專利名稱：治療眼新生血管化疾病的RNAi治療藥物的制作方法
本申請(qǐng)要求2004年2月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/541,775的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用整體結(jié)合到本文。
背景技術(shù)：
許多不同的眼病是過(guò)度新生血管化(NV)——眼內(nèi)部血管的異常增殖和生長(zhǎng)的結(jié)果。眼NV本身的發(fā)展不但對(duì)視力產(chǎn)生不利后果，而且還是許多嚴(yán)重眼病中的早期病理步驟；盡管已引入新的治療藥物，但它在美國(guó)和歐洲仍是造成永久失明的最普遍原因。有幾種主要的眼病會(huì)促進(jìn)異常的新生血管形成，導(dǎo)致引起失明的進(jìn)一步損害。遺憾的是，對(duì)于患有任一這類眼NV疾病的患者，只存在很少幾種治療選擇。最常用的認(rèn)可療法是維速達(dá)爾(Visudyne)光動(dòng)力療法，該法使用光線來(lái)激活新生血管化附近的光敏劑，以破壞不需要的血管。它對(duì)許多試驗(yàn)對(duì)象是無(wú)效的，即使有效也不能防止復(fù)發(fā)。最近批準(zhǔn)的藥物Macugen有些益處，但對(duì)大多數(shù)試驗(yàn)對(duì)象仍無(wú)效。另外，Macugen的眼內(nèi)給藥會(huì)導(dǎo)致發(fā)生刺激和感染風(fēng)險(xiǎn)，這兩方面都是不利的因?yàn)闀?huì)加重新生血管化的病狀。因此，存在對(duì)有效治療法極大和增長(zhǎng)的未滿足的臨床需求，這種治療要么是抑制疾病的進(jìn)展，因?yàn)榧膊∵M(jìn)展往往遷延過(guò)久，要么是逆轉(zhuǎn)不需要的血管發(fā)生。
美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)的國(guó)家眼科學(xué)院(National Eye Institute)估計(jì)有400,000名美國(guó)人患有某種形式的眼皰疹，而且美國(guó)每年診斷出將近50,000個(gè)新病例和復(fù)發(fā)病例，其中較為嚴(yán)重的基質(zhì)角膜炎約占25％。從更大規(guī)模的研究發(fā)現(xiàn)，眼皰疹復(fù)發(fā)率一年內(nèi)為10％，兩年內(nèi)為23％，二十年內(nèi)為63％。盡管應(yīng)用現(xiàn)有的抗病毒藥物能在一定程度上控制HSV感染，但仍沒(méi)有能治療HSV引起的基質(zhì)角膜炎和保護(hù)試驗(yàn)對(duì)象免于失明的有效藥物。
眼新生血管化疾病可分為影響眼前部或眼睛前部和影響眼后部或視網(wǎng)膜的疾病。這些不同區(qū)域的NV的發(fā)生可能有不同的起源，但不論是眼睛的哪個(gè)區(qū)域，NV過(guò)程的生化和生理特征本質(zhì)上近乎相同。因此，用以干預(yù)眼NV生化特征的有效方法展示的前景，是給以眼NV為主要病理癥狀或潛在病理癥狀的任何眼病提供有效治療法，而不論這些眼病作用于眼前部還是眼后部。盡管如此，眼前部和眼后部的組織差別是相當(dāng)大的，這些差別可顯著影響便于治療劑到達(dá)組織和細(xì)胞的給藥治療法的這種最有效方法。
眼后部NV疾病當(dāng)為視網(wǎng)膜供氧的微小血管受到損害時(shí)會(huì)發(fā)生眼糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)。這種損害會(huì)讓血液和分泌液逸出到視網(wǎng)膜中，而且還導(dǎo)致新血管生長(zhǎng)。這些新血管較脆，往往會(huì)出血到眼睛的玻璃體區(qū)域，干擾視力?；加凶顕?yán)重型DR的試驗(yàn)對(duì)象不加治療將有導(dǎo)致嚴(yán)重視力喪失的重大風(fēng)險(xiǎn)。在這些疾病中，新生血管化是主要的疾病病理。
年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是60歲以上人群的最主要失明原因，且這個(gè)問(wèn)題每年都變得更嚴(yán)重。在AMD中，中央視覺(jué)的喪失使得清晰識(shí)別成為不可能。就個(gè)人和社會(huì)負(fù)擔(dān)的AMD數(shù)量整體而言，造成這種疾病的原因及其如何發(fā)展沒(méi)有被更多地認(rèn)識(shí)到或許令人奇怪。不過(guò)人們還是清楚，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)起著關(guān)鍵的作用。異常廢物在RPE底下和內(nèi)部積累，致使RPE細(xì)胞最終死亡。視網(wǎng)膜的視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的存活依賴于正常執(zhí)行功能的RPE，因此RPE功能的失效會(huì)導(dǎo)致逐漸失明。這種疾病引起眼睛后部發(fā)生結(jié)疤過(guò)程，導(dǎo)致新生血管的形成(新血管化)。在一大部分患有“濕性AMD”的試驗(yàn)對(duì)象中，視網(wǎng)膜前部的滲漏新血管系統(tǒng)持續(xù)過(guò)度增殖，這也會(huì)使視力模糊和扭曲。在這種疾病中，試驗(yàn)對(duì)象群體的大部分人在疾病稍后的嚴(yán)重階段有破壞性新生血管持續(xù)增生。
眼色素層炎是起源于眼睛內(nèi)部組織過(guò)度或持續(xù)發(fā)炎的一種眼病。隨著時(shí)間推移色素層炎會(huì)導(dǎo)致新生血管化，從而損害視力。這種疾病可在眼睛的幾個(gè)不同區(qū)域發(fā)展，如局限于眼后部，或者彌散于包括眼后部區(qū)域的眾多區(qū)域各處。這種疾病起源于炎癥，而炎癥可由包括病毒感染的多種原因引起。共通性是過(guò)度和持續(xù)的炎癥，導(dǎo)致破壞性病理過(guò)程(包括新生血管化)和最終失明。
眼前部NV疾病虹膜紅變是描述虹膜和眼前部結(jié)構(gòu)上異常血管生長(zhǎng)的術(shù)語(yǔ)。通常該區(qū)域的血管不可見(jiàn)。當(dāng)視網(wǎng)膜缺氧或局部缺血如糖尿病性視網(wǎng)膜病或靜脈阻塞的情況時(shí)，會(huì)有異常血管形成，以給眼睛供氧。遺憾的是，這些血管的形成阻礙房水從眼前部排出，使眼壓升高。這通常會(huì)導(dǎo)致新生血管性青光眼。
眼色素層炎是起源于眼睛內(nèi)部組織發(fā)炎的一大類疾病。這種疾病在解剖學(xué)上最常分成前色素層炎、中色素層炎、后色素層炎或彌漫性色素層炎。眼色素層炎的眼并發(fā)癥會(huì)引起深度的和不可逆的失明，尤其是未被識(shí)出或未得到適當(dāng)治療時(shí)。最常見(jiàn)的并發(fā)癥包括白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜脫離，及視網(wǎng)膜、視神經(jīng)或虹膜的新生血管化等。
脈絡(luò)膜新生血管化(CNV)是一大類眼病的潛在病理，該眼睛區(qū)域具有新生血管化的特征。相關(guān)的一類眼病是眼睛感染的結(jié)果，包括結(jié)膜炎、角膜炎、瞼炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫和虹膜炎，而且這些全是眼新生血管化的主要原因并導(dǎo)致失明。在美國(guó)，復(fù)發(fā)性HSV感染是角膜失明的最常見(jiàn)感染原因。這種病毒感染造成稱之為基質(zhì)角膜炎(SK)的致盲性損傷。角膜NV是皰疹性SK引起的視力喪失過(guò)程中的早期步驟。
眼NV生物化學(xué)和生理學(xué)如同其他組織一樣，眼組織常處于需要新生血管化的連續(xù)維護(hù)狀態(tài)。這個(gè)必需過(guò)程由促進(jìn)因子和抑制因子之間的平衡來(lái)維持平衡。遺憾的是，在許多眼新生血管化疾病中沒(méi)有恰當(dāng)?shù)木S持這種平衡，結(jié)果造成破壞性新血管過(guò)度生長(zhǎng)。不管是什么眼睛區(qū)域和疾病，盡管病理的起因及其在視力喪失中的作用差別很大，但這種過(guò)度新生血管化的過(guò)程幾乎完全相同。病理過(guò)程的共同特征為這些不同眼部疾病的有效治療干預(yù)提供了方法。
正常角膜是無(wú)血管的，HSV本身并不表達(dá)任何血管生成蛋白質(zhì)，但被感染的眼組織表達(dá)誘導(dǎo)角膜NV的血管生成因子。血管生成因子的產(chǎn)生最初出現(xiàn)在被病毒感染的角膜上皮非炎性細(xì)胞，然后在臨床階段由基質(zhì)中的炎性細(xì)胞(PMN和巨噬細(xì)胞)表達(dá)。通過(guò)移植純化的HSV病毒DNA片段(HSV DNA，富含CpG基序)或合成的CpG寡核苷酸(CpG ODN)建立了HSV誘導(dǎo)角膜NV的小鼠模型。這個(gè)模型被認(rèn)為能提供角膜NV和皰疹性SK疾病的臨床相關(guān)模型，且可用于測(cè)試抑制眼NV疾病的治療方式的有效性。
一種引人注意的治療干預(yù)方法是抑制這些疾病的共同病理?xiàng)l件。從許多研究中已確定，VEGF介導(dǎo)的新生血管化和血管發(fā)生是許多眼新生血管化疾病的共同病理途徑之一。VEGF介導(dǎo)的血管發(fā)生途徑在所有這些NV相關(guān)眼病的血管發(fā)生中起主要作用。VEGF家族由五種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的生長(zhǎng)因子組成VEGF-A、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。已知的受體包括三種結(jié)構(gòu)上同源的酪氨酸激酶受體VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR或Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，它們與不同VEGF成員具有不同親和性或相關(guān)功能。雖然對(duì)四種VEGF成員的功能和調(diào)節(jié)知之甚少，但已知VEGF-A能結(jié)合VEGFR-1和VEGFR-2，誘導(dǎo)新生血管化和血管發(fā)生以及增加血管通透性。VEGFR-1和VEGFR-2在增生的內(nèi)皮中均被上調(diào)，這可能是對(duì)VEGF-A或低氧的直接響應(yīng)。VEGFR-1對(duì)VEGF-A的親和性比VEGFR-2高。VEGFR-2據(jù)認(rèn)為負(fù)責(zé)血管生長(zhǎng)的血管生成信號(hào)，而對(duì)VEGFR-1的功能卻知之甚少。一些研究提示其在轉(zhuǎn)導(dǎo)血管生成信號(hào)中的直接作用及在能動(dòng)性和通透性方面的作用。對(duì)血管發(fā)生的VEGF途徑中的關(guān)鍵參與者的這種認(rèn)識(shí)，促使了對(duì)以VEGF-A抑制劑作為候選治療藥物(包括macugen，一種抑制VEGF與其受體結(jié)合的適體寡核苷酸)的研究。雖然在眼血管發(fā)生以及在其他血管發(fā)生疾病如腫瘤生長(zhǎng)方面的研究已證實(shí)VEGF途徑對(duì)臨床療效的價(jià)值，但實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)許多試驗(yàn)對(duì)象遠(yuǎn)未能奏效。顯然，如果我們要為這些主要的眼病開發(fā)出治療法，則需要有更好的VEGF途徑抑制劑。
發(fā)明概述本發(fā)明提供使用RNAi藥物，包括小干擾RNA或siRNA(雙鏈RNA寡核苷酸)及給藥系統(tǒng)來(lái)抑制促血管生成因子的表達(dá)從而抑制眼NV疾病的組合物和方法。
因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供包含至少一種dsRNA寡核苷酸和藥物載體的組合物，其中當(dāng)對(duì)患有新生血管化或血管發(fā)生有關(guān)的眼病的試驗(yàn)對(duì)象給藥時(shí)，所述dsRNA抑制與眼病中新生血管化或血管發(fā)生有關(guān)的基因的表達(dá)。
本發(fā)明的又一個(gè)目標(biāo)是提供用以治療試驗(yàn)對(duì)象眼病的方法，其中所述疾病特征至少部分是新生血管化，該方法包括給予所述試驗(yàn)對(duì)象包含dsRNA寡核苷酸和藥學(xué)上可接受載體的組合物，其中所述dsRNA寡核苷酸抑制能促進(jìn)所述試驗(yàn)對(duì)象眼新生血管化的基因的表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物載體選自聚合物、脂質(zhì)或膠束。載體可選自例如聚陽(yáng)離子粘合劑、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陽(yáng)離子膠束、陽(yáng)離子多肽、親水聚合物接枝聚合物、非天然陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子聚縮醛、親水聚合物接枝聚縮醛、配體官能化陽(yáng)離子聚合物和配體官能化親水聚合物接枝聚合物。
眼病可選自基質(zhì)角膜炎、色素層炎、發(fā)紅、結(jié)膜炎、角膜炎、瞼炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑變性和視網(wǎng)膜病。眼病可至少發(fā)生在眼前部。可在眼遠(yuǎn)端部位給予組合物，例如可結(jié)膜下、靜脈內(nèi)和皮下給藥，和/或可在眼睛局部給予組合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA抑制選自以下的基因的表達(dá)促炎途徑基因、促血管發(fā)生途徑基因、促細(xì)胞增殖途徑基因及病毒感染介質(zhì)基因組RNA和病毒感染介質(zhì)基因。組合物可包含至少兩種dsRNA分子，其中每種dsRNA分子均抑制選自以下的基因的表達(dá)促炎途徑基因、促血管發(fā)生途徑基因、促細(xì)胞增殖途徑基因及病毒感染介質(zhì)基因組RNA和病毒感染介質(zhì)基因。組合物可包含至少三種dsRNA分子，其中至少一種dsRNA分子抑制VEGF的表達(dá)，至少一種dsRNA分子抑制VEGF R1的表達(dá)，至少一種dsRNA分子抑制VEGF R2的表達(dá)。組合物可包含至少兩種dsRNA分子，其中至少一種dsRNA分子抑制堿性FGF的表達(dá)，至少一種dsRNA分子抑制FGF R的表達(dá)。
dsRNA分子可抑制一種或多種VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合的表達(dá)。dsRNA分子可抑制一種或多種促血管發(fā)生基因、促炎基因或它們的組合的表達(dá)。dsRNA分子可抑制一種或多種促血管發(fā)生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達(dá)。dsRNA分子可抑制一種或多種促血管發(fā)生基因、內(nèi)皮細(xì)胞增殖基因或它們的組合的表達(dá)。dsRNA分子可抑制一種或多種促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達(dá)。
組合物可包含至少三種能抑制至少兩種或多種基因的表達(dá)的dsRNA分子。所述基因可編碼VEGF、VEGF R1和VEGF R2、堿性FGF、FGF R和/或它們的組合。所述基因可為促血管發(fā)生基因、內(nèi)皮細(xì)胞增殖基因、單純皰疹病毒基因、促炎基因或它們的組合。
在這些組合物中，dsRNA分子可為dsRNA寡核苷酸。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示含三個(gè)功能域陽(yáng)離子核心、立體聚合物和肽配體的TargeTranTM(TT)的結(jié)構(gòu)示意圖。TT與核酸發(fā)生電相互作用，引發(fā)自組裝形成納米顆粒，納米顆粒將有效載荷選擇性遞送到具有配體受體的細(xì)胞。
圖2顯示siRNA介導(dǎo)的對(duì)VEGF途徑基因的體外敲減。35mm孔中的RAW264.7 gamma NO(-)細(xì)胞(A)和SVR細(xì)胞(B)分別用靶向mVEGFA和mVEGFR1的siRNA以指示量轉(zhuǎn)染。293細(xì)胞(C)用靶向mVEGFR2的siRNA和表達(dá)mVEGFR2的質(zhì)粒以指示量共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，分離細(xì)胞RNA，通過(guò)mVEGFA的RT-PCR或mVEGFR1和mVEGFR2)的RS-PCR判斷內(nèi)源表達(dá)的mVEGFA或mVEGFR1的敲減情況，或mVEGFR2的外源表達(dá)敲減情況。
圖3顯示FITC標(biāo)記的siRNA的眼部給藥。CpG植入后六小時(shí)，分別通過(guò)局部途徑(左)或全身途徑(右)將FITC標(biāo)記的siRNALuc與PT或TT一起給予小鼠。采用每眼10μg siRNA(局部給藥)或每尾40μg(全身給藥)一次的劑量。siRNA給藥24小時(shí)后在熒光顯微鏡下檢查眼球、肝臟和肺的冷凍切片。只顯示了眼切片的結(jié)果。
圖4顯示在被感染并用siVEGFmix通過(guò)局部或全身給藥治療的角膜中VEGF mRNA水平下降。用1×105pfu HSV-1 RE感染小鼠，并在感染后第1天和第3天用靶向VEGF途徑基因的siRNA通過(guò)局部(10μg/眼)或全身(40μg/尾)給藥治療后，在感染后第4天和第7天收集角膜，然后通過(guò)RT-PCR(A)或?qū)崟r(shí)定量PCR(B)測(cè)量VEGF mRNA水平。
圖5顯示在被感染并用siVEGFmix通過(guò)局部或全身給藥治療的角膜中VEGF蛋白質(zhì)水平下降。在感染后第7天處理兩張角膜/小鼠，以測(cè)量VEGF蛋白質(zhì)水平。如在材料和方法中所述，小鼠用HSV-1感染并用靶向VEGF途徑基因的siRNA治療，通過(guò)抗體捕捉ELISA估測(cè)其角膜裂解液上清的VEGF水平。結(jié)果以四只單獨(dú)小鼠(每鼠2張角膜)的平均值±SD表示。在各組之間觀察到VEGF蛋白質(zhì)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p＜0.05)。
圖6顯示靶向VEGF途徑基因的siRNA的局部給藥能抑制CpGODN誘導(dǎo)的血管發(fā)生。將CpG ODN(1μg)植入到小鼠角膜中的微袋24小時(shí)后，通過(guò)結(jié)膜下注射將10μg/眼的siLacZ、siVEGFA、siVEGFR1、siVEGFR2或siVEGFmix(靶向VEGF途徑基因的總siRNA的等摩爾混合物)隨PT一起給予小鼠。在CpG微球(pellet)植入(每組四只小鼠)后第4天和第7天測(cè)量血管發(fā)生面積。在各組之間觀察到血管發(fā)生面積有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(*p＜0.05，**p＜0.01)(A)。NV由第7天攝取的照片顯示(40x)(B)。
圖7顯示針對(duì)VEGF途徑基因的siRNA的全身給藥能抑制CpGDNA誘導(dǎo)的血管發(fā)生。在CpG ODN誘導(dǎo)后6小時(shí)和24小時(shí)，將針對(duì)VEGF途徑基因的單個(gè)siRNA或總siRNA混合物通過(guò)尾靜脈注射給藥。在CpG微球植入(每組四只小鼠)后第4天和第7天測(cè)量血管發(fā)生面積。在各組之間觀察到血管發(fā)生面積有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(*p＜0.05，**p＜0.01)(A)。NV由第7天攝取的照片顯示(40x)(B)。
圖8顯示TargeTranTM介導(dǎo)的全身給藥增強(qiáng)了siRNA的功效，并在CpG ODN誘導(dǎo)后6小時(shí)和24小時(shí)顯示劑量反應(yīng)。將被測(cè)抗生血管siRNA的混合物或非相關(guān)siLuc對(duì)照分別隨TT一起全身給藥。siVEGFmix還隨PBS一起給藥。在CpG微球植入后第4天和第7天測(cè)量血管發(fā)生面積；在各組(每組四只小鼠)之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(*p＜0.05)(A)。以每鼠10、20、40和80μg總siRNA的劑量全身給藥靶向EGF途徑基因的混合siRNA，進(jìn)行劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。在CpG微球植入后第4天和第7天測(cè)量血管發(fā)生面積，比較不同劑量之間的抗生血管效率(B)。
圖9顯示siRNA介導(dǎo)的HSK和血管發(fā)生嚴(yán)重程度的降低。以每眼1×105pfu HSV-1 RE感染小鼠，在感染后第1天和第3天分別用siVEGF mix或siLuc局部和全身治療。在感染后第10天計(jì)算HSK臨床評(píng)分的平均值(A)或臨床生血管評(píng)分的平均值(B)。每個(gè)點(diǎn)代表每只眼睛的臨床評(píng)分。橫棒和括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示每組的平均值。數(shù)據(jù)收集兩組平行實(shí)驗(yàn)，每組6只眼睛。在各組之間觀察到HSK或血管發(fā)生評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p＜0.05)。感染后第14天，在siLuc治療的小鼠受感染角膜中可見(jiàn)血管過(guò)度生長(zhǎng)和潰瘍形成，而siVEGF mix治療的小鼠在接近角膜緣的區(qū)域顯示較少的NV。局部和全身給藥均顯示NV面積明顯減少。全身給藥結(jié)果見(jiàn)照片(C)。
圖10顯示綠色熒光標(biāo)記的siRNA在荷瘤小鼠中的組織分布。小鼠通過(guò)靜脈注射以P-nanoplex(左列)或RPP-nanoplex(中列)或水溶液(右列)形式接受40mg熒光標(biāo)記的siRNA。注射后一小時(shí)，解剖組織并在熒光顯微鏡上檢查。每個(gè)組織均以相等的曝光時(shí)間拍照。P-nanoplex在所有器官中均顯示點(diǎn)狀熒光，在肺和肝臟中尤其強(qiáng)烈。RPP-nanoplex在肺中顯示較弱的熒光水平，為點(diǎn)狀分布，而在肝臟中則是較弱的非點(diǎn)狀熒光。相比于P-nanoplex，在腫瘤中觀察到較高的熒光水平。與兩種nanoplex制劑的任一種相比，給予游離siRNA后所有器官中熒光水平都非常低。
圖11顯示靜脈給予復(fù)合于納米顆粒中的導(dǎo)向VEGFR2的siRNA對(duì)腫瘤新生血管化和VEGFR2蛋白質(zhì)水平的抑制作用。(B-D)用siRNARPP-nanoplex治療的腫瘤中的新生血管化。對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)切除的代表性腫瘤進(jìn)行低倍光學(xué)顯微鏡檢。對(duì)腫瘤和周圍皮膚組織的透照顯示，在不進(jìn)行治療的小鼠(B)和用帶siRNA-LacZ的RPP-nanoplex治療的小鼠(C)中有強(qiáng)烈的新生血管化。相反，用帶VEGFR2siRNA的RPP-nanoplex治療的小鼠顯示較低的新生血管化和雜亂的血管分支(D)。星號(hào)表示腫瘤組織。標(biāo)尺＝2mm。(E)siRNA RPP-nanoplex治療后腫瘤組織中的VEGFR2表達(dá)。將腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)切除的代表性腫瘤(A)均漿，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法測(cè)量VEGFR2表達(dá)水平。左泳道是未進(jìn)行治療的腫瘤，中間泳道是用LacZ siRNA治療的腫瘤，右泳道是用VEGF R2 siRNA治療的腫瘤。
圖12顯示陰性對(duì)照siRNA(siLuc)治療的眼睛視網(wǎng)膜中滲漏新生血管化抑制情況的綠色熒光測(cè)量結(jié)果與VEGF途徑活性siRNA(siMix)治療的眼睛視網(wǎng)膜中滲漏新生血管化抑制情況的綠色熒光測(cè)量結(jié)果的對(duì)比。鋪片揭示給予靶向VEGF、VEGF R1和VEGF R2的活性siRNA抑制劑對(duì)NV有抑制作用，但對(duì)熒光素酶表達(dá)有特異性的陰性siRNA卻沒(méi)有抑制作用。綠色熒光染料在滲漏新生血管化部位的滲入由鋪片鏡檢方法獲得的圖像中的綠色觀察到。左邊圖像獲自陰性對(duì)照siRNA寡核苷酸即siLuc治療的眼睛，顯示由于滲漏新生血管化造成的綠色熒光。右邊圖像獲自活性siRNA寡核苷酸即siMix治療的眼睛，顯示與陰性對(duì)照相比，由于滲漏新生血管化減少造成的綠色熒光減少。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用以治療眼新生血管化疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、色素層炎、基質(zhì)角膜炎(SK)和癌癥的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明采用RNAi介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞和生化途徑的抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)眼病的抑制。本發(fā)明提供包括siRNA寡核苷酸在內(nèi)的RNAi藥物來(lái)抑制1)病毒感染的基因表達(dá)，2)炎性細(xì)胞和生化途徑，3)促血管發(fā)生細(xì)胞和生化途徑，包括VEGF、VEGF受體、FGF、FGF受體、PDGF和PDGF受體，4)介導(dǎo)眼新生血管化的細(xì)胞增殖，和5)它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明采用全身給藥的化學(xué)合成載體來(lái)遞送合成的siRNA寡核苷酸。本發(fā)明提供siRNA介導(dǎo)的局限于眼組織和發(fā)生新生血管化疾病的組織的抗血管發(fā)生效應(yīng)。本發(fā)明為核酸藥物、蛋白質(zhì)或肽和為小分子抑制眼病的過(guò)度新生血管化提供方法。本發(fā)明還對(duì)誘導(dǎo)不需要的眼新生血管化的多個(gè)因子和多個(gè)生化途徑的抑制提供藥物組合。本發(fā)明還提供將治療藥物給予眼組織的臨床手段。本發(fā)明的方法和組合物可用以治療由眼睛感染、糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)性黃斑變性和眼癌癥引起的眼新生血管化。
VEGF是負(fù)責(zé)正常血管生成和血管再塑的必需生長(zhǎng)因子。在某些疾病條件下，例如在腫瘤狀況下(其中形成新生血管以向快速生長(zhǎng)的異常組織傳送足夠的氧和營(yíng)養(yǎng)物)，VEGF生血管途徑將被激活。在美國(guó)，大多數(shù)嚴(yán)重視力喪失由局部缺血性眼病如糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈阻塞和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病試驗(yàn)對(duì)象中聯(lián)合視網(wǎng)膜新生血管化的并發(fā)癥引起。生血管蛋白質(zhì)VEGF的眼內(nèi)表達(dá)與這些人類病癥中的新生血管化和與小鼠中局部缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管化密切相關(guān)。因此，由VEGF和VEGF受體組成的的VEGF途徑是抑制視網(wǎng)膜血管發(fā)生的合理靶標(biāo)。
可獲得公布的臨床相關(guān)動(dòng)物模型，以便評(píng)估抗生血管藥物，開發(fā)出針對(duì)眼NV疾病的新型治療藥物。一種視網(wǎng)膜血管發(fā)生臨床相關(guān)動(dòng)物模型采用低氧來(lái)誘導(dǎo)過(guò)度血管發(fā)生。另一種視網(wǎng)膜血管發(fā)生模型采用激光燒傷來(lái)造成出現(xiàn)血管發(fā)生的視網(wǎng)膜損傷。一種角膜NV臨床相關(guān)動(dòng)物模型采用通過(guò)預(yù)先植入到小鼠角膜基質(zhì)的微袋中的CpG或通過(guò)HSV感染進(jìn)行的疾病誘導(dǎo)，這樣可容易地測(cè)量對(duì)血管發(fā)生的抑制作用。可首先在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)試候選治療藥物的效果，然后在疾病的臨床相關(guān)動(dòng)物模型中有選擇的進(jìn)行研究。
RNAi治療方法RNAi，雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)序列特異性的信使RNA(mRNA)的降解，常稱為基因沉默，它已被證明是發(fā)現(xiàn)基因或驗(yàn)證基因的一種強(qiáng)有力工具，且在開發(fā)新型基因特異性藥物中擁有極大的潛力。在我們?yōu)橐种蒲跱V而進(jìn)行的抗生血管RNAi設(shè)計(jì)中，選擇了VEGF生血管途徑的關(guān)鍵參與者mVEGF-A、mVEGF-R1和mVEGF-R2作為靶基因。小干擾RNA(siRNA)根據(jù)Tuschl的研究小組建議的一般指導(dǎo)方針進(jìn)行設(shè)計(jì)。該siRNA是21核苷酸長(zhǎng)的雙鏈RNA，在任一3′末端均帶2-nt突出端，負(fù)鏈與靶mRNA序列互補(bǔ)。單獨(dú)或組合敲減這些基因，具有阻斷生血管途徑、導(dǎo)致NV被抑制，從而減輕SK癥狀的效果。相同的方法適用于其他NV相關(guān)眼病。
迄今為止，尚沒(méi)有給予RNAi藥物至靶向眼新生血管化的合適技術(shù)報(bào)道。因此，針對(duì)眼新生血管化疾病的RNAi藥物的專利核酸給藥系統(tǒng)存在極大的需求。RNA干擾(RNAi)的應(yīng)用在細(xì)胞培養(yǎng)和模式生物如果蠅、線蟲、紋斑魚中已取得飛速的發(fā)展。對(duì)RNAi的研究已發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)dsRNA由切酶(一種細(xì)胞核糖核酸酶III)加工，產(chǎn)生帶3′-突出端的約21nt雙鏈體，稱為短干擾RNA(siRNA)，其介導(dǎo)序列特異性的mRNA降解(4，5，6)。對(duì)RNAi的機(jī)制及其快速擴(kuò)大的應(yīng)用的認(rèn)識(shí)，代表了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近十年來(lái)的重大突破。應(yīng)用siRNA雙鏈體來(lái)干擾特定基因的表達(dá)需要靶標(biāo)可接近性的知識(shí)，但還受阻于缺乏給予siRNA到眼NV疾病的靶細(xì)胞的有效手段。隨著有關(guān)siRNA作為功能基因組工具的文獻(xiàn)的飛速增多，人們對(duì)將siRNA用作新型治療藥物的興趣不斷涌現(xiàn)。治療應(yīng)用顯然要依賴于有效的局部和全身給藥方法。使用siRNA作為治療藥物的優(yōu)點(diǎn)顯然應(yīng)歸于其特異性、穩(wěn)定性、效力、自然作用機(jī)制，以及靶向不同基因靶標(biāo)的藥物的一致化學(xué)特性，因?yàn)檫@些藥物只在核苷酸序列上有所不同。
我們已用siRNA使腫瘤模型中的促血管生成因子沉默，并已證實(shí)了強(qiáng)烈的基因沉默效應(yīng)(10)。這個(gè)進(jìn)展證實(shí)了RNAi在體外和體內(nèi)使促血管生成因子沉默的可行性和有效性，并證明我們的分子設(shè)計(jì)和專利給藥系統(tǒng)適用于siRNA介導(dǎo)的基因沉默來(lái)治療眼新生血管化。已將稱之為TargeTranTM的全身給藥系統(tǒng)用于siRNA的給藥(11)。siRNA給藥載體是基于Woodle等(WO 01/49324，其內(nèi)容通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中)描述技術(shù)的陽(yáng)離子聚合物。本文所用的“合成載體”指多功能合成載體，其最少含有核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合(即組織靶向)結(jié)構(gòu)域，并與核酸序列復(fù)合。合成載體還可含有其他結(jié)構(gòu)域，例如親水聚合物結(jié)構(gòu)域、內(nèi)體破壞或解離結(jié)構(gòu)域、核靶向結(jié)構(gòu)域和核酸凝縮結(jié)構(gòu)域。用于本發(fā)明的合成載體優(yōu)選能使非特異性相互作用減少，但仍能有效地參與配體介導(dǎo)的(即特異性的)細(xì)胞結(jié)合。另外，用于本發(fā)明的合成載體能夠與一種或多種治療核酸形成復(fù)合物，并隨后可給予試驗(yàn)對(duì)象。我們已用這種全身方法通過(guò)尾靜脈注射在嚙齒類動(dòng)物中給予這些siRNA。對(duì)VEGF A、VEGF R1和VEGF R2的敲減作用導(dǎo)致眼新生血管化明顯被抑制(13)。
我們還使用了另一種稱之為PolyTranTM的基于聚合物的載體來(lái)在體外和體內(nèi)給予siRNA。這種技術(shù)(參見(jiàn)WO 0147496，其內(nèi)容通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中)能夠極大地減少由CpG在本應(yīng)無(wú)血管的小鼠眼角膜中誘導(dǎo)的新血管系統(tǒng)形成。我們?cè)趕iRNA設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)中取得的成功顯示了開發(fā)RNAi治療藥物以治療皰疹性SK和其他生血管眼病的巨大可能性(圖1-3)。
RNAi和治療藥物本發(fā)明提供能抑制基因表達(dá)和干預(yù)眼新生血管化的干擾RNA藥物。本發(fā)明提供許多形式的干擾RNA分子作為治療藥物，包括雙鏈RNA(dsRNA)寡核苷酸、小發(fā)夾RNA(shRNA)和DNA衍生的RNA(ddRNA)。本發(fā)明還提供因其序列而有活性，但未必被認(rèn)為是“RNA干擾”的核酸藥物，包括誘殺性寡核苷酸、反義、核酶、基因表達(dá)和適體。這些核酸和其他治療藥物具有凈負(fù)電荷或其他物理特性，這樣本發(fā)明的制劑和組合物可被眼組織和細(xì)胞接觸并在需要時(shí)吸收。
RNAi是可用來(lái)敲減基因表達(dá)，從而以序列特異性方式破壞mRNA的有效方法?？刹倏vRNAi，以快速和持續(xù)的方式提供生物功能。本發(fā)明提供對(duì)基因進(jìn)行選擇性干預(yù)的RNAi藥物來(lái)治療眼NV或其他NV相關(guān)眼病，以此作為控制人類眼病的手段。
干擾RNA的設(shè)計(jì)RNAi藥物設(shè)計(jì)成具有與靶向基因的一段序列匹配的核苷酸序列。選定的靶向基因的RNAi序列可在由該基因表達(dá)所產(chǎn)生的mRNA的任何部分。RNAi包含能與來(lái)自靶基因的mRNA雜交的序列，即RNAi序列的“反義鏈”。RNAi序列包含能與反義鏈雜交的序列，即RNAi序列的“有義鏈”。所選靶向序列的RNAi序列不應(yīng)與細(xì)胞所產(chǎn)生的任何其他mRNA同源，也不應(yīng)與不被轉(zhuǎn)錄成mRNA的靶向基因的任何序列同源。已知有多種設(shè)計(jì)規(guī)則，包括市售的方法，是從靶mRNA序列選擇20-27堿基的序列。這些設(shè)計(jì)方法不斷發(fā)展，可采用當(dāng)前最流行的方法。可從至少三個(gè)方法獲得設(shè)計(jì)方案，然后從這些方法構(gòu)建和裝配最高優(yōu)先的單一共有序列表。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)制備至少6個(gè)最高優(yōu)先的候選序列，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以測(cè)試其基因抑制能力，幾乎都能夠揭示出至少兩個(gè)活性RNAi序列。如果不是這樣，則可進(jìn)行第二輪的獲取6個(gè)最高優(yōu)先的候選序列并用于試驗(yàn)。
設(shè)計(jì)工作除需要鑒定活性RNAi序列外，還必須確保只與所需的mRNA序列有同源性。RNAi序列與靶基因mRNA的基因組序列之外的基因組序列同源性差，能在mRNA水平或基因水平減少脫靶反應(yīng)(off-target effect)。同樣，RNAi序列的“有義鏈”同源性差，也能減少脫靶反應(yīng)。通過(guò)用Clone Manager Suite(SciEd Software，Cary NC)進(jìn)行DNA比較和通過(guò)在線Blast檢索，可確認(rèn)選定基因的靶向序列是獨(dú)特的，且缺乏與其他基因(包括人類對(duì)等基因)的序列同源性。例如，與mVEGF-A的mRNA匹配的序列經(jīng)確認(rèn)對(duì)mVEGF-A是獨(dú)特的，與mVEGF-B mRNA、mVEGF-C mRNA、mVEGF-D mRNA或人類對(duì)等基因(包括hVEGF165-a(AF486837))沒(méi)有同源性。但是，匹配的序列會(huì)靶向mVEGF-A的多個(gè)同種型，例如分別編碼190氨基酸(aa)、141aa、146aa和148aa mVEGF-A蛋白質(zhì)的mVEGF(M95200)、mVEGF115(U502791)、mVEGF-2(S38100)、mVEGF-A(NM_192823)。所有這些公開的mVEGF-A同種型的cDNA序列，除mVEGF-A(NM_192823，蛋白質(zhì)的成熟形式)之外，其N端均包含26aa信號(hào)肽。mVEGF的靶向序列不是選擇在信號(hào)肽部分，而是選擇在所有這些mVEGF-A同種型共有的成熟蛋白質(zhì)部分。mVEGF-R1和mVEGF-R2的靶向序列也被證實(shí)分別對(duì)這兩個(gè)基因是獨(dú)特的。本發(fā)明包括不同形式的干擾RNA。例如，小干擾RNA(siRNA)采用已知的指導(dǎo)方針按上述靶序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。這些siRNA是21nt雙鏈RNA寡核苷酸，3′突出端為2nt(TT)。靶向序列(mRNA序列)和siRNA的序列在表1中列舉。
RNAi藥物對(duì)靶基因序列具有特異性，這取決于基因的物種。大多數(shù)哺乳動(dòng)物基因具有很高的同源性，這樣可選擇RNAi藥物，以對(duì)所有帶有基因mRNA的該同源區(qū)段的物種中的基因產(chǎn)生活性。本發(fā)明的優(yōu)選RNAi藥物設(shè)計(jì)與人基因mRNA序列有完全的同源性，與至少一種用于毒性試驗(yàn)的動(dòng)物物種的基因mRNA有足夠同源性，以對(duì)該動(dòng)物物種基因產(chǎn)生活性。
RNAi藥物對(duì)靶基因序列具有特異性，這可包括對(duì)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的特異性。本發(fā)明優(yōu)選的RNAi藥物設(shè)計(jì)是與疾病病理相關(guān)的全部多態(tài)性的靶基因的所有人基因mRNA序列有完全的同源性，與疾病病理無(wú)關(guān)的全部多態(tài)性的靶基因的所有人基因mRNA序列有較少的同源性。
表1.基因及部分靶向mRNA序列(顯示反義鏈)
臨床相關(guān)動(dòng)物模型最近的小鼠眼模型提供了可行的角膜NV臨床相關(guān)模型。在這個(gè)模型中，用純化的HSV DNA(富含CpG)和/或合成的CpG基序-寡核苷酸(CpG ODN)，而不是用HSV干擾或VEGF蛋白質(zhì)，來(lái)誘導(dǎo)角膜中的VEGF表達(dá)，從而誘導(dǎo)NV和角膜SK。在這個(gè)模型中，易于誘導(dǎo)新生血管化并加以測(cè)量。本發(fā)明采用這個(gè)模型來(lái)測(cè)試干擾RNA并收集有關(guān)CpG誘導(dǎo)SK的RNAi療法的數(shù)據(jù)，以提供定量數(shù)據(jù)，產(chǎn)生接近于HSV感染相關(guān)的人眼SK的環(huán)境。
對(duì)病毒感染的抑制眼新生血管化的一種已確立的原因是皰疹和其他病毒感染。一種干預(yù)病毒感染衍生的眼新生血管化的手段是抑制病毒感染的起源。RNAi藥物利用的是對(duì)dsRNA病毒感染有活性的內(nèi)源過(guò)程，但事實(shí)上可用來(lái)具有高度選擇性的抑制幾乎任何mRNA的表達(dá)。本發(fā)明提供用以抑制眼病毒感染的RNAi藥物作為干預(yù)眼新生血管化的手段。本發(fā)明的RNAi藥物包括短dsRNA寡核苷酸——siRNA，其具有與病毒基因序列匹配的序列，缺乏對(duì)人類基因的序列特異性。本發(fā)明的RNAi藥物能抑制由DNA或RNA病毒感染所表達(dá)的mRNA，能降解dsRNA病毒感染的基因組。本發(fā)明的RNAi藥物所抑制的一種DNA病毒感染是引起皰疹性基質(zhì)角膜炎的HSV。這種病毒具有相對(duì)較大的保持游離的基因組，病毒mRNA的表達(dá)水平隨時(shí)間推移有升有降。連續(xù)低水平的HSV病毒mRNA表達(dá)導(dǎo)致持續(xù)的(盡管是潛伏的)感染，這種感染不時(shí)會(huì)發(fā)作。本發(fā)明的RNAi藥物可用來(lái)抑制感染復(fù)發(fā)引起的HSVmRNA表達(dá)升高。通過(guò)降低感染出現(xiàn)發(fā)作的能力，RNAi藥物能防止眼新生血管化疾病被誘發(fā)。RNAi藥物還可用于將連續(xù)的低水平HSVmRNA表達(dá)減少至更低的水平，這能降低HSV感染出現(xiàn)發(fā)作的能力。RNAi藥物能有效地抑制導(dǎo)致眼新生血管化的眼組織DNA和RNA病毒感染。
對(duì)促進(jìn)眼NV的炎性細(xì)胞和途徑的抑制炎癥是涉及許多細(xì)胞和生化因子的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程盡管復(fù)雜，但在各種組織中卻是高度保守的。炎癥中的一個(gè)早期事件是組織低氧、損傷或其他傷害所引起的激活因子分泌。這些因子能激活細(xì)胞，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞募集到組織中，炎性細(xì)胞再分泌出另外的激活因子。炎癥的誘導(dǎo)的一個(gè)共同生化途徑是TNF和IL-1的分泌。這些因子主要以并行的方式起作用，因此要強(qiáng)烈抑制它們對(duì)炎癥級(jí)聯(lián)的激活作用需要同時(shí)干預(yù)它們兩者。在此點(diǎn)下游，炎癥級(jí)聯(lián)導(dǎo)致誘導(dǎo)新生血管化的因子的分泌，炎癥過(guò)程提供了許多可供干預(yù)的點(diǎn)引發(fā)級(jí)聯(lián)的分泌性因子的上游；和負(fù)責(zé)激活級(jí)聯(lián)中的特定細(xì)胞的因子的下游，如內(nèi)皮細(xì)胞從血液募集嗜中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)新生血管化。本發(fā)明提供能有效抑制因子上調(diào)的RNAi藥物，所述因子在炎癥中的作用取決于其基因的表達(dá)。雖然許多分泌性因子存在于細(xì)胞中并被釋放出來(lái)引發(fā)炎癥，但對(duì)于炎癥的不斷發(fā)展和對(duì)于炎癥的持續(xù)存在來(lái)說(shuō)，對(duì)上述這些因子的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)是重要的。本發(fā)明的RNAi藥物提供了對(duì)持續(xù)性炎癥的抑制，而持續(xù)性炎癥是造成眼新生血管化疾病的更強(qiáng)因素。有多種因子參與到炎癥途徑中，特別是導(dǎo)致眼新生血管化疾病的持續(xù)性眼炎癥，重要的是包括內(nèi)皮細(xì)胞激活。
對(duì)介導(dǎo)眼NV的生血管途徑的抑制血管發(fā)生過(guò)程和炎癥一樣，雖然復(fù)雜但在各種組織中卻高度保守。另一個(gè)相似性是幾種分泌性因子所起的主要作用。有一個(gè)早期步驟由涉及VEGF生長(zhǎng)因子的分泌的VEGF途徑驅(qū)動(dòng)，所述VEGF生長(zhǎng)因子結(jié)合并激活攜帶VEGF家族不同成員的受體的細(xì)胞。這些生長(zhǎng)因子還與其他受體(例如NP-1)發(fā)生相互作用，從而刺激攜帶這些受體的細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞。另一種主要的分泌性生血管生長(zhǎng)因子是bFGF，其激活單獨(dú)一套受體。這兩種途徑均激活鄰近血管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞，刺激它們發(fā)生增殖和遷移，從而在分泌生長(zhǎng)因子刺激物的區(qū)域形成新的血管系統(tǒng)。但是，VEGF誘導(dǎo)的胞內(nèi)激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和bFGF途徑在與c-RAF或其下游靶轉(zhuǎn)錄因子如NFkB有關(guān)的公共點(diǎn)合并。因此，VEGF途徑和bFGF途徑在它們合并前以略為并行的方式起作用。新生血管化的這些分泌性生長(zhǎng)因子途徑代表了供進(jìn)行本發(fā)明所提供的治療干預(yù)的非常有用的點(diǎn)，所述治療干預(yù)可通過(guò)抑制生長(zhǎng)因子或其受體或兩者來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明還提供同時(shí)抑制兩種途徑，以及抑制這些途徑所誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)，如誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶，或者在優(yōu)選的實(shí)施方案中為轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子已被確立為有用的治療干預(yù)點(diǎn)，但常規(guī)治療方式對(duì)其卻難以對(duì)付。本發(fā)明提供抑制蛋白質(zhì)(包括轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)的RNAi藥物，這使得現(xiàn)在能夠在新生血管化的這些關(guān)鍵胞內(nèi)步驟進(jìn)行治療干預(yù)。
VEGF家族由五個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的成員組成VEGF-A、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。VEGF受體家族中存在三種結(jié)構(gòu)上同源的酪氨酸激酶受體VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR或Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，它們與不同VEGF成員具有不同親和性或相關(guān)的功能。雖然對(duì)其他四種VEGF成員的功能和調(diào)節(jié)知之甚少，但已知VEGF-A能結(jié)合VEGFR-1和VEGFR-2，誘導(dǎo)新生血管化、血管發(fā)生和血管通透性。為在功能上與其特異性受體發(fā)生相互作用，VEGF自然形成同型二聚體。VEGFR-1和VEGFR-2在腫瘤和增生的內(nèi)皮中均被上調(diào)，這可能是對(duì)VEGF-A或部分上對(duì)低氧的直接響應(yīng)。普遍認(rèn)為VEGFR-2介導(dǎo)血管生長(zhǎng)的血管生成信號(hào)，且為增殖所必需。但是，VEGFR-1的功能卻不甚明確。VEGFR-1對(duì)VEGF-A的親和性比VEGFR-2高，且能介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性和通透性，因此在轉(zhuǎn)導(dǎo)血管生成信號(hào)中發(fā)揮作用。對(duì)VEGF和VEGF受體的基本生物學(xué)性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，為設(shè)計(jì)靶向VEGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的方法提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明提供能特異性抑制鼠和人形式的VEGF、VEGF受體和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的RNAi藥物。
bFGF途徑是幾種FGF途徑之一。bFGF因子是血管發(fā)生的強(qiáng)刺激物，因此，它和它的受體是治療干預(yù)的重點(diǎn)。本發(fā)明提供能特異性抑制bFGF及其受體和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的RNAi藥物。
對(duì)眼NV內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制新血管系統(tǒng)形成的一個(gè)關(guān)鍵步驟是鄰近血管系統(tǒng)中激活的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。這個(gè)步驟是治療干預(yù)的重點(diǎn)。已知許多胞內(nèi)因子對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞存活和/或增殖是必不可少的。本發(fā)明提供的兩個(gè)實(shí)施方案是1)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞增殖和2)誘導(dǎo)激活內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。這兩個(gè)實(shí)施方案任一個(gè)或兩者導(dǎo)致因內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移被抑制造成的新血管系統(tǒng)減少。本發(fā)明提供抑制細(xì)胞周期從而抑制增殖的RNAi藥物。本發(fā)明還提供引發(fā)激活內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的RNAi藥物。本發(fā)明提供能通過(guò)與新血管系統(tǒng)激活有關(guān)的ανβ3/ανβ5整聯(lián)蛋白上調(diào)選擇性結(jié)合激活內(nèi)皮細(xì)胞的配體靶向納米顆粒。本發(fā)明提供的納米顆粒能將RNAi藥物給予到內(nèi)皮細(xì)胞的胞內(nèi)區(qū)室，以誘導(dǎo)凋亡或抑制增殖，或者這兩方面同時(shí)發(fā)生。
抑制眼NV疾病的組合方式導(dǎo)致過(guò)度和不需要的眼新生血管化的過(guò)程是復(fù)雜的，通常涉及并行的生化途徑。因此，在一個(gè)靶標(biāo)乃至一個(gè)途徑上進(jìn)行治療干預(yù)不能完全控制疾病病理(新生血管化)。本發(fā)明提供組合干預(yù)在生化途徑的多個(gè)靶標(biāo)上干預(yù)，或者在多個(gè)途徑上干預(yù)，或者兩方面同時(shí)進(jìn)行。例如，本發(fā)明提供對(duì)VEGF途徑的多個(gè)靶標(biāo)的干預(yù)，包括針對(duì)VEGF-A、VEGF-R1和VEGF-R2的siRNA組合。本發(fā)明進(jìn)一步提供在多個(gè)途徑上的干預(yù)，包括siRNA VEGF途徑靶標(biāo)和bFGF途徑靶標(biāo)的組合。本發(fā)明還提供這些組合的組合，例如針對(duì)VEGF途徑和bFGF途徑的siRNA組合。本發(fā)明還提供在疾病病理的多個(gè)方面上進(jìn)行組合干預(yù)，如引發(fā)包括病毒感染介質(zhì)在內(nèi)的各種因子，引發(fā)炎癥途徑、生血管途徑和內(nèi)皮細(xì)胞增殖途徑。
治療藥物的給藥，包括定位、局部和全身給藥本發(fā)明提供用以給予治療藥物以治療眼新生血管化疾病特別是治療眼前部的疾病的組合物和方法。本發(fā)明還提供用以給予治療藥物以治療眼睛任何部位(包括眼后部)的眼新生血管化疾病的組合物和方法。眼睛任何部位的組織，可根據(jù)本發(fā)明用新血管系統(tǒng)靶向給藥的治療藥物通過(guò)局部給予到眼睛和通過(guò)在遠(yuǎn)側(cè)部位靜脈內(nèi)給予來(lái)治療。眼前部的組織，可根據(jù)本發(fā)明通過(guò)局部給予到結(jié)膜下組織、通過(guò)局部給予到眼睛、通過(guò)眼周注射、通過(guò)眼內(nèi)注射和通過(guò)在遠(yuǎn)側(cè)部位靜脈內(nèi)給予來(lái)治療。本發(fā)明提供的組合物包含1)通過(guò)靜電相互作用結(jié)合核酸的陽(yáng)離子劑(cationic agent)，包括非天然合成聚合物、接枝聚合物、嵌段共聚物、肽、脂質(zhì)和膠束，2)降低與組織和細(xì)胞的非特異性結(jié)合的親水劑(hydrophilic agent)，包括非天然合成聚合物、肽和碳水化合物，3)組織和細(xì)胞穿透劑(penetrating agent)，包括表面活性劑、肽、非天然合成聚合物和碳酸化合物。
優(yōu)選的一類肽是組氨酸-賴氨酸共聚物，其為一大類堿性陽(yáng)離子肽，在一些情況下稱為PolyTranTM。優(yōu)選的另一類肽是線型聚賴氨酸，其中組氨酸或咪唑單體偶聯(lián)到賴氨酸單體的ε氨基部分。優(yōu)選的組合物具有帶負(fù)電荷的治療藥物如核酸與陽(yáng)離子肽的自組裝復(fù)合物，其中陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至10倍，更優(yōu)選陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至6倍。優(yōu)選的一類與組氨酸或咪唑單體偶聯(lián)的聚賴氨酸，其賴氨酸單體的伯胺偶聯(lián)度達(dá)30-70％。優(yōu)選的另一類肽是其單體由組氨酸-組氨酸-賴氨酸三肽或組氨酸-組氨酸-賴氨酸-賴氨酸四肽組成的聚合物，其中所述聚合物為線型聚合物或支鏈聚合物，支鏈聚合物中的一個(gè)單體偶聯(lián)到另一個(gè)單體的α或ε氨基或均偶聯(lián)。聚賴氨酸類聚合物的優(yōu)選分子量范圍為5,000-100,000，更優(yōu)選分子量為10,000-30,000。
優(yōu)選的一類接枝聚合物是與親水聚合物接枝的肽，其中所述親水聚合物包括PEG、聚唑啉(polyoxazoline)、聚縮醛(在一些情況下稱為Fleximer)、HPMA和聚甘油。優(yōu)選的組合物具有帶負(fù)電荷的治療藥物如核酸與陽(yáng)離子接枝聚合物的自組裝復(fù)合物，其中陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至10倍，更優(yōu)選陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至6倍。親水聚合物的優(yōu)選分子量范圍為2,000-10,000。優(yōu)選的另一類接枝聚合物是與親水聚合物接枝的肽，其進(jìn)一步包含接枝到親水聚合物的配體，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營(yíng)養(yǎng)物和抗體或它們的片段。
優(yōu)選的一類非天然合成陽(yáng)離子聚合物是具有乙基-氮(-C-C-N-)主鏈重復(fù)單元的聚合物，包括聚唑啉和聚乙烯亞胺(PEI)。優(yōu)選的組合物具有帶負(fù)電荷的治療藥物如核酸與陽(yáng)離子聚合物的自組裝復(fù)合物，其中陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至10倍，更優(yōu)選陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至6倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用組氨酸或咪唑單體衍生化的線型聚唑啉或PEI。優(yōu)選的另一類聚合物是用組氨酸或咪唑單體衍生化的支鏈聚唑啉或PEI。優(yōu)選的一類與組氨酸或咪唑單體偶聯(lián)的聚合物其30-70％的堿性部分是咪唑。所述聚合物的優(yōu)選分子量在5,000-100,000的范圍，更優(yōu)選分子量為10,000-30,000。
優(yōu)選的一類接枝聚合物是與親水聚合物接枝的聚合物，其中所述親水聚合物包括PEG、聚唑啉、聚縮醛(在一些情況下稱為Fleximer)、HPMA和聚甘油。優(yōu)選的組合物具有帶負(fù)電荷的治療藥物如核酸與陽(yáng)離子接枝聚合物的自組裝復(fù)合物，其中陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至10倍，更優(yōu)選陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至6倍。優(yōu)選的另一類接枝聚合物是與親水聚合物接枝的聚合物，其進(jìn)一步包含接枝到親水聚合物的配體，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營(yíng)養(yǎng)物和抗體或它們的片段。
優(yōu)選的另一類陽(yáng)離子聚合物是具有聚縮醛主鏈的聚合物。優(yōu)選的組合物具有帶負(fù)電荷的治療藥物如核酸與陽(yáng)離子聚縮醛聚合物的自組裝復(fù)合物，其中陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至10倍，更優(yōu)選陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至6倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用堿性部分衍生化的線型聚縮醛，其中所述堿性部分類別包括賴氨酸、伯胺、組氨酸和咪唑單體的混合物。優(yōu)選的另一類聚合物是用堿性部分(同樣包括賴氨酸、胺、組氨酸和咪唑單體類別)衍生化的支鏈聚縮醛。優(yōu)選的一類與賴氨酸、胺、組氨酸和咪唑單體偶聯(lián)的聚縮醛聚合物其30-70％的堿性部分是咪唑。所述聚合物的優(yōu)選分子量在5,000-100,000的范圍，更優(yōu)選分子量為10,000-30,000。優(yōu)選的一類接枝聚合物是用親水聚合物接枝的聚合物，其中所述親水聚合物包括PEG、聚唑啉、聚縮醛(在一些情況下稱為Fleximer)、HPMA和聚甘油。優(yōu)選的另一類接枝聚合物是用親水聚合物接枝的聚縮醛聚合物，其進(jìn)一步包含接枝到親水聚合物的配體，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營(yíng)養(yǎng)物和抗體或它們的片段。
優(yōu)選的一類脂質(zhì)是Woodle等(WO 01/49324，其內(nèi)容通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中)所公開的取代的乙醇胺。優(yōu)選的組合物具有帶負(fù)電荷的治療藥物如核酸與陽(yáng)離子脂質(zhì)的自組裝復(fù)合物，其中陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至10倍，更優(yōu)選陽(yáng)離子電荷過(guò)量2倍至6倍。優(yōu)選的另一類脂質(zhì)是用親水聚合物接枝的脂質(zhì)，優(yōu)選的又一類脂質(zhì)是聚合物接枝的脂質(zhì)，其進(jìn)一步包含接枝到親水聚合物的配體，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營(yíng)養(yǎng)物和抗體或它們的片段。
優(yōu)選的一類膠束是其中一種嵌段包含親水聚合物、另一種嵌段包含疏水聚合物的嵌段共聚物，包括聚環(huán)氧丙烷、疏水聚唑啉、用伯胺或咪唑或兩者衍生化的疏水聚合物、用能與治療藥物形成可裂解的鍵的部分衍生化的疏水聚合物，所述部分包括形成二硫化物的巰基、形成席夫堿的醛以及形成酯的酸或醇。優(yōu)選的組合物具有帶負(fù)電荷的治療藥物如核酸與膠束的自組裝復(fù)合物，其中膠束質(zhì)量比治療藥物質(zhì)量過(guò)量2倍至50倍，更優(yōu)選質(zhì)量過(guò)量4倍至20倍。優(yōu)選的另一類膠束是進(jìn)一步包含接枝到親水聚合物的配體的嵌段共聚物，其中所述配體包括肽、碳水化合物、維生素、營(yíng)養(yǎng)物和抗體或它們的片段。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括由以下三個(gè)功能域組成的共軛聚合物陽(yáng)離子聚合物如25kD PEI、親水聚合物如3.4kD聚乙二醇(PEG)和配體如二硫化物穩(wěn)定化的折疊RGD-肽。陽(yáng)離子聚合物域能縮合培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的常規(guī)轉(zhuǎn)染中所采用的核酸(DNA或RNA)。親水聚合物功能域保護(hù)被給藥的核酸免受降解，而且屏蔽表面電荷，從而防止核酸與細(xì)胞表面上或血液中存在的蛋白質(zhì)之間發(fā)生非特異性電荷介導(dǎo)相互作用。這些非特異性相互作用往往誘導(dǎo)治療藥物分布不利或者有害的生物活性。第三種域即RGD-肽配體提供對(duì)在有新生血管化的組織中被上調(diào)的細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白(如ανβ3和ανβ5整聯(lián)蛋白)的組織和細(xì)胞特異性尋靶作用。這個(gè)實(shí)施方案可用來(lái)進(jìn)行siRNA全身給藥，以靶向新血管系統(tǒng)和抑制不需要的血管發(fā)生(包括在眼部)。
本發(fā)明提供配制成制劑的治療藥物(包括siRNA)以給予細(xì)胞中組織中。制劑能保護(hù)核酸免受降解，促進(jìn)治療藥物的組織和細(xì)胞吸收。通過(guò)用本發(fā)明的制劑組合物給予RNAi或其他帶負(fù)電荷的治療藥物，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了治療藥物的細(xì)胞吸收和對(duì)內(nèi)源靶基因表達(dá)的抑制。通過(guò)使用制劑進(jìn)行局部給藥，本發(fā)明提供將siRNA和其治療藥物局部給予眼睛以治療眼病，包括基質(zhì)內(nèi)感染、角膜新生血管化、基質(zhì)角膜炎、色素層炎等。盡管局部給藥可能比遠(yuǎn)處全身給藥侵入性更強(qiáng)，而且招致會(huì)導(dǎo)致炎癥的感染或刺激風(fēng)險(xiǎn)，但在許多臨床情況下，例如在嚴(yán)重NV病情或在快速生長(zhǎng)的腫瘤的情況下，還是優(yōu)選局部給予siRNA。本發(fā)明還提供摻入能提高對(duì)組織的黏附力和對(duì)角膜內(nèi)皮的通透性的藥物。這種組合提供滴眼劑形式的局部應(yīng)用。
通過(guò)使用本發(fā)明的組合物和方法，可將siRNA和其他治療藥物通過(guò)局部注射或靜脈注射給藥用于治療眼新生血管化。
實(shí)施例實(shí)施例1.局部和全身給予VEGF途徑抑制劑以治療眼前部NV疾病小鼠SK模型、病毒和組織培養(yǎng)眼基質(zhì)角膜炎(SK)BALB/c小鼠模型已被報(bào)道，其角膜NV通過(guò)微袋方法將CpG DNA寡核苷酸(CpG ODN，含有HSV DNA基因組的NV誘導(dǎo)基序等價(jià)物)植入到基質(zhì)中來(lái)誘導(dǎo)，或者通過(guò)角膜劃痕法進(jìn)行HSV-1病毒感染來(lái)誘導(dǎo)。本研究中所用刺激性O(shè)DN的序列是1466，TCAACGTTGA和1555，GCTAGA CGTTAGCGT(由美國(guó)FDA生物制品評(píng)價(jià)和研究中心的Dr.Dennis M.Klinman博士提供)。用于植入到角膜微袋的微球含有ODN 1466和1555的等摩爾混合物以及先前所報(bào)道的hydron聚合物。用HSV-1 RE株(由Uni.Alabama，Mobile的RobertLausch博士提供)以每眼2-μl 1×105蝕斑形成單位的劑量誘導(dǎo)HSK。為測(cè)試體外RNAi效果，使用了以下三種細(xì)胞系RAW264.7 gamma NO(-)，ATCC CRL-2278，為表達(dá)內(nèi)源mVEGF-A的小鼠巨噬細(xì)胞系。SVR，ATCC CRL-2280，為荷mVEGF受體(mVEGFR1和mVEGFR2)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系。293細(xì)胞系，用于由cmv啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)mVEGFR2的pCImVEGFR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以檢測(cè)外源mVEGFR2的敲減。
小干擾RNA(siRNA)設(shè)計(jì)雙鏈siRNA，以靶向VEGF途徑因子mVEGF-A(XM_192823)、mVEGFR1(D88689)和mVEGFR-2(MN010612)。從每個(gè)基因選取兩個(gè)靶序列。這些序列是(從5′到3′)mVEGF-A1)AAGCCGTCCTGTGTGCCGCTG；mVEGF-A 2)AACGATGAAGCCCTGGAGTGC；mVEGFR1 1)AAGTTAAAAGTGCCTGAACTG；mVEGFR1 2)AAGCAGGCCAGACTCTCTTTC；mVEGFR2 1)AAGCTCAGCACACAGAAAGAC；mVEGFR2 2)AATGCGGCGGTGGTGACAGTA。為合成非相關(guān)siRNA對(duì)照，還選擇了LacZ(E00696)和螢火蟲熒光素酶(Luc，AF434924)各自的兩個(gè)靶序列。它們是LacZ1)AACAGTTGCGCAGCCTGAATG；LacZ 2)AACTTAATCGCCTTGCAGCAC；Luc 1)AAGCTATGAAACGATATGGGC；2)AACCGCTGGAGAGCAACTGCA。Blast序列檢索確認(rèn)這些siRNA對(duì)它們的靶向序列的特異性，mVEGF-A靶標(biāo)設(shè)計(jì)成由不同mVEGF-A異構(gòu)體所共有。所有siRNA均按Tuschl的研究小組建議的公認(rèn)指導(dǎo)方針委托設(shè)計(jì)成21-nt雙鏈RNA寡核苷酸，其任一RNA鏈的中間為19-nt雙鏈體，3’-末端為dTdT突出端；并由Qiagen合成。為獲得更好的RNAi效果，我們例行使用靶向單個(gè)mRNA分子上的不同序列的兩個(gè)雙鏈21-核苷酸RNA雙鏈體的混合物。
RNA模板特異性PCR(RS-PCR & RT-PCR)進(jìn)行RS-PCR，以檢測(cè)siRNA體外對(duì)mRNA的敲減作用。細(xì)胞質(zhì)RNA通過(guò)RNAwiz(Ambion，#9736)按廠商說(shuō)明書進(jìn)行分離，另進(jìn)行DNA酶處理，然后用專門設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RS-PCR。RT反應(yīng)的mRNA特異性反向引物均為47-mer寡核苷酸，其5′-末端30-mer的獨(dú)特序列(稱為“TS1”序列，以下用大寫字母表示)與對(duì)每個(gè)mRNA分子獨(dú)特的17-mer序列(以下用小寫字母表示)連接。它們是(從5′到3′)1)mVEGFA DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg；2)mVEGFR1 DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAtagattgaagattccgc；3)mVEGFR2 DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAggtcactgacagaggcg。
RT試驗(yàn)后對(duì)所有被測(cè)基因進(jìn)行的PCR試驗(yàn)使用相同的反向引物，TS 1GAACATC GATGACAAGCTTAGGTATCGATA。PCR的正向引物是30-mer寡核苷酸，均對(duì)每個(gè)基因獨(dú)特1)mVEGFA UpGATGTCTACCAGCGAA GCTACTGCCGTCCG；2)mVEGFR1 UpGTCAGCTGC TGGGACACCGCGGTCTTGCCT；3)mVEGFR2 UpGGCGCTGCTAGCTGTCGCTCTGTGGT TCTG。
持家基因GAPDH的RT-PCR用作RS-PCR中所用RNA量的對(duì)照。寡脫氧胸苷(dT)引物(19-mer)用于GAPDH的RT試驗(yàn)。用于PCR的引物是20-mer寡核苷酸1)GAPDH UpCCTGGTCACCA GGGCTGCTT；2)GAPDH DnCCAGCCTTCTCCATGGTGGT。
還根據(jù)前述方案使用RT-PCR。為檢測(cè)mVEGF-A表達(dá)，所用引物是5′-GCGGGCTGCCTCGCAGTC-3′(有義鏈)和5′-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3′(反義鏈)。
定量實(shí)時(shí)PCR用DNA Engme Opticon(MJ Research Inc.)進(jìn)行QRT-PCR。用SYBR Green I試劑(Qiagen，CA)按照廠商方案進(jìn)行PCR。在引物的優(yōu)選程序中，1％瓊脂糖凝膠分析證實(shí)了一個(gè)預(yù)測(cè)大小的產(chǎn)物的擴(kuò)增，無(wú)引物二聚體帶。通過(guò)建立解鏈曲線圖形也確認(rèn)每個(gè)寡核苷酸組無(wú)引物二聚體形成。如下進(jìn)行計(jì)算，以作樣品之間的半定量比較對(duì)于每個(gè)樣品，通過(guò)扣除目的基因的CT(循環(huán)閾值)與“持家”基因GAPDH的CT之差(目的基因CT-GAPDH CT＝ΔCT)使數(shù)據(jù)歸一化。然后將此ΔCT與載體對(duì)照樣品的表達(dá)水平比較(樣品ΔCT-載體ΔCT)。為確定目的基因的相對(duì)增強(qiáng)表達(dá)，進(jìn)行以下計(jì)算改變倍數(shù)＝2(樣品ΔCT-載體ΔCT)。所用的引物是mGAPDH有義鏈5′-CATCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′，GAPDH反義鏈5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGATG-3′，mVEGF164有義鏈GCCAGCACATAGAGAGAATGAGC和mVEGGF165反義鏈CAAGGCTCACAGTGATTTTCTGG。
siRNA的體內(nèi)給藥用PolyTranTM(PT)和TargeTranTM(TT)分別通過(guò)結(jié)膜下和尾靜脈注射局部和全身給藥siRNA。PT是一類能通過(guò)其帶正電荷的顆粒表面高效率地轉(zhuǎn)化細(xì)胞的陽(yáng)離子多肽。TT屬于配體靶向的nanoplex，其與不需要的生物分子和細(xì)胞的非特異性相互作用大為減少。TT由以下三個(gè)功能層組成結(jié)構(gòu)上與先前報(bào)道的含RGD肽類似的H-ACRGDMFGCA-OH肽的RGD配體、PEG立體層和聚集siRNA或其他大分子的陽(yáng)離子PEI核心(圖1)。通過(guò)設(shè)計(jì)，TT-siRNA制劑能靶向RGD特異性整聯(lián)蛋白被上調(diào)的生血管組織。先前研究已在異種移植乳腺癌小鼠腫瘤模型中證明了TT-siRNA制劑的功效，在所述小鼠腫瘤模型中給予靶向人VEGF和小鼠VEGFR2的siRNA獲得了相當(dāng)大的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。
siRNA體內(nèi)抗生血管功效的評(píng)估siRNA抑制角膜NV和HSK的功效通過(guò)三種方式進(jìn)行評(píng)估。
1)測(cè)量生血管區(qū)域在CpG ODN微球植入后第4天和第7天，用測(cè)徑器在立體顯微鏡下測(cè)量NV區(qū)域的長(zhǎng)度和寬度。起源于角膜緣血管環(huán)并長(zhǎng)向角膜中央的新血管以角膜圓周鐘點(diǎn)數(shù)描述，每個(gè)鐘點(diǎn)數(shù)等于圓周的1/12。NV面積按橢圓的公式計(jì)算。A＝[(鐘點(diǎn)數(shù))×0.4(血管長(zhǎng)度mm)]/2。
2)HSK嚴(yán)重程度的臨床評(píng)分在HSV感染后不同日子用裂隙燈檢查眼睛臨床損傷的發(fā)展。角膜炎損傷的臨床嚴(yán)重程度按以下體系評(píng)分0，正常角膜；+1，輕度角膜混濁；+2，中度角膜不透明或結(jié)疤；+3，炎癥角膜不透明但虹膜可見(jiàn)；+4，不透明角膜和角膜潰瘍；+5，角膜破裂和壞死性基質(zhì)角膜炎。
3)NV嚴(yán)重程度的臨床評(píng)分血管發(fā)生的嚴(yán)重程度如前所述進(jìn)行記錄。簡(jiǎn)單的說(shuō)，眼睛的特定四分之一圓周評(píng)分為4代表1.5mm朝向角膜中央的向心生長(zhǎng)。將眼睛的四個(gè)四分之一圓周的分?jǐn)?shù)加和，得到每只眼特定時(shí)間點(diǎn)的新生血管化指數(shù)(范圍0-16)。
xx.RNA模板特異性RT-PCR針對(duì)三個(gè)鼠VEGF途徑基因的siRNA序列的體外測(cè)量為評(píng)估候選siRNA序列的基因抑制作用，在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行了一系列的轉(zhuǎn)染，siRNA對(duì)mRNA水平的作用確定為siRNA活性的量度。用上述RS-PCR和RT-PCR進(jìn)行測(cè)量。如圖2所示，獲得了siRNA序列敲減所有三個(gè)VEGF途徑基因的證據(jù)。抑制作用在一些情況下是針對(duì)內(nèi)源表達(dá)，在另一些情況下則是針對(duì)內(nèi)源表達(dá)。
mVEGF-A的體外抑制如圖2A所示，在RAW264.7 NO(-)細(xì)胞——內(nèi)源表達(dá)VEGF-A的小鼠巨噬細(xì)胞系中評(píng)估siRNA序列抑制VEGF-A的能力。如RT-PCR所測(cè)出，mVEGF-A的120和164同種型的表達(dá)均按劑量依賴性方式降低，而對(duì)照siRNA的轉(zhuǎn)染沒(méi)有作用。
mVEGF-R1的體外抑制siRNA序列抑制VEGF R1的活性在內(nèi)源表達(dá)此種VEGF受體的SVR細(xì)胞中評(píng)估。如圖2B所示，由RS-PCR測(cè)出，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后mVEGFR1表達(dá)按劑量依賴性方式降低，而對(duì)照siRNA的轉(zhuǎn)染對(duì)mVEGFR1水平?jīng)]有作用。
mVEGF-R2的體外抑制最后，siRNA序列抑制VEGF R2的活性在293細(xì)胞中用供質(zhì)粒pCImEGFR2進(jìn)行外源表達(dá)的共轉(zhuǎn)染方法來(lái)評(píng)估。圖2C顯示mVEGFR2表達(dá)降低，而對(duì)照siRNA的轉(zhuǎn)染沒(méi)有作用。
這些體外研究結(jié)果表明，所有三種被研究的鼠VEGF途徑基因均能被通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定的siRNA序列所抑制?，F(xiàn)適合根據(jù)此研究成果評(píng)估siRNA在眼組織中的體內(nèi)給藥和活性。
熒光siRNA向鼠眼組織的給藥進(jìn)行了這樣的研究將FITC標(biāo)記siRNA給予眼組織，然后摘除組織，觀察siRNA的分布。局部給藥的結(jié)果在圖3A(左圖)中顯示。這些結(jié)果證明將siRNA摻入到PolyTran陽(yáng)離子肽聚合物促進(jìn)其向角膜組織的吸收(左上圖)，而siRNA水溶液(非配成制劑)的熒光快速消失(左下圖)。
鼠眼新血管組織中的VEGF siRNA基因抑制進(jìn)行了有關(guān)研究，以確定局部給予VEGF siRNA是否能抑制VEGFmRNA的表達(dá)水平。用HSV感染小鼠角膜誘導(dǎo)眼新生血管化，并用針對(duì)mVEGF-A基因的siRNA通過(guò)局部給藥進(jìn)行治療，以此作為檢查RNA或蛋白質(zhì)水平上的可能變化的實(shí)例。用1×105pfu HSV-1感染小鼠，并在第1天和第3天用siRNA治療后，在第4天和第7天收集角膜。通過(guò)RT-PCR或QRT-PCR測(cè)量mVEGF-A mRNA水平。由RT-PCR所測(cè)出(圖4A)，與非相關(guān)siLuc對(duì)照相比，用siVEGFmix治療的角膜在第4天和第7天mVEGF-A mRNA的表達(dá)下降。同樣，如QRT-PCR所測(cè)出(圖4B)，與用對(duì)照siRNA序列治療的角膜相比，用VEGF siRNA治療的角膜在第7天顯示顯著的mVEGF-A mRNA表達(dá)下降。在這里，全身給藥比局部給藥顯示出更強(qiáng)的功效。
與用對(duì)照siRNA治療相比，用siRNA治療HSV感染小鼠，在第7天p.i.經(jīng)ELISA監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)水平也顯示mVEGF-A被抑制(p＜0.05)(圖5)。在RNA或蛋白質(zhì)水平上所觀察到的mVEGF-A表達(dá)下降，證實(shí)siRNA對(duì)HSV誘導(dǎo)的NV和HSK的抗生血管作用(待在下文描述)與siRNA介導(dǎo)的對(duì)靶向VEGF途徑因子的敲減作用有關(guān)。
用siRNA局部治療CpG誘導(dǎo)的角膜新生血管化將hydron微球中含CpG的ODN植入到鼠眼組織(角膜微袋)中，猶如HSV感染介導(dǎo)的HSK一樣會(huì)誘導(dǎo)VEGF介導(dǎo)的血管發(fā)生。這個(gè)模型系統(tǒng)避免要處理HSV。采用這個(gè)系統(tǒng)來(lái)測(cè)量局部給予由聚合物載體PolyTranTM攜帶的siRNA的抑制作用。對(duì)所有三對(duì)分別靶向mVEGF-A、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA的體外活性(圖2)進(jìn)行了研究。在將CpG ODN插入到微袋中24小時(shí)后，通過(guò)結(jié)膜下注射給予10μg/10μl/眼的siRNA單劑量。每對(duì)siRNA雙鏈體(分別靶向VEGF-A、VEGF R1和VEGF R2)以相同的總RNA劑量(即10μg/10μl/眼)單獨(dú)或組合(以等摩爾比)進(jìn)行檢測(cè)。起源于角膜緣的新生血管化(角膜NV)在微球植入后第4天和第7天進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖6所示，與非相關(guān)siRNA對(duì)照(LacZ)相比，在微球植入后第4天和第7天在所有三個(gè)被測(cè)siRNA對(duì)上均觀察到角膜NV被顯著抑制(p＜0.05)。靶向所有三個(gè)被測(cè)基因的siRNA雙鏈體組合顯示最有效的抑制作用，在第4天測(cè)出NV減少大約60％(p＜0.01)。在第7天抑制作用最有效。這些體內(nèi)研究結(jié)果證明了被測(cè)siRNA的體內(nèi)功效；提示了PolyTranTM是作為將siRNA局部給予動(dòng)物眼睛的給藥運(yùn)載體的合理選擇；而且表明了組合使用靶向不同基因的siRNA以實(shí)現(xiàn)對(duì)病理的協(xié)同抑制作用的潛力。
對(duì)CpG ODN誘導(dǎo)的血管發(fā)生HSK模型的全身治療通過(guò)全身治療證明siRNA在眼NV部位的定位，研究了全身給藥siRNA的治療潛力。在微球植入后24小時(shí)通過(guò)尾靜脈注射給予小鼠40μg/100μl單劑量的分別靶向mVEGF-A、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA。按上述局部給藥研究相同的方式以相同的siRNA總劑量單獨(dú)或組合給予siRNA。在微球植入后第4天和第7天，按方法中所述對(duì)血管發(fā)生面積進(jìn)行測(cè)量。如圖7所示，與siLacZ治療組相比，所有被測(cè)siRNA雙鏈體單獨(dú)使用時(shí)在微球植入后第4天，均顯示對(duì)NV的顯著抑制作用(p＜0.05)。與在局部給藥中所觀察到的相似，相比于單獨(dú)使用只靶向一個(gè)靶基因的siRNA，給予靶向所有三個(gè)靶基因的siRNA混合液提供最有效的抑制作用(大約60％抑制，p＜0.01)。再且，盡管第7天的抑制效率通常低于第4天，但相比于單獨(dú)應(yīng)用的抗生血管siRNA，混合siRNA是最有效的。為證實(shí)所觀察到的TargeTranTM介導(dǎo)給藥的功效是由于給藥制劑引起的，我們比較了siRNA在相同的小鼠模型中用TargeTranTM或只用PBS全身給藥時(shí)的抗生血管功效。顯然，在植入后第4天或第7天，TargeTranTM介導(dǎo)的iRNA給藥比只用PBS運(yùn)載體給藥實(shí)現(xiàn)更有效的抗血管發(fā)生作用(p＜0.05)(圖8A)。為進(jìn)一步證實(shí)所觀察到的TargeTranTM-siRNA制劑的功效，還在相同的CpG-SK小鼠模型進(jìn)行了抗生血管功效的劑量反應(yīng)研究。帶有含CpG ODN微袋的小鼠，在微球植入后6小時(shí)和24小時(shí)以10、20、40和80μg的劑量尾靜脈注射組合siRNA雙鏈體兩劑進(jìn)行治療。在第4天和第7天評(píng)估出的抗生血管作用均顯示明顯的劑量依賴性模式(圖8B)。
用siRNA治療HSV感染誘導(dǎo)的角膜新生血管化已知了VEGF siRNA在CpG-ODN HSK模型中抑制角膜NV的功效，再用更有臨床相關(guān)性的HSV感染介導(dǎo)的HSK模型進(jìn)行研究。在這個(gè)研究中，用這個(gè)模型系統(tǒng)再次進(jìn)行siRNA的局部給予。每對(duì)siRNA雙鏈體(分別靶向VEGF-A、VEGF R1和VEGF R2)以相同的總RNA劑量單獨(dú)或組合(以等摩爾比)進(jìn)行試驗(yàn)。在HSV感染后14天中監(jiān)測(cè)到基質(zhì)角膜炎和新生血管化。如圖9所示，與用Luc siRNA對(duì)照處理的動(dòng)物相比，所有三個(gè)局部或全身給予的被測(cè)siRNA對(duì)中均觀察到對(duì)兩個(gè)測(cè)量項(xiàng)(SK和角膜NV)的顯著抑制作用(p＜0.05)。Luc siRNA對(duì)照治療的眼睛有80％發(fā)展臨床上明顯損傷(在感染后第10天評(píng)分為2或更高)，而用靶向VEGF途徑基因的siRNA治療的眼睛只有42％(局部給藥)或50％(全身給藥)發(fā)展這種損傷，在這當(dāng)中局部給藥比全身給藥顯示更強(qiáng)的抗生血管功效。這些結(jié)果匯總在一起表明，給予針對(duì)VEGF途徑基因的siRNA，可通過(guò)抑制血管發(fā)生來(lái)減少HSK的發(fā)展。如在CpG微袋模型中所觀察到(圖7)，靶向所有三個(gè)VEGF途徑基因的siRNA雙鏈體組合提供最有效的抑制作用。
FITC-siRNA向生血管眼睛的定向給藥為測(cè)試用RGD肽靶向納米顆粒全身給藥siRNA是否能提供對(duì)眼新生血管化的定位，在CpG-ODN HSK模型中用TargeTranTM給予FITC標(biāo)記的siRNA進(jìn)行研究。圖3(右圖)所示結(jié)果證明局部方法和全身方法產(chǎn)生相似的吸收效果。再且，用納米顆粒全身給予FITC標(biāo)記的siRNA結(jié)果是熒光主要分布在生血管眼中，在肝臟、腎臟或肺中水平很低(數(shù)據(jù)未顯示)。全身給予siRNA鹽水溶液沒(méi)有顯示siRNA分布到生血管眼中(圖3右圖)，這并不意外。結(jié)膜下注射PolyTranTM所觀察到的FITC-siRNA向生血管眼中的分布很可能歸因于在接近新生血管化的地方(角膜緣)局部給藥。不過(guò)，在PolyTranTM所觀察到向眼新血管的給藥，正是RGD配體靶向的nanoplex靶向在新生血管化部位被上調(diào)的整聯(lián)蛋白表達(dá)的預(yù)期特征(圖1)。
雞尾酒式siRNA應(yīng)用我們反復(fù)試驗(yàn)了“雞尾酒方法”來(lái)組合應(yīng)用siRNA雙鏈體。當(dāng)靶向相同mRNA的不同序列(組織培養(yǎng)物中，數(shù)據(jù)未顯示)或靶向所有三個(gè)被測(cè)VEGF途徑基因(體內(nèi)，圖4-8)的混合siRNA同時(shí)使用時(shí)，獲得比使用靶向單個(gè)基因的siRNA要高的效價(jià)。
在小鼠SK模型中通過(guò)局部或全身給藥siRNA實(shí)現(xiàn)了靶向mVEGFA、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA對(duì)角膜NV和SK的極大抑制作用。這種siRNA介導(dǎo)的抑制作用在被測(cè)小鼠HSK模型中以劑量依賴性方式(圖8)在CpG誘導(dǎo)的角膜NV和SK(圖6、7、8)或HSV感染引起的角膜NV和SK(圖4、5和9)中實(shí)現(xiàn)。這種抑制作用與由RS-PCR、RT-PCR和QRT-PCR測(cè)出的siRNA介導(dǎo)的體外和體內(nèi)對(duì)靶向mRNA的敲減作用(圖2、4)相一致，與ELISA測(cè)出的體內(nèi)對(duì)靶向基因的蛋白質(zhì)表達(dá)的敲減作用(圖5)也相一致。還觀察到同時(shí)給予靶向所有三個(gè)被測(cè)VEGF途徑基因的siRNA所顯示的抗生血管作用比單獨(dú)使用siRNA時(shí)更強(qiáng)(圖4-8)。這些體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在非相關(guān)Luc siRNA或LacZ siRNA對(duì)照和鹽水對(duì)照上得到的觀察結(jié)果證實(shí)，靶向VEGF途徑的siRNA和給藥試劑造成所觀察到的角膜NV抑制。
在角膜給藥試驗(yàn)中，PolyTranTM和TargeTranTM似乎都能有效給予FITC標(biāo)記的siRNA到CpG處理的眼睛。PolyTranTM相關(guān)的眼給藥似乎可歸因于給藥的位置，但TargeTranTM相關(guān)的眼給藥可能要?dú)w因于nanoplex的RGD配體靶向作用。雖然不清楚所檢測(cè)出的熒光是否來(lái)自完整或降解的siRNA分子，且所給予的RNA雙鏈體的半壽期不能由熒光檢測(cè)揭示，但還是可以適當(dāng)?shù)氐贸鋈缦陆Y(jié)論，即siRNA向生血管眼睛的選擇性給藥是通過(guò)TargeTranTM介導(dǎo)的全身途徑實(shí)現(xiàn)的。
上述多重靶向方法使siRNA介導(dǎo)的基因敲減作用得以改進(jìn)。當(dāng)靶向所有三個(gè)被測(cè)VEGF途徑基因的混合siRNA在組織培養(yǎng)物或小鼠中同時(shí)使用時(shí)，結(jié)果顯示的效價(jià)總是比使用靶向單一基因的siRNA時(shí)要強(qiáng)(圖4-8)。這種我們稱之為“雞尾酒方法”的方法可用來(lái)敲減單一基因的多個(gè)靶序列、多個(gè)靶向某個(gè)途徑的不同基因(或序列)的siRNA、多個(gè)感染介質(zhì)基因和宿主基因(例如病毒蛋白質(zhì)和宿主受體蛋白質(zhì)基因)等。這種方法適用于角膜SK、其他生血管疾病(包括腫瘤)，其原理還適用于其他疾病和生物過(guò)程。
本實(shí)施例證明，VEGF途徑特異性siRNA與臨床給藥系統(tǒng)一起使用，是治療眼NV疾病，包括HSV誘導(dǎo)的角膜SK、糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、色素層炎和發(fā)紅的新方法。配體靶向性非病毒給藥試劑在安全性、無(wú)損傷性以及siRNA治療給藥和眼NV疾病治療的組織特異性方面具有優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例2.局部給予VEGF途徑抑制劑治療眼后部NV疾病材料和方法將同一代孕母親的幼鼠在P7至P12進(jìn)行低氧(75％)處理，在P12至P16轉(zhuǎn)換到正?？諝?正常氧)。(P數(shù)指天數(shù))。采用結(jié)膜下給藥與陽(yáng)離子聚合物試劑PolyTran PT73復(fù)合的siRNA。siRNA與PT73之比為1∶8(重量)。用5mM HEPES溶液將混合物稀釋至所需體積。siRNA劑量為每眼4μg siRNA(PT73復(fù)合物中)分散于5μl體積中。在P12和P13各進(jìn)行一次注射。每只小鼠左眼用陰性對(duì)照siRNA即siLuc處理，右眼用活性siRNA即siMix處理。陰性對(duì)照siLuc為兩種寡核苷酸(siLuc-a和b)的等量混合物。siMix為simVEGFA、simVEGFR1和simVEGFR2的等量混合物，它們各自為兩種寡核苷酸(例如simVEGF-a和b、simVEGFR1-a和b、simVEGFR2-a和b)的混合物。在P16處死小鼠，進(jìn)行熒光灌注/鋪片和冷凍切片分析，以鑒定新生血管化。
結(jié)果雙眼的鋪片在圖5中顯示。一個(gè)鋪片結(jié)果顯示強(qiáng)烈熒光，熒光由出現(xiàn)過(guò)度新生血管化時(shí)灌注染料而產(chǎn)生，這是用siLuc處理的眼睛。另一個(gè)鋪片結(jié)果顯示相當(dāng)弱的熒光，這是用siMix處理的眼睛中新生血管化被抑制的標(biāo)志。
實(shí)施例3.遠(yuǎn)側(cè)全身給予VEGF途徑抑制劑治療腫瘤模型系統(tǒng)的新生血管化材料和方法核酸基于Elbashir等(2)的研究，設(shè)計(jì)siRNA標(biāo)記siLuc、siLacZ、siGFP和siVEGFR2的短雙鏈RNA寡核苷酸，經(jīng)BLAST分析證實(shí)缺乏顯著的干擾同源性，并由Dharmacon(Lafayette，CO)合成和純化。每個(gè)靶標(biāo)合成兩個(gè)序列，以1∶1摩爾比合并。所用的靶序列為，siLucaaccgctggagagcaactgca和aagctatgaaacgatatgggc，siLacZaacagttgcgcagcctgaatg和aacttaatcgccttgcagcac，siGFPaagctgaccctgaagttcatc和aagcagcacgacttcttcaag，siVEGFR2aatgcggcggtggtgacagta和aagctcagcacacagaaagac(已描述了此siRNA對(duì)VEGF R2的抑制作用(28))。靶向熒光素酶的siRNA在有義鏈的3′位置用熒光素通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)鍵化學(xué)綴合作用標(biāo)記(FITC-siRNA)，以作FACS分析和組織分布實(shí)驗(yàn)。編碼熒光素酶的pCI-Luc質(zhì)粒(pLuc)獲自LofstrandLabs(Gaithersburg，MD)。
RGD-PEG-PEI(RPP)和PEG-PEI(PP)的合成制備了兩種聚乙二醇化形式的支鏈PEI(P)，一種是其中的PEG在其遠(yuǎn)側(cè)末端帶RGD肽(RPP)，另一種是其中的PEG沒(méi)有肽(PP)。這三種化合物在本文所用的縮寫為，P代表支鏈PEI，PP代表聚乙二醇化PEI，RPP代表RGD-PEG-PEI。
合成了序列為H-ACRGDMFGCA-OH的環(huán)化10-mer RGD-肽，經(jīng)氧化形成分子內(nèi)二硫鍵，由Advanced ChemTech(Louisville，KY，USA)純化至＞95％純度。這個(gè)序列衍生自經(jīng)噬菌體展示鑒定結(jié)合RGD肽的整聯(lián)蛋白，且發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化有效(23，29)。
RPP的合成如下分兩步進(jìn)行。在第一步，在氮?dú)庀孪驍嚢柚械腞GD(60mg)的DMSO(600μL)溶液加入TEA(8.54μL于20μL THF中)。攪拌1分鐘后，一次加入NHS-PEG-VS(212mg于THF∶DMSO；300μL∶100μL中)溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4小時(shí)，用TFA(用量相當(dāng)于TEA)猝滅，然后將混合物凍干。中間體RGD-PEG-VS通過(guò)反相HPLC或?qū)λ肝鲞M(jìn)行純化，然后將混合物凍干，得率為50-90％。綴合作用通過(guò)質(zhì)譜分析(MALDI)確認(rèn)。
在合成的第二步，將100mg(21.7μmole)純化的RGD-PEG-VS中間體溶于1ml純DMSO中。向此溶液中加入6當(dāng)量TEA(溶于0.5mlTHF中)并混合。將9.4mg(218μmole，以胺計(jì))溶于DMF(0.5ml)中的PEI加入到以上溶液中，在室溫下攪拌12小時(shí)。綴合作用的完成通過(guò)TLC上RGD-PEG-VS的消失來(lái)確認(rèn)。反應(yīng)通過(guò)加入過(guò)量的TFA終止并凍干。產(chǎn)物通過(guò)HPLC純化為TFA鹽。在500MHz分光計(jì)(Varian)上通過(guò)質(zhì)子NMR光譜測(cè)定法，由對(duì)應(yīng)于PEI(2.8-3.1ppm)和PEG(3.3-3.6ppm)的-CH2-質(zhì)子的峰面積比，確定RGD-PEG與PEI的綴合度。根據(jù)這一估計(jì)，有約7％的PEI胺與RGD-PEG綴合，或者說(shuō)每25KD PEI分子有大約40個(gè)RGD-PEG分子連接于其上，使得每個(gè)PEI分子的胺平均數(shù)從580降低至540。不同合成的百分綴合度在7-9之間。
Nanoplex的制備如下制備nanoplex混合等體積的陽(yáng)離子聚合物水溶液和核酸水溶液，使可電離氮(聚合物)相對(duì)于磷酸鹽(核酸)的凈摩爾過(guò)量在2-6的范圍。陽(yáng)離子聚合物與核酸之間的靜電相互作用導(dǎo)致形成平均顆粒大小分布約為100nm的多聚物(polyplex)，本文稱nanoplex。
根據(jù)以下三種形式的PEI制備了三種形式的nanoplex支鏈PEI(P)、聚乙二醇化PEI(PP)和RGD-PEG-PEI(RPP)。較早的研究揭示，用于DNA縮聚的聚陽(yáng)離子與其他大分子的綴合作用會(huì)導(dǎo)致不完全縮聚和形成非球形結(jié)構(gòu)(30，31)。雖然我們?cè)诒狙芯克玫木Y合物中沒(méi)有觀察到任何這些問(wèn)題，但為避免出現(xiàn)這種潛在問(wèn)題，將一部分縮聚所需的聚陽(yáng)離子用非綴合PEI代替。因此所有的RPP和PP nanoplex均含有摩爾數(shù)(以胺濃度表示)與綴合物相當(dāng)?shù)腜EI。因此如下制備這些nanoplex首先用5mM Hepes緩沖液(pH 7)制備含1∶1摩爾比的RGD-PEG-PEI(RPP)或PEI-PEG(PP)與PEI(P)的陽(yáng)離子聚合物水溶液。在單獨(dú)的管中，將核酸(質(zhì)粒DNA和/或siRNA)以與陽(yáng)離子聚合物相同的總體積溶于相同的緩沖液中。然后將兩個(gè)溶液合并在一起，旋渦攪拌30秒鐘，制成nanoplex。平均顆粒大小分布用Coulter N4plus顆粒大小測(cè)定儀(Beckman Coulter)測(cè)定，ζ-電勢(shì)在Coulter Delsa 440 SX測(cè)定儀上進(jìn)行測(cè)量。兩種儀器均用確定大小和遷移率的膠乳珠(Beckman Coulter，Miami，F(xiàn)L)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。
小鼠腫瘤新生血管化模型雌性裸鼠(6-8周齡)獲自Taconic(Germantown，NY)，關(guān)在頂部有濾膜的籠中(filter-topped)，不限制標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物食物(rodent chow)和水，并接受12小時(shí)的光/暗周期。實(shí)驗(yàn)按照國(guó)際法規(guī)和地方動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)(local animal experiments ethical committee)的批準(zhǔn)進(jìn)行。通過(guò)在小鼠脅腹接種1×106N2A細(xì)胞誘導(dǎo)皮下N2A腫瘤。腫瘤在體積約0.5-1cm3時(shí)開始顯示新生血管化，此時(shí)小鼠通過(guò)尾靜脈注射0.2ml溶液接受nanoplex或游離siRNA。在組織分布實(shí)驗(yàn)中，注射40μg游離形式或者P-nanoplex或RPP-nanoplex形式的熒光標(biāo)記siRNA。注射后一小時(shí)，解剖組織并用適合熒光的解剖顯微鏡檢查。組織的鏡檢用Olympus SZX12熒光顯微鏡進(jìn)行，該顯微鏡裝備有數(shù)碼相機(jī)并與運(yùn)行MagnaFire 2.0相機(jī)軟件(Optronics，Goleta，CA)的PC連接。每個(gè)組織均以相等的曝光時(shí)間拍照。
在腫瘤新生血管化表型研究中，當(dāng)接種腫瘤細(xì)胞后第7天可觸知腫瘤時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。每鼠每3天通過(guò)尾靜脈注射用40μg siRNA(RPP-nanoplex中)進(jìn)行處理。每隔一定時(shí)間由對(duì)處理分配不知情的觀測(cè)者用數(shù)字測(cè)徑器測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。每個(gè)測(cè)量包括相隔大約90度的兩個(gè)方向上的腫瘤直徑。腫瘤體積如下計(jì)算0.52×最長(zhǎng)直徑×最短直徑2(32)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物，切除腫瘤組織和周圍皮膚，置顯微鏡載玻片上，測(cè)定新生血管化。用以上對(duì)熒光組織測(cè)量所述的Olympus顯微鏡和相機(jī)設(shè)備，通過(guò)顯微鏡檢術(shù)進(jìn)行新生血管化和血管發(fā)生的組織檢查。透照組織以顯示皮膚中的血管，攝取數(shù)字圖像并如上所述進(jìn)行保存。然后立即將組織速凍，待進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
蛋白質(zhì)印跡分析腫瘤樣品中的鼠VEGF受體2表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。將腫瘤組織與M-Per哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)提取試劑(Pierce)一起放入lysingMatrix D(Bio-Rad，Cambridge，MA)中。將組織均漿，離心，收集上清。將相當(dāng)含量的提取蛋白質(zhì)(50μg)與含5％2-巰基乙醇(Bio-Rad)的樣品緩沖液混合，煮沸，冷卻后加樣到6％聚丙烯酰胺凝聚的各泳道上。在30mA下進(jìn)行電泳，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Immunblot PVDF膜(Bio-Rad)。用3％明膠(于Tris緩沖鹽水(TBS)中)將膜封閉過(guò)夜。隨后將膜轉(zhuǎn)移到1％明膠(于TTBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％吐溫20)中)，與1μg單克隆抗mVEGFR2抗體(R&D Systems)溫育過(guò)夜。在TTBS中洗滌兩次后，將山羊抗小鼠IgG過(guò)氧化物酶綴合物加入到1％明膠中保持1小時(shí)，用TTBS洗滌膜兩次，然后用TBS洗滌一次?？贵w用Bio-Rad顏色試劑盒染色30分鐘。
結(jié)果siRNA Nanoplex膠體特性用定型設(shè)計(jì)法開發(fā)siRNA nanoplex，以設(shè)計(jì)出結(jié)合以下三個(gè)功能要求的分子綴合物自組裝、形成立體聚合物保護(hù)性表面層和暴露配體。為設(shè)計(jì)siRNA nanoplex，我們重新研究了原先質(zhì)粒DNA所用的材料，包括聚陽(yáng)離子絡(luò)合劑用聚乙烯亞胺(PEI)、立體穩(wěn)定用聚乙二醇(PEG)和含Arg-Gly-Asp(RGD)基序的肽配體，所述肽配體因其靶向在腫瘤血管系統(tǒng)中的激活內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的整聯(lián)蛋白的能力而提供腫瘤選擇性。雖然含有RGD基序的肽能結(jié)合幾種整聯(lián)蛋白，但它們的特異性是由側(cè)翼氨基酸序列以及結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象決定的。在本研究中，我們使用了“環(huán)狀”RGD肽，其整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域在構(gòu)象上受到二硫鍵的約束。這個(gè)肽具有被證明當(dāng)在絲狀噬菌體上表達(dá)時(shí)通過(guò)受體介導(dǎo)途徑造成細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化的肽的環(huán)狀區(qū)域當(dāng)中的完全相同氨基酸序列。這個(gè)肽被證明以序列特異性方式抑制細(xì)胞附著于纖連蛋白和玻連蛋白包被的板。此外，當(dāng)偶聯(lián)到寡賴氨酸時(shí)，這個(gè)肽在多種細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞)中顯示受體介導(dǎo)的DNA給藥。在這些研究中，為促進(jìn)與PEG的化學(xué)綴合，將丙氨酸殘基添加到這個(gè)肽的環(huán)狀區(qū)域外部的每個(gè)末端。靶向性siRNA nanoplex如下制備化學(xué)合成帶陽(yáng)離子聚合物、立體聚合物和肽配體(RPP)的三聯(lián)聚合物綴合物，然后在水溶液中與核酸混合進(jìn)行納米顆粒自組裝。這個(gè)RPP綴合物允許對(duì)每個(gè)功能域進(jìn)行個(gè)別優(yōu)化或化學(xué)置換。
當(dāng)將純化RPP與核酸水溶液混合時(shí)，綴合物的陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)域結(jié)合帶負(fù)電荷的核酸，驅(qū)動(dòng)自組裝形成那么顆粒分散液。研究發(fā)現(xiàn)，胺(PEI)與磷酸鹽(核酸)之比(N/P)為2∶1時(shí)可形成穩(wěn)定的nanoplex。此比例下的顆粒大小和ζ-電勢(shì)結(jié)果在表I中給出。RPP-nanoplex或PP-nanoplex的平均大小都比較小，在0.07-0.10μm之間。在監(jiān)測(cè)顆粒大小的9天時(shí)間內(nèi)，顆粒大小基本保持不變。相反，P-nanoplex的平均顆粒大小較大，在0.12-0.17μm之間，且在24小時(shí)內(nèi)發(fā)生聚集。發(fā)現(xiàn)帶siRNA的P-nanoplex的ζ-電勢(shì)如同質(zhì)粒DNA通常所見(jiàn)的那樣為高正電勢(shì)，達(dá)35±4mV，但PEI的PEG綴合物的摻入導(dǎo)致PP-nanoplex和RPP-nanoplex的ζ-電勢(shì)分別下降至5±6mV和6±1mV。表面電荷極性和數(shù)量取決于兩種成分的比例，但在相同的比例下，當(dāng)存在PEG時(shí)表面電荷數(shù)量(數(shù)據(jù)未顯示)下降，表明在nanoplex表面上形成了立體聚合物層。
這些顆粒大小和ζ-電勢(shì)測(cè)量結(jié)果表明，與siRNA形成的RPPnanoplex顯示膠體表面特性，這種膠體表面特性表示了立體聚合物外層和潛在暴露的介導(dǎo)細(xì)胞結(jié)合特異性的RGD配體。只需簡(jiǎn)單地將RPP綴合物水溶液與siRNA混合，就可發(fā)生這種nanoplex自組裝(RPP-nanoplex)。它們的膠體特性和生物特性比得上不含RGD肽的前體綴合物的制劑(PP-nanoplex)，或者比得上非綴合PEI(P-nanoplex)。
腫瘤吸收、靶向基因抑制、表型作用選擇RPP-nanoplex，在荷瘤小鼠中進(jìn)行有關(guān)新生血管化的抑制的體內(nèi)研究。進(jìn)行研究是為了確定通過(guò)靜脈注射給予荷瘤動(dòng)物的siRNAnanoplex造成siRNA在腫瘤新生血管化水平的提高。通過(guò)對(duì)FITC標(biāo)記的siRNA向裸鼠中的確立成神經(jīng)細(xì)胞瘤N2A腫瘤的吸收進(jìn)行成像，觀察腫瘤新生血管化積累情況。被給予siRNA、P-nanoplex和RPP-nanoplex水溶液的動(dòng)物中腫瘤、肺和肝臟FITC熒光的熒光顯微鏡檢結(jié)果在圖中顯示。靜脈給予siRNA水溶液并沒(méi)有在腫瘤中產(chǎn)生可觀的FITC-siRNA熒光。同樣，對(duì)于這個(gè)樣品，在肝臟中只觀察到極少的FITC熒光，在肺中還更少。這些結(jié)果極可能是FITC-siRNA被快速降解到尿中、組織積累不足(肝臟除外)和導(dǎo)致FITC被快速排泄或被肝臟代謝的潛在代謝不穩(wěn)定性的反映。腫瘤中缺乏來(lái)自FITC-siRNA水溶液的熒光表明，會(huì)導(dǎo)致FITC從nanoplex制劑中損失的任何FITC鍵不穩(wěn)定性都將不產(chǎn)生腫瘤熒光。這個(gè)結(jié)論由給予P-nanoplex時(shí)缺乏腫瘤FITC熒光得到證實(shí)。這種腫瘤FITC熒光缺乏證明，P-nanoplex在腫瘤中沒(méi)有積累到任何可檢測(cè)程度，siRNA nanoplex中也沒(méi)有任何FITC鍵穩(wěn)定性使人為腫瘤熒光得以產(chǎn)生。另一方面，P-nanoplex中的FITC-siRNA的確在肝臟中特別是在肺中產(chǎn)生可觀的點(diǎn)狀FITC-siRNA熒光。相反，RPP-nanoplex在腫瘤新血管系統(tǒng)中產(chǎn)生可觀的FITC-siRNA熒光，但其在肝臟和肺中積累不足，表現(xiàn)為點(diǎn)狀熒光較弱。這提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，即RPP-nanoplex顯示出非特異性組織相互作用減少，從而減少肝臟和肺的吸收，同時(shí)顯示出由于靶向作用造成的在腫瘤新血管系統(tǒng)中的積累。由于FITC熒光標(biāo)記通過(guò)寡核苷酸所常規(guī)使用的具有已知體內(nèi)穩(wěn)定性的鍵共價(jià)連接到siRNA，在這些組織中觀察到的熒光分布對(duì)應(yīng)于siRNA的分布，而不是對(duì)應(yīng)于FITC不穩(wěn)定性。此外，即使以水溶液形式給予對(duì)血清降解更為敏感的FITC綴合siRNA，也不在任何被測(cè)量的組織中造成任何顯著積累。這些結(jié)果表明RPP siRNA nanoplex造成siRNA分子在腫瘤新血管系統(tǒng)中水平提高，這導(dǎo)致下文描述的在腫瘤中進(jìn)行的siRNA生物活性研究。
用靶向內(nèi)源治療基因的siRNA，確定siRNA是否通過(guò)RPP介導(dǎo)的向腫瘤中的給藥來(lái)抑制新生血管化。在這些研究中，選擇了靶向鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGF R2)的siRNA，并將其與RPP nanoplex一起使用，因?yàn)樵撌荏w是血管發(fā)生中的關(guān)鍵因素。不過(guò)，為對(duì)此基因產(chǎn)生治療作用，需要將siRNA給予至腫瘤中的宿主(鼠)內(nèi)皮細(xì)胞中，以引起對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的表型作用。用抑制鼠VEGF R2表達(dá)的siRNA通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物鑒定進(jìn)行了功效研究(數(shù)據(jù)未顯示)。用這種治療性基因siRNA，每3天以RPP-nanoplex形式靜脈給予進(jìn)行研究。在圖中顯示的結(jié)果表明了對(duì)腫瘤VEGF R2水平、新生血管化和生長(zhǎng)速率的抑制作用，并且這種抑制作用是序列特異性的。腫瘤血管發(fā)生與VEGF R2表達(dá)水平一起作了鑒定。腫瘤生長(zhǎng)速率下降與緊靠腫瘤周圍的血管減少并行發(fā)生。另外，在用mVEGF R2 siRNA治療的腫瘤中可見(jiàn)血管很少，這是使VEGFR2表達(dá)沉默所預(yù)期出現(xiàn)的無(wú)規(guī)律分支的證據(jù)。VEGFR2在受治療腫瘤中的表達(dá)也是以序列特異性方式減少(圖6E)。這些結(jié)果匯總一起支持了這樣的說(shuō)法，即RPP-nanoplex中的siVEGFR2對(duì)腫瘤的抑制作用是因?yàn)閟iRNA被有效給予至腫瘤血管系統(tǒng)中，產(chǎn)生對(duì)VEGFR2表達(dá)、腫瘤血管發(fā)生和生長(zhǎng)的序列特異性抑制而發(fā)生的。這些結(jié)果證明siRNA nanoplex通過(guò)新血管靶向和抑制機(jī)制起作用。
實(shí)施例4.遠(yuǎn)側(cè)全身給予VEGF途徑抑制劑治療眼后部NV疾病材料和方法將同一代孕母親的幼鼠在P7至P12進(jìn)行低氧(75％)處理，然后在P12至P16轉(zhuǎn)換到正?？諝?正常氧)。采用靜脈給藥遞送與陽(yáng)離子聚合物試劑PolyTran RPP復(fù)合的siRNA。siRNA與RPP之比為1∶2-1∶8(重量)。用5mM HEPES溶液將混合物稀釋至所需體積。siRNA劑量為每鼠10μg-100μg siRNA(RPP復(fù)合物中)分散于100μl體積中。在一些情況下在P12開始給藥，在另一些情況下早些給藥，而在又一些情況下晚些給藥。按不同時(shí)間表從連續(xù)一周每天給藥到每周一次給藥，反復(fù)進(jìn)行給藥。對(duì)于每個(gè)研究，一組小鼠用陰性對(duì)照siRNA即siLuc治療，另一組小鼠用活性siRNA即siMix治療。陰性對(duì)照siLuc為兩種寡核苷酸(siLuc-a和b)的等量混合物。siMix為simVEGFA、simVEGFR1和simVEGFR2的等量混合物，它們各自為兩種寡核苷酸(例如simVEGF-a和b、simVEGFR1-a和b、simVEGFR2-a和b)的混合物。從P16起在不同時(shí)間處死小鼠，進(jìn)行熒光灌注/鋪片和冷凍切片分析，以鑒定新生血管化。
結(jié)果當(dāng)小鼠用siLuc處理時(shí)，雙眼的鋪片顯示強(qiáng)烈熒光，熒光由過(guò)度新生血管化出現(xiàn)時(shí)灌注染料而產(chǎn)生。當(dāng)小鼠用siMix處理時(shí)，新生血管化被抑制，雙眼的鋪片結(jié)果顯示相當(dāng)弱的熒光。
RNAi藥物siRNA藥物按照本發(fā)明的方法和實(shí)施例1的說(shuō)明設(shè)計(jì)和制備siRNA藥物。合適的siRNA藥物的序列在以下附錄II中顯示。
1)RNA特異性PCR(RS-PCR)用RS-PCR來(lái)檢測(cè)靶向基因的mRNA合成的減少。RS-PCR包括兩個(gè)連續(xù)反應(yīng)RNA特異性反轉(zhuǎn)錄(RT)和PCR。從被測(cè)哺乳動(dòng)物中摘除被轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織，用RNAwiz(Ambion)從中分離總細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄物，并按Promega的T7RiboMAX手冊(cè)所述的方式用DNA酶處理。無(wú)DNA的RNA用作RT反應(yīng)的模板，以合成mRNA特異性cDNA分子的第一鏈。為RT設(shè)計(jì)的mRNA特異性引物從5′到3′方向包含特殊30nt序列，其與靶向基因編碼序列不互補(bǔ)，接著是與AUG密碼子下游約400nt的部分編碼序列互補(bǔ)的14nt序列。RT反應(yīng)用MuLv反轉(zhuǎn)錄酶(retrotranscriptase)(Applied Biosystems)在20μl體積中進(jìn)行。反應(yīng)在37℃進(jìn)行30秒，接著42℃進(jìn)行15秒，然后94℃加熱5秒。PCR反應(yīng)用GeneAmp試劑盒(PE Biosystems)進(jìn)行。PCR所用的每對(duì)引物包括正向引物和反向引物，前者與從AUG密碼子下游約10nt開始的編碼序列互補(bǔ)，后者只具有上述特殊30nt序列。50μl反應(yīng)中含有每對(duì)引物的1μl 20μm原液、5μl 10x PCRII緩沖液、3μl 25mM MgCl2、1μl10mM dNTPs和0.5μl(5u/μl)TaqDNA聚合物酶。如下進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2秒，然后94℃1秒-72℃2秒兩步反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，接著72℃10秒后，在4℃下浸泡。反應(yīng)樣品隨DNA大小標(biāo)準(zhǔn)一起通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。合理大小(約400bp)的DNA片段的密度反映了靶基因特異性mRNA在被感染細(xì)胞中的起始水平。siRNA由Dharmacon合成，引物由Elim Biopharmaceuticals合成。
2)RS-PCR引物的設(shè)計(jì)對(duì)于mVEGF-A(參考序列XM 192823)引物1mVEGF-A Up(30-mer，mVEGF-A編碼序列的4-33nt或克隆序列的64-93nt)。
5′---GAT GTC TAC CAG CGA AGC TAC TGC CGT CCG---3′引物2mVEGF-A Dn(47-mer，前面30-mer同“TS1引物”，后面17-mer與mVEGF-A編碼序列的403-387nt或克隆序列的463-447nt互補(bǔ))。
5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA caa gct gcctog cct tg---3′對(duì)于mVEGFR-1(參考序列D88689)引物3mVEGFR-1 Up(30-mer，mVEGFR-1編碼序列的4-33bp或克隆序列的255-284)5′---GTC AGC TGC TGG GAC ACC GCG GTC TTG CCT---3′引物4mVEGFR-1 Dn(47-mer，前面30-mer同“TS1引物”，后面17-mer與mVEGFR-1編碼序列的377-361nt或克隆序列的628-612nt互補(bǔ))。
5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA tag att gaa gattcc gc---3′
對(duì)于mVEGFR-2(參考序列D88689)引物5mVEGFR2/400Dn(47-mer，3′17-mer與mVEGFR2 400-384nt互補(bǔ))5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA ggt cac tgacag agg cg---3′引物6mVEGFR2/12up(30-mer，mVEGFR2的12-41)5′---GGC GCT GCT AGC TGT CGC TCT GTG GTT CTG---3′表2.RS-PCR靶向基因和產(chǎn)物大小
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43.Banerjee K，et al.J Immunol 2004，1721237-1245.
附錄II.眼病的siRNA靶向序列和抗血管發(fā)生活性SS1.VEGF途徑SS1.1.VEGF-AVEGF基因人VEGF，檢索號(hào)XM_052681，基因ID14781453，小鼠VEGF，檢索號(hào)M95200，基因ID202350。
選擇了以下20個(gè)候選siRNA
位置 序列VEGF-A-1 64-84AAGTGGTCCCAGGCTGCACCCVEGF-A-2 467-487 AAGATCCGCAGACGTGTAAATVEGF-A-3 498-518 AAACACAGACTCGCGTTGCAAVEGF-A-4 499-519 AACACAGACTCGCGTTGCAAGVEGF-A-5 517-537 AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAVEGF-A-6 537-557 AAACGAACGTACTTGCAGATGVEGF-A-7 538-558 AACGAACGTACTTGCAGATGTVEGF-A-8 542-564 AACGTACTTGCAGATGTGACAVEGF-A-9 162-182 AATCGAGACCCTGGTGGACATVEGF-A-10338-358 AAGGCCAGCACATAGGAGAGAVEGF-A-1192-112 AAGGAGGAGGGCAGAATCATCVEGF-A-12386-406 AATGCAGACCAAAGAAAGATAVEGF-A-13380-400 AATGTGAATGCAGACCAAAGAVEGF-A-14301-321 AACATCACCATGCAGATTATGVEGF-A-15451-471 AAGCATTTGTTTGTACAAGATVEGF-A-16116-136 AAGTGGTGAAGTTCATGGATGVEGF-A-17401-421 AAGATAGAGCAAGACAAGAAAVEGF-A-18421-441 AATCCCTGTGGGCCTTGCTCAVEGF-A-19379-499 AAATGTGAATGCAGACCAAAGVEGF-A-20262-282 AATGACGAGGGCCTGGAGTGTSS1.2.VEGF-BVEGF-B基因人VEGF-B，檢索號(hào)NM_003377.3，基因ID39725673選擇了以下10個(gè)候選siRNA位置 序列VEGF-B-1 140-160 AAAGTGGTGTCATGGATAGATVEGF-B-2 141-163 AAGTGGTGTCATGGATAGATGVEGF-B-3 236-258 AAACAGCTGGTGCCCAGCTGCVEGF-B-4 327-349 AAGTCCGGATGCAGATCCTCAVEGF-B-5 390-412 AAGAACACAGCCAGTGTGAATVEGF-B-6 393-415 AACACAGCCAGTGTGAATGCAVEGF-B-7 424-446 AAAGGACAGTGCTGTGAAGCCVEGF-B-8 425-447 AAGGACAGTGCTGTGAAGCCAVEGF-B-9 440-462 AAGCCAGACAGGGCTGCCACTVEGF-B-10670-692 AACCCAGACACCTGCAGGTGCSS1.3.
VEGF R-1基因人VEGF-R1，(hFLT-1)，檢索號(hào)AF063657，基因ID3132830，小鼠VEGF-R1，(mFLT-1)，檢索號(hào)D88689，基因ID2809068)，選擇了以下20個(gè)候選siRNA
位置 序列VEGFR1-1 1706-1728AAGGAGAGGACCTGAAACTGTVEGFR1-2 2698-2720AAGCAAGGAGGGCCTCTGATGVEGFR1-3 2702-2724AAGGAGGGCCTCTGATGGTGAVEGFR1-4 2755-2777AACTACCTCAAGAGCAAACGTVEGFR1-5 3014-3036AAGTGGCCAGAGGCATGGAGTVEGFR1-6 3048-3070AAAGTGCATTCATCGGGACCTVEGFR1-7 3049-3071AAGTGCATTCATCGGGACCTGVEGFR1-8 2140-2160AGCACGCTGTTTATTGAAAGAVEGFR1-9 568-588 AAGGGCTTCATCATATCAAATVEGFR1-10215-235 AAAGGCTGAGCATAACTAAATVEGFR1-112352-2372AAGGTCTTCTTCTGAAATAAAVEGFR1-123517-3537AATGCCATACTGACAGGAAATVEGFR1-131190-1210AAGAGGATGCAGGGAATTATAVEGFR1-14834-854 AAGGCGACGAATTGACCAAAGVEGFR1-1589-109 AAGATCCTGAACTGAGTTTAAVEGFR1-16216-236 AAGGCTGAGCATAACTAAATCVEGFR1-173429-3449AAGGCCAAGATTTGCAGAACTVEGFR1-18967-987 AACACCTCAGTGCATATATATVEGFR1-19567-587 AAAGGGCTTCATCATATCAAAVEGFR1-201938-1958AATCCTCCAGAAGAAAGAAATSS1.4.
VEGF R-2基因人VEGF-R2，(hKDR)，檢索號(hào)AF063658，基因ID3132832，小鼠VEGF-R2，(mFLK-1)，檢索號(hào)X70842，基因ID57923)，選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列VEGFR2-1 523-545 AACAGAATTTCCTGGGACAGCVEGFR2-2 2387-2409AACTGAAGACAGGCTACTTGTVEGFR2-3 2989-3011AAGGACTTCCTGACCTTGGAGVEGFR2-4 3032-3054AAGTGGCTAAGGGCATGGAGTVEGFR2-5 3040-3062AAGGGCATGGAGTTCTTGGCAVEGFR2-6 3401-3423AAATGTACCAGACCATGCTGGVEGFR2-7 3632-3654AATTCCATTATGACAACACAGVEGFR2-8 3676-3698AACAGTAAGCGAAAGAGCCGGVEGFR2-9 3641-3661ATGACAACACAGCAGGAATCAVEGFR2-10357-377 AAGCTCAGCACACAGAAAGACVEGFR2-11493-513 AATGCGGCGGTGGTGACAGTASS2.EGF途徑SS2.1.
EGF基因人EGF，檢索號(hào)NM_001963，基因ID6031163。
選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列EGF-12042-2062AAGTGGATAGAGAGAGCTAATEGF-23873-3893AAGGCTGCTGGATTCCAGTATEGF-32426-2446AAGCAGTCTGTGATTGAAATGEGF-42621-2641AAGCCCTCATCACTGGTTGTGEGF-51273-1293AAAGGACATGGTTAGAATTAAEGF-62328-2348AAGGCCTTGGCCGTCTGGTTAEGF-7174-194 AAGGGTGTCAGGTATTTCTTAEGF-83922-3942AATGGAGCGAAGCTTTCATATEGF-91496-1516AAGTACTGTGAAGATGTTAATEGF-10 1274-1294AAGGACATGGTTAGAATTAACEGF-11 531-551 AAGGTACTCTCGCAGGAAATGEGF-12 2686-2706AAACGGAGGCTGTGAACATATEGF-13 2263-2283AATGGCCAAGAGATTATTCTGEGF-14 1292-1312AACCTCCATTCATCATTTGTAEGF-15 261-281 AAGGTCTCTCAGTTGAAGAAAEGF-16 3218-3238AATGCCAGCTGCACAAATACAEGF-17 1019-1039AAGGCTCTGTTGGAGACATCAEGF-18 2576-2596AAGAGGACTGGCAAAGATAGAEGF-19 760-780 AAGGCAAGAGAGAGTATGTAAEGF-20 765-785 AAGAGAGAGTATGTAATATAGSS2.2.
EGF R基因人EGF-R，檢索號(hào)NM_005228，基因ID41327737)，小鼠EGF-R，檢索號(hào)NM_207655，基因ID46560581，選擇了以下5個(gè)候選siRNA位置 序列EGFR-1 483-505 AAAGACCATCCAGGAGGTGGCEGFR-2 2869-2889AAAGTGCCTATCAAGTGGATGEGFR-3 2870-2890AAGTGCCTATCAAGTGGATGGEGFR-4 3751-3771AACCCTGACTACCAGCAGGACEGFR-5 3755-3775CTGACTACCAGCAGGACTTCTSS2.3.
HER-2基因人HER-2，檢索號(hào)M11730，基因ID183986，小鼠HER-2，檢索號(hào)BC053078，基因ID31419374，選擇了以下5個(gè)候選siRNA位置 序列
HER2-1 1255-1275AAGATCTTTGGGAGCCTGGCAHER2-2 1253-1273AAGAAGATCTTTGGGAGCCTGHER2-3 2797-2817AAGGTGCCCATCAAGTGGATGHER2-4 3019-3039AAATGTTGGATGATTGACTCTHER2-5 3805-3825AACCTCTATTACTGGGACCAGSS2.4.
HER-3基因人HER-3，檢索號(hào)M34309，基因ID183990，小鼠HER-3，檢索號(hào)XM125954，基因ID38091004，選擇了以下13個(gè)候選siRNA位置 序列HER3-1 678-698 AATTGACTGGAGGGACATCGTHER3-2 1264-1284AAGATCCTGGGCAACCTGGACHER3-3 1537-1557AAGGAAATTAGTGCTGGGCGTHER3-4 2404-2424AAGATTCCAGTCTGCATTAAAHER3-5 2857-2877AAATACACACACCAGAGTGATHER3-6 2858-2878AATACACACACCAGAGTGATGHER3-7 3770-3790AAGATGAAGATGAGGAGTATGHER3-8 3776-3796AACCTCTATTACTGGGACCAGHER3-9 1118-1138CTGACAAGATGGAAGTAGATAHER3-10 1119-1139TGACAAGATGGAAGTAGATAAHER3-11 2402-2422TCAAGATTCCAGTCTGCATTAHER3-12 2403-2423CAAGATTCCAGTCTGCATTAAHER3-13 2805-2825TGAGGCCAAGACTCCAATTAASS2.5.
HER-4基因人HER-4，檢索號(hào)NM_005235，基因ID4885214，小鼠HER-4，檢索號(hào)XM_136682，基因ID38049556。
選擇了以下7個(gè)候選siRNA位置 序列HER4-1 462-482 AAATGGTGGAGTCTATGTAGAHER4-2 463-483 AATGGTGGAGTCTATGTAGACHER4-3 731-751 AATGTGCTGGAGGCTGCTCAGHER4-4 838-860 AATCCAACCACCTTTCAACTGHER4-5 1227-1247AACAGGTTTCCTGAACATACAHER4-6 1450-1470AACTGGACAACACTCTTCAGCHER4-7 1909-1929AACGGTCCCACTAGTCATGACSS3.FGF途徑SS3.1.
FGF-2基因人FGF-2(堿性FGF)，檢索號(hào)NM_002006，基因ID41352694。
選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列FGF-2-1 630-650 AAGAGCGACCCTCACATCAAGFGF-2-2 661-681 AAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGFGF-2-3 849-869 AAACGAACTGGGCAGTATAAAFGF-2-4 880-900 AAACAGGACCTGGGCAGAAAGFGF-2-5 854-874 AACTGGGCAGTATAAACTTGGFGF-2-6 648-668 AAGCTACAACTTCAAGCAGAAFGF-2-7 850-870 AACGAACTGGGCAGTATAAACFGF-2-8 881-901 AACAGGACCTGGGCAGAAAGCFGF-2-9 667-687 AAGAGAGAGGAGTTGTGTCTAFGF-2-10 723-743 AAGGAAGATGGAAGATTACTGFGF-2-11 734-754 AAGATTACTGGCTTCTAAATGFGF-2-12 781-801 AACGATTGGAATCTAATAACTFGF-2-13 690-710 AAAGGAGTGTGTGCTAACCGTFGF-2-14 818-838 AAGGAAATACACCAGTTGGTAFGF-2-15 804-824 AATACTTACCGGTCAAGGAAAFGF-2-16 750-770 AAATGTGTTACGGATGAGTGTFGF-2-17 822-842 AAATACACCAGTTGGTATGTGFGF-2-18 655-675 AACTTCAAGCAGAAGAGAGAGFGF-2-19 823-843 AATACACCAGTTGGTATGTGGFGF-2-20 798-818 AACTACAATACTTACCGGTCASS3.2.
FGF-1基因人FGF-1(酸性FGF)，轉(zhuǎn)錄物變體1，檢索號(hào)NM_000800，基因ID15055546；轉(zhuǎn)錄物變體2，檢索號(hào)NM_033136，基因ID15055540；轉(zhuǎn)錄物變體3，檢索號(hào)NM_033137，基因ID15055544。
選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列
FGF-1-1 447-467 AAGGCTGGAGGAGAACCATTAFGF-1-2 214-234 AAGCCCAAACTCCTCTACTGTFGF-1-3 190-210 AATCTGCCTCCAGGGAATTACFGF-1-4 114-134 AAGCGCCACAAGCAGCAGCTGFGF-1-5 484-504 AAGAAGCATGCAGAGAAGAATFGF-1-6 539-559 AACGCGGTCCTCGGACTCACTFGF-1-7 460-480 AACCATTACAACACCTATATAFGF-1-8 97-117 AAGCTCTTTAGTCTTGAAAGCFGF-1-9 469-489 AACACCTATATATCCAAGAAGFGF-1-10221-241 AACTCCTCTACTGTAGCAACGFGF-1-11288-308 AAGGGACAGGAGCGACCAGCAFGF-1-12487-507 AAGCATGCAGAGAAGAATTGGFGF-1-13113-133 AAAGCGCCACAAGCAGCAGCTFGF-1-14502-522 AATTGGTTTGTTGGCCTCAAGFGF-1-15520-540 AAGAAGAATGGGAGCTGCAAAFGF-1-16211-231 AAGAAGCCCAAACTCCTCTACFGF-1-17538-558 AAACGCGGTCCTCGGACTCACFGF-1-18526-546 AATGGGAGCTGCAAACGCGGTFGF-1-19220-240 AAACTCCTCTACTGTAGCAACFGF-1-20424-444 AATGAGGAATGTTTGTTCCTGSS3.3.
FGFR2基因人FGFR2，轉(zhuǎn)錄物變體1，檢索號(hào)NM_000141，基因ID13186239；轉(zhuǎn)錄物變體2，檢索號(hào)NM_022969，基因ID13186252；轉(zhuǎn)錄物變體3，檢索號(hào)NM_022970，基因ID13186254；轉(zhuǎn)錄物變體4，檢索號(hào)NM_022971，基因ID13186256；轉(zhuǎn)錄物變體5，檢索號(hào)NM_022972，基因ID13186258；轉(zhuǎn)錄物變體6，檢索號(hào)NM_022973，基因ID13186260；轉(zhuǎn)錄物變體7，檢索號(hào)NM_022974，基因ID13186262；轉(zhuǎn)錄物變體8，檢索號(hào)NM_022975，基因ID27754768；轉(zhuǎn)錄物變體9，檢索號(hào)NM_022976，基因ID13186266；轉(zhuǎn)錄物變體10，檢索號(hào)NM_023028，基因ID13186268；轉(zhuǎn)錄物變體11，檢索號(hào)NM_023029，基因ID13186242；轉(zhuǎn)錄物變體12，檢索號(hào)NM_023030，基因ID13186270；轉(zhuǎn)錄物變體13，檢索號(hào)NM_023031，基因ID13186272；選擇了以下20個(gè)候選siRNA
位置 序列FGFR2-1 1368-1388AAGCCGGACTGCCGGCAAATGFGFR2-2 2610-2630AAGCCCTGTTTGATAGAGTATFGFR2-3 2088-2108AAGCAGTGGGAATTGACAAAGFGFR2-4 2297-2317AAAGGCAACCFCCGAGAATACFGFR2-5 1753-1773AATCGCCTGTATGGTGGTAACFGFR2-6 2010-2030AATGGGAGTTTCCAAGAGATAFGFR2-7 699-719 AAGAGCCACCAACCAAATACCFGFR2-8 2843-2863AAGCAGTTGGTAGAAGACTTGFGFR2-9 1187-1207AAGCAGGAGCATCGCATTGGAFGFR2-10 1082-1102AAGCGGCTCCATGCTGTGCCTFGFR2-11 1557-1577AAGAGATTGAGGTTCTCTATAFGFR2-12 1771-1791AACAGTCATCCTGTGCCGAATFGFR2-13 2762-2782AAGCCAGCCAACTGCACCAACFGFR2-14 1178-1198AAGGAGTTTAAGCAGGAGCATFGFR2-15 2151-2171AAGATGATGCCACAGAGAAAGFGFR2-16 2745-2765AAGGACACAGAATGGATAAGCFGFR2-17 1171-1191AAACGGGAAGGAGTTTAAGCAFGFR2-18 1222-1242AAACCAGCACTGGAGCCTCATFGFR2-19 2732-2752AAGCTGCTGAAGGAAGGACACFGFR2-20 1556-1576AAAGAGATTGAGGTTCTCTATSS3.4.
FGFR1基因人FGFR1轉(zhuǎn)錄物變體1，檢索號(hào)NM_000604，基因ID13186232；轉(zhuǎn)錄物變體2，檢索號(hào)NM_015850，基因ID13186250；轉(zhuǎn)錄物變體3，檢索號(hào)NM_023105，基因ID13186233；轉(zhuǎn)錄物變體4，檢索號(hào)NM_023106，基因ID13186235；轉(zhuǎn)錄物變體5，檢索號(hào)NM_023107，基因ID13186237；轉(zhuǎn)錄物變體6，檢索號(hào)NM_023108，基因ID13186240；轉(zhuǎn)錄物變體7，檢索號(hào)NM_023109，基因ID13186244；轉(zhuǎn)錄物變體8，檢索號(hào)NM_023110，基因ID13186246；轉(zhuǎn)錄物變體9，檢索號(hào)NM_023111，基因ID13186248；選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列
FGFR1-1 2701-2721AACGGCCGACTGCCTGTGAAGFGFR1-2 2275-2295AAGTCGGACGCAACAGAGAAAFGFR1-3 2422-2442AAGGGCAACCTGCGGGAGTACFGFR1-4 2255-2275AAGTGGCTGTGAAGATGTTGAFGFR1-5 2319-2339AATGGAGATGATGAAGATGATFGFR1-6 2237-2257AACCCAACCGTGTGACCAAAGFGFR1-7 2887-2907AAGCCCAGTAACTGCACCAACFGFR1-8 1540-1560AACGTGGAGTTCATGTGTAAGFGFR1-9 2236-2256AAACCCAACCGTGTGACCAAAFGFR1-10 2332-2352AAGATGATCGGGAAGCATAAGFGFR1-11 1153-1173AACACCAAACCAAACCGTATGFGFR1-12 1303-1323AATGGCAAAGAATTCAAACCTFGFR1-13 2905-2925AACGAGCTGTACATGATGATGFGFR1-14 1636-1656AACCTGCCTTATGTCCAGATCFGFR1-15 2857-2877AAGCTGCTGAAGGAGGGTCACFGFR1-16 1596-1616AAAGCACATCGAGGTGAATGGFGFR1-17 2230-2250AAGGACAAACCCAACCGTGTGFGFR1-18 2968-2988AAGCAGCTGGTGGAAGACCTGFGFR1-19 2254-2274AAAGTGGCTGTGAAGATGTTGFGFR1-20 1444-1464AACCACACATACCAGCTGGATSS3.5.
FGFR3基因人FGFR3，檢索號(hào)M58051，基因ID182568轉(zhuǎn)錄物變體1，檢索號(hào)NM_000142，基因ID13112046；轉(zhuǎn)錄物變體2，檢索號(hào)NM_022965，基因ID13112047；選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列
FGFR3-1 1969-1989AACCTCGACTACTACAAGAAGFGFR3-2 1627-1647AAGATGATCGGGAAACACAAAFGFR3-3 1588-1608AAGGACCTGTCGGACCTGGTGFGFR3-4 865-885 AAGGTGTACAGTGACGCACAGFGFR3-5 2263-2283AAGCAGCTGGTGGAGGACCTGFGFR3-6 652-672 AAGCTGCGGCATCAGCAGTGGFGFR3-7 1540-1560AAGCCTGTCACCGTAGCCGTGFGFR3-8 1571-1591AAGACGATGCCACTGACAAGGFGFR3-9 1321-1341AACGCGTCCATGAGCTCCAACFGFR3-10 1297-1317AAGCGACAGGTGTCCCTGGAGFGFR3-11 2191-2211AACTGCACACACGACCTGTACFGFR3-12 994-1014 AAGGAGCTAGAGGTTCTCTCCFGFR3-13 1570-1590AAAGACGATGCCACTGACAAGFGFR3-14 982-1002 AACACCACCGACAAGGAGCTAFGFR3-15 1873-1893AAGTGCATCCACAGGGACCTGFGFR3-16 331-351 AATGCCTCCCACGAGGACTCCFGFR3-17 1813-1833AAGGACCTGGTGTCCTGTGCCFGFR3-18 2152-2172AAGCTGCTGAAGGAGGGCCACFGFR3-19 1723-1743AACCTGCGGGAGTTTCTGCGGFGFR3-20 265-285 AAGGATGGCACAGGGCTGGTGSS3.6.
FGFR4基因人FGFR4，檢索號(hào)L03840，基因ID182570轉(zhuǎn)錄物變體1，檢索號(hào)NM_002011，基因ID47524172；轉(zhuǎn)錄物變體2，檢索號(hào)NM_022963，基因ID47524176；轉(zhuǎn)錄物變體3，檢索號(hào)NM213647，基因ID47524174；選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列
FGFR4-1 726-746 AAGGATGGACAGGCCTTTCATFGFR4-2 2403-2423AAGGTCCTGCTGGCCGTCTCTFGFR4-3 1743-1763AAGCTGATCGGCCGACACAAGFGFR4-4 1085-1105AAAGACTGCAGACATCAATAGFGFR4-5 292-312 AAGAGCAGGAGCTGACAGTAGFGFR4-6 1657-1677AAGCCAGCACTGTGGCCGTCAFGFR4-7 753-773 AACCGCATTGGAGGCATTCGGFGFR4-8 1833-1853AAGGGAAACCTGCGGGAGTTCFGFR4-9 1392-1412AAGCTCTCCCGCTTCCCTCTGFGFR4-10 1078-1098AAGTCCTAAAGACTGCAGACAFGFR4-11 1692-1712AACGCCTCTGACAAGGACCTGFGFR4-12 604-624 AAGCACCCTACTGGACACACCFGFR4-13 1086-1106AAGACTGCAGACATCAATAGCFGFR4-14 1686-1706AAAGACAACGCCTCTGACAAGFGFR4-15 666-686 AACACCGTCAAGTTCCGCTGTFGFR4-16 1454-1474AAGCTCATCCCTGGTACGAGGFGFR4-17 984-1004 AAGGTGTACAGCGATGCCCAGFGFR4-18 1687-1707AAGACAACGCCTCTGACAAGGFGFR4-19 1764-1784AACATCATCAACCTGCTTGGTFGFR4-20 504-524 AATCTCACCTTGATTACAGGTSS4.1.其他途徑I
HP BRCA2-AAAGTCAACCACAGAGTCGTAT247-268HP BRCA2-BAAGTAACGAGTGAGCCACGCT215-235NOXA-AAAGTCGAGTGTGCTACTCAAC238-258NOX AACTGAACTTCCGGCAGAAAC277-297新型ZF蛋白AATGCGGAGAACACTAATTAT345-365新型ZF蛋白AACTTCCATAAATGTGAAATC381-401NFAT4 AAGTGATACTCCCGCCTCAGC726-746NFAT4 AAGTAGCTGGCACTACGGGCA752-772SP1的輔因子 AATCAGGTTCCAATGTGATGA200-221SP1的輔因子 AAGGCTTAGCTCCCAAGCCTC145-165Ets2抑制蛋白 AAGGCAGATCCAGCTGTGGCA194-214Ets2抑制蛋白 AAGCCAGAGTCGTCCCCTGGC171-191PKC相關(guān) AAGTCTTCCGTTTTCTGAGAA69-89PKC相關(guān) AATGGTGCAGCAGAAATTGGA126-136PKC eta AAGAAGGGCCACCAGCTGCTG269-289PKC eta AACGTCACCGACGGCGGCCAC389-409線粒體F0 AACCTCGGGCAGAAGAGGAGA164-184線粒體F0 AACTGAAACGGATTGCCAGAG211-231Bcl-2 TF AAGAAGCGATACAGGTCTCGT91-111Bcl-2 TF AAGGTCTCGTAGTAGAGATCG126-146Bcl-2 A1 AACCTGGATCAGGTCCAAGCA257-277Bcl-2 A1 AATCTGAAGTCATGCTTGGAC334-354RAP1 AACAGAGGAGGACTACATTCC267-287RAP1 AACCACGAAATCACCAGCATC379-399SS5.1.其他途徑II
EGFR-RP-A AK026010AAGCTGGACATTCCCTCTGCGEGFR-RP-B AAGAGCCCAGCTTCCTGCAGC內(nèi)質(zhì)蛋白94-AAK025862AACTGTTGAGGAGCCCATGGA內(nèi)質(zhì)蛋白94-BAATCTGATGATGAAGCTGCAG葉酸BP-AAF000381AACCGCGGTCCTATTCCATTA葉酸BP-BAACACTCCAATTFTTCAAAGTA-RAF-A U33821 AAGAGTTACCTTCCTAATGCAA-RAF-B AAGATTGGGTTGGTATATTCANOVEL-1-A NM_017873 AATCCTTGTTCTCACTGAGCTNOVEL-1-B AAGATGGCTGAGCTGGGGCTGEGF因子8-A NM_005928 AACCCCTGCCACAACGGTGGTEGF因子8-B AACCACTGTGAGACGAAATGTAPRIL-A AK090698AACTGCCCCAGCGATCTCTGCAPRIL-B AACCTAATTCTCCTGAGGCTGPGF前體-A AK023843AAGAGTGACACTGTGGCTTCCPGF前體-B AATGGGCTGAGCTGCTGCTCCSS6，TNF途徑TNF途徑SS6.1.
TNF基因人TNF(同義詞DIF，TNFA，TNFSF2，TNF-α)，檢索號(hào)NM 000594，基因ID 25952110選擇了以下10個(gè)候選siRNA位置 序列hTNF-1 428-448 AAGCCTGTAGCCCATGTTGTAhTNF-2 512-532 AATGGCGTGGAGCTGAGAGAThTNF-3 671-691 AACCTCCTCTCTGCCATCAAGhTNF-4 533-553 AACCAGCTGGTGGTGCCATCAhTNF-5 731-751 AAGCCCTGGTATGAGCCCATChTNF-6 497-517 AATGCCCTCCTGGCCAATGGChTNF-7 779-899 AAGGGTGACCGACTCAGCGCThTNF-8 181-201 AAGCATGATCCGGGACGTGGAhTNF-9 665-685 AAGGTCAACCTCCTCTCTGCChTNF-10 180-200 AAAGCATGATCCGGGACGTGGSS6.2.
hTNFR1基因人TNF受體，1A(同義詞TNFRSF1A，F(xiàn)PF，p55，p60，TBP1，TNF-R，TNFAR，TNFR1，p55-R，CD120a，TNFR55，TNFR60，TNF-R-I，TNF-R55，MGC19588)，檢索號(hào)NM_001065，
基因ID23312372選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列hTNFR1-1 666-686 AAGAACCAGTACCGGCATTAThTNFR1-2 1005-1025AAGCTCTACTCCATTGTTTGThTNFR1-3 1320-1340AAGCCACAGAGCCTAGACACThTNFR1-4 841-861 AAAGCCTGGAGTGCACGAAGThTNFR1-5 472-492 AAGGAACCTACTTGTACAATGhTNFR1-6 714-734 AATTGCAGCCTCTGCCTCAAThTNFR1-7 605-625 AATGGGTCAGGTGGAGATCTChTNFR1-8 669-689 AACCAGTACCGGCATTATTGGhTNFR1-9 471-491 AAAGGAACCTACTTGTACAAThTNFR1-10462-482 AAGTGCCACAAAGGAACCTAChTNFR1-11604-624 AAATGGGTCAGGTGGAGATCThTNFR1-12810-830 AACGAGTGTGTCTCCTGTAGThTNFR1-13888-908 AAGGGCACTGAGGACTCAGGChTNFR1-14809-829 AAACGAGTGTGTCTCCTGTAGhTNFR1-15991-1011 AACGGTGGAAGTCCAAGCTCThTNFR1-16768-788 AACACCGTGTGCACCTGCCAThTNFR1-17732-752 AATGGGACCGTGCACCTCTCChTNFR1-181089-1109AACCCAAGCTTCAGTCCCACThTNFR1-19476-496 AACCTACTTGTACAATGACTGhTNFR1-20444-464 AATTCGATTTGCTGTACCAAGSS6.3.
hTNFR2基因人TNF受體，1B(同義詞TNFRSF1B，p75，TBPII，TNFBR，TNFR2，CD120b，TNFR80，TNF-R75，p75TNFR，TNF-R11)，檢索號(hào)Nom001066，基因ID23312365。
選擇了以下20個(gè)候選siRNA位置 序列
hTNFR2-1 844-864 AAGGGAGCACTGGCGACTTCGhTNFR2-2 957-977 AAGCCCTTGTGCCTGCAGAGAhTNFR2-3 412-432 AAGCCTGCACTCGGGAACAGAhTNFR2-4 1362-1382AAGGAGGAATGTGCCTTTCGGhTNFR2-5 294-314 AAGACCTCGGACACCGTGTGThTNFR2-6 351-371 AACTGGGTTCCCGAGTGCTTGhTNFR2-7 784-804 AACCCAGCACTGCTCCAAGCAhTNFR2-8 1301-1321AATGGGAGACACAGATTCCAGhTNFR2-9 979-1099 AAGCCAAGGTGCCTCACTTGChTNFR2-10914-934 AATAGGAGTGGTGAACTGTGThTNFR2-111227-1247AATGTCACCTGCATCGTGAAChTNFR2-12600-620 AACACGACTTCATCCACGGAThTNFR2-131288-1308AAGCCAGCTCCACAATGGGAGhTNFR2-14432-452 AACCGCATCTGCACCTGCAGGhTNFR2-15984-1004 AAGGTGCCTCACTTGCCTGCChTNFR2-16800-820 AAGCACCTCCTTCCTGCTCCChTNFR2-17954-974 AAGAAGCCCTTGTGCCTGCAGhTNFR2-181245-1265AACGTCTGTAGCAGCTCTGAChTNFR2-191369-1389AATGTGCCTTTCGGTCACAGChTNFR2-20776-796 AACTCCAGAACCCAGCACTGCSS6.4.
小鼠IL-1b AGGCTCCGAGATGAACAACAA小鼠IL-1b TACCTGTCCTGTGTAATGAAA小鼠IL-1r ACCATCGAGGTTACTAATGAA小鼠IL-1r TCGGAATATCTCCCATCATAA小鼠IL-1a TCGGGAGGAGACGACTCTAAA小鼠IL-1a CCAGAGTGATTTGAGATACAA小鼠IL-1r2 CACGTTTATCTCGGCTGCTTA小鼠IL-1r2 AAGACTGATAGTCCCGTGCAA小鼠TNF受體aAAGGAAAGTATGTCCATTCTA小鼠TNF受體aCCGCAACGTCCTGACAATGCA小鼠TNF受體bCCAGGTTGTCTTGACACCCTA小鼠TNF受體bCTGGCTATTCCCGGAAATGCA小鼠TNF CACGTCGTAGCAAACCACCAA小鼠TNF CAGCCGATTTGCTATCTCATA
權(quán)利要求
1.一種包含至少一種dsRNA寡核苷酸和藥物載體的組合物，其中當(dāng)給予患有與新生血管化或血管發(fā)生有關(guān)的眼病的受試者時(shí)，所述dsRNA抑制與眼病中的新生血管化或血管發(fā)生有關(guān)的基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述藥物載體選自聚合物、脂質(zhì)或膠束。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中所述眼病選自基質(zhì)角膜炎、色素層炎、發(fā)紅、結(jié)膜炎、角膜炎、瞼炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑變性和視網(wǎng)膜病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其中所述dsRNA抑制選自促炎途徑基因、促血管發(fā)生途徑基因、促細(xì)胞增殖途徑基因以及病毒感染介質(zhì)基因組RNA和病毒感染介質(zhì)基因的基因的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，所述組合物包含至少兩種dsRNA分子，其中每種dsRNA分子能抑制選自促炎途徑基因、促血管發(fā)生途徑基因、促細(xì)胞增殖途徑基因以及病毒感染介質(zhì)基因組RNA和病毒感染介質(zhì)基因的基因的表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，所述組合物包含至少三種dsRNA分子，其中至少一種dsRNA分子能抑制VEGF的表達(dá)，至少一種dsRNA分子能抑制VEGF R1的表達(dá)，至少一種dsRNA分子能抑制VEGF R2的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，所述組合物包含至少兩種dsRNA分子，其中至少一種dsRNA分子能抑制堿性FGF的表達(dá)，至少一種dsRNA分子能抑制FGF R的表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個(gè)或多個(gè)VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合的表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個(gè)或多個(gè)促血管發(fā)生基因、促炎基因或它們的組合的表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個(gè)或多個(gè)促血管發(fā)生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個(gè)或多個(gè)促血管發(fā)生基因、內(nèi)皮細(xì)胞增殖基因或它們的組合的表達(dá)。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述dsRNA分子能抑制一個(gè)或多個(gè)促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達(dá)。
13.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，所述組合物包含至少三種能抑制至少兩個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的dsRNA分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述基因編碼VEGF、VEGFR1和VEGF R2。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述基因編碼堿性FGF和FGF R的表達(dá)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述基因編碼VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述基因是促血管發(fā)生基因、促炎基因或它們的組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述基因是促血管發(fā)生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述基因是促血管發(fā)生基因、內(nèi)皮細(xì)胞增殖基因或它們的組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述基因是促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述載體選自聚陽(yáng)離子粘合劑、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陽(yáng)離子膠束、陽(yáng)離子多肽、親水聚合物接枝聚合物、非天然陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子聚縮醛、親水聚合物接枝聚縮醛、配體官能化陽(yáng)離子聚合物和配體官能化親水聚合物接枝聚合物。
22.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的組合物，其中所述dsRNA分子是dsRNA寡核苷酸。
23.一種治療受試者的眼病的方法，其中所述疾病至少部分特征是新生血管化，所述方法包括給予所述受試者包含dsRNA寡核苷酸和藥學(xué)可接受載體的組合物，其中所述dsRNA寡核苷酸能抑制促使所述受試者發(fā)生眼新生血管化的基因的表達(dá)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述眼病至少位于眼前部。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述組合物在選自結(jié)膜下、靜脈和皮下的眼睛遠(yuǎn)側(cè)部位給予。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述組合物局部給予眼睛。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述藥物載體選自聚合物、脂質(zhì)或膠束。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述眼病選自基質(zhì)角膜炎、色素層炎、發(fā)紅、結(jié)膜炎、角膜炎、瞼炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑變性和視網(wǎng)膜病。
29.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述dsRNA能抑制至少一個(gè)選自促炎途徑基因、促血管發(fā)生途徑基因、促細(xì)胞增殖途徑基因以及病毒感染介質(zhì)基因組RNA和病毒感染介質(zhì)基因的基因的表達(dá)。
30.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述dsRNA能抑制不只一個(gè)基因的表達(dá)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF、VEGF R1和VEGF R2的表達(dá)。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制堿性FGF和FGF R的表達(dá)。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合的表達(dá)。
34.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發(fā)生基因、促炎基因或它們的組合的表達(dá)。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發(fā)生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達(dá)。
36.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發(fā)生基因、內(nèi)皮細(xì)胞增殖基因或它們的組合的表達(dá)。
37.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達(dá)。
38.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制不只兩個(gè)基因的表達(dá)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF、VEGF R1和VEGF R2的表達(dá)。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制堿性FGF和FGF R的表達(dá)。
41.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF途徑基因、FGF途徑基因或它們的組合的表達(dá)。
42.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發(fā)生基因、促炎基因或它們的組合的表達(dá)。
43.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發(fā)生基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達(dá)。
44.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管發(fā)生基因、內(nèi)皮細(xì)胞增殖基因或它們的組合的表達(dá)。
45.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促炎基因、單純皰疹病毒基因或它們的組合的表達(dá)。
46.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述載體選自聚陽(yáng)離子粘合劑、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陽(yáng)離子膠束、陽(yáng)離子多肽、親水聚合物接枝聚合物、非天然陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子聚縮醛、親水聚合物接枝聚縮醛、配體官能化陽(yáng)離子聚合物和配體官能化親水聚合物接枝聚合物。
47.根據(jù)權(quán)利要求23-46中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
全文摘要
提供了治療眼病的組合物和方法。具體的說(shuō)，提供了能抑制眼睛血管發(fā)生和/或新生血管化的siRNA分子和siRNA分子的混合物。所述組合物和方法適合用于治療與血管發(fā)生和/或新生血管化有關(guān)的眼病。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101052644SQ200580011952
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月5日
發(fā)明者Q·唐, P·Y·盧, F·Y·謝, M·C·伍德爾 申請(qǐng)人:因特拉迪格姆公司