專利名稱：：通過給予組織因子途徑抑制劑(tfpi)治療社區(qū)獲得性重癥肺炎的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療性治療社區(qū)獲得性重癥肺炎(severecommunity-acquiredpneumoriia)的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及給予組織因子途徑抑制劑蛋白來緩解重癥肺炎相關(guān)生理途徑的過度擴張。
背景技術(shù)：
：一種或多種肺部功能性物件，包括肺泡間隙和間質(zhì)組織的急性感染可導(dǎo)致肺炎。美國每年約有2百萬人染上肺炎，40，000-70，000人死亡。肺炎在所有致死疾病中排名第6，它是最常見的致死性醫(yī)院內(nèi)(醫(yī)院獲得性)感染。在美國，社區(qū)獲得性肺炎(CAP)對醫(yī)療保健經(jīng)費影響顯著，估計每年直接費用為140億美元，工資損失達90億美元(LynchJP，MartinezFJ.,"社區(qū)獲得性肺炎"(Community-acquiredpneumonia.)，CurrOpinPulmMed.，1998;4:162-172)。在發(fā)展中國家，下呼吸道感染通常是主要的致死原因，僅次于感染性腹瀉而排名第二(《Merck手冊》(TheMerckManual)，第6部分，第73章，Pneumonia,2000)?？筛鶕?jù)各種組織，包括美國胸科協(xié)會(AmericanThoracicSociety(ATS))(AmJRespirCritCareMed，2001;163:1730-1754)提出的指南來特征鑒定稱為"重癥肺炎"的疾病。例如，除了其它診斷重癥肺炎的標準以外，ATS要求至少負荷一項主要標準，如需要機械方法換氣(mechanicalventilation)或(存在)敗血性休克。總體上，急性肺病、肺部炎性疾病或例如由于炎癥或阻塞等因素所致肺功能干擾可導(dǎo)致重癥肺炎?？筛鶕?jù)準入的肺炎專用ICU的患者作出重癥CAP的診斷。流行病學(xué)上，該患者人群約占所有ICU準入(患者)的10%。與一般住院治療的CAP患者低于15%的死亡率相比，ICU中肺炎患者在所有CAP患者中死亡率最高(30%-40%)。美國每年約4百萬成年人診斷為感染社區(qū)獲得性肺炎(CAP)，其中多達600,000人需要住院。Fine等，N.Engl丄Med.，336，243-50，1997?？傮w上，CAP的發(fā)病率隨年齡而增加，65歲與更年長人中最普遍。Marston等，ArchInternMed.，1997;157:1709-1718。該發(fā)病率在共患疾病(comorbidity)，例如慢性阻塞性肺病、哮喘、糖尿病、酗酒、免疫抑制、腎功能不全、慢性肝病和心臟病患者中也增加。Marrie，CurrOpinPulmMed.，1996，2:192-197;Niedermann等，AmRevRespirDis.,1993，148:1418-1426。在美國，肺炎是首位的感染致死原因，在總致死原因中排名第6。肺炎相關(guān)死亡率從1979到1992年上升了22%，在1992年，老年患者(65歲和更年長)占所有肺炎相關(guān)死亡的89%。參見《肺炎和流感死亡率一美國》(Pneumoniaandinfluenzadeathrates—UnitedStates),1979-1994[MMWR,，1995，44:782公布的校正]。MMWR.，1995，44:535-537。Fine和他的同事(1997)報道了某些共患疾病(腫瘤病、充血性心力衰竭(CHF)、腦血管疾病、腎病和肝病)和某些體檢發(fā)現(xiàn)(精神狀態(tài)改變、心率升高、呼吸加速、收縮壓降低和體溫異常降低或升高)也與CAP相關(guān)死亡率升高有關(guān)。此外，CAP對美國醫(yī)療保健經(jīng)費影響顯著，估計每年直接費用為140億美元，工資損失達90億美元。LynchJP和Martinez,CurrOpinPulmMed.，1998;4:162-172)。組織因子途徑抑制劑(TFPI)是一種存在于哺乳動物血漿中的蛋白質(zhì)和絲氨酸蛋白酶抑制劑。Thomas,BulUohnsHopkinsHosp.，81，26，(1947);Schneider,Am丄Physiol.，149,123，(1947);Broze和Miletich，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,84，1886，(1987)。TFPI也稱為組織因子抑制劑、組織促凝血酶原激酶抑制劑、因子II抑制劑、外源途徑抑制劑(EPI)和脂蛋白相關(guān)促凝劑抑制物(LACI)。國際血栓形成和止血協(xié)會(InternationalSocietyonThrombosisandHemostasis)在1991年6月30曰接受了"組織因子途徑抑制劑"(TFPI)這個名稱。血液凝結(jié)活化是液態(tài)血液轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w凝膠或凝塊。此外，凝血蛋白酶的消耗可導(dǎo)致大出血。主要變化是可溶性血纖蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇艿难w蛋白，雖然血纖蛋白本身只形成總血液凝塊的0.15%，但該轉(zhuǎn)變過程是復(fù)雜的酶級聯(lián)反應(yīng)的最后一步。其中的各組分(因子)以酶原(蛋白水解酶的無活性前體)形式存在，通過在特定位點經(jīng)蛋白酶水解切割轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚悦?。激活少量的某種因子可催化形成大量的下一步(因子)，導(dǎo)致放大(作用)極快形成血纖蛋白。據(jù)信，血管損傷使因子Vila與在內(nèi)皮下方細胞上表達的組織因子(TF)接觸從而啟動凝血。因子VIIa-TF復(fù)合物切割因子X產(chǎn)生因子Xa，切割因子IX產(chǎn)生因子IXa。TFPI可與因子VIIa和因子Xa二者結(jié)合。TFPI、因子VIIa(與其結(jié)合的TF)和因子Xa之間形成的復(fù)合物抑制了維持止血所需因子Xa和IXa的進一步形成。Broze，Jr.，Ann.Rev.Med.，46:103，(1995)。直接引入血流的細菌產(chǎn)物，包括內(nèi)毒素激活凝血級聯(lián)反應(yīng)可導(dǎo)致大量血纖蛋白沉積在動脈表面，以及消耗血纖蛋白原、凝血酶原、因子V和VIII與血小板。此外，刺激溶纖系統(tǒng)可導(dǎo)致進一步形成血纖蛋白降解產(chǎn)物。在細菌產(chǎn)物(例如，內(nèi)毒素)明顯啟動凝血激活的同時，凝血似乎也激活了相反的機制，即激活了纖溶系統(tǒng)。激活的因子xin將血纖蛋白溶酶原前激活物轉(zhuǎn)變?yōu)檠w蛋白溶酶原激活物，然后將血纖蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)檠w蛋白從而介導(dǎo)了血凝塊的溶解。因此，激活血漿纖溶系統(tǒng)也造成出血趨勢。內(nèi)毒素血癥與組織血纖蛋白溶酶原激活物抑制劑(PAI)的循環(huán)水平增加有關(guān)。該抑制劑能使組織血纖蛋白溶酶原激活物(TPA)快速滅活從而阻礙了其通過激活血纖蛋白溶酶原成為血纖蛋白溶酶來啟動血纖蛋白溶解的能力。血纖蛋白溶解受影響可導(dǎo)致血纖蛋白沉積在血管中，從而造成敗血性休克相關(guān)的DIC。人們正在努力鑒定滿意的干預(yù)方法來預(yù)防或治療重癥肺炎和相關(guān)的凝血病。采用能打斷凝血途徑的藥物不一定是重癥肺炎的有效治療性或預(yù)防性治療方法。例如，肝素是常用的抗凝劑。然而，肝素的使用難以控制，因為肝素可導(dǎo)致大出血并且發(fā)現(xiàn)雖可減弱凝血異常但對存活沒有益處。參見例如，Aoki等，"激活的C蛋白和傳統(tǒng)肝素治療彌散性血管內(nèi)凝血的比較性雙盲隨機試驗"(AComparativeDouble-BLINDrandomizedTrialofActivatedProteinCandUnfractionatedHeparinintheTreatmentofDisseminatedIntravascularCoagulation),Int丄Hematol.，75，540-47，(2002)。主要在腦膜炎球菌內(nèi)毒素血癥(其主要特征是爆發(fā)型DIC)中進行的幾項臨床試驗未能證明肝素治療降低了膿毒癥的死亡率。參見，例如Corrigan等，"肝素治療爆發(fā)型彌散性血管內(nèi)凝血敗血癥對死亡率和止血缺陷糾正的作用"("HeparinTherapyinSeptacemiawithDisseminatedIntravascularCoagulation.EffectonMortalityandonCorrectionofHemostaticDefects),N.EngU,Med.，283:778-782，(1970);Lasch等，"彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的肝素治療"(HeparinTherapyofDifftiseIntravascularCoagulation(DIC))，Thrombos.Diathes.Haemorrh,，33:105，(1974);Straub，"肝素治療血管內(nèi)凝血的病例"(ACaseAgainstHeparinTherapyofIntravascularCoagulation),Thrombos.Diathes.Haemorrh.，33:107，(1974)。易患嚴重的社區(qū)獲得性肺炎的患者是那些需要進入重癥監(jiān)護病房(ICU)的社區(qū)獲得性肺炎患者。社區(qū)獲得性肺炎患者臨床上鑒定為具有肺部薄壁組織感染和/或經(jīng)放射攝影和臨床體征證實。重癥肺炎包括社區(qū)獲得性重癥肺炎，通常其病原體己明確，包括肺炎鏈球菌、軍團菌、流感嗜血菌或各種革蘭陰性細菌。大多數(shù)社區(qū)獲得性重癥肺炎患者在CAP發(fā)作前生活在社區(qū)中，其中只有約20%允許自醫(yī)院、療養(yǎng)院或長期照料中轉(zhuǎn)移出來。美國的重癥CAP患者男性約50%和女性約50%,但傾向于更年長者。美國約17%的重癥CAP患者在50歲以下，約24%在50和64歲之間，約21%在64和74歲之間，約38%超過75歲。大多數(shù)重癥CAP患者具有一種或多種明顯的共患疾病。在2003年，接受ICU照料治療的美國CAP患者通常患有相應(yīng)的心臟病、COPD/囊性纖維化、糖尿病、腎病、癌癥、酗酒和/或藥物濫用。給予重組人ala-TFPI(TFPI類似物)在膿毒血癥動物模型中顯示提高了存活率。參見，例如美國專利號6,063,764。TFPI作為內(nèi)源性蛋白耐受良好。已證明通過靜脈內(nèi)輸液或皮下注射給予TFPI顯示可降低凝血能力，表現(xiàn)為凝血酶原時間(PT)增加。在動物和人研究中，PT的延長與血漿TFPI增加呈線性相關(guān)。A,A.Creasey，Sepsis,3:173，(1999)。本領(lǐng)域仍然需要能抑制重癥肺炎的致死作用同時最大程度降低可能的嚴重副作用的治療方法。發(fā)明簡述本發(fā)明的一個實施方案是治療或預(yù)防重癥肺炎的方法，包括給予患有或處于重癥肺炎風(fēng)險的患者TFPI或TFPI類似物。在一些實施方案中，患者具有可證實的感染。本發(fā)明的另一實施方案是治療重癥肺炎的方法，包括給予患者選自TFPI或TFPI類似物的藥物連續(xù)靜脈內(nèi)輸液。在一些實施方案中，患者具有可證實的感染。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液給予所述TFPI或TFPI類似物，其劑量率(dosingrate)等于以低于約2.0mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。在一優(yōu)選的實施方案中，所述劑量率等于以約0.00025-2.0，或者約0.001-1.75mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。在另一優(yōu)選實施方案中，所述劑量率等于以約0.005-1.50mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。在一更優(yōu)選的實施方案中，所述劑量率等于以約0.010-0.75mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。在還要優(yōu)選的實施方案中，所述TFPI或所述TFPI類似物的給藥劑量率等于以約0.2-0.8mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。在另一優(yōu)選實施方案中，給予所述劑量率所提供的總劑量等于以約0.024-4.8mg/kg的總劑量給予參比ala-TFPI。在另一優(yōu)選實施方案中，給予所述劑量率提供的每日劑量等于以至少約0.006mg/kg到小于約L2mg/kg的每日劑量給予參比ala-TFPI。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中給予所述TFPI或TFPI類似物至少72小時。在一優(yōu)選實施方案中，給予所述TFPI或TFPI類似物至少96小時。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中所述TFPI類似物包含由SEQIDNO:1的氨基酸19-89構(gòu)成的第一Kunitz結(jié)構(gòu)域。在一優(yōu)選的實施方案中，所述TFPI類似物還包含由SEQIDNO:1的氨基酸90-160構(gòu)成的第二Kunitz結(jié)構(gòu)域。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中所述TFPI類似物包含SEQIDNO:1的氨基酸1-160或者其中所述TFPI類似物包含由SEQIDNO:1的氨基酸90-160構(gòu)成的第二Kunitz結(jié)構(gòu)域。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物從含有TFPI或TFPI類似物的凍干組合物制備。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物以含有精氨酸的制劑給予。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物以含有檸檬酸鹽的制劑給予。其它實施方案包括任一以上實施方案，其中所述TFPI或TFPI類似物在含有約300mM鹽酸精氨酸和約20mM檸檬酸鈉，pH約5.5的制劑中濃度為0.15mg/ml。其它實施方案包括任一以上實施方案，還包括在給予所述TFPI或TFPI類似物的同時或24小時內(nèi)給予選自以下的其它藥物抗生素、抗體、內(nèi)毒素拮抗劑、具有抗凝血活性的組織因子類似物、免疫剌激劑、細胞粘著阻斷劑、肝素、BPI蛋白、IL-l拮抗劑、pafase(PAF酶抑制劑)、TNF抑制劑、IL-6抑制劑和補體抑制劑。在一優(yōu)選的實施方案中，所述其它藥物是能與選自TNF、IL-6和MCSF的抗原特異性結(jié)合的抗體。閱讀以下附圖和詳述可以進一步明白本發(fā)明的實施方案。發(fā)明詳述給予TFPI或TFPI類似物可有效地預(yù)防和治療重癥肺炎。連續(xù)給予低劑量TFPI或TFPI類似物(下文稱為"低劑量TFPI給藥")也可有效地預(yù)防或治療重癥肺炎。TFPI或TFPI類似物給藥，特別是低劑量給藥抑制或緩解了急性或慢性炎癥、特別是重癥肺炎。低劑量TFPI給藥持續(xù)至少3天降低了重癥肺炎的死亡危險，同時最大程度降低了不良副作用導(dǎo)致的并發(fā)癥發(fā)生率，特別是出血性疾病(bleedingdisorder)。低劑量TFPI給藥的其它優(yōu)點是避免了足夠高的劑量可能降低TFPI血漿濃度的耐受作用。血漿TFPI濃度約850ng/ml時可刺激半數(shù)最大的耐受作用，而低劑量TFPI給藥的血漿水平一般維持在500ng/ml以下。一般通過TFPI或TFPI類似物的連續(xù)靜脈內(nèi)輸液實施低劑量TFPI給藥。TFPI和TFPI類似物本文所用的"TFPI"指具有SEQIDNO:1所示276個氨基酸殘基序列和分子量為約38,000道爾頓的成熟血清糖蛋白。它是組織因子活性和凝血激活的天然抑制劑。美國專利號5,110,730描述了組織因子(TF)，美國專利號5,106,833描述了TFPI。Wun等的美國專利號4,966,852描述了TFPIcDNA的克隆。TFPI是一種蛋白酶抑制劑，具有3個Kunitz結(jié)構(gòu)域，其中兩個已知分別與因子VII和Xa相互作用。第三個結(jié)構(gòu)域的功能未知。據(jù)信，TFPI通過形成惰性的四因子Xa:TFPI:因子VIIa:組織因子復(fù)合物來抑制凝血啟動而在體內(nèi)(inviva)起作用。參見Rapaport的綜述，Blood，73:359-365，(1989)和Broze等，Biochemistry,29:7539-7546，(1990)?？蓮腡FPI與其它研究透徹的蛋白酶抑制劑的同源性推測其許多結(jié)構(gòu)特征。TFPI不是一種酶，因此它可能以化學(xué)計量方式抑制其靶蛋白酶，即TFPI的K皿itz結(jié)構(gòu)域之一能抑制一種蛋白酶分子。本發(fā)明的TFPI分子中優(yōu)選存在Kunitz結(jié)構(gòu)域1和/或2。Kunitz結(jié)構(gòu)域3的功能未知。"TFPI類似物"是經(jīng)一個或多個氨基酸添加或取代(一般是保守性的)、一個或多個氨基酸刪除(例如TFPI片段)、或在一個或多個氨基酸加上一個或多個化學(xué)基團而修飾的TFPI衍生物，只要這些修飾不破壞TFPI的生物學(xué)活性。制備多肽類似物的方法是本領(lǐng)域已知的，下文將進一步描述。優(yōu)選的TFPI類似物是氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的N-丙氨?；?TFPI(ala-TFPI)。用下文所述的生物活性試驗測定的TFPI類似物具有TFPI的一些活性。TFPI和類似物的優(yōu)選生物活性試驗是凝血酶原時間(PT)試驗(參見下文)。TFPI和TFPI類似物可以糖基化或非糖基化。美國專利號5,106,833描述了TFPI的類似物。Ala-TFPI是國際藥物名稱為"tifacogin"的TFPI類似物。Ala-TFPI包含成熟的全長人TFPI的整個氨基酸序列加上氨基末端的一個額外丙氨酸殘基。將ala-TFPI的氨基末端丙氨酸殘基工程改造加入TFPI序列提高了其在大腸桿菌中的表達和切割位點，否則此處是氨基末端甲硫氨酸殘基。參見美國專利號5,212,091。特別優(yōu)選的TFPI類似物可包含保守性取代，即在側(cè)鏈相似的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的取代。具體地說，氨基酸通?？煞譃?個家族(1)酸性—天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性--賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性--丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時分類為芳香族氨基酸。例如，可合理地預(yù)計用異亮氨酸或纈氨酸單獨取代亮氨酸、用谷氨酸單獨取代天冬氨酸、用絲氨酸單獨取代蘇氨酸、或用結(jié)構(gòu)相似的氨基酸類似地保守性取代某種氨基酸，對生物學(xué)活性不會有重要影響。例如，感興趣的多肽可含有多達約1-70個保守性或非保守性氨基酸取代，如l、2、3、4、5、6-50、15-25、5-10、或1-70的任一整數(shù)取代，只要該分子的所需功能維持完好。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定感興趣分子中的可被修飾同時能合理保留本文所定義生物學(xué)活性的區(qū)域。"同源性"指兩個多核苷酸或兩個多肽部分之間的相似性百分比。當兩條多肽序列在二分子的限定長度上顯示至少約50%、優(yōu)選至少約75%、更優(yōu)選至少約80%-85%、還優(yōu)選至少約90%、最優(yōu)選至少約95%-98%的序列同源性，或者在特定范圍之間顯示任何同源性百分比時，則這二序列是相互"基本上同源"。本文所用"基本上同源"也指顯示與具體的多肽序列完全相同的序列?？傮w上，"相同性"指兩條多肽序列的氨基酸-與-氨基酸精確相一致?？赏ㄟ^比對序列、計數(shù)所比對的兩條序列之間確切的匹配數(shù)目、除以較短序列的長度并將所得結(jié)果乘以100，直接比較兩分子之間的序列信息來確定相同性百分比。天然或非天然產(chǎn)生的TFPI類似物優(yōu)選與SEQIDNO:1的TFPI具有至少70%、80%、85%、90%或95%或更高同源性的氨基酸序列。更優(yōu)選這些分子98%或99%同源?？衫肧mith-Waterman同源性檢索算法確定序列同源性百分比，該算法利用相關(guān)空格(affinegap)檢索，所用參數(shù)為空格開放罰分12、空格延伸罰分2和BLOSUM矩陣62。Sm池-Waterman同源性檢索算法的說明見Sm他和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482-489，(1981)?？赏ㄟ^凝血酶原試驗測定TFPI和TFPI類似物的生物學(xué)活性。美國專利號5,888,968和WO96/40784描述了合適的凝血酶原試驗。簡言之，可用血凝度計(例如，OrganonTeknika的Coag-A-MateMTXII)測定凝血酶原時間。合適的試驗緩沖液是含有l(wèi)mg/ml牛血清白蛋白、調(diào)節(jié)至pH7.5的100mMNaCl、50mMTris。其它所需試劑是正常人血漿(例如，OrganonTeknika的"Verify1")、促凝血酶原激酶試劑(例如，OrganonTeknika的"SimplastinExcel")和TFPI標準溶液(例如，每毫升試驗緩沖液20嗎100。/。純的ala-TFPI(或其相當量))。通過分析一系列TFPI標準溶液的稀釋液(例如，稀釋至終濃度范圍1-5pg/ml)的凝血時間獲得標準曲線。為測定凝血時間，先用試驗緩沖液稀釋樣品或TFPI標準品。然后加入正常人血漿。加入促凝血酶原激酶試劑啟動凝血反應(yīng)。然后用儀器記錄凝血時間。以凝血時間的對數(shù)值與TFPI濃度對數(shù)值作圖得到線性TFPI標準曲線。根據(jù)TFPI標準品的純度將標準曲線調(diào)整為相應(yīng)于100%純標準品的等價TFPI濃度。例如，如果標準品是97y。生化純的ala-TFPI制劑(即，以重量計其含有的3%分子無TFPI生物學(xué)活性)，則標準品的每種稀釋液的濃度應(yīng)乘以0.97得到TFPI的確切濃度。因此，按照97%純制劑的每毫升實際重量，1.0嗎/ml的TFPI標準品等于和處理為1.0乘以0.97的濃度，或0.97嗎/ml。獲得TFPI和TFPI類似物可從細胞或組織分離和純化、化學(xué)合成或在原核或真核細胞中重組產(chǎn)生TFPI和TFPI類似物?？捎脦追N方法分離TFPI。例如，可分泌TFPI的細胞包括已用TNF處理約3到4天的衰老的內(nèi)皮細胞、年輕的內(nèi)皮細胞、肝細胞和肝癌細胞?？赏ㄟ^常規(guī)方法純化TFPI，包括Pedersen等，1990，J.Biol.Chem.，265，16786-93;Novotny等，1989，J.Biol.Chem.，264，18832-'37;Novotny等，1991，Blood，78，394-400;Wun等,19卯，J.Biol.Chem.，265，16096-101;和Broze等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，1886-90所述的層析方法。TFPI看來存在于血流中故可從血液中純化，參見Pedersen等，1990?？捎没瘜W(xué)方法合成其氨基酸序列來產(chǎn)生TFPI或TFPT變體，例如通過釆用固相技術(shù)(Merrifield，J.Am.Chem.Soc,，85，2149-2154，1963;Roberge等，Science,269，202-204，1995)直接合成肽?？刹捎檬止せ蜃詣蛹夹g(shù)合成蛋白質(zhì)。14例如可利用AppliedBiosystems431A肽合成儀(PerkinElmer)實現(xiàn)自動化合成。TFPI或TFPI變體的片段可任選分別合成再用化學(xué)方法組合以產(chǎn)生全長分子?？扇缑绹鴮＠?,966,852所示重組產(chǎn)生TFPI和TFPI類似物。例如，可將所需蛋白質(zhì)的cDNA摻入能在原核生物或真核生物中表達的質(zhì)粒中。美國專利號4,847,201提供了用特定的DNA序列轉(zhuǎn)化微生物并表達這些DNA序列的細節(jié)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的許多其它參考文獻提供了利用微生物表達蛋白質(zhì)的細節(jié)。美國專利號4,847,201引用了許多這樣的參考文獻，例如Maniatas等，1982，《分子克隆》(MolecularCloning),冷泉港出版社?？刹捎酶鞣N技術(shù)轉(zhuǎn)化微生物并利用這些微生物表達TFPI和TFPI類似物。以下只是可能的方法的例子。必須分離TFPIDNA序列并使之與合適的控制序列相連。TFPIDNA序列如美國專利號4,966,852所示，可將其摻入到例如pUNC13或pBR3822質(zhì)粒中，這些質(zhì)?？少徸岳鏐oehringer-Mannheim公司。TFPIDNA—旦插入載體，可將其克隆入合適的宿主?？刹捎美鏜ullis的美國專利4,683,202和Mullis等的美國專利4,683,195所示技術(shù)擴增該DNA?？赏ㄟ^誘導(dǎo)細胞，例如肝癌細胞(如HepG2和SKHep)來制備TFPImRNA，然后鑒定、分離該mRNA并將其逆轉(zhuǎn)錄以獲得TFPI的cDNA。將該表達載體轉(zhuǎn)化入例如大腸桿菌宿主細胞后，發(fā)酵該細菌表達蛋白質(zhì)。優(yōu)選的細菌是原核微生物，特別優(yōu)選大腸桿菌。優(yōu)選用于本發(fā)明的微生物是根據(jù)布達佩斯條約的條款于1984年2月14日由ATCC保藏的大腸桿菌K-12，菌株MM294(登錄號39607)。當然也可能在得自多細胞生物的真核宿主細胞培養(yǎng)物中表達編碼多肽的基因。參見，例如《組織培養(yǎng)》(TissueCulture),1973，Cruz和Patterson編，科學(xué)出版社?？捎玫牟溉閯游锛毎蛋ㄐ∈蠊撬枇鯪51、VERO、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS、C127、HepG2和SKHep。TFPI和TFPI類似物也可在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達(也可參見上文引用的美國專利號4,847,201)。也可參見Pedersen等，1990，J.ofBiologicalChemistry,265:16786-16793。真核細胞表達載體通常包含與哺乳動物細胞相容的啟動子和控制序列，例如常用的猿病毒40(SV40)早期和晚期啟動子(Fiers,etal.,1978,Nature,273:113)，或例如得自多瘤病毒、腺病毒2、牛乳頭瘤病毒或禽肉瘤病毒的其它病毒啟動子，或免疫球蛋白啟動子和熱激(蛋白)啟動子。Axd的美國專利號4,399,216描述了哺乳動物宿主細胞系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的總體方面。目前，"增強子"區(qū)域也顯示對優(yōu)化表達很重要；這些"增強子"區(qū)域一般是在啟動子區(qū)域上游發(fā)現(xiàn)的序列。如果需要，可獲得病毒來源的復(fù)制起點。然而，就真核生物中DAN復(fù)制而言，整合入染色體是一種常規(guī)機制。目前，植物細胞也可用作宿主，并可采用與植物細胞相容的控制序列，例如胭脂氨酸合成酶啟動子和聚腺苷酸化信號序列(Depicker,A.等，1982，J.Mol.Appl.Gen.，1:561)。WO85/04899公開了轉(zhuǎn)化植物細胞的方法和載體。用于純化哺乳動物細胞表達的TFPI和TFPI類似物的方法包括依次應(yīng)用肝素-瓊脂糖、MonoQ、MonoS和反相HPLC層析。參見Pedersen等，同上；Novotny等，1989,J,Biol.Chem.，264:18832-18837;Novotny等，1991，Blood，78:394-400;Wun等，1990，J.Biol.Chem.，265:16096-16101;Broze等，1987，PNAS，(USA)，84:1886-1890;美國專利號5,106,833;和美國專利號5,466,783。這些參考文獻描述了純化哺乳動物(細胞)所產(chǎn)生TFPI的各種方法。也可利用哺乳動物宿主細胞，例如小鼠C127cells(Day等，Blood，76，1538-45，1990)、幼倉鼠腎細胞(Pedersen等，1990)、中國倉鼠卵巢細胞和人SK肝癌細胞將TFPI表達為重組的糖基化蛋白。已將C127TFPI用于動物研究，顯示其在家兔中能有效抑制組織因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)凝血(Day等，同上)，在狗中能防止血栓溶解后的動脈再阻塞(Haskel等，Circulation,84:821-827,(1991))，在狒狒的大腸桿菌膿毒血癥模型中降低了死亡率(Creasey等，J.Clin.Invest.，91:2850，(1993))?？衫么竽c桿菌宿主細胞將ala-TFPI表達為重組的非糖基化蛋白。通過使大腸桿菌產(chǎn)生的重組蛋白在體外重折疊從而得到高活性ala-TFPI的方法已見描述。參見，例如WO96/40784。也可在細菌或酵母中產(chǎn)生TFPI和TFPI類似物，然后純化。通?？刹捎妹绹鴮＠?,212,091;6,063,764和6,103,500或WO96/40784所示的方法?？砂凑占{入本文作為參考的WO96/40784和Gustafson等，Prot.Express.Pur.，5:233，(1994)所述進行ala-TFPI和其它TFPI類似物的純化、溶解和重折疊。例如，按16照WO96/40784的實施例9制備時，獲得的TFPI制劑以重量計總蛋白中含有約85%到90%的成熟、適當折疊、生物學(xué)活性的ala-TFPI，其中約10%到15%具有一個或多個氧化的甲硫氨酸殘基。凝血酶原試驗測定到這些氧化形式具有與非衍生化ala-TFPI相等的生物學(xué)活性，預(yù)計它們在本文公開的發(fā)明中有活性。其余物質(zhì)含有ala-TFPI的各種修飾形式，包括二聚體、凝聚體和乙酰化形式。TFPI和TFPI類似物具有明顯數(shù)目的半胱氨酸殘基，美國專利號4,929,700所示方法是關(guān)于TFPI的重折疊。可采用各種層析方法，例如上述方法從緩沖溶液中純化TFPI和類似物。如果需要，可采用美國專利號4,929,700所示方法?？刹捎媚塬@得適合人體給藥的一定純度和活性水平的任何方法來純化TFPI和TFPI類似物。治療方法和組合物總體上，TFPI和TFPI類似物可用于治療或預(yù)防因TNF、IL-1或其它細胞因子造成的組織因子表達上調(diào)從而提高了TF活性所致的那些疾病。TFPI給藥，特別是低劑量TFPI給藥可降低患者的細胞因子，例如IL-6的濃度。低劑量TFPI給藥可用于治療炎癥和凝血異常，通常包括急性和慢性炎性疾病，例如重癥肺炎。根據(jù)美國胸科協(xié)會所述指南定義"重癥肺炎"。具體地說，重癥肺炎要求診斷為肺炎和存在a)兩種主要標準之一，b)三種次要標準中的兩種或c)英國胸科協(xié)會(BritishThoracicSociety)四種標準中(Thorax，2001，56，[增刊IV]:l-64)的兩種。主要標準是1)需要機械方法換氣和2)敗血性休克或需要升壓劑超過4小時。次要標準是1)收縮血壓大于等于(ltor叫)90mmHg，2)多葉肺炎，和3)血氧過低標準(PaO2/FiO2)<250。英國胸科協(xié)會的標準是1)呼吸速率等于大于(gtor叫)30次呼吸/分鐘，2)舒張血壓等于低于60mmHg，3)血尿氮(BUN)>7.0mM(>19.6mg/dL)和4)意識模糊。本領(lǐng)域知道血氧過低標準(Pa02/Fi02)指動脈氧分壓是所吸入氧的分數(shù)，其表示氣體交換受損的水平。重癥肺炎患者宜具有可用本領(lǐng)域已知方法證明的感染。這些方法包括但不限于通過例如革蘭染色、培養(yǎng)、組織化學(xué)染色、免疫化學(xué)試驗或核酸試驗來檢測血液或其它常規(guī)無菌體液或組織培養(yǎng)物中的病原性生物。也可通過與構(gòu)成全身性抗感染治療理由的肺炎診斷以及感染的任何臨床癥狀相符合的胸部放射攝影來證明可證實的感染，所述臨床癥狀包括但不限于呼吸速率>/=30次/分鐘或PaCO2/FiO2<250、血壓降低和體溫升高。TFPI和TFPI類似物的制劑優(yōu)選通過靜脈內(nèi)輸液給予TFPI和TFPI類似物的制劑。優(yōu)選基本上連續(xù)的靜脈內(nèi)輸液。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知實施這種給藥的方法。可經(jīng)中心線(centralline)和外周線(peripheralline)進行輸液。雖然應(yīng)避免劑量率的大波動，但本發(fā)明劑量率的短期偏差可以接受，只要給予TFPI產(chǎn)生的血漿水平在本發(fā)明優(yōu)選實施方案恒定劑量率連續(xù)輸液所預(yù)計的20%以內(nèi)。給予患者之前，可加入TFPI和TFPI類似物制劑。優(yōu)選液體制劑?？衫貌煌闹苿⒃谂cTFPI蛋白給藥途徑、溶解性和穩(wěn)定性相容的任何合適生理pH下配制不同濃度的TFPI和TFPI類似物。靜脈內(nèi)輸液的優(yōu)選制劑包括多達約0.6mg/ml的ala-TFPI、多達約300mM的鹽酸精氨酸和pH5.0-6.0的檸檬酸鈉緩沖液。某些溶質(zhì)，例如精氨酸、NaCl、蔗糖和甘露醇作用是增溶和/或穩(wěn)定ala-TFPI。參見WO96/40784。用于靜脈內(nèi)輸液特別優(yōu)選的制劑含有約0.15mg/ml的ala-TFPI、300mM鹽酸精氨酸和20mMpH5.5的檸檬酸鈉。也可用任選含0.005。/o或0.01。/。(w/v)聚山梨酯80(Tween80)的150mMNaCl和20mM磷酸鈉或另一種pH5.5-7.2的緩沖液將TFPI和TFPI類似物配制為濃度高達約0.15mg/ml。其它制劑含有用pH5.5的10mM乙酸鈉配制的高達約0.5mg/ml的TFPI或TFPI類似物，其中含有150mMNaCl、8%(w/v)蔗糖或4.5%(w/v)甘露醇。也可用高濃度鹽將TFPI和TFPI類似物配制為高達幾個mg/ml的較高濃度。例如，一種制劑含有用500mMNaCl和pH7.0的20mM磷酸鈉配制的高達約6.7mg/ml的ala-TFPI。此夕卜，TFPI制劑可含有甲硫氨酸，甲硫氨酸的范圍優(yōu)選約l-10mM。TFPI制劑的一優(yōu)選實施方案是約0.1-0.7mg/ml的ala-TFPI、200-500mML-精氨酸、1-7mM甲硫氨酸、pH5.0-6.0的5-50mM檸檬酸鈉緩沖液。TFPI制劑的一優(yōu)選實施方案是約0.1-約0.5mg/ml的ala-TFPI、250-400mML-精氨酸、3-6.5mM甲硫氨酸、pH5.0-6.0的15-30mM擰檬酸鈉緩沖液。TFPI制劑的一優(yōu)選實施方案含有約0.15mg/ml的ala-TFPI、約300mM鹽酸L-精氨酸、5mM甲硫氨酸、pH5.5的20mM檸檬酸鈉緩沖液。TFPI制劑的另一優(yōu)選實施方案含有約0.45mg/ml的ala-TFPI、約300mM鹽酸L-精氨酸、4mM甲硫氨酸、pH5.5的20mM檸檬酸鈉緩沖液。TFPI和TFPI類似物制劑的其它例子含有油、聚合物、維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖液、白蛋白、表面活性劑或填充劑。優(yōu)選的碳水化合物包括糖或糖醇，例如單糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、a和P環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素或它們的混合物。最優(yōu)選蔗糖。糖醇定義為具有0H基團的C4-Q烴，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和阿拉伯糖醇。最優(yōu)選甘露醇。這些糖或糖醇可單獨使用或聯(lián)用。其用量無固定限制，只要所述糖或糖醇能溶解于水性制備物中。糖或糖醇的濃度優(yōu)選為1.0w/vQ/o和7.0w/vG/。之間，更優(yōu)選在2.0和6.0w/v%之間。優(yōu)選的氨基酸包括左旋(L)形式的肉毒堿、精氨酸和甜菜堿；然而，可加入其它氨基酸。優(yōu)選的聚合物包括平均分子量為2,000-3,000之間的聚乙烯吡咯垸酮(PV)，或平均分子量為3,000-5,000之間的聚乙二醇(PEG)。在該組合物中優(yōu)選利用緩沖液以最大程度減少凍干前或重建后溶液pH的變化?？衫么蠖鄶?shù)生理緩沖液，但是優(yōu)選檸檬酸、磷酸、琥珀酸和谷氨酸緩沖液或它們的混合物。緩沖液的濃度優(yōu)選為0.01-0.3摩爾。如歐洲專利號270,799和268,110所示可在該制劑中加入表面活性劑。此外，可化學(xué)修飾TFPI和TFPI類似物，例如通過與聚合物共價偶聯(lián)來增加其循環(huán)半衰期。美國專利號4,766,106;4,179,337;4,495,285和4,609,546說明了優(yōu)選的聚合物和將這些聚合物與肽相連的方法。優(yōu)選的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫下溶解于水，其通用分子式為R(0—CH2—CH2)n—0—R，其中R可以是氫，或是例如烷基或垸醇基的保護性基團。保護性基團優(yōu)選具有1-8個碳，更優(yōu)選的甲基。符號n是正整數(shù)，優(yōu)選1-1,000之間，更優(yōu)選2-500之間。PEG的平均分子量優(yōu)選在1,000-40,000之間，更優(yōu)選在2,000-20,000之間，最優(yōu)選在3,000-12,000之間。PEG優(yōu)選具有至少一個羥基，更優(yōu)選是末端羥基。優(yōu)選激活該羥基以和抑制劑上的游離氨基反應(yīng)。然而，應(yīng)該理解反應(yīng)基團的類型和數(shù)量可以不同以獲得本發(fā)明共價偶聯(lián)的PEG/TFPI。水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本發(fā)明。它們包括聚氧乙基化山梨醇、聚乙氧基化葡萄糖、聚乙氧基化甘油(POG)等。優(yōu)選POG。原因之一是聚乙氧基化甘油的甘油骨架與例如人或動物的單甘油酯、甘油二酯、甘油三酯中的天然骨架相同。因此，該分支化合物在體內(nèi)不會被視為外來物質(zhì)。POG的優(yōu)選分子量與PEG的相同。POG的結(jié)構(gòu)見Knauf等，1988，J.Bio.Chem.，263:15064-15070中所示，對POG-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的討論見美國專利號4,766,106。TFPI或TFPI類似物的液體藥物組合物制備好后，可凍干以防降解并保持無菌。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知凍干液體組合物的方法D可在使用前用含有其它成分的無菌稀釋液(例如，林格溶液、蒸餾水或無菌鹽水)重建該組合物。重建后，優(yōu)選通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液將組合物給予對象。TFPI和TFPI類似物的劑量可以治療有效濃度給予TFPI或TFPI類似物來治療和預(yù)防重癥肺炎。此劑量對其它急性或慢性炎癥和細胞因子上調(diào)組織因子表達的疾病也有效。為達到此目的，優(yōu)選靜脈內(nèi)給予TFPI或TFPI類似物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知實施此種給藥的方法。TFPI或TFPI類似物一般以1pg/kg和30mg/kg之間的劑量給予，更優(yōu)選20嗎/kg和25mg/kg之間，最優(yōu)選1和15mg/kg之間的劑以上劑量通常在至少約150個小時期間給予，優(yōu)選在至少約100個小時。在一個實施方案中，TFPI連續(xù)給藥約99-90小時，優(yōu)選約97-94小時，更優(yōu)選約96小時。以單劑量或分劑量給予宿主的每日總劑量可以是，例如每日約2-20mg/kg體重，優(yōu)選每日約2-15mg/kg體重，約4-10mg/kg的用量。劑量單位組成可包括這種用量或其約數(shù)構(gòu)成的每日劑量。較低的每日劑量，例如1^g/kg到2mg/kg可用于預(yù)防或其它目的?？膳c運載體物質(zhì)組合產(chǎn)生的單劑量形式中活性成分的用量取決于所治療的患者和具體給藥方式而不同?？筛鶕?jù)各種因素選擇劑量方案，包括患者的類型、年齡、體重、性別、飲食和醫(yī)療條件、疾病的嚴重性、給藥途徑、藥理學(xué)考慮，例如活性、效力、藥代動力學(xué)和毒理學(xué)情況、是否利用藥物遞送系統(tǒng)和化合物是否作為藥物組合的一部分給予。因此，實際采用的劑量方案可能極為不同，故而可偏離上述優(yōu)選劑量方案。TFPI或TFPI類似物的劑量優(yōu)選不應(yīng)超過與約0.66mg/kg/小時的ala-TFPI劑量率相等的劑量率。低劑量給藥當TFPI或TFPI類似物的給藥劑量率等于至少約0.00025mg/kg/小時(0.00417lag/kg/分鐘)和小于約2.00mg/kg/小時(0.833嗎/kg/分鐘)給予ala-TFPI的劑量率時，仍可有效治療重癥肺炎并最大程度降低不良副作用，例如出血。在一優(yōu)選實施方案中，ala-TFPI的給藥劑量率至少在約0.02mg/kg/小時到約1.0mg/kg/小時之間，更優(yōu)選在約0.24mg/kg/小時到約0.8mg/kg/小時之間。為提高聯(lián)用效力和安全性，劑量率優(yōu)選等于至少約0.010mg/kg/小時(0.167嗎/kg/分鐘)和小于約0.045mg/kg/小時(0.833(ig/kg/分鐘)的ala-TFPI劑量率，或等于至少約0.020mg/kg/小時和小于約0.040mg/kg/小時的ala-TFPI劑量率，最優(yōu)選等于約0.025mg/kg/小時(0.417pg/kg/分鐘))的ala-TFPI劑量率。給藥途徑通常是靜脈內(nèi)輸液，優(yōu)選連續(xù)靜脈內(nèi)輸液。輸液可進行至少約72、96、120或240小時。連續(xù)輸液優(yōu)選進行3-8天，更優(yōu)選3-6天，最優(yōu)選約4天。"通過連續(xù)輸液"給藥意味著在處方指定期間輸液大致維持于處方指定的速率而無實質(zhì)性中斷。或者，可采用間歇性靜脈內(nèi)輸液。如果采用間歇性輸液，則應(yīng)采用與上述連續(xù)輸液劑量率相等的時間平均劑量率。此外，間歇性輸液方案導(dǎo)致的血清最大濃度不能超過采用連續(xù)輸液獲得的最大濃度的約20%以上。為避免患者產(chǎn)生的不良反應(yīng)，特別是涉及出血的副作用，劑量率應(yīng)小于約0.050mg/kg/小時連續(xù)靜脈內(nèi)輸液(給予)ala-TFPI的劑量率。由于用凝血酶原試驗測定蛋白質(zhì)濃度和生物學(xué)活性中存在誤差，本文所述的所有劑量，包括劑量率和總劑量在實施中會有高達10%的差異。因此，高于或低于本文所述劑量10%的任何實際給予劑量均應(yīng)認為等于所述劑量。為此原因，所有劑量稱為"大約的"特定劑量。例如，描述為"約0.025mg/kg/小時"的劑量應(yīng)認為等于范圍0.0225-0.0275mg/kg/小時的任何實際劑量。實施本發(fā)明時，如果其后是低劑量TFPI給藥，也可采用TFPI或TFPI類似物的單次藥團注射或簡言之較高的輸液速率。例如，可釆用單次藥團注射或較高的輸液速率來減少所給予的TFPI或TFPI類似物在患者循環(huán)系統(tǒng)中達到的平衡時間。如此，可更快達到TFPI的最終穩(wěn)態(tài)血漿水平，TFPI的受體可更快飽和。以約0.025mg/kg/小時給予人體ala-TFPI2小時可將TFPI(加上ala-TFPI)的血槳水平從約80ng/ml提高到約125ng/ml，或提高約50%。如果再增加輸液速率或采用單次藥團注射，還可更快速地達到同一水平。如果連續(xù)輸液直至獲得穩(wěn)態(tài)，較高的輸液速率可導(dǎo)致較高的水平。發(fā)現(xiàn)以約0.050mg/kg/小時給予ala-TFPI在膿毒癥患者體內(nèi)達到的穩(wěn)態(tài)水平約是300ng/ml,以約0.33或約0.66mg/kg/小時給予ala-TFPI達到的穩(wěn)態(tài)水平至少約2^g/ml。在單次連續(xù)輸液或分開的輸液劑量中，給予宿主的每日總劑量可以是，例如等于以至少約0.006mg/kg/天到小于約1.2mg/kg/天給予ala-TFPI，或更常見等于以約0.24mg/kg/天到小于約1.2mg/kg/天給予ala-TFPI，優(yōu)選等于以約0.6mg/kg/天給予ala-TFPI的的用量。該范圍內(nèi)較低的用量可用于預(yù)防或其它目的。給予該范圍的較高劑量可用于治療重癥CAP。本發(fā)明的給藥方案也可表示為給予患者的總劑量?？倓┝渴禽斠核俾逝c輸液總時間的數(shù)字乘積。例如，當ala-TFPI的優(yōu)選劑量率約0.025mg/kg/小時時，優(yōu)選的輸液時間96小時，總劑量約2.4mgala-TFPI/kg體重。在一個實施方案中，ala-TFPI的優(yōu)選劑量率約0.25mg/kg/小時，優(yōu)選的輸液時間96小時，總劑量約24mgala-TFPI/kg體重。在一個實施方案中，ala-TFPI的優(yōu)選劑量率約0.75mg/kg/小時，優(yōu)選的輸液時間96小時，總劑量約72mgala-TFPI/kg體重。在另一實施方案中，按照本發(fā)明所給予的TFPI的總劑量等于至少約0.75嗎/kg和小于約4.8mg/kg的ala-TFPI?？倓┝績?yōu)選等于至少約1mg/kg和小于約4.8mg/kg的ala-TFPI?？倓┝扛鼉?yōu)選等于約2.4mg/kg的ala-TFPI。22可用于調(diào)整劑量方案的因素之一是通常用凝血酶原時間(PT)試驗檢測的每位患者的凝血功能，或國際標準化比例(INR)。INR是對國際參比品促凝血酶原激酶試劑進行校驗的PT試驗的標準化。參見，例如R.S.Riley等，J.Clin丄ab.Anal.，14:101-114，(2000)。在所觀察到的血槳濃度范圍中，健康人志愿者中對ala-TFPI的INR反應(yīng)大致是線性的(圖3)。血槳ala-TFPI濃度每增加1pg/ml，INR的總變化是1.2個單位。在藥效學(xué)模型中，對數(shù)-線性模型最好地描述了對ala-TFPI的INR反應(yīng)，其中對數(shù)INR與ala-TFPI血漿濃度線性相關(guān)。反應(yīng)的對數(shù)-線性性質(zhì)意味著INR基線值(baseline)升高的對象可能比具有相似ala-TFPI循環(huán)水平而基線值低的對象經(jīng)歷了更高的抗凝血應(yīng)答。上述給藥方案，包括基于mg/kg/小時的劑量率和每日總劑量表示為"等于給予參比ala-TFPI"的劑量。這意味著可通過標準化為"參比ala-TFPI"的劑量來定量測定這些劑量，所述"參比ala-TFPI"定義為成熟的100%純(以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ))、正確折疊、有生物學(xué)活性、非糖基化的ala-TFPI。Ala-TFPI是TFPI的類似物，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。其它形式的TFPI也可用于本發(fā)明，包括成熟的全長TFPI及其類似物。為確定用除ala-TFPI以外的TFPI形式和純度小于100y。的ala-TFPI或另一種TFPI類似物制劑來實施本發(fā)明的合適劑量范圍，可根據(jù)TFPI具體形式的內(nèi)在生物學(xué)活性調(diào)整上述參比ala-TFPI的劑量范圍，還可根據(jù)該制劑的生化純度來調(diào)整。在一優(yōu)選實施方案中，患者在接受第一次TFPI給藥的10天內(nèi)不接受抗凝血劑。在一優(yōu)選實施方案中，患者在接受第一次TFPI給藥的7天內(nèi)不接受抗凝血劑?；颊邇?yōu)選在接受第一次TFPI給藥的24小時內(nèi)不接受肝素形式。在一個實施方案中，患者在接受第一次TFPI給藥的IO小時內(nèi)、優(yōu)選12小時內(nèi)不接受傳統(tǒng)肝素。在一個實施方案中，患者在接受第一次TFPI給藥的20小時內(nèi)、優(yōu)選24小時內(nèi)不接受低分子量肝素。在一個實施方案中，患者在接受第一次TFPI給藥的10小時內(nèi)、優(yōu)選12小時內(nèi)不接受替加色羅-a(drotrecogin-alpha)低分子量肝素。TFPI或TFPI類似物的內(nèi)在生物學(xué)活性指如同凝血酶原試驗測定的成熟、100%純、正確折疊的TFPI或TFPI類似物的特異形活性。因此，等價劑量計算為(參比ala-TFPI劑量)/((相對的內(nèi)在活性)乘以(生化純度))，其中相對的內(nèi)在活性指(類似物的內(nèi)在活性)/(參比ala-TFPI的內(nèi)在活性)。例如，如果具體TFPI類似物具有參比ala-TFPI的內(nèi)在生物學(xué)活性的80%,則可將參比ala-TFPI的劑量值除以0.8得到該具體TFPI類似物的等價劑量。此外，如果給予患者的制劑例如只有90%的生化純度，即含有10%無TFPI生物學(xué)活性的分子，則通過將劑量值除以0.9來額外校正ala-TFPI的參比劑量值。因此，假定給予的TFPI類似物具有ala-TFPI的80%內(nèi)在活性并且是90%生化純，則等于給予0.025mg/kg/小時參比ala-TFPI的劑量率是0.0347mg/kg/小時(即，0.025/(0,8X0.9))。當不知道內(nèi)在活性或生化純度時也可通過測定相對生化活性來確定等價劑量。可利用凝血酶原時間試驗通過比較具體的TFPI類似物與TFPI生物學(xué)活性標準品來測定相對生物學(xué)活性。例如，根據(jù)WO96/40784的實施例9的方法產(chǎn)生的ala-TFPI(含有約85%生物學(xué)活性的TFPI分子)可用作TFPI生物學(xué)活性標準品。在凝血酶原試驗中，根據(jù)WO96/40784的實施例9的方法產(chǎn)生的ala-TFPI具有參比ala-TFPI約85%的活性。在繪制凝血酶原時間標準曲線時，按凝血時間的對數(shù)與TFPI濃度的對數(shù)作圖。如果TFPI生物學(xué)活性標準品具有參比ala-TFPI的85。/。的活性，則所制的標準曲線等于參比ala-TFPI的，如果在作圖前將TFPI生物學(xué)活性標準品的濃度乘以0.85，則圖示的活性等于100%純的參比ala-TFPI的活性。當將具體TFPI類似物的凝血時間與標準曲線比較時，可從曲線讀出參比ala-TFPI的相等濃度。或者，如果標準曲線線性部分的斜率是通過線性回歸分析得到，則可根據(jù)TFPI生物學(xué)活性標準品與參比ala-TFPI的活性比較來校正該斜率。因此，具體TFPI類似物的相對生物學(xué)活性等于參比ala-TFPI活性與該類似物活性之比。例如，如果某具體類似物需要1.43pg來產(chǎn)生與1.00嗎參比ala-TFPI相同的凝血酶原時間活性，則該類似物的相對生物學(xué)活性是1.00/1.43或0.7。就該類似物而言，通過將參比ala-TFPI劑量除以該類似物的相對生物學(xué)活性獲得參比ala-TFPI劑量的等價劑量。例如，0.025mg/kg/小時的參比ala-TFPI劑量等于該類似物的0.0357mg/kg/小時(即，0.025/0.7)。雖然TFPI或TFPI類似物可作為單用的活性抗凝血藥物給予，但這些分子也可與一種或多種其它治療性藥物聯(lián)用以提供對重癥肺炎的聯(lián)合治療作用。所述的其它治療性藥物包括抗體，例如抗-內(nèi)毒素的單克隆抗體(例如，結(jié)合內(nèi)毒素的單克隆抗體)和抗-TNF抗體產(chǎn)品，例如抗-TNF小鼠單克隆抗體。TFPI和TFPI類似物也可與白介素-1受體拮抗劑、殺菌/滲透增加(BPI)蛋白、免疫剌激劑、具有抗炎活性的化合物例如PAF拮抗劑和細胞粘著阻斷劑(例如，抗血小板藥物，如GPIIb/IIIa抑制劑)聯(lián)用。當聯(lián)合給藥時，可將這些治療性藥物配制為獨立的組合物在同時或不同時間給予。其它治療性藥物優(yōu)選同時給予(即，在TFPI或TFPI類似物給藥期間)或在TFPI或TFPI類似物給藥期間的24小時內(nèi)(即，在TFPI或TFPI類似物給藥期間開始之前或開始之后的24小時內(nèi))給予。其它治療性藥物也可作為一種組合物與TFPI或TFPI類似物一起給予。TFPI或TFPI類似物也可與其它能有效治療重癥肺炎的藥物聯(lián)合給予。例如，以下藥物可與TFPI或TFPI類似物聯(lián)合給予可治療潛伏細菌感染的抗生素、直接針對細菌細胞壁組分的單克隆抗體、可與參與重癥肺炎(發(fā)病)途徑的細胞因子形成復(fù)合物的受體，通常能與細胞因子或其它激活的或擴增的生理途徑相互作用的任何藥物或蛋白質(zhì)，包括能緩解重癥肺炎和/或其癥狀的補體蛋白質(zhì)。有用的抗生素包括通用類別的p-內(nèi)酰胺環(huán)(青霉素)、糖苷鍵中的氨基糖(氨基糖苷類)、大環(huán)內(nèi)酯環(huán)(大環(huán)內(nèi)酯類)、并四苯羧酰胺(napthacenecarboxanide)的多元環(huán)衍生物(四環(huán)素類)、硝基苯的二氯乙酸衍生物、肽(桿菌肽、短桿菌肽和多粘菌素)、含偶聯(lián)雙鍵系統(tǒng)的大環(huán)(多烯類)、衍生自磺胺的磺胺類藥物(磺胺類)、5-硝基-2-呋喃基(硝基呋喃類)、喹諾酮羧酸(萘啶酸)和許多其它抗生素。其它抗生素和上述特異性抗生素的更多形式見《化學(xué)技術(shù)百科全書》(EncyclopediaofChemicalTechnology),第三版，Kirk-Othymer(編)，第2巻，第782-1036頁，(1978)和第3巻，第1-78頁;Zinsser,《微生物學(xué)》(MicroBiology)，第17版，WJoldik等(編)，第235-277頁，(1980)或《Dorland圖示醫(yī)學(xué)字典》(Dorland'sIllustratedMedicalDictionary),第27版，W.B.SaundersCompany,(1988)?？膳cTFPI或TFPI類似物聯(lián)用的其它藥物包括內(nèi)毒素拮抗劑，例如E5531(脂質(zhì)A類似物，參見Asai等，Biol.Pharm.Bull.，22:432，(1999));具有抗凝血活性的TF類似物(參見，例如Kelley等，Blood，89:3219，(1997);Lee和Kelley，J.Biol.Chem.，273:4149，(1998));針對細胞因子的單克隆抗體，例如抗IL-6或M-CSF單克隆抗體，參見1989年12月15日提交的美國專利系列號07/451,218，和抗TNF單克隆抗體(參見Cerami等，美國專利號4,603,106);將成熟的TNF激素原從產(chǎn)生它的細胞上切下的蛋白質(zhì)的抑制劑(參見1989年8月6日提交的美國專利系列號07/395,253);IL-1拮抗劑(參見1990年5月1日提交的美國專利系列號07/517,276);IL-6細胞因子表達的抑制劑，例如抑制素(參見美國專利號5，942,220)和基于各種細胞因子，例如IL-1受體的抑制劑。也可采用補體的抗體或補體蛋白抑制劑，例如CR。DAF和MCP。本文引用的所有專利、專利申請和參考文獻全文納入本文作為參考。下文將參考描述了優(yōu)選實施方案的以下實施例來說明本發(fā)明。然而，應(yīng)注意這些實施方案是說明性的，不以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例1重癥肺炎患者的ala-TFPI治療評價重癥肺炎患者來研究ala-TFPI治療對相對均一(患者)組可能的作用。如果研究人員證明膿毒血癥來源之一是肺炎，則肺炎患者得到鑒定。也可存在其它感染部位。由于難于區(qū)分化學(xué)藥物后遺癥(chemicalsequdae)所致的感染，不包括吸入性肺炎(患者)。然后將鑒定的肺炎患者分為培養(yǎng)物陽性(感染的任一證據(jù)，例如培養(yǎng)物或革蘭菌株(陽性))或培養(yǎng)物陰性(陰性培養(yǎng)物或未培養(yǎng))。利用大腸桿菌中表達的非糖基化ala-TFPI制劑，以0.025mg/kg/小時劑量，通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液治療患者，所述制劑用含300mML-精氨酸、20mM檸檬酸26鈉、pH5.5、摩爾滲透壓濃度為560+/-110mOsm的緩沖液配制。安慰劑由不含ala-TFPI的同一緩沖液組成，輸液速率與所研究藥物相同。這些分析的結(jié)果證明ala-TFPI治療對那些培養(yǎng)物陽性肺炎患者有正面作用(表1)。無感染來源證據(jù)的那些患者顯示陰性結(jié)果。表1.肺炎狀況的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在給予或未給予肝素的患者群中顯示高INR的培養(yǎng)物陰性組的死亡率升高，雖然應(yīng)注意肺炎培養(yǎng)物陰性、未給予肝素組對象數(shù)量相對較少(表3)。培養(yǎng)物陽性/未給予肝素的患者觀察到強烈的正面治療效果。表3.肺炎狀況和(是否給予)肝素(治療)的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例2檢測疾病變量的基線嚴重性評估了許多疾病變量的基線嚴重性(baselineseverity)來測定是否有能解釋所觀察結(jié)果的組失衡(groupimbalance)。這些數(shù)據(jù)表明與培養(yǎng)物狀態(tài)相關(guān)的結(jié)果存在差異不是由于基線失衡所致。因此，這些結(jié)果顯示感染和未感染患者之間的生物學(xué)差異導(dǎo)致TFPI治療的不同效果。盡管在經(jīng)TFPI治療的肺炎培養(yǎng)物陰性組中嚴重性指標(例如，II評分或器官功能障礙評分)等于或低于安慰劑，但培養(yǎng)物陰性組顯示總死亡率最高(表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>IL-6是膿毒癥早期升高、反映炎性應(yīng)答強度并與結(jié)局相關(guān)的炎性細胞因子。IL-6的基線水平在臨床鑒定為肺炎但無感染證據(jù)的患者中較低(表5)。這提示證明有肺炎感染源和無明顯感染源的患者之間存在生物學(xué)差異。相矛盾的是培養(yǎng)物陰性TFPI組的基線IL-6水平最低，但死亡率最高。在膿毒血癥患者群中，IL-6水平隨時間推移而降低。經(jīng)TFPI治療的肺炎培養(yǎng)物陰性對象中IL-6的降低速率減慢(表5)。這提示在感染和未感染患者之間TFPI的生物學(xué)作用不同。表5.(不同)肺炎狀態(tài)時的IL-6<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實施例3分析重癥肺炎患者經(jīng)證實的感染類型如上所述，在感染最確定的患者，即血液培養(yǎng)陽性的患者中觀察到ala-TFPI治療的總益處。分析了證實感染類型的重癥肺炎患者，在血液培養(yǎng)陽性和具有其它證據(jù)的對象中觀察到ala-TFPI治療有效(表6)。其作用在菌血癥組，即感染可能性最高或有最明顯感染源的組中最強。表6.(不同)培養(yǎng)物狀態(tài)和肺炎狀態(tài)的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>如上所示，在不用肝素時，證實感染的患者(血液+"其它"證據(jù))從TFPI治療中獲益。肺炎組的藥效最可能導(dǎo)致該結(jié)果(表7)。此發(fā)現(xiàn)似乎表明內(nèi)源性抗凝劑的效益在重癥肺部感染的患者中最好。表7.(不同)感染狀態(tài)、肺炎狀態(tài)和使用肝素的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>為進一步限制不均勻性，以后的試驗致力于社區(qū)獲得性肺炎(CAP)。在醫(yī)院染上肺炎(醫(yī)院內(nèi)肺炎)的患者最可能有病原生物定居并具有其它肺病而使感染性肺炎更難診斷。此外，CAP患者曾經(jīng)接觸肝素的可能性低于醫(yī)院內(nèi)肺炎患者。當利用治療前住院時間長短來分析數(shù)據(jù)時，注意到住院多于等于2天但培養(yǎng)物陽性的患者(社區(qū)獲得性)與住院超過2天的患者(醫(yī)院內(nèi))藥效相似。主要在醫(yī)院組的培養(yǎng)物陰性患者中觀察到負面作用(表8)。表8.住院(染上的)肺炎狀態(tài)和時間長短的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>權(quán)利要求1.一種治療或預(yù)防重癥肺炎的方法，包括通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液給予患有或處于重癥肺炎風(fēng)險中的患者TFPI或TFPI類似物，其劑量率等于以低于約1.0mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI，并且患者在給予TFPI或TFPI類似物的24小時內(nèi)不接受抗凝劑。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述患者具有可證實的感染。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液給予，其劑量率等于以低于約0.80mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述劑量率等于以約0.25-0.10mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI，并且所述TFPI或TFPI類似物至少給予約72小時。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述劑量率等于以約0.010-0.10mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于,所述劑量率等于以約0.020-0.08mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物至少給予約96小時。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。12.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液給予，提供的總劑量等于以約0.025-2.5mg/kg的總劑量給予參比ala-TFPI。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。14.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液給予，其劑量率等于以約0.02-0.09mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。16.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液給予，提供的每日劑量等于以約0.06-4mg/kg的每日劑量給予參比ala-TFPI。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物包含由SEQIDNO:1的氨基酸19-89構(gòu)成的第一Kunitz結(jié)構(gòu)域。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物還包含由SEQIDNO:1的氨基酸90-160構(gòu)成的第二Kunitz結(jié)構(gòu)域。20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物包含SEQIDNO:1的氨基酸1-160。21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物包含由SEQIDNO:1的氨基酸90-160構(gòu)成的第二Kunitz結(jié)構(gòu)域。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。23.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物從包含TFPI或TFPI類似物的凍干組合物制備。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。25.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物以含精氨酸的制劑給予。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。27.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物以含檸檬酸鹽的制劑給予。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。29.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI類似物在含約300mM鹽酸精氨酸和約20mM檸檬酸鈉，pH約5.5的制劑中濃度約為0.15mg/ml。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。31.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，還包括在給予所述TFPI或TFPI類似物的同時或24小時內(nèi)給予選自以下的其它藥物抗生素、抗體、內(nèi)毒素拮抗劑、具有抗凝血活性的組織因子類似物、免疫刺激劑、細胞粘著阻斷劑、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗劑、pafase(PAF酶抑制劑)、TNF抑制劑、IL-6抑制劑和補體抑制劑。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述其它藥物是抗體，其中所述抗體與選自TNF、IL-6和M-CSF的抗原能特異性結(jié)合。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。35.—種治療重癥肺炎的方法，包括給予患者(i)TFPI或TFPI類似物和(ii)選自抗生素、單克隆抗體、細胞因子抑制劑和補體抑制劑的其它藥物。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述TFPI類似物是非糖基化的ala-TFPI。37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述患者具有可證實的感染。38.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，通過連續(xù)靜脈內(nèi)輸液給予TFPI或TFPI類似物，其劑量率等于以低于約1.0mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述劑量率等于以約0.001-0.090mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述劑量率等于以約0.002-0.050mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述劑量率等于以約0.002-0.010mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述劑量率等于以約0.0025-0.075mg/kg/小時的劑量率給予參比ala-TFPI。全文摘要預(yù)防性或治療性治療重癥肺炎的方法，包括給予患有或處于該疾病風(fēng)險的患者組織因子途徑抑制劑(TFPI)或TFPI類似物。所述方法包括采用TFPI或TFPI類似物的連續(xù)靜脈內(nèi)輸液，優(yōu)選低劑量以避免不良副作用。文檔編號A61K38/57GK101426520SQ200580014406公開日2009年5月6日申請日期2005年3月17日優(yōu)先權(quán)日2004年3月17日發(fā)明者A·克里西申請人:諾華疫苗和診斷公司