專利名稱：耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的治療方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種將藥物混合物輸送到內耳以治療由耳蝸興奮性毒性(cochlear excitotoxicity)引起的耳鳴的方法，更具體地說，涉及將N-甲基-D-天門冬氨酸鹽(NMDA)受體拮抗劑局部施加到內耳以抑制出現(xiàn)急性、反復性或長期性或慢性耳蝸興奮性毒性后的以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異常活性，所述耳蝸興奮性由聽覺損傷、老年性耳聾、心肌缺血、缺氧、使用一種或多種特定的耳毒性藥物治療，以及突發(fā)性耳聾等所引發(fā)。
背景技術：
耳鳴，即沒有外部聲音刺激下卻感覺到聲音，是很常見的內耳紊亂。據估計，有860萬的美國人患有慢性耳鳴，占美國人口的3％(Centers for DiseaseControl and Prevention，Vital and Health Statistics，Series10，#200，Oct 1999)。根據美國言語聽力協(xié)會(American Speech-Language-Hearing Association，ASHA)，有一百萬甚至更多的人認為耳鳴妨礙了他們的正常生活(占美國人口的0.3％)。歐洲的人口研究估計7％至14％的人曾經與他們的醫(yī)生談論過耳鳴，而可能引致殘疾的耳鳴則出現(xiàn)在1％至2.4％的人群中(Vesterarger V.，British Medical Journal 314(7082)728-731(1997))。
盡管耳鳴的高發(fā)病率以及其對患者的健康和生活質量帶來嚴重的影響，目前還沒有真正有效的治療方法。目前的治療方法包括避免耳毒性藥物、減少對酒精、咖啡因和煙堿的食用、緩解壓力、使用背景噪聲，或者佩戴耳鳴罩(一些耳鳴罩同時結合了助聽器)、行為治療例如催眠、認知療法以及生物反饋、耳鳴再訓練療法(tinnitus retraining therapy，TRT)、藥理的以及其他輔助療法。
耳鳴不是一種疾病，而是一種與各種聽覺障礙有關的普通癥狀，就像疼痛與多種不同的疾病共存一樣。耳鳴常常與噪聲導致的聽覺損失、老年性耳聾以及梅尼埃病(Meniere disease，MD)有關(Nicolas-Puel et al.，InternationalTinnitus Journal 8(1)37-44(2002))。另外，不常見的原因包括受耳毒性藥物影響(氨基糖苷抗生素、大劑量的袢利尿劑、非類固醇類消炎藥(NSAID)以及某些化學療法藥)、供血下降(心肌缺血)、自體免疫處理、傳染病、傳導性聽覺損失、耳硬化癥、頭部損傷等。超過90％的病例中，耳鳴與已知原因的聽覺損失有關，超過70％的耳鳴發(fā)生在內耳中(Nicolas-Puel et al.，International Tinnitus Journal 8(1)37-44(2002))。
在過去的十年中，內耳病理生理學研究的主要進展導致確定了內毛細胞突觸復合體在耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的發(fā)展過程中所起的主要作用，耳蝸興奮性毒性是引起耳鳴的最常見原因。所謂興奮性毒性，最初的描述見Olney et al.，J.Neuropathol.Exp.Neuol.31(3)464-488(1972)，通常以谷氨酸的過量突觸釋放為特征，谷氨酸是中央神經系統(tǒng)以及聽覺系統(tǒng)中最重要的神經傳遞素。興奮性毒性刺激突觸后的谷氨酸受體(離子型和代謝型)，這引發(fā)了去極化(depolarization)和神經元興奮。但是，如果受體活性由于谷氨酸的過多釋放而變得過興奮，如興奮性毒性的情況，目標神經元會被損壞，最終會死亡(Puel J.L，Prog Neurobiol.47(6)449-76(1995))。
耳蝸興奮性毒性要么是由暴露在過大的噪聲中，如被劇烈的或重復的噪聲損傷(這會導致噪聲引起的聽力損失或耳聾)、突發(fā)耳聾或缺氧癥(心肌缺血)所引起(Pujol and Puel，Ann.NY Acad.Sci.884149-254(1999))，要么是由于使用一種或多種耳毒性藥物治療而引起。谷氨酸的過多釋放，要么是由于進入耳蝸的過大的聲音壓強而引起的聽覺損傷，要么是由于流入谷氨酸調節(jié)系統(tǒng)的血液減少而引起的缺氧/心肌缺血的突發(fā)耳聾。在所有的病例中，興奮性毒性都是以兩步機制為特征首先，由離子型谷氨酸受體作為媒介的I型傳導樹突出現(xiàn)劇烈膨脹，導致突觸后結構的破壞和功能的損失。在接下來的5年中，能觀察到突觸修復(新近突觸發(fā)生，neo-synaptogenesis)以及完全恢復的或部分恢復的耳蝸電勢(Puel et al.，Acta Otolaryngol.117(2)214-218(1997))。在興奮性毒性的第二階段，在強烈的或反復的損傷之后，興奮性毒性加強，Ca2+的進入導致的一連串代謝活動，導致了螺旋節(jié)神經元(ganglionneurous)的神經元死亡。
耳蝸興奮性毒性可包括突出后結構的破裂過程中的耳鳴，還包括在該破裂不是晚期的情況下，接下來在內毛細胞突觸復合體的新近突觸發(fā)生(Puel etal.，Audiol.Neurootol.7(1)49-54(2002))。興奮性毒性之后的功能恢復的主要任務由NMDA受體承擔，NMDA受體與生理條件下的聽覺神經纖維的活性無關(Puel et al.，Audiol.Neuroootol.7(1)49-54(2002))，但其在新近突觸發(fā)生的過程中被增量調節(jié)(up-regulated)(Puel et al.，C.R.Acad.Sci.III.318(1)67-75(1995))，這主要是因為它們的高鈣(Ca2+)滲透性(Sattler and Tymianski，Mol.Neurobiol.24(1-3)107-129(2001))。正如在動物模型的耳蝸突觸間隙修復機制中所表明的，通過局部使用NMDA受體拮抗劑D-AP5(D-2-氨基-5-磷酸基戊酸)來阻卻NMDA受體，延遲了聽覺樹突(dendrite)的功能性恢復和再生(Gervais D’Aldin et al.，Int.J.Dev.Neurosci.15(4-5)619-629(1997))。因此可以概括出，谷氨酸以其作為快速興奮的神經傳遞素的功能，通過NMDA受體的活化作用承擔親神經的角色。
據推測，耳蝸興奮性毒性引起的NMDA受體nRNA的增量調節(jié)與聽覺神經纖維的異常的自發(fā)“沖動”(firing)有關，這種“沖動”可理解為耳鳴(PuelJ.-L.et al.，Audiol.Neurootol.7(1)49-54(2002))。在新近突觸產生(neo-synaptogenesis)的過程中，傳入樹突(afferent dendrites)處于臨界狀態(tài)，從而容易被NMDA受體的活化而導致興奮。要避免這種傳入樹突興奮，以及因為不完整的新近突觸產生而無限地持續(xù)下去所產生的耳鳴，應當尋找一種特別拮抗NMDA受體的治療方法。如上所述，將NMDA受體拮抗劑局部施用到耳蝸，能防止聽覺損傷或心肌缺血引起的興奮性毒性(Duan et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.USA97(13)7595-7602(2000)；Puel，Prog.Neuobiol.47(6)449-476(1995)；Puel et al.，J.Comp.Neurol.341(2)241-256(1994))。盡管也可以采用2-氨基-3-(3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸)丙酸酯(AMPA)或者克他命受體拮抗劑來阻卻興奮性毒性，因為傳入樹突的急性膨脹主要通過它們(這兩種受體)來進行的(Puel et al.，J.Comp.Neurol.341(2)241-256(1994))，但是這種方法對聽覺功能有潛在的重大負面影響。因為內毛細胞和聽覺神經纖維之間的興奮性神經傳導的主要媒介是AMPA偏好受體(preferringreceptor)(Ruel et al.，J.Physiol.London 518667-680(1999))，這種阻卻不僅抑制不想得到的聽覺神經的過刺激，也抑制了想得到的正常興奮，從而導致聽力損失。
目前，耳鳴發(fā)生過程中NMDA受體的這種推論僅僅被使用水楊酸而致耳鳴的行為模型在體內進行了測試和演示(Guitton et al.，J.of Neuroscience23(9)3944-3952(2003))。這種行為模式用于測量耳鳴，因為耳鳴是不能直接觀察的。這種行為模式基于主動回避模式(active avoidance paradigm)動物聽到特定的聲音時，會條件性地跳到支桿上。即使不存在外部聲音的情況下，施用水楊酸也導致跳躍次數的顯著增加，這表明(動物)感覺到了耳鳴。通過圓窗膜將NMDA拮抗劑MK-801、7-CK(7-氯化犬尿氨酸脢)和Gacyclidine(一種N-甲基D-天門冬氨酸受體拮抗劑)施用到動物的耳蝸后，假陽性反應的次數顯著下降，這表明耳鳴得到了抑制。
雖然這些結果第一次證實了NMDA受體在發(fā)生耳鳴時的推測性牽連，但是這些結果不能確定地推廣到所有類型的內耳紊亂，因為水楊酸致耳鳴是非常特殊的耳鳴形式。一個世紀前，就已經知道，大量服用阿司匹林(aspilin)的活性組分水楊酸會導致耳鳴(Cazals Y.，Prog.Neurobiol.62583-631(2000))。水楊酸可能會引起耳鳴的感覺，與耳蝸興奮性毒性或者其他不同病因一樣，這種耳鳴通常是可逆的，和基于特定的分子機制。除了水楊酸外，采用甲滅酸(Mefenamate)，一種非常有名的環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑，也會增加假陽性反應的次數，這表明水楊酸致耳鳴與抑制環(huán)氧化酶的途徑有關。雖然耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴是谷氨酸層疊的結果，以導致NMDA受體的nRNA的增量調節(jié)過程為媒介；但是水楊酸致耳鳴以花生四烯酸(arachidonic acid)代謝的變化為媒介(例如，見Cazals Y.，Prog.Neurobiol.62583-631(2000))。已經表明，水楊酸抑制環(huán)氧化酶的活性(例如，見Vaneand Botting，Am.J.Med.1042S-8S(1998))。有證據表明花生四烯酸加強了NMDA受體的電流(Miller et al.，Nature 355722-725(1992)；Horimoto et al.，NeuroReport72463-2467(1996)；Casado and Ascher，J.Physiol.513317-330(1998))。電生理學研究已經表明花生四烯酸在多種系統(tǒng)中增加了NMDA受體開放通道的概率，包括小腦顆粒細胞、解離的椎體細胞/皮層神經元以及腦片(hippocampal slice)(例如，見Miller et al.，Nature 355722-725(1992)；Horimoto et al.，NeuroReport2463-2467(1996)；Yamakura and Shimoji，Prog.Neurobiol.59279-298(1998))。與興奮性毒性引起的耳鳴不同，水楊酸致耳鳴中，內毛細胞突觸復合體尤其是突觸末端沒有形態(tài)上的毀壞。
發(fā)明人為Sands的美國專利No.5,716,961公開了施用特定的NMDA受拮抗劑來治療耳鳴。在細胞培養(yǎng)中演示了谷氨酸興奮性毒性的神經保護屬性。但是，沒有在病例生理學條件下示出化合物在體內的藥物活性和功效，就是說，它與耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴沒有關系。鑒于內毛細胞突觸復合體的復雜性，必須認為這是嚴重的不足。此外，Sands提倡口服NMDA受體拮抗劑，僅僅在病人無法吞咽或者口服的通道損壞的情況下討論過局部施用。所述局部施用是采用“溶液、洗劑、藥膏、涂油膏等”的形式。
全身施用NMDA受體拮抗劑來治療內耳紊亂通常是無效的，因為耳蝸像大腦一樣被生物屏障保護著。因此，為達到希望的治療效果，需要相當大的劑量，但是NMDA受體拮抗劑的各種潛在副作用例如學習、記憶或運動性的顯著下降，限制了最大的允許劑量。對使用NMDA受體拮抗劑治療CNS紊亂人體的許多研究表明，全身施用后的血漿水平比動物模型中需要最大神經保護的血漿水平低，由于大量的潛在CNS不利作用、緊張癥、血壓升高和麻木，必須限制其臨床用量(Kemp and McKernan，Nature Neuroscience5，supplement1039-1042(2002))。換句話說，已經表明，局部施用NMDA受體拮抗劑卡羅維林(caroverine)到耳內上，導致更高的耳蝸內濃度，同時避免了全身施藥中所遇到的血漿和腦脊髓液中較高的次級濃度(Chen et al.，Audiol.Neurootol，849-56(2003))。
發(fā)明人為Zenner的美國專利No.6,066,652公開了一種通過施用金剛烷(adamantane)治療耳鳴的方法，金剛烷是公知的NMDA受體拮抗劑。該發(fā)明人應用了全身施藥的臨床研究得出的結果，在治療期間，這種全身施藥減少了耳鳴。用于解釋這些結果的推測集中在外毛細胞和突出前細胞(presynapse)，沒有具體地包括NMDA受體的作用。
雖然有一些跡象支持這個推測NMDA受體在耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴中起著重要的作用，但是前面的討論表明其中的分子機制還是不清楚的，因此，不能可靠地預測使用NMDA受體拮抗劑是否會有效地阻止特定類型的耳鳴。從而，還需要更多的關于耳鳴產生的病理生理學研究，來證實這種假定以及研發(fā)出具體的真實有效的治療方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及預防和/或治療人體中由耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的方法。該方法包括給人體施用有效治療量的藥物成分，該藥物成分包括NMDA受體拮抗劑。在治療耳鳴的方法中，所施用的NMDA受體拮抗劑有效地抑制或減少受療人體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異常活性。在防止耳鳴的方法中，所施用的NMDA受體拮抗劑有效地預防受療人體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異常活性。所述耳蝸興奮性毒性由以下原因引起聽覺損傷、老年性耳聾、心肌缺血、缺氧、使用一種或多種特定的耳毒性藥物治療、突發(fā)性耳聾以及其他的耳蝸興奮性毒性誘變的發(fā)生。


下面將結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中圖1是對照動物(聽覺)損傷后7天的CAP(compound action potential，復合動作電位)測量結果。通過記錄損傷后7天的CAP測量評估聽覺損傷引起的聽力損失。聽覺損傷后第七天在10kHZ上觀察到的永久性聽力損失(Permanent Threshold Shift，PTS)最大值是13dB±2.0。
圖2是對照動物在聽覺損傷后的假陽性反應的得分。其中，(A)聽覺損傷導致正確地響應聲音刺激的行為的次數下降，隨著時間的過去，出現(xiàn)了部分的恢復，反映出所導致的聽力損失；(B)被測試動物在聽覺損傷后假陽性反應的次數不一致，組1的動物沒有體驗到耳鳴，組2的動物僅僅短暫地體驗到耳鳴，而組3則短暫地而后永久地體驗到耳鳴。
圖3表明與聽覺損傷引起的聽力損失有關的毛細胞損失對耳鳴的產生不起重要作用。正如(A)中損傷后快速恢復的得分所示，在急性的聽覺損傷后使用D-JNKI-1治療防止了聽力損失；但是在預防耳鳴方面沒有顯著效果，因為(B)中為不曾治療過的動物的耳鳴的趨勢(prevalence)和模式與試樣在本質上是一樣的。
圖4示出了局部施用NMDA受體拮抗劑7-CK到圓窗膜，預防了耳鳴。(A)平均的行為得分從第0天到第1天下降，隨后恢復；但這種提高比未治療動物的要慢。(B)局部施用NMDA受體拮抗劑7-CK導致了抑制耳蝸興奮性毒性引起的永久性耳鳴，僅僅能觀察到暫時耳鳴。
圖5示出了局部施用NMDA拮抗劑S-(+)-克他命到圓窗膜，導致預防了永久性耳鳴。(A)平均的行為得分從第0天到第1天下降，隨后恢復；但這種提高比未治療動物的要慢。(B)局部施用NMDA拮抗劑S-(+)-克他命導致了抑制耳蝸興奮性毒性引起的永久性耳鳴，僅僅能觀察到暫時耳鳴。
圖6示出了聽覺損傷對感官的外毛細胞(out hair cell，OHC)以及內毛細胞(inner hair cell，IHC)的突觸復合體產生了真實的形態(tài)上的破壞，但是施用水楊酸卻不導致這種坡壞。注射水楊酸2天后，OHC和IHC的靜纖毛(stereocilia)保持完整(6A)，而遭受聽覺損傷的動物，OHC靜纖毛顯示出嚴重的損壞，IHC靜纖維也出現(xiàn)了混亂，甚至在一些個例中還出現(xiàn)了溶化(如黑色箭頭所示)(6D)。IHC突觸復合體的放大圖表明，在水楊酸治療的個例中沒有超微異常(6N)，但是，在損傷的動物中，在受影響的頻率范圍區(qū)內的IHC的基極上，發(fā)現(xiàn)了大量的、顯著地膨脹的放射狀傳入樹突(如星號所示)，這證實了興奮性毒性的出現(xiàn)(6E)。要注意，IHC的頂部出現(xiàn)了大量的液泡，以及畸變的靜纖毛(如箭頭所示)。IHC基極的高度放大圖表明水楊酸治療的動物沒有出現(xiàn)異常(6C)。兩個傳入神經末梢(用a1和a2表示)是正常的，典型的突觸前體(presynaptic body)神經末梢a2是清晰可見的。與此相反，(6F)顯示出膨脹的(a1)和混亂的(a2)神經末梢，以及朝向a2的突觸前體。A和D的比例標尺(scale bar)是10um(掃描電子顯微鏡)；B和E的是5um，C和F的是0.25um(透射電子顯微鏡)。
圖7是暴露在水楊酸或聽覺損傷后的NMDA受體的NR1亞單元的表達，用蛋白質印跡免疫法(Western Blot immunodetection)測定。能夠看到，水楊酸治療不會導致NR1 NMDA受體亞單元表達的顯著變化(比對照動物高4％)。相反，聽覺損傷在發(fā)生5后導致清晰的表達(比對照動物高50％)，這與觀察到永久性耳鳴是一致的。但是，聽覺損傷24小時后，沒有可檢測的顯著的過表達(高8％)，這表明臨時性耳鳴和永久性耳鳴的機制是根本不同的。在對照動物的大腦進行的免疫印跡，證實了大腦中和耳蝸中的NR1亞單元的分子量是相同的。
具體實施例方式
本發(fā)明是基于由耳蝸興奮性毒性引起的動物模型的耳鳴試驗結果。本發(fā)明涉及藥物化合物尤其是NMDA受體拮抗劑的使用。為不受理論的束縛，相信本發(fā)明的NMDA受體拮抗劑能將NMDA受體束縛在它的其中一個束縛位置，從而阻卻(部分地或完全地)了所述受體的離子通道的開口。NMDA受體被復雜的方式激活，從而需要谷氨酸和甘氨酸束縛來打開離子通道和允許鈣的進入(Kemp and McKernan，Nature Neuroscience5，supplement1039-1042(2002))。谷氨酸擔任神經傳遞素的角色，因為谷氨酸是以活性依賴的方式從突觸前末端被釋放出來的；而甘氨酸作為調節(jié)器，它以更恒定的水平存在于細胞外液中。NMDA受體的離子通道被鎂電位調控地阻卻，而去極化作用又消除了該阻卻。三個拮抗劑位置之一的NMDA受體拮抗劑的束縛結果，導致部分地或完全地阻卻NMDA受體，從而阻卻或減小了離子通道的開口以及神經元的去極化。NMDA受體拮抗劑抑制了由增量調節(jié)的NMDA受體引起的聽覺神經的異常興奮，這種異常興奮會伴隨著耳蝸興奮性毒性，并且NMDA受體拮抗劑也降低或消除了耳鳴的感覺。隨著NMDA受體拮抗劑的輸送，NMDA受體不再被增量調節(jié)。通過明確地以僅僅在生理條件下被增量調節(jié)的NMDA受體為目標來抑制以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異常活性，能避免不想得到的對聽覺的副作用，因為正常的聽覺神經傳導主要以AMPA受體為媒介。
在本發(fā)明的一個實施例中，涉及一種治療人體中由耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的方法。該方法包括給病人施用有效治療量的含有NMDA受體拮抗劑的藥物成分。施用一定量的NMDA受體拮抗劑一段時間后，能有效地抑制或降低需要治療的人體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異常活性。聽覺神經的這種以NMDA受體為媒介的異常活性的抑制或降低，抑制或降低了受治療個體的耳鳴。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，在人體耳蝸出現(xiàn)興奮性毒性誘導作用之時或之后施用NMDA受體拮抗劑。
在本發(fā)明的另一個實施例中，涉及一種預防人體出現(xiàn)由耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的方法。該方法包括給人體施用有效治療量的含有NMDA受體拮抗劑的藥物成分。在該方法中，以一定劑量施用NMDA受體拮抗劑一段時間后，有效地預防需要治療的個體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異?；钚?。通過預防以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異?；钚?，預防了被治療個體的耳鳴。在本方法的一個優(yōu)選實施例中，在人體耳蝸出現(xiàn)興奮性毒性誘導作用之時或之前施用NMDA受體拮抗藥。本發(fā)明的目標是預防和/或治療由耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴。本發(fā)明并不要求由特定類型的耳蝸興奮性毒性來激發(fā)耳鳴，僅僅要求出現(xiàn)激起的耳蝸興奮性毒性和誘導耳鳴。在預防和/或治療耳鳴時，不需要知道出現(xiàn)耳蝸興奮性的本質。被預防和/或被治療的耳鳴可以是急性的、亞急性的或慢性的。
業(yè)內已經知道，耳鳴由聽覺損傷、老年性耳聾、心肌缺血、缺氧、使用一種或多種特定的耳毒性藥物治療和/或突發(fā)性耳聾之后的耳蝸興奮性毒性所引起。這里以由聽覺損傷引起的耳鳴的預防為例子。本領域內的技術人員將高度確定性地預測到，這里提供的方法在預防和/或治療耳鳴方面是有效的，不僅僅包括由聽覺損傷引起的耳鳴，還包括由老年性耳聾、心肌缺血、缺氧、使用一種或多種特定的耳毒性的藥物進行的治療和/或突發(fā)性耳聾引起的耳鳴，因為由這些原因引起的耳鳴具有共同的引發(fā)機制(mechanistic cause)。所述聽覺損傷、老年性耳聾、心肌缺血、缺氧、使用一種或多種特定的耳毒性藥物治療和/或突發(fā)性耳聾可以是以急性、反復性、長期性為特征的。本領域的技術人員將預測到，本發(fā)明的方法在預防和/或治療由聽覺損傷、老年性耳聾、心肌缺血、缺氧、使用一種或多種特定的耳毒性藥物治療和/或突發(fā)性耳聾之外的原因引起的耳鳴是有效的，只要耳鳴是由耳蝸興奮性毒性引起的。由這些原因導致的耳蝸興奮性毒性可以表征為急性的、反復性的或長期性的，取決于耳蝸興奮性毒性出現(xiàn)的持續(xù)時間。
用在本發(fā)明的范圍的詞語“耳毒性藥物”是指在治療性服藥時能通過耳蝸興奮性毒性引起耳鳴的任何的化合物。出現(xiàn)耳蝸興奮性毒性是施用耳毒性藥物的副作用，這些藥物通常作為治療性化合物施用，所治療的病情可能與聽覺或聽覺感知無關。例如，具有這些特性的耳毒性藥物包括氨基糖苷抗生素(aminoglycoside antibiotics)以及化療劑如順鉑(cisplatin)等。業(yè)內已經知道，使用這些具有耳蝸興奮性毒性的耳毒性藥物與出現(xiàn)耳鳴有關，但是在本發(fā)明之前，沒有有效的療法。這些藥物的使用因為它們的耳毒性副作用而被限制，因此，減少這些副作用的方法將使這些藥物在治療中的到更廣泛的使用。
化合物根據本發(fā)明的方法所施用的藥用化合物的分子包括選擇性的NMDA受體拮抗劑，該NMDA受體拮抗劑將NMDA受體束縛在離子通道中的競爭性(competitive)NMDA拮抗劑束縛位點、非競爭性NMDA拮抗劑束縛位點，或者甘氨酸位點。示范性的化合物包括但不限于艾芬地爾(ifenprodil)、克他命(Ketamine)、金剛胺(memantine)、地佐環(huán)平(dizocilpine)(MK-801)、gacyclidine(一種N-甲基D-天門冬氨酸受體拮抗劑)、traxoprodil(一種非競爭性的NMDA拮抗劑)、D-2-氨基-5-磷酸基戊酸(D-AP5)、3±2-羥基哌嗪丙基磷酸(CPP)、芋螺睡眠肽(conantokin)(競爭性NMDA拮抗劑)、7-氯化犬尿氨酸脢(7-CK)以及利可替奈(Licostinel)(甘氨酸位點拮抗劑)。本發(fā)明使用的NMDA拮抗劑可以是NMDA拮抗劑的任何派生體、結構衍生物和/或異構體，它們保持著NMDA拮抗劑的功能。本發(fā)明的方法所施用的化合物可包括一種或多種NMDA拮抗劑。
本發(fā)明優(yōu)先將芳基環(huán)烷基胺(Arylcycloalkylamines)作為NMDA拮抗劑。各類芳基環(huán)烷基胺中，優(yōu)選具有通式I的化合物(保持著NMDA拮抗劑的功能) 其中，R1、R2、R3、R4和R5獨立地為H、Cl、F、I、CH3、CH2CH3、NH2、OH或COOH，而R6和R7獨立地為H、CH3、CH2CH3、OH、Cl、F、或I。
優(yōu)選的芳基環(huán)烷基胺是克他命(Ketamine，也稱氯胺酮)(C13H16CINO(自由基)，2-(2-氯苯基)-2-(甲氨基)-環(huán)己酮)。由通式II表示的結構分子可用作NMDA拮抗劑 克他命的任何的派生體、結構衍生物和/或異構體，或者由通式II或I定義的芳基環(huán)烷基胺化合物，都可以用作NMDA拮抗劑。
克他命是非競爭性的NMDA受體拮抗劑，它束縛在PCP束縛位點，也就是離子通道中的NMDA受體復合體的一個獨立位點，從而阻卻了離子流的跨膜(tranmembranous)。可通過US 3,254,124所公開的方法來獲得克他命。更具體地，優(yōu)選的化合物是(S)-克他命，因為它使用比(R)-克他命大3-4倍的吸力束縛在NMDA受體的PCP束縛位點(Vollenweider et al.，Eur.Neuropsychopharmacol.725-38(1997))。光學異構體的合成可以根據專利DE2062620或WO01/98265來實施，這里參考并引用了該專利。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，克他命可以以其自由基形式的鹽酸鹽(hydrochloride salt)C13H17ClNO(鹽酸克他命)來施藥。
本發(fā)明優(yōu)選的其他化合物屬于保持NMDA拮抗劑功能的替代性chinanolines類。在本發(fā)明中，具有以下的通式III的chinanolines化合物優(yōu)先作為NMDA拮抗劑 其中，R’1、R’2、R’3和R’4獨立地是H、Cl、F、I、CH3、NH2、OH或COOH，R’5和R’6獨立地是COOH、OH、CONH2、H、CH3、CH2CH3、OH、Cl、F，或I。
在各類喹唑啉中，最好是7-氯化犬尿氨酸脢(7-CK)。7-CK由下面的結構分子式IV表示 根據分子式IV的7-CK的任何派生體、結構衍生物和/或異構體，或者由分子式III定義的其他化合物，都可用于本發(fā)明的方法中。
施藥及其配方可通過口服、靜脈注射、皮下注射、腹膜內給藥、肌肉注射、直腸給藥或局部給藥來完成藥物的輸送，其中，優(yōu)選在內耳進行局部給藥，因為全身用藥會引起不想要的副作用。本領域的技術人員應當知道，在本發(fā)明中NMDA拮抗劑的施用還可以采用其他方式。本發(fā)明中，施藥的唯一要求就是含有NMDA拮抗劑的有效治療量的藥物成分要能夠到達患病人體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異?；钚缘奈稽c。
可通過各種施藥技術來將化合物送服到內耳。這些給藥技術包括使用設備或者制劑載體將化合物以靶標造型輸送和/或送服到圓窗和卵圓窗(ovalwindow)的膜上，化合物在該膜上彌散到內耳中，或者被活性地吸收。實例如耳芯(otowick)(詳見美國專利6,120,484，發(fā)明人為Silverstein)、卵圓窗導管(詳見美國專利5,421,818；5,474,529；5,476,446；6,054,528；發(fā)明人均為Areberg，或者美國專利6,377,849及其分案2002/008255，發(fā)明人Lenarz)，或者其他類型的凝膠體、泡沫、纖維或其他載體制劑，它們被放置在卵圓窗位置或卵圓窗上，裝載所述化合物以穩(wěn)定地釋放(見WO 97/383699，發(fā)明人為Manning；Silverstein et al.，Otolaryngology-Head and Neck Surgery 120(5)649-655(1999)；Balough et al.，Otolaryngology-Head and Neck Surgery 119(5)427-431(1998))。其中還包括使用插入到耳蝸管或者耳蝸任何部分的設備(例如，見美國專利6,309,410，發(fā)明人為Kuzma)。還可以通過內淋巴囊注射來送服所述化合物，其中，將所述化合物的溶液或載體填在中耳或者中耳的某些部位(見Hoffer et al.，Otolaryngologic Clinics of North America 36(2)353-358(2003))。給內耳施藥的優(yōu)選方法是在卵圓窗膜上擴散，從中耳位置相對容易到達卵圓窗膜，并不允許觸及內耳，從而避免了耳蝸內液滲漏的潛在問題。
本發(fā)明的藥用成份中所包含的化合物可能以制藥上可接受的鹽的形式提供。例如，所述的鹽包括但不局限于采用有機酸(例如，乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、?，斔?formaric)、酒石酸、硬脂酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、甲基磺酸、對甲苯磺酸或雙羥萘酸)形成的鹽，以及使用無機酸(例如，鹽酸、硝酸、二磷酸、硫酸、磷酸)形成的鹽，以及聚合酸(例如鞣酸、羧甲基纖維素、聚乳酸、聚乙二醇酸或者羧甲基纖維素-羥基乙醇酸的共聚體)制成的鹽。
對于本發(fā)明的任何的施藥途徑，藥用成分中含有有效治療量的活性成分，以及藥學上可接受的必需的有機或無機的、固體或液體的載體。適用于局部施藥到內耳的藥用成分包括水溶液或懸浮液。例如，單獨包含活性成份或者包含活性成分以及載體的凍干分子，應該在使用前制成水溶液或懸浮液。所述藥用成分還包括凝膠體，這些凝膠體可以是生物可分解的或者生物不可分解的，水溶液的或非水溶液的，或者基于微球體的。凝膠體的例子包括但不限于聚二醇醚共聚物(poloxamers)、透明質酸鹽(hyaluronate)、芳基糖(xyloglucans)、殼聚糖(chitosans)、聚酯、聚交酯、聚交乙酯或它們的共聚PLGA、蔗糖乙酸酯異丁酸酯，以及單油酸甘油酯(Glycerol monooleate)。適用于腸內施藥或者腸胃外施藥的藥用成分包括藥片或膠囊，或者如上所述的水溶液和懸浮液。
所述藥用成分可以是已滅菌的和/或可以含有佐劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑和/或乳化劑、用于調節(jié)滲透壓力的鹽和/或緩沖劑。如果愿意，本發(fā)明的藥用成分還含有其它的藥用活性材料。本發(fā)明的藥用成分可通過制藥領域內公知的方法制備，例如，通過常規(guī)的混合、粒化、調制、溶解或凍干等方法。它們的含量從0.01％左右至100％，優(yōu)選0.1％左右至50％(凍干劑中高達100％)的活性材料。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，藥用成分被配制用于局部施用。耳部施藥的恰當工具是有機物質或無機物質，這些物質是藥學上可接受的并且不會與活性化合物發(fā)生反應，例如生理鹽水、酒精、植物油、苯甲醇、亞烴基、聚乙二醇、三乙酸甘油酯、凝膠、醣類如乳糖或淀粉、鎂、硬脂酸鹽、云母或礦脂。所指的制備可以是消毒和/或包括輔助材料如潤滑劑、防腐劑如硫柳汞(例如，占50％)、穩(wěn)定劑和/或潤濕劑、乳化劑、用于改變滲透壓力的鹽、緩沖液材料、著色劑和/或芳香材料。
如果需要，所述藥用成分也包括一種或多種其他的活性成分。根據本發(fā)明的近耳成分(otic composition)可以包括各種成分，包括生物活性劑如抗生素，例如氟化恩蓖類抗生素(Fluoroquinolone)、消炎劑如類固醇、可的松、止痛劑、苯坐卡因、普魯卡因等。
本發(fā)明的用于局部施藥的組合物可含有其他的藥學可接受的成分。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所選擇的局部賦形劑在給耳部施藥時不會增強將藥劑向體循環(huán)或中央神經系統(tǒng)中的輸送。例如，一般而言，局部賦形劑最好不具有堅實的閉合特性，堅實的閉合特性會增強通過粘膜經皮到體循環(huán)的傳輸。這些閉合媒介物包括烴基、無水吸收基如親水礦脂和無水羊毛脂(如氯磺水楊)，以及油包水乳化基如羊毛脂和冷霜。更優(yōu)選的媒介物是實質性非閉合的，通常包括那些可水溶的媒介物，例如水包油乳化基(乳酪或親水藥膏)和水溶基如聚乙二醇基的媒介物，以及與各種制劑如甲基纖維素、羥基纖維素以及羥基-甲基纖維素凝膠的親水溶液(如KY凝膠)。
對本領域內的技術人員來說，合適的局部賦形劑和媒介物都可為特定的用途而固定地選擇，具體參考領域內多種標準原文，例如Remington’sPharmaceutical Sciences，Vol.18，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)，其中特別是第87章。例如，根據本發(fā)明的生物活化劑能夠與增強藥劑滲透性的增強劑組合。
這種化合物可以在被興奮性毒性引起耳鳴之前、之時或之后施用。施用量根據施用方法、療程、受療者狀況而變化。耳鳴的嚴重程度以及所使用的特定化合物的功效、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、施藥時間和施藥途徑、排泄率以及藥物組合最終由主治醫(yī)生決定。療程從1小時至幾天、幾星期或者幾個月，可能會延長為慢性治療。將要被輸送的化合物的有效治療量從0.1毫微克每小時到大約100毫微克每小時。本發(fā)明的材料類似于其他以口服的化合物一樣正常施用。例如，可以施用一定量的克他命(ketamine)以治療耳鳴，優(yōu)選地，劑量約為10ug/30ml到10000ug/30ml，最好是500ug/30ml到10000ug/30ml，或者每劑大約0.01-2μg。關于局部施藥的用語“劑量”，是指在單療程中施用的藥劑量。例如，施加到耳部的每兩滴藥液大約含有0.05-1ug的克他命。這里提到的其他抗耳鳴劑可以根據藥效而施用。
有效治療劑量被定義為有效地抑制或減少受療人體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異?；钚缘牧?。有效治療量也被定義為有效地抑制或減輕受療人體的耳鳴的量。如上所述，有效治療量隨著治療所用的特定NMDA拮抗劑以及施用方法的選擇而變化。例如，以靜脈注射的NMDA拮抗劑比將相同的藥用成分局部施加到耳部的卵圓窗膜或者卵圓窗需要更大的劑量。此外，在本發(fā)明的NMDA拮抗劑使用更高的束縛吸力來束縛NMDA受體，所需要的量比使用更低吸力來束縛NMDA拮抗劑所需的量要小。因此，優(yōu)選那些使用更高束縛吸引力來束縛NMDA受體的NMDA拮抗劑。如上所述，(S)-克他命在束縛NMDA受體的PCP束縛位點時，吸力比(R)-克他命高3～4倍(Vollenweider et al.，Eur.Neuopsycopharmacol.725-38(1997))，本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用這種(S)-克他命。療程根據打算治療的耳鳴的形式——急性、亞急性、慢性而不同。作為指導，停止治療是指耳鳴沒有復發(fā)，短療程是優(yōu)選的和足夠的。對于在短療程之后，耳鳴依然存在的人體，應該使用更長的療程。
類似的，這里所公開的用于治療或預防耳鳴，尤其是耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴(如這里所述)的方法，允許使用有效治療量的含有NMDA受體拮抗劑的藥物成分來制造用于治療或預防耳鳴尤其是耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的藥物，所述NMDA受體拮抗劑能有效地抑制或減少人體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異?；钚?。優(yōu)選使用芳基環(huán)(arylcycloalkylamines)和喹唑啉類(chinazolines)的化合物，更優(yōu)選使用通式I或III的化合物，特別優(yōu)選從克他命、7-氯化犬尿氨酸脢、D-AP5、MK801以及gacyclidine中選出的NMDA受體拮抗劑。此外，優(yōu)選使用根據本發(fā)明的藥物成分，這些藥物成分為局部施藥而配制，特別是通過溶液、凝膠或者其他受控制的緩釋劑型、藥膏或乳酪或者藥物擴散傳輸技術的方式，經由圓窗膜或者卵圓窗膜局部地施藥到內耳，或者直接施藥到內耳。
實施例1方法和材料我們研究和試驗動物模型的由耳毒性興奮性毒性引起的耳鳴，這種耳鳴由聽覺損傷引起。因為一般而言耳鳴是無法直接觀察到的，因為不是所有的個體的聽覺損傷都導致耳鳴，而且耳鳴的感覺可在發(fā)生興奮性毒性的幾個小時候小時后小時或者永遠保持下去，這種動物模型的定義和實施是很大的挑戰(zhàn)。例如，這些需要考慮的事情，包括需要更多的動物以獲得足夠數量的耳鳴病例以進行研究，以及允許對耳鳴觀察一段時間。因為不清楚由耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴病例是否會持續(xù)，所以建議在耳鳴的早期進行研究。
試驗分兩個階段來實行。首先，在施加治療化合物的情況下，評估急性的聽覺損傷后的聽力損失以及所出現(xiàn)的耳鳴。第二階段，試驗這三種藥物化合物在抑制耳鳴方面的效果S-(+)-克他命，它是NMDA受體拮抗劑(Sigma-Aldrich公司)；7-氯化犬尿氨酸脢(7-CK；Sigma-Aldrich公司)，它是另一種NMDA受體拮抗劑，之前在水楊酸致耳鳴的模型中進行過試驗(Guitton et al.，J.of Neuroscience 23(9)3944-3952(2003))，可供參考；以及D-JNKI-1，一種c-Jun N-末端激酶的縮氨酸抑制劑(Xigen S.A.公司)，它顯示出拮抗由聽力損失導致聽覺發(fā)細胞死亡和聽力損失(Wang et al.，J.ofNeuroscience 23(24)8596-8607(2003))。第一階段(即，不使用藥物化合物的階段)的試驗結果作為對照。
動物實驗在Long-Evans鼠上實施，因為它們比其他鼠有更高的運動能力。在實驗時，在恒溫下將動物一個一個單獨地關在籠里，為時一個白天/晚上，即12/12小時。在黑暗階段(dark phase)，也就是動物活動的一般周期內，每天在大概相同的時間里對每個動物的所有行為進行實驗。實驗之外，給動物隨機地提供水和營養(yǎng)?？偣彩褂?0個動物30個用于第一階段(采用主動(行為)技術對其他25進行試驗，另外5個使用電生理學做試驗)，另外30個用于第二階段，每種藥用成分使用10個動物進行試驗。
急性聽力損失這種聽力損失由波形合成器(Hewlett-Packard惠普8904A)產生的6kHz的連續(xù)純音調來引起。將動物麻醉并在130dB的聲壓水平(SPL)下暴露20分鐘。這種聲壓水平通過可編程衰減器傳輸，并使用放置在動物頭部前方10cm處的JBL 075耳機的自由聲場傳輸給動物的耳朵。使用校準的Bmel and Kjaer麥克風(4314)以及Bruel and Kjaer校準放大器(2606)測量聲級。
行為訓練和測試動物習慣于獲得主動回避(Guitton et al.，J.of Neuroscience 23(9)3944-3952(2003))。行為測試包括無論在什么時候在訓練盒中通過電底板和爬桿產生聲音時都能進行某項行為。動物訓練共分為10期來完成，每期持續(xù)15至20分鐘，使用頻率為10kHz、SPL為50dB的純音調進行3秒鐘的條件刺激。非條件刺激包括點擊動物的腳部(3.7mA)，為期最長30秒，刺激間距為1秒。一旦動物正確地爬上了電極，研究員停止電擊。試驗的間距至少1分鐘。
得分定義為動物的表現(xiàn)，測試動物對聲音的響應而正確地爬上電極的次數。只有動物在連續(xù)的三期內獲得80％的分數，才認為該動物已被成功地訓練，可用于實驗。
實驗每天都進行，測量每期10分鐘內的得分和假反應，共試驗10期。所述假陽性反應是兩輪試驗之間，在沒有任何聲音刺激的情況下，也就是沉默期內爬上電極。這些響應可解釋為耳鳴感覺，因為動物如果聽到刺激的話才會爬上電極(Guitton et al.，J.of Neuroscience 23(9)3944-3952(2003))。聲音刺激是隨機的，而電擊則是在動物聽到聲音但沒有爬上電極時才釋放。
電生理學使用植入到動物的圓窗膜的電極來測量聽覺神經的復合動作電位(compound action potential，CAP)(頸部肌肉放置有參考電極)。參考電極和圓窗膜電極被焊接到固定在頭殼的插銷。通過JBL075的自由聲場將隨機功能生成器(LeCroy Corp.，model 9100R)每秒產生的10個聲脈沖群(為期9毫秒，上升/下降周期為1毫秒)施加到動物的耳朵上。測試10種頻率(2、4、6、8、10、12、16、20、26以及32kHz)，每種頻率使用0至100dB的脈沖級，步進為5dB。在PC(Dimension，Dell)上放大(Grass P511K，Astro-Med Inc)、過濾(100Hz至3kHz)和平均聽覺神經的響應。在負向下降N1和隨后的正向波P1的波峰-波峰之間測量CAP振幅。CAP閾值定義為引起可測量的響應(大于5uV)所需要的聲強(單位是dB SPL)。
藥理學使用單劑量i.p.(也稱ip，腹腔注射)注射0.3ml/kg 6％的戊巴比妥(pentobartital)(Sanofi公司)將動物麻醉，并在第一次行為試驗(第0天)后馬上在無菌環(huán)境下做手術。通過而后的外殼手術打開兩個水泡(背部手術)。兩個耳蝸露出來后，使用2.5ul含有藥物成分的人造外淋巴浸泡的明膠海綿(Gelita tampon，B.Braun Medical AG)放置在兩個耳蝸的各自圓窗上。所用的三種藥物化合物的濃度都是50uM。接著，使用牙科粘固粉(Unifast Trad，GCCorporation)封閉所述水泡。接著，將動物暴露在致傷性的聲音下。在該聽覺損傷24小時候(第一天)繼續(xù)進行行為試驗，并每天重復試驗，重復8天。
統(tǒng)計在每個行為試驗中，根據雙因素(組群×時間，對最后因素進行重復測量)方差分析(ANOV)對相關參數進行比較，以檢測測量效果(組效應)、時間效應以及組群×時間的交互作用。方差分析之后進行兩兩比較(Tukey檢驗)。根據單因素ANOVA對CAP測量進行統(tǒng)計分析之后，進行Dunnett檢驗。所有的結果都用“平均值±SEM”表示。
結論第一階段，不施用治療化合物正如預期，致傷性聲音導致永久的聽力損失(使用電生理學試驗的5個動物)。如圖1所示，在聽覺損傷第7天，可觀察到10kHz處最大為13dB±2.0的永久性聽力障礙(在第一天就發(fā)生了)。
聽覺損傷也導致得分的下降(行為模型中試驗的25個動物)。如圖2A所示，平均分數從第0天的較高的初始水平87％±1.6顯著地降到第一天的5.9％±1.0，其中，出現(xiàn)了聽覺損傷(p＜0.001)，從第二天起能夠觀察到部分功能恢復(69％±1.2)，在第4天穩(wěn)定的平均分數是80％±2.0。對該結果的統(tǒng)計分析表明所觀察到的分數的下降是顯著的(p＜0.05)，從第二天至第八天的分數下降也是顯著的(最后一天是80％±1.4)。動物正確地響應條件性聲音刺激的能力的下降，與動物聽到以該聽覺損失的頻率的聲音的能力已經被該致傷性聲音顯著地降低了是一致的。
有趣的是，在聽覺損傷后進行測試的動物中，假陽性反應的次數明顯不同，如圖2B所示。其中一組動物(命名為組1；n＝11)的假陽性反應的次數根本沒有增加——甚至在聽覺損傷發(fā)生之后(第0、1天是0.18次假反應±0.12)。但是，剩下的14個動物假反應次數顯示出顯著的增加，從第0天的0.34±0.13到第1天的4.28±0.22。對于其中6個動物(命名為組2)，這種增加是可逆的，假陽性反應的次數在第二天以及之后回落到正常的水平。但是另外的8個動物(組3)在短暫地增加后又呈現(xiàn)假陽性反應的增加。第二階段假陽性反應的最大值在第五天觀察到，為3.87±0.29；直到第8天，這種影響都保持著統(tǒng)計學的顯著性(最后一點觀察到的假陽性反應是2.25±0.25)。換言之，響應聲音刺激的假陽性反應首先是可逆性的增加，接著是永久性的增加。這意味著聽覺損傷后，一些動物根本沒有經歷耳鳴(組1)；一些是臨時性耳鳴(組2)；另一些開始是臨時性耳鳴，接著在余下的觀察期內再變?yōu)橛谰眯远Q。這些試驗結果原則上與從人體上觀察到的是一致的。
第二階段，施加治療性化合物為了測試聽覺損傷導致的耳鳴產生的機制是否與耳蝸毛細胞的損失和/或興奮性毒性有關，而將D-JNK-1局部施加到圓窗膜。如圖3A所示，藥物化合物不能阻止第0天(88％±2.5)至第1天(65±1.7)的得分的增加。但是，這種治療導致第2天快速地、完全地功能性恢復到聽覺損傷前的水平(90％±2.6)，隨后繼續(xù)保持這種恢復(在第8天是92％±2.0)。
雖然D-JNK-1防止了急性聽覺損傷后的永久性聽力損失，但它對假陽性反應的次數沒有顯著效果，從而對預防耳鳴沒有效果。如圖3B所示，假陽性反應的模式與從控制組(如2B)所觀察到的大致相同雖然組1(n＝4)沒有顯示出增加(第0、1兩天的假反應是0.25±0.25)，另外兩組的假陽性反應次數在第0天(0.33±0.21)至第1天(4.66±0.42)依然顯示出顯著性的增加(p＜005)。對于組2(n＝2)，這種增加也是短期的，完全可逆的增加；但組3中，這種臨時增加之后，接著是假陽性反應次數的永久性增加(第四天是3.50±0.29，第八天是2.25±0.25)?？偟膩碚f，這些結果表明由聽覺損傷導致的毛細胞損失不是產生耳鳴的主要原因，以及在該基礎上得出耳蝸興奮性毒性是耳鳴的機理。
局部施加兩種NMDA受體拮抗劑7-CK和S-(+)-克他命，所得到的結果是非常相似的。如圖4A和圖5A所示，從第0天至第1天，平均得分是顯著下降的，隨后得分恢復，然而恢復速率比未治療的動物要慢。與未治療的動物形成對比，使用NMDA受體拮抗劑治療的動物僅僅在第6天出現(xiàn)了穩(wěn)定的得分(使用S-(+)-克他命、7-CK治療的分別是89％±2.3和88％±2.5)。對這種不同的一個可逆解釋是，(部分)阻卻的NMDA受體延遲了新近突觸發(fā)生，而新近突觸發(fā)生具有親神經的效果，就這樣，延緩了功能的恢復。
另一方面，施用這兩種NMDA拮抗劑，對假陽性反應的次數有實質的影響(圖4B和圖5B)。假陽性反應的次數在初始的臨時增加之后，沒有觀察到永久性的增加，這與那些未治療的動物或者那些使用D-JNK1-1的動物不同。在該試驗中，要么根本沒有假陽性反應的增加(組1；對于使用S-(+)-克他命、7-CK治療的動物分別是n＝5和n＝4)，在第0和第1天觀察到的假陽性反應次數是0.22±0.22；要么是在聽覺損傷之后出現(xiàn)可逆的增加(組2對于使用克他命和7-CK治療的動物分別是n＝5和n＝6)，假陽性反應的次數從第0天的0.2±0.2(S-(+)-克他命)、0.33±0.21(7-CK)增加到第1天的5±0.48(S-(+)-克他命)、4.66±0.42(7-CK)。在出現(xiàn)臨時性耳鳴后，沒有觀察到永久性耳鳴的出現(xiàn)。這些結果表明本地施用NMDA受體拮抗劑到耳蝸上，抑制了耳蝸興奮性毒性引起的永久性耳鳴。
實施例2方法與材料為了評估水楊酸鹽和興奮性毒性致耳鳴的不同機制，在這兩種不同類型的耳鳴誘導發(fā)生后，進行耳蝸感覺神經的比較形態(tài)分析以及蛋白質免疫印跡分析(Western Blot immunodetection)。
形態(tài)學使用兩組Long Evans鼠，每組3只。給其中一組腹腔注射350mg/kg的水楊酸溶液，每天兩次，共2天；如實施例1一樣使另一組聽覺受損傷。將深度麻醉的鼠的頭部去掉之后，將耳蝸從顳骨移除，往耳蝸灌注固定液，該固定液是0.1M的磷酸緩沖液(PBS)，含2.5％的戊二醛，PH為7.3。接著對耳蝸進行處理，然后進行掃描(SEM)處理或透射電子顯微鏡(TEM)處理。對于SEM，將聽覺軟骨囊切碎，移除血管紋(stria vascularis)、覆膜以及瑞氏膜。使用PBS(PH為7.3)沖洗之后，在等級系列的乙醇(30-100％)中對樣本進行脫水，使用CO2將樣本干縮到臨界點，涂覆金-鈀，然后用日立S4000顯微鏡進行檢查。對于TEM，使用1％的四氧化鋨水溶液將耳蝸預固定2小時，用磷酸緩沖器沖洗，采用等級系列的乙醇(30-100％)脫水，并用環(huán)氧樹脂(Epon resin)包埋。從耳蝸的頂部移除柯氏體(Corti)的橫向超薄部分。將該部分放在聚醋酸甲基乙烯脂涂層(formvar-coaded)上或者編制網上，使用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛褪色，然后用日立7100顯微鏡檢查。
免疫檢測使用3組Long Evans鼠，每組3只。對其中一組腹腔注射350kg/ml的水楊酸溶液，在24小時以上注射2次，如“實施例1”之前的那一段記述的那樣使另一組的聽覺受損。已經知道一定劑量的水楊酸鹽會導致耳鳴(Guittion etal.，J.of Neuroscience 23(9)3944-3952(2003))。第3組的3只鼠作為對照，IP注射0.9％的NaCl溶液，劑量與使用水楊酸治療的動物的劑量相同。24小時后，從水楊酸組和對照組中取出樣本；對于聽覺損傷組，分別在損傷發(fā)生24小時和5天后取出樣本。正如在實驗1中所顯示的，在聽覺損傷的24小時候出現(xiàn)了短期耳鳴，從第3天開始觀察到永久性耳鳴。因此，可以預料永久性的耳鳴也會存在于第5天。因為水楊酸不能引起永久性耳鳴，所以，不能夠預期24小時以外(beyond)的任何處理和測量得到的結果與24小時后(after)得到的結果不同。
使用冷的PBS獲取組織，并在樣本緩沖器中進行勻質化處理，將所得的溶解產物離心分離以移除不可溶的清潔劑，將溶液分離在10％SDS-PAGE的Tris/Tricine緩沖溶液(三羧甲基氨基甲烷/三(羥甲基)甲基甘氨酸)中。電泳之后，將蛋白質電泳地轉移到硝化纖維膜(PVDF transfer membrane Hydond-P，Amersham Pharmacia Biotech，USA)。首先使用對抗NMDA NR1受體亞單元的主要抗抗體(anti-antibody)[1/1000的稀釋度；兔多克隆抗體(RabbitPolyclonal Antibody)，美國Chemicon internation公司]以及主要的抗肌動蛋白抗體(antibody anti-actin)[1/50000稀釋度，鼠單克隆抗β肌動蛋白(mousemonoclonal anti-β-actin)，美國Sinma公司]，在4℃通宵孵化印跡。為了證實腦部和耳蝸的NR1亞單元的分子量是相同的，在控制動物的腦部實施免疫印跡。接著，使用抗小鼠抗體IgG，生物素化的特有物種的完整抗體(1/3500，美國Amersham Lifescience公司)以及小鼠抗體IgG生物素化的特有物種的完整抗體(1/3500，美國Amersham Lifescience公司)在4℃孵化2小時。使用TBS-T(Tris buffer saline tween)沖洗5次，每次5分鐘之后，使用鏈酶親和素(streptavidin-alkalin phosphatase，SAP)結合物(1/5000，美國AmesshamLifescience公司)在4℃孵化2小時。使用BCIP/NBT(美國Sigma公司)來顯示蛋白質抗體復合體。接著，使用Biorad Fluor-S軟件(Quantity one)對蛋白質印跡(Western blots)進行圖像掃描，以將NR1和肌動蛋白的表達水平半量化。
結論正如所意料的，水楊酸致耳鳴和興奮性毒性引起的耳鳴的機理暗示著不同的路徑，以及導致不同的形態(tài)學和生理上的結果。如圖6所示，施用水楊酸留下保持了感覺器官外毛細胞(OHC)和內毛細胞(IHC)的靜纖毛的完整；而哪些被暴露在聽覺損傷之下的動物的OHC靜纖毛纖維束顯示出嚴重的損壞，以及出現(xiàn)了混亂的甚至一些個例中出現(xiàn)了斷裂的IHC靜纖毛。在水楊酸治療的個例中，沒有觀察到IHC突觸復合體的超微異常；而在受損傷的動物中，在受影響的頻率范圍的區(qū)域的IHC的基極(basal pole)上徑向傳入樹突上有大量的劇烈的膨脹，這證實已經出現(xiàn)了興奮性毒性。IHC的頂部出現(xiàn)了很多液泡和異常形狀的靜纖毛。高度放大的IHC基極表明，采用水楊酸治療的動物沒有出現(xiàn)異常。傳導神經末端是正常的，以及特有的突出前體是清晰可見的。與此相反，隨后出現(xiàn)了損傷的、膨脹的和破裂的神經末梢。
圖7所示是采用蛋白質印跡免疫確定的暴露在水楊酸或聽覺損傷后的耳蝸NMDA受體NR1亞單元的表達。水楊酸治療不引起NR1 NMDA受體亞單元表達的任何顯著變化(比控制動物高4％)。相反，聽覺損傷發(fā)生5天后，會出現(xiàn)清晰的過表達(比控制動物高50％)，這與觀察到持續(xù)性耳鳴是一致的。NMDA NR1表達的不同表明由聽覺損傷導致的耳鳴是由于NMDA受體的增量調節(jié)，而水楊酸的則不是。這證實了水楊酸導致的耳鳴以不同的路徑為媒介，如上所述。圖7還表明，損傷24小時后，沒有可檢測到的過表達(+8％)，這意味著聽覺損傷后的短期耳鳴和永久性耳鳴的機制是根本不同的。
總的來說，形態(tài)學和免疫檢測的分析，證實了水楊酸致耳鳴和興奮性致耳鳴的行為機制是根本不同的。與水楊酸不一樣，興奮性毒性會損壞內耳發(fā)細胞突觸復合體，以及引起NMDA受體的增量調節(jié)，這導致持續(xù)性耳鳴的產生。因為耳蝸NMDA響應的調節(jié)涉及兩種不同的路徑，所以，NMDA受體拮抗劑在抑制耳蝸興奮性毒性引起的持續(xù)耳鳴的效果方面，不能采用水楊酸致耳鳴的模型來推定。
權利要求
1.一種治療人體中由耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的方法，該方法包括給人體施用有效治療量的含有NMDA受體拮抗劑的藥物成分，該NMDA受體拮抗劑有效地抑制或減少受療人體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異常活性。
2.一種預防人體中由耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的方法，該方法包括給人體施用有效治療量的含有NMDA受體拮抗劑的藥物成分，該NMDA受體拮抗劑有效地預防受療人體中以NMDA受體為媒介的聽覺神經的異?；钚?。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述NMDA受體拮抗劑是選自克他命、7-CK、D-AP5、MK801和Gacyclidine。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述耳蝸興奮性毒性的出現(xiàn)是由聽覺損傷、老年性耳聾、心肌缺血、缺氧、使用一種或多種特定的耳毒性藥物治療，或突發(fā)性耳聾所引起的。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述藥物成分是通過圓窗膜或者卵圓窗膜被施用到內耳中的。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述藥物成分是通過擴散性藥物輸送技術被施用到內耳中的。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述耳蝸興奮性毒性是急性的。
8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述耳蝸興奮性毒性是反復性的。
9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述耳蝸興奮性毒性是長期或者慢性的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預防和/或治療由耳蝸興奮性毒性引起的耳鳴的方法。在這些實施例中，使用適當的設備和/或配方將含有NMDA受體拮抗劑的藥物成分施加到人體，以對內耳進行局部施藥。所述被預防和/或治療的耳鳴系由聽覺損傷、老年性耳聾、心肌缺血、缺氧、使用一種或多種特定的耳毒性藥物治療、突發(fā)性耳聾所引發(fā)，或者其他的耳蝸興奮性毒性誘變所引發(fā)。
文檔編號A61K31/4535GK1972677SQ200580009886
公開日2007年5月30日 申請日期2005年3月29日 優(yōu)先權日2004年3月29日
發(fā)明者馬賽厄·吉頓, 吉恩－盧克·帕爾, 里米·普若爾 申請人:奧里斯醫(yī)學股份有限公司, 國立衛(wèi)生研究所