專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于粘膜接種疫苗的組合物和方法用于粘膜接種疫苗的組合物和方法
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)的注射接種疫苗的途徑一一例如，皮下的、肌內(nèi)的和靜脈內(nèi)的——主要涉及誘導(dǎo)全身的免疫性(血清抗體和T細(xì)胞)。然而這種方法可合適于抵抗由傳染劑導(dǎo)致的疾病(例如破傷風(fēng))，所述傳染劑通過(guò)被刺穿或損傷的皮膚而全身性地進(jìn)入身體，大部分病原體通過(guò)粘膜途徑，例如口腔粘膜、鼻粘膜或泌尿生殖器粘膜自然感染宿主?？勺⑸湟呙鐚?duì)于引發(fā)粘膜表面處的免疫性通常是無(wú)效的，這通常通過(guò)IgA和分泌性IgA(s-IgA)的產(chǎn)生和分泌而得，其中所述IgA和分泌性IgA經(jīng)常隨著各種不同的腺組織的分泌物一起被分泌入腸道、呼吸道和尿道的內(nèi)腔中。在這些分泌物中，s-IgA能與病原體結(jié)合，這允許免疫細(xì)胞在所述病原體開(kāi)始感染宿主細(xì)胞之前消除該病原體。因此，粘膜接種疫苗可實(shí)質(zhì)上降低病原體感染宿主細(xì)胞(即細(xì)胞感染)的可能性和，在一些情況下，甚至防止病原體感染宿主細(xì)胞。相反，注射的疫苗經(jīng)常應(yīng)答宿主細(xì)胞被病原體感染而釋放(例如，被感染細(xì)胞的溶胞)的抗原。因此粘膜接種疫苗和注射接種疫苗之間一個(gè)重要的區(qū)別是粘膜接種疫苗可刺激宿主的防御以限制或甚至防止細(xì)胞感染，而注射接種疫苗希望在感染疾病出現(xiàn)之前應(yīng)答于細(xì)胞感染的結(jié)果。由于粘膜疫苗能誘導(dǎo)s-IgA應(yīng)答，它們可能更有效地防止或限制粘膜感染。另外，粘膜疫苗還具有優(yōu)于注射疫苗的幾個(gè)其它優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括易于給藥、降低副作用、給藥是非侵入性的(例如不需要針)和不需要專(zhuān)業(yè)人員而可以幾乎無(wú)限頻次的加強(qiáng)免疫的效力。這些優(yōu)點(diǎn)可降低成本和增加接種疫苗的安全性并改善依從性，這些方面在發(fā)展中世界尤其重要。另外，在新型粘膜接種疫苗系統(tǒng)的設(shè)計(jì)上的改進(jìn)可允許對(duì)當(dāng)今難于控制的疾病開(kāi)發(fā)疫苗。另外，在一個(gè)粘膜位置上誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答可導(dǎo)致在不同粘膜位置上的免疫應(yīng)答。例如，鼻粘膜或口腔粘膜接種疫苗能導(dǎo)致從陰道粘膜分泌s-IgA和IgG。盡管通過(guò)粘膜途徑免疫具有重要優(yōu)點(diǎn)，但由于許多因素使用粘膜免疫的成功受到限制，所述因素包括例如，抗原的降解、受限制的吸收和與在粘膜位置上的非特異性宿主因素的相互作用、缺乏安全和有效的佐劑，以及不充分遞送系統(tǒng)的應(yīng)用。目前非常需要擴(kuò)展粘膜疫苗的應(yīng)用和功效。
發(fā)明內(nèi)容已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些小分子免疫應(yīng)答改進(jìn)劑(IRM)可用作適合于粘膜遞送的藥物組合物的組分。因此，本發(fā)明提供包含用于粘膜給藥而配制的IRM化合物和用于粘膜給藥而配制的抗原的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物和所述抗原可以在單一制劑中被提供，而在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物和所述抗原可以在分別的制劑中被提供。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供使對(duì)象免疫的方法。通常，該方法包括與IRM化合物組合，將抗原以有效的量給藥到對(duì)象的粘膜表面上，以產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答；和與所述抗原組合，將IRM化合物以有效的量給藥到對(duì)象的粘膜表面上，以產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)初始劑量的抗原，一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)劑量的抗原或IRM化合物，或者兩者。本發(fā)明的其它各種特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，參考如下詳述的描述、實(shí)施例、權(quán)利要求和附圖而變得易于明白。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)的幾個(gè)地方中，通過(guò)實(shí)施例的列舉提供指導(dǎo)。在每個(gè)例子中，所敘述的列舉僅用作代表性的組并且不應(yīng)被解釋為排他性的列舉。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1為流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，其顯示在接種疫苗后，在淋巴組織(NALT，圖1A;ILN，圖1B;CLN，圖1C;脾，圖1D)中抗原-特異性T細(xì)胞的增殖。圖2的數(shù)據(jù)顯示了在接種疫苗后，在淋巴組織中的抗原-特異性T細(xì)胞的總數(shù)(圖2A-2C)，并顯示在鼻粘膜中的抗原-特異性T細(xì)胞的百分比(圖2D)。圖3為流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，其說(shuō)明在接種疫苗后，抗原-特異性CD8+T細(xì)胞(圖3A)和CD4+T細(xì)胞(圖3B)的增殖。圖4的數(shù)據(jù)顯示了利用IRM和抗原的組合，對(duì)通過(guò)各種途徑免疫的肺灌洗IgA(圖.4A)、鼻腔灌洗IgA(圖4B)和血清IgG(圖4C)的抗體應(yīng)答。圖5的數(shù)據(jù)顯示了將抗原單獨(dú)或與各種IRM化合物一起通過(guò)鼻內(nèi)給藥，肺灌洗IgA(圖5A)和血清IgG2b(圖5B)的抗體應(yīng)答。圖6的數(shù)據(jù)顯示了在用抗原和其中一種IRM化合物免疫后，在DLN(圖6A)和脾(圖6B)中抗原-特異性T細(xì)胞。圖7的數(shù)據(jù)顯示了當(dāng)用抗原和IRM化合物通過(guò)不同途徑5個(gè)月分兩次免疫時(shí)，在DLN(圖7A)和NALT(圖7B)中抗原-特異性T細(xì)胞。本發(fā)明說(shuō)明性實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明免疫應(yīng)答改進(jìn)劑(IRM)為可具有免疫調(diào)節(jié)活性的效力的化合物。IRM通過(guò)已知為T(mén)oll-like受體(TLR)的基礎(chǔ)免疫體系機(jī)理而起作用以選擇性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的生物合成。例如，某些IRM化合物誘導(dǎo)某些細(xì)胞因子，例如I型干擾素、TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-IO、IL陽(yáng)12、MIP-1和/或MCP-1的生成和分泌。如另一個(gè)實(shí)例，某些IRM化合物可抑制某些Th2細(xì)胞因子，例如IL-4和IL-5的生成和分泌。另外，據(jù)說(shuō)一些IRM化合物抑制IL-I.和TNF(美國(guó)專(zhuān)利6，518，265)。某些IRM可用于治療很多不同疾病和癥狀，例如某些病毒疾病(例如，人乳頭狀瘤病毒、肝炎，皰疹)，某些瘤形成(例如基礎(chǔ)細(xì)胞癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、光化性角^S病、黑素瘤)和某些TH2介導(dǎo)的疾病(例如哮喘、過(guò)敏性鼻炎、遺傳性過(guò)敏癥皮炎)。本發(fā)明涉及可有效用作粘膜疫苗的組合藥物和包含將這種組合藥物給藥到粘膜表面的方法。通常，本發(fā)明的藥物組合物包括IRM化合物和抗原，每個(gè)都以適合于粘膜遞送的方式配制和每個(gè)的量為，與另一個(gè)組合時(shí)，可引起抵抗所述抗原的免疫應(yīng)答。粘膜接種疫苗的優(yōu)點(diǎn)很多，本發(fā)明的組合物和方法可提供一個(gè)或多個(gè)如下優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明組合物易于給藥而不需要針；2)粘膜接種疫苗可產(chǎn)生粘膜和全身性免疫應(yīng)答兩者，而注射疫苗通常只誘導(dǎo)全身性應(yīng)答。因?yàn)榇蟛糠植≡w在粘膜表面感染宿主，所以粘膜接種疫苗在病原體進(jìn)入的位置誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；和3)粘膜接種疫苗可在不同于接種疫苗位置的粘膜位置上誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。這種組合藥物的組分可被說(shuō)成是彼此"組合"而被遞送，如果該組分以允許細(xì)胞接觸一種組分的生物效果保持不變至少直至另一種組分與該細(xì)胞接觸的任何方式而被提供。因此，組分可與另一種組分組合而被遞送，即使它們以分別的制劑形式而被提供，通過(guò)不同的給藥途徑而被遞送，和/或在不同的時(shí)間給藥。例如，IRM化合物和抗原可被考慮為組合藥物，無(wú)論是否所述組分以單獨(dú)制劑的形式提供，還是所述抗原在一個(gè)制劑中給藥而所述IRM化合物在另一個(gè)制劑中給藥。當(dāng)以不同制劑給藥時(shí)，所述組分可以在不同時(shí)間給藥，如果需要，只是給藥以使得其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答比如果單獨(dú)給藥所述抗原或者單獨(dú)給藥所述IRM化合物而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答更大。在一些實(shí)施方案中，所述組合藥物可包括IRM/抗原共軛物，其中至少一個(gè)IRM部分共價(jià)結(jié)合于抗原。制備這種IRM/抗原共軛物的方法描述于，例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2004/0091491中。測(cè)量由粘膜疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法是測(cè)量在應(yīng)答所述抗原攻擊中抗原-特異性〔08+T細(xì)胞的增殖。這示于實(shí)施例l中。抗原-特異性CD8+T細(xì)胞被熒光標(biāo)記并過(guò)繼性地轉(zhuǎn)移到同源小鼠中。用IRM-抗原共軛物攻擊所述小鼠。4天后，取出來(lái)自不同位置的淋巴組織(鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)，子宮頸淋巴結(jié)(CL)和脾)并測(cè)量抗原-特異性CD8+T細(xì)胞的增殖。在得自每個(gè)位置的組織中，由鼻內(nèi)免疫產(chǎn)生的008+T細(xì)胞的增殖比由用IRM-抗原共軛物的靜脈內(nèi)免疫，或者用抗原或IRM的鼻內(nèi)免疫產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞的增殖更大(圖2A-2C)。同樣，在用IRM-抗原共軛物鼻內(nèi)免疫7天后，在鼻粘膜中觀(guān)察到的抗原-特異性CD8+T細(xì)胞的百分比，比用IRM-抗原共軛物的靜脈內(nèi)免疫、或者用抗原或IRM的鼻內(nèi)免疫之后觀(guān)察到的百分比更大(圖2D)。類(lèi)似的結(jié)果在使用非共軛IRM和抗原中也發(fā)現(xiàn)了(圖3A)。另一個(gè)測(cè)量通過(guò)粘膜接種疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法是測(cè)量在淋巴組織中，例如鼻相關(guān)淋巴組織中的抗原-特異性CD4+T細(xì)胞的增殖?；罨目乖?特異性CD4+T細(xì)胞，反過(guò)來(lái)剌激B細(xì)胞產(chǎn)生直接抵抗所述抗原的抗體(例如，s-IgA)。在實(shí)施例2中，抗原-特異性T細(xì)胞被過(guò)繼性地移植入宿主小鼠中。用IRM化合物和免疫原性抗原肽的組合攻擊所述小鼠。3天后，從所述小鼠上取出淋巴組織并分析抗原-特異性CD4+T細(xì)胞的增殖。結(jié)果示于圖3B中。用IRM和抗原進(jìn)行免疫的小鼠中的CD4+T細(xì)胞的增殖，比僅用抗原單獨(dú)進(jìn)行免疫的小鼠中的CD4+T細(xì)胞的增殖更大。因此，接種疫苗的粘膜途徑(例如鼻內(nèi))可在相關(guān)的組織位置上一一鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)和鼻粘膜上一一與非粘膜遞送(靜脈內(nèi)的)或者9用單獨(dú)抗原或單獨(dú)IRM的粘膜遞送相比,提供更大的抗原-特異性CD8+丁細(xì)胞和/和。04+T細(xì)胞的數(shù)量。在粘膜處抗原-特異性T細(xì)胞種群的增殖說(shuō)明免疫細(xì)胞在那些位置的活化和可防止感染的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。當(dāng)抗原-特異性CD8+T細(xì)胞和抗原-特異性CD4+T細(xì)胞兩者都被激活時(shí)，可產(chǎn)生抗原-特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和抗原特異性抗體的免疫應(yīng)答兩者。所述抗原可包括產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答的任何材料。適合的抗原材料包括但不限于蛋白質(zhì)；肽；多肽；脂質(zhì)；糖脂；多糖；糖類(lèi)；多核苷酸；朊病毒；活性或非活性細(xì)菌、病毒或真菌；以及細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物、腫瘤衍生的或生物衍生的免疫原、毒素或類(lèi)毒素。另外，如本文中所用的，抗原可包括不必然導(dǎo)致粘膜免疫應(yīng)答自身，但能在宿主細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生抗原蛋白、肽或多肽的寡核苷酸序列。這種寡核苷酸用于，例如，DNA疫苗。在一些實(shí)施方案中，所述抗原可包括兩種或更多種抗原材料的組合。包含IRM和抗原的組合物，所述IRM和抗原每個(gè)均用于粘膜給藥而配制，可用這種組合物的病癥包括但不限于a)病毒性疾病，例如，由如下病毒感染產(chǎn)生的疾病腺病毒、皰疹病毒(例如HSV-I、HSV-II、CMV或VZV)、痘病毒(例如正痘病毒，如天花或牛痘，或者傳染性軟疣)、細(xì)小核糖核酸病毒(例如鼻病毒或腸病毒)、正粘液病毒(例如，流感病毒)、副粘液病毒(例如，副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒(RSV))、冠狀病毒(例如，SARS)、乳多空病毒(例如，乳頭瘤病毒，如導(dǎo)致尖銳濕疣、尋常疣或跖疣的那些)、肝DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒)、黃熱病病毒(例如，丙型肝炎病毒或登革熱病毒)或逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(例如，慢病毒，如HIV);b)細(xì)菌性疾病，例如，由如下列舉的細(xì)菌感染導(dǎo)致的疾病埃希氏菌屬、腸桿菌屬、沙門(mén)氏菌屬、葡萄狀球菌屬、志賀菌屬、李斯特菌屬、氣桿菌屬、螺旋桿菌屬、克雷白桿菌屬、變形菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、衣原體、支原體、肺炎球菌、奈瑟球菌屬、梭菌屬、桿菌屬、棒狀桿菌、分支桿菌屬、彎曲桿菌屬、弧菌屬、沙雷氏菌屬、普羅威登斯菌屬、色桿菌屬、布魯氏菌、耶爾森氏菌屬、嗜血桿菌屬或博代氏菌屬；c)其它感染性疾病，例如衣原體，真菌疾病包括但不限于念珠菌病，曲霉病，組織胞漿菌病，隱球菌腦膜炎或寄生物病包括但不限于癥疾，卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎，利什曼病，隱孢子蟲(chóng)病，弓形體病和錐體蟲(chóng)感染；和d)TH2介導(dǎo)的遺傳性過(guò)敏癥疾病，例如遺傳性過(guò)敏性皮炎或濕疹，嗜酸細(xì)胞增多，哮喘，過(guò)敏癥，過(guò)敏性鼻炎和Ommen氏綜合癥。例如，粘膜給藥組合物可用于預(yù)防或治療性防止如下疾病例如BCG、霍亂、瘟疫、傷寒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、A型流感、B型流感、副流感、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、黃熱病、破傷風(fēng)、白喉、嗜血桿菌b型流感、肺結(jié)核、腦膜炎球菌和肺炎球菌疫苗、腺病毒、HIV、水痘、巨細(xì)胞病毒、登革熱、貓白血病、雞瘟、HSV-1和HSV-2、豬瘟、乙型腦炎、呼吸道合胞病毒、輪狀病毒、乳頭狀瘤病毒和阿茲海默癥。在一些情況下，粘膜接種疫苗可用于降低穿過(guò)粘膜表面感染的可能性或者甚至防止穿過(guò)粘膜表面的感染。在另一些情況下，粘膜疫苗可用于刺激血清抗體應(yīng)答。在一些情況下，粘膜疫苗可提供防止粘膜感染和血清抗體應(yīng)答兩者。因此，粘膜接種疫苗可用于抵抗不典型的通過(guò)粘膜表面而進(jìn)行感染的病原體的接種疫苗。在一些實(shí)施方案中，所述抗原，可在給藥所述抗原-IRM組合之前，給藥以一個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的"引發(fā)"劑量。以此方式引發(fā)，在給藥抗原-IRM組合時(shí)，可提供增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。在另一些實(shí)施方案中，所述抗原，可在給藥所述抗原-IRM組合之后，給藥以一個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的"加強(qiáng)"劑量。此方式加強(qiáng)，可通過(guò)激活CD8+記憶T細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞或兩者而重新激活至少部分消退的免疫應(yīng)答。在又一些實(shí)施方案中，可在給藥抗原-IRM組合之后，將IRM化合物以一個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的加強(qiáng)劑量給藥。以加強(qiáng)劑量提供的IRM化合物可以相同或不同于在所述抗原-IRM組合中提供的IRM化合物，并且可以相同或不同于在任何其它加強(qiáng)劑量中提供的IRM化合物。另外，IRM化合物的任何組合都是可用的，無(wú)論作為抗原-IRM組合的組分還是作為加強(qiáng)劑。許多IRM化合物是有機(jī)小分子咪唑并喹啉胺衍生物(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利4，689,338)，但很多其它類(lèi)化合物也同樣已知(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,446,153、6，194，425和6,110，929)并且更多的化合物還正在被研發(fā)。其它的IRM具有較高的分子量，例如寡核苷酸，包括CpGs(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,194,388)。一些IRM是有機(jī)小分子(例如，與生物大分子，例如蛋白質(zhì)、肽等相反，分子量在約IOOO道爾頓以下，優(yōu)選在約500道爾頓以下)，例如在如下文獻(xiàn)中公開(kāi)的那些例如美國(guó)專(zhuān)利4，689，338;4,929,624;5,266,5755,482,9366，451，8106，656，9386,667,3126,756，3825，268，3765，756，7476,525,0646,660,7356,670,372;5，346，卯55,352,784;;6,110，9296,194,425;;6，541，4856'545，016;;6,660,7476,664,260;;6,677,3476,677,348;5,389,640;5，446,1536,331,539;6，376，6696,545,017;6，573，2736,664,264;6,664,2656,677，349;6,683,0886，797，718和6,818,650;美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2004/00914912004/0147543和2004/0176367;和國(guó)際公開(kāi)WO2005/18551、WO2005/18556和WO2005/20999。小分子IRM的另外的例子包括一些嘌呤衍生物(例如，在美國(guó)專(zhuān)利6,376,501和6,028,076中描述的那些)、一些咪唑并喹啉酰胺衍生物(例如描述于美國(guó)專(zhuān)利6，069，149中的那些)、一些咪唑并吡啶衍生物(例如，描述于美國(guó)專(zhuān)利6，518，265中的那些)、一些苯并咪唑衍生物(例如，描述于美國(guó)專(zhuān)利6,387,938中的那些)、一些稠合于五員含氮雜環(huán)的4-氨基嘧啶衍生物(例如，描述于美國(guó)專(zhuān)利6,376,501、6,028,076禾口6,329,381中和在WO02/0S905中的腺嘌呤衍生物)和一些3-]S-D-核糖呋喃基噻唑并[4，5-d]嘧啶衍生物(例如，描述于美國(guó)公開(kāi)2003/0199461中的那些)。其它IRM包括生物大分子，例如寡核苷酸序列。一些IRM寡核苷酸序列包含胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸(CpG)并被描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,194,388;6,207,646;6，239，116;6,339，068禾B6,406,705中。一些含CpG的寡核苷酸可包括合成的免疫調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基序，例如描述于美國(guó)專(zhuān)利6，426，334和6,476,000中的那些。其它的IRM核苷序列沒(méi)有CpG序列并被描述于例如國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO00/75304。其它IRM包括生物分子，例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，并被描述于美國(guó)專(zhuān)利6,113,918;6，303，347;6,525,028禾B6,649,172中。適合用于本發(fā)明的IRM化合物包括具有稠合于五員含氮雜環(huán)的2-氨基吡啶的化合物，這些化合物包括例如，咪唑并喹啉胺，包括但不限于取代的咪唑并喹啉胺，例如酰胺取代的咪唑并喹啉胺，磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺，脲取代的咪唑并喹啉胺，芳基醚取代的咪唑并喹啉胺，雜環(huán)醚取代的咪唑并喹啉胺，氨基醚取代的咪唑并喹啉胺，氨磺?；讶〈倪溥虿⑧?，脲取代的咪唑并喹啉醚，硫醚取代的咪唑并喹啉胺，羥胺取代的咪唑并喹啉胺，肟取代的咪唑并喹啉胺，6_、7-、8-或9-芳基、雜芳基、芳氧基或芳基烯氧取代的咪唑并喹啉胺和咪唑并喹啉二胺；四氫咪唑并喹啉胺，包括但不限于酰胺取代的四氫瞇唑并喹啉胺，磺酰胺取代的四氫咪唑并喹啉胺，脲取代的四氫咪唑并喹啉胺，芳基醚取代的四氫咪唑并喹啉胺，雜環(huán)醚取代的四氫咪唑并喹啉胺，氨基醚取代的四氫咪唑并喹啉胺，氨磺?；讶〈乃?3氫咪唑并喹啉胺，脲取代的四氫咪唑并喹啉醚，硫醚取代的四氫咪唑并喹啉胺，羥胺取代的四氫咪唑并喹啉胺，肟取代的四氫咪唑并喹啉胺和四氫咪唑并喹啉二胺；咪唑并吡啶胺，包括但不限于酰胺取代的咪唑并吡啶胺，磺酰胺取代的咪唑并吡啶胺，脲取代的咪唑并吡啶胺，芳基醚取代的咪唑并吡啶胺，雜環(huán)醚取代的咪唑并吡啶胺，氨基醚取代的咪唑并吡啶胺，氨磺?；讶〈倪溥虿⑦拎ぐ?，脲取代的咪唑并吡啶醚和硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1,2-橋接咪唑并喹啉胺；6，7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶胺；四氫咪唑并萘啶胺；噁唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；噁唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；噁唑并萘啶胺；噻唑并萘啶胺；吡唑并吡啶胺；吡唑并喹啉胺、四氫吡唑并喹啉胺；吡唑并萘啶胺、四氫吡唑并萘啶胺；和稠合于吡啶胺、喹啉胺、四氫喹啉胺、萘啶胺或四氫萘啶胺的1H-咪唑二聚物。在一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是咪唑并萘啶胺、四氫咪唑并萘啶胺、噁唑并喹啉胺、噻唑并喹啉胺、噁唑并吡啶胺、噻唑并吡啶胺、噁唑并萘啶胺、噻唑并萘啶胺、吡唑并吡啶胺、吡唑并喹啉胺、四氫吡唑并喹啉胺、吡唑并萘啶胺或四氫吡唑并萘啶胺。在一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是取代的咪唑并喹啉胺、四氫咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、1，2-橋接咪唑并喹啉胺、6,7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并萘啶胺、四氫咪唑并萘啶胺、噁唑并喹啉胺、噻唑并喹啉胺、噁唑并吡啶胺、噻唑并吡啶胺、噁唑并萘啶胺、噻唑并萘卩定胺、吡唑并吡啶胺、吡唑并喹啉胺、四氫吡唑并喹啉胺、吡唑并萘啶胺或四氫吡唑并萘啶胺。如本文中所用的，取代的咪唑并喹啉胺指酰胺取代的咪唑并喹啉胺，磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺，脲取代的咪唑并喹啉胺，芳基醚取代的咪唑并喹啉胺，雜環(huán)醚取代的咪唑并喹啉胺，氨基醚取代的咪唑并喹啉胺，氨磺?；讶〈倪溥虿⑧罚迦〈倪溥虿⑧?，硫醚取代的咪唑并喹啉胺，羥基胺取代的咪唑并喹啉胺，肟取代的咪唑并喹啉胺，6-、7-、8-或9-芳基、雜芳基、芳氧基或芳烯氧基取代的咪唑并喹啉胺或咪唑并喹啉二胺。如本文中所用的，取代的咪唑并喹啉胺特別和明確排除l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺和4-氨基-a，o;-二甲基-2-乙氧基甲基-m-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-乙醇。適合的IRM化合物還可包括上述的嘌呤衍生物，咪唑并喹啉酰胺衍生物，苯并咪唑衍生物，腺嘌呤衍生物，氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯和寡核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述的IRM化合物可以是酰胺取代的咪唑并喹啉胺，例如，l-(2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺或！^-[6-({2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基>111-咪唑并[4，5-(0喹啉-1-基]-1，1-二甲基乙基}氨基)-6-氧己基]-4-疊氮基-2-羥基苯甲酰胺。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是噻唑并喹啉胺，例如2-丁基噻唑并[4，5-c]喹啉-4-胺。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是咪唑并喹啉胺，例如4-氨基-a，a-二甲基-2-乙氧基甲基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-乙醇。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是酰胺取代的咪唑并喹啉胺，例如N-P-[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-7-基氧基]丙基}煙酰胺。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺，例如3-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-111-咪唑并[4,5-(:]喹啉-1-基]-N，2，2-三甲基丙烷-l-磺酰胺。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是硫醚取代的咪唑并喹啉胺，例如2-丁基-l-(2-甲基-2-[2-(甲磺?；?乙氧基]丙基卜lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是吡唑并喹啉胺，例如2-丁基-l-[2-(丙磺?；?乙基]-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-4-胺。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是芳基烯氧基取代的咪唑并喹啉胺，例如1-{4-氨基-2-乙氧基甲基-7-[3-(吡啶-3-基)丙氧基〗-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-基卜2-甲基丙-2-醇。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是脲取代的咪唑并吡啶胺，例如N"2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-6,7-二甲基-lH-咪唑并[4，5-c]吡啶-l-基]-l,l-二甲基乙基l-N'-環(huán)己基脲。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺，例如仆[2-(4-氨基-2-丁基-1^1-咪唑并[4，5-(:]喹啉-1-基)-1，1-二甲基乙基]甲垸磺酰胺。在又一些實(shí)施方案中，所述的IRM化合物可以是酰胺取代的咪唑并喹啉胺，例如，N-{2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-基]-l，l-二甲基乙基}環(huán)己烷甲酰胺。除非另外明確說(shuō)明，化合物可包括以任何藥學(xué)可接受的形式的化合物，包括所有的異構(gòu)體(例如，非對(duì)映異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體)、鹽、溶劑化物、多晶型物等等。特別是，如果化合物是光學(xué)活性的，該化合物可包括每個(gè)化合物的對(duì)映異構(gòu)體以及該對(duì)映異構(gòu)體的外消旋混合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是至少一種TLR的激動(dòng)劑，優(yōu)選是TLR6、TLR7和TLR8的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以是TLRS選擇性激動(dòng)劑。在另一些實(shí)施16方案中，所述IRM化合物可以是TLR7選擇性激動(dòng)劑。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)"TLR8選擇性激動(dòng)劑"指充當(dāng)TLR8激動(dòng)劑，但不充當(dāng)TLR7激動(dòng)劑的所有化合物。"TLR7選擇性激動(dòng)劑"指充當(dāng)TLR7激動(dòng)劑，但不充當(dāng)TLR8激動(dòng)劑的化合物。"TLR7/8激動(dòng)劑"指充當(dāng)TLR7和TLR8兩者的激動(dòng)劑的化合物。TLR8選擇性激動(dòng)劑或TLR7選擇性激動(dòng)劑可以充當(dāng)用于所指TLR和一種或多種TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9或TLR10的激動(dòng)劑。因此，盡管"TLR8選擇性激動(dòng)劑"可以指充當(dāng)TLR8而不是其它的TLR的激動(dòng)劑，但它可以另外指充當(dāng)TLR8和，例如，TLR6的激動(dòng)劑的化合物。類(lèi)似的，"TLR7選擇性激動(dòng)劑"可以指充當(dāng)TLR7，而不是其它TLR的激動(dòng)劑，但它可以另外指充當(dāng)TLR7和，例如，TLR6的激動(dòng)劑的化合物。具體化合物的TLR激動(dòng)作用可以以任何適合的方式評(píng)估。例如，用于檢測(cè)測(cè)試化合物的TLR激動(dòng)作用的試驗(yàn)被描述于，例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)US2004/0132079，并且在例如國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO04/053057中描述了適合用于這個(gè)試驗(yàn)的重組細(xì)胞系。不考慮所用的具體試驗(yàn)，如果用化合物進(jìn)行的試驗(yàn)至少導(dǎo)致由特定TLR介導(dǎo)的一些生物活性的閾值增加，那么化合物可以被認(rèn)為是特定TLR的激動(dòng)劑。相反，如果當(dāng)被用于進(jìn)行設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)由特定TLR介導(dǎo)的生物活性試驗(yàn)時(shí)，該化合物沒(méi)有引出所述生物活性的閾值增加，則化合物被認(rèn)為不作為特定TLR的激動(dòng)劑。除非另外明確說(shuō)明，生物活性增加指同樣的生物活性，超過(guò)在合適對(duì)照中觀(guān)察到的活性的增加。可以與適合的對(duì)照結(jié)合或不結(jié)合而進(jìn)行試驗(yàn)。利用經(jīng)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以具有對(duì)特定試驗(yàn)足夠的熟悉程度(例如在特定的試驗(yàn)條件下在合適的對(duì)照中觀(guān)察到的數(shù)值范圍)，以使得不必總是進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)以確定在特定試驗(yàn)中化合物的TLR激動(dòng)作用。TLR介導(dǎo)的生物活性的精確的閾值增加，在給定的試驗(yàn)中用于確定是否特定的化合物是或不是特定TLR的激動(dòng)劑，可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的因素變化，所述因素包括但不限于作為試驗(yàn)終點(diǎn)而觀(guān)察到的生物活性，用于測(cè)量和確定試驗(yàn)終點(diǎn)的方法，試驗(yàn)的信噪比、試驗(yàn)的精度和同樣的試驗(yàn)是否被同時(shí)用于確定化合物對(duì)于兩種TLR的激動(dòng)作用。因此，對(duì)于所有可能的試驗(yàn)，通常提出TLR介導(dǎo)的生物活性的閾值增加是不實(shí)際的，所述增加對(duì)確定化合物作為特定TLR的激動(dòng)劑或非激動(dòng)劑是必需的。然而，那些本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員利用應(yīng)當(dāng)考慮的所述因素可容易地確定合適的閾值。用可表達(dá)的TLR結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，采用該細(xì)胞的試驗(yàn)可用一個(gè)閾值用于確定化合物是轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中的TLR的激動(dòng)劑，所述閾值例如，當(dāng)在一定濃度，例如約lpM至約10pM，提供所述化合物時(shí)，至少三倍增加TLR介導(dǎo)的生物活性(例如，NFkB活化)。然而，不同的閾值和/或不同的濃度范圍也許只在某些情況適合。同樣，不同的閾值可能只適合于不同的試驗(yàn)。以引發(fā)劑量或加強(qiáng)劑量提供的抗原-IRM組合物的組分，以及抗原或IRM，可以在適合于對(duì)對(duì)象粘膜給藥的任何制劑中被提供。合適類(lèi)型的制劑描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利5，939，090、美國(guó)專(zhuān)利6，365，166、美國(guó)專(zhuān)利6，245，776和美國(guó)專(zhuān)利6,486,168中。所述化合物——無(wú)論抗原或IRM化合物一一可以以任何適合的形式而被提供，所述形式包括但不限于溶液、懸浮液、乳液或任何混合形式。所述化合物可與所有藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或媒介物一起以制劑遞送。另外，抗原-IRM組合中的IRM組分和抗原組分可以在單一制劑中一起被提供，或者在分開(kāi)的制劑中被提供。制劑可以以任何合適的劑型被遞送，所述劑型例如，乳膏、軟膏、氣溶膠制劑、非氣溶膠噴劑、凝膠劑、洗劑等等。所述制劑可進(jìn)一步包括一種和多種添加劑，包括但不限于佐劑、促滲劑、著色劑、香味劑、調(diào)味劑、潤(rùn)濕劑、增稠劑等等。制劑可被給藥到對(duì)象的任何適合的粘膜表面，例如，口腔粘膜、鼻粘膜或泌尿生殖器粘膜。適合于粘膜接種疫苗的制劑的組合物將根據(jù)本領(lǐng)域已知的因素而改變，所述因素包括但不限于所述一種或多種組分(即，IRM化合物禾口/或抗原)的物理和化學(xué)性質(zhì)，載體的性質(zhì)、計(jì)劃的服藥方案，對(duì)象免疫系統(tǒng)的狀態(tài)(例如，抑制、折衷、刺激)，一種或多種組分的給藥方法，以及將所述制劑給藥的物種。因此，對(duì)于所用可能應(yīng)用，通常提出有效用于粘膜接種疫苗制劑的組合物是不實(shí)際的。然而，那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用應(yīng)當(dāng)考慮的所述因素可容易地確定合適的制劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括向?qū)ο笠灾苿┬问浇o藥IRM，所述制劑含例如約0.0001%至約10%(除非另外明確說(shuō)明，本文中提供的所有百分比均為總制劑的重量/重量)的IRM，盡管在一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以采用提供超過(guò)這個(gè)范圍外的濃度的TRM化合物的制劑給藥。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向?qū)ο蠼o藥制劑，所述制劑包括至少約0.01%IRM化合物、至少約0.03%IRM化合物或至少約0.1XIRM化合物。在另一些實(shí)施方案中，所述方法包括向?qū)ο蠼o藥制劑，所述制劑包括最大至約5XIRM化合物、最大至約1。％IRM化合物或最大至約0.5XIRM化合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述方法包括以一種制劑給藥IRM化合物，所述制劑包括至少約0.1XIRM化合物，最大至約5%IRM的化合物。在一些實(shí)施方案中，制劑可以被給藥到粘膜表面上，所述粘膜表面為典型的感染位置或特定病原體感染的預(yù)計(jì)的位置。例如，粘膜疫苗或粘膜疫苗的組分可以被給藥到鼻粘膜上以接種抵抗呼吸病原體(例如，流感病毒)?；蛘撸苿┛梢员唤o藥到一個(gè)粘膜表面以誘導(dǎo)在遠(yuǎn)離粘膜位置上的免疫應(yīng)答。例如，制劑可以給藥到鼻粘膜或口腔粘膜上，以接種抵抗通過(guò)例如陰道粘膜感染的病原體(例如，皰疹病毒)。對(duì)于粘膜接種疫苗，IRM化合物的有效量為與由給藥不含IRM化合物的抗原而引起的免疫應(yīng)答相比，對(duì)組合中的抗原足以增加免疫應(yīng)答的量。在粘膜疫苗中給藥的IRM化合物的準(zhǔn)確的量將根據(jù)本領(lǐng)域已知的因素改變，所述因素包括但不限于所述IRM化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)、載體的性質(zhì)、計(jì)劃的服藥方案，對(duì)象免疫系統(tǒng)的狀態(tài)(例如，抑制、折衷、刺激)、所述IRM化合物的給藥方法，和將所述粘膜疫苗給藥的物種。因此，對(duì)于所用可能應(yīng)用，通常提出構(gòu)成有效用于粘膜接種疫苗的IRM化合物的量的量是不實(shí)際的。那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用應(yīng)當(dāng)考慮的所述因素可容易地確定合適的量。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括給藥足夠的IRM化合物以向?qū)ο筇峁﹦┝?，例如約100ng/kg至約50mg/kg，盡管在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)以超出該范圍的劑量給藥IRM化合物而進(jìn)行所述方法。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述方法包括給藥足夠的IRM化合物以向?qū)ο筇峁﹦┝浚s10pg/kg至約5mg/kg，例如，約3.75mg/kg的劑量。所述的服藥方案可至少部分依賴(lài)于本領(lǐng)域已知的許多因素，包括但不限于，所述IRM化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)、載體的性質(zhì)、被給藥的IRM的量、對(duì)象免疫系統(tǒng)的狀態(tài)(例如，抑制、折衷、刺激)、所述IRM化合物的給藥方法，和將所述粘膜疫苗給藥的物種。因此，對(duì)于所有可能應(yīng)用，通常設(shè)定有效用于粘膜接種疫苗的服藥方案是不實(shí)際的。那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用應(yīng)當(dāng)考慮的所述因素可容易地確定合適的服藥方案。在一些實(shí)施方案中，所述IRM化合物可以，例如，在設(shè)定的時(shí)間期限內(nèi)(例如，每天，每星期等)一次或多次劑量給藥。在一些實(shí)施方案中，可以將所述IRM化合物只給藥一次。在另一些實(shí)施方案中，所述IRM可以約每10年1次到每天多次給藥。例如，可以將所述的IRM化合物給藥至少每10年1次，至少每5年一次，或者至少每2年1次。在另一些實(shí)施方案中，可以將所述IRM化合物給藥至少每年1次，至20少每6個(gè)月l次，至少每個(gè)月l次，至少每星期一次或至少每天一次。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將所述的IRM化合物給藥約每星期1次至約每年一次。本發(fā)明的方法可在任何合適的對(duì)象身上進(jìn)行。合適的對(duì)象包括但不限于動(dòng)物，例如但不限于人、非人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、犬、貓、馬、豬、綿羊、山羊或牛。實(shí)施例選擇下述的實(shí)施例僅僅為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的特征、優(yōu)點(diǎn)和其它細(xì)節(jié)。然而，應(yīng)當(dāng)清楚理解的是盡管這些實(shí)施例用于這個(gè)目的，但所用的具體的材料和量以及其它條件和細(xì)節(jié)不必解釋成過(guò)度的限制本發(fā)明的范圍。用于所述實(shí)施例中的IRM化合物示于表1中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>弁該化合物不是特定的實(shí)施例，但利用公開(kāi)于引用文獻(xiàn)的合成方法可容易地合成。實(shí)施例1如下制備卵白蛋白-IRMl共軛物。將IRM1懸浮于二甲基亞砜(DMSO)中形成10mg/ml。將卵白蛋白懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中形成10mg/ml，并通過(guò)加入NaOH將pH調(diào)整至〉10.0。將500^1的該卵白蛋白溶液(5mg卵白蛋白)與100pl的IRM1溶液(lmgIRM1)混合于12-孔組織培養(yǎng)板的一個(gè)孔中。將該板放置于冰上，并將長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光源放置在該板的正上方，與含有所述IRMl/卵白蛋白混合物的孔盡可能近。照射所述混合物15分鐘。形成的共軛物從孔中移出并懸浮于PBS中以形成卵白蛋白為5mg/mL、IRM1為0.5mg/mL的最終濃度，并對(duì)PBS中透析以除去所有未共軛的IRM。將雞卵白蛋白-特異性CD8+T細(xì)胞(OT-I，TheJacksonLaboratories,BarHarbor，ME)用以固定方式染色細(xì)胞的熒光染料，羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE,MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR)標(biāo)記，然后過(guò)繼性地轉(zhuǎn)移到同源C57BL/6小鼠中(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)。然后將受體小鼠在第O天用100微克(pg)的卵白蛋白-IRMl共軛物通過(guò)鼻內(nèi)(IN)或者通過(guò)靜脈內(nèi)(IV)免疫。在第4天，將該小鼠處死并取出鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)、腹股溝淋巴結(jié)(ILN)、子宮頸淋巴結(jié)(CLN)和脾(Spl)。將從小鼠上采集的每個(gè)組織穿過(guò)100/mi尼龍篩(BDBiosciences,Bedford,MA)，離心并再次懸浮于流式細(xì)胞術(shù)染色緩沖液(BiosourceInternational,Inc.，Rockville，Md)中。然后將細(xì)胞用CD8國(guó)cych腿e(BDPharmigen，SanDiego，CA)和SIINFEKL/Kb四聚體-phycoerytherine(BeckmanCoulter,Inc.,Fullerton，CA)抗體標(biāo)記。然后將細(xì)胞在FACSCaliber(Becton，Dickinson,andCo.，SanJose，CA)上運(yùn)行，并且分析CD8+SIINFEKL/Kb四聚體+T細(xì)胞的CFSE表達(dá)。結(jié)果示于圖1中，如下NALT在圖1A中，ILN在圖IB中，CLN在圖1C中和脾在圖1D中?？乖cIRM—起鼻內(nèi)遞送導(dǎo)致在所有的位置上有效地激活細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞，如通過(guò)CFSE的累進(jìn)損失而表明的那樣。另外，在第7天計(jì)數(shù)在鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)中、子宮頸淋巴結(jié)(CLN)中和脾中的總OT-I細(xì)胞數(shù)。OT-I細(xì)胞數(shù)量通過(guò)計(jì)數(shù)總淋巴細(xì)胞(臺(tái)盼藍(lán)排阻)和與0T-I+CD8+的百分比(流式細(xì)胞術(shù)分析灘乘而確定。另外，在鼻粘膜中的OT-I細(xì)胞的百分比在第7天確定。結(jié)果示于圖2中，如下NALT在圖2A中；CLN在圖2B中；脾在圖2C中和鼻粘膜在圖2D中。抗原加上IRM1的鼻內(nèi)遞送在第7天，在所有被檢驗(yàn)的淋巴組織中，比靜脈遞送產(chǎn)生更多的總OT-I細(xì)胞數(shù)量。IRM1加上抗原的鼻內(nèi)遞送在第7天也產(chǎn)生了比單獨(dú)抗原更大的總OT-I細(xì)胞數(shù)量，這說(shuō)明了通過(guò)這個(gè)途徑IRM在增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞活化上引人注目的效果。另外，接種疫苗的鼻內(nèi)途徑在相關(guān)的組織位置上一一鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)和鼻粘膜上——產(chǎn)生較大量的OT-I細(xì)胞。實(shí)施例2將得自O(shè)T-I小鼠(TheJacksonLaboratories,BarHarbor,ME)的CD8+T細(xì)胞過(guò)繼地轉(zhuǎn)移到C57BL/6小鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)中。將得自DO.l1TCR小鼠(TheJacksonLaboratories,BarHarbor,ME)的CD4+T細(xì)胞過(guò)繼性地轉(zhuǎn)移到Balb/c小鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)中。然后將這些小鼠在第O天鼻內(nèi)免疫，如下將OT-I轉(zhuǎn)移的C57BL/6小鼠用每只小鼠100pg全雞卵白蛋白免疫，或者與(IRMS+Ag，75/xgIRMW鼠)或不與(單獨(dú)的Ag)IRM2一起免疫；將DO.ll轉(zhuǎn)移的Balb/c小鼠用每只鼠100/ig的OVA肽(ISQAVHAAHAEINEAGR)免疫，或者與(IRM2+Ag，75pgIRM2/鼠)或不與(單獨(dú)的Ag)IRM2—起免疫。在第3天，取出鼻相關(guān)淋巴組織，并且確定每個(gè)細(xì)胞種群相對(duì)單獨(dú)的PBS的增殖倍數(shù)。CD8+OT-I細(xì)胞用SIINFEKL/Kb四聚體檢測(cè)，并且CD4+D0.11用克隆型抗體(CaltagLaboratories,Burlingame，CA)檢測(cè)，并采用FACSCaliber(Becton，Dickinson,SanJose,CA)進(jìn)行分析。結(jié)果示于圖3中，如下CD8+OT-I的增殖示于圖3A中；CD4+DO.11的增殖示于圖3B中。IRM/抗原組合的鼻內(nèi)免疫誘導(dǎo)了CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞兩者的增殖，其達(dá)到比用單獨(dú)的抗原在鼻內(nèi)免疫更大的程度。實(shí)施例3將Balb/c小鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)用50/xg的全雞卵白蛋白(OVA)蛋白質(zhì)(Sigma-Aldrich，St丄ouis，MO)與50/xg的IRM4的磷酸鹽緩沖液(PBS)—起通過(guò)不同途徑處理。通過(guò)用生物珠(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA，Cat弁152-3920)洗滌OVA以清除內(nèi)毒素而制備干凈的卵白蛋白蛋白質(zhì)，然后將干凈的卵白蛋白蛋白質(zhì)重新懸浮于磷酸緩沖鹽(PBS)中。用OVA和IRM4通過(guò)如下方式處理小鼠皮下(SC)注射、靜脈內(nèi)(IV)注射、肌內(nèi)(IM)注射、皮內(nèi)(ID)注射、鼻內(nèi)滴注(IN)、皮內(nèi)OVA注射，其中直接在OVA注射位置上典型地給藥10/xlIRM4膏劑(ID+Top.)，或者不處理(什么都沒(méi)有)。在第21天處死小鼠，通過(guò)氣管施用lmL的PBS進(jìn)行肺和鼻的灌洗，并且通過(guò)心臟穿刺和離心以除去細(xì)胞而獲得血清。收集血清用來(lái)分析。通過(guò)ELISA測(cè)量灌洗樣本的OVA特異性IgA。通過(guò)ELISA測(cè)量血清樣本的OVA特異性IgG2a。通過(guò)用100/xI/孔20/xg/ml卵白蛋白的PBS溶液涂覆CostarEIR/RIA96孔板(Cat弁3590，Corning,Inc.,Corning,NY)并在37。C下培養(yǎng)一到兩小時(shí)或在4"C下培養(yǎng)過(guò)夜而進(jìn)行所述OVA特異性抗體ELISA。然后將板用0.5%的吐溫-20的PBS溶液(洗滌緩沖液)洗滌一次。將200/^1/孔的1XBSA的PBS溶液放置于孔中，然后在37匸下培養(yǎng)一到兩小時(shí)或在4匸下培養(yǎng)過(guò)夜。接著用洗滌緩沖液洗滌兩次。在垂直于板方向(acrosstheplate)以未稀釋的灌洗樣本開(kāi)始三倍系列稀釋?zhuān)蛘咭匝鍢颖镜?:10稀釋液開(kāi)始20倍系列稀釋在0.2XBSA、0.05%吐溫-20的PBS(稀釋緩沖液)中，并且在4'C下培養(yǎng)過(guò)夜。然后用洗滌緩沖液洗滌該板4次。將100/d/孔以稀釋緩沖液1:2000稀釋的羊抗鼠IgG2a(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.,Birmingham,AL)或羊抗鼠IgA(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.)放置于孔中并在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。然后將板用洗滌緩沖液洗滌4次，用100/d/孔的穩(wěn)定化的chromagen(Cat弁SB02，BiosourceInternational,Camarillo，CA)填充，培養(yǎng)少于5分鐘，然后加入50/!l/孔的終止溶液(Cat弁SS02,BiosourceInternational)。在分光光度計(jì)上在OD490處讀板。結(jié)果示于圖4中。在肺(圖4A)和鼻(圖4B)粘膜中只有IRM/抗原組合的鼻內(nèi)給藥產(chǎn)生強(qiáng)烈的IgA應(yīng)答。所有的給藥途徑，包括鼻內(nèi)給藥，在血中產(chǎn)生強(qiáng)烈的IgG2a應(yīng)答。實(shí)施例4在第0天和第7天將Balb/c小鼠(charlesRiversLabcratorics)用35pg的OVA單獨(dú)或與14pg的IRM3，IRM4，IRM5，IRM6，IRM7，IRM8，IRM9，IRM10，IRM11或IRM12的PBS組合進(jìn)行鼻內(nèi)免疫。在第14天，處死小鼠，如實(shí)施例3中所述的那樣進(jìn)行肺灌洗和血清收集。如實(shí)施例3中所述的那樣分別分析肺灌洗和血清樣本的OVA特異性IgA禾口IgG2b(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.)結(jié)果示于圖5中。所有測(cè)試的IRM化合物的IRM/抗原的組合提供比單獨(dú)抗原更大的IgA(圖5A)和IgG2b(圖5B)應(yīng)答。實(shí)施例5得自GFP+/OT-I+C57BL6小鼠的淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞被過(guò)繼性地轉(zhuǎn)移到C57BL6小鼠中。在過(guò)繼性轉(zhuǎn)移后l天，小鼠用35/xg的卵白蛋白單獨(dú)或與14pig的IRM3，IRM4,IRM5，IRM6，IRM7，IRM8，IRM9，IRMIO，IRM11或IRM12的檸檬酸鹽緩沖液(CBS)組合進(jìn)行鼻內(nèi)免疫。4天后，處死小鼠并取出瀝干的淋巴結(jié)(DLN)和脾。DLN淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞的總數(shù)通過(guò)使用GuavaPCA96(GuavaTechnologies,Inc.，Hayward,CA)確定。DLN淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞用碘化丙啶染色，并且小鼠的抗CD8抗體(BDPharmingen，SanDiego，CA)和OT-I"GFP+淋巴細(xì)胞的百分比通過(guò)對(duì)P^CD8+/GFP+淋巴細(xì)胞門(mén)控的流式細(xì)胞術(shù)而測(cè)定。0丁-1+^^+淋巴細(xì)胞的總量通過(guò)將脾細(xì)胞的總數(shù)與PrOT-I+/GFP+淋巴細(xì)胞的百分比相乘而確定。結(jié)果示于圖6中。采用許多不同的IRM化合物的IRM/抗原組合的鼻內(nèi)給藥，在DLN中(圖6A)和脾中(圖6B)中提供了比單獨(dú)抗原給藥更大數(shù)量的抗原特異性T細(xì)胞。實(shí)施例6得自O(shè)T-I小鼠的淋巴細(xì)胞(TheJacksonLaboratories，BarHarbor,ME)凈皮過(guò)繼性轉(zhuǎn)移到C57BL/6(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)小鼠中。如實(shí)施例3中所述的那樣洗滌卵白蛋白。在過(guò)繼性轉(zhuǎn)移1天后，用PBS單獨(dú)鼻內(nèi)免疫小鼠，或用50pg的卵白蛋白和的IRM4的PBS，通過(guò)鼻內(nèi)(IN)、靜脈內(nèi)(IV)或皮下(SC)使小鼠免疫。5個(gè)月后，小鼠以它們先前被免疫的同樣方式再次免疫，或者不再免疫。在5個(gè)月免疫后4天，處死小鼠，并收集瀝干的淋巴結(jié)(DLN)和鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)。DLN淋巴細(xì)胞和NALT淋巴細(xì)胞的總數(shù)通過(guò)使用GuavaPCA96(GuavaTechnologies,Inc.,Hayward，CA)確定。DLN淋巴細(xì)胞和NALT淋巴細(xì)胞用碘化丙啶(PI)和小鼠的抗CD8抗體(BDPharmingen,SanDiego，CA)染色，并且通過(guò)對(duì)？1-008+/0+淋巴細(xì)胞門(mén)控的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定OT-I+ZGFP+淋巴細(xì)胞的百分比。OT-I"VGFP+淋巴細(xì)胞的總量通27過(guò)將dln淋巴細(xì)胞或nalt淋巴細(xì)胞的總量與dln或naltpi-ot-iVgfp+淋巴細(xì)胞的百分比相乘而確定。結(jié)果示于圖7中，如下dln在圖7a中；nalt在圖7b中。所有的免疫途徑，包括鼻內(nèi)免疫，導(dǎo)致在再次免疫時(shí)，在dln中的ot-i細(xì)胞數(shù)量的增加。另外，鼻內(nèi)免疫導(dǎo)致在再次免疫時(shí)在nalt中的ot-i細(xì)胞數(shù)量的增加。本文中引用的專(zhuān)利、專(zhuān)利文獻(xiàn)和公開(kāi)文本的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用全文而并入本文中，如每個(gè)被單獨(dú)并入那樣。在出現(xiàn)矛盾的情況下，應(yīng)該以包括定義的本說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，不背離本發(fā)明的范圍和主旨，本發(fā)明的各種修改和變化將是明顯的。所列舉的實(shí)施方案和實(shí)施例僅作為例子而被提供并且不意于用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍僅由如下提出的權(quán)利要求限定。權(quán)利要求1.一種組合藥物，其包含用于粘膜給藥而配制的IRM化合物；和用于粘膜給藥而配制的抗原。2.權(quán)利要求1的組合藥物，其包含含有所述IRM化合物和所述抗原的單一制劑。3.權(quán)利要求l的組合藥物，其包含包含所述IRM化合物的第一制劑；和包含所述抗原的第二制劑。4.使對(duì)象免疫的方法，其包括與IRM化合物組合，將抗原以有效的量給藥到對(duì)象的粘膜表面，以產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答；和與所述抗原組合，將IRM化合物以有效的量給藥到對(duì)象的粘膜表面，以產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的抗原和IRM以單一制劑給藥。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述的抗原以第一制劑給藥，而所述IRM化合物以第二制劑給藥。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的抗原和所述的IRM化合物在不同的位置給藥。8.權(quán)利要求7的方法，其中至少一個(gè)位置包含鼻粘膜。9.權(quán)利要求7的方法，其中至少一個(gè)位置包含口腔粘膜。10.權(quán)利要求7的方法，其中至少一個(gè)位置包含胃-腸粘膜。11.權(quán)利要求7的方法，其中至少一個(gè)位置包含泌尿生殖器粘膜。12.權(quán)利要求7的方法，其中所述的不同位置為不同的粘膜表面。13.權(quán)利要求6的方法，其中所述的IRM化合物在給藥抗原之前給藥。14.權(quán)利要求6的方法，其中所述的IRM化合物在給藥抗原之后給藥。15.權(quán)利要求4的方法，其中所述的抗原包含蛋白質(zhì)、肽、活的或滅活的細(xì)菌、活的或滅活的病毒或者它們的任意組合。16.權(quán)利要求4的方法，其中所述的IRM化合物包含稠合于五員含氮雜環(huán)的2-氨基吡啶。17.權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包含至少一次另外給藥所述抗原。18.權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包含至少一次另外給藥IRM化合物。19.權(quán)利要求18的方法，其中第一次給藥IRM化合物中的IRM化合物不同于第二次給藥IRM化合物中的IRM化合物。20.權(quán)利要求4的方法，其中針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答包含分泌IgA。21.權(quán)利要求4的方法，其中針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答包含增加抗原特異的T細(xì)胞在粘膜組織中的數(shù)量或百分比。全文摘要本發(fā)明提供包含用于粘膜給藥而配制的IRM化合物和用于粘膜給藥而配制的抗原的組合藥物。另外，本發(fā)明還提供用于使對(duì)象免疫的方法。通常，該方法包括與IRM化合物組合，將抗原以有效的量給藥到對(duì)象的粘膜表面上，以產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答；和與抗原組合，將IRM化合物以有效的量給藥到對(duì)象的粘膜表面上，以產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答。文檔編號(hào)A61K39/02GK101426524SQ200580013768公開(kāi)日2009年5月6日申請(qǐng)日期2005年4月28日優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日發(fā)明者威廉·C·基佩爾,理查德·L·米勒申請(qǐng)人:3M創(chuàng)新有限公司