專利名稱：具有佐劑活性的復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有佐劑性能的復(fù)合物。
背景技術(shù)：
對(duì)暴露在病原體中而產(chǎn)生的保護(hù)性免疫是兩種不同的免疫應(yīng)答聯(lián)合完成的。它們分別是先天性應(yīng)答和抗原特異性應(yīng)答，后者也稱作適應(yīng)性應(yīng)答。先天性免疫應(yīng)答在感染早期發(fā)揮作用，它在幾分鐘內(nèi)探測(cè)出來自侵入病原體的廣泛信號(hào)并做出應(yīng)答。相反，適應(yīng)性免疫應(yīng)答需要長(zhǎng)達(dá)兩周的時(shí)間才能發(fā)揮作用，但是它具有精確的抗原特異性，這對(duì)于完全消除病原體和產(chǎn)生免疫記憶是必需的。先天性免疫系統(tǒng)中病原體的抗原獨(dú)立識(shí)別導(dǎo)致直接動(dòng)員免疫效應(yīng)物和調(diào)控機(jī)制，提供給宿主三種重要的生存優(yōu)勢(shì)(i)迅速啟動(dòng)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并建立抗原識(shí)別所需要的炎性和共刺激環(huán)境。
(ii)在適應(yīng)性應(yīng)答成熟時(shí)期建立抑制病原體的第一道防御。
(iii)控制適應(yīng)性應(yīng)答達(dá)到免疫應(yīng)答的細(xì)胞或體液元件，這對(duì)于保護(hù)其免受特殊感染源感染是最有效的。
因此，盡管接種的全部目的都是為激活抗原的特異性免疫，但在沒有首先并有效激活先天性免疫應(yīng)答的病原體探測(cè)機(jī)制的情況下，疫苗并不能最理想地完成這一任務(wù)。
許多疫苗都包含抗原和佐劑。根據(jù)其功能，它們被廣泛定義為當(dāng)聯(lián)用時(shí)可以增強(qiáng)抗原體內(nèi)免疫原性的物質(zhì)。這樣，佐劑成為大多數(shù)成功疫苗的重要組分，特別是以包括被殺滅的病原體和/或重組抗原的隔離片段的病原體亞單位為基礎(chǔ)的疫苗。然而，由于對(duì)先天性免疫機(jī)制和抗原加工與抗原遞呈的情況認(rèn)識(shí)的增長(zhǎng)，需要有新的和更復(fù)雜的佐劑。因此，傳統(tǒng)的和新的佐劑逐漸被分成作為遞送系統(tǒng)的佐劑和作為免疫增強(qiáng)劑的佐劑。然而，遞送系統(tǒng)的主要功能是把疫苗組分集中到抗原呈遞細(xì)胞上，免疫增強(qiáng)劑則通過包括類-Toll受體的特異性受體直接激活抗原呈遞細(xì)胞。
重要的是記住，傳染原和大多數(shù)已許可的疫苗，特別地是減毒活疫苗和被殺死的全細(xì)胞疫苗制品，包含激活整個(gè)免疫應(yīng)答所需要的所有組分。這是因?yàn)樵谶@些疫苗中使用的病原體具有微粒形式的所有相關(guān)抗原，作為一個(gè)完整的細(xì)胞，也包含許多有效的免疫調(diào)節(jié)因子；即，分子模式的病原體。但是疫苗發(fā)展的趨勢(shì)是去除這些產(chǎn)物，而成為更安全和更好的確定的亞單位疫苗并作為高度純化的重組蛋白質(zhì)制造出來。不幸的是，這些重組抗原的免疫原性常常很低，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈?nèi)在的免疫增強(qiáng)活性。因此在亞單位疫苗發(fā)展中的挑戰(zhàn)是，再導(dǎo)入選擇性信號(hào)以激發(fā)先天性免疫應(yīng)答，以充分模擬自然傳染或整個(gè)病原體細(xì)胞接種的途徑。與完整細(xì)胞的疫苗相比，用于改善亞單位疫苗效能的遞送系統(tǒng)和免疫增強(qiáng)劑應(yīng)當(dāng)是低廉、更有效和更安全的。
盡管術(shù)語“遞送系統(tǒng)”和“佐劑”在與疫苗相關(guān)的領(lǐng)域一般是可互換使用的，但常常要區(qū)分它們之間明顯的區(qū)別和各自所具有的作用。所列舉的疫苗“佐劑”包括許多的微粒遞送系統(tǒng)，例如，乳劑、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物、病毒類粒子和微粒體，其作用的原理類型是促進(jìn)抗原遞送到負(fù)責(zé)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵抗原呈遞細(xì)胞上。但是，它們是較弱的免疫調(diào)節(jié)因子，因此需要加入免疫增強(qiáng)劑顯著改善它們的性能。除非另有定義，此處的術(shù)語“佐劑”代表免疫增強(qiáng)劑。作為免疫增強(qiáng)劑的新的和改良型的佐劑，其發(fā)展的主要障礙在于安全性，因?yàn)槿绻梢越邮苡糜谂R床，那么新的疫苗必須具有最低的不良反應(yīng)。因此，盡管許多佐劑已經(jīng)做過臨床前和臨床的廣泛評(píng)估，但僅有來源于鋁(一般稱作“Alum”)的佐劑在北美成功獲得作為疫苗佐劑應(yīng)用的許可。Alum在產(chǎn)生細(xì)胞毒素CD8 T細(xì)胞免疫方面是較弱的。它優(yōu)先介導(dǎo)偏重于Th2的免疫應(yīng)答，而不是偏重于Th1的免疫應(yīng)答。
盡管在動(dòng)物中使用天然的包含病原體相關(guān)性分子圖式分子作為免疫增強(qiáng)劑佐劑的觀點(diǎn)已經(jīng)得到證明，但未來的趨勢(shì)則是設(shè)計(jì)合成類似物。這主要是由于良好確定和標(biāo)準(zhǔn)化的合成免疫增強(qiáng)劑制造價(jià)格較低廉并且調(diào)節(jié)障礙較小。
正如最早在1968年報(bào)道的那樣，一些合成的聚陰離子聚合物可以保護(hù)用致死量腦膜炎病毒進(jìn)行免疫性試驗(yàn)的小鼠，并且當(dāng)其體外給予羧酸鹽共聚物或其鹽時(shí)，鼠科腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生出抑制囊狀口腔炎病毒的因子(Merigan&Finkelstein.Interferon stimulating and in vivo antiviral effects of various synthetic anionicpolymers.Virology 1968；35363-374)。
最近，報(bào)道了藻酸鹽(分離自海藻的聚合物)可以誘導(dǎo)TNF-α、IL-1和IL-6釋放(Otterlei M et al.Induction of cytokine production from human monocytesstimulated with alginate.J.Immunother.1991；10286-291)。藻酸鹽的1-4-β-甘露糖醛酸部分也可以通過CD14/類Toll受體調(diào)節(jié)機(jī)制誘導(dǎo)TNF-α從單核細(xì)胞中釋放。木質(zhì)素衍生物和墨角藻多糖也可以誘導(dǎo)TNF-α從巨噬細(xì)胞中釋放(Sorimachi K et al.Secretion of TNF-a from macrophages following induction with a ligninderivative.Cell Biol.Int.1995；19833-838；Heinzelmann et al.Modulation ofLPS-induced monocyte activation by heparn-binding protein and fucoidan.Infect.Immun.1998；66；5842-5847)。當(dāng)給豬尾猴注射時(shí)，硫酸墨角藻多糖和硫酸葡聚糖也顯示可以顯著提高IL-6、IL-8、MCP-1、M-CSF和G-CSF的循環(huán)水平(Sweeney EA等，Mobilization of stem/progenitor cells by sulphated polysaccharides does notrequire selectin presence.Proc.Natl.Acad.Sci.200；6；6544-6549)。
趨化因子是一組異源性的可誘導(dǎo)促炎趨化細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1和IL-6，包括MIP-1α和MIP-1β在內(nèi)的β-趨化因子，在單核細(xì)胞、嗜伊紅粒細(xì)胞、嗜堿型利細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中作為化學(xué)誘導(dǎo)物(LusterAD.Chemokines-chemotactic cytokinesthat mediate inflammation.New Eng.J.Med.1998；338；436-446)。將趨化因子結(jié)合到各自的受體上會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞激活的串聯(lián)過程，包括肌醇三磷酸的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放及蛋白激酶C的激活。由此，趨化因子激活了可控制趨化性的細(xì)胞機(jī)制。這樣，它們?cè)谙蚱湫罘e區(qū)域補(bǔ)充白細(xì)胞和產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。
然而，由上述聚合物導(dǎo)致的促炎細(xì)胞因子過度釋放，這意味著它們具有非常大的毒性而不能安全施用于人。因此，盡管許多聚合物都顯示出具有免疫調(diào)節(jié)的性質(zhì)，但由于它們從天然來源中分離、分離的重現(xiàn)性、實(shí)驗(yàn)室中合成型聚合物的合成及當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)聚合物的毒性等問題，它們從未被有效開發(fā)應(yīng)用于人的治療中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種復(fù)合物，包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)，或(ii)具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，或(iii)一種或多種選自抗原和免疫原的試劑。
本發(fā)明也提供一種藥物制劑，包括將本發(fā)明的復(fù)合物與藥學(xué)上適宜的載體混合或結(jié)合。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用作藥物的本發(fā)明的復(fù)合物。
本發(fā)明還提供一種復(fù)合物，用于治療病原生物感染和/或誘導(dǎo)對(duì)病原生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中該復(fù)合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要這種治療的對(duì)象中治療病原生物感染的方法，包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康膹?fù)合物，該復(fù)合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要這種治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)病原生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向?qū)ο笫┯糜行Я康膹?fù)合物，該復(fù)合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于治療癌癥的復(fù)合物，其中該復(fù)合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要這種治療的對(duì)象中治療癌癥的方法，包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康膹?fù)合物，該復(fù)合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)癌癥產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向?qū)ο笫┯糜行Я康膹?fù)合物，該復(fù)合物包括窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種復(fù)合物，包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和一種或多種選自抗原和免疫原的試劑，用于誘導(dǎo)對(duì)抗原或免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)抗原或免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向?qū)ο笫┯糜行Я康膹?fù)合物，該復(fù)合物包括窄分子量分布的聚合物和抗原或免疫原，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)一起治療病原生物感染和/或誘導(dǎo)對(duì)病原生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要這種治療的對(duì)象中治療病原生物感染的方法，包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康恼肿恿糠植嫉木酆衔锖途哂锌共≡锼幚砘钚缘奈镔|(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)病原生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向?qū)ο笫┯糜行Я康恼肿恿糠植嫉木酆衔锖途哂锌共≡锼幚砘钚缘奈镔|(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于和一種或多種選自抗原和免疫原的試劑一起誘導(dǎo)對(duì)抗原或免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要這種治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)抗原或免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康恼肿恿糠植嫉木酆衔锖涂乖蛎庖咴?，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)一起治療癌癥和/或誘導(dǎo)對(duì)癌產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要這種治療的對(duì)象中治療癌癥的方法，包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康恼肿恿糠植嫉木酆衔锖途哂锌拱┧幚砘钚缘奈镔|(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)癌產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向?qū)ο笫┯糜行Я康恼肿恿糠植嫉木酆衔锖途哂锌拱┧幚砘钚缘奈镔|(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于在疫苗的制造中作為免疫增強(qiáng)佐劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于在疫苗的制造中作為免疫增強(qiáng)佐劑，其中所述疫苗包含誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原或免疫原。
在制造疫苗的方法中，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種改進(jìn)，包括使用一種窄分子量分布的聚合物作為免疫增強(qiáng)佐劑，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
定義此處所述的術(shù)語“包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物”表示一種包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元的聚合物，例如本文所述聚合物中的一種，例如包含衍生自甲基丙烯酸或其鹽的單元的聚合物，如聚甲基丙烯酸或其鹽，例如其鈉鹽。該聚合物可以是丙烯酸的均聚物或共聚物，例如丙烯酸或甲基丙烯酸或它們的鹽。
聚合物具有窄分子量分布，具體而言多分散性為1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地說，多分散性越小越好。由此，通常優(yōu)選多分散性小于1.2。
聚合物通常具有這樣的分子量以使得存在于血液中時(shí)，在通過腎以后聚合物基本都保留在循環(huán)血液中，沒有或只有少量聚合物經(jīng)過腎小球器官的過濾。腎過濾(也稱為腎小球過濾)大分子是其一項(xiàng)功能，尤其是根據(jù)分子的大小和形狀進(jìn)行過濾，而部分也依賴于分子量。一般地，對(duì)于任意特定的聚合物，存在閾分子量或窄范圍的分子量，低于該分子量則發(fā)生腎過濾，高于該分子量則不發(fā)生或很少發(fā)生腎過濾。任意特定聚合物的閾分子量可以通過標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)例如用放射標(biāo)記聚合物來確定。
作為一般性的指導(dǎo)，該聚合物的分子量一般為例如100,000或更小，例如小于100,00，例如80,000或更小，例如75,000或更小，例如65,000或更小，例如55,000或更小，例如45,000或更小。該聚合物的分子量一般為例如4,000或更大，例如5,000或更大，例如10,000或更大，例如20,000或更大，例如30,000或更大，例如40,000或更大。該聚合物可具有如上較大分子量和較小分子量的組合范圍的分子量。例如，該范圍包括但不限于，80,000至4,000、75,000至5,000、65,000至10,000、55,000至10,000及45,000至10,000。進(jìn)一步的實(shí)例包括的范圍例如是50,000至4,000，例如40,000至25,000。一般優(yōu)選分子量范圍為45,000至10,000。
此處術(shù)語“PMAA-Na”表示聚甲基丙烯酸，鈉鹽。除非另有說明，它表示實(shí)施例A1-A4制備的聚甲基丙烯酸，鈉鹽。
此處術(shù)語“復(fù)合物”表示包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和其他所述物質(zhì)的聯(lián)合體，該聯(lián)合體各組分之間主要是非共價(jià)結(jié)合的，例如包括一種或多種離子、靜電和范德華力。盡管根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物各組分之間主要是非共價(jià)結(jié)合的，但其中也會(huì)有一些共價(jià)結(jié)合。


附圖1附圖1顯示的是在RPMI中細(xì)胞與PMAA-Na培養(yǎng)后紅細(xì)胞的溶解。
人紅細(xì)胞的2％v/v溶液與PMAA-Na(“藥物”)溶液在RPMI 1640介質(zhì)中在37℃培養(yǎng)1小時(shí)和24小時(shí)。在1小時(shí)或24小時(shí)后當(dāng)PMAA-Na濃度高達(dá)2,000μg/ml時(shí)未觀察到顯著毒性。該圖顯示了3個(gè)人類供體(A、B和C)的結(jié)果。附圖1a顯示供體A的結(jié)果，附圖1b顯示供體C的結(jié)果，附圖1c顯示供體B的結(jié)果。培養(yǎng)1小時(shí)后得到的結(jié)果如圓所示，培養(yǎng)24小時(shí)后得到的結(jié)果如菱形所示。
附圖2附圖2顯示的是在RPMI中與PMAA-Na培養(yǎng)后全血中紅細(xì)胞的溶解。
全人血(供體D)的2％v/v溶液與PMAA-Na(“藥物”)溶液在RPMI 1640介質(zhì)中培養(yǎng)。當(dāng)使用人全血的PMAA-Na濃度高達(dá)500μg/ml，在1小時(shí)(如交叉所示)、6小時(shí)(如三角形所示)或24(如圓所示)后均未觀察到顯著毒性。
附圖3附圖3顯示的是PMAA-Na對(duì)來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞(附圖3a)和人原代腹膜巨噬細(xì)胞(附圖3b)的毒性的缺失。
附圖3a顯示的是當(dāng)來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞在包含濃度為0至2,000μg/ml的PMAA-Na的介質(zhì)中培養(yǎng)所得到的結(jié)果。將細(xì)胞培養(yǎng)71小時(shí)，然后加入噻唑藍(lán)(MTT，Sigma 5mg/ml)。使用PMAA-Na的結(jié)果如閉合方塊所示，作為對(duì)照組的聚(L-賴氨酸)結(jié)果如圓所示。在MTT測(cè)定和錐蟲藍(lán)測(cè)定中當(dāng)PMAA-Na的最高濃度為2,000μg/ml時(shí)，對(duì)MDMs仍然是沒有毒性的。
附圖3b顯示的是當(dāng)人腹膜細(xì)胞在包含濃度為0至2,000μg/ml的PMAA-Na的介質(zhì)中培養(yǎng)所得到的結(jié)果。將細(xì)胞培養(yǎng)71小時(shí)，然后加入MTT。使用PMAA-Na的結(jié)果如閉合方塊所示，使用作為對(duì)照組的聚(L-賴氨酸)結(jié)果如圓所示。PMAA-Na在濃度高達(dá)500μg/ml時(shí)對(duì)腹膜巨噬細(xì)胞仍然是沒有毒性的。在濃度為500μg/ml到2,000μg/ml之間時(shí)在MTT測(cè)定和錐蟲藍(lán)測(cè)定中觀察到較小的毒性。
附圖4附圖4顯示的是在不含內(nèi)毒素的PMAA-Na的作用下MIP-1β從人腹膜巨噬細(xì)胞中釋放。
來自3個(gè)供體(A、B和C)的人腹膜巨噬細(xì)胞在不含內(nèi)毒素的PMAA-Na(500μg/ml)中培養(yǎng)，36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液，分析其中的MIP-1β。所有試劑和PMAA-Na包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml(EU/ml)。附圖4a顯示供體A的結(jié)果，附圖4b顯示供體B，附圖4c顯示供體C。在PMAA-Na存在的條件下，MIP-1β具有顯著的釋放。
附圖5附圖5顯示的是在不含內(nèi)毒素的PMAA-Na作用下TNF-α從人腹膜巨噬細(xì)胞中釋放。
來自2個(gè)供體(A和B，分別為附圖5a和5b)在不含內(nèi)毒素的PMAA-Na(500μg/ml和2,000μg/ml)中培養(yǎng)，36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液，分析其中的TNF-α。在兩種濃度的PMAA-Na存在的條件下，TNF-α具有顯著的釋放。
附圖6附圖6顯示的是在用介質(zhì)對(duì)照組或PMAA-Na培養(yǎng)的單一供體人腹膜巨噬細(xì)胞中趨化因子和細(xì)胞因子釋放。
人腹膜巨噬細(xì)胞在PMAA-Na(500μg/ml)中培養(yǎng)，36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液，分析其中的促炎癥反應(yīng)趨化因子MIP-1α、MIP-1β和IL-8以及促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6。圖中所示為取自3個(gè)不同的人類供體(A、B和C)細(xì)胞的結(jié)果。介質(zhì)對(duì)照組的結(jié)果用空白方塊表示，PMAA-Na的結(jié)果用黑方塊表示。MIP-1α的釋放如附圖6a所示，TNF-α由附圖6b表示，MIP-1β由附圖6c表示，IL-8和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β如附圖6d所示，IL-8如附圖6e所示，IL-6如附圖6f所示。所述趨化因子和細(xì)胞因子從組織抗原呈遞細(xì)胞中的釋放達(dá)到某一水平，該水平可以促進(jìn)人體的藥理學(xué)Th1應(yīng)答，而沒有高到導(dǎo)致人體有顯著的有害不良作用。
附圖7附圖7顯示的在不含內(nèi)毒素的PMAA-Na的作用下MIP-1β從來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中釋放。
來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞在濃度為100μg/ml、500μg/ml和2,000μg/ml的PMAA-Na中培養(yǎng)。來自3個(gè)不同人供體A、B和C的細(xì)胞的結(jié)果分別如附圖7a、7b和7c所示。并未觀察到MIP-1β的釋放。因此與源自基于組織體區(qū)室中巨噬細(xì)胞源的細(xì)胞相比，PMAA-Na對(duì)于來源于血單核細(xì)胞的細(xì)胞具有不同的免疫調(diào)節(jié)效果。
附圖8附圖8顯示的是在PMAA-Na而不是市售的PMAA-Na作用下MIP-1β從人腹膜巨噬細(xì)胞中釋放。
人腹膜巨噬細(xì)胞分別在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)和如本文所描述制備的PMAA-Na中培養(yǎng)。市售的PMAA-Na中的一個(gè)具有與實(shí)施例A1-A4制備的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)(即附圖中的PMAA-Na)相同的MWt。PMAA-Na在每種情況下都是500μg/ml。36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液。結(jié)果顯示沒有MIP-1β的釋放。附圖8a和8b分別顯示了兩個(gè)人供體A和B的結(jié)果。
附圖9附圖9顯示的是在PMAA-Na但不是市售的PMAA-Na作用下TNF-α從人腹膜巨噬細(xì)胞中釋放。
人腹膜巨噬細(xì)胞分別在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)和如本文所描述制備的PMAA-Na中培養(yǎng)。市售的PMAA-Na中的一個(gè)具有與我們合成制備的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)(附圖中的PMAA-Na)相同的MWt。PMAA-Na在每種情況下都是500μg/ml。36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液。結(jié)果顯示沒有TNF-α的釋放。附圖9a和9b分別顯示了兩個(gè)人類供體A和B的結(jié)果。
附圖10，11和12附圖10，11和12顯示的是在用兩性霉素B或兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物培養(yǎng)后紅細(xì)胞的溶解。
方法如附圖1所述。該對(duì)比是在臨床級(jí)兩性霉素B(ampho B，結(jié)果如空白方塊所示)和由如實(shí)施例C中所述制備的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(amphoB-PMAA-Na，結(jié)果如空白圓所示)之間做出的。用于測(cè)試化合物的母液在MGM中制備。在培養(yǎng)1小時(shí)(附圖10)、6小時(shí)(附圖11)和24小時(shí)(附圖12)后測(cè)定人紅細(xì)胞的溶解。每種情況下都使用來自3個(gè)不同供體(A、B和C)的細(xì)胞。每條線代表一個(gè)人供體的結(jié)果。
附圖10a、10b和10c分別顯示了供體A、B和C的細(xì)胞在培養(yǎng)1小時(shí)后的結(jié)果。附圖11a、11b和11c分別顯示了供體A、B和C的細(xì)胞在培養(yǎng)6小時(shí)后的結(jié)果。附圖12a、12b和12c分別顯示了供體A、B和C的細(xì)胞在培養(yǎng)24小時(shí)后的結(jié)果。
在培養(yǎng)1小時(shí)后，沒有觀察到兩性霉素B-PMAA-Na制劑的毒性。在培養(yǎng)6小時(shí)后，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于臨床級(jí)兩性霉素B的毒性。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間增加到24小時(shí)后，臨床級(jí)兩性霉素B的毒性增加到100％，但兩性霉素B-PMAA-Na制劑的毒性沒有進(jìn)一步的增加。
附圖13附圖13顯示的是在兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物培養(yǎng)后單個(gè)供體的紅細(xì)胞溶解。
方法如附圖11所述，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物如實(shí)施例C中所述制備。在濃度高至1,000μg/ml的各濃度兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(“藥物”)下培養(yǎng)1小時(shí)和24小時(shí)后測(cè)定紅細(xì)胞溶解的程度。培養(yǎng)1小時(shí)后所得到的結(jié)果如空白方塊所示，培養(yǎng)24小時(shí)后的結(jié)果如黑圓圈所示。
附圖14附圖14顯示的是在培養(yǎng)PBMN細(xì)胞1、2和6天后兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物毒性的缺失。
RPMI介質(zhì)中的PBMCs在包含兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(“藥物”)如實(shí)施例3中所述制備且濃度為0-70μg/ml。在加入MTT(5mg/ml)之前，該細(xì)胞培養(yǎng)1天或2天或6天。在培養(yǎng)1天、2天或6天后，當(dāng)化合物濃度最高70μg/ml時(shí)，其在MTT測(cè)定和錐蟲藍(lán)測(cè)定中對(duì)PBMcs仍然沒有毒性。附圖14顯示的分別是3個(gè)代表性人供體的結(jié)果。每條線表示一個(gè)供體。附圖14a、14b和14c分別顯示在培養(yǎng)1天、2天和6天后的結(jié)果。
附圖15附圖5顯示的是在培養(yǎng)來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞2和3天后兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的毒性。
來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞(MDM)在包含濃度為0-125μg/ml的化合物(“藥物”)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在加入MTT前，將細(xì)胞培養(yǎng)2天或3天。使用兩性霉素B得到的結(jié)果如空白圓所示，使用如實(shí)施例C中所述制備的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的結(jié)果如空白方塊所示。附圖15a顯示培養(yǎng)2天后的結(jié)果，附圖15b顯示培養(yǎng)2天后的結(jié)果。在培養(yǎng)2天或3天后，當(dāng)濃度都高達(dá)125μg/ml時(shí)，該化合物在MTT測(cè)定和錐蟲藍(lán)測(cè)定中其毒性都小于臨床級(jí)兩性霉素B。
附圖16附圖16顯示的是在用兩性霉素或兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物處理后墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的存活率。
用于實(shí)驗(yàn)的墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體保存在Schneider′s Drosophila生長(zhǎng)介質(zhì)(Invitrogen)中，該介質(zhì)中加入15％胎牛血清(在56℃下加熱滅活1小時(shí))和慶大霉素(1mg/100ml)。臨床級(jí)兩性霉素B對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的半數(shù)致死量(LD50)是0.14μg/ml(附圖16d)。臨床級(jí)兩性霉素B對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的90％致死量(LD90)是1.49μg/ml(附圖16d)。使用如實(shí)施例C中所述制備的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的三個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如附圖16a、16b和16c所示。兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的半數(shù)致死量(LD50)是0.10至0.19μg/ml(附圖16a、16b和16c)。兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的90％致死量(LD90)是1.02至1.49μg/ml(附圖16a、16b和16c)?；谥亓?重量，兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體具有與臨床級(jí)兩性霉素B類似的活性。
附圖17附圖17顯示的是在用兩性霉素或兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物處理后杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的存活率。
用于實(shí)驗(yàn)的杜氏利什曼原蟲前鞭毛體保存在Schneider′s生長(zhǎng)介質(zhì)199中，該介質(zhì)中加入15％胎牛血清(在56℃下加熱滅活1小時(shí))和慶大霉素(1mg/100ml)。臨床級(jí)兩性霉素B對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的半數(shù)致死量(LD50)是0.08μg/ml(附圖17d)。臨床級(jí)兩性霉素B對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的90％致死量(LD90)是1.91μg/ml(附圖17d)。使用如實(shí)施例C中所描述制備的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的三個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖17a、17b和17c所示。兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的半數(shù)致死量(LD50)是0.10至0.17μg/ml(附圖17a、17b和17c)。兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的90％致死量(LD90)是0.98至1.28μg/ml(附圖17a、17b和17c)。基于重量/重量，兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體具有與臨床級(jí)兩性霉素B類似的活性。
附圖18&19附圖18顯示的是在來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)的抑制作用。附圖19顯示了當(dāng)使用臨床級(jí)兩性霉素B或AmBiosome(脂質(zhì)體兩性霉素B，Gilead Sciences，Great Abingdon，Cambridge，UK)時(shí)相應(yīng)的抑制作用。
用墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體感染保存在RPMI 1640(Invitrogen)中的來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，該介質(zhì)中加入10％人血清(在56℃下加熱滅活1小時(shí))和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的鏈霉素。用寄生物/細(xì)胞的平均數(shù)乘以受感染細(xì)胞的百分比作為感染指數(shù)。使用如實(shí)施例C中所述制備的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的四個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖18a-18d所示。臨床級(jí)兩性霉素B的抑制作用如19a所示，AmBiosome(Gliead Sciences)如19b所示。對(duì)細(xì)胞內(nèi)墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)具有50％抑制作用時(shí)，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的劑量為0.18至0.32μg/ml(附圖18a至18d)，而臨床級(jí)兩性霉素B為0.14μg/ml(附圖19a)或Ambisome為0.45μg/ml(附圖19b)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)具有90％抑制作用時(shí)，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的劑量為1.18至1.55μg/ml(附圖18a至18d)，而臨床級(jí)兩性霉素B為0.95μg/ml(附圖19a)或Ambisome為3.89μg/ml(附圖19b)。
附圖20附圖20顯示的是兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物和AmBiosome對(duì)人巨噬細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)抑制作用的比較。
附圖20顯示了如實(shí)施例C中所述制備的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(如空白方塊所示；IC50＝0.3μg/ml)和AmBisome(脂質(zhì)體兩性霉素B，Gilead Sciences，GreatAbingdon，Cambridge，UK)(如黑圓圈所示；IC50＝1.7μg/ml)對(duì)細(xì)胞內(nèi)墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體的相對(duì)活性的斜度對(duì)比?？梢钥闯?，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的殺滅曲線比AmBisome的殺滅曲線更陡。
附圖21&22附圖21和22顯示的是在來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(4個(gè)實(shí)驗(yàn)，如附圖21a-21d所示)、臨床級(jí)兩性霉素B(附圖22a)和AmBiosome(Gilead Sciences，同上)(附圖22b)對(duì)細(xì)胞內(nèi)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)的抑制作用。
用杜氏利什曼原蟲無鞭毛體感染保存在RPMI 1640(Invitrogen)中的來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，該介質(zhì)中加入10％人血清(在56℃下加熱滅活1小時(shí))和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的鏈霉素。用寄生蟲數(shù)/細(xì)胞的平均數(shù)乘以受感染細(xì)胞的百分比作為感染指數(shù)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)具有50％抑制作用時(shí)，由如實(shí)施例C中所述制備的兩性霉素B-PMAA-Na制劑的劑量為0.30至0.71μg/ml(附圖21a至21d)，而臨床級(jí)兩性霉素B為0.54μg/ml(附圖22a)或Ambisome為1.96μg/ml(附圖22b)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)具有90％抑制作用時(shí)，由如實(shí)施例C中所述制備的兩性霉素B-PMAA-Na制劑的劑量為2.18至3.18μg/ml(附圖21a-21d)，而臨床級(jí)兩性霉素B為2.31μg/ml(附圖22a)或Ambisome為＞8μg/ml(附圖22b)。
附圖23附圖23顯示的是用不同的化合物培養(yǎng)24小時(shí)后，干擾素-γ從人腹膜巨噬細(xì)胞中釋放。
在巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)人腹膜細(xì)胞，其中該培養(yǎng)基包含所示濃度的各個(gè)化合物。所用的化合物是如實(shí)施例C中所述制備的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物、臨床級(jí)兩性霉素B、市售的PMAA-Na及如實(shí)施例A1-A4中所述制備的PMAA-Na。所有試劑和化合物包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。24小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液。用EIA(R&D系統(tǒng))測(cè)定干擾素-γ。在兩性霉素B-PMAA-Na制劑(100μg/ml)存在下Th1促進(jìn)細(xì)胞因子、干擾素-γ從腹膜巨噬細(xì)胞中的釋放顯著地高于僅有細(xì)胞的對(duì)照組、臨床級(jí)兩性霉素B、市售的PMAA-Na或PMAA-Na。
附圖24附圖24顯示的是在用結(jié)核菌素PMAA-Na復(fù)合物培養(yǎng)后細(xì)胞中PMBC的增殖。
PBMCs再懸浮于加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的鏈霉素的RPMI1640中。結(jié)核菌素PMAA-Na復(fù)合物(也稱為結(jié)核菌素PPD-PMAA-Na)如實(shí)施例L2中所述制備。由鱟變形細(xì)胞溶解物測(cè)定法(Pyrotell，Associates of CapeCod，US)測(cè)定所有試劑和化合物包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。
將細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/孔)和各個(gè)化合物(如所示濃度的結(jié)核菌素PPD和結(jié)核菌素-PMAA-Na)按一式兩份混合并在37℃/5％CO2下培養(yǎng)4天。按照1μCi/孔加入[3H]-胸苷(特定活性20-30Ci/mmol；Amersham Biosciences，UK)，再培養(yǎng)18小時(shí)。然后收集細(xì)胞并用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定其增殖。結(jié)果用平均數(shù)/分(cpm)±sem表示。
附圖24a顯示的是供體A的細(xì)胞在用結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑培養(yǎng)6天后PBMC增殖的結(jié)果。附圖24顯示了當(dāng)用1μg/ml的結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑培養(yǎng)時(shí)，T淋巴細(xì)胞的增殖顯著提高。甚至當(dāng)用10μg/ml的結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑培養(yǎng)時(shí)，T淋巴細(xì)胞的增殖會(huì)進(jìn)一步提高(P＝0.001)。
附圖24b顯示的是供體B的細(xì)胞在用結(jié)核菌素-PPD和結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑培養(yǎng)5天后PBMC增殖的結(jié)果。與用10μg/ml的結(jié)核菌素抗原相比，用10μg/ml的結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞增殖顯著提高(P＝0.002)。這表明與結(jié)核菌素抗原對(duì)其本身的作用相比，結(jié)核菌素-PMAA-Na更能顯著提高T淋巴細(xì)胞的增殖(P＝0.001)。
附圖25附圖25顯示的是用供體A的抗原刺激人PMBCs24小時(shí)IFN-γ的產(chǎn)生。
分離人PBMCs并在加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的鏈霉素的RPMI中調(diào)節(jié)為2×105個(gè)細(xì)胞/孔。所有試劑和化合物包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。PBMCs和所述化合物(結(jié)核菌素和結(jié)核菌素-PMAA-Na復(fù)合物，也稱為結(jié)核菌素PPD-PMAA-Na，如實(shí)施例L2中所述制備，濃度如圖所示)在由人干擾素-γ單克隆抗體(R&DSystems，UK)包被的ELISpot PVDF-backed微量培養(yǎng)板的孔中混合。用未受激的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，用重組人干擾素-γ作為陽性對(duì)照組。該培養(yǎng)板在37℃/5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)。然后根據(jù)廠商的說明書使微量培養(yǎng)板顯像并得到陽性斑的數(shù)目以計(jì)算干擾素-γ的量。每個(gè)斑代表一個(gè)干擾素-γ分泌細(xì)胞。
附圖25顯示了產(chǎn)生IFN-γ細(xì)胞數(shù)目。附圖25表明與單獨(dú)使用結(jié)核菌素抗原相比，結(jié)核菌素PPD-PMAA-Na制劑刺激人原代T淋巴細(xì)胞釋放干擾素的效果更加顯著。當(dāng)使用50μg/ml結(jié)核菌素PPD-PMAA-Na制劑和100μg/ml結(jié)核菌素PPD-PMAA-Na制劑時(shí)，觀察到干擾素-γ分泌物從T淋巴細(xì)胞中釋放增加。
附圖26附圖26顯示的是用臨床級(jí)兩性霉素B、AmBisome或兩性霉素B-PMAA-Na靜脈注射處理后和未處理的對(duì)照物和空白脂質(zhì)體對(duì)照組中，杜氏利什曼原蟲無鞭毛體在小鼠肝巨噬細(xì)胞中的存活率。
使用如附圖26中所示濃度的不同化合物。無鞭毛體/500肝細(xì)胞的數(shù)目用顯微鏡來計(jì)數(shù)，結(jié)果用未治療對(duì)照物的百分比來表示。相對(duì)于對(duì)照組，如實(shí)施例C中所述制備的1mg/kg兩性霉素B-PMAA-Na對(duì)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體具有顯著的殺滅活性(P＜0.0001)。該結(jié)果表明，兩性霉素B-PMAA-Na制劑在內(nèi)臟利什曼原蟲病的動(dòng)物模型中是有效的。
附圖27用MTT測(cè)定法測(cè)定的不同分子量的PMAA-Na構(gòu)造物對(duì)于紅細(xì)胞的毒性。
附圖27a-27c表明，如實(shí)施例N中所述制備的具有不同分子量的PMAA-Na構(gòu)造物對(duì)于單個(gè)供體的紅細(xì)胞的毒性的缺失。對(duì)于每種情況，PMAA-Na構(gòu)造物的濃度以μg/ml給出，而紅細(xì)胞的溶解以百分比形式給出。方塊表示PMAA-Na構(gòu)造物的分子量為19kDa時(shí)的結(jié)果，三角形表示28kDa的PMAA-Na構(gòu)造物的結(jié)果，倒三角形表示37kDa的PMAA-Na構(gòu)造物的結(jié)果(n＝3)。附圖27a顯示了在PMAA-Na構(gòu)造物培養(yǎng)1小時(shí)后紅細(xì)胞(RBCs)的溶解，附圖27b顯示了5小時(shí)后RBCs的溶解，附圖27c顯示了24小時(shí)后RBCs的溶解。在培養(yǎng)1小時(shí)、5小時(shí)和24小時(shí)后，2mg/ml的PMAA-Na構(gòu)造物都不會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解。而且該結(jié)果不受PMAA-Na構(gòu)造物分子量的影響。
附圖28用MTT測(cè)定法測(cè)定不同分子量的PMAA-Na構(gòu)造物對(duì)外周血單核細(xì)胞(PMBCs)的毒性。
在附圖28a和28b中，用如實(shí)施例N中所述制備的PMAA-Na構(gòu)造物的濃度對(duì)PMBCs的百分比來作圖。方塊表示PMAA-Na構(gòu)造物的分子量為19kDa時(shí)的結(jié)果，三角形表示28kDa的PMAA-Na構(gòu)造物的結(jié)果，圓表示37kDa的PMAA-Na構(gòu)造物的結(jié)果(n＝3)。附圖28a顯示了用PMAA-Na構(gòu)造物培養(yǎng)1天后PMBCs的存活率，附圖28b顯示了用該構(gòu)造物培養(yǎng)2天后PMBCs的存活率。在培養(yǎng)1天和2天后，濃度為2mg/ml的該構(gòu)造物對(duì)外周血單核細(xì)胞并沒有毒性。結(jié)果沒有收到所制PMAA-Na構(gòu)造物的分子量的影響。
附圖29附圖29顯示的是在不同條件下貯存，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物對(duì)紅細(xì)胞毒性的效果。
附圖29a顯示的是如實(shí)施例C中所述制備并以凍干粉末形式在4℃下貯存4個(gè)月后的PMAA-Na復(fù)合物對(duì)紅細(xì)胞(RBCs)的毒性的缺失。將不同濃度的該復(fù)合物與RBCs培養(yǎng)1小時(shí)，測(cè)定RBCs的溶解百分比。附圖29a表明，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物在以凍干粉末形式在4℃下貯存4個(gè)月后對(duì)紅細(xì)胞沒有毒性。
附圖29顯示的是如實(shí)施例C中所述制備并在4℃下在5％葡萄糖中貯存7個(gè)月后的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物與RBCs培養(yǎng)1小時(shí)后的結(jié)果。溶解率用百分比表示。用新制備的臨床級(jí)兩性霉素B為參照物作對(duì)比。培養(yǎng)進(jìn)行了1小時(shí)和6小時(shí)；培養(yǎng)1小時(shí)的結(jié)果如圖所示。附圖29表明，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物在4℃下的5％葡萄糖中貯存7個(gè)月后對(duì)紅細(xì)胞沒有毒性。
附圖30附圖30顯示的是在不同條件下貯存后兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物對(duì)利什曼原蟲無鞭毛體和前鞭毛體的抑制作用。
附圖30a顯示的是根據(jù)實(shí)施例C制備并以凍干粉末形式在4℃下貯存4個(gè)月后的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物對(duì)墨西哥利什曼原蟲細(xì)胞內(nèi)無鞭毛體生長(zhǎng)的抑制作用。用感染指數(shù)對(duì)復(fù)合物的濃度作圖。LD50為0.21μg/ml。
附圖30b顯示的是用根據(jù)實(shí)施例C制備并在4℃下在5％葡萄糖中貯存7個(gè)月后的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物在MDMs中培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)無鞭毛體2小時(shí)后，墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體的存活率。
用存活率百分?jǐn)?shù)對(duì)復(fù)合物的濃度作圖。用新制備的、臨床級(jí)兩性霉素B為參照物作對(duì)比。該復(fù)合物的LD50為0.4μg/ml，兩性霉素B的LD50為0.3μg/ml。該復(fù)合物的結(jié)果如實(shí)心方塊所示，兩性霉素B的結(jié)果如空白圓所示。
兩性霉素B-PMAA-Na的活性在以凍干粉末形式在4℃下貯存4個(gè)月后或4℃下在5％葡萄糖中貯存7個(gè)月后沒有受到影響。
附圖31附圖31顯示的是不同菌株的新型隱球菌(Cryptococcus neoforman)的抑制作用，其中該新型隱球菌感染了來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。
在使用如實(shí)施例C中所述制備的不同濃度的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(實(shí)心方塊)三天后，并用兩性霉素B為參照物(空白圓)作對(duì)比，測(cè)定其抑制作用。計(jì)算受感染和未感染的巨噬細(xì)胞的數(shù)目及革蘭氏陽性酵母CFU的數(shù)目。用CFU的平均數(shù)/受感染細(xì)胞的百分比，其結(jié)果為感染指數(shù)。由此也可以確定LD50值。
附圖31a顯示的是新型隱球菌新型變種(C.neoformans var neoformans)臨床分離物1的抑制作用，附圖31b顯示的是新型隱球菌新型變種NCPF3003的抑制作用，附圖31c顯示的是新型隱球菌gattii變種臨床分離物的抑制作用，附圖31d顯示的是新型隱球菌gattii變種臨床分離物的抑制作用。兩性霉素B的LD50(0.9-1.4μg/ml)和兩性霉素B-PMAA-Na的LD50(1.6-2.7μg/ml)相似。因此，該復(fù)合物和單獨(dú)使用兩性霉素B一樣，都具有對(duì)抗隱球菌的活性。
附圖32附圖32顯示的是不同的新型隱球菌菌株的存活率，其中該菌株感染了來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。
在使用如實(shí)施例C中所述制備的不同濃度的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(實(shí)心方塊)三天后，用兩性霉素B為參照物(空白圓)作對(duì)比，測(cè)定其存活率。
用所述生物感染來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，附圖32a顯示的是新型隱球菌新型變種NCPF 3003的結(jié)果，附圖32b顯示的是新型隱球菌新型變種臨床分離物的結(jié)果，附圖32c顯示的是新型隱球菌gattii變種NCPF 3216的結(jié)果，附圖32d顯示的是新型隱球菌gattii變種臨床分離物的結(jié)果。兩性霉素B和兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的LD50在4個(gè)實(shí)驗(yàn)中都是相似的，也類似于附圖31a-31d所示的4個(gè)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于新型隱球菌新型變種，兩性霉素B的LD50是0.9-1.4μg/ml，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的LD50與之相似，為1.6-2.7μg/ml。對(duì)于新型隱球菌gattii變種，兩性霉素B的LD50是0.06-1.0μg/ml，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的LD50與之相似，為0.1-0.5μg/ml。因此，該復(fù)合物和單獨(dú)使用兩性霉素B一樣，都具有對(duì)抗隱球菌的活性。
附圖33在用不同濃度的兩性霉素B(參照物)或兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物處理1天后，附圖33a顯示的是白色念珠菌ATCC 90028的存活率，附圖33b顯示的是光滑念珠菌ATCC 90030的存活率。
存活率用百分比來表示。用分光光度計(jì)(490nm)測(cè)定濁度以確定存活率。將對(duì)照組孔中未經(jīng)處理的酵母的光密度作為100％存活率。
對(duì)于白色念珠菌，兩性霉素的LD50(0.9-1.8μg/ml)和實(shí)施例C制備的兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的LD50(1.6-2.3μg/ml)相似(附圖33a)，而附圖33b顯示的是光滑念珠菌的結(jié)果。因此，該復(fù)合物和單獨(dú)使用兩性霉素B一樣，都具有對(duì)抗念珠菌的活性。
具體實(shí)施例方式
如上所述，本發(fā)明涉及包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物的各種用途，用于治療病原生物感染、治療癌癥、和/或作為免疫增強(qiáng)佐劑，還涉及一種復(fù)合物，包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)或(ii)具有抗癌藥理活性的物質(zhì)或(iii)一種或多種選自抗原和免疫原的試劑。
本發(fā)明基于我們?nèi)缦碌挠^察包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物可以誘導(dǎo)β-趨化因子MIP-1α和MIP-1β的釋放和干擾素-γ從人原代組織巨噬細(xì)胞即抗原呈遞細(xì)胞中釋放，而不誘導(dǎo)釋放中毒量的促炎細(xì)胞因子。該聚合物在高濃度下對(duì)人細(xì)胞也是無毒的。根據(jù)本發(fā)明所述的方法制備上述供試聚合物。不與任何理論相聯(lián)系，我們認(rèn)為上述觀察表明，包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物可以作為Th1免疫增強(qiáng)佐劑，其刺激包含類Toll受體在內(nèi)的細(xì)胞表面受體，即，作為增強(qiáng)抗原免疫刺激性質(zhì)的物質(zhì)。
我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明，包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物確實(shí)可以作為Th1免疫增強(qiáng)佐劑。所述復(fù)合物包含一種抗原(即結(jié)核菌素純蛋白衍生物BP)和如本文所述生產(chǎn)的甲基丙烯酸鈉鹽均聚物(PMAA-Na)，與比結(jié)核菌素抗原對(duì)其本身的作用相比，該復(fù)合物能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的更多地增殖，而且與單獨(dú)使用結(jié)核菌素抗原相比，它也能增加干擾素-γ分泌物從T淋巴細(xì)胞中分泌。
因此，包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物可以作為免疫增強(qiáng)佐劑與在常規(guī)疫苗中使用的抗原和/或免疫原聯(lián)合使用，例如，所需要的抗原和免疫原直接或間接來源于治療性和/或預(yù)防性疫苗所對(duì)抗的生物。這些抗原和抗體是例如來自天然源即直接來自相關(guān)生物的抗原和/或免疫原、亞單位抗原和免疫原和間接來自相關(guān)生物的由重組DNA技術(shù)和/或化學(xué)合成制備的抗原和免疫原。該聚合物可以和適當(dāng)?shù)目乖?或免疫體配制成疫苗組合物?？梢耘c遞送系統(tǒng)佐劑一樣，加入載體和賦形劑。所述聚合物和抗原和/或免疫原以本發(fā)明復(fù)合物的形式使用，或聯(lián)合使用，見下文。
用于上述疫苗中的疫苗、抗原和免疫原的例子包括但不限于，直接對(duì)抗白喉(diptheria)、破傷風(fēng)、傷寒、百日咳、麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、脊髓灰質(zhì)炎、H.流行性感冒eg b型、髓膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、霍亂、狂犬病、腦炎(各種類型)、黃熱病和流行性感冒的疫苗，抗原和免疫原用于和適合用于這些疫苗?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用這些抗原和免疫原。
但是，包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物不僅在與抗原和免疫原聯(lián)用時(shí)具有免疫增強(qiáng)的作用，而且即使不與抗原和免疫原聯(lián)用，它也能促進(jìn)對(duì)于病原生物的保護(hù)性Th1免疫應(yīng)答，例如該病原生物主要但不僅是細(xì)胞內(nèi)生物，特別是對(duì)于存在并主要保持在巨噬細(xì)胞源的細(xì)胞和/或包括樹突細(xì)胞在內(nèi)的其他抗原呈遞細(xì)胞的生物的保護(hù)性Th1免疫應(yīng)答。可以通過施用本發(fā)明該聚合物和具有抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)(這里稱做“藥物”)來完成，例如，該病原生物主要但不僅是細(xì)胞內(nèi)生物，特別是存在并主要保持在巨噬細(xì)胞源的細(xì)胞和/或包括樹突細(xì)胞在內(nèi)的其他抗原呈遞細(xì)胞的生物，該物質(zhì)尤其可以殺滅或以其他方式分裂上述的生物。生物的殺滅或分裂導(dǎo)致抗原物質(zhì)的釋放。該聚合物的存在能夠加強(qiáng)對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答，因?yàn)檫M(jìn)入到該已發(fā)生變化的細(xì)胞環(huán)境中的樹突細(xì)胞能吸收并處理釋放的抗原。然后樹突細(xì)胞引發(fā)CD4+T細(xì)胞激活，促進(jìn)產(chǎn)生效應(yīng)子細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。上述效應(yīng)中的某些能直接治療性抵抗在殘余的慢性受感染細(xì)胞中的任何生物和在這些細(xì)胞環(huán)境中的生物。對(duì)于未來再感染，其他效應(yīng)子細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答也能提供基于疫苗的保護(hù)性應(yīng)答。由此可以實(shí)現(xiàn)藥理學(xué)治療、治療性接種和保護(hù)性接種。
因此，本發(fā)明也涉及包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物，用于和具有抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)聯(lián)用，治療病原生物感染和/或誘導(dǎo)對(duì)于病原生物的免疫應(yīng)答。本發(fā)明也涉及一種在需要這種治療的對(duì)象中治療病原生物感染和/或誘導(dǎo)對(duì)于病原生物的免疫應(yīng)答的方法，包括向?qū)ο笫┯冒苌员┧峄蚱潲}單元的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)。
該聚合物和藥理活性物質(zhì)優(yōu)選是本發(fā)明復(fù)合物的形式，或者可選擇地，它們可以聯(lián)用，見下文。
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的病原體主要是在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或存留的那些，特別是在基于組織的巨噬細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或存留的那些，例如樹突細(xì)胞。這些生物和由這些生物導(dǎo)致的疾病和病癥如下列所示a)導(dǎo)致下列疾病和病癥的生物淺部真菌病，包括癬菌?。话_；鵝口瘡；馬拉色菌感染，包括變色糠疹、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性(seborrhoeic)皮炎和柱頂孢霉感染(Scytalidium infection)；耳真菌?。缓徒悄ふ婢?。
b)導(dǎo)致侵入性和慢性真菌感染的念珠菌物種，包括白色念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌；曲霉物種，包括煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉；新型隱球菌；毛霉菌病，例如，由犁頭霉、根霉和根毛霉物種所導(dǎo)致；鐮刀菌類；毛孢子菌物種；芽生菌??；孢子絲菌物種；側(cè)孢霉物種；組織胞漿菌病，例如由莢膜組織胞漿菌莢膜變種(Histoplasmacapsulatum var.capsulatum)所導(dǎo)致；非洲組織胞漿菌病，例如由莢膜組織胞漿菌杜氏變種所導(dǎo)致；芽生菌病，例如由皮炎芽生菌所導(dǎo)致；球孢子菌病，例如由粗球孢子菌所導(dǎo)致；類球孢子菌病，例如由巴西類球孢子菌所導(dǎo)致；和由馬內(nèi)菲青霉導(dǎo)致的感染。
c)導(dǎo)致分枝桿菌病的生物，例如，由諸如結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌的分枝桿菌科成員導(dǎo)致的肺結(jié)核和麻風(fēng)病。
d)可導(dǎo)致血吸蟲病的血吸蟲科成員，例如埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲、日本血吸蟲、間插血吸蟲及湄公血吸蟲。
e)導(dǎo)致傷寒和副傷寒的生物，例如A、B、C和D血清型沙門菌科成員。
f)導(dǎo)致弓形體病的生物，例如鼠弓形體。
g)導(dǎo)致人非洲錐蟲病的生物，例如布氏岡比亞錐蟲或布氏岡比亞錐蟲。
h)導(dǎo)致美洲錐蟲病的生物，例如，克氏錐蟲。
i)導(dǎo)致瘧疾的生物，例如惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲。
j)導(dǎo)致HIV和HTLV感染的生物，例如HIV-1、HIV-2、HTLV-I和HTLV-II。
k)導(dǎo)致卡氏肺囊蟲感染的生物。
l)導(dǎo)致利什曼原蟲病的生物，例如內(nèi)臟型的，如黑熱病(kala azar)，或者表皮型的，如杜氏利什曼原蟲病和墨西哥利什曼原蟲病。
用于治療這些疾病和病癥的藥理活性物質(zhì)(藥物)是本領(lǐng)域眾所周知的，例如參見Principles and Practice of Infectious Diseases，Mandell G.L，Bennett J.E.，&Dolin R著，第5版，Churchill Livingstone.(2000)，Manson′s Tropical Diseases，Cook&Zumla著，第21版，Saunders.(2003)，及其他已經(jīng)開發(fā)出來的藥物。
這些具有對(duì)抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)的例子包括但不限于克霉唑、5-氟胞嘧啶、氟康唑、灰黃霉素、依曲康唑、酮康唑、咪康唑、吡嗪酰氨、環(huán)丙沙星、利福平、氨硫脲、環(huán)絲氨酸、氯法齊明、氨苯砜、rothionamide、美曲磷脂、羥氨喹、吡喹酮、聯(lián)用型復(fù)方新諾明、乙氨嘧啶、磺氨多辛、螺旋霉素、美拉胂醇、硝呋替莫、氨酚喹、氯奎甲氟喹、甲氟喹、伯氨喹、氯胍、奎寧、疊氮胸苷、依法韋倫、印地那韋、病毒唑、阿糖腺苷、左旋咪唑及阿昔洛韋。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的用途，治療不需要是完全成功的，即對(duì)生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答來治療對(duì)象或完全清除該生物，可以提供有效的“第二線”防御。效應(yīng)子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生可以清除所有殘留的生物，因?yàn)樗鼈儗⒅苯又委熈粼诼允芨腥炯?xì)胞中的生物。必須要?dú)缫恍┥铮虼丝梢葬尫懦隹乖?。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于即使該治療不能完全清除這些生物，但對(duì)于未來再感染，效應(yīng)子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)作用仍可以提供基于保護(hù)性疫苗的應(yīng)答。由此可以實(shí)現(xiàn)藥理學(xué)治療、治療性接種和保護(hù)性接種。
相同的考慮也適用于癌癥。本發(fā)明涉及復(fù)合物的用途，該復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，尤其是可以殺滅或部分殺滅或以其他方式分裂變異的、即癌變的細(xì)胞的細(xì)胞毒素劑。細(xì)胞的殺滅或分裂導(dǎo)致抗原性物質(zhì)的釋放，抗原性物質(zhì)中的一些可以被巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞當(dāng)作非自身抗原“觀察”到。該聚合物的存在能夠增強(qiáng)對(duì)于該抗原的免疫應(yīng)答，這是因?yàn)檫M(jìn)入到已發(fā)生變化的細(xì)胞環(huán)境中的樹突細(xì)胞能吸收并處理釋放的抗原。然后樹突細(xì)胞一氟CD4+細(xì)胞激活，該激活能促進(jìn)效應(yīng)子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生。上述應(yīng)答中的某一些能直接治療其他癌細(xì)胞并以此對(duì)于癌復(fù)發(fā)和任何其他的殘留癌腫微小轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)提供基于保護(hù)性疫苗的應(yīng)答。這些應(yīng)答在具有大量巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的癌癥中達(dá)到最大化。尤其是在淋巴瘤和白血病中。由此可以實(shí)現(xiàn)藥理學(xué)治療、治療性接種和保護(hù)性接種。
具有抗癌藥理活性的物質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周知的，而且新的活性劑正在開發(fā)中，見例如CancerPrinciples and practice of oncology.V.T.DeVita，S Hellman&S.A.Rosenburg，Lippincott Williams&Wilkins出版，第6版，2001?？拱﹦┑睦影ǖ幌抻诎⑷岜刃?、放線菌素D、安吖啶、氮胞苷、博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、氮烯唑氨、柔紅霉素、羥基脲、美法侖、巰嘌呤、甲氨蝶呤、絲裂霉素C、米托蒽醌、tresulfan、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、crisantaspase。
如上所述，通常優(yōu)選的是，上述聚合物、具有抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)或具有抗癌藥理活性的物質(zhì)(兩者都稱為“藥物”)以本發(fā)明的復(fù)合物形式施用。經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞吸收后該復(fù)合物比單獨(dú)使用上述藥物更為有效，而且可以確定的是，上述藥物和聚合物同時(shí)存在于相同的細(xì)胞中，這樣，當(dāng)上述藥物殺滅生物并釋放出抗原時(shí)，該聚合物可以在原處等待以產(chǎn)生能夠加強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答的微環(huán)境。但是，該聚合物和藥物也可以是在相同的藥物制劑中、或在獨(dú)立的制劑中聯(lián)合使用。在后者中，一個(gè)制劑可以在另一個(gè)制劑之前施用，但一般優(yōu)選兩種制劑基本上同時(shí)施用。
一般優(yōu)選地，該聚合物和抗原和/或免疫原以本發(fā)明的復(fù)合物的形式施用。但是，該聚合物和抗原和/或免疫原也可以在在相同的藥物制劑中、或在獨(dú)立的制劑中聯(lián)合使用。在后者中，一個(gè)制劑可以在另一個(gè)制劑之前施用，但一般優(yōu)選兩種制劑基本上同時(shí)施用。
本發(fā)明的一種復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)，或(ii)具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，或(iii)一種或多種選自抗原和免疫原的試劑。
病原生物、具有對(duì)抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)、具有抗癌藥理活性的物質(zhì)、抗原和免疫原可以是例如如上所述的物質(zhì)。
本發(fā)明的復(fù)合物或包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物可以是藥物制劑的形式，其中所述制劑包含上述復(fù)合物和藥學(xué)上適宜的載體。該制劑可以是或視為常規(guī)的藥物制劑或疫苗，或兩者都是，這取決于它的組分，特別是物質(zhì)(i)、(ii)和(iii)的性質(zhì)。如果試圖用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，作為遞送系統(tǒng)佐劑，也可以含有例如明礬。
如果包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物與如上所述的物質(zhì)(i)、(ii)和(iii)聯(lián)用，而不是以所述物質(zhì)的復(fù)合物的形式施用，那么該聚合物與物質(zhì)(i)、(ii)和(iii)可以制備在相同的藥物制劑中或制備成獨(dú)立的制劑，在每種情況下都要加入藥學(xué)上適宜的載體。如果在獨(dú)立的制劑中，一個(gè)制劑可以在另一個(gè)制劑之前施用，但優(yōu)選兩種制劑基本上同時(shí)施用。
如上所述，本發(fā)明包括對(duì)于病原生物導(dǎo)致的疾病、病癥和癌癥的常規(guī)藥物治療和誘導(dǎo)對(duì)上述疾病、病癥和癌癥免疫應(yīng)答。可以理解的是，在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，優(yōu)選是治療性和/或預(yù)防性的免疫應(yīng)答。治療性免疫應(yīng)答可以幫助治療疾病或病癥。該應(yīng)答可以是短期的應(yīng)答。預(yù)防性免疫應(yīng)答提供長(zhǎng)期的保護(hù)，例如可以防止疾病或病癥復(fù)發(fā)、或繼發(fā)性感染或再感染、或癌癥微小轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生和發(fā)展。這些應(yīng)答通常稱作治療性和預(yù)防性“接種”。
包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物和具有對(duì)抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)的用途已經(jīng)在利什曼病的情況中舉例說明，所述用途包括治療由病原生物導(dǎo)致的疾病以及可同時(shí)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。利什曼病中的感染可以是內(nèi)臟型的，如黑熱病，或者表皮型的。內(nèi)臟利什曼病是一種傳播性的原蟲感染。許多年來，常規(guī)治療包括將5價(jià)銻每天一次靜脈或肌肉注射，共28天。但是，自1990年以來，在印度大規(guī)模銻治療的失敗導(dǎo)致引入了兩性霉素B脫氧膽酸鹽(AmB)作為有效的抗利什曼病藥物。通過兩性霉素B靜脈給藥，按照0.75-1mg/kg/天的劑量每天1次或更典型地為隔日給藥，共注入15-20次，獲得了97％長(zhǎng)期治愈率。上述治療的療程很長(zhǎng)，往往伴隨著較高的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和大量的花費(fèi)。結(jié)果，由于經(jīng)常伴隨不利事件的發(fā)生，常常導(dǎo)致患者不配合治療或放棄治療。
脂質(zhì)的兩性霉素B復(fù)合物在基于組織的巨噬細(xì)胞中蓄積。它們對(duì)于對(duì)抗大量在人巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)的酵母和真菌是非常有效的。據(jù)顯示，兩性霉素B的脂質(zhì)制劑對(duì)內(nèi)臟利什曼病具有較高水平的效力，當(dāng)給藥5-10天時(shí)，其治愈率大于90％。Sundar等已經(jīng)表明，短程治療，即用脂質(zhì)體兩性霉素B(AmBisome；Gilead Sciences)按照1.5mg/kg/天的劑量每天1次給藥5天，可以治愈93％的患者。在另一個(gè)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中，個(gè)體輸注總劑量5mg/kg的脂質(zhì)體兩性霉素B治愈了91％的患者。而它只有很少的不良反應(yīng)。(Sundar，S et al.Treatment of Indian visceral leishmaniasis with singleor daily infusion of low dose liposomal amphotericin Ba randomised trial.Brit.Med.J.2001，323419-422.Sundar，S.等.Single-dose liposomal amphoteri cin B inthe treatment of visceral leishmaniasis in Indiaamulticenter study.Clin.Inf.Dis.200337；800-804)。因此在印度，人們認(rèn)為單劑量脂質(zhì)體兩性霉素B療法對(duì)于治療內(nèi)臟利什曼病是安全和有效的。然而，即使是單劑量，該療法也是很昂貴的，而且其在實(shí)踐中的一個(gè)缺點(diǎn)是，脂質(zhì)的兩性霉素B在長(zhǎng)期的貯存中是不穩(wěn)定的，特別是在熱帶的高溫下，而許多的內(nèi)臟利什曼病都發(fā)生在熱帶。
在利什曼病中促進(jìn)痊愈和清除寄生蟲的免疫應(yīng)答是由干擾素γ介導(dǎo)的Th-1應(yīng)答控制的。雖然巨噬細(xì)胞可以有效地吸收利什曼原蟲，但它們不會(huì)被生物的吸收激活；因此并沒有釋放出促炎趨化因子、促炎細(xì)胞因子和干擾素γ。與巨噬細(xì)胞相反，樹突細(xì)胞可以吸收利什曼寄生蟲并使其發(fā)育成熟，然后促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)展。在動(dòng)物模型中已經(jīng)顯示，如果可以激活受感染的巨噬細(xì)胞，那么接著就可以殺滅寄生蟲。因此，兩個(gè)不同的過程，即抗原加工和細(xì)胞成熟/激活必須聯(lián)合用于有效的細(xì)胞疫苗應(yīng)答中。如微生物所表明的那樣，具有抗原性組分和樹突細(xì)胞激活/成熟組分的物質(zhì)可以促進(jìn)樹突細(xì)胞發(fā)生Th1介導(dǎo)的應(yīng)答。而脂質(zhì)的兩性霉素B制劑不具有免疫調(diào)節(jié)或佐劑的活性。
如實(shí)施例中具體所述制備根據(jù)本發(fā)明的兩性霉素B和聚(甲基丙烯酸，鈉鹽)(PMAA-Na)的復(fù)合物并進(jìn)行試驗(yàn)。該復(fù)合物顯示出具有如下獨(dú)特的性質(zhì)a)在靜脈注射給藥后，它能把兩性霉素B遞送到有效器官—肝、脾和淋巴結(jié)。這些是動(dòng)物和人被利什曼原蟲感染的主要器官。
b)當(dāng)靜脈注射給藥時(shí)，它能有效地用細(xì)胞內(nèi)遞送把兩性霉素B遞送至利什曼原蟲感染的巨噬細(xì)胞。
c)兩性霉素B-聚(甲基丙烯酸，鈉鹽)復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)利什曼原蟲無鞭毛體存活、繁殖和存留的胞內(nèi)細(xì)胞器中蓄積，可以增強(qiáng)利什曼原蟲無鞭毛體的細(xì)胞內(nèi)殺滅。
d)內(nèi)臟利什曼原蟲動(dòng)物模型的體內(nèi)研究表明，臨床級(jí)兩性霉素B、市售的脂質(zhì)體兩性霉素B制劑AmBisome、及兩性霉素B-聚(甲基丙烯酸，鈉鹽)制劑彼此之間的抗利什曼病活性并沒有顯著的不同。在內(nèi)臟利什曼病的動(dòng)物模型中，兩性霉素B-聚(甲基丙烯酸，鈉鹽)和市售的脂質(zhì)體兩性霉素B制劑AmBisome都是同樣有效的。
e)在組織巨噬細(xì)胞中，聚(甲基丙烯酸，鈉鹽)從兩性霉素B中釋放出來，然后它可以促進(jìn)P-趨化因子和干擾素γ釋放。這會(huì)產(chǎn)生局部的Th1輔助性應(yīng)答。
f)趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)的局部誘導(dǎo)作用可以促進(jìn)遺傳免疫系統(tǒng)細(xì)胞的復(fù)原和激活到其位置。其包含未成熟的樹突細(xì)胞和CD+4T淋巴細(xì)胞。上述淋巴細(xì)胞刺激巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生更多的TNF-α、IL-10和IL-6。
g)遺傳免疫系統(tǒng)的激活可以誘導(dǎo)樹突細(xì)胞成熟并從組織轉(zhuǎn)移到包含新釋放抗原的局部淋巴結(jié)中。這會(huì)誘導(dǎo)并產(chǎn)生CD+4T細(xì)胞應(yīng)答和效應(yīng)子CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
h)因此，在抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)殺滅利什曼原蟲和Th1促進(jìn)佐劑直接鄰近的利什曼原蟲抗原的繼發(fā)有效性，能夠?qū)⑹芨腥镜木奘杉?xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞疫苗。
i)由于抗原呈遞細(xì)胞近似封閉，兩性霉素B的殺滅活性會(huì)導(dǎo)致利什曼原蟲抗原的釋放，并同時(shí)對(duì)適宜的和局部的Th1趨化因子/細(xì)胞因子環(huán)境有促進(jìn)作用，因此細(xì)胞免疫應(yīng)答得到顯著的增強(qiáng)。
j)同時(shí)治愈疾病和產(chǎn)生治療性效應(yīng)子細(xì)胞免疫應(yīng)答，即對(duì)于受感染個(gè)體中的生物，接種產(chǎn)生了長(zhǎng)期保護(hù)性免疫。
k)因此可以同時(shí)完成疾病的治愈和治療性接種，而不需要其他的佐劑或其他來源的利什曼原蟲抗原。
l)單劑量治療是有效的，而不像兩性霉素B，后者一般需要15-20劑量。
m)與市售的脂質(zhì)體兩性霉素B制劑相比，該制劑更為穩(wěn)定，特別是在熱帶環(huán)境溫度較高的情況下。
n)當(dāng)使用該制劑時(shí)，人靜脈給藥常見的游離兩性霉素B毒性減少到了最小。
o)兩性霉素B和PMAA-Na形成復(fù)合物，可以避免藥物的化學(xué)衍生作用。因此，兩性霉素B對(duì)于利什曼原蟲sp.的效能并沒有改變或減弱。特別是對(duì)于兩性霉素B糖基部分的氨基，因?yàn)樵摶鶊F(tuán)在誘導(dǎo)藥物的藥理活性方面是很重要的。由于具有反應(yīng)性，其糖基部分的氨基可以作為一個(gè)共軛點(diǎn)(Conover C.D.et al.Utility of poly(ethyleneglycol)conjugation to create prodrugs of amphotericin B.Bioconjugate Chem.2003；14661-666)。
如上所述，本發(fā)明提供一種藥物制劑，包含本發(fā)明的復(fù)合物，或與藥學(xué)上適宜的載體混合或結(jié)合的包括衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物。
本發(fā)明的藥物制劑的給藥形式可以是適于靜脈、動(dòng)脈、進(jìn)入淋巴循環(huán)、進(jìn)入淋巴結(jié)、口服、腹膜、局部、向頰、直腸、皮膚表面、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、進(jìn)入關(guān)節(jié)空腔、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、或肺、直接到器官、器官周圍、注射到器官、或直接注入到器官給藥。本發(fā)明包括將根據(jù)本發(fā)明聚合物的復(fù)合物以任何的途徑給藥。本發(fā)明的藥物制劑可以是貯庫型或儲(chǔ)庫型(depot or reservoir)制劑，或是一種氣霧劑的形式。如上述或其他給藥途徑的適宜制劑是眾所周知的，參見例如E.W.Martin著的Remington′s Pharmaceutical Sciences，也可參見Wang，Y.J.and Hanson，M.A.，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，Supp.422S，1988。
本發(fā)明的復(fù)合物或包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物可以是“結(jié)合微?！?。這些微粒可以用本領(lǐng)域已知的乳化、勻化和噴霧干燥的方法制備出來。對(duì)于這些制劑的討論，可參見例如Hanes J，Cleland JL&Langer R，AdancedDrug Delivery Reviews 28(1997)97-119。包含本發(fā)明的結(jié)合微粒復(fù)合物的藥物組合物可以通過鼻或肺途徑粘膜給藥、吸入給藥、非粘膜胃腸外途徑給藥，特別是皮下或肌內(nèi)給藥。
在液體形式的本發(fā)明的藥物制劑中，聚合物的濃度可以是例如0.1-2,500μg/ml，例如1至500μg/ml。其他制劑可以包含類似量的聚合物，例如以液體制劑為基礎(chǔ)來計(jì)算。
本發(fā)明涉及包括衍生自丙烯酸或其鹽單元的窄分子量分布的聚合物，涉及包含上述聚合物和抗原或免疫原或具有抗病原生物或癌的藥理活性的物質(zhì)的復(fù)合物。該聚合物可以是包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的同聚物或共聚物，例如包含衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸的同聚物或共聚物。一些包含衍生自丙烯酸的單元的聚合物是已知的。如上所述，該聚合物一般應(yīng)具有窄分子量分布。其多分散性為例如1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地說，多分散性越小越好。因此，通常優(yōu)選多分散性小于1.2。因此，通常優(yōu)選多分散性小于1.2。
聚合物通常具有一定的分子量，使得其在血液中時(shí)，在通過腎期間或之后聚合物基本都保留在循環(huán)血液中，沒有或只有少量聚合物經(jīng)過腎小球器官的過濾。腎過濾(也稱為腎小球過濾)大分子是其一項(xiàng)功能，尤其是根據(jù)分子的大小和形狀進(jìn)行過濾，而部分也根據(jù)分子量過濾。一般地，對(duì)于任意特定的聚合物，存在閾分子量或窄范圍的分子量，低于該分子量則發(fā)生腎過濾，高于該分子量則不發(fā)生或很少發(fā)生腎過濾。任意特定聚合物的閾分子量可以通過標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，例如用放射標(biāo)記聚合物來確定。
作為一般性的指導(dǎo)，該聚合物的分子量一般為例如100,000或更小，例如小于100,00，例如80,000或更小，例如75,000或更小，例如65,000或更小，例如55,000或更小，例如45,000或更小。該聚合物的分子量一般為例如4,000或更大，例如5,000或更大，例如10,000或更大，例如20,000或更大，例如30,000或更大，例如40,000或更大。該聚合物可具有上面給出的較大分子量和較小分子量的組合范圍內(nèi)的分子量。例如，該范圍包括但不限于80,000-4,000、75,000-5,000、65,000-10,000、55,000-10,000、及45,000-10,000。進(jìn)一步的實(shí)例包括50,000-4,000的范圍，例如40,000-25,000。一般優(yōu)選分子量范圍為45,000-10,000。
一般通常需要該聚合物或復(fù)合物在循環(huán)血中保留比較適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的那樣，該適當(dāng)?shù)臅r(shí)間取決于很多因素，在復(fù)合物的情況下，包括結(jié)合到聚合物上的物質(zhì)的性質(zhì)。例如，聚合物或復(fù)合物可以在循環(huán)中保留幾個(gè)小時(shí)，例如高達(dá)24小時(shí)，例如約4-6小時(shí)乃至約24小時(shí)。
包括衍生自丙烯酸或其鹽單元的聚合物可以是包含單元(I)的聚合物 其中R選自氫和C1-C18烷基、C2-C18烯基、C7-C18芳烷基、C7-C18烷芳基、C6-C18芳基、羧酸、C2-C18烷氧基羰基、C2-C18烷氨基羰基、或任一在碳主鏈上由雜原子取代或連接有雜原子的C1-C18烷基、C2-C18烯基、C7-C18芳烷基、C7-C18烷芳基、C6-C18芳基、羧酸、C2-C18烷氧基羰基、C2-C18烷氨基羰基；R1選自氫和C1-C6烷基；及其鹽，例如其堿金屬鹽，例如其鈉鹽，或其銨鹽。
優(yōu)選R選自氫、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6芳烷基、C1-C6烷芳基、C1-C6烷基酰氨基和C1-C6烷基亞氨基。優(yōu)選R是氫或者甲基。優(yōu)選R1獨(dú)立于R，是氫或者甲基。特別地，R是氫并且R1是甲基。
包括衍生自丙烯酸或其鹽單元的嵌段共聚物可以是包含單元(II)的嵌段共聚物
其中，R、R1和R2如上述定義；R3選自C1-C18亞烷基、C2-C18亞烯基、C7-C18亞芳烷基、C7-C18亞烷芳基、C6-C18亞芳基；L是連接嵌段的二價(jià)連接體；m和n分別是1或大于1的整數(shù)。
優(yōu)選R選自氫、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6芳烷基、C1-C6烷芳基、C2-C8烷氧基羰基和C2-C8烷氨基羰基。最優(yōu)選R選自氫和甲基。
優(yōu)選R1選自氫、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或它們的異構(gòu)體。最優(yōu)選R1選自氫和甲基。
優(yōu)選R2選自鍵或包含至少一個(gè)碳原子或至少一個(gè)雜原子。
當(dāng)R2不是鍵時(shí)，R2通過二價(jià)基團(tuán)連接到CR1上，優(yōu)選包含由一個(gè)或多個(gè)雜原子取代的羰基、C1-C18亞烷基和/或C6-C18亞芳基的基團(tuán)。優(yōu)選R2包含選自C1-C6亞烷基、C6-C12亞芳基、C1-C12氧化烯基及羰基-C1-C6亞烷基的基團(tuán)。當(dāng)R2包含亞烷基時(shí)，它可以是支化的、線型的或者環(huán)狀的，被一個(gè)或多個(gè)烷基取代或者沒有取代，優(yōu)選其為亞甲基、1，2-亞乙基、1，3-亞丙基、亞己基或亞辛基。當(dāng)R2包含亞芳基時(shí)，優(yōu)選其為亞芐基、甲代亞苯基或亞二甲苯基。
優(yōu)選的是，基團(tuán)R3可以相同或不同，選自C1-C8亞烷基，優(yōu)選1，2-亞烷基和C6-C12亞芳基，最優(yōu)選是亞甲基、亞乙基、1，2-亞丙基和1，3-亞丙基。優(yōu)選所有的R3都是相同的，最優(yōu)選都是1，2-亞乙基、1，2-亞丙基。
優(yōu)選L包含由一個(gè)或多個(gè)雜原子取代或阻斷的C1-C18亞烷基或C6-C18亞芳基。優(yōu)選L包含的基團(tuán)選自C1-C6亞烷基、C6-C12亞芳基、C1-C12氧化烯基及C1-C6?；?。當(dāng)L包含包含亞烷基時(shí)，它可以是支化的、線型的或者環(huán)狀的，或者被一個(gè)或多個(gè)烷基取代或未被取代，優(yōu)選其為亞甲基、1，2-亞乙基、1，2-亞丙基、亞叔丁基、亞仲丁基、亞己基或亞辛基。當(dāng)L包含亞芳基時(shí)，優(yōu)選其為亞芐基、甲代亞苯基或亞二甲苯基。最優(yōu)選L包含-CORa，其中Ra選自C1-C6亞烷基或C6-C12亞芳基，優(yōu)選為亞甲基、1，2-亞乙基、1，2-亞丙基、1，3-亞丙基、亞叔丁基及亞仲丁基。
該聚合物可以是含有單元(I)的均聚物，或者可以是含有其它多聚體、低聚體或單體單元的共聚物或嵌段共聚物，例如包含如上述單元(II)的嵌段共聚物。例如，在均聚物、共聚物或嵌段共聚物中的其它多聚體單元可以包含丙烯酸聚合物、烯化聚合物、氨基甲酸乙酯聚合物、酰氨聚合物、多肽、多糖和酯聚合物。優(yōu)選當(dāng)該聚合物是雜聚物時(shí)，其它的多聚體組分包括聚乙二醇、聚烏頭酸或聚酯。
例如，具有單元(I)或(II)的聚合物還可以包含例如在本發(fā)明的聚合物中能夠?qū)η绑w聚合物具有增溶作用和/或能夠控制游離丙烯酸數(shù)目(并由此形成鹽基團(tuán))的單元。例如，包含單元(I)的該聚合物可以具有結(jié)構(gòu)(III)或(IV) 其中，R、R1、R2和R3、L、m和n如上述定義，R4、R5和R6獨(dú)立地分別選自與R、R1、R2相同的基團(tuán)；Q代表一個(gè)在制備聚合物的條件下不分裂或基本不分裂的基團(tuán)；p代表1或大于1的整數(shù)。如果需要，Q可以是靶向基團(tuán)，即將聚合物靶向輸送到某一類型的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞，或輸送到某一器官例如肝。
例如，Q可以選自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C7-C12芳烷基、C7-C12烷芳基、C1-C12烷氧基、C1-C12羥烷基、C1-C12烷氨基、C1-C12烷?；1-C12氨烷基或被胺、羥基或硫醇基取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、C7-C12芳烷基、C7-C12烷芳基、C1-C12烷氧基、C1-C12羥烷基、C1-C12烷氨基、C1-C12烷?；械娜我环N。優(yōu)選Q包含胺基，例如C1-C12羥烷氨基、例如2-羥丙基氨基或羥乙基氨基部分。
基團(tuán)Q可以是聚合物在液體溶液中的增溶基團(tuán)。例如該聚合物可以是水溶性的聚丙烯酰胺均聚或共聚物，優(yōu)選是聚甲基丙烯酰胺或聚乙基丙烯酰胺均聚或共聚物。此外，當(dāng)基團(tuán)Q在制備上述聚合物的條件下不分裂(或基團(tuán)Q大部分不分裂)時(shí)，基團(tuán)Q的存在能夠控制聚合物中游離丙烯酸數(shù)目(并由此形成鹽基團(tuán))。例如在前體聚合物中含Q單元相對(duì)于含離去基團(tuán)X的單元數(shù)目的比例是可以選擇的。含Q單元相對(duì)于含離去基團(tuán)X單元的數(shù)目的相對(duì)比例將會(huì)決定聚合物產(chǎn)物中丙烯酸或其鹽基團(tuán)的數(shù)目。如下文所示，該聚合物的多陰離子性質(zhì)會(huì)影響它的生物活性。因此，處理聚合物離子性質(zhì)的能力對(duì)于制備具有所需性質(zhì)的聚合物是非常有用的。
根據(jù)本發(fā)明使用的聚合物，例如本發(fā)明所形成的復(fù)合物，可以是，例如聚甲基丙烯酸，例如該丙烯酸的多分散性為例如1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地說，多分散性越小越好。因此，通常優(yōu)選多分散性小于1.2。聚合物的分子量一般如上文定義部分所述。聚甲基丙烯酸及其鹽和它們的產(chǎn)品的例子將會(huì)在下文的實(shí)施例中給出。這些聚甲基丙烯酸及其鹽在本發(fā)明的實(shí)踐中是特別有效的。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，β-趨化因子和干擾素-γ從原代組織巨噬細(xì)胞即抗原呈遞細(xì)胞中釋放，其中該釋放是由如本文所描述制備的聚丙烯酸鈉鹽(PMAA-Na)復(fù)合物誘導(dǎo)的，并未在市售的具有類似窄分子量分布的丙烯酸鈉鹽均聚物中觀察到這種釋放。所觀察到的趨化因子和細(xì)胞因子從組織巨噬細(xì)胞中釋放的不同，表明如本文所描述制備的PMAA-Na與市售的PMAA-Na的結(jié)構(gòu)不同。由于本文制備的PMAA-Na的Mn與市售的一種樣品相同(即Mn～22kg/mol)，因此免疫效果不太可能是取決于分子量的影響。PMAA-Na是一種聚陰離子。有人提出，聚陰離子的生物活性可能取決于其結(jié)構(gòu)特征，例如分子量、電荷密度及立構(gòu)規(guī)整度(Ottenbrite，R.et al.Biologicalactivity of poly(carboxylic acid)polymers.，in Polymeric Drugs，L.Donaruma and O.Vogl，Editors.1978，Academic PressNew York.p.263-304.)。不受上下文中涉及根據(jù)本發(fā)明使用的聚合物的生物活性的假定所限制，我們認(rèn)為，生物學(xué)數(shù)據(jù)表明，可能是能夠給出結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的制備方法導(dǎo)致了PMAA-Na具有所述獨(dú)特的生物活性。
本文實(shí)施例中的聚合物是聚甲基丙烯酸，鈉鹽，其制備方法包括用氫氧化鈉水解聚(N-甲丙烯?；牾啺?(PMOSu)。該方法和類似的方法特別是涉及前體聚合物水解的方法可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的所述聚合物和其它的聚合物。
例如，根據(jù)本發(fā)明的聚合物可以通過用包括利用堿性試劑水解前體聚合物的方法制備，其中堿性試劑例如是堿金屬或堿土金屬的堿，例如是鈉、鉀、銫、鈣、鎂或鋰的堿。所述堿可以是例如氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽，如氫氧化鈉。所述前體聚合物可以是PMOSu，或者其它適宜的前體聚合物，例如如下所述的前體聚合物。水解在適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行。由于前體聚合物一般是疏水性分子，因此該反應(yīng)通常在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，例如DMF、DMSO、DMPU或二甲替酰胺化合物(dimethylactamide)。該水解作用可以在溫和條件下進(jìn)行，例如在環(huán)境氣溫與氣壓和微熱條件下，例如40-60℃，例如2-16小時(shí)，或者也可以在較強(qiáng)烈的條件下進(jìn)行。
用所述方法制備的聚合物所具有的生物學(xué)活性類似于如本文所制備的PMAA-Na所顯示出來的部分或全部生物學(xué)性質(zhì)。
如在WO01/18080和在本文的實(shí)施例A4中所述，利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法特別是銅介導(dǎo)法均相聚合甲丙烯酰氧基琥珀酰亞胺來生產(chǎn)如本文所描述制備PMAA-Na中作為前體聚合物使用的POMSu，所述的制備方法對(duì)于制備根據(jù)本發(fā)明的前體聚合物和其它前體聚合物是非常有用的，但是在本發(fā)明中，不論是用這些方法制備的前體聚合物還是由這些前體聚合物制備的聚合物，都并不僅限于這些方法。
根據(jù)本發(fā)明的包含衍生自丙烯酸或其鹽單元的聚合物可以通過水解相應(yīng)的前體聚合物而制備，該前體聚合物具有在衍生自丙烯酸的單元中替換丙烯酸羧酸的氫原子的基團(tuán)，該基團(tuán)通過水解作用可以分裂從而產(chǎn)生酸，例如以溫和的水解作用分裂?？梢酝ㄟ^水解作用分裂的基團(tuán)例如是適當(dāng)?shù)碾x去基團(tuán)，例如吸電子基團(tuán)，如?；鶊F(tuán)，優(yōu)選是羧酸鹽活化的，一般選自N-琥珀酰亞胺基、五氯苯基、五氟苯基、對(duì)硝基苯基、二硝基苯基、N-苯二酰亞氨基、N-冰片基、氰甲基、吡啶基、三氯三嗪、5-氯喹啉基及咪唑基，優(yōu)選N-琥珀酰亞胺基或咪唑基，特別優(yōu)選N-琥珀酰亞胺基。該水解作用可以用堿性試劑完成，例如如上所述使用氫氧化鈉，并且水解可以在溫和條件下進(jìn)行，例如在環(huán)境氣溫與氣壓和微熱條件下，例如40-60℃，例如2-16小時(shí)。
如上述所述包含單元(I)或(II)的聚合物可以由WO01/18080所述的聚合物(“前體聚合物”)或類似的聚合物來制備，或者由WO03/059973所述的聚合物或類似的聚合物來制備。這些前體聚合物包括含有單元(Ia)的聚合物和含有單元(IIa)的聚合物 其中R、R1、R2和R3、L、m和n如上述定義，X代表離去基團(tuán)，例如吸電子基團(tuán)，如?；鶊F(tuán)，優(yōu)選是羧酸鹽活化的，一般選自N-琥珀酰亞胺基、五氯苯基、五氟苯基、對(duì)硝基苯基、二硝基苯基、N-苯二酰亞氨基、N-冰片基、氰甲基、吡啶基、三氯三嗪、5-氯喹啉基及咪唑基，優(yōu)選X代表N-琥珀酰亞胺基或咪唑基。
可以由相應(yīng)的前體聚合物(IIIa)或(IVa)來制備包含含有基團(tuán)Q的單元的聚合物，即含有單元(III)的聚合物或含有單元(IV)的聚合物
其中R、R1、R2和R3、R4、R5和R6、L、Q、X、m、n和p如上述定義。m，n和p各自代表最高為500的整數(shù)，優(yōu)選m、n和p的總和不大于約500。
可以由任意適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽淝绑w聚合物，尤其是包含離去基團(tuán)的前體聚合物，其中該離去基團(tuán)適于在水解中斷裂而得到本發(fā)明聚合物，，特別是采用能夠制備窄分子量分布的聚合物的任何方法，優(yōu)選所述窄分子量分布的聚合物的多分散性為例如1.7或更小，例如1.6或更小，例如1.5或更小，例如1.4或更小，例如1.2或更小，例如小于1.7，例如小于1.6，例如小于1.5，例如小于1.4，例如小于1.2。一般地說，多分散性越小越好。因此，通常優(yōu)選多分散性小于1.2。該聚合物通常具有如上文定義部分所述的分子量。
具有所需多分散性的前體聚合物可以由原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法得到，例如銅介導(dǎo)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法，或使用包括自由基聚合的其他方法。這些方法在WO01/18080和WO03/059973中有描述。實(shí)施例在下文給出。本發(fā)明也提供一種根據(jù)這些方法可得到的包含衍生自丙烯酸及其鹽單元的聚合物。但是，本發(fā)明并不僅限于這些方法制備的聚合物。任何適于生產(chǎn)包含含有丙烯酸原子單元的聚合物的方法都是可以使用的，特別是生產(chǎn)具有上述多分散性的聚合物的方法。
當(dāng)聚合作用是通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法完成的，那么需要使用適宜的自由基引發(fā)劑。這些引發(fā)劑通常包括烷基鹵，優(yōu)選烷基溴。晶體地，該引發(fā)劑是2-溴-2-甲基-(2-羥乙基)丙酸酯。該聚合作用也可以在包含Cu(I)復(fù)合物的聚合介質(zhì)存在的條件下實(shí)施。所述復(fù)合物通常是由螯合配位體復(fù)合的Cu(I)Br復(fù)合物。典型的介質(zhì)是Cu(I)Br(Bipy)2、Cu(I)Br(Bipy)、Cu(I)Br(五甲基二亞乙基)、Cu(I)Br[甲基]6三(2-氨乙基)胺]及Cu(I)Br(N，N，N′，N″，N-五甲基二亞乙基三胺)。
上述反應(yīng)應(yīng)當(dāng)是在適宜的溶劑中進(jìn)行的。所述溶劑一般是非質(zhì)子溶劑，例如四氫呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和環(huán)丁砜及它們的混合物。也可以選擇使用水。特別優(yōu)選的溶劑是二甲基亞砜和二甲基甲酰胺及它們的混合物。
關(guān)于本發(fā)明復(fù)合物的生物學(xué)性質(zhì)，我們發(fā)現(xiàn)，制備本發(fā)明的復(fù)合物的方法不同會(huì)影響復(fù)合物的性質(zhì)。顯然，在抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的藥理活性的物質(zhì)存在的情況下，特別是在溫和條件下，通過水解聚合物前體形成聚合物從而制備本發(fā)明的復(fù)合物，比用已經(jīng)制備好的聚合物和抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的藥理活性的物質(zhì)形成復(fù)合物更有利。
在抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的藥理活性的物質(zhì)存在的情況下水解聚合物前體一般應(yīng)當(dāng)在適宜條件下進(jìn)行，以使得抗原、免疫原或所述物質(zhì)基本不受有害影響，例如水解應(yīng)當(dāng)在溫和條件下進(jìn)行。例如，該條件能夠使抗原、免疫原或所述物質(zhì)基本不發(fā)生分解、降解或以其它方式導(dǎo)致相關(guān)活性喪失。
例如，在抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的藥理活性的物質(zhì)存在的情況下水解聚合物前體可以使用堿性試劑進(jìn)行，例如堿金屬或堿土金屬的堿，例如是鈉、鉀、銫、鈣、鎂或鋰的堿。所述堿可以是例如氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽，如氫氧化鈉。水解作用在適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行，例如有機(jī)溶劑，如DMF，、DMSO、DMPU或二甲替酰胺化合物。水解作用可以在溫和條件下進(jìn)行，例如在環(huán)境氣溫與氣壓和微熱條件下，例如40-60℃。該反應(yīng)可以進(jìn)行，例如2-16小時(shí)。
通過制備本發(fā)明的聚合物來制得復(fù)合物的方法，包括在抗原和免疫原或具有對(duì)抗病原生物或癌的藥理活性的物質(zhì)存在的情況下水解聚合物前體；例如，如上所述，作為本發(fā)明的一部分，用這種方法獲得該復(fù)合物。
我們認(rèn)為，在本發(fā)明的復(fù)合物中，聚合物與具有抗病原生物或抗原或癌的藥理活性的物質(zhì)的結(jié)合主要是非共價(jià)的(即通過離子或范德華力結(jié)合)，但是藥理活性物質(zhì)或抗原的一些分子也可以共價(jià)結(jié)合到所述聚合物上。共價(jià)結(jié)合的程度取決于藥理活性物質(zhì)或抗原的性質(zhì)和該聚合物的性質(zhì)。
如上所述，術(shù)語“復(fù)合物”表示聚合物和具有抗病原生物或抗原或癌的藥理活性的物質(zhì)之間的結(jié)合主要是非共價(jià)的，但也可以包含一些共價(jià)鍵。
本發(fā)明的復(fù)合物是具有酸性基團(tuán)的聚電解質(zhì)。根據(jù)復(fù)合物的環(huán)境，其去質(zhì)子化的程度也是不同的。本發(fā)明的復(fù)合物可以是鹽的形式。鹽可以有例如一價(jià)、二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)相反離子。一價(jià)相反離子可以是例如堿金屬離子，例如鈉或鉀離子，或銨離子。二價(jià)相反離子可以是例如堿土金屬離子，例如鈣或鎂離子。其他相反離子包括過渡金屬的離子，例如鐵、錫等?？梢源嬖谝环N以上的相反離子，并與所述聚合物相結(jié)合。此外，形成鹽的基團(tuán)數(shù)目和性質(zhì)是可以控制的，例如，通過使用適當(dāng)?shù)木酆衔锴绑w，例如，如上所述。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，由于聚合物具有酸性基團(tuán)并因此形成負(fù)電荷，那么與聚合物形成復(fù)合物的物質(zhì)或試劑一般應(yīng)當(dāng)是可以保持正電荷的，以便可通過包括源于相對(duì)電荷的靜電力的非共價(jià)作用直接形成復(fù)合物。例如，用于形成復(fù)合物的物質(zhì)或試劑可以具有堿性、陽離子或兩性離子的性質(zhì)或適合具有上述性質(zhì)。作為替代方案，可以改變聚合物的組成，特別是適當(dāng)選擇基團(tuán)Q，使得所需要的物質(zhì)或試劑可以例如與基團(tuán)Q結(jié)合形成復(fù)合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的復(fù)合物中的聚合物或與抗原或免疫原或具有抗病原生物或抗原或癌的藥理活性的物質(zhì)結(jié)合的聚合物是聚甲基丙烯酸(PMAA)或其鹽，例如，鈉鹽，其多分散性小于1.4，優(yōu)選小于1.2。該聚合物的分子量一般如上文定義部分所述。如本文實(shí)施例所述或基本如本文實(shí)施例所述，利用氫氧化鈉水解前體聚合物例如含N-琥珀酰亞胺離去基團(tuán)的前體聚合物來制備該聚合物是比較有利的。在制備聚合物的同時(shí)，用抗原和免疫原或具有抗病原生物或癌的藥理活性的物質(zhì)在原位制備復(fù)合物也是比較有利的。
本發(fā)明具體涉及一種復(fù)合物，該復(fù)合物包含具有抗病原生物例如利什曼原蟲的物質(zhì)，例如兩性霉素B；涉及一種包含上述復(fù)合物的藥物制劑，例如如上所述的藥物制劑；還涉及所述復(fù)合物在治療由病原體導(dǎo)致的疾病或病癥和/或誘導(dǎo)對(duì)上述病原體產(chǎn)生免疫應(yīng)答中的各種用途。該復(fù)合物的聚合物組分是窄分子量分布的聚合物，包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，例如如上所述的聚合物，例如上述的聚甲基丙烯酸聚合物或其鹽。
本發(fā)明具體提供一種復(fù)合物，包含兩性霉素B和上述的聚甲基丙烯酸聚合物或其鹽，尤其是如實(shí)施例中所描述制備的PMAA聚合物或其鹽；還提供一種包含上述復(fù)合物的藥物制劑，例如上述的藥物制劑。本發(fā)明還提供該復(fù)合物在治療利什曼病和/或誘導(dǎo)對(duì)導(dǎo)致利什曼病的病原體產(chǎn)生免疫應(yīng)答中的各種用途，包括如上所述完成對(duì)抗利什曼病的治療和/或預(yù)防接種。
在另一種作為替代方案的治療利什曼病和/或誘導(dǎo)對(duì)導(dǎo)致利什曼病的病原體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法中，聯(lián)合使用獨(dú)立制劑形式的本發(fā)明的聚合物和具有抗諸如利什曼原蟲的病原生物的藥理活性的物質(zhì)例如兩性霉素B，對(duì)利什曼病進(jìn)行治療性和/或預(yù)防性接種，如上所述。一個(gè)制劑可以在另一個(gè)制劑之前施用，但一般優(yōu)選兩種制劑基本上同時(shí)施用。
下面用非限制性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明。
實(shí)施例實(shí)施例A1化學(xué)合成甲基丙烯酸鈉鹽均聚物的制備通過用氫氧化鈉水解聚(N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺)(PMOSu)1來制備聚(甲基丙烯酸，鈉鹽)(PMAA-Na)2(方案1)。
首先用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)(Brocchini S.J.和Godwin A.，″Uniformmolecular weight precursors″，International Patent Publication Numbers WO01/18080A1&EP 99307152.1(March 15，2001))由甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺3(方案2)的聚合作用制備出PMOSu 1。
方案1由PMOSu 1制備PMAA-Na 2實(shí)施例2合成PMOSu1 方案2.由甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺3制備PMOSu1甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺3的合成。保持溫度低于5℃，將甲基丙烯酰氯(6.0g，57mmol)的二氯甲烷(12ml)溶液滴加到二氯甲烷(12ml)溶液中的N-羥基琥珀酰亞胺(6.6g，57mmol)中，同時(shí)加入三乙胺(5.8g，57mmol)的二氯甲烷(12ml)溶液。完成滴加后，攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，然后用碳酸氫鈉(0.1M)和水洗滌(3次)。然后分離有機(jī)相并用硫酸鎂干燥。除去溶劑獲得呈白色固體狀的產(chǎn)物，用乙酸乙酯己烷再結(jié)晶。產(chǎn)品質(zhì)量為8g，m.p.＝102℃。
(1H，500MHz，DMSO-d6)2.00(3H，s，CH3)，2.84(4H，s，(CH2)2)，6.09(1H，s，＝CH2)，6.34(1H，s，＝CH2)。
均相聚合本反應(yīng)如方案2所示。在典型的銅介導(dǎo)的聚合反應(yīng)中，DMSO為溶劑，在單體3中其優(yōu)選重量百分比為56％，將銅(I)溴(31.3mg，0.2mmol)、2-2’-二吡啶(Bpy)(68.3mg，0.4mmol)和單體3(2.00g，10.9mmol)加入到圓底燒瓶中，然后用隔膜密封。然后向該燒瓶中注入DMSO(1.3g)。微熱所得到褐色混合物直到形成溶液，然后用氬氣凈化大約5分鐘。將氬氣凈化過的DMSO(0.2g)中2-溴-2-甲基-(2-羥乙基)propaneate4(46.1ml，0.2mmol)溶液注入到上述混合物中，燒瓶在油浴中加熱到100℃。在幾分鐘后反應(yīng)混合物變成粘稠狀，加熱10-15分鐘后移開反應(yīng)混合物并迅速冷卻。加入7-8ml DMSO溶解粗產(chǎn)物混合物以分離出聚合產(chǎn)物，然后緩慢加入到丙酮(100ml)的攪拌溶液中，沉淀出呈白色固體狀的PMOSu1。在聚合物1的沉淀過程中，由于銅類和配體的溶解，丙酮溶液變成了綠色。原子吸收分析表明，在DMF中濃度為28.0mg/ml的聚合物1，其銅的含量為0.153ppm。氧化鋁色譜法常用于銅介導(dǎo)的聚合作用以從聚合物產(chǎn)品中除去銅，聚合物1從DMSO反應(yīng)溶液中沉淀到丙酮中可以提供對(duì)氧化鋁色譜法的可行替代方案。聚合物1分離收率是1.78g(89％)。平均分子量為22,700g/mol，多分散性指數(shù)為1.20。PMOSu1的表觀分子量和分子量分布可以用與Gibson133反射指數(shù)檢測(cè)器配對(duì)的Waters Styragel HR4和HR3(7.3×300mm)柱測(cè)定，聚(甲基丙烯酸甲酯)PMAA作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，含0.1％LiCl的DMF為洗脫液。
聚合作用中使用不同比率的單體3和引發(fā)劑4可以獲得分子量不同并且窄分子量分布(MWD)的PMOSu1。這些實(shí)驗(yàn)列于表1，其反應(yīng)范圍是2-6g的甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺3。在DMSO中的均相聚合條件都是幾分鐘左右即可得到得到聚合物1(例如表1中的實(shí)驗(yàn)6是在2分鐘后完成，得到了顯著收率的窄MWD的聚合物1)。
聚合作用在80-130℃的范圍內(nèi)進(jìn)行以保持在甲基丙烯酰琥珀酰亞胺與溶劑重量比為33-91％時(shí)溶液的均勻性。優(yōu)選溶劑為DMSO，但用DMF也能獲得類似的結(jié)果。單體3與極性溶劑(DMSO或DMF)的重量比對(duì)于聚合作用的結(jié)果是關(guān)鍵性的。在DMSO中，單體3的重量比小于56％(如50和41％)將會(huì)導(dǎo)致聚合物的收率較低(分別是52％和40％)。在DMSO中，如果單體3的重量比大于60％，聚合作用的溶液會(huì)發(fā)生固化。同樣在DMF中，單體的重量濃度對(duì)于聚合作用的結(jié)果也是關(guān)鍵性的。但是，DMF的最大收率要小于DMF。當(dāng)單體3∶DMF的重量比為61％時(shí)，分離出的聚合物1的收率為50％。當(dāng)反應(yīng)在單體3的重量比為33％時(shí)進(jìn)行，將分離不出聚合物。在單體重量濃度較高(75％以上)時(shí)，反應(yīng)混合物發(fā)生固化。
表1

(a)開始時(shí)單體和引發(fā)劑濃度的比例(b)用DMSO稀釋使反應(yīng)在2.5分鐘后停止并迅速冷卻。
(B)沉淀聚合單體3的銅介導(dǎo)的聚合作用在例如THF、乙酸乙酯、甲苯和丙酮中進(jìn)行也能得到窄MWD的聚合物1。根據(jù)聚合物分子量的不同，其收率為10-95％。高達(dá)25,000g/mol的較高分子量聚合物1可以在例如THF和碳酸亞乙酯的混和溶劑系統(tǒng)中獲得。當(dāng)分子量大于10,000g/mol時(shí)，其收率有時(shí)會(huì)小于在DMSO或DMF中進(jìn)行的聚合作用。在THF中在70℃下利用0.5g單體1實(shí)施典型的銅介導(dǎo)聚合作用，反應(yīng)超過16小時(shí)，其結(jié)果列于表2。在THF反應(yīng)中的銅螯合配位體是N，N，N′，N″，N-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA)。其它的沉淀反應(yīng)列于表3，其用2-溴-2-甲基-丙酸(BMA)作為引發(fā)劑。
表2

表3

a直接過濾和洗滌產(chǎn)品b剛蒸餾過的THF實(shí)施例A3水解PMOSu1得到PMAA-Na2(方案1)將PMOSu1(1.00g，Mn＝24,800g/mol，Mw/Mn＝1.20，DMF洗脫液，PMMA標(biāo)準(zhǔn)品)溶解在DMF(5.0ml)中，然后在攪拌下滴加2M氫氧化鈉水溶液(6.0ml)使得聚合物部分沉淀。反應(yīng)器很快變熱并隨即溶液變成均勻。然后將溶液在70℃加熱24小時(shí)，之后再加入水(約50ml)。然后將該稀溶液用再生纖維素膜(MWCO2000，SpectraPor)在水中透析。冷凍干燥該透析溶液，得到白色固體產(chǎn)物PMAA-Na2(0.3g)。GPC(PBS洗脫液，PMAA-Na標(biāo)準(zhǔn)品)Mn＝22,000g/mol，Mw/Mn＝1.28；FT-IR(ATR)1675cm-1，1547cm-1，1194cm-1。
PMAA-Na2的分子量值可用于確定聚合度(DP)，以知道在衍生自1的任意聚合物中重復(fù)單元的數(shù)目。在本實(shí)施例中，PMAA-Na2的重復(fù)單元的分子量是108，樣品的DP是約203(即，22,000g/mol除于108g/mol)。這就是說，PMOSu1的DP是203，而且由于PMOSu1重復(fù)單元的分子量是183g/mol，該樣品中PMOSu1的絕對(duì)數(shù)均分子量就是37,149g/mol(即，183g/mol乘于203)。窄MWD的PMOSu1的DP為203，可以用類似的方式將其用于確定衍生自1的聚合物的絕對(duì)分子量。
實(shí)施例A4水解PMOSu1將PMOSu1(200mg，Mn＝32,200g/mol，Mw/Mn＝1.24，DMF洗脫液，PMMA標(biāo)準(zhǔn)品)溶解于DMSO(2ml)并攪拌。再向其中滴加1M氫氧化鈉水溶液(2.2ml)。通常發(fā)生部分沉淀。在加入氫氧化鈉后，立即加入水(23ml)，并將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。然后將得到的反應(yīng)溶液稀釋到44ml并用Visking透析膜(MWCO 7000，MedicellInternational)在1L水中透析24小時(shí)。透析過程中，需要換6次水。用0.2μm的過濾器過濾該透析溶液，然后冷凍干燥，獲得0.2g PMAA-Na產(chǎn)物2.GPC(三級(jí)檢波，NaNO30.2M/10％CH3CN)Mn＝35,700g/mol和Mw/Mn＝1.18)。
用1H核磁共振和傅里葉變換紅外光譜鑒別如上述制備的PMAA-Na2的每個(gè)產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)與所需要的產(chǎn)品一致。
實(shí)施例A5用AIBN進(jìn)行自由基聚合作用合成PMOSu1，然后水解得到PMAA-Na2將經(jīng)氬氣凈化的甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(3g)和AIBN(0.135g)的丙酮溶液(30.0ml)在封閉容器中50℃下加熱24小時(shí)。過濾分離所形成的白色沉淀，溶解于DMSO(6.0ml)并在快速攪拌的丙酮中再沉淀。過濾分離并真空干燥后，DMSO(4.8ml)中的一些干燥PMOSu1(0.48g)與1N氫氧化鈉(5.2ml)和水(56ml)混合。然后將得到的溶液在室溫下攪拌1小時(shí)，然后加入105ml新鮮水稀釋，再用Visking透析膜(MWCO 7000，Medicell International)在5L水中透析24小時(shí)。5L水需要換6次。用0.2μm的過濾器過濾該透析溶液，然后冷凍干燥，獲得呈固體產(chǎn)物狀的PMAA-Na2(0.56g)；Mw26,100Da，Mn15,200g/mol，Mw/Mn1.7(SEC 0.2M NaNO3水溶液/10％CH3CN，PMAA-Na標(biāo)準(zhǔn)品)實(shí)施例A6用4，4′-偶二(氰基戊酸)進(jìn)行自由基聚合作用合成PMOSu1，然后水解得到PMAA-Na2在壓力管中加入甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(0.5-1.0g)、4，4′-偶二(氰基戊酸)(15-30wt％)和溶劑(例如丙酮、新蒸餾過的THF、或者包括甲苯和碳酸亞乙酯在內(nèi)的上述溶劑的混和物)，然后密封所得到的溶液，然后用氬氣凈化15分鐘。然后將密封的燒瓶加熱到70-120℃0.25-2.5小時(shí)。實(shí)施例反應(yīng)的情況見表4。過濾并真空干燥，分離呈白色沉淀狀的PMOSu1，再用PMMA標(biāo)準(zhǔn)品在DMF中進(jìn)行GPC。
表4

實(shí)施例B合成嵌段共聚物PEG-PMOSu6和它的水解作用，獲得嵌段共聚物PEG-PMAA-Na7方案3的聚合作用和水解作用及其實(shí)例在現(xiàn)有技術(shù)中已有記載(Brocchini S.J和Godwin A，″Block Copolymers.″WO 03/059973和Pedone et al.An information richbiomedical polymer library，J.Mat.Chem.，2003，13，2825-2837)。

方案3合成嵌段共聚物PEG-PMOSu6和嵌段共聚物PEG-PMAA-Na7(A)制備大分子引發(fā)劑5用Jankova等人的方法(Macromolecules(1998)，31，538-541)制備PEG大分子引發(fā)劑5。將含三乙胺(12.5×10-3mol，1.265g，1.75ml)的15ml干燥CH2Cl2加入到裝有冷凝管、滴液漏斗、進(jìn)氣口和磁力攪拌器的250ml三頸圓底燒瓶中。在冷卻到0℃后，加入含2，2-溴代異丁酰溴化物(12.5×10-3mol，2，874g，1.55ml)的10ml CH2Cl2，再用氬氣凈化混合物。然后將含一甲氧基化封端的PEG(Mn＝2,000g/mol)(5×10-3mol，10g)的50ml CH2Cl2在氬氣存在條件下在1小時(shí)內(nèi)滴加入上述混合物。PEG事先已經(jīng)在甲苯中共沸蒸餾干燥化，真空除去殘留的甲苯。將反應(yīng)混合物的溫度升高到室溫，反應(yīng)持續(xù)18小時(shí)。過濾該溶液，將一半的溶劑真空蒸發(fā)掉，產(chǎn)品在冷醚中沉淀出來。沉淀物在無水乙醇中再結(jié)晶(在冰箱中貯存過夜)。過濾大分子引發(fā)劑5，用冷醚洗滌并真空干燥。在80ml水中溶解4g粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。將溶液的pH升高到8以水解掉多余的i-BuBr。然后用CH2Cl2(70ml)萃取該溶液。得到穩(wěn)定的乳劑，而實(shí)現(xiàn)完全的相分離需要幾個(gè)小時(shí)。真空除去溶劑。將產(chǎn)物溶解于熱EtOH中并置于冰箱中結(jié)晶。然后過濾，用醚洗滌并真空干燥。純凈的產(chǎn)品5是白色的。用H MNR光譜計(jì)算置換的程度。該方法也可以用于制備衍生自PEG 5000和PEG 10000的PEG大分子引發(fā)劑5。
(B)嵌段PEG-PMOSu6的典型制備方法將單體3(其合成見WO 01/18080)、碳酸亞乙酯和二吡啶的混合物置于用隔膜密封的管中，通入氬氣凈化5分鐘，并加入CuBr。緩慢加熱該混合物至形成溶液(深棕色)，再通入氬氣凈化30分鐘。然后PEG大分子引發(fā)劑5的碳酸亞乙酯溶液(緩慢加熱到碳酸亞乙酯和5都具有流動(dòng)性)用氬氣凈化10分鐘，其中該大分子引發(fā)劑5的量為表5所示的相對(duì)于單體的量，用經(jīng)氬氣凈化的注射器加入到該單體溶液中。將混合物置于油浴中，攪拌。將混合物暴露于空氣中、冷卻和用DMF稀釋使反應(yīng)停止。然后將溶液通過填充了氧化鋁的柱，聚合物在甲醇中沉淀出來。過濾PEG-PMOSu6沉淀物，用醚洗滌并真空干燥。得到的PEG-PMOSu6呈白色粉末狀。表5顯示了衍生自分子量為2000g/mol的PEG的大分子引發(fā)劑5發(fā)生聚合作用時(shí)聚合作用的條件、收率和分子量。
表5

1EC＝碳酸亞乙酯2凝膠滲透色譜法，以DMF為洗脫液，PMMA為標(biāo)準(zhǔn)品3反應(yīng)混合物用氬氣凈化1小時(shí)(C)合成衍生自分子量為2000g/mol的聚(乙二醇)的PEG-PMMA-Na7的詳細(xì)實(shí)施例將溴化銅(I)(31.2mg，0.2mmol)、bpy(68.4mg，0.4mmol)、N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(3.67g，20mmol)和碳酸亞乙酯(2g)加入到圓底燒瓶中，然后用隔膜密封。緩慢加熱所得到的棕色混合物直至形成溶液，然后用氬氣凈化約15分鐘。然后向該混合物中注入經(jīng)氬氣凈化過的含PEG2000-大分子引發(fā)劑5(430mg，0.2mmol)的碳酸亞乙酯(0.6g)溶液，然后在油浴中把圓底燒瓶加熱到80℃1小時(shí)。然后從熱源中移開粘稠的反應(yīng)混合物并快速冷卻。把所得到的粗聚合物產(chǎn)物溶解于DMF(8ml)中，再將所得溶液緩慢加入到攪拌中的甲醇(500ml)中，即可沉淀出白色固體狀的PEG-PMOSu6(3.8g，92％)；Mn＝37，160g.mol-1Mw/Mn＝1.32 SEC(DMF 0.1％LiCl)。1HNMR(DMSO-d6)δ1.38(br，3H，CH3)，2.42(br m，2H，CH2C)，2.78(br，4H，CH2CH2)，3.50(s，4H，OCH2CH2O)。
然后水解PEG-PMOSu6。通過向10ml圓底燒瓶?jī)?nèi)的嵌段聚合物前體(0.1g，0.54mmol)的DMF(0.5ml)攪拌溶液中緩慢滴加2M NaOH(0.6ml)來實(shí)施PEG-PMAA-Na鹽的水解。將反應(yīng)混合物在60℃加熱16個(gè)小時(shí)，再加入水(5.0ml)。然后用Visking管(MWCO 12,000-14,000)透析該稀釋溶液，冷凍干燥透析液得到白色固體產(chǎn)物PEG2000-PMAA-Na鹽(收率為95％)；Mn＝34,110g.mol-1Mw/Mn＝1.34(三級(jí)探波-SEC；NaNO30.2M/10％CH3CN)。1H-NMR(D2O)δ0.85-0.96(br s，3H，CH3)1.60，1.88(br，m，2H，CH2)和3.58(s，4H，OCH2CH2O)，該鑒別結(jié)果證明，連接PEG2000-嵌段的受阻酯鍵并未被水解。
(D)合成衍生自分子量為5000g/mol的聚(乙二醇)的PEG-PMMA-Na7的詳細(xì)實(shí)施例將溴化銅(I)(10.4mg，0.072mmol)、2，2′-二吡啶(bpy，22.6mg，0.145mmol)、N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(2.0g，10.8mmol)、PEG5000-大分子引發(fā)劑5(362mg，0.072mmol)和碳酸亞乙酯(2.362g)加入到Schlenk燒瓶中，然后用隔膜密封。用冷凍溶解法給所得到的棕色混合物除氣，然后將混合物在油浴中加熱到110℃2小時(shí)。然后從熱源中移開粘稠的反應(yīng)混合物并快速冷卻。把所得到的粗聚合物產(chǎn)物溶解于DMF(8ml)中。所得溶液緩慢加入到攪拌中的甲醇/二乙醚(2∶1v/v，300ml)中，即可沉淀出白色固體狀的PEG-PMOSu6(1.8g，76％)；Mn＝32,860g.mol-1Mw/Mn＝1.36(SEC(DMF0.1％LiCl)。1H NMR(DMSO-d6)δ1.38(br，3H，CH3)，2.42(br m，2H，CH2C)，2.78(br，4H，CH2CH2)，3.50(s，4H，OCH2CH2O)。
通過向10ml圓底燒瓶?jī)?nèi)的嵌段聚合物前體(0.1g，0.54mmol)的DMF(0.5ml)攪拌溶液中緩慢滴加2M NaOH(0.6ml)來實(shí)施PEG-PMOSu6的水解。將反應(yīng)混合物在60℃加熱16個(gè)小時(shí)，再加入水(5.0ml)。然后用Visking管(MWCO 12,000-14,000)透析該稀釋溶液，冷凍干燥透析液得到白色固體產(chǎn)物PEG 5000-PMAA-Na鹽(收率為75％)；Mn＝29,360g.mol-1Mw/Mn＝1.28(三級(jí)探波-SEC；NaNO30.2M/10％ CH3CN)。1H-NMR(D2O)δ0.87-0.97(br s，3H，CH3)1.63，1.89(br，m，2H，CH2)和3.58(s，4H，OCH2CH2O)，該鑒別結(jié)果證明，連接PEG2000-嵌段的受阻酯鍵并未被水解。
實(shí)施例C)制備兩性霉素B-PMAA-Na制劑實(shí)施例C1將聚合物PMOSu(40mg)溶解于DMSO(0.4ml)中，再把該溶液加入到包含兩性霉素B(“藥物”)(50mg)的玻璃瓶中。攪拌下向所得到的藥物混合物中滴加1M氫氧化鈉水溶液(0.44ml)。典型地，這時(shí)可以觀察到一些沉淀。在加入氫氧化鈉后立即加入水(4.7ml)，將得到的混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。然后把反應(yīng)溶液稀釋到8.8ml，再用Visking透析膜(MWCO 7000，Medicell International)在水(1L)中透析24小時(shí)。在透析期間，需要換6次水。用0.2μm的過濾器過濾該透析溶液，然后冷凍干燥，獲得0.9g黃色固體產(chǎn)物。FT-IR(ATR)1676cm-1，1568cm-1，1404cm-1，1070cm-1，1012cm-1。
該制劑中含有的藥物和聚合物可以用1H NMR和FT-IR光譜法來證實(shí)。該制劑中兩性霉素B的重量比(wt％)可以用UV光譜法在419.5nm處測(cè)定，其中用來自Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Ltd的兩性霉素B作校準(zhǔn)曲線。經(jīng)測(cè)定，實(shí)施例C1的wt％為44-48％。
在生物學(xué)評(píng)價(jià)之前，用活性碳或多粘菌素B柱處理甲基丙烯酸鈉鹽均聚物和共聚物的水溶液以除去內(nèi)毒素。用鱟變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物(LAL)測(cè)定法測(cè)定內(nèi)毒素水平，在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中使用的化合物包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。
D)甲基丙烯酸鈉鹽同聚物和共聚物在原代細(xì)胞中的細(xì)胞毒性所有的實(shí)驗(yàn)都是在人的原代細(xì)胞中完成的。
實(shí)施例D1人紅細(xì)胞在RPMI 1640中制備人紅細(xì)胞的2％v/v溶液。在RPMI 1640中制備PMAA-Na(“藥物”)的母液。用TritonX-100的1％溶液作為細(xì)胞100％溶解的陽性參照物。葡聚糖和聚-L-賴氨酸分別作為陰性和陽性對(duì)照物。抽取相同體積的樣品和紅細(xì)胞到96孔微量反應(yīng)板中并在37℃下培養(yǎng)。在1小時(shí)和24小時(shí)之后，離心每一個(gè)樣品(2,000g，10分鐘)并將上層清液加入96孔微量反應(yīng)板中。用分光光度計(jì)在490nm處測(cè)定其吸光度。溶解的程度用相對(duì)于TritonX-100導(dǎo)致的100％溶解的百分比表示。如附圖1所示，在加入濃度高達(dá)2,000μg/ml的PMAA-Na 1小時(shí)或24小時(shí)后，沒有觀察到其對(duì)于來自3個(gè)供體(A、B和C)的人紅細(xì)胞具有顯著的毒性。
實(shí)施例D2人全血在RPMI 1640中制備來自供體D的人全血的2％v/v溶液。在RPMI 1640中制備PMAA-Na(“藥物”)的母液。用TritonX-100的1％溶液作為細(xì)胞100％溶解的陽性標(biāo)準(zhǔn)物。葡聚糖和聚-L-賴氨酸分別作為陰性和陽性對(duì)照物。抽取相同體積的樣品和紅細(xì)胞到96孔微量反應(yīng)板中并在37℃培養(yǎng)。在1小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)后，每個(gè)樣品都進(jìn)行離心(500g，10分鐘)，然后將上清液加入到96孔微量反應(yīng)板中。用分光光度計(jì)在490nm處測(cè)定其吸光度。溶解的程度用其相對(duì)于TritonX-100導(dǎo)致的100％溶解的百分比表示。如附圖2所示，在加入濃度高達(dá)500μg/ml的PMAA-Na 1小時(shí)或6小時(shí)或24小時(shí)后，沒有觀察到其對(duì)于人全血具有顯著的毒性。
實(shí)施例D3a)來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞從單個(gè)供體的新鮮血液中分離單核細(xì)胞，并將其在RPMI 1640、20mML-谷氨酰胺、青霉素(200IU/ml)、鏈霉素(200μg/ml)和10％人血清中培養(yǎng)，并按照1×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度鋪到培養(yǎng)板上。在3天的粘連反應(yīng)后，單核細(xì)胞發(fā)生分化并形成來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞(MDMs)。然后向該細(xì)胞中加入包含PMAA-Na的介質(zhì)，其中PMAA-Na的濃度范圍為0-2,000μg/ml。細(xì)胞培養(yǎng)71小時(shí)后，加入噻唑藍(lán)(MTT，Sigma5mg/ml)。細(xì)胞培養(yǎng)的存活率用相對(duì)于細(xì)胞在不含任何化合物的環(huán)境中存活率的百分比表示。葡聚糖和聚(L-賴氨酸)分別作為陰性和陽性對(duì)照物。如附圖3a所示，在MTT測(cè)定和錐蟲藍(lán)測(cè)定中當(dāng)PMAA-Na的最高濃度為2,000μg/ml時(shí)，其對(duì)MDMs仍然是沒有毒性的。
b)腹膜組織巨噬細(xì)胞將人腹膜組織細(xì)胞在RPMI 1640、20mML-谷氨酰胺、10％混合供體人血清、200IU/ml青霉素和200μg/ml鏈霉素中培養(yǎng)，并將它們的密度調(diào)整到1×106個(gè)細(xì)胞/ml。然后向該細(xì)胞中加入包含PMAA-Na的介質(zhì)，其中PMAA-Na的濃度范圍為0-2,000μg/ml。細(xì)胞培養(yǎng)71小時(shí)后，加入MTT。細(xì)胞的存活率用相對(duì)于細(xì)胞在不含任何化合物的環(huán)境中存活率的百分比表示。葡聚糖和聚(L-賴氨酸)分別作為陰性和陽性對(duì)照物。PMAA-Na在濃度高達(dá)500μg/ml時(shí)對(duì)腹膜巨噬細(xì)胞仍然是沒有毒性的。如附圖3b所示，在濃度為500μg/ml到2,000μg/ml之間時(shí)在MTT測(cè)定和錐蟲藍(lán)測(cè)定中觀察到較小的毒性。
E)抗凝血?jiǎng)┗钚詫?shí)施例E1抗凝血?jiǎng)┗钚钥梢酝ㄟ^測(cè)定凝血酶時(shí)間(PT)、高領(lǐng)土部分凝血激酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原和抗-Xa活性來獲得。將該化合物溶解于磷酸鹽緩沖生理鹽水中并與血漿/巴比妥緩沖液(1∶1)按照50∶50的比例混合并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？?Xa活性可以用肝素/ml(HEP(Xa)(V/ml))的單位來表示。PMAA-Na延長(zhǎng)了APTT和TT，但對(duì)于PT卻沒有作用?？?Xa測(cè)定是陰性的。因此這些分子的抗凝血?jiǎng)┗钚圆蝗Q于“類肝素”活性，見表6。
表6

將患者的腹膜細(xì)胞與每種化合物在連續(xù)的流動(dòng)性腹膜透析(CAPD)中培養(yǎng)，36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液。用EIA(R&D系統(tǒng))測(cè)定其中的促炎趨化因子和促炎細(xì)胞因子。
實(shí)施例F1將來自3個(gè)供體(A、B和C)的腹膜細(xì)胞在PMAA-Na(500μg/ml)中培養(yǎng)，36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液，并分析其中的MIP-1β。當(dāng)利用鱟變形細(xì)胞溶解物測(cè)定法(Pyrotell，Associates of Cape Cod，US)測(cè)定時(shí)，所有試劑和PMAA-Na包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml(EU/ml)。這是對(duì)于注刺用水的歐共體標(biāo)準(zhǔn)值。如附圖4所示，在PMAA-Na存在的條件下，MIP-1β具有顯著的釋放。
實(shí)施例F2將來自2個(gè)供體(A和B)的腹膜細(xì)胞在PMAA-Na(500μg/ml和2,000μg/ml)中培養(yǎng)，36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液，并分析其中的TNF-α。所有試劑和PMAA-Na包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml(EU/ml)。如附圖5所示，在兩種濃度的PMAA-Na存在的條件下，TNF-α具有顯著的釋放。
實(shí)施例F3人腹膜巨噬細(xì)胞在PMAA-Na(500μg/ml)中培養(yǎng)，36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液，分析其中的促炎趨化因子MIP-1α、MIP-1β和IL-8和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6。所有試劑和PMAA-Na包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。附圖6所示的是取自3個(gè)不同的人類供體(A、B和C)的細(xì)胞的結(jié)果。所述趨化因子和細(xì)胞因子從組織抗原呈遞細(xì)胞中的釋放處于可以促進(jìn)人體的藥理學(xué)Th1應(yīng)答的水平，而不會(huì)高到導(dǎo)致人體有顯著的有害不良作用。
實(shí)施例F4來源于血液的單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞在濃度高達(dá)2,000μg/ml的PMAA-Na中培養(yǎng)。所有試劑和PMAA-Na包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。并未觀察到MIP-1β的釋放。附圖7所示的是取自3個(gè)不同的人類供體(A、B和C)的細(xì)胞的結(jié)果。因此與來自組織體區(qū)室中的巨噬細(xì)胞源和其他抗原呈遞細(xì)胞(如，樹突細(xì)胞)的細(xì)胞相比，PMAA-Na對(duì)于來源于血單核細(xì)胞的細(xì)胞具有不同的免疫調(diào)節(jié)效果。
G)市售的PMAA-Na缺乏Th1佐劑活性實(shí)施例G1人腹膜巨噬細(xì)胞在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)中培養(yǎng)。所有試劑和PMAA-Na包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。市售的PMAA-Na中的一個(gè)具有與我們制備的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)相同的MWt。36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液。結(jié)果顯示沒有MIP-1β的釋放。附圖8顯示了來自2個(gè)人類供體(A和B)各自的結(jié)果。
實(shí)施例G2人腹膜巨噬細(xì)胞在MWt′s(Mn＝1,300、22,100和129,000g/mol)并且窄分子量分布的市售的PMAA-Na(Polymer Standards Service，Germany)中培養(yǎng)。市售的PMAA-Na中的一個(gè)與我們制備的PMAA-Na(Mn＝22,000g/mol)具有相同的MWt。所有試劑和PMAA-Na包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。36小時(shí)后收集培養(yǎng)的上清液。結(jié)果顯示沒有TNF-α的釋放。附圖9顯示了來自2個(gè)人類供體(A和B)各自的結(jié)果。
H)兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)人原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)施例H1紅細(xì)胞方法如實(shí)施例D1所述。該對(duì)比是在臨床級(jí)兩性霉素B和兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(在附圖中都稱作“藥物”)之間做出的。供試化合物的母液在MGM中制備。在培養(yǎng)1小時(shí)(附圖10)、6小時(shí)(附圖11)和24小時(shí)(附圖12)后測(cè)定3個(gè)不同供體(A、B和C)的人紅細(xì)胞溶解。在培養(yǎng)1小時(shí)后，沒有觀察到兩性霉素B-PMAA-Na制劑的毒性。在培養(yǎng)6小時(shí)后，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于臨床級(jí)兩性霉素B的毒性。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間增加到24小時(shí)后，臨床級(jí)兩性霉素B的毒性增加到100％但兩性霉素B-PMAA-Na制劑的毒性沒有進(jìn)一步的增加。
實(shí)施例H2紅細(xì)胞
方法如實(shí)施例H1所述。在兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物(“藥物”)濃度為0至1,000μg/ml下培養(yǎng)1小時(shí)和24小時(shí)后測(cè)定紅細(xì)胞溶解的程度。結(jié)果如附圖13所示。
實(shí)施例H3外周血單核細(xì)胞將外周血單核細(xì)胞(PBMCs)按1×105個(gè)細(xì)胞的密度懸浮于RPMI介質(zhì)、10％混合供體人血清、200IU/ml青霉素和200μg/ml鏈霉素中并在37℃、5％CO2條件下在96孔組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)。然后按最終體積為100μl/孔的劑量向該細(xì)胞中加入包含濃度為0-70μg/ml兩性霉素B-PMAA-Na制劑(“藥物”)的介質(zhì)。該細(xì)胞培養(yǎng)1天或2天或6天，之后加入MTT(5mg/ml)。一小時(shí)后除去MTT溶液并加入DMSO(100μl)以溶解MTT結(jié)晶物。用平板閱讀器(Molecular Devices，Wokingham，UK)在550nm處測(cè)定光密度。細(xì)胞培養(yǎng)的存活率，用相對(duì)于細(xì)胞在不含任何化合物的環(huán)境中生長(zhǎng)的存活率百分比表示。葡聚糖和聚(L-賴氨酸)分別作為陰性和陽性對(duì)照物。在培養(yǎng)1天、2天或6天后，當(dāng)化合物濃度高達(dá)70μg/ml時(shí)，其在MTT測(cè)定和錐蟲藍(lán)測(cè)定中對(duì)外周血單核細(xì)胞仍然沒有毒性。附圖14顯示的分別是3個(gè)代表性人類供體的結(jié)果。在附圖14中每個(gè)供體的結(jié)果都用線圖來表示。
實(shí)施例H4來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞將來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞(MDM)通過密度梯度離心從單個(gè)供體的新鮮血液中分離出來并在巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MGM)中培養(yǎng)，其中該培養(yǎng)基包含RPMI介質(zhì)、20mM L-谷氨酰胺、青霉素(250IU/ml)、鏈霉素(250μg/ml)和10％人血清。它們?cè)谂囵B(yǎng)板上的密度是1×106個(gè)細(xì)胞/孔并在3天中分化成MDMs。向上述細(xì)胞中加入包含濃度為0-125μg/ml的化合物(“藥物”)的介質(zhì)。在加入MTT前，將細(xì)胞培養(yǎng)2天或3天。細(xì)胞的存活率用相對(duì)于細(xì)胞在不含任何化合物的環(huán)境中生長(zhǎng)的存活率百分比表示。葡聚糖和聚(L-賴氨酸)分別作為陰性和陽性對(duì)照物。如附圖15所示，在培養(yǎng)2天或3天后，當(dāng)濃度都高達(dá)125μg/ml時(shí)，兩性霉素B-PMAA-Na制劑在MTT測(cè)定和錐蟲藍(lán)測(cè)定中其毒性都小于臨床級(jí)兩性霉素B。
J)測(cè)定兩性霉素B-PMAA-Na制劑抗利什曼原蟲前鞭毛體的抗利什曼病活性實(shí)施例J1用于本實(shí)驗(yàn)的是墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體。將其保存在Schneider′sDrosophila生長(zhǎng)介質(zhì)(Invitrogen)中，該介質(zhì)中加入15％胎牛血清(在56℃下加熱滅活1小時(shí))和慶大霉素(1mg/100ml)。將寄生物濃度調(diào)節(jié)到2×106個(gè)寄生物/ml。將兩倍于生長(zhǎng)介質(zhì)所需的最終濃度的供試化合物二倍稀釋。然后將等體積的藥物和寄生物懸浮液在96孔培養(yǎng)板上混合，在26℃培養(yǎng)24小時(shí)。這時(shí)，加入MTT(5mg/ml)，該培養(yǎng)板在26℃下再培養(yǎng)24小時(shí)。然后離心分離(2000g，5分鐘)該培養(yǎng)板，棄去上清液，將沉淀物再懸浮于100μl DMSO中。用分光光度計(jì)在570nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果用相對(duì)于對(duì)照孔中未處理、復(fù)制的前鞭毛體OD的100％存活率的百分比表示。
臨床級(jí)兩性霉素B對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的50％致死劑量(LD50)是0.14μg/ml(附圖16插圖)。臨床級(jí)兩性霉素B對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的90％致死劑量(LD90)是1.49μg/ml(附圖16插圖)。兩性霉素B-PMAA-Na制劑的三個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如附圖16所示。兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的50％致死劑量(LD50)是0.10-0.19μg/ml(附圖16)。兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體的90％致死劑量(LD90)是1.02-1.49μg/ml(附圖16)?；谥亓?重量，兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)墨西哥利什曼原蟲前鞭毛體具有與臨床級(jí)兩性霉素B類似的活性。
實(shí)施例J2用于實(shí)驗(yàn)的是杜氏利什曼原蟲。將其保存在Schneider′s生長(zhǎng)介質(zhì)199中，該介質(zhì)中加入15％胎牛血清(在56℃下加熱滅活1小時(shí))和慶大霉素(1mg/100ml)。將寄生物濃度調(diào)節(jié)到2×106個(gè)寄生物/ml。將兩倍于生長(zhǎng)介質(zhì)所需最終濃度的供試化合物二倍稀釋。然后將等體積的藥物和寄生物懸浮液在96孔培養(yǎng)板上混合，在26℃培養(yǎng)24小時(shí)。這時(shí)，加入MTT(5mg/ml)，該培養(yǎng)板在26℃下再培養(yǎng)24小時(shí)。然后離心分離(2000g，5分鐘)該培養(yǎng)板，棄去上清液，將沉淀物再懸浮于100μl DMSO中。用分光光度計(jì)在570nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果用相對(duì)于對(duì)照孔中未處理、復(fù)制的前鞭毛體OD100％存活率的百分比表示。
臨床級(jí)兩性霉素B對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的50％致死劑量(LD50)是0.08μg/ml(附圖17插圖)。臨床級(jí)兩性霉素B對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的90％致死劑量(LD90)是1.91μg/ml(附圖17插圖)。兩性霉素B-PMAA-Na制劑的三個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如附圖17所示。兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的50％致死劑量(LD50)是0.10-0.17μg/ml(附圖17)。兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的90％致死劑量(LD90)是0.98-1.28μg/ml(附圖17)。基于重量/重量，兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體具有與臨床級(jí)兩性霉素B類似的活性。
K)測(cè)定兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)抗利什曼原蟲無鞭毛體的抗利什曼病活性實(shí)施例K1用墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體感染來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，該巨噬細(xì)胞保存在RPMI 1640(Invitrogen)中，該介質(zhì)中加入10％人血清(在56℃下加熱滅活1小時(shí))和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的鏈霉素。將該細(xì)胞按106個(gè)細(xì)胞/ml轉(zhuǎn)移到Lab-Tek腔式載波片(Nunc)上，37℃/5％CO2中培養(yǎng)3天。然后從該腔式載波片中吸出介質(zhì)，并加入等量的新鮮介質(zhì)，以調(diào)節(jié)無鞭毛體濃度使得寄生物受感染細(xì)胞的比例為5∶1。然后將細(xì)胞在32℃培養(yǎng)20小時(shí)，使巨噬細(xì)胞確實(shí)受到感染。然后從該腔式載波片中吸出介質(zhì)并用供試化合物的二倍稀釋液代替。然后將細(xì)胞在32℃培養(yǎng)72小時(shí)。用PBS洗滌后，移開該腔，干燥載波片并在甲醇中固定。然后用吉姆薩染料給每個(gè)載波片著色并在顯微鏡下檢查。共計(jì)數(shù)出250個(gè)細(xì)胞用于確定感染和未感染細(xì)胞的數(shù)目。
寄生物數(shù)/細(xì)胞的平均數(shù)乘以受感染細(xì)胞的百分比作為感染指數(shù)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)具有50％抑制作用時(shí)，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的劑量為0.18-0.32μg/ml(附圖18)，而臨床級(jí)兩性霉素B為0.14μg/ml(附圖19a)或Ambisome為0.45μg/ml(附圖19b)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)具有90％抑制作用時(shí)，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的劑量為1.18-1.55μg/ml，而臨床級(jí)兩性霉素B為0.95μg/ml或Ambisome為3.89μg/ml。
附圖19和20中的曲線坡度可以比較出臨床級(jí)兩性霉素B、(脂質(zhì)體兩性霉素B，Gilead Sciences，Great Abingdon，Cambridge，UK)和兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)于細(xì)胞內(nèi)墨西哥利什曼原蟲無鞭毛體的相對(duì)活性。它們表明，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的殺菌曲線比AmBisome的殺菌曲線更陡。
實(shí)施例K2用杜氏利什曼原蟲無鞭毛體感染來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，該巨噬細(xì)胞保存在RPMI 1640(Invitrogen)中，該介質(zhì)中加入10％人血清(在56℃下加熱滅活1小時(shí))和200IU/ml的青霉素和200μg/ml的鏈霉素。將該細(xì)胞按106個(gè)細(xì)胞/ml轉(zhuǎn)移到Lab-Tek腔式載波片(Nunc)上，37℃/5％CO2中培養(yǎng)3天。然后從該載波片中吸出介質(zhì)，并加入等量的新鮮介質(zhì)，以調(diào)節(jié)無鞭毛體濃度使得寄生物受感染細(xì)胞的比例為5∶1。然后將細(xì)胞在32℃培養(yǎng)20小時(shí)，使巨噬細(xì)胞確實(shí)受到感染。然后從該腔式載波片中吸出介質(zhì)并用供試化合物的二倍稀釋液代替。然后將細(xì)胞在32℃培養(yǎng)72小時(shí)。在用PBS洗滌后，移開該腔，干燥載波片并在甲醇中固定。然后用吉姆薩染料給每個(gè)載波片著色并在顯微鏡下檢查?？偣灿?jì)數(shù)出250個(gè)細(xì)胞用于確定感染和未感染細(xì)胞的數(shù)目。
用寄生物數(shù)/細(xì)胞的平均數(shù)乘以受感染細(xì)胞的百分比作為感染指數(shù)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)具有50％抑制作用時(shí)，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的劑量為0.30-0.71μg/ml(附圖21)，而臨床級(jí)兩性霉素B為0.54μg/ml(附圖22a)或Ambisome為1.96μg/ml(附圖22b)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體生長(zhǎng)具有90％抑制作用時(shí)，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的劑量為2.18-3.18μg/ml，而臨床級(jí)兩性霉素B為2.31μg/ml或Ambisome為＞8μg/ml。
L)干擾素-γ的釋放，兩性霉素B-PMAA-Na制劑的Th1佐劑活性實(shí)施例L1
將包含巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的人腹膜細(xì)胞在巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中該培養(yǎng)基包含各個(gè)化合物。所有試劑和化合物包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。24小時(shí)后收集上清液。用EIA測(cè)定干擾素-γ。如附圖23所示，在兩性霉素B-PMAA-Na制劑(100μg/ml)存在下Th1促進(jìn)的細(xì)胞因子、干擾素-γ從腹膜巨噬細(xì)胞中釋放顯著地高于對(duì)照組、臨床級(jí)兩性霉素B、市售的PMAA-Na或PMAA-Na。不含內(nèi)毒素的兩性霉素B-PMAA-Na制劑的干擾素-γ釋放水平能夠足于促進(jìn)人體的藥理學(xué)Th1應(yīng)答，但并沒有達(dá)到可以導(dǎo)致顯著有害副反應(yīng)的水平。
實(shí)施例L2在本部分所述的實(shí)驗(yàn)的目的是確定抗原和PMAA-Na的制劑能否也能引發(fā)Th1輔助應(yīng)答。
用如下方法制備結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑。將如實(shí)施例A1-A4制備的均聚物PMAA-Na(30mg)加入到結(jié)核菌素純蛋白衍生物BP(10ml，100,000單位/ml，Evans疫苗)中，將得到的溶液在室溫下攪拌1.5小時(shí)。然后將溶液用Visking透析膜(MWCO7000，Medicell International)在1L水中透析24小時(shí)，在此期間要更換6次水。用0.2μm的過濾器過濾該透析溶液并冷凍干燥，獲得灰白色固體產(chǎn)物(20mg)。FT-IR(ATR)1648cm-1，1545cm-1，1450cm-1，1398cm-1，1259cm-1。
然后用菲可帕克(Ficoll-Paque)將PBMCs從全血中分離出來并再懸浮于加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的鏈霉素的RPMI 1640中。在鱟變形細(xì)胞溶解物測(cè)定法(Pyrotell，Associates of Cape Cod，US)測(cè)定中，所有試劑和化合物包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。將細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/孔)和各個(gè)化合物按一式兩份混合并在37℃/5％CO2中培養(yǎng)4天。按照1μCi/孔加入[3H]-胸苷(特定活性20-30Ci/mmol；Amersham Biosciences，UK)，再培養(yǎng)18小時(shí)。然后收集細(xì)胞并用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定其增殖。結(jié)果用平均數(shù)/分(cpm)±sem表示。附圖24a顯示，當(dāng)用1μg/ml的結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑培養(yǎng)時(shí)，T淋巴細(xì)胞的增殖顯著提高。當(dāng)用10μg/ml的結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑培養(yǎng)時(shí)，T淋巴細(xì)胞的增殖會(huì)進(jìn)一步提高(P＝0.001)。
附圖24b顯示的是供體B的結(jié)果。與用10μg/ml的結(jié)核菌素抗原相比，使用10μg/ml的結(jié)核菌素-PMAA-Na制劑后，T淋巴細(xì)胞增殖顯著提高(P＝0.002)。這表明與結(jié)核菌素抗原對(duì)其本身的作用相比，結(jié)核菌素-PMAA-Na更能顯著提高T淋巴細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例L3用ELISpot測(cè)定法測(cè)定干擾素-γ分泌細(xì)胞分離人PBMCs并在加入了10％人血清和200μg/ml的青霉素和200IU/ml的鏈霉素的RPMI中調(diào)節(jié)為2×105個(gè)細(xì)胞/孔。所有試劑和化合物包含的內(nèi)毒素＜0.06內(nèi)毒素單位/ml。PBMCs和所述化合物在由人干擾素-γ單克隆抗體(R&D系統(tǒng)，UK)包被的ELISpot PVDF-backed培養(yǎng)板的孔中混合。用未受激的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，用人重組干擾素-γ作為陽性對(duì)照組。該培養(yǎng)板在37℃/5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)。然后根據(jù)廠商的說明書使培養(yǎng)板顯像并得到陽性斑的數(shù)目以計(jì)算干擾素-γ的量。每個(gè)斑代表一個(gè)干擾素-γ分泌細(xì)胞。附圖25表明與單獨(dú)使用結(jié)核菌素抗原相比，結(jié)核菌素PPD-PMAA-Na制劑刺激人原代T淋巴細(xì)胞釋放干擾素的效果更加顯著。當(dāng)使用50μg/ml結(jié)核菌素PPD-PMAA-Na制劑和100μg/ml結(jié)核菌素PPD-PMAA-Na制劑時(shí)，都可以觀察到干擾素-γ分泌物從T淋巴細(xì)胞中釋放增加。
M)在內(nèi)臟利什曼病的小鼠模型中，測(cè)定兩性霉素B-PMAA-Na制劑對(duì)于杜氏利什曼原蟲的抗利什曼病活性實(shí)施例M1從重度感染的供體金黃地鼠-Mesocrifetus auratus的脾中收集杜氏利什曼菌株(MHOM/ET/67/L82)無鞭毛體。制備包含7.5-10×107個(gè)無鞭毛體/mL的接種物。在第0天通過靜脈注射200μL(相當(dāng)于1.5-2×107無鞭毛體)感染不含特殊病原體的雌性BALB/c小鼠(20g)。第14天在顯微鏡下觀察來評(píng)價(jià)感染的結(jié)束點(diǎn)，以確定小鼠的感染水平。在第21天用后感染的吉姆薩染料給肝印模著色來確定所負(fù)荷的總寄生物數(shù)目。
根據(jù)如下的方法將下列化合物靜脈給藥
a)感染后未治療的對(duì)照物。
b)在感染后第14，16和18天的0.5mg/kg空白脂質(zhì)體。
c)在感染后第14，16和18天的8mg/kg的PMAA-Na。
d)在感染后第14，16和18天的1mg/kg臨床級(jí)兩性霉素B。
e)在感染后第14，16和18天的0.5mg/kg AmBisome。
f)在感染后第14，16和18天的0.5mg/kg兩性霉素B-PMAA-Na制劑。
g)在感染后第14，16和18天的1mg/kg兩性霉素B-PMAA-Na制劑。
h)在感染后第14，16和18天的2mg/kg兩性霉素B-PMAA-Na制劑。
每組有5只動(dòng)物。用于PMAA-Na和兩性霉素B-PMAA-Na制劑靜脈注射的載體溶液是5％葡萄糖。用0.2μL注射器式濾器過濾所有的藥物制劑。靜脈注射的量是每次注射200μL。
在治療前后分別將各組的小鼠稱重以測(cè)定毒性并記錄重量變化的比例。在感染21天(在治療完成后三天)后，用顯微鏡觀察固定于甲醇中并用10％吉姆薩染料著色的肝印模載玻片，以測(cè)定所負(fù)荷的寄生物。用顯微鏡數(shù)出無鞭毛體/500肝細(xì)胞，結(jié)果用未治療對(duì)照物的百分比表示。
附圖26顯示的是空白脂質(zhì)體和PMAA-Na不具有抗利什曼病活性。相對(duì)于對(duì)照組，臨床級(jí)兩性霉素B、Ambisome、1mg/kg兩性霉素B-PMAA-Na和2mg/kg兩性霉素B-PMAA-Na對(duì)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體具有顯著的殺滅活性(P＜0.0001)。臨床級(jí)兩性霉素B、Ambisome和兩性霉素B-PMAA-Na(2mg/kg)對(duì)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體的殺滅活性彼此之間不具有顯著差異(P＜0.05)。該結(jié)果表明，兩性霉素B-PMAA-Na制劑和Ambisome一樣，在內(nèi)臟利什曼原蟲病的動(dòng)物模型中是有效的。
實(shí)施例NPMAA-Na的合成制備不同分子量的PMAA-Na構(gòu)造物在合成PMAA-Na前體期間，如實(shí)施例A所述改變聚合反應(yīng)的條件，可以得到分子量范圍在19kD-37kD的幾種聚合物。用凝膠滲透色譜法(GPC)確定分子量和多分散性指數(shù)。
不同分子量的PMAA-Na構(gòu)造物對(duì)于人原代細(xì)胞(紅細(xì)胞溶解和外周血單核細(xì)胞(PBMCs))的毒性可以用MTT測(cè)定法來測(cè)定。如附圖27所示，在培養(yǎng)2小時(shí)、5小時(shí)和24小時(shí)后，濃度為2mg/ml的PMAA-Na構(gòu)造物不會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解。另外，如附圖28所示。在培養(yǎng)1天和2天后，濃度為2mg/ml的該物質(zhì)對(duì)于外周血單核細(xì)胞沒有毒性。上述結(jié)果不會(huì)受PMAA-Na構(gòu)造物分子量的影響而改變。
實(shí)施例O兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物在貯存期間的穩(wěn)定性冷凍干燥的兩性霉素B-PMAA-Na貯存于4℃氬氣中4個(gè)月。該物質(zhì)溶于濃度為1mg/ml的5％葡萄糖中并貯存于4℃氬氣中7個(gè)月。在此段時(shí)間結(jié)束后，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的穩(wěn)定性可以通過將其與人紅血細(xì)胞培養(yǎng)來測(cè)定。先前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物的毒性遠(yuǎn)小于兩性霉素B。因此復(fù)合物在貯存幾個(gè)月后再次進(jìn)行上述測(cè)定。
如前所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。用新制備的臨床級(jí)兩性霉素B為參照物作對(duì)比。培養(yǎng)1小時(shí)和6小時(shí)。附圖29表明，兩性霉素B-PMAA-Na復(fù)合物在貯存后對(duì)紅細(xì)胞沒有毒性。因此作為冷凍粉末貯存4個(gè)月后和貯存于4℃5％葡萄糖中7個(gè)月后，該復(fù)合物仍然是穩(wěn)定的。
該復(fù)合物貯存后的抗利什曼病活性可以用如實(shí)施例J1和K1的方法來測(cè)定。附圖30顯示的是兩性霉素B-PMAA-Na對(duì)于游離利什曼前鞭毛體和細(xì)胞內(nèi)無鞭毛體的抗利什曼病活性。兩性霉素B-PMAA-Na的活性在以凍干粉末形式在4℃下貯存4個(gè)月后沒有受到影響。兩性霉素B-PMAA-Na的活性在4℃下在5％葡萄糖中貯存7個(gè)月后也沒有受到影響。
實(shí)施例P新型隱球菌實(shí)驗(yàn)中所使用的是來自National Collection of Pathogenic Fungi的新型隱球菌類黏蛋白菌株(mucoidal strains)新型變種3003和gattii變種3216。也可以使用新型變種的非類黏蛋白臨床分離物和gattii變種的非類黏蛋白臨床分離物。將上述生物保存在32℃含有氯霉素(Oxoid，UK)的Sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)板中，該培養(yǎng)板置于含5％CO2的潮濕室中。
將菌株在Sabouraud葡萄糖瓊脂中再培養(yǎng)48小時(shí)，然后懸浮于無菌水中，其濃度調(diào)節(jié)為每ml含4×104菌落形成單位(CFU)。將兩倍于x2酵母氮基質(zhì)(YNB，Anachem)所需最終濃度的樣品進(jìn)行二倍稀釋。然后把等體積的樣品和酵母混懸液加到96孔平底培養(yǎng)板中，在32℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，充分搖動(dòng)該培養(yǎng)板以使酵母均勻地分散通過孔并用分光光度計(jì)(490nm)測(cè)定濁度。100％的存活率定義為對(duì)照組細(xì)胞中未治療酵母的光密度。
為了達(dá)到感染人原代巨噬細(xì)胞的目的，將隱球菌菌株在加入了10％人血清的YNB中在5％CO2存在下次培養(yǎng)48小時(shí)，以使它們形成莢膜。將人腹膜巨噬細(xì)胞或來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞(～750,000)置于腔式載玻片(Lab-Tek，USA)并粘連24小時(shí)。旋壓酵母細(xì)胞，洗滌并再懸浮于加入了10％人血清和2％葡萄糖的RPMI中，后者(2％葡萄糖)可以促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)。加入懸浮液，其濃度為巨噬細(xì)胞濃度的15倍，感染在含5％的CO2的潮濕室中和37℃下進(jìn)行。然后吸出介質(zhì)并用PBS洗滌該巨噬細(xì)胞。然后把二倍稀釋的供試樣品加入到含10％人血清的RPMI中，在含5％的CO2的潮濕室中和37℃下培養(yǎng)3天。吸出介質(zhì)并用PBS廣泛洗滌該巨噬細(xì)胞，以除去所有細(xì)胞外的隱球菌。移開該腔，并干燥該載玻片，然后在甲醇中固定并加熱，然后用革蘭氏液染色。計(jì)算受感染和未感染巨噬細(xì)胞的數(shù)目，和革蘭氏陽性酵母CFU的數(shù)目。結(jié)果用感染指數(shù)表示，該指數(shù)由CFU的平均數(shù)/受感染細(xì)胞的比例來確定。
附圖31(i)和(ii)顯示了新型隱球菌新型變種的結(jié)果，附圖31(iii)和(iv)顯示了新型隱球菌gatti變種的結(jié)果。兩性霉素B的LD50(0.9-1.4μg/ml)和兩性霉素B-PMAA-Na的LD50(1.6-2.7μg/ml)相似。當(dāng)上述生物感染了人來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞時(shí)，附圖32(i)和(ii)顯示了新型隱球菌新型變種的結(jié)果，附圖32(iii)和(iv)顯示了新型隱球菌gatti變種的結(jié)果。兩性霉素B和兩性霉素B-PMAA-Na的LD50在所有68個(gè)實(shí)驗(yàn)中都是類似的。對(duì)于新型隱球菌新型變種，兩性霉素B的LD50是0.9-1.4μg/ml，而兩性霉素B-PMAA-Na的LD50與其類似，為1.6-2.7μg/ml。對(duì)于新型隱球菌gatti變種，兩性霉素B的LD50是0.06-1.0μg/ml，而兩性霉素B-PMAA-Na的LD50與其類似，為0.1-0.5μg/ml。因此，該復(fù)合物與單獨(dú)使用兩性霉素一樣，都可以有效對(duì)抗隱球菌。
實(shí)施例Q念珠菌屬本實(shí)驗(yàn)使用的是白色念珠菌(ATCC 90028)和光滑念珠菌(ATCC 90030)。在每種情況下，把所述菌株保存在32℃的加入了氯霉素(Oxoid，UK)的Sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)板中，該培養(yǎng)板置于含5％CO2的潮濕室中。將菌株在Sabouraud葡萄糖瓊脂中再培養(yǎng)48小時(shí)，然后將其濃度調(diào)節(jié)為每ml含2×105CFU。將兩倍于酵母氮基質(zhì)(YNB，Anachem)所需最終濃度的樣品進(jìn)行一倍稀釋。然后把等體積的樣品和酵母混懸液加到96孔平底培養(yǎng)板中，在32℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)1天后，充分搖動(dòng)該培養(yǎng)板以使酵母均勻地分散通過孔。用分光光度計(jì)(490nm)測(cè)定濁度。100％的存活率定義為對(duì)照組細(xì)胞中未治療酵母的光密度。
附圖33(i)顯示了白色念珠菌的結(jié)果，附圖33(ii)顯示了光滑念珠菌的結(jié)果。兩性霉素B的LD50(0.9-1.8μg/ml)和兩性霉素B-PMAA-Na的LD50(1.6-2.3μg/ml)相似。因此，該復(fù)合物與單獨(dú)使用兩性霉素一樣，都可以有效對(duì)抗念珠菌屬。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合物，包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)，或(ii)具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，或(iii)一種或多種選自抗原和免疫原的試劑。
2.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述病原生物主要但不僅是細(xì)胞內(nèi)生物。
3.權(quán)利要求2的復(fù)合物，其中病原生物是存在和/或保持在巨噬細(xì)胞源的細(xì)胞和/或諸如樹突細(xì)胞的其他抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)生物。
4.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中病原生物選自下列生物a)導(dǎo)致下列疾病的生物淺部真菌病，包括癬菌??；癬；鵝口瘡；馬拉色菌感染，包括花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎和柱頂孢霉感染；耳真菌?。缓徒悄ふ婢?。b)導(dǎo)致侵入性和慢性真菌感染的念珠菌物種，包括白色念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌；曲霉物種，包括煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉；新型隱球菌；毛霉菌病，例如，由犁頭霉、根霉和根毛霉物種所導(dǎo)致；鐮刀菌物種；毛孢子菌物種；芽生菌??；孢子絲菌物種；側(cè)孢霉物種；組織胞漿菌病，例如由莢膜組織胞漿菌莢膜變種所導(dǎo)致；非洲組織胞漿菌病，例如由莢膜組織胞漿菌杜氏變種所導(dǎo)致；芽生菌病，例如由皮炎芽生菌所導(dǎo)致；球孢子菌病，例如由粗球孢子菌所導(dǎo)致；類球孢子菌病，例如由巴西類球孢子菌所導(dǎo)致；和由馬內(nèi)菲青霉導(dǎo)致的感染。c)導(dǎo)致分枝桿菌病的生物，例如，由分枝桿菌科成員導(dǎo)致的肺結(jié)核和麻風(fēng)病，例如結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌。d)導(dǎo)致血吸蟲病的血吸蟲科成員，例如埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲、日本血吸蟲、間插血吸蟲和湄公血吸蟲。e)導(dǎo)致傷寒和副傷寒的生物，例如A、B、C和D血清型沙門菌科成員。f)導(dǎo)致弓形體病的生物，例如鼠弓形體。g)導(dǎo)致人非洲錐蟲病的生物，例如布氏岡比亞錐蟲或布氏岡比亞錐蟲。h)導(dǎo)致美洲錐蟲病的生物，例如，克氏錐蟲。i)導(dǎo)致瘧疾的生物，例如惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲。j)導(dǎo)致HIV和HTLV感染的生物。k)導(dǎo)致卡氏肺囊蟲感染的生物。
5.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述病原生物導(dǎo)致利什曼病。
6.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)能夠殺滅或分裂如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所定義的生物。
7.權(quán)利要求6的復(fù)合物，其中藥理活性物質(zhì)是兩性霉素B。
8.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中抗原或免疫原直接或間接來自導(dǎo)致下列疾病的生物肺結(jié)核、破傷風(fēng)、炭疽、霍亂、白喉、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、甲型肝炎、乙型肝炎、流行性感冒、帶狀皰疹、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、天花、黃熱病、水痘、帶狀皰疹、單純皰疹、流行性感冒或利什曼病。
9.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中抗原或免疫原直接或間接來自B型流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、百日咳桿菌、肺炎鏈球菌或傷寒沙門菌。
10.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其中所述抗原或免疫原直接或間接來自權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)所定義的生物。
11.如權(quán)利要求1、9或10所述的復(fù)合物，其中抗原或免疫原得自天然源，或由重組DNA技術(shù)和/或化學(xué)合成制備，或由所述方法中的一種或多種制備。
12.權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其中具有抗癌藥理活性的物質(zhì)是細(xì)胞毒素劑。
13.一種藥物制劑，包含與藥學(xué)適宜的載體混合或結(jié)合的如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物制劑，其包含遞送系統(tǒng)佐劑。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，用作藥物。
16.一種復(fù)合物，用于治療病原生物感染和/或誘導(dǎo)對(duì)病原生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所述復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物的藥理活性的物質(zhì)。
17.一種在需要治療的對(duì)象中治療病原生物感染的方法，包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康膹?fù)合物，該復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)。
18.一種在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)病原生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的復(fù)合物，該復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)。
19.如權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或方法，其中所述病原生物如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所定義。
20.如權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或方法，其中具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)如權(quán)利要求6所定義。
21.如權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或方法，以任意的臨床形式用于治療利什曼病和/或誘導(dǎo)對(duì)導(dǎo)致利什曼病的生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
22.如權(quán)利要求21所述的復(fù)合物或方法，其中具有抗導(dǎo)致利什曼病的生物的藥理活性的物質(zhì)是兩性霉素B。
23.如權(quán)利要求16-22中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或方法，其中所述免疫應(yīng)答包括抗病原生物的治療性和/或預(yù)防性接種。
24.一種用于治療癌癥的復(fù)合物，所述復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)。
25.一種在需要治療的對(duì)象中治療癌癥的方法，包括向所述對(duì)象施用治療有效量的復(fù)合物，該復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)。
26.一種在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)癌產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的復(fù)合物，該復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)。
27.如權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或方法，其中具有抗癌藥理活性的物質(zhì)是細(xì)胞毒素劑。
28.如權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或方法，其中所述免疫應(yīng)答包括抗癌的治療性和/或預(yù)防性接種。
29.一種復(fù)合物，包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的聚合物和一種或多種選自抗原和免疫原的試劑，用于誘導(dǎo)對(duì)抗原或免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
30.一種在對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)抗原或免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的復(fù)合物，該復(fù)合物包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和抗原或免疫原。
31.如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或方法，其中所述抗原或免疫原直接或間接來自需要對(duì)其進(jìn)行保護(hù)性免疫應(yīng)答的生物。
32.如權(quán)利要求29或30所述的復(fù)合物或方法，其中所述抗原或免疫原如權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)所定義。
33.如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或方法，其中所述免疫應(yīng)答包括抗病原生物的治療性和/或預(yù)防性接種。
34.一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)一起治療病原生物感染和/或誘導(dǎo)對(duì)病原生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
35.一種在需要治療的對(duì)象中治療病原生物感染的方法，包括向所述對(duì)象施用治療有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
36.一種在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)病原生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
37.如權(quán)利要求34所述的聚合物或者如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答包括抗病原生物的治療性和/或預(yù)防性接種。
38.如權(quán)利要求34-37中任一項(xiàng)所述的聚合物或方法，其中病原生物如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所定義。
39.如權(quán)利要求34-38中任一項(xiàng)所述的聚合物或方法，其中具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)如權(quán)利要求6所定義。
40.如權(quán)利要求34-37中任一項(xiàng)所述的聚合物或方法，以任意的臨床形式用于治療利什曼病和/或誘導(dǎo)對(duì)導(dǎo)致利什曼病的生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
41.如權(quán)利要求40所述的聚合物或方法，其中具有抗導(dǎo)致利什曼病的生物的藥理活性物質(zhì)是兩性霉素B。
42.一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于和一種或多種選自抗原和免疫原的物質(zhì)一起誘導(dǎo)對(duì)抗原或免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
43.一種在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)抗原或免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向所述對(duì)象施用治療有效量的窄分子量分布的聚合物和抗原或免疫原，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
44.如權(quán)利要求42或43所述的聚合物或方法，其中所述抗原或免疫原如權(quán)利要求31或32所定義。
45.如權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)所述的聚合物或方法，其中所述免疫應(yīng)答包括治療性和/或預(yù)防性接種。
46.一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)一起治療癌癥和/或誘導(dǎo)對(duì)癌產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
47.一種在需要治療的對(duì)象中治療癌癥的方法，包括向所述對(duì)象施用治療有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
48.一種在需要治療的對(duì)象中誘導(dǎo)對(duì)癌產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括給所述對(duì)象施用有效量的窄分子量分布的聚合物和具有抗癌藥理活性的物質(zhì)，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
49.如權(quán)利要求46或48所述的聚合物，其中所述免疫應(yīng)答包括治療性或預(yù)防性接種。
50.如權(quán)利要求34-49中任一項(xiàng)所述的聚合物或方法，其中所述聚合物和其他物質(zhì)一起施用或分開施用。
51.如權(quán)利要求50所述的聚合物或方法，其中當(dāng)所述聚合物和藥理活性物質(zhì)分開施用時(shí)，它們基本上同時(shí)施用或一個(gè)在另一個(gè)之前施用。
52.一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于在疫苗的制備中作為免疫增強(qiáng)佐劑。
53.一種窄分子量分布的聚合物，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元，用于在疫苗的制備中作為免疫增強(qiáng)佐劑，其中該疫苗包含將對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原或免疫原。
54.一種制備疫苗的方法，其改進(jìn)包括用一種窄分子量分布的聚合物作為免疫增強(qiáng)佐劑，所述聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
55.如前述任一權(quán)利要求所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物具有1.7或更小的多分散性。
56.如權(quán)利要求55所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物的多分散性小于1.4，例如小于1.2。
57.如前述任一權(quán)利要求所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物具有一定的分子量，使得當(dāng)存在于血液中時(shí)，聚合物在通過腎期間或以后基本都保留在循環(huán)血液中。
58.如前述任一權(quán)利要求所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物分子量是例如100,000或更小，例如小于100,00，例如80,000或更小，例如75,000或更小，例如65,000或更小，例如55,000或更小，例如45,000或更小。
59.如前述任一權(quán)利要求所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物分子量是例如4,000或更大，例如5,000或更大，例如10,000或更大，例如20,000或更大，例如30,000或更大，例如40,000或更大。
60.如前述任一權(quán)利要求所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物分子量的范圍是80,000-4,000、75,000-5,000、65,000-10,000、55,000-10,000、45,000-10,000、50,000-4,000、40,000-25,000或者45,000-10,000。
61.如前述任一權(quán)利要求所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物是由包括水解聚合物前體的方法制備的。
62.如權(quán)利要求61所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的聚合物通過水解相應(yīng)的前體聚合物而得到，該前體聚合物具有在衍生自丙烯酸的單元中替換丙烯酸酯羧酸的氫原子的基團(tuán)，該基團(tuán)可以通過水解作用分裂從而產(chǎn)生酸。
63.如權(quán)利要求62所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中可以通過水解作用分裂的基團(tuán)是例如適當(dāng)?shù)碾x去基團(tuán)，例如吸電子基團(tuán)，例如?；鶊F(tuán)，優(yōu)選其是羧酸鹽活化的，通常選自N-琥珀酰亞胺基、五氯苯基、五氟苯基、對(duì)硝基苯基、二硝基苯基、N-苯二酰亞氨基、N-冰片基、氰甲基、吡啶基、三氯三嗪、5-氯喹啉基和咪唑基，優(yōu)選N-琥珀酰亞胺基或咪唑基，特別是N-琥珀酰亞胺基。
64.如權(quán)利要求61-63中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中水解是利用堿性試劑進(jìn)行的，例如堿金屬或堿土金屬的堿，例如是鈉、鉀、銫、鈣、鎂或鋰的堿。所述堿可以是例如氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽，如氫氧化鈉。
65.如前述任一權(quán)利要求所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物是聚(甲基丙烯酸)或其鹽。
66.如權(quán)利要求65所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中聚(N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺)(PMOSu)是用銅介導(dǎo)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法由甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺的均相聚合制備的。
67.如權(quán)利要求1-64中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物是或者包含單元(I) 其中R選自氫和C1-C18烷基、C2-C18烯基、C7-C18芳烷基、C7-C18烷芳基、C6-C18芳基、羧酸、C2-C18烷氧基羰基、C2-C18烷氨基羰基、或在碳主鏈上由雜原子取代或連接有雜原子的C1-C18烷基、C2-C18烯基、C7-C18芳烷基、C7-C18烷芳基、C6-C18芳基、羧酸、C2-C18烷氧基羰基、C2-C18烷氨基羰基中的任一種；R1選自氫和C1-C6烷基；及其鹽，例如堿金屬鹽，如鈉鹽，或其銨鹽?；蛘咴摼酆衔锸腔虬瑔卧?II) 其中，R、R1和R2如上述定義；R3選自C1-C18亞烷基、C2-C18亞烯基、C7-C18亞芳烷基、C7-C18亞烷芳基和C6-C18亞芳基；L是連接嵌段的二價(jià)連接體；m和n分別是1或大于1的整數(shù)。
68.如權(quán)利要求1-64中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物是或者包含單元(III)或(IV) 其中，R、R1、R2和R3、L、m和n如上述定義，R4、R5和R6分別獨(dú)立地選自與R、R1和R2相同的基團(tuán)；Q表示在用于制備聚合物的條件下不分裂或基本不分裂的基團(tuán)；p表示1或大于1的整數(shù)。如果需要，Q可以是靶向基團(tuán)，即將聚合物靶向輸送到某一類型的細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞，或輸送到某一器官例如肝的基團(tuán)。
69.如權(quán)利要求1-68中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物、藥物制劑、方法或聚合物，其中所述聚合物是采用原子介導(dǎo)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法例如銅介導(dǎo)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法通過琥珀酰亞胺前體的均相聚合來制備的。
70.如前述任一權(quán)利要求定義或涉及的復(fù)合物，其中利用包括水解聚合物前體以形成聚合物的方法來制備復(fù)合物，其中水解是在前述任一權(quán)利要求所定義的組分(i)、(ii)或(iii)存在下進(jìn)行。
71.如權(quán)利要求70的復(fù)合物，其中水解是利用堿性試劑進(jìn)行的，例如堿金屬或堿土金屬的堿，例如是鈉、鉀、銫、鈣、鎂或鋰的堿。所述堿可以是例如氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽，如氫氧化鈉。
72.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其包含具有抗利什曼病的藥理活性的物質(zhì)和窄分子量分布的聚合物，其中該聚合物包含衍生自丙烯酸或其鹽的單元。
73.權(quán)利要求72的復(fù)合物，其中藥學(xué)活性物質(zhì)是兩性霉素B。
74.如權(quán)利要求72或73所述的復(fù)合物，其中聚合物如權(quán)利要求55-71中任一項(xiàng)所定義。
75.一種藥物制劑，包含與藥學(xué)適宜的載體混合的如權(quán)利要求72-74中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物和任選的遞送系統(tǒng)佐劑。
76.如權(quán)利要求72-74中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或如權(quán)利要求75的藥物制劑，用于以任意臨床形式治療利什曼病。
77.一種在需要治療的對(duì)象中治療利什曼病的方法，包括向所述對(duì)象施用治療有效量的如權(quán)利要求72-74中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或如權(quán)利要求75所述的藥物制劑。
全文摘要
一種復(fù)合物，包含包括衍生自丙烯酸或其鹽的單元的窄分子量分布的聚合物和(i)具有抗病原生物藥理活性的物質(zhì)或(ii)具有抗癌藥理活性的物質(zhì)或(iii)一種或多種選自抗原和免疫原的試劑，該復(fù)合物可以用于治療和/或誘導(dǎo)對(duì)于病原生物或癌的免疫，并可以用于誘導(dǎo)對(duì)于抗原或免疫原的免疫。
文檔編號(hào)A61K31/78GK1909928SQ200580002089
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月7日
發(fā)明者蘇尼爾·肖納克, 斯蒂芬·布羅基尼, 安東尼·戈德溫, 崔志元 申請(qǐng)人:波利泰里克斯有限公司