯示了不同的CAPE類似物的結(jié)構(gòu)(7A)及其對TNF誘導(dǎo)NF-кB活化的影響(7B)。使U-937細胞(2×106/ml)與不同的CAPE類似物(25μg/ml)37℃培育2小時,用(上圖)或不用(下圖)TNF(0.1nM)活化15分鐘,測定NF-кB的活化情況。C表示只經(jīng)過TNF處理,P表示用母化合物CAPE然后用TNF處理。任意單位代表存在的放射活性的相對量。
圖8示出了辣椒素、樹脂毒素和佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是同系的。
圖9示出了電泳遷移率變動測定的結(jié)果,該結(jié)果表明辣椒素抑制依賴于TNF的NF-кB活化的劑量-反應(yīng)方式和動力學(xué)。
9A使ML-1a細胞(2×106/ml)與不同濃度的辣椒素在37℃預(yù)培育2小時,然后用或不用0.1nM TNF活化15分鐘。
9B使細胞(2×106/ml)與300μM辣椒素在37℃預(yù)培育2小時,然后測定在37℃用所示不同濃度的TNF活化15分鐘后的NF-кB活化情況。
9C使ML-1a細胞(2×106/ml)與300μM辣椒素在37℃預(yù)培育不同的時間,然后測定在37℃用0.1nM TNF活化15分鐘后的NF-кB活化情況。(-)表示在加入TNF前,辣椒素存在的時間;(0)表示與TNF共同培育;(+)表示在TNF后,加入辣椒素的時間。在這些處理后,制得核抽提物并測定NF-кB。
圖10示出了樹脂毒素抑制依賴于TNF的NF-кB活化的劑量-反應(yīng)方式。使細胞(2×106/ml)與所示不同濃度的樹脂毒素在37℃預(yù)培育2小時,用0.1nM TNF 37℃活化30分鐘,然后測定NF-кB。在這些處理后,制得核抽提物,然后測定NF-кB。UT表示未經(jīng)處理的細胞。
圖11超移動試驗和辣椒素對NF-кB活化的抑制作用的特異性。對于圖(A),從未經(jīng)TNF(0.1nM)處理的或經(jīng)處理的細胞(2×106/ml)中制得核抽提物,與抗體培育30分鐘,然后測定NF-кB。對于圖(B),用不同濃度的辣椒素處理細胞2小時,再用TNF處理15分鐘,制得細胞質(zhì)抽提物,用8%脫氧膽酸處理這些抽提物,用電泳遷移率變動測定測定NF-кB。對于圖(C),使經(jīng)TNF處理過的細胞的核抽提物與不同濃度的辣椒素培育15分鐘,用電泳遷移率變動測定分析NF-кB。
圖12示出了辣椒素對不同NF-кB活化劑(佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯和岡田酸)的影響。對于圖12A,使ML-1a細胞(2×106/ml)與辣椒素在37℃預(yù)培育2小時,用佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯(25ng/ml)、岡田酸(500nM)或TNF(0.1nM)處理30分鐘,然后測定NF-кB的活化情況。用100倍過量的、冷的或突變的寡核苷酸來測定結(jié)合特異性。標(biāo)記為Mut.探針的泳道系將突變的探針作標(biāo)記然后用來檢測此結(jié)合。
對于圖12B,使指定濃度的辣椒素與U-937或Hela細胞(2×106/ml)在37℃預(yù)培育2小時,然后用TNF(0.1nM)活化15分鐘,然后測定NF-кB。
圖13示出了辣椒素對TNF誘導(dǎo)的IkBa降解和對p65水平的影響。
13A使未經(jīng)處理的或用300μM辣椒素在37℃預(yù)處理2小時的ML-1a(2×106/ml)細胞與TNF(0.1nM)培育不同的時間,然后用western印跡分析測定胞質(zhì)級分中的IкBa。S和N表示緩慢遷移和正常遷移的條帶。
13B用辣椒素處理細胞不同的時間,然后用western印跡分析測定胞質(zhì)級分中的IкBa或p65。
13C使經(jīng)辣椒素預(yù)處理2小時的ML-1a細胞(2×106/ml)與TNF(0.1nM)一起培育30分鐘,然后用Western印跡分析測定核抽提物和細胞質(zhì)抽提物中的p65。
13D用不同濃度的辣椒素預(yù)處理細胞2小時,然后用或不用TNF(0.1nM)處理15分鐘,再用western印跡分析測定胞質(zhì)級分中的p50或c-Rel。
圖14示出了辣椒素對與CAT基因相連的IкBa啟動子的活性的影響。用pIкBCAT和pmutIкBCAT瞬時轉(zhuǎn)染細胞,用300μM辣椒素處理該細胞2小時并使其接觸0.1nM TNF 1小時,測定CAT活性。結(jié)果用未經(jīng)處理的對照的活性倍數(shù)表示。
本文包括了這些附圖,這樣就能清楚詳細地了解本發(fā)明的上述特征、優(yōu)點和目的。這些附圖組成了本說明書的一部分。然而,應(yīng)當(dāng)注意,附圖只是描述了本發(fā)明的較佳實施例,其不應(yīng)被認為限制了本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
在對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明的范圍和精神下顯然可對本文公開的發(fā)明作各種變化和改動。
本文所用的術(shù)語“核因子NF-кB”或“NF-кB”應(yīng)指對B細胞有特異性的、與免疫球蛋白輕鏈к基因座增強子區(qū)域中的特異性DNA序列(5-GGGGACTTTCC-3)結(jié)合的蛋白,其在哺乳動物體內(nèi)是由p50和p65(Rel-A)蛋白組成的異源二聚物。NF-кB在各種應(yīng)答中起主要作用,其通過迅速誘導(dǎo)基因表達來引起宿主防御,并控制參與腫瘤轉(zhuǎn)移的各種炎性細胞因子、主要的組織適合性復(fù)合基因和粘著分子的表達。
本文所用的術(shù)語“CAPE”指咖啡酸(3,4-二羥基肉桂酸)苯乙酯。
本文所用的術(shù)語“CAPE的5,6-二羥基雙環(huán)衍生物”指圖7A中化合物編號6表示的CAPE類似物分子。
本文所用的術(shù)語“CAPE的2,5-二羥基衍生物”指圖7A中化合物編號1表示的CAPE類似物分子。
本文所用的術(shù)語“辣椒素”指高香草酸衍生物,8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺,其分子量為305.42。
本文所用的術(shù)語“樹脂毒素”指圖8B所示辣椒素的結(jié)構(gòu)同系物。
本文所用的術(shù)語“病理性病征”指與疾病有關(guān)或由疾病引起的病征。這些病征可以包括(但不局限于),中毒或膿毒性休克、移植物抗宿主反應(yīng)、急性炎癥、急性時象反應(yīng)、病毒復(fù)制、放射性損傷、動脈粥樣硬化和癌癥。
本文所用的術(shù)語“試劑的治療有效量”指試劑量在生理上是顯著的,并能改善個體的健康狀況。如果試劑的存在改變了接受者的生理狀況,則稱試劑“在生理上是顯著的”。例如,在治療病理性病征時,給予的劑量能緩解或阻止病征的進一步發(fā)展,則認為給予的試劑在生理上是顯著的,并且在治療上是有效的。
本文所用的術(shù)語“CAT”指氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明涉及用各種抑制劑來抑制NF-кB活化的方法。另外還考慮了治療個體內(nèi)由NF-кB的活化引起的病理性病征的方法。
對于治療應(yīng)用,分子藥理學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員能不進行多余的實驗即可確定本發(fā)明中抑制NF-кB活化的新穎的抑制劑的合適劑量和給藥途徑。
給出下列實施例只是為了描述本發(fā)明的各種實例,而并不意味著以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1材料青霉素、鏈霉素、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO(GrandIsland,NY)。佛波酯和牛血清白蛋白鹽購自Sigma Chemical Co.(St.Louis.MO)。從細菌獲得的、并經(jīng)純化至均質(zhì)的比活為5×107單位/毫克的重組人TNF由Genentech,Inc.(South San Franciso,CA)提供??笽кBa的抗體、細胞周期蛋白D1和NF-кB亞基p50和p65,以及具有AP-1和Oct-1共有序列的雙鏈寡核苷酸購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。神經(jīng)酰胺(C8)購自Calbiochem(SanDiego,CA)。Tris、甘氨酸、NaCl、SDS、樹脂毒素、佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯、氯霉素和牛血清白蛋白購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。32P-標(biāo)記的γ-ATP(比活為7000Ci/毫摩爾)購自ICN(Costa Mesa,Ca)。岡田酸(OA)購自LCLaboratories(Woburn,MA),辣椒素購自Tocris Cookson Inc.(St.Louis,MO),乙酰輔酶A購自Pharmacia Biotech(Alameda,CA),氚化的乙酰輔酶A購自AmershamLife Sciences(Arlington Heights,IL)。GIBCO-BRL磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)試劑盒(Cat.#18306-019)購自Life Technologies(Madison,WI)。
CAPE及其類似物為了進行結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的研究,如Grunberger等,Experientia 44230-32(1988)和Burke等,J.Med.Chem.384171-78(1995)所述,合成幾個CAPE的類似物。這些類似物包括環(huán)取代基、酯基、旋轉(zhuǎn)受限的變異體以及飽和的酰胺類似物。在50℃乙醇中制得濃度為1-5mg/ml的CAPE及其類似物的貯備液,再在細胞培養(yǎng)基中作進一步稀釋。
細胞系對于CAPE研究,使人組織細胞型細胞系U937細胞在補加了谷氨酰胺(2mM)、慶大霉素(50mg/ml)和胎牛血清(FBS)(10%)的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)生長。將細胞以1×105細胞/毫升的密度接種入含10毫升培養(yǎng)基的T25燒瓶(Falcon 3013,Becton Dickinson Labware,Lincoln Park,NJ)中,并在37℃、95%空氣和5%CO2下生長。細胞培養(yǎng)物每隔3或4天分裂一次。有時,用DNA為基的試劑盒(購自Gen-Probe,San Diego,CA)測定細胞中支原體的污染情況。
對于辣椒素和樹脂毒素的研究采用ML-1a細胞,它是一種人骨髓單核母細胞白血病細胞系,由Dr.Ken Takeda(Showa University,Japan)提供;U-937和Hela細胞系(從ATCC獲得)。使細胞在補加了谷氨酰胺(2mM)、慶大霉素(50mg/ml)和胎牛血清(FBS)(10%)的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)生長。將細胞以1×105細胞/毫升的密度接種入含10毫升培養(yǎng)基的T25燒瓶(Falcon 3013,Becton Dickinson Labware,Lincoln Park,NJ)中,并在37℃、95%空氣和5%CO2生長。細胞培養(yǎng)物每隔3或4天分裂一次。
DNA構(gòu)建物氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因上游連接有0.2kb片段的IкBa質(zhì)粒pIкBCAT,以及含有與CAT相連的、但具有NF-кB突變位點的0.2kb片段的質(zhì)粒pmutIкBCAT由M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX的Dr.PaulChiao提供。這些質(zhì)粒的性質(zhì)鑒定在Schreiber等,Nucleic Acids Res.176419(1989)中有詳細描述。
實施例2電泳遷移率變動測定這些試驗如以前Chaturvedi等,J.Biol.chem.26914575-83(1994)以及Schreiber等,Nucleic Acids Res.176419(1989)中詳細描述的那樣進行。簡言之,用冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2×106個細胞,然后懸浮在0.4ml裂解緩沖液(10mM HEPES pH7.9,10mM KCl,0.1mM EDTA,0.1mMEGTA,1mM DTT,0.5mM PMSF,2.0mg/ml亮抑酶肽,2.0mg/ml抑蛋白酶肽和0.5mg/ml苯甲脒)中。使細胞在冰上溶脹15分鐘,然后加入12.5ml 10%NP-40。然后使試管劇烈旋渦10秒種,再離心勻漿物30秒種。將細胞核沉淀重新懸浮在25μl冰冷的核抽提物緩沖液(20mM HEPES pH7.9,0.4M NaCl,1mM EDTA,1mMEGTA,1mM DTT,1mM PMSF,2.0mg/ml亮抑酶肽,2.0mg/ml抑蛋白酶肽和0.5mg/ml苯甲脒)中,置于冰上培育30分鐘間以混合攪拌。使樣品4℃離心5分鐘,上清液(核抽提物)可立即使用,或保藏在-70℃。用Bradford,M.M.,Anal.Biochem.72248-254(1976)所述的方法測定蛋白含量。
電泳遷移率變動分析如下進行使4mg核抽提物與16fmol32P末端標(biāo)記的HIV-LTR的45聚雙鏈NF-кB寡核苷酸5′-TTGTT ACAAG GGACTTT CCGCTGGGGAC TTTCCA GGGAG GCGTGG-3′(Nabel,G.和Baltimore,D.,Nature326711-13(1987))37℃培育15分鐘。培育混合物包括在結(jié)合緩沖液(25mM HEPESpH7.9,0.5mM EDTA,0.5mM DTT,1%NP-40,5%甘油和50mM NaCl)中的2-3mg聚(dI-dC)。在4.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠上用含有50mM Tris,200mM甘氨酸pH8.5和1mM EDTA的緩沖液使形成的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物與游離的寡核苷酸分離,然后干燥凝膠。用雙鏈突變的寡核苷酸5′-TTGTTA CAACTC ACTTTCCGCTGCTCAC TTTCCA GGGAGG CGTGG-3′來檢測NF-кB與DNA結(jié)合的特異性。結(jié)合特異性還可通過與未標(biāo)記的寡核苷酸競爭來檢測。
對于超移動試驗,在對復(fù)合物進行電泳遷移率變動分析前,使從經(jīng)TNF處理過的細胞中制得的核抽提物在室溫下與抗NF-кB的p50或p65亞基的抗體一起培育30分鐘(Singh,S.和Aggarwal,B.B,J.Biol.Chem.27010631-39(1995))。另加入抗細胞周期蛋白D1的抗體作為陰性對照。
對AP-1、TFII D和Oct-1作電泳遷移率變動分析,如NF-кB一樣,也用32P末端標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸。如Singh,S.和Aggarwal,B.B,J.Biol.Chem.27010631-39(1995)中所述的,常規(guī)用過量未標(biāo)記的寡核苷酸競爭測定對結(jié)合的特異性。使放射活性條帶顯色,并用磷光測定儀(phosphorimager)(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)和“Image-quant”軟件對其作定量測定。
實施例3Western印跡分析IкBa和p65為分析IкBa,在NF-кB活化反應(yīng)后,將核后(postnuclear)抽提物溶解在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。為了測定p65水平,將核和核后(細胞質(zhì))抽提物溶解在8%SDS聚丙烯酰胺凝膠中。將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到Immobilon P膜上,用抗IкBa或抗p65的兔多克隆抗體作為探針進行化學(xué)發(fā)光檢測(ECL-Amersham;30)。
實施例4CAPE對轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活化的(抑制)作用用U937細胞來作這些研究,因為關(guān)于U937細胞對因各種刺激而活化的NF-кB反應(yīng)已作了很好地性質(zhì)鑒定(參見Reddy,等,J.Biol.Chem.26925369-72(1994))。在這些實驗中,所有濃度的CAPE及其類似物均獲得了98%以上的細胞存活率。使U937細胞與不同濃度的CAPE預(yù)培育2小時,再用TNF(0.1nM)在37℃處理15分鐘,然后檢測NF-кB的活化情況。結(jié)果(圖1A)表明CAPE以劑量依賴方式抑制了TNF依賴的NF-кB活化,在25μg/ml時有最大效果。在未經(jīng)TNF處理的細胞、或只用載體(乙醇)處理過的細胞或只用CAPE處理過的細胞中均沒有發(fā)現(xiàn)NF-кB活化。
為了表明在經(jīng)TNF處理過的細胞中電泳遷移率變動分析所見的滯后條帶的確是NF-кB,將核抽提物與抗p50(NF-кB1)或p65(Rel A)亞基的抗體分開來培育,然后進行電泳遷移率變動分析。本實驗的結(jié)果(圖1B,上圖)表明,抗NF-кB中任一亞基的抗體使條帶移動至較高分子量處,這說明TNF活化的復(fù)合物由p50和p65亞基組成。抗細胞周期蛋白D的非特異性的抗體對NF-кB的遷移率沒有影響。另外,當(dāng)采用了未標(biāo)記的寡核苷酸(100倍過量)時,經(jīng)TNF處理過的細胞中電泳遷移率變動分析所見的滯后條帶消失,而當(dāng)采用了突變型寡核苷酸時,條帶卻不會消失(圖1B,上圖)。
在加入TNF前120、90、60和30分鐘時、在加入TNF的同時、在加入TNF后5和10分鐘時,使細胞與CAPE一起培育,以檢測抑制動力學(xué)。細胞用TNF處理15分鐘。只有當(dāng)細胞預(yù)先用CAPE處理過時,TNF反應(yīng)才會受到抑制(圖1B,下圖)。用TNF和CAPE共同處理細胞是無效的。
實施例5CAPE也能抑制由佛波酯、神經(jīng)酰胺、岡田酸和過氧化氫誘導(dǎo)的NF-кB活化佛波酯(佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯)、神經(jīng)酰胺、岡田酸和過氧化氫也能誘導(dǎo)NF-кB的活化(Meyer,等,EMBO J.122005-15(1993))。然而,這些試劑誘導(dǎo)導(dǎo)致NF-кB活化的初始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同。因此,檢測CAPE對這些不同試劑活化轉(zhuǎn)錄因子的(抑制)作用。圖2中的結(jié)果表明CAPE完全阻斷了所有四種試劑誘導(dǎo)的NF-кB活化,這表明CAPE作用于導(dǎo)致NF-кB活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的趨同(converge)步驟。
實施例6CAPE特異性地抑制NF-кB(而不是其它轉(zhuǎn)錄因子)與DNA的結(jié)合TPCK(絲氨酸蛋白酶抑制劑)和除莠霉素(蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑)均表現(xiàn)出能通過干擾NF-кB與DNA的結(jié)合來阻斷NF-кB的活化(Finco等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9111884-88(1994);和Mahon,T.M.和O′Neill,L.A.J.,J.Biol.Chem.27028577-64(1995))。為了測定CAPE對NF-кB與DNA的結(jié)合的影響,使預(yù)先用TNF活化的細胞的核抽提物與各種濃度的CAPE一起培育。電泳遷移率變動分析(圖3,上圖)表明CAPE能防止NF-кB與DNA結(jié)合。由于IкBa也可通過洗滌劑(如脫氧膽酸)溫和處理從NF-кB上解離下來,因此檢測經(jīng)脫氧膽酸處理過的細胞質(zhì)抽提物與經(jīng)或未經(jīng)CAPE處理的DNA結(jié)合的能力。同樣,CAPE也干擾了NF-кB蛋白與DNA的結(jié)合(圖3,下圖)。
測試CAPE抑制其它轉(zhuǎn)錄因子(如AP-1、TFII D和Oct-1)結(jié)合的能力。CAPE對NF-кB結(jié)合的抑制作用是特異性的,因為它不抑制其它轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的能力(圖4)。
實施例7CAPE不抑制依賴于TNF的IкBa磷酸化和降解NF-кB轉(zhuǎn)運到胞核上是通過IкBa的磷酸化和蛋白水解來進行的(參見Thanos,D.和Maniatis,T.,Cell80529-32(1995))。為了確定CAPE的抑制作用是否是因為對IкBa降解有抑制作用,用western印跡分析檢測IкBa蛋白的細胞質(zhì)水平。如圖5上圖所示,用CAPE處理細胞對IкBa的細胞質(zhì)庫沒有影響,但是用TNF處理細胞卻會使IкBa條帶在5分鐘內(nèi)減少,在15分鐘時完全消失,然后在30分鐘時重現(xiàn)。CAPE的存在對TNF誘導(dǎo)IкBa降解的速率沒有顯著影響,但是它延遲了IкBa的重新合成。這種延遲可能是一種反饋調(diào)節(jié),因為IкBa的重新合成取決于NF-кB的活化。
由于NF-кB活化需要NF-кBp65亞基的核轉(zhuǎn)運,因此用western印跡分析來檢測p65蛋白的胞質(zhì)和胞核庫。如圖5下圖所示,沒有一種處理明顯改變了p65的胞質(zhì)庫,但是TNF誘導(dǎo)的胞核內(nèi)p65的出現(xiàn)被CAPE阻斷。在經(jīng)TNF處理過的細胞中,p65相應(yīng)胞質(zhì)庫中的降低量并不顯著,這可能是因為在活化時,只有20%的p65被轉(zhuǎn)運到胞核中。
實施例8還原劑逆轉(zhuǎn)了CAPE的作用已經(jīng)知道,過釩酸鹽、TPCK和除莠霉素A抑制NF-кB活化的生物作用可被還原劑逆轉(zhuǎn)。因此,測定DTT、2,3-二巰基丙醇(DMP)和β巰基乙醇(BME)使CAPE作用逆轉(zhuǎn)的能力。在有或沒有DTT、DMP或BME存在下,用CAPE處理細胞,并檢測用TNF活化NF-кB的情況。如圖6所示,沒有一種還原劑本身對依賴于TNF的NF-кB活化有明顯影響,但是所有的還原劑均使CAPE誘導(dǎo)的抑制作用完全逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果暗示,巰基在依賴于TNF的活化NF-кB中起關(guān)鍵作用。
實施例9對CAPE的結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系的研究為了進一步描述CAPE在抑制NF-кB活化中的作用,采用具有四類不同修飾的CAPE類似物。這些類似物包括環(huán)取代基(化合物1、2、3)、酯基團(化合物4)、旋光受限的變體(化合物5和6)和飽和的酰胺類似物(化合物7和8),它們均顯示在圖7A中。以前已經(jīng)對這些類似物抑制人HIV整合酶和細胞生長的能力作了性質(zhì)鑒定(參見Burke等,J.Med.Chem.384171-78(1995))。盡管所有這些化合物在抑制NF-кB活化上具有活性,但是它們的抑制能力有顯著差別(圖7B)。
從3,4-二羥基模式變?yōu)?,5二羥基模式(化合物1)的羥基部位的改變提高了抑制效能,該效能高于用兩個甲醚來代替CAPE的羥基(化合物2)所得的效能。然而,加入第三個羥基形成2,3,4-三羥基衍生物(化合物3)卻使效能有所損失,這說明,羥基數(shù)目和部位是抑制程度的一個關(guān)鍵性決定因素。在酯類似物組中,分子的咖啡酸部分(3,4-二羥基肉桂酸)保持不變,而改變苯乙基側(cè)鏈。烷基間隔長度的增加(化合物4)會使抑制效果明顯喪失。
在旋光受限的變體中,采用了羥基取代基部位不同的兩個CAPE異構(gòu)體的雙環(huán)類似物。發(fā)現(xiàn)兩個類似物的抑制效能有顯著變化。異構(gòu)體5完全失效,而異構(gòu)體6完全消除了結(jié)合,這再一次表明羥基部位在抑制NF-кB活化中起關(guān)鍵作用。
在飽和酰胺類似物中,檢測了側(cè)鏈鍵和酯基氧的重要性。(苯乙基)胺環(huán)中具有額外的三個羥基的類似物(化合物7)以及反向酰胺類似物(化合物8,它沒有額外的羥基)的活性比CAPE差。因此,CAPE的結(jié)構(gòu)類似物可能比CAPE更具活性(如化合物6),可能與CAPE的活性相同(如化合物1),也可能活性低于CAPE(如化合物2、3、4、5、7和8)。
實施例10瞬時轉(zhuǎn)染和CAT試驗用磷酸鈣方法,根據(jù)生產(chǎn)商(GIBCO-BRL)提供的說明書,用pIкBCAT以及pmutIкBCAT瞬時轉(zhuǎn)染Hela細胞20小時。在轉(zhuǎn)染后,更換培養(yǎng)基(MEM);使細胞在37℃培育24小時,然后用辣椒素(300μM)處理2小時,再用0.1nM TNF刺激1小時。然后用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞,并如Sambrook J.,E.E.Fritsch,和T.Maniatis.編輯,Molecular cloningA laboratorymanual,第2版,Cold Spring Harbor Press.,New York中所述的檢測CAT活性。
實施例11辣椒素能抑制依賴于TNF的NF-кB活化測試辣椒素及其類似物樹脂毒素(樹脂毒素也與佛波酯在結(jié)構(gòu)上是同系物(見圖8))調(diào)節(jié)NF-кB活化的能力。采用的培育最大時間和化合物濃度對細胞存活力或TNF受體的影響最小。用臺盼藍排阻法測得細胞在暴露在100μM、200μM和300μM辣椒素下2小時時的細胞存活力分別為99%、98%和95%。
用不同濃度的辣椒素(高達300μM)預(yù)處理ML-1a細胞2小時,再與或不與TNF(0.1nM)一起37℃培育15分鐘,用電泳遷移率變動分析測定NF-кB的活化情況(圖9A)。結(jié)果顯示,辣椒素本身不會活化NF-кB,而200-300μM的辣椒素則抑制了大部分TNF誘導(dǎo)的NF-кB活化。TNF活化NF-кB是非常特異性的,因為在加入未標(biāo)記寡核苷酸時條帶消失,而在加入帶有突變型結(jié)合部位的寡核苷酸時則條帶不消失(圖13A)。
以前的研究已經(jīng)表明,高濃度的TNF(10nM)能誘導(dǎo)出更強而迅速(在5分鐘內(nèi))的NF-кB活化(Chaturvedi等,J.Biol.Chem.26914575-83(1994))。為了確定辣椒素是否也能抑制對TNF的強反應(yīng),用濃度增加的TNF(高達10nM)作用于經(jīng)辣椒素預(yù)處理過的細胞15分鐘,然后檢測NF-кB(圖9B)。盡管10nM TNF的NF-кB活化作用非常強,但是辣椒素完全抑制了該活化作用(就如其對0.01nM濃度的TNF那樣有效)。這些結(jié)果表明,辣椒素是一種抑制NF-кB活化的非常有效的抑制劑。
為了更進一步地了解抑制的動力學(xué),使細胞與辣椒素共同培育120、60。30和10分鐘,然后使細胞受TNF作用。另外還在加入TNF的同時(0分鐘)及加入后10分鐘時加入辣椒素。每種情況下的TNF均作用30分鐘。如圖9C所示,辣椒素和TNF與細胞共同培育不會阻斷NF-кB的活化。只有當(dāng)細胞與辣椒素預(yù)先培育120分鐘時才發(fā)現(xiàn)有抑制TNF反應(yīng)的最大效果。
實施例12樹脂毒素也能抑制NF-кB活化樹脂毒素是辣椒素的結(jié)構(gòu)類似物,兩者共享一個公共的受體(參見Holzer,H.Pharmacol.Rev.43143(1994);和Szallasi,A.,和Blumberg,P.,Brain Res.524106(1990))。因此,對樹脂毒素抑制TNF介導(dǎo)NF-кB活化的能力進行測定。與辣椒素一樣,用樹脂毒素本身處理細胞不會活化NF-кB,但是它能以劑量依賴方式(圖10)完全抑制TNF介導(dǎo)的NF-кB活化。由于40μM的樹脂毒素就足以實現(xiàn)對TNF反應(yīng)的最大抑制,因此認為樹脂毒素的效力約為辣椒素的8倍。
實施例13受辣椒素抑制的、活化的NF-кB由p50和p65亞基組成Rel/NF-кB蛋白的不同組合能構(gòu)成有活性的、與DNA中特異性序列結(jié)合的NF-кB異二聚物。為了證明經(jīng)TNF處理過的細胞中電泳遷移率變動分析顯示的滯后條帶的確是NF-кB,使受TNF活化的細胞核抽提物與抗p50(NF-кB1)或p65(Rel A)亞基的抗體一起培育,并進行電泳遷移率變動分析??筃F-кB的任一亞基的抗體使條帶移動到更高的分子量處(圖11A),這就說明TNF-活化的復(fù)合物由p50和p65亞基組成。抗p65抗體的部分移動可能是由于所用抗體的性質(zhì)或條件的緣故。用不相關(guān)的抗體(NS)作為對照跑電泳;它對NF-кB條帶沒有影響。
已經(jīng)證明,TPCK(絲氨酸蛋白酶抑制劑)和除莠霉素(酪氨酸激酶抑制劑)均能通過化學(xué)改變NF-кB亞基,從而防止NF-кB與DNA結(jié)合,下調(diào)NF-кB的活化。為了確定辣椒素是否直接修飾NF-кB蛋白,使DNA與以下兩種抽提物一起培育并進行電泳遷移率變動分析(1)受辣椒素作用的細胞的經(jīng)脫氧膽酸處理過的細胞質(zhì)抽提物(圖11B)和(2)在經(jīng)TNF處理后受辣椒素作用的核抽提物(圖11C)。已經(jīng)知道,用脫氧膽酸處理能解離IкBa亞基,從而釋放出NF-кB與DNA結(jié)合。圖11B和11C的結(jié)果表明,辣椒素不改變NF-кB與DNA的結(jié)合能力。因此,辣椒素通過不同于TPCK或除莠霉素A的作用機理,抑制了NF-кB活化。
實施例14辣椒素也能阻止其它試劑誘導(dǎo)的NF-кB活化NF-кB可被其它各類試劑誘導(dǎo)活化,它們包括TNF、佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯和岡田酸。然而,關(guān)于所有這些試劑導(dǎo)致NF-кB活化的途徑是否相同還不清楚。因此,測定了辣椒素對不同試劑活化NF-кB的(抑制)效果。與TNF一樣,辣椒素能完全抑制佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯誘導(dǎo)的NF-кB活化,但是只能部分地抑制通過岡田酸介導(dǎo)的活化(圖12A)。
實施例15辣椒素抑制NF-кB活化對細胞類型沒有特異性除了ML-1a細胞外,還測定了辣椒素在其它骨髓樣細胞(U-937)和上皮細胞(HeLa)中阻抑TNF介導(dǎo)的NF-кB活化的能力。圖12B中顯示了這些實驗的結(jié)果,結(jié)果表明,辣椒素能在這兩類細胞中抑制TNF誘導(dǎo)的NF-кB。在200μM時辣椒素發(fā)現(xiàn)有幾乎完全的抑制,這就說明辣椒素的這種抑制作用對細胞類型沒有特異性。
實施例16辣椒素抑制依賴于TNF的IкBa降解已經(jīng)知道,在刺激細胞時,IкBa被磷酸化并經(jīng)歷蛋白降解,從而使NF-кB轉(zhuǎn)運到細胞核中。本發(fā)明的一個目的是確定辣椒素的抑制作用是否是由于阻止了IкBa降解的緣故。用western印跡分析測定IкBa蛋白的細胞質(zhì)水平。圖13A所示的結(jié)果表明,用TNF處理細胞會使遷移較緩慢的IкBa條帶在5分鐘內(nèi)出現(xiàn),在15分鐘時完全消失(上圖)。然而,用辣椒素預(yù)處理細胞則消除了TNF介導(dǎo)的遷移較慢條帶的出現(xiàn)以及IкBa的降解(下圖)。已經(jīng)知道,遷移較慢的條帶的出現(xiàn)是由IкBa中32位和36位絲氨酸的磷酸化誘導(dǎo)而致(參見Finco等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9111884-88(1994))。
研究用辣椒素處理不同時間后的細胞胞質(zhì)中的p65和IкBa水平(圖13B)。在經(jīng)辣椒素處理過的細胞中,IкBa(上圖)和p65(下圖)的細胞質(zhì)水平保持不受影響。然而,在檢測經(jīng)辣椒素單獨處理、經(jīng)TNF和辣椒素一同處理或經(jīng)TNF單獨處理的細胞胞質(zhì)和胞核中的p65水平時,發(fā)現(xiàn)TNF誘導(dǎo)p65蛋白遷移入胞核中。辣椒素本身不誘導(dǎo)這種遷移,但是它抑制了TNF誘導(dǎo)的遷移。這些結(jié)果表明辣椒素不影響p65的水平,而是阻止了依賴于TNF的向胞核轉(zhuǎn)運的作用。除p65外,還檢測了辣椒素對Rel蛋白家族其它成員的胞質(zhì)庫的影響。圖13D的結(jié)果表明,辣椒素本身以及辣椒素與TNF的組合對p50或C-Rel蛋白的水平均沒有影響。
實施例17辣椒素阻遏了IкBa-CAT基因的表達由于IкBa基因的啟動子有NF-кB結(jié)合位點,它在NF-кB活化時受到調(diào)節(jié),在幾分鐘內(nèi)迅速地誘導(dǎo)基因表達,因此用瞬時表達試驗來測定辣椒素對與CAT基因相連的、TNF誘導(dǎo)的IкBa啟動子的影響。如所預(yù)計的,在用TNF刺激時,CAT活性幾乎提高4倍(圖14)。然而,當(dāng)轉(zhuǎn)染了pIкBCAT的細胞在TNF處理前用辣椒素預(yù)處理2小時時,TNF所增強的CAT活性明顯減少。用含突變型NF-кB結(jié)合位點的IкB啟動子(pmutIкBCAT)來轉(zhuǎn)染沒導(dǎo)致TNF誘導(dǎo)出CAT。這些結(jié)果證明了,辣椒素也能阻遏NF-кB激活劑誘導(dǎo)的基因表達。
本說明書中提及的任何專利或出版物均說明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。另外,這些專利和出版物均納入本文作參考,其程度就如各出版物具體地和單獨地納入本文作參考一樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明白,本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)本文所述的目的、結(jié)果和優(yōu)點,而且還能實現(xiàn)本文中固有的目的、結(jié)果和優(yōu)點。本文所述的這些實施例、以及方法、步驟、處理、分子和具體化合物都以較佳實施例為代表,它們是示范性的,并不意味著限制了本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作變化以及其它應(yīng)用,它們均包括在權(quán)利要求范圍所明確的本發(fā)明的宗旨內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種在體外抑制細胞內(nèi)核因子NF-κB活化的方法,該方法包括用CAPE的5,6-二羥基雙環(huán)類似物來處理所述細胞的步驟。
2.CAPE的5,6-二羥基雙環(huán)類似物在制備用來治療個體內(nèi)由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的藥物中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途,其中所述病理性病征包括中毒性休克、膿毒性休克、急性時象反應(yīng)、病毒感染、放射易感性、動脈粥樣硬化、癌癥、急性炎癥或移植物抗宿主反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過咖啡酸苯乙酯的兩種類似物來阻斷NF-κB活化的方法。另外,辣椒素(8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺)和樹脂毒素抑制了不同制劑誘導(dǎo)活化NF-κB。而且,本發(fā)明還公開了用這些抑制劑來治療因NF-κB活化引起的病理性病征(如中毒性休克、急性炎癥、急性時象反應(yīng)、動脈粥樣硬化和癌癥)的方法。
文檔編號A61K38/19GK1810958SQ200510137839
公開日2006年8月2日 申請日期1997年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月5日
發(fā)明者B·B·阿加爾瓦爾, D·格林貝格爾 申請人:研究發(fā)展基金會