專利名稱：含白介素－6拮抗劑作為有效成分的內(nèi)耳障礙治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑。本發(fā)明的治療和/或預(yù)防劑含有白介素-6(IL-6)拮抗劑。
背景技術(shù)：
耳聾中，因內(nèi)耳性(耳蝸性)或者迷走性(第8腦神經(jīng)性)導(dǎo)致的耳聾叫做感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。耳聾的原因多種多樣，例如可列舉梅尼埃病綜合癥(Meniere’s disease)、藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙(由于抗癌制劑，如氨基糖苷類和順鉑等導(dǎo)致的內(nèi)耳障礙)、病毒性內(nèi)耳炎、化膿性內(nèi)耳炎、側(cè)頭骨骨折、聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)腫瘤。另外突發(fā)性耳聾、老人性耳聾、噪音性耳聾(noise deafness)也包括在感覺(jué)神經(jīng)性耳聾中。噪音性耳聾是鏈鋸、內(nèi)燃機(jī)引擎、重型裝置、槍、飛機(jī)等發(fā)出大的噪音導(dǎo)致內(nèi)耳障礙而發(fā)生的結(jié)果，與射擊、雪上移動(dòng)、飛機(jī)旅行、搖滾音樂(lè)會(huì)等相關(guān)。
認(rèn)為感覺(jué)神經(jīng)性耳聾的原因多種多樣，已知內(nèi)耳的急性免疫反應(yīng)能夠引起永久性聽(tīng)力下降(hearing loss)(Satoh H et al.，Laryngoscope.2002 Sep；112(9)1627-34)。該文獻(xiàn)還報(bào)道KLH(keyhole limpet hemocyanin)的內(nèi)耳或者蛛網(wǎng)膜下的注射引發(fā)在耳蝸的免疫反應(yīng)，表達(dá)TNF-α和IL-1β，TNF-α導(dǎo)致耳蝸的疾病惡化，以及由于TNF-α抑制劑導(dǎo)致聽(tīng)力部分降低?？墒?，至今，尚完全沒(méi)有關(guān)于將白介素-6對(duì)感覺(jué)神經(jīng)性耳聾有貢獻(xiàn)的報(bào)道。
非專利文獻(xiàn)1 Satoh H et al.，laryngoscope.2002 Sep；112(9)1627-34

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于治療和/或預(yù)防內(nèi)耳障礙的新型藥物。
本發(fā)明人等刻苦研究，闡明白介素-6與感覺(jué)神經(jīng)性耳聾的疾病形成有關(guān)，白介素-6拮抗劑具有感覺(jué)神經(jīng)性耳聾疾病的治療效果。
因此，本發(fā)明提供作為有效成分含有白介素-6拮抗劑的內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑。
上述內(nèi)耳障礙，例如感覺(jué)神經(jīng)性耳聾，該感覺(jué)神經(jīng)性耳聾例如梅尼埃病綜合癥、藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙、病毒性內(nèi)耳炎、化膿性內(nèi)耳炎、側(cè)頭骨骨折、聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)腫瘤導(dǎo)致的感覺(jué)神經(jīng)性耳聾，或者突發(fā)性耳聾、老人性耳聾或噪音性耳聾。
或者，上述內(nèi)耳障礙，例如前庭障礙，該前庭障礙，例如梅尼埃病綜合癥、前庭神經(jīng)炎或者藥物性內(nèi)耳障礙導(dǎo)致的前庭障礙。
上述白介素-6拮抗劑，例如抗白介素-6受體抗體，該抗白介素-6受體抗體例如是抗白介素-6受體的單克隆抗體，優(yōu)選抗人白介素-6受體的單克隆抗體，或抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體，上述抗人白介素-6受體的單克隆抗體例如PM-1抗體，上述抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體例如MR16-1抗體。
上述抗白介素-6受體的抗體優(yōu)選重組型抗體，該重組型抗體，例如，是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。該人源化抗體例如是人源化PM-1抗體。
本發(fā)明可以采取下面的方式。
(1)白介素-6拮抗劑在制造內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑中的應(yīng)用。
(2)上述(1)所述的應(yīng)用，其中，所述內(nèi)耳障礙是感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
(3)上述(2)所述的應(yīng)用，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是梅尼埃病綜合癥、藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙、病毒性內(nèi)耳炎、化膿性內(nèi)耳炎、側(cè)頭骨骨折、聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)腫瘤導(dǎo)致的感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
(4)上述(2)所述的應(yīng)用，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是突發(fā)性耳聾、老人性耳聾或噪音性耳聾。
(5)上述(1)所述的應(yīng)用，其中，所述內(nèi)耳障礙是前庭障礙。
(6)上述(5)所述的應(yīng)用，其中，所述前庭障礙是梅尼埃病綜合癥、前庭神經(jīng)炎或藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙導(dǎo)致的前庭障礙。
(7)上述(1)～(6)任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述白介素-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體。
(8)上述(7)所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的單克隆抗體。
(9)上述(8)所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗人白介素-6受體的單克隆抗體。
(10)上述(8)所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體。
(11)上述(7)～(10)任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是重組型抗體。
(12)上述(9)所述的應(yīng)用，其中，所述抗人白介素-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
(13)上述(10)所述的應(yīng)用，其中，所述抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
(14)上述(7)～(13)任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
(15)上述(14)所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。
本發(fā)明還可以采取下面的方式(1)治療和/或預(yù)防內(nèi)耳障礙的方法，包括給予白介素-6拮抗劑。
(2)上述(1)所述的方法，其中，所述內(nèi)耳障礙是感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
(3)上述(2)所述的方法，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是梅尼埃病綜合癥、藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙、病毒性內(nèi)耳炎、化膿性內(nèi)耳炎、側(cè)頭骨骨折、聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)腫瘤導(dǎo)致的感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
(4)上述(2)所述的方法，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是突發(fā)性耳聾、老人性耳聾或噪音性耳聾。
(5)上述(1)所述的方法，其中，所述內(nèi)耳障礙是前庭障礙。
(6)上述(5)所述的方法，其中，所述前庭障礙是梅尼埃病綜合癥、前庭神經(jīng)炎或藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙導(dǎo)致的前庭障礙。
(7)上述(1)～(6)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述白介素-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體。
(8)上述(7)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的單克隆抗體。
(9)上述(8)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗人白介素-6受體的單克隆抗體。
(10)上述(8)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體。
(11)上述(7)～(10)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是重組型抗體。
(12)上述(9)所述的方法，其中，所述抗人白介素-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
(13)上述(10)所述的方法，其中，所述抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
(14)上述(7)～(13)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
(15)上述(14)所述的方法，其中，所述抗白介素-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。


圖1是表示實(shí)施例1的結(jié)果，表示在通過(guò)3種頻率制得的小鼠的耳聾模型中，給予本發(fā)明的白介素-6R人源化抗體(MR16-1)的施用組和給予小鼠免疫球蛋白G的對(duì)照組的聽(tīng)力閾值降低度(dB)的圖。
圖2是表示實(shí)施例2中的RT-PCR的電泳結(jié)果，該結(jié)果表示在進(jìn)行聲音負(fù)荷后的SD大鼠的耳蝸的各種細(xì)胞因子的經(jīng)時(shí)變化。
圖3是表示實(shí)施例2中的定量RT-PCR的結(jié)果，該結(jié)果表示在進(jìn)行聲音負(fù)荷后的SD大鼠的耳蝸的TNFα的經(jīng)時(shí)變化。
圖4是表示實(shí)施例2中的定量RT-PCR的結(jié)果，該結(jié)果表示在進(jìn)行聲音負(fù)荷后的SD大鼠的耳蝸的白介素-6的經(jīng)時(shí)變化。
圖5是表示實(shí)施例2中的定量RT-PCR的結(jié)果的圖，該結(jié)果表示在進(jìn)行聲音負(fù)荷后的SD大鼠的耳蝸的IL-1β的經(jīng)時(shí)變化。
圖6是表示實(shí)施例2中的通過(guò)Vectastein ABC試劑盒使用抗小鼠白介素-6抗體檢測(cè)進(jìn)行聲音負(fù)荷6小時(shí)后的SD大鼠的組織的結(jié)果的圖的替代照片。
圖7是表示實(shí)施例2中的通過(guò)Vectastein ABC試劑盒對(duì)聲音負(fù)荷6小時(shí)后的SD大鼠的組織使用抗小鼠白介素-6抗體檢測(cè)白介素-6的結(jié)果的圖的替代照片。
圖8是C57BL/6J小鼠負(fù)荷2小時(shí)124dB的放大的聲音后，測(cè)定在施用本發(fā)明的MR16-1(在參考例4制備的抗白介素-6人源化抗體)或者大鼠IgG(對(duì)照)后的內(nèi)耳螺旋器中總STAT3、Erk和Akt以及磷酸化的STAT3、Erk和Akt的表達(dá)的結(jié)果的電泳圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的治療劑具有抑制耳蝸組織障礙、即內(nèi)耳性感覺(jué)神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss)的聽(tīng)力下降的發(fā)展的效果。特別是本發(fā)明的治療劑具有抑制感覺(jué)神經(jīng)性耳聾中的高音區(qū)域聽(tīng)力下降的效果。作為與感覺(jué)神經(jīng)性耳聾相同與毛細(xì)胞的障礙有關(guān)的疾病，可列舉前庭障礙。在感覺(jué)神經(jīng)性耳聾中的耳蝸發(fā)生障礙，盡管耳蝸和前庭掌管不同的感覺(jué)，在結(jié)構(gòu)上，任何一個(gè)都以毛細(xì)胞、支持細(xì)胞與淋巴液相連，通過(guò)它們類似的組織及其物理性質(zhì)承擔(dān)著生理功能。即，毛細(xì)胞感知由于聲音導(dǎo)致的搖動(dòng)、加速度導(dǎo)致的淋巴的運(yùn)動(dòng)的不同而產(chǎn)生的不同感覺(jué)，成為以同樣的結(jié)構(gòu)進(jìn)行感知的組織。耳蝸和前庭的任何一個(gè)與有毛細(xì)胞的障礙與功能降低相關(guān)聯(lián)，其對(duì)藥物的感受性是相似的。所以，本發(fā)明的治療劑可以用于治療感覺(jué)神經(jīng)性耳聾、前庭障礙等內(nèi)耳障礙。
白介素-6是被稱為B細(xì)胞刺激因子2(BSF2)或干擾素β2的細(xì)胞因子。白介素-6作為參與B淋巴細(xì)胞活化的分化因子被發(fā)現(xiàn)(Hirano，T.et al.，Nature(1986)324，73-76)，后來(lái)被闡明是影響各種細(xì)胞功能的多功能細(xì)胞因子(Akira，S.et al.，Adv.inImmunology(1993)54，1-78)。據(jù)報(bào)道白介素-6誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的成熟(Lotz，M.et al.，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258)。
白介素-6通過(guò)細(xì)胞上的兩種蛋白質(zhì)傳遞其生物學(xué)活性。一種是結(jié)合白介素-6的分子量約80kD的配體結(jié)合性蛋白質(zhì)白介素-6受體(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.et al.，Science(1987)241，825-828)。白介素-6受體除了貫通細(xì)胞膜、在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜結(jié)合型之外，主要作為由該細(xì)胞外區(qū)域構(gòu)成的可溶性白介素-6受體存在。
另一種是非配體結(jié)合性的與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的分子量約130kD的膜蛋白質(zhì)gp130。白介素-6與白介素-6受體形成白介素-6/白介素-6受體復(fù)合物，然后通過(guò)與gp130結(jié)合，白介素-6的生物學(xué)活性被傳遞到細(xì)胞內(nèi)(Taga，T.et al.，Cell(1989)58，573-581)。
白介素-6拮抗劑是抑制白介素-6生物學(xué)活性傳遞的物質(zhì)。到目前為止，已知有針對(duì)白介素-6的抗體(抗白介素-6抗體)、針對(duì)白介素-6受體的抗體(抗白介素-6受體抗體)、針對(duì)gp130的抗體(抗gp130抗體)、白介素-6變體、白介素-6或白介素-6受體的部分肽等。
已有幾個(gè)與抗白介素-6受體抗體有關(guān)的報(bào)告(Novick，D.et al.，Hybridoma(1991)10，137-146、Huang，Y.W.et al.，Hybridoma(1993)12，621-630、國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 95-09873、法國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)FR 2694767、美國(guó)專利號(hào)US 521628)。通過(guò)將其中之一的小鼠抗體PM-1(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR；complementarity determiningregion)移植到人抗體得到的人源化PM-1抗體已為人們所知(國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 92-19759)。
上述白介素-6拮抗劑優(yōu)選抗白介素-6受體的抗體，最好是抗人白介素-6受體的單克隆抗體或抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體。作為上述抗人白介素-6受體的單克隆抗體如PM-1抗體，此外作為抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體如MR16-1抗體。上述抗體最好是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體，例如人源化PM-1抗體。人源化抗體是稱做人化抗體(altered antibody)或者再構(gòu)(reshaped)人抗體的改型抗體。
本發(fā)明中使用的白介素-6拮抗劑只要是抑制內(nèi)耳障礙細(xì)胞增殖，可用作內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑的活性成分，不管其來(lái)源、種類和形狀都可以使用。
白介素-6拮抗劑是可阻斷依賴于白介素-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制白介素-6生物學(xué)活性的物質(zhì)。白介素-6拮抗劑最好是對(duì)白介素-6、白介素-6受體以及gp130中任一個(gè)的結(jié)合具有抑制作用的物質(zhì)。作為白介素-6拮抗劑，例如抗白介素-6抗體、抗白介素-6受體抗體、抗gp130抗體、白介素-6變體、可溶性白介素-6受體變體或白介素-6或白介素-6受體的部分肽、以及表現(xiàn)出與它們同樣活性的低分子物質(zhì)。
本發(fā)明中使用的抗白介素-6抗體可以使用眾所周知的手段以多克隆或單克隆抗體形式獲得。作為本發(fā)明中使用的抗白介素-6抗體，特別優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。作為來(lái)自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體，有由雜交瘤產(chǎn)生的抗體、以及通過(guò)基因工程手段由用含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的抗體。該抗體通過(guò)與白介素-6結(jié)合，抑制白介素-6與白介素-6受體的結(jié)合，阻斷白介素-6生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)傳遞。
作為這樣的抗體，如MH166(Matsuda，T.et al.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)和SK2抗體(Sato，K.et al.，第21次日本免疫學(xué)會(huì)總會(huì)、學(xué)術(shù)記錄(1991)21，166)等。
可以基本上使用眾所周知技術(shù)，如下制備產(chǎn)生抗白介素-6抗體的雜交瘤。即、使用白介素-6作為致敏抗原，按照通常的免疫方法進(jìn)行免疫，使用通常的細(xì)胞融合法使得到的免疫細(xì)胞與眾所周知的親本細(xì)胞融合，通過(guò)常規(guī)的篩選方法，篩選制備產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
具體來(lái)說(shuō)，可以象如下那樣制備抗白介素-6抗體。例如可以通過(guò)使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541、或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688公開(kāi)的白介素-6基因/氨基酸序列獲得用作獲得抗體的致敏抗原的人白介素-6。
將白介素-6的基因序列插入到眾所周知的表達(dá)載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后，用眾所周知的方法從該宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清中純化目的白介素-6蛋白質(zhì)，可以使用該純化的白介素-6蛋白質(zhì)作為致敏抗原。另外，也可以使用白介素-6蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原。
可以使用眾所周知的手段，以多克隆或單克隆抗體形式獲得本發(fā)明中使用的抗白介素-6受體的抗體。作為本發(fā)明中使用的抗白介素-6受體的抗體特別優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。作為來(lái)自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體，有由雜交瘤產(chǎn)生的抗體、以及由通過(guò)基因工程手段用以含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的抗體。該抗體通過(guò)與白介素-6受體結(jié)合，抑制白介素-6與白介素-6受體的結(jié)合，阻斷白介素-6的生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)的傳遞。
作為這樣的抗體，如MR16-1抗體(Tamura，T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗體(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 92-19759)等。其中特別優(yōu)選的抗體是PM-1抗體。
將產(chǎn)生PM-1抗體雜交瘤細(xì)胞株作為PM-1，于平成元年(1989年)7月12日，以FERM BP-2998，根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。另外，將產(chǎn)生MR16-1抗體雜交瘤細(xì)胞株作為Rat-mousehybridoma MR16-1，于平成9年(1997年)3月13日，以FERM BP-5875，根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。
可以基本上使用眾所周知技術(shù)，如下制備產(chǎn)生抗白介素-6受體單克隆抗體的雜交瘤。即、使用白介素-6受體作為致敏抗原，根據(jù)通常的免疫方法進(jìn)行免疫，通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞融合方法使得到的免疫細(xì)胞與眾所周知的親本細(xì)胞融合，使用通常的篩選方法，可通過(guò)篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞制備。
具體來(lái)說(shuō)，可以如下制備抗白介素-6受體的抗體。例如作為用于獲得抗體的致敏抗原使用的人白介素-6受體可通過(guò)使用歐州專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 325474、小鼠白介素-6受體可通過(guò)使用日本專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)特開(kāi)平3-155795公開(kāi)的白介素-6受體的基因/氨基酸序列獲得。
白介素-6受體蛋白質(zhì)有在細(xì)胞膜上表達(dá)的和從細(xì)胞膜脫離的(可溶性白介素-6受體)(Yasukawa，K.et al.，J.Biochem.(1990)108，673-676)兩種?？扇苄园捉樗?6受體的抗體由結(jié)合在細(xì)胞膜上的白介素-6受體的實(shí)質(zhì)上的細(xì)胞外區(qū)域構(gòu)成，因缺少細(xì)胞膜貫通區(qū)域或細(xì)胞膜貫通區(qū)域與細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，可溶性白介素-6受體與膜結(jié)合型白介素-6受體不同。白介素-6受體蛋白質(zhì)只要是可作為制備本發(fā)明中使用的抗白介素-6受體的抗體的致敏抗原使用，可以使用任一種白介素-6受體。
可以將白介素-6受體的基因序列插入到眾所周知的表達(dá)載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后，用眾所周知的方法從該宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清中純化目的白介素-6受體蛋白質(zhì)，將該純化白介素-6受體蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。另外，也可以使用表達(dá)白介素-6受體的細(xì)胞或白介素-6受體蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白作為致敏抗原。
含有含編碼人白介素-6受體的cDNA的質(zhì)粒pIBIBSF2R的大腸桿菌(E.coli)于平成元年(1989年)1月9日以HB101-pIBIBSF2R、保藏號(hào)FERM BP-2232，根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。
本發(fā)明中使用的抗gp130抗體可以使用眾所周知的手段以多克隆或單克隆抗體形式獲得。作為本發(fā)明中使用的抗gp130抗體特別優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。作為來(lái)自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體，有由雜交瘤產(chǎn)生的抗體以及由通過(guò)基因工程手段用含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的抗體。該抗體通過(guò)與gp130結(jié)合，抑制白介素-6/白介素-6受體復(fù)合物與gp130的結(jié)合，阻斷白介素-6的生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)的傳遞。
作為這樣的抗體，如AM64抗體(特開(kāi)平3-219894公報(bào))、4B11抗體以及2H4抗體(US 5571513)、B-S12抗體和B-P8抗體(特開(kāi)平8-291199公報(bào))等。
可基本上使用眾所周知技術(shù)如下制備產(chǎn)生抗gp130單克隆抗體的雜交瘤。即、使用gp130作為致敏抗原，根據(jù)通常的免疫方法進(jìn)行免疫，通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞融合法使得到的免疫細(xì)胞與眾所周知的親本細(xì)胞融合，使用常規(guī)的篩選方法，通過(guò)篩選單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行制備。
具體來(lái)說(shuō)，可以如下制備單克隆抗體。例如可以通過(guò)使用歐州專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 411946中公開(kāi)的gp130的基因/氨基酸序列得到用作獲得抗體的致敏抗原使用的gp130。
可以將gp130的基因序列插入到眾所周知的表達(dá)載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化至適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后，使用眾所周知方法從該宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清中純化目的gp130蛋白質(zhì)，將該純化的gp130受體蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。另外，也可以將表達(dá)gp130的細(xì)胞或gp130蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。
作為用致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物，沒(méi)有特別限定，最好是考慮到與細(xì)胞融合中使用的親本細(xì)胞的適合性之后選擇，一般使用嚙齒類動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等。
按照眾所周知的方法將致敏抗原免疫動(dòng)物。例如、作為一般的方法，通過(guò)將致敏抗原注射到哺乳動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下。具體來(lái)說(shuō)，將致敏抗原用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理鹽水等稀釋到適當(dāng)量，根據(jù)要求可以將懸濁溶液與通常的佐劑，例如弗氏完全佐劑適量混合，乳化后最好是每4-21日向哺乳動(dòng)物注射數(shù)次。另外，在致敏抗原免疫時(shí)，可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。
象上述那樣進(jìn)行免疫，確認(rèn)血清中期望的抗體水平上升后，從哺乳動(dòng)物取出免疫細(xì)胞，用于細(xì)胞融合。作為用于細(xì)胞融合的理想的免疫細(xì)胞特別列舉脾細(xì)胞。
適宜使用已經(jīng)眾所周知的各種細(xì)胞株作為可與上述免疫細(xì)胞融合的另一方親本細(xì)胞的哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.et al.J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.etal.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合基本上根據(jù)眾所周知的方法、例如Milstein等人的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等進(jìn)行。
更具體地說(shuō)，上述細(xì)胞融合可以在例如有細(xì)胞融合促進(jìn)劑存在的情況下，在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中實(shí)施。作為融合促進(jìn)劑，例如，可以使用聚乙二醇(PEG)、仙臺(tái)病毒(HVJ)等，另外根據(jù)要求，為了進(jìn)一步提高融合效率，也可以添加使用二甲基亞砜等輔助劑。
免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的使用比例，例如、優(yōu)選相對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞1～10倍的免疫細(xì)胞。作為上述細(xì)胞融合使用的培養(yǎng)液，例如、可以使用適合上述骨髓瘤細(xì)胞株增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、其它的在這種細(xì)胞培養(yǎng)中使用的常規(guī)培養(yǎng)液，另外也可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加液。
細(xì)胞融合可以通過(guò)將所定量的上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在上述培養(yǎng)液中充分混合，按照30～60％(w/v)的濃度添加預(yù)先加熱到37℃左右的PEG溶液，例如平均分子量1000～6000左右的PEG溶液，通過(guò)混合形成目的融合細(xì)胞(雜交瘤)。然后，逐次添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，通過(guò)重復(fù)離心除去上清的操作，可以除去影響雜交瘤生育的細(xì)胞融合劑等。
該雜交瘤通過(guò)在通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)液)中進(jìn)行培養(yǎng)、選擇。為了為目的雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)的徹底死亡提供充分的時(shí)間，通常使在該HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)持續(xù)數(shù)日～數(shù)周。然后，實(shí)施常規(guī)的極限稀釋法，進(jìn)行產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤的篩選以及克隆。
另外、除了對(duì)人以外的動(dòng)物進(jìn)行抗原免疫獲得上述雜交瘤之外，也可以在體外用期待的抗原蛋白質(zhì)或抗原表達(dá)細(xì)胞致敏人淋巴細(xì)胞，使致敏B淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞、例如U266融合，也可以得到與期待的抗原或抗原表達(dá)細(xì)胞具有結(jié)合活性的期望的人抗體(參照特公平1-59878)。另外、將抗原或抗原表達(dá)細(xì)胞給予具有人抗體基因庫(kù)(repertoire)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使用上述方法也可以獲得期待的人抗體(參照國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
這樣制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在常規(guī)的培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，另外可以在液氮中長(zhǎng)期保存。
為了從該雜交瘤取得單克隆抗體，可以采用下述方法按照常規(guī)方法對(duì)該雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)，得到其培養(yǎng)上清，或下述方法將雜交瘤給予適合它的哺乳動(dòng)物，使其增殖，得到其腹水等。前面的方法適于獲得高純度的抗體，而后者的方法適于抗體的大量生產(chǎn)。
例如、可以根據(jù)特開(kāi)平3-139293公開(kāi)的方法制備產(chǎn)生抗白介素-6受體抗體的雜交瘤。將于平成元年(1989年)7月12日、以FERMBP-2998，根據(jù)布達(dá)佩斯條約國(guó)際保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)的產(chǎn)生PM-1抗體的雜交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)獲得腹水，從該腹水純化PM-1抗體，或?qū)⒈倦s交瘤在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、例如、含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制造)的RPMI1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)等進(jìn)行培養(yǎng)，從該培養(yǎng)上清純化PM-1抗體。
在本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用從雜交瘤克隆抗體基因，整合到適當(dāng)?shù)妮d體，將該載體導(dǎo)入宿主，使用基因重組技術(shù)產(chǎn)生的重組型抗體(例如、參照Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the UnitedKingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具體來(lái)說(shuō)，從產(chǎn)生目的抗體的細(xì)胞、例如雜交瘤分離編碼抗體可變(V)區(qū)的mRNA。mRNA的分離根據(jù)眾所周知的方法，例如、胍超離心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制備總RNA，使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)等制備mRNA。另外通過(guò)使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)可以直接制備mRNA。
使用逆轉(zhuǎn)錄酶可以從得到的mRNA合成抗體V區(qū)的cDNA。使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第1條鏈cDNA合成試劑盒等進(jìn)行cDNA的合成。另外為了進(jìn)行cDNA的合成和擴(kuò)增，可以使用5′-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech制造)以及使用PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。由得到的PCR產(chǎn)物純化目的DNA片段，與載體DNA連接。再由此制成重組載體，導(dǎo)入大腸桿菌等，選擇菌落，制備期待的重組載體。通過(guò)眾所周知的方法、例如脫氧法確認(rèn)目的DNA的堿基序列。
如果得到編碼目的抗體V區(qū)的DNA，將它與期待的編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，整合到表達(dá)載體?；蛞部梢詫⒕幋a抗體V區(qū)的DNA整合到含有抗體C區(qū)DNA的表達(dá)載體中。
為了制造本發(fā)明中使用的抗體，象下面敘述的那樣，將抗體基因整合到可在表達(dá)調(diào)控區(qū)、例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)的表達(dá)載體。然后，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使抗體表達(dá)。
在本發(fā)明中，為了使對(duì)人的異種抗原性降低等的目的，可以使用人為改變的基因重組型抗體，例如嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體、人(human)抗體。可以使用已知方法制造這些改變抗體。
嵌合抗體可以通過(guò)將如上所述得到的編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后整合到表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主，使其產(chǎn)生得到(參照歐州專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 125023、國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759)。使用這個(gè)已知的方法，可以得到用于本發(fā)明的嵌合抗體。
例如、含有編碼嵌合PM-1抗體L鏈以及H鏈V區(qū)的DNA的質(zhì)粒分別被命名為pPM-k3和pPM-h1，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌于1991年2月12日分別以NCIMB 40366和NCIMB 40362，根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于National Collections of Industrial and Marine BacteriaLimited(Ferguson Building，Craibst one Estate，Bucksburn，Aberdeen AB 21 9YA，United Kindom)。
人源化抗體也稱為再構(gòu)(reshaped)人抗體，是將人以外的哺乳動(dòng)物、例如小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體互補(bǔ)決定區(qū)后的產(chǎn)物，其一般的基因重組方法已為人所知(參照歐州專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP125023、國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 92-19759)。
具體來(lái)說(shuō)、由制作成在末端部具有重疊部分的數(shù)個(gè)寡核苷酸通過(guò)PCR法合成按照小鼠抗體的CDR與人抗體的框架區(qū)(FR；frameworkregion)連接那樣設(shè)計(jì)的DNA序列。將得到的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后整合到表達(dá)載體中，將該載體導(dǎo)入宿主，使其產(chǎn)生得到(參照歐州專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 239400、國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759)。
通過(guò)CDR連接的人抗體的FR選擇可使互補(bǔ)決定區(qū)形成良好抗原結(jié)合部位的區(qū)域。根據(jù)需要，為了使再構(gòu)人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)形成合適的抗原結(jié)合部位也可以對(duì)抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)的氨基酸進(jìn)行置換(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
對(duì)于嵌合抗體、人源化抗體，可以使用人抗體C區(qū)。作為人抗體C區(qū)，如Cγ，例如可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。而為了改善抗體或其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，也可以對(duì)人抗體C區(qū)進(jìn)行修飾。
嵌合抗體由來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的可變區(qū)和來(lái)自人抗體的C區(qū)構(gòu)成，人源化抗體由來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)與來(lái)自人抗體的構(gòu)架區(qū)和C區(qū)構(gòu)成，由于在人體內(nèi)的抗原性低下，所以可作為本發(fā)明中使用的抗體。
作為本發(fā)明中使用的人源化抗體的理想的具體例子，如人源化PM-1抗體(參照國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 92-19759)。
而作為獲得人抗體的方法，除了前面敘述的方法之外，已知還有使用人抗體庫(kù)，通過(guò)淘選，獲得人抗體的技術(shù)。例如、通過(guò)噬菌體展示法使人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)展示在噬菌體表面，也可以選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。如果解析選擇的噬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的可變區(qū)的DNA序列。如果與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列被闡明，可以利用該序列制備適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，獲得人抗體。這些方法已眾所周知，可以參考WO 92/01047，WO 92/20791，WO93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388。
象上述那樣構(gòu)建的抗體基因可以通過(guò)眾所周知的方法使其表達(dá)獲得。在是哺乳類細(xì)胞的情況下，通過(guò)使常用的有用的啟動(dòng)子、被表達(dá)的抗體基因、其3′側(cè)下游聚A信號(hào)肽功能性地結(jié)合的DNA或含有該DNA的載體表達(dá)。例如作為啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，如人巨細(xì)胞病毒即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(human cytomegalovirus immediate earlypromoter/enhancer)。
另外作為其它的可用于在本發(fā)明的抗體表達(dá)中使用的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，可以使用逆病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV 40)等病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或人延伸因子1a(HEF1a)等來(lái)自哺乳類細(xì)胞的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
例如、使用SV 40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，根據(jù)Mu11igan等人的方法(Mulligan，R.C.et al.，Nature(1979)277，108-114)，使用HEF1α啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，根據(jù)Mizushima等人的方法(Mizushima，S.andNagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)容易實(shí)施。
使用大腸桿菌時(shí)，可以使常用的有用的啟動(dòng)子、用于抗體分泌的信號(hào)肽序列、被表達(dá)的抗體基因功能性地結(jié)合、表達(dá)。例如作為啟動(dòng)子，如lacZ啟動(dòng)子、araB啟動(dòng)子。使用lacZ啟動(dòng)子時(shí)，可以根據(jù)Ward等人的方法(Ward，E.S.et al.，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.et al.FASEB J.(1992)6，2422-2427)實(shí)施，使用araB啟動(dòng)子時(shí)，可以根據(jù)Better等人的方法(Better，M.et al.Science(1988)240，1041-1043)實(shí)施。
作為用于抗體分泌的信號(hào)肽序列，使抗體在大腸桿菌的周質(zhì)產(chǎn)生時(shí)，可以使用pelB信號(hào)肽序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分離在周質(zhì)產(chǎn)生的抗體后，對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)重折疊(refold)后使用(例如、參照WO96/30394)。
作為復(fù)制起點(diǎn)，可以使用來(lái)自SV 40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)等的復(fù)制起點(diǎn)，另外，為了在宿主細(xì)胞系進(jìn)行基因拷貝數(shù)擴(kuò)增，表達(dá)載體可以含有作為選擇標(biāo)志的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。
為了制造本發(fā)明中使用的抗體，可以使用任意的生產(chǎn)系統(tǒng)。用于抗體制造的生產(chǎn)系統(tǒng)有體外和體內(nèi)的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為體外的生產(chǎn)系統(tǒng)，如使用真核細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)和使用原核細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。
使用真核細(xì)胞時(shí)，有使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、或真菌細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為動(dòng)物細(xì)胞，已知(1)哺乳類細(xì)胞、例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等；(2)兩棲類細(xì)胞、例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞、或(3)昆蟲(chóng)細(xì)胞、例如、sf9、sf21、Tn5等。作為植物細(xì)胞，已知來(lái)自煙草(Nicotianat abacum)的細(xì)胞，可以對(duì)它們進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細(xì)胞，已知有酵母、例如酵母(Saccharomyces)屬、例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、絲狀菌、例如曲霉屬(Aspergillus)、例如黑曲霉(Aspergillusniger)等。
使用原核細(xì)胞時(shí)，有使用細(xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為細(xì)菌細(xì)胞已知有大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
通過(guò)轉(zhuǎn)化將目的抗體基因?qū)氲竭@些細(xì)胞中，通過(guò)將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，可得到抗體。根據(jù)眾所周知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。例如、作為培養(yǎng)液，可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加液。另外也可通過(guò)將導(dǎo)入了抗體基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到動(dòng)物的腹腔等，在體內(nèi)生產(chǎn)抗體。
另外，作為體內(nèi)的生產(chǎn)系統(tǒng)，如使用動(dòng)物的生產(chǎn)系統(tǒng)和使用植物的生產(chǎn)系統(tǒng)。使用動(dòng)物時(shí)有使用哺乳類動(dòng)物、昆蟲(chóng)的生產(chǎn)系統(tǒng)等。
作為哺乳類動(dòng)物，可以使用山羊、豬、羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。而作為昆蟲(chóng)可以使用蠶。使用植物時(shí)，例如可以使用煙草。
將抗體基因?qū)脒@些動(dòng)物或植物中，使抗體在動(dòng)物或植物的體內(nèi)產(chǎn)生、回收。例如將抗體基因插入到編碼山羊β酪蛋白那樣的在乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基因中間后，制備成融合基因。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚中，將這個(gè)胚導(dǎo)入雌性山羊?？梢詮慕邮芰伺叩纳窖虍a(chǎn)下的轉(zhuǎn)基因山羊或其子孫產(chǎn)生的乳汁獲得期待的抗體。為了使從轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有期待抗體的乳汁量增加，也可以對(duì)轉(zhuǎn)基因山羊使用適當(dāng)?shù)募に亍?Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
另外，使用蠶時(shí)，用插入了目的抗體基因的桿狀病毒感染蠶，從該蠶的體液獲得期待的抗體(Maeda，S.et al.，Nature(1985)315，592-594)。另外，使用煙草時(shí)，將目的抗體基因插入植物表達(dá)用載體、例如pMON 530，將該載體導(dǎo)入到根癌土壤桿菌那樣的細(xì)菌中。使該細(xì)菌感染煙草、例如Nicotiana tabacum，可以從本煙草的葉得到期待的抗體(Julian，K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
象上述那樣通過(guò)體外或體內(nèi)的生產(chǎn)系統(tǒng)生產(chǎn)抗體時(shí)，也可以將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別整合到表達(dá)載體后，同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主，也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA整合到一個(gè)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主(參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 94-11523)。
本發(fā)明中可使用的抗體只要是適合本發(fā)明使用的，即使是抗體的片段或其修飾物也可以。例如作為抗體的片段，如Fab、F(ab′)2、Fv或用適當(dāng)?shù)慕宇^連接Fv的H鏈與L鏈的單鏈Fv(scFv)。
具體來(lái)說(shuō)，將抗體用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶進(jìn)行處理，使之生成抗體片段，或構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將該基因?qū)氡磉_(dá)載體后，用適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá)(例如、參照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.& Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-66、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通過(guò)將抗體的H鏈的V區(qū)與L鏈的V區(qū)連接可以獲得scFv。在這個(gè)scFv中，H鏈的V區(qū)與L鏈的V區(qū)通過(guò)接頭、最好是肽接頭連接(Huston，J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。ScFv中的H鏈的V區(qū)與L鏈的V區(qū)也可以是來(lái)自上述作為抗體記載的任一個(gè)抗體。作為連接V區(qū)的肽接頭，例如可以使用由12-19個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的任意的單鏈肽。
可以通過(guò)以編碼上述抗體的H鏈或H鏈的V區(qū)的DNA、以及編碼L鏈或L鏈的V區(qū)的DNA作為模板，對(duì)編碼這些序列中期待的氨基酸序列的DNA部分使用規(guī)定其兩端的引物對(duì)通過(guò)PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，然后再將編碼肽接頭部分的DNA以及規(guī)定其兩端能夠與各個(gè)H鏈、L鏈連接的引物對(duì)組合后進(jìn)行擴(kuò)增獲得編碼scFv的DNA。
而一旦制備得到編碼scFv的DNA，可以通過(guò)常規(guī)方法獲得含有這些DNA的表達(dá)載體、以及用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主，另外可以使用該宿主根據(jù)常規(guī)方法得到scFv。
這些抗體的片段可與上述同樣地得到其基因，通過(guò)宿主表達(dá)產(chǎn)生。本發(fā)明中提到的“抗體”也包含這些抗體的片段。
作為抗體的修飾物，也可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。本發(fā)明中提到的“抗體”也包含這些抗體修飾物。為了獲得這樣的抗體修飾物，通過(guò)對(duì)得到的抗體實(shí)施化學(xué)修飾可以得到。這些方法在該領(lǐng)域中已經(jīng)確立。
可以從細(xì)胞內(nèi)外、從宿主分離象上述那樣產(chǎn)生、表達(dá)的抗體，純化至均一。可以通過(guò)親和層析進(jìn)行本發(fā)明中使用的抗體的分離、純化。作為用于親和層析中的柱子、例如蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中使用的載體，例如、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，可以使用通常蛋白質(zhì)中使用的分離、純化方法，沒(méi)有任何限定。
例如可以適當(dāng)選擇、組合上述親和層析以外的層析、過(guò)濾、排阻過(guò)濾、鹽析、透析等，可以對(duì)本發(fā)明中使用的抗體進(jìn)行分離、純化。作為層析，例如、離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾等。這些層析適用于HPLC(High performance liquid chromatography)。另外，也可以使用反相HPLC(reverse phase HPLC)。
可以通過(guò)吸光度測(cè)定或ELISA等進(jìn)行上述得到的抗體的濃度測(cè)定。即、利用吸光度測(cè)定時(shí)，用PBS(-)適當(dāng)稀釋后，測(cè)定280nm的吸光度，以1mg/ml作為1.35OD計(jì)算。通過(guò)ELISA測(cè)定時(shí)，可如下測(cè)定。即、將100μl用0.1M碳酸氫酸緩沖液(pH9.6)稀釋至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制造)加到96孔板(Nunc制造)，于4℃溫育過(guò)夜，固定抗體。封閉后、添加適當(dāng)稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含有抗體的樣品、或作為標(biāo)準(zhǔn)品的人IgG(CAPPEL制)100μl，于室溫下溫育1小時(shí)。
洗滌后，加稀釋了5000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG(BIOSOURCE制)100μl，于室溫下溫育1小時(shí)。洗滌后，加底物溶液，溫育后，使用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)測(cè)定405nm的吸光度，計(jì)算目的抗體的濃度。
本發(fā)明中使用的白介素-6變體是具有與白介素-6受體的結(jié)合活性，而且不傳遞白介素-6生物學(xué)活性的物質(zhì)。即，白介素-6變體與白介素-6競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合白介素-6受體，由于不傳遞白介素-6的生物學(xué)活性，所以可阻斷依賴于白介素-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
白介素-6變體是通過(guò)對(duì)白介素-6的氨基酸序列的氨基酸殘基進(jìn)行置換導(dǎo)入突變制備的。作為白介素-6變體的本體的白介素-6不管其來(lái)源，如果考慮抗原性等，最好是人白介素-6。
具體來(lái)說(shuō)，使用眾所周知的分子模型程序，例如WHATIF(Vriend etal.，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)對(duì)白介素-6的氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，再通過(guò)對(duì)被置換的氨基酸殘基對(duì)整體的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。確定合適的置換氨基酸殘基后，以含有編碼人白介素-6基因的堿基序列的載體作為模板，通過(guò)使用通常進(jìn)行的PCR法導(dǎo)入能夠使氨基酸置換的突變，可以得到編碼白介素-6變體的基因。根據(jù)需要可以將該基因整合到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，通過(guò)上述重組型抗體的表達(dá)、產(chǎn)生以及純化方法可以得到白介素-6變體。
作為白介素-6變體的具體例子，如Brakenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93、以及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357-1367、WO 96-18648、WO 96-17869公開(kāi)的例子。
本發(fā)明中使用的白介素-6部分肽或白介素-6受體部分肽是分別具有與白介素-6受體或白介素-6的結(jié)合活性，而且不傳遞白介素-6生物學(xué)活性的物質(zhì)。即，白介素-6部分肽或白介素-6受體部分肽與白介素-6受體或白介素-6結(jié)合，通過(guò)捕獲它們，特異性地抑制白介素-6與白介素-6受體的結(jié)合。其結(jié)果由于不傳遞白介素-6的生物學(xué)活性，所以阻斷了依賴于白介素-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
白介素-6部分肽或白介素-6受體部分肽是由在白介素-6或白介素-6受體的氨基酸序列中與白介素-6和白介素-6受體結(jié)合有關(guān)的區(qū)域的一部分或全部氨基酸序列構(gòu)成的肽。這樣的肽通常由10～80、優(yōu)選20～50、更優(yōu)選20～40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。
白介素-6部分肽或白介素-6受體部分肽可以如下制備。對(duì)白介素-6或白介素-6受體的氨基酸序列中與白介素-6和白介素-6受體的結(jié)合有關(guān)的區(qū)進(jìn)行特別指定，通過(guò)常規(guī)的已知方法、例如基因工程手段或肽合成法制備其的一部分或全部的氨基酸序列。
為了通過(guò)基因工程手段制備白介素-6部分肽或白介素-6受體部分肽，將編碼期待的肽的DNA序列整合到表達(dá)載體中，根據(jù)上述重組型抗體表達(dá)、產(chǎn)生以及純化方法可以得到所述部分肽。
為了通過(guò)肽合成法制備白介素-6部分肽或白介素-6受體部分肽，可以使用在肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具體來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)“續(xù)醫(yī)藥品的開(kāi)發(fā)”第14卷，“肽合成”，監(jiān)修矢島治明，廣川書(shū)店，1991年，所述的方法進(jìn)行。作為固相合成法，例如可以使用在不溶于有機(jī)溶劑的載體上使對(duì)應(yīng)于要合成的肽的C末端氨基酸結(jié)合，通過(guò)交替反復(fù)進(jìn)行使用適當(dāng)保護(hù)基對(duì)α-氨基以及側(cè)鏈官能基進(jìn)行了保護(hù)的氨基酸按照從C末端至N末端方向的順序一個(gè)一個(gè)進(jìn)行氨基酸縮合的反應(yīng)和使結(jié)合在樹(shù)脂上的氨基酸或肽的α-氨基的該保護(hù)基脫離的反應(yīng)，使肽鏈延伸的方法。固相肽合成法因使用的保護(hù)基的種類不同大致分為Boc法與Fmoc法。
象上述那樣合成了目的肽后，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)以及將肽鏈從載體上切下的反應(yīng)。在切下肽鏈的切斷反應(yīng)中，如果使用Boc法通常使用氟化氫或三氟甲烷磺酸，而如果使用Fmoc法通常使用TFA。如果用Boc法，例如在氟化氫中于茴香醚存在下對(duì)上述保護(hù)肽樹(shù)脂進(jìn)行處理。然后脫保護(hù)基和從載體上切下，回收肽。通過(guò)將該肽進(jìn)行冷凍干燥，得到粗肽。另外，如果用Fmoc法，例如在TFA中與上述同樣操作，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)以及將肽鏈從載體上切下的反應(yīng)。
得到的粗肽通過(guò)運(yùn)用HPLC可以進(jìn)行分離、純化。在進(jìn)行洗脫時(shí)，使用蛋白質(zhì)純化中通常使用的水-乙腈系溶劑，在最適條件下進(jìn)行。對(duì)得到的相當(dāng)于整個(gè)層析圖的峰級(jí)分進(jìn)行收集，對(duì)該級(jí)分進(jìn)行冷凍干燥。對(duì)于這樣純化的肽級(jí)分，通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行的分子量解析、氨基酸組成分析、或通過(guò)氨基酸序列解析等進(jìn)行鑒定。
白介素-6部分肽以及白介素-6受體部分肽的具體例子，如特開(kāi)平2-188600、特開(kāi)平7-324097、特開(kāi)平8-311098和美國(guó)專利公報(bào)US5210075公開(kāi)的例子。
本發(fā)明中使用的白介素-6拮抗劑的白介素-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制活性可以通過(guò)通常用的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)對(duì)白介素-6依賴性人骨髓瘤株(S6B45，KPMM2)、人Lennert T淋巴瘤細(xì)胞株KT3、或白介素-6依賴性細(xì)胞MH60.BSF2進(jìn)行培養(yǎng)，添加白介素-6，同時(shí)使白介素-6拮抗劑共存，據(jù)此測(cè)定白介素-6依賴性細(xì)胞的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入。
另外，通過(guò)對(duì)作為白介素-6受體表達(dá)細(xì)胞的U266進(jìn)行培養(yǎng)，添加125I標(biāo)記的白介素-6，同時(shí)加入白介素-6拮抗劑，測(cè)定與白介素-6受體表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的125I標(biāo)記的白介素-6。在上述分析體系中，除了使白介素-6拮抗劑存在的組外，設(shè)置不含有白介素-6拮抗劑的陰性對(duì)照組，如果對(duì)兩者得到的結(jié)果進(jìn)行比較，可以評(píng)價(jià)白介素-6拮抗劑的白介素-6抑制活性。
就象下面實(shí)施例給出的那樣，由于確認(rèn)了抗白介素-6受體的抗體對(duì)內(nèi)耳障礙細(xì)胞的增殖抑制效果，表明抗白介素-6受體的抗體等白介素-6拮抗劑可用作內(nèi)耳障礙的治療劑。
本發(fā)明的治療對(duì)象是哺乳動(dòng)物。治療對(duì)象哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。
本發(fā)明的內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑或內(nèi)耳障礙細(xì)胞增殖抑制劑可以通過(guò)口服或非口服方式全身或局部施用。例如、可以選擇點(diǎn)滴等靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、胸腔內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、栓劑、灌腸、口服性腸溶劑等，可以根據(jù)患者的年齡、癥狀選擇適當(dāng)?shù)慕o予方法。有效給予量可從每次、每1kg體重、從0.01mg至100mg的范圍內(nèi)選擇。或?qū)τ诿總€(gè)患者可以選擇1～1000mg、優(yōu)選5～50mg的給予量。
理想的施用量、施用方法，例如是抗白介素-6受體抗體時(shí)，以血中有游離抗體存在程度的量為有效施用量，作為具體的例子，每1kg體重1個(gè)月(4周)內(nèi)分1次至數(shù)次，例如按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等的施用計(jì)劃使用點(diǎn)滴等靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法給予0.5mg至40mg、優(yōu)選1mg至20mg等。給予計(jì)劃也可以一邊觀察病情和血液檢查值的動(dòng)向，進(jìn)行將施用間隔從2次/周或1次/周延長(zhǎng)至1次/2周、1次/3周、1次/4周等調(diào)整。
本發(fā)明的內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑或內(nèi)耳障礙細(xì)胞增殖抑制劑可根據(jù)施用途徑同時(shí)含有在醫(yī)藥上容許的載體或添加物。作為這樣的載體和添加物的例子，如水、醫(yī)藥上容許的有機(jī)溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯樹(shù)膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、一縮二甘油、丙(撐)二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清清蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作為醫(yī)藥添加物容許的表面活性劑等。使用的添加物可根據(jù)劑型，從上述化合物中適當(dāng)或組合選擇，但并不限定于這些化合物。
實(shí)施例以下、通過(guò)實(shí)施例和參考例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1.
接實(shí)驗(yàn)方法(1)聲音負(fù)荷前小鼠的聽(tīng)力測(cè)定對(duì)于4周齡的C57BL/6J雄性小鼠，在聲音負(fù)荷前通過(guò)聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)進(jìn)行聽(tīng)力測(cè)定。在測(cè)定前，通過(guò)向腹腔內(nèi)注射Xyladine和氯胺酮(Ketamine)，實(shí)施充分的深度麻醉，在測(cè)定中根據(jù)需要，用氯胺酮實(shí)施追加麻醉。
(聽(tīng)性腦干反應(yīng))上述的噪音條件下，為了知道噪音誘發(fā)耳聾的程度，對(duì)聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)的閾值shift進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用PowerLabsystem(ModelPowerLob2/20，ADInstruments CastleHillAustralia)的Scope軟件的waveform storing和stimuluscontrol進(jìn)行ABR的測(cè)定，使用細(xì)胞外放大器Digital Biomap System(ModelBAL-1，Tucker-Davis Technologies FL/USA)記錄EEG。聲音刺激是通過(guò)向小鼠的外耳道中插入耦合型揚(yáng)聲器(ModelESlspc，BioResearch Center，名古屋/日本)產(chǎn)生的。使之產(chǎn)生0.1ms升/降時(shí)間(cosine gate)的破裂音刺激和1ms的平坦片段(flatsegment)，用聲音發(fā)生器、Attention Real-time Processor和Programable Attenater(ModelRP2.1 and PA5，Tucker-DavisTechnologies FL/USA)指定振幅。使用Sound Level Meter(ModelLA-5111，0no Sokki橫濱/日本)測(cè)定聲音水平。為了記錄，將不銹鋼制的針狀電極設(shè)置于左耳和右耳的頂部和空洞側(cè)部。通常，使用50-5000Hz的濾波器裝置，以40000Hz的取樣速度，記錄時(shí)間為12.8ms的ABR波形，平均在9Hz頻率的來(lái)自256刺激的波形。以5-dB SPL的間隔，從最高振幅處開(kāi)始記錄直至波形到視力不可見(jiàn)為止。為了測(cè)定閾值，將給予的聲音的頻率定為4kHz、12kHz和20kHz三種，測(cè)定各聽(tīng)力閾值。
(2)耳聾模型的制作在聲音負(fù)荷裝置(該裝置是用RION Audiometyr AA67N的制噪裝置作為聲音發(fā)生器，用SONY SRP-P150，F(xiàn)OSTEXD-1405作為增幅器，進(jìn)行增幅后，在密閉空間內(nèi)以直徑大約12cm的擴(kuò)音器進(jìn)行負(fù)荷的裝置)內(nèi)，向在擴(kuò)音器正下方1cm處?kù)o置的高3cm的金屬網(wǎng)制籠中裝入小鼠。用同樣性狀的金屬網(wǎng)將籠子以放射狀分隔，同時(shí)將4只小鼠分別裝到每個(gè)室中。然后，在聲音負(fù)荷裝置內(nèi)，按照124±1db預(yù)先設(shè)定聲音壓力(CASELA公司，通過(guò)CEL-231在2小時(shí)的負(fù)荷過(guò)程中，進(jìn)行多次測(cè)定)，在此條件下，進(jìn)行2小時(shí)的高音負(fù)荷。使用4kHzSPL的Octaveband noise的聲音。此外，在聲音裝置內(nèi)放置溫度計(jì)，測(cè)定聲音負(fù)荷前后的溫度。
(3)施用藥物在上述(2)后，將動(dòng)物分成A群和B群，馬上將大鼠IgG按照2mg/只或者M(jìn)R16-1(在參考例4中制備的抗白介素-6R人源化抗體)按照2mg/只施用于各組。在施用時(shí)，作為盲實(shí)驗(yàn)，直至(4)的聽(tīng)力測(cè)定結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員不清楚向個(gè)組施用的內(nèi)容。
(4)聽(tīng)力閾值的測(cè)定與上述(1)的方式相同，從聲音負(fù)荷和施用藥物一周后測(cè)定聽(tīng)力。在確認(rèn)測(cè)定后的小鼠達(dá)到充分的麻醉深度后，斷頭，摘出側(cè)頭骨，固定后，保存以備用于組織學(xué)考察。
(5)結(jié)果分析取各個(gè)個(gè)體在上述(4)得到的聽(tīng)力與在上述(1)得到的處置前的聽(tīng)力的差，計(jì)算出聽(tīng)力閾值降低度(dB)。分別計(jì)算出MR16-1施用組與對(duì)照組在各頻率處的平均聽(tīng)力閾值降低(dB)。
結(jié)果在進(jìn)行上述(4)的麻醉時(shí)，死亡1只，由于不能測(cè)定聽(tīng)力，所以扣除。得到聽(tīng)力閾值度的只數(shù)在MR16-1組中為4只，在IgG施用組中為為2只。此外，聲音負(fù)荷器內(nèi)的溫度在負(fù)荷前為25℃，負(fù)荷后為27℃。結(jié)果如下表1和圖1所示。
表1

討論認(rèn)為聲音外傷是聲音壓力這種物理性外力，在本實(shí)驗(yàn)中使用的模型是耳蝸的物理組織損傷模型。在本實(shí)驗(yàn)中，以4kHz的頻率為中心，負(fù)荷放大的聲音。在耳蝸處，感受聲音的感受器對(duì)應(yīng)于頻率進(jìn)行空間性分布(to notropic)，在對(duì)照組中的聽(tīng)力降低高達(dá)4kHz，由此出發(fā)，直到高音區(qū)域逐漸變小，可以說(shuō)明在4kHz的區(qū)域因?yàn)樨?fù)荷放大的聲音，所以造成了越靠近該區(qū)域，組織的損傷越大。
另一方面，在白介素-6受體抗體施用組中，負(fù)荷放大的聲音的組織損傷離直接接受部位越遠(yuǎn)，與對(duì)照組相比，越能抑制聽(tīng)力降低。由上所述，認(rèn)為白介素-6受體抗體具有空間漸進(jìn)性抑制耳蝸的組織障礙，即，內(nèi)耳性神經(jīng)性耳聾的聽(tīng)力降低的效果，或者具有抑制在神經(jīng)性耳聾的高音區(qū)域的聽(tīng)力降低的效果。
實(shí)施例2.炎癥性細(xì)胞因子在聲音外傷后的耳蝸的表達(dá)使用3～4周齡的雄性SD大鼠以實(shí)施例1相同的方法，制作耳聾模型，緊接著聲音負(fù)荷，在3小時(shí)后、6小時(shí)后、12小時(shí)后、24小時(shí)后、3天后、5天后、7天后、28天后分別從各大鼠中摘出側(cè)頭骨。以不漏出耳蝸內(nèi)的淋巴液體狀態(tài)保持，只摘出耳蝸，通過(guò)RT-PCR法測(cè)定各種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在聲音外傷模型的耳蝸處，TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-1受體拮抗劑(IL-1RA)、白介素-6的表達(dá)上升。另一方面，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)IL-12p40和GM-CSF的表達(dá)。
然后，通過(guò)定量RT-PCR，測(cè)定TNFα、白介素-6、IL-1β、白介素-6表達(dá)的經(jīng)時(shí)變化。定量RT-PCR中，使用18SrRNA作為內(nèi)標(biāo)(reference gene)，通過(guò)ΔΔCt法分析結(jié)果。結(jié)果如圖3～圖5所示。從圖3～圖5可知，在聲音外傷后不足24小時(shí)的早期階段，確認(rèn)有顯示表達(dá)量的峰的TNFα、IL-1β、白介素-6的表達(dá)。
此外，使用聲音負(fù)荷6小時(shí)的組織，在冷凍切片上進(jìn)行免疫組織染色。動(dòng)物使用SD大鼠，以與實(shí)施例1相同的方法制成耳聾模型，在噪音負(fù)荷后6小時(shí)后斷頭。立即摘出側(cè)頭骨，使用液氮將用4％的多聚甲醛固定6小時(shí)，用0.5mol/1EDTA液脫礦物質(zhì)而得到的檢測(cè)樣本迅速冷凍，使用低溫保藏器(CM3000，Leica公司)，切成7μm厚，得到冷凍切片。在該切片上施行免疫組化染色。在染色中使用Vectastein ABC試劑盒，用DAB顯色。作為染色的對(duì)照，使用不加第一抗體進(jìn)行的染色。結(jié)果如圖6～圖7所示，由圖6～圖7可知，在聲音負(fù)荷6小時(shí)后的耳蝸，顯示出在耳蝸外壁和螺旋器(Corti’s organ)的正下方的基底膜表達(dá)白介素-6。
實(shí)施例3.白介素-6拮抗劑的全身施用所致的藥效的確認(rèn)與實(shí)施例1一樣，向C57BL/6J雄性小鼠負(fù)荷2小時(shí)124dB的過(guò)大音，緊接著，將MR16-1按照2mg/只、將大鼠IgG按照2mg/只向腹腔內(nèi)施用。施用抗體后，在8小時(shí)后摘出側(cè)頭骨，摘出兩側(cè)的內(nèi)耳，解剖出螺旋器，分成第一螺旋(尖部)、第二螺旋(基底)，分別從左右回收，合并。通過(guò)Western印跡方法，測(cè)定總STAT3、Erk、Akt和磷酸化的STAT3、Erk、Akt的表達(dá)。結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，對(duì)照組中很清楚的確認(rèn)磷酸化的STAT3、磷酸化Erk、磷酸化Akt的信號(hào)在MR16-1使用組受到抑制。根據(jù)該結(jié)果，可確認(rèn)全身施用的MR16-1在耳蝸內(nèi)發(fā)揮藥效。
根據(jù)該結(jié)果和實(shí)施例2的結(jié)果，認(rèn)為通過(guò)實(shí)施例1所示的MR16-1的腹腔內(nèi)施用所致的抑制聽(tīng)力降低的作用機(jī)制是在由于聲音外傷后早期時(shí)的耳蝸內(nèi)的表達(dá)的白介素-6信號(hào)受到MR16-1的抑制的效果。
參考例1.人可溶性白介素-6受體的制備使用根據(jù)Yamasaki等人的方法(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)得到的含有編碼白介素-6受體的cDNA的質(zhì)粒pBSF2R.236，通過(guò)PCR法制備成可溶性白介素-6受體。將質(zhì)粒pBSF2R.236用限制性內(nèi)切酶Sph I消化，得到白介素-6受體cDNA，將該cDNA插入到mp18(Amersham制造)中。為了向白介素-6受體cDNA導(dǎo)入終止密碼子，使用設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸引物，通過(guò)體外誘變系統(tǒng)(Amersham制造)用PCR法向白介素-6受體cDNA導(dǎo)入突變。通過(guò)該操作，終止密碼子被導(dǎo)入到氨基酸345的位置，得到編碼可溶性白介素-6受體的cDNA。
為了在CHO細(xì)胞表達(dá)可溶性白介素-6受體cDNA，使它與質(zhì)粒pSV(Pharmacia制造)連接，得到質(zhì)粒pSVL344。向含有dhfr的cDNA的質(zhì)粒pECEdhfr插入用Hind III-Sal I切斷的可溶性白介素-6受體cDNA，得到CHO細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pECEdhfr 344。
用磷酸鈣沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)以10μg的質(zhì)粒pECEdhfr344轉(zhuǎn)染dhfr-CHO細(xì)胞株DXB-11(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)。將轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在含有1mM谷胺酰胺、10％透析FCS、100U/ml的青霉素以及100μg/ml的鏈霉素的不含核苷酸的αMEM選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)3周。
用極限稀釋法對(duì)選擇的CHO細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到單一的CHO細(xì)胞克隆。將該CHO細(xì)胞克隆在20nM～200nM濃度的氨甲蝶呤中進(jìn)行擴(kuò)增，得到可產(chǎn)生人可溶性白介素-6受體的CHO細(xì)胞株。將CHO細(xì)胞株5E27在含有5％FBS的Iscove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)液(IMDM、Gibco制造)中進(jìn)行培養(yǎng)?；厥张囵B(yǎng)上清，培養(yǎng)上清中的可溶性白介素-6受體濃度通過(guò)ELISA進(jìn)行測(cè)定。該結(jié)果確認(rèn)培養(yǎng)上清中存在可溶性白介素-6受體。
參考例2.抗人白介素-6抗體的制備將10μg的重組型白介素-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41)與弗氏完全佐劑一起免疫BALB/c小鼠，每隔一周繼續(xù)免疫直至血清中能夠檢測(cè)出抗白介素-6抗體為止。從局部淋巴節(jié)摘出免疫細(xì)胞，使用聚乙二醇1500，與骨髓瘤細(xì)胞株P(guān)3U1融合。根據(jù)Oi等人的使用HAT培養(yǎng)液的方法(Selective Methodsin CellularImmunology，W.H.Freeman and Co.，San Francisco，351，1980)選擇雜交瘤，建立產(chǎn)生抗人白介素-6抗體的雜交瘤。
產(chǎn)生抗人白介素-6抗體的雜交瘤可以象下述那樣進(jìn)行白介素-6結(jié)合分析。即、將以柔軟的聚乙烯制的96孔微量板(DynatechLaboratories，Inc.制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10μl/ml，Cooper Biomedical，Inc制Malvern，PA)于4℃下包被過(guò)夜。然后將板用含有100μl1％牛血清清蛋白(BSA)的PBS于室溫下處理2小時(shí)。
然后用PBS將板洗滌后，將100μl的雜交瘤培養(yǎng)上清加到各孔，于4℃下溫育過(guò)夜。洗滌板，按照2000cpm/0.5ng/well那樣向各孔添加125I標(biāo)記的重組型白介素-6，洗滌后，用γ計(jì)數(shù)器(Beckman Gamma9000，Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)測(cè)定各孔的放射活性。通過(guò)白介素-6結(jié)合分析，216個(gè)雜交瘤克隆中有32個(gè)雜交瘤克隆為陽(yáng)性。在這些克隆中最終得到穩(wěn)定的MH166.BSF2。該雜交瘤產(chǎn)生的抗白介素-6抗體MH166具有IgG1K亞型。
然后使用白介素-6依賴性的小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2，研究MH166抗體與雜交瘤增殖有關(guān)的中和活性。將MH60.BSF2細(xì)胞按照1×104/200μl/孔進(jìn)行分注，然后加含有MH166抗體的樣品，培養(yǎng)48小時(shí)，加0.5μCi/孔的3H胸腺嘧啶脫氧核苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。將細(xì)胞置于玻璃過(guò)濾紙上，用自動(dòng)收集器(Labo Mash Science Co.，Tokyo，Japan)處理。使用兔抗白介素-6抗體作為對(duì)照。
該結(jié)果表明MH166抗體容量依賴性地抑制由白介素-6誘導(dǎo)的MH60.BSF2細(xì)胞的3H胸腺嘧啶脫氧核苷摻入。由此表明MH166抗體可中和白介素-6的活性。
參考例3.抗人白介素-6受體抗體的制備根據(jù)附帶的配方使通過(guò)Hirata等人的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900-2906)制備成的抗白介素-6受體抗體MT18與用CNBr活化的瓊脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制，Piscataway，NJ)結(jié)合，純化白介素-6受體(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)。將人骨髓瘤細(xì)胞株U266用含有1％毛地黃皂苷(Wako Chemicals制)，10mM三乙醇胺(pH7.8)以及0.15MNaCl的1mM對(duì)氨基苯基甲烷磺酰氟鹽酸鹽(Wako Chemicals制)(毛地黃皂苷緩沖液)溶解，與結(jié)合在瓊脂糖4B顆粒的MT18抗體進(jìn)行混合。然后，將顆粒用毛地黃皂苷緩沖液洗6次，作為用于進(jìn)行免疫的部分純化的白介素-6受體。
用從3×109個(gè)U266細(xì)胞得到的上述部分純化白介素-6受體每隔10日免疫一次BALB/c小鼠，免疫4次，然后通過(guò)常規(guī)方法制成雜交瘤。通過(guò)下述方法研究來(lái)自成長(zhǎng)陽(yáng)性孔的雜交瘤培養(yǎng)上清與白介素-6受體的結(jié)合活性。將5×107個(gè)U266細(xì)胞用35S-蛋氨酸(2.5mCi)進(jìn)行標(biāo)記，用上述毛地黃皂苷緩沖液進(jìn)行溶解。將溶解的U266細(xì)胞與0.04ml容量的結(jié)合在瓊脂糖4B顆粒的MT18抗體混合，然后，用毛地黃皂苷緩沖液洗6次，用0.25ml的毛地黃皂苷緩沖液(pH3.4)將35S-蛋氨酸標(biāo)記白介素-6受體洗脫出，用0.025ml的1MTris(pH7.4)進(jìn)行中和。
將0.05ml的雜交瘤培養(yǎng)上清與0.01ml的Protein G瓊脂糖(Phramacia制)混合。洗滌后，將瓊脂糖與上述制備的0.005ml的35S標(biāo)記的白介素-6受體溶液一起溫育。通過(guò)SDS-PAGE對(duì)免疫沉淀物質(zhì)進(jìn)行分析，研究與白介素-6受體反應(yīng)的雜交瘤培養(yǎng)上清。該結(jié)果建立了反應(yīng)陽(yáng)性雜交瘤克隆PM-1(FERM BP-2998)。由雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體具有IgG1κ亞型。
使用人骨髓瘤細(xì)胞株U266研究雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體對(duì)白介素-6與人白介素-6受體結(jié)合的抑制活性。從大腸桿菌制備人重組型白介素-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41-45)、通過(guò)Bolton-Hunter試劑(New England Nuclear，Boston，MA)進(jìn)行125I標(biāo)記(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981)。
將4×105個(gè)U266細(xì)胞與70％(v/v)的雜交瘤PM-1的培養(yǎng)上清以及14000cpm的125I標(biāo)記的白介素-6一起培養(yǎng)1小時(shí)。將70μl的樣品鋪在400μl的微融合聚乙烯管的300μl的FCS上面，離心后，測(cè)定細(xì)胞上的放射活性。
該結(jié)果表明雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體抑制白介素-6與白介素-6受體的結(jié)合。
參考例4.抗小鼠白介素-6受體抗體的制備利用Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168-173所述的方法制備抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體。
將產(chǎn)生小鼠可溶性白介素-6受體的CHO細(xì)胞在含有10％FCS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使用在Affigel 10凝膠(Biorad制造)上固定了來(lái)自該培養(yǎng)上清的抗小鼠白介素-6受體抗體RS12的親和柱(參照上述Saito，T.et al)純化小鼠可溶性白介素-6受體。
將得到的小鼠可溶性白介素-6受體50μg與弗氏完全佐劑混合，注射到Wistar大鼠的腹部。2周后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行追加免疫。第45天時(shí)，獲取大鼠脾臟細(xì)胞，將2×108個(gè)細(xì)胞與1×107個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3U1使用50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制)通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合后，通過(guò)HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤。
將雜交瘤培養(yǎng)上清加到包被了兔抗大鼠IgG抗體(Cappel制造)的板后，使之與小鼠可溶性白介素-6受體反應(yīng)。然后，通過(guò)使用兔抗小鼠白介素-6受體抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG的ELISA法篩選產(chǎn)生小鼠可溶性抗白介素-6受體抗體的雜交瘤。確認(rèn)產(chǎn)生抗體的雜交瘤克隆進(jìn)行2次亞篩選，得到單一的雜交瘤克隆。將該克隆命名為MR16-1。
通過(guò)使用MH60.BSF2細(xì)胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951-956)的3H胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入研究該雜交瘤產(chǎn)生的抗體在小鼠白介素-6的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)中的中和活性。按照1×104個(gè)/200μl/孔那樣在96孔板中制備MH60.BSF2細(xì)胞。向該板加10pg/ml的小鼠白介素-6和MR16-1抗體或RS12抗體12.3～1000ng/ml，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)44小時(shí)后，加1μCi/孔的3H胸腺嘧啶脫氧核苷。于4小時(shí)后測(cè)定3H胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入。該結(jié)果表明MR16-1抗體抑制MH60.BSF2細(xì)胞的3H胸腺嘧啶脫氧核苷摻入。
因此表明雜交瘤MR16-1(FERM BP-5875)產(chǎn)生的抗體抑制白介素-6與白介素-6受體的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.含有白介素-6拮抗劑作為有效成分的內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑。
2.權(quán)利要求1所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述內(nèi)耳障礙是感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
3.權(quán)利要求2所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是梅尼埃病綜合癥、藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙、病毒性內(nèi)耳炎、化膿性內(nèi)耳炎、側(cè)頭骨骨折、聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)腫瘤導(dǎo)致的感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
4.權(quán)利要求2所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是突發(fā)性耳聾、老人性耳聾或噪音性耳聾。
5.權(quán)利要求1所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述內(nèi)耳障礙是前庭障礙。
6.權(quán)利要求5所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述前庭障礙是梅尼埃病綜合癥、前庭神經(jīng)炎或藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙導(dǎo)致的前庭障礙。
7.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述白介素-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體。
8.權(quán)利要求7所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的單克隆抗體。
9.權(quán)利要求8所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗人白介素-6受體的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求8所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體。
11.權(quán)利要求7～10任一項(xiàng)所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是重組型抗體。
12.權(quán)利要求9所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述抗人白介素-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
13.權(quán)利要求10所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
14.權(quán)利要求7～13任一項(xiàng)所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
15.權(quán)利要求14所述的治療和/或預(yù)防劑，其中，所述抗白介素-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。
16.白介素-6拮抗劑在制造內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述內(nèi)耳障礙是感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
18.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是梅尼埃病綜合癥、藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙、病毒性內(nèi)耳炎、化膿性內(nèi)耳炎、側(cè)頭骨骨折、聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)腫瘤導(dǎo)致的感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
19.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是突發(fā)性耳聾、老人性耳聾或噪音性耳聾。
20.權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述內(nèi)耳障礙是前庭障礙。
21.權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中，所述前庭障礙是梅尼埃病綜合癥、前庭神經(jīng)炎或藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙導(dǎo)致的前庭障礙。
22.權(quán)利要求16～21任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述白介素-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體。
23.權(quán)利要求22所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的單克隆抗體。
24.權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗人白介素-6受體的單克隆抗體。
25.權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體。
26.權(quán)利要求22～25任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是重組型抗體。
27.權(quán)利要求24所述的應(yīng)用，其中，所述抗人白介素-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
28.權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其中，所述抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
29.權(quán)利要求22～28任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
30.權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中，所述抗白介素-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。
31.治療和/或預(yù)防內(nèi)耳障礙的方法，包括向?qū)ο蠼o予白介素-6拮抗劑。
32.權(quán)利要求31所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述內(nèi)耳障礙是感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
33.權(quán)利要求32所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是梅尼埃病綜合癥、藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙、病毒性內(nèi)耳炎、化膿性內(nèi)耳炎、側(cè)頭骨骨折、聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)腫瘤導(dǎo)致的感覺(jué)神經(jīng)性耳聾。
34.權(quán)利要求32所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是突發(fā)性耳聾、老人性耳聾或噪音性耳聾。
35.權(quán)利要求31所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述內(nèi)耳障礙是前庭障礙。
36.權(quán)利要求35所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述前庭障礙是梅尼埃病綜合癥、前庭神經(jīng)炎或藥物誘導(dǎo)性內(nèi)耳障礙導(dǎo)致的前庭障礙。
37.權(quán)利要求31～36任一項(xiàng)所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述白介素-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體。
38.權(quán)利要求37所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的單克隆抗體。
39.權(quán)利要求38所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗人白介素-6受體的單克隆抗體。
40.權(quán)利要求38所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體。
41.權(quán)利要求37～40任一項(xiàng)所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是重組型抗體。
42.權(quán)利要求39所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述抗人白介素-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
43.權(quán)利要求40所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述抗小鼠白介素-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
44.權(quán)利要求37～43任一項(xiàng)所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述抗白介素-6受體的抗體是抗白介素-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
45.權(quán)利要求44所述的治療和/或預(yù)防方法，其中，所述抗白介素-6受體的人源化抗體是人源化PM-1抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有白介素－6拮抗劑，優(yōu)選含有抗白介素－6受體抗體作為有效成分的內(nèi)耳障礙治療和/或預(yù)防劑。
文檔編號(hào)A61P27/16GK1933854SQ20058000930
公開(kāi)日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者藤岡正人, 岡野洋尚詹姆斯, 小川郁, 岡野榮之, 神崎晶 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社, 學(xué)校法人慶應(yīng)義塾