專利名稱：用于治療局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的集落刺激因子組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的治療。尤其涉及一種集落刺激因子(CSF)組合物，用于治療口腔和竇部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病。
背景技術(shù)：
牙周疾病由牙菌斑內(nèi)的細菌和毒素引起，牙菌斑是粘附的無色薄膜，它持續(xù)形成于牙齒表面。牙周疾病很常見；據(jù)估計其影響世界上70-90％的人群，并且是35歲以上人群牙齒缺失的主要原因。
牙周疾病具有多種形式。最常見的包括牙齦炎、侵蝕性牙周炎和慢性牙周炎。
牙齦炎是最輕微的牙周疾病，導致牙齦紅腫，并且容易出血。如果不加治療，牙齦炎將會發(fā)展為牙周炎。牙周炎表明感染已經(jīng)發(fā)展到將牙齒固定在顎骨上的那些口腔組織。如果不加治療，牙周炎最終將導致受影響的牙齒缺失。
侵蝕性牙周炎可能發(fā)生于那些其它臨床方面健康的病人。其特點是快速的附著喪失、骨質(zhì)破壞和家族性聚集。臨床上，可觀察到牙齦的慢性感染，牙周袋出血，牙槽骨吸收以及類似癥狀，并且已知牙齒的活動和移動是由于損壞提前發(fā)生，最終引起牙齒的自發(fā)性缺失或拔出。
慢性牙周炎是牙周炎最常見的形式，其結(jié)果是牙齒的支持組織內(nèi)部發(fā)炎，附著逐漸喪失以及牙槽骨逐漸吸收。這種形式的牙周炎其特點是形成牙袋和/或牙齦萎縮。由于提前損壞，牙齒的活動和移動增多，最終引起牙齒的自發(fā)性缺失或拔出。
非外科手術(shù)治療牙周包括刮治和根面平整，可任選隨后附加治療如局部給予抗菌劑，主要是四環(huán)素抗生素，其目的是消滅和牙周炎有關(guān)的細菌。然而，牙周疾病通常非常難治，中止治療后潛在的病原體常常返回袋中。此外，外科手術(shù)或拔牙可能是最終的手段。
為了克服再次發(fā)生細菌性感染的問題，采用長期的抗菌治療，但是這種形式的治療可能產(chǎn)生耐藥性菌株和更嚴重的感染。抗菌劑例如口腔清洗劑形式的洗必泰和季銨鹽，但是當以液體形式給藥時，這些藥劑不能影響齦下菌群，因為它們不能滲透到產(chǎn)生疾病的袋中。因而，它們不能用作口腔清洗劑來治療牙周疾病。
竇通常是鼻周圍面部骨骼內(nèi)存在的無菌空氣空間，包括顴骨內(nèi)的區(qū)域和眼上部的前額骨內(nèi)的區(qū)域。牙齒和齒齦的感染可擴展到竇，這種感染因而被稱為竇炎。竇炎可能是急性的(癥狀存在時間少于1個月左右)、亞急性的(癥狀存在時間大約1到4個月)或慢性的(癥狀存在時間大于4個月左右)。
涉及到竇炎的細菌通常有流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。在慢性竇炎中發(fā)現(xiàn)有更高比率的厭氧菌(例如，類桿菌屬、類鏈球菌和梭桿菌)。
竇炎的癥狀包括鼻塞和大量濃稠、有色的鼻涕、滴鼻后味覺差、咳嗽、頭部充血，伴隨頭痛、感覺面部腫脹、牙疼、持續(xù)疲勞以及偶爾發(fā)燒。感染可能波及面部骨骼或者腦膜(腦膜炎)。少數(shù)情況下，竇炎還可能發(fā)展到在眼窩、大腦或面部骨骼內(nèi)形成膿袋(砂眼)。
鎮(zhèn)痛藥例如對乙酰氨基酚，有助于減輕疼痛和降溫。解充血藥例如假麻黃堿，可減輕鼻內(nèi)腫脹并且使竇排液。然而，通常情況下，長期使用解充血藥實際上會加劇鼻腔堵塞。同樣，可以使用抗菌劑治療，但是可能產(chǎn)生耐藥性。最后，可能進行鼻內(nèi)鏡外科手術(shù)。
M.van Agtoyen等(Rhinology，40，69-74，2002)提到非中性粒細胞減少癥課題的臨床研究已經(jīng)表明非格司亭(Filgrastim，一種重組粒細胞集落刺激因子)可能對非中性粒細胞減少病人的嚴重細菌和機會真菌感染的治療過程的附加治療中有益。根據(jù)作者報道，對患嚴重慢性細菌性竇炎的病人的治療是通過每天給藥兩次環(huán)丙沙星500-750毫克和三次克林霉素450-600毫克，連續(xù)14天，最初14天同時皮下給藥非格司亭300微克(或皮下給予安慰劑)每天一次，另外1O周交替地每天皮下給藥非格司亭300微克或安慰劑。在這種情況下，白細胞的總數(shù)增加了，因而免疫力也增強了。
Brent Weston等人(Journal of laboratory and clinical medicine117(1991)4)和J.Goultchin等人在一個案例報告(J.Periodontol，2000年9月)中描述了G-CSF對幾個先天性中性粒細胞減少病人牙齒疾病的治療效果。他們靜脈注射該物質(zhì)以刺激骨髓，表明對牙周炎和口腔潰瘍有改善作用。這被認為是由于增強了免疫力的緣故。和大多數(shù)病人進行對比很困難，因為患先天性中性粒細胞減少癥的病人從幼年期開始牙齒發(fā)育就失調(diào)了。
Gamoual J.等人(J.Chin.Periodontology 2003；30；616-62)提到對慢性牙周炎病人的研究中考慮到中性粒細胞的凋亡。盡管健康人和牙周炎病人的牙齦樣品中的GM-CSF總量沒有顯著差異，他們?nèi)匀惶岢鲆粋€新的機理，即中性粒細胞在成年牙周炎病人的牙周組織累積。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)GM-CSF減少了中性粒細胞的凋亡。他們沒有治療任何病人或討論這種可能性。
臨床上，CSF組合物已經(jīng)用于治療由癌癥化療或放療引起的骨髓抑制。也提出了CSF的其它臨床用途。因而，WO03/039444公開了使用各種趨化因子和細胞因子即CSF，治療病毒和/或真菌性皮膚病。美國第6689351號專利公開了通過GM-CSF的局部給藥，促進各種創(chuàng)傷病人的傷口加速愈合。
已經(jīng)被研究過CSF的化學結(jié)構(gòu)，并且采用技術(shù)方法進行了說明，例如X-射線晶體衍射和核磁共振，參見Hill C.P.，Osslund T.D.，Eisenberg D.The structure of granulocyte-colony-stimulatingfactor and its relationship to other growth factors.Proc Natl Acad SciA 90，pp.5167(1993)和Zink T.，Ross A.，Luers K.，Cieslar C.，Rudolph R.，Holak T.A.Structure and dynamics of the humangranulocyte colony-stimulating factor determined by NMRspectroscopy.Loop mobility in a four-helix-bundle protein.Biochemistry 33，pp.8453(1994)。
本發(fā)明最重要的方面是快速消除感染和細菌性相關(guān)疾病之后的牙齒再鈣化。該目的是通過局部治療來完成的，而不是傳統(tǒng)的刺激骨髓的方式。
從再鈣化可以得出一個結(jié)論，那就是該方法還可以用于治療骨折。
似乎細菌性竇炎和牙周疾病都是局部的細菌感染和細菌性相關(guān)疾病，雖然程度不同，都可能傾向于轉(zhuǎn)為慢性并最終不得不通過外科手術(shù)來治療。很明顯，這兩種疾病都仍然需要有效的藥物，以避免外科手術(shù)和化療，例如抗生素治療。優(yōu)選地，這樣的藥物能夠提供實質(zhì)上的總體治療，以降低再次發(fā)作的可能性。換句話說，如果能夠在例如牙齦和牙齒患有從牙齦炎到牙周炎的各種牙周疾病期間，使疾病得到不僅短期的而且長期的改善，這樣的藥物將是非常有益的。尤其是，即使對晚期牙周炎也不需要進行外科手術(shù)介入的藥物，將是極度有益的。
本發(fā)明的主要目的是提供這種藥物。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明涉及到至少一種集落刺激因子(CSF)或其實質(zhì)上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物在制備治療局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病以及感染骨組織再鈣化的藥物中的用途。
另一方面，本發(fā)明提供了一種包含至少一種CSF或其片段或衍生物的組合物，用于治療局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病。
又一方面，本發(fā)明涉及到一種治療哺乳動物細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的方法，給予有效治療劑量的至少一種CSF或其實質(zhì)上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物。在本發(fā)明中，CSF用于激發(fā)巨嗜細胞和粒細胞的產(chǎn)生，和通常使用的將骨髓作為靶標的靜脈(i.v.)或皮下(s.c.)路線不同。
CSF可以是粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)或多能集落刺激因子(multi-CSF)。
根據(jù)本發(fā)明的治療方法，通過兩個步驟來治愈牙周疾病1.根除細菌感染和細菌性相關(guān)疾?。缓?.使牙齒長到骨骼上(再鈣化)。
本發(fā)明的具體方面和內(nèi)容如權(quán)利要求中的定義。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明是基于驚人發(fā)現(xiàn)即至少一種有效治療劑量的CSF局部給藥能夠明顯改善局部細菌感染或細菌性相關(guān)疾病。的確，正如下文的一個實施例所述，通過對嚴重牙周炎、事實上正準備拔掉的牙齒附近牙齦組織注射僅僅一個劑量的GM-CSF制劑，牙齒就保住了；牙齒的病情很快得到改善并且沒有復發(fā)。
另一方面，我們注意到注射GM-CSF不僅對病人的牙患有效，并且對病人的慢性竇炎也有效。確實，在注射之后，病人感到鼻竇堵塞有顯著的好轉(zhuǎn)，鼻內(nèi)流出難聞的膿液，竇炎隨之痊愈。
CSF局部治療主要通過活化和趨化起作用。
不受制于任何理論，在低劑量給藥情況下，CSF局部治療激發(fā)局部的免疫防御能力而不產(chǎn)生任何顯著的系統(tǒng)效果，另外，在牙周炎中牙槽骨被吸收的情況下，骨的再生能力被局部激發(fā)。
本發(fā)明一個很大的優(yōu)點是，局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病可以通過身體有限部位的局部給藥小劑量的本發(fā)明組合物進行治療，而不產(chǎn)生任何對治療主體的顯著的系統(tǒng)效果。
因此，本發(fā)明涉及到一種治療局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的藥物和方法。所述“局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病”指的是實質(zhì)上使哺乳動物的局部身體痛苦的細菌感染和細菌性相關(guān)疾病。因此，牙周疾病和竇炎屬于局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病，例如敗血病就不屬于該疾病。
細胞因子是白細胞和其它幾種類型的體細胞分泌的一種常規(guī)蛋白質(zhì)。它們的多效性行為包括調(diào)節(jié)先天性和適應性免疫反應以及調(diào)節(jié)炎性反應。有各種各樣的細胞因子如白細胞介素、干擾素、血小板活化因子和集落刺激因子(CSF)。CSF可以被細分為粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)以及多能集落刺激因子(multi-CSF，也稱為白細胞介素-3)。
CSF為骨髓前身存活、再生和分化所必須，以形成成熟的中性粒細胞、單核細胞和成熟的巨嗜細胞，以控制白血球的產(chǎn)生。例如，G-CSF刺激優(yōu)勢中性粒細胞集落的產(chǎn)生。另一方面，M-CSF僅僅對巨嗜細胞前身有用。M-CSF出現(xiàn)在胚胎形成的早期，對該多肽具有潛在的促進作用。GM-CSF控制巨嗜細胞和粒細胞前身細胞的不可逆行為。盡管GM-CSF和G-CSF作用于同一前身細胞世系，它也刺激巨嗜細胞的產(chǎn)生。
GM-CSF對成熟骨髓細胞的功能也具有重大的影響，包括增強抗體的產(chǎn)生、噬菌作用和細胞毒性。在較低濃度下，例如本發(fā)明所述的，骨髓細胞的這種活性主要是局部效果。
CSF可以通過例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組技術(shù)來制備(rCSFs)。例如歐洲第0188479號專利，公開了通過培養(yǎng)被含有編碼靈長類GM-CSF蛋白的基因的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞，來制備重組GM-CSF(rGM-CSF)。重組的人類GM-CSF的生產(chǎn)程序也已經(jīng)被Burgess等人描述過[(1987)Blood，Vol.69，No.143-51]。重組G-CSF(rG-CSF)的生產(chǎn)方法已經(jīng)在美國第4810643號專利中描述過。
CSF也可以通過商業(yè)途徑得到。例如Molgramostim，一種重組GM-CSF，Schering-Plough出品，商品名Leucomax。另一種重組GM-CSF是Sargramostim，德國Schering AG出品，商品名Leukine。非格司亭(Filgrastim)是一種重組G-CSF，Amgen出品，商品名Neupogen和Granulokine。
任何CSF類似物或衍生物，只要具有可比的或增強的體內(nèi)生物活性就可用于本發(fā)明。CSF類似物可通過消去、引入、或取代天然存在的糖蛋白主結(jié)構(gòu)中的氨基酸或通過對糖蛋白進行化學修飾而產(chǎn)生。
優(yōu)選地，CSF以藥劑或由有效治療劑量的CSF和一種或多種藥學上可接受的載體和/或輔料組成的組合物的方式給藥。使用的載體必須和制劑中的所有成分配伍。任意配制方法包括將生物活性成分引入載體和/或輔料，例如將CSF溶解或懸浮在液體或半液體賦形劑或載體中。
根據(jù)本發(fā)明，合適的局部給藥制劑包括有效治療劑量的治療劑和一種或多種藥物可接受載體和/或輔料。優(yōu)選水作為載體。
例如，CSF制劑可以是小瓶裝的消毒注射液。它也可以是凍干滅菌的粉劑，用滅菌水或抑菌水重新構(gòu)成注射液。
本發(fā)明的藥劑也可以是多種CSF的混合物，例如GM-CSF與G-CSF和/或M-CSF結(jié)合。這種藥劑可以和僅有一種CSF作為活性成分的組合物以同樣的方式制備和給藥。
關(guān)于藥物制劑和制備藥物制劑的方法的一般信息，可以參考Remington的著作The Science and Practice of Pharmacy，19th ed.，Mack Printing Company，Easton，Pennsylvania(1995)。
本發(fā)明的制劑在哺乳動物、優(yōu)選人的鼻腔和/或口腔局部給藥，使藥劑穿透粘膜。當治療牙周疾病時，優(yōu)選在患病區(qū)域附近例如在牙周裂縫中或其附近注射。注射劑可以局部注射到牙槽骨周圍的牙周組織中，也即牙齦、牙槽粘膜、舌下粘膜、上腭部等部位中?？梢院线m地采用美國第6,682,718號專利討論的“牙槽粘膜注射方法”。在該方法中，在牙齦附近柔軟的口腔粘膜區(qū)不是垂直而是平鋪的位置插入一根針，將藥液注射到牙槽骨膜和牙槽粘膜之間。
本發(fā)明藥劑也可以在鼻腔和口腔通過噴射方式給藥。給藥次數(shù)可以一天一次或一天數(shù)次。
局部注射的CSF制劑可包含無菌水或非水溶液，以及懸浮劑或乳化劑。水溶液的例子包括注射用蒸餾水和生理鹽水。制劑可進一步包括助劑例如抗菌劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑、助溶劑和等滲劑。通過能滯留細菌的過濾器過濾制劑，通過殺菌劑或輻射方式來滅菌。制劑可以在滅菌條件下制備或通過首先制備無菌固體組合物，然后在使用之前將其溶解在無菌水或無菌溶劑中得到注射液。
也可通過凝膠的方式給藥，或通過任何其它具有類似流變性能的藥物載體，例如包含一種緩釋劑，直接施用于牙齦或牙周裂縫中，或通過灌輸裝置，將適量的CSF以合適的速度給藥。美國第5,023,082號專利描述了治療牙周疾病所使用的灌輸裝置。美國第6,274,175號專利公開了GM-CSF緩釋劑。
對于竇炎的治療，CSF注射劑優(yōu)選在上腭進行，CSF制劑也可以通過噴入鼻孔或吸入鼻孔的方式給藥。
CSF的給藥劑量每次5-800μg，更優(yōu)選每次20-400μg，最優(yōu)選每次50-100μg之間。給藥頻率可以從每天一次至每三周一次，例如每周給藥一至三次?？偗熎诳梢詮呐紶柦o藥一次至三周。主治醫(yī)生能夠決定合適的給藥劑量、給藥頻率以及給藥期限。
還可以對治療對象給藥至少一種有效治療劑量的其它活性成分。這種活性成分的選擇取決于治療對象的具體情況。例如，為有效對抗疾病涉及到的細菌，組合物可以包含抗菌劑。例如當該疾病是牙周炎時，很可能涉及到厭氧菌，適合的抗菌化合物可以是抗菌甲硝噠唑。這種抗菌劑可以配合CSF一起給藥或單獨給藥，例如牙膠Elyzol。當然，同樣可以使用其它的抗菌劑。
其它活性成分還可以是例如磷酸鹽離子釋放制劑和/或鈣和維生素D3的組合。例如，在治療期或臨床主治醫(yī)師決定的給藥期中，給予0.5至2克鈣和20-100μg維生素D3。
其它的活性成分還可以選自鎂、螢石和維生素C和D，或它們的混合物，或任何上述提到的其它活性成分，例如鈣。
在竇炎的治療中，抗菌劑、解充血藥或甾族化合物也可獨立于CSF制劑或和CSF一起給藥。適合的解充血藥例子是Rinexin，適合的甾體制劑的例子是Nasonex噴霧劑。
可以使用CSF凍干制劑來制備本發(fā)明藥物。例如，這種制劑可以即時溶解在一種合適的液體載體中。如果不是立即使用，可以將這種CSF液體制劑保存在冰箱或冷庫中，或者通過添加本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的防腐劑以延長其保存期限。適合的防腐劑可以是苯甲醇，添加量占CSF水溶液制劑的重量百分比1-2％。
也可使用兩室注射器，裝有CSF凍干制劑和適合的液體載體，在室溫下保存。
另一種使用方式是使用單劑量的凝膠彈性小瓶并配備小針頭，用于感染牙齒周圍的袋中。
目前，本發(fā)明優(yōu)選的CSF是GM-CSF，采用液體注射液進行給藥，每劑0.05-0.2ml液體，含有50-100μg。
以下提供的實施例是為了更好地說明本發(fā)明，而不是意圖限制其范圍。
具體實施例方式
注射劑配方GM-CSF(Molgramostim)50μg注射用水適量(qs)100μl將Molgramostim溶解到注射用水中，并在室溫下緩慢攪拌。
牙周炎的治療實施例1男性病人，年齡47，患有嚴重的牙周炎。主治牙醫(yī)認為，尤其是一顆上牙無法補救，計劃將其拔掉。在該病人牙周裂縫附近注射單劑80μg GM-CSF，每周一次，連續(xù)三周。牙周感染和細菌性相關(guān)疾病痊愈，并且恢復了牙齒和腭骨的連接。
該病人也患有慢性竇炎。在接受GM-CSF注射之后，該病人的竇炎有顯著好轉(zhuǎn)并且在治療期間內(nèi)竇炎徹底痊愈。三年之后，此人仍未患過牙周炎。
實施例2女性病人，年齡59，患嚴重的牙周炎。牙齒的射線照相表明在幾顆牙齒周圍存在深的裂縫。在該病人牙周裂縫附近注射單劑50μg GM-CSF。病人有顯著好轉(zhuǎn)。注射三個月后在牙齒的同一部位射線照相?？梢悦黠@地觀察到牙齒狀況顯著改善——深的牙周裂縫消失了。
一年之內(nèi)沒有復發(fā)。
權(quán)利要求
1.至少一種集落刺激因子(CSF)、其實質(zhì)上具有CSF生物功能和活性的片段或它們的衍生物在制備局部治療哺乳動物局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的細菌感染和細菌性相關(guān)疾病是牙周疾病或竇炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中的牙周疾病是齦炎或牙周炎。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中的CSF選自粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)和多能集落刺激因子(multi-CSF)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中的CSF是GM-CSF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的用途，其中的藥物形式適于注射到牙齦粘膜中或應用于牙周袋中進行給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的用途，其中CSF、其片段或其衍生物在藥物中的量是例如單位劑量5μg-800μg。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中單位劑量是50μg-100μg。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的用途，其中給藥間隔是從一天一次至三周一次。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中一周給藥一至三次。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項的用途，其中的藥物包括至少一種有效治療劑量的并且生理上可接受量的其它活性成分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項的用途，其中的CSF、其片段或其衍生物通過載體和宿主細胞來制備，所述載體含有編碼CSF的基因，所述宿主細胞能夠表達該基因。
13.一種用于局部治療局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的組合物，包含至少一種CSF或其片段或衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中的CSF是GM-CSF。
15.一種治療哺乳動物局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的方法，給藥有效治療劑量和生理上可接受量的至少一種CSF或其實質(zhì)上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明提供包含至少一種CSF或其片段或衍生物的組合物，用于治療局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病。同時，提供至少一種集落刺激因子(CSF)或其實質(zhì)上具有CSF生物學功能和活性的片段或其衍生物在制備治療局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的藥物中的用途。該CSF選自粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子和多能集落刺激因子。同時提供治療哺乳動物局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病的方法。局部細菌感染和細菌性相關(guān)疾病可以是牙周疾病或竇炎。
文檔編號A61K38/19GK1956705SQ200580016492
公開日2007年5月2日 申請日期2005年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月8日
發(fā)明者漢瑞克·阿爾恩博格 申請人:因諾文圖斯設計有限公司