專利名稱：用于肉毒毒素的局部施用和透皮遞送的組合物和方法
本申請要求2004年3月3日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/550,015的優(yōu)先權(quán)。以美國臨時專利申請?zhí)?0/550,015的全文在此引用作為參考。
背景技術(shù)：
皮膚保護身體的器官免受外界環(huán)境的威脅并充當(dāng)恒溫器以維持身體的溫度。其由幾個不同的層構(gòu)成，各層具有特化的功能。主要的層包括表皮、真皮和皮下組織。表皮是覆在真皮上面的上皮細胞的層化層，真皮由結(jié)締組織構(gòu)成。表皮和真皮都進一步由皮下組織(內(nèi)層脂肪組織)支持。
表皮，皮膚的最上層，只有0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s Medical Society，1-7(1998))。其由角質(zhì)形成細胞構(gòu)成并且基于其分化的狀態(tài)分為幾層。表皮可進一步分為角質(zhì)層和由粒狀melphigian以及基底細胞組成的活表皮層。角質(zhì)層是吸濕的并且按重量計算需要至少10％的水分以維持其彈性和柔軟性。吸濕性部分歸因于角蛋白的保持水分的能力。角質(zhì)層失去其柔軟性和彈性時，其變得粗糙易碎，導(dǎo)致干性膚質(zhì)。
正好位于表皮下面的真皮為1.5至4毫米厚。其是皮膚的三層中最厚的一層。此外，真皮也包含大多數(shù)皮膚的結(jié)構(gòu)，包括汗腺和脂腺(其通過在皮膚中稱為毛孔或粉刺的開口分泌物質(zhì))、毛囊、神經(jīng)末梢和血管及淋巴管(Inlander，Skin，New York，NYPeople′sMedical Society，1-7(1998))。然而，真皮的主要成分是膠原和彈性蛋白。
皮下組織是皮膚的最深層。其充當(dāng)保持體溫的絕熱器和保護器官的減震器(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s Medical Society，1-7(1998))。另外，皮下組織也貯存作為能源蘊藏的脂肪。皮膚的pH一般在5和6之間。該酸性是由于存在來自皮脂腺分泌物的兩性氨基酸、乳酸和脂肪酸造成的。術(shù)語“酸性保護膜”是指皮膚的大多數(shù)區(qū)域上存在可溶于水的物質(zhì)。皮膚的緩沖能力部分歸因于貯藏在皮膚角質(zhì)層中的這些分泌物。
皺紋，老化體征中的一個體征，可以是由生物化學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)變化造成的，所述變化是由環(huán)境破壞積累的(Benedetto，International Journal of Dermatology，38641-655(1999))。此外，存在可導(dǎo)致面部皺紋的特征性折痕、折皺和摺痕的其他次要因素(Stegman等人，The Skin of the Aging Face CosmeticDermatologcal Surgery，第2版，St.Louis，MOMosby Year Book5-15(1990))。這些次要因素包括重力的恒定拉力、對皮膚的經(jīng)常性和恒定性定位壓力(即，在睡眠期間)，和由面部肌肉的收縮產(chǎn)生的反復(fù)的面部活動(Stegman等人，The Skin of the Aging FaceCosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis，MOMosbyYear Book5-15(1990))。為了潛在地減緩一些老化的體征，使用了不同的技術(shù)。這些技術(shù)從含有α羥酸和維生素A的面部保濕液到手術(shù)方法和神經(jīng)毒素的注射。
皮膚的一個基本功能是為潛在地對正常內(nèi)穩(wěn)態(tài)有害的水分和物質(zhì)的運輸提供屏障。沒有堅韌的、半透性的皮膚，身體將很快脫水。皮膚幫助防止有害物質(zhì)進入身體。盡管大多數(shù)物質(zhì)不能滲透過屏障，但已發(fā)展了許多策略來選擇性地增加皮膚的透性并獲得不同程度的成功。
肉毒毒素(Botulinum toxin)(也稱作肉毒桿菌毒素或肉毒神經(jīng)毒素)是由革蘭氏陽性細菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產(chǎn)生的神經(jīng)毒素。其通過阻止突觸傳遞或乙酰膽堿通過神經(jīng)肌肉接頭的釋放來使肌肉產(chǎn)生麻痹，其也被認為以其他的方式發(fā)揮作用。其作用基本上阻斷了通常導(dǎo)致肌肉痙攣或收縮的信號，從而產(chǎn)生麻痹。
肉毒毒素被分為八種血清學(xué)上相關(guān)但不同的神經(jīng)毒素。其中，七種可導(dǎo)致麻痹，即A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒神經(jīng)毒素。通過和類型特異性抗體的中和作用來區(qū)分這些亞型中的每一亞型。然而，對于所有這七種活性肉毒毒素，肉毒毒素蛋白分子的分子量大約為150kD。因為通過細菌釋放，所以肉毒毒素是包含和非毒素蛋白結(jié)合在一起的150kD肉毒毒素蛋白分子的復(fù)合物。梭菌可產(chǎn)生900kD、500kD和300kD形式的A型肉毒毒素復(fù)合物。B型和C型肉毒毒素只有700kD或500kD表觀的復(fù)合物產(chǎn)生。D型肉毒毒素可以300kD和500kD的復(fù)合物形式產(chǎn)生。E型和F型肉毒毒素只以大約300kD復(fù)合物的形式產(chǎn)生。據(jù)認為復(fù)合物(即，分子量大于大約150kD)含有非毒素血凝素蛋白以及非毒素和非毒性非血凝素蛋白。這兩種非毒素蛋白(其和肉毒毒素分子一起包含相關(guān)的神經(jīng)毒素復(fù)合物)可用于為肉毒毒素分子提供抗變性的穩(wěn)定性，以及當(dāng)毒素被攝入時提供抗消化酸的保護作用。此外，更大的(大于大約150kD分子量)的肉毒毒素復(fù)合物可能導(dǎo)致肉毒毒素從肉毒毒素復(fù)合物的肌內(nèi)注射位點擴散的速度變慢。
肉毒毒素的不同血清型在其作用的動物種類和在其引起的麻痹嚴(yán)重度和持續(xù)時間上是不同的。例如，如以在大鼠中產(chǎn)生的麻痹率估量，已確定A型肉毒毒素比B型肉毒毒素強500倍。此外，已確定B型肉毒毒素在480u/kg的劑量(大約是靈長類動物對于A型的LD50的12倍)下在靈長類動物中是無毒的。由于肉毒毒素的分子大小和分子結(jié)構(gòu)的原因，其不能穿過角質(zhì)層和多層底層皮膚結(jié)構(gòu)。
肉毒中毒，由于系統(tǒng)性肉毒毒素暴露而產(chǎn)生的特征綜合癥狀，自古以來就在歐洲存在。在1895年，Emile P.van Ermengem第一次從腌生豬肉中分離出厭氧性產(chǎn)孢子桿菌，該腌生豬肉獲自在比利時死于肉毒中毒的死豬的死后的組織。Van Ermengem發(fā)現(xiàn)所述疾病是由他稱為肉毒芽孢桿菌(Bacillus botulinus)產(chǎn)生的細胞外毒素引起的(Van Ermengem，Z Hyyg Infektionskr，261-56；Rev Infect(1897))。1922年該名稱改為肉毒梭菌。名稱梭菌用于反映該微生物的無氧特性，也反映其形態(tài)學(xué)特征(Carruthers和Carruthers，CanJ Ophthalmol，31389-400(1996))。在1920年代，在其他食物中毒暴發(fā)后分離了A型肉毒桿菌毒素的粗提物形式。University ofCalifornia，San Francisco的Dr.Herman Sommer進行了第一次純化神經(jīng)毒素的嘗試(Borodic等，Ophthalmic Plast Recostr Surg，754-60(1991))。1946年，Dr.Edward J.Schantz和其同事分離了以晶體形式存在的神經(jīng)毒素(Schantz等人，InJankovi J，HalletM(Eds)Therapy with Botulinum Toxin，New York，NYMarcelDekker，41-49(1994))。到了1949年，Burgen和其同事能夠證明肉毒毒素阻斷通過神經(jīng)肌肉接點的沖動(Burgen等人，J Physiol，10910-24(1949))。Allan B.Scott在1973第一次在猴子中使用肉毒毒素A(BTX-A)。Scott證實持續(xù)3個月的可逆的眼肌麻痹(Lamanna，Science，130763-772(1959))。此后很快地，報導(dǎo)了BTX-A成功地在人中治療了斜視、眼瞼痙攣、和痙攣性斜頸(Baron等人，InBaron EJ，Peterson LR，F(xiàn)inegold SM(Eds)，Bailey & ScottsDiagnostic Microbiology，St.Louis，MOMosby Year Book，504-523(1994)；Carruthers和Carruthers，Adv Dermatol，12325-348(1997)；Markowitz，InStrickland GT(Eds)HuntersTropical Medicine，第7版，PhiladelphiaW.B.Saunders，441-444(1991))。在1986年，Jean和Alastair Carruthers，由眼外科醫(yī)生和皮膚科醫(yī)生組成的夫妻團隊，開始發(fā)展肉毒毒素-A(BTX-A)的化妝品用途，用于眉間區(qū)域中和運動相關(guān)的皺紋的治療(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，NewYorkAcademic Press，143-150(1981))。Carruthers使用BTX-A治療皺紋在1992年導(dǎo)致其的關(guān)于該方法的開創(chuàng)性出版物問世(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects ofBotulinum，New YorkAcademic Press，143-150(1981))。到了1994年，相同的組報導(dǎo)了關(guān)于治療臉上的其他運動相關(guān)的皺紋的經(jīng)驗(Scott，Ophthalmol，871044-1049(1980))。這反過來導(dǎo)致化妝用的BTX-A治療法的問世。
A型肉毒毒素據(jù)認為是人們已知的致死性最強的天然的生物學(xué)試劑。在土壤中可發(fā)現(xiàn)肉毒梭菌的孢子，其可在未恰當(dāng)滅菌的和封閉的食物容器中生長。細菌的攝入可導(dǎo)致肉毒中毒，其可以是致命的。但同時，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治療作用。肉毒毒素的受控施用已用于提供肌肉麻痹來治療病癥，例如，特征在于過度興奮的骨骼肌的神經(jīng)肌肉病癥。已用肉毒毒素治療的病癥包括偏側(cè)面肌痙攣、成人發(fā)生的痙攣性斜頸(adult onset spasmodic torticollis)、肛裂、眼瞼痙攣、大腦性癱瘓、cervical dystonia、偏頭痛、斜視、temperomandibular joint disorder和各種類型的肌肉痙攣和抽搐。最近以來，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治療性應(yīng)用和化妝品面部應(yīng)用，例如皺紋、眉間紋(frown lines)和面部肌肉痙攣或抽搐造成的其他結(jié)果的治療。
因為施用的無痛性質(zhì)、更大的可覆蓋的治療表面積、配制具有更高比活性的純毒素的能力、減少的對應(yīng)用肉毒毒素治療劑的培訓(xùn)、更少的產(chǎn)生想要的效應(yīng)所必需的劑量和不需要大量的毒素來達到治療性臨床結(jié)果的原因，肉毒毒素的局部遞送提供了更安全和更想要的可選擇的治療法。因此，不需要注射并用于肉毒毒素的透皮遞送的有效方法以及用于施用肉毒毒素以治療或預(yù)防許多病癥的有效方法是非常想要的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含肉毒毒素的新組合物，更確切地是這樣的組合物，該組合物能夠?qū)⑷舛径舅剡\輸或遞送通過皮膚或上皮(也稱作“透皮遞送”)，從而可用作局部施用以給受試者提供肉毒毒素以達到此處描述的各種治療、美學(xué)和/或美容目的。
本發(fā)明的一個方面是提供包含肉毒毒素和載體的組合物。所述載體具有聚合物主鏈，所述主鏈具有附著的帶正電荷的分支基團。所述載體和所述肉毒毒素之間的結(jié)合是非共價結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面提供了用于給受試者施用肉毒毒素的試劑盒。所述試劑盒包含了以對其透皮遞送有效的量存在的肉毒毒素和載體，所述載體具有聚合物主鏈，該主鏈具有附著的帶正電荷的分支基團。所述載體和肉毒毒素之間的結(jié)合是非共價結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面提供用于給受試者施用肉毒毒素的試劑盒。該試劑盒包含用于將肉毒毒素遞送給皮膚的裝置和組合物，所述組合物包含具有聚合物主鏈的載體，所述主鏈具有附著的選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD的帶正電荷的分支基團，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
本發(fā)明提供了給受試者施用肉毒毒素的方法，該方法包括將肉毒毒素和有效量的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用。所述載體具有聚合物主鏈，所述主鏈具有附著的帶正電荷的分支基團，并和所述肉毒毒素非共價地結(jié)合。
在一個方面，本發(fā)明涉及這樣的組合物，該組合物包含肉毒毒素(如此所定義的)和這樣的載體，所述載體包含帶正電荷的“主鏈”，所述主鏈具有此處描述的帶正電荷的分枝或“效能”基團。最優(yōu)選地所述帶正電荷的載體是長鏈帶正電荷的多肽或帶正電荷的非肽基聚合物，例如聚烯化亞胺。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的方法，例如肌肉麻痹、減少分泌過多或出汗、治療神經(jīng)疼痛或偏頭痛、減少肌肉痙攣、預(yù)防或減少痤瘡、或減少或增強免疫應(yīng)答，通過局部使用(優(yōu)選地對需要該治療的受試者或患者的皮膚使用)有效量的此類組合物來進行所述方法。本發(fā)明也涉及用于產(chǎn)生美學(xué)和/或美容效果的方法，例如通過給臉部局部使用肉毒毒素而不是通過注射入臉部肌肉產(chǎn)生所述效果。
本發(fā)明也提供了用于制備或配制包含載體和肉毒毒素的組合物以及其它額外的產(chǎn)品或預(yù)混劑的試劑盒，所述產(chǎn)品是生產(chǎn)可用的制劑所需的產(chǎn)品，所述預(yù)混劑可用于生產(chǎn)這樣的制劑?？蛇x擇地所述試劑盒包含用于分開地但將肉毒毒素和載體給受試者組合施用的手段。
附圖概述

圖1顯示這樣的實驗的結(jié)果，該實驗顯示了使用本發(fā)明的包含肽主鏈的組合物進行的肉毒毒素的透皮遞送的效率。
圖2是描述小鼠的后肢的狀態(tài)的照片，在所述小鼠中，用本發(fā)明的組合物處理一只肢體的區(qū)域，用另一種含有肉毒毒素但不包含本發(fā)明的載體的組合物處理另一只肢體的區(qū)域。
圖3是描述在用“Essentia Botox洗劑”進行局部處理前和處理后的受試者的前額上的縐紋的照片。
圖4顯示在(A)用“Essentia Botox洗劑”局部處理皺紋后，和(B)處理前的前額的Mikrosil鑄型(Mikrosil cast)。這些Mikrosil鑄型清楚地顯示未經(jīng)處理的一側(cè)具有更深的皺紋，所述Mikrosil鑄型，因為其可最大限度地使由于拍攝實際的受試者而導(dǎo)致的假象降到最小，從而非常有用。
圖5顯示描述在受試者的前額上進行的Minor’s淀粉/碘檢測的照片，所述檢測在施用“Essentia Botox洗劑”(A)和對照(B)后5天進行。對照洗劑包含了具有大約21,000的分子量的和具有TAT分支基團的帶正電荷的多聚賴氨酸主鏈。在施用后2分鐘拍攝這些照片。
圖6和圖5相同，除了其是在4分鐘后拍攝的外。
圖7顯示用于腋下多汗癥(axillary hyperhidrosis)研究的給藥區(qū)域。注意，給藥區(qū)域超出由腋毛覆蓋的區(qū)域1厘米。
圖8a表示這樣的實驗的結(jié)果，所述實驗顯示了通過對人受試者使用短肽基載體，將肉毒毒素作為局部試劑治療性地遞送通過完整皮膚的效率，用于治療腋下多汗癥。照片顯示，在用Botox和短肽基載體一起或單獨的載體處理后4周，按重量測量，出汗量(每5分鐘的mg數(shù))顯著降低。結(jié)果是作為和相同組的基線值的比的4周的值，通過Wilcoxon分析確定顯著性，p＜0.05。N＝10個患者。圖8b表示這樣的實驗的結(jié)果，該實驗顯示了通過對人受試者使用短肽基載體，將肉毒毒素作為局部試劑治療性的遞送通過完整的皮膚的效率，用于治療腋下多汗癥。照片顯示，在用Botox和短肽基載體一起或單獨的載體處理后4周，按重量測量，出汗量(每5分鐘的mg數(shù))顯著降低。結(jié)果是兩個時間點上的作為和對照值的比的處理值，通過Wilcoxon分析確定顯著性，p＜0.05。N＝10個患者。
圖9顯示描述在用用于腋下多汗癥治療的“Essentia Botox洗劑”治療前和治療后的Minor’s淀粉/碘檢測的照片。顯示了基線和2周的淀粉/碘檢測值，其中對于受試者#12，用“Essentia Botox洗劑”(a和c)處理右腋，和給左腋施用對照(b和d)。這些照片說明在用淀粉碘中的載體+botxo處理后觀察到的一般益處。盡管在對照側(cè)觀察到一些交叉(和按重量計算的數(shù)據(jù)25％的減少一致)，但使用處理物提供了顯著的減少(和在接受處理的側(cè)按重量計算的數(shù)據(jù)65％的減少一致)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過局部施用合適的制劑進行的肉毒毒素的遞送，特別是透皮遞送的組合物和方法。
根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)此處所描述的具有效能基團的帶正電荷的載體分子適合作為肉毒毒素的運輸系統(tǒng)，其使該毒素能夠被透皮施用至肌肉和/或其他和皮膚相關(guān)的結(jié)構(gòu)。所述轉(zhuǎn)運可在無需肉毒毒素的共價修飾的情況下發(fā)生。
“帶正電荷的”是指載體在至少一些溶液相條件下，更優(yōu)選地在至少一些生理相容的條件下具有正電荷。更確切地，此處所用的“帶正電荷的”是指所述基團含有在所有pH條件都帶電荷的官能團，例如季胺，或含有可在某些溶液相條件下例如pH發(fā)生變化的條件下獲得正電荷的官能團，在該情況下是伯胺。更優(yōu)選地，此處所用的“帶正電荷的”是指具有在生理相容條件下和陰離子結(jié)合的形為的基團。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很明顯的是，具有多個帶正電荷的部分的聚合物不必是同聚物。帶正電荷的部分的其他示例在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的并且可容易地使用，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是很顯然的。
一般地，所述帶正電荷的載體(也稱作“帶正電荷的主鏈”)一般是線性的原子鏈，其在鏈上具有在生理pH下攜帶正電荷的基團，或具有附著至從主鏈延伸出來的側(cè)鏈的攜帶正電荷的基團。優(yōu)選地，帶正電荷的主鏈自身不具有明確的酶促或生物學(xué)活性。線性主鏈?zhǔn)翘細渲麈?，在一些實施方案中，其被選自氮、氧、硫、硅和磷的雜原子間插。大部分主鏈原子通常是碳。此外，所述主鏈通常是重復(fù)單位(例如，氨基酸、聚(氧乙烯)、聚(丙烯亞胺)、聚烯化亞胺等)的聚合物，但可以是異聚合物。在一組實施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷郾﹣啺?，其中許多胺的氮原子以攜帶正電荷的銨基(四取代的)形式存在。在另一個實施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)欠请幕酆衔?，其可以是異聚合物或同聚合物，例如聚烯化亞胺，例如聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺，具有從大約10,000至大約2,500,000、優(yōu)選地從大約100,000至大約1,800,000，和最優(yōu)選地從大約500,000至大約1,400,000的分子量。在另一組實施方案中，所述主鏈已附著多個含有帶正電荷基團(例如，銨基、吡啶基、基、锍基、胍基或amidinium基)的側(cè)鏈部分。該組實施方案中的側(cè)鏈部分可以以一致的或可變的間距沿主鏈放置。此外，側(cè)鏈的長度可以相似或不同。例如，在一組實施方案中，側(cè)鏈可以是具有從1至20個碳原子并在遠端(遠離主鏈)以上面提到的帶正電荷的基團中的一個結(jié)束的線性的或分枝的烴鏈。在本發(fā)明的所有方面，載體和具有生物學(xué)活性的試劑之間的結(jié)合是通過非共價相互作用結(jié)合的，所述相互作用的非限定性例子包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
在一組實施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷哂卸鄠€帶正電荷的側(cè)鏈基團(例如，賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)的多肽。優(yōu)選地，所述多肽具有從大約10,000至大約1,500,000，更優(yōu)選地從大約25,000至大約1,200,000，最優(yōu)選地從大約100,000至大約1,000,000的分子量。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，當(dāng)氨基酸用于本發(fā)明的該部分時，所述側(cè)鏈在附著的中心可具有D型或L型(R或S構(gòu)型)?？蛇x擇地，所述主鏈可以是多肽的類似物，例如類肽(peptoid)。參見，例如，Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32543(1993)；Zuckermann等人Chemtracts-Macromol.Chem.480(1992)；和Simon等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 899367(1992))。簡而言之，類肽是多聚甘氨酸，其中側(cè)鏈附著至主鏈的氮原子而不是附著至α碳原子。如上所述，側(cè)鏈的一部分通常以帶正電荷的基團結(jié)尾以提供帶正電荷的主鏈組分。在例如美國專利號5,877,278中描述了類肽的合成，其以其全文在此引用作為參考。當(dāng)所述術(shù)語在此使用時，具有類肽主鏈結(jié)構(gòu)的帶正電荷的主鏈被認為是“非肽”，因為其不是由在α碳原子位置上具有天然發(fā)生的側(cè)鏈的氨基酸構(gòu)成的。
可應(yīng)用例如多肽的空間或電子模擬物來使用多種其他主鏈，其中肽的酰胺鍵由取代物替代，所述取代物是例如酯鍵、硫代酰胺鍵(-CSNH-)、反向硫代酰胺鍵(-NHCS-)、氨基亞甲基鍵(-NHCH2-)或反向亞甲基氨基鍵(-CH2NH-)、酮亞甲基鍵(-COCH2-)、次膦酸基(-PO2RCH2-)、磷酸酰胺和磷酸酰胺酯鍵(-PO2RNH-)、反向肽鍵(-NHCO-)、反式烯烴鍵(-CR＝CH-)、氟代烯烴鍵(-CF＝CH-)、二亞甲基鍵(-CH2CH2-)、硫醚鍵(-CH2S-)、羥亞乙基鍵(-CH(OH)CH2-)、亞甲氧基鍵(-CH2O-)、四唑(CN4)、亞磺酰胺基(-SO2NH-)、亞甲亞磺酰胺基(-CHRSO2NH-)、反向亞磺酰胺基(-NHSO2-)，以及具有丙二酸和/或gem-二氨基-烷基亞基的主鏈，例如，由Fletcher等人((1998)Chem.Rev.98763)綜述的，和由其中引用的參考資料所詳細描述的。許多前述的取代物產(chǎn)生近似的(和由α氨基酸形成的主鏈相比)電子等排聚合物主鏈。
在上面提供的各主鏈中，可附著攜帶正電荷的基團的側(cè)鏈基團。例如，亞磺酰胺連接的主鏈(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有附著至氮原子上的側(cè)鏈基團。類似地，羥乙烯基(-CH(OH)CH2-)連接鏈可攜帶附著至羥基取代基的側(cè)鏈基團。通過使用標(biāo)準(zhǔn)的合成方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地改造其他鍵合化學(xué)物質(zhì)以使其提供帶正電荷的側(cè)鏈基團。
在一個實施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷哂蟹种Щ鶊F(也稱作效能基團)的多肽。如此處所用的，效能基團或分支基團是具有促進帶正電荷的主鏈轉(zhuǎn)運通過組織或細胞膜的作用的任何試劑。分支基團或效能基團的非限定性示例包括-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段、或觸角足(Antennapedia)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域、或其片段，其中下標(biāo)n1是從0至20的整數(shù)，更優(yōu)選地是0至8的整數(shù)，更優(yōu)選地是2至5的整數(shù)，下標(biāo)n2獨立地是從大約5至大約25、更優(yōu)選地大約7至大約17、最優(yōu)選地大約7至大約13的奇整數(shù)。其他優(yōu)選的實施方案是這樣的實施方案，在所述實施方案中，HIV-TAT片段具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q，其中下標(biāo)p和q各獨立地是從0至20的整數(shù)，所述片段通過該片段的C端或N端附著至主鏈。優(yōu)選的HIV-TAT片段是其中下標(biāo)p和q各自獨立地是0至8、更優(yōu)選地2至5的整數(shù)的片段。在另一個優(yōu)選的實施方案中，帶正電荷的側(cè)鏈或分支基團是觸角足(Antp)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)、或保持活性的其片段。優(yōu)選地帶正電荷的載體以至少大約0.05％(載體總重量的百分比)、優(yōu)選地從大約0.05至大約45％的重量，最優(yōu)選地從大約0.1至大約30％的重量的量包含帶正電荷的側(cè)鏈分支基團。對于具有式-(gly)n1-(arg)n2的帶正電荷的分支基團，最優(yōu)選的量是從大約0.1至大約25％。
在另一個實施方案中，所述主鏈部分是多聚賴氨酸，帶正電荷的分支基團附著至所述賴氨酸側(cè)鏈氨基。所述多聚賴氨酸具有從大約10,000至大約1,500,000、優(yōu)選地從大約25,000至大約1,200,000，和最優(yōu)選的大約100,000至大約1,000,000的分子量。其可以是可商購獲得(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)的多聚賴氨酸中的任一種，例如，具有MW＞70,000的多聚賴氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚賴氨酸、具有MW 150,000至300,000的多聚賴氨酸和具有MW＞300,000的多聚賴氨酸。多聚賴氨酸的恰當(dāng)選擇依賴于組合物的其余組分，要足以為組合物提供總的凈正電荷和提供這樣的長度，該長度優(yōu)選地是帶負電荷的組分的組合長度的1至4倍。優(yōu)選的帶正電荷的分支基團或效能基團包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)或HIV-TAT。在另一個優(yōu)選的實施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)情L鏈聚烯化亞胺例如聚乙烯亞胺，例如，分子量為大約1,000,000的聚乙烯亞胺。
帶正電荷的主鏈或載體分子是新的化合物并形成本發(fā)明的方面，所述主鏈或載體包含具有上述分支基團的多肽或聚烯化亞胺。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，只有具有帶正電荷的分支基團的帶正電荷的載體是肉毒毒素的透皮遞送所必需的。在某些實施方案中，所述帶正電荷的載體是具有多個上述的帶正電荷的側(cè)鏈基團的多肽(例如，賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)。優(yōu)選地，所述多肽具有至少大約10,000的分子量。在另一個實施方案中，帶正電荷的載體是非肽基聚合物例如具有至少大約100,000分子量的具有多個帶正電荷的側(cè)鏈基團的聚烯化亞胺。這些聚烯化亞胺包括聚乙烯亞胺和聚丙烯亞胺。在任一示例中，為了用作透皮遞送所唯一必需的試劑，所述帶正電荷的載體分子包含帶正電荷的分枝或效能基團，包括-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段、觸角足PTD或其片段，其中下標(biāo)n1是從0至20，更優(yōu)選地從0至8，更優(yōu)選地2至5的整數(shù)，下標(biāo)n2獨立地是從大約5至大約25，更優(yōu)選地從大約7至大約17和最優(yōu)選地從大約7至大約13的奇整數(shù)。優(yōu)選地所述側(cè)鏈或分支基團具有上述通式-(gly)n1-(arg)n2。其他優(yōu)選的實施方案是這樣的方案，在所述方案中，分支基團或效能基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨立地是從0至20的整數(shù)，所述片段通過該片段的C端或N端附著至載體分子。所述側(cè)鏈分支基團可在附著的中心具有D型或L型(R或S構(gòu)型)。優(yōu)選的HIV-TAT片段是這樣的片段，在所述片段中，下標(biāo)p和q各自獨立地是從0至8、優(yōu)選地2至5的整數(shù)。其他優(yōu)選的實施方案是這樣的實施方案，在所述實施方案中，分支基團是觸角足PTD基團或其保持基團活性的片段。這些在本領(lǐng)域中是已知的，例如根據(jù)Console等人，J.Biol.Chem.27835109(2003)。優(yōu)選地帶正電荷的載體以至少大約0.05％(作為載體總重量的百分比)、優(yōu)選地從大約0.05至大約45％的重量，和最優(yōu)選地從大約0.1至大約30％的重量的量包含側(cè)鏈帶正電荷的分支基團。對于具有式-(gly)n1-(arg)n2的帶正電荷的分支基團，最優(yōu)選的量是從大約0.1至大約25％。
在另一個實施方案中，所述載體是具有附著至賴氨酸側(cè)鏈氨基的帶正電荷的分支基團的多聚賴氨酸。用于該特定實施方案的多聚賴氨酸可以是可商購獲得(例如，Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)的多聚賴氨酸中的任一種，例如，具有MW＞70,000的多聚賴氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚賴氨酸、具有MW150,000至300,000的多聚賴氨酸和具有MW＞300,000的多聚賴氨酸。然而，優(yōu)選的多聚賴氨酸具有至少大約10,000的MW。優(yōu)選的帶正電荷的分支基團或效能基團包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)、HIV-TAT或其片段、和觸角足PTD或其片段。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述載體是相對較短的多聚賴氨酸或聚乙烯亞胺(PEI)主鏈(其可以是線性或分枝的)，并且其具有帶正電荷的分支基團。這些載體在使組合物中的主鏈和肉毒毒素的不受控制的凝聚減少至最低上非常有用，所述凝聚使運輸效率急劇降低。當(dāng)所述載體是相對短的線性多聚賴氨酸或PEI主鏈時，所述主鏈具有低于75,000，更優(yōu)選地低于30,000，和最優(yōu)選地低于25,000的分子量。然而，當(dāng)載體是相對短的分枝多聚賴氨酸或PEI主鏈時，主鏈將具有低于60,000，更優(yōu)選地低于55,000和最優(yōu)選地低于50,000的分子量。然而，如果組合物包含此處描述的隔離試劑(partitioningagents)，那么分枝的多聚賴氨酸和PEI主鏈的分子量可高達75,000，而線性多聚賴氨酸和PEI主鏈的分子量可高達150,000。
此處所用的術(shù)語“肉毒毒素”是指無論是通過細菌產(chǎn)生的還是通過重組技術(shù)產(chǎn)生的任何已知類型的肉毒毒素，以及以后可被發(fā)現(xiàn)的任何這樣的類型，包括通過基因工程產(chǎn)生的變體或融合蛋白。如上面所提到的，目前，已表征了七種免疫學(xué)上不同的肉毒神經(jīng)毒素，即A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒神經(jīng)毒素，其各自通過用類型特異性抗體進行中和來區(qū)別。肉毒毒素血清型可從Sigma-Aldrich和從Metabiologics，Inc.(Madison，Wisconsin)以及從其他來源商購獲得。肉毒毒素的不同血清型在其作用的動物種類和在其引起的麻痹的嚴(yán)重度和持續(xù)時間上是不同的。至少兩種類型的肉毒毒素，A型和B型，可以以制劑形式商購獲得用于治療某些病癥。例如，在商標(biāo)為BOTOXO的Allergan的制劑中和商標(biāo)為DYSPORT的Ipsen的制劑中含有A型，而在商標(biāo)為MYOBLOC的Elan的制劑中含有B型。
用于本發(fā)明組合物的肉毒毒素可選擇地可以是肉毒毒素的衍生物，即其是這樣的化合物，所述化合物具有肉毒毒素活性，但相對于天然發(fā)生的或重組的天然的肉毒毒素，在其任何部分或任何鏈上包含一種或多種化學(xué)或功能性改變。例如，肉毒毒素可以是經(jīng)修飾的神經(jīng)毒素(例如，這樣的神經(jīng)毒素，當(dāng)和天然地或重組地產(chǎn)生的神經(jīng)毒素或其衍生物或其片段相比，其氨基酸的至少一個被刪除、被修飾或被替代)。例如，所述肉毒毒素可以是以這樣的方式修飾的肉毒毒素，所述方式是例如增強其特性或減少不想要的副作用，但仍保持想要的肉毒毒素活性的方式。如上所述，肉毒毒素可以是由細菌產(chǎn)生的肉毒毒素復(fù)合物中的任一種。可選擇地，肉毒毒素可以是使用重組或化學(xué)合成技術(shù)制備的毒素(例如，重組肽、融合蛋白或雜合的神經(jīng)毒素，如從不同的肉毒毒素的亞基或結(jié)構(gòu)域制備而來的(參見美國專利6,444,209))。肉毒毒素也可以是完整的分子的部分，該部分經(jīng)顯示具有必需的肉毒毒素活性，在該情況下其自身可被使用或用作組合分子或綴合分子例如融合蛋白的部分。此外，肉毒毒素可以肉毒毒素前體(該前體自身可以是無毒的)的形式存在，例如，在蛋白水解斷裂后變得有毒的無毒性鋅蛋白酶。
本發(fā)明也涉及肉毒毒素的組合物和混合物的一般用途，不過由于其不同的性質(zhì)和特性，目前在衛(wèi)生保健或美容業(yè)中一般不施用肉毒毒素血清型的混合物。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選地以這樣的產(chǎn)品形式存在，即該產(chǎn)品被用于受試者或患者即需要特定治療的人或其他哺乳動物的皮膚或上皮。術(shù)語“需要”是指包括藥物和保健相關(guān)(例如治療涉及不想要的面部肌肉痙攣的癥狀)的需要，以及美容和主觀(例如改變或改善面部組織的外觀)上的需要。一般地，通過將肉毒毒素和載體以及通常地一種或多種額外的藥物可接受的載體或賦形劑混合來制備組合物。在其最簡單的形式中，其可包含簡單的水性藥物可接受的載體或稀釋劑，例如緩沖鹽水。然而，組合物可包含一般存在于局部藥物組合物或藥妝(cosmeceutical)組合物中的其他成分，包括皮膚或藥物可接受的載體、賦形劑或介質(zhì)(即和其施用的組織相容的載體、賦形劑或介質(zhì))。此處使用的術(shù)語“皮膚或藥物可接受的”是指此處描述的組合物或其組分適合用于和這些組織接觸，或適用于患者而通常無過度的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、過敏反應(yīng)等。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的組合物可包含常規(guī)地用于所述領(lǐng)域特別是藥妝和皮膚學(xué)領(lǐng)域中的任何組分。所述組合物也可包含一些小陰離子，優(yōu)選地多價陰離子，例如，磷酸鹽、天冬氨酸鹽或檸檬酸鹽。
根據(jù)其形式，本發(fā)明的組合物可包括溶液、乳液(包括微乳液)、懸浮液、乳膏劑、洗劑、凝膠、粉劑或其他類型的固體或液體組合物，所述其他類型的組合物用于可使用所述組合物的皮膚或其他組織。除了肉毒毒素和載體分子外，這些組合物可包含一般用于該產(chǎn)品的其他成分，例如抗微生物劑、增濕劑和水合劑、滲透劑、防腐劑、乳化劑、天然的或合成的油、溶劑、表面活性劑、去垢劑、潤滑藥劑、抗氧化劑、芳香劑、充填劑、增稠劑、石蠟、氣味吸收劑(odor absorbers)、染料、著色劑、粉劑，和任選地包含麻醉劑、止癢添加劑、植物萃取物、調(diào)節(jié)劑、暗化劑(darkening agent)或亮化劑(lightening agent)、吉洛特、濕潤劑、云母、礦物質(zhì)、多酚、硅氧烷或其衍生物、防曬劑(sunblocks)、維生素和植物藥(phytomedicinals)。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含膠凝劑和/或粘性調(diào)節(jié)劑。一般加入這些試劑以增加組合物的粘度，從而使組合物的施用更容易和更精確。此外，這些試劑幫助防止水性肉毒毒素/載體溶液變干，變干將導(dǎo)致肉毒毒素的活性降低。特別優(yōu)選的試劑是不帶電荷和不干擾肉毒毒素活性或不干擾毒素-載體復(fù)合物通過皮膚的效率的試劑。所述膠凝劑可以是某些基于纖維素的膠凝劑，例如羥丙基纖維素(HPC)。在一些實施方案中，將肉毒毒素/載體復(fù)合物配制在具有2-4％的HPC的組合物中?？蛇x擇地，可通過加入聚乙二醇(PEG)改變含有肉毒毒素/載體復(fù)合物的溶液的粘度。在其他實施方案中，將肉毒毒素/載體溶液和預(yù)先混合的粘性試劑例如Cetaphil增濕劑混合。
本發(fā)明的組合物任選地可包含隔離試劑。如此處所用的，“隔離試劑”是這樣的任何物質(zhì)或添加劑，即其具有防止或最小化本發(fā)明的肉毒毒素和載體的不想要的或不受控制的凝聚的性質(zhì)。隔離試劑可在例如當(dāng)由于體積的限制必須使用濃縮的肉毒毒素溶液的時候使用。在這些情況下，所述隔離試劑使肉毒毒素保持分散狀態(tài)，從而防止在沒有隔離試劑時會發(fā)生的毒素凝聚。一般地，隔離試劑是(1)無刺激性的，(2)不破壞肉毒毒素，(3)不增加任何滲透性，(4)提供可靠的和穩(wěn)定的顆粒大小，(5)不帶電荷，和(6)不干擾毒素和透皮載體的復(fù)合。合適的隔離試劑的例子是EtOH(EtOH)。在優(yōu)選的實施方案中，EtOH少于組合物的20％，和最優(yōu)選地少于組合物的5％。
例如，如果體積限制要求在0.5ml溶液中，而不是2.5ml溶液中重構(gòu)100U的肉毒毒素，那么人們一般觀察到肉毒毒素將表現(xiàn)不想要的凝聚，從而降低了活性。然而，通過加入1％的EtOH作為分散試劑，在該濃度下，在24小時后仍然保持完全的活性。例如在另一個示例中，在1.0ml 0.9％的NaCl重構(gòu)溶液中的Botox具有完全的活性，而在0.5ml 1％和5％EtOH+0.9％NaCl中的重構(gòu)產(chǎn)生具有完全活性的溶液。
在本發(fā)明的某些實施方案中，向肉毒毒素組合物中加入寡聚或多聚陰離子橋以提高毒素與帶正電荷的主鏈載體的復(fù)合作用。如在本領(lǐng)域中所熟知的，肉毒毒素實際上是不同蛋白的復(fù)合物，其中一些是帶正電荷的，其中一些是帶負電荷的。因為毒素的組分的確切分布視毒素的來源變化而變化，來自某些來源的肉毒毒素可以具有更低的和此處描述的帶正電荷的主鏈形成復(fù)合物的趨勢。然而，本發(fā)明的一個方面是發(fā)現(xiàn)通過向這些肉毒毒素加入寡聚或多聚陰離子橋，可非常顯著地增加局部給藥的效率和功效。這些寡聚/多聚陰離子橋的合適的示例包括磷酸鈉(5％)、PBS或5％的多聚L-天冬氨酸(例如，具有3000的分子量)。
本發(fā)明的組合物可以控釋組合物或緩釋組合物的形式存在，其中將要遞送的肉毒毒素和載體包囊化或裝入材料中，以使其在一段時間內(nèi)以受控的方式釋放至皮膚上?？蓪⑷舛径舅睾洼d體裝入基質(zhì)、脂質(zhì)體、囊泡、微囊、微球體等，或裝入固體顆粒材料，所有這些材料都是被選擇和/或構(gòu)建來在一段時間內(nèi)釋放肉毒毒素的?？蓪⑷舛径舅睾洼d體一起包囊化(例如，在相同的膠囊中)或分開包囊化(在分開的膠囊中)。
通過使用此處的描述的組合物，可將肉毒素以這樣的有效量遞送至皮膚下面的肌肉中，或遞送至皮膚內(nèi)的腺體結(jié)構(gòu)中，所述有效量可產(chǎn)生麻痹、產(chǎn)生松弛、減緩抽搐、預(yù)防或減輕痙攣、減少腺體分泌或提供其他想要的效果。和可注射的或可移植的材料相比，以這種方式局部遞送肉毒毒素可減少劑量、降低毒性和使得可為想要的效果提供更精確的劑量最優(yōu)化。
施用本發(fā)明的組合物，以使得能夠施用有效量的肉毒毒素。此處所用的術(shù)語“有效量”是指如上面定義的這樣的量的肉毒毒素，該量的肉毒毒素足以產(chǎn)生想要的肌肉麻痹或其他生物學(xué)或美學(xué)效應(yīng)，但該量絕對是安全的量，即低至足以避免嚴(yán)重的副作用的量。想要的效果包括使某些肌肉松弛，其目的在于例如減少細紋和/或皺紋(特別是在臉部的)的出現(xiàn)、或以其他方式例如加寬眼睛、抬高嘴角、或使從上唇散開的細紋平滑來調(diào)整面貌，或總體緩解肌肉緊張。最后提到的效果，即肌肉緊張的總體緩解，可在臉部或其他部位實現(xiàn)。本發(fā)明的組合物可包含用作單劑治療的合適的有效量的肉毒毒素，或可以是更濃縮的，以在施用的部位進行稀釋或以多次施用的方式進行使用。通過使用本發(fā)明的帶正電荷的載體，可將肉毒毒素給受試者透皮施用以治療病癥，所述病癥是例如不想要的面部肌肉或其他肌肉痙攣、多汗癥、痤瘡或身體中其他部位的想要減輕肌肉疼痛或痙攣的病癥。局部施用肉毒毒素以透皮遞送至肌肉或與皮膚相關(guān)的其他結(jié)構(gòu)?？山o例如腿、肩、背(包括下背部(lower back))、腋窩、手掌、足、頸、腹股溝、手或足的背部、肘、上臂、膝蓋、大腿、臀部、軀干、骨盆或想要施用肉毒毒素的身體的任何其他部分。
也可施用肉毒毒素以治療其他病癥，包括治療神經(jīng)痛、預(yù)防或減輕偏頭痛或其他頭痛、預(yù)防或減輕痤瘡、預(yù)防或減輕肌張力障礙(dystonia)或張力障礙收縮(dystonic contractions)(無論是主觀性的還是臨床性的)、預(yù)防或減輕和主觀的或臨床的多汗癥相關(guān)的癥狀、減少分泌過多或出汗、降低或加強免疫應(yīng)答、或治療其他疾病，所述其他疾病是被建議通過注射施用肉毒毒素或已經(jīng)進行注射施用肉毒毒素來治療的病癥)。
為了免疫相關(guān)的目的，也可施用此處描述的肉毒毒素或其他治療性蛋白。令人驚奇的是，也可施用此處描述的肉毒毒素以降低免疫應(yīng)答。更確切地，本發(fā)明允許通過其它的施藥途徑遞送肉毒毒素，從而改變所述試劑的復(fù)合抗原呈遞。通過該方式，本發(fā)明可用于減少對針對肉毒毒素的抗原的免疫應(yīng)答，和用于幫助反復(fù)施用而沒有和免疫相關(guān)的活性降低?？蛇x擇地，可制備和局部施用所述復(fù)合物以增強免疫應(yīng)答，例如提供有關(guān)各種蛋白的免疫例如兒童免疫而無需注射。對于和免疫相關(guān)的活性的用途，“有效量”是指這樣的量的肉毒毒素，即該量足以使受試者在施用或系列施用肉毒毒素后產(chǎn)生對其的免疫應(yīng)答。
最優(yōu)選地，在醫(yī)生的指導(dǎo)下或在其他專業(yè)護理人員的指導(dǎo)下施用所述組合物，或由他們來施用所述組合物。可以單劑治療的方式或以一段時間內(nèi)系列周期性治療的方式施用其。對于為了上述目的的肉毒毒素的透皮遞送，給想要得到效果的部位上的皮膚局部施用上述組合物。在將水性肉毒毒素/載體溶液直接給皮膚施用的實施方案中，為了防止溶液變干(其可導(dǎo)致毒素活性的降低)，優(yōu)選地覆蓋經(jīng)處理的區(qū)域(例如，用Cetaphil增濕劑)或用屏障(例如，Telfa)封閉經(jīng)處理的區(qū)域。因為其性質(zhì)，最優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)非常小心地，以可產(chǎn)生想要的結(jié)果但不產(chǎn)生任何不利的或不想要的結(jié)果的施用比率和施用頻率施用所用的肉毒毒素的量。因此，例如，應(yīng)當(dāng)以每cm2的皮膚面積從大約1U至大約20,000U、優(yōu)選地大約1U至大約10,000U的肉毒毒素的比率施用本發(fā)明的局部組合物。例如，優(yōu)選地可將這些范圍內(nèi)的較高劑量和例如控釋材料一起使用，或使得能夠在除去之前在皮膚上停留更短的時間。
為了保持溶液的功效，在施用肉毒毒素/載體組合物之前皮膚表面的恰當(dāng)處理是非常重要的。例如，為了在施用之前清潔皮膚上的表面油脂而在皮膚的表面引入表面活性劑令人吃驚地會起反作用，因為表面活性劑似乎破壞了肉毒毒素的活性。即使隨后在施用肉毒毒素/載體溶液之前用水洗滌數(shù)次，該現(xiàn)象仍會發(fā)生。甚至極溫和的表面活性劑，例如嬰兒抹擦的表面活性劑，似乎都會導(dǎo)致該現(xiàn)象。因此，在優(yōu)選的施用本發(fā)明的組合物的方法中，單獨地用水預(yù)先清潔皮膚。只用水清洗也似乎適度地提高了肉毒毒素的透皮運輸。
此外，在施用肉毒毒素/載體復(fù)合物之前，可剝離皮膚以減少角質(zhì)層。原則上，剝離皮膚的方法應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致增強的肉毒毒素的透皮運輸效率。然而，用于剝離皮膚的方法是重要的。例如，丙酮介導(dǎo)的人或動物中的角質(zhì)層的減少似乎減少了隨后施用的肉毒毒素的活性。相反地，膠帶剝離(即，用膠帶貼在皮膚的表面上，然后取下膠帶)似乎在小鼠模型和人中使得肉毒毒素滲透得更深并且減少了劑量。據(jù)推測，皮膚表面的磨損(例如，通過使用拋光墊(abrasive pad))可產(chǎn)生和膠帶剝離相似的效果。
本發(fā)明也包括用于進行包含肉毒毒素和載體的組合物的透皮遞送的裝置，所述載體具有帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有附著的此處定義的分支基團。這些裝置在結(jié)構(gòu)上可以如皮膚貼劑一樣簡單，或可以是更復(fù)雜的裝置，包括用于分配和監(jiān)控組合物的分配的工具和任選地用于監(jiān)控受試者的狀況(例如監(jiān)控受試者和正被分配的物質(zhì)的反應(yīng))的工具。
應(yīng)當(dāng)指出，用于建造裝置的材料的選擇是非常重要的。用于建造遞送裝置的優(yōu)選的材料是不會導(dǎo)致肉毒毒素/載體溶液的活性喪失(通過肉毒毒素的降解或在裝置表面上的不想要的吸附導(dǎo)致的活性喪失)的材料。已觀察到該不想要的形為，例如當(dāng)水溶液中的肉毒毒素/載體接觸聚丙烯表面時觀察到該行為，但當(dāng)肉毒毒素/載體溶液接觸聚氯乙烯(PVC)表面時則沒有觀察到該行為。
一般地，可在裝置中預(yù)先配制和/或預(yù)先安裝組合物或隨后制備組合物，例如通過使用這樣的試劑盒隨后制備組合物，所述試劑盒分開地包含兩種組分(肉毒毒素和載體)，但提供了用于在施用時或施用之前將其混合的工具。載體分子的量或其對肉毒毒素的比例依賴于所述組合物中選擇使用的載體?？扇菀椎卮_定，例如通過進行一個或多個實驗(例如下面描述的實驗)確定在給定的情況下的載體分子的合適的量或比例。
一般地，本發(fā)明也包括將肉毒毒素施用給需要其的受試者或患者的方法。所述方法包括，將有效量的肉毒毒素和具有帶正電荷的主鏈的載體一起施用，所述主鏈具有附著的此處描述的帶正電荷的分支基團?！昂?.....一起”是指以組合的方法將兩種組分(肉毒毒素和載體)一起施用，該方法可包括將其組合在組合物中，然后再將組合物給受試者施用，或?qū)⑵浞珠_施用，但以這樣的方式分開施用其，所述方式可使其一起作用，從而提供有效量的治療性蛋白的必需遞送。例如，可首先將含有載體的組合物用于受試者的皮膚，然后使用含有肉毒毒素的皮膚貼劑或其他裝置。可將肉毒毒素以無水的形式整合入皮膚貼劑或其他分配裝置中，可在使用皮膚貼劑之前給皮膚的表面施用帶正電荷的載體，這樣可使所述兩類物質(zhì)共同作用，產(chǎn)生想要的透皮遞送。因此，所述兩種物質(zhì)(載體和肉毒毒素)，以組合的方式起作用，或可能相互作用以在原位形成組合物或組合。因此，本發(fā)明也包含這樣的試劑盒，所述試劑盒包含通過皮膚分配肉毒毒素的裝置和含有載體或主鏈并且適合于給受試者的皮膚或上皮施用的液體、凝膠、乳膏劑等。用于在專業(yè)護理人員指導(dǎo)下施用或由患者或受試者施用本發(fā)明的組合物的試劑盒也可包含適合于該目的的定制的施藥器(customapplicator)。
本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法使得可以遞送更純的具有更高比活性、潛在地提高的藥物動力學(xué)的肉毒毒素。此外，所述載體可充當(dāng)穩(wěn)定劑，減少對外源輔助蛋白(例如，在400-600mg范圍內(nèi)的人血清白蛋白或在250-500mg范圍內(nèi)的重組血清白蛋白)和/或多糖穩(wěn)定劑的需要并且可有益地降低對肉毒毒素的免疫應(yīng)答。此外，所述組合物適合用于pH在4.5至6.3范圍內(nèi)變化的生理環(huán)境，因此其可具有這樣的pH。本發(fā)明的組合物可在室溫下或在冷凍的條件下貯存。
下面是本發(fā)明的代表性實施例。其展示了功能性肉毒神經(jīng)毒素復(fù)合物通過皮膚的遞送而無需共價修飾要遞送的神經(jīng)毒素。
實施例實施例1通過使用肽基載體在體內(nèi)進行的肉毒毒素的轉(zhuǎn)運本實驗顯示在一次施用后，和對照相比，肽基載體將含有完整的標(biāo)記蛋白肉毒毒素的大復(fù)合物運輸通過完整皮膚的用途。
主鏈的選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至多聚賴氨酸(MW 112,000)來裝配帶正電荷的主鏈，通過以18％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個賴氨酸殘基共價地綴合至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側(cè)鏈的游離胺基來進行該附著。所述經(jīng)修飾的主鏈被命名為“KNR”。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治療劑選擇Boxtox商標(biāo)的肉毒毒素A(Allergan)進行本實驗。其具有大約150,000的分子量。
樣品的制備根據(jù)廠商說明書對肉毒毒素進行重構(gòu)。用經(jīng)計算超過12倍摩爾量的硫代NHS-LC生物素(Pierce Chemical)對蛋白的等分進行生物素化。被標(biāo)記的產(chǎn)物稱作“Btox-b”。
在各情況下，如同遞送高度負電的大核苷酸復(fù)合物一樣，使用過量的聚陽離子裝配具有過量正電荷的終復(fù)合物。凈中性或凈正電荷防止了來自高度負電的細胞表面蛋白聚糖和細胞外基質(zhì)對蛋白復(fù)合物的排斥。對所有組的Btox-b劑量進行標(biāo)準(zhǔn)化，也對要局部施用的組合物的總體積和終pH進行標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品標(biāo)記為“JMW-7”的組將每等分(即總共20U)2.0U的Btox-b和肽基載體KNR以經(jīng)計算為4∶1的MW比率混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。將所得的組合物用1.8ml Cetaphil洗劑混合均勻并以200微升進行等分。
標(biāo)記為“JMW-8”的組將每等分(即總共20U)2.0U的Btox-b和K以4∶1的MW比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。將所得的組合物和1.8ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在用肽基載體和經(jīng)標(biāo)記的Btox進行一次處理后確定透皮遞送效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝4)接受局部敷藥，將200微升劑量的適當(dāng)處理物施用于背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因為小鼠不能用嘴或四肢達到該區(qū)域)。動物不進行脫毛。在最初的處理之后30分鐘，通過吸入CO2對小鼠實行安樂死，由盲測者(blinded observer)收獲完整厚度的經(jīng)處理的皮膚部分。將經(jīng)處理的部分分成三等分，在10％的中性緩沖的福爾馬林中固定顱部分12-16小時，然后貯存在70％的EtOH中直至石蠟包埋。如下面所概述的，由盲測者將中心部分進行快速冷凍并將其直接用于生物素顯示。為進行溶解研究，快速冷凍經(jīng)處理的尾部節(jié)段。
如下進行生物素顯示。簡而言之，將各切片浸沒在NeutrAvidin緩沖液中1小時。為觀察堿性磷酸酶的活性，在鹽水中洗滌橫切面4次，然后浸沒在NBT/BCIP(Pierce Scientific)中1小時。然后在鹽水中漂洗切片，在具有平場復(fù)消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對整個切片照相。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析由盲測者使用Image Pro Plus軟件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)通過分批圖象分析確定總的陽性染色，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為總的橫切面面積以確定各組的陽性染色百分比。然后，在單向ANOVA重復(fù)測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果在將Btox-b與KNR(“EB-Btox”)或K(“n1”)一起進行一次局部施用后，用總面積的百分比來表示對于生物素化的肉毒毒素呈陽性的平均橫切面面積。將所述結(jié)果列于下列的表1中并在圖1中進行說明。在圖1中，在用“EB-Btox”和對照“n1”進行每天一次的處理三天后，將對于標(biāo)記是陽性的面積測定為總面積的百分比，其中“EB-Btox”包含Btox-b和肽基載體KNR，“n1”包含Btoxb和聚陽離子K。描述各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
表4.在將Btox-b與KNR(JMW-7)或K(JMW-8)一起進行一次局部施用30分鐘后，以總的橫切面的百分比表示的被標(biāo)記的肉毒毒素區(qū)域的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0001(在置信度99％下是顯著的)實施例2具有肽基載體的局部肉毒毒素制劑的治療效果實施例1表明在鼠類模型的完整皮膚中局部施用后，肽基透皮載體可使肉毒毒素有效地轉(zhuǎn)運。然而，該實驗沒有表明復(fù)合蛋白肉毒毒素在轉(zhuǎn)運穿過皮膚后是否以功能性形式釋放。因此建立下列的實驗來估計使用該肽基載體(同樣，無蛋白的共價修飾)是否可將肉毒毒素作為局部試劑遞送穿過完整的皮膚仍具治療效果。
通過將-Gly3Arg7共價地附著至多聚賴氨酸MW 112,000來裝配帶正電荷的主鏈，以18％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側(cè)鏈的游離胺基來進行該附著。所述經(jīng)修飾的主鏈被命名為“KNR”。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。和在實施例1中一樣使用相同的肉毒毒素治療劑，和以相同的方式制備其。如下制備樣品標(biāo)記為“JMW-9”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和肽基載體KNR以經(jīng)計算為4∶1的MW比率混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標(biāo)記為“JMW-10”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和K以4∶1的MW比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標(biāo)記為“JMW-11”的組用磷酸緩沖鹽溶液將每等分(即總共60U)2.0單位的無聚陽離子的肉毒毒素稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在用肽基載體和肉毒毒素進行一次處理后確定治療效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝4)接受局部敷藥，將400微升劑量的適當(dāng)處理物均一地施用于腳趾至大腿中部(mid-thigh)。兩只腿都進行處理，對于任一側(cè)，處理都是隨機的。動物不進行脫毛。在最初的處理之后30分鐘，根據(jù)公開的足趾外展(digital abduction)分值(用于評價足的靈活性)(Aoki，KR.A comparison of the safety margins of botulinumneurotoxin serotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001Dec；39(12)1815-20)在施用肉毒毒素后就足趾外展的能力對小鼠進行估計。小鼠的靈活性也通過主觀估計。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析由兩個盲測者獨立地將足趾外展分值列表。然后，在單向ANOVA重復(fù)測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
結(jié)果將平均足趾外展分值(在肉毒毒素與KNR(“JMW-9”)、K(“JMW-10”)或無聚陽離子的稀釋劑一起進行一次局部施用后獲得的)示于下面表2并在圖2的代表性顯微照片中進行說明。和兩個對照(其相互之間是相當(dāng)?shù)?相比，肽基載體KNR提供了統(tǒng)計學(xué)上顯著的肉毒毒素通過皮膚的功能性遞送。本發(fā)明的另外的獨立重復(fù)實驗(總共三個獨立的實驗，所有實驗具有相同的結(jié)論具有KNR而非對照的局部肉毒毒素具有統(tǒng)計學(xué)上顯著的麻痹作用)進一步確認了本發(fā)現(xiàn)和揭示了在具有K或不具有K的局部肉毒毒素(即兩個對照)之間沒有顯著的不同。有趣的是，小鼠始終朝向被麻痹的肢體方向走動(在100％的接受處理的動物中發(fā)生該現(xiàn)象，在來自任一對照組的對照中發(fā)生率為0％)。如圖2所示，用肉毒毒素和對照聚陽離子多聚賴氨酸或用肉毒毒素而無聚陽離子(“單獨的Botox”)處理的肢體可活動足趾(當(dāng)被提起時，作為防御機制)，但用肉毒毒素和肽基載體KNR(“Essentia Botox洗劑”)處理的肢體則不能活動。
表2在一次局部施用肉毒毒素和肽基載體KNR(“JMW-9”)、肉毒毒素和對照聚陽離子K(“JMW-10”)、和單獨的肉毒毒素(“JMW-11”)后30分鐘，足趾外展分值。
P＝0.0351(在置信度95％下是顯著的)結(jié)論本實驗表明肽基透皮載體可將治療有效量的肉毒毒素治療劑轉(zhuǎn)運穿過皮膚而無需治療劑的共價修飾。本實驗也進一步確認當(dāng)在對照中局部施用時，肉毒毒素不起作用。
實施例3具有非肽基載體的局部肉毒毒素制劑的治療效率本實證顯示非肽基載體在本發(fā)明中的性能。
方法主鏈的選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至聚乙烯亞胺(PEI)MW 1,000,000來裝配帶正電荷的主鏈，通過以30％的飽和度(即，每100個賴氨酸殘基中有30個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至PEI側(cè)鏈的游離胺基來進行該附著。經(jīng)修飾的主鏈被命名為“PEIR”以表示大的非肽基載體。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經(jīng)修飾的PEI(稱為“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如實施例1中那樣，使用相同的肉毒毒素治療劑。
根據(jù)廠商說明書從Botox產(chǎn)品對肉毒毒素進行重構(gòu)。在各情況下，同遞送高度負電的大核苷酸復(fù)合物一樣，用過量的聚陽離子裝配具有過量正電荷的終復(fù)合物。凈中性或凈正電荷防止了來自高度負電的細胞表面蛋白聚糖和細胞外基質(zhì)對蛋白復(fù)合物的排斥。對所有組的肉毒毒素劑量進行標(biāo)準(zhǔn)化，也對要局部施用的組合物的總體積和終pH進行標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品標(biāo)記為“AZ”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和超純形式的非肽基載體PEIR以經(jīng)計算為5∶1的MW比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4mlCetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標(biāo)記為“BA”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和PEI以5∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在一次處理后確定治療效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝3)接受局部敷藥，將400微升劑量的適當(dāng)處理物均一地施用于腳趾至大腿中部。對兩只腿都進行處理，對兩側(cè)中的任一側(cè)來說，處理都是隨機的。動物不進行脫毛處理。在最初的處理之后30分鐘，根據(jù)公開的足趾外展分值(用于評價足的靈活性)(Aoki，KR.Acomparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001 Dec；39(12)1815-20)在施用肉毒毒素后就足趾外展的能力對小鼠進行估計。小鼠的靈活性也通過主觀估計。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析由兩個盲測者獨立地將足趾外展分值列表。然后，在單向ANOVA重復(fù)測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果將在一次局部施用肉毒毒素和PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素和對照聚陽離子PEI(“BA”)后獲得的平均足趾外展分值示于下列的表3中。將重復(fù)實驗(對本實驗進行單次獨立重復(fù)實驗)的結(jié)果列于表4。和對照相比，非肽基載體PEIR提供了統(tǒng)計學(xué)上顯著的肉毒毒素通過皮膚的功能性遞送。和前面一樣，觀察到動物朝向被麻痹的肢體作圓周走動。
表3在一次局部施用Botox和超純PEIR(“AZ”)、或Botox和對照聚陽離子PEI(“BA”)后30分鐘的足趾外展分值。顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0002(在置信度99％下是顯著的)表4在一次局部施用Botox和超純PEIR(“AZ1”)、或Botox和對照聚陽離子PEI(“BA1”)后30分鐘的足趾外展分值。顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
P＝0.0001(在置信度99％下是顯著的)
結(jié)論本實驗表明非肽基透皮載體可將治療劑量的肉毒毒素轉(zhuǎn)運穿過皮膚而無需在之前共價修飾肉毒毒素。這些發(fā)現(xiàn)補充了用具有肽基轉(zhuǎn)移試劑進行的實驗。使用非肽基或肽基載體獲得治療效果的選擇可使施用適合特定的情況、環(huán)境和施用方法，加寬了本發(fā)明的透皮遞送平臺的范圍。
實施例4具有肽基載體的局部肉毒毒素制劑對前額多汗癥和皺紋的治療功效本實驗表明，通過使用該肽基載體，可將肉毒毒素作為局部試劑治療性地遞送通過完整的皮膚以治療人受試者上的前額多汗癥和皺紋。
用于前額多汗癥和皺紋研究的實驗方法使用具有Nikon TTL Macro-speedlight SB29s閃光燈的NikonD70照相機(Nikon，Inc.USA)在藍色背景下拍攝受試者的前額的基線和處理后的照片。
使用Sony Digital Handycam攝象機在藍色背景下拍攝受試者的前額的基線和處理后的錄相。
使用10％的局部聚維酮碘溶液(Walgreen Co.，Deerfield，Illinois)和Kingsford′s 100％的玉米淀粉(ACH Food Companies，Inc.，Memphis，Tennessee)進行Minor′s淀粉/碘檢測以顯示汗的產(chǎn)生。使用無菌棉球(Johnson & Johnson Consumer ProductCompany，Skillman，New Jersey)用碘溶液涂抹受試者的前額，然后讓其完全干燥。使用無菌棉球用淀粉輕輕地涂在該區(qū)域。在環(huán)境室溫下通過體育運動引發(fā)出汗。當(dāng)汗溶解碘并和淀粉粉末反應(yīng)時就出現(xiàn)深藍色的小點。使用具有Nikon TTL Macro-speedlight SB29s閃光燈的Nikon D70照相機在藍色背景下拍攝碘-淀粉檢測法的基線和處理后的照片。用70％EtOH清洗受試者的前額，然后用去離子水清洗。
在處理實施前，通過用于角質(zhì)層的非侵入性膠帶粘貼方法(non-invasive tape stripping method)預(yù)處理受試者的前額上的預(yù)先確定的處理區(qū)域。將預(yù)先剪好的膠帶用于處理區(qū)域，用力壓牢數(shù)秒。通過從膠帶的一角拉起快速地取下膠帶。在取下第一膠帶后立即向相同的區(qū)域小心地施用第二膠帶。重復(fù)進行膠帶粘貼3至5次。
處理物的配制配制無菌的0.9％的氯化鈉(Abbott Laboratories，NorthChicago，Illinois)+5％EtOH+5％的標(biāo)記有A-3C(Donlar BioPolymer，Inc.Bedford Park，Illinois)的短鏈多聚天冬氨酸溶液的Botox重構(gòu)溶液(即，每1.0毫升溶液，900微升無菌的0.9％的氯化鈉和50微升的100％EtOH和50微升的短鏈多聚天冬氨酸溶液)。以1毫克/毫升的濃度配制具有0.9％的氯化鈉和5％的EtOH的Kn21T(即，以500微升Kn21T為等分，其中加入了25微升100％的EtOH)。如此處所用的，Kn21T是指具有21,000的分子量和TAT分支基團的帶正電荷的多聚賴氨酸主鏈。使用具有18G11/2的不含乳膠成份的注射器(BectonDickinson & Co.，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey)，用1.0毫升重構(gòu)溶液對100個單位的Botox(Allergan，Irvine，CA)進行重構(gòu)。通過8次倒轉(zhuǎn)小心地混合重構(gòu)的Botox。每個受試者使用200單位的Botox。制備“Essentia Botox溶液”，其具有200個單位的Botox和Kn21T+5％EtOH(即，向500微升的Kn21T和25微升100％的EtOH中加入2.0毫升Botox)并室溫下放置5分鐘以形成復(fù)合物。
用重構(gòu)溶液和Kn21T+5％EtOH制備對照溶液(即向500微升的Kn21T和25微升100％的EtOH中加入2.0毫升重構(gòu)溶液)并保持在室溫。
處理物應(yīng)用受試者靠在桌子上，用防護罩圍住眼睛、臉和上半身。使用移液器對受試者的前額均勻地施用處理物，并用戴有無粉劑的腈手套的手指作環(huán)形運動將其按摩入皮膚。用薄層Cetaphil潤膚霜(moisturizing cream)(Galderma，F(xiàn)ort Worth，TX)覆蓋處理區(qū)域并溫育60分鐘。在60分鐘溫育后，用無菌紗布片除去處理物。將沙布片和手套扔入收集生物危害物的袋中。
結(jié)果圖3描述了在用肽基載體和肉毒毒素組合局部處理后，皺紋長度、深度和寬度顯著減少。本實驗進一步確認，當(dāng)和透皮載體組合時，局部施用的肉毒毒素可提供顯著的肌肉麻痹以提供美容效果。圖4是經(jīng)處理的皮膚(A)和未處理的皮膚(B)的Mikrosll鑄型。在未處理的皮膚的鑄型上可見皺紋。
圖5和6顯示Minor′s淀粉/碘檢測法的結(jié)果。圖5顯示施用后2分鐘拍攝的照片，圖框(A)對應(yīng)于用Essentia Botox洗劑處理的一側(cè)，圖框(B)對應(yīng)于用只含有Kn21T載體的對照洗劑處理的側(cè)面。圖6和圖5相同，除了其攝自施用后4分鐘之外。注意，在對照洗劑側(cè)的染色更明顯，表明在該側(cè)的皮膚分泌的汗更多。也要注意，在未處理側(cè)更早地開始出汗。
結(jié)論本實施例表明，局部施用的肉毒毒素復(fù)合物可在減少細紋和粗皺紋上提供顯著的美容益處。該透皮作用進一步確定可用合適的載體實現(xiàn)局部施用肉毒毒素復(fù)合物例如此處描述的復(fù)合物后的肌肉麻痹。因此本實施例表明肉毒毒素的局部施用可導(dǎo)致肌肉痙攣例如眼瞼痙攣(blepharospasm)或斜頸的緩解以及與肌肉痙攣相關(guān)的疼痛例如下背疼痛的緩解。
實施例5具有肽基載體的局部肉毒毒素制劑對腋下多汗癥的治療功效本實驗證明，通過使用該肽基載體是否可將肉毒毒素作為局部試劑治療性地遞送通過完整的皮膚以治療人受試者的腋下多汗癥(每組10個腋窩，在隨機雙盲模式中對每位患者一個腋窩進行處理，另一個腋窩用作對照)。
腋下多汗癥研究的納入標(biāo)準(zhǔn)(inclusion criteria)·年齡18歲或更大·健康志愿者·提供知情同意書并由志愿者簽名·愿意遵從指導(dǎo)和返回以進行繼續(xù)觀察·具有預(yù)先存在的、主觀性的多汗癥·受試者未懷孕或未計劃在以后3個月內(nèi)懷孕·受試者居住在和/或工作在San Francisco或離研究區(qū)域較近·受試者在過去6個月內(nèi)從未接受腋下出汗癥的治療·受試者不打算在以后3個月內(nèi)進行腋下出汗癥的治療重量測量法作為重量測量法的部分，首先使受試者適應(yīng)進行檢測的區(qū)域的新環(huán)境。確切地，受試者以放松的姿勢在室溫72-77下坐15分鐘。
腋窩準(zhǔn)備(戴上無粉劑的腈手套以進行下列方法。)受試者換上一次性披肩和乳罩(如果是女性)或脫下上身衣服(如果是男性)以完全暴露兩個腋窩。預(yù)先確定的給藥區(qū)域為腋窩上長毛的皮膚包括的區(qū)域再加上擴展超出長毛皮膚1cm的區(qū)域。用取自50ml錐形管中的預(yù)濕的無菌沙布片清洗給藥區(qū)域，使用沙布的一面以相同的方向從上至下進行5次長撫摩擦拭來進行清洗。每次用干凈的預(yù)濕的沙布片再重復(fù)該步驟3次，同時當(dāng)心不要刺激或摩擦皮膚。將沙布片扔入垃圾。對另一個腋窩重復(fù)相同的洗滌方法。通過從腋窩的上部至底部的用力壓墊運動用干燥無菌的沙布來干燥腋窩，同時小心不要刺激或摩擦皮膚。然后，在進行重量估計方法后，通過將濾紙置于腋皺下進一步干燥腋窩并使所述濾紙在測試部位駐留5分鐘?；颊咦?，以放松的位置將其胳膊靠在其身上。將濾紙扔入垃圾。在第一次重量估計前，讓受試者休息1分鐘而不進行腋下處理。
汗的產(chǎn)量測量(重量估計)(在這些測量之前戴上一雙新的無粉劑的腈手套)。受試者將其手一起舉到頭的后面以完全暴露腋窩，同時部分傾斜(大約45度)。從錐形貯藏管中取出預(yù)先稱過重的濾紙并將其放在受試者的腋窩下，將濾紙的頂部沿腋皺線的中心排成列。用手指將濾紙保持原位，同時受試者松弛放下手臂至身體的側(cè)面。受試者坐起，用兩只胳膊緊緊地靠著其軀干進行5分鐘。當(dāng)濾紙被牢固地置于兩個腋窩下面時開始計時。同時測量兩個腋窩。5分鐘后，從腋窩取出濾紙并將其放回相同的各錐形管中。先放置的濾紙先取出。擰緊錐形管的蓋子以防止汗從管中蒸發(fā)。以一分鐘間隔再重復(fù)兩次汗的產(chǎn)生。
Minor′s淀粉/碘檢測受試者將其手一起舉至頭的后面以完全暴露腋窩。如前所述用無菌沙布片將碘溶液涂抹在預(yù)先確定的腋下區(qū)域并讓其晾干。當(dāng)?shù)庖淹耆蓵r，用棉球?qū)⒈拥矸弁吭谟傻飧采w的區(qū)域上。在施用淀粉前先讓碘晾干以減少假陽性和背景。然后受試者坐起，用雙臂緊緊地夾住其軀干。5分鐘后，受試者舉起其手臂并將手一起置于腦后以完全暴露腋窩。拍攝各腋窩的照片，清楚地標(biāo)明左腋窩和右腋窩及日期。用70％的EtOH清洗腋窩，然后用無菌去離子水清洗。
處理物制備用鹽和5％的EtOH以1mg/ml的濃度制備Kn21pr(即，以500微升Kn21pr為等分，向其中加入25微升100％的EtOH)。如此處所用的，Kn21pr是指帶正電荷的多聚賴氨酸主鏈，該主鏈具有21,000的分子量和包含被保護的寡聚精氨酸的分支基團。使用具有18G11/2的不含乳膠成份的無菌3ml注射器(Becton Dickinson & Co.，F(xiàn)ranklinLakes，New Jersey)，用0.75毫升0.9％的氯化鈉(AbbottLaboratories，North Chicago，Illinois)對100個單位的Botox(Allergan，Irvine，CA)進行重構(gòu)。通過倒轉(zhuǎn)8次小心地混合重構(gòu)的Botox。對每一受試者使用200單位的Botox。用200單位的Botox和5％的EtOH和Kn21pr制備處理溶液(即，向500微升的Kn21pr+25微升100％的EtOH中加入1.5毫升Botox)并在室溫下保持5分鐘以使之形成復(fù)合物。在5分鐘的溫育期后，加入大約1.0毫升4％的HPC(羥丙基纖維素)(具有1％的EtOH)并使用小的金屬調(diào)藥刀(spatula)輕輕地混合徹底。將均質(zhì)的處理溶液轉(zhuǎn)移至3ml注射器中和注射器尖蓋(syring tip cap)中。(Becton Dickinson and Company，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey)。
用0.9％的氯化鈉+5％EtOH和Kn21pr制備對照溶液(即，向500微升Kn21pr和25微升100％的EtOH中加入1.5毫升0.9％氯化鈉)并在室溫下放置5分鐘。在溫育后，加入大約1.0毫升4％的HPC(含有1％EtOH)并用小的金屬調(diào)藥刀輕輕地混合徹底。將均質(zhì)的對照液轉(zhuǎn)移至3ml注射器和注射器尖蓋中。
物理物的施用(帶上無粉劑的腈手套)受試者將其手指交叉扣在一起并將手置于頭的背面以完全暴露受試者的腋窩。然后，受試者靠在椅子上呈大約45度的角度。如圖7中所示，可視地繪出用于施用的給藥區(qū)域(即，超出長毛的皮膚1cm的區(qū)域)。檢查皮膚是否干燥。將標(biāo)記有表示左邊的“L”的經(jīng)標(biāo)記的注射器和標(biāo)記有表示右邊的“R”的注射器的注射器尖蓋取走，并準(zhǔn)備對受試者的腋窩施用。用注射器圍繞給藥區(qū)域均勻地涂上處理溶液并用手指按摩1分鐘使之進入皮膚。然后受試者放下其手臂貼在身體側(cè)邊并溫育60分鐘。在60分鐘溫育后，用無菌沙布片清潔處理物。將沙布片和手套扔入裝生物危害物的袋中。允許受試者離開。
結(jié)果Essentia局部BT減少出汗65％，在圖8a中對其進行說明。在用單獨的Kn21pr主鏈(對照)或Kn21pr主鏈+200U Botox(對基線的比例)治療(對兩側(cè)隨機進行)4周后的出汗量。使用NPSS，以p為顯著性，在p＜0.05下，通過魏克森訊號等級檢定(Wilcoxon signed rank)進行統(tǒng)計分析。[n＝10個受試者]。
第二次比較基線對4周(參見圖8b)。在用單獨的kn21pr主鏈(對照)或kn21pr主鏈+200U Botox(處理與對照的比例)治療(兩側(cè)隨機進行)腋窩4周后的出汗量(每5分鐘的mg數(shù))示于圖6。使用NPSS，以p為顯著性，在p＜0.05下，通過魏克森訊號等級檢定進行統(tǒng)計分析。[n＝10]。
圖9顯示這樣的照片，該照片描述了在用用于腋下多汗癥的治療的“Essentia Botox洗劑”進行局部治療之前和之后的Minor’s淀粉/碘檢測。顯示對于受試者#12的基線上的淀粉/碘檢測對2周后的檢測，其中用“Essentia Botox洗劑”(a和c)處理右腋窩，用對照(b和d)給左腋窩施用。這些照片說明在用淀粉碘中的載體+botox治療后觀察到的一般益處。盡管在對照側(cè)觀察到一些交叉(和在重量數(shù)據(jù)上25％的減少一致)，但處理物提供了顯著的減少(和在處理側(cè)在重量數(shù)據(jù)上65％的減少一致)。
結(jié)論本實施例進一步確定，肉毒毒素復(fù)合物的局部施用容易地在患有多汗癥(主觀地或通過測量判斷的)的患者群中在減少出汗上提供了治療上的益處，所述肉毒毒素是此處公開的根據(jù)本發(fā)明形成的復(fù)合物。在上面所示的前額的情況下和在手掌/足底(此時結(jié)合使用手套以在駐留期間限制制劑的擴散)的情況下已提供了該減少出汗的功效。用于提供治療上的益處的肉毒毒素的該透皮遞送進一步確定了所述方法可擴展用于其他情況(其中SNAP功能或乙酰膽堿信號是至關(guān)重要的)，例如膀胱功能障礙或痙攣、胃腸施用或皮脂腺分泌以減少臭味或預(yù)防/治療痤瘡。
權(quán)利要求
1.包含肉毒毒素和載體的組合物，所述載體包含聚合物主鏈，所述聚合物主鏈具有附著的帶正電荷的分支基團，其中所述載體和所述肉毒毒素之間的結(jié)合是非共價結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肉毒毒素是肉毒毒素衍生物。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肉毒毒素包含重組肉毒毒素。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肉毒毒素包含經(jīng)修飾的肉毒毒素。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述肉毒毒素是A型肉毒毒素。
7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述肉毒毒素是B型肉毒毒素。
8.權(quán)利要求5的組合物，其中所述肉毒毒素是C1型肉毒毒素。
9.權(quán)利要求5的組合物，其中所述肉毒毒素是D型肉毒毒素。
10.權(quán)利要求5的組合物，其中所述肉毒毒素是E型肉毒毒素。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體包含多肽，所述多肽具有附著的選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT、觸角足PTD、和HIV-TAT的片段或觸角足PTD的片段的帶正電荷的分支基團，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述載體包含多肽，所述多肽具有帶正電荷的選自-(gly)n1-(arg)n2的分支基團，其中下標(biāo)n1是從約0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中下標(biāo)n1是從0至大約8的整數(shù)。
14.權(quán)利要求12的組合物，其中下標(biāo)n1是從大約2至大約5的整數(shù)。
15.權(quán)利要求12的組合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約17的奇整數(shù)。
16.權(quán)利要求12的組合物，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約13的奇整數(shù)。
17.權(quán)利要求11的組合物，其中所述載體包含多肽，所述多肽具有附著的選自HIV-TAT和其片段的帶正電荷的分支基團。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述分支基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的帶正電荷的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨立地是從0至20的整數(shù)。
19.權(quán)利要求1的組合物，其中所述帶正電荷的分支基團按重量計算占至少大約0.05％的載體總重量。
20.權(quán)利要求1的組合物，其中所述帶正電荷的分支基團按重量計算占大約0.5％至大約45％的載體總重量。
21.權(quán)利要求1的組合物，其中所述帶正電荷的分支基團按重量計算占大約0.1％至大約30％的載體總重量。
22.權(quán)利要求1的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述多聚賴氨酸具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量。
25.權(quán)利要求23的組合物，其中所述多聚賴氨酸具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量。
26.權(quán)利要求23的組合物，其中所述多聚賴氨酸具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量。
27.權(quán)利要求1的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基載體。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至大約2,500,000的分子量。
31.權(quán)利要求29的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
32.權(quán)利要求29的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
33.權(quán)利要求1的組合物，其具有從大約4.5至大約6.3的pH。
34.權(quán)利要求1的組合物，當(dāng)在室溫下或在冷凍條件下貯存時其是穩(wěn)定的。
35.權(quán)利要求1的控釋組合物。
36.權(quán)利要求1的液體組合物。
37.權(quán)利要求1的凝膠組合物。
38.權(quán)利要求1的組合物，其是乳膏劑、洗劑或軟膏劑。
39.權(quán)利要求1的組合物，其還包含鹽水。
40.權(quán)利要求1的組合物，其還包含鹽水和pH緩沖系統(tǒng)。
41.用于給受試者施用肉毒毒素的試劑盒，其包含肉毒毒素和對其透皮遞送有效的量的載體，所述載體包含聚合物主鏈，所述主鏈具有附著的帶正電荷的分支基團，其中所述載體和所述肉毒毒素之間的結(jié)合是非共價結(jié)合。
42.權(quán)利要求41的試劑盒，其還包含定制的施藥器。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述定制的施藥器經(jīng)設(shè)計供專業(yè)護理人員使用。
44.權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述定制的施藥器經(jīng)設(shè)計供受試者自己使用。
45.權(quán)利要求41的試劑盒，其包含預(yù)先配制的包含所述肉毒毒素和所述載體的組合物。
46.權(quán)利要求41的試劑盒，其中分開地配制所述肉毒毒素和所述載體以在施用之前進行組合。
47.權(quán)利要求41的試劑盒，其中在用于通過皮膚給受試者施用所述肉毒毒素的裝置中含有所述肉毒毒素。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
49.用于給受試者施用肉毒毒素的試劑盒，其包含用于將肉毒毒素遞送給皮膚的裝置和組合物，所述組合物包含含有聚合物主鏈的載體，所述主鏈具有附著的選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD的帶正電荷的分支基團，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
50.權(quán)利要求49的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
51.給受試者施用肉毒毒素的方法，該方法包括將所述肉毒毒素和有效量的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的聚合物主鏈，其中所述載體和所述肉毒毒素之間的結(jié)合是非共價結(jié)合。
52.權(quán)利要求51的方法，其包括給受試者的皮膚或上皮局部施用有效量的權(quán)利要求1的組合物。
53.權(quán)利要求51的方法，其包括給受試者的皮膚或上皮分開地施用所述肉毒毒素和所述載體。
54.權(quán)利要求51的方法，其中施用所述肉毒毒素以獲得想要的生物學(xué)效果。
55.權(quán)利要求54的方法，其中施用所述肉毒毒素以獲得美學(xué)或美容上的益處。
56.權(quán)利要求54的方法，其中施用所述肉毒毒素以減少或預(yù)防免疫應(yīng)答。
57.權(quán)利要求56的方法，其中減少或預(yù)防的免疫應(yīng)答改善了之后所述組合物再施用時的治療反應(yīng)。
58.權(quán)利要求54的方法，其中施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和主觀或臨床多汗癥相關(guān)的癥狀。
59.權(quán)利要求54的方法，其中局部施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕主觀或臨床上的張力障礙收縮或肌張力障礙。
60.權(quán)利要求54的方法，其中局部施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和肌肉痙攣相關(guān)的癥狀。
61.權(quán)利要求60的方法，其中給受試者的下背部局部施用所述肉毒毒素。
62.權(quán)利要求60的方法，其中給受試者的頸部局部施用所述肉毒毒素。
63.權(quán)利要求60的方法，其中給受試者的至少一條腿局部施用所述肉毒毒素。
64.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的臉部或其一部分局部施用所述肉毒毒素。
65.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的腋窩或其部分局部施用所述肉毒毒素。
66.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的手掌或足或其部分局部施用所述肉毒毒素。
67.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的背部或頸部或其部分局部施用所述肉毒毒素。
68.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的腹股溝或其部分局部施用所述肉毒毒素。
69.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的手或足或其部分局部施用所述組合物。
70.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的肘、上臂、膝蓋或大腿，或其部分局部施用所述肉毒毒素。
71.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的臀部或其部分局部施用所述肉毒毒素。
72.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的軀干或其部分局部施用所述肉毒毒素。
73.權(quán)利要求51的方法，其中給受試者的骨盆或其部分局部施用所述肉毒毒素。
74.權(quán)利要求51的方法，其中施用所述肉毒毒素以產(chǎn)生或增強免疫應(yīng)答。
75.權(quán)利要求51的方法，其中局部施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和偏頭痛相關(guān)的癥狀。
76.權(quán)利要求51的方法，其中局部施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕痤瘡。
77.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是肉毒毒素衍生物。
78.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含重組肉毒毒素。
79.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含經(jīng)修飾的肉毒毒素。
80.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
81.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是A型肉毒毒素。
82.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是B型肉毒毒素。
83.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是C型肉毒毒素。
84.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是D型肉毒毒素。
85.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是E型肉毒毒素。
86.權(quán)利要求51的方法，其中所述載體包含聚合物主鏈，所述主鏈具有附著的選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT、觸角足PTD、和HIV-TAT或觸角足PTD的片段的帶正電荷的分支基團，其中下標(biāo)n1是從0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述載體包含多肽，所述多肽具有附著的選自-(gly)n1-(arg)n2的帶正電荷的分支基團，其中下標(biāo)n1是從約0至大約20的整數(shù)，下標(biāo)n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數(shù)。
88.權(quán)利要求87的方法，其中下標(biāo)n1是從0至大約8的整數(shù)。
89.權(quán)利要求87的方法，其中下標(biāo)n1是從大約2至大約5的整數(shù)。
90.權(quán)利要求87的方法，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約17的奇整數(shù)。
91.權(quán)利要求87的方法，其中下標(biāo)n2是從大約7至大約13的奇整數(shù)。
92.權(quán)利要求86的方法，其中所述載體包含多肽，所述多肽具有附著的選自HIV-TAT和其片段的帶正電荷的分支基團。
93.權(quán)利要求92的方法，其中所述分支基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的帶正電荷的HIV-TAT片段，其中下標(biāo)p和q各自獨立地是從0至20的整數(shù)。
94.權(quán)利要求51的方法，其中所述帶正電荷的分支基團按重量計算占至少大約0.05％的載體總重量。
95.權(quán)利要求51的方法，其中所述帶正電荷的分支基團按重量計算占大約0.5％至大約45％的載體總重量。
96.權(quán)利要求51的方法，其中所述帶正電荷的分支基團按重量計算占大約0.1％至大約30％的載體總重量。
97.權(quán)利要求51的方法，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述多聚賴氨酸具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量。
100.權(quán)利要求98的方法，其中所述多聚賴氨酸具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量。
101.權(quán)利要求98的方法，其中所述多聚賴氨酸具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量。
102.權(quán)利要求51的方法，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基載體。
103.權(quán)利要求102的方法，其中所述帶正電荷的非肽基聚合物是聚烯化亞胺。
104.權(quán)利要求102的方法，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至大約2,500,000的分子量。
106.權(quán)利要求104的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
107.權(quán)利要求104的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
108.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含重組肉毒毒素。
109.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素以具有從大約4.5至大約6.3的pH的組合物形式施用。
110.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素以控釋組合物的形式施用。
111.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在液體組合物中。
112.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在凝膠組合物中。
113.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在乳膏劑、洗劑或軟膏劑形式的組合物中。
114.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在還含有鹽水的組合物中。
115.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在還含有鹽水和pH緩沖系統(tǒng)的組合物中。
116.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在用于分配肉毒毒素的裝置中，該裝置局部地用于受試者的皮膚或上皮。
117.權(quán)利要求116的方法，其中所述裝置是皮膚貼劑。
118.權(quán)利要求117的方法，其中所述裝置是小室膠囊化(cell-encapsulating)裝置。
119.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和粘膜分泌相關(guān)的癥狀。
120.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕肥胖或其癥狀。
121.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕炎癥或其癥狀。
122.權(quán)利要求121的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和銀屑病相關(guān)的癥狀。
123.權(quán)利要求122的方法，其中將所述組合物和其他治療形式一起施用。
124.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕打鼾。
125.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和糖尿病相關(guān)的皮膚癥狀。
126.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以促進傷口愈合。
127.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和自主神經(jīng)功能障礙有關(guān)的癥狀。
128.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和大腦性癱瘓相關(guān)的癥狀。
129.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和橋本甲狀腺炎相關(guān)的癥狀。
130.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和乳腺疾病相關(guān)的癥狀。
131.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以改變毛發(fā)生長。
132.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和甲狀旁腺疾病相關(guān)的癥狀。
133.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和運動障礙相關(guān)的癥狀。
134.權(quán)利要求133的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和帕金森氏疾病相關(guān)的癥狀。
135.權(quán)利要求133的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和震顫相關(guān)的癥狀。
136.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和癲癇相關(guān)的癥狀。
137.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和內(nèi)耳疾病相關(guān)的癥狀。
138.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和泌尿疾病相關(guān)的癥狀。
139.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕其他膽堿能控制的分泌。
140.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和神經(jīng)精神紊亂相關(guān)的癥狀。
141.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和受傷的肌肉相關(guān)的癥狀。
142.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和耳疾病相關(guān)的癥狀。
143.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和癌癥相關(guān)的癥狀。
144.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和神經(jīng)陷夾病癥(nerve entrapment disorders)相關(guān)的癥狀。
145.權(quán)利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以預(yù)防或減輕和高鈣血癥相關(guān)的癥狀。
146.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含融合蛋白。
147.權(quán)利要求5的組合物，其中所述肉毒毒素是F型肉毒毒素。
148.權(quán)利要求5的組合物，其中所述肉毒毒素是G型肉毒毒素。
149.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是F型肉毒毒素。
150.權(quán)利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是G型肉毒毒素。
全文摘要
用于肉毒毒素(包括肉毒毒素的衍生物)的局部遞送的組合物，其包含肉毒毒素和載體，所述載體包含聚合物主鏈，所述主鏈包含具有附著的帶正電荷的分枝或“效能”基團的長鏈多肽或非肽基聚合物。本發(fā)明也涉及這樣的方法，該方法通過將有效量的肉毒毒素和載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用，減少肌肉麻痹和可用肉毒毒素治療的病癥，特別是皮下肌肉的麻痹，和最特別地是臉部肌肉的麻痹。也描述了用于施用的試劑盒。
文檔編號A61K39/42GK1946431SQ200580012922
公開日2007年4月11日 申請日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月3日
發(fā)明者M·D·戴克, J·M·沃 申請人:雷文斯治療公司