專(zhuān)利名稱(chēng)：用維生素d化合物治療間質(zhì)性膀胱炎的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及維生素D化合物在制備用于預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物中的用途。進(jìn)一步涉及預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的方法，該方法施用單獨(dú)的或者與其它物質(zhì)組合的預(yù)防和/或治療這類(lèi)疾病有效量的維生素D化合物。
間質(zhì)性膀胱炎在本文中表示為“IC”，是一種慢性炎性膀胱疾病，也被稱(chēng)為慢性盆腔疼痛綜合征(CPPS)或膀胱疼痛綜合征(PBS)，以盆腔疼痛、尿急和尿頻為特征。這種疾病主要影響女性，不過(guò)男性也有被診斷為IC的。與其它膀胱功能障礙的病癥不同，IC以膀胱壁的慢性炎癥為特征，膀胱壁的慢性炎癥是癥狀學(xué)的主要原因；換言之，膀胱收縮性異常和慢性盆腔疼痛的原因是慢性炎癥，所以治療應(yīng)當(dāng)針對(duì)該病因。事實(shí)上，用平滑肌松弛劑進(jìn)行的膀胱功能障礙如膀胱過(guò)度活動(dòng)癥(overactive bladder)的傳統(tǒng)治療對(duì)IC患者無(wú)效。
目前，有大量療法用于這種疾病，這反映出這是一種沒(méi)有真正有效的治療方法的病癥。例如，膀胱內(nèi)二甲基亞砜(DMSO)已經(jīng)成為廣泛臨床研究的對(duì)象。但是，其作用機(jī)理仍然不明。臨床結(jié)果不能完全令人滿(mǎn)意，施用途徑(膀胱內(nèi))對(duì)于IC經(jīng)常需要的長(zhǎng)期治療而言并不理想。
一些現(xiàn)有療法以粘膜屏障保護(hù)的觀念為基礎(chǔ)，例如肝素類(lèi)似物戊聚糖多硫酸鈉(PPS)的使用。結(jié)果再次令人失望，在長(zhǎng)期的基礎(chǔ)上，不到20％的口服施用PPS的患者顯示有益效果。
其它方法包括使用抗組胺劑、黃酮類(lèi)化合物和其它可以減少由肥大細(xì)胞介導(dǎo)的促炎劑作用的物質(zhì)。這類(lèi)方法已經(jīng)在多項(xiàng)研究中顯示出不一致的和低限度的有效性。另一種方法、即膀胱內(nèi)BCG(卡介苗)的使用也未在以DMSO為對(duì)照的交叉試驗(yàn)中顯示出癥狀改善。
因此，顯然需要尋找針對(duì)與該疾病病因有關(guān)的所有不同免疫因素的新的藥理學(xué)方法。
正如本文所述，現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，維生素D類(lèi)似物能夠治療和預(yù)防間質(zhì)性膀胱炎。
自從Mellanby于1920年發(fā)現(xiàn)維生素D(膽骨化醇)以來(lái)(Mellanby，E.(1921)Spec.Rep.Ser.Med.Res.Council(GB)SRS614)，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了它在高級(jí)動(dòng)物生物系統(tǒng)中的重要性。正是在1920-1930年間維生素D被正式歸類(lèi)為“維生素”，其骨骼的正常發(fā)育和鈣與磷內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持所必需的。
關(guān)于維生素D3代謝的研究開(kāi)始于血漿代謝物25-羥基維生素D3[25(OH)D3](Blunt，J.W.等人.(1968)Biochemistry 63317-3322)和激素活性形式1-α，25(OH)2D3(Myrtle，J.F.等人.(1970)J.Biol.Chem.2451190-1196；Norman，A.W.等人.(1971)Science17351-54；Lawson，D.E.M.等人.(1971)Nature230228-230；Holick，M.F.(1971)Proc.Natl.Acad.Sci.USA68803-804)的發(fā)現(xiàn)和化學(xué)表征。維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的概念的表述依賴(lài)于腎臟在以謹(jǐn)慎調(diào)節(jié)方式產(chǎn)生1-α，25(OH)2D3中的關(guān)鍵作用的認(rèn)識(shí)(Fraser，D.R.和Kodicek，E(1970)Nature 288764-766；Wong，R.G.等人.(1972)J.Clin.Invest.511287-1291)和腸中1-α，25(OH)2D3核受體(VD3R)的發(fā)現(xiàn)(Haussler，M.R.等人.(1969)Exp.Cell Res.58234-242；Tsai，H.C.和Norman，A.W.(1972)J.Biol.Chem.2485967-5975)。
維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的運(yùn)行依賴(lài)于下列因素第一，細(xì)胞色素P450酶在肝臟(Bergman，T.和Postlind，H.(1991)Biochem.J.276427-432；Ohyama，Y和Okuda，K.(1991)J.Biol.Chem.2668690-8695)和腎臟(Henry，H.L.和Norman，A.W.(1974)J.Biol.Chem.2497529-7535；Gray，R.W.和Ghazarian，J.G.(1989)Biochem.J.259561-568)中以及在多種其它組織中的存在，以實(shí)現(xiàn)維生素D3向生物活性代謝物例如1-α，25(OH)2D3和24R，25(OH)2D3的轉(zhuǎn)化；第二，血漿維生素D結(jié)合蛋白(DBP)的存在，以實(shí)現(xiàn)這些疏水性分子向維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的各種組織的選擇性運(yùn)輸和遞送(Van Baelen，H.等人.(1988)Ann NY Acad.Sci.53860-68；Cooke，N.E.和Haddad，J.G.(1989)Endocr.Rev.10294-307；Bikle，D.D.等人.(1986)J.Clin.Endocrinol.Metab.63954-959)；第三，立體選擇性受體在多種靶組織中的存在，所述受體與激動(dòng)劑1-α，25(OH)2D3相互作用以產(chǎn)生必不可少的對(duì)該開(kāi)環(huán)甾類(lèi)激素的特異性生物學(xué)響應(yīng)(Pike，J.W.(1991)Annu.Rev.Nutr.11189-216)。迄今為止，有證據(jù)表明1-α，25(OH)2D3的核受體(VD3R)存在于30多種組織和癌細(xì)胞系中(Reichel，H.和Norman，A.W.(1989)Annu.Rev.Med.4071-78)，包括正常的膀胱。
Vitamin D3及其激素活性形式是眾所周知的鈣和磷內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)劑。已知這些化合物刺激鈣與磷的腸吸收、骨礦物質(zhì)的調(diào)動(dòng)和鈣在腎中的存留中的至少一種。此外，發(fā)現(xiàn)特異性維生素D受體存在于30多種組織中已經(jīng)導(dǎo)致維生素D3被確定為除其在鈣/骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的經(jīng)典角色以外的多能調(diào)節(jié)劑。能將維生素D3氧化為其活性形式的酶、例如25-OHD-1-α-羥化酶和特異性受體在多種組織例如骨、角質(zhì)形成細(xì)胞、胎盤(pán)和免疫細(xì)胞中的聯(lián)合存在已經(jīng)提示了1-α，25(OH)2D3的旁分泌作用。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)維生素D3激素和活性代謝物能調(diào)節(jié)正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞的細(xì)胞增殖和分化(Reichel，H.等人.(1989)Ann.Rev.Med.4071-78)。
由于維生素D3及其代謝物的活性，很多關(guān)注已經(jīng)集中于這些化合物的合成類(lèi)似物的開(kāi)發(fā)。大量這些類(lèi)似物牽涉A環(huán)、B環(huán)、C/D環(huán)和主要是側(cè)鏈中的結(jié)構(gòu)修飾(Bouillon，R.等人.(1995)Endocrine Reviews 16(2)201-204)。盡管大多數(shù)迄今所開(kāi)發(fā)的維生素D3類(lèi)似物牽涉?zhèn)孺湹慕Y(jié)構(gòu)修飾，但是少量研究已經(jīng)報(bào)道了A環(huán)非對(duì)映體的生物特性(Norman，A.W.等人.(1993)J.Biol.Chem.268(27)20022-20030)。此外，已經(jīng)研究了甾類(lèi)的生物酯化作用(Hochberg，R.B.，(1998)Endocr Rev.19(3)331-348)，維生素D3的酯是已知的(WO97/11053)。
而且，盡管為開(kāi)發(fā)合成類(lèi)似物已付出大量努力，但是維生素D及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的臨床應(yīng)用被這些化合物施用于受試者用于維生素D化合物的已知適應(yīng)癥/應(yīng)用后所引起的不希望的副作用所限制。
維生素D的活化形式、維生素D3和其類(lèi)似物中的一些已被描述為細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的有力調(diào)節(jié)劑。以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，維生素D3以及類(lèi)似物(類(lèi)似物V)抑制BPH細(xì)胞增殖，抵抗BPH細(xì)胞的有力生長(zhǎng)因子例如角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF1)的促有絲分裂活性。而且，該類(lèi)似物在未刺激的與KGF-刺激的BPH細(xì)胞中誘導(dǎo)bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)動(dòng)和細(xì)胞凋亡。
因此，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療間質(zhì)性膀胱炎的維生素D化合物和使用這類(lèi)化合物的新治療方法。
在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明之前，為了可以更容易地理解本發(fā)明，為方便起見(jiàn)此處首先定義和集中了某些術(shù)語(yǔ)。
“間質(zhì)性膀胱炎”(IC)表示膀胱的慢性、炎性障礙，以不定程度的尿急、尿頻和膀胱疼痛為特征。正如本文所述，發(fā)明人已經(jīng)指明，維生素D3類(lèi)似物可用于治療IC的炎性組分和由此導(dǎo)致的IC特征性的膀胱活動(dòng)過(guò)度，這對(duì)IC患者中見(jiàn)到的疼痛、尿急和尿頻癥狀有作用。一些IC患者可能出現(xiàn)疼痛為主要癥狀，伴有輕微的尿頻和尿急，而其它患者可能僅呈現(xiàn)尿頻和尿急癥狀。IC患者可能或者可能不出現(xiàn)另外的夜尿癥狀。疼痛目前被視為IC的最重要的特征性癥狀，而夜尿不被視為IC診斷的重要因素。人們還認(rèn)為具有正常排尿頻率、但是具有疼痛和尿急的患者也可能患有IC。這表明IC患者可能呈現(xiàn)出各種癥狀組合。所有呈現(xiàn)排尿不適、恥骨上加壓或沉重(suprapubic pressure or heaviness)或者排尿燒灼感(burning micturation)、伴有或沒(méi)有疼痛、無(wú)細(xì)菌感染的患者均應(yīng)當(dāng)懷疑為IC。目前，IC是根據(jù)臨床特性進(jìn)行診斷的。推薦的檢測(cè)包括尿分析、尿培養(yǎng)、細(xì)胞學(xué)、尿流動(dòng)力學(xué)和在麻醉與膀胱擴(kuò)張下的膀胱鏡檢查。
術(shù)語(yǔ)“施用”包括向受試者引入維生素D化合物以發(fā)揮它們預(yù)期功能的途徑?？墒褂玫氖┯猛緩降膶?shí)例包括注射(皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi))、口服、吸入、直腸、透皮或經(jīng)由膀胱滴注。藥物制劑當(dāng)然是通過(guò)適合于每種施用途徑的形式給予的。例如，通過(guò)注射、輸注、吸入、洗劑、軟膏劑、栓劑等、以片劑或膠囊的形式施用這些制劑?？诜┯檬莾?yōu)選的。注射可以是推注或者可以是連續(xù)輸注。根據(jù)施用的途徑，維生素D化合物可以用所選擇的材料包衣或者置于所選擇的材料中，以保護(hù)它免受可能對(duì)其發(fā)揮預(yù)期功能的能力具有有害影響的自然條件。維生素D化合物可以被單獨(dú)施用或者與另一種上述物質(zhì)、例如與平滑肌松弛劑(例如α阻滯劑或抗毒蕈堿藥)或與藥學(xué)上可接受的載體或此二者聯(lián)合施用。維生素D化合物可以在施用另一種物質(zhì)之前、與該物質(zhì)同時(shí)或者在施用該物質(zhì)之后被施用。此外，維生素D化合物也可以以前體形式施用，它在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其活性代謝物或者更大活性的代謝物。
術(shù)語(yǔ)“有效量”包括在必要的劑量和時(shí)間段下有效達(dá)到所需結(jié)果、即足以治療間質(zhì)性膀胱炎的量。維生素D化合物的有效量可以因多種因素而異，所述因素例如疾病狀態(tài)、受試者的年齡與體重和維生素D化合物在受試者中引發(fā)所需響應(yīng)的能力?？梢哉{(diào)節(jié)給藥方案，以提供最佳的治療響應(yīng)。有效量還是其中維生素D化合物的治療有益作用比任何毒性和有害作用(例如副作用)重要的量。
維生素D化合物的治療有效量(即有效劑量)可以從約0.001至30μg/kg體重不等，優(yōu)選約0.01至25μg/kg體重，更優(yōu)選約0.1至20μg/kg體重，甚至更優(yōu)選約1至10μg/kg、2至9μg/kg、3至8μg/kg、4至7μg/kg或5至6μg/kg體重。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，某些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量，包括但不限于疾病或障礙的嚴(yán)重性、以前的治療、受試者的總體健康狀況和/或年齡以及存在的其它疾病。另外，施用的劑量也將取決于所使用的特定維生素D化合物，每種化合物的有效量可以由本領(lǐng)域已知的滴定法來(lái)確定。此外，用治療有效量的維生素D化合物治療受試者可以包括單一治療，或者優(yōu)選地可以包括一系列治療。在一個(gè)實(shí)例中，用維生素D化合物治療受試者，劑量在約0.1至20μg/kg體重的范圍內(nèi)，每天一次，持續(xù)六個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，例如一生，這取決于癥狀的控制和病癥的變化情況。而且，如同其它慢性治療一樣，可以考慮“開(kāi)關(guān)(on-off)”或間歇性治療方案。還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，治療所用的維生素D化合物的有效劑量可以隨著特定治療過(guò)程而增加或減少。
術(shù)語(yǔ)“烷基”表示飽和脂族基團(tuán)，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基(脂環(huán)族基團(tuán))、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。術(shù)語(yǔ)烷基進(jìn)一步包括這樣的烷基，它們可以進(jìn)一步包括氧、氮、硫或磷原子以代替烴骨架中的一個(gè)或多個(gè)碳，例如氧、氮、硫或磷原子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，直鏈或支鏈烷基在其骨架中具有30個(gè)或30個(gè)以下的碳原子(例如對(duì)于直鏈，C1-C30，對(duì)于支鏈，C3-C30)，優(yōu)選26個(gè)或26個(gè)以下，更優(yōu)選20個(gè)或20個(gè)以下。同樣，優(yōu)選的環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選地在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3、4、5、6或7個(gè)碳。
此外，整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)烷基旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者表示具有取代基以代替烴骨架中的一個(gè)或多個(gè)碳上的氫的烷基部分。這類(lèi)取代基可以包括例如鹵素、羥基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基(alkylthiocarbonyl)、烷氧基、磷酸根、膦?；?phosphonato)、次膦?；?phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲?；碗寤?、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、磺酸基(sulfonato)、氨磺?；?、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或者芳族或雜芳族部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，如果適當(dāng)，在烴鏈上取代的部分本身可以被取代。環(huán)烷基可以被進(jìn)一步取代，例如被上述取代基進(jìn)一步取代?！巴榛蓟辈糠质潜环蓟〈耐榛?例如苯甲基(芐基))。術(shù)語(yǔ)“烷基”也包括在長(zhǎng)度和可能的取代上類(lèi)似于上述烷基、但是分別含有至少一條雙鍵或叁鍵的不飽和的脂族基團(tuán)。
除非對(duì)碳數(shù)另有規(guī)定，否則本文所用的“低級(jí)烷基”表示如上所定義的烷基，但是在其骨架結(jié)構(gòu)中具有1至10個(gè)碳，更優(yōu)選1至6個(gè)、最優(yōu)選1至4個(gè)碳原子，它可以是直鏈或支鏈的。低級(jí)烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、己基、庚基、辛基等。低級(jí)烷基的其它實(shí)例包括仲丁基、正丁基和戊基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”包括在其骨架中具有4個(gè)或4個(gè)以下碳原子的直鏈烷基，例如C1-C4烷基。
因此，烷基的具體實(shí)例包括C1-6烷基或C1-4烷基(例如甲基或乙基)。羥基烷基的具體實(shí)例包括C1-6羥基烷基或C1-4羥基烷基(例如羥甲基)。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基烷基”、“多氨基烷基”和“硫代烷氧基烷基”表示如上所述的烷基，它們進(jìn)一步包括氧、氮或硫原子代替烴骨架中的一個(gè)或多個(gè)碳，例如氧、氮或硫原子。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“芳基”表示芳基原子團(tuán)，包括5-和6-元單環(huán)芳族基團(tuán)，它可以包括0至4個(gè)雜原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、苯并_唑、苯并噻唑、三唑、四唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。芳基也包括多環(huán)稠合芳族基團(tuán)，例如萘基、喹啉基、吲哚基等。在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有雜原子的那些芳基也可以稱(chēng)為“芳基雜環(huán)”、“雜芳基”或“雜芳族基團(tuán)”。芳族環(huán)可以在一個(gè)或多個(gè)環(huán)位置上被上述取代基取代，例如鹵素、羥基、烷氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、磷酸根、膦?；?、次膦?；?、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、?；被?包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲?；碗寤?、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、磺酸基、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或者芳族或雜芳族部分。芳基也可以與不是芳族的脂環(huán)族或雜環(huán)的環(huán)稠合或橋連以形成多環(huán)(例如四氫化萘)。
術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”和“炔基”表示長(zhǎng)度和可能的取代類(lèi)似于上述烷基、但是分別含有至少一條雙鍵或叁鍵的不飽和的脂族基團(tuán)。例如，本發(fā)明涵蓋氰基和炔丙基。
術(shù)語(yǔ)“手性”表示具有鏡像伴侶的不可疊加性質(zhì)的分子，而術(shù)語(yǔ)“非手性”表示可疊加于它們鏡像伴侶的分子。
術(shù)語(yǔ)“非對(duì)映體”表示具有兩個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)中心的立體異構(gòu)體，它們的分子不是彼此的鏡像。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)映體”表示化合物的兩種立體異構(gòu)體，它們是彼此的不可疊加鏡像。兩種對(duì)映體的等摩爾混合物被稱(chēng)為“外消旋混合物”或“外消旋物”。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”表示-F、-Cl、-Br或-I；術(shù)語(yǔ)“巰基”或“硫醇”表示-SH；術(shù)語(yǔ)“羥基”表示-OH。
術(shù)語(yǔ)“鹵代烷基”旨在包括被鹵素單-、二-或多-取代的以上所定義的烷基，例如C1-6鹵代烷基或C1-4鹵代烷基，例如氟甲基和三氟甲基。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜原子”表示任何除碳或氫以外的元素的原子。優(yōu)選的雜原子是氮、氧、硫和磷。
術(shù)語(yǔ)“多環(huán)基”或“多環(huán)原子團(tuán)”表示兩個(gè)或多個(gè)環(huán)狀環(huán)的原子團(tuán)(例如環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基)，其中兩個(gè)鄰接的環(huán)共用兩個(gè)或多個(gè)碳，例如這些環(huán)是“稠合環(huán)”。通過(guò)不相鄰原子連接的環(huán)被稱(chēng)為“橋連”環(huán)。多環(huán)的每個(gè)環(huán)可以被上述取代基取代，例如鹵素、羥基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸根、膦?；⒋戊Ⅴ；?、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、?；被?包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基和脲基)、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、磺酸基、氨磺?；⒒酋０被?、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基、烷基芳基或者芳族或雜芳族部分。
術(shù)語(yǔ)“異構(gòu)體”或“立體異構(gòu)體”表示具有相同化學(xué)組成、但是在原子或基團(tuán)的空間排列方面不同的化合物。
術(shù)語(yǔ)“分離的”或“基本上純化的”在本文中可互換使用，表示非天然存在狀態(tài)的維生素D3化合物。這些化合物當(dāng)天然產(chǎn)生時(shí)可以基本上不含細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)可以基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“分離”或“基本上純化”也表示基本上沒(méi)有對(duì)映體之一的手性化合物的制備物；即分子的對(duì)映體富集或非外消旋制備物。與之相似，術(shù)語(yǔ)“分離的差向異構(gòu)體”或“分離的非對(duì)映體”表示基本上不含其它立體化學(xué)形式的手性化合物的制備物。例如，分離的或基本上純化的維生素D3化合物包括富集具有以α-構(gòu)型連接于A-環(huán)3位手性碳上的取代基的立體異構(gòu)體的維生素D3的合成或天然制備物，因而基本上沒(méi)有其它具有β-構(gòu)型的異構(gòu)體。除非另有規(guī)定，否則這類(lèi)術(shù)語(yǔ)表示其中α與β形式的重量比大于1∶1的維生素D3組合物。例如，差向異構(gòu)體的分離的制備物表示相對(duì)于β-立體異構(gòu)體而言具有大于50重量％、更優(yōu)選至少75重量％、甚至更優(yōu)選至少85重量％的α-差向異構(gòu)體的制備物。當(dāng)然，富集作用可以遠(yuǎn)大于85％，提供“基本上差向異構(gòu)體-富集的”制備物，即相對(duì)于β-立體異構(gòu)體而言具有大于90％、甚至更優(yōu)選大于95％的α-差向異構(gòu)體的化合物制備物。術(shù)語(yǔ)“基本上不含β-立體異構(gòu)體”應(yīng)理解為具有相似的純度范圍。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“維生素D化合物”包括任何能夠治療或預(yù)防間質(zhì)性膀胱炎的為維生素D類(lèi)似物的化合物。一般而言，為維生素D受體配體(VDR配體)并且能夠治療或預(yù)防間質(zhì)性膀胱炎的化合物被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。維生素D化合物優(yōu)選地是維生素D受體的激動(dòng)劑。因此，維生素D化合物旨在包括開(kāi)環(huán)甾類(lèi)。適用于本發(fā)明的方法的具體維生素D化合物的實(shí)例在本文中有進(jìn)一步描述。維生素D化合物包括維生素D2化合物、維生素D3化合物、其異構(gòu)體或者其衍生物/類(lèi)似物。優(yōu)選的維生素D化合物是維生素D3化合物，它們是維生素D受體的配體(更優(yōu)選地是激動(dòng)劑)。優(yōu)選地，維生素D化合物(例如維生素D3化合物)是比天然配體(即維生素D，例如維生素D3)更有力的維生素D受體激動(dòng)劑。維生素D1化合物、維生素D2化合物和維生素D3化合物分別包括維生素D1、D2、D3和其類(lèi)似物。在某些實(shí)施方案中，維生素D化合物可以是甾類(lèi)，例如開(kāi)環(huán)甾類(lèi)，例如骨化醇(calciol)、骨化二醇或骨化三醇。本發(fā)明的維生素D化合物的非限制性實(shí)例包括下列文獻(xiàn)所述的那些美國(guó)專(zhuān)利No.6,017,908、6,100,294、6,030,962、5,428,029和6,121,312、已公布的國(guó)際申請(qǐng)WO98/51633、WO01/40177A3。
術(shù)語(yǔ)“開(kāi)環(huán)甾類(lèi)”是本領(lǐng)域公認(rèn)的，包括其中甾環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)戊環(huán)多氫菲環(huán)之一斷裂的化合物。例如，1-α，25(OH)2D3及其類(lèi)似物是有激素活性的開(kāi)環(huán)甾類(lèi)。在維生素D3的情況下，B-環(huán)的9-10碳-碳鍵斷裂，生成開(kāi)環(huán)-B-甾類(lèi)。維生素D3的正式IUPAC名稱(chēng)為9，10-開(kāi)環(huán)膽甾-5，7，10(19)-三烯-3B-醇。為了方便，本文闡述1-α，25(OH)2D3的6-s-反式構(gòu)象異構(gòu)體，所有碳原子均用標(biāo)準(zhǔn)甾類(lèi)表示法進(jìn)行編號(hào)。
在本文所列的結(jié)構(gòu)式中，環(huán)A上的各種取代基與甾族核的連接用這些表示法之一闡述虛線(xiàn)(----)表示取代基為β-取向(即，在環(huán)平面以上)，楔形實(shí)線(xiàn)(_)表示取代基為α-取向(即，在分子平面以下)，或者波浪線(xiàn) 表示取代基可以在環(huán)平面以上或以下。關(guān)于環(huán)A，應(yīng)當(dāng)理解的是，維生素D領(lǐng)域中的立體化學(xué)常規(guī)與一般化學(xué)領(lǐng)域相反，其中虛線(xiàn)表示環(huán)A上的取代基為α-取向(即，在分子平面以下)，楔形實(shí)線(xiàn)表示環(huán)A上的取代基為β-取向(即，在環(huán)平面以上)。
此外，跨越碳-碳雙鍵的立體化學(xué)的表示也與一般化學(xué)領(lǐng)域相反，“Z”表示常被稱(chēng)為“順式”(同側(cè))的構(gòu)象，而“E”表示常被稱(chēng)為“反式”(對(duì)側(cè))的構(gòu)象。無(wú)論如何，兩種構(gòu)型順式/反式和/或Z/E都適用于本發(fā)明的化合物。
正如所示的那樣，激素1-α，25(OH)2D3的A環(huán)在碳1和3含有兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)中心，每個(gè)不對(duì)稱(chēng)中心含有構(gòu)型得到充分表征的羥基，即1-α-和3-β-羥基。換言之，A環(huán)的碳1和3是“手性碳”或“碳中心”。
關(guān)于手性中心的命名，術(shù)語(yǔ)“d”和“l(fā)”構(gòu)型是用IUPACRecommendations定義的。至于術(shù)語(yǔ)的使用，非對(duì)映體、外消旋物、差向異構(gòu)體和對(duì)映體將以它們的通常含義被用來(lái)描述制備物的立體化學(xué)。
而且，在本專(zhuān)利文獻(xiàn)中，維生素D化合物的A環(huán)在一般結(jié)構(gòu)式中常被描繪為下列結(jié)構(gòu)中的任意一種 其中X1和X2被定義為H或＝CH2；或者 其中X1和X2被定義為H2或CH2。
盡管似乎沒(méi)有任何既定常規(guī)，但是顯然本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解式(A)或(B)代表以下的其中例如X1是＝CH2且X2被定義為H2的A環(huán) 對(duì)于本發(fā)明的目的，在所有一般結(jié)構(gòu)中將使用式(B)。
因此，一方面，本發(fā)明提供了維生素D化合物在預(yù)防或治療間質(zhì)性膀胱炎中的用途。也提供了通過(guò)施用有效量的維生素D化合物治療患有間質(zhì)性膀胱炎的患者的方法。進(jìn)一步提供了維生素D化合物在制備用于預(yù)防或治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物中的用途。進(jìn)一步提供了用于預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的維生素D化合物。還提供了一種套藥盒，其含有維生素D化合物以及指導(dǎo)將所述化合物施用于需要治療和/或預(yù)防間質(zhì)性膀胱炎的患者、從而治療和/或預(yù)防所述患者的間質(zhì)性膀胱炎的說(shuō)明書(shū)。間質(zhì)性膀胱炎可以例如以存在膀胱功能障礙和膀胱炎癥癥狀為特征。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途可以是治療女性的方法和用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它們是治療男性的方法和用途。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(I)的化合物 其中X是羥基或氟；Y是H2或CH2；Z1和Z2是H或者式(II)所示的取代基，條件是Z1和Z2是不同的(優(yōu)選地，Z1和Z2不均代表式(II)) 其中Z3代表上述式(I)；A是單鍵或雙鍵；R1、R2和Z4各自獨(dú)立地是氫、烷基或者式(III)所示的飽和或不飽和的碳鏈，條件是R1、R2和Z4至少有一個(gè)是式(III)所示的飽和或不飽和的碳鏈，并且條件是R1、R2和Z4不都是式(III)所示的飽和或不飽和的碳鏈
其中Z5代表上述式(II)；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；A3是單鍵或雙鍵；R3和R4各自獨(dú)立地是氫、烷基、鹵代烷基、羥基烷基；R5是H2或氧。R5也可以代表氫或者可以不存在。
因此，在以上的式(III)結(jié)構(gòu)(和下列相應(yīng)的結(jié)構(gòu))中，當(dāng)A2代表叁鍵時(shí)，R5不存在。當(dāng)A2代表雙鍵時(shí)，R5代表氫。當(dāng)A2代表單鍵時(shí)，R5代表羰基或兩個(gè)氫原子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(IV)的化合物 其中X1和X2是H2或CH2，其中X1和X2不同時(shí)是CH2；A是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；A3是單鍵或雙鍵；R1和R2是氫、C1-C4烷基或4-羥基-4-甲基戊基，其中R1和R2不都是氫；R5是H2或氧，R5也可以代表氫或者可以不存在；R3是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；R4是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(V)的化合物 其中X1和X2是H2或CH2，其中X1和X2不同時(shí)是CH2；A是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；A3是單鍵或雙鍵；R1和R2是氫、C1-C4烷基，其中R1和R2不都是氫；R5是H2或氧，R5也可以代表氫或者可以不存在；R3是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；R4是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基。
以上的式(V)結(jié)構(gòu)的實(shí)例是1，25-二羥基-16-烯-23-炔膽骨化醇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(VI)的“孿位(geminal)”化合物
其中X1是H2或CH2；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；R3是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；R4是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；C20的構(gòu)型是R或S。
由于在C20上存在兩個(gè)烷基鏈，這種類(lèi)型的化合物可以被稱(chēng)為“孿位”或“偕”維生素D3化合物。
式(VI)的孿位化合物的實(shí)例是1，25-二羥基-21-(3-羥基-3-甲基丁基)-19-降(nor)-膽骨化醇，下文稱(chēng)之為“化合物I” “化合物I”在WO98/49138和US6,030,962中描述了化合物I的合成，將它們?nèi)囊氡疚淖鳛閰⒖肌?br> 在另一個(gè)實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(VII)的化合物 其中A是單鍵或雙鍵；R1和R2各自獨(dú)立地是氫、烷基(例如甲基)；R3和R4各自獨(dú)立地是烷基；X是羥基或氟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(VIII)的化合物 其中R1和R2各自獨(dú)立地是氫或者烷基，例如甲基；R3是烷基，例如甲基；R4是烷基，例如甲基；且X是羥基或氟。
在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，維生素D化合物選自下組
在本發(fā)明的其它特定的實(shí)施方案中，維生素D化合物選自下組
在本發(fā)明的另外的特定的實(shí)施方案中，維生素D化合物選自下組的孿位化合物
在本發(fā)明的另外的特定的實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(IX)的化合物 其中
X1是H2或CH2；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；R1、R2、R3和R4各自獨(dú)立地是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；Z是-OH，Z也可以是＝O、-NH2或-SH；且C20的構(gòu)型是R或S，及其藥學(xué)上可接受的酯、鹽和前體藥物。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，X1是CH2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，A2是單鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R1、R2、R3和R4各自獨(dú)立地是甲基或乙基。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，Z是-OH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X1是CH2；A2是單鍵；R1、R2、R3和R4各自獨(dú)立地是甲基或乙基；且Z是-OH。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，R1、R2、R3和R4各自是甲基。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，維生素D化合物是下式的孿位化合物 上述化合物2和3的化學(xué)名稱(chēng)分別是1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20R-膽骨化醇和1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-膽骨化醇。
孿位化合物的另外的實(shí)施方案包括用于本發(fā)明的下列維生素D化合物
(1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-19-降-膽骨化醇)， (1，25-二羥基-20S-21-(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-19-降-膽骨化醇)， (1，25-二羥基-20S-21-(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-膽骨化醇)， (1，25-二羥基-21(3-羥基-3-三氟甲基-4-三氟-丁炔基)-26，27-六氘-19-降-20S-膽骨化醇)和 (1，25-二羥基-21(3-羥基-3-三氟甲基-4-三氟-丁炔基)-26，27-六氘-20S-膽骨化醇)。
在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(X)的化合物 其中X1和X1各自獨(dú)立地是H2或＝CH2，條件是X1和X1不都是＝CH2；R1和R2各自獨(dú)立地是羥基、OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基、OC(O)氟代烷基；R3和R4各自獨(dú)立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基；R5和R6各自獨(dú)立地是C1-C4烷基；及其藥學(xué)上可接受的酯、鹽和前體藥物。
適合地，R3和R4各自獨(dú)立地是氫、C1-C4烷基，或者R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基。
在一組化合物實(shí)例中，R5和R6各自獨(dú)立地是C1-C4烷基。
在另一組化合物實(shí)例中，R5和R6各自獨(dú)立地是鹵代烷基，例如C1-C4氟代烷基。
當(dāng)R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基時(shí)，實(shí)例是環(huán)丙基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，X1和X1各自是H2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R3是氫，R4是C1-C4烷基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R4是甲基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R5和R6各自獨(dú)立地是甲基、乙基、氟甲基或三氟甲基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R5和R6各自是甲基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R1和R1各自獨(dú)立地是羥基或OC(O)C1-C4烷基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1和R1各自是OC(O)C1-C4烷基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1和R1各自是乙酰氧基。
這類(lèi)化合物的一個(gè)實(shí)例是1，3-O-二乙?；?1，25-二羥基-16-烯-24-酮基-19-降-膽骨化醇，其具有下列結(jié)構(gòu) 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物是2-亞甲基-19-降-20(S)-1-α，25-羥基維生素D3
在WO02/05823和US5,536,713中描述了這種化合物和相關(guān)化合物的合成，將它們?nèi)囊氡疚淖鳛閰⒖肌?br> 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，維生素D化合物是式(XII)的化合物 其中A1是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；X1和X2各自獨(dú)立地是H或＝CH2，條件是X1和X2不都是＝CH2；R1和R2各自獨(dú)立地是OC(O)C1-C4烷基(例如OAc)、OC(O)羥基烷基、OROC(O)鹵代烷基；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基；R6和R7各自獨(dú)立地是C1-4烷基或鹵代烷基；R8是H、-COC1-C4烷基(例如Ac)、-CO羥基烷基或-CO鹵代烷基；
及其藥學(xué)上可接受的酯、鹽和前體藥物。
當(dāng)R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基時(shí)，實(shí)例是環(huán)丙基。
適合地，R6和R7各自獨(dú)立地是鹵代烷基。適合地，R8可以代表H或Ac。
在一個(gè)實(shí)施方案中，A1是單鍵，A2是單鍵，E或Z雙鍵或叁鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，A1是雙鍵，A2是單鍵，E或Z雙鍵或叁鍵。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，當(dāng)A2是叁鍵時(shí)，R5不存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，X1和X2各自是H。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X1是CH2，X2是H2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R3是氫，R4是C1-C4烷基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R4是甲基。
在另一組化合物實(shí)例中，R1和R2都代表Oac。
在一組化合物實(shí)例中，R6和R7各自獨(dú)立地是C1-4烷基。在另一組化合物實(shí)例中，R6和R7各自獨(dú)立地是鹵代烷基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R6和R7各自獨(dú)立地是甲基、乙基或氟代烷基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R6和R8各自是三氟烷基，例如三氟甲基。
適合地，R5代表氫。
因此，在某些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物如式(XII)所示 其中A1是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；
X1和X2各自獨(dú)立地是H或＝CH2，條件是X1和X2不都是＝CH2；R1和R2各自獨(dú)立地是OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基或OC(O)鹵代烷基；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基；R6和R7各自獨(dú)立地是鹵代烷基；R8是H、C(O)C1-C4烷基、C(O)羥基烷基或C(O)鹵代烷基；及其藥學(xué)上可接受的酯、鹽和前體藥物。
在本發(fā)明的背景中特別優(yōu)選的上述式(XII)化合物的一個(gè)實(shí)例是1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(“化合物A”) “化合物A”。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物是式(XIII)的化合物，其中R1和R2各自是OAc；A1是雙鍵；A2是叁鍵；R8是H或Ac 在上列式(XII)的某些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物是式(XIV)所示的化合物
上述式(XIV)化合物的其它實(shí)例包括1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-23-炔-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-膽骨化醇；1，3-二O-乙?；?1，25-二羥基-16，23E-二烯-膽骨化醇；1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16-烯-膽骨化醇；1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23E-二烯-25R-26-三氟-膽骨化醇；1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-19-降-膽骨化醇(“化合物C”)；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-雙高(homo)-19-降-膽骨化醇。
在上列式(XII)的某些其它實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物是式(XV)所示的化合物
上述式(XV)化合物的其它實(shí)例包括1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-19-降-膽骨化醇；1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(“化合物F”)；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇。
優(yōu)選的式XV化合物是1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(“化合物E”) 化合物E。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物是式(XVI)的化合物 其中X是H2或CH2；R1是氫、羥基或氟；R2是氫或甲基；R3是氫或甲基；當(dāng)R2或R3是甲基時(shí)，R3或R2必須是氫；R4是甲基、乙基或三氟甲基；R5是甲基、乙基或三氟甲基；A是單鍵或雙鍵；B是單鍵、E-雙鍵、Z-雙鍵或叁鍵。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R4和R5各自是甲基或乙基，例如1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇(在實(shí)施例中稱(chēng)為“化合物B”)，其具有下式 “化合物B”。
在US5,939,408和EP808833中描述了這類(lèi)化合物，將它們?nèi)囊氡疚淖鳛閰⒖?。本發(fā)明也涵蓋化合物B的酯和鹽的用途。酯包括可以在體內(nèi)水解從而釋放出化合物B的藥學(xué)上可接受的不穩(wěn)定酯?；衔顱的鹽包括可以與堿金屬和堿土金屬離子和金屬離子鹽例如鈉、鉀和鈣離子及其鹽例如氯化鈣、丙二酸鈣等形成的加合物和絡(luò)合物。然而，盡管化合物B可以以其藥學(xué)上可接受的鹽或酯的形式施用，但是優(yōu)選地采用化合物B本身，即，不采用其酯或鹽。
其它優(yōu)選的用于本發(fā)明的維生素D化合物包括具有式(XVII)的那些 其中B是單鍵、雙鍵或叁鍵；X1和X2各自獨(dú)立地是H2或CH2，條件是X1和X2不都是CH2；R4和R5各自獨(dú)立地是烷基或鹵代烷基。
式(XVII)的化合物包括以下化合物1，25-二羥基-16-烯-23-炔-20-環(huán)丙基-膽骨化醇 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇
1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇 1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇 1，25-二羥基-16，23E-二烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇
1，25-二羥基-16，23E-二烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氟-膽骨化醇 1，25-二羥基-16，23Z-二烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇 1，25-二羥基-16，23Z-二烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氟-膽骨化醇
1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇 1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(“化合物H”) 本發(fā)明的另一種維生素D化合物是1，25-二羥基-21(3-羥基-3-三氟甲基-4-三氟-丁炔基)-26，27-六氘-19-降-20S-膽骨化醇。
具有上文所給出的結(jié)構(gòu)的化合物的用途延及其藥學(xué)上可接受的酯、鹽和前體藥物。
特別值得關(guān)注的維生素D化合物是骨化三醇。
用于本發(fā)明的為維生素D受體激動(dòng)劑的其它化合物實(shí)例包括帕立骨化醇(ZEMPLARTM)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,587,497)、他卡西妥(BONALFATM)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,022,891)、度骨化醇(HECTOROLTM)(參見(jiàn)Lam等人.(1974)Science186，1038)、馬沙骨化醇(OXAROLTM)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,891,364)、鈣泊三醇(DAIVONEXTM)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,866,048)和氟骨三醇(FULSTANTM)。
其它化合物包括ecalcidene、calcithiazol和tisocalcitate。
其它化合物包括atocalcitol、來(lái)沙骨化醇和西奧骨化醇。
另一種可能相關(guān)的化合物是司骨化醇(“OSTEO D”)。
可以用于本發(fā)明的其它維生素D化合物的非限制性實(shí)例包括在下列已公布的國(guó)際申請(qǐng)中描述的那些WO01/40177，WO0010548，WO0061776，WO0064869，WO0064870，WO0066548，WO0104089，WO0116099，WO0130751，WO0140177，WO0151464，WO0156982，WO0162723，WO0174765，WO0174766，WO0179166，WO0190061，WO0192221，WO0196293，WO02066424，WO0212182，WO0214268，WO03004036，WO03027065，WO03055854，WO03088977，WO04037781，WO04067504，WO8000339，WO8500819，WO8505622，WO8602078，WO8604333，WO8700834，WO8910351，WO9009991，WO9009992，WO9010620，WO9100271，WO9100855，WO9109841，WO9112239，WO9112240，WO9115475，WO9203414，WO9309093，WO9319044，WO9401398，WO9407851，WO9407852，WO9408958，WO9410139，WO9414766，WO9502577，WO9503273，WO9512575，WO9527697，WO9616035，WO9616036，WO9622973，WO9711053，WO9720811，WO9737972，WO9746522，WO9818759，WO9824762，WO9828266，WO9841500，WO9841501，WO9849138，WO9851663，WO9851664，WO9851678，WO9903829，WO9912894，WO9915499，WO9918070，WO9943645，WO9952863，在下列美國(guó)專(zhuān)利中描述的那些US3856780，US3994878，US4021423，US4026882，US4028349，US4225525，US4613594，US4804502，US4898855，US5039671，US5087619，US5145846，US5247123，US5342833，US5428029，US5451574，US5612328，US5747479，US5804574，US5811414，US5856317，US5872113，US5888994，US5939408，US5962707，US5981780，US6017908，US6030962，US6040461，US6100294，US6121312，US6329538，US6331642，US6392071，US6452028，US6479538，US6492353，US6537981，US6544969，US6559138，US6667298，US6683219，US6696431，US6774251，和在下列已公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中描述的那些US2001007907，US2003083319，US2003125309，US2003130241，US2003171605，US2004167105。
應(yīng)當(dāng)注意的是，一些本發(fā)明的化合物的結(jié)構(gòu)包括不對(duì)稱(chēng)的碳原子。因此，不言而喻的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括從這類(lèi)不對(duì)稱(chēng)性產(chǎn)生的異構(gòu)體(例如所有對(duì)映體和非對(duì)映體)，另有說(shuō)明者除外。通過(guò)經(jīng)典的分離技術(shù)和/或通過(guò)立體化學(xué)控制的合成可以得到基本上純形式的這類(lèi)異構(gòu)體。
天然存在的或合成的異構(gòu)體可以用本領(lǐng)域已知的多種方式加以分離。分離兩種對(duì)映體的外消旋混合物的方法包括采用手性固定相的色譜法(例如參見(jiàn)″Chiral Liquid Chromatography，″W.J.Lough編輯.Chapman andHall，New York(1989))。也可以通過(guò)經(jīng)典的拆分技術(shù)分離對(duì)映體。例如，可以利用非對(duì)映體鹽的生成和分步結(jié)晶來(lái)分離對(duì)映體。對(duì)于羧酸對(duì)映體的分離，可以通過(guò)加入對(duì)映體純的手性堿例如番木鱉堿、奎寧、麻黃堿、馬錢(qián)子堿等生成非對(duì)映體鹽?；蛘?，可以與對(duì)映體純的手性醇例如薄荷醇生成非對(duì)映體酯，然后分離非對(duì)映體酯并水解，得到游離的對(duì)映體富集的羧酸。對(duì)于氨基化合物旋光異構(gòu)體的分離，加入手性羧酸或磺酸例如樟腦磺酸、酒石酸、扁桃酸或乳酸可以導(dǎo)致非對(duì)映體鹽的生成。
本發(fā)明也提供了藥物組合物，其包含有效量的本文所述的維生素D化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，有效量是有效治療間質(zhì)性膀胱炎的量，如前文所述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用藥學(xué)上可接受的制劑將維生素D化合物施用于受試者，例如在施用于受試者后將維生素D化合物持續(xù)遞送至受試者達(dá)至少12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、一周、兩周、三周或四周的藥學(xué)上可接受的制劑。
在某些實(shí)施方案中，這些藥物組合物適合于局部或口服施用于受試者。在其它實(shí)施方案中，正如下文所詳細(xì)描述的，本發(fā)明的藥物組合物可以被特殊配制成以固體或液體形式施用，包括適應(yīng)于以下施用途徑的那些(1)口服施用，例如頓服劑(drench)(水性或非水性的溶液或混懸液)、片劑、大丸劑(bolus)、散劑、顆粒劑、糊劑；(2)腸胃外施用，例如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，例如無(wú)菌的溶液或混懸液；(3)局部應(yīng)用，例如應(yīng)用于皮膚的乳膏劑、軟膏劑或噴霧劑；(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，例如陰道栓、乳膏劑或泡沫劑；或者(5)氣霧劑，例如水性氣霧劑、脂質(zhì)體制劑或含有化合物的固體顆粒。
措辭“藥學(xué)上可接受的”表示在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合于與人類(lèi)和動(dòng)物的組織接觸使用、沒(méi)有過(guò)度的毒性、刺激作用、變態(tài)反應(yīng)或者其它問(wèn)題或并發(fā)癥、與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)的那些本發(fā)明的維生素D化合物、含有這類(lèi)化合物的組合物和/或劑型。
措辭“藥學(xué)上可接受的載體”包括藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，它們參與將主題化學(xué)物質(zhì)從機(jī)體的一個(gè)器官或一個(gè)部分?jǐn)y帶或運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體的另一個(gè)器官或另一個(gè)部分。每種載體必須是“可接受的”，意義是與制劑其它成分相容并對(duì)患者無(wú)害。能夠用作藥學(xué)上可接受的載體的一些物質(zhì)的實(shí)例包括(1)糖類(lèi)，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉末狀西黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油類(lèi)，例如花生油、棉子油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯類(lèi)，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無(wú)熱原的水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)藥物制劑中采用的其它無(wú)毒的相容性物質(zhì)。
在組合物中也可以存在濕潤(rùn)劑、乳化劑和潤(rùn)滑劑，例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑與芳香劑、防腐劑和抗氧化劑。
藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
含有維生素D化合物的組合物包括適合于口服、鼻、局部(包括口腔和舌下)、直腸、陰道、氣霧劑和/或腸胃外施用的那些。組合物可以適宜地為單元?jiǎng)┬?，并且可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任意方法加以制備?？梢耘c載體物質(zhì)組合形成單一劑型的活性成分的量將因所治療的主體、特定的施用方式而異?？梢耘c載體物質(zhì)組合形成單一劑型的活性成分的量一般是該化合物產(chǎn)生治療效果的量。一般而言，以百分之一百計(jì)，該量將是約1％至約99％的活性成分，優(yōu)選約5％至約70％，最優(yōu)選約10％至約30％。
制備這些組合物的方法包括使維生素D化合物與載體和任選地一種或多種輔助成分聯(lián)合在一起的步驟。一般而言，制劑通過(guò)以下方法制備將維生素D化合物與液體載體或微細(xì)粉碎的固體載體或此二者均勻且緊密地聯(lián)合在一起，然后如果必要，使產(chǎn)物成形。
適合于口服施用的本發(fā)明的組合物可以是膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用矯味基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)、散劑、顆粒劑的形式，或者是在水性或非水性液體中的溶液或混懸液形式，或者是水包油型或油包水型乳劑的形式，或者是酏劑或糖漿劑的形式，或者是軟錠劑(pastille)(使用惰性基質(zhì)，例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口劑等形式，它們各自含有預(yù)定量的維生素D化合物作為活性成分?；衔镆部梢砸源笸鑴?、藥糖劑(electuary)或糊劑的形式施用。
在用于口服施用的本發(fā)明的固體劑型(膠囊劑、片劑、丸劑、糖衣丸、散劑、顆粒劑等)中，活性成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合，例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或任意下列成分(1)填充劑或增量劑(extender)，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶解阻滯劑(solution retardingagent)，例如石蠟；(6)吸收加速劑(absorption accelerator)，例如季銨化合物；(7)濕潤(rùn)劑，例如acetyl alcohol和甘油單硬脂酸酯；(8)吸收劑，例如高嶺土和膨潤(rùn)土；(9)潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和其混合物；和(10)著色劑。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩沖劑。也可以采用相似類(lèi)型的固體組合物作為軟與硬填充明膠膠囊劑中的填充劑，使用賦形劑例如乳糖或奶糖(milk sugars)，以及高分子聚乙二醇等。
片劑可以通過(guò)壓制或模制法制備，任選地含有一種或多種輔助成分。壓制片可以使用粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑加以制備。模制片可以通過(guò)在適合的機(jī)器中模制用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉末狀活性成分混合物來(lái)制備。
本發(fā)明的藥物組合物的片劑和其它固體劑型例如糖衣丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可以任選地具有刻痕或者具有包衣和外殼，例如腸溶衣和藥物制劑領(lǐng)域中眾所周知的其它包衣。也可以使用例如不同比例的羥丙基甲基纖維素(以提供所需的釋放性質(zhì))、其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球?qū)λ鼈冞M(jìn)行配制以提供其中活性成分的緩慢或控制釋放。它們可以被滅菌，方法是例如通過(guò)截留細(xì)菌的濾器進(jìn)行過(guò)濾，或者在使用前以無(wú)菌固體組合物的形式摻入可溶于無(wú)菌水或一些其它無(wú)菌可注射溶媒中的滅菌劑。這些組合物還可以任選地含有遮光劑，并且可以是任選地以延遲方式僅僅在胃腸道的某一部分或者優(yōu)先在胃腸道的某一部分釋放活性成分的組合物。可以使用的包埋組合物的實(shí)例包括聚合物質(zhì)和蠟類(lèi)?；钚猿煞忠部梢允俏⒛野獾男问?，如果適當(dāng)，還有一種或多種上述賦形劑。
維生素D化合物的用于口服施用的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳、溶液、混懸液、糖漿劑和酏劑。除了活性成分以外，液體劑型可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐基酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油類(lèi)(特別是棉子油、花生油、玉米油、胚油(germ oil)、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇(tetrahydrofuryl alcohol)、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。
除了惰性稀釋劑以外，口服組合物還可以包括輔劑，例如濕潤(rùn)劑、乳化和助懸劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。
除了具有活性的維生素D化合物以外，混懸液還可以含有助懸劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、膨潤(rùn)土、瓊脂和西黃蓍膠及其混合物。
用于直腸或陰道施用的本發(fā)明的藥物組合物可以是栓劑的形式，它可以通過(guò)將一種或多種維生素D化合物與一種或多種適合的無(wú)刺激性的賦形劑或載體(例如包含可可脂、聚乙二醇、栓劑用蠟或水楊酸鹽的賦形劑或載體混合)來(lái)制備，其在室溫下是固體，但是在體溫下是液體，因此將在直腸或陰道腔中融化，并釋放出活性成分。
適合于陰道施用的本發(fā)明的組合物也包括陰道栓、衛(wèi)生栓(tampon)、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑，它們含有本領(lǐng)域已知的適用的載體。
用于局部或透皮施用維生素D化合物的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液、貼劑和吸入劑?？梢詫⒒钚跃S生素D化合物在無(wú)菌條件下與藥學(xué)上可接受的載體和可能需要的任意防腐劑、緩沖劑或拋射劑混合。
除了本發(fā)明的維生素D化合物以外，軟膏劑、糊劑、乳膏劑和凝膠劑還可以含有賦形劑，例如動(dòng)物與植物脂肪、油類(lèi)、蠟類(lèi)、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤(rùn)土、硅酸、滑石粉和氧化鋅或其混合物。
除了維生素D化合物以外，散劑和噴霧劑還可以含有賦形劑，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或者這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可以另外含有常用的拋射劑，例如氯氟烴或，和揮發(fā)性的未取代的烴，例如丁烷和丙烷。
作為替代選擇，維生素D化合物可以通過(guò)氣霧劑施用。這是通過(guò)制備含有該化合物的水性氣霧劑、脂質(zhì)體制劑或固體顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)的。也可能使用非水性(例如碳氟化合物拋射劑)混懸液。聲波噴霧器是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兪顾幬锉┞队诩羟凶钚』?，而剪切能夠?qū)е禄衔锏慕到狻?br> 通常，水性氣霧劑是通過(guò)配制藥物與常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體和穩(wěn)定劑的水性溶液或混懸液來(lái)制備的。載體和穩(wěn)定劑因特定化合物的需要而異，但是通常包括非離子表面活性劑(吐溫(Tween)、普流羅尼(Pluronic)或聚乙二醇)、無(wú)害的蛋白質(zhì)如血清白蛋白、脫水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、緩沖劑、鹽、糖或糖醇。氣霧劑一般是由等滲溶液制備的。
透皮貼劑具有向機(jī)體提供維生素D化合物的控制遞送的附加優(yōu)點(diǎn)。這類(lèi)劑型可以通過(guò)將藥物溶解或分散在恰當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中來(lái)制備。也可以使用吸收促進(jìn)劑，以增加活性成分跨越皮膚的通量。通過(guò)提供速率控制膜或者將活性成分分散在聚合物基質(zhì)或凝膠中可以控制這類(lèi)通量的速率。
適合于腸胃外施用的本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種維生素D化合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的無(wú)菌等滲水性或非水性溶液、分散物、混懸液或乳液或者無(wú)菌粉末，所述粉末可以在使用前即刻被重構(gòu)為無(wú)菌可注射的溶液或分散物，它們可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)或者助懸劑或增稠劑。
在本發(fā)明的藥物組合物中可以采用的適合的水性與非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油例如橄欖油和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯。恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以通過(guò)利用包衣材料例如卵磷脂、在分散物的情況下通過(guò)維持所需的粒徑以及通過(guò)利用表面活性劑來(lái)維持。
這些組合物也可以含有輔劑，例如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑。通過(guò)包含各種抗細(xì)菌和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以確保防止微生物的作用。也可能需要在組合物中包括等滲劑(isotonic agent)例如糖、氯化鈉等。另外，通過(guò)包含延遲吸收的物質(zhì)例如單硬脂酸鋁和明膠可以實(shí)現(xiàn)可注射藥物形式的延遲吸收。
在一些情況下，為了延長(zhǎng)藥物的作用，需要延緩藥物從皮下或肌內(nèi)注射劑中的吸收。利用水溶性差的結(jié)晶性或無(wú)定形材料的液體混懸液可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。因此藥物的吸收速率依賴(lài)于它的溶解速率，后者則可以依賴(lài)于晶體大小和結(jié)晶形式?；蛘?，通過(guò)將藥物溶解或混懸在油性媒介物中實(shí)現(xiàn)腸胃外施用的藥物形式的延遲吸收。
可注射的貯庫(kù)形式是通過(guò)在生物可降解的聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成維生素D化合物的微囊基質(zhì)來(lái)制備的。根據(jù)藥物與聚合物的比例和所采用的特定聚合物的性質(zhì)，可以控制藥物釋放的速率。其它生物可降解的聚合物的實(shí)例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。貯庫(kù)型可注射制劑也通過(guò)將藥物包埋在與機(jī)體組織相容的脂質(zhì)體或微乳中來(lái)制備。
當(dāng)維生素D化合物作為藥物被施用于人和動(dòng)物時(shí)，它們可以以其本身或者作為藥物組合物被給予，所述組合物含有例如0.1至99.5％(更優(yōu)選0.5至90％)的活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體。
無(wú)論所選擇的施用途徑如何，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法將本發(fā)明的維生素D化合物(其可以使用適合的水合形式)和/或藥物組合物配制成藥學(xué)上可接受的劑型。
可以改變活性成分在本發(fā)明的藥物組合物中的實(shí)際劑量水平和施用時(shí)間，以獲得就特定患者、組合物和施用方式而言有效達(dá)到所需治療響應(yīng)、對(duì)患者沒(méi)有毒性的活性成分量。舉例性的劑量范圍是0.1至300μg/天。
本發(fā)明維生素D化合物的優(yōu)選劑量是患者能夠耐受并且不形成高血鈣的最大值。優(yōu)選地，以下列濃度施用本發(fā)明的維生素D化合物約0.001μg至約100μg/千克體重，約0.001-約10μg/kg或約0.001μg-約100μg/kg體重。剛才引用的數(shù)值范圍也旨在構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
維生素D化合物可以與第二種治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物在獨(dú)立的或組合的藥物制劑中分別、相繼或同時(shí)施用。
本發(fā)明化合物的合成大量本發(fā)明的化合物可以這樣制備，在細(xì)胞中溫育維生素D3類(lèi)似物，例如，在UMR106細(xì)胞或Ros17/2.8細(xì)胞中溫育維生素D3類(lèi)似物，導(dǎo)致本發(fā)明維生素D3化合物的生成。例如，在UMR106細(xì)胞中溫育1，25-二羥基-16-烯-5，6-反式-骨化三醇，導(dǎo)致生成1，25-二羥基-16-烯-24-氧代-5，6-反式-骨化三醇。
除了本文所述的方法以外，本發(fā)明的化合物可以利用多種合成方法加以制備。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠利用合成現(xiàn)有維生素D3化合物的方法來(lái)制備本發(fā)明的化合物(例如參見(jiàn)Bouillon，R.等人.，(1995)EndocrineReviews16(2)201-204；Ikekawa N.(1987)Med.Res.Rev.7333-366；DeLuca H.F.和Ostrem V.K.(1988)Prog.Clin.Biol.Res.25941-55；Ikekawa N.和Ishizuka S.(1992)CRC Press 8293-316；Calverley M.J.和Jones G.(1992)Academic Press193-270；Pardo R.和Santelli M.(1985)Bull.Soc.Chim.Fr98-114；Bythgoe B.(1980)Chem.Soc.Rev.449-475；Quinkert G.(1985)Synform 341-122；Quinkert G.(1986)Synform4131-256；Quinkert G.(1987)Synform 51-85；Mathieu C.等人.(1994)Diabetologia 37552-558；Dai H.和Posner G.H.(1994)Synthesis 1383-1398；DeLuca等人，WO97/11053)。
舉例性的合成方法包括7-脫氫膽固醇的1-羥基化側(cè)鏈修飾衍生物的光化學(xué)開(kāi)環(huán)，該方法首先生成前維生素，前維生素容易以眾所周知的方式熱解為維生素D3(Barton D.H.R.等人.(1973)J.Am.Chem.Soc.952748-2749；Barton D.H.R.(1974)JCS Chem.Comm.203-204)；(Lythgoe等人(1978)JCS Perkin Trans.1590-595)開(kāi)發(fā)的氧化膦偶聯(lián)法，其包括偶聯(lián)氧化膦與Grundmman酮衍生物，直接生成1-α，25(OH)2D3骨架，如Baggiolini E.G.，等人.(1986)J.Org.Chem.513098-3108；DeSchrijver J.和DeClercq P.J.(1993)Tetrahed Lett344369-4372；Posner G.H和KinterC.M.(1990)J.Org.Chem.553967-3969所述；二烯炔(dienzyne)經(jīng)半氫化作用生成前維生素結(jié)構(gòu)，前維生素結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，生成相應(yīng)的維生素D3類(lèi)似物，如Harrison R.G.等人.(1974)JCS Perkin Trans.12654-2657；Castedo L.等人.(1988)Tetrahed Lett291203-1206；Mascarenas J.S.(1991)Tetrahedron473485-3498；Barrack S.A.等人.(1988)J.Org.Chem.531790-1796)和Okamura W.H.等人.(1989)J.Org.Chem.544072-4083所述；乙烯基丙二烯法，該方法牽涉這樣的中間體，它們隨后利用加熱或者金屬催化異構(gòu)化、繼之以敏化光異構(gòu)化的組合進(jìn)行排列(Okamura W.H.等人.(1989)J.Org.Chem.544072-4083；Van Alstyne E.M.等人.(1994) J.Am.Chem.Soc.1166207-6210)；Trost等人.B.M.等人.J.Am.Chem.Soc.1149836-9845；Nagasawa K.等人.(1991)Tetrahed Lett 324937-4940所述的方法，該方法牽涉無(wú)環(huán)的A-環(huán)前體，它與溴代烯炔發(fā)生分子內(nèi)交叉偶聯(lián)，直接導(dǎo)致1，25(OH)2D3骨架的形成；甲苯磺酰化衍生物，其被異構(gòu)化為i-甾類(lèi)，i-甾類(lèi)能夠在碳-1被修飾，隨后在溶劑解條件下反異構(gòu)化，形成1-α，25(OH)2D2或其類(lèi)似物(Sheves M.和Mazur Y.(1974)J.Am.Chem.Soc.976249-6250；Paaren H.E.等人.(1980)J.Org.Chem.453253-3258；KabatM.等人.(1991)Tetrahed Lett 322343-2346；Wilson S.R.等人.(1991)Tetrahed Lett 322339-2342)；維生素D衍生物直接修飾為1-氧合5，6-反式維生素D，如Andrews D.R.等人.(1986)J.Org.Chem.511635-1637所述；經(jīng)由熱異構(gòu)化通過(guò)前維生素形式的中間作用可以用前維生素D3的Diels-Alders環(huán)加成法環(huán)恢復(fù)(cyclorevert)為1-α，25(OH)2D2(Vanmaele L.等人.(1985)Tetrahedron 41141-144)；最后一種方法需要通過(guò)使用適合的保護(hù)基團(tuán)例如過(guò)渡金屬衍生物或者通過(guò)其它化學(xué)轉(zhuǎn)化作用直接修飾1-α，25(OH)2D2或類(lèi)似物(Okarmura W.H.等人.(1992)J.Cell Biochem.4910-18)。用于合成維生素D2化合物的另外的方法例如如日本專(zhuān)利公報(bào)No.62750/73、26858/76、26859/76和71456/77；美國(guó)專(zhuān)利No.3,639,596、3,715,374、3,847,955和3,739,001中所述。
具有飽和側(cè)鏈的本發(fā)明的化合物的實(shí)例可以按照美國(guó)專(zhuān)利No.4,927,815所闡述和描述的一般過(guò)程加以制備。具有不飽和側(cè)鏈的本發(fā)明的化合物的實(shí)例可以按照美國(guó)專(zhuān)利No.4,847,012所闡述和描述的一般過(guò)程加以制備。其中R基團(tuán)一起代表環(huán)烷基的本發(fā)明的化合物的實(shí)例可以按照美國(guó)專(zhuān)利No.4,851,401所闡述和描述的一般過(guò)程加以制備。
在Kutner等人，The Journal of Organic Chemistry，1988，533450-3457中公開(kāi)了另一種制備1-α，25-二羥基麥角骨化醇的側(cè)鏈修飾類(lèi)似物的合成策略。另外，在美國(guó)專(zhuān)利No.4,717,721中公開(kāi)了24-高與26-高維生素D類(lèi)似物的制備。
手性分子的對(duì)映選擇性合成是本領(lǐng)域的已知技術(shù)。通過(guò)對(duì)映選擇性合成與純化技術(shù)的組合，可以合成很多手性分子的對(duì)映體富集制備物。例如，已經(jīng)報(bào)道了1-α，25(OH)2D3的A-環(huán)非對(duì)映體的對(duì)映選擇性合成的方法，如Muralidharan等人.(1993)J.Organic Chem.58(7)1895-1899和Norman等人.(1993)J.Biol.Chem.268(27)20022-30所述。本領(lǐng)域已知的各種化合物的其它對(duì)映體合成方法尤其包括環(huán)氧化物(例如參見(jiàn)Johnson，R.A.；Sharlpess，K.B.Catalytic Asymmetric Synthesis；Ojima，I.編輯VCHNewYork，1993；第4.1章.Jacobsen，E.N.Ibid.第4.2章)、二醇(例如Sharpless，J.Org.Chem.(1992)572768的方法)和醇(例如酮的還原，E.J.Corey等人.，J.Am.Chem.Soc.(1987)1095551)。其它可用于生成光學(xué)富集產(chǎn)物的反應(yīng)包括烯烴的氫化(例如M.Kitamura等人.，J.Org.Chem.(1988)53708)、Diels-Alder反應(yīng)(例如K.Narasaka等人.，J.Am.Chem.Soc.(1989)1115340)、羥醛反應(yīng)和烯醇化物的烷基化(例如參見(jiàn)D.A.Evans等人.，J.Am.Chem.Soc.(1981)1032127；D.A.Evans等人.，J.Am.Chem.Soc.(1982)1041737)、羰基加成(例如R.Noyori，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.(1991)3049)和內(nèi)消旋(meso)環(huán)氧化物的開(kāi)環(huán)(例如Martinez，L.E.；Leighton J.L.，Carsten，D.H.；Jacobsen，E.N.J.Am.Chem.Soc.(1995)1175897-5898)。利用酶產(chǎn)生光學(xué)富集產(chǎn)物也是本領(lǐng)域所眾所周知的(例如M.P.Scheider編輯″Enzymes as Catalysts in Organic Synthesis″，D.Reidel，Dordrecht(1986))。
手性合成能夠?qū)е赂吡Ⅲw異構(gòu)體純度的產(chǎn)物。然而，在一些情況下，產(chǎn)物的立體異構(gòu)體純度不是足夠高的。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以利用本文所述的分離方法進(jìn)一步提高通過(guò)手性合成所獲得的維生素D3-差向異構(gòu)體的立體異構(gòu)體純度。
式(XVIII)的化合物 其中X1和X1各自獨(dú)立地是H2或＝CH2，條件是X1和X1不都是＝CH2；R1和R2各自獨(dú)立地是羥基、OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基、OC(O)氟代烷基，條件是R1和R2不都是羥基；R3和R4各自獨(dú)立地是氫、C1-C4烷基，或者R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基；R5和R6各自獨(dú)立地是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；及其藥學(xué)上可接受的酯、鹽和前體藥物，可以通過(guò)本節(jié)和化學(xué)文獻(xiàn)中所述的方法加以合成。具體而言，本發(fā)明的式(XVIII)化合物可以如以下流程

圖1所示進(jìn)行制備。因此，式(XVIII)化合物是通過(guò)以下方法制備的用正丁基鋰作為堿，在四氫呋喃中偶聯(lián)式(XIX)化合物與式(XX)化合物，得到式(XXI)化合物。隨后除去保護(hù)性硅烷基(R1＝OSi(CH3)2t.Bu)，得到式(XVIII)的1，3-二羥基維生素D3化合物(R1＝OH，R2＝OH)。1和/或3位的?；抢帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法實(shí)現(xiàn)的。例如，式IV的1，3-二乙酰氧基化合物(R1＝R2＝OAc)的制備需要用乙酸酐和吡啶進(jìn)行另外的乙酰化，如流程圖2所示和下天所述。
關(guān)于流程圖1，式(XX)的化合物是已知化合物，是從已知的式(XXII)的環(huán)氧-酮開(kāi)始制備的。通過(guò)Wittig反應(yīng)將式(XXII)的化合物轉(zhuǎn)化為式(XXIII)的環(huán)氧-烯烴。用LiAlH4還原為化合物(XXIV)并保護(hù)羥基，得到化合物(XXV)。然后，在路易斯酸(CH3)2AlCl的存在下在四氫呋喃中使式(XXV)的烯與已知的羥基-綴合的酮(XXVI)(R5＝R6＝CH3)反應(yīng)，得到化合物(XXVII)，其具有目標(biāo)維生素D類(lèi)似物的C，D-環(huán)和完整側(cè)鏈。最后，除去硅烷基并氧化，得到關(guān)鍵中間體式(XX)的酮。
流程圖1 流程圖2顯示了化合物(XX)與硅烷基化的氧化膦在Wittig偶聯(lián)條件下的偶聯(lián)。除去硅烷基保護(hù)基團(tuán)，得到式(XVIII)的二醇，其中R1和R2都是羥基。
流程圖2 其中X1、X2、R3、R4、R5和R6如上文所定義。
流程圖3顯示了式(P)的維生素D3衍生物的乙?；饔?，生成式(Q)的乙酸酯。
流程圖3 1，25-二羥基-16-烯-24-酮基-19-降- 1，3-O-二乙?；?1，25-二羥基-16-膽骨化醇 烯-24-酮基-19-降-膽骨化醇(P) (Q)
下式的維生素D3化合物 其中A1是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；X1和X2各自獨(dú)立地是H或＝CH2；R1和R2各自獨(dú)立地是OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基或OROC(O)鹵代烷基；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基；R6和R7各自獨(dú)立地是鹵代烷基；R8是H或OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基或OROC(O)鹵代烷基；及其藥學(xué)上可接受的酯、鹽和前體藥物，可以類(lèi)似于1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(1)(以下實(shí)施例中的“化合物A”)的合成加以制備，其在標(biāo)準(zhǔn)的二醇的乙?；瘲l件下進(jìn)行，得到相應(yīng)的二乙酸酯
現(xiàn)在將參照以下的非限制性實(shí)施例描述本發(fā)明；關(guān)于附圖，其中圖1顯示了在用維生素D3類(lèi)似物“化合物A”處理的大鼠和對(duì)照(媒介物處理的)大鼠中記錄到的膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)之間的比較。
圖2顯示了維生素D3類(lèi)似物化合物A(A-E)與媒介物(miglyol)(F-L)對(duì)大鼠膀胱炎癥的組織學(xué)跡象的作用的比較。考慮了五種不同的參數(shù)止血(A，F(xiàn))、水腫(B，G)、浸潤(rùn)(C，H)、纖維化(D，I)、膀胱上皮損傷(E，L)。箭頭和棒條指示了媒介物處理的動(dòng)物與化合物A處理的大鼠中存在的炎癥跡象的比較。U＝膀胱上皮。
圖3顯示了總結(jié)每組4只大鼠的每種炎癥跡象的組織學(xué)分?jǐn)?shù)的直方圖?？紤]了不同的炎性參數(shù)止血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(主要是淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)、上皮糜爛、纖維化，如實(shí)施例2所述對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行評(píng)分。用組織學(xué)分?jǐn)?shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行繪圖。
圖4顯示了實(shí)施例5的受試者所發(fā)生的非排尿性(non-voiding)膀胱收縮的次數(shù)。顯示了每個(gè)處理組(媒介物對(duì)照、30μg/kg化合物B和75μg/kg化合物B)的平均收縮次數(shù)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5顯示了實(shí)施例5的受試者的膀胱容量。顯示了每個(gè)處理組(媒介物對(duì)照、30μg/kg化合物B和75μg/kg化合物B)的平均膀胱容量(ml)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖6顯示了實(shí)施例5的受試者的血清鈣水平。顯示了各處理組(媒介物對(duì)照、30μg/kg化合物B和75μg/kg化合物B)的每個(gè)受試者的血清中的鈣水平(mg/dL)，每個(gè)組中的平均水平周水平線(xiàn)表示。
圖7闡述了實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)時(shí)間表。
圖8顯示了在實(shí)施例6的受試者的血清中檢測(cè)到的IgE蛋白總量。顯示了每個(gè)組(攻擊前、媒介物處理的對(duì)照、75μg/kg化合物B處理的組)的平均IgE總量(μg/ml)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖9顯示了在實(shí)施例6的受試者的血清中檢測(cè)到的卵清蛋白特異性IgE蛋白的量。顯示了每個(gè)組(攻擊前、媒介物處理的對(duì)照、75μg/kg化合物B處理的組)的血清中的特異性IgE蛋白的平均量(OD450)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖10顯示了實(shí)施例6的受試者的血清MMCP1蛋白水平。顯示了每個(gè)組(攻擊前、媒介物處理的對(duì)照、75μg/kg化合物B處理的組)的血清MMCP1蛋白的平均水平(μg/ml)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。該數(shù)據(jù)被得自每個(gè)受試者的個(gè)體數(shù)值所覆蓋。
圖11顯示了實(shí)施例6的受試者的血清鈣水平。顯示了各處理組(媒介物對(duì)照和75μg/kg化合物B)中每個(gè)受試者的血清中的鈣水平(mg/dL)，每個(gè)組的平均水平用水平線(xiàn)表示。延伸的水平虛線(xiàn)表示鈣毒性開(kāi)始出現(xiàn)的水平。
圖12顯示了實(shí)施例6的受試者的體重變化。顯示了兩個(gè)處理組(媒介物對(duì)照和75μg/kg化合物B)在每天時(shí)間點(diǎn)的平均體重(g)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖13顯示了實(shí)施例6的受試者中炎性標(biāo)志基因IL-13、MCPT2和FcεR1α的mRNA表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示了鹽水攻擊(媒介物處理)的和卵清蛋白攻擊(媒介物、30μg/kg化合物B和75μg/kg化合物B處理)的每種標(biāo)志相對(duì)于管家基因的水平。
圖14顯示了實(shí)施例6的受試者中炎性標(biāo)志基因IL-13、MMCP4和FcεR1α的mRNA表達(dá)水平。圖形顯示了卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物或75μg/kg化合物B)的每種標(biāo)志相對(duì)于管家基因的水平。用來(lái)自受試者的各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)繪圖，水平線(xiàn)表示平均水平。
圖15顯示了對(duì)實(shí)施例6的受試者進(jìn)行組織學(xué)分析(肥大細(xì)胞浸潤(rùn)、水平、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴單核-漿細(xì)胞)的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個(gè)受試者的分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理組(媒介物或75μg/kg化合物B)的平均水平用水平線(xiàn)表示。
圖16顯示了媒介物和75μg/kg化合物B處理的動(dòng)物的代表性膀胱切片(×50放大率)。組織學(xué)損傷用箭頭表示。
圖17顯示了實(shí)施例7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總結(jié)。
圖18顯示了實(shí)施例7的受試者中炎性標(biāo)志基因FcεR1α的mRNA表達(dá)水平。圖形顯示了鹽水攻擊的、未處理的和卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物、化合物C至化合物I處理)的FcεR1α相對(duì)于管家基因的水平。用來(lái)自受試者的各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)繪圖，水平線(xiàn)表示平均水平。
圖19顯示了實(shí)施例7的受試者中炎性標(biāo)志基因IL-13的mRNA表達(dá)水平。圖形顯示了鹽水攻擊的、未處理的和卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物、化合物C至化合物I處理)的IL-13相對(duì)于管家基因的水平。用來(lái)自受試者的各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)繪圖，水平線(xiàn)表示平均水平。
圖20顯示了實(shí)施例7的受試者中炎性標(biāo)志基因MMCP4的mRNA表達(dá)水平。圖形顯示了鹽水攻擊的、未處理的和卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物、化合物C至化合物I處理)的MMCP4相對(duì)于管家基因的水平。用來(lái)自受試者的各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)繪圖，水平線(xiàn)表示平均水平。
圖21顯示了實(shí)施例7的受試者的血清MMCP1蛋白水平。圖形顯示了攻擊前、鹽水攻擊的、未處理的和卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物、化合物C至化合物I處理)的血清中的MMCP1蛋白水平(ng/ml)。用來(lái)自受試者的各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)繪圖，水平線(xiàn)表示平均水平。
圖22顯示了對(duì)實(shí)施例7的受試者進(jìn)行的肥大細(xì)胞浸潤(rùn)的組織學(xué)分析的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個(gè)受試者的分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理組(媒介物、化合物C、化合物E、化合物F、化合物H或化合物I)的平均水平用水平線(xiàn)表示。
圖23顯示了對(duì)實(shí)施例7的受試者進(jìn)行的嗜酸性粒細(xì)胞的組織學(xué)分析的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個(gè)受試者的分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理組(媒介物、化合物C、化合物E、化合物F、化合物H或化合物I)的平均水平用水平線(xiàn)表示。
圖24顯示了對(duì)實(shí)施例7的受試者進(jìn)行的LMPC的組織學(xué)分析的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個(gè)受試者的分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理組(媒介物、化合物C、化合物E、化合物F、化合物H或化合物I)的平均水平用水平線(xiàn)表示。
圖25顯示了對(duì)實(shí)施例7的受試者進(jìn)行的水腫的組織學(xué)分析的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個(gè)受試者的分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理組(媒介物、化合物C、化合物E或化合物F)的平均水平用水平線(xiàn)表示。
圖26顯示了實(shí)施例7的受試者的血清中的鈣濃度。顯示了各處理組(媒介物對(duì)照、化合物C至I)中每個(gè)受試者的血清鈣濃度(mg/dL)，每個(gè)組的平均水平用水平線(xiàn)表示。
合成實(shí)施例所有牽涉維生素D3類(lèi)似物的操作都是在琥珀色玻璃器皿中、在氮?dú)夥罩羞M(jìn)行的。在使用前即刻從鈉-二苯酮羰游基中蒸餾出四氫呋喃，將溶質(zhì)的溶液用硫酸鈉干燥。熔點(diǎn)是在Thomas-Hoover毛細(xì)管儀上測(cè)定的，未經(jīng)校正。旋光度是在25℃下測(cè)量的。1H NMR光譜是在400MHz下、在CDCl3中記錄的，另有說(shuō)明者除外。TLC是在硅膠板(Merck PF-254)上進(jìn)行的，在短波長(zhǎng)UV光下顯影或者向板噴以10％磷鉬酸的甲醇溶液，然后加熱。快速色譜是在40-65μm目的硅膠上進(jìn)行的。制備型HPLC是在5×50cm柱和15-30μm目的硅膠上進(jìn)行的，流速100ml/min。
合成實(shí)施例1-1，3-二-O-乙酰基-1，25-二-羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(1)(化合物A)的合成 原料1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇可以如Doran等人的美國(guó)專(zhuān)利5,428,029中所述來(lái)制備。將3mg 1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于0.8ml吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2ml乙酸酐，在該溫度下維持16h。然后將反應(yīng)混合物用1ml水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在5ml水與20ml乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用3×5ml水洗滌，用5ml飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3ml鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，經(jīng)過(guò)快速色譜處理，使用1∶6、1∶4和1∶2乙酸乙酯-己烷逐步梯度洗脫。用TLC監(jiān)測(cè)柱色譜(1∶4乙酸乙酯-己烷，噴以磷鉬酸使斑點(diǎn)顯影)，合并適當(dāng)?shù)募?jí)分，蒸發(fā)，將殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，然后再次蒸發(fā)，得到23.8mg標(biāo)題化合物(1)，為無(wú)色糖漿狀物；400MHz1H NMRδ0.66(3H，s)，0.90(1H，m)，1.06(3H，d，J＝7.2Hz)，1.51(1H，m)，1.72-1.82(3H，m)，1.9-2.1(3H，m)，1.99(3H，s)2.04(3H，s)，2.2-2.3(3 m)，2.44-2.64(6H，m)，2.78(1H，m)，3.01(1H，s)，5.10(2H，m).5.38(1H，m)，5.43(1H，d，J＝12Hz)，5.85(1H，d，J＝11.5Hz)，5.97(1H，dt，J＝12和7.3Hz)，6.25(1H，d，J＝11.5Hz).
合成實(shí)施例2-1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(2)和1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(3)的合成 原料1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇可以如Baggiolini等人的美國(guó)專(zhuān)利5,451,574和5,612,328中所述來(lái)制備。將314mg(0.619mmol)1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于1.5ml吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.4ml乙酸酐。將反應(yīng)混合物在室溫下保持7小時(shí)，然后在冰箱中保持23小時(shí)。然后用10ml水稀釋?zhuān)?0ml乙酸乙酯萃取。將有機(jī)萃取液用水和鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)。將殘余物在10×140mm柱上用快速色譜處理，以1∶6和1∶4乙酸乙酯-己烷作為流動(dòng)相，得到126mg 1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(2)和248mg 1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(3)。
合成實(shí)施例3-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-膽骨化醇(4)的合成
向10-mL圓底燒瓶裝入40mg 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-膽骨化醇。將該原料溶于1mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，然后加入0.3mL乙酸酐。將溶液攪拌30min，然后冷藏過(guò)夜，用水稀釋?zhuān)柚?0mL水和40mL乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。將有機(jī)層用4×20mL水和10mL通過(guò)硫酸鈉塞的鹽水洗滌，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶9乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×130mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶9乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1-5的流動(dòng)相，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分6-13的流動(dòng)相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分14-20的流動(dòng)相(18mL級(jí)分)。級(jí)分14-19含有主要的帶，Rf0.15(TLC 1∶4)。合并這些級(jí)分，蒸發(fā)，得到無(wú)色油狀物0.044g。將該物質(zhì)用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到無(wú)色粘性泡沫狀物，0.0414g標(biāo)題化合物(4)。
合成實(shí)施例4-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23E-二烯-膽骨化醇(5)的合成 將0.0468g 1，25-二羥基-16，23E-二烯-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，然后冷藏過(guò)夜，用10mL水稀釋?zhuān)瑫r(shí)仍然浸在冰浴中，攪拌10min，借助10mL水和40mL乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。將有機(jī)層用4×20mL水和10mL通過(guò)硫酸鈉塞的鹽水洗滌，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶9乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×130mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶9乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1-3的流動(dòng)相(20mL級(jí)分)，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分6-8的流動(dòng)相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分9-17的流動(dòng)相(18mL級(jí)分)。級(jí)分11-14含有主要的帶，Rf0.09(TLC 1∶4)。合并這些級(jí)分，蒸發(fā)，得到無(wú)色油狀物0.0153g。將該物質(zhì)用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.014g標(biāo)題化合物(5)。
合成實(shí)施例6-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-膽骨化醇(6)的合成 將0.0774g 1，25-二羥基-16-烯-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，然后加入0.3mL乙酸酐。將溶液攪拌，冷藏過(guò)夜，然后用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?h，用30mL乙酸乙酯和15mL水稀釋。將有機(jī)層用4×15mL水洗滌，用5mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶9乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×130mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶9乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1的流動(dòng)相(20mL級(jí)分)，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分2-7的流動(dòng)相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分8-13的流動(dòng)相。級(jí)分9-11含有主要的帶，Rf 0.09(TLC 1∶4乙酸乙酯-己烷)。合并這些級(jí)分，蒸發(fā)，得到無(wú)色油狀物0.0354g。將該物質(zhì)用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)溶液，得到0.027g無(wú)色薄膜狀物，即標(biāo)題化合物(6)。合成實(shí)施例7-1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(7)和1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(8)的合成
將0.0291g 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，然后加入0.25mL乙酸酐。將溶液攪拌20min，在冰箱中保存過(guò)夜。將冷溶液用15mL水稀釋?zhuān)瑪嚢?0min，用30mL乙酸乙酯稀釋。將有機(jī)層用4×15mL水洗滌，用5mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×110mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為流動(dòng)相。由級(jí)分2-3得到72.3461-72-3285＝0.0176g。蒸發(fā)級(jí)分6-7，得到0.0055g。將級(jí)分2-3的殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.0107g標(biāo)題三乙酸酯(7)。將級(jí)分6-7的殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.0049g二乙酸酯(8)。
合成實(shí)施例8-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23E-二烯-25R，26-三氟-膽骨化醇(9)的合成 將1.5mL 1，25-二羥基-16，23E-二烯-25R，26-三氟-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.4mL乙酸酐。然后將混合物冷藏。2天后，將混合物用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，然后在10mL水與30mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用4×15mL水洗滌，用5mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×130mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為流動(dòng)相。級(jí)分4-6(TLC，1∶4)含有主要的帶(參見(jiàn)TLC)。蒸發(fā)這些級(jí)分，得到0.0726g。將該殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.0649g無(wú)色泡沫狀物，即標(biāo)題化合物(9)。
合成實(shí)施例8-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-19-降-膽骨化醇(10)(“化合物C”)的合成 將0.0535g 1，25-二羥基-16-烯-19-降-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.3mL乙酸酐，將混合物冷藏過(guò)夜。將溶液用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，然后在10mL水與30mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用4×15mL水洗滌，用5mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將幾乎無(wú)色的油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1-6的流動(dòng)相，然后使用1∶4乙酸乙酯-己烷。合并級(jí)分9-19(TLC，1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf0.09，見(jiàn)下)，蒸發(fā)，得到0.0306g，將其用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，然后蒸發(fā)。得到0.0376g標(biāo)題化合物(10)。
合成實(shí)施例9-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-19-降-膽骨化醇(11)的合成
將50mg 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將混合物冷藏3天，然后用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用4×5mL水洗滌，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將幾乎無(wú)色的油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在15×120mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1-6的流動(dòng)相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分9-12的流動(dòng)相，用1∶3乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分13-15的流動(dòng)相，用1∶2乙酸乙酯-己烷作為其余級(jí)分的流動(dòng)相。合并級(jí)分11-16(TLC，1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf0.09，見(jiàn)下)，蒸發(fā)76.1487-76.1260＝0.0227g，用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，然后蒸發(fā)。得到0.0186g標(biāo)題化合物(11)。合成實(shí)施例10-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-雙高-19-降-膽骨化醇(12)的合成 將0.0726g 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-雙高-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將溶液在冰浴中攪拌，然后冷藏過(guò)夜。然后將溶液用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在10mL水與25mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用3×10mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥和蒸發(fā)，33.5512-33.4654＝0.0858g褐色油性殘余物，將其在15×120mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6作為流動(dòng)相。合并級(jí)分7-11(各20mL)(TLC 1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf0.14)，蒸發(fā)，67.2834-67.2654＝0.018g。將該殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)。得到0.0211g標(biāo)題化合物(12)。
合成實(shí)施例11-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-19-降-膽骨化醇(13)的合成 將0.282g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐，將混合物冷藏過(guò)夜，然后用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在15×110mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1-4的流動(dòng)相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分5-12的流動(dòng)相，用1∶3乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分13-15的流動(dòng)相，用作為其余級(jí)分的流動(dòng)相。合并級(jí)分7-12(TLC，1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf 0.13)，蒸發(fā)，將殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，然后蒸發(fā)，得到0.023g標(biāo)題化合物(13)。
合成實(shí)施例12-1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(14)和1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(15)的合成 將0.1503g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將混合物冷藏過(guò)夜，然后用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在15×150mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1-5的流動(dòng)相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為其余級(jí)分的流動(dòng)相。合并級(jí)分3-4和6-7，蒸發(fā)，然后用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.0476g標(biāo)題三乙酸酯(14)和0.04670g標(biāo)題二乙酸酯(15)。
合成實(shí)施例13-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-膽骨化醇(16)的合成 將0.0369g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐，將混合物冷藏過(guò)夜，然后用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在13×110mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1-7的流動(dòng)相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為其余級(jí)分的流動(dòng)相。合并級(jí)分9-11(TLC，1∶4乙酸乙酯-己烷)，蒸發(fā)，用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，然后蒸發(fā)，得到0.0099g標(biāo)題化合物(16)。
合成實(shí)施例14-1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(17)(化合物E)的合成
將0.0328g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將溶液冷藏過(guò)夜。然后將溶液用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配(萃取水層沒(méi)有得到磷鉬酸可檢測(cè)的產(chǎn)物)。將有機(jī)層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)，殘余物顯示Rf0.25，為唯一的斑點(diǎn)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在13.5×110mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級(jí)分1-10的流動(dòng)相。合并級(jí)分4-9，蒸發(fā)，將殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，然后蒸發(fā)，得到0.0316g標(biāo)題化合物(17)。
合成實(shí)施例15-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(18)的合成 將0.0429g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將溶液冷藏過(guò)夜。然后將溶液用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在7mL水與25mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)顯示幾乎一個(gè)斑點(diǎn)，蒸發(fā)，在15×120mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6作為流動(dòng)相。合并級(jí)分3-6(各20mL)，蒸發(fā)。將殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.0411g標(biāo)題化合物(18)。
合成實(shí)施例16-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(19)(化合物F)的合成 將0.0797g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將溶液冷藏過(guò)夜。然后將溶液用1mL水稀釋?zhuān)诒≈袛嚢?0min，在10mL水與25mL乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用3×10mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥，蒸發(fā)，得到0.1061g褐色油性殘余物，將其在15×120mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6作為流動(dòng)相。合并級(jí)分9-16(各20mL)(TLC1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf 0.13)，蒸發(fā)。將該殘余物用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.0581g標(biāo)題化合物(19)。
合成實(shí)施例17-1，3-二-O-乙?；?1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇(20)的合成 在0℃下，向1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇(94mg，0.23mmol)在吡啶(3mL)中的溶液中加入乙酸酐(0.5mL，5.3mmol)。將混合物攪拌1h，冷藏15h，然后攪拌另外8h。加入水(10mL)，攪拌15min后，將反應(yīng)混合物用AcOEt∶己烷1∶1(25mL)萃取，用水(4×25mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(120mg)經(jīng)FC純化(15g，30％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(20)(91mg，0.18mmol，80％)。[α]30D＝+14.4c0.34，EtOH；UVλmax(EtOH)242nm(ε34349)，250nm(ε40458)，260nm(ε27545)；1H NMR(CDCl3)6.25(1H，d，J＝11.1Hz)，5.83(1H，d，J＝11.3Hz)，5.35(1H，m)，5.09(2H，m)，2.82-1.98(7H，m)，2.03(3H，s)，1.98(3H，s)，2.00-1.12(15H，m)，1.18(6H，s)，0.77(3H，s)，0.80-0.36(4H，m)；13C NMR(CDCl3)170.73(0)，170.65(0)，157.27(0)，142.55(0)，130.01(0)，125.06(1)，123.84(1)，115.71(1)，71.32(0)，70.24(1)，69.99(1)，59.68(1)，50.40(0)，44.08(2)，41.40(2)，38.37(2)，35.96(2)，35.80(2)，32.93(2)，29.48(3)，29.31(2)，28.71(2)，23.71(2)，22.50(2)，21.56(3)，21.51(0)，21.44(3)，18.01(3)，12.93(2)，10.53(2)；C31H46O5的MS HRES計(jì)算值M+Na521.3237，觀測(cè)值M+Na521.3233合成實(shí)施例18-1，3-二-O-乙?；?1-α，25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(21)的合成 在0℃下，向1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(100mg，0.23mmol)在吡啶(3mL)中的溶液中加入乙酸酐(0.5mL，5.3mmol)。將混合物攪拌2h，然后冷藏另外15h。加入水(10mL)，攪拌15min后，將反應(yīng)混合物用AcOEt∶己烷1∶1(25mL)萃取，用水(4×25mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(150mg)經(jīng)FC純化(15g，30％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(21)(92mg，0.18mmol，78％)。[α]30D＝-14.9c0.37，EtOH；UVλmax(EtOH)208nm(ε15949)，265nm(ε15745)；1HNMR(CDCl3)6.34(1H，d，J＝11.3Hz)，5.99(1H，d，J＝11.3Hz)，，5.47(1H，m)，5.33(1H，m)，5.31(1H，s)，5.18(1H，m)，5.04(1H，s)，2.78(1H，m)，2.64(1H，m)，2.40-1.10(18H，m)，2.05(3H，s)，2.01(3H，s)，1.18(6H，s)，0.76(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；13C NMR(CDCl3)170.76(0)，170.22(0)，157.18(0)，143.02(0)，142.40(0)，131.94(0)，125.31(1)，125.10(1)，117.40(1)，115.22(2)，72.97(1)，71.32(0)，69.65(1)，59.71(1)，50.57(0)，44.07(2)，41.73(2)，38.36(2)，37.10(2)，35.80(2)，29.45(3)，29.35(2)，29.25(3)，28.92(2)，23.80(2)，22.48(2)，21.55(3)，21.50(3)，21.35(0)，17.90(3)，12.92(2)，10.54(2)；C32H46O5的MSHRES計(jì)算值M+Na533.3237，觀測(cè)值M+Na533.3236合成實(shí)施例19-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-23-炔-膽骨化醇(22)的合成 將0.2007g(0.486mmol)溶于2mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，加入0.6mL乙酸酐。將溶液在冰浴中保持45h，然后用10mL水稀釋?zhuān)瑪嚢?0min，用10mL水和40mL乙酸乙酯平衡。將有機(jī)層用4×20mL水和10mL鹽水洗滌，干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將棕色的油性殘余物經(jīng)快速色譜處理，用1∶19、1∶9和1∶4乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。蒸發(fā)Rf 0.16(TLC1∶4乙酸乙酯-己烷)的主要的帶，得到1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-23-炔-膽骨化醇(22)，為無(wú)色泡沫狀物，0.0939g。
合成實(shí)施例20-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成
在-78℃下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-1-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]}-環(huán)丙基}-乙炔基(1.0g，2.90mmol)在四氫呋喃(15mL)中的溶液中加入n-BuLi(2.72mL，4.35mmol，1.6M己烷溶液)。在-78℃下攪拌1h后，加入丙酮(2.5mL，34.6mmol)，繼續(xù)攪拌2.5h。加入NH4Claq(15mL)，將混合物在室溫下攪拌15min，然后用AcOEt萃取(2×50mL)。合并萃取液，用鹽水(50mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(2.4g)經(jīng)FC純化(50g，10％EtOAc的己烷溶液)，得到(3aR，4S，7aR)-5-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]-環(huán)丙基}-2-甲基-戊-3-炔-2-醇(1.05g，2.61mmol)，用四丁基氟化銨(6mL，6mmol，1.0M THF溶液)處理，在65-75℃下攪拌48h。將混合物用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×25mL)和鹽水(25mL)洗滌。合并水洗液，用EtOAc(25mL)萃取，合并有機(jī)萃取液，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(1.1g)經(jīng)FC純化(50g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(0.75g，2.59mmol，90％)。[α]30D＝+2.7 c 0.75，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.50(1H，m)，4.18(1H，m)，2.40(2H，s)，2.35-1.16(11H，m)，1.48(6H，s)，1.20(3H，s)，0.76-0.50(4H，m)；13C NMR (CDCl3)156.39，125.26，86.39，80.19，69.21，65.16，55.14，46.94，35.79，33.60，31.67，29.91，27.22，19.32，19.19，17.73，10.94，10.37；C22H28O2的MS HREI計(jì)算值M+288.2089，觀測(cè)值M+288.2091。
合成實(shí)施例21-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成
將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(-4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(0.72g，2.50mmol)、乙酸乙酯(10mL)、己烷(24mL)、無(wú)水乙醇(0.9mL)、喹啉(47μL)與Lindlar催化劑(156mg，5％Pd/CaCO3)的混合物在室溫下氫化2h。將反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，濾墊用AcOEt洗滌。合并濾液和洗液，用1M HCl、NaHCO3和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥后，蒸發(fā)溶劑，將殘余物(0.79g)經(jīng)FC純化(45g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(640mg，2.2mmol，88％)。
合成實(shí)施例22-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成 利用Paar儀器，將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(100mg，0.34mmol)、1，4-雙(二苯基-膦基)丁烷1，5環(huán)辛二烯四氟硼酸銠(25mg，0.034mmol)、二氯甲烷(5mL)與一滴汞的混合物在室溫和50p.s.i.壓力下氫化3h。將反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，然后用乙酸乙酯洗滌。合并濾液和洗液，蒸發(fā)至干(110mg)，經(jīng)FC純化(10g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(75mg，0.26mmol，75％)。[α]30D＝-8.5 c 0.65，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.37(1H，m，)，4.14(1H，m)，2.37-1.16(17H，m)，1.19(6H，s)，1.18(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；C19H32O2的MS HREI計(jì)算值M+H292.2402，觀測(cè)值M+H292.2404。
合成實(shí)施例23-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成 在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(440mg，1.50mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.13g，3.0mmol)。將所得混合物攪拌5h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(426mg，1.47mmol，98％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(424mg，1.47mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(0.44mL，3.0mmol)。將所得混合物攪拌1.0h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物(460mg，1.27mmol，86％)。[α]29D＝-9.9 c 0.55，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.33(1H，dd，J＝3.2，1.5Hz)，2.81(1H，dd，J＝10.7，6.2Hz)，2.44(1H，ddd，J＝15.6，10.7，1.5Hz)，2.30-1.15(13H，m)重疊2.03(ddd，J＝15.8，6.4，3.2Hz)，1.18(6H，s)，0.92(3H，s)，0.66-0.28(4H，m)，0.08(9H，s)；13C NMR(CDCl3)211.08(0)，155.32(0)，124.77(1)，73.98(0)，64.32(1)，53.91(0)，44.70(2)，40.45(2)，38.12(2)，34.70(2)，29.86(3)，29.80(3)，26.80(2)，24.07(2)，22.28(2)，21.24(0)，18.35(3)，12.60(2)，10.64(2)，2.63(3)；C22H38O2Si的MS HRES計(jì)算值M+362.2641，觀測(cè)值M+362.2648。
合成實(shí)施例24-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成
在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(381mg，1.32mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.0g，2.65mmol)。將所得混合物攪拌1.5h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(360mg，1.26mmol，95％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(360mg，1.26mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(0.25mL，1.7mmol)。將所得混合物攪拌0.5h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，用5％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物(382mg，1.07mmol，81％)。
合成實(shí)施例25-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-膽骨化醇(23)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基(phosphinoyl))-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(513mg，0.88mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.55mL，0.88mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(179mg，0.50mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(25mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(716mg)經(jīng)FC純化(15g，5％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-膽骨化醇(324mg，0.45mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-膽骨化醇(322mg，0.45mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌18h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(280mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(23)(172mg，0.41mmol，82％)。[α]31D＝+32.4c0.50，MeOH.UVλmax(EtOH)261nm(ε11930)；1H NMR(CDCl3)6.36(1H，d，J＝11.3Hz)，6.09(1H，d，J＝11.3Hz)，5.45(1H，m)，5.33(1H，m)，5.01(1H，s)，4.45(1H，m)，4.22(1H，m)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.50-1.10(16H，m)，1.45(6H，s)，0.81(3H，s)，0.72-0.50(4H，m)；C28H38O3的MS HRES計(jì)算值M+422.2821，觀測(cè)值M+422.2854。
合成實(shí)施例26-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-19-降-膽骨化醇(24)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(674mg，1.18mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.74mL，1.18mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(235mg，0.66mmol)在四氫呋喃(3mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(25mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(850mg)經(jīng)FC純化(15g，5％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-19-降-膽骨化醇(330mg，0.46mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-19-降-膽骨化醇(328mg，0.46mmol)中加入四丁基氟化銨(5mL，5mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌62h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(410mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(24)(183mg，0.45mmol，68％)。[[α]29D＝+72.1 c0.58，MeOH.UVλmax(EtOH)242nm(ε29286)，251nm(ε34518)，260nm(ε23875)；1H NMR(CDCl3)6.30(1H，d，J＝11.3Hz)，5.94(1H，d，J＝11.3Hz)，5.48(1H，m)，4.14(1H，m)，4.07(1H，m)，2.78(2H，m)，2.52-1.10(18H，m)，1.49(6H，s)，0.81(3H，s)，0.72-0.50(4H，m)；C27H38O3的MS HRES計(jì)算值M+410.2821，觀測(cè)值M+410.2823。
合成實(shí)施例27-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成 在-78℃下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-1-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]}-環(huán)丙基}-乙炔基(1.95g，5.66mmol)在四氫呋喃(35mL)中的溶液中加入n-BuLi(4.3mL，6.88mmol，1.6M己烷溶液)。在-78℃下攪拌1h后，加入六氟丙酮(六滴，來(lái)自冷卻管)，繼續(xù)攪拌1h。加入NH4Claq(10mL)，使混合物升溫至室溫。將反應(yīng)混合物用鹽水(100mL)稀釋?zhuān)眉和檩腿?2×125mL)。合并萃取液，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(8.2g)經(jīng)FC純化(150g，10％EtOAc的己烷溶液)，得到(3aR，4S，7aR)-5-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]-環(huán)丙基}-1，1，1-三氟-2-三氟甲基-戊-3-炔-2-醇(2.73g，5.35mmol)，用四丁基氟化銨(20mL，20mmol，1.0M THF溶液)處理，在65-75℃下攪拌30h。將混合物用AcOEt(150mL)稀釋?zhuān)盟?5×150mL)和鹽水(150mL)洗滌。合并水性洗液，用AcOEt(150mL)萃取，合并有機(jī)萃取液，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(3.2g)經(jīng)FC純化(150g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(2.05g，5.17mmol，97％)。[α]28D＝+6.0 c 0.47，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.50(1H，br.s)，4.16(1H，br.s)，3.91(1H，s)，2.48(1H，AB四重蜂的A部分，J＝17.5Hz)，2.43(1H，AB四重蜂的B部分，J＝17.5Hz)，2.27(1H，m)，2.00-1.40(9H，m)，1.18(3H，s)，0.8-0.5(4H，m)；13C NMR(CDCl3)155.26(0)，126.68(1)，121.32(0，q，J＝284Hz)，90.24(0)，71.44(0，七重峰J＝34Hz)，70.54(0)，69.57(1)，55.17(1)，47.17(0)，36.05(2)，33.63(2)，30.10(2)，27.94(2)，19.50(3)，19.27(0)，17.90(2)，11.56(2)，11.21(2)；C19H22O2F6的MS HREI計(jì)算值M+396.1524，觀測(cè)值M+396.1513。
合成實(shí)施例28-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-羥基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成 在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(504mg，1.27mmol)與硅藻土(1.5g)在二氯甲烷(12mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(0.98g，2.6mmol)。將所得混合物攪拌2.5h，通過(guò)硅膠(5g)過(guò)濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物(424mg，1.08mmol，85％)。[α]28D＝+3.1 c 0.55，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.46(1H，br.s)，3.537(1H，s)，2.81(1H，dd，J＝10.7，6.5Hz)，2.49-1.76(10H，m)，0.90(3H，s)，0.77-0.53(4H，m)；C19H20O2F6的MS HREI計(jì)算值M+H395.1440，觀測(cè)值M+H395.1443。
合成實(shí)施例29-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(25)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(900mg，1.58mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(1.0mL，1.6mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-羥基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(200mg，0.51mmol)在四氫呋喃(3mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(25mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(850mg)經(jīng)FC純化(20g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(327mg，0.44mmol，86％)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(327mg，0.44mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌24h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(250mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(25)(183mg，0.45mmol，68％)。[α]30D＝+73.3 c 0.51，EtOH.UVλmax(EtOH)243nm(ε29384)，251nm(ε34973)，260nm(ε23924)；1H NMR(CDCl3)6.29(1H，d，J＝11.1Hz)，5.93(1H，d，J＝11.1Hz)，5.50(1H，m)，4.12(1H，m)，4.05(1H，m)，2.76(2H，m)，2.55-1.52(18H，m)，0.80(3H，s)，0.80-0.49(4H，m)；13C NMR(CDCl3)155.24(0)，141.78(0)，131.28(0)，126.23(1)，123.65(1)，121.09(0，q，J＝285Hz)，115.67(1)，89.63(0)，70.42(0)，67.48(1)，67.29(1)，59.19(1)，49.87(0)，44.49(2)，41.98(2)，37.14(2)，35.76(2)，29.22(2)，28.47(2)，27.57(2)，23.46(2)，19.32(0)，17.97(3)，11.89(2)，10.18(2)；C27H32O3F6的MS HRES計(jì)算值M+H519.2329，觀測(cè)值M+H 519.2325。
合成實(shí)施例30-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(26)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(921mg，1.58mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(1.0mL，1.6mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-羥基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(197mg，0.50mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(25mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(876mg)經(jīng)FC純化(20g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(356mg，0.47mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(356mg，0.47mmol)中加入四丁基氟化銨(5mL，5mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(270mg)經(jīng)FC純化(20g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(26)(216mg，0.41mmol，87％)。[α]30D＝+40.0 c 0.53，EtOH.UVλmax(EtOH)262nm(ε12919)；1H NMR(CDCl3)6.38(1H，d，J＝11.5Hz)，6.10(1H，d，J＝11.1Hz)，5.49(1H，m)，5.35(1H，s)，5.02(1H，s)，4.45(1H，m)，4.25(1H，m)，3.57(1H，s)，2.83-1.45(18H，m)，0.82(3H，s)，0.80-0.51(4H，m)；C28H32O3F6的MS HRES計(jì)算值M+H531.2329，觀測(cè)值M+H531.2337。
合成實(shí)施例31-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成 在5℃下，向氫化鋁鋰(4.5mL，4.5mmol，1.0M THF溶液)中首先加入固體甲醇鈉(245mg，4.6mmol)，然后滴加(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(360mg，0.91mmol)在四氫呋喃(5mL)中的溶液。加入完成后，將混合物在回流下攪拌2.5h。然后在冰浴中冷卻，用水(2.0mL)和氫氧化鈉(2.0mL，2.0M水溶液)淬滅；用乙醚(50mL)稀釋?zhuān)瑪嚢?0min，然后加入MgSO4(5g)，繼續(xù)攪拌30min。蒸發(fā)濾液后，將殘余物(0.42g)經(jīng)FC純化(20g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(315mg，0.79mmol，87％)。[α]28D＝+2.0 c 0.41，CHCl3.1H NMR(CDCl3)6.24(1H，dt，J＝15.7，6.7Hz)，5.60(1H，d，J＝15.7Hz)，5.38(1H，br.s)，4.13(1H，br.s)，3.27(1H，s)，2.32-1.34(12H，m)，1.15(3H，s)，0.80-0.45(4H，m)；13C NMR(CDCl3)155.89(0)，138.10(1)，126.21(1)，122.50(0，q，J＝287Hz)，119.15(1)，76.09(0，sep.J＝31Hz)，69.57(1)，55.33(1)，47.30(0)，40.31(2)，36.05(2)，33.71(2)，30.10(2)，20.36(0)，19.46(3)，17.94(2)，11.96(2)，11.46(2)；C19H24O2F6的MS REI計(jì)算值M+398.1680，觀測(cè)值M+398.1675。
合成實(shí)施例32-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成 在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟4-羥基-4-三氟甲基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(600mg，1.51mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.13g，3.0mmol)。將所得混合物攪拌3.5h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，然后用25％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(550mg，1.39mmol，92％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(550mg，1.39mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(1.76mL，12.0mmol)。將所得混合物攪拌1.0h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物(623mg，1.33mmol，88％)。[α]28D＝-1.6 c 0.51，CHCl3.1H NMR(CDCl3)6.14(1H，dt，J＝15.5，6.7Hz)，5.55(1H，d，J＝15.5Hz)，5.35(1H，m)，2.80(1H，dd，J＝10.7，6.4Hz)，2.47-1.74(10H，m)，0.90(3H，s)，0.76-0.40(4H，m)，0.2(9H，s)；13C NMR(CDCl3)210.99(0)，154.28(0)，137.41(1)，126.26(1)，122.59(0，q，J＝289Hz)，120.89(1)，64.31(1)，53.96(0)，40.60(2)，40.13(2)，35.00(2)，27.03(2)，24.21(2)，20.57(0)，18.53(3)，12.41(2)，10.79(2)，1.65(3)；C22H30O2F6Si的MS HRES計(jì)算值M+H469.1992，觀測(cè)值M+H469.1995。
合成實(shí)施例33-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(27)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(514mg，0.90mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.57mL，0.91mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(200mg，0.43mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(35mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(750mg)經(jīng)FC純化(15g，5％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇的混合物(250mg)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇的混合物(250mg)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌24h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(270mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(27)(157mg，0.30mmol，70％)。[α]30D＝+63.3 c 0.45，EtOH.UVλmax(EtOH)243nm(ε30821)，251nm(ε36064)，260nm(ε24678)；1H NMR(CDCl3)6.29(1H，d，J＝11.3Hz)，6.24(1H，dt，J＝15.9，6.4Hz)，5.92(1H，d，J＝11.1Hz)，5.61(1H，d，J＝15.7Hz)，5.38(1H，m)，4.13(1H，m)，4.05(1H，m)，2.88(1H，s)，2.82-1.34(19H，m)，0.770(3H，s)，0.80-0.36(4H，m)；C27H34O3F6的MS HRES計(jì)算值M+H521.2485，觀測(cè)值M+H521.2489。
合成實(shí)施例34-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇(28)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(525mg，0.90mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.57mL，0.91mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(200mg，0.43mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌2.5h，用己烷(35mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(760mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇的混合物(274mg)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇的混合物(274mg)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(280mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(28)(167mg，0.31mmol，73％)。[α]30D＝+18.3 c 0.41，EtOH.UVλmax(EtOH)207nm(ε17778)，264nm(ε15767)；1H NMR(CDCl3)6.36(1H，d，J＝11.1Hz)，6.24(1H，dt，J＝15.7，6.7Hz)，6.07(1H，d，J＝11.3Hz)，5.60(1H，d，J＝15.5Hz)，5.35(1H，m)，5.33(1H，s)，5.00(1H，s)，4.44(1H，m)，4.23(1H，m)，3.14(1H，s)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.40-1.40(15H，m)，0.77(3H，s)，0.80-0.36(4H，m)；C28H34O3F6的MS HRES計(jì)算值M+H533.2485，觀測(cè)值M+H533.2483。
合成實(shí)施例35-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成 將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(300mg，0.76mmol)、乙酸乙酯(5mL)、己烷(12mL)、無(wú)水乙醇(0.5mL)、喹啉(30μL)與Lindlar催化劑(75mg，5％Pd/CaCO3)的混合物在室溫下氫化2h。將反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，用AcOEt洗滌濾墊。蒸發(fā)溶劑，得到標(biāo)題化合物(257mg，0.65mmol，87％)。[α]28D＝+1.8 c 0.61，CHCl3.1H NMR(CDCl3)6.08(1H，dt，J＝12.3，6.7Hz)，5.47(1H，m，)，5.39(1H，d，J＝12.1Hz)，4.15(1H，br.s)，3.28(1H，s)，2.52-1.34(12H，m)，1.16(3H，s)，0.78-0.36(4H，m)；13C NMR(CDCl3)156.66(0)，141.77(1)，126.51(1)，122.79(0，q，J＝285Hz)，115.77(1)，69.59(1)，55.41(1)，47.28(0)，36.44(2)，35.90(2)，33.75(2)，30.22(2)，20.89(0)，19.41(3)，17.94(2)，12.05(2)，11.11(2)；C19H24O2F6的MS HRES計(jì)算值M+H399.1753，觀測(cè)值M+H 399.1757。
合成實(shí)施例36-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成 在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(617mg，1.55mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.17g，3.1mmol)。將所得混合物攪拌2.5h，通過(guò)硅膠(5g)過(guò)濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(600mg，1.51mmol，98％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(600mg，1.51mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(1.76mL，12.0mmol)。將所得混合物攪拌1.0h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物(640mg，1.37mmol，88％)。[α]28D＝-0.2 c 0.55，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.97(1H，dt，J＝12.2，6.2Hz)，5.40(1H，m)，5.38(1H，d，J＝12.2Hz)，2.82(1H，dd，J＝10.7，6.6Hz)，2.60-1.74(10H，m)，0.89(3H，s)，0.75-0.36(4H，m)，0.21(9H，s)；13C NMR(CDCl3)210.56(0)，154.30(0)，139.28(1)，125.81(1)，122.52(0，q，J＝289Hz)，118.17(1)，64.11(1)，53.69(0)，40.43(2)，35.51(2)，34.85(2)，26.94(2)，24.07(2)，20.89(0)，18.39(3)，12.26(2)，10.61(2)，1.43(3)；C22H30O2F6Si的MS HRES計(jì)算值M+H469.1992，觀測(cè)值M+H469.1992。
合成實(shí)施例37-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(29)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(514mg，0.90mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.57mL，0.91mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(194mg，0.41mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.0h，用己烷(35mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(750mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇的混合物(230mg)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇的混合物(230mg)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌40h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，周Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(260mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(29)(1327mg，0.25mmol，62％)。[α]28D＝+53.6 c 0.33，EtOH.UVλmax(EtOH)243nm(ε26982).251nm(ε32081)，260nm(ε21689)；1H NMR(CDCl3)6.29(1H，d，J＝10.7Hz)，6.08(1H，dt，J＝12.5，6.7Hz)，5.93(1H，d，J＝11.1Hz)，5.46(1H，m，)，5.40(1H，d，J＝12.7Hz))，4.12(1H，m)，4.05(1H，m)，3.14(1H，s)，2.80-1.40(19H，m)，0.77(3H，s)，0.80-0.36(4H，m)；C27H34O3F6的MS HRES計(jì)算值M+H521.2485，觀測(cè)值M+H521.2487。
合成實(shí)施例38-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇(30)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(525mg，0.90mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.57mL，0.91mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(200mg，0.43mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌2.5h，用己烷(35mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(680mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇的混合物(310mg)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇的混合物(310mg)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(370mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(30)(195mg，0.37mmol，85％)。[α]30D＝+9.4 c 0.49，EtOH.UVλmax(EtOH)262nm(∈11846)；1H NMR(CDCl3)6.36(1H，d，J＝11.1Hz)，6.08(2H，m)，5.44(1H，m)，5.40(1H，d，J＝12.3Hz)，5.32(1H，s)，5.00(1H，s)，4.43(1H，m)，4.23(1H，m)，3.08(1H，s)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.55-1.40(15H，m)，0.77(3H，s)，0.80-0.34(4H，m)；C28H34O3F6的MS HRES計(jì)算值M+H533.2485，觀測(cè)值M+H533.2502。
合成實(shí)施例39-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇(31)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(697mg，1.22mmol)在四氫呋喃(9mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.77mL，1.23mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(220mg，0.61mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(35mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(900mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇(421mg，0.59mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氘代-19-降-膽骨化醇(421mg，0.59mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌40h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(450mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(31)(225mg，0.54mmol，89％)。[α]29D＝+69.5 c 0.37，EtOH.UVλmax(EtOH)243nm(ε27946)，251nm(ε33039)，261nm(ε22701)；1H NMR(CDCl3)6.30(1H，d，J＝11.3Hz)，5.93(1H，d，J＝11.3Hz)，，5.36(1H，m)，4.12(1H，m)，4.04(1H，m)，2.75(2H，m)，2.52-1.04(22H，m)，1.18(6H，s)，0.79(3H，s)，0.65-0.26(4H，m)；13C NMR(CDCl3)157.16(0)，142.33(0)，131.25(0)，124.73(1)，123.76(1)，115.50(1)，71.10(0)，67.39(1)，67.19(1)，59.47(1)，50.12(0)，44.60(2)，43.84(2)，42.15(2)，38.12(2)，37.18(2)，35.57(2)，29.26(3)，29.11(2)，29.08(3)，28.48(2)，23.46(2)，22.26(2)，21.27(0)，17.94(3)，12.70(2)，10.27(2)；C27H42O3的MS HRES計(jì)算值M+H415.3207，觀測(cè)值M+H415.3207。
合成實(shí)施例40-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(32)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(675mg，1.16mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.73mL，1.17mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(210mg，0.58mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(35mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(850mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(382mg，0.53mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(382mg，0.53mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(380mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(32)(204mg，0.48mmol，83％)。[α]29D＝+16.1 c 0.36，EtOH.UVλmax(EtOH)208nm(ε17024)，264nm(ε16028)；1H NMR(CDCl3)6.37(1H，d，J＝11.3Hz)，6.09(1H，d，J＝11.1Hz)，5.33(2H，m)，5.01(1H，s)，4.44(1H，m)，4.23(1H，m)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.38-1.08(20H，m)，1.19(6H，s)，0.79(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；13C NMR(CDCl3)157.07(0)，147.62(0)，142.49(0)，133.00(0)，124.90(1)，124.73(1)，117.19(1)，111.64(2)，71.10(1)，70.70(0)，66.88(1)，59.53(1)，50.28(0)，45.19(2)，43.85(2)，42.86(2)，38.13(2)，35.59(2)，29.27(2)，29.14(3)，28.65(2)，23.57(2)，22.62(2)，21.29(0)，17.84(3)，12.74(2)，10.30(2)；C28H42O3的MS HRES計(jì)算值M+Na449.3026，觀測(cè)值M+Na449.3023。
合成實(shí)施例41-1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20R-膽骨化醇(33)的合成 [1R，3aR，4S，7aR]-2(R)-[4-(1，1-二甲基乙基)二甲基-硅烷氧基]-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-6-甲基-庚烷-1，6-二醇(34)和[1R，3aR，4S，7aR]-2(S)-[4-(1，1-二甲基乙基)二甲基-硅烷氧基]-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-6-甲基-庚烷-1，6-二醇(35) 將烯醇(alkenol)的四氫呋喃溶液(9mL)在冰浴中冷卻，在原來(lái)泡騰的反應(yīng)中滴加1M硼烷-THF的四氫呋喃溶液(17mL)。將溶液在室溫下攪拌過(guò)夜，在冰浴中重新冷卻，滴加水(17mL)，然后加入過(guò)碳酸鈉(7.10g，68mmol)。將混合物浸在50℃浴中，攪拌70min，生成溶液。使兩相系統(tǒng)冷卻，然后用1∶1乙酸乙酯-己烷(170mL)平衡。將有機(jī)層用水(2×25mL)、然后用鹽水(20mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)，留下無(wú)色油狀物(2.76g)。使該物質(zhì)通過(guò)短的快速柱，使用1∶1乙酸乙酯-己烷和硅膠G。將徹底洗脫后所得的流出物蒸發(fā)，用乙酸乙酯吸收，過(guò)濾，在2×18”15-20μ二氧化硅YMC HPLC柱上進(jìn)行色譜處理，用2∶1乙酸乙酯-己烷作為流動(dòng)相，流速100mL/min。異構(gòu)體34出現(xiàn)在流出物最多2.9L時(shí)，為無(wú)色油狀物，1.3114g，[α]D+45.2°(甲醇，c0.58；1H NMR δ-0.002(3H，s)，0.011(3H，s)，0.89(9H，s)，0.93(3H，s)，1.17(1H，m)，1.22(6H，s)，1.25-1.6(16H，m)，1.68(1H，m)，1.80(2H，m)，1.89(1H，m)，3.66(1H，dd，J＝4.8和11Hz)，3.72(1H，dd，J＝3.3和11Hz)，4.00(1H，m)；LR-ES(-)m/z412(M)，411(M-H)；HR-ES(+)計(jì)算值(M+Na)435.3265，實(shí)測(cè)值435.3269。
異構(gòu)體35出現(xiàn)在流出物最多4.9L時(shí)，為無(wú)色油狀物，0.8562g，長(zhǎng)時(shí)間放置后結(jié)晶mp102-3°，[α]D+25.2°(甲醇，c0.49)；1H NMRδ-0.005(3H，s)，0.009(3H，s)，0.89(9H，s)，0.93(3H，s)，1.16(1H，m)，1.22(6H，s)，1.3-1.5，(14H，m)，1.57(2H，m)，1.67(1H，m)，1.80(2H，m)，1.91(1H，m)，3.54(1H，dd，J＝4.8和11Hz)，3.72(1H，dd，J＝2.9和11Hz)，4.00(1H，m)；)；LR-ES(-)m/z412(M)，411(M-H)。C24H48O3Si的分析計(jì)算值C，69.84，H，11.72；實(shí)測(cè)值C，69.91；H，11.76。-6(R)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-7-碘-2-甲基-庚-2-醇(36) 將攪拌著的三苯膦(0.333g，1.27mmol)與咪唑(0.255g，3mmol)在二氯甲烷(3mL)中的混合物在冰浴中冷卻，加入碘(0.305g，1.20mmol)。將該混合物攪拌10min，然后歷經(jīng)10min滴加34(0.4537g，1.10mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液。將混合物在冰浴中攪拌30min，然后在環(huán)境溫度下攪拌23/4h。TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)確認(rèn)沒(méi)有反應(yīng)物(educt)存在。加入硫代硫酸鈉(0.1g)在水(5mL)中的溶液，使混合物平衡，將有機(jī)相用含有幾滴鹽水的0.1N硫酸(10mL)洗滌，然后用1∶1水-鹽水洗滌(2×10mL)，用鹽水(10mL)洗滌一次，然后干燥和蒸發(fā)。將殘余物用快速色譜純化，用1∶9乙酸乙酯-己烷作為流動(dòng)相，得到36，為無(wú)色糖漿狀物，0.5637g，98％1H NMRδ-0.005(3H，s)，0.010(3H，s)，0.89(9H，s)，0.92(3H，s)，1.23(6H，s)，1.1-1.6(16H，m)，1.68(1H，m)，1.79(2H，m)，1.84(1H，m)，3.37(1H，dd，J＝4和10Hz)，3.47(1H，dd，J＝3和10Hz)，4.00(1H，m)；LR-EI(+)m/z522(M)，465(M-C4H9)，477(M-C4H9-H2O)；HR-EI(+)C24H47IO2Si的計(jì)算值522.2390，實(shí)測(cè)值522.2394。-6(S)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-壬-8-炔-2-醇(37) 將乙炔化鋰DMA絡(luò)合物(0.110g，1.19mmol)加入到36(0.2018g，0.386mmol)在二甲基亞砜(1.5mL)與四氫呋喃(0.15mL)中的溶液中。將混合物攪拌過(guò)夜。TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)顯示是兩個(gè)移動(dòng)得非常接近的斑點(diǎn)(Rf 0.52和0.46)的混合物。在洗脫帶開(kāi)始時(shí)的級(jí)分含有純的烯醇，它是36的消除產(chǎn)物，是作為主要產(chǎn)物生成的。然而，在洗脫帶結(jié)束時(shí)的級(jí)分也是均勻的，蒸發(fā)后得到所需的炔37。以前報(bào)道過(guò)37及其6-差向異構(gòu)體的NMR光譜用于鑒別。-7-苯磺?；?6(S)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-庚-2-醇(38) 將37b(0.94g，1.8mmol)、苯亞磺酸鈉(2.18g，13mmol)與N，N-二甲基甲酰胺(31.8g)的混合物在室溫下攪拌12h，然后在40℃浴中攪拌約6h，直至TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)顯示全部反應(yīng)物被轉(zhuǎn)化。將溶液用1∶1乙酸乙酯-己烷(120mL)和1∶1鹽水-水(45mL)平衡。將有機(jī)層用水(4×25mL)和鹽水(10mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)，留下無(wú)色油狀物，1.0317g。將該物質(zhì)用快速色譜處理，使用逐步梯度(1∶9，1∶6，1∶3乙酸乙酯-己烷)，得到無(wú)色油狀物，0.930g，96％300MHz1H NMRδ-0.02(3H，s)，0.00(3H，s)，0.87(9H，s)，0.88(3H，s)，1.12(1H，m)，1.20(6H，s)，1.2-1.8(18H，m)，1.81(1H，m)，3.09(2H，m)，3.97(1H，brs)，7.59(3H，m)，7.91(2H，m)。-1-(1(S)-苯磺?；谆?5-甲基-5-三甲基硅烷氧基-己基)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚(39) 將1-(三甲基硅烷基)咪唑(1mL)加入到38(0.8g)在環(huán)己烷(10mL)中的溶液中，攪拌過(guò)夜，然后用快速色譜處理，使用己烷、1∶39和1∶19乙酸乙酯-己烷的逐步梯度。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測(cè)洗脫，得到39，為無(wú)色糖漿狀物，0.7915g300 MHz1H NMRδ0.00(3H，s)，0.02(3H，s)，0.12(9H，s)，0.90(12H，s，t-丁基+7a-Me)，1.16(1H，m)，1.20(6H，s)，1.2-1.6(15H，m)，1.66-1.86(3H，m)，3.10(2H，m)，4.00(1H，brs)，7.56-7.70(3H，m)，7.93(2H，m)。-6(R)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二甲基-十一烷-2，3(R)，10-三醇(40) 將39(0.7513g，1.23mmol)與二醇(0.508g，1.85mmol)在四氫呋喃(28mL)中的溶液冷卻至-35℃，然后滴加2.5M丁基鋰的己烷溶液(2.75mL)。使溫度上升至-20℃，在該溫度下維持6h或者直至反應(yīng)物被消耗。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，顯示有反應(yīng)物(Rf0.71)和兩個(gè)差向異構(gòu)的二醇(Rf 0.09和0.12)。接近反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將溫度短暫增加至0℃，再次降低至-10℃，然后加入飽和氯化銨(25mL)，然后加入乙酸乙酯(50mL)和足量的水，以溶解沉淀的鹽。將所得的水相用乙酸乙酯(15mL)萃取。合并萃取液，用鹽水(15mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)。將所得糖漿狀物用快速色譜處理，使用1∶9、1∶6、1∶4和1∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到39a，為無(wú)色糖漿狀物，0.8586g。將該物質(zhì)溶于四氫呋喃(30mL)與甲醇(18mL)的混合物，然后加入5％鈉汞齊(20g)。將混合物攪拌14h后，還原性去磺?；饔檬峭耆?。用TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，顯示差向異構(gòu)的二醇(Rf 0.63和0.74)消失，40a(Rf 0.79)與部分去硅烷基化類(lèi)似物40(Rf 0.16)生成。將混合物用甲醇(20mL)稀釋?zhuān)瑪嚢?min，然后加入冰(20g)，攪拌2min，將上清液潷析到含有飽和氯化銨(50mL)的混合物中。將殘余物反復(fù)用少量四氫呋喃洗滌，也加入到鹽溶液中，然后用乙酸乙酯(80mL)平衡。水層用乙酸乙酯(20mL)反萃取一次，合并萃取液，用鹽水(10mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將所得的含有40a和40的無(wú)色油狀物溶于10mL 1N草酸的甲醇溶液(從二水合物制備)，在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生三甲基硅烷基醚的選擇性水解。加入碳酸鈣(1g)，將混懸液攪拌過(guò)夜，然后過(guò)濾。蒸發(fā)溶液，將所得殘余物用快速色譜處理，使用1∶4、1∶2、1∶1和2∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到三醇40的殘余物，從乙腈中結(jié)晶出非常微細(xì)的分支針狀結(jié)晶，0.45gmp94-95℃，[α]D+44.1°(甲醇，c0.37)；400MHz1H NMRδ-0.005(3H，s)，0.007(3H，s)，0.89(9H，s)，0.92(3H，s)，1.15(1H，m)，1.16(3H，s)，1.21(9H，s)，1.2-1.6(19H，m)，1.67(1H，m)，1.79(2H，m)，1.90(2H，m)，2.06(1H，m)，3.31(1H，brd，J＝10Hz)，4.00(1H，brs)，LR-ES(-)m/z533(M+Cl)，497(M-H)；HR-ES(+)C29H58O4Si+Na計(jì)算值521.3996，實(shí)測(cè)值521.4003。C29H58O4Si的分析計(jì)算值C，69.82，H，11.72；實(shí)測(cè)值C，69.97；H，11.65。-6(R)-(4-羥基-7a-甲基-八氫-茚-1-基)-2，10-二甲基-十一烷-2，3(R)，10-三醇(41) 將攪拌著的三醇40(0.4626g，0.927mmol)在乙腈(10mL)與二_烷(0.7mL)中的溶液冷卻至10℃，滴加氟硅酸溶液(2mL)。除去冷卻浴，將兩相系統(tǒng)進(jìn)一步用乙腈(2mL)稀釋?zhuān)缓笤谑覝叵聰嚢?_h。用TLC(乙酸乙酯)監(jiān)測(cè)反應(yīng)物的消失。將混合物用水(10mL)和乙酸乙酯(30mL)平衡。水相用乙酸乙酯反萃取(2×20mL)，合并萃取液，用水(5mL)和鹽水(10mL)洗滌，然后用1∶1鹽水-飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥。將殘余物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶1至2∶1乙酸乙酯-己烷和純乙酸乙酯的逐步梯度，得到殘余物，將其用1∶1二氯甲烷-己烷吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到無(wú)定形固體，0.3039g(85％)[α]D+42.6°(甲醇，c0.48)；1H NMR(DMSO-d6)δ0.87(3H，s)，0.97(3H，s)，1.02(3H，s)，1.04(6H，s)，1.1-1.4(18H，m)，1.5-1.8(4H，m)，1.84(1H，m)，2.99(1H，dd，J＝6和10Hz)，3.87(1H，brs)，4.02(1H，s，OH)，4.05(1H，s，OH)，4.16(1H，d，OH，J＝3.6Hz)，4.20(1H，d，OH，J＝6.4Hz)；LR-ES(+)m/z384(M)，383(M-H)；HR-ES(+)計(jì)算值(M+Na)407.3132，實(shí)測(cè)值407.3134。-1-{5-羥基-5-甲基-1(R)-[2-(2，2，5，5-四甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4(R)-基)-乙基]-己基}-7a-甲基-八氫-茚-4-醇(42) 將四醇40(0.2966g，0.771mmol)與甲苯磺酸吡啶_(100mg)在丙酮(8mL)與2，2-二甲氧基丙烷(8mL)中的溶液在室溫下保持12h。TLC分析(乙酸乙酯)顯示沒(méi)有反應(yīng)物(Rf0.21)存在，有兩個(gè)新的斑點(diǎn)Rf 0.82和0.71，前者是預(yù)期的42，后者被認(rèn)為是醋酮(methylacetal)。將反應(yīng)混合物用水(5mL)稀釋?zhuān)瑪嚢?0min。此時(shí)僅觀察到Rf值較高的斑點(diǎn)。將混合物用碳酸氫鈉(0.5g)中和，然后用乙酸乙酯(50mL)和鹽水(5mL)平衡。將有機(jī)層用水(5mL)和鹽水(5mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)，留下粘性殘余物(0.324g)，將其直接用于下一步300MHz1H NMRδ0.94(3H，s)，1.10(3H，s)，1.20(1H，m)，1.22(6H，s)，1.25(3H，s)，1.34(3H，s)，1.41(3H，s)，1.2-1.65(20H，m)，1.78-1.86(3H，m)，1.93(1H，m)，3.62(1H，dd，J＝4.6和8.3Hz)，4.08(1H，brs)。-乙酸1-{5-羥基-5-甲基-1(R)-[2-(2，2，5，5-四甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4(R)-基)-乙基]-己基}-7a-甲基-八氫-茚-4-基酯(43) 將以上所得的殘余物溶于吡啶(6.9g)，進(jìn)一步用乙酸酐(3.41g)稀釋。將混合物在室溫下放置24h，然后在35℃浴中放置約10h，直至不再能檢測(cè)到反應(yīng)物(TLC，乙酸乙酯)。將混合物用甲苯稀釋?zhuān)舭l(fā)。經(jīng)殘余物經(jīng)快速色譜純化(1∶4乙酸乙酯-己烷)，得到43，為無(wú)色糖漿狀物，0.3452g，97％1HNMRδ0.89(3H，s)，1.10(3H，s)，1.20(1H，m)，1.22(6H，s)，1.25(3H，s)，1.33(3H，s)，1.41(3H，s)，1.25-1.6(19H，m)，1.72(1H，m)，1.82(2H，m)，1.95(1H，m)，2.05(3H，s)，3.63(1H，dd，J＝4.4和8.4Hz)，5.15(1H，brs)；LR-FAB(+)m/z467(M+H)，465(M-H)，451(M-Me)。-乙酸1-[4(R)，5-二羥基-1(R)-(4-羥基-4-甲基-戊基)-5-甲基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-基酯(44) 使43(0.334g，0.716mmol)在80％乙酸(2mL)中的溶液保持在68℃浴中。用TLC(乙酸乙酯，Rf0.33)監(jiān)測(cè)水解的進(jìn)程。2.5h后不再能檢測(cè)到反應(yīng)物。將混合物蒸發(fā)，然后與少量甲苯共蒸發(fā)，留下無(wú)色薄膜狀物(0.303g)，直接用于下一步300MHz 1H NMRδ0.89(3H，s)，1.17(3H，s)，1.22(6H，s)，1.56(3H，s)，1.1-1.6(21H，m)，1.6-2.0(5H，m)，2.04(3H，s)，3.32(1H，brd，J＝10Hz)，5.15(1H，brs)。-乙酸1-[4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-羥基-1(R)-(4-羥基-4-甲基-戊基)-5-甲基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-基酯(45) 使三醇44(0.30g)、咪唑(0.68g，10mmol)與二甲基thexyl硅烷基氯(1.34g，7.5mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(6g)中的溶液保持在室溫下。48h后，加入4-(N，N-二甲氨基)吡啶(15mg)，將混合物攪拌另外24h。用TLC(乙酸乙酯；24，Rf 0.83；25a，Rf 0.38)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。將混合物用水(2mL)稀釋?zhuān)瑪嚢?0min，然后在乙酸乙酯(45mL)與水(20mL)之間分配。水層用乙酸乙酯(10mL)萃取一次。合并有機(jī)相，用水(4×12mL)和鹽水(8mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將殘余的油狀物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶9和1∶4乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到45，為無(wú)色糖漿狀物。少量未反應(yīng)的反應(yīng)物(80mg)用乙酸乙酯洗脫。將糖漿狀物45直接用于下一步400MHz1H NMRδ0.13(3H，s)，0.14(3H，s)，0.87(6H，s)，0.91(9H，m)，1.10(1H，m)，1.14(3H，s)，1.15(3H，s)，1.21(6H，s)，1.1-1.6(19H，m)，1.6-1.9(5H，m)，1.94(1H，brd，J＝12.8Hz)，2.05(3H，s)，3.38(1H，brs)，5.15(1H，brs)。-乙酸1-[4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-甲基-1(R)-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-5-三甲基硅烷氧基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-基酯(46) 將1-(三甲基硅烷基)咪唑(0.90mL，6.1mmol)加入到45(0.2929mg)在環(huán)己烷(6mL)中的溶液中，攪拌12h，然后經(jīng)快速色譜處理(1∶79乙酸乙酯-己烷)，得到46，為無(wú)色糖漿狀物(0.3372g)。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測(cè)洗脫，得到46，為無(wú)色糖漿狀物，0.7915g1H NMR δ0.074(3H，s)，0.096(3H，s)，0.103(9H，s)，0.106(9H，s)，0.82(1H，m)，0.83(6H，s)，0.88(9H，m)，1.32(3H，s)，1.20(9H，s)，1.15-1.6(17H，m)，1.6-1.9(5H，m)，1.97(1H，brd，J＝12.8Hz)，2.05(3H，s)，3.27(1H，m)，5.15(1H，brs)；LR-FAB(+)m/z712(M)，711(M-H)，697(M-Me)，653(M-AcO)，627(M-C6H13)。-1-[4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-甲基-1(R)-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-5-三甲基硅烷氧基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-醇(47)
將攪拌著的46(0.335mg，0.47mmol)在四氫呋喃(15mL)中的溶液在冰浴中冷卻，滴加1M氫化鋁鋰的四氫呋喃溶液(2mL)。TLC(1∶9乙酸乙酯-己烷)顯示1.5h后25b(Rf 0.61)完全轉(zhuǎn)化為26(Rf 0.29)。加入2M氫氧化鈉溶液(14滴)，然后加入水(0.5mL)和乙酸乙酯(30mL)。加入少量硅藻土，攪拌15min后，濾出液體層。將固體殘余物反復(fù)用乙酸乙酯沖洗，合并液體相，蒸發(fā)，留下無(wú)色糖漿狀物，將其用己烷吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到26(0.335g)，其無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用1H NMRδ0.075(3H，s)，0.10(21H，brs)，0.82(1H，m)，0.84(6H，s)，0.89(6H，m)，0.93(3H，s)，1.13(3H，s)，1.20(9H，s)，1.2-1.6(16H，m)，1.6-1.7(2H，m)，1.82(3H，m)，1.95(1H，brd，J＝12.4Hz)，3.27(1H，m)，4.08(1H，brs)；LR-FAB(+)m/z585(M-C6H13)，481(M-TMSO)；HR-ES(+)m/zC37H78O4Si3+Na的計(jì)算值693.5100實(shí)測(cè)值693.5100。-1-[4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-甲基-1(R)-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-5-三甲基硅烷氧基-己基]-7a-甲基-八氫-茚4-酮(48) 將硅藻土(0.6g)加入到攪拌著的47(0.310g，0.462mmol)在二氯甲烷(14mL)中的溶液中，然后加入重鉻酸吡啶_(0.700g，1.86mmol)。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)跟蹤47(Rf0.54)向酮27(Rf0.76)的轉(zhuǎn)化。4.5h后，將混合物用環(huán)己烷稀釋?zhuān)缓笸ㄟ^(guò)一層硅膠過(guò)濾。合并濾液和乙醚洗液，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理(1∶39乙酸乙酯-己烷)，得到27，為無(wú)色糖漿狀物，0.2988g，96.6％1H NMRδ0.078(3H，s)，0.097(3H，s)，0.107(18H，s)，0.64(3H，s)，0.81(1H，m)，0.84(6H，s)，0.89(6H，m)，1.134(3H，s)，1.201(3H，s)，1.207(3H，s)，1.211(3H，s)，1.3-1.6(14H，m)，1.6-1.7(3H，m)，1.88(1H，m)，2.04(2H，m)，2.2-2.32(2H，m)，2.46(1H，dd，J＝7.5和11.5Hz)，3.28(1H，m)；LR-FAB(+)m/z583(M-C6H13)，479(M-OTMS)；HR-ES(+)m/zC37H76O4Si3+Na的計(jì)算值691.4943，實(shí)測(cè)值691.4949。-4-{2(Z)-[3(S)，5(R)-雙-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2-亞甲基-亞環(huán)己基]-亞乙基}-7a-甲基-1-[5-甲基-1(R)-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-三甲基硅烷氧基-己基]-八氫-茚(49) 在-70℃下，將2.5M丁基鋰的己烷溶液(0.17mL)加入到28的四氫呋喃溶液(2mL)中，產(chǎn)生深櫻桃紅色。10min后，歷經(jīng)15min滴加酮27(0.1415g，0.211mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。4h后，加入pH7磷酸鹽緩沖液(2mL)淬滅反應(yīng)。使溫度增加至0℃，然后加入己烷(30mL)。水層用己烷(15mL)反萃取。合并萃取液，用鹽水(5mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)，得到無(wú)色油狀物，經(jīng)快速色譜純化(1∶100乙酸乙酯-己烷)，得到49，為無(wú)色糖漿狀物，0.155g，71％1H NMRδ0.068(15H，m)，0.103(12H，s)，0.107(9H，s)，0.53(3H，s)，0.82(1H，m)，0.84(6H，s)，0.88(18H，m)，0.89(6H，m)，1.14(3H，m)，1.20(9H，s)，12-1.9(22H，m)，1.97(2H，m)，2.22(1H，dd，J＝7.5和13Hz)，2.45(1H，brd，J＝13Hz)，2.83(1H，brd，J＝13Hz)，3.28(1H，m)，4.20(1H，m)，4.38(1H，m)，4.87(1H，d，J＝2Hz)，5.18(1H，d，J＝2Hz)，6.02(1H，d，J＝11.4Hz)，6.24(1H，d，J＝11.4Hz)；LR-FAB(+)m/z1033(M+H)，1032(M)，1031(M-H)，901(M-TBDMS)。
1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20R-膽骨化醇(33)的合成 將前文實(shí)驗(yàn)中所獲得的49的殘余物(0.153g，0.148mmol)溶于1M四丁基氟化銨溶液(3.5mL)。用TLC(乙酸乙酯)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。因而，24h后將溶液用鹽水(5mL)稀釋?zhuān)瑪嚢?min，然后用乙酸乙酯(35mL)和水(15mL)平衡。水層用乙酸乙酯(15mL)反萃取一次。合并有機(jī)層，用水洗滌(5×10mL)，用鹽水(5mL)洗滌一次，然后干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜純化，使用乙酸乙酯和1∶100甲醇-乙酸乙酯的逐步梯度，從甲酸甲酯-戊烷中得到33，為無(wú)色微晶性物質(zhì)，70mg，91％[α]D+34.3°(甲醇，c0.51)；1HNMR(DMSO-d6)δ0.051(3H，s)，0.98(3H，s)，1.03(3H，s)，1.05(6H，s)，1.0-1.6(17H，m)，1.64(3H，m)，1.80(2H，m)，1.90(1H，d，J＝11.7Hz)，1.97(1H，dd，J＝J＝9.8Hz)，2.16(1H，dd，J＝5.9和J＝13.7Hz)，2.36(1H，brd)，2.79(1H，brd)，3.00(1H，dd，J＝5和10Hz)，3.99(1H，brs)，4.01(1H，s，OH)，4.04(1H，s，OH)，4.54(1H，OH，d，J＝3.9Hz)，4.76(1H，brs)，4.87(1H，OH，d，J＝4.9Hz)，5.22(1H，brs)，5.99(1H，d，J＝10.7Hz)，6.19(1H，d，J＝10.7Hz)；LR-ES(+)m/z519(M+H)，518(M)，517(M-H)，501(M-OH)；HR-ES(+)C32H54O5+Na的計(jì)算值541.3863；實(shí)測(cè)值541.3870；UVmax(ε)213(13554)，241sh(12801)，265(16029)nm。
合成實(shí)施例42-1，25-二羥基-21(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-膽骨化醇(50)的合成 [1R，3aR，4S，7aR]-7-苯磺酰基-6(R)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-庚-2-醇(51) 將36與苯亞磺酸鈉(0.263g，1.6mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液在77℃浴中攪拌3h。將溶液用1∶1乙酸乙酯-己烷(25mL)平衡，將有機(jī)層用水洗滌(5×10mL)，干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用1∶9、1∶4和1∶3乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到砜，為無(wú)色糖漿狀物1HNMRδ-0.02(3H，s)，0.005(3H，s)，0.79(3H，s)，0.87(9H，s)，1.12(1H，m)，1.19(6H，s)，1.12(1H，m)，1.20(6H，s)，1.2-1.8(18H，m)，2.08(1H，m)，3.09(1H，dd，J＝9.3和14.5Hz)，3.31(1H，dd，J＝3和14.5Hz)，3.97(1H，brs)，7.58(3H，m)，7.66(1H，m)，7.91(2H，m)；LR-ES(+)m/z600(M+Na+MeCN)，559(M+Na)；LR-ES(-)m/z536(M)，535(M-H)；HR-ES(+)C30H52O4SSi+Na的計(jì)算值559.3248；實(shí)測(cè)值559.3253。-1-(1(R)-苯磺?；谆?5-甲基-5-三甲基硅烷氧基-己基)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚(52)
將1-(三甲基硅烷基)咪唑(0.146mL)加入到51(0.145g，0.27mmol)在環(huán)己烷(2mL)中的溶液中。17h后，將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶79和1∶39乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到52，為無(wú)色殘余物，0.157g 0.258mmol，TLC(1∶9乙酸乙酯-己烷)Rf 0.14。300MHz1H NMRδ-0.02(3H，s)，0.00(3H，s)，0.87(12H，s)，1.12(1H，m)，1.17(6H，s)，1.2-1.6(15H，m)，1.6-1.9(3H，m)，3.08(2H，m)，3.97(1H，brs)，7.53-7.70(3H，m)，7.90(2H，d，J＝7Hz)。-5(R，S)-苯磺?；?6(R)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二甲基-10-三甲基硅烷氧基-十一烷-2，3(R)-二醇(53) 將152(0.2589g，0.425mmol)與二醇(0.176g，0.638mmol)在四氫呋喃(9mL)中的溶液冷卻至-25℃，加入1.6M丁基鋰的己烷溶液(1.4mL)。使溫度上升至-20℃，維持3h，然后在-10℃下維持2.5h，在0℃下維持10min。將混合物再次冷卻至-10℃，加入飽和氯化銨溶液(5mL)，然后用乙酸乙酯(50mL)和足量的水平衡，以溶解沉淀的鹽。水層周乙酸乙酯(15mL)反萃取，合并萃取液，干燥，蒸發(fā)，將殘余物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶6、1∶4和1∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到53，為無(wú)色糖漿狀物，0.212g，70％300MHz1H NMRδ0.00(3H，s)，0.017(3H，s)，0.12(9H，s)，0.81(3H，s)，0.89(9H，s)，1.16(1H，m)，1.19(12H，m)，1.1-1.6(20H，m)，1.6-1.8(2H，m)，3.10(1H，dd，J＝8.4和14.7Hz)，3.30(1H，m)，3.99(1H，brs)，7.61(2H，m)，7.67(1H，m)，7.93(2H，m)。-6(S)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二甲基-10-三甲基硅烷氧基-十一烷-2，3(R)-二醇(54)
將化合物53(0.186mg，0.262mmol)溶于0.5M草酸二水合物的甲醇溶液(2.5mL)。將溶液攪拌15min，然后加入碳酸鈣(0.5g)，將混懸液攪拌過(guò)夜，然后過(guò)濾。蒸發(fā)濾液，得到54，為白色泡沫狀物，0.188g，98％TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)Rf 0.06。該產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化即可用于下一步。-6(S)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二甲基-十一烷-2，3(R)，10-三醇(三醇55) 將鈉汞齊(5％鈉，10.8g)加入到劇烈攪拌著的54(0.426g，0.667mmol)在四氫呋喃(15mL)與甲醇(9mL)混合物中的溶液中。將混懸液攪拌24h，用TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測(cè)反應(yīng)，觀察到55(Rf0.17)的生成。將混合物用甲醇(3mL)稀釋?zhuān)瑪嚢?min，然后進(jìn)一步用水(10mL)稀釋?zhuān)瑪嚢?min，潷析到飽和氯化銨溶液(25mL)中。水層用乙酸乙酯萃取(2×20mL)。合并萃取液，用pH7磷酸鹽緩沖液(5mL)、然后用鹽水(10mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶1和2∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到55，為無(wú)色糖漿狀物，0.244g，73％1H NMRδ-0.006(3H，s)，0.006(3H，s)，0.86(9H，s)，0.92(3H，s)，1.11(1H，m)，1.15(3H，s)，1.21(9H，s)，1.2-1.75(21H，m)，1.7-1.85(3H，m)，1.90(1H，m)，3.29(1H，brd)，3.99(1H，brs)；LR-ES(+)m/z521(M+Na)，481(M-OH)；LR-ES(-)m/z544(M+CH2O2)，543(M-H+CH2O2)，533(M-Cl)；HR-ES(+)m/zC29H58O4Si+Na的計(jì)算值521.3996，實(shí)測(cè)值521.3999。-6(S)-(4-羥基-7a-甲基-八氫-茚-1-基)-2，10-二甲基-十一烷-2，3(R)，10-三醇(56) 將氟硅酸水溶液(3mL)加入到攪拌著的55(0.240g，0.481mmol)在乙腈(12mL)中的溶液中。用TLC(乙酸乙酯)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。2.5h后，化合物56(Rf0.37)是占優(yōu)勢(shì)的物質(zhì)，其通過(guò)消耗極性較小的55而產(chǎn)生。將混合物用乙酸乙酯和水(10mL)平衡，水層用水反萃取(2×10mL)，合并萃取液，用水(6mL)和鹽水(2×10mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將無(wú)色殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用1∶2、1∶1和2∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度洗脫一些未反應(yīng)的55，然后洗脫56，為無(wú)色糖漿狀物，0.147g，79％1H NMR0.94(3H，s)，1.12(1H，m)，1.15(3H，s)，1.21(9H，s)，1.15-1.7(20H，m)，1.7-1.9(5H，m)，1.96(1H，brd)，3.29(1H，d，J＝9.6Hz)，4.08(1H，brs)；LR-ES(+)m/z448(M+Na+MeCN)，407(M+Na)；LR-ES(-)m/z419(M+Cl)；HR-ES(+)m/zC23H44O4+Na的計(jì)算值407.3132，實(shí)測(cè)值407.3135。-1-(5-羥基-1(S)-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-5，5-二甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4(R)-基]-乙基}-5-甲基-己基)-7a-甲基-八氫-茚-4-醇(57) 將4-甲氧基苯甲醛二甲縮醛(60μL，0.35mmol)加入到56(81.2mg，0.211mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中，然后加入在二氯甲烷(10mL)中含有甲苯磺酸吡啶_(200mg)的溶液(0.2mL)。用TLC(1∶2乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，顯示有4-甲氧基苯甲醛二甲縮醛(Rf 0.80)、4-甲氧基苯甲醛(Rf 0.65)、反應(yīng)物56(Rf 0.42)和產(chǎn)物57(Rf 0.26)。53/4h后，將混合物與飽和碳酸氫鈉溶液(5mL)一起攪拌15min，然后用乙酸乙酯(25mL)平衡。將有機(jī)層用鹽水(5mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用1∶3和1∶2乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到57，為無(wú)色糖漿狀物，0.106mg(100％)1H NMR0.94(3H，s)，1.19，1.21(6H，各為單峰，Me2COH)，1.23，1.35和1.24，1.37(6H，各為單峰，主要和次要的5，5-二甲基氧雜環(huán)戊烷非對(duì)映體)，1.1-1.7(18H，m)，1.7-1.9(5H，m)，1.9-2.0(2H，m)，3.65(1H，m)，3.81(3H，s)，4.08(1H，brs)，5.78和5.96(1H，各為單峰，主要和次要的縮醛非對(duì)映體)，6.89(2H，m)，7.41(2H，m)。-1-(5-羥基-1(S)-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-5，5-二甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4(R)-基]-乙基}-5-甲基-己基)-7a-甲基-八氫-茚-4-酮(58) 將重鉻酸吡啶_(230mg，0.61mmol)加入到攪拌著的含有57(0.0838，0.167mmol)、硅藻土(185mg)和二氯甲烷(4mL)的混合物中。用TLC(1∶25甲醇-氯仿)監(jiān)測(cè)57(Rf0.31)向58(Rf0.42)的轉(zhuǎn)化。2.5h后，將混合物用二氯甲烷(10mL)稀釋?zhuān)缓笸ㄟ^(guò)一層硅膠過(guò)濾。蒸發(fā)濾液和洗液(1∶1二氯甲烷-乙酸乙酯)，將殘余物經(jīng)色譜處理(1∶4乙酸乙酯-己烷)，得到酮58，0.0763g，91％1H NMR0.63(3H，s)，1.19，1.21和1.23(6H，各為單峰，Me2COH)，1.25，1.36，1.38(6H，m，s，s，5，5-二甲基氧雜環(huán)戊烷非對(duì)映體)，1.1-1.9(18H，m)，1.9-2.1(3H，m)，2.1-2.4(2H，m)，2.45(1H，m)，3.66(1H，m)，3.802和3.805(3H，各為單峰)，5.78和5.95(1H，各為單峰，主要和次要的縮醛非對(duì)映體)，6.89(2H，m)，7.39(2H，m)。-1-[4(R)，5-二羥基-1(S)-(4-羥基-4-甲基-戊基)-5-甲基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-酮(59)
將酮58在1N草酸的90％甲醇溶液中攪拌。幾分鐘后混合物變得均勻。75min后TLC(乙酸乙酯)提示反應(yīng)完全(59的Rf0.24)。因而，加入碳酸鈣(0.60g)，將混懸液攪拌過(guò)夜，然后過(guò)濾。蒸發(fā)濾液，經(jīng)快速色譜處理，使用4∶1∶5二氯甲烷-乙酸乙酯-己烷、1∶1乙酸乙酯-己烷和純乙酸乙酯的逐步梯度，得到59，為無(wú)色殘余物，0.060mg，94％1H NMR0.5(3H，s)，1.17(3H，s)，1.22(6H，s)，1.23(3H，s)，1.2-1.21(23H，m)，2.15-2.35(2H，m)，2.45(1H，dd，J＝7和11Hz)，3.30，1H，brd)。-7a-甲基-1-[5-甲基-1(S)-(4-甲基-4-三乙基硅烷氧基-戊基)-4(R)，5-雙-三乙基硅烷氧基-己基]-八氫-茚-4-酮(60) 將59(0.055g，0.143mmol)、咪唑(14.9mg，1.69mmol)、N，N-二甲基吡啶(6mg)、三乙基氯硅烷(0.168mL，1mmol)與N，N-二甲基甲酰胺(1.5mL)的混合物攪拌17h。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)跟蹤反應(yīng)，顯示迅速轉(zhuǎn)化為二硅烷基中間體(Rf 0.47)。進(jìn)一步的反應(yīng)順利地進(jìn)行過(guò)夜，得到完全硅烷基化的60(Rf 0.90)。將溶液用水(3mL)平衡，用乙酸乙酯(20mL)平衡，將乙酸乙酯層用水洗滌(3×4mL)，干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用己烷和1∶100乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到60，為無(wú)色糖漿狀物，0.0813g，78.4％1H NMRδ0.55-0.64(2IH，m)，0.92-0.97(27H，m)，1.12(3H，s)，1.18(3H，s)，1.19(3H，s)，1.21(3H，s)，1.1-1.7(18H，m)，1.9-2.15(2H，m)，2.15-2.35(2H，m)，2.43(1H，dd，J＝7.7和11Hz)，3.30(1H，dd，J＝3和8.4Hz)。-4-{2(Z)-[3(S)，5(R)-雙-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2-亞甲基-亞環(huán)己基]-亞乙基}-7a-甲基-1-[5-甲基-1(S)-(4-甲基-4-三乙基硅烷氧基-戊基)-4(R)，5-雙-三乙基硅烷氧基-己基]-八氫-茚(61) 在-70℃下，將1.6M丁基鋰的己烷溶液(0.14mL)加入到膦(0.1308g，0.224mmol)在四氫呋喃(1.5mL)中的溶液中。10min后，歷經(jīng)15min滴加酮60(0.0813g，0.112mmol)在四氫呋喃(1.5mL)中的溶液。3h后，內(nèi)_鹽的顏色褪去，加入pH7磷酸鹽緩沖液(2mL)，使溫度增加至0℃。將混合物用己烷(30mL)平衡，將有機(jī)層用鹽水(5mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)，得到無(wú)色油狀物，將其經(jīng)快速色譜純化(1∶100乙酸乙酯-己烷)。僅收集Rf0.33的帶(TLC，1∶39乙酸乙酯-己烷)。蒸發(fā)這些級(jí)分，得到61，為無(wú)色糖漿狀物，0.070g，57％1H NMRδ0.06(12H，brs)，0.53-0.64(21H，m)，0.88(18H，s)，0.92-0.97(27H，m)，1.11(3H，s)，1.177(3H，s)，1.184(3H，s)，1.195(3H，s)，1-1.9(22H，m)，1.98(2H，m)，2.22(1H，m)，2.45(1H，m)，2.83(1H，brd，J＝13Hz)，3.27(1H，d，J＝6Hz)，4.19(1H，m)，4.38(1H，m)，4.87(1H，brs)，5.18(1H，brs)，6.02(1H，d，J＝11Hz)，6.24(1H，d，J＝11Hz)。
1，25-二羥基-21(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-膽骨化醇(50)的合成
用TLC(乙酸乙酯)跟蹤61(0.068g，0.06238mmol)在1M四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液中的去保護(hù)反應(yīng)，逐漸進(jìn)行得到50(Rf 0.19)。25h后，將混合物用鹽水(5mL)稀釋?zhuān)瑪嚢?min，用乙酸乙酯(35mL)和水(15mL)平衡。水層用乙酸乙酯(35mL)反萃取一次，合并萃取液，用水(5×10mL)和鹽水(5mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用1∶1與2∶1乙酸乙酯-己烷和2∶98甲醇-乙酸乙酯的線(xiàn)性梯度，得到殘余物，將其用甲酸甲酯吸收，蒸發(fā)，得到白色泡沫狀物，30mg，93％[α]D+29.3°(甲醇，c0.34)；MHz1H NMRδ0.55(3H，s)，1.16(3H，s)，1.21(9H，s)，1.1-1.75(22H，m)，1.80(2H，m)，1.9-2.1(5H，m)，2.31(1H，dd，J＝7和13Hz)，2.60(1H，brd)，284(1H，m)，3.29(1H，d，J＝9.5Hz)，4.22(1H，m)，4.43(1H，m)，5.00(1H，s)，5.33(1H，s)，6.02(1H，d，J＝11Hz)，6.02(1H，d，J＝11Hz)；LR-ES(-)m/z564(M+H2CO2)，563M-H+H2CO2)；HR-ES(+)C32H54O5+Na的計(jì)算值541.3863；實(shí)測(cè)值541.3854；UVmax(ε)211(15017)，265(15850)，204sh(14127)，245sh(13747)nm。
合成實(shí)施例43-1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-19-降-膽骨化醇(62)的合成 [1R，3aR，7aR，4E]-4-{2(Z)-[3(S)，5(R)-雙-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-亞環(huán)己基]-亞乙基}-7a-甲基-1-[5-甲基-1(S)-(4-甲基-4-三乙基硅烷氧基-戊基)-4(R)，5-雙-三乙基硅烷氧基-己基]-八氫-茚(63)
在-70℃下，將1.6M丁基鋰的己烷溶液加入到膦的四氫呋喃溶液中。10min后，歷經(jīng)15min滴加來(lái)自實(shí)施例2的酮60的四氫呋喃溶液。內(nèi)_鹽的顏色褪去后，加入pH7磷酸鹽緩沖液，使溫度增加至0℃。將混合物用己烷平衡，將有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥，蒸發(fā)，得到無(wú)色油狀物，將其經(jīng)快速色譜純化(1∶100乙酸乙酯-己烷)，得到63。
1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-19-降-膽骨化醇(62) 在1M四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液中進(jìn)行63的去保護(hù)反應(yīng)，得到62。25h后，將混合物用鹽水稀釋?zhuān)瑪嚢?min，然后用乙酸乙酯和水平衡。水層用乙酸乙酯反萃取一次，合并萃取液，用水和鹽水洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，得到殘余物，將其用甲酸甲酯吸收，蒸發(fā)，得到62。
合成實(shí)施例44-1，25-二羥基-20S-21(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-19-降-膽骨化醇(64)的合成
(R)-6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-7-苯硫基-庚-2-醇(65) 以上反應(yīng)如Tet. Lett.1975，171409-12所述進(jìn)行。具體而言，向50mL的圓底燒瓶中裝入1.54g(3.73mmol)(R)-2-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基二甲基硅烷氧基)-7a-甲基八氫茚-1-基]-6-甲基庚烷-1，6-二醇(1)(Eur.J.Org.Chem.2004，1703-1713)和2.45g(11.2mmol)二苯硫。將混合物溶于5mL吡啶，加入2.27g(11.2mmol，2.80mL)三丁基膦。將混合物攪拌過(guò)夜，然后用20mL甲苯稀釋?zhuān)舭l(fā)。將殘余物再次用甲苯吸收，蒸發(fā)，其余液體在硅膠上經(jīng)色譜處理，使用己烷、1∶39、1∶19和1∶9乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到標(biāo)題化合物65，為糖漿狀物，1.95g。
(R)-7-苯磺?；?6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-庚-2-醇(67)和(1R，3aR，4S，7aR)-1-((R)-1-苯磺?；谆?5-甲基-5-三乙基硅烷氧基-己基)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚(68)
向含有1.95g(3.9mmol)粗品硫化物65的500mL圓底燒瓶中混入84g二氯甲烷(63mL)。將溶液在冰浴中攪拌，然后一次性加入2.77g(11mmol)間氯過(guò)苯甲酸。將混懸液在冰浴中攪拌40min，然后在室溫下攪拌2h。用TLC(1∶19甲醇-二氯甲烷)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，觀察到僅有一個(gè)斑點(diǎn)Rf 0.45。然后，向混懸液中加入1.68g(20mmol)固體碳酸氫鈉，將混懸液攪拌10min，然后分批加入30mL水，繼續(xù)劇烈攪拌5min，以溶解全部固體。將混合物進(jìn)一步用40mL己烷稀釋?zhuān)瑪嚢?0min，用41.6g己烷轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。棄去下層，將上層用25mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)，得到3.48g 67。將該物質(zhì)用己烷研制，過(guò)濾，蒸發(fā)，留下67，為渾濁的糖漿狀物(2.81g)，將其直接用于下一步。
向含有2.81g以上獲得的67的100mL圓底燒瓶中裝入30mL N，N-二甲基甲酰胺、1.43g(21mmol)咪唑和1.75mL(10mmol)三乙基硅烷基氯。將混合物攪拌17h，然后用50g冰水稀釋?zhuān)瑪嚢?0min，進(jìn)一步用5mL鹽水和60mL己烷稀釋。水層用20mL己烷反萃取，合并兩次萃取液，用2×30mL水洗滌，干燥，蒸發(fā)。該物質(zhì)含有主要的斑點(diǎn)Rf 0.12(1∶39乙酸乙酯-己烷)和次要的斑點(diǎn)Rf 0.06。將該物質(zhì)在硅膠上進(jìn)行色譜處理，使用己烷、1∶100、1∶79、1∶39和1∶19乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。主要的帶用1∶39和1∶19乙酸乙酯-己烷洗脫，得到1.83g 68。
(R)-5-苯磺?；?6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-10-甲基-2-(R)-甲基-10-三乙基硅烷氧基-十一烷-2，3-二醇(69)
向配有磁攪拌器、溫度計(jì)和具有橡膠隔板和氮?dú)鈷?nitrogen sweep)的克萊森接頭的100mL 3頸圓底燒瓶中裝入1.7636g(2.708mmol)砜68、1.114g(4.062mmol)甲苯磺酸鹽和50mL從二苯酮羰游基新鮮蒸餾的四氫呋喃。將該溶液冷卻至-20℃，在≤-20℃下滴加9.31mL 1.6M丁基鋰的己烷溶液。維持溫度范圍在-10與-20℃之間達(dá)5h。除去冷卻浴，加入50mL飽和氯化銨溶液，然后加入75mL乙酸乙酯和足量的水，以溶解所有鹽。將有機(jī)層用15mL鹽水洗滌，干燥，蒸發(fā)，得到無(wú)色油狀物。將該殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜處理，使用己烷、1∶9、1∶6、1∶4和1∶3乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。主要的帶用1∶4和1∶3乙酸乙酯-己烷洗脫，得到1.6872g化合物69，為無(wú)色糖漿狀物。
(S)-6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-10-甲基-2-(R)-甲基-10-三乙基硅烷氧基-十一烷-2，3-二醇(70) 向配有磁攪拌器、溫度計(jì)和具有橡膠隔板和氮?dú)鈷叩目巳R森接頭的25mL 2頸圓底燒瓶中裝入1.6872g(2.238mmol)砜69和40mL甲醇。然后向攪拌著的溶液中分兩等份加入1.25g(51.4mmol)鎂，間隔30min。將混懸液攪拌70min，然后加入另外0.17g鎂和約5mL甲醇，繼續(xù)攪拌1h。然后將混合物用100mL己烷稀釋?zhuān)渭?0mL 1M硫酸，得到兩個(gè)液體相。水層是中性的。水層用25mL 1∶1二氯甲烷-己烷反萃取一次。合并有機(jī)層，然后用15mL鹽水洗滌一次，干燥，蒸發(fā)。將所得物質(zhì)在硅膠上進(jìn)行色譜處理，使用己烷、1∶39、1∶19和1∶9乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。主要的帶用1∶9乙酸乙酯-己烷洗脫，得到1.2611g 70，為無(wú)色糖漿狀物。
(S)-6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二羥基-2，10-二甲基-十一烷-3-酮(71) 向配有磁攪拌器、溫度計(jì)、具有氮?dú)鈷吆拖鹉z隔板的克萊森接頭的25mL圓底燒瓶中裝入518mg(3.88mmol)N-氯琥珀酰亞胺和11mL甲苯。攪拌5min(沒(méi)有全部溶解)，然后冷卻至0℃，加入2.4mL(4.8mmol)2M二甲硫的甲苯溶液。將混合物攪拌5min，然后冷卻至-30℃，在-30℃下滴加0.7143g(1.165mmol)二醇70在4×1.5mL甲苯中的溶液。繼續(xù)在該溫度下攪拌1h。然后使混合物在2h期間升溫至-10℃，然后冷卻至-17℃，滴加3.20mL(6.4mmol)2M三乙胺的甲苯溶液。將混合物在-17至-20℃下攪拌10min，然后緩慢升溫至室溫。將混合物在硅膠柱上進(jìn)行色譜處理，使用己烷、1∶79、1∶39、1∶19、1∶9、1∶4和1∶1乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。主要的帶用1∶1乙酸乙酯-己烷洗脫，得到0.3428g化合物71，為固體。
(S)-2，10-二羥基-6-((1R，3aR，4S，7aR)-4-羥基-7a-甲基-八氫-茚-1-基)-2，10-二甲基-十一烷-3-酮(72) 向配有磁攪拌器的25mL圓底燒瓶中裝入0.3428g(0.69mmol)二醇71，溶于5mL乙腈，然后加入1.25mL氟硅酸溶液。3h后，將混合物在35mL乙酸乙酯與10mL水之間分配，水層用10mL乙酸乙酯反萃取，合并有機(jī)層，用2×5mL水洗滌，用5mL 1∶1鹽水-飽和碳酸氫鈉溶液洗滌一次，干燥，蒸發(fā)。將該物質(zhì)在硅膠上進(jìn)行色譜處理，使用1∶4、1∶3、1∶2和1∶1作為逐步梯度，得到0.2085g標(biāo)題化合物72。
(1R，3aR，7aR)-1-[(S)-5-羥基-1-(4-羥基-4-甲基-戊基)-5-甲基-4-氧代-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-酮(73) 向25mL圓底燒瓶中裝入0.2153g(0.56mmol)72、5mL二氯甲烷和0.20g硅藻土。向該攪拌著的混懸液中一次性加入1.00g(2.66mmol)重鉻酸吡啶_。將反應(yīng)攪拌3h，用TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測(cè)進(jìn)程。將反應(yīng)混合物用5mL環(huán)己烷稀釋?zhuān)缓笸ㄟ^(guò)硅膠G過(guò)濾。用二氯甲烷、然后用1∶1乙酸乙酯-己烷對(duì)柱進(jìn)行洗脫，直至在流出物中檢測(cè)不到溶質(zhì)。蒸發(fā)流出物，得到無(wú)色油狀物。然后將該油狀物在硅膠上進(jìn)行色譜處理，使用1∶4、1∶3、1∶2、1∶1和2∶1乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度，得到0.2077g二酮73。
(1R，3aR，7aR)-7a-甲基-1-[(S)-5-甲基-1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-4-氧代-5-三甲基硅烷氧基-己基]-八氫-茚-4-酮(74) 向25mL圓底燒瓶中裝入0.2077g(0.545mmol)二酮73。將該物質(zhì)溶于0.5mL四氫呋喃與3mL環(huán)己烷的混合物。向所得混合物中加入0.30mL(2.0mmol)TMS-咪唑。10h后，將反應(yīng)混合物用3mL己烷稀釋?zhuān)缓鬂饪s，在硅膠上進(jìn)行色譜處理，使用己烷、1∶79、1∶39、1∶19乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度，得到0.2381g 74，為無(wú)色油狀物。
(S)-6-((1R，3aS，7aR)-4-{2-[(R)-3-((R)-叔丁基二甲基硅烷氧基)-5-(叔丁基二甲基硅烷氧基)-亞環(huán)己基]-亞乙基}-7a-甲基八氫茚-1-基)-2，10-二甲基-2，10-雙-三甲基硅烷氧基十一烷-3-酮(75)
向配有磁攪拌器、溫度計(jì)和含有氮?dú)鈷吲c橡膠隔板的克萊森接頭的15mL 3頸梨形燒瓶中裝入0.2722g(0.4768mmol)[2-[(3R，5R)-3，5-雙，(叔丁基二甲基硅烷氧基)亞環(huán)己基]乙基]二苯基氧化膦和2mL四氫呋喃。將溶液冷卻至-70℃，加入0.30mL 1.6M丁基鋰的己烷溶液。將深紅色溶液在該溫度下攪拌10min，然后歷經(jīng)10min經(jīng)由注射器滴加溶于2mL四氫呋喃的0.1261g(0.240mmol)二酮74。3h又15min后，在-65℃下加入5mL飽和氯化銨溶液，使混合物升溫至10℃，然后在35mL己烷與10mL水之間分配。水層用10mL己烷反萃取一次，合并各層，用含有2mL pH7緩沖液的5mL鹽水洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將該物質(zhì)在15×150mm快速柱上進(jìn)行色譜處理，使用己烷和1∶100乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度，得到0.1572g標(biāo)題化合物75，為無(wú)色糖漿狀物。
1，25-二羥基-20S-21(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-19-降-膽骨化醇(64) 向配有磁攪拌器的15mL 3頸圓底燒瓶中裝入155mg(0.17mmol)四硅烷基醚75。將該無(wú)色殘余物溶于2mL 1M四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液。43h后，加入另外0.5mL 1M四丁基氟化銨溶液，繼續(xù)攪拌5h。將淺褐色溶液用5mL鹽水稀釋?zhuān)瑪嚢?min，用50mL乙酸乙酯和5mL水轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，然后用5mL乙酸乙酯反萃取。合并有機(jī)層，用5×10mL水、10mL鹽水洗滌，干燥，蒸發(fā)。將所得殘余物在15×123mm柱上進(jìn)行色譜處理，使用2∶3、1∶1、2∶1乙酸乙酯-己烷和乙酸乙酯作為逐步梯度，得到64，為白色固體(TLC，乙酸乙酯，Rf0.23)，將其用甲酸甲酯吸收，過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.0753g標(biāo)題化合物64，為固體物質(zhì)。
合成實(shí)施例45-1，25-二羥基-20S-21(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-膽骨化醇(76)的合成 (S)-6-{(1R，3aS，7aR)-4-[2-[(R)-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-5-((S)-叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2-亞甲基-亞環(huán)己基]-亞乙-(E)-基]-7a-甲基-八氫-茚-1-基}-2，10-二甲基-2，10-雙-三甲基硅烷氧基-十一烷-3-酮(77)如實(shí)施例4關(guān)于75所述制備化合物77，但是使74與[(2Z)-2-[(3S，5R)-3，5-雙(叔丁基二甲基硅烷氧基)亞甲基亞環(huán)己基]-乙基]二苯基氧化膦反應(yīng)。
1，25-二羥基-20S-21(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-膽骨化醇(76)如實(shí)施例44關(guān)于64所述，通過(guò)將77去保護(hù)從77制備化合物76。
合成實(shí)施例46-1α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(78)(化合物H)的合成按照下列合成工藝合成化合物(78)。
在-78℃下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-1-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]}-環(huán)丙基}-乙炔基(1.0g，2.90mmol)在四氫呋喃(15mL)中的溶液中加入n-BuLi(2.72mL，4.35mmol，1.6M己烷溶液)。在-78℃下攪拌1h后，加入丙酮(2.5mL，34.6mmol)，繼續(xù)攪拌2.5h。加入NH4Claq(15mL)，將混合物在室溫下攪拌15min，然后用AcOEt萃取(2×50mL)。合并萃取液，用鹽水(50mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(2.4g)經(jīng)FC純化(50g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到(3aR，4S，7aR)-5-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]-環(huán)丙基}-2-甲基-戊-3-炔-2-醇(1.05g，2.61mmol)，將其用四丁基氟化銨(6mL，6mmol，1.0M THF溶液)處理，在65-75℃下攪拌48h。將混合物用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×25mL)和鹽水(25mL)洗滌。合并水性洗液，用AcOEt(25mL)萃取，合并有機(jī)萃取液，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(1.1g)經(jīng)FC純化(50g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(0.75g，2.59mmol，90％)。[α]30D＝+2.7c 0.75，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.50(1H，m)，4.18(1H，m)，2.40(2H，s)，2.35-1.16(11H，m)，1.48(6H，s)，1.20(3H，s)，0.76-0.50(4H，m)；13C NMR(CDCl3)156.39，125.26，86.39，80.19，69.21，65.16，55.14，46.94，35.79，33.60，31.67，29.91，27.22，19.32，19.19，17.73，10.94，10.37；C22H28O2的MS HREI計(jì)算值M+288.2089觀測(cè)值M+288.2091。
將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(-4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(0.72g，2.50mmol)、乙酸乙酯(10mL)、己烷(24mL)、無(wú)水乙醇(0.9mL)、喹啉(47μL)與Lindlar催化劑(156mg，5％Pd/CaCO3)的混合物在室溫下氫化2h。將反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，用AcOEt洗滌濾墊。合并濾液和洗液，用1M HCl、NaHCO3和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥后，蒸發(fā)溶劑，將殘余物(0.79g)經(jīng)FC純化(45g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(640mg，2.2mmol，88％)。
利用Paar儀器，將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(100mg，0.34mmol)、1，4-雙(二苯基-膦基)丁烷1，5環(huán)辛二烯四氟硼酸銠(25mg，0.034mmol)、二氯甲烷(5mL)與一滴汞的混合物在室溫和50p.s.i.壓力下氫化3h。將反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，然后用乙酸乙酯洗滌濾墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)至干(110mg)，經(jīng)FC純化(10g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標(biāo)題化合物(75mg，0.26mmol，75％)。[α]3D＝-8.5 c 0.65，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.37(1H，m，)，4.14(1H，m)，2.37-1.16(17H，m)，1.19(6H，s)，1.18(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；C19H32O2的MS HREI計(jì)算值M+H 292.2402，觀測(cè)值M+H 292.2404。
在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(440mg，1.50mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.13g，3.0mmol)。將所得混合物攪拌5h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(426mg，1.47mmol，98％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(424mg，1.47mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(0.44mL，3.0mmol)。將所得混合物攪拌1.0h，通過(guò)硅膠(10g)過(guò)濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物(460mg，1.27mmol，86％)。[α]29D＝-9.9 c 0.55，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.33(1H，dd，J＝3.2，1.5Hz)，2.81(1H，dd，J＝10.7，6.2Hz)，2.44(1H，ddd，J＝15.6，10.7，1.5Hz)，2.30-1.15(13H，m)重疊2.03(ddd，J＝15.8，6.4，3.2Hz)，1.18(6H，s)，0.92(3H，s)，0.66-0.28(4H，m)，0.08(9H，s)；13C NMR(CDCl3)211.08(0)，155.32(0)，124.77(1)，73.98(0)，64.32(1)，53.91(0)，44.70(2)，40.45(2)，38.12(2)，34.70(2)，29.86(3)，29.80(3)，26.80(2)，24.07(2)，22.28(2)，21.24(0)，18.35(3)，12.60(2)，10.64(2)，2.63(3)；C22H38O2Si的MSHRES計(jì)算值M+362.2641，觀測(cè)值M+362.2648。
在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(675mg，1.16mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.73mL，1.17mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(210mg，0.58mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(35mL)稀釋?zhuān)名}水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(850mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(382mg，0.53mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(382mg，0.53mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(380mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(78)(204mg，0.48mmol，83％)。[α]29D＝+16.1 c 0.36，EtOH.UVλmax(EtOH)208nm(ε17024)，264nm(ε16028)；1H NMR(CDCl3)6.37(1H，d，J＝11.3Hz)，6.09(1H，d，J＝11.1Hz)，5.33(2H，m)，5.01(1H，s)，4.44(1H，m)，4.23(1H，m)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.38-1.08(20H，m)，1.19(6H，s)，0.79(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；13C NMR(CDCl3)157.07(0)，147.62(0)，142.49(0)，133.00(0)，124.90(1)，124.73(1)，117.19(1)，111.64(2)，71.10(1)，70.70(0)，66.88(1)，59.53(1)，50.28(0)，45.19(2)，43.85(2)，42.86(2)，38.13(2)，35.59(2)，29.27(2)，29.14(3)，28.65(2)，23.57(2)，22.62(2)，21.29(0)，17.84(3)，12.74(2)，10.30(2)；C28H42O3的MS HRES計(jì)算值M+Na449.3026，觀測(cè)值M+Na 449.3023。
合成實(shí)施例47-1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇(79)(化合物B)的合成按照下列合成工藝合成化合物(79)。
在室溫下，向攪拌著的11-(5-羥基-1，5-二甲基-己-3-烯基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇與硅藻土在二氯甲烷中的混懸液(10mL)中加入重鉻酸吡啶_。將所得混合物攪拌5h，通過(guò)硅膠過(guò)濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到酮。在室溫下，向攪拌著的酮的二氯甲烷溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑。將所得混合物攪拌1.0h，通過(guò)硅膠過(guò)濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物。
在-78℃下，向攪拌著的叔丁基-{3-[2-(二苯基-氧膦基)-亞乙基]-5-氟-4-亞甲基-環(huán)己氧基}-二甲基-硅烷的四氫呋喃溶液中加入n-BuLi。將所得混合物攪拌15min，滴加1-(5-乙基-1-甲基-5-三甲基硅烷氧基-庚-3-烯基)-7a-甲基-3，3a，5，6，7，7a-六氫-茚-4-酮的四氫呋喃溶液。將反應(yīng)混合物在-78℃下攪拌3.5h，用己烷稀釋?zhuān)名}水洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到硅烷基化的化合物。在室溫下，向硅烷基化的化合物中加入四丁基氟化銨。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋?zhuān)盟?5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(380mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標(biāo)題化合物(79)。
生物學(xué)實(shí)施例生物學(xué)實(shí)施例1在體內(nèi)模型-環(huán)磷酰胺(CYP)誘發(fā)的大鼠慢性IC中評(píng)價(jià)維生素D3類(lèi)似物(化合物A)由腹膜內(nèi)注射CYP誘發(fā)的化學(xué)性膀胱鹽的大鼠模型已經(jīng)獲得充分的認(rèn)可。CYP在臨床實(shí)踐中用于治療多種惡性腫瘤。其代謝物之一丙烯醛在尿中以高濃度排泄，導(dǎo)致出血性膀胱炎，伴有尿頻、尿急和盆腔疼痛的癥狀。該炎性過(guò)程以膀胱總體組織學(xué)的改變、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、PMN)的數(shù)量與分布增加、環(huán)加氧酶-2表達(dá)與前列腺素產(chǎn)生、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子產(chǎn)生為特征?；瘜W(xué)性膀胱炎的大鼠模型非常類(lèi)似于間質(zhì)性膀胱炎—一種慢性疼痛的膀胱綜合征，并且過(guò)去已經(jīng)用于測(cè)試治療劑。
這種模型用于測(cè)試口服施用1，25-二羥基維生素D3類(lèi)似物對(duì)患有CYP-誘發(fā)的膀胱炎的大鼠的作用。監(jiān)測(cè)治療對(duì)清醒的自由活動(dòng)的患有CYP-誘發(fā)的膀胱炎的大鼠的膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)的影響。記錄每只動(dòng)物的下列膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)·膀胱容量·充盈壓(膀胱充盈開(kāi)始時(shí)的壓力)·閾值壓(排尿前即刻的膀胱壓力)·排尿壓(排尿期間的最大膀胱壓力)·非排尿性膀胱收縮的有無(wú)(膀胱壓力增加至少10cm H2O，沒(méi)有尿排出)·非排尿性膀胱收縮的幅度。
動(dòng)物使用8周齡、體重125-175g的Wistar雌性大鼠。向兩組動(dòng)物的膀胱內(nèi)植入管以記錄膀胱內(nèi)壓力?；謴?fù)后，所有動(dòng)物接受三次CYP腹膜內(nèi)注射，隨后分為治療組和假對(duì)照組。
治療組大鼠用口服1，25-二羥基維生素D3類(lèi)似物(1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇)“化合物A”處理14天(日劑量0.1μg/kg)。
對(duì)照組大鼠用口服媒介物(miglyol)處理，劑量等于治療組。
在給予最后一個(gè)劑量的藥物或媒介物后24小時(shí)，對(duì)清醒的自由活動(dòng)的動(dòng)物進(jìn)行膀胱內(nèi)壓測(cè)量。
每組的動(dòng)物數(shù)假對(duì)照動(dòng)物 4治療動(dòng)物3方法向膀胱植入聚乙烯管在全身吸入麻醉(異氟烷與O2)的情況下進(jìn)行下部中線(xiàn)腹部切開(kāi)，向膀胱頂部插入末端經(jīng)過(guò)加熱而張開(kāi)的聚乙烯管(PE-50，Clay Adams，Parsippany，NJ)，用6-0prolene荷包縫合(purse string suture)原位固定。將管的遠(yuǎn)端加熱密封，皮下埋植，在頸部背部露出外表，使動(dòng)物無(wú)法觸及。用4-0尼龍縫合線(xiàn)閉合腹部和頸部切口。
腹膜內(nèi)注射環(huán)磷酰胺恢復(fù)(5天)后，受試動(dòng)物經(jīng)歷三次CYP腹膜內(nèi)注射(Sigma Chemical，St.Luis，MO；75mg/kg每次，腹膜內(nèi))，歷經(jīng)九天。在第一次CPY注射后的第十天，假對(duì)照動(dòng)物僅接受媒介物，而實(shí)驗(yàn)組用1，25-二羥基維生素D3類(lèi)似物1，3-二-O-乙酰基-1，25二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇“化合物A”處理(利用管飼法口服遞送)。處理開(kāi)始后兩周，將動(dòng)物在清醒下測(cè)定膀胱內(nèi)壓測(cè)量圖，以評(píng)估膀胱的功能。
膀胱內(nèi)壓測(cè)量圖將動(dòng)物不受限制地放置在籠中，將導(dǎo)管經(jīng)由T-管與壓力傳感器(Grass_ Model PT300，West Warwick，RI)和微量注射泵(HarvardApparatus22，South Natick，MA)連接。在室溫下向膀胱輸注0.9％鹽水溶液，速率10ml/小、時(shí)。利用Neurodata Acquisition System (Grass_Model 15，Astro-Med，Inc，West Warwick，RI)連續(xù)記錄膀胱內(nèi)壓力。在25-30分鐘的初始穩(wěn)定期后，記錄至少三個(gè)可再現(xiàn)的排尿周期。
實(shí)驗(yàn)時(shí)間表程序 天數(shù)適應(yīng)期1-5管植入+恢復(fù)期 6-10CYP處理(三劑75mg/kg i.p.，每三天一劑) 11-17處理(假對(duì)照或活性)18-31膀胱內(nèi)壓測(cè)量評(píng)價(jià) 32結(jié)果數(shù)據(jù)分析總結(jié)在表1與2和圖1中，其中Bl.Cap＝膀胱容量(ml)FP＝充盈壓(cmH2O)TP＝閾值壓(cmH2O)MP＝排尿壓(cmH2O)#of NVBC＝非排尿性膀胱收縮的次數(shù)
NVBC的幅度＝非排尿性膀胱收縮的幅度表1對(duì)照組的膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)
表2處理組的膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)
注意到很多膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)都有改變。在藥物處理的動(dòng)物中觀察到非排尿性膀胱收縮的次數(shù)和幅度都大大減少。也記錄到充盈壓和閾值壓有不太明顯但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上仍顯著的減少。處理沒(méi)有導(dǎo)致膀胱容量的改變。
與慢性膀胱炎有關(guān)的膀胱活動(dòng)過(guò)度本身表現(xiàn)為頻繁的膀胱壁收縮，伴有刺激性、經(jīng)常是疼痛性的泌尿癥狀。非排尿性膀胱收縮的頻率和幅度均減少這一事實(shí)有力地表明如果對(duì)患有間質(zhì)性膀胱炎的患者的膀胱功能的影響將是相似的，則用維生素D3類(lèi)似物進(jìn)行的口服治療就具有緩解這些不利癥狀的潛力。從臨床觀點(diǎn)來(lái)看，充盈壓和閾值壓降低是有意義的，因?yàn)榕c間質(zhì)性膀胱炎有關(guān)的膀胱內(nèi)壓力增加是潛在危害尿道上部的情況。
生物學(xué)實(shí)施例2大鼠膀胱的組織學(xué)分析通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，將來(lái)自實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)的大鼠膀胱在福爾馬林中固定，包埋在石蠟中，用蘇木精和曙紅染色。
對(duì)每只膀胱的至少10個(gè)切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查?？紤]不同的炎性參數(shù)·止血·水腫·炎性細(xì)胞(主要是淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)浸潤(rùn)·上皮糜爛·纖維化并如下進(jìn)行評(píng)分0＝正常，沒(méi)有任何炎癥跡象，1＝輕度，2＝中度，3＝重度，4＝擴(kuò)散全部切片的嚴(yán)重跡象。
結(jié)果以下的表3和4顯示了化合物A對(duì)組織學(xué)分?jǐn)?shù)的影響。表3表示媒介物處理的動(dòng)物，表4表示“化合物A”處理的動(dòng)物。每種炎性參數(shù)都評(píng)為0至4分，其中0是正常，4是最嚴(yán)重的癥狀。
表3
表4
圖2顯示了化合物A對(duì)大鼠膀胱炎癥的組織學(xué)跡象的作用，而圖3顯示了總結(jié)每種炎癥跡象的組織學(xué)分?jǐn)?shù)的直方圖。
實(shí)施例1和2的數(shù)據(jù)清楚地證明維生素D3類(lèi)似物用于治療間質(zhì)性膀胱炎的炎性組分以及間質(zhì)性膀胱炎特征性的膀胱活動(dòng)過(guò)度的效用。
生物學(xué)實(shí)施例3在體內(nèi)模型-環(huán)磷酰胺(CYP)誘發(fā)的大鼠慢性IC中評(píng)價(jià)維生素D3類(lèi)似物(化合物B)方法向膀胱植入聚乙烯管使用Wistar大鼠(250gr雌性，體重125-175g，8周齡)。在用2％異氟烷全身吸入麻醉的情況下，向膀胱頂部插入末端經(jīng)過(guò)加熱而張開(kāi)的聚乙烯管(PE-50，Clay Adams，Parsippany，NJ)，用6-0尼龍荷包縫合原位固定。將管的遠(yuǎn)端密封，皮下埋植，通過(guò)小切口在頸部背部露出外表。然后將管盤(pán)繞并皮下埋藏。
腹膜內(nèi)注射環(huán)磷酰胺恢復(fù)(5天)后，受試動(dòng)物經(jīng)歷三次CYP腹膜內(nèi)注射(Sigma Chemical，St.Luis，MO；75mg/kg每次，腹膜內(nèi))，歷經(jīng)九天。在第一次CPY注射后的第十天，假對(duì)照動(dòng)物僅接受媒介物，而實(shí)驗(yàn)組用1，25-二羥基維生素D3類(lèi)似物1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇“化合物A”處理(利用管飼法口服遞送)。處理開(kāi)始后兩周，將動(dòng)物在清醒下測(cè)定膀胱內(nèi)壓測(cè)量圖，以評(píng)估膀胱的功能。
處理治療組將4-6只大鼠用口服維生素D3類(lèi)似物(1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇)化合物“B”連續(xù)處理14天(日劑量30或75μg/kg)。
對(duì)照組將4只大鼠用口服媒介物(miglyol)處理，劑量等于治療組。
將化合物B的乙醇儲(chǔ)備液(1mg/ml)以適當(dāng)?shù)臐舛热苡贛iglyol媒介物中。對(duì)照動(dòng)物接受含有等量乙醇的媒介物。在對(duì)動(dòng)物稱(chēng)重后，通過(guò)每日管飼法進(jìn)行藥物(或媒介物)處理。計(jì)算100μl/10克體重的最終體積，制備藥物溶液。
膀胱內(nèi)壓測(cè)量圖處理兩周后，將動(dòng)物不受限制地放置在籠中，將導(dǎo)管的遠(yuǎn)端從皮下袋中抽出，經(jīng)由T-管與壓力傳感器(Grass_ Model PT300，West Warwick，RI)和微量注射泵(Harvard Apparatus22，South Natick，MA)連接。向膀胱輸注鹽水溶液(0.9％，室溫)，速率10ml/小時(shí)。利用NeurodataAcquisition System(Grass_，Astro-Med，West Warwick，RI)連續(xù)記錄膀胱內(nèi)壓力。至少記錄三個(gè)可再現(xiàn)的排尿周期。對(duì)每只動(dòng)物記錄下列膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)充盈壓(FP膀胱充盈開(kāi)始時(shí)的壓力)、閾值壓(TP排尿前即刻的膀胱壓力)、排尿壓(MP排尿期間的最大膀胱壓力)、非排尿性膀胱收縮的有無(wú)(NVBC膀胱壓力增加至少10cm H2O，沒(méi)有尿排出)。在最后一次排尿或者借助重力排空膀胱之后，通過(guò)抽吸膀胱中剩余的殘余尿液測(cè)量排泄后殘留(PVR)。計(jì)算膀胱容量(BC)，為排泄體積與PVR之和。在安樂(lè)死后，收獲膀胱，記錄它的重量。
血鈣(calcemia)評(píng)估通過(guò)可商購(gòu)獲得的比色測(cè)定法(Calcium Dry-Fast，Sentinel CH.意大利)評(píng)價(jià)血清鈣。簡(jiǎn)言之，在96孔板中，將10μl血清加入到100μl按照生產(chǎn)商的工藝制備的反應(yīng)溶液中。在RT下溫育5min后，利用分光光度計(jì)在570nm下對(duì)樣品進(jìn)行讀數(shù)，使用所指示的參照標(biāo)準(zhǔn)一式三份地計(jì)算鈣水平。
結(jié)果表5膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)(括號(hào)內(nèi)顯示的是標(biāo)準(zhǔn)誤差值)
再次注意到作為用維生素D化合物(在這種情況下為化合物B)處理的結(jié)果，很多膀胱內(nèi)壓測(cè)量參數(shù)都有改變。
非排尿性膀胱收縮的頻率在兩種劑量水平下都顯著地減少了(30ug/kg，p＜0.01；75ug/kg，p＜0.005)，參見(jiàn)圖4。用化合物B處理導(dǎo)致膀胱容量在兩種劑量水平下都增加了(30ug/kg，p＜0.01；75ug/kg，p＜0.01)，如圖5所示。
作為用化合物B處理的結(jié)果，充盈壓和閾值壓有微小增加(在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著)。在較高的劑量水平下用化合物B處理減少了非排尿性膀胱收縮的幅度(在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著)。
在化合物B的兩種劑量水平下，平均血清鈣水平僅有微小的而非顯著的升高，參見(jiàn)圖6(虛線(xiàn)表示在大鼠10.7mg/dl的正常范圍限)。
生物學(xué)實(shí)施例4在體內(nèi)模型-小鼠變應(yīng)性IC中評(píng)價(jià)維生素D3類(lèi)似物(化合物B)方法一般說(shuō)明通過(guò)腹膜內(nèi)注射，在4mg明礬(SERVA，德國(guó))存在下，注射10μg/小鼠的來(lái)自Sigma的雞卵清蛋白(OVA，V級(jí))，使小鼠(BALB/c，雌性8周齡，體重18-20g，Charles River，Calco ITA)致敏化，每周一次，持續(xù)4周。這會(huì)誘導(dǎo)血清中可檢測(cè)的持續(xù)性IgE水平。
在最后一次免疫接種激發(fā)(immunization boost)之后一周或兩周，將敏化小鼠麻醉(1.5％異氟烷)，然后沿尿道插入導(dǎo)管(24 gauge，3/4 in.；Angiocath，Becton-Dickson)。向下腹部施加微小指壓，以排放尿液。
向膀胱滴注150μl單獨(dú)的鹽水或OVA(1mg/150μl)，以緩慢速率輸注以避免創(chuàng)傷和膀胱-輸尿管回流，在30min間隔內(nèi)重復(fù)兩次，使用固定在導(dǎo)管上的注射器進(jìn)行，持續(xù)至少30min。在第一次膀胱攻擊之后7-10天，利用相同的方法重復(fù)進(jìn)行膀胱攻擊。
治療組將10只小鼠用口服維生素D3類(lèi)似物(1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇)化合物“B”處理14天(日劑量30或75μg/kg)。
對(duì)照組將10只小鼠用口服媒介物(miglyol)處理，劑量等于治療組。
將化合物B的乙醇儲(chǔ)備液(1mg/ml)以適當(dāng)?shù)臐舛热苡贛iglyol媒介物中。對(duì)照動(dòng)物接受含有等量乙醇的媒介物。在對(duì)動(dòng)物稱(chēng)重后，通過(guò)每日管飼法進(jìn)行藥物(或媒介物)處理。計(jì)算100μl/10克體重的最終體積，制備藥物溶液，處理開(kāi)始于第一次膀胱內(nèi)卵清蛋白攻擊當(dāng)天，每日維持，但是跨越周末時(shí)中斷，總計(jì)處理12天。圖7闡述了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間表。
ELISA利用可商購(gòu)獲得的試劑盒(BD Opteia，Mouse IgE ELISA Set Cat.No.555248)并且按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)測(cè)定血清總IgE水平。簡(jiǎn)言之，用50μL/孔的捕獲抗體包被微孔，所述抗體被稀釋在包被緩沖液(0.1M碳酸鈉，pH9.58.40g NaHCO3，3.56g Na2CO3；適量至1.0L；pH至9.5；新鮮制備或者在制備7天內(nèi)使用，貯存在2-8℃下)中。根據(jù)批次-特異性指導(dǎo)/分析證書(shū)，推薦的抗體包被稀釋比例為1∶250。將板密封，在4℃下溫育過(guò)夜。洗滌(6×PBS/吐溫0.1％)后，將板用≥200μL/孔PBS/10％FBS封閉，在室溫(RT)下溫育1小時(shí)。將各為100μL的標(biāo)準(zhǔn)、樣品和對(duì)照吸移至適當(dāng)?shù)目字?，將板在RT下溫育2小時(shí)。6次洗滌后，向每個(gè)孔中加入100μL所制備的檢測(cè)抗體+抗生物素蛋白-HRP(1∶250)試劑，在RT下放置1小時(shí)。如上洗滌后，向板中加入0.1ml底物溶液，進(jìn)一步在RT下于暗處溫育30分鐘(沒(méi)有板密封器)。反應(yīng)停止(H2SO41M，50μl/孔)后，在30分鐘內(nèi)記錄450nm下的吸光度。
按照下列工藝測(cè)定OVA-特異性IgE。在碳酸鹽緩沖液中包被抗小鼠IgE抗體(1ug/ml Pharmingen，cat.)，將板在4℃下進(jìn)行溫育。封閉(＞200ulPBS/10％FBS，1hr37℃)后，將板用在4℃下適當(dāng)稀釋的血清樣品進(jìn)一步溫育。充分洗滌后，向每個(gè)孔中加入PBS/含有生物素化的卵清蛋白(最終濃度10ug/ml)的5％FBS，將板在RT下溫育2hr。加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1∶5000，Pharmingen，45min RT)和特異性底物顯露OVA-特異性IgE。最后，在反應(yīng)終止后記錄450nm的吸光度。
組織學(xué)和免疫組織化學(xué)從動(dòng)物中移出膀胱，縱向分為兩部分，一半立即在福爾馬林(10％緩沖的)中固定至少3hr，或者在OCT冷凍介質(zhì)(Tissue-Tek Sakura)中切開(kāi)后在液氮中迅速冷凍。對(duì)于組織學(xué)分析，將固定的膀胱進(jìn)行進(jìn)一步加工，最后用石蠟包埋。連續(xù)切制5μm的切片，然后用GIEMSA染色(BDH，20％溶液，3hr RT)，然后在0.1％乙酸中去染色10秒。在二甲苯中經(jīng)過(guò)澄清步驟后，將載玻片用Eukitt培養(yǎng)基永久封固，由病理學(xué)家以盲法方式進(jìn)行分析，以便評(píng)價(jià)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肥大細(xì)胞數(shù)量和間質(zhì)水腫的存在。采用半定量的組織學(xué)評(píng)分1為輕微浸潤(rùn)，沒(méi)有水腫；2為中等浸潤(rùn)，微小水腫；3為嚴(yán)重浸潤(rùn)，水腫。
在所選擇的膀胱組織中，通過(guò)對(duì)冷凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢查維生素D3受體(VDR)的表達(dá)。在RT下將切片在丙酮中固定10min。5次PBS洗滌后，將載玻片與含有0.3％ H2O2的甲醇一起在RT下溫育30min，目的是淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用5％正常兔血清預(yù)溫育1hr。然后向載玻片加入抗VDR抗體(Affinity Bio Reagents克隆9A7同種型IgG2b)(最終濃度5ug/ml)，在4℃下延長(zhǎng)溫育。
徹底洗滌后，將切片與兔抗大鼠IgG(10ug/ml)一起在RT下溫育1hr，再次洗滌，進(jìn)一步與鏈霉抗生物素蛋白-HRP(Vector Labs)一起在RT下溫育30min。加入特異性色原(Vector Labs)使載玻片顯色，直至達(dá)到良好的視覺(jué)染色，用蘇木精復(fù)染色，最后用Eukitt培養(yǎng)基(Bio-optica)永久封固。
Taq-man分析利用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen)從一半膀胱中提取總RNA，用脫氧核糖核酸酶1(Qiagen)處理，利用具有隨機(jī)六聚體的逆轉(zhuǎn)錄試劑(AppliedBiosystems)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(按照生產(chǎn)商的說(shuō)明)。從1ug RNA合成cDNA。在96孔光學(xué)反應(yīng)板(Applied Biosystems)中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。對(duì)于每種樣品，我們?cè)诓煌目?singleplex)中一式兩份地?cái)U(kuò)增靶基因和管家基因(HPRT)。按照下列方案制備擴(kuò)增主控混合物(Master Mix)(體積表示單個(gè)孔，最終體積為40ul/孔)2X TaqMan_ Universal PCR主控混合物(Applied Biosystems，4304437)20ul；20X測(cè)定靶基因2ul；H2O8ul；cDNA10ul。在SDS 7000(Applied Biosystems)儀器上進(jìn)行反應(yīng)，利用下列擴(kuò)增程序2’，50℃；10’，95℃；15”，95℃；1’，60℃，40個(gè)周期。將周期閾(Ct)值輸出到Excel工作表中進(jìn)行分析，利用ΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。所使用的所有引物都攜帶FAM報(bào)道基因。
血鈣評(píng)估通過(guò)可商購(gòu)獲得的比色測(cè)定法(Calcium Dry-Fast，Sentinel CH.意大利)評(píng)價(jià)血清鈣。簡(jiǎn)言之，在96孔板中，將10μl血清加入到100μl按照生產(chǎn)商的方法制備的反應(yīng)溶液中。在RT下溫育5min后，利用分光光度計(jì)在570nm下對(duì)樣品進(jìn)行讀數(shù)，使用所指示的參照標(biāo)準(zhǔn)一式三份地計(jì)算鈣水平。
結(jié)果ELISA圖8顯示了IgE的總量，圖9顯示了抗原特異性IgE的量。數(shù)據(jù)代表重復(fù)至少三次的單一實(shí)驗(yàn)，8-10只受試動(dòng)物/組(治療、對(duì)照和血清水平預(yù)攻擊)。僅顯示了一種劑量75ug/kg的結(jié)果，利用30ug/kg的劑量獲得了相似的結(jié)果(沒(méi)有顯示)。
數(shù)據(jù)表明，該方法非常有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，卵清蛋白/明礬處理的動(dòng)物中的抗原特異性血清IgE與相同動(dòng)物的攻擊前的血清相比增加8倍。然而，在媒介物與化合物B處理的動(dòng)物之間在IgE總量或卵清蛋白特異性IgE的水平方面沒(méi)有檢測(cè)到顯著改變。這一發(fā)現(xiàn)正如所預(yù)期的那樣。
肥大細(xì)胞衍生的糜蛋白酶(chymase)MMCP1蛋白的血清水平如圖10所示。一旦暴露于抗原，膀胱粘膜通過(guò)觸發(fā)駐留肥大細(xì)胞的脫粒和導(dǎo)致多種炎性介質(zhì)的釋放而發(fā)生反應(yīng)。糜蛋白酶MMCP1蛋白的血清水平在用化合物B(75ug/kg)處理的小鼠中顯著(p＜0.05)低于用媒介物處理的那些，這提示了對(duì)肥大細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答的抑制作用。
血鈣用化合物B(75ug/kg)處理沒(méi)有導(dǎo)致血鈣水平上升至毒性閾值以上，如圖11所示(虛線(xiàn)表示在小鼠中10.7mg/dl的毒性閾)。在化合物B處理的組中注意到血清鈣水平有小的但是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加(p＜0.05)。在用較低劑量(30mg/kg)化合物B處理的小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到血清鈣水平的顯著改變(沒(méi)有顯示)。
體重圖12闡述了(化合物B，75ug/kg)處理的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物的體重差異。數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差值表示。每組8-10只受試動(dòng)物。兩組的數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示沒(méi)有顯著性差異。因?yàn)轶w重是毒性的良好指征，這一發(fā)現(xiàn)為用化合物B治療不會(huì)導(dǎo)致副作用提供了證據(jù)。
Taq-man分析各種炎性標(biāo)志物的水平如圖13所示給出了鹽水攻擊(媒介物處理)的和卵清蛋白攻擊(媒介物、化合物B30ug/kg和化合物B75ug/kg處理)的IL-13、MCPT2和FcεR1α。通過(guò)合并從受試者回收的等量血清得到這些結(jié)果。用化合物B進(jìn)行口服處理在兩種劑量水平下(以劑量依賴(lài)性方式)顯著減少所有三種炎性標(biāo)志物的表達(dá)。用鹽水攻擊沒(méi)有顯示Th2/肥大細(xì)胞特異性標(biāo)志物有任何增加。
圖14闡述了關(guān)于卵清蛋白攻擊(媒介物和化合物B處理75ug/kg)的小鼠的炎性標(biāo)志物IL-13、MMCP4和FcεR1α存在的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示了單個(gè)動(dòng)物的各個(gè)數(shù)值。在對(duì)照組內(nèi)觀察到標(biāo)志物有不同程度的增量調(diào)節(jié)，提示動(dòng)物可以以不同速率從攻擊中恢復(fù)。但是，用維生素D3類(lèi)似物口服處理減量調(diào)節(jié)炎性標(biāo)志物的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)提示本發(fā)明的化合物可以調(diào)控膀胱中的Th2型炎性應(yīng)答。
組織學(xué)媒介物和化合物B處理(75ug/kg)的動(dòng)物的膀胱切片的盲法組織學(xué)分析數(shù)據(jù)列在圖15中。觀察到肥大細(xì)胞(p＜0.05)、嗜酸性粒細(xì)胞(p＜0.01)和淋巴細(xì)胞(p＜0.01)有顯著的減少，水腫似乎完全消散了(p＜0.001)。
用化合物B處理的效果在圖16所示的代表性切片中也是顯而易見(jiàn)的，其中在化合物B處理的動(dòng)物(75ug/kg)中沒(méi)有水腫的跡象，但是在對(duì)照動(dòng)物(媒介物處理的)中有大量用箭頭指示的損傷。
討論本實(shí)施例所給出的數(shù)據(jù)支持了這樣一種假說(shuō)，維生素D3類(lèi)似物化合物B通過(guò)減量調(diào)節(jié)典型標(biāo)志物例如IL-13或FcεR1α的表達(dá)而有效調(diào)控膀胱中的Th2型炎性應(yīng)答。另外，在藥物處理后在卵清蛋白攻擊的膀胱內(nèi)也可檢測(cè)到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，這表明炎性細(xì)胞的遷移可能被減少了，原因可能是細(xì)胞因子/趨化因子環(huán)境減少和骨髓中細(xì)胞成熟受損?；衔顱處理也抑制血清中MMCP1蛋白的釋放，提示了對(duì)肥大細(xì)胞活化的直接作用。但是，尚不清楚這種所觀察到的作用是由肥大細(xì)胞遷移至膀胱粘膜內(nèi)的數(shù)量減少還是由維生素D3類(lèi)似物對(duì)肥大細(xì)胞脫粒的直接作用所產(chǎn)生的。
可以得出結(jié)論用維生素D3類(lèi)似物化合物B口服處理在變應(yīng)原誘發(fā)的慢性膀胱炎癥模型中對(duì)膀胱發(fā)揮抗炎作用，表明維生素D化合物代表間質(zhì)性膀胱鹽的一種新的治療選擇。
生物實(shí)施例5在體內(nèi)模型-小鼠變應(yīng)性IC中評(píng)價(jià)維生素D3類(lèi)似物(化合物C-I)方法按照前文實(shí)施例6所述的一般方法進(jìn)行實(shí)施例7中的實(shí)驗(yàn)。將小鼠用鹽水(未處理)或卵清蛋白(用媒介物或者化合物C-I之一處理，劑量如表6所示，以u(píng)g/kg計(jì))攻擊。
表6實(shí)施例7中所用的化合物A-I的化學(xué)名稱(chēng)和劑量
結(jié)果實(shí)施例7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)在圖17中。數(shù)據(jù)以圖形方式闡述在圖18至26中。
FcεR1α炎性標(biāo)志物的表達(dá)如圖18所示。用化合物E(p＜0.05)、化合物H(p＜0.05)、特別是化合物F(p＜0.001)處理引起FcεR1α基因的mRNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。
IL-13炎性標(biāo)志物的表達(dá)如圖19所示。用化合物H(p＜0.05)、化合物I(p＜0.05)、特別是化合物E(p＜0.001)和化合物F(p＜0.001)處理引起IL-13基因的mRNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。
MMCP4炎性標(biāo)志物的表達(dá)如圖20所示。用化合物H(p＜0.05)、化合物I(p＜0.05)、特別是化合物E(p＜0.001)和化合物F(p＜0.001)處理引起MMCP4基因的mRNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。
圖21顯示了MMCP1的血清水平。用化合物F(p＜0.05)、特別是化合物A(p＜0.001)和化合物E(p＜0.001)處理引起MMCP1蛋白的血清水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。
盲法組織學(xué)分析的數(shù)據(jù)如圖22至25所示。注意到用一些供試化合物處理的數(shù)據(jù)此時(shí)沒(méi)有。用維生素D3類(lèi)似物化合物C處理導(dǎo)致膀胱壁中肥大細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)于對(duì)照(媒介物處理)動(dòng)物而言有顯著減少(p＜0.05)，如圖22所示。用化合物A處理導(dǎo)致膀胱壁中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(p＜0.05)，如圖23所示。圖24顯示用化合物E和化合物I處理都引起膀胱壁中LMPC的數(shù)量顯著減少(對(duì)于這兩種處理，p＜0.05)。水腫評(píng)價(jià)如圖25所示。
與媒介物處理的對(duì)照組相比，用化合物C、化合物E、化合物F、化合物H和化合物I處理引起血清鈣水平輕微升高(在所有情況下p＜0.001)，血清鈣升高的程度因治療組而異。用化合物A或化合物G處理顯示血清鈣水平?jīng)]有顯著增加。
總結(jié)實(shí)施例7中所有上述結(jié)果，我們可以得出結(jié)論這些化合物可以根據(jù)它們?cè)陂g質(zhì)性膀胱炎的變應(yīng)原誘發(fā)的慢性膀胱炎癥模型中減少若干測(cè)量膀胱炎癥的參數(shù)的功效進(jìn)行排序。功效排序如下化合物E＞化合物F＞化合物B＞化合物H＞化合物I＞化合物A＞化合物A＝化合物G?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實(shí)維生素D化合物代表間質(zhì)性膀胱炎的一種新的治療選擇。
制劑實(shí)施例制劑實(shí)施例1A軟明膠膠囊劑I項(xiàng)目 成分 mg/粒膠囊1 化合物A 10.001-0.022 丁羥甲苯(BHT) 0.0163 丁基化羥基苯甲醚(BHA) 0.0164 Miglyol 812適量至 160.0制造工藝1.將BHT和BHA混懸在Miglyol 812中，升溫至約50℃，同時(shí)進(jìn)行攪拌，直至溶解。
2.在50℃下，將化合物A溶于來(lái)自步驟1的溶液。
3.將來(lái)自步驟2的溶液在室溫下冷卻。
4.將來(lái)自步驟3的溶液填充至軟明膠膠囊中。
注所有制造步驟都是在氮?dú)夥障隆⒈芄膺M(jìn)行的。
制劑實(shí)施例1B軟明膠膠囊劑II
制造工藝1.將二-α-生育酚混懸在Miglyol 812中，升溫至約50℃，同時(shí)進(jìn)行攪拌，直至溶解。
2.在50℃下，將化合物A溶于來(lái)自步驟1的溶液。
3.將來(lái)自步驟2的溶液在室溫下冷卻。
4.將來(lái)自步驟3的溶液填充至軟明膠膠囊中。
制劑實(shí)施例2A口服劑型軟明膠膠囊在氮下、在琥珀色光中，由在含有0.015mg丁羥甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)的150mg分餾椰子油(例如Miglyol 812)中的0.01至25.0mg化合物B配制口服施用的膠囊，填充在軟明膠膠囊中。
通過(guò)以下方法制備膠囊1.將BHT和BHA混懸在分餾椰子油(例如Miglyol 812)中，升溫至約50℃，同時(shí)進(jìn)行攪拌，直至溶解。
2.在50℃下，將化合物A溶于來(lái)自步驟1的溶液。
3.將來(lái)自步驟2的溶液在室溫下冷卻。
4.將來(lái)自步驟3的溶液填充至軟明膠膠囊中。
所有制造步驟都是在氮?dú)夥障隆⒈茏匀还膺M(jìn)行的。
制劑實(shí)施例2B口服劑型軟明膠膠囊在氮下、在琥珀色光中，配制口服施用的膠囊在含有0.015mg丁羥甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)的150mg分餾椰子油(Miglyol 812)中的150μg化合物B，填充在軟明膠膠囊中。
制劑實(shí)施例2C口服劑型軟明膠膠囊在氮下、在琥珀色光中，配制口服施用的膠囊在含有0.015mg丁羥甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)的150mg分餾椰子油(Miglyol 812)中的75μg化合物B，填充在軟明膠膠囊中。
在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和以下的權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文另有需要，否則詞語(yǔ)“包含”應(yīng)理解為意指包括所述整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組，但是不排除任意其它整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組。
參考文獻(xiàn)的引用在本說(shuō)明書(shū)全文中引用的所有參考文獻(xiàn)(包括參考文件、已頒布的專(zhuān)利、已公布的專(zhuān)利申請(qǐng)和未決專(zhuān)利申請(qǐng))的內(nèi)容在此均明確全文引入本文作為參考。
等價(jià)方式本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或者能夠確定利用不超出慣用的實(shí)驗(yàn)方法，可以獲得本文所述發(fā)明的具體實(shí)施方案的很多等價(jià)方式。這類(lèi)等價(jià)方式也被以下的權(quán)利要求所涵蓋。
權(quán)利要求
1.維生素D化合物在預(yù)防或治療間質(zhì)性膀胱炎中的用途。
2.權(quán)利要求1所述的維生素D化合物在制備用于預(yù)防或治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物中的用途。
3.通過(guò)施用有效量的維生素D化合物而預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的方法。
4.權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)的用途或方法，其中所述的間質(zhì)性膀胱炎以存在膀胱功能障礙和膀胱炎癥的癥狀為特征。
5.權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)的用途或方法，其中維生素D化合物是與第二種用于治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物在獨(dú)立或組合的藥物制劑中分別、相繼或同時(shí)施用的。
6.用于預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物制劑，其包含維生素D化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
7.藥物制劑，其包含維生素D化合物和藥學(xué)上可接受的載體，包裝有用于預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的說(shuō)明書(shū)。
8.用于預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的維生素D化合物。
9.套藥盒，其含有維生素D化合物以及指導(dǎo)將所述化合物施用于需要治療和/或預(yù)防間質(zhì)性膀胱炎的患者、從而治療和/或預(yù)防所述患者的間質(zhì)性膀胱炎的說(shuō)明書(shū)。
10.權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的維生素D化合物是下式的化合物 其中A1是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；X1和X2各自獨(dú)立地是H或＝CH2，條件是X1和X2不都是＝CH2；R1和R2各自獨(dú)立地是OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基、OROC(O)鹵代烷基、OAc；R3、R4和R5各自獨(dú)立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構(gòu)成C3-C6環(huán)烷基；R6和R7各自獨(dú)立地是C1-4烷基或鹵代烷基；R8是H、-COC1-C4烷基、-CO羥基烷基或-CO鹵代烷基；及其藥學(xué)上可接受的酯、鹽和前體藥物。
11.權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的維生素D化合物是下式的化合物 其中X是H2或CH2；R1是氫、羥基或氟；R2是氫或甲基；R3是氫或甲基，條件是當(dāng)R2或R3是甲基時(shí)，R3或R2必須是氫；R4是甲基、乙基或三氟甲基；R5是甲基、乙基或三氟甲基；A是單鍵或雙鍵；B是單鍵、E-雙鍵、Z-雙鍵或叁鍵。
12.權(quán)利要求11的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中R4和R5各自是甲基或乙基。
13.權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的維生素D化合物是1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇，其具有下式
14.權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的維生素D化合物是1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇，其具有下式
15.權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的化合物是1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇，其具有下式
全文摘要
本發(fā)明提供了用于預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的維生素D化合物。也提供了預(yù)防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的方法，該方法施用有效量的維生素D化合物。
文檔編號(hào)A61P13/10GK1953752SQ200580013744
公開(kāi)日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
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