專(zhuān)利名稱(chēng)：膜聯(lián)蛋白v用于預(yù)防動(dòng)脈血栓和斑塊破裂的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)和動(dòng)脈血栓(atherothrombosis)。本發(fā)明涉及一種新的預(yù)防或抑制動(dòng)脈血栓及斑塊破裂(plaque rupture)的機(jī)制。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化與動(dòng)脈血栓有關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化具有炎性疾病的許多特點(diǎn)，包括在損傷部位存在大量的炎性細(xì)胞并生成促炎細(xì)胞因子1，2。
心血管疾病，特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的心血管疾病，主要的臨床問(wèn)題是致死風(fēng)險(xiǎn)增加。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的心血管疾病既與傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子有關(guān)，如血脂異常(dyslipidemia)，也與非傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子有關(guān)，包括低密度脂蛋白(oxLDL)氧化的增加，腫瘤壞死因子系統(tǒng)(TNF，與血脂異常密切相關(guān))中的活性的增加，由CRP、同型半胱氨酸和抗磷脂抗體(aPL)等指標(biāo)確定的全身炎癥反應(yīng)3-7。抗磷脂可能導(dǎo)致抗磷脂抗體綜合征(APS)，在SLE患者中常見(jiàn)，表現(xiàn)為習(xí)慣性流產(chǎn)和反復(fù)發(fā)生的血栓(thrombosis)8，9。在一般人群的心血管疾病中也發(fā)現(xiàn)了不同形式的抗磷脂反應(yīng)10，11。
眾多膜聯(lián)蛋白(Annexin)都可以與鈣及帶負(fù)電的磷脂結(jié)合，后兩者都是凝血過(guò)程必需的成分。近來(lái)在APS中發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白V，因?yàn)橐恍゛PL破壞了胎盤(pán)中的膜聯(lián)蛋白-V抗栓屏障(antithrombotic shield)，由此引起胎盤(pán)微栓塞和習(xí)慣性流產(chǎn)12-14。
膜聯(lián)蛋白-V與激活的血小板以及與損傷的細(xì)胞相結(jié)合或許能解釋該蛋白在血栓中的選擇性滯留現(xiàn)象。在動(dòng)脈和靜脈血栓的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中有這種表現(xiàn)15，由此提出將標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白用于人血管栓塞的醫(yī)學(xué)影像檢測(cè)可以減少噪聲并增加安全性16。
膜聯(lián)蛋白V在凝血障礙中的治療性應(yīng)用遇到的一個(gè)主要問(wèn)題是其在循環(huán)中半衰期短，用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物估算值為5-15分鐘15，17；膜聯(lián)蛋白V在人體的循環(huán)半衰期短。
在EP1379266“修飾的膜聯(lián)蛋白及預(yù)防血栓的方法”中，要求保護(hù)經(jīng)過(guò)聚乙二醇修飾的膜聯(lián)蛋白，用于預(yù)防血栓形成而不增加出血。在一項(xiàng)預(yù)防血栓形成所必須的凝血酶原復(fù)合物結(jié)合的方法中，用PEG交聯(lián)法使膜聯(lián)蛋白V的半衰期延長(zhǎng)。
在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白V可以穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊。施用(優(yōu)選靜脈注射)本發(fā)明的膜聯(lián)蛋白V或膜聯(lián)蛋白V的N端片段時(shí)，它在首次通過(guò)時(shí)與內(nèi)皮斑塊結(jié)合。EP1379266所述的膜聯(lián)蛋白V在循環(huán)中半衰期短的情況就不成問(wèn)題了。含有膜聯(lián)蛋白V或膜聯(lián)蛋白VN端片段并含有或不含添加成分的注射用組合物因與斑塊直接結(jié)合，穩(wěn)定頸動(dòng)脈帽，從而防止血栓形成。
免疫球蛋白G或IgG是成人體內(nèi)的一類(lèi)蛋白，正常濃度在900mg/dl到2400mg/dl之間。大約占血清或血漿總蛋白的20％。IgG的半衰期為23天，它提供對(duì)細(xì)菌，病毒，寄生蟲(chóng)及一些真菌的免疫力，在組織中發(fā)揮抗體作用。IgG能激活補(bǔ)體，進(jìn)而觸發(fā)炎癥反應(yīng)，并作用于自身。IgG對(duì)多種病毒有防御作用，動(dòng)物通過(guò)免疫接種或農(nóng)場(chǎng)內(nèi)自然接觸病原體可以獲得。一旦接觸過(guò)病原體會(huì)產(chǎn)生免疫記憶，讓機(jī)體能夠迅速產(chǎn)生所需的抗體對(duì)抗特定的感染。人類(lèi)的IgG通過(guò)胎盤(pán)傳遞給胎兒。哺乳動(dòng)物如果沒(méi)有IgG或IgG量少，對(duì)所接觸的感染原的抵抗力就會(huì)差。
靜脈注射用免疫球蛋白制劑(如IGIV；Baxter及其他制劑)，是高度純化的商品化IgG，用于治療那些無(wú)抗體產(chǎn)生，或抗體產(chǎn)生水平非常低的患者。免疫球蛋白制劑現(xiàn)有下列生產(chǎn)廠商Baxter(美國(guó))eg Gammagard，Isiven(Antimo Naples，意大利)，Omrix(Tel-Hashomer，以色列)，Miles(BiologicalProducts Division，West Heaven，CT)，Sclavo(Lucca，意大利)，Sandoz(Novartis，Basel，瑞士 eg Sandoglobulin)，Biotest Diagnostic Corporation(Deville，NJ)。免疫球蛋白制劑類(lèi)產(chǎn)品有Gamrnagard S/D，Gammar IV，Gammar-P IV，Gammimune N，Iveegam，Panglobulin，Polygam S/D，Sandoglobulin，Venoglobulin。免疫球蛋白制劑一般含有IgG和一些IgM。Gammagard中有痕量的IgM。Pentaglobin(Biotest)是富含IgM的制劑，用于治療SARS。
這種從眾多捐獻(xiàn)者血漿中匯集的靜脈注射用免疫球蛋白制劑(IvIg)也常用于自身免疫病，其已知作用機(jī)制之一是存在抗獨(dú)特型抗體，即，與其他致病性抗體反應(yīng)并中和它們的抗體。
US6613328中描述了一種方法，用von Willebrand因子的特異性抗體治療血栓疾病。其中具體制備了人源化抗體。但是沒(méi)有查到關(guān)于目前容易得到的免疫球蛋白，如IGIV，或其它免疫球蛋白亞組分能夠用于預(yù)防動(dòng)脈血栓或斑塊破裂的信息。此外，在文獻(xiàn)中沒(méi)有查到IgG能抑制抗體與天然(native)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合，而這有可能是膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮結(jié)合減少的原因，此觀點(diǎn)在本發(fā)明中提出。
發(fā)明概覽本發(fā)明提供了通過(guò)給藥能恢復(fù)膜聯(lián)蛋白V與斑塊的結(jié)合的化合物來(lái)預(yù)防動(dòng)脈血栓和斑塊破裂以及治療動(dòng)脈血栓并發(fā)癥的新方法，所述化合物可通過(guò)抑制那些阻止上述結(jié)合的免疫球蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)恢復(fù)。該治療通過(guò)給予膜聯(lián)蛋白V或N端片段藥物(優(yōu)選通過(guò)靜脈注射給藥)來(lái)實(shí)現(xiàn)；或通過(guò)靜脈給予能促進(jìn)膜聯(lián)蛋白V與斑塊結(jié)合(可以是通過(guò)抑制膜聯(lián)蛋白V與抗體結(jié)合來(lái)促進(jìn)膜聯(lián)蛋白V與斑塊結(jié)合)的免疫球蛋白或免疫球蛋白亞組分來(lái)實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域已知能治療或預(yù)防感染和嚴(yán)重自身免疫病的免疫球蛋白(IGIV；Baxter)或其他商品制劑(產(chǎn)品舉例見(jiàn)前文)以及親和純化的亞組分都可以使用。親和純化的免疫球蛋白亞組分更優(yōu)選。
本發(fā)明所述方法中，活性成分(膜聯(lián)蛋白V，膜聯(lián)蛋白V的N端片段，或免疫球蛋白亞組分)以具有有效量的該活性成分的藥物組合物的形式，給予有動(dòng)脈血栓風(fēng)險(xiǎn)的受試者。藥物組合物可通過(guò)靜脈給藥或者通過(guò)其他途徑給藥，作為風(fēng)險(xiǎn)組患者的治療措施之一。更優(yōu)選風(fēng)險(xiǎn)組是SLE患者組。另一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組患有或曾經(jīng)罹患(或有相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn))能引起抗磷脂相關(guān)抗體水平增加的上呼吸道感染或其他感染(包括肺炎球菌感染)。所述治療按最佳時(shí)間間隔重復(fù)多次。
發(fā)明詳述當(dāng)抗體抑制膜聯(lián)蛋白V-斑塊結(jié)合，導(dǎo)致膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮結(jié)合下降，這時(shí)動(dòng)脈血栓和板塊破裂風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。通過(guò)給予膜聯(lián)蛋白V(或片段)來(lái)恢復(fù)膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合，或者通過(guò)給予能抑制其他降低斑塊-膜聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體(即膜聯(lián)蛋白V-結(jié)合抗體)的免疫球蛋白，優(yōu)選免疫球蛋白亞組分(如上文提到的免疫球蛋白匯集物制劑的亞組分)來(lái)恢復(fù)膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合，這為治療動(dòng)脈血栓，特別是斑塊破裂-這一心血管疾病的主要原因，提供了新方法。
本發(fā)明一方面提供膜聯(lián)蛋白V蛋白或膜聯(lián)蛋白V的N端片段(非必需含鹽)用于制備預(yù)防動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂的藥物組合物的用途。
術(shù)語(yǔ)膜聯(lián)蛋白V為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并常用在，例如，上述引用文獻(xiàn)中，例如，EP1379266。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然膜聯(lián)蛋白V的N端片段已經(jīng)大得足以被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是膜聯(lián)蛋白V(而不是其它膜聯(lián)蛋白)的片段。
藥物組合物可含有有效量的膜聯(lián)蛋白V蛋白或膜聯(lián)蛋白V的N端片段，非必需有載體和添加成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解那些適宜的可用的載體和添加成分，包括EP1379266中用到的實(shí)例。鹽可以是制藥上允許使用的酸加成鹽，其反離子(counter ion)為，例如，氯離子，醋酸根離子。
膜聯(lián)蛋白V在藥物組合物中的有效量可由膜聯(lián)蛋白V-內(nèi)皮結(jié)合情況的診斷性分析來(lái)確定。因此，可通過(guò)評(píng)估患者的膜聯(lián)蛋白V-內(nèi)皮結(jié)合狀況來(lái)確定劑量。因此，膜聯(lián)蛋白V-內(nèi)皮結(jié)合情況可通過(guò)評(píng)估患者血清對(duì)膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮的結(jié)合的影響而評(píng)估，例如使用諸如實(shí)施例中使用的技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)患者血漿對(duì)膜聯(lián)蛋白V與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合的影響(見(jiàn)“培養(yǎng)與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的內(nèi)皮細(xì)胞”及“結(jié)果”章節(jié))。也可以對(duì)患者活檢斑塊材料進(jìn)行免疫組化染色(見(jiàn)實(shí)施例的“人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的免疫組化染色”章節(jié))。也可以采用使用標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的影像學(xué)技術(shù)(見(jiàn)上文參考文獻(xiàn)16的討論部分(WO95/34315))。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，那些膜聯(lián)蛋白V結(jié)合水平很低的患者，與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合水平接近正常人的患者相比，需要更大劑量的膜聯(lián)蛋白V(或其片段)。
本發(fā)明的另一方面提供一種治療方法，用于治療有動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)的受試者，其特征在于，對(duì)所述受試者給予藥物組合物，該組合物含有有效量的膜聯(lián)蛋白V或膜聯(lián)蛋白V的N端片段，非必需以鹽形式。
有風(fēng)險(xiǎn)的受試者可以為SLE患者。SLE患者可以還有上文提到的風(fēng)險(xiǎn)因子，例如，血脂異常，oxLDL氧化增加，TNF系統(tǒng)(與血脂異常密切相關(guān))中的活性增加，由CRP、同型半胱氨酸、aPL等指標(biāo)判定的全身炎癥反應(yīng)。SLE患者還可以表現(xiàn)出復(fù)發(fā)血栓或頻繁發(fā)生的動(dòng)脈血栓，或有心血管疾病的一或多種表現(xiàn)，例如，血栓栓塞性而不是出血性或脈管炎性中風(fēng)，心肌梗塞，心絞痛或間歇性跛行(intermittent claudication)。有風(fēng)險(xiǎn)的受試者可以是罹患或曾經(jīng)罹患肺炎球菌感染者，或有罹患肺炎球菌感染風(fēng)險(xiǎn)者；或者，可以是根據(jù)表明即將患心血管疾病(如不穩(wěn)定性心絞痛，其他類(lèi)型嚴(yán)重心絞痛，或短暫缺血發(fā)作(TIA))的癥狀和臨床評(píng)估可被鑒定為有不穩(wěn)定斑塊的患者。上文所述的膜聯(lián)蛋白V-內(nèi)皮結(jié)合水平評(píng)估方法可以用于評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明的另一方面提供一種純化的免疫球蛋白亞組分(即，前述的免疫球蛋白匯集物制品的純化亞組分)，其具有抑制與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的抗體的能力。這樣的亞組分可以通過(guò)前述技術(shù)制備，例如，使用親和純化方法。純化的亞組分可以是抗IgG抗體亞組分，例如，通過(guò)結(jié)合IgG(尤其是結(jié)合IgG恒定區(qū))的親和力而選出的亞組分。
本發(fā)明的另一方面提供一種純化的免疫球蛋白亞組分(例如，前述免疫球蛋白匯集物制品的純化亞組分)，其能促進(jìn)膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮(或內(nèi)皮細(xì)胞，例如，培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞)相結(jié)合。這種亞組分可以用前述技術(shù)制備，例如，用親和純化法。該亞組分可以是抗IgG抗體亞組分，例如，通過(guò)結(jié)合IgG(尤其是結(jié)合IgG恒定區(qū))的親和力而選出的亞組分。該亞組分可含有抗aPAF，抗aLPC，抗aPS或抗肺炎球菌疫苗抗體，以降低aPAF，aLPC，aLPC，aPS或抗肺炎球菌疫苗的抗體的水平，有人發(fā)現(xiàn)，缺少這些成分會(huì)增加膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合(見(jiàn)實(shí)施例)。所述亞組分促進(jìn)膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮結(jié)合的能力可以用前述及實(shí)施例中提到的膜聯(lián)蛋白V-內(nèi)皮結(jié)合檢測(cè)方法評(píng)估。例如，合適的亞組分可以指能降低SLE患者血漿(血清高抗磷脂抗體(aPL)滴度)對(duì)膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的抑制作用的亞組分。該亞組分可基于其與磷酸膽堿偶聯(lián)物(例如PC-BSA或PC-KLH)結(jié)合，通過(guò)親和純化來(lái)制備，例如見(jiàn)實(shí)施例。這類(lèi)亞組分可以具有比起始免疫球蛋白制劑更高的抗磷酸膽堿(aPC)抗體(如aPC IgG和/或aPC IgM)水平。如實(shí)施例中所述，我們發(fā)現(xiàn)aPC-BSA和aPC-KLH水平與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。據(jù)認(rèn)為，aPC IgG和/或IgM可與一些IgG結(jié)合(見(jiàn)，例如，Halpern et al(1991)J Clin Invest 88(2)，476-482)，且最有可能由B1細(xì)胞產(chǎn)生，此B1細(xì)胞是一種B細(xì)胞亞型，它也能中和B2細(xì)胞，后者可產(chǎn)生IgG。
本發(fā)明的另一方面提供本發(fā)明的純化亞組分的醫(yī)藥用途，例如，用于預(yù)防動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂。
本發(fā)明的另一方面提供本發(fā)明的純化亞組分或商品免疫球蛋白制劑(即，前述的免疫球蛋白匯集物制劑)用于制備預(yù)防動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂的藥物的用途。
本發(fā)明的另一方面提供治療有動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，包括將含有有效量的免疫球蛋白(即，前述免疫球蛋白匯集物制劑)或免疫球蛋白純化亞組分(實(shí)例見(jiàn)前文)的藥物組合物給予所述受試者。
對(duì)接受治療的受試者(或用藥對(duì)象)的選擇見(jiàn)上文。受試者可以是，例如，SLE患者，或者罹患或曾經(jīng)罹患或有可能罹患肺炎球菌感染的患者，或者有不穩(wěn)定斑塊和/或不穩(wěn)定心絞痛的患者。
在下述實(shí)施例和附圖且不僅限于這些的幫助下，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
參考文獻(xiàn)將以引用的方式并入本文中。
附圖
圖1抗磷脂抗體(aPL)高滴度的血清與人免疫球蛋白匯集物Gammagard預(yù)孵育對(duì)膜聯(lián)蛋白V與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)結(jié)合的影響培養(yǎng)24小時(shí)后流式細(xì)胞學(xué)分析。
圖2抗磷脂抗體(aPL)高滴度的血清與肺炎球菌莢膜多糖預(yù)孵育對(duì)膜聯(lián)蛋白V與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)結(jié)合的影響培養(yǎng)24小時(shí)后流式細(xì)胞學(xué)分析。
圖3抗磷脂抗體(aPL)高滴度的血清與LysoPC及PAF預(yù)孵育對(duì)膜聯(lián)蛋白V與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)結(jié)合的影響培養(yǎng)24小時(shí)后流式細(xì)胞學(xué)分析。
圖4抗磷脂抗體(aPL)高滴度的血清與無(wú)關(guān)抗原(破傷風(fēng)類(lèi)毒素)預(yù)孵育對(duì)膜聯(lián)蛋白V與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)結(jié)合的影響培養(yǎng)24小時(shí)后流式細(xì)胞學(xué)分析。
圖5抗磷脂抗體(aPL)高滴度的血清與LysoPC預(yù)孵育對(duì)膜聯(lián)蛋白V與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)結(jié)合的影響培養(yǎng)24小時(shí)后流式細(xì)胞學(xué)分析。
實(shí)驗(yàn)研究組研究組由以下人員組成26例SLE婦女，她們都有心血管疾病的一或多種表現(xiàn)，為血栓栓塞性而不是出血性或脈管炎性中風(fēng)(n＝15)，(由計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)或磁共振成像(MRI)證實(shí))；心肌梗塞(n＝7)，(由心電圖及肌酸激酶的升高所證實(shí))；心絞痛(n＝9)，(由運(yùn)動(dòng)負(fù)荷試驗(yàn)(exercise stress test)證實(shí))或者間歇性跛行(n＝4)(由血管造影證實(shí)外周動(dòng)脈粥樣硬化)，26例年齡相當(dāng)?shù)幕加蠸LE且沒(méi)有心血管疾病臨床癥狀的婦女，以及26例年齡相當(dāng)?shù)慕】祴D女。
所有患者均符合1982年修訂的美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)SLE16標(biāo)準(zhǔn)。本研究獲得卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院(Karolinska Hospital)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有參與者參加本研究前均簽訂知情同意書(shū)。
頸動(dòng)脈超聲右側(cè)及左側(cè)頸動(dòng)脈用雙向掃描儀(duplex scanner，Acuson Sequoia，Mountain View，California，USA)檢查，動(dòng)脈粥樣硬化程度用內(nèi)膜-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)確定。
培養(yǎng)與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的內(nèi)皮細(xì)胞匯集的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)經(jīng)低溫保存的第二代培養(yǎng)物購(gòu)自Cascade Biologics公司(Portland，OR，USA)，在無(wú)酚紅的EGMTM培養(yǎng)基(Clonetics，San Diego，CA，USA)中維持，該培養(yǎng)基含2％胎牛血清及添加成分。細(xì)胞在75cm2培養(yǎng)瓶(TPP，AG，Trasadingen，瑞士)中于5％CO2、37℃的濕境中孵育。所有實(shí)驗(yàn)采用第三代到第四代細(xì)胞。HUVEC按接種密度2×104個(gè)細(xì)胞/ml接種至12孔培養(yǎng)板中(NUNC，Inc，Naperville，IL，美國(guó))，用于流式細(xì)胞學(xué)檢查；按密度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔/100μl接種到96孔板(TPP)用于MTT檢測(cè)；按密度為8×103個(gè)細(xì)胞/ml接種到24孔板(NUNC)用于DNA fragmentation ELISA。使細(xì)胞貼壁12-24小時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)小心地洗細(xì)胞，將細(xì)胞在SFM中靜置至少12小時(shí)，然后進(jìn)行處理。各研究組的血漿加肝素保存，按SFM中10％的濃度加入到單層細(xì)胞上。
細(xì)胞不經(jīng)酶處理，而是用細(xì)胞分離液(Cell Dissociation Solution，CDS；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)進(jìn)行收獲。HUVEC小心地從上清中收集，以免選擇性失去脫壁后漂浮的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)，然后在1200rpm離心7分鐘。在100μl膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液(Molecular Probes Inc，Eugene，OR，美國(guó))中重懸后，樣品用5mg/ml膜聯(lián)蛋白V-FITC(Mol.Probes)染色并冰浴15分鐘。加入1mg/ml碘化丙啶(PI；R&DSystems Europe Ltd，Abingdon，UK)，之后迅速采樣(acquisition)。使用配備有CellQuestTM軟件的FACScan流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，San Jose，CA，美國(guó))進(jìn)行分析。采樣期間，設(shè)門(mén)(gate)，以排除在線(xiàn)性FCS和SSC scale中小于230的事件。每個(gè)樣品收集10000個(gè)事件。
人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的免疫組化染色對(duì)人的斑塊進(jìn)行免疫染色，特征如前。斑塊取自12位在暫時(shí)性缺血發(fā)作后行頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)的患者。所有樣本均有進(jìn)展期動(dòng)脈粥樣硬化病變。對(duì)照為取自無(wú)關(guān)腸切除術(shù)后目測(cè)為健康的腸系膜動(dòng)脈。冰凍切片用2％多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS溶液(Sigma Chemicals)4℃固定20分鐘，于-70℃儲(chǔ)存。封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，切片與小鼠IgG2a型抗膜聯(lián)蛋白V單克隆抗體(Alexis Biochemicals，Corp.，Lausen，瑞士)，抗CD68(DakoCytomation，Glostrup，丹麥)或抗CD31(Monosan，Uden，TheNetherlands)孵育過(guò)夜。無(wú)關(guān)的小鼠IgG2a(Serotec Ltd，Oxford，英國(guó))作為陰性對(duì)照。所有抗體用1％BSA-0.02％NaN3的PBS溶液稀釋。沖洗后，使用1％正常馬血清的PBS溶液。加入第二抗體-生物素標(biāo)記的馬抗小鼠免疫球蛋白(VectorLaboratories，Burlingame，CA，美國(guó))。使用ABC過(guò)氧化物酶EliteTM試劑盒(Vector Laboratories)。染色使用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，VectorLaboratories)，復(fù)染使用蘇木精。所有切片均用Leica DMRXA顯微鏡(Leica，Wetzlar，Germany)分析。
aPC的制備用HiTrap IgM或IgG柱(Amersham Biosciences)將總IgM或IgG級(jí)分從市售的人免疫球蛋白匯集物(Gammagard)中分離，濃度50mg/ml。將IgM或IgG級(jí)分加載至結(jié)合了PC-KLH(1或5mg/ml)或PC-BSA(1mg/ml)的NHS-Sepharose柱，接著加載至僅結(jié)合BSA的柱，從而將抗磷酸膽堿抗體洗脫下來(lái)。PC-BSA(磷酸膽堿-牛血清白蛋白)及PC-KLH購(gòu)自BiosearchTechnologies，INC(Ca，美國(guó))。洗脫下來(lái)的級(jí)分更換緩沖液后加載至PD-10柱，用Millipore Centricone裝置濃縮。根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。制備的IgM aPC的濃度一般為50μg/ml，IgG aPC的濃度一般為30μg/ml。
膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合添加了肝素、具有較強(qiáng)的抑制膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的能力的血漿，以SFM中10％的濃度添加至單層HUVEC。24小時(shí)后，細(xì)胞用細(xì)胞分離液(CDS；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)收獲，小心地從上清中收集，以免選擇性失去脫壁后漂浮的細(xì)胞，然后在1200rpm離心7分鐘。在100μl膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液(Molecular Probes Inc，Eugene，OR，美國(guó))中重懸后，樣品用2μl5mg/ml膜聯(lián)蛋白V-FITC(Mol.Probes)染色并冰浴15分鐘。加入lmg/ml碘化丙啶(PI；活體染料，R&DSystems Europe Ltd，Abingdon，UK)，之后迅速采樣。分析按照上文所述的方法進(jìn)行。
結(jié)果免疫球蛋白IgG耗竭對(duì)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的影響免疫球蛋白IgG亞類(lèi)耗竭導(dǎo)致膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的熒光強(qiáng)度(FI)增長(zhǎng)最多2.7-2.6倍(全血清平均FI267.95±vs.709.91±；中值FI222.67±vs567.42±)。在已耗竭的血清中重構(gòu)IgG級(jí)分能降低上述熒光強(qiáng)度，而含有IgG洗脫物的培養(yǎng)物則使膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的熒光強(qiáng)度與全血清的熒光強(qiáng)度相當(dāng)。
在24小時(shí)后，SLE病例的血漿的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合明顯低于對(duì)照組(SLE病例組對(duì)(vs.)一般對(duì)照p＝0.002；SLE病例組對(duì)SLE對(duì)照組p＝0.02)。將具有較強(qiáng)的抑制膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的能力的血清中總IgG耗竭后，能完全恢復(fù)上述膜聯(lián)蛋白V結(jié)合。在眾多SLE病例中，膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合與動(dòng)脈粥樣硬化程度呈顯著正相關(guān)(R＝0.73，p＜0.001)。免疫染色發(fā)現(xiàn)在12例被檢斑塊中11例有膜聯(lián)蛋白V存在。
蛋白G親和柱層析具有較強(qiáng)的抑制膜聯(lián)蛋白V與EC結(jié)合的能力的血清匯集物經(jīng)0.45μm過(guò)濾后，用等體積的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋。HiTrap蛋白G HP購(gòu)自Amersham Biosciences(Uppsala，瑞典)，其1ml柱具有結(jié)合25mg人IgG/ml凝膠的能力，按廠家說(shuō)明書(shū)使用。該柱用0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7洗脫，獲得IgG級(jí)分。用1M Tris-HCl，pH9.0進(jìn)行中和。在分離當(dāng)天，全血清、流出液(effluate)和洗脫液在SFM中按1∶10稀釋后與HUVEC孵育。
測(cè)量與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的膜聯(lián)蛋白V測(cè)定膜聯(lián)蛋白V染色呈陽(yáng)性的HUVEC的比率，表示為雙變量點(diǎn)圖中膜聯(lián)蛋白V+/PI-細(xì)胞的百分率，或直方圖中膜聯(lián)蛋白V+細(xì)胞的百分率。在有已知可降低膜聯(lián)蛋白V與HUVEC的結(jié)合的血清存在且已與IVIG預(yù)孵育的條件下測(cè)定該結(jié)合。與IVIG預(yù)孵育可以恢復(fù)膜聯(lián)蛋白的結(jié)合，表明IVIG中的抗體能中和該結(jié)合(圖1)。
在眾多有心血管疾病(CVD)病史的SLE患者中，aPC-BSA和aPC-KLH都與膜聯(lián)蛋白V-EC結(jié)合顯著相關(guān)(分別為r＝0.45；p＝0.02和r＝0.03)。aPC-BSA和aPC-KLH水平用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，例如，使用以下試劑。PolysorpF96微量免疫滴定板購(gòu)自Nunc(Roskilde Danmark)，PC-BSA(磷酸膽堿-牛血清白蛋白)購(gòu)自Biosearch Technologies，INC(美國(guó))。BSA、偶聯(lián)了山羊抗人IgG(r鏈特異性)的堿性磷酸酶、偶聯(lián)了山羊抗人IgM(u鏈特異性)的堿性磷酸酶、PNPP(堿性磷酸酶底物)都購(gòu)自Sigma(St.Louis，MO，美國(guó))。例如，抗PC-BSA的IgG和IgM抗體用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定。從17例抗磷脂綜合征患者匯集的血清被用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)并在每個(gè)板上進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)抗原濃度為10μg/ml時(shí)達(dá)到抗體結(jié)合的平臺(tái)期。F96微量滴定polysorp板用PC-BSA的PBS溶液(10μg/ml)按照50μl/孔進(jìn)行包被。包被后的板4℃孵育過(guò)夜。這些板用PBS清洗5次后，用2％BSA-PBS室溫封閉2小時(shí)，如上述洗板。血清樣本用0.2％BSA-PBS稀釋(1∶30)，按照50μl/孔水平加樣。
用肺炎球菌疫苗(Statens Serum Institute，丹麥)，PAF，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)降低結(jié)合之能力的血清中的磷脂酰絲氨酸或溶血磷脂酰膽堿預(yù)孵育，有引起血清與抗原結(jié)合下降的作用；并能恢復(fù)膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合(圖2，3，5)。相反，PC沒(méi)有明顯影響。這說(shuō)明，與肺炎球菌疫苗、PAF、磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰膽堿結(jié)合的抗體可能參與減弱膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。
總之，膜聯(lián)蛋白V存在于動(dòng)脈粥樣硬化損傷的多個(gè)部位，特別是那些容易發(fā)生斑塊破裂的部位。當(dāng)膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合不理想，甚至由于抗體干擾膜聯(lián)蛋白-斑塊結(jié)合而導(dǎo)致該結(jié)合降低時(shí)，動(dòng)脈血栓和斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)猛增。因此，恢復(fù)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合是治療動(dòng)脈血栓特別是斑塊破裂(這是心血管疾病的主要原因)的可能的新方法。本發(fā)明提供了兩種方法。一種基于使用最佳劑量的膜聯(lián)蛋白V或其鹽，優(yōu)選靜脈注射給藥；另一種方法基于使用現(xiàn)有免疫球蛋白或其經(jīng)過(guò)親和純化的亞組分(也可注射給藥)。
每劑藥中膜聯(lián)蛋白V(或免疫球蛋白)的有效量可通過(guò)對(duì)當(dāng)前(current)膜聯(lián)蛋白V-斑塊結(jié)合的診斷分析來(lái)確定。該結(jié)合可用前文所述分析方法確定。
用含有所述活性成分的藥物組合物進(jìn)行的治療，優(yōu)先給予那些有風(fēng)險(xiǎn)的受試者。有風(fēng)險(xiǎn)的受試者是指多次反復(fù)發(fā)生動(dòng)脈血栓的SLE患者。還有一種有風(fēng)險(xiǎn)的受試者是指罹患或曾經(jīng)罹患肺炎球菌感染，或有罹患肺炎球菌感染風(fēng)險(xiǎn)者。
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權(quán)利要求
1.膜聯(lián)蛋白V蛋白或膜聯(lián)蛋白V的N端片段用于制備預(yù)防動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂的藥物組合物的用途，所述膜聯(lián)蛋白V蛋白或膜聯(lián)蛋白V的N端片段可選是其鹽形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中藥用組合物包括有效量的膜聯(lián)蛋白V蛋白或膜聯(lián)蛋白V的N端片段，可選還有載體或添加成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述用途，其中藥物組合物中膜聯(lián)蛋白V的有效量由膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮結(jié)合情況的診斷性分析所確定。
4.一種治療有動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，其特征在于，給與所述受試者一種藥物組合物，該組合物包括有效量的膜聯(lián)蛋白V或膜聯(lián)蛋白V的N端片段或其鹽類(lèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其中有風(fēng)險(xiǎn)的受試者為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者。
6.免疫球蛋白匯集物的純化的亞組份，有抑制與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的抗體的能力。
7.免疫球蛋白匯集物的純化的亞組份，有促進(jìn)膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮結(jié)合的能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的純化亞組份的用途或市售免疫球蛋白匯集物制劑的用途，用于制備預(yù)防動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的純化的亞組份，用于醫(yī)藥。
10.一種治療有動(dòng)脈血栓和/或斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，其特征在于，給與所述受試者一種藥物組合物，該組合物含有有效量的免疫球蛋白匯集物或免疫球蛋白匯集物的亞組份。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中具有風(fēng)險(xiǎn)的受試者為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者。
全文摘要
動(dòng)脈粥樣硬化可被看作是對(duì)損傷的反應(yīng)，并且動(dòng)脈粥樣硬化本身并不嚴(yán)重，而一些導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊破裂的因子導(dǎo)致嚴(yán)重后果。在本發(fā)明中，我們鑒定出了這樣的因子。在有動(dòng)脈粥樣血栓形成病史的患者中發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮的結(jié)合降低。本發(fā)明提出，用天然的膜聯(lián)蛋白V或N端片段活性成分或者免疫球蛋白的亞組份制備藥物組合物來(lái)改善上述結(jié)合。膜聯(lián)蛋白V，N端片段或免疫球蛋白用于增加膜聯(lián)蛋白V與頸動(dòng)脈斑塊的結(jié)合的用途，體現(xiàn)了預(yù)防動(dòng)脈粥樣血栓形成的新機(jī)制。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1997385SQ200580019695
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者安娜·錫德霍姆, 約翰·弗羅斯特加德 申請(qǐng)人:阿瑟拉生物技術(shù)公司