專利名稱：含有去a肽纖維蛋白的惡性腫瘤抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以含有去A肽纖維蛋白為特征的惡性腫瘤抑制劑。
背景技術(shù)：
近年來，由于外科手術(shù)、放療或化療的應(yīng)用去除原發(fā)癌的成功率得到提高，從而惡性腫瘤的治療取得了穩(wěn)步的進展。但是，即使是完全去除了原發(fā)癌，因癌的轉(zhuǎn)移引發(fā)死亡的情況也并不少見。
特別是黑色素瘤、肺癌、肝癌和胰腺癌等惡性程度高的惡性腫瘤很難在早期發(fā)現(xiàn)，當(dāng)被診斷為惡性腫瘤時，原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌已經(jīng)同時存在，導(dǎo)致無法接受手術(shù)治療的病例很多。對于這些惡性腫瘤，放療的效果也不好。而且，目前的實際情況是臨床上使用的阿霉素等化療制劑幾乎都是通過直接攻擊惡性腫瘤細胞而發(fā)揮藥效，在其攻擊腫瘤細胞的同時也攻擊正常細胞，出現(xiàn)強的副作用，因此成為臨床應(yīng)用中的難題。所以，這幾十年來，沒有突破性的新藥出現(xiàn)。為了打破這一局面，亟待新型的、用于惡性腫瘤的藥品出現(xiàn)。
在這種背景下，最近，很多基礎(chǔ)研究和臨床研究結(jié)果表明，惡性腫瘤與凝血纖溶系統(tǒng)有密切的關(guān)系。例如，已知惡性腫瘤患者由于血漿纖維蛋白原增加、血漿粘度增加以及血液流變學(xué)的異常等凝血纖溶系統(tǒng)的異常引起微循環(huán)障礙。另外，有報道認為由于血漿纖維蛋白原的增加或惡性腫瘤細胞本身分泌纖維蛋白原，惡性腫瘤組織的細胞外基質(zhì)中發(fā)生纖維蛋白原或纖維蛋白沉積，其作為細胞外基質(zhì)的一員對惡性腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移起促進作用(參照例如Cancer Researh602033-2039(2000)，Ann N Y Acad Sci 936406-425(2001)以及Blood963302-3309(2000))。
鑒于上述惡性腫瘤與凝血纖溶系統(tǒng)的關(guān)系，在體外用纖維蛋白處理惡性腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞向肺臟的實驗性轉(zhuǎn)移增強(參照例如Clin Exp Metastasis17723-730(1999))。纖維蛋白(又稱為去AB肽纖維蛋白或纖維蛋白II)是凝血酶作用于纖維蛋白原，使纖維蛋白肽A(fibrinopeptide A，以下稱為FPA)和纖維蛋白肽B(fibrinopeptide B，以下稱為FPB)從纖維蛋白原游離而得到的物質(zhì)(參照例如Nature 275501-505(1978)和Biochemistry 354417-4426(1996))。
另外，鑒于血中纖維蛋白原濃度與惡性腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，有報道認為使用具有降低纖維蛋白原作用的類凝血酶——巴曲酶(Batroxobin)或安克洛酶(Ancrod)可使纖維蛋白原減少，從而抑制惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移(參照例如Eur J Cancer 16919-923(1980)和日本血液學(xué)會雜志44739-743(1981))。巴曲酶是來源于矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)moojeni亞種毒液的絲氨酸蛋白酶類的類凝血酶，僅使FPA從纖維蛋白原游離，產(chǎn)生去A肽纖維蛋白(也稱為纖維蛋白I)的糖蛋白酶(參照例如Thromb Haemost 369-13(1976)和ThrombDiath Haemorrh 45(Suppl)63-68(1971)。
這些文獻公開的技術(shù)是，基于纖維蛋白原作為屏障起保護腫瘤細胞的作用，而不受免疫系統(tǒng)攻擊的推定，認為類凝血酶通過減少纖維蛋白原，從而使免疫系統(tǒng)易于對惡性腫瘤細胞進行攻擊，結(jié)果使惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移得到抑制。
另一方面，已知惡性腫瘤細胞具有伸展(spreading)和游走(migration)的特性。在此，惡性腫瘤細胞的伸展是指腫瘤細胞接受某種信號后，圓形的腫瘤細胞形成偽足的現(xiàn)象，其為腫瘤細胞的一種生物學(xué)行為，是腫瘤增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。
另外，惡性腫瘤細胞的游走是指腫瘤細胞接受某種信號，細胞膜上的細胞粘附分子與配體之間產(chǎn)生不斷的結(jié)合和解離，腫瘤細胞從原來的位置移動的現(xiàn)象，這是作為腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)的生物學(xué)行為。
因此，通過抑制惡性腫瘤細胞的伸展和游走，來抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，由此可抑制惡性腫瘤。
但是，有關(guān)通過該機理有效抑制惡性腫瘤的藥物并沒有報道。
另外，也沒有關(guān)于纖維蛋白原的分解產(chǎn)物去A肽纖維蛋白與惡性腫瘤細胞的伸展和游走的相關(guān)性報道。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種惡性腫瘤抑制劑，作為惡性腫瘤抑制劑其含有新的有效成分。
為了解決上述課題，本發(fā)明人考慮到去A肽纖維蛋白對惡性腫瘤細胞具有與纖維蛋白不同的作用，深入研究了去A肽纖維蛋白對惡性腫瘤細胞的伸展和游走的影響，發(fā)現(xiàn)去A肽纖維蛋白具有抑制惡性腫瘤細胞伸展和游走的作用。本發(fā)明是基于這一發(fā)現(xiàn)完成的。
即，本發(fā)明涉及以含有去A肽纖維蛋白為特征的惡性腫瘤抑制劑。


圖1纖維蛋白原、去A肽纖維蛋白以及纖維蛋白的電泳照片。
圖2將圖1的電泳圖用圖像分析系統(tǒng)定量化的曲線圖。
圖3在用PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纖維蛋白(E)和纖維蛋白(F)處理的孔中培養(yǎng)的黑色素瘤細胞的顯微照片。
圖4在用PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纖維蛋白(E)和纖維蛋白(F)處理的孔中培養(yǎng)的黑色素瘤細胞的伸展率的直方圖。
圖5在用PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纖維蛋白(E)和纖維蛋白(F)處理的孔中培養(yǎng)的乳癌細胞的顯微照片。
圖6在用PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纖維蛋白(E)和纖維蛋白(F)處理的孔中培養(yǎng)的乳癌細胞的伸展率的直方圖。
圖7在用PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纖維蛋白(E)和纖維蛋白(F)處理的孔中培養(yǎng)的纖維肉瘤細胞的顯微照片。
圖8在用PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纖維蛋白(E)和纖維蛋白(F)處理的孔中培養(yǎng)的纖維肉瘤細胞的伸展率的直方圖。
圖9去A肽纖維蛋白對黑色素瘤細胞伸展的影響的曲線圖。
具體實施例方式
以下詳細說明本發(fā)明。
本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑的特征在于含有去A肽纖維蛋白作為有效成分。
去A肽纖維蛋白是使FPA從纖維蛋白原游離后得到的物質(zhì)。
纖維蛋白原是通過二硫鍵(S-S)將下述的2個亞單位(AαBβγ)結(jié)合起來所形成的2倍體糖蛋白(AαBβγ)2。其中每個所述的亞單位包含通過二硫鍵結(jié)合的稱為Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈的3種鏈。因Aα鏈含有610個氨基酸(68kDa)、Bβ鏈含有461個氨基酸(54KDa)、γ鏈含有411個氨基酸(48kDa)，所以纖維蛋白原的分子量為340kDa(參照Thromb Res 831-75(1996)以及Blood Coagulation，F(xiàn)ibrinolysisand Kinin，Aoki A and Iwanaga S(Eds)Chugi Igaku Co.，Tokyo，1979，p59-71)。另外，還已知在Bβ鏈和γ鏈上有糖結(jié)合，而在Aα鏈上沒有(參照Int J Biochem & Cell Biol 31741-746(1999))。
FPA是相當(dāng)于從纖維蛋白原的Aα鏈的NH2末端起的16個氨基酸(NH2-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg)組成的肽。
因此，去A肽纖維蛋白是使FPA從纖維蛋白原游離后得到的剩余部分[(αBβγ)2](參照Thromb Haemost 369-13(1976)和ThrombDiath Haemorrh 45(Suppl)63-68(1971))。FPA的分子量為1,536Da，所以可計算出去A肽纖維蛋白的分子量約為337kDa。
從纖維蛋白原游離FPA可應(yīng)用類凝血酶進行。類凝血酶是絲氨酸蛋白酶的一種，大多來源于蛇毒。作為具體例子，可列舉由矛頭蝮蛇moojeni亞種的毒液中提取純化的巴曲酶(東菱藥品工業(yè)株式會社(日本東京)及其子會社北京托畢西藥業(yè)有限公司(Beijing TobishiPharmaceutical Co.，Ltd.)，中國北京生產(chǎn))、安克洛酶、以及其它來源于蛇毒的類凝血酶(例如Crotalase)等。這些類凝血酶可以是天然產(chǎn)物，也可以是基因重組產(chǎn)品。
使用纖維蛋白原和類凝血酶制備去A肽纖維蛋白可按照例如下述(1)～(6)的方法進行(1)使纖維蛋白原附著于塑料培養(yǎng)器皿、玻璃培養(yǎng)器皿、載玻片、不銹鋼或合成固體物質(zhì)EPTEE人工血管等的表面，并向其添加類凝血酶，從而制備去A肽纖維蛋白的方法；(2)向上述固體物質(zhì)同時添加纖維蛋白原和類凝血酶制備去A肽纖維蛋白的方法；(3)在液體反應(yīng)系統(tǒng)中，在0.1～15N的尿素和/或抗凝肽(Gly-Pro-Arg-Pro-amide，GPRP-NH2(序列號2))存在下，使纖維蛋白原與類凝血酶反應(yīng)，并同時防止去A肽纖維蛋白之間凝集的制備方法(參照Clin Exp Metastasis 17723-730(1999)；(4)將纖維蛋白結(jié)合于柱子，使含有類凝血酶的溶液灌入，從而制備去A肽纖維蛋白的方法；(5)將類凝血酶結(jié)合于柱子，用含有纖維蛋白原的溶液灌流，從而制備去A肽纖維蛋白的方法；(6)將類凝血酶通過靜脈、腹腔內(nèi)、皮下和肌肉注射等給藥方式，作用于體內(nèi)的纖維蛋白原，從而在體內(nèi)制備去A肽纖維蛋白的方法(參照Acta Haematol Jpn 44706-711(1981))。
制備本發(fā)明的去A肽纖維蛋白所用的纖維蛋白原和類凝血酶本身均為公知的物質(zhì)，可從市場上容易地買到或制備。去A肽纖維蛋白本身也是公知的物質(zhì)，可由上述方法制備。
本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑的對象為惡性腫瘤。惡性腫瘤根據(jù)其來源組織可分為上皮性惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤。據(jù)報導(dǎo)上皮性腫瘤占腫瘤總體的約9成。非上皮性惡性腫瘤又可分為來源于間葉組織的惡性腫瘤、來源于神經(jīng)組織的惡性腫瘤和未分化細胞的惡性腫瘤。以下列舉各種惡性腫瘤的具體例子。
上皮性惡性腫瘤腺癌(來源于腺上皮的癌，發(fā)生于胃、腸、胰臟、氣管、肺臟、乳腺、卵巢、子宮、前列腺等身體的各處，推測占人類癌癥的70～80％)、鱗狀上皮癌(來源于復(fù)層鱗狀上皮，例如表皮、唇、舌、咽、食道、肛門、外陰、子宮頸部等上皮組織發(fā)生的癌、分類為非小細胞肺癌的肺鱗狀上皮癌)、基底細胞癌(來源于皮膚和附件的基底細胞)、移行上皮細胞癌(來源于移行上皮、例如膀胱癌)、肝細胞癌(來源于肝實質(zhì)細胞)、腎細胞癌(來源于腎上皮)、膽管癌(來源于膽管)、絨毛癌(來源于胎盤上皮)。
非上皮性惡性腫瘤來源于間葉組織的惡性腫瘤纖維肉瘤(來源于結(jié)締組織和纖維組織)、脂肪肉瘤(來源于結(jié)締組織和脂肪組織)、軟骨肉瘤(來源于結(jié)締組織和軟骨組織)、骨肉瘤(來源于結(jié)締組織和骨組織)、血管肉瘤(來源于血管)、淋巴管肉瘤(來源于淋巴管)、骨髓性白血病(來源于造血細胞)、單核細胞性白血病(來源于造血細胞)、惡性淋巴瘤(來源于淋巴組織)、淋巴性白血病(來源于淋巴組織)、漿細胞瘤(多發(fā)性骨髓瘤)(來源于淋巴組織)、霍奇金(Hodgkin)細胞(來源于淋巴組織)、平滑肌肉瘤(來源于平滑肌)、橫紋肌肉瘤(來源于橫紋肌)。
來源于神經(jīng)組織的惡性腫瘤神經(jīng)母細胞瘤(來源于神經(jīng)母細胞)、髓母細胞瘤(來源于髓母細胞)、惡性星形膠質(zhì)細胞瘤(來源于星形膠質(zhì)細胞)、視網(wǎng)膜母細胞瘤(來源于視網(wǎng)膜母細胞)、膠質(zhì)母細胞瘤(來源于膠質(zhì)母細胞)、惡性神經(jīng)鞘瘤(來源于許旺細胞)、黑色素瘤(來源于神經(jīng)外胚葉)。
未分化細胞的惡性腫瘤惡性畸胎瘤(來源于全能干細胞)、腎母細胞瘤(來源于腎母細胞)、肝母細胞瘤(來源于肝母細胞)、混合腫瘤(來源于多種細胞)。
本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑對這些惡性腫瘤中的上皮性惡性腫瘤，以及作為非上皮性惡性腫瘤的、來源于神經(jīng)組織的惡性腫瘤和來源于間葉組織的惡性腫瘤，特別是黑色素瘤、乳癌和纖維肉瘤可發(fā)揮出色的效果。
本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑通過抑制惡性腫瘤細胞的伸展和游走，來抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，由此抑制惡性腫瘤。
在此，惡性腫瘤細胞的伸展是指腫瘤細胞接受某種信號后，圓形的腫瘤細胞形成偽足的現(xiàn)象，其為腫瘤細胞的一種生物學(xué)行為，是腫瘤細胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。
另外，惡性腫瘤細胞的游走是指腫瘤細胞接受某種信號后，細胞膜上的細胞粘附分子與配體之間產(chǎn)生不斷的結(jié)合和解離，細胞由原來的位置移動的現(xiàn)象，這是作為腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)的生物學(xué)行為。
本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑可以由去A肽纖維蛋白單體構(gòu)成，也可以是與其它活性物質(zhì)組合而成。
作為其它活性物質(zhì)，可列舉氟尿嘧啶等代謝拮抗劑、阿霉素等抗腫瘤抗生素、氮烯咪唑胺等烷化劑、紫杉醇等來源于植物的抗癌劑等。
作為本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑的劑型，可適用于日本藥局方制劑總則中的任何劑型，可列舉例如直接用于體內(nèi)的注射劑(包括混懸劑、乳劑)；軟膏劑(包括油脂性軟膏、乳劑型軟膏(霜)、水溶性軟膏等)、吸入劑、液體制劑(包括滴眼劑、滴鼻劑等)、栓劑、貼劑、糊劑、洗劑等外用劑；或片劑(包括糖衣、薄膜、膠衣)、液體制劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑(包括細粒劑)、丸劑、糖漿劑、含片等內(nèi)服劑等。這些制劑可按照日本藥局方制劑總則等中記載的方法進行制備。
另外，本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑根據(jù)劑型可以含有可藥用的固態(tài)或液態(tài)載體或介入治療材料。作為可藥用的固態(tài)或液態(tài)載體，可列舉溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、助溶解劑、乳化劑、懸濁劑、緩沖劑、等滲劑、著色劑、基質(zhì)、增稠劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、包衣劑、矯味劑等。
作為具體例子，可列舉水、乳糖、白糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖醇等糖．糖醇；結(jié)晶纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧基甲基乙基纖維素、乙酸鄰苯二酸纖維素等纖維素及其相關(guān)衍生物；玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、糊精、預(yù)膠化淀粉、部分預(yù)膠化淀粉、羥丙基淀粉、羧甲基淀粉鈉、環(huán)糊精、支鏈淀粉等淀粉及其相關(guān)衍生物；瓊脂、藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、膠原、蟲膠、黃著膠、黃原膠等天然高分子(海藻類、植物粘質(zhì)、蛋白質(zhì)等)；聚乙烯吡咯烷酮、氨基烷基甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯醇、二甲基聚硅氧烷等合成高分子；橄欖油、可可油、巴西棕櫚蠟、牛油、硬化油、大豆油、芝麻油、山茶油、石蠟、液體石蠟、黃蜂蠟、白色凡士林、椰子油、微晶蠟等油脂類；硬脂酸、硬脂酸鋁、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、檸檬酸三乙酯、三乙酸甘油酯、中鏈脂肪酸三甘油酯、硬脂、肉豆蔻酸異丙酯等脂肪酸及其衍生物；甘油、硬脂醇、鯨蠟醇、丙二醇、聚乙二醇等醇和多元醇；氧化鋅、磷酸氫鈣、沉降碳酸鈣、合成硅酸鋁、硅酸酐、高嶺土、干燥氫氧化鋁凝膠、合成水滑石、氧化鈦、滑石、膨潤土、硅酸鋁鎂、硫酸鋁鉀、次沒食子酸鉍、次水楊酸鉍、乳酸鈣、碳酸氫鈉等無機物質(zhì)和金屬鹽化合物；蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸聚烴氧酯、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、倍半油酸脫水山梨醇酯、三油酸脫水山梨醇酯、單硬脂酸脫水山梨醇酯、單棕櫚酸脫水山梨醇酯、單月桂酸脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯、單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉、聚桂醇等表面活性劑；色素；香料等。
作為介入治療材料，可列舉支架(Stent)、人工血管等。
本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑中的去A肽纖維蛋白含量根據(jù)所采用的劑型而變化，例如，在為內(nèi)服劑的情況下，每1g含0.01～900mg，為注射劑時，每1ml含0.01～500mg，為外用劑的情況下，每1g含0.01～500mg。
本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑的給藥量通常因患者的體重、疾病的性質(zhì)和狀態(tài)而變化，用于成人時，每天以去A肽纖維蛋白量計為0.1～5000mg，最好為100～2500mg。
以下列舉實施例進行具體說明，但本發(fā)明不受這些實施例所限定。
去A肽纖維蛋白的制備和確認用類凝血酶使FPA從纖維蛋白原游離，制備去A肽纖維蛋白。為了進一步確認去A肽纖維蛋白的生成，與纖維蛋白原和纖維蛋白進行了對比研究。
(1)去A肽纖維蛋白的制備在最終濃度為3.0mg/ml的人纖維蛋白原(F-4883，Sigma，MO，USA)的磷酸緩沖液(PBS)溶液中加入類凝血酶巴曲酶(注冊商標(biāo)Tobarpin、中文為東菱迪芙，北京托畢西藥業(yè)有限公司(Beijing TobishiPharmaceutical Co.，Ltd.，)中國北京生產(chǎn))使巴曲酶的最終濃度為0.5BU/ml，然后在37℃下培養(yǎng)1小時，制備去A肽纖維蛋白。
(2)纖維蛋白的制備在最終濃度為3.0mg/ml的人纖維蛋白原(F-4883，Sigma，MO，USA)的PBS溶液中加入人凝血酶(Sigma，MO，USA)的PBS溶液，使凝血酶的最終濃度為0.5U/ml，然后在37℃下培養(yǎng)1小時，制備纖維蛋白。
(3)纖維蛋白原的制備作為無處理對照，使用人纖維蛋白原(F-4883，Sigma，MO，USA)制備最終濃度為3.0mg/ml的纖維蛋白原PBS溶液。
(4)去A肽纖維蛋白生成的確認利用電泳確認通過上述步驟(1)是否生成了去A肽纖維蛋白。具體步驟為，通過下述處理，以纖維蛋白原還原為Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈3種鏈為基準，將去A肽纖維蛋白還原為α鏈、Bβ鏈和γ鏈3種鏈，將纖維蛋白還原為α鏈、β鏈和γ鏈3種鏈后，用電泳來評價。
將步驟(1)得到的去A肽纖維蛋白和步驟(2)得到的纖維蛋白用無菌生理鹽水洗滌3次后，在0.5ml 2％SDS-2％β巰基乙醇-5M尿素液中煮沸5～6分鐘，使二硫鍵斷開，溶解。
對于步驟(3)得到的纖維蛋白原省略上述洗滌工序，其后與上述操作一樣，使二硫鍵斷開，加熱溶解。
在得到的各樣品的150μl溶液中加入50μl電泳緩沖液(4X2％SDS-0.1％溴甲酚蘭)，進行7.5％SDS-PAGE(PAGEL(注冊商標(biāo))，AttoCorp.，Tokyo，Japan)電泳。
結(jié)果如圖1的電泳圖所示。在圖1中，泳道1和泳道4為纖維蛋白原，泳道2為去A肽纖維蛋白，泳道3為纖維蛋白。
在各泳道中，最下面的帶為γ鏈，從下面數(shù)第二條帶為Bβ鏈，從下面數(shù)第三條帶為Aα鏈。
在此，以泳道1和泳道4(纖維蛋白原)為基準來評價泳道2(去A肽纖維蛋白)，泳道2從下面數(shù)第3條帶(Aα鏈)的位置向下方(低分子量側(cè))偏移。這表明，由于類凝血酶巴曲酶的作用FPA被從纖維蛋白原的Aα鏈中游離出來。而其它帶的位置與纖維蛋白原一致。由上可知，在步驟(1)中，F(xiàn)PA從纖維蛋白原游離，生成了去A肽纖維蛋白。
另外，以泳道1和泳道4(纖維蛋白原)為基準評價泳道3(纖維蛋白)，泳道3從下面數(shù)第2條帶(Bβ鏈)和第3條帶(Aα鏈)的位置均向下方(低分子量側(cè))偏移。這表明，由于凝血酶的作用FPA和FPB分別被從纖維蛋白原的Aα鏈和Bβ鏈中游離出來。由上可知，在步驟(2)中生成了纖維蛋白。
這些結(jié)果與已知數(shù)據(jù)一致(參照Acta Haematol Jpn 44706-711(1981))。
再者，將上述電泳圖用圖像分析系統(tǒng)(Furi Science & TechnologyCo.，Ltd.，Shanghai，China)進行定量化，以曲線表示(圖2)。
圖2中的3個峰中，左側(cè)的峰表示Aα鏈的帶密度，中間的峰表示Bβ鏈的帶密度，右側(cè)的鏈表示γ鏈的帶密度。
對左側(cè)的峰(Aα鏈)進行評價的話，去A肽纖維蛋白和纖維蛋白的峰一致，而且與纖維蛋白原的峰相比，向低分子量側(cè)偏移。這表明，去A肽纖維蛋白和纖維蛋白中的FPA被從纖維蛋白原的Aα鏈中游離出來。
對中間的峰(Bβ鏈)進行評價的話，纖維蛋白原和去A肽纖維蛋白原的峰一致，只是纖維蛋白的峰向低分子量側(cè)偏移。這表明只有纖維蛋白中的FPB被從纖維蛋白原的Bβ鏈中游離出來。
由上可知，巴曲酶作用于纖維蛋白原((AαBβγ)2)生成的物質(zhì)為去A肽纖維蛋白((αBβγ)2、凝血酶作用于纖維蛋白原生成的物質(zhì)為纖維蛋白((αβγ)2)。
去A肽纖維蛋白對惡性腫瘤細胞伸展的影響用Matrigel(注冊商標(biāo))(BD Biosciences，NJ，USA)制備模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)的環(huán)境，用3種惡性腫瘤(黑色素瘤、乳癌和纖維肉瘤)細胞評價在該環(huán)境下去A肽纖維蛋白對惡性腫瘤細胞伸展的影響。
(1)所使用的惡性腫瘤細胞將作為黑色素瘤細胞代表的B16-BL6小鼠惡性黑色素瘤細胞(Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，China)在含有10％胎牛血清(FBS，HyClone，Utah，USA)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，MD，USA)中進行傳代培養(yǎng)，用于本實驗。
將作為乳癌細胞代表的MMT060562小鼠乳癌細胞(ATCC，VA，USA)在含有10％FBS和1％非必需氨基酸(Non-Essential Amino AcidsSolution，Gibco，MD，USA)的MEM培養(yǎng)基(Gibco，MD，USA)中進行傳代培養(yǎng)，用于本實驗。
將作為纖維肉瘤細胞代表的HT-1080人纖維肉瘤細胞(Academy ofChinese Medical Sciences，Beijing，China)在含有10％FBS的MEM培養(yǎng)基(Gibco，MD，USA)中進行傳代培養(yǎng)，用于本實驗。
(2)細胞伸展的測定方法向8孔細胞培養(yǎng)板(Nunc，IL，USA)的各孔中加入0.25ml Matrigel(注冊商標(biāo))7.5μg/ml(BD Biosciences，NJ，USA)，在室溫下培養(yǎng)1小時，將培養(yǎng)板用Matrigel包被。接著向經(jīng)Matrigel包被的各孔中添加下述A～F溶液(各0.25ml)，進行處理。
A添加磷酸緩沖液(PBS)(溶劑對照)B添加纖維蛋白原(3mg/ml)C添加巴曲酶(0.5BU/ml)D添加凝血酶(0.5U/ml)E添加去A肽纖維蛋白(3mg/ml纖維蛋白和0.5BU/ml巴曲酶)。
F添加纖維蛋白(3mg/ml纖維蛋白和0.5U/ml凝血酶)以上處理使用的溶液均為PBS。
(在此，BU(巴曲酶單位)是表示巴曲酶的酶活性量的單位，在37℃的溫度下，向0.3ml檸檬酸鈉抗凝的標(biāo)準人血漿中添加0.1ml巴曲酶溶液時，在19.0±0.2秒使其凝固的活性量規(guī)定為2BU)。
在A～D的處理中，根據(jù)所示最終濃度向孔中添加所示各成分，在室溫下培養(yǎng)1小時，然后棄去液體，用PBS洗滌。
在E～F的處理中，根據(jù)所示最終濃度向孔中添加所示各成分，反應(yīng)60秒，在生成物(處理E去A肽纖維蛋白，處理F纖維蛋白)還未凝固時棄去液體。然后，在室溫下培養(yǎng)1小時，之后棄去液體，用PBS洗滌。在E的處理中通過使巴曲酶作用于纖維蛋白原生成去A肽纖維蛋白，在F的處理中，通過使凝血酶作用于纖維蛋白原生成纖維蛋白。
向各個經(jīng)處理的孔中注入懸浮于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中的5600個B16-BL6黑色素瘤細胞，將培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。然后，用相差顯微鏡對附著在處理后的孔上的約150個細胞中的伸展細胞(有偽足的細胞)進行計數(shù)，按照以下計算式計算伸展細胞數(shù)的比例。
伸展率(％)＝(伸展細胞數(shù)/附著細胞數(shù))×100用懸浮于無血清MEM+1％非必需氨基酸培養(yǎng)基中的5600個MMT060562乳癌細胞和懸浮于無血清MEM培養(yǎng)基中的5600個HT-1080纖維肉瘤細胞代替懸浮于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中的5600個B16-BL6黑色素瘤細胞，進行同樣的步驟。
(3)黑色素瘤細胞的伸展抑制圖3為在各個經(jīng)處理的孔中培養(yǎng)2小時后的黑色素瘤細胞的顯微照片(×45倍)。圖4為在各個經(jīng)處理的孔中培養(yǎng)的黑色素瘤細胞的伸展率直方圖。
在PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)和纖維蛋白(F)存在下，大部分黑色素瘤細胞長出偽足而伸展(圖3)，伸展率均超過80％(圖4)。
另一方面，在去A肽纖維蛋白(E)存在下，黑色素瘤細胞的大部分為圓形狀態(tài)，即使有偽足，也較短(圖3)，伸展率為12.53±6.69％(圖4)。
因此，與其它成分比較，去A肽纖維蛋白顯著抑制了Matrigel存在下的黑色素瘤細胞的伸展(圖4，P＜0.01)。
由上可知，去A肽纖維蛋白能有效抑制黑色素瘤細胞的伸展。
(4)乳癌細胞的伸展抑制圖5為在各個經(jīng)處理的孔中培養(yǎng)2小時后的乳癌細胞的顯微照片(×45倍)。圖6為在各個經(jīng)處理的孔中培養(yǎng)的乳癌細胞的伸展率直方圖。
在PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)和纖維蛋白(F)存在下，大部分乳癌細胞長出偽足而伸展(圖5)，伸展率均超過60％(圖6)。
另一方面，在去A肽纖維蛋白(E)存在下，乳癌細胞的大部分為圓形狀態(tài)，即使有偽足，也較短(圖5)，伸展率為8.87±3.06％(圖6)。
因此，與其它成分比較，去A肽纖維蛋白顯著抑制了Matrigel存在下的乳癌細胞的伸展(圖6，P＜0.01)。
由上可知，去A肽纖維蛋白能有效抑制乳癌細胞的伸展。
(5)纖維肉瘤細胞的伸展抑制圖7為在各個經(jīng)處理的孔中培養(yǎng)2小時的纖維肉瘤細胞的顯微照片(×45倍)。圖8為在各個經(jīng)處理的孔中培養(yǎng)的纖維肉瘤細胞的伸展率直方圖。
在PBS(A)、纖維蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)和纖維蛋白(F)存在下，大部分纖維肉瘤細胞長出偽足而伸展(圖7)，伸展率均超過70％(圖8)。
另一方面，在去A肽纖維蛋白(E)存在下，纖維肉瘤細胞的大部分為圓形狀態(tài)，即使有偽足，也較短(圖7)，伸展率為34.19±6.55％(圖8)。
因此，與其它成分比較，去A肽纖維蛋白顯著抑制了Matrigel存在下的纖維肉瘤細胞的伸展(圖7，P＜0.01)。
由上可知，去A肽纖維蛋白能有效抑制纖維肉瘤細胞的伸展。
不同劑量去A肽纖維蛋白對惡性腫瘤細胞伸展的影響一般認為，由巴曲酶作用于纖維蛋白原得到的去A肽纖維蛋白生成量隨著纖維蛋白原量的增加和纖維蛋白原與巴曲酶反應(yīng)時間的延長而增加。因此，用相同濃度的巴曲酶(0.5BU/ml)與不同濃度的纖維蛋白原(0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/ml和15mg/ml)分別反應(yīng)30秒、60秒、90秒，制備各種劑量的去A肽纖維蛋白，評價它們對惡性腫瘤細胞伸展的影響。實驗方法中除了所使用的纖維蛋白原的量和反應(yīng)時間外，其它的處理與實施例2的(2)細胞伸展測定法的E處理相同。結(jié)果如圖9所示。
反應(yīng)時間為30秒(□)的情況下，即使增加纖維蛋白原的濃度也對伸展率減少沒有影響，伸展率僅減少至76.23％。這被認為是在30秒的反應(yīng)時間內(nèi)沒有生成足以對伸展產(chǎn)生影響劑量的去A肽纖維蛋白的緣故。
反應(yīng)時間為60(○)和90秒(△)的情況下，纖維蛋白原濃度達到3mg/ml時伸展率大幅減少(60秒12.53％；90秒9.13％)。如果進一步增加纖維蛋白原的濃度，則幾乎觀察不到伸展細胞。這表明隨著去A肽纖維蛋白生成量的增加，惡性腫瘤細胞的伸展被強烈地抑制。
另一方面，如果纖維蛋白原的濃度超過9mg/ml，反而伸展率增高，在濃度為15mg/ml時觀察不到對伸展率抑制的效果。這被認為是在高濃度的纖維蛋白原存在下，在生成的去A肽纖維蛋白將孔包被之前，大量的纖維蛋白原先覆蓋在孔上(沒有包被孔的去A肽纖維蛋白在洗滌步驟中被洗去)，是纖維蛋白原自身的作用表現(xiàn)出來的緣故。
如上所述，可知去A肽纖維蛋白對黑色素瘤細胞的伸展抑制作用具有量效關(guān)系。
去A肽纖維蛋白對惡性腫瘤細胞游走的影響惡性腫瘤細胞的游走這一生物學(xué)行為是腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。惡性程度高的惡性腫瘤游走能力也高。因此，在本實施例中，用“劃痕試驗(scratch wound assay)”(參照Gynecol Oncol 8960-72(2003))，評價去A肽纖維蛋白對2種惡性腫瘤(黑色素瘤和乳癌)細胞游走的影響。
(1)所使用的惡性腫瘤細胞將作為黑色素瘤細胞代表的B16-BL6小鼠惡性黑色素瘤細胞(Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，China)在含有10％胎牛血清(FBS，HyClone，Utah，USA)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，MD，USA)中進行傳代培養(yǎng)，用于本實驗。
將作為乳癌細胞代表的MMT060562小鼠乳癌細胞(ATCC，VA，USA)在含有10％FBS和1％非必需氨基酸(Non-EssentialAmino Acids Solution，Gibco，MD，USA)的MEM培養(yǎng)基(Gibco，MD，USA)中進行傳代培養(yǎng)，用于本實驗。
(2)細胞游走的測定方法在6孔板的孔(Corning，NY，USA)中鋪上蓋玻片，接入2ml懸浮于含有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中的2.5×104個B16-BL6黑色素瘤細胞，或者2ml懸浮于含有10％FBS的MEM培養(yǎng)基中的2.5×104個MMT060562乳癌細胞，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
培養(yǎng)后，用塑料細胞刮棒在細胞增殖中的蓋玻片上劃出寬0.5mm的劃痕，除去本來生長在劃痕處的細胞，并用PBS洗滌留下的細胞斷片。
向黑色素瘤細胞培養(yǎng)孔中分別加入用2ml含有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的0.05mg/ml纖維蛋白原，或去A肽纖維蛋白(通過添加0.05mg/ml纖維蛋白原和2BU/ml巴曲酶生成的)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。
向乳癌細胞培養(yǎng)孔中分別加入用2ml 10％FBS MEM培養(yǎng)基稀釋的0.05mg/ml纖維蛋白原，或去A肽纖維蛋白(通過添加0.05mg/ml纖維蛋白原和2BU/ml巴曲酶生成的)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。
培養(yǎng)后，進行瑞氏染色，用相差顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)計數(shù)游走至劃痕上的細胞數(shù)，以每平方毫米蓋玻片的游走細胞數(shù)(細胞數(shù)/mm2)的形式表示。
要說明的是，將纖維蛋白原處理作為去A肽纖維蛋白處理的對照是由于生體內(nèi)存在惡性腫瘤時，在惡性腫瘤細胞的周圍存在纖維蛋白原的緣故。
(3)黑色素瘤細胞的游走抑制結(jié)果如表1所示。
表1.黑色素瘤細胞的游走

**P＜0.01與纖維蛋白原的比較去A肽纖維蛋白處理時的游走細胞數(shù)(14±4個/mm2)比纖維蛋白原處理時的游走細胞數(shù)(87±14個/mm2)顯著少(P＜0.01)。
由上可知，去A肽纖維蛋白能有效抑制黑色素瘤細胞的游走。
(4)乳癌細胞的游走抑制結(jié)果如表2所示。
表2.乳癌細胞的游走

**P＜0.01與纖維蛋白原的比較去A肽纖維蛋白處理時的游走細胞數(shù)(12±3個/mm2)比纖維蛋白原處理時的游走細胞數(shù)(29±10個/mm2)顯著少(P＜0.01)。
由上可知，去A肽纖維蛋白能有效抑制乳癌細胞的游走。
產(chǎn)業(yè)實用性如上述實施例所示，本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑可抑制惡性腫瘤細胞的伸展和游走。因此，本發(fā)明能用于有效地抑制惡性腫瘤。
權(quán)利要求
1.惡性腫瘤抑制劑，其特征在于所述抑制劑含有去A肽纖維蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤抑制劑，其中，所述的去A肽纖維蛋白是由類凝血酶作用于纖維蛋白原而得到的物質(zhì)。
3.權(quán)利要求2所述的惡性腫瘤抑制劑，其中，所述的類凝血酶是巴曲酶。
4.權(quán)利要求1～3中任意一項所述的惡性腫瘤抑制劑，其中，所述的惡性腫瘤細胞為上皮性惡性腫瘤細胞。
5.權(quán)利要求1～3中任意一項所述的惡性腫瘤抑制劑，其中，所述的惡性腫瘤細胞是非上皮性惡性腫瘤細胞。
6.權(quán)利要求1～3中任意一項所述的惡性腫瘤抑制劑，其中，所述的惡性腫瘤細胞是來源于神經(jīng)組織的惡性腫瘤細胞或來源于間葉組織的惡性腫瘤細胞。
7.權(quán)利要求1～3中任意一項所述的惡性腫瘤抑制劑，其中，所述的惡性腫瘤細胞是黑色素瘤細胞、乳癌細胞或纖維肉瘤細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含有去A肽纖維蛋白的惡性腫瘤抑制劑，它通過抑制惡性腫瘤細胞的伸展和游走，從而能抑制惡性腫瘤。
文檔編號A61K35/00GK1972706SQ20058002097
公開日2007年5月30日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日
發(fā)明者千賀博文, 李彩霞, 萬永玲, 常立水 申請人:東菱藥品工業(yè)株式會社