專利名稱：復(fù)合粒子和包覆復(fù)合粒子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及復(fù)合粒子和包覆復(fù)合粒子以及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
迄今，在藥品、食品、農(nóng)藥、動(dòng)物用藥等中，關(guān)于包覆粒子的制備方法已公開(kāi)了很多技術(shù)。粒子(被包覆的粒子)用包覆層包覆，是由于例如抑制了所受來(lái)自外部因素的影響，因此，為了使其選擇性地接受外部因素的影響，以此作為引發(fā)器(扳機(jī))引起粒子的變化等，而向粒子賦予功能為目的而進(jìn)行的。
然而，在例如將小型粒子用包覆層包覆的場(chǎng)合，粒子彼此由于粒子間的范得華力或靜電力、來(lái)自包覆層成分或液滴的交聯(lián)的力等而凝聚，往往得到不是理想大小的包覆粒子。作為不是理想大小的包覆粒子，例如可列舉出在例如經(jīng)肺給藥用微?；蜢o脈注射用微粒中，具有或是容易使氣管或血管阻塞的大小、或是容易因機(jī)體的異物排除作用而被排泄的大小的包覆粒子等。
另一方面，作為核酸向細(xì)胞內(nèi)的送達(dá)手段，已知有使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物的方法。但是，該方法中，在將含有核酸的陽(yáng)離子脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物注射到靜脈內(nèi)之后，核酸被從血液中快速去除，在靶組織為肝臟和肺以外的場(chǎng)合，例如在腫瘤部位等的場(chǎng)合，不能把核酸送達(dá)至靶組織，從而不能充分發(fā)揮其應(yīng)有的作用。因此，曾報(bào)導(dǎo)了一種可以解決核酸在血中被快速去除的問(wèn)題的核酸封入脂質(zhì)體(將核酸封入在脂質(zhì)體內(nèi)的脂質(zhì)體)(參見(jiàn)特表2002-508765號(hào)公報(bào)、特表2002-501511號(hào)公報(bào)、Biochimica et Biophysica Acta，2001年，第1510卷，p.152-166和專利文獻(xiàn)1)。在特表2002-508765號(hào)公報(bào)中，報(bào)導(dǎo)了用于制備含有核酸等粒子的方法，作為這種方法，例如將陽(yáng)離子型脂質(zhì)預(yù)先溶解于氯仿中，接著加入寡脫氧核苷酸(ODN)的水溶液和甲醇并混合后，經(jīng)過(guò)離心分離，使陽(yáng)離子型脂質(zhì)/ODN的復(fù)合體轉(zhuǎn)移至氯仿層，進(jìn)而取出該氯仿層，向其中加入聚乙二醇衍生化磷脂、中性的脂質(zhì)和水，形成油包水型(W/O)乳液，采用逆相蒸發(fā)法進(jìn)行處理，從而制備ODN內(nèi)包脂質(zhì)體的方法；在特表2002-501511號(hào)公報(bào)和Biochimica et Biophysica Act中曾報(bào)告將ODN溶解于pH3.8的檸檬酸水溶液中，加入脂質(zhì)(乙醇中)，將乙醇濃度降低至20vol％，從而配制成包封ODN的脂質(zhì)體，進(jìn)行粒度分級(jí)過(guò)濾，采用透析法除去過(guò)剩的乙醇后，將試樣進(jìn)一步在pH7.5下進(jìn)行透析，除去附著在脂質(zhì)體表面上的ODN，從而制備包封ODN的脂質(zhì)體的方法，分別制成了封入各種核酸等有效成分的脂質(zhì)體。
與此相對(duì)，在專利文獻(xiàn)1中，曾報(bào)導(dǎo)采用在液體中用脂質(zhì)膜包覆微粒的方法來(lái)制備封入了核酸等有效成分的脂質(zhì)體。在該方法中，通過(guò)使微粒分散、并且使極性有機(jī)溶劑在溶解有脂質(zhì)的含極性有機(jī)溶劑的水溶液中的比例減少，使微粒被脂質(zhì)膜包覆，在液體中進(jìn)行包覆，可以非常高效率地制備例如適于靜脈注射用的微粒等那樣大小的包覆微粒，另外，該專利文獻(xiàn)1中還舉出作為微粒例子的藥物復(fù)合體。該藥物復(fù)合體是導(dǎo)引(リ一ド)粒子(與下述的介導(dǎo)粒子的含義相同)與藥物的復(fù)合粒子。包覆了該復(fù)合粒子的包覆復(fù)合粒子的粒徑，根據(jù)所包覆的復(fù)合粒子而不同，據(jù)報(bào)告，包覆使ODN附著在作為介導(dǎo)粒子的陽(yáng)離子脂質(zhì)體上而制得的復(fù)合粒子而得到的包覆復(fù)合粒子，其粒徑小，可以作為注射劑使用，該包覆復(fù)合粒子在靜脈內(nèi)給藥的場(chǎng)合，顯示出高的血中滯留性，較多地聚集在腫瘤組織中。
另一方面，近年來(lái)，siRNA作為藥效比反義藥物更好的藥劑而引人注目[參見(jiàn)Biochemical and Biophysical ResearchCommunication，2002年，第296卷，p.1000-1004]。迄今為止，關(guān)于siRNA在血中的動(dòng)態(tài)雖還沒(méi)有充分的報(bào)導(dǎo)，但可以預(yù)料，siRNA與反義藥物相同，從血中快速消失而不轉(zhuǎn)移至靶組織，因此，為了提高藥物向靶組織的轉(zhuǎn)移性，人們希望開(kāi)發(fā)出某種載體[參見(jiàn)Biochimica et Biophysica Acta，1996年，第1281卷，p.139-149；J.Controlled Release，1996年，第41卷，p.121-130]。
專利文獻(xiàn)1國(guó)際公開(kāi)第02/28367號(hào)小冊(cè)子發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供一種藥物附著在介導(dǎo)粒子上的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法及其制備方法等。另外，本發(fā)明的目的還在于提供凝聚被抑制的復(fù)合粒子由包覆層包覆的包覆復(fù)合粒子的制備方法、能夠采用該制備方法制備的包覆復(fù)合粒子等。
解決課題的手段本發(fā)明涉及以下的(1)～(47)。
(1)復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子中，使該介導(dǎo)粒子中含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
(2)上述(1)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑，是水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物。
(3)上述(1)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑，是從聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯和聚乙二醇烷基醚中選出的1種以上的物質(zhì)。
(4)上述(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子，是在已分散有介導(dǎo)粒子的液體中，使藥物分散或者溶解而被含有，使藥物附著在該介導(dǎo)粒子上而得到的。
(5)上述(1)～(4)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子，是藥物借助靜電附著在介導(dǎo)粒子上而形成的。
(6)上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，介導(dǎo)粒子為具有與藥物靜電相反的電荷的介導(dǎo)粒子。
(7)上述(1)～(6)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，介導(dǎo)粒子為以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒，該脂質(zhì)體含有具有與藥物靜電相反的電荷的脂質(zhì)。
(8)上述(1)～(7)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，藥物為核酸。
(9)上述(8)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，作為藥物的核酸是從基因、DNA、RNA、寡核苷酸、質(zhì)粒和siRNA中選出的1種以上的物質(zhì)。
(10)上述(1)～(9)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子為由藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子。
(11)上述(10)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子，是在已分散有介導(dǎo)粒子的液體中，使藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑分散或者溶解而被含有，使藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在該介導(dǎo)粒子上而得到的。
(12)上述(10)或者(11)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子，是藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑借助靜電附著在介導(dǎo)粒子上而形成的。
(13)上述(10)～(12)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽和高分子中選出的1種以上的物質(zhì)。
(14)上述(10)～(12)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖鈉、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素(ケタラン硫酸)以及陰離子性葡聚糖熒光素中選出的1種以上的物質(zhì)。
(15)復(fù)合粒子的凝聚抑制劑，該復(fù)合粒子是由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的，其中含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
(16)上述(15)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制劑，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑是水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。
(17)上述(15)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制劑，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑是從聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中選出的1種以上的物質(zhì)。
(18)復(fù)合粒子的制備方法，該復(fù)合粒子是由作為藥物的核酸附著在介導(dǎo)粒子上而形成的，其中包括在含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑的介導(dǎo)粒子的分散液中，使作為藥物的該核酸分散或者溶解而被含有，使作為藥物的該核酸附著在該介導(dǎo)粒子上的步驟。
(19)復(fù)合粒子的制備方法，該復(fù)合粒子是由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的，其中包括在含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑的介導(dǎo)粒子的分散液中，通過(guò)使藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑分散或者溶解而被含有，使該藥物和該附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在該介導(dǎo)粒子上的步驟。
(20)上述(19)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽和高分子中選出的1種以上的物質(zhì)。
(21)上述(19)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖鈉、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素以及陰離子性葡聚糖熒光素中選出的1種以上的物質(zhì)。
(22)上述(19)～(21)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，藥物是核酸。
(23)上述(18)或者(22)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，作為藥物的核酸是從基因、DNA、RNA、寡核苷酸、質(zhì)粒和siRNA中選出的1種以上的物質(zhì)。
(24)上述(18)～(23)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑為水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。
(25)上述(18)～(23)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑是從聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中選出的1種以上的物質(zhì)。
(26)上述(18)～(25)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，介導(dǎo)粒子為具有與藥物靜電相反的電荷的介導(dǎo)粒子。
(27)上述(18)～(25)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，介導(dǎo)粒子為以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒，該脂質(zhì)體含有具有與藥物靜電相反的電荷的脂質(zhì)。
(28)按照上述(18)～(27)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法制備的復(fù)合粒子。
(29)復(fù)合粒子，其中含有介導(dǎo)粒子以及附著在該介導(dǎo)粒子上的作為藥物的核酸；其中所述介導(dǎo)粒子含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
(30)復(fù)合粒子，其中含有介導(dǎo)粒子、附著在該介導(dǎo)粒子上的藥物、以及附著在該介導(dǎo)粒子上的附著競(jìng)爭(zhēng)劑；其中所述介導(dǎo)粒子含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
(31)上述(30)所述的復(fù)合粒子，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽和高分子中選出的1種以上的物質(zhì)。
(32)上述(30)所述的復(fù)合粒子，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖鈉、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素以及陰離子性葡聚糖熒光素中選出的1種以上的物質(zhì)。
(33)上述(30)～(32)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，藥物為核酸。
(34)上述(29)或者(33)所述的復(fù)合粒子，其中，作為藥物的核酸是從基因、DNA、RNA、質(zhì)粒和siRNA中選出的1種以上的物質(zhì)。
(35)上述(29)～(34)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑為水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。
(36)上述(29)～(34)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑是從聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中選出的1種以上的物質(zhì)。
(37)上述(29)～(36)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，介導(dǎo)粒子為具有與藥物靜電相反的電荷的介導(dǎo)粒子。
(38)上述(29)～(36)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，介導(dǎo)粒子為以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒，該脂質(zhì)體含有具有與藥物靜電相反的電荷的脂質(zhì)。
(39)包覆復(fù)合粒子的制備方法，包括配制含有極性有機(jī)溶劑的液體(A液)的步驟，其中分散有上述(28)～(38)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子并且溶解有包覆層成分；然后，通過(guò)使A液中的極性有機(jī)溶劑的比例減少，使復(fù)合粒子被由包覆層成分構(gòu)成的包覆層包覆的步驟。
(40)上述(39)所述的包覆復(fù)合粒子的制備方法，配制A液的步驟包括配制含有極性有機(jī)溶劑的液體(B液)的步驟，其中分散有上述(28)～(38)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子；配制將包覆層成分溶解于溶劑中而形成的液體(C液)的步驟，該溶劑中含有與B液中的極性有機(jī)溶劑相同或者不同的極性有機(jī)溶劑；以及，將B液與C液混合的步驟。
(41)上述(39)或者(40)所述的包覆復(fù)合粒子的制備方法，其中，包覆層為脂質(zhì)膜。
(42)上述(41)所述的包覆復(fù)合粒子的制備方法，其中，包覆層含有水溶性高分子衍生物。
(43)按照上述(39)～(42)中任一項(xiàng)所述的包覆復(fù)合粒子的制備方法制備的包覆復(fù)合粒子。
(44)包覆復(fù)合粒子，由上述(28)～(38)中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子以及包覆該復(fù)合粒子的包覆層構(gòu)成，其中，構(gòu)成該包覆層的包覆層成分是這樣一種成分，即，在含有極性溶劑的溶劑中，當(dāng)極性溶劑的濃度相對(duì)提高時(shí)溶解、而相對(duì)降低時(shí)析出或者聚集，其中極性溶劑在溶劑中的濃度范圍是該復(fù)合粒子不溶解但能夠分散的濃度范圍。
(45)上述(44)所述的包覆復(fù)合粒子，其中，包覆層為脂質(zhì)膜。
(46)上述(45)所述的包覆復(fù)合粒子，其中，包覆層為含有水溶性高分子衍生物的包覆層。
(47)上述(44)～(46)中任一項(xiàng)所述的包覆復(fù)合粒子，其中，包覆復(fù)合粒子的平均粒徑在300nm以下。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供一種藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法、其制備方法等，還提供凝聚被抑制的、由包覆層將復(fù)合粒子包覆了的包覆復(fù)合粒子的制備方法、可以采用該制備方法制備的包覆復(fù)合粒子等。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中所述復(fù)合粒子是指至少含有介導(dǎo)粒子和藥物并且藥物附著在介導(dǎo)粒子上的粒子。
上述藥物(以下稱為藥物A)是在本發(fā)明的復(fù)合粒子中附著在介導(dǎo)粒子上的藥物，優(yōu)選是靜電附著在介導(dǎo)粒子上的藥物，其中包含由于藥物分子內(nèi)的電荷或者由于分子內(nèi)的極化等原因而導(dǎo)致產(chǎn)生朝向陽(yáng)離子或者陰離子的靜電引力的物質(zhì)?？闪信e出例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物等具有藥理學(xué)活性的物質(zhì)等，優(yōu)選可列舉出核酸，更優(yōu)選可列舉出基因、DNA、RNA、寡核苷酸(ODN)、質(zhì)粒和siRNA，進(jìn)一步優(yōu)選可列舉出質(zhì)粒和siRNA。
作為蛋白質(zhì)或者肽，可列舉出例如緩激肽、血管緊張肽、催產(chǎn)素、加壓素、促腎上腺皮質(zhì)激素、降鈣素、胰島素、胰高血糖素、縮膽囊素、β-內(nèi)啡肽、促黑素細(xì)胞抑制因子、促黑素、胃泌素拮抗劑、神經(jīng)降壓素、生長(zhǎng)抑素、二甲氧基馬錢子堿、環(huán)孢霉素、腦啡肽、鐵傳遞蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽、甲狀腺素、生長(zhǎng)素、促性腺激素、促黃體生成素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、尿酸酶、羧肽酶、谷氨酰胺酶、超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原激活劑、鏈激酶、白細(xì)胞介素、干擾素、胞壁酰二肽、胸腺生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、血小板生成素、胰蛋白酶抑制劑、溶菌酶、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、來(lái)自血小板的生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞(纖維母細(xì)胞)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胸腺素、特異抗體(可列舉出例如，抗EGF受體抗體等)等。
作為核酸，可列舉出例如反義寡核苷酸、有義寡核苷酸等的ODN、基因、DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA等，該核酸也包含在核酸結(jié)構(gòu)中的磷酸部分、酯部分等中所含的氧原子等被替代成例如硫原子等其他的原子而形成的衍生物。應(yīng)予說(shuō)明，siRNA是指短的雙鏈RNA。
作為低分子化合物，可列舉出例如ε-氨基己酸、鹽酸精氨酸、L-天冬氨酸鉀、氨甲環(huán)酸、硫酸博萊霉素、硫酸長(zhǎng)春新堿、頭孢唑啉鈉、頭孢噻吩鈉、胞磷膽堿、阿糖胞苷、硫酸慶大霉素、鹽酸萬(wàn)古霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星等。
作為糖類，可列舉出例如硫酸軟骨素鈉、肝素鈉、葡聚糖熒光素等。
作為高分子化合物，可列舉出例如聚乙烯磺酸鈉、二乙烯基醚-馬來(lái)酸酐共聚物(DIVEMA)、苯乙烯馬來(lái)酸酐共聚物-新制癌菌素結(jié)合體(SMANCS)等。
本發(fā)明中所述介導(dǎo)粒子是指以例如藥物、脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液粒子、高分子、金屬膠體、微粒制劑等作為構(gòu)成成分的微粒，優(yōu)選以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒。本發(fā)明中的介導(dǎo)粒子也可以由藥物、脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液粒子、高分子、金屬膠體、微粒制劑等之中的2種以上組合而成的復(fù)合體作為構(gòu)成成分，也可以由藥物、脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液粒子、高分子、金屬膠體、微粒制劑等與其他的化合物(例如糖、脂質(zhì)、無(wú)機(jī)化合物等)組合而成的復(fù)合體作為構(gòu)成成分。
作為介導(dǎo)粒子的構(gòu)成成分的藥物(以下稱為藥物B)，包括在分散有下述的介導(dǎo)粒子的溶劑中呈粒子形態(tài)的藥物；與上述其他的化合物一起形成復(fù)合體進(jìn)而在分散有下述的介導(dǎo)粒子的溶劑中呈粒子形態(tài)的藥物等?？闪信e出例如脂質(zhì)性藥物、高分子藥物、金屬藥物等，具體地可列舉出順鉑、維生素D、維生素E、香菇多糖等。
脂質(zhì)聚集體或者脂質(zhì)體由例如脂質(zhì)和/或表面活性劑等構(gòu)成，作為脂質(zhì)，為單純脂質(zhì)、復(fù)合脂質(zhì)或者衍生脂質(zhì)均可，可列舉出例如磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、鞘脂類(sphingoid)、固醇類等，優(yōu)選可列舉出磷脂。另外，作為脂質(zhì)，還可列舉出例如表面活性劑(與下述的表面活性劑的含義相同)、高分子(與下述的高分子的含義相同，具體為葡聚糖等)、聚氧乙烯衍生物(具體為聚乙二醇等)等的脂質(zhì)衍生物，優(yōu)選可列舉出聚乙二醇衍生化磷脂。作為表面活性劑，可列舉出例如非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、兩性表面活性劑等。
作為磷脂，可列舉出例如磷脂酰膽堿(具體為大豆磷脂酰膽堿、蛋黃磷脂酰膽堿(EPC)、二硬脂酰基磷脂酰膽堿、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A、二油?；字Ｄ憠A等)、磷脂酰乙醇胺(具體為二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)、二棕櫚?；字Ｒ掖及贰⒍王；字Ｒ掖及返?、甘油磷脂(具體為磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰膽堿等)、鞘類磷脂(具體為(神經(jīng))鞘磷脂、神經(jīng)酰胺磷酸乙醇胺、神經(jīng)酰胺磷酸甘油、神經(jīng)酰胺磷酸甘油酸(セラミドホスホグリセロリン酸)等)、甘油磷酸脂(glycerophosphono)、鞘類磷酸脂(sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(具體為蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂等)、氫化磷脂(具體為氫化磷脂酰膽堿等)等的天然或者合成的磷脂。
作為甘油糖脂，可列舉出例如亞硫酸核糖基甘油酯(sulfoxyribosyl glyceride)、二糖基甘油二酯、二半乳糖甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、糖基二甘油酯等。
作為鞘糖脂，可列舉出例如半乳糖基腦苷脂、乳糖基腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂等。
作為鞘脂類，可列舉出例如sphingan、icosasphingan、鞘氨醇、它們的衍生物等。作為衍生物，可列舉出例如由sphingan、icosasphingan、鞘氨醇等中的-NH2轉(zhuǎn)變成-NHCO(CH2)xCH3(式中，x表示0～18的整數(shù)，其中優(yōu)選6、12或18)而成的衍生物等。
作為固醇類，可列舉出例如膽固醇、二氫膽固醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、麥角固醇、巖藻甾醇、3β-[N-(N′N′-二甲氨基乙基)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)等。
作為其他的脂質(zhì)，還可列舉出例如N-[1-(2，3-二油?；?]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油?；?]-N，N-二甲胺(DODAP)、N-[1-(2，3-二油酰氧基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、2，3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸銨(DOSPA)、N-[1-(2，3-二(十四烷氧基)丙基)]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、N-[1-(2，3-二油酰氧基丙基)]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DORIE)等。
作為非離子型表面活性劑，可列舉出例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(具體為聚山梨酯80等)、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇(具體為Pluronic F68等)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(具體為山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯等)、聚氧乙烯衍生物(具體為聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂基醇等)、脂肪酸甘油酯等。
作為陰離子型表面活性劑，可列舉出例如?；“彼帷⑼榛蛩徕c、烷基苯磺酸鹽、碳數(shù)7～22的脂肪酸鈉等。具體地可列舉出十二烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉等。
作為陽(yáng)離子型表面活性劑，可列舉出例如烷基胺鹽、酰基胺鹽、季銨鹽、胺衍生物等。具體地可列舉出苯扎氯銨、酰氨基乙基二乙胺鹽、N-烷基多烷基多胺鹽、脂肪酸多亞乙基多酰胺、鯨蠟基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、烷基聚氧乙烯胺、N-烷基氨基丙胺、脂肪酸三乙醇胺酯等。
作為兩性表面活性劑，可列舉出例如3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸、N-十四烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸等。
在脂質(zhì)體中，這些脂質(zhì)和表面活性劑可以單獨(dú)地或者組合使用，優(yōu)選組合使用。作為組合使用場(chǎng)合的組合，可列舉出例如從氫化大豆磷脂酰膽堿、聚乙二醇衍生化磷脂和膽固醇中選出的2種成分以上的組合；從二硬脂?；字Ｄ憠A、聚乙二醇衍生化磷脂和膽固醇中選出的2種成分以上的組合；EPC與DOTAP的組合；EPC、DOTAP和聚乙二醇衍生化磷脂的組合；EPC、DOTAP、膽固醇和聚乙二醇衍生化磷脂的組合等。
另外，在脂質(zhì)體中，根據(jù)需要，還可以含有例如膽固醇等固醇類等的膜穩(wěn)定化劑，例如生育酚等抗氧化劑等。
作為脂質(zhì)聚集體，可列舉出例如球狀膠束、球狀反膠束、香腸狀膠束、香腸狀反膠束、板狀膠束、板狀反膠束、六角形I、六角形II和脂質(zhì)2分子以上組成的聚集體等。
作為乳液粒子，可列舉出例如由脂肪乳劑、非離子型表面活性劑與大豆油形成的乳液、脂質(zhì)乳劑、脂質(zhì)納米球等水包油型(O/W)乳液和水包油包水型(W/O/W)乳液粒子等。
作為高分子，可列舉出例如白蛋白、葡聚糖、殼聚糖、硫酸葡聚糖、DNA等天然高分子；例如聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚天冬氨酸、苯乙烯馬來(lái)酸共聚物、異丙基丙烯酰胺-丙烯?；量┩橥簿畚?、聚乙二醇修飾樹(shù)枝狀聚合物、聚乳酸、聚乳酸聚羥基乙酸、聚乙二醇化聚乳酸等合成高分子、以及它們的鹽等。
在此，高分子的鹽包括例如金屬鹽、銨鹽、酸加成鹽、有機(jī)胺加成鹽、氨基酸加成鹽等。作為金屬鹽，可列舉出例如鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽、鎂鹽、鈣鹽等堿土類金屬鹽、鋁鹽、鋅鹽等；作為銨鹽，可列舉出例如銨、四甲基銨等的鹽；作為酸加成鹽，可列舉出例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無(wú)機(jī)酸鹽、以及乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽等有機(jī)酸鹽；作為有機(jī)胺加成鹽，可列舉出例如嗎啉、哌啶等的加成鹽；作為氨基酸加成鹽，可列舉出例如甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸等的加成鹽。
作為金屬膠體，可列舉出例如含有金、銀、鉑、銅、銠、氧化硅、鈣、鋁、鐵、銦、鎘、鋇、鉛等的金屬膠體。
作為微粒制劑，可列舉出例如微球、微膠囊、納米晶體、脂類納米粒子、高分子膠束等。
另外，優(yōu)選地，介導(dǎo)粒子具有與藥物A靜電相反的電荷。此處所述與藥物A靜電相反的電荷，包括相對(duì)于藥物分子內(nèi)的電荷、分子內(nèi)的極化等產(chǎn)生靜電引力的電荷、表面極化等。為了使介導(dǎo)粒子具有與藥物A靜電相反的電荷，優(yōu)選地，介導(dǎo)粒子含有具有與藥物A靜電相反的電荷的帶電物質(zhì)，更優(yōu)選地，介導(dǎo)粒子含有具有與藥物A靜電相反的電荷的脂質(zhì)(下述的陽(yáng)離子型脂質(zhì)或者陰離子型脂質(zhì))。
介導(dǎo)粒子中所含有的帶電物質(zhì)，可分為呈陽(yáng)離子性的陽(yáng)離子型物質(zhì)和呈陰離子性的陰離子型物質(zhì)兩類，不過(guò)即使是具有陽(yáng)離子性基團(tuán)和陰離子性基團(tuán)二者的兩性物質(zhì)，由于pH值的影響或者由于與其他物質(zhì)的結(jié)合等而使相對(duì)陰性度發(fā)生變化，相應(yīng)于各種情況，可以將其歸類為陽(yáng)離子型物質(zhì)或者陰離子型物質(zhì)。這些帶電物質(zhì)作為上述介導(dǎo)粒子的構(gòu)成成分使用，或者加入到該介導(dǎo)粒子的構(gòu)成成分中使用均可。
作為陽(yáng)離子型物質(zhì)，可列舉出例如上述的介導(dǎo)粒子的定義中所示例的那些中的陽(yáng)離子型物質(zhì)[具體為陽(yáng)離子型脂質(zhì)、陽(yáng)離子型表面活性劑(與上述同義)、陽(yáng)離子型高分子等]、在等電點(diǎn)以下的值的pH下能夠形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或者肽等。
作為陽(yáng)離子型脂質(zhì)，可列舉出例如DOTAP、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DORIE、DC-Chol等。
作為陽(yáng)離子型高分子，可列舉出例如聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺、polyfect、殼聚糖等。
作為在等電點(diǎn)以下的值的pH下能夠形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或者肽，只要是在該物質(zhì)的等電點(diǎn)以下的值的pH下能夠形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或者肽就沒(méi)有特別限定?？闪信e出例如白蛋白、血清類粘蛋白、球蛋白、纖維蛋白原、胃蛋白酶、核糖核酸酶T1等。
作為陰離子型物質(zhì)，可列舉出例如在上述的介導(dǎo)粒子的定義中所示例的那些物質(zhì)中的陰離子型物質(zhì)[具體為陰離子型脂質(zhì)、陰離子型表面活性劑(與上述同義)、陰離子型高分子等]、在等電點(diǎn)以上的值的pH下能夠形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或者肽、核酸等。
作為陰離子型脂質(zhì)，可列舉出例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。
作為陰離子型高分子，可列舉出例如聚天冬氨酸、苯乙烯馬來(lái)酸共聚物、異丙基丙烯酰胺-丙烯?；量┩橥簿畚铩⒕垡叶夹揎棙?shù)枝狀聚合物、聚乳酸、聚乳酸聚羥基乙酸、聚乙二醇化聚乳酸、硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖鈉、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素、陰離子性葡聚糖熒光素等。
作為在等電點(diǎn)以上的值的pH下能夠形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或者肽，只要是在該物質(zhì)的等電點(diǎn)以上的值的pH下能夠形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或者肽就沒(méi)有特別限定。可列舉出例如白蛋白、血清類粘蛋白、球蛋白、纖維蛋白原、組蛋白、魚(yú)精蛋白、核糖核酸酶、溶菌酶等。
作為陰離子型物質(zhì)的核酸，可列舉出例如DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA、ODN等，只要是不顯示生理活性的，不管其長(zhǎng)度和序列如何，均可使用。
在本發(fā)明中，作為介導(dǎo)粒子中所含有的選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑，優(yōu)選可列舉出糖脂、或者水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物，具體地可列舉出例如聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚等。另外，更優(yōu)選可列舉出水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。本發(fā)明中選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物以及表面活性劑，其分子的一部分由于例如疏水性親合力、靜電力等而具有與介導(dǎo)粒子的構(gòu)成成分結(jié)合的性質(zhì)，而分子的其他部分則由于例如親水性親合力、靜電力等而具有與制備介導(dǎo)粒子時(shí)的溶劑結(jié)合的性質(zhì)，優(yōu)選是具有這兩方面性能的物質(zhì)。以下，將選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑表示為凝聚抑制物質(zhì)。
作為從糖、肽和核酸中選出的1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物，可列舉出由例如蔗糖、山梨糖醇、乳糖等的糖，例如來(lái)自酪蛋白的肽、來(lái)自蛋白的肽、來(lái)自大豆的肽、谷胱甘肽等的肽，例如DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA、ODN等的核酸等，與例如在上述介導(dǎo)粒子的定義中所列舉的脂質(zhì)等或者例如硬脂酸、棕櫚酸、月桂酸等的脂肪酸結(jié)合而形成的衍生物等。
作為糖的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物，可列舉出例如在上述介導(dǎo)粒子的定義中所列舉的甘油糖脂、鞘類糖脂等。
作為水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物，可列舉出由例如聚乙二醇、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、低聚糖、糊精、水溶性纖維素、葡聚糖、硫酸軟骨素、聚甘油、殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬氨酰胺(polyaspartate amide)、聚-L-賴氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、低聚甘油等或者它們的衍生物，與例如在上述介導(dǎo)粒子的定義中所列舉的脂質(zhì)結(jié)合，或者與例如硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸結(jié)合而形成的衍生物等，更優(yōu)選可列舉出聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物，進(jìn)一步優(yōu)選可列舉出聚乙二醇衍生物的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。
作為聚乙二醇衍生物的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物，可列舉出例如聚乙二醇化脂質(zhì)[具體為聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(更具體為1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE)等)、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、Cremophor EL等]、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯類(具體為聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯等)、聚乙二醇脂肪酸酯類等，更優(yōu)選可列舉出聚乙二醇化脂質(zhì)。
作為聚甘油衍生物的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物，可列舉出例如聚甘油化脂質(zhì)(具體為聚甘油-磷脂酰乙醇胺等)、聚甘油脂肪酸酯等，更優(yōu)選可列舉出聚甘油化脂質(zhì)。
作為表面活性劑，可列舉出例如在上述介導(dǎo)粒子的定義中所列舉的表面活性劑、聚乙二醇烷基醚等，優(yōu)選可列舉出聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚等。
作為本發(fā)明中的附著競(jìng)爭(zhēng)劑，可列舉出例如具有與藥物A靜電相同的電荷的物質(zhì)等，包含因分子內(nèi)的電荷、分子內(nèi)的極化等產(chǎn)生的朝向陽(yáng)離子或者陰離子的靜電引力而靜電附著在介導(dǎo)粒子上的物質(zhì)，可列舉出例如脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽、高分子等。作為脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽和高分子，可列舉出例如在上述荷電物質(zhì)的定義中所列舉的陽(yáng)離子型脂質(zhì)、陰離子型脂質(zhì)、陽(yáng)離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽、陽(yáng)離子型高分子、陰離子型高分子等，優(yōu)選可列舉出在上述荷電物質(zhì)的定義中所列舉的陽(yáng)離子型高分子、陰離子型高分子等，更優(yōu)選可列舉出硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖鈉、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素、陰離子性葡聚糖熒光素、聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺、polyfect、殼聚糖等中選出的1種以上的物質(zhì)。附著競(jìng)爭(zhēng)劑優(yōu)選靜電附著在介導(dǎo)粒子上，優(yōu)選為即使附著在介導(dǎo)粒子上也不會(huì)使象介導(dǎo)粒子凝聚那樣的交聯(lián)形成的那樣大小的物質(zhì)，或者優(yōu)選為在分子內(nèi)具有能夠排斥介導(dǎo)粒子附著的部分從而抑制該介導(dǎo)粒子凝聚的物質(zhì)。另外，特別是在上述藥物A為分子量5000以上的大分子藥物(例如基因、DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA等)的場(chǎng)合，進(jìn)一步使附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上，這是本發(fā)明的最優(yōu)選的方案之一。
本發(fā)明的凝聚抑制劑可以含有本發(fā)明中的凝聚抑制物質(zhì)，而且，在不妨礙該凝聚抑制物質(zhì)的凝聚抑制作用的前提下，也可以含有其他的任何物質(zhì)。
在本發(fā)明中，藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子的凝聚抑制，可以通過(guò)使該介導(dǎo)粒子含有凝聚抑制物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，具體地說(shuō)，例如，在已分散有含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子的液體中，使藥物分散或者溶解而被含有，使藥物附著在該介導(dǎo)粒子上而得到的，這樣就可以在該復(fù)合粒子的制備過(guò)程中抑制該復(fù)合粒子的凝聚和/或在制備后抑制該復(fù)合粒子的凝聚。另外，優(yōu)選地，當(dāng)將藥物A分散或者溶解而使其被含有時(shí)，可以使其進(jìn)一步含有附著競(jìng)爭(zhēng)劑，從而使附著競(jìng)爭(zhēng)劑與藥物一起附著在該介導(dǎo)粒子上，由此可以進(jìn)一步抑制復(fù)合粒子的凝聚。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明的凝聚抑制方法可以采用使藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子的制備方法來(lái)實(shí)施，該方法包括例如以下幾個(gè)步驟制備一種分散有含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子的液體的步驟，以及在分散有介導(dǎo)粒子的液體中通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有藥物A的步驟(例如向分散有介導(dǎo)粒子的液體中加入藥物A并使其分散或者溶解的步驟、向分散有介導(dǎo)粒子的液體中加入分散或者溶解了藥物A的液體的步驟等)。此處，作為按照在分散有介導(dǎo)粒子的液體中通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有藥物A的步驟而得到的復(fù)合粒子，具體地可列舉出例如在分散有以含有陽(yáng)離子型脂質(zhì)的脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒的液體中，通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有作為藥物的核酸，在以含有陽(yáng)離子型脂質(zhì)的脂質(zhì)體作為構(gòu)成成分的微粒上附著作為藥物的核酸而形成的復(fù)合粒子，同樣地，在以含有陽(yáng)離子型脂質(zhì)的脂質(zhì)聚集體作為構(gòu)成成分的微粒上附著作為藥物的核酸而形成的復(fù)合粒子，在以含有聚-L-賴氨酸等陽(yáng)離子型高分子的高分子作為構(gòu)成成分的微粒上附著作為藥物的核酸的復(fù)合粒子，在以含有磷脂酸等陰離子型脂質(zhì)的脂質(zhì)體或者脂質(zhì)聚集體作為構(gòu)成成分的微粒上附著蛋白質(zhì)的復(fù)合粒子，在以含有苯乙烯馬來(lái)酸等陰離子型高分子的高分子為構(gòu)成成分的微粒上附著蛋白質(zhì)的復(fù)合粒子，在以含有聚-L-賴氨酸等陽(yáng)離子型高分子的高分子作為構(gòu)成成分的微粒上附著蛋白質(zhì)的復(fù)合粒子，在以含有陽(yáng)離子型脂質(zhì)的脂質(zhì)體或者脂質(zhì)聚集體作為構(gòu)成成分的微粒上附著蛋白質(zhì)的復(fù)合粒子等。另外，在分散有介導(dǎo)粒子的液體中通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有藥物A的步驟，優(yōu)選是在分散或者溶解有藥物A的液體中還含有附著競(jìng)爭(zhēng)劑，然后將該液體加入到分散有介導(dǎo)粒子的液體中的步驟，在該場(chǎng)合，使藥物A與附著競(jìng)爭(zhēng)劑一起附著到介導(dǎo)粒子上來(lái)制備復(fù)合粒子，這樣就可以在復(fù)合粒子的制備中抑制該復(fù)合粒子的凝聚以及在制備后抑制該復(fù)合粒子的凝聚。
含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子可以按照公知的制備方法或者按照類似的方法來(lái)制備，只要是能使介導(dǎo)粒子中含有凝聚抑制物質(zhì)，任何的制備方法均可用來(lái)制備。例如，為了制備一種作為介導(dǎo)粒子之一的以含有凝聚抑制物質(zhì)的脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒，可以采用公知的脂質(zhì)體的制備方法。作為公知的脂質(zhì)體的制備方法，可列舉出例如Bangham等人的脂質(zhì)體制備法[參見(jiàn)“J.Mol.Biol.”，1965年，第13卷，p.238-252]、乙醇注入法[參見(jiàn)“J.Cell Biol.”，1975年，第66卷，p.621-634]、French Press法[參見(jiàn)“FEBS Lett.”，1979年，第99卷，p.210-214]、冷凍熔融法[參見(jiàn)“Arch.Biochem.Biophys.”，1981年，第212卷，p.186-194]、逆相蒸發(fā)法[參見(jiàn)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，1978年，第75卷，p.4194-4198]、pH梯度法(參見(jiàn)例如專利第2572554號(hào)公報(bào)、專利第2659136號(hào)公報(bào)等)等。作為制備脂質(zhì)體時(shí)使脂質(zhì)體混懸的溶液，可以使用例如水、酸、堿、各種緩沖液、生理鹽水、氨基酸輸液等。另外，在制備脂質(zhì)體時(shí)，也可以添加例如檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等的抗氧化劑；例如甘油、葡萄糖、氯化鈉等的等滲劑等。另外，也可以通過(guò)將脂質(zhì)等溶解于例如乙醇等有機(jī)溶劑中，蒸餾除去溶劑后，添加生理鹽水等，振蕩攪拌，使其形成脂質(zhì)體來(lái)制備脂質(zhì)體。
另外，也可以利用例如非離子型表面活性劑(與上述同義)、陽(yáng)離子型表面活性劑(與上述同義)、陰離子型表面活性劑(與上述同義)、高分子、聚氧乙烯衍生物等任意地進(jìn)行脂質(zhì)體的表面改性，這些表面改性的脂質(zhì)體也可以作為本發(fā)明中的介導(dǎo)粒子的構(gòu)成成分使用[參見(jiàn)D.D.Lasic，F(xiàn).Martin編，“Stealth Liposomes”，(美國(guó))，CRC Press Inc，1995年，p.93-102]。作為高分子，可列舉出例如葡聚糖、普魯蘭多糖、甘露聚糖、支鏈淀粉、羥乙基淀粉等。作為聚氧乙烯衍生物，可列舉出例如聚山梨酯80、Pluronic F68、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇、PEG-DSPE等。脂質(zhì)體的表面改性，可以采用使介導(dǎo)粒子中含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑的方法之一。
脂質(zhì)體的平均粒徑可以根據(jù)希望自由選擇。作為調(diào)節(jié)平均粒徑的方法，可列舉出例如擠壓法、將大的多室脂質(zhì)體(MLV)機(jī)械粉碎(具體使用Manton-gaulin、微流體化儀(microfluidizer)等)的方法[參見(jiàn)R.H.Muller、S.Benita、B.Bohm編著，“Emulsion andNanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs”，德國(guó)，Scientific Publishers Stuttgart，1998年，p.267-294]等。
另外，將構(gòu)成介導(dǎo)粒子的例如從藥物B、脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液粒子、高分子、金屬膠體、微粒制劑等中選出的2種以上組合而成的復(fù)合體的制備方法，可以是例如僅僅在水中將藥物B與脂質(zhì)或高分子等混合的制備方法，此時(shí)，如果需要，還可以增加整粒步驟或無(wú)菌化步驟等。另外，復(fù)合體的形成也可以在例如丙酮、醚等各種溶劑中進(jìn)行。
在本發(fā)明的藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法中，凝聚抑制物質(zhì)相對(duì)于介導(dǎo)粒子全體的比例，按重量比計(jì)，優(yōu)選1∶0.9～1∶0.01，更優(yōu)選1∶0.7～1∶0.1，進(jìn)一步優(yōu)選1∶0.6～1∶0.2，最優(yōu)選1∶0.5～1∶0.3。
作為介導(dǎo)粒子的大小，平均粒徑優(yōu)選為10nm～300nm，更優(yōu)選為50nm～150nm，進(jìn)一步優(yōu)選為50nm～100nm。
用于使介導(dǎo)粒子分散的溶劑，是那些不溶解介導(dǎo)粒子的溶劑，在復(fù)合粒子的制備步驟中，優(yōu)選是不妨礙藥物A附著在介導(dǎo)粒子上的溶劑。作為用于使介導(dǎo)粒子分散的溶劑，可列舉出例如含有水等的溶劑，優(yōu)選可列舉出水。另一方面，作為介導(dǎo)粒子，優(yōu)選在例如水等中分散的介導(dǎo)粒子。在制備介導(dǎo)粒子時(shí)使用的溶劑為水的場(chǎng)合，可以在相同液體中，在制備介導(dǎo)粒子之后，接著制備復(fù)合粒子。
在向分散有含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子的液體中，通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有藥物A或者藥物A與附著競(jìng)爭(zhēng)劑的步驟中，在該分散有介導(dǎo)粒子的液體中加入分散或者溶解有藥物A或者藥物A與附著競(jìng)爭(zhēng)劑的液體的場(chǎng)合，作為可使藥物A或者藥物A與附著競(jìng)爭(zhēng)劑分散或者溶解的液體使用的溶劑，只要是在該分散有介導(dǎo)粒子的液體與分散或者溶解有藥物A或者藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑的液體混合后的混合液中，不會(huì)妨礙藥物A附著在該介導(dǎo)粒子上的溶劑，任何一種溶劑均可以使用。作為使藥物A或者藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑分散或者溶解的溶劑，可列舉出例如含有水等的溶劑，優(yōu)選可列舉出水。另一方面，作為藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑，分別優(yōu)選能夠溶解或者分散在例如水等中的藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑，進(jìn)一步分別優(yōu)選能夠溶解在水中的藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑。
介導(dǎo)粒子在分散有介導(dǎo)粒子的液體中所占的比例，只要能夠使藥物A或者藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上就沒(méi)有特殊限定，優(yōu)選為1μg/mL～1g/mL，更優(yōu)選為0.1～500mg/mL。另外，在分散有含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子的液體中，通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有藥物A或者藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑的步驟中，在向該分散有介導(dǎo)粒子的液體中加入分散或者溶解有藥物A或者藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑的液體的場(chǎng)合，藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑的總量相對(duì)于分散或者溶解有藥物A或者藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑的液體的比例，只要能夠使藥物A或者藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上就沒(méi)有特殊限定，優(yōu)選為1μg/mL～1g/mL，更優(yōu)選為0.1～400mg/mL。藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑的總量相對(duì)于介導(dǎo)粒子的比例，按重量比計(jì)，優(yōu)選為1∶1～1000∶1，更優(yōu)選為2∶1～200∶1。
本發(fā)明的復(fù)合粒子，是含有一種含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子、以及作為附著在該介導(dǎo)粒子上的藥物的核酸、或者附著在該介導(dǎo)粒子上的藥物和附著在該介導(dǎo)粒子上的附著競(jìng)爭(zhēng)劑的復(fù)合粒子，本發(fā)明的復(fù)合粒子中的各構(gòu)成成分的定義與上述各定義相同。
本發(fā)明的復(fù)合粒子的制備方法是包括在分散有含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子的液體中通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有作為藥物的核酸或者藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑，從而使該核酸或者該藥物和該附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在該介導(dǎo)粒子上的步驟的制備方法。包括在分散有含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子的液體中通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有作為藥物的核酸，從而使該核酸附著在該介導(dǎo)粒子上的步驟的制備方法，在上述本發(fā)明的藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法的說(shuō)明中，可以把藥物作為核酸，采用同樣的方法來(lái)實(shí)施。包括在分散有含有凝聚抑制物質(zhì)的介導(dǎo)粒子的液體中通過(guò)分散或者溶解來(lái)使該液體含有藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑，從而使該藥物和該附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在該介導(dǎo)粒子上的步驟的制備方法，可以采用與上述本發(fā)明的藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法的說(shuō)明中使用附著競(jìng)爭(zhēng)劑的場(chǎng)合的說(shuō)明中所記載的同樣的方法來(lái)實(shí)施。
本發(fā)明中的復(fù)合粒子和本發(fā)明的復(fù)合粒子的大小，其平均粒徑優(yōu)選為50nm～300nm，更優(yōu)選為50nm～200nm，進(jìn)一步優(yōu)選為50nm～150nm。
另外，在本發(fā)明中的復(fù)合粒子和本發(fā)明的復(fù)合粒子的制備步驟之后，通過(guò)加入荷電物質(zhì)或者分散或者溶解有荷電物質(zhì)的液體，也可以使荷電物質(zhì)附著在該復(fù)合粒子上，從而得到多重復(fù)合粒子。例如，利用陽(yáng)離子型物質(zhì)和凝聚抑制物質(zhì)在水中配制以作為介導(dǎo)粒子的脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒，然后，添加作為藥物A的例如核酸(優(yōu)選同時(shí)添加附著競(jìng)爭(zhēng)劑)，進(jìn)而添加例如陰離子型物質(zhì)，也可以制成多重復(fù)合粒子。另外，本發(fā)明中的復(fù)合粒子和本發(fā)明的復(fù)合粒子，也可以制成包覆復(fù)合粒子。
本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子是一類至少由本發(fā)明的復(fù)合粒子和包覆該復(fù)合粒子的包覆層構(gòu)成的包覆復(fù)合粒子，例如是這樣一類包覆復(fù)合粒子等，其中，構(gòu)成該包覆層的包覆層成分，在含有極性溶劑的溶劑中，當(dāng)極性溶劑的濃度相對(duì)提高時(shí)溶解、而相對(duì)降低時(shí)析出或者聚集，所述極性溶劑在溶劑中的濃度范圍是該復(fù)合粒子不溶解但能夠分散的濃度范圍。
作為本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子中構(gòu)成包覆層的包覆層成分，可列舉出例如在上述介導(dǎo)粒子的定義中所列舉的脂質(zhì)、表面活性劑、高分子等，優(yōu)選可列舉出上述介導(dǎo)粒子的定義中所列舉的從脂質(zhì)和表面活性劑中選出的1種以上的物質(zhì)，更優(yōu)選可列舉出當(dāng)包覆層為脂質(zhì)膜時(shí)，是從脂質(zhì)和表面活性劑中選出的1種以上的物質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)選可列舉出磷脂。
另外，作為在包覆層為脂質(zhì)膜的場(chǎng)合使用的脂質(zhì)，還可列舉出例如合成脂質(zhì)等。作為合成脂質(zhì)，可列舉出例如含氟磷脂酰膽堿、含氟表面活性劑、二烷基溴化銨等，它們可以單獨(dú)使用或者與其他脂質(zhì)等組合使用。另外，在包覆層為脂質(zhì)膜的場(chǎng)合，包覆層優(yōu)選含有水溶性高分子衍生物。作為水溶性高分子衍生物，可列舉出例如在上述凝聚抑制物質(zhì)的定義中所示例的水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物等，優(yōu)選可列舉出在上述凝聚抑制物質(zhì)的定義中所示例的聚乙二醇衍生化磷脂等。另外，作為水溶性高分子衍生物，更優(yōu)選具有以下兩方面性質(zhì)的物質(zhì)，即，其分子的一部分具有通過(guò)例如親水性親合力、靜電力等與本發(fā)明中的凝聚抑制物質(zhì)或者附著競(jìng)爭(zhēng)劑相結(jié)合的性質(zhì)、而其他部分具有通過(guò)例如疏水性親合力、靜電力等與其他的包覆層成分相結(jié)合的性質(zhì)；通過(guò)使用上述物質(zhì)，可以提高本發(fā)明的復(fù)合粒子的包覆效率。水溶性高分子衍生物相對(duì)于包覆層成分全體的比例，按重量比計(jì)，優(yōu)選為1∶0.5～1∶0.01，更優(yōu)選為1∶0.25～1∶0.01，進(jìn)一步優(yōu)選為1∶0.15～1∶0.02。
本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子可以采用這樣一種制備方法來(lái)制備，該制備方法包括，例如配制含有一種能使本發(fā)明的復(fù)合粒子分散且能使包覆層成分溶解的極性有機(jī)溶劑的液體(A液)的步驟；接著，通過(guò)減少A液中的極性有機(jī)溶劑的比例來(lái)使復(fù)合粒子被包覆層包覆的步驟；在該場(chǎng)合，該包覆復(fù)合粒子以混懸液(D液)的形態(tài)獲得。A液中的溶劑是使復(fù)合粒子不溶解、但可使包覆層成分溶解的溶劑，在減少了A液中的極性有機(jī)溶劑的比例的D液中，復(fù)合粒子不溶解，而包覆層成分或者不溶解，或者凝聚。在A液中的溶劑為單獨(dú)的極性有機(jī)溶劑的場(chǎng)合，優(yōu)選緩慢地加入一種溶劑(E液)，該E液含有例如可與該極性有機(jī)溶劑混合的該極性有機(jī)溶劑以外的溶劑，由此可以使該極性有機(jī)溶劑的比例相對(duì)減少。此處，E液是含有該極性有機(jī)溶劑以外的溶劑的溶劑，但是也可以含有極性有機(jī)溶劑。另外，在A液中的溶劑為由極性有機(jī)溶劑與該極性有機(jī)溶劑以外的溶劑形成的混合液的場(chǎng)合，可以通過(guò)加入溶劑(F液)，該F液含有例如可與極性有機(jī)溶劑混合的該極性有機(jī)溶劑以外的溶劑，和/或，通過(guò)蒸餾、半透膜分離、分餾等，選擇性地除去極性有機(jī)溶劑，從而可以使該極性有機(jī)溶劑的比例減少。此處，F(xiàn)液是含有該極性有機(jī)溶劑以外的溶劑的溶劑，F(xiàn)液也可以含有極性有機(jī)溶劑，只要其比例低于A液中的極性有機(jī)溶劑的比例即可。作為極性有機(jī)溶劑，可列舉出例如甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇等醇類；甘油、乙二醇、丙二醇等二醇類；聚乙二醇等的聚亞烷基二醇類等，優(yōu)選可列舉出乙醇。作為極性有機(jī)溶劑以外的溶劑，可列舉出例如水、液體二氧化碳、液體烴、鹵化碳、鹵代烴等，優(yōu)選可列舉出水。另外，A液、E液和F液也可以含有離子、緩沖成分等。
極性有機(jī)溶劑與該極性有機(jī)溶劑以外的溶劑的組合，優(yōu)選是可相互混合的組合，可以根據(jù)上述復(fù)合粒子和上述包覆層成分在A液和D液的溶劑中以及在E液和F液中的溶解度等來(lái)選擇。另一方面，對(duì)于上述復(fù)合粒子，優(yōu)選在A液和D液的溶劑中以及在E液和F液的任一種溶劑中的溶解度低，而且優(yōu)選在極性有機(jī)溶劑和該極性有機(jī)溶劑以外的溶劑的任一種溶劑中的溶解度也低，而包覆層成分優(yōu)選在D液的溶劑中和在F液中的溶解度低并優(yōu)選在A液的溶劑中和在E液中的溶解度高，而且優(yōu)選在極性有機(jī)溶劑中的溶解度高并優(yōu)選在該極性有機(jī)溶劑以外的溶劑中的溶解度低。此處，復(fù)合粒子的溶解度低是指復(fù)合粒子中所含有的介導(dǎo)粒子、藥物A和附著競(jìng)爭(zhēng)劑等各成分在該溶劑中的溶出性小，即使各成分各自的溶解度高，但只要通過(guò)各成分間的結(jié)合等，各成分的溶出性也能變小即可。例如，即使在介導(dǎo)粒子中所含有的成分中的任一種在A液的溶劑中的溶解度高的場(chǎng)合，只要附著競(jìng)爭(zhēng)劑在A液的溶劑中的溶解度低，就可以抑制復(fù)合粒子中的其他成分的溶出，從而可以降低復(fù)合粒子在A液的溶劑中的溶解度。即，在選擇性地使用與復(fù)合粒子中的其他成分在A液的溶劑中的溶解度相比，在A液的溶劑中的溶解度低的附著競(jìng)爭(zhēng)劑的場(chǎng)合，附著競(jìng)爭(zhēng)劑在制備包覆復(fù)合粒子的過(guò)程中具有抑制復(fù)合粒子的其他成分的溶出，從而提高生產(chǎn)率和合格率的效果。
A液中的極性有機(jī)溶劑的比例，只要滿足不使本發(fā)明的復(fù)合粒子溶解地存在、而只是使包覆該復(fù)合粒子的包覆層成分溶解的條件，就沒(méi)有特殊限定，根據(jù)所使用的溶劑、復(fù)合粒子和包覆層成分的種類等的不同而異，但優(yōu)選為30vol％以上，更優(yōu)選為60～90vol％。另外，D液中的極性有機(jī)溶劑的比例，只要是能使包覆層成分在本發(fā)明的復(fù)合粒子表面上形成包覆層的比例，就沒(méi)有特殊限定，但優(yōu)選為50vol％以下。
作為配制A液的步驟，只要上述復(fù)合粒子不溶解，則按照任何順序添加上述極性有機(jī)溶劑、上述復(fù)合粒子和上述包覆層成分、或者上述極性有機(jī)溶劑、上述復(fù)合粒子、上述包覆層成分和上述極性有機(jī)溶劑以外的溶劑來(lái)配制A液的步驟均是可以的，優(yōu)選可列舉出，首先配制含有其中分散有本發(fā)明復(fù)合粒子的極性有機(jī)溶劑的液體(B液)，另外配制使包覆層成分溶解在含有與B液中的極性有機(jī)溶劑相同或者不同的極性有機(jī)溶劑的溶劑中而形成的液體(C液)，然后將B液與C液混合來(lái)配制A液的步驟。在將B液與C液混合來(lái)配制A液時(shí)，優(yōu)選緩慢地混合。
作為例如包覆層為脂質(zhì)膜的本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子的優(yōu)選制備方法，可列舉出以下的方法。
(步驟1)使本發(fā)明的復(fù)合粒子分散(混懸)于含有極性有機(jī)溶劑的水溶液、優(yōu)選含有乙醇等醇類的水溶液中。
(步驟2)將構(gòu)成脂質(zhì)膜的脂質(zhì)和/或表面活性劑(構(gòu)成脂質(zhì)膜的成分)溶解于一種含有與上述含有極性有機(jī)溶劑的水溶液相同或者不同的含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中、優(yōu)選溶解于相同的含有極性有機(jī)溶劑的水溶液或者極性有機(jī)溶劑中。此時(shí)，也可以進(jìn)一步添加水溶性高分子衍生物(例如聚乙二醇修飾脂質(zhì)衍生物等)，此處，對(duì)添加的水溶性高分子衍生物的量沒(méi)有特殊限定。
(步驟3)將步驟1中得到的液體與步驟2中得到的液體混合。
(步驟4)向步驟3中得到的混合液中逐次少量添加水、或者將該混合液透析、或者從該混合液中蒸餾除去極性有機(jī)溶劑，來(lái)使該混合液中的極性有機(jī)溶劑的相對(duì)比例減少，以混懸液的形態(tài)獲得被脂質(zhì)膜包覆的包覆復(fù)合粒子。
不管所使用的復(fù)合粒子的種類和所使用的包覆層成分的種類是什么，都可以采用基本上與上述同樣的方法來(lái)制備本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子。對(duì)于介導(dǎo)粒子是以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒、包覆層成分為脂質(zhì)和/或表面活性劑、包覆層為脂質(zhì)膜的包覆復(fù)合粒子，從其構(gòu)成考慮，可分類為狹義的脂質(zhì)體；而對(duì)于介導(dǎo)粒子是以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒以外的粒子，包覆層成分為脂質(zhì)和/或表面活性劑、包覆層為脂質(zhì)膜的包覆復(fù)合粒子，可分類為廣義的脂質(zhì)體。在本發(fā)明中，更優(yōu)選介導(dǎo)粒子的構(gòu)成成分和包覆復(fù)合粒子均為脂質(zhì)體。
在本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子的制備方法中所使用的本發(fā)明的復(fù)合粒子在A液和B液中的比例，只要該復(fù)合粒子能夠被包覆層成分包覆，就沒(méi)有特殊限定，但優(yōu)選為1μg/mL～1g/mL，更優(yōu)選為0.1～500mg/mL。另外，所使用的包覆層成分(例如脂質(zhì)等)在A液和C液中的比例，只要能夠包覆本發(fā)明的復(fù)合粒子，就沒(méi)有特殊限定，但優(yōu)選為1μg/mL～1g/mL，更優(yōu)選為0.1～400mg/mL。包覆層成分相對(duì)于本發(fā)明的復(fù)合粒子的比例，按重量比計(jì)，優(yōu)選為1∶0.1～1∶1000，更優(yōu)選為1∶1～1∶10。
另外，本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子和采用本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子的制備方法得到的包覆復(fù)合粒子的大小，其平均粒徑優(yōu)選為350nm以下，更優(yōu)選為300nm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為200nm以下。具體地優(yōu)選為例如可注射的大小。
進(jìn)而，也可以用抗體等蛋白質(zhì)、糖類、糖脂、氨基酸、核酸、各種低分子化合物、高分子化合物等物質(zhì)對(duì)上述得到的包覆復(fù)合粒子進(jìn)行修飾，這樣得到的包覆復(fù)合粒子也包括在本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子中。例如，為了應(yīng)用于靶向制劑，也可以進(jìn)一步用抗體等蛋白質(zhì)、肽、脂肪酸類等對(duì)上述得到的包覆復(fù)合粒子進(jìn)行脂質(zhì)膜表面修飾[參見(jiàn)D.D.Lasic、F.Martin編，Stea1th Liposomes，(美國(guó))，CRC Press Inc.，1995年，p.93-102]，另外，與對(duì)作為介導(dǎo)粒子的構(gòu)成成分的脂質(zhì)體的處理相同地，也可以用例如非離子型表面活性劑(與上述同義)、陽(yáng)離子型表面活性劑(與上述同義)、陰離子型表面活性劑(與上述同義)、高分子(與上述同義)、聚氧乙烯衍生物(與上述同義)等任意地進(jìn)行表面改性，這些經(jīng)過(guò)脂質(zhì)膜表面修飾或者表面改性的粒子也包括在本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子中。
本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子，為了達(dá)到例如藥劑對(duì)血液成分等機(jī)體成分、胃腸道消化液等的穩(wěn)定化、副作用的降低、藥劑在腫瘤等的靶臟器中的集聚性增大、經(jīng)口或經(jīng)粘膜的藥劑的吸收的改善等目的而制成制劑使用。
在將本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子制成制劑使用的場(chǎng)合，可以將采用上述方法配制的包覆復(fù)合粒子的混懸液直接以例如注射劑等形式使用，也可以采用例如過(guò)濾、離心分離等方法從該混懸液中除去溶劑來(lái)使用，也可以將該混懸液、或者將加入了例如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麥芽糖、甘氨酸等賦形劑的該混懸液冷凍干燥后使用。
在注射劑的場(chǎng)合，優(yōu)選向上述的包覆復(fù)合粒子的混懸液或者將上述的溶劑除去或者冷凍干燥的包覆復(fù)合粒子中混合例如水、酸、堿、各種緩沖液、生理鹽水、氨基酸輸液等來(lái)配制注射劑。另外，也可以添加例如檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA等抗氧化劑，甘油、葡萄糖、氯化鈉等的等滲劑等來(lái)制備注射劑。另外，也可以加入例如甘油等的冷凍保存劑進(jìn)行冷凍保存。
另外，本發(fā)明的包覆復(fù)合粒子也可以與適當(dāng)?shù)馁x形劑等一起進(jìn)行制粒、干燥等，加工成例如膠囊劑、片劑、顆粒劑等口服用制劑。
下面，用實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。
應(yīng)予說(shuō)明，本實(shí)施例中所使用的ODN是硫代磷酸酯(ホスホロチオエ一ト)型、20mer、5’端為FITC標(biāo)記、5’ACTAGTGGCTAGCGAATCTC3’、寶生物公司制。
另外，本實(shí)施例中所使用的質(zhì)粒，為含有連結(jié)到CAG啟動(dòng)子上的β-半乳糖苷酶基因的8.5kb的質(zhì)粒(以下記做pCAG-LacZ)、或者含有連結(jié)到CAG啟動(dòng)子的RLuc基因的6.1kb的質(zhì)粒(以下記做pCAG-RLuc)。
pCAG-Rluc質(zhì)粒按照以下的方法制備。
將質(zhì)粒pRL-nu11載體[Promega公司制]1μg溶解于30μL的緩沖液(pH7.5)[Universal Buffer H；50mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽、6.6mmol/L氯化鎂、10mmol/L二硫蘇糖醇以及100mmol/L氯化鈉、寶酒造公司制，以下相同]中，加入10單位的限制酶SalI和EcoRI，在37℃下進(jìn)行2小時(shí)消化反應(yīng)。將得到的反應(yīng)溶液用瓊脂糖凝膠電泳處理后，將3.3kbp的DNA片段用精制試劑盒[QIAEX II Gel Extraction Kit、QIAGEN公司制，以下相同]回收。
接著，將國(guó)際公開(kāi)第01/33957號(hào)小冊(cè)子中所述的質(zhì)粒pBSKS(+)CAG啟動(dòng)子1μg溶解于30μL的緩沖液(pH7.5)中，加入限制酶SalI和EcoRI，在37℃下進(jìn)行2小時(shí)消化反應(yīng)，將這樣得到的反應(yīng)溶液用瓊脂糖凝膠電泳處理后，將含有1.7kbp的CAG啟動(dòng)子的DNA片段用精制試劑盒回收。
將上述得到的、來(lái)自質(zhì)粒pRL-nu11載體的Sal I-EcoRI片段(3.3Kbp)0.1μg和來(lái)自質(zhì)粒pBSKS(+)CAG啟動(dòng)子的SalI-EcoRI片段(1.7kbp)0.1μg溶解于T4連接酶緩沖液[66mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽、10mmol/L氯化鎂、1mmol/L二硫蘇糖醇以及0.1mmol腺苷三磷酸、寶酒造公司制]30μL中，加入T4DNA連接酶100單位(寶酒造公司制)，在16℃下進(jìn)行16小時(shí)連結(jié)反應(yīng)。
使用得到的反應(yīng)液，將大腸桿菌DH5α(東洋紡社制)采用Cohen等人的方法[參見(jiàn)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1972年，第69卷，p.2110-2114]進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到氨芐青霉素耐藥性株。按照公知的方法從該轉(zhuǎn)化株分離pCAG-Rluc質(zhì)粒。
另外，本實(shí)施例中所使用的siRNA，是由5’端為FITC標(biāo)記的有義序列5’CUGGAUCGUAAGAAGGCAGdT.dT3’和反義序列5’CUGCCUUCUUACGAUCCAG dTdT3’構(gòu)成的siRNA。
實(shí)施例1將DOTAP[Avanti公司制，以下相同]/PEG-DSPE(日本油脂制，以下相同)/蒸餾水按照30mg/6mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜(Whatman制，以下相同)4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜(Whatman制，以下相同)10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜(Whatman制，以下相同)24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例2將DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水按照30mg/9mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例3將DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水按照30mg/12mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例4將DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水按照30mg/18mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例5將DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水按照30mg/24mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例6將DOTAP/聚氧乙烯氫化蓖麻油[HCO-60、日本油脂制]/蒸餾水按照30mg/24mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
比較例1將DOTAP/蒸餾水按照30mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例7與實(shí)施例1同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc質(zhì)粒水溶液0.005mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例8與實(shí)施例2同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc質(zhì)粒水溶液0.005mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例9與實(shí)施例3同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc質(zhì)粒水溶液0.005mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例10與實(shí)施例4同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc質(zhì)粒水溶液0.005mL，制備復(fù)合粒子。
實(shí)施例11與實(shí)施例5同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc質(zhì)粒水溶液0.005mL，制備復(fù)合粒子。
比較例2與比較例1同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.02mL中，加入8mg/mL的pCAG-RLuc質(zhì)粒水溶液0.005mL，制備復(fù)合粒子。
試驗(yàn)例1對(duì)于實(shí)施例1～11和比較例1～2中得到的各復(fù)合粒子，用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)儀(NanoZS、Malvern社制)測(cè)定復(fù)合粒子的平均粒徑。
結(jié)果示于表1中。
表1

由于實(shí)施例1～11中制備的復(fù)合粒子的平均粒徑為300nm以下，因此可以認(rèn)為凝聚已受到抑制，與此相反，比較例1和2中制備的復(fù)合粒子的平均粒徑大于300nm。
實(shí)施例12將DOTAP/PEG-DSPE[Avanti公司制，以下相同]/蒸餾水按照30mg/12mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.04mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ質(zhì)粒水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
比較例3將DOTAP/蒸餾水按照30mg/mL混合，用渦旋混合器振蕩攪拌。將得到的混懸液在室溫下通過(guò)0.4μm的聚碳酸酯濾膜4次，通過(guò)0.1μm的聚碳酸酯濾膜10次，進(jìn)而通過(guò)0.05μm的聚碳酸酯濾膜24次，制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.04mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ質(zhì)粒水溶液0.01mL，制備復(fù)合粒子。
試驗(yàn)例2目視觀察實(shí)施例12和比較例3中配制的各復(fù)合粒子的凝聚物的生成。結(jié)果示于表2中。
表2

從表2看出，實(shí)施例12中制備的復(fù)合粒子中即使添加質(zhì)粒也觀察不到凝聚物的生成，與此相反，對(duì)于比較例3中制備的復(fù)合粒子就觀察到凝聚物的生成。
實(shí)施例13與實(shí)施例12同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.5mL中，加入0.5mg/mL的pCAG-LacZ質(zhì)粒水溶液0.25mL，加入乙醇1mL，制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中，加入將包覆層成分的EPC[日本油脂制；以下相同]/PEG-DSPE按照最終成為120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.25mL，接著緩慢加入蒸餾水23mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入生理鹽水進(jìn)行再混懸，得到制劑。
實(shí)施例14與實(shí)施例12同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.5mL中，加入3mg/mL的pCAG-LacZ質(zhì)粒水溶液0.25mL，加入乙醇1mL，制備復(fù)合粒子。
用得到的復(fù)合粒子的混懸液，經(jīng)過(guò)與實(shí)施例13同樣的包覆復(fù)合粒子的配制，得到制劑。
實(shí)施例15與實(shí)施例12同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.5mL中，加入2mg/mL的pCAG-LacZ質(zhì)粒水溶液0.125mL以及6mg/mL的硫酸葡聚糖(Merk社制，以下相同)水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制備復(fù)合粒子。
用得到的復(fù)合粒子的混懸液，經(jīng)過(guò)與實(shí)施例13同樣的包覆復(fù)合粒子的配制，得到制劑。
實(shí)施例16與實(shí)施例12同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ質(zhì)粒水溶液0.125mL以及12mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制備復(fù)合粒子。
用得到的復(fù)合粒子的混懸液，經(jīng)過(guò)與實(shí)施例13同樣的包覆復(fù)合粒子的配制，得到制劑。
實(shí)施例17與實(shí)施例12同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ質(zhì)粒水溶液0.125mL以及3mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制備復(fù)合粒子。
用得到的復(fù)合粒子的混懸液，經(jīng)過(guò)與實(shí)施例13同樣的包覆復(fù)合粒子的配制，得到制劑。
實(shí)施例18與實(shí)施例12同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.5mL中，加入1mg/mL的pCAG-LacZ質(zhì)粒水溶液0.125mL以及3mg/mL的陰離子性葡聚糖熒光素(Molecular Probes社制)水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制備復(fù)合粒子。
用得到的復(fù)合粒子的混懸液，經(jīng)過(guò)與實(shí)施例13同樣的包覆復(fù)合粒子的配制，得到制劑。
試驗(yàn)例3對(duì)于實(shí)施例13～18中得到的各制劑，用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)儀(A model ELS-800、大塚電子制)測(cè)定包覆微粒的平均粒徑。結(jié)果示于表3中。
表3

實(shí)施例13～18中得到的任一個(gè)制劑，其平均粒徑均為350nm以下，因此可以認(rèn)為，在包覆復(fù)合粒子的制備步驟中，復(fù)合粒子的凝聚受到抑制。
試驗(yàn)例4對(duì)于實(shí)施例13和實(shí)施例15～17中得到的各制劑，質(zhì)粒和EPC相對(duì)于加入量的回收率如下述那樣求出。
將各制劑用水稀釋10倍，向該稀釋液200μL中加入10w/v％的TritonX-100(和光純藥制，以下相同)水溶液200μL，加入2μg/mL溴化乙錠(和光純藥社制)水溶液200μL以及生理鹽水1400μL。使用熒光光度計(jì)(日立、F-4500)，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)580nm和熒光波長(zhǎng)615nm處的熒光，由此定量測(cè)定各制劑中的質(zhì)粒。另外，將制劑中的EPC通過(guò)使用磷脂C-test Wako(和光純藥制，以下相同)的酶法進(jìn)行定量測(cè)定。質(zhì)粒和EPC的回收率分別按照下述式(1)和(2)算出。
結(jié)果示于表4中。
質(zhì)粒的回收率(％)＝A/C×100…………(1)EPC的回收率(％)＝B/D×100…………(2)A制劑中的質(zhì)粒量(mg)B制劑中的EPC量(mg)C實(shí)施例中的質(zhì)粒加入量(mg)D實(shí)施例中的EPC加入量(mg)表4

從表4看出，對(duì)于實(shí)施例13和15～17中得到的制劑，質(zhì)粒的回收率均為高達(dá)50％以上，由此表明，使用包覆用脂質(zhì)對(duì)復(fù)合粒子的包覆是良好的。另外，對(duì)于含有附著競(jìng)爭(zhēng)劑的實(shí)施例15～17中得到的制劑，EPC的回收率也基本在高達(dá)50％以上，使用包覆用脂質(zhì)對(duì)復(fù)合粒子的包覆的效率更好，更優(yōu)選的。
實(shí)施例19與實(shí)施例12同樣地制備介導(dǎo)粒子。向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.5mL中，加入2mg/mL的siRNA水溶液0.125mL和6mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.125mL，加入乙醇1mL，制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中，加入由包覆層成分的EPC/PEG-DSPE按照最終成為120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.25mL，接著緩慢加入蒸餾水23mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入生理鹽水，接著，將相對(duì)于120重量份的EPC為50重量份的PEG-DSPE(復(fù)合粒子混懸液的4vol％)溶解于少量的乙醇中并進(jìn)行混合，在70℃下加溫2分鐘，得到制劑。
試驗(yàn)例5用DLS檢測(cè)儀(A model ELS-800、大塚電子制)測(cè)定實(shí)施例19得到的制劑中的包覆微粒的平均粒徑。結(jié)果示于表5中。
表5

應(yīng)予說(shuō)明，實(shí)施例19中得到的制劑，其平均粒徑為350nm以下，因此可以認(rèn)為，在包覆復(fù)合粒子的制備步驟中，復(fù)合粒子的凝聚受到抑制。
試驗(yàn)例6對(duì)于實(shí)施例19中得到的制劑，如下述那樣求出siRNA和EPC相對(duì)于加入量的回收率。
將制劑用水稀釋20倍，向該稀釋液50μL中加入10w/v％TritonX-100水溶液50μL，進(jìn)而加入生理鹽水400μL。使用熒光酶標(biāo)儀(WALLAC、ARVOTMSX1420 Multilabel counter)，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm和熒光波長(zhǎng)530nm處的熒光，由此定量測(cè)定制劑中的siRNA。另外，將制劑中的EPC通過(guò)使用磷脂C-test Wako(和光純藥制)的酶法進(jìn)行定量測(cè)定。siRNA和EPC的回收率分別按照下述式(3)和(4)算出。結(jié)果示于表6中。
siRNA的回收率(％)＝A/C×100……………(3)EPC的回收率(％)＝B/D×100………………(4)A制劑中的siRNA量(mg)B制劑中的EPC量(mg)C實(shí)施例19中的siRNA加入量(mg)D實(shí)施例19中的EPC加入量(mg)
表6

從表6看出，對(duì)于實(shí)施例19中得到的制劑，siRNA的回收率為高達(dá)50％以上，使用包覆用脂質(zhì)對(duì)復(fù)合粒子的包覆是良好的，EPC的回收率也為高達(dá)50％以上，由此可以認(rèn)為，使用包覆用脂質(zhì)對(duì)復(fù)合粒子的包覆是很有效的。
實(shí)施例20與實(shí)施例3同樣地制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.25mL中，加入15mg/mL的ODN水溶液0.125mL，制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中，加入乙醇0.5mL，進(jìn)而加入將包覆層成分的EPC按照最終成為120mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接著緩慢加入蒸餾水11.5mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入磷酸緩沖生理鹽水(PBS)進(jìn)行再混懸，得到制劑。
實(shí)施例21與實(shí)施例20同樣地制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中加入乙醇0.5mL，進(jìn)而加入將包覆層成分的EPC/PEG-DSPE(日本油脂制，以下相同)按照最終成為120mg/10mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接著緩慢加入蒸餾水11.5mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。
將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入PBS進(jìn)行再混懸，得到制劑。
實(shí)施例22
與實(shí)施例20同樣地制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中加入乙醇0.5mL，進(jìn)而加入將包覆層成分的EPC/PEG-DSPE按照最終成為120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接著緩慢加入蒸餾水11.5mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。
將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入PBS進(jìn)行再混懸，得到制劑。
實(shí)施例23與實(shí)施例20同樣地制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中加入乙醇0.5mL，進(jìn)而加入將包覆層成分的EPC/PEG-DSPE按照最終成為120mg/50mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接著緩慢加入蒸餾水11.5mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。
將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入PBS進(jìn)行再混懸，得到制劑。
實(shí)施例24與實(shí)施例3同樣地制備介導(dǎo)粒子。
向得到的介導(dǎo)粒子的混懸液0.25mL中，加入2mg/mL的pCAG-RLuc質(zhì)粒水溶液0.0625mL、以及20mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液0.0625mL，制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中加入乙醇0.5mL，進(jìn)而加入將包覆層成分的EPC按照最終成為120mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接著緩慢加入蒸餾水11.5mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，制備包覆復(fù)合粒子。將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入生理鹽水進(jìn)行再混懸，得到制劑。
實(shí)施例25與實(shí)施例24同樣地制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中加入乙醇0.5mL，進(jìn)而加入將包覆層成分的EPC/PEG-DSPE按照最終成為120mg/10mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接著緩慢加入蒸餾水11.5mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。
將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入生理鹽水進(jìn)行再混懸，得到制劑。
實(shí)施例26與實(shí)施例24同樣地制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中加入乙醇0.5mL，進(jìn)而加入將包覆層成分的EPC/PEG-DSPE按照最終成為120mg/25mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接著緩慢加入蒸餾水11.5mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。
將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入生理鹽水進(jìn)行再混懸，得到制劑。
實(shí)施例27與實(shí)施例24同樣地制備復(fù)合粒子。
向得到的復(fù)合粒子的混懸液中加入乙醇0.5mL，進(jìn)而加入將包覆層成分的EPC/PEG-DSPE按照最終成為120mg/50mg/mL的比例溶解于乙醇中而形成的溶液0.125mL，接著緩慢加入蒸餾水11.5mL，以將乙醇的濃度調(diào)整至5vol％以下，配制包覆復(fù)合粒子。
將得到的包覆復(fù)合粒子的混懸液超速離心(1小時(shí)、110000×g、25℃)分離，除去上清液，加入生理鹽水進(jìn)行再混懸，得到制劑。
試驗(yàn)例7對(duì)于實(shí)施例20～27中得到的各制劑，用DLS檢測(cè)儀(NanoZS、Malvern社制)測(cè)定包覆微粒的平均粒徑。結(jié)果示于表7中。
表7

實(shí)施例20～27中得到的制劑，其平均粒徑為350nm以下，因此可以認(rèn)為，在包覆復(fù)合粒子的制備步驟中，復(fù)合粒子的凝聚受到抑制。
試驗(yàn)例8對(duì)于實(shí)施例20～27中得到的各制劑，與試驗(yàn)例4同樣地求出EPC相對(duì)于加入量的回收率。結(jié)果示于表8中。
表8

從表8看出，對(duì)于實(shí)施例20～27中得到的制劑，EPC的回收率均很高，使用包覆用脂質(zhì)對(duì)復(fù)合粒子的包覆可以很有效地進(jìn)行。另外，水溶性高分子衍生物相對(duì)于包覆層成分全體的比例，按重量比計(jì)為1∶0.25～1∶0.01的實(shí)施例21、22、25和26中得到的制劑，包覆微粒的平均粒徑更小，而且EPC的回收率更高，因此更優(yōu)選。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法及該復(fù)合粒子的制備方法等，另外還提供將凝聚受到抑制的復(fù)合粒子用包覆層包覆而成的包覆復(fù)合粒子的制備方法以及可以按照該制備方法制備的包覆復(fù)合粒子等。
權(quán)利要求
1.復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子中，使該介導(dǎo)粒子中含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
2.權(quán)利要求1所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑，是水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。
3.權(quán)利要求1所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑，是從聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯和聚乙二醇烷基醚中選出的1種以上的物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子，是在已分散有介導(dǎo)粒子的液體中，使藥物分散或者溶解而被含有，使藥物附著在該介導(dǎo)粒子上而得到的。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子，是藥物借助靜電附著在介導(dǎo)粒子上而形成的。
6.權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，介導(dǎo)粒子為具有與藥物靜電相反的電荷的介導(dǎo)粒子。
7.權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，介導(dǎo)粒子為以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒，該脂質(zhì)體含有具有與藥物靜電相反的電荷的脂質(zhì)。
8.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，藥物為核酸。
9.權(quán)利要求8所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，作為藥物的核酸是從基因、DNA、RNA、寡核苷酸、質(zhì)粒和siRNA中選出的1種以上的物質(zhì)。
10.權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子為由藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子。
11.權(quán)利要求10所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子，是在已分散有介導(dǎo)粒子的液體中，使藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑分散或者溶解而被含有，使藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在該介導(dǎo)粒子上而得到的。
12.權(quán)利要求10或者11所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，由藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子，是藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑借助靜電附著在介導(dǎo)粒子上而形成的。
13.權(quán)利要求10～12中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽和高分子中選出的1種以上的物質(zhì)。
14.權(quán)利要求10～12中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖鈉、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素以及陰離子性葡聚糖熒光素中選出的1種以上的物質(zhì)。
15.復(fù)合粒子的凝聚抑制劑，該復(fù)合粒子是由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的，其中含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
16.權(quán)利要求15所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制劑，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑是水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。
17.權(quán)利要求15所述的復(fù)合粒子的凝聚抑制劑，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑是從聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中選出的1種以上的物質(zhì)。
18.復(fù)合粒子的制備方法，該復(fù)合粒子是由作為藥物的核酸附著在介導(dǎo)粒子上而形成的，其中包括在已分散有介導(dǎo)粒子的液體中，通過(guò)使作為藥物的該核酸分散或者溶解而被含有，使作為藥物的該核酸附著在該介導(dǎo)粒子上的步驟；所述介導(dǎo)粒子含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
19.復(fù)合粒子的制備方法，該復(fù)合粒子是由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的，其中包括在已分散有介導(dǎo)粒子的液體中，通過(guò)使藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑分散或者溶解而被含有，使該藥物和該附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在該介導(dǎo)粒子上的步驟，所述介導(dǎo)粒子含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
20.權(quán)利要求19所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽和高分子中選出的1種以上的物質(zhì)。
21.權(quán)利要求19所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖鈉、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素以及陰離子性葡聚糖熒光素中選出的1種以上的物質(zhì)。
22.權(quán)利要求19～21中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，藥物是核酸。
23.權(quán)利要求18或者22所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，作為藥物的核酸是從基因、DNA、RNA、寡核苷酸、質(zhì)粒和siRNA中選出的1種以上的物質(zhì)。
24.權(quán)利要求18～23中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑為水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。
25.權(quán)利要求18～23中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑是從聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中選出的1種以上的物質(zhì)。
26.權(quán)利要求18～25中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，介導(dǎo)粒子為具有與藥物靜電相反的電荷的介導(dǎo)粒子。
27.權(quán)利要求18～25中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法，其中，介導(dǎo)粒子為以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒，該脂質(zhì)體含有具有與藥物靜電相反的電荷的脂質(zhì)。
28.按照權(quán)利要求18～27中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子的制備方法制備的復(fù)合粒子。
29.復(fù)合粒子，其中含有介導(dǎo)粒子以及附著在該介導(dǎo)粒子上的作為藥物的核酸；其中所述介導(dǎo)粒子含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
30.復(fù)合粒子，其中含有介導(dǎo)粒子、附著在該介導(dǎo)粒子上的藥物、以及附著在該介導(dǎo)粒子上的附著競(jìng)爭(zhēng)劑；其中所述介導(dǎo)粒子含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
31.權(quán)利要求30所述的復(fù)合粒子，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽和高分子中選出的1種以上的物質(zhì)。
32.權(quán)利要求30所述的復(fù)合粒子，其中，附著競(jìng)爭(zhēng)劑是從硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖鈉、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素以及陰離子性葡聚糖熒光素中選出的1種以上的物質(zhì)。
33.權(quán)利要求30～32中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，藥物為核酸。
34.權(quán)利要求29或者33所述的復(fù)合粒子，其中，作為藥物的核酸是從基因、DNA、RNA、質(zhì)粒和siRNA中選出的1種以上的物質(zhì)。
35.權(quán)利要求29～34中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑為水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或者脂肪酸衍生物。
36.權(quán)利要求29～34中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑是從聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油化脂質(zhì)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚丙二醇、甘油脂肪酸酯以及聚乙二醇烷基醚中選出的1種以上的物質(zhì)。
37.權(quán)利要求29～36中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，介導(dǎo)粒子為具有與藥物靜電相反的電荷的介導(dǎo)粒子。
38.權(quán)利要求29～36中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子，其中，介導(dǎo)粒子為以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒，該脂質(zhì)體含有具有與藥物靜電相反的電荷的脂質(zhì)。
39.包覆復(fù)合粒子的制備方法，包括配制含有極性有機(jī)溶劑的液體A液的步驟，其中分散有權(quán)利要求28～38中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子并且溶解有包覆層成分；然后，通過(guò)使A液中的極性有機(jī)溶劑的比例減少，使復(fù)合粒子被由包覆層成分構(gòu)成的包覆層包覆的步驟。
40.權(quán)利要求39所述的包覆復(fù)合粒子的制備方法，配制A液的步驟包括配制含有極性有機(jī)溶劑的液體B液的步驟，其中分散有權(quán)利要求28～38中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子；配制將包覆層成分溶解于溶劑中而形成的液體C液的步驟，該溶劑中含有與B液中的極性有機(jī)溶劑相同或者不同的極性有機(jī)溶劑；以及，將B液與C液混合的步驟。
41.權(quán)利要求39或者40所述的包覆復(fù)合粒子的制備方法，其中，包覆層為脂質(zhì)膜。
42.權(quán)利要求41所述的包覆復(fù)合粒子的制備方法，其中，包覆層含有水溶性高分子衍生物。
43.按照權(quán)利要求39～42中任一項(xiàng)所述的包覆復(fù)合粒子的制備方法制備的包覆復(fù)合粒子。
44.包覆復(fù)合粒子，由權(quán)利要求28～38中任一項(xiàng)所述的復(fù)合粒子以及包覆該復(fù)合粒子的包覆層構(gòu)成，其中，構(gòu)成該包覆層的包覆層成分為如下成分，該成分在含有極性溶劑的溶劑中，當(dāng)極性溶劑的濃度相對(duì)提高時(shí)溶解、而相對(duì)降低時(shí)析出或者聚集，其中極性溶劑在溶劑中的濃度范圍是該復(fù)合粒子不溶解但能夠分散的濃度范圍。
45.權(quán)利要求44所述的包覆復(fù)合粒子，其中，包覆層為脂質(zhì)膜。
46.權(quán)利要求45所述的包覆復(fù)合粒子，其中，包覆層為含有水溶性高分子衍生物的包覆層。
47.權(quán)利要求44～46中任一項(xiàng)所述的包覆復(fù)合粒子，其中，包覆復(fù)合粒子的平均粒徑在300nm以下。
全文摘要
本發(fā)明提供一種復(fù)合粒子的凝聚抑制方法，其特征在于，在由藥物附著在介導(dǎo)粒子上而形成的復(fù)合粒子中，使該介導(dǎo)粒子中含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。另外還提供復(fù)合粒子的制備方法，該復(fù)合粒子由作為藥物的核酸或者藥物與附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在介導(dǎo)粒子上而形成，其中包括在分散有介導(dǎo)粒子的液體中，使作為藥物的該核酸或者藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑分散或溶解，使作為藥物的該核酸或者藥物和附著競(jìng)爭(zhēng)劑附著在該介導(dǎo)粒子上，其中所述介導(dǎo)粒子含有選自糖、肽、核酸和水溶性高分子中1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或者表面活性劑。
文檔編號(hào)A61K9/10GK1929864SQ20058000758
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者山內(nèi)雅博, 加藤泰己 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社