專利名稱：抑制血管生成的成分和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞生物學領域，尤其涉及含有細胞滯留信號的VEGF結合成員族。 本發(fā)明的
背景技術：
腫瘤的生長和血管生成很大程度上取決于瘤床新血管形成的程度(Camieliet， P et al., (2000) Nature 407, 249-57; Folkman, J(1995) Nat Med 1, 27-31; Hanahan, D. & Folkman, J. Cell(1996) 86,353-64)。血管內皮生長因子(VEGF)是一個重要的血管生成因子，經常被腫 瘤或其他組織利用來啟動血管的生長(Dvorak, H.F. (2000) Semin Perinatol 24, 75-8; Ferrara, N. & Alitalo, K(1999) Nat Med 5， 1359-64; Yancopoulos, GD. et al., (2000) Nature 407, 242-8; Benjamin, L.E. & Keshet, E.(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 8761-6)。 VEGA也能夠增加血 管的通透性，而這對于腫瘤的侵入和轉移具有重要作用(Dvorak, H.F et al.， (1999) Curr Top Microbiol Immunol 237, 97-132; Senger, D.R. et al.,(1983) Science 219, 983-5)。除了病理性的血 管生成外，VEGA在胚胎的發(fā)育階段通過刺激血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管生成 (angiogenesis)而有助于血管系統(tǒng)的形成(Carmeliet, P. et al., (1996) Nature 380， 435-9; Ferrara N. et al.，(1996) Nature 380, 439-42)。
VEGF成員族由結構上相關的成員組成，這些成員包括但不限于VEGA，原型VEGA， 胎盤生長因子(PLGF)， VEGF-B，VEGF陽C， VEGF-D和VEGF陽E(Eriksson, U. & Alitalo, K.(1999) Curr Top Microbiol Immunol 237, 41-57)。 VEGF成員的生物功能由至少三種結構同源的酪氨酸 激酶受體，VEGFR-1/Flt-1， VEGFR-2/Flk-l/KDR和VEGFR-3/Flt-4，的活化所介導(Cao,Y. el al.,(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 14389-94)。 VEGF和PLGF也結合到一個非酪氨酸激酶 受體上(Migdal， M. et al., (1998). J Biol Chem 273, 22272-8, S et al., 1998) Cell 92, 735-45)。根 據它們的受體的結合模式和血管生成的特性，VEGF成員族可被進一步分成亞組，例如，但 是不限于1) VEGF，其與VEGFR-1和VEGFR-2結合，并誘導血管發(fā)生，血管生成和血管 通透性；2) PLGF和VEGF-B，它們選擇性地與VEGFR-1結合，而它們的生理學和病理學 作用仍然未知；3) VEGF-C和VEGF-D，它們與VEGFR-2和VEGFR-3相互作用，并誘導血 管生成和淋巴管生成(Cao, Y. et al. s寧a; Makinen, T. et al.，(200丄)Nat Med 7, 199-205; Marconcini, L. et al., (1999) Pro Natl Acad Sci USA 96, 9671-6; Skobe, M. et al" (2001) Nat Med 7: 192-8; Stmcker， S.A. et al., (2001) Nat Med 7, 186-91 )。積累下來的證據表明VEGFR-2，對VEGF 做出響應，為血管生長介導血管生成信號，而VEGFR-3則為淋巴管的生長轉導信號(Dvorak, H.F. supra; Ferrara, N. & Alitalo， K. supra; Ferrara, N. (1999) Curr Top Microbiol Immunol 237, 1-30)。
與血小板生長因子(PDGF)成員族相似，為了與它們特定的受體結合，VEGA成員族 自然地以二聚體的形式存在。除了同源二聚體外，PLGF(SEQ ID NO:2)和VEGF-B(SEQ ID NO: 11或4)在同一個細胞內被產生時也能夠形成異源二聚體(Cao,Y.etal.(1996)JBioChem271, 3154-62; DiSalvo， J. et al., (1995) J Biol Chem 270， 7717-23)。分布研究表明這些因子通常在一 些重疊的組織或細胞中表達。因此，當兩種因子在同樣的細胞群中被合成時，PLGF/VEGF 或VEGF/VEGF-B異源二聚體自然地在組織中出現(Cao, Y. et al. supra; Cao, Y. et al., (1996)supra)。這些異源二聚體與VEGF同源二聚體比較，展現出較低的血管生成活性，可如申請 號為10/346,589，申請日為2003年1月17日的美國專利申請所描述的那樣，被用作抑制血 管生成。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個方面是提供帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員。該VEGF結合家族成員 可包括，PLGF(SEQ ID N0.2)' VEGF-B(SEQ ID NO.ll或14)， VEGF受體(VEGFR) l(VEGFR-l)， VEGFR-2，神經菌毛素一l(neuropilin—1)，神經菌毛素—2(neuropilin—2)，或 者針對表達VEGF的細胞的VEGF結合抗體的衍生物。細胞滯留信號可包括內質網滯留信號， 例如KDEL(SEQIDNO:7)。其他合適的細胞滯留信號包括但不限于內質滯留信號序列，高 爾基體滯留信號序列(例如，但不限于YQRL(SEQIDNO:19))，核內體/溶酶體滯留序列(例 如，但不限于KFERQ(SEQ ID NO:16))，線粒體靶序列，細胞核靶序列，和/或過氧物酶 體靶序列。滯留信號在本技術領域的技術人員中是眾所周知的，合適的滯留信號能很容易地 被選定并被并入蛋白編碼序列中，翻譯后形成帶有該滯留信號的蛋白。編碼滯留信號的CDNA 序列可被直接插入到編碼需要被保留的蛋白的CDNA序列的終止密碼子前。
本發(fā)明的又一方面是提供一個能夠與VEGF形成異源二聚體的分子。在一些的實施方式 中，該分子可包括帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物。
本發(fā)明的又一方面是提供一種抑制VEGF的方法，該方法包括施加了帶有細胞滯留信號 的VEGA結合成員或它們的衍生物。在一個實施例中，抑制VEGF的方法包括施加 VEGF-B-KDEL(SEQ ID NO: 12或15)。
進一步地，還提供一種抑制個體內的血管生成的方法，包括對該個體施加有效量的帶有 滯留信號的VEGF結合成員，或它們的衍生物。所述的帶有滯留信號的VEGF結合成員或它 們的衍生物可進一歩與細胞內的VEGF形成異源二聚體。在一些實施方式中，帶有滯留信號 的VEGF結合成員或它們的衍生物可抑制細胞內的VEGF的分泌，VEGF同源二聚體的形成 或VEGF同源二聚體的分泌。
本發(fā)明的又一方面是提供抑制VEGF活性(也叫VEGF-A)的方法，該方法是把一細胞 內的滯留信號連接到一 VEGF結合蛋白或它們的衍生物。該方法可被用來治療各種VEGF誘 導血管生成所引致的疾病。該方法的一個例子包括傳送編碼VEGF結合成員或它們的衍生物 的基因進入到表達VEGF的細胞內，并且保留細胞內滯留信號，從而當這兩種蛋白都在細胞 內表達時，該結合成員或它們的衍生物與VEGF形成異源二聚體。上述的VEGF結合成員或 它們的衍生物可為PLGF(SEQ ID NO:l)、 VEGF-B(SEQ ID NO: 10或13)、 VEGF受體 (VEGFR)1(VEGFR-1)、 VEGFR-2、神經菌毛素一l、神經菌毛素一2、或者針對表達VEGF 的細胞的VEGF結合抗體。正如這里所述的研究表明，與VEGF/VEGF同源二聚體相比，異 源二聚體VEGF/PLGF和VEGF/VEGF-B降低了血管生成的活性，因此抑制了 VEGF的血管 生成活性。
在本發(fā)明的一個特定的實施方式中，編碼帶有細胞內滯留信號的合成員或它的衍生物的 基因被包含在一個適合于基因基因傳送的載體上。這樣的載體包括腺病毒載體、反轉錄病毒 載體、慢病毒載體、牛豆病毒載體、腺相關病毒載體、RNA載體、脂質體載體、陽離子脂類、 轉座子等。在一較佳的實施方式中，該基因被包含在反轉錄病毒載體或慢病毒載體。該基因 也能與另一抗血管生成介質或抗腫瘤介質一起傳送或施用。
本發(fā)明方法的一個實施例能在體外或回體法被用于抑制血管生成、糖尿病視網膜病和/或 腫瘤生長。該方法也能被在體外用作治療多種在人或動物個體內由VEGF誘導血管生成所導
6致的疾病。這些疾病包括多種癌癥、糖尿病視網膜病和自體免疫疾病，例如類風濕性關節(jié)炎。
本發(fā)明的進一步的應用包括但不限于形成一種生長因子對抗劑(例如蛋白質、多糖或 脂類)，該對抗劑是通過一個生長因子結合成員來吸收細胞內的生長因子。細胞內滯留信號將 發(fā)揮作用而影響蛋白質在細胞內的路線。ER滯留信號KDEL(SEQ ID N0:7)， 一個哺乳動物 的ER滯留信號序列，就是可應用在本發(fā)明的滯留信號的一個例子。其它合適的內質滯留信 號可包括但不限于具有同樣功能的氨基酸序列。例如，這些氨基酸序列可以是源自細菌毒素 的氨基酸序列，例如ETA，或者是源自酵母的氨基酸序列，例如HDEL(SEQIDNO:24)。
本發(fā)明的進一步的實施例是一個被分離的核酸，該核酸含有編碼帶有細胞內滯留信號的 VEGF結合成員或它的衍生物的核苷序列。該被分離的編碼VEGF結合成員或它的衍生物的 核酸包括但不限于VEGF-B(SEQID NO:10或13)、或PLGF-1(SEQ ID NO: 1)。在一個 實施方式中，細胞內滯留信號可以是一個含有KDEL(SEQ ID NO:7)的內質網滯留信號。
本發(fā)明的又一個方面是提供一個重組質粒，該重組質粒編碼帶有細胞內滯留信號的 VEGF結合成員或其衍生物，而該帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物能與細 胞內的VEGF形成異源二聚體。本發(fā)明的更進一步是提供一個重組病毒載體，該病毒載體含 有編碼帶有細胞內滯留信號的并能與細胞內的VEGF形成異源二聚體的VEGF結合成員或其 衍生物的核苷酸序列，所述的核苷酸序列是一個cDNA序列。重組病毒載體內的VEGF結合 成員的核苷酸序列可以是VEGF-B(SEQIDNO:10或13)或PLGF-l(SEQIDNO:l)。所述的內 質網滯留信號可以是KEDL(SEQIDNO:7)。所述的重組病毒載體可以是腺病毒載體、腺相關 病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、皰疹病毒載體等。
本發(fā)明的一個具體實施方式
是一種藥物組合物，該藥物組合物包含有附有細胞內滯留信 號的VEGF結合成員或其衍生物。在一些具體實施方式
中，該藥物組合物可進一步含有藥學 上可接受的載體。所述的藥物組合物中的帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物 能與細胞內的VEGF形成異源二聚體。在一個具體實施方式
中，所述的藥物組合物是一個病 毒載體以及藥學上可接受的載體，該病毒載體含有編碼帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成 員或其衍生物的基因。
本發(fā)明的一個具體實施方式
是一種抑制細胞內的VEGF分泌的方法，該方法通過對某一 個體施加有效量的帶有細胞內滯留信號的VEGF成員或其衍生物來實現的，所述的帶有細胞 內滯留信號的VEGF成員或其衍生物與細胞內的VEGF形成異源二聚體并抑制VEGF的分泌。 在本發(fā)明的一些方面，帶有細胞內滯留信號的VEGF成員或其衍生物能夠從一重組質?；蛞?重組病毒載體得到表達。
本發(fā)明的一個具體實施方式
是在細胞內抑制VEGF活性的方法，該方法通過對某一個體 施加有效量的帶有細胞內滯留信號的VEGF成員或其衍生物來實現的。所述的VEGF成員或 其衍生物可與細胞內的VEGF形成異源二聚體并抑制或破壞病原細胞的生長。在進一步的具 體實施方式中，所述的個體患有以下疾病中的一種癌癥、炎性關節(jié)炎(例如類風濕性關節(jié) 炎)、糖尿病視網膜病以及其他新生血管性眼睛疾病(例如角膜新生血管、新生血管性青光眼、 晶狀體后面的纖維細胞化病、黃斑變性)、動靜脈畸形、過度出血(月經過多)、Osier-Webber 綜合癥、心肌血管新生、血小板新血管生成、毛細管擴張、血友病關節(jié)癥、血管纖維瘤、傷 口肉芽以及過度的或不正常的內皮細胞累積疾病。在一個具體的實施方式中，在個體的細胞 內，抑制VEGF的活性的方法包括施加帶有細胞滯留信號的VEGF-B(SEQ ID NO:12或15)或 PLGF-l(SEQ ID NO:3)。在進一步的具體實施方式
中，所述的細胞滯留信號包括KDEL(SEQ ID NO:7)。
再一個具體實施方式
是抑制VEGF的分泌的方法，該方法通過對患者施加足量的反轉錄病毒載體來轉導病人的VEGF分泌細胞來實現。所述的反轉錄病毒載體含有編碼帶有細胞滯 留信號的VEGF結合成員或其衍生物的核甘酸序列，而所述的帶有細胞滯留信號的VEGF結 合成員或其衍生物被表達有足夠的數量來與VEGF結合以形成異源二聚體，用于抑制VEGF 從細胞內分泌。本發(fā)明的具體實施方式
包括多個方面，主要涉及患有以下疾病的病人癌癥、 炎性關節(jié)炎(例如類風濕性關節(jié)炎)、糖尿病視網膜病以及其他新生血管性眼睛疾病(例如角 膜新生血管、新生血管性青光眼、晶狀體后面的纖維細胞化病、黃斑變性)、動靜脈畸形、過 度出血(月經過多)、Osier-Webber綜合癥、心肌血管新生、血小板新血管生成、毛細管擴 張、血友病關節(jié)癥、血管纖維瘤、傷口肉芽以及過度的或不正常的內皮細胞積累疾病。帶有 細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物可以是VEGF-B(SEQ ID NO:12或15)或 PLGF-l(SEQ ID NO:3)。所述的細胞滯留信號可以是KDEL(SEQ ID NO:7)。
再一個具體實施方式
是一個藥物組合物，該藥物組合物含有至少一個反轉錄病毒載體， 該反轉錄病毒載體含有編碼帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的核甘酸序列。 所述的帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物可以是VEGF-B(SEQ NO:12或15)或 PLGF-l(SEQ ID NO:3)。所述的細胞滯留信號可以是KDEL(SEQ ID NO:7)。
這些方面進一步包括在個體內抑制血管生成的方法，該方法是通過對個體施加有效量的 附有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物來實現的。所述的附有細胞滯留信號的VEGF 結合成員或其衍生物與細胞內的VEGF形成異源二聚體，并抑制細胞內的VEGF的分泌。
本發(fā)明的再一個方面是治療個體內的血管生成疾病的方法，該方法是通過對個體施加有 效量的帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物來實現的。所述的帶有細胞滯留信號 的VEGF結合成員或其衍生物與細胞內的VEGF形成異源二聚體，抑制細胞內的VEGF的分 泌從而使與血管生成疾病相關聯的血管生成受到抑制。
再一個方面是治療個體內的血管生成疾病的方法，該方法是通過對個體施加有效量的帶 有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物來實現的。所述的帶有細胞滯留信號的VEGF 結合成員或其衍生物與細胞內的VEGF形成異源二聚體，抑制細胞內的VEGF的分泌從而使 與血管生成疾病相關的血管生成收到抑制。


圖1各種細胞系產生的趨化活性和細胞形態(tài)的變化/肌動蛋白重組。純化的PLGF-l(SEQ ID NO:2)、 VEGF、 PLGF-1/VEGF異源二聚體(a、 d、 h、 i和j)，或來自各種被轉導的或未 被轉導的LLC腫瘤細胞系的條件培養(yǎng)基(b、 c、 e、 f和k-p)對VEGF-l/PAE(a-c)以及 VEGFR-2/PAE(d-q)內皮細胞的趨化和細胞形態(tài)的影響的分析。每個光場內(32X)的遷移細 胞被統(tǒng)計，數據代表每個樣品(a-f) —式四份的％ (土 SEM)。為了進行形態(tài)分析，生長因 子或條件培養(yǎng)基以VEGFR-2/PAE細胞進行培植，通過TRITC-鬼筆[毒]環(huán)肽染色觀察到肌動 蛋白重組(g-p)。在每個樣品的任意5個光場(20X)里，紡錘狀細胞被統(tǒng)計數量，并被表 示為所有細胞的平均百分數(土SEM) (q)。 *P<0.05;** P<0.01;禾tl p<0.001。
圖2是用PLGF-1KDEL(SEQ ID NO:3)抑制腫瘤的生長，在顯示的時間點，wtLLC、 載體-LLC、 hPLGF-LLC以及hPLGF—KDEL-LLC腫瘤細胞的生長率。大約地，每個細胞系 地lxl0S個腫瘤細胞皮下注射入6而大的C57Bl/6雌鼠。從第6天開始，每隔兩天，測 量一次腫瘤的尺寸(c和d)。在腫瘤被種植的第14天，典型的腫瘤外觀被拍照(b)，按照 標準的公式長2x寬2x0.52測量腫瘤的體積。數據表示為每組的6個小鼠的平均數％ (土 SEM)(c和d)。對于hPLGF-l和對照腫瘤與hPLGF-l-KDEL-LLC月中瘤的對比，*p<0.05; **p<0.01;禾口***<0.001。
8圖3是用hVEGF-KDEL抑制腫瘤細胞的生長，在顯示的時間點，wt LLC、載體-LLC、 hVEGF-LLC和hVEGF-KDEL-LLC腫瘤細胞的生長速率。大約每個細胞系的1乂106個腫瘤 細胞皮下注射入6周大的C57Bl/6雌鼠體內。從第5天開始，每隔2天測量一次腫瘤的大 小。在種植后的第14天(b)和第lO天(c)，典型的腫瘤外觀被拍照，按照標準的公式長 2乂寬2X0.52測量腫瘤的體積。黃色箭頭指向種植的腫瘤。數據被表示為每組的6個小鼠 的平均％ (土 SEM)。對于以hVEGF(c和e)及對照腫瘤(b和d)與hVEGF-KDEL-LLC腫 瘤)^比；*p<0.05; **p<0.01;禾口***<0.001。
圖4是腫瘤血管的免疫組織化學檢測。wt LLC、 hVEGF-LLC、 hVEGF-KDEL-LLC、 hPLGF-l和hPLGF-l-KDEL-LLC腫瘤長到同樣的大小，組織切片采用傳統(tǒng)的免疫組織化學方 法(a-f)或整體染色/共聚焦方法(h-m),以抗CD31抗體進行染色。在光學顯微鏡的至少任意 6個光場(20X)統(tǒng)計微血管密度，并表示為平均值(土SEM) (g)。 **p<0.01;和"承p〈0細。
圖5是月中瘤細胞調亡。wt LXC、載體-IXC、 hVEGF-IXC、 hVEGF-KDEL-IXC 、 hPLGF-l-LLC和hPLGF-l-KDEL-LLC腫瘤的組織切片用TITC-labelled TUNEL試劑盒染色， 接著用Hoescht染料(藍色)統(tǒng)計染色量。箭頭指向之處為凋亡的綠色細胞(a-f)凋亡的細胞 數在10個任意選定的光場(optical field) (40X )進行統(tǒng)計，且用平均數來表示(土 SEM) (g)。 *p<0.05; **p<0.01;和承"p0.001。
具體實施例方式
在描述本發(fā)明的組合物和方法之前，應該明白，本發(fā)明不應該局限于所描述的特定分子、 組合物、方法或方案，因為這些都是可以變化的。同時，也應該明白，本說明書中使用的術 語僅僅是為了描述特定的具體實施方式
，而不應用來限制本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明的保護 范圍應該由權利要求來限制。
這里所使用的術語的意思對本技術領域的人員來說都是清楚的，然而，為了方便和完整 起見，對特定的術語和它們的意思做如下的闡述。
應該注意到，在這里以及權利要求中所使用的單數形式"a"， "an"和"the"包括復數形 式，除非上下文清楚表明是單數。因此，例如，"球狀體"被看作為一個或多個球狀體和本技 術領域地人員所知道的等同物。除非有專門的定義，這里所使用的技術和科學術語的意思都 與本技術領域的技術人員所懂得的通常意思一樣。雖然與這里所描述的方法和物質相似或等 同的任何方法和物質雖然能夠在實際中使用或用于驗證本發(fā)明的具體實施方式
，但是這里描 述較佳的方法、裝置和物質。所有提及的公開資料被加入進來作為參考。
"病人"和"個體"的意思是所有的動物，包括人。例如，病人和個體包括人、牛、狗、 貓、山羊、綿羊和豬。
"血管生成"指從已有的血管組織(例如，脈管系統(tǒng))產生新的血供，例如，毛細血管、 血管和靜脈。血管生成的過程涉及到許多組織細胞類型，例如，形成所有的血管的單一細胞 層內襯，并用作調節(jié)血流與周邊組織的交換的內皮細胞。通過內皮細胞的生長，新血管(血 管生成)會從現有的小血管壁形成。血管生成與腫瘤的生長也有關系，因為它為腫瘤提供腫 瘤細胞存活和繁殖(生長)所必需的血供。
"癌"是指由不正常的和失控的細胞分裂導致的任何惡性生長或瘤；它可以通過淋巴系 統(tǒng)或血流擴散至身體的其他部分。癌包括實體瘤和血瘤。實體瘤包括但不限于卡波濟肉瘤、 血管瘤、實體瘤、血瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、結腸癌、橫紋肌肉癌、眼癌、猶文
氏肉瘤、成神經細胞瘤和骨肉瘤。血管生成也與血瘤有關，例如白血病，各種急性或慢性骨 髓疾病，在骨髓中，白細胞無限制地繁殖，通常伴隨有貧血、血液凝固受損、以及淋巴結、肝和脾的腫大。相信血管生成在導致白血病等類似的腫瘤發(fā)生的骨髓異常中起一定的作用。 此處使用的"抑制血管生成"是指血管生成的全部或部分抑制。
此處使用的"基因"是指編碼目標蛋白質的DNA(cDNA)或RNA，例如在編碼序列的3， 末端，終止密碼前含有一段編碼KDEL(SEQ ID N0:7)的序列的PLGF(SEQ ID NO:3)或 VEGF-B(SEQ ID NO:12或15)。 DNA基因是互補的DNA(cDNA)序列，因此缺少基因內區(qū)和 包含編碼目標蛋白序列(例如，附有細胞內滯留信號的VEGF結合成員)。編碼本發(fā)明所使用 的VEGF的基因通常與細胞表達該基因所必須的遺傳元素一起被包含在一個表達載體上。在 本技術領域中，眾所周知地，這些元素包括合適地啟動子和強化子。
"VEGF結合成員或其衍生物"指除了 VEGF夕卜，能與VEGF(也叫做VEGF-A)結合并抑 制VEGF活性(例如VEGF誘導血管生成)的蛋白或多肽。VEGF結合成員包括PLGF、VEGF-B、 和其它能夠自然地與VEGF結合的蛋白，該蛋白也可和VEGFR-1結合(正如VEGF與 VEGFR-1結合一樣)。
"PLGF"和"VEGF-B"指PLGF和VEGF-B生長因子以及能夠與VEGF結合(與VEGF 形成異源二聚體)并降低VEGF活性的具有相同功能的類似物。這些具有相同功能的類似物 包括具有相同功能的多肽以及從PLGF和域VEGF-B衍生出來同系物，這些同系物保留了與 VEGF結合且降低VEGF活性(相對于其內沒有PLGF、VEGF-B或類似物的細胞而言)的功能。
"功能等同物"指具有抗血管生成活性，且通過標準分析確定，與附有細胞滯留信號的 VEGF成員具有類似作用的成分。"標準檢測"包括但不限于，在分子生物領域用作評估抗血 管生成活性的方法、細胞形態(tài)檢測和肌動蛋白著色、細胞周期阻滯、細胞死亡檢測、趨化現 象檢測和內皮細胞遷移。這些分析在此后的實施例中提供。
與VEGF結合成員(例如，PLGF禾n VEGF-B)有關的"在足夠量的水平上表達或施加" 是指能夠部分或全部抑制VEGF活性(例如，VEGF誘導血管生成)所必需的量。VEGF結 合成員表達量與細胞內表達的內生VEGF的表達量相等(1: 1)是比較合適的，而高于細胞 內表達的內生VEGF的表達量則是更好的，這樣在細胞內，VEGF與含有KDEL(SEQ ID NO:7) 的VEGF結合成員形成的異源二聚體的量高于VEGF/VEGF同源二聚體的量。例如，細胞內， VEGF的表達量與VEGF結合成員的表達量的比率可以是1:2、 1:3、 1:4、 1:5、 1:6、 1:7或更 高。在沒有VEGF結合成員表達的情況下，VEGF將會產生活性，而VEGF結合成員這樣的 表達量則降低了全部VEGF的這種活性，這被叫做VEGF的"過量表達"。另夕卜，在一些情 況下(視被處理的細胞的情況而定)，VEGF結合成員可能已經在細胞內自然地(內生地)被 表達，以致于把編碼VEGF結合成員的基因轉入到細胞內將會增加VEGF結合體的量到足以 降低或阻隔VEGF的活性。
藥物組合物的"治療有效量"指足以降低或阻止與健康狀況或虛弱有關的癥狀的藥量， 或者指足以使處于疾病或功能紊亂而導致身體某些功能受到損害的狀況下的身體功能恢復正 常的藥量，或者指足以改善疾病的一項或多項臨床上測得的指標參數的藥量。與本申請相關 的，治療有效量是足以降低或抑制VEGF的分泌或表達或者血管生成的藥量。
VEGF結合成員與VEGF相對比的蛋白質水平的測定或定量的分析(例如標準ELISA分 析)，以及測量VEGF活性的分析方法都是本技術領域眾所周知的，例如包括這里所提供的研 究所描述的各種分析方法。
術語"反轉錄病毒載體"指一種載體，該載體含有來源于反轉錄病毒，例如C型反轉錄 病毒，的結構上的和功能上的遺傳成分。合適的翻轉錄病毒包括莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、 哈維大鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、大鼠乳房腫瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓
10白血病病毒(FLY)、泡沫病毒、Friend、大鼠干細胞病毒(MSCV)和魯斯氏肉瘤病毒(RSV)。本 發(fā)明所使用的"反轉錄病毒"還可以包括來源于人T細胞白血病病毒、HTLV-1和HTLV-2，
以及反轉錄病毒的慢性病毒家族成員的載體，所述的反轉錄病毒的慢性病毒家族成員例如可 為人免疫缺陷病毒、HIV-1、 HIV-2、猿免疫缺陷病毒(SIY)、貓免疫缺陷病毒(FIY)、馬免疫缺 陷病毒(EIY)、以及其它類型的發(fā)轉錄病毒。
"反轉錄病毒"是一種在復制周期內使用反轉錄酶的RNA病毒。該反轉錄病毒染色體 RNA通過反轉錄酶的作用被轉化成雙鏈DNA。所述的病毒雙鏈DNA形式能夠被整合入被侵 染的細胞的染色體內； 一旦被整合，就被稱作"前病毒"。該前病毒被用作RNA聚合酶II模 板以及編碼產生新的病毒所需要的結構蛋白以及酶的mRNA分子的模板。前病毒的每個末端 是一種被叫做"長末端重復序列"或"LTRs"的結構。該LTR包含有多種調節(jié)信號，這些調 節(jié)信號包括病毒的染色體組復制和整合所需要的翻譯控制元件、多聚核苷酸化信號以及序列。 所述的病毒LTR被分成三個區(qū)，分別叫做U3、 R、禾nU5。 U3區(qū)包含增強子和啟動子元件。 U5區(qū)是位于引物結合位點和R區(qū)之間的序列，它包含多聚核苷酸化序列。R (repeat)區(qū) 連接在U3和U5之間。LTR由U3、 R和U5區(qū)組成，均出現在病毒基因組的兩端。
術語"慢性病毒"指緩慢導致疾病產生的反轉錄病毒組(類)。屬于這些反轉錄病毒組的 病毒包括HIV(艾滋病毒；包括HIV型1，和HIV型2)，人類獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS) 的病原；導致綿羊腦炎或肺炎的梅迪/維斯那病(visna-maedi)病原，導致山羊免疫缺陷、 關節(jié)炎和腦病的山羊關節(jié)炎腦炎病毒；導致馬自身免疫性溶血性貧血和腦病的馬傳染性貧血 病毒；導致貓免疫缺陷的貓免疫缺陷病毒(FIV);導致牛淋巴結病、淋巴球增多、中樞神經
系統(tǒng)感染的牛免疫缺陷病毒(BIV);以及導致靈長類動物免疫缺陷和腦病的猿免疫缺陷病毒
(SIV)。由這些病毒導致的疾病具有長潛伏期和遷延期的特點。通常，這些病毒隱蔽地侵染 單核細胞和巨噬細胞，并從這些細胞傳播至其他細胞。HIV、 FIV、和SIV也很容易侵染T 淋巴細胞(例如T-細胞)。
術語"載體"指能夠把連接于其上的另外一個核酸進行傳送(例如進入細胞內)的核酸 分子。術語"表達載體"指包含有以適合于細胞表達的形式(例如，與啟動子連接)出現的 基因結構的任何載體(例如質粒、粘?；蛘呤删w染色體)。在本說明書中，"質粒"和"載 體"是互用的，因為質粒是載體的常用形式。另外，本發(fā)明中，其他具有相同功能的載體也 需要包括在內。
術語"基因傳送"或"轉染"是指把外源DNA或RNA轉入真核細胞內。本發(fā)明所述的 基因傳送可以使用本技術領域總所周知的技術以in vitro、 in vitro以及ex vivo的方式完 成。例如，in vitro以及ex vivo方式的基因傳送采用DNA-磷酸鈣共沉淀法、
DEAE-dextranmediated轉染法、聚凝胺接導轉染法、電穿孔法、顯微注射法、脂質體融合、 脂質轉染、原生質體融合、生物彈射擊法以及病毒轉染。Invivo方式的基因傳送可通過各種 本技術領域的技術實現，這些技術包括最常用的注射法(例如靜脈注射、肌肉注射等)。
本發(fā)明的一個方面是基于以下的發(fā)現當C末端帶有內質網滯留信號的PLGF與VEGF 在同一細胞內被產生時，C末端帶有內質網滯留信號的PLGF，例如KDEL(SEQ ID NO:7)， 能夠抑制VEGF (例如VEGF-A)的功能，其基本原理是產生了 VEGF異質聚體。VEGF與 通過遺傳工程產生的并在C末端有內質網滯留信號的PLGF (SEQ IDNO:3)之間形成異源二 聚體，將會抑制VEGF的血管生成活性。相應的，本發(fā)明的一個方面是提供一種抑制包括VEGF 誘導血管生成(例如在腫瘤里)在內的VEGF的活性的方法，該方法通過施加除了 VEGF本 身外的VEGF結合成員，例如PLGF-KDEL(SEQ ID NO:7)。
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員的施加方式可通過傳送在一個病毒載體內，最好是在反轉錄病毒或慢性病毒內，的編碼附有細胞滯留信號的 VEGF結合成員的基因來實現。在本發(fā)明中使用的慢性病毒載體包括美國臨時專利申請 60/288042所描述的自我失活型慢性病毒載體。
在本發(fā)明的進一步的具體實施方式
中，用于基因傳送的載體(例如，反轉錄病毒和慢性 病毒載體)在與細胞接觸之前，也能夠通過使用包裝細胞系而被整合入病毒體內，這在本技 術領域是眾所周知的。"包裝細胞系"指含有產生病毒粒子所必須的編碼序列的細胞系(尤其 是哺乳動物細胞)，該細胞系缺乏包裝DNA或RNA和產生增殖型輔助病毒的能力。當包裝 功能在細胞系內被提供(例如，通過質粒載體的方式轉導)，該包裝細胞系產生重組病毒，從 而成為"生產細胞系"。根據載體的性質，任何合適的包裝細胞系可被用于本發(fā)明中。
另夕卜，編碼VEGF成員的基因，例如PLGF-KDEL(SEQ ID N0:3)和VEGF-B-KDEL(SEQ IDNO:12或15)，可單獨地或者與一個或多個的其它血管生成抑制(抗血管生成)因子一起 被傳送，這些其他血管生成抑制(抗血管生成)因子包括但不限于血管內皮抑制素或血管生 成抑制素(見美國專利6174861和6024688，該兩專利的內容被整合到這里作為參考)，或者 一個或多個抗癌劑，例如化療劑或放射物。此外，編碼帶有細胞內滯留信號的不同的VEGF 結合信號的多個基因可以一起被傳送以增強對VEGF的抑制。
細胞內滯留信號包括但不限于內質滯留信號序列、高爾基體滯留信號序列、核內體/溶酶 體滯留信號序列、線粒體靶序列、細胞核靶序列、和/或過氧物溶酶體靶序列。這些滯留信號 可以位于VEGF結合蛋白序列的任何位置，只要該蛋白的部分功能活性能夠被保留就可以了。 被保留的部分活性功能，在一個具體實施方式
中，至少是天然蛋白的功能活性的50%。在進 一步的具體實施方式
中，被保留的部分功能活性至少是天然蛋白的功能活性的75%。在又一 個具體實施方式
中，被保留的部分功能活性至少是天然蛋白的90%。
相應地，本發(fā)明的幾個方面是提供多個治療由VEGF活性和VEGF誘導血管生成導致的 疾病(例如癌癥、糖尿病視網膜病、和類風濕性關節(jié)炎)的方法，這些方法使用基因治療和 多種基因傳送系統(tǒng)，例如反轉錄病毒和慢性病毒基因傳送系統(tǒng)。這些系統(tǒng)使體內持續(xù)的、高 水平地表達被轉送的治療基因，而且在以無毒的方式侵染并整合入各種細胞型的染色體組內 方面高度有效。
有多種疾病是多余的血管生成的結果。因此，如果在某些情況、特定的時間或者特定的 組織內能夠停止毛細血管的生長和擴展，那么許多疾病和不良健康狀況能夠被阻止或減輕。 能夠通過本發(fā)明公開的內容所治療的血管生長依賴型疾病是需要或誘導血管生長的那些健康 狀況/疾病。例如，癌癥、炎性關節(jié)炎(例如類風濕性關節(jié)炎)、糖尿病視網膜病及其它眼睛 新生血管性疾病(例如，角膜新生血管、新生血管性青光眼、眼晶狀體后面的纖維細胞化和
黃斑變性)、動靜脈畸形、流血過度(月經過多)、Osier-Webber綜合癥、心肌血管新生、 血小板新血管生成、毛細管擴張、血友病關節(jié)癥、血管纖維瘤、傷口肉芽。這里提供的抗血 管生成成分可用于治療過度的或不正常的內皮細胞積累疾病。這些疾病包括但不限于腸粘連、 克朗氏病、動脈硬化癥、硬皮病和增生性瘢痕(例如瘢痕疙瘩)。
雖然本發(fā)明按照其較佳實施方式進行描述，但是其它的具體實施方式
也能得到同樣的結 果。本技術領域的技術人員利用常規(guī)試驗就可認識到或發(fā)現許多與在此描述的特定的具體實 施方式等同的技術方案。這些等同技術方案被認為是落入本發(fā)明的范圍，并被以下的段落所 包圍。
基因治療
基因治療指對個體施加核酸的治療方法。在本發(fā)明的這個實施方式中，編碼帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的核酸序列被傳送到一個細胞內，并通過抑制VEGF 的分泌而產生治療效果。在一個基因治療方案中，為了抑制VEGF的分泌，包含有表達盒的 載體可以被直接施加到細胞，例如腫瘤細胞，而上述的表達盒編碼帶有細胞內滯留信號的 VEGF結合成員及其衍生物，例如VEGF-KDEL、 PLGF-KDEL(SEQ ID N0:3)。近來，合
成了許多帶有嵌合外被蛋白的反轉錄病毒載體。這些嵌合蛋白由兩個典型的區(qū)域組成，其中 一個區(qū)域被嵌入病毒的外被且來源于反轉錄病毒。而第二區(qū)域與病毒不同源，是結合對家族 成員中的一員。例如，第二區(qū)域由包括一結合到腫瘤細胞表面標記的單鏈的Fv片斷，或者 它是在細胞表面表達的抗體的結合配合體。其它結合對，不一定是單克隆抗體，它們的配合 體對于本技術領域的人員來說是很清楚的。這些配合體將會把治療基因導向合適的細胞。
根據本發(fā)明，本技術領域中可以用于基因治療的方法都可以使用。舉例性的方法在下面 進行描述。
對基因治療的方法進行綜合回顧，見Goldspiel et al. 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Arm. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932;以及 Morgan and Anderson, 1993, Arm. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11 (5): 155 — 215)。這些方法在被使用的重組D N A技術的領域都是很常見的， 重組DNA技術在Ausubel et al.(eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;禾口 Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expressin, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY有描述。
在一個具體實施方式
中，藥物化合物包括作為表達載體的一部分的帶有細胞內滯留信 號的VEGF結合成員或其衍生物的核酸，上述的表達載體表達帶有細胞內滯留信號蛋白的 VEGF結合成員或其衍生物。尤其是，這樣的核酸有一個啟動子連接在編碼區(qū)，所述的啟動 子是可誘導的或組成型的，并且也可以是組織特異性的。在另外一個詳細的實施方式中，一 核酸分子被使用，在該核酸分子里，前面提及的結合成員或其衍生物、編碼序列以及其它需 要的任何序列的兩端被連接有在染色體需要的位點啟動同源重組的區(qū)域，從而供作核酸的染 色體內表達。
核酸可以直接或間接地被轉入病人體內，在直接傳送的情況下，病人直接直接接觸核 酸或核酸運載載體，在間接傳送的情況下，細胞在體外首先用核酸進行轉化，然后被移植入 病人體內。這兩種方法分別被叫做in vivo或exvivo基因治療。
在一個特定的具體實施方式
中，核酸在體內被直接施加，并在體內表達產生被編碼的 產品。這過程能夠通過本技術領域通知的多種方法中的一種得以完成。這些方法例如可以是 把該核酸構建入核酸表達載體并將其施加而進入到細胞內，該施加的方式例如可通過使用有 缺陷的或減毒的反轉錄病毒或其它病毒載體(見美國專利4980286)進行侵染，或者直接 注射裸露的DNA，或者采用微粒子轟炸(例如，基因槍、生物彈擊法、Dupont法)，或者 用脂類或細胞表面受體或轉染劑進行嵌合，或者在脂質體、微粒子或微膠囊進行包封。這些 施加方法例如還可是把核酸連接到可以進入細胞核的多肽上來進行施加，或者是把核酸連接 到可以進行受體介導細胞內吞作用的配合基體上來進行施加。(見Wu and Wu, 1987, J, Biol. Chem. 262:4429-4432)(這方法可以被用于特異性表達受體的靶細胞型)。
在另外一個具體實施方式
中，形成了一核酸-配合基體的聯合體，而該聯合體內的配合 基體是一個能夠破壞內函體的融合病毒多肽，使核酸不會被溶酶體所降解。在又一個具體實 施方式中，為了能夠讓細胞對核酸進行特異性地吸收并表達，所述的核酸可以通過靶向特異 性的受體而被標靶((見PCT的1992年4月16的公告WO92/06180(Wu et al.); 1992年12月23日的公告W092/22635(Wilson et al.); 1992年11月26日的公告 WO92/20316(Findeisetal); 1993年7月22日的公告W093/14188(Clarke et al.); 1993年10月14曰的公告WO93/20221(Young))。作為選擇，通過通源重組的方式， 核酸可被導入細胞內并被整合入宿主細胞DNA內用于表達(Koller and smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
編碼帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員的反轉錄病毒載體
在一個專門的具體實施方式
中， 一含有編碼帶有細胞內滯留信號的VEGF接合成員或其 衍生物的核酸的病毒載體被使用。例如，反轉錄病毒載體可以被使用(見Miller etal., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599)。這些反轉錄病毒載體被修飾，刪除了那些與病毒染色體 的包裝以及整合入宿主細胞DNA無關的反轉錄病毒的序列。用作基因治療并編碼帶有細胞 內滯留信號的VEGF成員或其衍生物的核酸被克隆到載體上，通過該載體很容易地把基因傳 送入病人體內。如下的文獻舉例說明了在基因治療中使用了反轉錄病毒載體Clowesetal., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141;禾口 Grossman and Wilson, 1993, Cum Opin. In Genetics and Devel. 3:110-114。
反轉錄病毒載體作為一種用作介導病毒-介導基因傳送入真核細胞的媒介物是有用的。反 轉錄病毒載體通常被構建，刪除了病毒結構基因編碼序列的主體部分，并用目的基因進行替 代。很經常地，通過使用本技術領域通知地基因工程技術，結構基因(例如，gag、 pol、和 env)從反轉錄病毒的主鏈被移走。
Gag、 pol以及env基因的移走形成了一載體主鏈，該主鏈包括一個5'LTR、 一個包裝 信號、用于引入一個或多個外源目標基因的一個或多個克隆位點，以及一個3'LTR?？梢员?使用的載體主鏈的一個例子是G1載體主鏈，其在以下的文獻中被公開McLachlin,etal., Virology, 195:1-5(1993)以及1991年7月25公告的PCT申請，公告號為 WO91/10728,發(fā)明名稱"新型的病毒載體"。
外源基因通過標準技術，被整合入前病毒主鏈，形成了反轉錄病毒載體。用作制備反轉 錄病毒的技術公開在PCT申請WO91/10728以及以下的文章中Armentano, et al., J. Virol., 61:1647-1650(1987)、 Bender, etal.,丄Virol., 61:1639-1646(1987)、以及 Miller, etal.,已iotechniques, 7:980-990(1989)。最直接的構建方法是把反轉錄病毒的 結構用單一的一條基因所取代，接著該基因在長端重復序列(LTR)內的病毒調節(jié)序列的控 制下被轉錄。能夠引入多個基因進入靶細胞的反轉錄病毒載體也可以被構建。通常，在這樣 的載體內，第一個基因是受到病毒LTR的調控，然而第二個基因要么是在沒有拼接信號的情 況下被表達，要么是在它自己的調控，內部啟動子下進行表達。合適的啟動子包括SV40啟 動子、人類細胞巨化病毒(CMV)啟動子、(3-肌動蛋白啟動子、a-胎蛋白啟動子、以及任何與 外源目標自然地基因有關聯的啟動子。
反轉錄病毒載體可以質粒、病毒RNA的一個片斷、或者前病毒DNA的一個片斷形式存 在。反轉錄病毒載體被導入一個包裝細胞以形成生產細胞。包裝細胞提供gag、 pol、 yi以及 env基因，這些基因可以讓反轉錄病毒載體包裝成為重組病毒，而該重組病毒具有感染性但 是復制缺陷。所述的載體通過標準的基因傳送技術被傳送入包裝細胞內，這些基因傳送技術 包括轉染、轉導、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、以及脂質體介導DNA傳送?？梢员皇褂玫陌b 細胞包括但不限于PE501、 PA317、 Psi-2、 Psi-AM、 PA12、 T19-14X、 VT-19-17-H2、 Psi-CRE、 Psi-CRIP、 GP+E-86、 GP+envAM12、以及DNA細胞系?？杀挥糜诋a生反轉錄病毒重組體的
14的生產細胞系PA317/GlTKlSvNa生產細胞系，該細胞系被公開在PCT申請WO96/06486中。
反轉錄病毒載體以足以抑制、阻止或破壞腫瘤細胞或其它病原細胞產生的VEGF的血管 生成特性的有效量被施加到宿主。所述的宿主可以是哺乳動物宿主，包括人類和非人類的靈 長類動物宿主。施加的方式可以是直接把反轉錄病毒載體施加到宿主的病原細胞區(qū)域(例如 腫瘤本身、或糖尿病視網膜病患者的視網膜區(qū)域)，在那里，反轉錄病毒載體轉導復制的細胞。 反轉錄病毒載體的施加部位取決于多個因素，這些因素包括被治療的疾病的特性。 一般來說， 反轉錄病毒載體以至少10、fu/劑的量進行施加，但藥量不超過10Scfu/劑。較佳的，反轉錄病 毒載體以10^fu/劑到1(Tcfu/劑的量來進行施用。確切的藥量取決于多種因素，這些因素包括 病人的年齡、體重和性別，被治療的疾患的性質、以及被治療的疾患的嚴重程度。
反轉錄病毒載體可與可接受的藥物載體一起被施用，這些載體例如為食鹽水、魚精蛋白 硫酸鹽(Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, N丄)、水、磷酸鹽和Tris等緩沖水溶液、或者聚 凝胺(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)。根據這里的教導，本技術領域的技術人員對于 合適的藥物載體的選擇是很清楚的。
在一個具體實施方式
中，編碼帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的反轉錄 病毒成分與化療劑一起被施用，兩者一起抑制和/或破壞了復制的病原細胞的生長。在另外一 個具體實施方式
中，編碼帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員的反轉錄病毒成分與抗血管生 成劑聯合施用，兩者一起抑制和/或阻止血管生成。
藥物組合物及其施用
為了預防或治療，本發(fā)明的藥物組合物包括帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員及其衍 生物，它們可以非腸道的、局部的、口服的方式被施用，例如采用噴霧方式或經皮膚用藥的 方式。藥物化合物可以多種藥劑形式被施用，采用何種方式取決于藥物施用的方法。例如， 適合于口服形式用藥的藥劑形式包括粉末、藥片、藥丸、膠囊和糖錠。本發(fā)明的帶有細胞內 滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的藥物化合物(例如，編碼帶有細胞內滯留信號的 VEGF結合成員或其衍生物的核酸、包含有編碼帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其 衍生物的核酸的病毒載體，等等)，在口服用藥時，必須采取防護措施以阻止被消化。這通常 是通過以下兩種方式來實現的把藥物化合物與另外一種成分結合以對酸和酶水解產生抗性， 或者用具有抗性的載體包裝藥物化合物，例如脂質體。阻止藥物組合物(例如那些含有核酸 和/或蛋白質的藥物化合物)被消化的手段在本技術領域是眾所周知的。
本發(fā)明的藥物組合物對于非腸道用藥尤其有用，例如靜脈注射用藥、或向身體的空腔或 器官的內腔施用藥物。作為一種選擇，藥物組合物也可以直接被施加到治療部位，例如直接 進入到腫瘤內、或直接進入視網膜內，這是治療糖尿病視網膜病所必須的。用于施用的成分 被溶解在藥學上可接受的載體里，優(yōu)選液體載體，該藥物化合物通常包括帶有細胞滯留信號 的VEGF結合成員或其衍生物的溶液。多種液體載體可以被使用，例如食鹽緩沖液等。這些 溶液被消毒并去除沒用的物質。這些成分可以采用傳統(tǒng)的公知滅菌技術來進行滅菌。這些成 分還可包含有藥學上可接受的，并用作使藥物接近生理狀況的輔助物質，這些輔助物質可以 為pH調節(jié)和緩沖劑、毒性調節(jié)劑等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣乳酸鈉等。帶 有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物(或編碼帶有細胞內滯留信號的VEGF結合 成員或其衍生物的核酸)的濃度可以有很大的變化，初步是根據液體體積、粘度、體重、所 選擇的特定用藥方式以及病人的需要等來確定。
因此，靜脈注射的典型藥物用量將會是每天每個病人O.lmg到10mg。 O.lmg到
lOOmg每人每天的用藥量可以被施用，尤其是當藥物是施加在一個被隔離的部位而不會進 入到血流中的時候，例如進入到身體的空腔中或器官的內腔中。非腸道用藥的方法對于本技術領域的技術人員來說是很清楚的，并在以下的文獻中有詳細的描述REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 15th en., Mack Publishing Company, Easton, Pa.(1980)。
本發(fā)明的藥物化合物也可包括藥學上可被接受的賦形劑或輔劑，包括但不限于助流劑、 分散劑、表面活性劑、稀釋劑、粘合劑包括低溫溶解粘合劑、分解質、增溶劑和/或潤滑劑。
包含有帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物或其組合(例如，與其它治療 劑，例如化療劑、抗血管生成劑等)可以為治療的目的而被施用。在治療的應用中，對遭受 疾病痛苦的患者是以細胞毒性的量，即足以抑制或/或阻止血管生成的藥量，來給藥物的。足 以實現這的藥量被定義為"治療有效劑量"。為此而使用的有效的藥物量取決于疾病的嚴重程 度以及病人的總體健康狀況。
單次或多次給藥可以按照病人需要的及能忍受的劑量和頻率來進行。在任何情況下，藥 物化合物應該有足夠的數量來有效地治療病人。
在此提供的帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物可以與其它用于治療疾病的 成分和方法一起使用。例如，但不限于，通常情況下，腫瘤的治療是以外科手術、放療、化 療或免疫療法，聯合使用帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物來進行，接著帶有 細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物可隨后施加給患者來延長微轉移的潛伏期并穩(wěn)定 和抑制任何殘留的初生腫瘤的生長。帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物可也與 其它抗血管生成的化合物、或蛋白質、片斷、抗血清、受體拮抗劑、其它抗血管生成的蛋白 的受體對抗劑(例如，血管抑制素、血管內皮抑制素)。該成分可進一步包括其它物質，這些 物質用于增強帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的活性，或者強化它在治療的 活性或作用，例如化療劑、或放療劑等。這些添加的因子和/或藥劑可被包含在本組合物中， 用作與本發(fā)明所述的蛋白質產生增效作用，或減少副作用。
雖然，為了能夠清楚明白本發(fā)明，本發(fā)明通過舉例的方式做了一些詳細的描述，但是對
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血管生成因子的表達
血管內皮生長因子/血管通透性因子(VEGF/VPF)是常被腫瘤或其它組織用作接通血管 生成顯型的一個血管生成因子。事實上，幾乎所有的腫瘤都高水平地表達VEGF。最近地研 究表明，VEGF剌激血管不僅對初生腫瘤的生長，也對轉移很重要。除了病態(tài)的血管生成， 在胚胎的發(fā)育期間，VEGF作為一個因子，通過刺激血管出現和血管生成，對循環(huán)系統(tǒng)的形 成起了很大的作用。VEGF誘導血管形成對于多種生理過程是很重要的，這些生理過程包括 器官的形成、女性生殖和傷口愈合。VEGF是生長因子家族成員中的原型，這些生長因子家 族成員包含了結構相關的成員，包括胎盤生長因子(PLGF)、VEGF-B、VEGF-C、和VEGF-D。 由任何VEGF家族成員觸發(fā)的血管生成信號可被兩個結構相關的同系列酪氨酸激酶受體， VEGFR-1和VEGFR-2，所介導。VEGFR-1和VEGFR-2基本上僅在內皮細胞被表達。VEGF 結合VEGFR-1和VEGFR-2，并誘導血管出現、血管生成和血管通透，然而PLGF禾[]VEGF-B 僅與VEGFR-1結合，其生理和病理功能仍然未知。然而， 一些近期的研究表明PLGF-2對 內皮前體細胞的分化起一 定的作用。
除了 VEGFR-1和VEGFR-2，淋巴內皮細胞特異性的酪氨酸激酶受體，VEGFR-3，也 被發(fā)現。VEGF-C和VEGF-D均能與VEGFR-2和VEGFR-3相互結合，并誘導血管生成和 淋巴管生成。VEGFR-2偶爾在淋巴內皮細胞表達。越來越多的證據表明VEGFR-2的激活能夠為血管生長觸發(fā)血管生成信號，而VEGFR-3的激活能夠誘導淋巴管生成。
對VEGFR-1的功能知道并不多。 一些研究暗示在轉導血管生成信號有直接作用，而其 它的研究報道VEGFR-1可能為VEGF/VEGFR-2發(fā)出信號而作為誘發(fā)受體。最近，VEGFR-1
被發(fā)現其在向新形成的血管補充干細胞分化的內皮細胞起一定的作用。
與VEGF類似，對人PLGF進行剪接，產生成熟PLGF蛋白的至少三種構體，PLGF-1(SEQ IDN0:2)、 PLGF-2(SEQIDNO:5)和PLGF-3。類似其它生長因子，為了與其它特異性的 受體結合，VEGF的所有成員都以二聚蛋白的形式自然存在。根據它們的表達模式，具有截 然不同的生物活性的同源二聚體和異型二聚體被形成。PLGF-1與VEGF在細胞內形成同源 二聚體。當PLGF-1及VEGF均在同一細胞內被產生，PLGF-1/VEGF異源二聚體自然地出 現在組織里。
知道分子機理和信號傳遞的途徑，多種作為治療策略的方案被設計出來以阻隔VEGF的 功能。從而，抗VEGF的反應物，包括VEGF中和抗體、VEGF反義寡核苷酸、可溶VEGF 受體、抗VEGF受體抗體以及細胞內信號傳遞抑制子，在動物模型中產生有價值的抗腫瘤效 果。受到這些臨床前的研究的鼓舞，大約IO個VEGF抗劑最近用作人癌癥試驗。然而，這 些抗VEGF化合物的早期臨床評估產生了一些意想不到的結果。例如，人化的抗VEGF抗體 核幾個抗VEGF小分子沒有產生多少有益的效果。這些失敗引發(fā)幾個重要的爭論，包括急迫 的需要改進現有的抗VEGF治療策略。今天所使用的方法主要是基于功能性重組蛋白對抗劑 的發(fā)展和和施用，這些對抗劑可中和細胞外的VEGF的功能或阻隔靶細胞內的VEGF信號的 傳遞。然而，所有這些策略都沒有把目標設定于阻隔腫瘤細胞內的VEGF的分泌。
現有的治療策略的缺點是很多的，包括難以生產有活性的重組蛋白、需要高劑量、對身 產和消費者來說高成本、以及對病人可能需要終生治療。因相對短的半衰期，重組蛋白必須 以注射的方式重復施用，從一天一次到好幾次?；蛑委熥鳛橐环N可供選擇的方法，能夠避 免蛋白治療的好幾個缺陷。本發(fā)明提供幾個可供選擇的抗VEGF的基因治療方法，這些方法 通過阻隔VEGF從細胞，例如腫瘤細胞，內分泌來實現的。
結果
含有PLGF-KDEL或VEGF-KDEL的反轉錄病毒載體的產生
經由傳統(tǒng)的分泌途徑，PLGF-1和VEGF被釋放出來，它們的功能二聚體可以在內質網里 形成。為了構建被內質網滯留的PLGF-1或VEGF，人或VEGF的C-末端融合有KEDL(SEQ ID NO:7)， 一個哺乳動物內質網滯留信號?；蚪Y構的正確融合通過序列分析來確定。融合基因 產物被分別克隆到一帶有綠色熒光蛋白(GFP)標記的反轉錄病毒載體上，而該重組反轉錄病毒 被用于轉導一被特性化的大鼠Lewis肺癌(LLC)細胞系，該細胞系在體內依賴VEGF來進行生 長。HPLGF-1(SEQ ID NO:l)和hVEGFcDNA的存在是通過Southern Blot分析來確定的，而 GFP陽性細胞則通過FACS分析被挑選出來。
腫瘤細胞內的VEGF分泌的隔斷
為了確定細胞內和細胞外的二聚體分子的數量，靈敏的夾心酶聯免疫吸附測試法被用于 分析細胞溶解產物以及被轉導和未被轉導的LLC細胞系的條件培養(yǎng)基。針對每個因子，特異 性的抗體被使用，兩個抗體針對同一個因子但產生不同的類型(同源二聚體)，或兩個抗體針 對不同的因子(異源二聚體)。正如所預料的，大量的mVEGF同源二聚體被檢測存到在于條 件培養(yǎng)基、wtLLC以及質粒轉導的LLC細胞里(表1 )。由wt和質粒轉導的LLC細胞所產生的大部分mPLGF-1與mVEGF發(fā)生異質二聚化，這表明mPLGF-1傾向于與mVEGF形成 異源二聚體，而不是形成mPLGF-1/mPLGF-1同源二聚體。在這些細胞內過度表達hVEGF 導致除了 hVEGF/hVEGF同源二聚體(41880pg/ml)外，還有足量的hVEGF/mVEGF異源二 聚體分子(3779pg/ml)的分泌。
相反地，以hVEGF-KDEL轉導LLC細胞有效地阻止了 VEGF的分泌，大部分 hVEGF/mVEGF和hVEGF/hVEGF (分別為1578pg/ml和2624pg/ml)滯留在細胞內，只有 很小量部分的hVEGF/mVEGF(268pg/ml)和hVEGF/hVEGF(628pg/ml)出現在條件培養(yǎng)基
中。這表明KDEL(SEQ ID N0:7)功能序列被有效地滯留在內質網中。與我們之前的報道一致， 事實上，所有的mVEGF分子以hPLGF/mVEGF異源二聚體的形式出現在PLGF-1高效表達 的LLC細胞的條件培養(yǎng)基中(5581pg/ml)(表1)。在這些腫瘤細胞中，HPLGF-1/mVEGF 異源二聚體的優(yōu)先形成使被分泌的mVEGF同源二聚體被有效地耗盡(表1)。非常顯著地， 在LLC細胞里，hPLGF-1-KDEL的基因傳送不僅使幾乎所有的mVEGF分子形成 hPLGF-1/VEGF異質而聚體，而且也阻止了 hPLGF-1/hPLGF-1同源二聚體以及 hPLGF-1/mVEGF異質而聚體的分泌。各種異質或同源二聚體大部分在細胞內存在，而只有 小部分出現在條件培養(yǎng)基中。
腫瘤細胞釋放的內皮刺激物活性的消耗
為了監(jiān)測VEGF介導的內皮細胞活性，使用各種被轉導的腫瘤細胞的條件培養(yǎng)基，利用 改良過的Boyden趨化分析方法來確定內皮趨化活性。表達VEGF-1和VEGF-2的豬大動脈內 皮(PAE)細胞之前已經被用作檢測VEGF的活性。在這檢測過程中，當對純化的重組二聚體生 長因子進行檢測，僅VEGF同源二聚體能夠明顯地引起VEGF-2/PAE細胞運動。PLGF-1同 源二聚體和PLGF-1/VEGF異源二聚體均不能使細胞的運動高于對照的水平。正如所預料的， 為被轉導的或載體轉導的LLC細胞明顯刺激VEGFR-2/PAE細胞的轉移(圖le和f)。然而， PLGF-1(SEQ ID NO:2)或PLGF-1-KDEL(SEQ ID NO:3)的過量表達明顯地阻止了 LLC細胞產 生地VEGF的活性(pO.OOl)(圖1 e)。 hVEGF的高水平表達增強了 LLC細胞產生的趨化活
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細胞的遷徙(PO.001)(圖lf)。所有的重組因子或條件培養(yǎng)基都不能誘導VEGF-1/PAE細胞 的運動(圖la-c)。類似的試驗結果也從初級HUVE細胞的試驗中獲得(試驗數據沒有顯示)。 與ELISA數量測定一致，這些結果表明KDEL(SEQ ID NO:7)與PLGF-1(SEQ ID NO:2)或 VEGF的結合有效地阻隔了鼠的內生VEGF活性。
除了趨化現象外，表達VEGF-1或VEGFR-2的PAE內皮細胞的形態(tài)變化也被檢測，作 為一個獨立的指標來評估腫瘤細胞釋放的VEGF活性。把濃度為SOng/ml的重組hVEGF同 源二聚體添加至VEGF-2/PAE細胞，隨著肌動蛋白纖維的重組，細胞變成紡錘形(圖lh)， PLGF-1同源二聚體及PLGF-1/VEGF異源二聚體則不能夠產生這種特征(圖li和j )。用wtLLC 或載體轉染LLC細胞的條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，也導致在VEGFR-2PAE細胞出現伸長的紡錘 狀細胞形(圖lk和l)，這與rhVEGF所導致的細胞形態(tài)類似。在LLC細胞內過量表達hVEGF 導致表達VEGFR-2的PAE細胞的細胞形態(tài)明顯的變化以及肌動蛋白重組(圖lo)。相反的， hPLGF-l則完全阻止了由VEGF引起的細胞形態(tài)的變化。這表明大部分VEGF分子與hPLGF-l 形成了異源二聚體(圖lm)，這與ELISA數量分析和趨化分析相一致。類似的，VEGF導致 的細胞形態(tài)的變化被PLGF-1-KDEL(SEQ ID NO:3)或VEGF-KDEL在這些腫瘤細胞中的表達 所抑制(圖ln和p)。另夕卜，細胞系的條件培養(yǎng)基不能導致在VEGF-1/PAE細胞的內皮形態(tài) 發(fā)生類似的變化(數據沒有顯示)。
腫瘤生長的抑制
18雖然PLGF-1和VEGF被看作是作用于血管內皮細胞的特異性生長因子，但是這些因子 在內質網的過量表達和滯留可以影響腫瘤細胞生長。為了排除可能性，PLGF-1-KDEL(SEQ ID N0:3)和VEGF-KDEL細胞的生長速率與對照細胞的生長率進行比較。與wtLLC和載體轉導 的LLC細胞相比，把PLGF-1-KDEL(SEQ ID NO:3)或PLGF-1 (SEQ ID NO:2)轉導入LLC細胞 不能改變生長速率，這表明PLGF-1在內質網腔的積累不能影響腫瘤在體外的生長(圖2a)。 類似的，與VEGF過量表達細胞或2個對照細胞系相比，VEGF-KDEL轉導的LLC細胞并沒 有顯示出有所變化的體外的生長速率(圖3a)。 LLC腫瘤是在體內最具有侵略性和迅速生長的 大鼠腫瘤之一。對于對照來說，在培養(yǎng)了5天后，肉眼可見的腫瘤就出現了，而在培養(yǎng)了 2 個星期內腫瘤就已經長至瑞典規(guī)范的極限(1500mm3)(圖2c和3c)。與我們最近在大鼠T241 纖維肉瘤模型的發(fā)現5相一致，hPLGF在LLC的表達明顯延緩了腫瘤的生長，且肉眼可見的 腫瘤在培養(yǎng)的第10天才被發(fā)現(圖2c)。與wt:和被載體轉導的腫瘤比較，在腫瘤培養(yǎng)的第14 天，在hPLGF-l表達型的腫瘤細胞里，大約90%的腫瘤生長抑制被記錄下來。這些腫瘤在培 養(yǎng)的第16天仍然維持在比較低的平均體積，小于200mm3 (圖2d)。
在培養(yǎng)的第14天，hPLGF-l-KDEL-LLC細胞的細胞大小幾乎不能被檢測到，40mm(圖 2b-d)。在延長試驗期間，又經過3個星期，這些腫瘤仍然維持較小的體積(圖2d)。在培養(yǎng) 了 3個星期后，當hPLGF-l-LLC腫瘤繼續(xù)生長成平均尺寸大于600mm時， hPLGF-l-KDEL-LLC腫瘤的平均尺寸小于100mm(圖2d)。因此，hPLGF-l-KDEL-LLC和 hPLGF-l-LLC被測得的腫瘤體積明顯不一樣(pO.OOl)。 hPLGF-l-KDEL-LLC腫瘤的生長速率 被明顯地延緩，這表明在體內，這些腫瘤細胞產生相對休止狀態(tài)的腫瘤，反之hPLGF-l-LLC 腫瘤不能夠促使腫瘤休止，而僅延緩血管生成的啟動。
為了進一步研究KEDL(SEQ ID N0:7)序列融合與VEGF的融合體是否也能抑制腫瘤生 長，hVEGF-KDEL-LLC細胞被移植到C57B1/6鼠體內。雖然wt和被載體轉染的細胞高水平 產生VEGF，在這些細胞里hVEGF的高度表達能夠進一步加速腫瘤的生長。在僅僅10天后， hVEGF-LLC腫瘤的平均大小就己經達到1400mm (接近瑞典規(guī)范的極限)(圖3c和e)，與此 相反，wt-LLC細胞和載體-LLC細胞需要14天才能產生類似大小的腫瘤(圖3b和d)。帶有 hVEGF-LLC腫瘤的老鼠在移植腫瘤細胞后的第IO天被宰殺，在此時，與hVEGF-LLC腫瘤 相比，在hVEGF-KDEL-LLC腫瘤，90%的抑制被檢測出(圖3c和e)。與hVEGF-LLC相反， 與wt和載體腫瘤相比，hVEGF-KDEL-LLC細胞的移植在第14天幾乎抑制了 50%的腫瘤生 長(圖紙3b和d)。在體內的這些腫瘤生長的差異不能歸因于改變了腫瘤細胞的生長速率， 因為所有被轉導或未被轉導的腫瘤細胞在體內以基本相同的速率生長(圖2a和3a)。
VEGF誘導的腫瘤新血管化的抑制
為了研究腫瘤的新血管化，用抗-CD31抗體進行了免疫組織化學的檢測。與wt或載體轉 導的LLC腫瘤比較，人PLGF-KDEL-LLC腫瘤明顯地減少了新血管化(圖4a、 b、 f和g)。 與早期在大鼠纖維肉瘤模型的發(fā)現相一致，在LLC內PLGF-1的過量表達導致LLC腫瘤新血 管化的顯著抑制(圖4e和g)。然而，hPLGF-l-KDEL在阻止腫瘤新血管化方面比PLGF-1明 顯更有效。以hPLGF-KDEL轉導LLC也顯著地阻止了腫瘤新血管化。與hPLGF-l(SEQ ID N0:2)、 hPLGF-l-KDEL(SEQ ID N0:3)以及hVEGF-KDEL相反，單獨以hVEGF轉導LLC明 顯增加了腫瘤新血管化(圖4c和g)，平均高于350微血管/光場(XIO)。
對腫瘤血管的共焦點檢測發(fā)現wt和載體轉導的腫瘤包含有較多的血管和更高密度的毛 細血管芽(圖4h和I)。有趣的是，在hVEGF-LLC腫瘤發(fā)現特別多的毛細血管或微型血管， 這些毛細血管核微型血管很可能融合入原有的血管神經從。這種類型的血管結構看起來是有 漏洞的和出血的，因為對腫瘤組織的解剖檢查顯示hVEGF-LLC腫瘤由大量的出血的組織流 體組成。相反的，以hVEGF-KDEL轉導的LLC腫瘤阻止了毛細血管芽的形成導致沒有通常的支血管的血管結構的形成(圖4k)。很明顯，在LLC腫瘤里過量表達hPLGF-l-KDEL(SEQ ID N0:3)導致不僅血管數目的大量減少，而且?guī)缀跛械奈⒚氀鼙缓谋M(圖4m)。這些 數據顯示在鼠腫瘤兩中，內質網滯留的hPLGF-l-KDEL(SEQ ID NO:3)或hVEGF-KDEL蛋白
的過量表達有效地阻止了 VEGF的分泌和腫瘤新血管化。
誘導腫瘤細胞凋亡
血管生長進入腫瘤不僅為腫瘤細胞提供了營養(yǎng)和氧氣，也提供了生存因子。因此，抑制 腫瘤血管生成可影響腫瘤細胞凋亡率。為了確定腫瘤細胞的凋亡數，進行了 TUNEL染色。 大約地，在快速生長的wt和載體轉導腫瘤中，平均8個凋亡細胞/光場(40X)被發(fā)現(圖 5a、 b和g)。 hVEGF的過量表達明顯腫瘤細胞的凋亡數目(4個凋亡細胞/光場，p<0.05)，這 表明hVEGF誘導的血管能夠提供而外的存活因子，因此防止腫瘤細胞的凋亡(圖5c和g)。 然而，hVEGF-KDEL轉導入LLC腫瘤細胞導致細胞凋亡明顯增多(17個凋亡細胞/光場， pO.OOl )(圖5d和g)。在hPLGF-l-KDEL(SEQ ID NO:3)和hPLGF-l(SEQ ID NO:2)轉導的LLC 細胞里，凋亡細胞的數目增加也是非常顯著的(分別為19和22個凋亡細胞/光場，pO.OOl) (圖5e、 f和g)。根據我們之前的結果，即使是腫瘤細胞凋亡地小量增多也會對腫瘤的體積長 生較大的影響，因為腫瘤細胞的周轉率是相對比較塊的。這些數據表明在hVEGF-KDEL和 hPLGF-l-KDEL(SEQ ID NO:3)轉導的腫瘤里，有大量的腫瘤細胞因供血不足而凋亡。
討論
在大多數腫瘤，VEGF被確信是啟動血管生成的一個因子。VEGF在疾病的調控的作用 不僅限于癌癥。其它的血管生成依賴型疾病，包括糖尿病視網膜病、與年紀相關的斑點退化、 與動脈硬化有關的局部缺血性心臟病、以及中風，也與VEGF有關。因此，VEGF對抗劑的 發(fā)展成為了用作治療癌癥和其它普通疾病的抗血管生成療法的一個中心焦點之一。這些對抗 劑以VEGF配合基體、受體以及細胞內的信號傳送元件為目標。在動物疾病模型中，成功地 傳送了大多數VEGF對抗劑，在阻礙病理過程和改善疾病狀況方面產生了顯著的影響。例如， VEGF中和抗體阻礙了老鼠體內的腫瘤生長。來至動物研究的良好結果喚起了把這些化合物 用于治療人類疾病的熱情。事實上，多于10種不同的VEGF抗劑己經進入了用于治療人類癌 癥的臨床試驗。
因為大多數抗-VEGF反應劑抑制細胞外的VEGF的功能，很有可能，這些VEGF抗劑可 能不能完全抑制VEGF的活性。另外，這些方法在臨床試驗中可能面臨著幾個潛在的問題， 包括1)為了維持在血液中的藥物的穩(wěn)定的量，需要經常注射抗VEGF重組蛋白或化合物； 2) —些對抗劑，例如可溶的VEGF受體，在血液循環(huán)中僅有非常短的半衰期，這些分子可能 通過結合到肝磷脂狀的結構，而被吸附在細胞外的基質層，或者從身體里快速地被清除；3) 作為蛋白分子， 一些VEGF對抗劑可能很容易被體內地蛋白酶所破壞；4)為了產生有益地效 果，需要使用相對大劑量的VEGF對抗劑；5)因為通過交叉的RNA剪接，能夠產生幾個 VEGF的異型體，不是所有的對抗劑可以有效抑制所有VEGF異型體的功能；6) VEGF和 VEGF受體可能會與身體內的其它蛋白結合，從而得到一個改變的結構，因此，抗-VEGF抗 體可能不能識別原始的抗原決定部位；7)長期使用VEGF對抗劑治療對于制造者和病人均需 要高昂的成本。所有的這些潛在的問題使優(yōu)化抗-VEGF的方法的需要特別突出。
本發(fā)明的一些方面是提供資料方法來阻止VEGF從腫瘤細胞分泌。因為腫瘤細胞缺乏高 度親和的VEGF受體，作為細胞內蛋白質的VEGF的吸收可能不會導致激發(fā)胞內分泌信號傳 導途徑。與這原理相一致，本發(fā)明的一個具體實施方式
揭示細胞內的VEGF的過量表達不會 改變腫瘤的體外生長速率。為了阻止VEGF的分泌， 一個細胞內滯留信號，KDEL(SEQ ID NO:7)， 一個把分泌蛋白滯留在內質網的四氨基酸多肽，被融合到PLGF-1的c末端。應用到這個方案的原理是用PLGF-1作為誘餌，與VEGF形成沒有活性的異源二聚體。在腫瘤細胞 里，hPLGF-l-KDEL(SEQIDN0:3)的過量表達使大部分內生VEGF單體形成異源二聚體。因 此，這種策略幾乎完全抑制了 VEGF被腫瘤細胞分泌。
除了異源二聚體，大多數PLGF-1同源二聚體被滯留在內質網腔中而沒有進一步分泌。 阻止PLGF-1同源二聚體的分泌是進一步抑制VEGF功能的重要步驟。與VEGFR-2比較， VEGF對VEGFR-1具有更高的結合親和力。過量的細胞外的PLGF-1能夠與VEGF競奪與 VEGFR-1受體的結合。因此，阻止PLGF-1同源二聚體分泌將會降低VEGF與VEGFR-2， 一 種轉導血管生成和血管泄漏信號的受體，結合的可能性。防止PLGF-1/VEGF異源二聚體分 泌可進一步抑制血管生成活性，因為這些異源二聚體可能具有一些未知的血管生成的特性。 因為許多腫瘤過量表達PLGF-1禾卩PLGF-2，通過hPLGF-1—KDEL(SEQ ID NO:3)阻止內生 PLGF分泌能夠進一步降低VEGF誘導的血管生成和腫瘤生i。因此，在此公開的本發(fā)明的 幾個方面在細胞內和細胞外，在兩個水平上阻隔VEGF。正如所預料的，hPLGF-l-KDEL(SEQ IDNO:3)的過量產生比原有的PLGF-1表現出更強的抗腫瘤活性的能力。
雖然把hVEGF轉到入腫瘤細胞進一步加強了腫瘤血管生成和腫瘤生長，但是，與對照腫 瘤相比，過量表達的hVEGF-KDEL有力地抑制腫瘤生長。這些數據表明把KDEL(SEQ ID NO:7) 序列結合到hVEGF序列，形成hVEGF-KDEL，有效地阻隔了內生的老鼠VEGF分泌和抵制 其活性。因此，本發(fā)明的一些方面是提供通過抑制和/或阻止VEGF分泌來有效地抵抗血管生 成的治療方法。
試驗過程
動物
6-7周大的C57B1/6雌鼠被馴化并以6個或更少為一組用籠子關住。動物在進行任何步 驟之前，先用1:1的多美康和芬多尼混合物對動物注射來使其麻醉，然后用致死量的二氧化 碳殺死動物。所有的動物研究都是在Stockholm Animal Board的動物關懷和使用委員會的監(jiān) 督和同意之下進行的。
PLGF-1/VEGF異源二聚體的產生和純化
如先前的描述，重組人PLGF-l(SEQIDNO:l)和VEGFi單體在E.Coli里被表達?？朔肿?數相等的PLGF-1和VEGFi同源二聚體混合物，總蛋白濃度0.5mg/ml，存放在還原緩沖溶液 中(20mM Tris-HCl, pH8.0, 6M Guanidine-HCl,禾Q 10mM DTT)， 4。C過夜。第二天，蛋白溶液 以10倍體積的再重疊緩沖液(2M urea, 20mM Tris-HCl, pH 8.0， 2mM GSH(Glutathione-SH)和 0.5mMGSSG(glutathione-S-S-glutathione))進行透析。使用這再重疊方法，PLGF-1禾Q VEGFi 同源二聚體的混合物以及異源二聚體PLGF-1/VEGF被制造。
該同源二聚體和異源二聚體蛋白用山羊多克隆的抗hVEGF親和柱以及多克隆的山羊抗 hPLGF親和柱來進行親和層析分離。該蛋白溶液，先用PBS透析，然后以2ml/min的流速加 入到預先用PBS平衡的抗hVEGF親和柱。接著，用同樣流速的PBS沖洗柱子，直到在280nm 的吸光率到達基線水平。VEGF同源二聚體和PLGF-1/VEGF異型二聚體，而不是PLGF同源 二聚體，被柱子所留住，并用0.1M的檸檬酸鈉、pH2.5、 0.3MNaCl溶液(洗脫緩沖液)洗脫。 從抗VEGF柱上被洗脫的二聚體立刻用2MTris緩沖液，pH8，中和，隨后20倍體積的PBS 于4。C透析4小時。在透析后，用同樣的條件，把蛋白樣品加入到預先用PBS平衡過的抗PLGF 親和柱。只有異源二聚體被留住并用同樣的洗脫緩沖液從柱子洗脫。純化的hPLGF-l、 hVEGF 和hPLGF-l/hVEGF蛋白最有用PBS透析出并在還原和非還原的條件下用SDS-PAGE進行分析，最后測量蛋白質的濃度。
反轉錄病毒載體的設計和腫瘤細胞轉導
編碼人PLGF-1(SEQ ID N0:1)、 PLGF-1-KDEL、 VEGF和VEGF-KDEL的足量cDNA被 克隆入帶有GFP的i鼠干細胞病毒(MSCV)載體(來自DR. R. Hawley at the Holland Laboratory, Rockville, MD)。采用傳統(tǒng)的磷酸鈣轉染法，把反轉錄病毒結構與編碼親嗜性的gag/pol以及 水皰性口炎病毒-糖蛋白(VSV-G)包膜蛋白的表達質粒一起轉染進入293T細胞，產生反轉錄病 毒上清液。在RetronectinTM (Biowhittaker, East Rutherford, NJ)被培養(yǎng)皿上，在連續(xù)的2天 里，把對數期生長的大鼠LLC細胞暴露在加有8ug/ml硫酸魚精蛋白的反轉錄病毒上清液的 濾液中6小時。GFP陽性細胞用配備有5-w氬氣以及30-mW氖氣激光的FACStar+(Becton Dikinson, San Jose, CA)進行篩選。PCR以及Southern blot檢測也按標準方式進行。
腫瘤細胞增殖檢測
用載體-、hPLGF-l-(SEQ ID NO:2)、 hPLGF-l-KDEL(SEQ ID NO:3)-、 hVEGF-以及 hVEGF-KDEL轉導的LLC細胞和wtLLC細胞被種植在24孔板上，細胞密度為1 X 104個細 胞/孔，培養(yǎng)基為添加有10XFCS的DME培養(yǎng)基，并在37'C。一在各個時間點，細胞用胰蛋白 酶消化，用IsotonII溶液(Beckman Coulter, Sweden)再次懸浮，并用Coulter計數器計數。 每個樣品一式三份，且所有的試驗均做三次。
細胞形態(tài)檢測和肌動蛋白染色
表達VEGFR-1或VEGFR-2的PAE細胞在12孔板里的蓋玻片上培養(yǎng)，培養(yǎng)基為添加有 10%FCS的Ham's F12培養(yǎng)基。當達到40%—60%的鋪滿時，培養(yǎng)基用新鮮的F12培養(yǎng)基替 換，該新鮮的培養(yǎng)基F12含有僅2%的FCS和50ng/ml的重組因子(hVEGF、 hPLGF-l或 hPLGF-l/VEGF)或者25% (v/v)的來自LLC細胞系的條件培養(yǎng)基，所述的LLC細胞系包 括wt，、 vector、 hPLGF-l、 hPLGF-l-KDEL、 hVEGF或hVEGF-l-KDEL。沒有被處理的細胞 作為負對照。在培養(yǎng)16小時后，用3X的多聚甲醛PBS(pH7.5)溶液固定15分鐘。用PBS沖 洗三次，并用0.5%Triton X-100的PBS溶液使其通透化15分鐘。細胞被再次用PBS沖洗， 并lug/ml的TRITC-phalloidin(Sigma)PBS稀釋液染色30分鐘。在用PBS沖洗后，蓋玻片 安裝在甘油和PBS (9:1)的混合物中。細胞用光和熒光顯微鏡進行檢測，在5個光場(20X) 里統(tǒng)計紡錘狀的細胞數量。數據表示平均％ (SEM)。
趨化檢測
使用之前描述過的修飾過的Boyden趨化小室技術，檢測VEGF-1/PAE和VEGFR-2/PAE 細胞對各種重組生長因子以及LLC條件培養(yǎng)基的運動反應。簡要地說，表達VEGFR的PAE 細胞遷移通過一微孔硝化纖維過濾器(8um厚，8um孔)的能力被檢測作為趨化刺激的一個 標準。補充有0.2%BSA和50ng/ml的重組因子(hVEGF、 hPLGF-l或hPLGF-l/hVEGF)或 25X(V/V)的來自被反轉錄病毒轉導的不同細胞的條件培養(yǎng)基之一的無血清培養(yǎng)基被添加至 下層室內。沒有被處理的細胞作為負對照。細胞被消化并用無血清的培養(yǎng)基(0.2%BSA)懸 浮，懸浮的細胞密度為0.8X10個細胞/ml，而且40000個細胞被添加到上層腔室內。37。C培 養(yǎng)4小時后，Boyden腔室被拆開，粘附在過濾器上的細胞用甲醇固定并用吉姆薩溶液染色。 每個樣品細胞的四倍量被使用，且所有的試驗均做三次。遷移通過過濾器的細胞用光學顯微 鏡統(tǒng)計個數，并被劃分為每個光場(32X)的遷移細胞個數。
酶聯合免疫吸附試驗(ELISA)
所有的夾心ELISA用Quantikine ELISA系統(tǒng)按照操作手冊的說明來(R&D系統(tǒng))進行。簡要地說，標準鼠(m)VEGF和樣品被添加到一個96孔的微孔板，該微孔板預先用親和純化 的并對mVEGF具有專一性的多克隆抗體包被。用對VEGF具有專一性的酶聯多克隆抗體檢 測到含有mVEGF的同源二聚體。類似地，mPLGF-l、 hVEGF和hPLGF-l的同源二聚體用 Quantikine M mPLGF-l ELISA試劑盒、Quantikine hVEGF ELISA試劑盒和Quantikine hPLGF ELISA試劑盒來進行測量。這三個試劑盒含有特異性單克隆抗體。
異源二聚體用交叉捕獲和以上提及的用ELISA檢測到的抗體來測量。對于 mVEGF/mPLGF-l異源二聚體，樣品被添加到一個預先用抗mVEGF的微孔板上。酶聯抗 mPLGF-l接著被用于檢測mVEGF/mPLGF-l異源二聚體。為了使檢測標準化， 一個重組 mPLGF-l標準物在該PLGF-1板上同時進行分析檢測。該同源二聚體沒有被發(fā)現有交叉反應。 類似的，用預先以抗hVEGF抗體以 用作檢測異源二聚體的抗mVEGF耦聯物來包被的微孔 板對mVEGF/hVEGF異源二聚體進行測量。在mVEGF板進行分析的重組mVEGF標準物被 用作標準。從每個同源二聚物，大約1-2%的交叉反應被觀察到，而這些結果被相應地修正。 用微板對mVEGF/hPLGF-l異源二聚體進行測量，該微板預先用抗mVEGF抗體以及抗 hPLGF-l耦聯物包被。在hPLGF-l板上進行分析的重組hPLGF-l標準物被用做標準。大約3 。"來自于hPLGF的同源二聚體的交叉反應被觀察到，且該結果被相應地修正。
小鼠身上的腫瘤研究
表達hPLGF-l、 hPLGF-l-KDEL、 hVEGF或hVEGF-KDEL的野生型LLC、載體轉導的 LLC以及LLC細胞被用于6-7周大的同源C57B1/6小老的腫瘤移植研究。大約1 X 106個腫 瘤細胞以皮下方式被移植到小鼠背部。被處理的組和對照組都使用6個小鼠。在所顯示的天 數里，初生腫瘤用數碼測徑器進行測量。腫瘤體積按照以下公式進行計算寬度"X長度2※ 0.52，而且，當達到瑞典規(guī)范的極限(1500mm3)，腫瘤被摘除。
組織學
當腫瘤達到瑞典規(guī)范的極限時用外殼手術摘除。為了確定腫瘤血管的數量，利用抗-CD31
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t幾1牛，近1丁光7父5丑5,VH^子fl;fr九。月卞溜5丑2:/h、州j;/orfA ,疋，jj咒/jv々wnjdn百'ti森?！陡蒮ifl個漢W門 (6um厚)并用20umml"蛋白酶K (Life Technologies)處理。過氧化物酶活性的背景水平以 0.3%11202消除，而內源生物素和抗生物素蛋白的活性用Avidin/BiotinBlocking試劑盒(Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)阻斷。首先使用針對CD31(Pharmingen, San Diego, CA)的生 物素?；膯慰寺】贵w，接者用山葵過氧化物酶(HRP)耦聯的鏈霉抗生物素蛋白(SA)來對切片 用生物素進行免疫染色。酪胺信號放大(TSA)試劑盒(NEN Life Science, Boston, MA)被用來 增強染色信號。利用二氨基聯苯胺(DAB, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)形成過氧 化物酶的活性。切片被拍照，且用光學顯微鏡在6個光場(20X)對血管的數目進行統(tǒng)計。 數據表示平局％ (土SEM)。
共聚焦顯微鏡術分析
為了能直接形象化地顯現腫瘤血管形成，進行了整體染色和共聚焦顯微術分析。腫瘤被 切成組織薄片，并用3XPFA固定過夜。組織內抗體抗的原決定基通過蛋白酶K(20ugml")消 化和甲醇通透化而被暴露出來。在用內生生物素和抗生物素蛋白的活性在染色前用生物素酰 化的針對CD31(Pharmingen, San Diego, CA)的老鼠抗-鼠單克隆抗體阻斷。用SACy3(Jackon ImmunoResearch Laboratories Inc.)找出血管，并用共聚焦顯微(Zeiss Confocal LSM510 Microscope)顯現血管。通過掃描每個樣品的16片薄切片(5-6um間距)，得到每個組織的三 維影像。
TUNEL染色為了在腫瘤里找出凋亡細胞，進行了 TUNEL染色。腫瘤組織用3%的多聚甲醛固定、脫 水并用石蠟包裹。按照標準的但被修飾過的熒光素Death Detection試劑盒(Amersham)，脫 蠟和再脫水的組織切片(5um厚)被進行TUNEL染色。簡單地說，組織用20ugm廠1蛋白酶 K(LifeTechnologies)處理，且過氧化物酶的背景水平在甲醇里用3%的11202消除。TUNEL反 應混合物被添加到切片，并在潮濕的氣氛下37。C培養(yǎng)1小時，接著用Hoescht33258(500ngmr1) 統(tǒng)計被染色的細胞。切片被拍照，并在熒光顯微鏡的IO個光場(40X)里統(tǒng)計凋亡細胞個數。 數據表示平均抗原決定簇(土SEM)。
統(tǒng)計分析
統(tǒng)計分析在Microsoft Excel里采用標準的Student's two-tailed t-test進行。P-值小于0.05 和O.OOl分別被看作顯著和非常顯著。
權利要求
1. 一種被分離的核酸，包括編碼帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是一個cDNA序列。
2. 按照權利要求1所述的被分離的核酸，其特征在于所述的VEGF結合成員是 VEGF-B(SEQ ID NO:IO或13)。
3. 按照權利要求1所述的被分離的核酸，其特征在于所述的VEGF結合成員是PLGF-1(SEQ ID NO:l)。
4. 按照權利要求1所述的被分離的核酸，其特征在于所述的細胞滯留信號是一個包含有KDEL(SEQ ID NO:7)的內質網膜滯留信號。
5. —用作表達帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員的重組質粒，其特征在于帶有細胞滯 留信號的VEGF結合成員或其衍生物與細胞內的VEGF形成異質二聚體。
6. —重組病毒載體，包含有編碼帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的核苷酸 序列，其特征在于所述的VEGF結合成員或其衍生物與細胞內的VEGF形成雙鏈體， 且所述核苷酸序列是一個CDNA序列。
7. 按照權利要求6所述的重組病毒載體，其特征在于所述的帶有細胞內滯留信號的VEGF 結合成員或其衍生物是VEGF-B。
8. 按照權利要求6所述的重組病毒載體，其特征在于所述的帶有細胞內滯留信號的VEGF 結合成員或其衍生物是PLGF-l(SEQ ID NO:l)。
9. 按照權利要求6所述的重組病毒載體，其特征在于所述的細胞內滯留信號是一個包含有 KDEL(SEQ ID NO:7)的內質網膜滯留信號。
10. 按照權利要求6所述的重組病毒載體，其特征在于:所述的重組病毒載體選至腺病毒載體、 腺相關病毒載體、慢性病毒載體、反轉錄病毒載體以及皰疹病毒載體。
11. 一種藥物組合物，包括帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物以及藥學上可 接受的載體。
12. 按照權利要求ll所述的組合物，其特征在于所述的帶有細胞內滯留信號的VEGF結合 成員或其衍生物與VEGF形成異源二聚體。
13. —種藥物組合物，包括權利要求6所述的病毒載體以及藥學上可接受的載體。
14. 一種抑制細胞內的VEGF分泌的方法，包括向個體施加有效劑量的帶有細胞內滯留信號 的VEGF結合成員或其衍生物，其特征在于所述的帶有細胞內滯留信號的VEGF結合 成員或其衍生物與所述的細胞內的VEGF形成異源而聚體并抑制所述的細胞內的VEGF 分泌。
15. 按照權利要求14所述的方法，其特征在于所述的帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物從一重組質粒表達。
16. 按照權利要求14所述的方法，其特征在于所述的帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物從一重組病毒載體表達。
17. 在病人細胞內抑制VEGF活性的方法，包括向個體施用有效量的帶有細胞內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物，其特征在于所述的VEGF結合成員或其衍生物與細胞內的 VEGF形成異源二聚體并抑制或破壞病原細胞的生長。
18. 按照權利要求17所述的在細胞內抑制VEGF活性的方法，其特征在于所述的病人患有以下疾病的一種癌癥、炎性關節(jié)炎、糖尿病視網膜病、新生血管性眼睛疾病、動靜脈畸形、過度出血、Osier-Webber綜合癥、心肌血管新生、血小板新血管化、毛細管擴張、 血友病關節(jié)癥、血管纖維瘤、傷口肉芽以及過度的或不正常的內皮細胞積累疾病。
19. 按照權利要求17所述的在細胞內抑制VEGF活性的方法，其特征在于所述的帶有細胞 內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物是VEGF-B(SEQ ID NO:12或14)。
20. 按照權利要求17所述的在細胞內抑制VEGF活性的方法，其特征在于所述的帶有細胞 內滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物是PLGF-1(SEQ ID NO:3)。
21. 按照權利要求17所述的在細胞內抑制VEGF活性的方法，其特征在于所述的細胞滯留 信號是KDEL(SEQ ID NO:7)。
22. —種抑制VEGF從VEGF分泌細胞分泌的方法，包括向病人施用足量的反轉錄病毒載體 以轉導病人體內的VEGF分泌細胞，其特征在于所述的反轉錄病毒載體包括一編碼帶 有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的核苷酸序列，而帶有細胞滯留信號的 VEGF結合成員或其衍生物表達有足夠的量以和所述的VEGF形成異源二聚體，而所述的 異源二聚體抑制VEGF從所述的VEGF分泌細胞分泌。
23. 按照權利要求22所述的抑制VEGF從VEGF分泌細胞分泌的方法，其特征在于所述的 病人患有以下疾病的一種癌癥、炎性關節(jié)炎、糖尿病視網膜病、新生血管性眼睛疾病、 動靜脈畸形、過度出血、Osier-Webber綜合癥、心肌血管新生、血小板新血管化、毛細 管擴張、血友病關節(jié)癥、血管纖維瘤、傷口肉芽以及過度的或不正常的內皮細胞積累疾病。
24. 按照權利要求22所述的抑制VEGF分泌的方法，其特征在于所述的帶有細胞滯留信號 的VEGF結合成員或其衍生物是VEGF-B(SEQ ID NO:3)。
25. 按照權利要求22所述的抑制VEGF分泌的方法，其特征在于所述的帶有細胞滯留信號 的VEGF成員或其衍生物是PLGF-1(SEQ ID NO:3)。
26. 按照權利要求22所述的抑制VEGF分泌的方法，其特征在于所述的細胞滯留信號是 KDEL(SEQ ID NO:7)。
27. —種藥物組合物，包括至少一個反轉錄病毒載體，該反轉錄病毒載體包含有編碼帶有細胞 滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物的核苷酸序列。
28. 按照權利要求27所述的藥物組合物，其特征在于所述的帶有細胞滯留信號的VEGF結 合成員或其衍生物是VEGF-B(SEQ ID NO: 10或13)。
29. 按照權利要求27所述的藥物組合物，其特征在于所述的帶有細胞滯留信號的VEGF結 合成員或其衍生物是PLGF-1(SEQ ID NO:l)。
30. 按照權利要求27所述的藥物組合物，其特征在于所述的細胞滯留信號是KDEL(SEQID NO:7)。
31. 在一個體里抑制血管生成的方法，包括向個體施用有效量的帶有細胞滯留信號的VEGF 結合成員或其衍生物。
32. 按照權利要求31所述的方法，其特征在于所述的帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或其衍生物與細胞內的VEGF形成異源二聚體。
33. —種在個體內治療血管生成疾病的方法，包括向該個體施加有效量的帶有細胞滯留信號的 VEGF結合成員或其衍生物，其特征在于所述的帶有細胞滯留信號的VEGF結合成員或 其衍生物與細胞內的VEGF形成異源二聚體，抑制了所述的細胞內的VEGF的分泌從而 抑制了血管生成以及與血管生成有關的疾病。
全文摘要
血管內皮生長因子/血管通透因子(VEGF/VPF)是腫瘤最常表達的血管生成因子中的一個。VEGF對抗劑的發(fā)展成為了一種治療癌癥的重要方法。本發(fā)明涉及抗VEGF策略，其特征是VEGF從腫瘤的分泌被阻止。胎盤生長因子-1(PLGF-1)是VEGF家族成員中缺乏血管生成活性中的一個成員，其在一個同時表達PLGF-1以及VEGF的細胞里傾向于與VEGF形成細胞內異源二聚體。含有人PLGF-1(SEQ ID NO7)或C末端帶有KDEL序列的VEGF的反轉錄病毒載體被構建，上述的KDEL是一個細胞內的內質網滯留信號。以PLGF-1-KDEL反轉錄病毒載體轉導大鼠Lewis肺癌細胞(LLC)幾乎完全停止了腫瘤的生長并誘導腫瘤休眠。與這明顯的抗腫瘤效果相一致地，大多數VEGF分子仍然保持為細胞內的VEGF/PLGF-1異源二聚體，僅僅有非常少量的VEGF同源二聚體被分泌。結果，在PLGF-1-KDEL(SEQ ID NO3)腫瘤里，血管仍然維持在非常低的數目，并缺少分枝和毛細血管網絡。VEGF-KDEL結構的基因傳送進入腫瘤細胞內也產生了明顯的抗腫瘤效果。因此，本發(fā)明提供了組合物和方法用于抑制VEGF從細胞內分泌。
文檔編號A61K31/198GK101426489SQ200580019894
公開日2009年5月6日 申請日期2005年4月18日 優(yōu)先權日2004年4月16日
發(fā)明者曹義海 申請人:曹義海