專利名稱：得自山茶科植物的生物活性組合物及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求保護2004年1月12日提交的美國臨時專利申請序號60/535,861的權(quán)益。
本發(fā)明涉及得自山茶科(Theacea)植物的生物活性組合物、其生產(chǎn)方法和這些組合物的用途。
背景技術(shù)：
山茶(茶植物)科包括含約40個屬和600個種的樹或灌木。茶樹(Camellia sinensis)在山茶科中占據(jù)著獨特的位置，因為此特殊的植物種主要用作生產(chǎn)全部三種基本茶類綠茶、烏龍茶和紅茶的單一原料源(在本文統(tǒng)稱為“茶植物”)。按照某些來源，有第4類茶，即所謂的“白茶”，其專門由茶植物的芽或梢生產(chǎn)。
茶的三種基本形式由加工程度決定，加工使用同等嫩幼茶葉。采集、分揀、清潔葉子，以不同方式氧化，然后蒸煮或干燥。術(shù)語“發(fā)酵”經(jīng)常用于描述茶的加工，但術(shù)語“氧化”是對所發(fā)生的化學轉(zhuǎn)變的更精確描述。
盡管加工有一些變化，但一般認為綠茶氧化程度最低，紅茶最高。烏龍茶被認為是部分氧化的，因此處于綠茶和紅茶之間的位置。就加工而言，綠茶和白茶之間的差異非常小(或根本沒有差異)。
蒸煮并萎凋鮮葉，然后立即干燥，由此制備綠茶。使葉萎凋，在滾筒中碾碎，然后使其氧化幾小時，之后干燥，由此制備紅茶。烏龍茶得自干燥前僅部分氧化的葉子。
在世界范圍內(nèi)，茶是第二大(在水之后)最常飲用的液體，在美國是第六大(在水、軟飲料、咖啡、啤酒和奶之后)最常飲用的液體。茶消費量在世界范圍內(nèi)持續(xù)增加，這尤其歸因于關(guān)于該液體健康利益的公眾認知逐漸增加。有越來越多的出版物提出茶及其成分的抗血管生成、抗細菌、抗癌、抗炎癥、抗誘變、抗氧化物、抗膿毒和解毒特性。茶益處的名單還包括降低類風濕性關(guān)節(jié)炎風險、降低膽固醇水平和抗糖尿病特性。不是所有這些利益都被證明是統(tǒng)計學顯著的。不過，非常廣泛范圍的茶益處反映了非常強生物活性物質(zhì)的獨特組成，這些物質(zhì)存在于新鮮植物葉中，并經(jīng)得住常規(guī)的茶加工。
具體地說，業(yè)已報道茶樹的鮮葉含22.2％多酚、17.2％蛋白、4.3％咖啡因、27.0％粗纖維、0.5％淀粉、3.5％還原糖、6.5％果膠、2.0％醚提取物和5.6％灰分(Duke，J.A.，Handbook of Energy Crops(1983)，參見www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia_sinensis.html)。據(jù)報道每100g葉含8.0g H2O、24.5g蛋白、2.8g脂肪、58.8g總碳水化合物、8.7g纖維、5.9g灰分、327mg Ca、313mg P、24.3mgFe、50mg Na、2700μg β-胡蘿卜素等同物、0.07mg硫胺素、0.8mg核黃素、7.6mg煙酸和9mg抗壞血酸。另一個報道記錄到8.0g H2O、28.3g蛋白、4.8g脂肪、53.6g總碳水化合物、9.6g纖維、5.6g灰分、245mg Ca、415mg P、18.9mg Fe、60mg Na、8400μg β-胡蘿卜素等同物、0.38mg硫胺素、1.24mg核黃素、4.6mg煙酸和230mg抗壞血酸。再另一個報道得到8.1g H2O、24.1g蛋白、3.5g脂肪、59.0g總碳水化合物、9.7g纖維、5.3g灰分、320mg Ca、185mg P、31.6mg Fe、8400μg β-胡蘿卜素等同物、0.07mg硫胺素、0.79mg核黃素、7.3mg煙酸和85mg抗壞血酸(J.A.Duke和A.A.Atchley，“Proximate Analysis，”載于Christie，B.R.(編輯)，The Handbook ofPlant Science in Agriculture，CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L(1984))。
葉還含有胡蘿卜素、核黃素、煙酸、泛酸和抗壞血酸?？Х纫蚝偷幨瞧渲凶钣谢钚缘慕M分(Council for Scientific and IndustrialResearch，1948-1976)。鮮葉中存在的抗壞血酸在制備紅茶時被破壞。存在蘋果酸和草酸，以及山奈酚、槲皮苷、茶堿、可可堿、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、樹膠、糊精和肌醇。揮發(fā)油(葉鮮重的0.007-0.014％)的主要組分是己烯醛、已烯醇和低級醛、丁醛、異丁醛(isobuteraldehyde)、異戊醛以及正-己基、芐基和苯乙基醇、苯酚、甲酚、己酸、正-辛醇、香葉醇、沉香醇、苯乙酮、芐醇和檸檬醛。
已發(fā)現(xiàn)鮮茶葉通常具有高水平的多酚(兒茶素)黃烷醇基團，其可高達葉干物質(zhì)的30％。兒茶素主要包括(-)-表兒茶素、(-)-表兒茶素沒食子酸酯、(-)-表沒食子兒茶素和(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯。另外存在茶獨有的3-沒食子?；鼘幩?茶沒食子素)和氨基酸茶氨酸(5-N-乙基谷氨酰胺)(Duke，J.A.，Handbook of Energy Crops(1983)，參見www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia_sinensis.html)。
茶葉含高水平的多酚氧化酶和過氧化物酶。第一種酶催化兒茶素的需氧氧化，該過程在葉細胞結(jié)構(gòu)完整性被破壞時啟動。酚氧化酶負責產(chǎn)生雙黃烷醇、茶黃素、表茶黃酸和Thearubigens，它們構(gòu)成了紅茶中可提取物質(zhì)的最大部分。這些化合物大部分易于和咖啡因形成復(fù)合物，咖啡因在鮮葉中具有顯著水平(干物質(zhì)的2-4％)。過氧化物酶在與原花色素產(chǎn)生上述復(fù)合物時起重要作用。在紅茶香味組分中存在的數(shù)百種揮發(fā)性化合物中，有多種化合物的形成也由兒茶素醌啟動。另外，發(fā)生相對可溶性的糖苷向較低溶解性糖苷配基的轉(zhuǎn)變。
以上過程的所有復(fù)雜級聯(lián)都由葉細胞結(jié)構(gòu)的破壞啟動，并隨氧化時間加強。因此，通常以強烈揉或切或相對長時間氧化加工的紅茶組成與鮮葉的組成極為不同。盡管綠茶(和白茶)以最小氧化加工，其組成與鮮葉的組成更類似，但也有非酶或酶催化的變化，這些變化在采摘后極為快速地發(fā)生，在干燥階段產(chǎn)生新的揮發(fā)性物質(zhì)。因此，即便是相對溫和的綠茶加工也產(chǎn)生了與原始新鮮植物組成的某些偏離，可降低鮮茶植物葉的治療價值和其它療效。
眾多的近期研究清楚表明，茶的療效以下列順序降低白茶＞綠茶＞烏龍茶＞紅茶。因此，研究新鮮茶植物可防止由于常規(guī)茶加工而觀察到的特定活性降解。鮮嫩山茶(Camellia)葉含約80％水。細胞的堅固細胞壁防止細胞膨脹和脫水。細胞壁結(jié)構(gòu)的破壞引起新鮮植物組織脫水，接著引起一系列有害的物理化學和生物化學過程滲壓休克、酶區(qū)室化喪失和破壞、水解和氧化、酚聚合、糖苷轉(zhuǎn)變成糖苷配基、產(chǎn)生Maillard反應(yīng)產(chǎn)物、異構(gòu)化和微生物污染。因此，鮮山茶含非常廣泛范圍的生物活性物質(zhì)，其僅有一部分在常規(guī)提取過程中變成可利用的。因此，僅有細胞壁、分解代謝產(chǎn)物和穩(wěn)定代謝物可用沸水提取，以獲得茶飲料，或用不同的溶劑提取，以獲得有限部分的生物活性組分(主要為多酚和類黃酮)。
按照鮮茶葉作為有價值治療劑和其它潛在有益生物活性組合物來源的潛能，需要研究鮮茶植物，以確定如何最大化其治療作用和其它潛在的有益生物活性特性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種生物活性組合物。在一個實施方案中，生物活性組合物包括得自山茶科植物的分離生物活性組分。合適的生物活性組分可包括但不限于細胞壁組分、細胞壁組分提取物、膜組分、膜組分提取物、胞質(zhì)組分、胞質(zhì)組分提取物、細胞汁漿液和/或其組合。
本發(fā)明還涉及適于局部施用于哺乳動物的生物活性局部制劑。在一個實施方案中，生物活性局部制劑包含局部有效量的本發(fā)明生物活性組合物。生物活性局部制劑可進一步包含局部可接受的載體。
本發(fā)明還涉及在哺乳動物皮膚組織中抑制炎性活性的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進一步包括以在皮膚組織中有效抑制炎性活性的量將生物活性組合物施用于皮膚組織。
本發(fā)明還涉及保護哺乳動物皮膚組織免受紫外線誘導(dǎo)損傷的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進一步包括以有效減輕皮膚組織紫外線誘導(dǎo)損傷和防止皮膚組織氧化損傷的量將生物活性組合物施用于皮膚組織。
本發(fā)明還涉及使哺乳動物皮膚組織中的皮膚病正常化的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進一步包括以有效使皮膚組織的細胞疾病正常化的量將生物活性組合物施用于皮膚組織。
本發(fā)明還涉及用于分離得自山茶科植物細胞汁的生物活性組分的方法。該方法包括提供山茶科植物。然后將山茶科植物分離成細胞汁和細胞壁組分。然后在有效生產(chǎn)生物活性組分的條件下處理細胞汁。合適的生物活性組分包括但不限于膜組分、膜組分提取物、胞質(zhì)組分、胞質(zhì)組分提取物和/或細胞汁漿液。然后分離生物活性組分和處理的細胞汁。本發(fā)明進一步涉及由該方法生產(chǎn)的分離生物活性組合物。
本發(fā)明進一步涉及用于分離得自山茶科植物細胞壁組分的生物活性組分的方法。該方法包括提供山茶科植物。然后將山茶科植物分離成細胞汁和細胞壁組分。然后在有效生產(chǎn)生物活性組分的條件下處理細胞壁組分。然后分離生物活性組分和處理的細胞壁組分。本發(fā)明進一步涉及由該方法生產(chǎn)的分離的生物活性組合物。
本發(fā)明用于解決常規(guī)茶加工法的缺陷，具體地說是常規(guī)茶加工不能保存廣泛范圍的有效生物活性組合物的缺陷。如本發(fā)明所提供的，在沒有發(fā)酵和過度熱處理的情況下加工新鮮山茶生物質(zhì)，可產(chǎn)生比常規(guī)茶加工產(chǎn)物更強和更多樣化的生物活性組合物。
附圖簡述

圖1是一幅示意圖，示范了本發(fā)明生物活性組合物制備方法的一個實施方案。
圖2圖示了細胞壁組分提取物和常規(guī)茶(稀釋度1∶1000)的UV/VIS光譜。
圖3圖示了山茶生物活性組合物(稀釋度1∶4000)的UV/VIS光譜。
圖4圖示了應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的細胞壁組分提取物和常規(guī)茶的吸收光譜。干物質(zhì)水平相等。
圖5圖示了應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶生物活性組合物的吸收光譜。干物質(zhì)水平相等。
圖6圖示了應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶生物活性組合物和白茶提取物的吸收光譜。
圖7A圖示了在稀釋溶液(1∶200)中和應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶膜組分提取物的吸收光譜。圖7B圖示了在稀釋溶液(1∶200)中和應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶細胞汁漿液的吸收光譜。
圖8A圖示了在稀釋溶液(1∶200)中和應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的大麥(Hordeum vulgare)細胞汁漿液的吸收光譜。圖8B圖示了在稀釋溶液(1∶200)中和應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的鼠尾草(Salviaofficinalis)細胞汁漿液的吸收光譜。
圖9圖示了廣譜UV照射對Vitro-Skin測試底物(IMS TestingGroup，Milord，CT)的作用。
圖10圖示了廣譜UV照射對應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上的白茶提取物的作用。
圖11圖示了廣譜UV照射對應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上的細胞壁組分提取物的作用。
圖12圖示了廣譜UV照射對應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上的山茶膜組分提取物的作用。
圖13圖示了廣譜UV照射對應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上的山茶細胞汁漿液的作用。
圖14圖示了白茶提取物對培養(yǎng)24小時和48小時的MDA-MB-435S細胞的作用。
圖15圖示了白茶提取物對培養(yǎng)24小時(對照)和在5ng/ml TGF-β存在下培養(yǎng)24小時和48小時的MCF-7細胞的作用。
圖16圖示了細胞壁組分提取物對培養(yǎng)24小時和48小時的MDA-MB-435S細胞的作用。
圖17圖示了細胞壁組分提取物對培養(yǎng)24小時(對照)和在5ng/mlTGF-β存在下培養(yǎng)24小時和48小時的MCF-7細胞的作用。
圖18圖示了膜組分提取物對培養(yǎng)24小時和48小時的MDA-MB-435S細胞的作用。
圖19圖示了膜組分提取物對培養(yǎng)24小時(對照)和在5ng/mlTGF-β存在下培養(yǎng)24小時和48小時的MCF-7細胞的作用。
圖20圖示了細胞汁漿液對培養(yǎng)24小時和48小時的MDA-MB-435S細胞的作用。
圖21圖示了細胞汁漿液對培養(yǎng)24小時(對照)和在5ng/ml TGF-β存在下培養(yǎng)24小時和48小時的MCF-7細胞的作用。
圖22圖示了白茶提取物對培養(yǎng)24小時和48小時的Mono Mac 6細胞的作用。
圖23圖示了白茶提取物對在10nM PMA存在下培養(yǎng)24小時和48小時的Mono Mac 6細胞的作用。
圖24圖示了細胞壁組分提取物對培養(yǎng)24小時和48小時的MonoMac 6細胞的作用。
圖25圖示了細胞壁組分提取物對在10nM PMA存在下培養(yǎng)24小時和48小時的Mono Mac 6細胞的作用。
圖26圖示了膜組分提取物對培養(yǎng)24小時和48小時的Mono Mac6細胞的作用。
圖27圖示了膜組分提取物對在10nM PMA存在下培養(yǎng)24小時和48小時的Mono Mac 6細胞的作用。
圖28圖示了細胞汁漿液對培養(yǎng)24小時和48小時的Mono Mac 6細胞的作用。
圖29圖示了細胞汁漿液對在10nM PMA存在下培養(yǎng)24小時和48小時的Mono Mac 6細胞的作用。
圖30圖示了白茶提取物對PMA刺激的Mono Mac 6細胞分泌的MMP水平的作用。
圖31圖示了細胞壁組分提取物對PMA刺激的Mono Mac 6細胞分泌的MMP水平的作用。
圖32圖示了膜組分提取物對PMA刺激的Mono Mac 6細胞分泌的MMP水平的作用。
圖33圖示了細胞汁漿液對PMA刺激的Mono Mac 6細胞分泌的MMP水平的作用。
圖34是Mono Mac 6細胞接觸白茶提取物48小時后收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜，以及由在無(U)或有(S)10nM PMA但無山茶組合物的情況下培養(yǎng)的細胞收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜。
圖35是Mono Mac 6細胞接觸細胞壁組分提取物48小時后收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜，以及由在無(U)或有(S)10nM PMA但無山茶組合物的情況下培養(yǎng)的細胞收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜。
圖36是Mono Mac 6細胞接觸膜組分提取物48小時后收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜，以及由在無(U)或有(S)10nM PMA但無山茶組合物的情況下培養(yǎng)的細胞收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜。
圖37是Mono Mac 6細胞接觸細胞汁漿液48小時后收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜，以及由在無(U)或有(S)10nM PMA但無山茶組合物的情況下培養(yǎng)的細胞收集的培養(yǎng)基的明膠酶譜。
圖38是對比白茶提取物(“WTE”)和本發(fā)明的細胞壁組分提取物(“CWFE”)、膜組分提取物(“MFE”)以及細胞汁漿液(“CJS”)中的各種兒茶素含量的條形圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種生物活性組合物。在一個實施方案中，生物活性組合物包括得自山茶科植物的分離的生物活性組分。本文使用的術(shù)語“分離的生物活性組分”意欲包括分離自還沒有經(jīng)歷任何常規(guī)茶加工(例如熱處理、氧化、發(fā)酵、干燥)的山茶科植物(例如山茶科植物的新鮮生物質(zhì))的組分。合適的分離的生物活性組分可包括但不限于細胞壁組分、細胞壁組分提取物、膜組分、膜組分提取物、胞質(zhì)組分、胞質(zhì)組分提取物、細胞汁漿液和/或其組合。
本發(fā)明的生物活性組合物和生物活性組分可具有如下限定的各種兒茶素分布和總兒茶素含量，并使用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)兒茶素檢定方法測定。本文使用的術(shù)語“兒茶素”一般指所有的兒茶素，包括但不限于以下特定類型的兒茶素(i)(-)-表沒食子兒茶素(參見CAS No.970-74-1，其通過引用整體結(jié)合到本文中)；(ii)(+)-兒茶素(參見CAS No.7295-85-4，其通過引用整體結(jié)合到本文中)；(iii)(-)-表兒茶素(參見CAS No.490-46-0，其通過引用整體結(jié)合到本文中)；(iv)(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(參見CAS No.989-51-5，其通過引用整體結(jié)合到本文中)；(v)(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(參見CAS No.4233-96-9，其通過引用整體結(jié)合到本文中)；和(vi)(-)-表兒茶素沒食子酸酯(參見CAS No.1257-08-5，其通過引用整體結(jié)合到本文中)?！翱們翰杷睾俊?如本文使用的)指包含在本發(fā)明的具體生物活性組合物或生物活性組分中的所有兒茶素的組合含量水平，不是指限于僅上文列出的特定類型兒茶素的含量水平。本文使用的術(shù)語“兒茶素含量分布”用于描述在本發(fā)明的具體生物活性組合物或生物活性組分中包含的選定兒茶素的量。
在本發(fā)明生物活性組合物的一個實施方案中，生物活性組分可為細胞壁組分。
在本發(fā)明生物活性組合物的一個實施方案中，生物活性組分可為細胞壁組分提取物。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，細胞壁組分提取物可具有約2.1至約4.5mg總兒茶素含量/g干物質(zhì)，具體地說為約2.6至約4.0mg總兒荼素含量/g干物質(zhì)，更具體地說為約3.0至約3.6mg總兒茶素含量/g干物質(zhì)。在另一個具體實施方案中，細胞壁組分提取物可具有如下的兒茶素含量分布(i)約2.0至約3.0mg(+)-兒茶素/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；(ii)約0.005至約0.02mg(-)-表兒茶素/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；(iii)約0.005至約0.02mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；和(iv)約0.003至約0.01mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)。更具體地說，細胞壁組分提取物可具有如下的兒茶素含量分布(i)約2.2至約2.7mg(+)-兒茶素/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；(ii)約0.01至約0.015mg(-)-表兒茶素/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；(iii)約0.01至約0.015mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；和(iv)約0.005至約0.007mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)。
在本發(fā)明生物活性組合物的一個實施方案中，生物活性組分可為膜組分。
在本發(fā)明生物活性組合物的一個實施方案中，生物活性組分可為膜組分提取物。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，膜組分提取物可具有約15.0至約30.5mg總兒茶素含量/g干物質(zhì)，具體地說為約18.0至約27.5mg總兒茶素含量/g干物質(zhì)，更具體地說為約21.0至約24.5mg總兒茶素含量/g干物質(zhì)。在另一個具體實施方案中，膜組分提取物可具有如下的兒荼素含量分布(i)約1.7至約3.3mg(-)-表沒食子兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；(ii)約6.1至約10.2mg(+)-兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；(iii)約0.3至約1.1mg(-)-表兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；(iv)約6.2至約12.5mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)；(v)約0.007至約0.03mg(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)；和(vi)約1.3至約3.3mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)。更具體地說，膜組分提取物可具有如下的兒茶素含量分布(i)約2.0至約3.0mg(-)-表沒食子兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；(ii)約7.0至約9.0mg(+)-兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；(iii)約0.5至約0.9mg(-)-表兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；(iv)約8.0至約10.0mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)；(v)約0.01至約0.02mg(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)；和(vi)約1.8至約2.8mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)。
在本發(fā)明生物活性組合物的一個實施方案中，生物活性組分可為胞質(zhì)組分。
在本發(fā)明生物活性組合物的一個實施方案中，生物活性組分可為胞質(zhì)組分提取物。
在本發(fā)明生物活性組合物的一個實施方案中，生物活性組分可為細胞汁漿液。在一個具體實施方案中，細胞汁漿液可具有約8.0至約20.0mg總兒茶素含量/g干物質(zhì)，具體地說為約10.0至約18.0mg總兒茶素含量/g干物質(zhì)，更具體地說為約12.0至約16.0mg總兒茶素含量/g干物質(zhì)。在另一個具體實施方案中，細胞汁漿液可具有如下的兒茶素含量分布(i)約2.1至約4.4mg(-)-表沒食子兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；(ii)約4.2至約8.6mg(+)-兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；(iii)約0.2至約2.0mg(-)-表兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；(iv)約1.2至約3.2mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)；(v)約0.01至約0.1mg(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)；和(vi)約0.2至約1.3mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)。更具體地說，細胞汁漿液可具有如下的兒茶素含量分布(i)約3.0至約3.5mg(-)-表沒食子兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；(ii)約5.0至約7.0mg(+)-兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；(iii)約0.7至約1.5mg(-)-表兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；(iv)約1.7至約2.7mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)；(v)約0.03至約0.07mg(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)；和(vi)約0.5至約1.0mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)。
在一個實施方案中，山茶科植物的新鮮生物質(zhì)可用于分離本發(fā)明的生物活性組合物。新鮮生物質(zhì)可取自屬于山茶屬和/或柃木屬的山茶科植物。用于本發(fā)明的山茶屬的合適種可包括但不限于茶樹(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japonica)、云南山茶花(Camelliareticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。用于本發(fā)明的柃木屬的合適種可包括但不限于Eurya sandwicensis。
本發(fā)明的生物活性組合物可進一步包含穩(wěn)定劑。合適的穩(wěn)定劑是本領(lǐng)域常用的那些穩(wěn)定劑。特別合適的穩(wěn)定劑可包括但不限于乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、聚合物基質(zhì)和/或其混合物。
在本發(fā)明的一個方面，生物活性組分可對至少一種哺乳動物細胞功能具有調(diào)節(jié)活性。這種調(diào)節(jié)活性可包括例如細胞生長抑制活性、細胞生長刺激活性、酶分泌活性、酶抑制活性、抗氧化劑活性、UV防護活性、抗炎活性、傷口愈合活性和/或這些活性的組合。對于細胞生長抑制活性，這種活性可包括癌細胞生長抑制。本發(fā)明的生物活性組分可抑制其生長的合適癌細胞可包括但不限于乳癌細胞和/或結(jié)腸癌細胞。所述細胞生長抑制活性還可包括白血病細胞生長抑制。本發(fā)明的生物活性組分可抑制其生長的合適白血病細胞可包括但不限于單核細胞白血病細胞。
在另一個實施方案中，生物活性組合物可有效抑制皮膚細胞的有害過度增殖或增殖不足和/或抑制皮膚細胞中有害的、不協(xié)調(diào)的酶活性或酶分泌過程。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的生物活性組合物可進一步包含本領(lǐng)域常用的、用于全身或局部給予的傳遞系統(tǒng)。
本發(fā)明還涉及適合局部施用于哺乳動物的生物活性局部制劑。在一個實施方案中，生物活性局部制劑包含局部有效量的本發(fā)明生物活性組合物。生物活性局部制劑還可包含局部可接受的載體。合適的局部可接受的載體可包括但不限于親水膏劑型基質(zhì)、親水洗劑型基質(zhì)、親水表面活性劑基質(zhì)、親水凝膠型基質(zhì)、親水溶液型基質(zhì)、疏水膏劑型基質(zhì)、疏水洗劑型基質(zhì)、疏水表面活性劑基質(zhì)、疏水凝膠型基質(zhì)、疏水溶液型基質(zhì)。在一個實施方案中，生物活性組合物可以生物活性局部制劑總重的約0.001％至約90％的量存在。
本發(fā)明還涉及在哺乳動物皮膚組織中抑制炎性活性的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進一步包括將生物活性組合物以有效抑制皮膚組織中的炎性活性的量應(yīng)用于皮膚組織。在該方法的一個實施方案中，生物活性組合物還可包含穩(wěn)定劑(其合適的實例如本文所述)。在該方法的另一個實施方案中，生物活性組合物還可包含局部可接受的載體(其合適的實例如本文所述)。
本發(fā)明還涉及保護哺乳動物皮膚組織免受紫外線誘導(dǎo)損傷的方法。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進一步包括將生物活性組合物以有效減輕皮膚組織的紫外線誘導(dǎo)損傷和防止皮膚組織氧化損傷的量應(yīng)用于皮膚組織。在一個實施方案中，該方法用于保護皮膚組織免受約320至約400nm范圍的紫外線引起的紫外線誘導(dǎo)損傷。在該方法的另一個實施方案中，生物活性組合物還可包含穩(wěn)定劑(其合適的實例如本文所述)。在該方法的另一個實施方案中，生物活性組合物還可包含局部可接受的載體(其合適的實例如本丈所述)。
本發(fā)明還涉及在哺乳動物皮膚組織中使皮膚病正?；姆椒?。該方法包括提供本發(fā)明的生物活性組合物。該方法進一步包括將生物活性組合物以使皮膚組織中的細胞疾病正?；挠行Я繎?yīng)用于皮膚組織。在該方法的一個實施方案中，生物活性組合物還可包含穩(wěn)定劑(其合適的實例如本文所述)。在該方法的另一個實施方案中，生物活性組合物還可包含局部可接受的載體(其合適的實例如本文所述)。
本發(fā)明還涉及用于分離得自山茶科植物細胞汁的生物活性組分的方法。該方法包括提供山茶科植物(例如為新鮮生物質(zhì)形式)。適用于該方法的山茶科植物如上文所述。然后將山茶科植物(例如新鮮生物質(zhì))分離成細胞汁和細胞壁組分。然后在有效產(chǎn)生生物活性組分的條件下處理細胞汁。合適的生物活性組分包括但不限于膜組分、膜組分提取物、胞質(zhì)組分、胞質(zhì)組分提取物和/或細胞汁漿液。然后分離生物活性組分和處理的細胞汁。在一個實施方案中，由該方法生產(chǎn)的各種合適的生物活性組分如本文所述。本發(fā)明進一步涉及由該方法生產(chǎn)的分離的生物活性組分。
本發(fā)明還涉及用于分離得自山茶科植物細胞壁組分的生物活性組分的方法。該方法包括提供山茶科植物(例如為新鮮生物質(zhì)形式)。然后將山茶科植物(例如新鮮生物質(zhì))分離成細胞汁和細胞壁組分。在有效產(chǎn)生生物活性組分的條件下處理細胞壁組分。然后分離生物活性組分和處理的細胞壁組分。在一個實施方案中，由該方法生產(chǎn)的各種合適的生物活性組分如本文所述。本發(fā)明進一步涉及由該方法生產(chǎn)的分離的生物活性組分。
作為實例，用于制備本發(fā)明的生物活性組分(如上文所述)的全過程以示意圖形式示于圖1。加工步驟的細節(jié)進一步描述于實施例(見下丈)。如圖1所示，在有效破壞堅固細胞壁的條件下，對山茶科植物的新鮮生物質(zhì)10(例如新鮮植物生物質(zhì))進行研磨、浸漬和擠壓20，由此產(chǎn)生植物細胞汁30和細胞壁32。新鮮生物質(zhì)10還用于常規(guī)茶加工22，以生產(chǎn)陽性對照150，用于對比測試和評價。對細胞汁30進行凝結(jié)40(例如微波處理)，以實現(xiàn)新鮮植物生物質(zhì)10膜組分的定量凝結(jié)。凝結(jié)40足以能夠在隨后使細胞汁30的凝結(jié)膜組分與其它未凝結(jié)組分分離。如圖1所示，這種分離的一個實施方案如下實現(xiàn)冷卻和離心42，以獲得膜組分(沉淀)50和上清液60，上清液60無特異性葉綠體膜組分，例如葉綠素和磷脂。
為生產(chǎn)細胞壁組分提取物(即組合物A 110)，對細胞壁32進行干燥34(例如隨后的幾次微波處理)，然后在常用于制備常規(guī)茶的條件下將干燥的材料與水36混合(混合在85℃的水中)。
為生產(chǎn)膜組分提取物(即組合物B 120)，使膜組分50與溶劑52混合，然后離心54，得到上清液56和組合物B 120。
為生產(chǎn)胞質(zhì)組分提取物(即組合物C 130)，對上清液60進行凝結(jié)62(例如等電沉淀)和離心64，以產(chǎn)生含大部分可溶性胞質(zhì)蛋白的胞質(zhì)組分(沉淀)70。然后使胞質(zhì)組分(沉淀)70與溶劑72混合，接著離心74，獲得上清液76，然后獲得組合物C 130。
為生產(chǎn)細胞汁漿液(即組合物D 140)，對上清液60進行凝結(jié)62(例如等電沉淀)和離心64，得到細胞汁漿液(上清液)66，然后獲得組合物D 140。
新鮮生物質(zhì)10的常規(guī)茶加工22用于生產(chǎn)例如陽性對照150(各種茶的陽性對照，包括例如白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶)。
然后，組合物A 110、組合物B 120、組合物C 130、組合物D 140和陽性對照150可用于過濾和測試80。
本發(fā)明還涉及將生物活性組合物的低分子量和還原、非氧化組分選擇性分散入液體中的裝置。在一個實施方案中，該裝置包括本發(fā)明的生物活性組合物。生物活性組合物可封裝在濾袋中。合適的濾袋可為有效將生物活性組合物的低分子量和還原、非氧化的組分選擇性分散入液體中的濾袋。在一個實施方案中，濾袋包含使生物活性組合物的低分子量和還原、非氧化組分由濾袋中分散入液體中的選擇性膜，但該膜抑制濾袋中的高分子量和氧化組分由濾袋中分散入液體中。本文使用的術(shù)語“低分子量和還原、非氧化的組分”包括低于或等于約5,000道爾頓的本發(fā)明生物活性組合物組分。在該方法的一個實施方案中，生物活性組合物還可包含穩(wěn)定劑(其合適的實例如本文所述)。在該方法的另一個實施方案中，生物活性組合物還可包含局部可接受的載體(其合適的實例如本文所述)。
本發(fā)明還涉及制備含低分子量和還原、非氧化生物活性組合物的治療性飲料的方法。該方法包括提供按照本發(fā)明方法生產(chǎn)的裝置。該裝置在有效使生物活性組合物的低分子量和還原、非氧化組分分散入液體中的條件下使裝置與液體接觸。在該方法的一個實施方案中，生物活性組合物還可包含穩(wěn)定劑(其合適的實例如本文所述)。在該方法的另一個實施方案中，生物活性組合物還可包含局部可接受的載體(其合適的實例如本文所述)。適用于該方法的液體可包括但不限于水。水可為熱水和冷水。本發(fā)明還涉及按照該方法生產(chǎn)的治療性飲料。
實施例實施例1-得自茶樹(Camellia sinensis)植物的生物活性組合物的制備本發(fā)明生物活性組合物制備方法的一個實施方案的流程圖示于圖1。以下是本發(fā)明方法的一個實施方案的相關(guān)方面的描述。
生物質(zhì)制備。收集足量的新鮮山茶(Camellia Sinensis)植物生物質(zhì)(僅具有芽的頂端幼嫩葉組織)，以獲得約100kg干物質(zhì)。經(jīng)計算，新鮮生物質(zhì)的干物質(zhì)水平為21.70％，需要收集約461kg新鮮植物生物質(zhì)來獲得100kg干物質(zhì)。小心保存植物生物質(zhì)的固有含水量，并小心避免由于水分丟失而萎凋。以避免或最小程度切碎、搗碎和碾碎所收集的生物質(zhì)的方式進行收集，以避免破壞葉細胞結(jié)構(gòu)，破壞葉細胞結(jié)構(gòu)可觸發(fā)由酚氧化酶和過氧化物酶催化的內(nèi)源性酶反應(yīng)。因為這些反應(yīng)隨氧化時間加強，所以所有步驟都在盡可能最短的時間段內(nèi)完成。例如，收集的生物質(zhì)在軋切后不超過10分鐘就付與加工。進行此步驟是為了使植物生物質(zhì)與陽光、高溫和其它負面環(huán)境因素的接觸最小。進行清洗步驟，以在進一步加工前去除土壤顆粒和植物的其它碎屑。此清洗可通過在≤1kg/cm2水壓下清洗收集的植物≤5分鐘完成。殘余的水清洗液不包含任何綠色或褐色色素，這表明水壓和清洗持續(xù)時間正確。由清洗的植物生物質(zhì)中去除過量的水。
研磨、浸漬和擠壓植物生物質(zhì)。在收獲、收集和清洗植物生物質(zhì)后，接著對植物進行研磨、浸漬和擠壓，以提取胞內(nèi)成分(即植物細胞汁)，將其與富含纖維的細胞壁組分(細胞壁組分)分離。使用具有10馬力發(fā)動機和顯示屏組件的錘磨機(型號VS 35，VincentCorporation，F(xiàn)L)研磨生物質(zhì)，以在最短時間內(nèi)獲得合適小尺寸的植物組織顆粒，而不顯著增加生物質(zhì)溫度。設(shè)定錘磨機，以在≤10秒的處理過程中產(chǎn)生最大尺寸≤0.5cm的浸漬物顆粒。生物質(zhì)溫度僅增加≤5℃。立即使用水平連續(xù)螺旋壓榨機(Compact Press“CP-6”，Vincent Corporation，F(xiàn)L)由植物中提取植物細胞汁。螺旋壓榨機錐體上的壓力保持在24kg/cm2的水平，螺旋速度為12rpm，溫度僅增加≤5℃。此處理產(chǎn)生185kg干物質(zhì)水平為41.39％的細胞壁組分和276kg干物質(zhì)水平為8.49％的植物細胞汁。
細胞壁組分提取物(組合物A)的制備。將初始干物質(zhì)水平41.39％的細胞壁組分等份在排風式微波爐(Model GH9115XE，Whirlpool)中干燥30秒，然后冷卻30秒。重復(fù)此處理幾次，直至細胞壁組分中的干物質(zhì)水平達到96.52％。將溫度為85℃的66.0L去離子水加入到4.0kg干細胞壁組分中，以高攪拌操作5分鐘。這些條件與描述于D’Amelio，F(xiàn).S.，Botanicals.A Phytocosmetic Desk Reference，Boca Raton，London，New York，Washington，D.C.CRC Press，361頁(1999)(其通過引用整體結(jié)合到本文中)(另參見www.leaftea.com；www.divinitea.com；www.equatorcoffee.com的討論，其通過引用整體結(jié)合到本文中)的茶制備方法一致。將混合物通過4層尼龍纖維過濾，然后通過0.8μm孔徑濾器過濾。獲得的細胞壁提取物的pH等于5.24，干物質(zhì)水平等于0.84％。此提取物進一步用于測試其活性。
膜組分與細胞汁的分離。干物質(zhì)水平為8.49％的初始植物細胞汁含小纖維顆粒，其可通過4層尼龍纖維過濾或使用低速離心生物質(zhì)去除。使過濾的植物細胞汁暴露于使用溫度傳感器控制的微波處理。繼續(xù)此處理，直至細胞汁溫度達到60℃。一旦誘發(fā)凝結(jié)，就立即將處理的細胞汁冷卻至40℃。使用高于或等于3,000g、大于或等于20分鐘的離心實現(xiàn)膜組分與凝結(jié)細胞汁的分離。這產(chǎn)生了膜組分(沉淀)以及含胞質(zhì)組分和細胞漿液組分(即低分子量可溶性組分)的細胞汁上清液。使用干物質(zhì)水平32.89％的膜組分制備來源于膜提取物的生物活性組合物。細胞汁上清液用于進一步加工，以獲得胞質(zhì)組分和細胞汁漿液。
膜組分提取物(組合物B)的制備。在恒定攪拌下于室溫將1份膜組分(10.0kg)和2份二甲基亞砜(20.0kg)混合1小時。然后材料以高于或等于4,000g、大于或等于45分鐘離心。棄去沉淀，上清液通過0.8μm孔徑濾器過濾。干物質(zhì)水平為6.83％的此濾過液—膜組分提取物(組合物B)進一步用于測試其活性。
胞質(zhì)組分與細胞汁上清液的分離。為了分離出胞質(zhì)組分，對細胞汁上清液進行等電沉淀。使用采用5.0N鹽酸(HCl)的滴定法使細胞汁上清液的pH達到4.0，誘使胞質(zhì)組分沉淀。通過以高于或等于3,000g、大于或等于20分鐘離心，實現(xiàn)干物質(zhì)水平14.5％的沉淀胞質(zhì)組分與上清液的分離。
胞質(zhì)組分提取物(組合物C)的制備。在恒定攪拌下于室溫將1份胞質(zhì)組分(10.0kg)和2份二甲基亞砜(20.0kg)混合1小時。然后材料以高于或等于4,000g、大于或等于45分鐘離心。棄去沉淀，上清液通過0.8μm孔徑濾器過濾。干物質(zhì)水平為3.50％的此濾過液—胞質(zhì)組分提取物(組合物C)進一步用于測試其活性。
細胞汁漿液(組合物D)的制備。在分離胞質(zhì)組分后，上清液含懸浮顆粒。為分離這些顆粒，以高于或等于7,500g、大于或等于30分鐘離心上清液。通過0.8μm孔徑濾器過濾透明上清液—細胞汁漿液。干物質(zhì)水平為5.69％的此濾過液(組合物D)進一步用于測試其活性。
常規(guī)茶提取物—對照的制備。使用制備組合物A、B、C和D的相同批次新鮮山茶葉生產(chǎn)常規(guī)白茶和紅茶。
使用以下的方法生產(chǎn)白茶。將含21.70％干物質(zhì)的新鮮生物質(zhì)置于沸水中20秒，以失活內(nèi)源性酶—酚氧化酶和過氧化物酶。在該方法的過程中，葉保持在尼龍篩袋中。然后將處理的葉在微波中干燥30秒，然后冷卻30秒。重復(fù)此處理幾次，直至生物質(zhì)中的干物質(zhì)水平達到93.74％。然后將66.0L溫度為85℃的去離子水加入到4.0kg干葉中，以高攪拌操作5分鐘。這些條件與描述于D′Amelio，F(xiàn).S.，Botanicals.A Phytocosmetic Desk Reference，Boca Raton，London，NewYork，Washington，D.C.CRC Press，361頁(1999)(其通過引用整體結(jié)合到本文中，另參見www.leaftea.com；www.divinitea.com；和www.equatorcoffee.com的論述，其通過引用整體結(jié)合到本文中)的茶制備方法一致。通過4層尼龍纖維過濾混合物，并通過0.8μm孔徑濾器過濾。獲得的細胞壁組分提取物的pH等于5.52，干物質(zhì)水平等于1.10％。該提取物進一步用于測試其活性。
使用以下的方法生產(chǎn)紅茶。在周期性(1小時“開”和1小時“關(guān)”)換氣下將含21.70％干物質(zhì)的新鮮生物質(zhì)保持于25℃，直至干物質(zhì)水平達到35％。然后將葉研磨(碾碎)成2-3mm大小顆粒。該方法導(dǎo)致生物質(zhì)溫度增加至約30℃。將研磨的生物質(zhì)以層(2″高)的形式放置在塑料傳送帶上，于25℃發(fā)酵(氧化)90分鐘。所獲的褐色發(fā)酵生物質(zhì)于130℃干燥30分鐘，以達到97.5％的干物質(zhì)水平。然后將66.0L溫度為85℃的去離子水加入到4.0kg干葉中，以高攪拌操作5分鐘。這些條件與描述于D′Amelio，F(xiàn).S.，Botanicals.A Phytocosmetic DeskReference，Boca Raton，London，New York，Washington，D.C.CRCPress，361頁(1999)(其通過引用整體結(jié)合到本文中，另參見www.leaftea.com；www.divinitea.com；和www.equatorcoffee.com的論述，其通過引用整體結(jié)合到本文中)的茶制備方法一致。通過4層尼龍纖維過濾混合物，并通過0.8μm孔徑濾器過濾。獲得的細胞壁組分提取物的pH等于4.96，干物質(zhì)水平等于1.38％。該提取物進一步用于測試其活性。
實施例2-關(guān)于茶樹(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japonica)、云南山茶花(Camellia reticulate)、茶梅(Camellia sasanqua)和Euryasandwicensis的生物活性組合物制品的干物質(zhì)分布分析在生物活性組合物生產(chǎn)過程中收集的各種組分，并比較干物質(zhì)分布。表1顯示了茶植物分離產(chǎn)物中100kg干物質(zhì)的分布。經(jīng)測定，本發(fā)明的方法允許將提取收率轉(zhuǎn)換成占初始生物質(zhì)干物質(zhì)約20-30％的植物細胞汁。膜組分干物質(zhì)的收率為5％-10％初始生物質(zhì)干物質(zhì)和25％-35％細胞汁干物質(zhì)。表1顯示胞質(zhì)組分干物質(zhì)的收率不超過1.0％初始生物質(zhì)干物質(zhì)，因此不超過2.5％細胞汁上清液干物質(zhì)。大部分細胞汁上清液干物質(zhì)濃縮在細胞汁漿液中。細胞壁組分、膜組分和胞質(zhì)組分用作其提取物的制備源，這些提取物被分類為生物活性組合物。細胞汁漿液“原態(tài)”直接用作不具有外源溶劑的后續(xù)生物活性組合物。
表1-100kg新鮮生物質(zhì)分離產(chǎn)物中的干物質(zhì)分布
應(yīng)當指出的是，三種選定材料是存在于新鮮植物組織中的所有功能性結(jié)構(gòu)的最多樣化的代表。僅有可溶性細胞汁漿液具有允許直接給予常用的體外測試系統(tǒng)的物理化學特性。細胞壁組分、膜組分和胞質(zhì)組分用作溶劑提取原料。因為細胞壁組分在結(jié)構(gòu)上類似于常規(guī)茶植物產(chǎn)物，所以該組分用水提取，以提供與常規(guī)茶的最佳比較。膜組分用二甲基亞砜提取，二甲基亞砜利于整合在葉綠體和線粒體結(jié)構(gòu)中的疏水和親水組分二者的有效溶解。胞質(zhì)組分用水提取。細胞汁漿液“原樣”使用。
表2顯示了100kg初始生物質(zhì)干物質(zhì)的全部4種測試生物活性組合物細胞壁組分提取物(組合物A)、膜組分提取物(組合物B)、胞質(zhì)組分提取物(組合物C)、細胞汁漿液(組合物D)和對照—白茶提取物或紅茶提取物的收率。
表2-100kg初始生物質(zhì)的生物活性組合物收率
表2表明，100kg茶樹(Camellia sinensis)干物質(zhì)的生物活性組合物A、B、C和D的總收率等于33.3％，非常顯著地超過了常規(guī)茶處理的收率-15.14…19.36％。
實施例3-組合物A(細胞壁組分提取物)和常規(guī)茶提取物的對比檢測由相同批次新鮮茶樹(Camellia sinensis)獲得的生物活性組合物A和常規(guī)白茶和紅茶提取物的各種參數(shù)，由此獲得的參數(shù)結(jié)果示于表3(使用的實驗方法述于實施例9和20和美國專利申請說明書第2003/0175235號，其通過引用整體結(jié)合到本文中)。
表3-生物活性組合物A和常規(guī)白茶和紅茶提取物的各種參數(shù)
表3表明，和常規(guī)白茶和紅茶提取物相比，細胞壁組分提取物的干物質(zhì)、電解質(zhì)和溶解性固體的水平較低。UN/VIS光譜數(shù)據(jù)表明，細胞壁組分提取物的光譜曲線下面積的比值最高，即此特定山茶產(chǎn)物(組合物A)每單位干物質(zhì)的光活性成分水平最高。另外，細胞壁組分提取物的氧化還原電位值較低，這表明該組合物比常規(guī)白茶和紅茶提取物較少氧化。細胞壁組分提取物表現(xiàn)出超氧化物清除活性，其以比白茶和紅茶提取物低得多的濃度產(chǎn)生50％的細胞色素c還原抑制(ICR50)。選擇定量描述分析(“QDA”)測試法，根據(jù)支配茶飲料可接受性的顏色、氣味和口感系統(tǒng)表征和定量荼。QDA法使用一組受過培訓的專業(yè)品嘗員量化茶飲料相對于限定參比標準的上述品質(zhì)。茶的顏色、氣味和口感的對比評價表明，細胞壁組分提取物明顯超過常規(guī)茶的相同特征。
因此，由新鮮山茶生物質(zhì)獲得而沒有任何發(fā)酵(氧化)和熱處理的細胞壁組分明顯不同于所有其它茶(Wilson等編輯，TeaCultivation toConsumption，LondonChapman Hall(1992)，其通過引用整體結(jié)合到本文中)。另外，關(guān)鍵的山茶酶(酚-氧化酶和過氧化物酶)總是保留在常規(guī)茶中。而本發(fā)明包括將新鮮山茶葉分離成細胞壁組分和細胞汁，細胞汁富含這些酶，因此細胞壁組分不含內(nèi)源性酚-氧化酶和過氧化物酶。因此細胞壁組分必須被分類為與白茶、綠茶、烏龍荼和紅茶相比具有根本差異的新茶類。此新細胞壁組分茶可以散裝或袋裝形式或其它表現(xiàn)形式用于制備廣泛范圍的飲料、營養(yǎng)添加劑和功能食品。
實施例4-不同應(yīng)用的生物活性組合物的制備所有的生物活性組合物都可用作溶液、懸浮液、分散液、糊漿或干燥粉末，摻入到各種全身或局部給予的制劑中。溶解形式的組合物可通過0.2μm孔徑濾器過濾，以完全去除不完全溶解的小顆粒和內(nèi)源性微生物。生物活性組合物在除菌過濾前后的干物質(zhì)水平示于表4。
表4-生物活性組合物在除菌過濾前(分子)和后(分母)的干物質(zhì)水平
表4表明，所有生物活性組合物中的干物質(zhì)水平在除菌過濾后都下降。但是，此下降未導(dǎo)致其生物活性出現(xiàn)任何損失或明顯下降，在2-14％的范圍內(nèi)。因此，大部分組合物由可溶性生物活性成分提供。
鮮山茶葉含相對較低分子量(還原、非氧化)的成分。由于在常規(guī)茶生產(chǎn)中的氧化和聚合過程，上述有效成分轉(zhuǎn)變成具有相對較低活性的高分子量物質(zhì)部分。
不進行發(fā)酵(氧化)和過度熱處理，獲得本發(fā)明的生物活性組合物。這又防止了新鮮植物活性的不可逆損失，此新鮮植物活性可使用例如新茶袋或類似的傳遞系統(tǒng)以最大效力傳遞。作為允許所有溶解性茶成分通過大孔遷移入周圍水中的常規(guī)紙茶袋的替代，新茶袋由半透膜制備。該袋在內(nèi)部含生物活性組合物，僅允許分子量低于一定膜截流分子量(例如5,000道爾頓)的成分穿透至周圍水相。較高分子量的成分保留在袋內(nèi)部，因此不包含在飲料中。
因此，截流分子量高于某一水平的成分使得可生產(chǎn)不具有氧化成分的飲料，因為生物活性組合物中分子量高于某一水平的所有氧化成分都保留在袋內(nèi)。新茶袋設(shè)計可基于利用透析膜管的錐形茶袋構(gòu)造。新茶袋設(shè)計還可以包括內(nèi)部具有生物活性組合物的薄塑料框和由半透膜制作的兩個透明表面。具體膜截流值的選擇根據(jù)生物活性組合物的類型確定，但一般來說較高截流分子量能夠使較高百分率的組合物干物質(zhì)釋放入周圍水相中，優(yōu)選較低的氧化還原電位值。
實施例5-得自細胞汁漿液的局部成分SF的制備細胞汁漿液(組合物D)不能用作局部產(chǎn)物的活性成分，原因是缺乏穩(wěn)定性以及顏色和氣味退化。所描述的方法允許精制細胞汁漿液組分，以生產(chǎn)穩(wěn)定和有活性的局部成分SF(該方法類似于先前美國專利申請說明書第2003/0175235號的描述，該專利申請通過引用整體結(jié)合到本文中)。細胞汁漿液的精制包括以下步驟熱處理、冷卻、過濾和穩(wěn)定化。在如實施例1所述分離細胞汁漿液和胞質(zhì)組分后立即進行精制。細胞汁漿液暴露于使用溫度傳感器控制的微波處理。該處理持續(xù)進行，直至細胞汁漿液溫度達到99℃(如先前美國專利申請說明書第2003/0175235號所述需要90℃，該專利申請通過引用整體結(jié)合到本文中)。一旦誘發(fā)凝結(jié)，立即將處理的細胞汁漿液冷卻至10℃。凝結(jié)的細胞汁漿液通過0.8μm孔徑濾器(在美國專利申請說明書第2003/0175235號中使用雙層Whatman No.2濾器，該專利申請通過引用整體結(jié)合到本文中)真空過濾。棄去沉淀，獲得的細胞汁漿液濾液用于進一步的加工(即穩(wěn)定化)。通過加入防腐劑(如先前的美國專利申請說明書第2003/0175235號所述，不需要外源抗氧化劑，該專利申請通過引用整體結(jié)合到本文中)并溫育混合物，直至達到完全溶解，實現(xiàn)細胞汁漿液濾過液的穩(wěn)定化。使用的防腐劑包括以下物質(zhì)0.1％山梨酸鉀、0.1％苯甲酸鈉、0.1％甲基羥苯甲酸鈉和0.1％檸檬酸。該制備導(dǎo)致產(chǎn)生16.3kg干物質(zhì)收率(或約286L)的局部成分SF，其用于表征其物理化學和生物活性性質(zhì)。局部成分SF的推薦儲存條件包括儲存在避光保護的密閉容器中，溫度為15℃-25℃。
實施例6-得自細胞汁漿液組分的局部成分SF的產(chǎn)品規(guī)格按照以上實施例5描述的方法制備局部成分SF。如下所述對局部成分SF進行分析，以確定其各種物理化學、微生物、細胞毒性和生物活性特征。局部成分SF是清澈液體，具有淡黃褐色和清淡特征氣味。未將溶劑(即乙二醇、油或水)加入到載體介質(zhì)中。表5概述了局部成分SF的物理和化學數(shù)據(jù)。
表5-局部成分SF的物理和化學參數(shù)
參考[1]Handbook of Chemistry and Physics，第80版，CRCPress，1999-2000，5-90；[2]Handbook of Chemistry and Physics，第80版，CRC Press，1999-2000，8-21；其通過引用整體結(jié)合到本文中。
表6描述了關(guān)于局部成分SF的UV光譜數(shù)據(jù)。
表6-局部成分SF(1∶500稀釋度)的UV光譜
按照以下方法(USP<61>)進行的微生物分析表明，局部成分SF包含的菌落形成單位/g樣品少于100個，沒有病原體(大腸桿菌、白假絲酵母(Candida albicans)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。該數(shù)據(jù)表明，局部成分SF滿足局部產(chǎn)物成分的工業(yè)要求。
經(jīng)測定，當局部成分SF于15-25℃的溫度儲存在避光保護的密閉容器中時，其穩(wěn)定(即保持物理和化學完整性)至少12-18個月。局部成分SF是生物可降解產(chǎn)物。在可控的臨床評價中，局部成分表現(xiàn)出生物活性，這些活性概述于表7。
表7-局部成分SF的生物活性
參考[1]Cannel等，Planta Medica 5410-14(1988)，其通過引用整體結(jié)合到本文中。
表7表明，局部成分SF表現(xiàn)出超氧化物清除能力。在可控的臨床評價中，局部成分SF以69.5μg干物質(zhì)/ml的濃度表現(xiàn)出50％的細胞色素c還原抑制(ICR50)。陽性對照(迷迭香酸)的ICR50＝26.5μg/ml。除了抗氧化劑特性以外，局部成分SF表現(xiàn)出抗肽水解酶的抗蛋白水解活性，例如彈性蛋白酶、明膠酶B或所謂的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和胰蛋白酶。在這些酶當中，彈性蛋白酶和MMP-9處于獨特的地位，其協(xié)同起作用，在皮膚炎癥中起極為重要的作用。應(yīng)當指出的是，彈性蛋白酶和MMP-9均由白血球(中性白細胞)分泌，這些酶在導(dǎo)致炎癥的最終通路中是關(guān)鍵酶。一般認為如果制劑可抑制兩種酶(彈性蛋白酶和MMP-9)，則認為這種制劑對治療炎性過程非常有效。
應(yīng)當指出的是，皮膚老化過程、曬傷、形成傷口和瘢痕具有非常相似的炎癥機制，該機制同時涉及MMP-9和彈性蛋白酶。因此，能夠抑制以上兩種酶的局部成分SF具有非常廣泛的應(yīng)用，其中由于以下原因出現(xiàn)炎癥損傷的情況a.這兩種酶可協(xié)同降解人組織胞外基質(zhì)的所有組分；b.彈性蛋白酶可使機體自身對抗MMP-9的抑制性防御失活；c.MMP-9可使機體自身對抗彈性蛋白酶的抑制性防御失活。局部成分SF的抗炎和抗氧化劑特性的組合提示，此基于生物活性組合物D的親水制品能夠系統(tǒng)地作用于非?；镜钠つw病問題。
實施例7-得自膜組分的局部成分MF的制備新鮮獲得的膜組分是具有深色和特定氣味的糊。該組分主要由葉綠體代表，其組成主要包括磷脂、膜蛋白、葉綠素和類胡蘿卜素。膜組分干燥導(dǎo)致許多探索測膜組分為局部成分所需要的有價值特性不可逆損失。在不干燥的情況下，不穩(wěn)定的的膜組分快速轉(zhuǎn)變成具有強烈非特征性氣味、深色、不分散、不溶性的團塊。因此，這種物質(zhì)不能用作局部成分。以下描述的方法允許將新鮮獲得的膜組分轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定和有活性的局部成分(該方法類似于先前在美國專利申請說明書第2003/0175235號中描述的方法，該專利申請通過引用整體結(jié)合到本文中)。
在按照以上實施例1描述的方法分離膜組分和細胞汁后，立即穩(wěn)定化膜組分，并摻入到聚合物基質(zhì)中。為制備約100g局部成分MF，通過將細胞膜組分與非離子型乳化劑Polysorbate 80(Tween 80)和抗氧化劑(Tenox 4)混合穩(wěn)定化細胞膜組分。具體地說，將20g新鮮膜組分與3.5g Tween 80和0.1g Tenox 4(丁羥茴醚和丁羥甲苯的油溶液)劇烈混合，直至均勻，同時在攪拌過程中避免曝氣。
一旦穩(wěn)定化，將膜組分摻入到聚合物基質(zhì)(即聚合乳化劑丙烯酸酯/C10-C30丙烯酸酯交聯(lián)共聚物的分散液)中。通過將0.9g PemulenTR-2分散在69.2g熱去離子水中，并使用中等攪拌混合，直至均一，同時避免曝氣，制備聚合物基質(zhì)。平行地，將5g甘油和1.0g Phenonip(苯氧基乙醇(和)羥苯甲酸甲酯(和)羥苯甲酸丁酯(和)羥苯甲酸乙酯(和)羥苯甲酸丙酯的混合物)合并在單獨的容器中，混合直至均一。在中等攪拌下，將含Pemulen的相和含Phenonip的甘油合并，混合，直至均一。為將膜組分摻入到聚合物基質(zhì)中，將含膜組分、Tween 80和Tenox 4的相加入到含Pemulen、甘油和Phenonip的相中，然后在避免曝氣的同時在劇烈攪拌下混合。通過用氫氧化鈉(NaOH)的18％水溶液中和膜組分混合物，并劇烈混合，以產(chǎn)生pH為5.0±0.4的均一體系，實現(xiàn)膜組分混合物穩(wěn)定化。該制備由100kg新鮮山茶生物質(zhì)(約461kg鮮葉，干物質(zhì)為21.7％)開始，導(dǎo)致生產(chǎn)出11.85kg干物質(zhì)收率(或約172L)的局部成分MF，其用于表征其物理化學特性和生物活性特性。局部成分MF推薦的儲存條件包括于2-8℃的溫度儲存在避光保護的密閉容器中。
實施例8-得自膜組分的局部成分MF的產(chǎn)物規(guī)格按照以上實施例7描述的方法制備局部成分MF。如下所述對局部成分MF進行分析，以確定其各種物理化學、微生物、細胞毒性和生物活性特征。局部成分MF是不透明膠體，具有褐綠色和清淡特征性氣味。使用以聚合物凝膠化的天然細胞汁成分配制局部成分MF。以確保最高水平的純度均一性、相容性、穩(wěn)定性、安全性和有效性。
表8描述了局部成分MF的物理和化學數(shù)據(jù)。
表8-局部成分MF的物理和化學參數(shù)
表9概述了關(guān)于局部成分MF的L*a*b*值數(shù)據(jù)。
表9-局部成分MF的L*a*b*值
微生物分析表明，局部成分MF滿足了局部成分關(guān)于CFU和沒有病原體(USP<61>)的工業(yè)要求。
經(jīng)測定，當局部成分SF于2-8℃的溫度儲存在避光保護的密閉容器中時，其穩(wěn)定(即保持物理和化學完整性)至少12-18個月。局部成分MF是生物可降解產(chǎn)物。在可控的臨床評價中，局部成分MF表現(xiàn)出彈性蛋白酶抑制活性和胰蛋白酶抑制活性。表10概述了局部成分MF的某些生物活性結(jié)果。
表10-局部成分MF的生物活性結(jié)果
參考[1]Cannel等，Planta Medica 5410-14(1988)，其通過引用整體結(jié)合到本文中。
表10表明，局部成分MF表現(xiàn)出的特性類似于局部成分SF(參見實施例6)。盡管局部成分MF不具有超氧化物清除活性，但其表現(xiàn)出高于局部成分SF的酶抑制比活。因此，基于生物活性組合物B的局部成分MF應(yīng)被認為是有效的多相抗炎成分，對治療皮膚病具有廣泛用途。
實施例9-得自茶樹(Camellia sinensis)植物的生物活性組合物的光譜分析光譜分析介紹。紫外(UV)照射對人皮膚具有損傷作用。短期作用包括曬成褐色和曬傷，而累積UV暴露的長期作用包括皮膚光老化和增加皮膚癌風險。紫外皮膚損傷由氧化損傷介導(dǎo)，許多具有抗氧化劑活性的植物提取物顯示出作為保護劑的前景葡萄種子提取物(Carini等，“Protective Effect of Procyanidines from Vitis vinifera Seedson UV-Induced PhotodamageIn vitro and In vivo Studies，”Proceedingsof the 19th IFSCC Congress 355-63(1996)，其通過引用整體結(jié)合到本文中)、番茄紅素(Di Mascio等，“Lycopene as the Most EfficientBiological Carotenoid Singlet Oxygen Quencher，”Archives ofBiochemistry and Biophysics 274532-8(1989)；和Ribaya-Mercado等，“Skin Lycopene is Destroyed Preferentially Over During UltravioletIrradiation in Humans”Journal of Nutrition 1251854-9(1995)，其通過引用整體結(jié)合到本文中)、水飛薊素(Morazzoni等，“Silybum marianum(Carduus marianus)，”Fitoterapia 663-42(1995)；Katiyar等，“ProtectiveEffects of Against Photocarcinogenesis in a Mouse Skin Model，”Journalof the National Cancer Institute 89556-66(1997)，其通過引用整體結(jié)合到本文中)，尤其是和由其它植物源生產(chǎn)的提取物相比具有較高效力的綠茶提取物(Katiyar等，“Protection Against Ultraviolet-BRadiation-Induced Local and Systemic Suppression of ContactHypersensitivity and Edema Responses in C3H/HeN Mice by Green TeaPolyphenols，”Photochemistry and Photobiology 62855-61(1995)；Ruch等，“Prevention of Cytotoxicity and Inhibition of IntercellularCommunication by Antioxidant Catechins Isolated from Chinese GreenTea，”Carcinogenesis 101003-8(1989)；Wang等，“Protection AgainstUltraviolet B Radiation-Induced Photocarcinogenesis in Hairless Mice byGreen Tea Polyphenols，”Carcinogenesis 121527-30(1991)，其通過引用整體結(jié)合到本文中)。
已發(fā)現(xiàn)茶植物(茶樹(Camellia sinensis))葉具有高含量的、具有抗氧化劑活性的多酚，包括(-)-表兒荼素、(-)-表兒茶素-3-沒食子酸酯、(-)-表沒食子兒茶素和(-)表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯。綠茶提取物已顯示出抗過氧化氫和超氧化物自由基的抗氧化物活性和防止氧化細胞毒性。提取物還可以防止對胞內(nèi)通信的抑制，該抑制是一種可能的腫瘤促進機制。UV誘導(dǎo)的免疫抑制和出現(xiàn)皮膚癌之間有密切關(guān)聯(lián)，業(yè)已發(fā)現(xiàn)綠茶提取物起抗UV-B照射引起的炎癥和免疫抑制的保護作用。在飲用水中口服給予或局部施用的綠茶提取物在動物模型中起抗UV-B誘導(dǎo)的皮膚癌發(fā)生的保護作用。這些結(jié)果表明，口服攝取的綠茶提取物可能有助于預(yù)防皮膚癌。
盡管已經(jīng)確立了山茶產(chǎn)物的UV保護特性，但茶植物作為有效保護皮膚抗日光損傷的來源的巨大潛能由于常規(guī)技術(shù)的限制還沒有被完全開發(fā)，驅(qū)使常規(guī)技術(shù)集中于有限的、相對狹窄的活性成分條帶主要是兒茶素。
現(xiàn)在，本文描述的“新”和“常規(guī)”山茶產(chǎn)物之間的對比性UV防護特性研究已經(jīng)表明，“新鮮山茶分離”技術(shù)能夠生產(chǎn)更有效的產(chǎn)物。使用常用于測定溶液光譜特性和體外陽光保護因子(SPF)的方法進行比較。
方法學AUV/VIS光譜。使用符合藥典的分光光度計Ultrospec4300 Pro(Amersham Biosciences Ltd.，Buckinghamshire，England)獲得山茶產(chǎn)物在200-450nm區(qū)域的UV/VIS光譜。按照USP<197>中描述的方法測定稀釋在蒸餾水中的山茶產(chǎn)物的光譜參數(shù)。
方法學B吸收光譜。使用UV-1000S透光度分析儀(Labsphere，North Sutton，NH)和模擬人皮膚表面特性的Vitro-Skin測試底物(IMSTesting Group，Milord，CT)獲得山茶產(chǎn)物在250-450nm區(qū)域的吸收光譜。Vitro-Skin測試底物含有優(yōu)化蛋白和脂質(zhì)組分兩者，被設(shè)計成具有類似于人皮膚的表面狀況、pH、臨界表面張力和離子強度。
將山茶樣品均一地涂在預(yù)水合底物表面上(施用劑量＝2.0μl/cm2)。在施用后15分鐘以后，經(jīng)5次重復(fù)實驗獲得初始吸收光譜。然后用配有300W氙氣燈的廣譜太陽光刺激器(型號16S-300 SinglePort，Solar Light Company，Inc.，Philadelphia，PA)照射具有施用產(chǎn)物的底物。劑量控制系統(tǒng)PMA 2100-DCS允許精確控制傳遞至樣品的劑量。
在照射(照射劑量＝60焦耳/cm2)后立即以5次重復(fù)實驗獲取相同位置的吸收光譜。照射前后的樣品吸收光譜用于統(tǒng)計分析。
樣品。評價按照以上實施例1所述方法制備的下述生物活性組合物組合物A(具有0.84％干物質(zhì)的細胞壁組分提取物)、組合物B(具有6.83％干物質(zhì)的膜組分提取物)、組合物D(具有5.69％干物質(zhì)的細胞汁漿液)。使用具有1.10％干物質(zhì)的常規(guī)白茶提取物和具有1.38％干物質(zhì)的常規(guī)紅茶提取物作為對照。所有的樣品都得自在CharlestonTea Plantation，SC收集的相同批次的新鮮山茶。這些樣品不含任何添加劑。
分析。已發(fā)現(xiàn)所有的山茶樣品都具有高UV吸光度值，因此將其稀釋在蒸餾水中。稀釋的山茶產(chǎn)物的UV-VIS光譜示于圖2和3。
所有液體樣品的光譜都具有一定相似性。例如，峰的位置在λmax1＝269-274nm和λmax2＝205-208nm的相對狹窄范圍中變化，這表明在所有測試樣品中都存在芳族環(huán)和σ-π鍵的共軛系統(tǒng)。但是，峰的頂點值、各峰下面積和完整光譜曲線下的總面積是不同的(表11)，這提示測試樣品具有不同的光學活性成分組成。
表11-山茶產(chǎn)物的UV/VIS光譜參數(shù)
*光譜下面積值以樣品稀釋度為基準標準化。
由200nm-450nm獲得的完整光譜曲線下面積的對比清楚表明，膜組分提取物(組合物B)和細胞汁漿液(組合物D)具有較高的吸光度值(表11)。比率“光譜下面積∶干物質(zhì)”表明，樣品的比吸光度值以下述順序增加紅茶提取物＞白茶提取物＞細胞壁組分提取物＞細胞汁漿液＞膜組分提取物(表12)。
表12-山茶產(chǎn)物的選定光譜特征
根據(jù)吸光度值的對比，新生物活性組合物似乎是比常規(guī)白茶和紅茶提取物更有效抗日光損傷的皮膚保護劑。應(yīng)當指出的是，使用與290nm-400nm區(qū)域相關(guān)的吸光度數(shù)據(jù)應(yīng)更好地評價山茶產(chǎn)物的UV防護特性，因為光譜的此特定部分負責UV誘導(dǎo)的皮膚損傷(Sayre等，“A Method for the Determination of UVA Protection for NormalSkin，”Journal of American Academy of Dermatology 23429-40(1990)，其通過引用整體結(jié)合到本文中)。盡管測試的液體樣品在290-400nm區(qū)域的吸光度僅占總UV/VIS吸光度的約10％，但新山荼組合物在上述光譜區(qū)域同樣有較高吸光度。
因此，與山茶樣品的稀釋溶液相關(guān)的數(shù)據(jù)提供了對測試產(chǎn)物UV保護效力的初始評價，使用Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)對其進一步評價。結(jié)果示于圖4-13。已發(fā)現(xiàn)，新山茶組合物和常規(guī)白茶和紅茶提取物即使以干物質(zhì)水平相等的濃度施用在底物上以后，也具有不同的光譜特性(圖4和5)。
施用在Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶樣品的光譜包含4-2個具有不同頂點值的特征峰(表13)。
表13-施用在Vitro-Skin測試底物上的山茶產(chǎn)物的吸收光譜參數(shù)
應(yīng)當指出的是，山茶產(chǎn)物溶液特征峰的參數(shù)(表11)和施用在測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶產(chǎn)物特征(表13)相比非常不同。如對照實驗所示，Vitro-Skin表面上的較低pH水平(約5.5)可能與上述差異無關(guān)，這些差異可能是山茶產(chǎn)物和用于制備Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的成分之間化學作用的結(jié)果。因此，Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)同時含可與山茶酚成分化學相互作用的蛋白和脂質(zhì)組分。應(yīng)當注意的是，觀測到所有生物活性組合物以及常規(guī)茶提取物的測試產(chǎn)物光譜特性位移。
考慮到測試樣品干物質(zhì)含量的差異，還以“原樣”對比了新山茶組合物和常規(guī)山茶產(chǎn)物提取物的光譜。以等體積應(yīng)用到Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶產(chǎn)物的吸收光譜示于圖6。
盡管細胞壁組分提取物和白茶提取物之間存在一些相似性，但第一個產(chǎn)物在250-280nm區(qū)域和近UV區(qū)域具有較高吸光度。應(yīng)當指出的是，較高吸光度不對應(yīng)于干物質(zhì)水平，白茶提取物的干物質(zhì)水平(1.10％)比細胞壁組分提取物(0.84％)高。這提示這兩種樣品的組成不同，細胞壁組分提取物還具有較低的電導(dǎo)率，其由較大的非解離光學活性成分構(gòu)成，這些成分是產(chǎn)生高吸光度的原因(參見表3提供的數(shù)據(jù))。
另外發(fā)現(xiàn)膜組分提取物(組合物B)和細胞汁漿液(組合物D)的光譜不同于細胞壁組分提取物(組合物A)和白茶提取物的光譜。因此，膜組分提取物和細胞汁漿液光譜再次表明這些產(chǎn)物具有與白茶提取物和細胞壁組分提取物不同的組成。同時，光譜數(shù)據(jù)提示，膜組分提取物和細胞汁漿液的組成不同。例如，膜組分提取物在260nm、286nm和394nm具有3個特征峰。細胞汁漿液光譜在260nm和286nm含兩個峰。
這兩個光譜的對比表明，膜組分提取物具有的消光度是細胞汁漿液的大約2倍高，盡管干物質(zhì)水平差異僅為約1％。因此，4個測試山茶產(chǎn)物具有顯著不同的成分組成，這些成分在250-450nm區(qū)域有光學活性。
與山茶產(chǎn)物定量對比相關(guān)的數(shù)據(jù)示于表14。
表14-應(yīng)用于Vitro-Skin測試底物的山茶產(chǎn)物的選定特征
表14表明，樣品在250-450nm區(qū)域和290-400nm區(qū)域的吸光度以下述順序漸增白茶提取物＞細胞壁組分提取物＞細胞汁漿液＞膜組分提取物。該順序與在稀釋溶液中測試的山茶產(chǎn)物比吸光度值順序(表12)完全一致。當測試樣品應(yīng)用在Vitro-Skin測試底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上時，250-400nm區(qū)域的吸光度對由250nm-450nm獲取的光譜吸光度的貢獻達約55-60％。
應(yīng)當指出的是，新山茶組合物的光譜在稀釋溶液中和在施用于Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上之后顯著不同。這些差異對膜組分提取物和細胞汁漿液既是定量的，也是定性的。因此，在250nm-450nm范圍內(nèi)，膜組分提取物溶液的峰位于274nm。相同的膜組分提取物在施用于Vitro-Skin測試底物(IMS TestingGroup，Milord，CT)上時，在以上波長未顯示任何特征峰，而是在260nm和286nm具有兩個特征峰(圖7A)。
對細胞汁漿液觀察到光譜特性的相似模式，盡管在施加于Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的樣品中于約360nm鑒別出另外的吸光度，但在相同組合物溶液的UV/VIS光譜中未記錄到此現(xiàn)象(圖7B)。
應(yīng)當指出，光譜間的上述差異可能是源于新山茶組合物和具有蛋白和脂質(zhì)成分、模擬人皮膚的Vitro-Skin測試底物(IMS TestingGroup，Milord，CT)表面之間的化學相互作用。這些相互作用導(dǎo)致負責UV照射損傷作用的光譜區(qū)的吸光度急劇增加，即新山茶組合物具有顯著的UV保護效力。用大麥(Hordeum vulgare)(圖8A)和鼠尾草(Salviaofficinalis)(圖8B)細胞汁漿液的對照實驗表明，對于山茶以外的植物源，未觀察到相同樣品在溶液中和在施加于Vitro-Skin測試底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上之后的光譜差異。因此，山茶產(chǎn)物在施加于Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上之后的光譜位移表明，特異性相互作用僅發(fā)生在新山茶產(chǎn)物和模擬人皮膚的底物之間。
用預(yù)水合底物的對照實驗表明，在照射后Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的吸光度顯著降低，尤其是在260-330nm的范圍(圖9)。該作用反映出以高劑量廣譜太陽光照射的未保護底物的光穩(wěn)定性相對較低。
照射施加白茶提取物的底物使吸收光譜發(fā)生變化(圖10)，該變化類似于未保護Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的光譜變化。當消除底物影響時，未照射和照射樣品的光譜表現(xiàn)出一定相似性，但未表現(xiàn)出完全相同的形態(tài)。例如，290-310nm范圍內(nèi)的吸光度下降，但在360nm開始形成寬峰。
照射細胞壁組分提取物(圖11)使吸收光譜產(chǎn)生相似的變化，尤其是對于消除(扣除)底物影響后獲得的曲線而言。
盡管白茶提取物和細胞壁組分提取物的組成不同，但在其光譜中照射誘生的修飾模式相當相似。應(yīng)當注意的是，白茶提取物和細胞壁組分提取物均不能完全保護底物對抗照射的破壞作用，因此，Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的吸光度下降得幾乎和該底物根本未保護時的情況一樣多(圖9)。在250nm-330nm范圍特別明顯，盡管在較長的波長觀察到吸光度有些增加。
照射膜組分提取物對其吸收光譜產(chǎn)生非常不同的作用(圖12)。例如，照射在250-285nm的光譜范圍內(nèi)不產(chǎn)生任何變化。正如所述，被照射的Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的破壞對光譜的該特定范圍有非常顯著的影響，因此，光譜對比提示，底物的破壞完全被其表面上存在的膜組分提取物阻止。
但是，在膜組分提取物光譜中記錄到某些變化。例如，290-320nm范圍的吸光度稍微下降，并伴有吸光度在較長波長的小幅增加。尤其要指出的是，膜組分提取物被證明在核酸和芳族氨基酸于260nm和其后的280nm具有特征峰的光譜范圍中非常有效。因此，膜組分提取物的作用使得該產(chǎn)物可用作局部施用的預(yù)期UV防護成分。
在照射后，漿液組分在其吸收光譜中表現(xiàn)出一定變化(圖13)。
一般來說，這些變化可被描述為250-340nm范圍的吸光度稍微下降，340-450nm的吸光度稍微增加。應(yīng)當注意的是，消除Vitro-Skin測試底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的光破壞作用產(chǎn)生的可能貢獻(見未照射漿液組分初始光譜上方光譜上的紅色曲線)清楚表明，底物被其表面上施加的漿液組分有效防護。
觀察與結(jié)論。以上結(jié)果清楚顯示，最好的常規(guī)山茶產(chǎn)物—白茶提取物提供了相對較弱的抗UV照射破壞作用的保護。細胞壁組分提取物表現(xiàn)出與白茶提取物類似的特性，但膜組分提取物和細胞汁漿液具有更加有效的UV防護特性。
已發(fā)現(xiàn)山茶產(chǎn)物的UV防護特性以下述順序增加白茶提取物＝細胞壁組分提取物＞細胞汁漿液＞膜組分提取物。
應(yīng)當注意的是，山茶產(chǎn)物的光譜特性和這些特性在UV照射后的變化模式提供了強有力的證據(jù)證明，白茶提取物(對照)、細胞壁組分提取物、膜組分提取物和細胞汁漿液的成分組成全都不同，并都表現(xiàn)出獨特的活性。特別令人感興趣的是新山茶組合物的情況，其中上述UV活性不能歸因于多酚，而對白茶提取物則要歸因于多酚。
實施例10-山茶產(chǎn)物的對比評價綜述實施例10-19描述了實驗相關(guān)的方法、結(jié)果和分析，進行這些實驗是為了評價與本發(fā)明的茶樹(Camellia sinensis)生物活性組合物調(diào)節(jié)細胞功能相關(guān)的生物活性范圍。主要目標是評價由本發(fā)明方法獲得的產(chǎn)物的生物活性范圍，并將其與通過常規(guī)(傳統(tǒng))茶技術(shù)獲得的最好產(chǎn)物—白茶提取物的活性對比，白茶提取物作為陽性對照進行研究，并與以下的本發(fā)明生物活性組合物對比(1)鮮葉的細胞壁組分提取物(組合物A，如本文所定義)；(2)膜組分提取物(組合物B，如本文所定義)；和(3)細胞汁漿液(組合物D，如本文所定義)。
進行測試以評價這些山茶生物活性組合物對三種人細胞系生長模式的作用，這三種人細胞系為具有單核細胞白血病細胞特征的骨髓細胞系(Mono Mac 6)和兩種乳癌細胞系具有體內(nèi)惡性腫瘤早期特征的乳癌細胞系(MCF-7)以及具有晚期癌癥特征的更高度侵襲、轉(zhuǎn)移和雌激素不敏感的細胞系(MDA-MB-435S)。
已發(fā)現(xiàn)常規(guī)白茶提取物對某些腫瘤細胞的代謝活性表現(xiàn)出一定抑制作用。但是，這種抑制的程度對所有類型的測試細胞都不顯著，甚至在檢測這種抑制時，其也一般不完全，而是最小或有限的。細胞壁組分提取物表現(xiàn)出的特性類似于白茶提取物的特性。
值得注意的是，兩種細胞汁衍生物膜組分提取物和細胞汁漿液，都是存在或不存在不同刺激物時培養(yǎng)的所有測試細胞系代謝功能的更有效抑制劑。例如，膜組分提取物明確表現(xiàn)出更大的抑制效力，其在0.001％劑量時的作用可容易地被檢測到。細胞汁漿液表現(xiàn)出復(fù)雜的反應(yīng)在較低劑量時刺激，在高劑量時抑制。
應(yīng)當指出的是，膜組分提取物和細胞汁漿液似乎在腫瘤細胞中啟動程序化或凋亡細胞死亡通路，而不是誘導(dǎo)壞死性細胞溶解。實驗數(shù)據(jù)表明，該通路是線粒體功能喪失引起的，可能需要24-48小時接觸來檢測。
由于接觸生物活性組合物，所有測試的腫瘤細胞系MCF-7，早期人乳癌模型；MDA-MB-435S，晚期乳癌模型；和Mono Mac 6，單核細胞白血病模型，其代謝功能都被抑制，膜組分提取物最有效，細胞汁漿液有效性較低，但更有選擇性。引人注目的是，白茶提取物和細胞壁組分提取物被證實無效或比以上組合物B和D效力低得多。這種趨勢被不同條件下測試的細胞明確證實沒有和存在轉(zhuǎn)化生長因子情況下的MCF-7細胞、MDA-MB-435S細胞以及刺激和未刺激的單核細胞Mono Mac 6細胞。
這些結(jié)果提供了強有力的證據(jù)表明本發(fā)明的方法能夠急劇增加山茶植物的效力，產(chǎn)生令人印象非常深刻的新產(chǎn)物，其表現(xiàn)出的活性甚至連常規(guī)茶技術(shù)的最好產(chǎn)物也沒有鑒別出來。
本發(fā)明的山茶組分對細胞介導(dǎo)的蛋白水解活性的作用與炎性組織損傷以及腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，可明確提示乳癌細胞和白血病細胞為本發(fā)明生物活性組合物的預(yù)期靶，最值得注意的是膜組分提取物。應(yīng)當指出的是，先前表明，結(jié)腸癌衍生細胞系COLO 205釋放出顯著水平的MMP-2，然后其被也是由該細胞分泌的胰蛋白酶樣酶活化。根據(jù)Mono Mac 6細胞的結(jié)果，這也是本發(fā)明山茶組分的潛在靶之一。
由這些研究已得出結(jié)論分離自新鮮山茶的本發(fā)明生物活性組合物具有對關(guān)鍵細胞功能產(chǎn)生重要調(diào)節(jié)的活性。已觀察到的作用可具有有價值的應(yīng)用由個人護理用品至營養(yǎng)補充品和潛在的藥品。
還應(yīng)當指出的是，本發(fā)明的非常有效的生物活性組合物不是單一純化組分，而是分離的成分復(fù)合物。膜組分提取物(組合物B)和細胞汁漿液(組合物D)的進一步分離可得到對于正在發(fā)展中的天然藥品市場來說極為有效的成分。
實施例11-山茶產(chǎn)物的對比評價測試組合物在實施例10-19描述的實驗中使用以下的生物活性組合物(1)陽性對照按照實施例1和4描述的方法制備的白茶提取物。
(2)組合物A鮮山茶葉的細胞壁組分提取物，其按照實施例1和4描述的方法制備。
(3)組合物B由新鮮加工的山茶葉獲得的膜組分提取物，其按照實施例1和4描述的方法制備。
(4)組合物D新鮮加工的山茶葉的細胞汁漿液，其按照實施例1和4描述的方法制備。
上述產(chǎn)物由相同批次的新鮮山茶獲得，以制備常規(guī)白茶提取物和本發(fā)明的三種“平行”產(chǎn)物(組合物A、B和D)。
文獻中有許多報道提示山茶葉提取物具有一系列生物活性，這些活性主要是源于加工過程中形成顯著濃度的多酚丹寧。業(yè)已報道這些多酚以及聚合丹寧的較低分子量前體如表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(EGCG)表現(xiàn)出有效的抗氧化劑活性。有越來越多的出版物提示，由山茶干葉制備的茶不僅具有抗氧化劑特性，而且具有抗血管生成、抗細菌、抗腫瘤、抗炎、抗誘變、抗膿毒和解毒特性。上述特性還沒有全部被證實賦予統(tǒng)計學顯著的利益。其中僅有一些以已使用多個測試系統(tǒng)以綜合研究證實。
應(yīng)當指出的是，作為與過去的對比，由采用生物活性組合物(使用本發(fā)明技術(shù)由山茶以外的眾多新鮮植物源分離)的過去經(jīng)驗證實，這種組合物遠比使用美國專利申請說明書第2003/0175235號(其通過引用整體結(jié)合到本文中)先前描述的眾多參數(shù)由相同的干燥植物分離的常規(guī)產(chǎn)物有效。例如，在其它類型的植物(紫花苜蓿(Medicagosativa)、大麥(Hordeum vulgare)、薰衣草(Lavandula angustifolia)、金盞菊(Calendula officinalis)和鼠尾草(Salvia officinalis))中，已鑒別和評價了使用本發(fā)明方法制備的組合物的幾種令人印象深刻的生物活性，包括高抗彈性蛋白酶活性和抗明膠酶B(MMP-9)活性、中性粒細胞呼吸暴發(fā)的新型調(diào)節(jié)和對活性氧物質(zhì)的顯著超氧化物清除活性。除了清除活性以外，這些活性似乎不能歸因于單獨的多酚混合物。
因此，尤其令人感興趣的是開發(fā)更全面的方法來比較可在本發(fā)明的山茶組合物中檢測到的活性范圍和使用常規(guī)(傳統(tǒng))山茶技術(shù)由相同的干燥植物獲得的提取物中存在的活性。因此，業(yè)已檢測了由新鮮收集的山茶葉制備的細胞壁組分提取物(組合物A)、膜組分提取物(組合物B)和細胞汁漿液(組合物D)對哺乳動物活細胞功能的調(diào)節(jié)。對比這些組合物和由干燥山茶葉制備的常規(guī)白茶提取物。
應(yīng)當注意的是，按照多個常規(guī)山茶產(chǎn)物的研究，白茶提取物表現(xiàn)出較高的比活性，因此選擇該類制品作為代表性陽性參比對照，以和本發(fā)明的新山茶產(chǎn)物對比。
實施例12-山茶產(chǎn)物的對比評價細胞系的選擇原理作為細胞功能調(diào)節(jié)的測試系統(tǒng)，使用兩種人乳癌衍生細胞系作為腫瘤細胞模型(MCF-7和MDA-MB-435S)，人單核細胞系(Mono Mac6)用作炎性細胞模型。以上細胞系描述于實施例21。
MCF-7被認為是早期或較少去分化乳癌的模型。該細胞系仍保留雌激素敏感性，并具有相對較低侵入性的表型；其在免疫缺陷動物模型中轉(zhuǎn)移的能力相當有限。在以前的研究中，已表明MCF-7細胞系表現(xiàn)出對轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的特征性反應(yīng)在TGF-β存在下培養(yǎng)24小時后，細胞分泌增加水平的蛋白水解酶的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族和促血管生成因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，這是侵入性和轉(zhuǎn)移潛力增強的兩種不同標記物。與生長停止相反，針對TGF-β的該反應(yīng)是腫瘤和某些腫瘤細胞系的標志，其在正常細胞中由生長因子誘導(dǎo)。為評價本發(fā)明的生物活性組合物，使用在沒有和有TGF-β的情況下培養(yǎng)的MCF-7細胞作為靶。
MDA-MB-435S系具有更高侵入性、轉(zhuǎn)移性和雌激素不敏感性。此人癌衍生細胞系還表現(xiàn)出一定的TGF-β敏感性，但是，即使在沒有生長因子的情況下，其也自發(fā)釋放出比MCF-7高水平的MMP和VEGF，這與其用作更晚期癌癥模型相一致。在本評價中，檢測生物活性組合物對僅在無TGF-β情況下培養(yǎng)的MDA-MB-435S細胞的作用。
人單核細胞系Mono Mac 6表達眾多與靜止單核細胞或巨噬細胞一致的生物標記，并和人單核細胞或巨噬細胞一樣對促炎活化刺激物如乙酸肉豆蔻佛波醇酯(PMA)起反應(yīng)。檢測生物活性組合物對沒有和有PMA情況下培養(yǎng)的Mono Mac 6細胞的作用，以用作靜止和活化單核細胞/巨噬細胞模型。
因此，選擇的上述細胞系組合為評價山茶生物活性組合物的抗腫瘤和抗炎效力提供了可靠基礎(chǔ)。用多種功能探測手段平行測試選定細胞系提供了一個機會，即和研究單個測試靶或?qū)δ承┐碳の锞哂邢嗨泼舾行曰蛳嗨品磻?yīng)性的多個靶的反應(yīng)相比，可獲得關(guān)于產(chǎn)物活性及其活動機制的更有價值的結(jié)論。
實施例13-對比評價山茶生物活性組合物實驗的選擇原理初始評價是基于兩個存活力實驗和一種細胞功能探測手段(參見實施例20，“方法8”)。
第一個實驗檢測胞質(zhì)酶乳酸脫氫酶的水平，乳酸脫氫酶僅在細胞裂解時釋放入胞外培養(yǎng)基中。傳統(tǒng)上認為這種細胞膜完整性的喪失是壞死性細胞死亡的標志，反映了細胞毒性模式。
第二個實驗檢測線粒體脫氫酶活性，該活性由四唑鹽還原成其有色甲膳反映。當將MTS試劑(四唑鹽)應(yīng)用于活細胞時，其轉(zhuǎn)變?yōu)樯钌衔?甲膳)。線粒體脫氫酶活性喪失還可能和細胞死亡相關(guān)，但其通常是程序化細胞死亡或凋亡通路早期步驟的標志，其中在核已凝聚和線粒體已失去功能以后細胞膜完整性一般保持完好。
乳酸脫氫酶泄漏表明與細胞溶解相關(guān)的存活力完全喪失，而四唑鹽還原下降表明線粒體活性喪失，但細胞膜完整性或存活力不一定不可挽回地喪失。
作為細胞功能的另一種檢測手段，已檢測了山茶生物活性組合物對Mono Mac 6細胞系分泌的蛋白酶水平的作用(參見實施例20，“方法9”)。在使用該細胞系的先前研究中，觀察到在與PMA溫育后，Mono Mac 6細胞分泌兩種所謂液化明膠的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)。這些MMP還由許多腫瘤及其周圍基質(zhì)分泌，涉及炎性組織損傷以及腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移。先前還表明，作為抗炎和抗腫瘤藥物開發(fā)的某些物質(zhì)(已知所研究的這些物質(zhì)減輕炎性組織破壞以及腫瘤細胞系的侵入和轉(zhuǎn)移)，除了對MMP蛋白水解活性的任何直接抑制之外，似乎還降低細胞產(chǎn)生的MMP的水平。這些研究的目標是評價本發(fā)明的山茶生物活性組合物可能具有降低活化Mono Mac 6細胞釋放的MMP水平的類似能力的可能性。
因此，選定實驗將使人們?nèi)菀自u價廣泛范圍的代謝過程和有效獲得重要數(shù)據(jù)，這可能揭示由某些山茶生物活性組合物觸發(fā)的作用機制。
實施例14-對比評價山茶產(chǎn)物山茶生物活性組合物對乳癌細胞系的作用在整個這些研究中，只通過將四唑鹽MTS還原成其甲膳的實驗檢測線粒體功能。應(yīng)當注意的是，已觀測到較高濃度的本發(fā)明山茶組合物的某些固有能力在沒有任何活細胞的情況下直接還原MTS，在本文報告的所有結(jié)果中，已經(jīng)由在存在細胞時觀測到的還原酶活性水平中扣除這種沒有細胞時甲膳的背景形成。
圖14-21圖示了在加入由0.01％或0.02％(w/v，在培養(yǎng)基中的終濃度，以山茶組合物中的固體干重為基準)至0.0001％各種劑量的4種山茶組合物的每一種后24小時和48小時，在沒有和有5ng/mlTGF-β時培養(yǎng)的MCF-7細胞和僅在沒有TGF-β時培養(yǎng)的MDA-MB-435S細胞的還原酶活性大小。
實施例15-山茶生物活性組合物的對比評價MCF-7細胞在沒有TGF-β時，最高測試濃度(0.01％)的組合物A和白茶提取物(陽性對照)對MCF-7細胞的MTS還原具有顯著作用。在該濃度和山茶組合物A接觸24小時后，有顯著但不完全抑制的還原酶活性(約50-70％抑制)。在接觸白茶提取物24小時后檢測到相似的還原酶活性抑制。
相反，由山茶細胞汁制備的兩種山茶生物活性組合物(膜組分提取物和細胞汁漿液)在沒有TGF-β存在時在MCF-7細胞中是更有效的還原酶活性抑制劑。膜組分提取物(組合物B)在劑量依賴性方面類似于白茶提取物，除了效力稍高以外，實際上在最高測試劑量0.01％時產(chǎn)生完全抑制。細胞汁漿液(組合物D)實際上也在0.01％時產(chǎn)生完全抑制，但在0.0025％的較低劑量時，有一些刺激還原酶活性的跡象。較低劑量的組合物D沒有顯著作用。
當在存在生長因子TGF-β的情況下培養(yǎng)MCF-7細胞時，其對山茶組合物的敏感性顯著改變。在接觸細胞壁組分提取物和白茶提取物24小時或48小時后，沒有證據(jù)表明任何劑量對還原酶活性的刺激或抑制作用，最高劑量(0.01％)白茶提取物低于20％的輕度抑制是例外。
相反，使TGF-β處理的MCF-7細胞接觸0.02％劑量的膜組分提取物24小時，對還原酶活性產(chǎn)生70％抑制，在48小時后，還原酶活性實際上被完全去除。在24小時后可檢測到較低劑量的膜組分提取物更輕微的抑制，但在48小時后檢測到還原酶活性顯著活化。在接觸48小時后檢測到低劑量細胞汁漿液同樣活化還原酶活性，以及最高劑量(0.02％)時顯著抑制，但在更有限地接觸24小時后，該組合物在TGF-β處理的MCF-7細胞中對還原酶活性僅具有最小作用，與劑量無關(guān)。
在評價時，對甚至接觸最高劑量的任何山茶組合物24小時的MCF-7細胞，也沒有檢測到乳酸脫氫酶顯著釋放到其培養(yǎng)基中。似乎在這些細胞中線粒體功能的喪失不伴有細胞壞死性裂解。如果細胞實際上在接觸的首個48小時內(nèi)死亡，則更有可能是啟動了程序性細胞死亡或凋亡通路。此結(jié)論得到光學顯微鏡觀察結(jié)果的支持，光學顯微鏡觀察結(jié)果揭示在接觸過程中細胞有一些變圓，但沒有形成碎片或膜片段。
因此，抑制線粒體功能似乎是所有測試山茶產(chǎn)物的主要作用模式，根據(jù)釋放的乳酸脫氫酶水平所示，其沒有表現(xiàn)出細胞毒性或壞死。
實施例16-山茶生物活性組合物的對比評價MDA-MB-435S細胞MDA-MB-435S細胞對山茶組合物的反應(yīng)模式類似于MCF-7細胞，因為最有效的組合物是組合物B和D，膜組分提取物(組合物B)顯示出比細胞汁漿液(組合物D)稍微高一點的效力。在接觸24小時后，僅有膜組分提取物對還原酶活性產(chǎn)生顯著抑制。在0.01％的最高劑量抑制達到對照還原酶值的70％，但即使在最低劑量的不尋常濃度0.0001％，也能容易地檢測到10％的輕度抑制。其它的測試組合物在接觸24小時時僅具有輕度的抑制作用，并且僅是在較高測試濃度的情況下。
在接觸48小時后，在各組合物存在下，還原酶活性以劑量依賴方式被抑制，但最高劑量組合物的效力未達到接近100％抑制，除了膜組分提取物以外。該組合物于0.001％在48小時后抑制還原酶活性達50％。白茶提取物和細胞壁組分提取物在接觸48小時后對MDA-MB-435S細胞也具有顯著抑制活性，其實際上高于細胞汁漿液的抑制活性。在該細胞系中沒有任何制品的劑量能誘導(dǎo)還原酶活性活化，與接觸時間長度無關(guān)。
應(yīng)當注意的是，僅在24小時后難以觀測到對高度侵襲、轉(zhuǎn)移和雌激素不敏感細胞系MDA-MB-435S的任何影響。因此，在24小時和48小時后組合物B的作用是相當引人注目的，表明該制品具有顯著活性。
實施例17-山茶生物活性組合物的對比評價山茶組合物對單核細胞的作用線粒體脫氫酶活性對乳癌細胞系的初步研究揭示的某些趨勢已證實和Mono Mac 6細胞對4種測試的山茶組合物的反應(yīng)一致。膜組分提取物(組合物B)和細胞汁漿液(組合物D)在此炎性細胞系中是比細胞壁組分提取物(組合物A)和白茶提取物(陽性對照)更有效的MTS還原酶活性抑制劑，膜組分提取物(組合物B)明顯具有最大的抑制效力。檢測保持未刺激的細胞和用10nM PMA刺激的細胞中對MTS還原酶的作用，并評價接觸山茶組合物24和48小時后的還原酶活性。這些組合物對Mono Mac 6細胞中MTS還原酶活性的作用示于圖22-33。
白茶提取物在接觸PMA刺激的細胞48小時后，表現(xiàn)出弱但劑量依賴性的還原酶活性抑制；在沒有PMA時還原酶活性沒有顯著損失，和劑量或接觸時間長度無關(guān)，任何劑量在接觸PMA處理的細胞24小時后都沒有任何作用。細胞壁組分提取物對Mono Mac 6細胞沒有作用，與劑量和接觸時間無關(guān)，與細胞是未受刺激還是用PMA刺激無關(guān)。
鮮山茶葉的細胞汁漿液在接觸24或48小時后以劑量依賴方式適度抑制未受刺激的Mono Mac 6細胞還原酶活性。在最高劑量0.01％(w/v，在培養(yǎng)基中的終濃度，以初始制品中的固體干重為基準)時的最大抑制僅為對照活性的約20-30％。PMA刺激的細胞的抑制達到對照活性的50％，但這僅是在最高劑量的組合物D(0.01％)且僅在接觸48小時后發(fā)生。
新鮮收獲的山茶的膜組分提取物(組合物B)在抑制Mono Mac 6細胞還原酶活性方面被證明是最有效的測試制品，同其對乳癌細胞系的情況一樣。PMA刺激作用或接觸組合物的時間長度對抑制的作用很小，其在有或無PMA的情況下是劑量依賴性的，在接觸24小時或48小時后大致相同。在最高劑量0.02％下，PMA存在時還原酶活性被抑制70％，沒有PMA時還原酶活性被抑制80-90％，但在0.001％劑量下可容易地檢測到較低水平的抑制(15％)。還沒有對胞質(zhì)酶釋放進行檢測來證實還原酶活性丟失與壞死性細胞溶解解無關(guān)，但通過光學顯微鏡檢查接觸0.02％的任何生物活性組合物48小時的MonoMac 6細胞未能觀察到膜碎裂的證據(jù)。而且，如下文所示，在MTS還原被顯著降低的情況下細胞似乎仍能夠分泌至少一種MMP。
這些結(jié)果提示，在這些細胞以及乳癌細胞系中，還原酶活性的丟失與線粒體功能相對選擇性的丟失相關(guān)，可反映出程序性細胞死亡或凋亡通路啟動。
MMP的分泌。已使用兩種不同的實驗檢測Mono Mac 6細胞釋放的兩種明膠酶MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)的水平。這些MMP涉及炎性組織損傷以及腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移。首先使用用于MMP-2和MMO-9的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，評價在10nM PMA和不同劑量的三種山茶生物活性組合物和陽性對照存在下，培養(yǎng)48小時的Mono Mac 6細胞培養(yǎng)基中兩種酶的總水平。
該細胞系在未受刺激時僅分泌MMP-2，但在其被活化時同時分泌MMP-2和MMP-9。(在24小時后釋放的MMP水平通常太低，以至于不容易被檢測到)。
ELISA檢測結(jié)果示于圖34-37。正如所觀測到的細胞壁組分提取物和白茶提取物對Mono Mac 6細胞的MTS還原的作用一樣，任何劑量的這些提取物在分泌的MMP-2或MMP-9水平方面都沒有顯著改變。在最高劑量(0.01w/v)的膜組分提取物和細胞汁漿液下，觀察到MMP-2水平降低，在該劑量膜組分提取物表現(xiàn)出最大效力。應(yīng)當注意的是，在次最高劑量組合物B(0.001％)和組合物D(0.002％)下，觀察到表觀上稍微刺激MMP-2釋放。此刺激使人聯(lián)想到相似劑量的這些組合物在TGF-β處理的MCF-7細胞中刺激MTS還原酶活性。
通過ELISA檢測到的MMP-2水平劑量依賴性減少與膜組分提取物和細胞汁漿液對MMP-9水平的作用不相對應(yīng)。這些水平在最高劑量時增加(細胞汁漿液在此方面顯然更顯著)，但在較低測試劑量時未改變。接觸僅在24小時后就對MTS還原酶活性產(chǎn)生顯著抑制的山茶制品劑量48小時的Mono Mac 6細胞，其分泌的MMP-9水平未改變或增加，該檢測結(jié)果進一步表明，接觸山茶膜組分提取物或細胞汁漿液的Mono Mac 6細胞中線粒體功能喪失未反映出壞死性細胞溶解，在該情況下MMP分泌應(yīng)突然終止。
作為山茶組合物對Mono Mac 6細胞分泌MMP的作用的進一步證據(jù)，使用明膠酶譜(gelatin zymography)技術(shù)檢查如上對ELISA檢測所述收集的培養(yǎng)基。在此方法中，首先在十二烷基硫酸鈉存在下在明膠浸制的聚丙烯酰胺凝膠中對培養(yǎng)基進行電泳(SDS-PAGE)，以基于分子量分離蛋白。然后將SDS洗出凝膠，以使存在的任何酶的至少一部分復(fù)性，將凝膠在使MMP活性最大化的培養(yǎng)基中溫育。MMP無論存在于哪里都可溶解明膠。在用蛋白染料顯色凝膠塊中的未消化明膠之后，掃描凝膠，MMP表現(xiàn)為與染色背景相反的澄明區(qū)域。本文提供了負影象，使得MMP表現(xiàn)為與亮背景相反的暗區(qū)域。
應(yīng)當注意的是，大部分細胞分泌的MMP為失活前體，其然后在胞外活化。但是，因為在酶譜中使用的變性和復(fù)性順序，即使是MMP的所謂失活前體形式，也獲得了明膠液化活性，產(chǎn)生澄明區(qū)域。圖34-37圖示了以下培養(yǎng)基的明膠酶譜負影象Mono Mac 6細胞接觸不同的山茶生物活性組合物48小時后收集的培養(yǎng)基，以及由沒有(U)或有(S)10nM PMA但沒有山茶組合物時培養(yǎng)的細胞收集的培養(yǎng)基。
僅對最低劑量(0.0001％，“l(fā)o”)和最高劑量(0.01％，“hi”)的制品評價組合物A和陽性對照的作用，而在0.001％的中間劑量(“med”)評價了組合物B和D的作用。由4幅圖顯然可知，在沒有PMA時Mono Mac 6細胞僅釋放MMP-2(約67kD)，發(fā)現(xiàn)該酶主要為前體形式。用10nM PMA處理導(dǎo)致誘導(dǎo)MMP-9分泌(約92kD)，以及進一步產(chǎn)生蛋白水解活性，該活性將顯著水平的兩種MMP的前體形式轉(zhuǎn)變成其稍微低分子量的活性形式。
和ELISA結(jié)果相一致，經(jīng)明膠酶譜顯色，使PMA刺激的MonoMac 6細胞接觸細胞壁組分提取物和白茶提取物對前體形式或活性形式的兩種MMP的任一種的水平都沒有可檢測的作用。相反，經(jīng)明膠酶譜顯色，接觸最高劑量的組合物B和D使MMP-2水平產(chǎn)生顯著減少，但MMP-9水平?jīng)]有明顯變化。
在由用最高劑量組合物B和D處理的細胞收集的培養(yǎng)基中，同時出現(xiàn)前體形式和活性形式的MMP-9，以及對應(yīng)于活性形式MMP-2的弱但可識別條帶，這提示這些組合物的作用主要是調(diào)節(jié)MMP-2的釋放，不涉及對這些培養(yǎng)細胞中MMP活化機制的其它作用。
實施例18-山茶生物活性組合物的對比評價結(jié)果概述實驗數(shù)據(jù)表明，山茶生物活性組合物觸發(fā)MTS還原酶活性的劑量依賴性損失，這一般歸因于線粒體功能的喪失。此抑制可能需要長達48小時的接觸才能被檢測，至少在前24小時，胞質(zhì)酶沒有可檢測的釋放，這提示生物活性組合物不是誘導(dǎo)壞死性細胞溶解，而是在腫瘤細胞中啟動程序性或凋亡細胞死亡通路。
MCF-7細胞和MDA-MB-435S細胞反應(yīng)在時間和劑量依賴性方面的差異，以及TGF-β處理MCF-7細胞的作用，都表明更加侵入性和轉(zhuǎn)移性的表型對白茶提取物、細胞壁組分提取物的抗性稍微增加，在某種程度上對細胞汁漿液的抗性增加，以在接觸的前24小時內(nèi)還原酶活性損失相對有限為證。但是，膜組分提取物在24小時內(nèi)抑制TGF-β處理的MCF-7細胞以及MDA-MB-435S細胞中的MTS還原酶活性證明了其效力更高的趨勢。
測試的山茶生物活性組合物對人單核細胞/巨噬細胞模型MonoMac 6細胞的作用同觀察到的對乳癌細胞系的作用具有一定相似性。根據(jù)在乳癌細胞系培養(yǎng)基中沒有乳酸脫氫酶和在Mono Mac 6細胞培養(yǎng)基中存在正常至增加水平的分泌MMP-9，已可推斷這些組合物不誘導(dǎo)壞死性細胞溶解，即便在最高的測試劑量(0.01％w/v)。
但是，兩種生物活性組合物(膜組分提取物和細胞汁漿液)誘導(dǎo)線粒體還原酶活性的劑量依賴性抑制，其反映出在Mono Mac 6細胞中程序性細胞死亡的凋亡通路啟動。而且，這些炎性細胞接觸膜組分提取物和細胞汁漿液導(dǎo)致明膠液化酶MMP-2(明膠酶A)水平選擇性降低。明膠酶譜表明，“前體形式”或酶原活化的機制未受山茶生物活性組合物的影響，所以非常不可能是培養(yǎng)基中MMP-2水平降低反映蛋白水解破壞作用增強。
因此，所有的測試細胞系(即早期人乳癌模型、晚期人乳癌模型和單核細胞白血病模型)的代謝活性都受到膜組分提取物(組合物B)的有效抑制，在大部分情況下，受到細胞汁漿液(組合物D)的抑制。引人注目的是，茶細胞壁提取物(組合物A)和白茶提取物(陽性對照)被證實無活性或遠比以上的組合物B和D效力低。
對于沒有或有轉(zhuǎn)化生長因子的情況下的所有測試MCF-7人癌細胞、晚期人乳癌細胞MDA-MB-435S以及刺激和未刺激的單核細胞Mono Mac 6細胞，此趨勢都被明確證實。表15提供了與生物活性山茶組合物測試和評價的概述相關(guān)的數(shù)據(jù)。
表15-生物活性山茶組合物測試和評價的概述
表15表明，山茶制品以劑量依賴方式調(diào)節(jié)細胞功能的能力以下述順序增加白茶提取物＝細胞壁組分提取物＞細胞汁漿液＞膜組分提取物。實驗數(shù)據(jù)提示，通過將新鮮植物組織加工成細胞汁衍生膜組分提取物(組合物B)和細胞汁漿液(組合物D)制備的新生物活性山茶組合物未觸發(fā)任何針對細胞的明顯壞死毒性。
因此，本發(fā)明的技術(shù)表現(xiàn)出急劇增加山茶生物活性組合物效力的能力和生產(chǎn)非常令人印象深刻的新產(chǎn)物的能力，其中所述新產(chǎn)物對活體人細胞表現(xiàn)出的活性在通過常規(guī)山茶技術(shù)生產(chǎn)的最好產(chǎn)物(例如白茶提取物)中也沒有表現(xiàn)出來。
實施例19-山茶生物活性組合物的對比評價與未來研究的關(guān)系本發(fā)明的山茶生物活性組合物對細胞介導(dǎo)的蛋白水解活性的作用涉及炎性組織損傷以及腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移。因此，可提議乳癌細胞和單核細胞白血病細胞作為本發(fā)明山茶生物活性組合物的預(yù)期靶，最值得注意的是組合物B(膜組分提取物)。先前已表明，結(jié)腸癌衍生細胞系COLO 205釋放顯著水平的MMP-2，然后其被也是由該細胞分泌的胰蛋白酶樣酶活化?；贛ono Mac 6細胞的結(jié)果，該類腫瘤細胞是本發(fā)明山茶生物活性組合物的眾多潛在靶之一。
由這些研究人們可確信，本發(fā)明的分離自新鮮山茶的生物活性組合物具有顯著活性，其對關(guān)鍵細胞功能產(chǎn)生重要調(diào)節(jié)。已觀察到的作用具有有價值的應(yīng)用，由個人護理用品至營養(yǎng)補充品和潛在的藥品。
實施例20-用于測定生物活性組合物的某些特征的方法以下是用于測定生物活性組合物的某些特征的各種方法。這些方法在整個上述實施例中都有提及。下文提到的“測試產(chǎn)物”或“測試樣品”是指生物活性組合物。
方法1；測定固體含量的方法。測定固體含量的方法包括在100℃水浴中蒸發(fā)測試生物活性組合物，至水完全蒸發(fā)，105℃用烘箱儲存樣品3小時，冷卻至室溫，立即測定具有固體物質(zhì)的容器的重量。
方法2測定不揮發(fā)性殘余物的方法。測定不揮發(fā)性殘余物的方法包括于105℃用烘箱儲存測試生物活性組合物5小時，冷卻，立即測定具有固體物質(zhì)的容器的重量。
方法3測定L*a*b*值的方法。測定L*a*b*值的方法使用配有檢測0°/45°幾何結(jié)構(gòu)的幾何比色計的Hunter Labscan。使用具有朝上視窗的標準光源D65。將具有測試生物活性組合物的容器放置在視窗上，通過底部檢測。使用以下的CIELAB等式C*=(a*2+b*2)1/2]]>DE*＝[(DL)2+(Da*)2+(Db*)2]DH＝[(DE*)2-(DL*)2-(DC*)2]1/2方法4測定總類胡蘿卜素含量和葉黃素含量的方法。用丙酮提取測試生物活性組合物。在勻漿和真空過濾后，用30％氫氧化鉀的甲醇溶液皂化所有的提取物。用石油醚由生物活性組合物中連續(xù)提取類胡蘿卜素。在乙醇中再次處理和重溶解后，在446nm檢測所有樣品。
為了測定葉黃素含量，使用各樣品提取物的另外干燥樣品進行高效液相層析(“HPLC”)分析。干燥樣品在MTBE和甲醇中再溶解。使用采用(250×4.60mm內(nèi)徑)5μm C18柱(“Vydac”)的反向HPLC系統(tǒng)。葉黃素的鑒別通過與可信標準共層析確認。葉黃素的乙醇溶液的摩爾吸光系數(shù)是144,800cm-1mol-1。
方法5測定彈性蛋白酶抑制活性的方法。使用以下實驗測定測試生物活性組合物的彈性蛋白酶抑制活性該實驗使用中性粒細胞彈性蛋白酶(由“Elastin Products”生產(chǎn)的純化酶制品)和“Sigma”生產(chǎn)的合成肽可溶性底物甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-對硝基苯胺。酶切割底物導(dǎo)致產(chǎn)生隨時間逐漸增加的黃色(405nm)；通過增加含抑制活性的測試生物活性組合物的濃度降低顏色產(chǎn)生的速率。分析抑制的濃度依賴性允許定量抑制活性的效力，其表示為達到50％抑制(IC50)時所需的各測試生物活性組合物中的干物質(zhì)濃度，而且提供與抑制模式相關(guān)的信息。
對于IC50測定，彈性蛋白酶的濃度為2.5μg/ml，底物濃度為150μm。對于Ki測定，底物濃度為100μM和200μM。
方法6測定明膠酶B(MMP-9)抑制活性的方法。在洗去其它蛋白酶后，使用商業(yè)性分布實驗(由“Amersham Pharmacia”生產(chǎn)的MMP-9活性ELISA)，其通過免疫識別將明膠酶B特異性捕獲在多孔微量培養(yǎng)板上。通過明膠酶B的低分子量合成底物APMA的水解，于405nm檢測酶活性。抑制的濃度依賴性分析用于確定測試生物活性組合物干物質(zhì)的效力。
方法7測定超氧化物清除活性的方法。使用采用黃嘌呤氧化酶(由“Sigma”生產(chǎn)的純化酶制品)的酶系統(tǒng)以高產(chǎn)量和可控方式生產(chǎn)超氧陰離子。該酶將黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基黃嘌呤，此轉(zhuǎn)變產(chǎn)生一定量的超氧陰離子，使用高鐵細胞色素c向亞鐵細胞色素c的還原作為超氧化物水平的敏感檢測。當將測試生物活性組合物加入到反應(yīng)系統(tǒng)中時，檢測亞鐵細胞色素c水平(550nm)允許測定測試生物活性組合物的超氧化物清除活性。每個孔的最終濃度為細胞色素c，75μM；黃嘌呤，425μm/L；以及黃嘌呤氧化酶，10mU/ml。
方法8測定體外毒性和凋亡的方法。開發(fā)了CellTiter 96 AQueous單溶液細胞增殖實驗和Cyto Tox 96非放射性細胞毒性實驗和后續(xù)的方法(兩個實驗均由Promega Corporation，Madison，WI生產(chǎn))。
第一個實驗是測定活細胞數(shù)的比色法，其開發(fā)了四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽；MTS和電子偶聯(lián)試劑(吩嗪硫酸甲酯；PMS)。MTS被細胞生物還原為在組織培養(yǎng)基中可溶的甲產(chǎn)物，其在490nm具有最大吸光度。MTS向水性、溶解性甲的轉(zhuǎn)變通過存在于代謝活性細胞中的脫氫酶實現(xiàn)，甲產(chǎn)物的量與培養(yǎng)的活細胞數(shù)成正比。
第二個實驗定量檢測乳酸脫氫酶(LDH)，乳酸脫氫酶是在細胞裂解時釋放的穩(wěn)定胞質(zhì)酶。用30分鐘偶聯(lián)酶實驗檢測釋放在細胞培養(yǎng)物上清液中的LDH，30分鐘偶聯(lián)酶實驗使四唑鹽(INT)轉(zhuǎn)變成紅色甲產(chǎn)物。形成顏色的量與裂解細胞數(shù)成比例。
方法9測定受刺激細胞分泌的酶水平的方法。在與PMA溫育后，Mono Mac 6細胞分泌兩種明膠液化基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)。用二維十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測定測試生物活性組合物存在時這些酶的水平。
實施例21-用于測試山茶產(chǎn)物的某些生物活性特征的細胞系由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC編號HTB-129)獲得細胞系MDA-MB-435S，其被認為是晚期乳癌模型。在以下ATCC培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)該細胞系含補加0.01mg/ml胰島素的2mM L-谷氨酰胺的Leibovitz L-15培養(yǎng)基，90％；胎牛血清，10％。
細胞系MCF-7得自ATCC(編號HTB-22)，其被認為是早期或較少分化的乳癌模型，將該細胞系在以下ATCC培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)含2mM L-谷氨酰胺的最低必須培養(yǎng)基(Eagle)和Earle BSS，其被調(diào)節(jié)至含1.5g/L碳酸氫鈉、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸鈉，并補加0.01mg/ml牛胰島素，90％；胎牛血清，10％。
細胞系MonoMac6(MM6，得自德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心)與分化人單核細胞密切相似(Ziegler-Heitbrock等，“Establishementof a Human Cell Line(Mono Mac 6)with Characteristics of MatureMonocytes，”International Journal of Cancer 41456-461(1988)，其通過引用整體結(jié)合到本文中)。細胞保持在RPMI 1640中，其中補加2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mM丙酮酸鈉、10％FCS、非必需氨基酸、9μg/ml胰島素和1mM草酰乙酸。對于實驗條件，還加入0.2％葡萄糖。
實施例22-山茶產(chǎn)物的兒茶素分析分析本發(fā)明的細胞壁組分提取物、膜組分提取物和細胞汁漿液的各種兒茶素含量。白茶樣品用作對照。測定以下的兒茶素(-)-表沒食子兒荼素、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯和(-)-表兒茶素沒食子酸酯。
樣品使用0.1％H3PO4提取，并超聲約15分鐘。在離心后，將提取物注射在HPLC上。使用C-18反向柱作為固定相。使用0.1％磷酸和乙腈作為流動相。于280nm檢測。根據(jù)列出的各兒茶素與其純標準品的面積對比進行計算。結(jié)果示于圖38和表16(見下文)。
表16-生物活性山茶組合物的兒茶素含量
盡管本文已詳細描述了優(yōu)選實施方案，但對相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，可進行各種修改、增補、替換等而不偏離本發(fā)明的精神，因此這些被認為在以下權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生物活性組合物，所述組合物包含得自山茶科(Theacea)植物的分離生物活性組分，其中所述生物活性組分選自細胞壁組分、細胞壁組分提取物、膜組分、膜組分提取物、胞質(zhì)組分、胞質(zhì)組分提取物、細胞汁漿液及其組合。
2.權(quán)利要求1的生物活性組合物，其中所述生物活性組分為細胞壁組分。
3.權(quán)利要求1的生物活性組合物，其中所述生物活性組分為細胞壁組分提取物。
4.權(quán)利要求3的生物活性組合物，其中所述細胞壁組分提取物的總兒茶素含量為約2.1至約4.5mg/g干物質(zhì)。
5.權(quán)利要求3的生物活性組合物，其中所述細胞壁組分提取物的兒茶素含量分布包含約2.0至約3.0mg(+)-兒茶素/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；約0.005至約0.02mg(-)-表兒茶素/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；約0.005至約0.02mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)；約0.003至約0.01mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g細胞壁組分提取物干物質(zhì)。
6.權(quán)利要求1的生物活性組合物，其中所述生物活性組分為膜組分。
7.權(quán)利要求1的生物活性組合物，其中所述生物活性組分為膜組分提取物。
8.權(quán)利要求7的生物活性組合物，其中所述膜組分提取物的總兒茶素含量為約15.0至約30.5mg/g干物質(zhì)。
9.權(quán)利要求7的生物活性組合物，其中所述膜組分提取物的兒茶素含量分布包含約1.7至約3.3mg(-)-表沒食子兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；約6.1至約10.2mg(+)-兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；約0.3至約1.1mg(-)-表兒茶素/g膜組分提取物干物質(zhì)；約6.2至約12.5mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)；約0.007至約0.03mg(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)；和約1.3至約3.3mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g膜組分提取物干物質(zhì)。
10.權(quán)利要求1的生物活性組合物，其中所述生物活性組分為胞質(zhì)組分。
11.權(quán)利要求1的生物活性組合物，其中所述生物活性組分為胞質(zhì)組分提取物。
12.權(quán)利要求1的生物活性組合物，其中所述生物活性組分為細胞汁漿液。
13.權(quán)利要求12的生物活性組合物，其中所述細胞汁漿液的總兒茶素含量為約8.0至約20.0mg/g干物質(zhì)。
14.權(quán)利要求12的生物活性組合物，其中所述細胞汁漿液的兒茶素含量分布包含約2.1至約4.4mg(-)-表沒食子兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；約4.2至約8.6mg(+)-兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；約0.2至約2.0mg(-)-表兒茶素/g細胞汁漿液干物質(zhì)；約1.2至約3.2mg(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)；約0.01至約0.1mg(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)；和約0.2至約1.3mg(-)-表兒茶素沒食子酸酯/g細胞汁漿液干物質(zhì)。
15.權(quán)利要求1的生物活性組合物，其中所述山茶科(Theacea)植物為山茶屬(Camellia)植物或柃木屬(Eurya)植物。
16.權(quán)利要求15的生物活性組合物，其中所述山茶屬(Camellia)植物選自茶樹(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japonica)、云南山茶花(Camellia reticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。
17.權(quán)利要求15的生物活性組合物，其中所述柃木屬(Eurya)植物為Eurya sandwicensis。
18.權(quán)利要求1的生物活性組合物，所述組合物進一步包含穩(wěn)定劑。
19.權(quán)利要求18的生物活性組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、聚合物基質(zhì)及其混合物。
20.一種適于局部施用給哺乳動物的生物活性局部制劑，所述生物活性局部制劑包含局部有效量的權(quán)利要求1的生物活性組合物和局部可接受的載體。
21.權(quán)利要求20的生物活性局部制劑，其中局部可接受的載體選自親水膏劑型基質(zhì)、親水洗劑型基質(zhì)、親水表面活性劑基質(zhì)、親水凝膠型基質(zhì)、親水溶液型基質(zhì)、疏水膏劑型基質(zhì)、疏水洗劑型基質(zhì)、疏水表面活性劑基質(zhì)、疏水凝膠型基質(zhì)和疏水溶液型基質(zhì)。
22.權(quán)利要求20的生物活性局部制劑，其中生物活性組合物以生物活性局部制劑總重的約0.001％至約90％的量存在。
23.一種在哺乳動物皮膚組織中抑制炎性活性的方法，所述方法包括提供權(quán)利要求1的生物活性組合物和以在皮膚組織中有效抑制炎性活性的量將生物活性組合物施用于皮膚組織。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物為山茶屬(Camellia)植物或柃木屬(Eurya)植物。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述生物活性組合物進一步包含穩(wěn)定劑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述穩(wěn)定劑選自乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、聚合物基質(zhì)及其混合物。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述生物活性組合物進一步包含局部可接受的載體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中局部可接受的載體選自親水膏劑型基質(zhì)、親水洗劑型基質(zhì)、親水表面活性劑基質(zhì)、親水凝膠型基質(zhì)、親水溶液型基質(zhì)、疏水膏劑型基質(zhì)、疏水洗劑型基質(zhì)、疏水表面活性劑基質(zhì)、疏水凝膠型基質(zhì)和疏水溶液型基質(zhì)。
29.一種保護哺乳動物皮膚組織免受紫外線誘導(dǎo)損傷的方法，所述方法包括提供權(quán)利要求1的生物活性組合物和以有效減少皮膚組織的紫外線誘導(dǎo)損傷和防止皮膚組織氧化損傷的量將生物活性組合物施用于皮膚組織。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物為山茶屬(Camellia)植物或柃木屬(Eurya)植物。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述生物活性組合物進一步包含穩(wěn)定劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述穩(wěn)定劑選自乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、聚合物基質(zhì)及其混合物。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述生物活性組合物進一步包含局部可接受的載體。
34.權(quán)利要求33的方法，其中局部可接受的載體選自親水膏劑型基質(zhì)、親水洗劑型基質(zhì)、親水表面活性劑基質(zhì)、親水凝膠型基質(zhì)、親水溶液型基質(zhì)、疏水膏劑型基質(zhì)、疏水洗劑型基質(zhì)、疏水表面活性劑基質(zhì)、疏水凝膠型基質(zhì)和疏水溶液型基質(zhì)。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述紫外線誘導(dǎo)的損傷由約320至約400nm范圍的紫外線引起。
36.一種使哺乳動物皮膚組織中的皮膚病正?；姆椒?，所述方法包括提供權(quán)利要求1的生物活性組合物，和以有效使皮膚組織中細胞疾病正?；牧繉⑸锘钚越M合物施用于皮膚組織。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物為山茶屬(Camellia)植物或柃木屬(Eurya)植物。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述生物活性組合物進一步包含穩(wěn)定劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述穩(wěn)定劑選自乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、聚合物基質(zhì)及其混合物。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述生物活性組合物進一步包含局部可接受的載體。
41.權(quán)利要求40的方法，其中局部可接受的載體選自親水膏劑型基質(zhì)、親水洗劑型基質(zhì)、親水表面活性劑基質(zhì)、親水凝膠型基質(zhì)、親水溶液型基質(zhì)、疏水膏劑型基質(zhì)、疏水洗劑型基質(zhì)、疏水表面活性劑基質(zhì)、疏水凝膠型基質(zhì)和疏水溶液型基質(zhì)。
42.一種用于分離得自山茶科(Theacea)植物細胞汁的生物活性組分的方法，所述方法包括提供山茶科(Theacea)植物；將山茶科(Theacea)植物分離成細胞汁和細胞壁組分；在有效生產(chǎn)生物活性組分的條件下處理細胞汁，其中所述生物活性組分選自膜組分、膜組分提取物、胞質(zhì)組分、胞質(zhì)組分提取物和細胞汁漿液；以及分離所述生物活性組分和處理的細胞汁。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述生物活性組分為膜組分。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述生物活性組分為膜組分提取物。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述生物活性組分為胞質(zhì)組分。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述生物活性組分為胞質(zhì)組分提取物。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述生物活性組分為細胞汁漿液。
48.權(quán)利要求42的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物為山茶屬(Camellia)植物或柃木屬(Eurya)植物。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述山茶屬(Camellia)植物選自茶樹(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japomca)、云南山茶花(Camelliareticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述柃木屬(Eurya)植物為Euryasandwicensis。
51.一種分離的生物活性組合物，所述組合物按照權(quán)利要求42的方法生產(chǎn)。
52.一種用于分離得自山茶科(Theacea)植物細胞壁組分的生物活性組分的方法，所述方法包括提供山茶科(Theacea)植物；將山茶科(Theacea)植物分離成細胞汁和細胞壁組分；在有效生產(chǎn)生物活性組分的條件下處理細胞壁組分；和分離生物活性組分和處理的細胞壁組分。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述生物活性組分為細胞壁組分。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述生物活性組分為細胞壁組分提取物。
55.權(quán)利要求52的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物為山茶屬(Camellia)植物或柃木屬(Eurya)植物。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述山茶屬(Camellia)植物選自茶樹(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japonica)、云南山茶花(Camelliareticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述柃木屬(Eurya)植物為Euryasandwicensis。
58.一種分離的生物活性組合物，所述組合物按照權(quán)利要求52的方法生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的生物活性組合物，其包含得自山茶科(Theacea)植物的生物活性組分。本發(fā)明還涉及含生物活性組合物的生物活性局部制劑。本發(fā)明進一步涉及使用本發(fā)明的生物活性組合物的方法，包括例如在哺乳動物皮膚組織中抑制炎性活性的方法、保護哺乳動物皮膚組織免受紫外線誘導(dǎo)損傷的方法，以及使哺乳動物皮膚組織中的皮膚病正?；姆椒?。本發(fā)明還涉及分離得自山茶科(Theacea)植物的細胞汁或細胞壁組分的生物活性組分的方法。
文檔編號A61P17/00GK1929851SQ200580007271
公開日2007年3月14日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月12日
發(fā)明者M·科加諾夫 申請人:綜合植物科技有限責任公司