專利名稱：改變胰島素分泌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改變胰島素分泌的方法，其包括使表達SGK1的胰島細胞與調(diào)節(jié)SGK1的物質(zhì)接觸，并且其中SGK1的抑制涉及葡萄糖去極化作用的逆轉(zhuǎn)，引起電壓門控鈣通道的活化和胰島素的釋放。
背景技術(shù)：
糖皮質(zhì)激素治療誘導2型糖尿病，其在停藥后可迅速逆轉(zhuǎn)(Hoogwerf和Danese 1999；Schacke等人，2002)。除了外周胰島素抗性和通過刺激糖原異生增加肝葡萄糖生成(McMahon等人，1988)外，糖皮質(zhì)激素還干擾胰腺細胞的胰島素分泌(Lambillotte等人，1997；Pierluissi等人，1986)。盡管進行了廣泛的研究，但是對其分子機理仍無定論?？乖屑に孛追撬就?RU486)—一種核糖皮質(zhì)激素受體(nuclear glucocorticoid receptor)拮抗劑—完全抵消了地塞米松誘導的胰島素分泌抑制(Lambillotte等人，1997)，表明與糖皮質(zhì)激素依賴性基因的表達有關(guān)。
血清和糖皮質(zhì)激素誘導的激酶SGK1屬于糖皮質(zhì)激素敏感基因(Webster等人，1993b；Webster等人，1993a，US6326181)。SGK1受許多刺激影響(Lang等人2001)，例如鹽皮質(zhì)激素(Chen等人1999，Naray-Fejes-Toth等人1999，Shigaev等人2000，Brennan等人2000，Cowling等人2000)。
已經(jīng)顯示SGK1通過胰島素樣生長因子IGF1、胰島素和經(jīng)由涉及磷脂酰肌醇(phosphoinositol)-3-激酶(PI3激酶)和磷脂酰肌醇依賴性激酶PDK1的信號級聯(lián)通過氧化應(yīng)激進行調(diào)節(jié)(Kobayashi & Cohen 1999，Park等人1999，Kobayashi等人1999)。通過PDK1進行的SGK1活化涉及絲氨酸422的磷酸化。此外還已證明，絲氨酸422向天冬氨酸(S422DSGK1)的突變導致持續(xù)活化的激酶(Kobayashi等人1999)。
多種測定系統(tǒng)可用于糖皮質(zhì)激素誘導的激酶SGK1活性的測定。在閃爍親近測定法(Sorg等人，J.of.Biomolecular Screening，2002，7，11-19)和閃爍板(flashplate)測定法中，測定蛋白質(zhì)或肽底物與γATP的放射性磷酸化。在存在抑制性化合物的情況下，檢測不到放射性信號或檢測到降低的放射性信號。此外，均相時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(HTR-FRET)和熒光偏振(FP)技術(shù)可用于測定方法(Sills等人，J.of Biomolecular Screening，2002，191-214)。其它基于非放射性ELISA的測定方法使用特定的磷酸抗體(AB)。磷酸-AB僅與磷酸化的底物結(jié)合。該結(jié)合可通過化學發(fā)光用過氧化物酶軛合的抗綿羊二抗檢測(Ross等人，2002，Biochem.J.，immediatepublication，manuscript BJ20020786)。
早期的結(jié)果顯示SGK1是腎上皮Na+通道的強效刺激物(De la Rosa等人1999，Boehmer等人2000，Chen等人1999，Naray-Fejes-Toth等人1999，Lang等人2000，Shigaev等人2000，Wagner等人2001)。
與SGK1有關(guān)的另一發(fā)現(xiàn)是在具有(CC/CT)核苷酸組合的外顯子8中的單核苷酸多態(tài)性和另外的在內(nèi)含子6中的多態(tài)性(CC)與血壓升高有關(guān)(Busjahn等人2002)，由此推斷SGK1對于血壓調(diào)控和高血壓可能是重要的。
由于SGK1的活性增加與腎上皮Na+通道活性有關(guān)(其通過腎對鈉的重吸收增加導致高血壓)(Lifton 1996；Staessen等人，2003；Warnock 2001)，所以確定無疑的是取決于SGK1的等位基因變體的組合，可能出現(xiàn)腎對Na+的重吸收增加，其進而將升高血壓(Busjahn等人2002)。
迄今為止，沒有顯示胰島的分泌胰島素的細胞表達相關(guān)量的SGK1(Klingel等人2000)，并且一般認為未經(jīng)處理的胰島細胞不表達或僅在較小程度上表達SGK1。
長時間的高劑量糖皮質(zhì)激素治療至少部分通過損害胰島素分泌使人易發(fā)生糖尿病。根本機理尚不清楚，并且目前也未發(fā)現(xiàn)可進行治療干預的靶標。本申請定義了這樣的新機理和分子靶標，同時還教導了如何鑒別干擾上述致病機理以消除糖尿病的新化合物。
發(fā)明概述本申請出乎意料地證明在用糖皮質(zhì)激素預處理的分泌胰島素的胰島細胞中，胰島細胞顯示出SGK1轉(zhuǎn)錄水平和表達的顯著增加。
糖皮質(zhì)激素過量至少部分通過損害胰島素分泌使人易發(fā)生糖尿病，本發(fā)明的方法用于調(diào)節(jié)胰島細胞中SGK1的活性，從而在需要這類治療的個體中減少糖皮質(zhì)激素誘導的2型糖尿病。
另一方面，本發(fā)明教導了鑒別可用于恢復胰島素分泌的治療活性化合物的方法，該方法使表達SGK1的胰島細胞與調(diào)節(jié)SGK1的物質(zhì)接觸。從而逆轉(zhuǎn)葡萄糖的去極化作用，引起電壓門控鈣通道的活化和隨后的胰島素釋放。
當應(yīng)用于用SGK1基因的單核苷酸多態(tài)性定義的臨床相關(guān)表型或基因型時，SGK1的調(diào)節(jié)是特別有用的。因此，對取自需要治療的個體的樣本中的多態(tài)SGK1 SNP變體的分析可能是另一種應(yīng)用。此外，本發(fā)明提供了通過測定SGK1的表達而確定疾病的進展、消退或發(fā)作的方法。取自患病個體的樣本還可對所選擇的SGK1 SNP變體和它們與易于罹患該疾病或其它例如由長期糖皮質(zhì)激素治療誘導的病癥的關(guān)系進行分析。另一方面涉及用于鑒別調(diào)節(jié)與SGK1有關(guān)的疾病的新藥候選者的篩選方法。特別有用的調(diào)節(jié)劑是干擾SGK1功能從而導致胰島素分泌上調(diào)的化合物。SGK1的抑制劑特別可用于治療患有2型糖尿病癥狀的個體。SGK1的調(diào)節(jié)劑也可用于治療患有應(yīng)激誘導的高血糖的個體或患有低血糖的個體。
根據(jù)本發(fā)明進行的藥物篩選方法已經(jīng)導致了定向于SGK1的治療化合物的發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)鑒別出兩種不同種類的化合物，一種屬于酰基腙衍生物，另一種屬于吡啶并嘧啶衍生物。在包含藥學上有效的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物中的所選擇的抑制SGK1的化合物可用于治療糖皮質(zhì)激素誘導的2型糖尿病。對于本發(fā)明而言至關(guān)重要的是，用于鑒別具有所需治療特性的新藥物的篩選方法不局限于本申請中所公開的化合物。此外，對于專業(yè)人員顯而易見的是，用于篩選調(diào)節(jié)SGK1的化合物的一步方法或兩步方法均可應(yīng)用。這類篩選的第一步包括鑒別干擾SGK1激酶活性的化合物。可使用多種測定形式，優(yōu)選的測定法使用SGK1催化的蛋白質(zhì)或肽底物與γATP的放射性磷酸化的測定。在存在SGK1抑制性化合物的情況下，檢測不到放射性信號或檢測到降低的放射性信號。在篩選的第二步中，測定抑制SGK1的化合物在糖皮質(zhì)激素處理的胰島細胞例如INS-1細胞中恢復胰島素分泌的潛力。在SGK1抑制后，測定胰島素的釋放，但是，測定其它讀出活性也可能是有用的。
發(fā)明詳述糖皮質(zhì)激素誘導的糖尿病的根本機理迄今為止尚不清楚。在本發(fā)明中，顯示糖皮質(zhì)激素如地塞米松在分泌胰島素的細胞中上調(diào)血清和糖皮質(zhì)激素誘導的激酶SGK1的轉(zhuǎn)錄和表達，該作用可被米非司酮(RU486)—一種核糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑—逆轉(zhuǎn)。當在爪蟾卵母細胞中共表達時，SGK1增加電壓門控K+通道Kv1.5的活性。在INS-1細胞中，地塞米松刺激Kv1.5的轉(zhuǎn)錄，增加復極化外向電流，并降低葡萄糖誘導的胰島素釋放。后兩種作用可被K+通道阻滯劑4-AP和TEA逆轉(zhuǎn)。事實上，地塞米松可抵消由野生型小鼠分離得到的胰島的葡萄糖誘導的胰島素釋放，在由SGK1敲除小鼠分離得到的胰島中該作用顯著減弱?？傊?，糖皮質(zhì)激素刺激SGK1的轉(zhuǎn)錄，該轉(zhuǎn)錄進而上調(diào)電壓門控K+通道的活性。隨后的超極化抵消葡萄糖的去極化作用，并防止電壓門控Ca2+通道的活化、Ca2+的進入和胰島素的釋放。
本發(fā)明涉及在調(diào)節(jié)胰島素分泌中SGK1的作用和SGK1依賴性通道的活性。
根據(jù)實時PCR，在未經(jīng)處理的INS-1細胞中SGK1轉(zhuǎn)錄水平低(

圖1A)，該發(fā)現(xiàn)與先前報道的關(guān)于人胰島的低轉(zhuǎn)錄水平(Kingel等人，2000)相對應(yīng)。但是，將INS-1細胞與100nM地塞米松一起孵育2-23小時增加mRNA轉(zhuǎn)錄水平，該作用可被糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486完全抵消(圖1A)。在23小時內(nèi)，地塞米松增加細胞SGK1轉(zhuǎn)錄水平，用地塞米松處理后在小鼠胰島中該轉(zhuǎn)錄水平增加(圖1A)。相似地，在其它細胞類型中也觀察到了糖皮質(zhì)激素對SGK1轉(zhuǎn)錄的強刺激(Itani等人，2002；Rozansky等人，2002)。從蛋白質(zhì)印跡法可明顯看出，在未經(jīng)處理的細胞中檢測不到SGK1蛋白，但在暴露于地塞米松(100nM)的2小時內(nèi)其已經(jīng)出現(xiàn)并在接下來的23小時內(nèi)進一步增加(圖1B)。SGK1蛋白豐度的增加可被RU486完全逆轉(zhuǎn)。因此，地塞米松刺激分泌胰島素的細胞中SGK1的表達。
如圖1D中所示，SGK1和Kv通道在爪蟾卵母細胞中的共表達將異種表達的Kv1.5通道的活性上調(diào)約2倍(圖1D)。先前已經(jīng)證明這些通道在INS-1細胞(Su等人，2000)以及嚙齒和人β細胞(Philipson等人，1994；Roe等人，1996)中被表達。在INS-1細胞中，這些通道可被K+通道阻滯劑4-AP抑制(Su等人，2001)。如圖2A和2B所示，用地塞米松處理的確可增加4-AP敏感性電壓門控外向電流。在未經(jīng)處理的細胞中，K+通道阻滯劑4-AP僅抑制10％(0.1mM)和28％(1mM)的外向電流。在用100nM地塞米松處理4小時后，4-AP敏感性電流增加至28％(0.1mM 4-AP)和40％(1mM 4-AP)。這些數(shù)據(jù)表明，在分泌胰島素的細胞中，地塞米松可提高Kv1.5通道的活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可增加Kv1.5通道在心臟(Takimoto和Levitan1994)、骨骼肌和垂體中的表達，但是不增加其在下丘腦和肺中的表達(Levitan等人，1996)。此外，在造成甲狀腺功能減退的腎上腺切除動物的左心室中，對于T3而言地塞米松是增加Kv1.5 mRNA水平所必需的(Nishiyama等人，1997)。實時PCR顯示，用地塞米松(100nM)處理在4小時內(nèi)使Kv1.5 mRNA在INS細胞中的豐度增加約10倍。因此，地塞米松刺激SGK1的表達，該表達進而增加Kv通道的活性。
為了闡明Kv通道和SGK1對地塞米松減弱胰島素釋放的影響，進行了另外的實驗。如圖3所示，將INS-1細胞用地塞米松(100nM)預處理抑制62％的葡萄糖誘導的胰島素分泌。該抑制作用可被Kv通道阻滯劑TEA和4-AP逆轉(zhuǎn)，表明地塞米松介導對胰島素分泌的抑制作用依賴Kv通道的活性。
為了估計SGK1對地塞米松的胰島素分泌抑制作用的貢獻，比較了在SGK1敲除小鼠(sgk-/-)中和在野生型同窩出生小鼠(sgk1+/+)中地塞米松對胰島素分泌的作用。在不進行地塞米松預處理的情況下，在由sgk-/-和sgk1+/+分離得到的胰島中，在暴露于葡萄糖(16.7mM)、活化腺苷酸環(huán)化酶(5μM福斯高林)或刺激蛋白激酶C(100nM PMA)后，胰島素分泌沒有顯著差別(圖4A和B，黑色條形)。但是，地塞米松處理在sgk1+/+胰島中比在sgk-/-中更顯著地降低葡萄糖、福斯高林或PMA對胰島素分泌的刺激作用。這些數(shù)據(jù)表明SGK1參與地塞米松對胰島素分泌的下調(diào)。
總之，本實驗公開了胰島素分泌調(diào)節(jié)中的新機理。糖皮質(zhì)激素地塞米松促進SGK1在分泌胰島素的細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達。激酶上調(diào)包括Kv1.5在內(nèi)的電壓門控K+通道。Kv通道的過量表達超極化β-細胞質(zhì)膜，從而妨礙電壓門控Ca2+通道的活化。因此，在糖皮質(zhì)激素過量時，激酶對抑制胰島素釋放有作用。
附圖簡要說明圖1地塞米松誘導SGK1在分泌胰島素的INS-1細胞中的表達。
在培養(yǎng)物中將INS-1細胞用100nM地塞米松或載體(DMSO)處理給定時間。在2小時內(nèi)地塞米松顯著誘導SGK1的表達。在1μmol/l下RU486完全抑制地塞米松的作用。
(A)使用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV(Roche Diagnostics GmbH，Roche AppliedScience，Mannheim，德國)將細胞的RNA轉(zhuǎn)錄入cDNA。在light cyclersystem(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，德國)中通過實時PCR對SGK1 mRNA進行定量。所用的引物是SGK1上游5′-TTT TTT TTC CCA ACC CTT GC-3′；下游5′-AAT GAA CAAAGG TTG GGG GG-3。所給出的是給定數(shù)量的實驗的均值±SEM。
(B)將全細胞裂解物用1％SDS-PAGE處理并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Schleicher and Schuell，Dassel，德國)上顯圖。將該圖與抗SGK1抗體(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，美國)一起進行孵育。用與辣根過氧化物酶偶合的二抗來顯示結(jié)合的抗體。
(C)使用light cycler system(Roche Diagnostics GmbH，Roche AppliedScience，Mannheim，德國)對Kv1.5進行實時PCR。如圖1A所述的實驗那樣對相同的RNA制品進行分析。所給出的是3個獨立實驗的均值±SEM。
(D)在爪蟾卵母細胞中SGK1和Kv通道的共表達增加K+電流。將人SGK1(μg/ml)和Kv1.5(μg/ml)的mRNA注射入卵母細胞，注射后2天用2-電壓箝法測定全細胞電流。所給出的是代表性跡線和均值±SEM。
圖2地塞米松提高INS-1細胞中kv通道的活性。
在進行實驗之前，將細胞用100nm地塞米松處理4小時。(2A)用200ms的電壓脈沖誘導全細胞電流，電壓以10mv的幅度從-70mv增加至+50mv。(2B)在用地塞米松處理之前(黑色柱)和之后(白色柱)在細胞中測試對4-ap(0.1和1mm)和tea(1和10mm)的敏感性。應(yīng)用200ms持續(xù)時間的從-70至50mv的電壓脈沖。所給出的是給定數(shù)量的實驗的均值±SEM。*表示在對照、相同抑制劑濃度下未經(jīng)處理的細胞中電流的顯著性(p＜0.05)。如之前所述培養(yǎng)Ins-1細胞(Abel等人，1996；Asfari等人，1992)。外部膜片箝溶液含有(以mmol/l為單位)140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、0.5葡萄糖和10HEPES，PH 7.4。內(nèi)部溶液含有(以mmol/l為單位)30KCL、95K+-葡糖酸鹽、1MgCl2、1.2NaH2PO4、4.8Na2HPO4、5Na2ATP、1Na3GTP、5mmol/l EGTA，PH 7.2。使用Epc9膜片箝放大器(HekaElectronic，Lambrecht，德國)測量電流。
圖3Kv通道抑制逆轉(zhuǎn)地塞米松誘導的INS-1細胞的胰島素分泌抑制。
在實驗之前，將INS-1細胞在培養(yǎng)物中用100nM地塞米松處理4小時。將細胞洗滌兩次，并于37℃下在HEPES緩沖鹽溶液中進行預孵育，所述的HEPES緩沖鹽溶液含有(以mmol/l為單位)140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、0.5葡萄糖、10HEPES和5g/l牛血清白蛋白，pH 7.4。其后，將細胞在含有適宜濃度的供試物質(zhì)的新鮮溶液中于37℃下孵育30分鐘。通過使用大鼠胰島素抗血清(Linco，Biotrend Chemikalien GmbH，Cologne，德國)、I125-胰島素(CIS Diagnostik GmbH，Dreieich，德國)和大鼠胰島素(Novo Nordisk，Mainz，德國)作為標準的放射免疫測定法或通過胰島素Elisa試劑盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)測定胰島素。
圖4A和B地塞米松不影響SGK1敲除小鼠的胰島的分泌。
將離體胰島在含有11mmol/l葡萄糖的RPMI 1640中培養(yǎng)過夜。在實驗之前5小時加入地塞米松(100ng/ml)或DMSO(對照)。在培養(yǎng)后，將胰島在孵育緩沖液中于37℃下預孵育1小時，所述孵育緩沖液含有(以mmol/l為單位)140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、2.8葡萄糖、10HEPES，pH 7.4和5g/l牛血清白蛋白(fraction V，Sigma，Deisenhofen)。其后，如各實驗所示，將5個胰島/0.5ml的各批次于37℃下在存在供試物質(zhì)的情況下孵育30分鐘。使用Elisa試劑盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)測定胰島素。
另外的方法和材料實施例1Sgk1-/-小鼠的產(chǎn)生有條件的打靶載體由一個7-kb片段產(chǎn)生，該片段包含位于12個外顯子上的完整轉(zhuǎn)錄區(qū)域(Wulff等人，2002)。新霉素抗性表達盒兩側(cè)各有一個loxP位點，將該表達盒插入內(nèi)含子11中。通過在內(nèi)含子3中插入第三個loxP位點將編碼sgk1激酶結(jié)構(gòu)域的外顯子4-11分隔(“floxed”)。將具有第一和第三loxP位點之間的重組(I型重組)的克隆注入C57BL/6胚細胞中。使雄性嵌合體與C57BL/6和129/SvJ雌性交配。使雜合的sgk1缺失小鼠與129/SvJ野生型小鼠回交兩代，然后雜交，產(chǎn)生純合的sgk1-/-和sgk+/+同窩生小鼠。
實施例2細胞培養(yǎng)和胰島素分泌測定將來自大鼠胰島素瘤的INS-1細胞(由瑞士University of Geneva的CB Wollheim惠贈)在HEPES緩沖的RPMI 1640中進行培養(yǎng)，所述RPMI1640中補充有10％胎牛血清(Biochrom，Berlin，德國)、1mmol/l HEPES、1mmol/l丙酮酸鈉、10μmol/lβ-巰基乙醇(Sigma，Munich，德國)和別處所述的抗生素(Abel等人，1996；Asfari等人，1992)。將細胞以2.0-2.5×105個細胞/ml的密度接種在24孔培養(yǎng)板中并在實驗之前培養(yǎng)2天。將細胞用HEPES緩沖鹽溶液洗滌兩次，所述HEPES緩沖鹽溶液含有(以mmol/l為單位)140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、0.5葡萄糖、10HEPES和5g/l牛血清白蛋白，pH 7.4，并在37℃下預孵育30分鐘。其后，丟棄培養(yǎng)基，加入含有適宜濃度的供試物質(zhì)的新鮮培養(yǎng)基。將細胞在37℃下孵育30分鐘。
在冰上停止孵育，取出培養(yǎng)基并在-20℃下冷凍，直至胰島素釋放進入上清液，通過使用大鼠胰島素抗血清(Linco，Biotrend Chemikalien GmbH，Cologne，德國)、I125-胰島素(CIS Diagnostik GmbH，Dreieich，德國)和大鼠胰島素(Novo Nordisk，Mainz，德國)作為標準的放射免疫測定法或通過胰島素Elisa試劑盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)對其該培養(yǎng)基進行測定。在4℃下用酸乙醇(1.5(v/v)％HCl/75％乙醇)提取過夜后，測定胰島素含量。
對于從SGK1 KO和野生型同窩出生小鼠中分離胰島，將3ml含有1mg/ml膠原酶(Serva，Heidelberg，德國)的膠原酶溶液通過主膽管(ductuscoledochus)注入位于原位的胰腺中。取出整個腺體，在37℃下消化10分鐘。然后通過在解剖顯微鏡下將胰島收集入新鮮培養(yǎng)基中而將胰島與外分泌組織分離。將胰島在含有11mmol/l葡萄糖和地塞米松(100ng/ml)或DMSO(對照)的RPMI 1640中培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng)后，將胰島在孵育緩沖液中于37℃下預孵育1小時，所述孵育緩沖液含有(以mmol/l為單位)140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、2.8葡萄糖、10HEPES，pH 7.4和5g/l牛血清白蛋白(fraction V，Sigma，Deisenhofen)。其后，如各實驗所示，將5個胰島/0.5ml的各批次于37℃下在存在供試物質(zhì)的情況下孵育30分鐘。使用Elisa試劑盒(Mercodia，Uppsala，瑞典)測定胰島素。
實施例3膜電流的測定將INS-1細胞以合適的細胞密度(1.2×106個細胞/ml)在用聚-L-鳥氨酸(10mg/l Sigma，Munich，德國)包被的玻璃蓋玻片上培養(yǎng)2-4天。在倒置顯微鏡的載物臺上，將蓋玻片在恒溫槽(bath chamber)中封固。如各實驗所示，將細胞保持在室溫或34℃，用溶液澆蓋(superfused)，所述溶液含有(以nmol/l為單位)140NaCl、5.6KCl、1.2MgCl2、2.6CaCl2、0.5葡萄糖和10HEPES，pH 7.4。用DMZ-萬能拉出器(Zeitz，Augsburg，德國)拉出電阻為4-6MΩ的膜片箝吸液管(Clark-Medical，Reading，英國)。它們充有內(nèi)部溶液，該內(nèi)部溶液含有(以mmol/l為單位)30KCl、95K+-葡糖酸鹽、1MgCl2、1.2NaH2PO4、4.8Na2HPO4、5Na2ATP、1Na3GTP、5mmol/l EGTA，pH 7.2。使用EPC9膜片箝放大器(Heka Electronic，Lambrecht，德國)進行電流的測量。僅僅穩(wěn)定的電流測量值(即取出各個抑制性藥物后電流達到對照電流的至少90％時)被用于分析。
實施例4實時PCR在70cm2的燒瓶中培養(yǎng)INS-1細胞，取出培養(yǎng)基，加入600μl裂解緩沖液(Mini kit，Qiagen，Hilden，德國)。刮下被裂解的細胞，將裂解物收集入Eppendorf管中。用Qiagen Mini kit分離細胞RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，德國)將2μg RNA轉(zhuǎn)錄入cDNA中。使用相應(yīng)于各實驗中所示RNA量的cDNA的等分試樣通過實時PCR對mRNA進行定量，使用light cyclersystem(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，德國)，所用的大鼠Kv1.5通道的特定引物，有義5′-ATC TTC AAG CTCTCC CGC CAC TCC AAG GG-3′；反義5′-GGG TTA TGG AAA GAGGAG TTA-3′。所用的大鼠SGK1引物為有義5′-TTT TTT TTC CCAACC CTT GC-3′；反義5′-AAT GAA CAA AGG TTG GGG GG-3。如所示的那樣對離體的小鼠胰島進行培養(yǎng)并用地塞米松處理。其后，收集胰島，在裂解緩沖液(Mini kit，Qiagen，Hilden，德國)中裂解，并通過反復抽吸將胰島吸入胰島素注射器中。
實施例5蛋白質(zhì)印跡法在不存在(對照)或存在100ng/ml地塞米松的情況下，將INS-1細胞在在70cm2燒瓶中培養(yǎng)給定時間。其后，取出培養(yǎng)基，將細胞在溶液中裂解，所述溶液含有300mM NaCl、20mM TrisHCl，pH 7.4、1％(v/v)TritonX-100、1％去氧膽酸鈉、0.1％SDS、2.5mM EDTA、10μg/ml抑胃酶肽A、10μg/ml抑酶肽和0.1mM PMSF。將用考馬斯藍G染色(Bradford dye assay，Biorad Laboratories GmbH，Munich，德國)定量的50μg總細胞蛋白進行SDS-PAGE(1％)處理，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Schleicher and Schuell，Dassel，德國)上顯圖。用該圖與抗SGK1抗體(New England Biolabs，Beverly，MA，美國)一起進行孵育。用與辣根過氧化物酶偶合的二抗來顯示結(jié)合的抗體。
實施例6調(diào)節(jié)SGK1的化合物6.1.通式I的化合物和其可藥用的衍生物、鹽、溶劑合物和立體異構(gòu)體，包括混合物。
其中R1，R5為H、OH、OA、OAc或甲基，R2，R3，R4，R6，R7，R8，R9，R10為H、OH、OA、OAc、OCF3、Hal、NO2、CF3、A、CN、OSO2CH3、SO2CH3、NH2或COOH，R11為H或CH3，A為具有1、2、3或4個碳原子的烷基，X為CH2、CH2CH2、OCH2或-CH(OH)-，Hal為F、Cl、Br或I。
式I的化合物，其選自下組的化合物(3-羥基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-羥基-苯基)-乙酸-[1-(4-羥基-2-甲氧基-苯基)-亞乙基]-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，苯乙酸-(3-氟-4-羥基-亞芐基)-酰肼，
(4-羥基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3，4-二氯-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，間甲苯基-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，鄰甲苯基-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(2-氯-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-氯-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(4-氟-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(2-氯-4-氟-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-氟-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2，6-二甲基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(3-氟-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-[1-(4-羥基-2-甲氧基-苯基)-亞乙基]-酰肼，(3-甲基磺酰氧基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3，5-二羥基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-氟-苯基)-乙酸-(3-氟-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-乙酸基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-三氟甲基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，3-(3-甲氧基-苯基)-丙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2，4-二羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯氧基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-硝基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(5-氯-2-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2-羥基-5-硝基-亞芐基)-酰肼，2-羥基-2-苯基-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2-乙氧基-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-溴-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-[1-(4-羥基-苯基)-亞乙基]-酰肼，
(3，5-二氟-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-羥基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲基-亞芐基)-酰肼，(3-羥基-苯基)-乙酸-(2-乙氧基-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-羥基-苯基)-乙酸-(2-甲氧基-4-羥基-6-甲基-亞芐基)-酰肼，(2-氟-苯基)-乙酸-(2-甲氧基-4-羥基-亞芐基)-酰肼。
6.2.通式II的化合物和其可藥用的衍生物、鹽、溶劑合物和立體異構(gòu)體，包括混合物。
其中R1，R2，R3，R4，R5為H、A、OH、OA、鏈烯基、炔基、NO2、NH2、NHA、NA2、Hal、CN、COOH、COOA、-OHet、-O-亞烷基-Het、-O-亞烷基-NR8R9或CONR8R9，選自R1、R2、R3、R4、R5的兩個基團還為-O-CH2-CH2-，-O-CH2-O-或-O-CH2-CH2-O-，R6，R7為H、A、Hal、OH、OA或CN，R8，R9為H或A，Het為飽和或不飽和的具有1至4個氮、氧和/或硫原子的雜環(huán)，該雜環(huán)被一個或多個Hal、A、OA、COOA、CN或羰基氧(＝O)取代，A為具有1至10個碳原子的烷基，其中1至7個氫原子可被氟和/或氯取代，X，X’為NH或不存在，Hal為F、Cl、Br或I。
式II的化合物，其選自下組的化合物1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-氯-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，4-二氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，6-二氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(3-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-甲基-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，3，4，5，6-五氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，4-二溴-6-氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-6-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-5-甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，3，4-三氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-溴-2，6-二氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-3-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-(1-叔丁氧羰基-哌啶-4-基)-苯基]-脲，
N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-2，4-二氯-苯甲酰胺，N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-4-氯-5-三氟甲基-苯甲酰胺，N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-2-氟-5-三氟甲基-苯甲酰胺，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-5-三氟甲基-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[(2-氟-5-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[5-氟-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氯-5-三氟甲基-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氟-5-(2-二乙基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氟-5-[2-(哌啶-1-基)-乙氧基]-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-(2-二乙基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-[2-(嗎啉-4-基)-乙氧基]-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-[2-(嗎啉-4-基)-乙氧基]-苯基]-脲，
1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-(2-二乙基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氯-2-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氯-5-(2-二乙基氨基-乙氧基)-苯基]-脲，包括它們的可藥用的衍生物、溶劑合物、鹽、互變異構(gòu)體和立體異構(gòu)體，包括它們?nèi)我獗壤幕旌衔铩?br> 實施例8SGK1核苷酸多態(tài)性定義兼性(facultative)高血壓患者的內(nèi)含子6的核苷酸序列為...aattacattCgcaacccag...，而代表健康人群的核苷酸序列為...aattacattTgcaacccag...。通過登錄號GI 2463200的2070位可得到這兩種序列。
兼性高血壓患者的外顯子8序列為純合的..tactgaCttcggact..或....tactgaTttcggact....或雜合的.tactgaCttcggact...和...tactgaTttcggact..。通過登錄號NM_005627.2的777位可得到這些序列。
具有TT核苷酸組合的純合個體是受保護的，即使在內(nèi)含子6中同時存在CC單核苷酸多態(tài)性也是如此。
實施例9統(tǒng)計數(shù)據(jù)均以均值±SEM表示。用多組的ANOVA和Student’s t-檢驗進行統(tǒng)計分析。p值＜0.05被認為表示統(tǒng)計學顯著。
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權(quán)利要求
1.改變胰島素分泌的方法，其包括使表達SGK1的胰島細胞與調(diào)節(jié)SGK1的物質(zhì)接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中被表達的SGK1包含選擇的SNP變體。
3.權(quán)利要求1-2的方法，其中SGK1的調(diào)節(jié)劑是抑制劑。
4.權(quán)利要求1-2的方法，其中所述的調(diào)節(jié)劑是SGK1的活化劑。
5.權(quán)利要求1的方法，其中SGK1的抑制包括葡萄糖去極化作用的逆轉(zhuǎn)、電壓門控鈣通道的活化和胰島素的釋放。
6.權(quán)利要求5的方法，其中多態(tài)SGK1SNP變體在抑制之前被診斷。
7.權(quán)利要求1-4的方法，其以胰島素分泌的上調(diào)為特征。
8.權(quán)利要求1-4的方法，其中被治療的個體患有2型糖尿病的癥狀。
9.在需要這類治療的個體中減少糖皮質(zhì)激素誘導的2型糖尿病的方法，該方法調(diào)節(jié)胰島細胞中SGK1的活性。
10.權(quán)利要求1-4的方法，其中被治療的個體具有應(yīng)激誘導的高血糖。
11.權(quán)利要求1-4的方法，其中被治療的個體具有低血糖。
12.通過測定SGK1的表達來確定疾病的進展、消退或發(fā)作的方法，其包括從患病個體取樣。
13.權(quán)利要求12的方法，其中SGK1包含選擇的SNP變體。
14.藥物組合物，其包含SGK1抑制劑以及藥學上有效的載體、賦形劑或稀釋劑。
15.選自所列的具有通式I或II的化合物的SGK1抑制劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療由胰島素分泌受損引起的障礙。
全文摘要
胰島細胞中糖皮質(zhì)激素誘導的激酶SGK1的活性的調(diào)節(jié)可恢復胰島素釋放。本發(fā)明還公開了可用于治療糖皮質(zhì)激素誘導的2型糖尿病的方法和化合物。
文檔編號A61K31/519GK1929831SQ200580007251
公開日2007年3月14日 申請日期2005年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月8日
發(fā)明者F·朗 申請人:默克專利有限公司