專利名稱：免疫抑制外體的制作方法
描述1.介紹本發(fā)明涉及用于介導免疫抑制反應的方法和組合物。本發(fā)明的組合物包含具有免疫抑制活性的外體。這種外體可衍生自各種不同細胞類型，其中包括抗原呈遞細胞，如樹突細胞和巨噬細胞。分離外體之前可通過基因工程改造細胞以使其表達能夠增強所述外體免疫抑制活性的分子，和/或使細胞接觸一種或多種試劑，如細胞因子或細胞因子抑制劑，這樣也能夠增強外體的免疫抑制活性。本發(fā)明還涉及這種外體在治療與免疫系統(tǒng)不希望的活化有關的疾病和病癥中的應用。本發(fā)明還包括直接分離已顯示被免疫抑制的血清的外體。
2.發(fā)明背景自身免疫疾病的特征是對抗自身抗原的耐受性喪失、抗“自身”抗原(自身抗原)的淋巴細胞反應激活和靶器官的病理損傷。自身免疫疾病包括類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、變態(tài)反應、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、1型糖尿病、炎性疾病、哮喘等。多數(shù)情況下，可通過外周耐受預防自身免疫，外周耐受是一種可能涉及抗原呈遞細胞(APC)尤其是樹突細胞(DC)和效應T細胞之間一系列多步相互作用的過程。
例如，類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種以末端動關節(jié)的慢性炎癥為特征的使人虛弱的全身性自身免疫疾病。一旦發(fā)生RA，受影響的關節(jié)將出現(xiàn)炎性細胞浸潤和滑膜增生，這會造成軟骨和骨的進行性降解，導致完全喪失正常關節(jié)功能。最近，調(diào)節(jié)TNF-α和IL-1β促炎癥活性的生物劑已顯示可作為新的有效的抗關節(jié)炎藥(Evans和Robbins，J.Rheumatol.21779-782(1994)；Robbins和Evans，Gene Ther.3187-189(1996)；Evans和Robbins，Curr Opin Rheumatol.8230-234(1996)；Evans等，Arthritis Rheum.421-16(1999)；Ghivizzani等，Clin Orthop.379(Suppl)S288-299(2000))。
此外，各種治療劑的基因轉(zhuǎn)移已顯示在關節(jié)炎的動物模型中有效。具體地說，關節(jié)內(nèi)局部注射和全身注射表達各種治療劑如sTNF-α受體、IL-1Ra、I型和II型sIL-1受體、IL-10、vIL-10和IL-4的腺病毒載體在患關節(jié)炎的小鼠、大鼠和兔模型中有顯著的抗關節(jié)炎作用(Arend，Lancet.341155-156(1993)；Bandara等，Proc NatlAcadSci U S A.9010764-10768(1993)；Ghivizzani等，Proc Natl Acad Sci U S A.954613-4618(1998)；Mori等，J.Immunol.1573178-3182(1996)；Joosten等，ArthritisRheum.39797-809(1996)；Kim等，Arthritis Res.2293-302；Kim等，J.Immunol.1641576-1581(2000))。
有趣的是，通過基因轉(zhuǎn)移局部遞送這些治療劑到一個關節(jié)或爪在對側(cè)膝蓋或未處理的爪中產(chǎn)生治療效果。例如，關節(jié)內(nèi)注射表達vIL-10-EB病毒編碼的IL-10基因—的腺病毒載體不僅在注射過的膝蓋而且在對側(cè)的對照膝蓋內(nèi)導致疾病病狀減輕、減少白血細胞浸潤和促進軟骨代謝(Lechman等，J.Immunol.1632202-2208(1999))。由于這種效應最初是在兔膝蓋關節(jié)炎模型中觀察到的，因此被稱為“對側(cè)效應”。在兔、大鼠和小鼠關節(jié)內(nèi)注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、脂質(zhì)體、甚至基因修飾的滑膜成纖維細胞也觀察到了類似的效應(Ghivizzani等，Gene Ther.4977-982(1997)；Ceponis等，Arthritis Rheum.441908-1916(2001)；Kim等，MoI Ther.6591-600(2002))。
最近對這種效應的分析提示，修飾抗原呈遞細胞(APC)如巨噬細胞和樹突細胞(DC)的功能在對遠端關節(jié)產(chǎn)生抗原特異性效應中起重要作用(Whalen等，MoI Ther.4543-550(2001)；Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001))。具體地說，培養(yǎng)時基因修飾的骨髓衍生的DC在鼠模型中是逆轉(zhuǎn)已有關節(jié)炎的有效藥劑這一事實進一步證實了DC的治療作用。例如，將IL-4或FasL基因轉(zhuǎn)移到DC然后注射入患有關節(jié)炎的小鼠能明顯消退關節(jié)炎，一半以上的治療小鼠至少在治療后的兩個月無病(Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001)；Kim等，MoI Ther.6584-590(2002)；Morita等，J.Clin Invest.1071275-84)。
樹突細胞是專職APC，它在控制免疫應答中扮演關鍵作用，并可通過各種機制增強或減弱自身免疫應答。經(jīng)基因工程改造以表達免疫抑制分子的DC被認為是減輕外源移植排斥和自身免疫疾病的有吸引力的方法(Lu等，1999，J.Leukoc.Biol.66293-296)。例如，通過重組腺病毒(Ad)載體將細胞毒T淋巴細胞抗原4-免疫球蛋白(CTLA4Ig)運送入DC已顯示可提高這些DC在同種異體受體內(nèi)的致耐原性(tolerogenicity)和存活(Lu等，1999，Gene Ther.6554-563)。
然而，這種方法也有一些潛在的問題。例如，盡管給予不成熟的低反應性DC能提高在宿主內(nèi)的致耐原性，但通過病毒基載體轉(zhuǎn)導DC可能會刺激其成熟，導致免疫刺激能力增強(Rea等，1999，J.Virol.7310245-10253)。因此，盡管它們具有減緩疾病發(fā)作的潛在療效，給予完整的樹突細胞還可能有不需要的后果。
30多年前就已經(jīng)證實包括DC在內(nèi)的各種細胞類型能釋放稱為外體(exosome)的小脂質(zhì)泡。外體是大小為30-100nM的小顆粒，它最初被描述為衍生自晚期內(nèi)體區(qū)室并釋放自腫瘤細胞系(Culvenor等，J.Cell Biochem.20127-138(1982))和網(wǎng)狀細胞(Johnstone等，J.Biol.Chem.2629412-9420(1987))的含有5’核苷酶活性和運鐵蛋白受體的小顆粒。外體通過向內(nèi)或向外出芽產(chǎn)生，這導致顆粒含有胞質(zhì)溶膠和某些膜相關蛋白的暴露的胞外結(jié)構(gòu)域(Stoorvogel等，Traffic 3321-330(2002))。外體已顯示不同于凋亡小體和似乎由質(zhì)膜脫落產(chǎn)生的較大微泡。已知許多細胞類型能產(chǎn)生外體，其中包括樹突細胞、網(wǎng)狀細胞、T淋巴細胞、B細胞、血小板、上皮細胞和腫瘤細胞(Johnstone等，Blood.741844-1851(1989)；Peters等，Eur J.Immunol.191469-1475(1989)；Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996)；Heijnen等，Blood943791-3799(1999)；Theiry等，J.Cell.Biol.147599-610(1999)；Wolfers等，NatureMed.7297-303(2001)；van Niel和Heyman，Am J.Physiol Gastrointest Liver Physiol.283G251-255(2002))。高度純化的DC-衍生外體已顯示含有某些胞質(zhì)蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白和某些肌動蛋白結(jié)合蛋白，以及I類和II類MHC抗原、CD86、ICAM-1、lamp-2、αM-β2整聯(lián)蛋白、四穿膜區(qū)蛋白CD9和CD63和MFGE8/乳黏著蛋白(Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996)；Theiry等，J.Cell.Biol.147599-610(1999)；Escola等，J.Biol Chem.27320121-20127(1998)；Thery等，J.Immunol.1667309-7318(2001))。
還顯示衍生自用腫瘤抗原肽脈沖的DC的外體能和DC一樣有效刺激小鼠內(nèi)的抗腫瘤反應，其中，外體在其表面暴露腫瘤抗原(Zitvogel等，Nature Med.4594-600(1998))。采用衍生自腫瘤抗原肽-脈沖的DC的外體進行的臨床試驗首先報道了積極的結(jié)果(Andre等，Adv Exp Med Biol.495349-354(2001)；Morse等，Proc.Am.Soc.Oncol.21 A42，p.11a(2002))。外體似乎具有免疫刺激能力并能夠敏化抗原呈遞細胞(Zitvogel等，US20040028692)。
還顯示外體具有某些免疫抑制活性。某些T細胞以及黑色素瘤細胞產(chǎn)生表面含有FasL并能夠刺激T細胞凋亡、允許腫瘤生長的外體(Andreola等，J.Exp Med.1951303-1316(2002)；Martinez-Lorenzo等，J.Immunol.1631274-1281(1999))。此外，由在存在INF-γ和消化的卵清蛋白時培養(yǎng)的大鼠腸上皮細胞產(chǎn)生的被稱為耐體(tolerosome)的外體顆粒在注射后能誘導抗原特異性耐性(Karlsson等，Eur.J.Immunol.312892-2900(2001))。
Peche等報告，使用同種異體供體衍生的外體延長了大鼠的移植存活(Peche等，Transplantation 761503-1510(2003))。然而，作者還顯示了抗-供體II類MHC同種異體抗體產(chǎn)生相應的增加，說明了同時發(fā)生的免疫刺激效應。
因此仍舊需要開發(fā)治療自身免疫疾病和炎性疾病的安全有效的方法。本發(fā)明提供了治療此類疾病和病癥的組合物和方法。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有免疫抑制活性的外體以及制造和利用所述外體的方法。明確地說，可給予哺乳類宿主本發(fā)明的外體以抑制不需要的免疫應答。
本發(fā)明的外體可衍生自多種不同T細胞，包括但不限于抗原呈遞細胞如樹突細胞和巨噬細胞。用來制備外體的細胞宜在收獲外體之前經(jīng)基因工程改造和/或用例如但不限于細胞因子或細胞因子抑制劑的試劑處理。
在各實施方案中，本發(fā)明提供了外體組合物以及它們用作免疫抑制劑的方法?？捎帽景l(fā)明治療的疾病和病癥包括但不限于炎癥；與炎癥有關的癥狀，如變態(tài)反應、哮喘、關節(jié)炎和傷口愈合；和自身免疫疾病，包括但不限于類風濕性關節(jié)炎和糖尿病。此外，就外體的免疫抑制活性而言，本發(fā)明提供了通過拮抗外體以增強免疫應答的方法，例如用來增強對象的抗腫瘤免疫力。
4.附圖簡述

圖1A-C。(A)來自鼠科BM-DC的外體的整體透射電子顯微術(shù)(TEM)。標尺(bar)＝200nm。(B)為了解一些外體-相關蛋白的存在而進行的外體和BMDC裂解液的Western印跡分析。(C)為了解MHCI和II、CD11c、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)的表達而進行的鼠科DC-衍生外體和DC的流式細胞分析。
圖2。骨髓樹突細胞(“BMDC”)衍生的外體的熒光激活細胞分選(“FACS”)特征。
圖3A-D。在脾中體內(nèi)(IV)注射PKH67標記的外體、(A)MOMA-1+(B)ER-TR9+巨噬細胞和(C)CD11c+DC6小時后，DC-衍生外體的體內(nèi)通行顯示已使外體內(nèi)在化。(D)經(jīng)不同時間點上CD8-α和PKH67的FACS評估，用脾DC亞類使標記的外體內(nèi)在化。
圖4A-C。(A)小鼠骨髓DC和DC-衍生外體的流式細胞分析，其中，純化的外體來自用Ad.對照和Ad.FasL轉(zhuǎn)導的骨髓DC。(B)顯示FasL的表達的DC-衍生外體和DC的Western印跡。(C)DC-衍生外體組分的透射電鏡圖。
圖5。證明用帶有FasL的外體和DC處理的小鼠足墊內(nèi)遲發(fā)型超敏反應(DTH)的抑制的柱狀圖?！?”表示p＜0.01有顯著性。
圖6。證明采用同系外體和DC與同種異體外體和DC相比的小鼠足墊內(nèi)DTH的抑制的柱狀圖?！?”表示p＜0.01有顯著性。
圖7A-B。(A)證明在野生型和MHC I缺陷型小鼠內(nèi)注射外體和被Ad.Ψ5或Ad.FasL感染的DC后小鼠足墊內(nèi)DTH應答的柱狀圖。“*”表示p＜0.01有顯著性。(B)證明在野生型或MHC II缺陷型小鼠內(nèi)注射外體和被Ad.Ψ5或Ad.FasL感染的DC后小鼠足墊內(nèi)DTH應答的柱狀圖?！?”表示p＜0.01有顯著性。
圖8。證明免疫抑制外體的抗原特異性的柱狀圖?！?”表示p＜0.01有顯著性。
圖9A-B。(A)比較DC和DC-衍生外體的DTH-抑制效應的柱狀圖，所述外體制備自野生型或gld(FasL-/-)小鼠并用對照腺病毒(psi5)或表達FasL的腺病毒(FasL)感染，然后注射回在將KLH注射入足墊之前12小時已經(jīng)用KLH免疫的野生型小鼠的足墊。(B)描述外體DTH抑制效應的柱狀圖，所述外體如(A)中制備并注射回lpr(Fas-/-)小鼠與野生型小鼠相比。
圖10A-B。(A)證明將表達FasL的DC注射入膠原誘導的關節(jié)炎的鼠科模型能抑制疾病進展的圖。“*”表示p＜0.01有顯著性。(B)證明將呈遞FasL的外體注射入膠原誘導的關節(jié)炎的鼠科模型能抑制疾病進展的圖?！?”表示p＜0.01有顯著性。
圖11A-B。(A)證明在混合淋巴細胞反應(MLR)中加入表達vIL-10的DC能抑制T細胞增殖的圖。(B)證明在混合淋巴細胞反應中加入分離自用Ad.vIL-10感染的DC的外體能抑制T細胞增殖的圖。
圖12A-B。(A)顯示用Ad.vIL-10-轉(zhuǎn)導的DC和衍生自DC/vIL-10的外體能抑制小鼠足墊的DTH應答的柱狀圖。(B)顯示用重組鼠科IL-10處理的BMDC和衍生自用重組鼠科IL-10處理的DC的外體能抑制小鼠足墊的DTH應答的柱狀圖?！?”表示p＜0.01有顯著性。
圖13A-C。(A)來自用Ad-vIL-10轉(zhuǎn)導的BM-DC的未處理或凍/融外體的整體透射電鏡圖。(B)來自Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導的BM-DC的未處理或凍/融外體制品的Western印跡，檢測到Hsc70的存在。(C)證明分離自用Ad.vIL-10感染的DC的膜破裂外體不能抑制DTH應答的柱狀圖。
圖14A-B。(A)證明分離自用Ad.vIL-10感染的DC的MHC II-耗竭外體的免疫抑制效應的柱狀圖?！?”表示p＜0.01有顯著性。(B)證明分離自用重組IL-10處理的DC的MHC II-耗竭外體的免疫抑制效應的柱狀圖?！?”表示p＜0.01有顯著性。
圖15。證明注射入膠原-誘導的關節(jié)炎小鼠模型的表達vIL-10的DC抑制疾病進展的圖。
圖16A-C。衍生自DC/IL-10的外體在建立的膠原-誘導的關節(jié)炎模型中的療效的分析。(A)外體分離自用Ad.vIL-10感染或用重組小鼠IL-10脈沖的DBA1小鼠骨髓DC，并給予具有建立的CIA的小鼠。(B)來自重組IL-10-脈沖的DC的外體被分成兩組，其中一組先經(jīng)過三輪凍融以破裂膜，再給予具有建立的CIA的小鼠。(C)在建立的CIA小鼠中測試來自DC/rmIL-10的外體，與直接注射重組小鼠IL-10進行比較。在A-C中，純化的外體在第32天(用箭頭表示)靜脈注射入在第28天用牛II型膠原免疫并給予LPS的DBA1小鼠。用建立的肉眼評分系統(tǒng)周期性監(jiān)測小鼠，該系統(tǒng)表示為所有爪的累加值，且最大可能記分為16。
圖17。鼠科DTH模型中足墊腫脹的增加，其中，處理的足墊被注射DC/mbmIL-4、制備自DC/mbmIL-4的外體、DC/Psi5(對照)、制備自DC/Psi5的外體(對照)或鹽水(對照)。
圖18。鼠科DTH模型中足墊腫脹的增加，其中，處理的足墊被注射DC/smIL-4、制備自DC/smIL-4的外體、DC/Psi5(對照)、制備自DC/Psi5的外體(對照)或鹽水(對照)。
圖19。鼠科DTH模型中足墊腫脹的增加，其中，處理的足墊被注射DC/mbmIL-4、制備自DC/mbmIL-4的外體、DC/FasL、制備自DC/FasL的外體、DC/Psi5(對照)或制備自DC/Psi5的外體(對照)。
圖20。野生型或lpr(Fas-/-)小鼠的鼠科DTH模型中爪腫脹的增加，小鼠被注射制備自DC的外體，所述DC收獲自野生型或gld(FasL-/-)小鼠并經(jīng)修飾以表達可溶性(smIL-4)或膜結(jié)合(mbmIL-4)IL-4。
圖21A-B。注射制備自來自(A)同系或(B)同種異體小鼠的膜結(jié)合IL-4增強的DC的外體后，鼠科DTH模型爪腫脹的增加。
圖22。顯示鼠科DTH模型中爪腫脹增加的柱狀圖，其中，野生型或B7.1和B7.2缺陷型(KO)小鼠的處理的爪(黑色柱)被注射制備自DC的外體，所述DC用含IL-4基因的腺病毒載體或Ad.Psi5處理過。未處理的爪的大小用空心柱表示。
圖23。描述CIA模型小鼠關節(jié)炎指數(shù)的圖，小鼠用制備自用Ad.psi＝5(對照)、Ad.mIL-4或Ad.mbmIL-4感染的DC的外體處理。
圖24A-B。(A)主要用DC/IL-4-衍生的外體處理的小鼠，或(B)給予來自原始對象(primary subject)的CD11C的小鼠內(nèi)的DTH應答。
圖25。顯示用鹽水、來自未處理DC的外體或制備自DC/IL-4的外體處理的小鼠內(nèi)高血糖發(fā)生的圖。
圖26。顯示給予DTH小鼠模型未處理全血清和用珠處理的全血清后48小時足墊腫脹的柱狀圖。
圖27。顯示采用血清、微泡和來自KLH免疫小鼠的外體的小鼠足墊內(nèi)DTH抑制的柱狀圖。
圖28。顯示采用各種血清組分的小鼠足墊內(nèi)DTH抑制的柱狀圖，其中，在加強免疫48小時后測量腫脹。
圖29。顯示采用各種血清組分的小鼠足墊內(nèi)DTH抑制的柱狀圖，其中，血清分離自KLH和OVA免疫的小鼠，在加強免疫48小時后測量腫脹。
圖30。分離自小鼠血清的外體的電子顯微照片。
圖31。用攜帶抗-II類MHC的珠標記的血清-衍生外體的FACS分析。
圖32。顯示鼠科DTH模型中爪腫脹增加的柱狀圖(其中，DTH抗KLH)，其中，處理的爪被注射(a)收集自KLH-免疫小鼠血清的外體(組I)，(b)收集自幼稚小鼠血清的外體(組II)，或(c)鹽水(組III)。處理的爪用黑色柱表示，對側(cè)爪用空心柱表示。
圖33。顯示鼠科DTH模型中爪腫脹增加的柱狀圖(其中，DTH抗KLH)，其中，處理的爪被注射(a)收集自KLH-免疫小鼠血清的外體(組I)，(b)收集自KLH-免疫小鼠的血清并用抗-MHCII抗體預吸附的外體；(c)收集自KLH-免疫小鼠血清的II類MHC陽性外體；(d)用抗-IgG抗體預吸附的外體耗竭對照；或(e)鹽水。
圖34。顯示鼠科DTH模型中爪腫脹增加的柱狀圖，其中，(a)來自FasL缺陷型gld(FasL-/-)小鼠的血清-衍生的外體被給予野生型受體；(b)來自野生型小鼠的血清-衍生的外體被給予野生型受體；(c)來自gld小鼠的血清-衍生的外體被給予lpr(Fas-/-)受體，(d)來自野生型小鼠的血清-衍生的外體被給予lpr受體，或者(e)給予鹽水作為對照。
圖35。顯示鼠科DTH模型中爪腫脹增加的柱狀圖，用外體供體動物免疫14天后收集的血清衍生的外體處理，免疫受體動物14天后給予。
圖36。顯示用VAS表示的疼痛的圖，注射以下三組后測量6次VASOrthokine血清和兩組去炎松。
圖37。顯示用SESaff(情感性疼痛標度(Affective Pain Scale))表示的疼痛的圖，注射以下三組后測量6次SESaffOrthokine血清和兩組去炎松。
圖38。顯示用SESsens(敏感性疼痛標度(Sensitive Pain Scale))表示的疼痛的圖，注射以下三組后測量6次SESsensOrthokine血清和兩組去炎松。
圖39。顯示疼痛Oswestry評分的圖，注射以下三組后測量4次Oswestry評分Orthokine血清和兩組去炎松。
圖40A-F。Orthokine血清中富含外體的組分的透射電鏡圖(TEM)((B)是由過濾的血清產(chǎn)生的圖象)。
5.發(fā)明詳述為清楚但不限制性地描述，本發(fā)明的詳述部分被分成以下小節(jié)(i)外體的細胞來源；(ii)調(diào)理細胞以收獲外體；(iii)從細胞制備外體；(iv)從血清制備外體；(v)含外體的組合物；(vi)免疫抑制方法；和(vii)拮抗外體-介導的免疫抑制的方法。
5.1外體的細胞來源本發(fā)明的外體可衍生自多種不同細胞，其中包括但不限于抗原呈遞細胞(“APC”)如樹突細胞(“DC”)和巨噬細胞，它們可從例如骨髓、脾、淋巴結(jié)或胸腺等組織，或從衍生出它們的外周血或血清中收獲。本發(fā)明的范圍還包括專門的抗原呈遞細胞，如皮膚的朗格漢斯細胞或肝臟的枯否細胞，它們可制備自它們的來源組織。收獲APC和DC的方法尤其是本領域已知的。
如下述工作實施例所證實，觀察到外體的免疫抑制活性依賴于II類MHC抗原，且當外體供體和受體同系時的活性要比同種異體時高。因此希望供體和受體之間的關系最密切。因此，雖然本發(fā)明包括將來自一種哺乳動物種類的外體用于免疫抑制另一種種類，但優(yōu)選供體和預定受體的種類是相同的，和/或優(yōu)選供體和預定受體的的II類MHC抗原是相同的(或基本類似或相容，例如采用用于預期組織移植物的考慮因素)，和/或優(yōu)選供體和預定受體是相同的(自體)或有家庭關系的(兄弟/姐妹；姐妹/姐妹；父母/孩子)。類似地，由于外體的免疫抑制活性是抗原特異的，因此，在本發(fā)明的特定非限制性實施方案中，外體供體可用要在受體中抑制其反應的抗原免疫。
5.2調(diào)理細胞以收獲外體在本發(fā)明優(yōu)選的非限制性實施方案中，APC被調(diào)理以增強從其制備的外體的免疫抑制活性。“調(diào)理”在文中包括(i)在體外或體內(nèi)使APC暴露于增強劑，以及(ii)基因工程改造APC以表達增強劑。
增強劑可以是細胞因子、細胞因子拮抗劑和NFκB拮抗劑，包括但不限于TGF-β、IL-10、CTLA4-Ig、sCD40-Ig、IL-4、IL-13、FasL、IL-I受體拮抗劑蛋白(“IRAP”)、vIL-10、sICAM-1、sICAM-3和TRAIL。在優(yōu)選的非限制性實施方案中，所述增強劑是IRAP或IL-10或IL-4或其組合，在具體的非限制性實施方案中，所述增強劑被給予APC，例如在細胞培養(yǎng)物中，IRAP的濃度可以為約5μg/ml，或者IL-10的濃度可以為約1000U/ml，或者IL-4的濃度可以為約1000 U/ml。任選地，當特定抗原或特定抗原來源已知時，這種特定抗原或特定抗原來源(例如，固定或減毒的感染劑)可作為增強劑加入培養(yǎng)物，其用量為非毒性、非致病性的。
在本發(fā)明的一組實施方案中，APC可經(jīng)基因工程改造以表達編碼增強劑的異源“增強基因”。這種“增強基因”包括但不限于操作性連接于在APC中有活性的啟動子元件的編碼TGF-β、IL-10、CTLA4-Ig、sCD40-Ig、IL-4、IL-13、FasL、IRAP、VIL-10、sICAM-1、sICAM-3和TRAIL的核酸。在優(yōu)選的實施方案中，所述增強基因是FasL、IL-10、IL-4或IRAP。增強基因產(chǎn)物可在外體表面(例如，膜結(jié)合)或在外體內(nèi)部表達?；蛘撸珹PC可經(jīng)基因工程改造以表達編碼血管生成因子的增強基因(例如，但不限于，Del1)或分選和定位信號。可用本領域已知方法引入增強基因，所述方法包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導、電穿孔、微注射等?？扇芜x將增強基因摻入合適的表達載體以便于其引入，在本發(fā)明的非限制性實施方案中，表達載體可以是病毒載體。病毒載體可以是，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)或單純皰疹病毒(HSV)載體。在本發(fā)明具體的優(yōu)選實施方案中，所述病毒載體衍生自腺病毒。(通常可參見，Horwitz，M.S.，“腺病毒及其復制”，引自Virology，第二版，F(xiàn)ields等編，Raven Press，New York，1990)。重組腺病毒具有用作編碼腺病毒載體外源蛋白質(zhì)的核酸分子表達系統(tǒng)的優(yōu)點，包括分裂和非分裂細胞向性、最小致病潛能、能以高效價復制以制備載體貯液、以及能夠攜帶大插入物。見Berkner，K.L.，1992，Curr.Top.Micro Immunol，15839-66；Jolly D.，1994，Cancer Gene Therapy，151-64。
在本發(fā)明具體的非限制性實施方案中，增強基因可含在衍生自基本缺失E1和E3結(jié)構(gòu)域的腺病毒血清型2(Ad2)或血清型5(AD5)的腺病毒載體中。其它腺病毒血清型也可用作腺病毒載體的骨架，其中包括Ad6、Ad9、Ad12、Ad15、Ad17、Ad19、Ad20、Ad22、Ad26、Ad27、Ad28、Ad30和Ad39。在列舉的這些腺病毒血清型中，優(yōu)選Ad2和Ad5。
任選含在病毒載體內(nèi)的含有操作性連接于合適啟動子元件的增強基因的核酸可通過遞送系統(tǒng)提供給APC，如包裹入脂質(zhì)體、微?；蛭⒛摇?br> 5.3從細胞制備外體從細胞制備外體是本領域已知的；參見，例如，Raposo等，J.Exp.Med.1831161(1996)。
在本發(fā)明具體的非限制性實施方案中，外體可從APC的培養(yǎng)物制得，該APC培養(yǎng)物優(yōu)選如下所述用增強劑調(diào)理(在細胞培養(yǎng)物中或通過基因工程改造)的APC培養(yǎng)物。收集培養(yǎng)物上清并于300g離心5分鐘、1,200g離心20分鐘、10,000g離心30分鐘連續(xù)離心3次以除去細胞和碎片，然后100,000g離心1小時。為除去過量的血清蛋白質(zhì)，外體團然后用PBS洗滌并在100,000g再離心1小時，之后將所得團塊重懸于PBS。外體可通過微量Bradford蛋白質(zhì)測定(Bio-Rad，CA)量化，優(yōu)選將通過測定確定與1mg蛋白質(zhì)相對應的外體的量懸浮于20ml PBS?？扇芜x通過電子顯微術(shù)證實外體的完整性(見圖1A)，且外體可任選通過FACS分析定性以表征表面標記(見下面的第6和7節(jié))。
5.4從血清制備外體根據(jù)本發(fā)明，可用于免疫抑制的外體可收集自合適對象的血清。優(yōu)選地，所述對象也是血清-衍生的外體的預定受體(自體給予)。如果外體的供體和受體不相同，由于外體-介導的免疫抑制活性的抗原特異性和II類MHC依賴性，優(yōu)選供體和受體是II類MHC抗原相容的和/或供體已經(jīng)暴露于需要在受體中抑制對其的免疫力的抗原。
由于外體是大小為30-100nM的小顆粒，因此可通過除去外周血樣品中較大的細胞組分在血清中回收它們，例如，但不限于，在1500g離心10分鐘。
優(yōu)選地，可通過連續(xù)離心步驟更加嚴格地純化外體。例如可采用上述從細胞培養(yǎng)物上清制備外體的方法或等價方法，但不限于此。這種方法優(yōu)選包括采用實驗室超速離心機。在一個非限制性的實施例中，外體可分離自血清(用標準實驗室技術(shù)收集自外周血)，通過1200g離心5分鐘、1200g離心20分鐘和10,000g離心30分鐘三次連續(xù)離心，然后100,000g離心1小時，所得團塊用PBS洗滌，重懸于PBS，然后再100,000g離心1小時，之后可將所得團塊重懸于PBS。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，外周血可在存在珠時培育以刺激細胞因子產(chǎn)生，然后再收集血清和外體?？捎糜诖四康牡闹榘ǖ幌抻谥睆綖?.5-10mm或0.5-5mm的玻璃或塑料珠，珠可任選用試劑處理，如能刺激淋巴細胞增殖的CrSO4(Mignini等，2004，Preventive Med 39(4)767-775；Rhee等，2002，Clin Exp Immunol127(3)463-469)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的非限制性實施方案中，使用直徑2.5mm、表面積21mm2的醫(yī)用玻璃珠，將珠在50％CrSO4(Merck，德國)中培育5分鐘以進行表面修飾，然后用蒸餾水洗滌直到洗滌液的pH與蒸餾水的pH相同，同時洗滌液電導率小于0.3μS。可將處理過的珠放在合適容器內(nèi)，如微量滴定板、離心管、培養(yǎng)管或針筒，然后滅菌(例如通過高壓滅菌或γ照射)。然后將外周血加入含有珠的容器，再在37℃、5％CO2下無菌培育例如24小時。然后可通過離心如3500rpm離心10分鐘從珠/血懸浮于收集血清。通?？苫厥兆畛跬庵苎傮w積的20％。然后將所得含外體的血清儲存于-20℃。Orthokine血清就是用這種方法制備的(見美國專利Nos.6759188和6713246)。
在本發(fā)明一個相關的特定非限制性實施方案中，可在與珠一起培育之前或者同時將IRAP加入外周血樣品。例如，每毫升外周血可加入5μgIRAP。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的非限制性實施方案中，可用如下方法制備外體的濃縮制品，從任選與珠和/或IRAP一起培育的外周血收集血清，方法是通過離心除去形成的血液成分(例如，3000-5000g離心10分鐘)，然后再超速離心，例如，100,000g離心1小時。所得團塊可重懸于生理鹽水，然后宜進行滅菌(例如，通過0.2μm濾器過濾)。用來懸浮團塊的體積決定了外體的濃度。優(yōu)選地，所述濃度在100ml血清1ml外體濃縮物(“100倍濃縮”)和2ml血清1ml外體濃縮物(“2倍濃縮”)之間，優(yōu)選在約50ml血清1ml外體濃縮物(“50倍濃縮”)和5ml血清1ml外體濃縮物(“5倍濃縮”)之間，優(yōu)選約10ml血清1ml外體濃縮物(“10倍濃縮”)。
5.5含外體的組合物本發(fā)明提供了含外體的組合物，其中的外體被懸浮于合適的藥用載體。
本發(fā)明的組合物以外體濃度為特征，相對于它們在外體供體或預定受體內(nèi)的平均血清濃度而言，外體被濃縮。在非限制性實施方案中，相對于血清的濃度可以在約100倍和2倍之間，或在50倍和5倍之間，或約10倍。
如上所述，本發(fā)明的組合物可含有獲自經(jīng)增強劑處理的APC或外周血的外體。
本發(fā)明的組合物可含有通過超速離心制備的外體。
在一組優(yōu)選的非限制性實施方案中，本發(fā)明提供了含有外體的藥物組合物，所述外體通過培養(yǎng)經(jīng)增強劑調(diào)理的對象的APC，然后從所述經(jīng)調(diào)理的APC的培養(yǎng)基中分離外體而制備。
在另一組優(yōu)選的非限制性實施方案中，本發(fā)明提供了含有外體的藥物組合物，所述外體通過將外周血與玻璃珠一起培育、從外周血收集血清、以及通過超速離心從所述血清分離外體而制備。
在另一組優(yōu)選的非限制性實施方案中，本發(fā)明提供了含有外體的藥物組合物，所述外體通過在存在增強劑(優(yōu)選IRAP)時將玻璃珠與外周血一起培育、從外周血收集血清、以及優(yōu)選通過超速離心從所述血清分離外體而制備，并優(yōu)選制造濃縮的外體制品。
5.6免疫抑制方法本發(fā)明提供了在需要這種治療的對象中減少、抑制或防止免疫應答的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的APC衍生的外體。所述減少/抑制/防止可通過炎癥參數(shù)的降低得到證實，所述參數(shù)例如有炎癥的臨床征兆(腫脹、發(fā)紅、發(fā)熱、疼痛、關節(jié)靈活性受限、皮疹、炎癥性神經(jīng)病、腦膜炎、腦炎)、變態(tài)反應或哮喘的臨床征兆(打噴嚏、發(fā)癢、咳嗽、發(fā)疹、蕁麻疹、喘息)、炎性腸病的臨床征兆(痙攣、大便出血和/或有粘液)或臨床標記如CRP、ESR、WBC。
需要減少、抑制或防止免疫應答的疾病和病癥包括但不限于關節(jié)炎、變態(tài)反應、哮喘或自身免疫疾病，例如，但不限于，類風濕性關節(jié)炎、青少年型類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、舍格倫綜合征、I型糖尿病、韋格納肉芽腫病、多發(fā)性硬化、克羅恩病、銀屑病、格雷夫斯病、口炎性腹瀉、斑禿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、古德帕斯丘綜合征、自身免疫性溶血性貧血、格-巴二氏綜合征、結(jié)節(jié)性多動脈炎、特發(fā)性血小板性紫癜(idiopathic thrombocyticpurpura)、巨細胞動脈炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、阿狄森病、強直性脊柱炎、萊特爾綜合征、大動脈炎和白癲風?？砂凑毡景l(fā)明治療的其它癥狀包括諸如肌營養(yǎng)不良的疾病以及炎癥可能會影響正常愈合的癥狀，如軟組織、韌帶或骨骼的意外損傷或醫(yī)源性損傷，或者非免疫事件造成的組織損傷，例如心肌梗塞后的心肌受損。
本發(fā)明的方法包括給予需要這種治療的對象有效量的按照本發(fā)明制備的外體。例如，可給予上述章節(jié)所描述的外體組合物。外體可通過任何臨床途徑給予，但優(yōu)選靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、皮下、膜內(nèi)給予，或者在例如外科手術(shù)過程中通過局部注射或灌輸給予。
要給予的外體的量如下，或者可根據(jù)臨床基礎例如根據(jù)對象-對象基礎決定。在具體的非限制性實施方案中，每千克對象體重可給予的外體的量約為5-100μg蛋白質(zhì)，或者約為50μg蛋白質(zhì)。術(shù)語“具有特定量蛋白質(zhì)的外體”指外體制品中存在的蛋白質(zhì)的量可被量化(例如，通過5.3節(jié)所述的Bradford蛋白質(zhì)測定法或測量蛋白質(zhì)的其它標準技術(shù))，且蛋白質(zhì)的量被用作外體用量的指標。在一組本發(fā)明具體的非限制性實施方案中，可給予人類對象收集自約20-50ml、50-100ml、100-200ml、200-300ml、300-400ml或400-500ml外周血的血清衍生的外體。在另一組本發(fā)明具體的非限制性實施方案中，可給予人類對象的外體的量約為100μg-5mg蛋白質(zhì)，或約500μg-2mg蛋白質(zhì)。
在具體的非限制性實施方案中，本發(fā)明提供了在需要這種治療的對象中抑制免疫應答的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的制備自抗原呈遞細胞培養(yǎng)物的外體。文中，“抗原呈遞細胞培養(yǎng)物”是通過本領域已知方法收集的富含抗原呈遞細胞的細胞培養(yǎng)物；這種培養(yǎng)物不必100％純。
5.7拮抗外體-介導的免疫抑制的方法由于發(fā)現(xiàn)APC衍生的外體具有免疫抑制作用，在某些條件下它們可顯示出負面作用，例如，抑制宿主對腫瘤或感染的免疫應答。因此，本發(fā)明提供了抑制這種不需要的免疫抑制的方法，包括在需要增強免疫力的部位給予有效量APC衍生的外體的抑制劑。這種抑制劑可以是，例如，針對外體相關抗原的抗體，所述抗原如運鐵蛋白或圖1C、2和4A所示的任何表面分子。
6.實施例外體-I的定性為證明DC-衍生外體的免疫調(diào)節(jié)作用，從以高密度培養(yǎng)在GMCSF/IL-4中的C57BL/6小鼠骨髓前體產(chǎn)生DC。然后通過差速離心從培養(yǎng)基分離DC產(chǎn)生的外體，并通過電子顯微術(shù)、Western印跡和流式細胞術(shù)定性。
6.1材料和方法小鼠雌性C57BL/6(H-2Kb)小鼠和雄性DBAl/LacJ(H-2Kq)小鼠，皆7-8周齡，購自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。動物保存在匹茲堡大學生物技術(shù)中心(Pittsburgh，PA)無病原體的動物設備內(nèi)。
產(chǎn)生和培養(yǎng)骨髓-衍生的DC按Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001)的描述產(chǎn)生骨髓-衍生的DC(BMDC)。簡言之，從小鼠脛骨和股骨收獲骨髓并使骨髓通過和尼龍網(wǎng)以除去小骨塊和碎片。在第0天用0.83M NH4Cl緩沖液裂解污染的紅血球，并用Ab(RA3-3A1/6.1，抗-B220；2.43，抗-Lyt2；GK1.5，抗-L3T4；都來自美國典型培養(yǎng)物保藏所，Manassas，VA)和兔補體(Accurate Chemical and Scientific，Westbury，NY)的混合物耗竭淋巴細胞。然后將細胞在完全培養(yǎng)基(CM；RPMI 1640，含10％FBS、50μM 2-ME、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100μg/ml鏈霉素和100IU/ml青霉素)內(nèi)培養(yǎng)24小時以除去粘附的巨噬細胞。然后，在第1天將未粘附的細胞置于含重組鼠科GM-CSF(1000U/ml)和重組鼠科IL-4(1000U/ml)的新鮮CM內(nèi)。將細胞培養(yǎng)4天，在第5天收獲細胞以進行腺病毒轉(zhuǎn)導或用重組細胞因子處理。
為進行腺病毒感染，以每孔1×106DC/孔鋪于24孔板，并在總體積為1ml的無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入5×107PFU各重組腺病毒。37℃培育24小時之后收集細胞，用PBS洗滌5次，并加入新鮮培養(yǎng)基。在第7天回收感染的DC和外體，充分洗滌并注射入動物。
外體純化如先前的描述在第7天通過差速離心從BMDC培養(yǎng)物的細胞培養(yǎng)物上清制備外體(Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996))。簡言之，對從各BMDC回收的培養(yǎng)物上清在300g(5分鐘)、1,200g(20分鐘)和10,000g(30分鐘)進行三次連續(xù)離心以除去細胞和碎片，然后在100,000g離心1小時。為除去剩下的血清蛋白質(zhì)，外體團用大體積PBS洗滌并在100,000g離心1小時，最后重懸于120μl PBS供進一步研究。外體可通過微量Bradford蛋白質(zhì)測定(Bio-Rad，CA)量化。各批次根據(jù)蛋白質(zhì)含量標準化，取1μg懸浮于20μl PBS以進行體內(nèi)小鼠研究。為進行MHC II吸附，將100μl洗滌過的抗-小鼠MHC II順磁珠(Miltenyi Biotech)與預稀釋的外體(1μg/20μl)一起在4℃培育1小時，培育時溫和振蕩。磁性分離后用PBS將留在微量離心管內(nèi)的組分調(diào)至最初體積。在干冰/乙醇浴中快速冷凍隨后在37℃浴中升溫，如此獨立進行3輪以凍/融預稀釋的外體。通過IL-10 ELISA(Endogen)確定最終的外體制品內(nèi)IL-10和vIL-10的污染濃度。
電子顯微術(shù)外體通過差速離心純化，將10ml加載到Formvar/碳涂布網(wǎng)格上，用10μl中性1％磷鎢酸水溶性負染，并用JEOL-1210計算機控制的高對比度120kv透射電子顯微鏡觀察。
蛋白質(zhì)分析在添加了CLAP(胰凝乳蛋白酶、亮肽素、抑肽酶和胃蛋白酶抑制劑，各100μM)的10mM三乙醇胺、1mM EDTA、10mM乙酸、250mM蔗糖(pH7.4)中勻漿細胞以將胞質(zhì)溶膠和所有的膜分離，勻漿通過在25-G針管中推拉60次進行。在1200g離心以除去上清液中的核和細胞碎片。100,000g離心1小時后所有的膜都留在細胞團中。10μg細胞裂解液或外體制品然后在5-20％梯度SDS-PAGE上分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，并用增強化學發(fā)光檢測試劑盒(Amersham)通過Western印跡檢測。
FACS分析采用FACScan(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)，通過表型分析多數(shù)培養(yǎng)細胞(60-95％)內(nèi)CD11b、CD11c、CD80、CD86和MHC I類和II類的表達來確定。就外體而言，將30μg沉淀的外體與10μl直徑4μm的醛/硫酸鹽乳膠珠(Interfacial Dynamics，Portland，OR)室溫培育15分鐘，終體積為30-100μl，然后再用1ml PBS溫和振蕩培育2小時。在100mM甘氨酸中培育30分鐘以終止反應。外體涂布的珠用FACS洗滌緩沖液(3％FCS和0.1％NaN3，用PBS配制)洗滌三次并重懸于500μl FACS洗滌緩沖液。將珠與各種第一抗體一起培育1小時，然后如果需要再與FITC-偶聯(lián)的第二抗體一起培育，洗滌并在FACSCaliber(Becton Dickinson，SanDiego，CA)上分析。用Lysis II FACScan軟件(Becton Dickinson)獲得并分析數(shù)據(jù)。
6.2結(jié)果通過整體透射電子顯微術(shù)對外體團進行超結(jié)構(gòu)分析顯示，直徑40-90nm的特征性碟形外體明顯富集(圖1A)。Western印跡分析證實，DC-衍生外體為外體相關蛋白CD71和Hsp70陽性(圖1B)，但對于外體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)如Hsp90、不變鏈和鈣聯(lián)接蛋白呈陰性。為進一步證實外體組分的完整囊泡特性，從eGFP/C57小鼠的BMDC純化外體，這是由于動物內(nèi)的大部分細胞組成型表達標記蛋白eGFP(圖1B)。高度富集的外體組分的Western分析顯示出顯著水平的全長eGFP，說明可溶性eGFP被包裹在BMDC衍生的外體腔的保護性環(huán)境中。
通過流式細胞術(shù)進一步檢測DC-衍生外體組分的表面蛋白。100,000xg離心回收外體，使其結(jié)合乳膠珠并用一些抗鼠科DC相關白細胞標記蛋白的單克隆抗體染色。外體表面有高水平MHC II正染，檢測出更中等水平的MHC I、CD11C、CD80(B7.1)和CD86(B7.2)(圖1C)。這些數(shù)據(jù)一起證明了能夠富集完整的外體，所述完整外體含有如其它文獻所述的許多DC-衍生外體相關蛋白的標記(Stoorvogel等，Traffic.3321-330(2002)；Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996)；Kleijmeer等，Traffic.2124-137(2001))。
7.實施例外體-II的定性表面抗原圖2顯示了FACS分析結(jié)果，該結(jié)果證明了DC-衍生外體的表面表型。將外體與CD11b(為分析II類MHC)或II類MHC(IAd)抗體涂布的4.5μm珠一起培育。用珠來增加外體尺寸以便可通過FACS檢測。珠涂布的外體然后用指定蛋白的PEmAb標記。除了圖2所示的表面抗原，骨髓-衍生的外體也為CD11c、CD14、CD54、MFG-E8、CD80、CD86和CD9陽性。顯著比例的外體為CD11a、CD11b和膜結(jié)合TNF-α陽性，而對CD8-α、CD32、CD49d、CD25、CD40、CD107a(Lamp-1)、CD95和Trail呈陰性。有趣的是，盡管只有少量制備外體的DC是FasL陽性的，但99％的外體為FasL(CD 178)陽性。該結(jié)果說明，F(xiàn)asL被優(yōu)先分選入外體，不局限于任何理論，F(xiàn)asL似乎在提供所觀察療效中發(fā)揮本質(zhì)作用。
通行(trafficing)圖3A-D顯示了DC-衍生外體的體內(nèi)通行。BDMC-衍生的外體用PKH67標記，IV注射入小鼠，注射后2小時開始分析小鼠(Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001))。檢測脾邊緣區(qū)中MOMA-1+巨噬細胞、ER-TRP+巨噬細胞和CD11c+DC內(nèi)標記的外體。在CD11c+DC中，發(fā)現(xiàn)外體與Lamp-1+內(nèi)吞小泡有關。此外，起初CD8-α陰性CD11c+細胞攝入外體，而標記的外體在CD8-α+Dc陽性的百分數(shù)隨時間增加。24小時后，外體顯示與T細胞區(qū)域內(nèi)的CD11c+DC有關。同時，對外體陽性DC的分析顯示，它們未上調(diào)DC成熟標記(IAb、CD86或CD54)。這些結(jié)果說明，脾中發(fā)現(xiàn)的不成熟DC以及巨噬細胞能有效內(nèi)化DC-衍生外體，但不會誘導DC成熟也不會影響DC成熟的能力。因此，外體功能的工作模型為，它們與脾和淋巴結(jié)內(nèi)抗原呈遞細胞的亞類相互作用，隨后抑制T細胞應答，從而可能誘導調(diào)節(jié)T細胞群。
8.實施例衍生自DC/FasL的外體有免疫抑制活性符號“DC/’X”表示樹突細胞被工程改造以表達X，或者DC先被暴露于X然后再從樹突細胞制備外體，其中的‘X’是諸如FasL、IL-10、IL-4等的試劑。
8.1衍生自攜帶外源FasL的DC/FasL的外體以下實施例證明，分離自被外源基因轉(zhuǎn)導的DC的外體能夠呈遞基因產(chǎn)物。具體地說，當DC被攜帶FasL基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)導時DC-衍生外體展示FasL。
8.1.1材料和方法DC產(chǎn)生按照先前的描述產(chǎn)生骨髓衍生的DC(Whalen等，MoI Ther.4543-550(2001)；Kim等，J Immunol.1663499-3505(2001)；Kim等，MoI Ther.6584-590(2002))。簡言之，從C57BL/6小鼠的脛骨和股骨收集骨髓。裂解污染的紅血球并用抗體混合物(RA3-3A1/6.1、抗-B220；2.43、抗-Lyt2；GK1.5、抗-L3T4；都來自ATCC，MD)耗竭淋巴細胞。細胞然后在完全培養(yǎng)基(CM)內(nèi)培育24小時以除去粘附的巨噬細胞。然后將未粘附的細胞置于含1000U/ml mGM/CSF和mIL-4的新鮮CM內(nèi)。將細胞培養(yǎng)4天，收獲細胞以進行腺病毒轉(zhuǎn)導。腺病毒感染時，在總體積為1ml的無血清培養(yǎng)基內(nèi)將1×106DC與5×107PFU病毒混合。培育24小時后DC用PBS劇烈洗滌3次，再培育48小時。在第8天收集培養(yǎng)物上清以純化外體，并回收感染的DC。
外體分離如先前的描述略微改動分離外體(Raposo等，J.Exp Med.1831161-1172(1996))。將收集的培養(yǎng)物上清在300g離心10分鐘、1200g離心20分鐘、3000g離心30分鐘。最后一次離心的上清液再在超速離心機中100,000g離心1小時。外體團用鹽水洗滌，100,000g離心1小時，并重懸于鹽水。
流式細胞術(shù)為對DC進行表型分析，用抗鼠科表面分子(CD11b、CD11c、CD80、CD86、H-2Kb、I-Ab和合適的同種型對照)的PE-或FITC-偶聯(lián)的單克隆抗體染色DC。
為進行FACS分析，將外體與5μl直徑4μm的醛/硫酸鹽乳膠珠在20微升終體積中室溫培育15分鐘。在各珠/外體樣品中加入10mg牛血清白蛋白(BSA)，之后繼續(xù)培育15分鐘。加入1ml鹽水，然后再溫和振蕩培育75分鐘。與100mM甘氨酸培育30分鐘以終止反應。外體涂布的珠用抗體染色，用FACS緩沖液(3％胎牛血清(FBS)和0.1％NaN3，用鹽水配制)洗滌兩次并重懸于400μl FACS緩沖液。DC和外體通過FACScan(Becton Dickenson，CA)檢測。
電子顯微術(shù)外體通過差速離心純化，將10ml加載到Formvar/碳涂布網(wǎng)格上，用10μl中性1％磷鎢酸水溶性負染，并用JEOL-1210計算機控制的高對比度120kv透射電子顯微鏡觀察。分離骨髓衍生的DC。在第5天用Ad.FasL感染一半分離的DC。外體如上述分離。
蛋白質(zhì)分析和Western印跡用12％十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離5微克外體蛋白質(zhì)和DC裂解液。將蛋白質(zhì)印跡到硝酸纖維素膜(Amersham)。封閉后，膜用抗體和辣根過氧化物酶顯示并用X射線膠片通過增強發(fā)光檢測(Perkin Elmer Life Science)。
8.1.2結(jié)果用Ad.eGFP或Ad.FasL轉(zhuǎn)導一天后充分洗滌，將感染的鼠科DC培養(yǎng)48小時并通過差速離心從上清液分離外體。48小時后106鼠科骨髓DC產(chǎn)生了1-2μg外體。然后與結(jié)合到乳膠珠的抗體一起培育、隨后通過流式細胞術(shù)分析DC和分離的DC-衍生的外體中MHC和共刺激分子的存在。如圖4A-C所示，衍生自Ad.eGFP和Ad.FasL轉(zhuǎn)導DC以及對照轉(zhuǎn)導DC的外體為MHC I類和II分子、CD11c和共刺激分子CD80和CD86陽性(圖4A)。此外，采用抗-FasL抗體通過Western分析顯示，DC/FasL和DC/FasL-衍生的外體對約40Kda的人FasL轉(zhuǎn)基因呈陽性(圖4B)。這些結(jié)果證明，衍生自Ad/FasL轉(zhuǎn)導DC的外體含有未蛋白酶水解的(non-proteolyzed)完整FasL和MHC、共刺激分子和CD11c。通過EM分析外體組分顯示了顯著數(shù)量的碟形囊泡，這是外體的特征(圖4C)。
8.2局部給予呈遞FasL的外體減輕了足墊腫脹試驗中治療爪和對側(cè)爪中遲發(fā)型超敏反應(“DTH”)相關腫脹為測試經(jīng)基因修飾表達FasL的DC，以及衍生自經(jīng)修飾DC的外體是否能夠在體內(nèi)抑制炎癥，采用了DTH小鼠模型。在該模型中，小鼠用特定抗原(匙孔血藍蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA))免疫，在后足墊注射特定抗原進行免疫10-14天后誘導了Th1-介導的炎性應答。
8.2.1材料和方法從骨髓分離DC，之后用Ad.Ψ5或Ad.FasL感染。如8.1節(jié)的描述純化外體。
給予DTH模型外體在單背側(cè)部位注射100μg用弗氏完全佐劑(FCA)1∶1乳化的抗原(KLH或OVA)以敏化C57BL/6小鼠。10天后，在免疫小鼠的一個后足墊注射百萬數(shù)量級的DC或1μg衍生自DC的外體，12小時后用抗原攻擊。對側(cè)足墊接受等體積鹽水代替DC或外體。在小鼠的兩個足墊內(nèi)注射20μg溶于20μl鹽水的抗原進行攻擊。攻擊24、48和72小時后測量足墊腫脹。結(jié)果表示為抗原加強注射之前和之后腫脹的差異(×0.01mm)。
統(tǒng)計分析用斯氏t檢驗和方差分析比較結(jié)果。
8.2.2結(jié)果如圖5所示，給予DC/FasL或DC/FasL-衍生的外體在注射抗原后24、48和72小時時不僅明顯抑制了處理爪的爪腫脹，而且明顯抑制了未處理的對側(cè)爪的腫脹。相反，注射DC/Ψ5或衍生自對照DC的外體不能抑制DTH應答。這些結(jié)果證明，表達FasL的經(jīng)基因修飾的DC以及衍生自DC/FasL的外體對于抑制處理爪以及未處理的對側(cè)爪中的DTH應答同樣有效。
在一些關節(jié)炎的不同動物模型中體內(nèi)和先體外后體內(nèi)遞送多種不同治療基因后都觀察到了對側(cè)效應。(Kim等，J.Immunol.1641576-1581(2000)；Whalen等，J.Immunol.1623625-3632(1999)；Lechman等，J.Immunol.1632202-2208(1999)；Ghivizzani等，Proc NatlAcad Sd USA.954613-4618(1998)；Kim等，J.Immunol.1663499-3505(2001)；Ijima等，Hum Gene Ther.121063-1077(2001)；Kim等，MoI Ther.6584-590(2002)；Smeets等，Arthritis Rheum.482949-2958(2002)；Lechman等，Gene Titer.102029-2035(2003))。
8.3通過呈遞FasL的同系外體抑制遲發(fā)型超敏反應8.3.1材料和方法為確定DC衍生外體通過何種機制抑制炎癥，檢測了觀察到的效應是否是MHC依賴性和抗原特異性的。為確定外體抑制DTH應答的能力是否是MHC依賴性的，檢測了同種異體外體是否能夠在體內(nèi)抑制DTH應答。將衍生自C57BL/6(H-2b，I-Ab)小鼠的DC用作同系外體來源，而將Balb/C(H-2d，I-Ad)的DC用作同種異體外體來源。為檢測同系和同種異體DC-衍生外體在體內(nèi)抑制DTH的能力，在KLH-免疫的小鼠兩只后爪之一注射同系或同種異體外體，12小時后再在兩只后爪注射抗原。48小時后測量足墊腫脹程度。
8.3.2結(jié)果衍生自同種異體DC的外體不能抑制DTH應答(圖6)。相反，注射來自同系小鼠的Ad.FasL-轉(zhuǎn)導的DC或DC/FasL-衍生的外體后觀察到了DTH抑制。此外，用同系DC/FasL-衍生的外體局部處理導致處理爪和未處理的對側(cè)爪的爪腫脹都減輕。體內(nèi)結(jié)果還證實，Exo/FasL效應不是由于注射攜帶FasL的細胞膜而誘導的大范圍凋亡。
8.4呈遞FasL的外體對遲發(fā)型超敏反應的抑制是MHC II類依賴性的8.4.1材料和方法為進一步檢測DC和外體的免疫調(diào)節(jié)特性，從MHC I類-和II類-缺陷型小鼠制備DC，并用Ad.FasL或Ad.Ψ5感染。將分離自MHC I類-和II類-缺陷型小鼠DC/FasL或DC/Ψ5的外體注射入KLH-免疫小鼠的后爪。
8.4.2結(jié)果注射來自I類缺陷型小鼠的基因修飾DC和DC-衍生的外體只有輕微療效(圖7A)。然而，注射來自II類MHC缺陷型小鼠的表達FasL的DC和DC-衍生外體導致治療性抗炎癥效應完全廢除(圖7B)。這些結(jié)果說明，DC/FasLd療效是II類MHC而非I類依賴性的，這與CD4+T細胞調(diào)節(jié)DTH應答的主要作用一致(Ptak等，J Immunol.146469-475(1991))。此外，該結(jié)果還說明，外體與DC類似，也需要II類而非I類以調(diào)節(jié)DTH應答。
8.5外體介導的對遲發(fā)型超敏應答的抑制是抗原特異的8.5.1材料和方法為證實呈遞FasL的外體能提供抗原依賴性免疫應答抑制，用KLH免疫小鼠。制備DC并用Ad.FasL或Ad.eGFP感染，然后用KLH或Ova蛋白脈沖給予(pulse)。從不同DC培養(yǎng)物制備外體并注射入免疫的小鼠，隨后立即注射KLH以誘導DTH應答，48小時后進行測量。
8.5.2結(jié)果如圖8所示，衍生自Ad.FasL感染、KLH脈沖DC的外體減輕了注射爪以及未處理的對側(cè)爪的炎癥。相反，衍生自Ova脈沖、表達FasL的DC的外體僅能適度抑制炎癥，這與衍生自KLH處理過、Ad.eGFP感染的DC的外體類似。這些結(jié)果說明，衍生自表達FasL的DC的外體能夠以抗原特異性方式抑制炎癥。
8.6制備自FasL-缺陷型小鼠樹突細胞的外體不能抑制遲發(fā)型超敏反應應答8.6.1材料和方法從野生型或gld(FasL-/-)小鼠分離DC和DC-衍生外體，并用對照腺病毒或表達FasL的腺病毒感染。將DC和DC-衍生外體注射回已用KLH免疫過的野生型小鼠足墊，12小時后向足墊注射KLH。然后測量注射抗原后的爪腫脹程度。將來自野生型和gld(FasL-/-)小鼠的外體也注射回lpr(Fas-/-)小鼠以證明外體和DC的作用需要受體小鼠內(nèi)存在功能性Fas。
來自gld(FasL-/-)小鼠的DC和外體不能抑制注射爪和對側(cè)爪的DTH應答，但如果用Ad.FasL轉(zhuǎn)導gld DC和DC-衍生外體則該功能恢復(圖9A)。此外，含有FasL的外體以及DC-FasL在lpr(Fas-/-)小鼠內(nèi)無效(圖9B)。
8.7給予攜帶FasL的外體緩解了膠原-誘導的關節(jié)炎模型中疾病的嚴重性為證實DC/FasL-衍生的外體可治療膠原-誘導的關節(jié)炎，將外體注射入膠原誘導的關節(jié)炎的小鼠模型。
8.7.1材料和方法7-8周齡的雄性DBA/1 lacJ(H-2q)小鼠購自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)，動物保存在匹茲堡大學生物技術(shù)中心無病原體的動物設備內(nèi)。0.05 M乙酸中的濃度為2mg/ml的牛II型膠原(Chondrex)用等體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化，然后注射入小鼠尾巴基部。
通過已有肉眼評分系統(tǒng)監(jiān)測小鼠，按0-4評分0，正常；1，可檢測到關節(jié)炎和紅斑；2，明顯腫脹和發(fā)紅；3，從關節(jié)到足趾嚴重腫脹和發(fā)紅；4，腫脹程度最大，關節(jié)強直并畸形。將肉眼評分的平均值表示為所有爪的累加值，每只小鼠的最大可能評分為16(n＝7)。
用Ad/FasL或Ad/Ψ5感染DC，并在第28天將分離自受感染DC的外體靜脈注射入用牛II型膠原免疫的DBA1小鼠。
8.7.2結(jié)果用DC/FasL(圖10A)和呈遞FasL的外體(圖10B)治療在單次治療后能延遲疾病發(fā)作并抑制關節(jié)炎發(fā)展，而Exo/Ψ5對照組相比DC對照和鹽水對照顯示出中等疾病抑制效應。這些結(jié)果說明，單次注射衍生自表達FasL的DC的外體能夠抑制膠原-誘導的關節(jié)炎。類似地，將Exo/FasL注射入已經(jīng)患病的小鼠(在第32天)也能抑制疾病。
9.實施例衍生自DC/IL-10的外體具有免疫抑制活性9.1呈遞IL-10的BMDC-衍生外體的體外功能為證實BM-DC衍生的外體能夠抑制T細胞增殖，檢測了在混合淋巴細胞反應(MLR)中添加DC-衍生外體的功效。采用表達EB病毒編碼的IL-10基因(稱為病毒IL-10(vIL-10))的腺病毒轉(zhuǎn)導的BMDC作為潛在的免疫抑制DC-衍生的外體的來源。已知關節(jié)內(nèi)基因轉(zhuǎn)移vIL-10能抑制兔抗原-誘導的關節(jié)炎(AIA)和鼠膠原-誘導的關節(jié)炎(CIA)模型中的炎癥(5，6)。對照使用經(jīng)表達螢光素酶的腺病毒載體(Ad.Luc)誘導的BM-DC。
9.1.1材料和方法載體構(gòu)建和腺病毒產(chǎn)生按照已經(jīng)描述的標準方法構(gòu)建、增殖和滴定表達病毒IL-10的腺病毒(Ad.vIL-10)和表達增強型綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad.eGFP)(Kim等，Arthritis Res.2293-302(2000))。簡言之，共轉(zhuǎn)染DNA、腺病毒5-衍生的E1-和E3-刪除的腺病毒主鏈(psi5)和腺病毒穿梭載體pAdlox之后，在293個表達Cre重組酶的細胞(CRE8細胞)內(nèi)同源重組以產(chǎn)生重組腺病毒。在人CMV啟動子控制下表達插入的cDNA序列。重組腺病毒通過CsCl梯度超速離心純化、用無菌病毒儲藏緩沖液透析、等分并儲存于-80℃直到使用。CRE8細胞生長和維持在添加有10％胎牛血清的DMEM(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中。
混合淋巴細胞反應從BALB/c小鼠脾臟純化T細胞以在圓底96孔板進行體外微量培養(yǎng)。在各孔中接種5×104個脾T細胞，以及對照C57BL/6衍生的DC或基因修飾的C57BL/6衍生的DC(vIL-10、rIL-10或螢光素酶)或從其中分離的外體。加入的DC與T細胞的比例為，T細胞∶DC之比為5∶1、10∶1、20∶1和40∶1。在培養(yǎng)的第5天，在各孔內(nèi)加入1μCi3H-胸苷，16小時后收獲。在微板Beta計數(shù)器(Wallac，Truku，芬蘭)上測量增殖T細胞的放射性標記。
9.1.2結(jié)果通過3H胸苷摻入測量可知，當加入MLR時，用Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導的DC能夠幾乎完全抑制T細胞增殖，而加入非轉(zhuǎn)導DC只顯示出很少的作用或幾乎沒有作用(圖11A)。用Ad.vIL-10感染的BMDC分泌的外體使T細胞增殖適度地降低4倍(圖11B)。這些數(shù)據(jù)說明，分離自表達免疫抑制性vIL-10的DC的外體能夠阻止T細胞增殖，而衍生自未修飾的BMDC的外體本身有具有部分抗炎癥作用。
9.2呈遞IL-10的外體在遲發(fā)型超敏反應模型中可抑制炎癥為證實BMDC衍生外體的體內(nèi)抗炎作用，采用了C57BL/6小鼠中的遲發(fā)型超敏反應模型。該模型曾經(jīng)被用來顯示在一個后足墊注射注射Ad.vIL-10能抑制注射足墊和對側(cè)足墊的炎癥。此外，過繼性轉(zhuǎn)移(adoptive transfer)試驗已經(jīng)顯示，在DTH模型中局部遞送Ad.vIL-10后觀察到的對側(cè)效應是由內(nèi)源性APC造成的。在一組敏化小鼠的右后足墊注射未經(jīng)處理或基因修飾的DC或衍生自這些細胞培養(yǎng)基的外體。對側(cè)足墊注射相似體積的鹽水。12小時后用20μgKLH攻擊各足墊，并在誘導疾病24、48和72小時后監(jiān)測足墊腫脹。
9.2.1材料和方法遲發(fā)型超敏反應在第0天皮下注射100μg用弗氏完全佐劑(Difco，Detroit，MI)1∶1乳化的抗原(OVA)以敏化小鼠。兩周后，在預敏化小鼠的一個后足墊注射1×106經(jīng)處理的DC(溶于50μl PBS)或1μg純化的衍生自各試驗DC組的外體(溶于50μlPBS)。試驗DC組包括用50moi Ad.螢光素酶轉(zhuǎn)導的DC和用50moi Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導的DC。對側(cè)足墊注射等體積鹽水。1天后，在兩個后足墊注射20μg溶于50μl PBS的抗原以攻擊小鼠，并在24小時、48小時和72小時后用彈簧卡尺(Dyer Co.Lancaster，PA)測量足墊。結(jié)果表示為由于腫脹造成的尺寸差異(mm×10-2)。
統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件分析。用斯氏t檢驗和ANOVA進行組比較。
9.2.2結(jié)果如圖12所示，鹽水對照動物的DTH應答是劇烈的，爪厚度平均增加了2mM。而接受1×106用Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導的BMDC的小鼠的注射足墊的足墊腫脹減少了50％以上。這些動物的鹽水處理的對側(cè)足墊的炎癥也減低了(40％)。有趣的是，注射1微克衍生自Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導BMDC的分泌外體的保護作用更強，相比鹽水對照小鼠抑制了65％爪腫脹。此外，在Ad.vIL-10/外體處理關節(jié)的對側(cè)足墊中也觀察到顯著降低(圖9A)。給予Ad.Luc/DC、Ad.Luc/外體、未處理DC或來自未處理DC的外體后未觀察到足墊腫脹顯著降低。這些數(shù)據(jù)說明，局部給予敏化小鼠衍生自Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導的BMDC的外體可抑制處理足墊和未處理的對側(cè)足墊內(nèi)的DTH。
9.3重組IL-10處理的DC-衍生外體有免疫抑制作用9.3.1材料和方法盡管上面進行的試驗說明，衍生自Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導的DC的外體有免疫抑制作用，但這可能是由于外體制品內(nèi)存在的低水平Ad.vIL-10或vIL-10蛋白污染造成的。為顯示腺病毒感染或vIL-10蛋白污染不會造成所觀察到的作用，用1μg/ml重組鼠科IL-10蛋白處理培養(yǎng)的BM-DC 24小時，利用實施例9所述的C57BL/6小鼠遲發(fā)型超敏反應模型體內(nèi)檢測產(chǎn)生的外體(圖12B)。
9.3.2結(jié)果衍生自經(jīng)重組鼠科IL-10處理的DC的外體在攻擊48小時后產(chǎn)生強免疫抑制效應，這可由處理爪的爪腫脹降低6倍、且未處理的對側(cè)爪的爪腫脹降低3倍得到證實。綜合而言，這些結(jié)果證實，衍生自鼠科IL-10處理的BMDC的外體可抑制經(jīng)處理的足墊和未處理的對側(cè)足墊內(nèi)的DTH，從而有效排除了腺病毒污染是造成這種效應的機制。重要的是，需要注意通過ELISA未測得外體制品內(nèi)含有重組IL-10蛋白。
9.4膜破裂造成外體免疫抑制能力喪失9.4.1材料和方法為證實100,000×g富集團塊組分中存在的外體對于在DTH模型中提供療效是重要的，檢測了這種功效對外體顆粒完整性的要求。
分離來自DC或經(jīng)Ad.螢光素酶或Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導DC的外體并對它們進行4輪凍/融。通過SDS-PAGE分離5μg制品，并對其進行印跡以分析Hsc 70。
為了測試外體是否需要有完整的膜以抑制DTH應答，向KLH-免疫小鼠的一只后足墊注射1μg未處理的(完整的)或經(jīng)凍/融的來自Ad-vIL-10轉(zhuǎn)導DC的外體(圖10C)。24小時后用KLH加強免疫各足墊并測量足墊腫脹程度。
9.4.2結(jié)果通過電子顯微術(shù)證實了通過4輪凍/融能夠破壞外體的完整性這一事實(圖13A)。實際上，在經(jīng)凍/融處理的外體組分中未測得可溶性外體相關蛋白Hsc 70(圖13B)，而該蛋白與未處理的外體相關。
在用完整exo/vIL-10處理的組中觀察到足墊腫脹的減輕，而注射凍/融處理的exo/vIL-10的組未顯示出爪腫脹的減輕，其腫脹程度類似于用鹽水或來自對照DC的外體處理的對照組。這些結(jié)果證明，多輪凍/融破壞了外體的膜結(jié)構(gòu)，從而消除了外體在DTH模型中的免疫抑制能力。
9.5抑制遲發(fā)型超敏反應應答需要含II類MHC的外體下面的數(shù)據(jù)證實了耗竭II類MHC陽性外體對于抑制DTH應答的作用。
9.5.1材料和方法將來自Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導的BMDC的外體分成4組，各組用不同方法預處理之后再注射回敏化小鼠(圖14A)。第一份外體樣品用鼠科MHC II特異性的順磁珠預吸附(Exo/vIL-10(MHC II IP))，第二份樣品用特異于不在DC衍生外體上呈遞的表面分子NK1.1的順磁珠預吸附(Exo/vIL-10(IP對照))。第三份樣品經(jīng)歷多輪凍/融(Exo/vIL-10(F/T))，而第四份樣品未經(jīng)處理。然后將外體樣品注射回小鼠的后足墊，12小時后開始在接下來的72小時內(nèi)測量兩個后足墊的DTH誘導的足墊腫脹。
9.5.2結(jié)果來自對照DC的外體對足墊腫脹沒有作用，而Ad.vIL-10/外體能夠顯著抑制注射足墊和未處理的對側(cè)足墊的DTH。預吸附到NK1.1珠的外體制品顯示出免疫抑制活性。然而，用II類珠預吸附Ad.vIL-10/外體樣品使其體內(nèi)活性幾乎100％消除。重要的是，實際上，注射結(jié)合了II類陽性外體的順磁珠導致免疫抑制活性類似于注射未吸附的Ad-vIL-10外體。來自重組小鼠IL-10蛋白處理的DC的外體在耗竭MHC II后顯示出類似的DTH應答結(jié)果(圖14B)。這些結(jié)果相互一致。經(jīng)歷幾輪凍/融的來自Ad-vIL-10-或重組IL-10-處理的DC的外體制品幾乎喪失活性(圖13C)。這些數(shù)據(jù)說明，給予小鼠外體組分后觀察到的體內(nèi)抗炎癥作用是II類MHC依賴的。由于II類MHC以高水平存在于外體表面，這說明在小鼠內(nèi)觀察到的體內(nèi)活性歸功于外體。此外，似乎還要求囊泡完整。這些體內(nèi)抗炎癥效應似乎是結(jié)構(gòu)完整的II類MHC陽性外體特有的，從而有效排除了腺病毒污染起效機制。
9.6呈遞IL-10的外體可在小鼠中抑制膠原-誘導的關節(jié)炎9.6.1材料和方法在4℃攪拌過夜以將牛II型膠原(Chondrex L.L.C.，Redmond，WA)以2mg/ml的濃度溶于0.05M乙酸，并用等體積弗氏完全佐劑(CFA)乳化。在尾巴基部用100μg膠原真皮內(nèi)免疫小鼠。初次免疫后的第21天，對小鼠真皮內(nèi)注射弗氏不完全佐劑(IFA)配制的II型膠原以加強免疫。通過已有肉眼評分系統(tǒng)隔天監(jiān)測小鼠，按0-4評分0，正常；1，可檢測到關節(jié)炎和紅斑；2，明顯腫脹和發(fā)紅；3，從關節(jié)到足趾嚴重腫脹和發(fā)紅；4，腫脹程度最大，關節(jié)強直并畸形。將肉眼評分的平均值表示為所有爪的累加值，每只小鼠的最大可能評分為16。再用彈簧卡尺測量每只爪的厚度，并將所有四只爪的厚度相加以計算各小鼠的爪腫脹。每組10只小鼠進行體內(nèi)試驗，重復兩次以確?？稍佻F(xiàn)性。
類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種以末端動關節(jié)的慢性炎癥和軟骨組織的進行性破壞為特征的使人虛弱的全身性自身免疫疾病?？赏ㄟ^注射牛II型膠原在DBAl/lacJ(H-2kq)品系中誘導類似病理和關節(jié)炎癥。為檢測DC和DC-衍生外體治療膠原-誘導的關節(jié)炎的能力，用Ad-vIL-10感染DC，然后將所得外體靜脈注射到用牛II型膠原免疫的DBA1小鼠。注射在第28天進行，恰在疾病發(fā)作前。
9.6.2結(jié)果單次注射DC/vIL-10或來自DC/vIL-10的外體能夠延遲關節(jié)炎的發(fā)作和減輕其嚴重性，而注射鹽水的對照組疾病正常發(fā)展(圖15)。該結(jié)果說明，單次注射衍生自表達IL-10的DC的外體對于自身免疫性炎性疾病的全身療效與注射基因修飾的DC相當。
除了在疾病預防研究中分析了DC-衍生的外體，還在已經(jīng)患有CIA的小鼠內(nèi)測試了來自DC-IL-10的外體。將來自Ad.vIL-10-轉(zhuǎn)導的或重組IL-10-處理的DC的外體靜脈注射入患病小鼠(圖16A-C)。雖然exo-IL-10-處理組的疾病抑制效果不及預防研究，但來自Ad.vIL-10轉(zhuǎn)導的和重組IL-10-處理的DC的外體都能夠減輕已有疾病的嚴重性(圖16A)。此外，對外體進行凍/融處理消除了這種療效(圖16B)，而直接注射注射重組IL-10對疾病進展沒有作用(圖16C)。
10.實施例DC/IL-4衍生的外體具有免疫抑制活性10.1 DC/mbmIL-4和從其制備的外體能抑制遲發(fā)型超敏反應應答用攜帶膜結(jié)合形式IL-4的腺病毒載體(Ad.mbmIL-4)或陰性對照病毒(Ad.Psi5或Ψ5)轉(zhuǎn)染樹突細胞。從這些DC的一部分制備外體。然后在文中所述的小鼠足墊DTH模型中檢測DC和外體。結(jié)果示于圖17。DC/mbmIL-4和制備自DC/mbmIL-4的外體能抑制注射爪和對側(cè)爪的DTH應答，證明了膜結(jié)合IL-4作為增強劑的功效。
10.2 DC/smIL-4和從其制備的外體能抑制遲發(fā)型超敏反應應答用攜帶可溶形式IL-4的腺病毒載體(Ad.sIL-4)或陰性對照病毒(Ad.Psi5或Ψ5)轉(zhuǎn)染樹突細胞。從這些DC的一部分制備外體。然后在文中所述的小鼠足墊DTH模型中檢測DC和外體。結(jié)果示于圖18。DC/smIL-4和制備自DC/smIL-4的外體能抑制注射爪和對側(cè)爪的DTH應答，證明了可溶性IL-4作為增強劑的功效。
10.3 DC/mbmIL-4和從其制備的外體以及DC/FasL和從其制備的外體抑制遲發(fā)型超敏反應應答10.3.1材料和方法從未感染的或用Ad.eGFP對照載體、Ad.FasL或攜帶膜結(jié)合形式IL-4的腺病毒載體(Ad.mbIL-4)感染的C57/BL6骨髓衍生的DC分離外體。將純化的外體(1μg總蛋白質(zhì))和不同的DC群(5×105細胞)注射入已預先對KLH免疫的小鼠的右足墊。注射外體或DC 24小時后，在右和左后足墊注射KLH抗原，并在48小時后測量治療足墊和其左邊對側(cè)足墊的腫脹程度。
10.3.2結(jié)果為確定衍生自FasL或IL-4修飾DC的外體組分能夠有效抑制DTH應答，從C57/BL6小鼠分離DC并通過腺病毒感染進行基因修飾以表達FasL或IL-4。在這些試驗中，采用含有融合到IL-4的CD28跨膜區(qū)的膜結(jié)合形式的IL-4(mbmIL-4)。然后將DC和外體組分注射到右側(cè)足墊，24小時后在兩個后足墊注射抗原。有趣的是，DC和來自Ad.FasL和Ad.mbmIL-4感染DC的外體組分都能夠抑制治療爪以及對側(cè)爪的炎性應答(圖19)。該結(jié)果說明，外體及其親本DC在局部注射后能通過抗原特異性機制發(fā)揮全身免疫抑制作用。不局限于任何特定理論，外體可在體內(nèi)與引流淋巴結(jié)內(nèi)的加工特定抗原的抗原呈遞細胞相互作用，導致抗原特異性抑制。
10.4 DC/IL-4衍生的外體需要FasL和Fas從野生型和gld(FasL-/-)小鼠分離DC并進行修飾以表達可溶性(smIL-4)或膜結(jié)合(mbmIL-4)鼠科IL-4。將DC群體和DC-衍生外體注射回野生型或lpr(Fas-/-)小鼠的足墊，將抗原注射入足墊后測量對爪腫脹的影響。
分離自DC/IL-4(膜結(jié)合的或可溶的)的外體要求受體中含有FasL和Fas以抑制DTH應答(圖20)。
10.5外體免疫抑制要求同源性(syngeneity)如圖21A-B所示，僅制備自同系而非同種異體DC/mbmIL-4的外體能抑制鼠科足墊模型內(nèi)的DTH應答，這與II類MHC抗原在外體-介導的免疫抑制中的作用一致。
10.6 DC/IL-4衍生的外體要求B7.1和B7.210.6.1.材料和方法從B7.1和B7.2(KO)缺陷型小鼠分離DC并用對照(Psi-5)或表達IL-4的腺病毒載體感染。然后將分離自不同DC群的外體注射入(1μg外體)KLH免疫小鼠的一只爪。測量注射和未處理爪的爪腫脹程度。
10.6.2結(jié)果如圖22所示，衍生自通過腺病毒基因轉(zhuǎn)移修飾以表達IL-4的野生型DC的外體能夠抑制DTH應答，而衍生自B7.1/B7.2雙GKO(“KO”)DC的外體對DTH應答無效。此外，B7缺陷型DC對DTH應答無效，類似于用B7缺陷型DC-衍生的外體觀察到的結(jié)果。Lohr等也觀察到在誘導T調(diào)節(jié)細胞以抑制糖尿病中對B7有類似需求(Lohr等，2003，Nature Immuno1.4664)。
此外，還觀察到免疫抑制性DC和DC-衍生的外體能刺激可能代表調(diào)節(jié)T細胞群的CD4+CD25+T細胞群。
10.7衍生自DC/IL-4的外體在膠原-誘導的關節(jié)炎模型內(nèi)能改善關節(jié)炎10.7.1材料和方法從模擬感染或用Ad.psi-5(對照)、Ad.mIL-4或Ad.mbmIL-4感染的DBA1骨髓衍生的DC分離外體。疾病發(fā)作后(第32天)將外體(1μg總蛋白質(zhì))靜脈注射到DBA1小鼠。對各治療組中每只小鼠的每只爪的關節(jié)炎嚴重性進行為期1個月的監(jiān)測(用0-4評分，最大評分為16)。
10.7.2結(jié)果如圖23所示，用制備自DC/IL-4，尤其是制備自DC/mbmIL-4的外體治療能夠阻止疾病發(fā)展(第32天時所有測試動物都顯示出疾病病理征兆)。一些經(jīng)治療的小鼠似乎康復。
11.免疫抑制活性的過繼性轉(zhuǎn)移如圖24A-B所示，用外體處理的小鼠CD11c細胞的過繼性轉(zhuǎn)移能阻斷DTH應答，證明CD11c陽性細胞是免疫抑制性外體的調(diào)節(jié)靶點。
12.外體-介導的對糖尿病鼠類模型中高血糖的抑制12.1材料和方法從幼年NOD小鼠的骨髓產(chǎn)生DC并用Ad.IL-4感染或不感染。分離來自DC群的外體并將1μg外體靜脈注射到5-6周齡的NOD小鼠，鹽水(sale)處理作為對照。然后監(jiān)測動物的高血糖情況。
12.2結(jié)果基于在CIA小鼠模型中觀察到的顯著療效，還檢測了免疫抑制性DC阻止低血糖發(fā)作的能力。靜脈注射衍生自幼年NOD小鼠(3-4周齡)骨髓的經(jīng)修飾以表達IL-4的DC，觀察到如果在10周齡時開始注射，則NOD小鼠出現(xiàn)高血壓的比例將降低。此外，還顯示用來自NOD小鼠的骨髓衍生的DC處理能夠抑制NOD小鼠高血糖的發(fā)作，所述DC經(jīng)NF-κB抑制劑(雙鏈NF-κB誘殺寡核苷酸)處理，這種處理可導致更加不成熟的DC表型(CD80、CD86和CD40低)。與這些觀察以及CIA模型的結(jié)果一致，在胰島炎早期給予經(jīng)基因修飾以表達FasL的DC已顯示可抑制NOD小鼠高血糖的發(fā)作(J.Mountz)。因此，經(jīng)修飾以表達IL-4或FasL或者用NF-κB抑制劑處理的免疫抑制性DC能預防或逆轉(zhuǎn)疾病。
如圖25所示，在上述試驗中，來自Ad.IL-4轉(zhuǎn)導DC的外體能夠延遲NOD小鼠高血糖的發(fā)作并能降低高血糖發(fā)作頻率。
13.實施例制備自血清的外體13.1用血清抑制DTH應答13.1.1材料和方法真皮內(nèi)注射KLH免疫C57BL6小鼠。兩周后收集小鼠血液。樣品1500g離心10分鐘以分離血清。將總共50μl血清注射到KLH免疫小鼠的后爪，24小時后在兩只后爪加強注射KLH抗原。KLH加強注射48小時后測量足墊腫脹。
13.1.2結(jié)果注射與珠一起培育24小時的幼稚小鼠的血清顯示相比鹽水處理的對照腫脹有一些減輕(見圖26，組I)。注射未培育或與珠一起培育的KLH-免疫小鼠的血清顯示相比鹽水對照足墊腫脹有最大減輕(見圖26，組II)。注射與或未與Minikin一起培育的KLH-免疫小鼠的血清顯示相比鹽水處理的對照腫脹有一些減輕(見圖26，組III和IV)，Minikin是適合可分離自人和小鼠的血清量的小注射器(syringe)。
13.2來自血清的外體能抑制DTH應答13.2.1材料和方法通過真皮內(nèi)注射KLH免疫小鼠。兩周后收集小鼠血液并冰凍4小時。樣品1500g離心10分鐘以分離血清。然后通過差速離心分離外體。收集的血清1500g離心20分鐘并3000g離心30分鐘。將最后一次離心的上清液再在超速離心機中100,000g離心1小時。外體團用鹽水洗滌，100,000g離心1小時，并重懸于鹽水。
將1微克懸浮于50微升鹽水的外體注射到KLH免疫小鼠后爪的足墊內(nèi)。另一后爪給予相同量的鹽水。24小時后向小鼠的兩只后爪注射20微克懸浮于50微升鹽水的KLH抗原。KLH加強注射48小時后測量足墊腫脹。
簡言之，從各BMDC培養(yǎng)物回收的培養(yǎng)物上清在300g(5分鐘)、1,200g(20分鐘)和10,000g(30分鐘)連續(xù)離心3次以除去細胞和碎片，然后100,000g離心1小時。為除去過剩的血清蛋白質(zhì)，外體團用大體積PBS洗滌并在100,000g再離心1小時，最后(將所得團塊)重懸于120μl PBS供進一步研究。
為獲得微泡，在3,000g(20分鐘)和10,000g(30分鐘)離心血清并將團塊重懸于鹽水。超速離心除去外體團后得到血清上清液。上清液無需進一步離心。
13.2.2結(jié)果與給予鹽水處理的對照或幼稚小鼠血清相比，給予DTH小鼠KLH-免疫小鼠的血清微泡、血清外體和全血清后產(chǎn)生腫脹減輕(圖27)。外體產(chǎn)生最大腫脹減輕，比采用全血清造成的減輕更加顯著(圖27，組II)。來自KLH免疫小鼠的血清外體造成的腫脹減輕大于KLH-免疫小鼠的上清液、凍/融外體和經(jīng)超聲處理的外體，并且遠大于未免疫小鼠的上清液和外體以及鹽水處理對照(圖28)。組VII用未免疫小鼠的全血清處理。組VIII是用鹽水處理的對照組。給予來自KLH-免疫小鼠的血清外體造成的腫脹減輕大于來自OVA-免疫小鼠的血清外體(圖29)。
13.3血清-衍生的外體以抗原特異的、II類MKC依賴的方式抑制遲發(fā)型超敏反應應答圖30是顯示純化自小鼠血清的外體的電子顯微照片。圖31是用攜帶抗-II類MHC抗體的珠標記的血清-衍生外體的FACS分析。注意，所有II類陽性外體都是CD178(FasL)陽性的。
如圖32所示，制備自經(jīng)KLH免疫小鼠血清的外體可有效抑制對KLH的DLH，但制備自幼稚小鼠血清的抗體不行，這證明了抗原特異性。圖33證明，攜帶II類MHC抗原的外體被耗竭的血清-衍生的外體制品基本喪失了所有免疫抑制活性，證明了血清衍生外體的MHCI類依賴性。圖34顯示，血清衍生外體的免疫抑制效應在用抗原免疫14天后達到峰值。
14.實施例制備自血清的外體在人類對象中有免疫抑制作用14.1含白細胞介素-1受體拮抗劑的血清(Orthokine)減輕了腰神經(jīng)根痛進行隨機雙盲臨床研究以評價經(jīng)IL-1R拮抗劑調(diào)理的血清對于減輕84名患者腰神經(jīng)根痛的作用。數(shù)據(jù)顯示，衍生自如此調(diào)理的血清的外體能用來減輕疼痛感。
14.1.1材料和方法珠制備在微板(24和48孔，Nunc，丹麥)或60ml針筒(Perfusor Syringes，BectonDickinson，USA)內(nèi)孵育血液。該針筒中裝有200個玻璃珠。玻璃珠為直徑2.5mm、表面積21mm2的醫(yī)用玻璃珠。珠用無菌雙蒸水洗滌直到其電導率小于0.3μS(HannaInstruments，USA)。將珠在50％v/v CrSO4(Merck，德國)中培育5分鐘以修飾其表面。然后反復洗滌珠直到其pH與用來沖洗的蒸餾水相同，且電導率小于0.3μS(HannaInstruments，USA)。裝有珠的微板或針筒通過高壓滅菌或γ照射滅菌。
血培養(yǎng)技術(shù)在所有試驗中，在裝有珠的容器(微板或60ml針管)內(nèi)填裝從20-50歲健康男性或女性供體新鮮抽取的人全血，除非另有說明不加抗凝血藥。在無菌層流條件(Kendro，德國)下建立全血培養(yǎng)物。在37℃、5％CO2(Kendro，德國)下無菌培育24小時。培育后將血清回收并離心(3500rpm，10分鐘，Megafuge，Kendro，德國)。從微板回收200ml血清，從針筒回收10ml血清，這對應于原始血液總體積的約20％。將血清儲存于-20℃。已知血清含有水平升高的白細胞介素-1-受體拮抗劑(IL-1Ra)以及水平升高的IL-4和IL-10(Meier等，Inflam Res.521-4(2003))。這種血清在商業(yè)上也稱為Orthokine。
每周對患者作硬膜外神經(jīng)周注射三次。每位患者在6個時間點(t1-t6)作主客觀評價，其中包括直觀類比標度(VAS)(Joyce等，Eur J Clin Pharmacol.14415-20(1975))，Oswestry疼痛問卷調(diào)查(Fairbank等，Spine，252940-2953(2000))，SF-36(健康調(diào)查摘要)(Ware等，Med.Care，30473-483(1992))，和標準化臨床檢查。注射入2毫升Orthokine。一組接受IL1-Ra調(diào)理的血清(Orthokine)，另一組接受10毫克去炎松，最后一組給予5毫克去炎松。去炎松是一種常用于治療炎癥、變態(tài)反應、關節(jié)炎和哮喘的甾類化合物。已經(jīng)顯示去炎松能有效減輕腰神經(jīng)根痛(隨機雙盲研究，KramerEur Spine 1997)。
14.1.2結(jié)果每次注射后疼痛明顯減輕(VAS)(p＜0.01)。Orthokine組和去炎松組之間有顯著差別(p＜0.01)。在去炎松組中6周后(t4)疼痛增加，而在Orthokine組中疼痛持續(xù)減輕(圖36)。去炎松5毫克組和10毫克組之間有顯著差別。t1和t4之間的SESaff(情感性疼痛標度)明顯減少，但組間沒有差別(圖37)。t1和t4之間的SESens(敏感性疼痛標度)明顯減少，但組間沒有差別(圖38)。t1和t4之間的Oswestry評分明顯減少，但組間沒有差別(圖39)。在三組中均沒有顯著的不良效應。
Orthokine組中觀察到的結(jié)果明顯優(yōu)于低劑量和高劑量去炎松組所觀察到的結(jié)果。
14.2 Orthokine血清含有外體14.2.1材料和方法外體組分制備自實施例16所述的血清制品。血清分離自人血。外體通過差速離心從血清富集，加載到Formvar/碳涂布網(wǎng)格上，用10μl中性1％磷鎢酸水溶性負染，并用JEOL-1210計算機控制的高對比度120 kv透射電子顯微鏡觀察。
14.2.2結(jié)果圖40A-C清楚顯示經(jīng)富集的Orthokine血清中存在外體。
14.3從Orthokine血清制備濃縮的外體在經(jīng)過特殊表面處理的針管(Orthokine針管)內(nèi)培育全血以制造外體。在6-24小時時細胞從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌囊泡。每毫升全血添加5μg IL-1ra(IRAP)可增強該過程(下面的實施例A-D)。在實施例A-D中，培育之后在5000 g離心10分鐘以將血清和血細胞分離。則血清中就含有不同量的外體。在100,000g第二次離心1小時以濃縮該囊泡。離心之后從20ml血清可得到約1ml體積的團塊(在離心管底部，通過0.2μM濾膜濾入螺旋帽離心管)。之后將這1ml外體溶液注射給患者。有時單次注射較高劑量(例如，5份每份1ml濃縮的外體)。
14.4用濃縮的外體治療人類對象14.4.1實施例A外體治療前的狀態(tài)對象是22歲的男性，患有青少年型類風濕性關節(jié)炎(Oligo-II型，伴有骶髂關節(jié)炎、髖關節(jié)炎、膝關節(jié)炎，HLA-B 27陽性)約10年。曾經(jīng)用每周10mg MTX和每周5mg去氧皮質(zhì)酮對他進行治療，但他的右膝仍嚴重疼痛和腫脹；向其腫脹的關節(jié)注射類固醇沒有任何改進。
在外體治療前先作檢查，對象血壓為90/60mm Hg，肩活動性減退，外展50度。兩膝都嚴重腫脹，伸直不足為10度。對對象膝蓋進行X射線研究證明有積液但無顯著軟骨損傷，其髖部X射線研究顯示有IV度軟骨損傷并指出接受過髖關節(jié)成形術(shù)。驗血顯示CRP 9.9mg/dl；BSR 59；RF、CCP-AK和ANA均呈陰性。貧血11.3，血細胞511000μl。
總之，對象表現(xiàn)出嚴重的青少年型關節(jié)炎的臨床癥狀，且常規(guī)治療無法治愈。
外體治療。如上文14.3所述從自體外周血制備外體。由于右膝是非常疼痛、腫脹且主要影響的關節(jié)，決定注射右關節(jié)。治療目標是減輕右膝腫脹和疼痛以及對受到影響的其它關節(jié)產(chǎn)生療效。向右膝關節(jié)內(nèi)注射1ml從20ml經(jīng)調(diào)理的血清制備的濃縮的外體，未出現(xiàn)并發(fā)癥。
注射4周后兩膝疼痛100％減輕，兩膝的WOMAC評分顯著降低，且雙肩的疼痛100％減輕。CRP水平降至6mg/dl，相比治療前的值，右膝腫脹減少3cm?；颊邔Y(jié)果非常滿意。
第一次注射濃縮的外體9周后，向右膝第二次注射1ml制備自20ml調(diào)理血清的濃縮外體，并向左肩關節(jié)和左膝關節(jié)分別關節(jié)內(nèi)注射1ml制備自20ml調(diào)理血清的濃縮外體。發(fā)現(xiàn)右膝得到100％改善，左膝顯示70％改善，肩膀顯示80％改善。
第二次注射4周后(第一次注射13周后)，再用濃縮的外體治療。
治療后，通過獨立風濕病學家的評價可以證實，患者的青少年型類風濕性關節(jié)炎得到緩解。因此，濃縮外體治療相比MTX和類固醇在緩解疾病進程上似乎更加有效。
14.4.2實施例B外體治療前的狀態(tài)對象是65歲的男性，患有血清陽性類風濕性關節(jié)炎10年。他母親也受該病折磨。對象有嚴重膝痛，Kellgreen顯示有III-IV級軟骨降解。MCP檢查顯示手關節(jié)疼痛，肩運動疼痛減輕，左膝積液，兩側(cè)髖內(nèi)部旋轉(zhuǎn)下降。驗血顯示SR 28/65；CRP 0.8mg/ml；RF 211 U/ml；ANA陰性，白細胞7900，血小板353000。X射線研究顯示手有II級RA，膝蓋有III-IV級RA。對象曾用金療法治療，在外體治療期間繼續(xù)接受金療法。
外體治療如14.3所述從自體外周血制備外體。兩膝關節(jié)內(nèi)各注射1ml制備自20ml調(diào)理血清的濃縮外體，未出現(xiàn)不良副作用。
注射4周后，重新檢查患者，發(fā)現(xiàn)他在整個觀察期非常良好地耐受了治療。相比治療前的值其癥狀改善了98％。WOMAC評分顯示異常顯著的良好測量結(jié)果(50-80％)。相比治療前的值腫脹完全消失，外體治療后關節(jié)直徑減小了2cm。
4周后，相比外體治療前的狀態(tài)，左膝疼痛復發(fā)約50％，右膝約30％。向兩膝分別第二次關節(jié)內(nèi)注射1ml制備自20ml調(diào)理血清的濃縮外體。2周后，向兩膝分別第三次注射1ml制備自20ml調(diào)理血清的外體，相比濃縮外體治療前的疼痛狀態(tài)，此時兩膝改善了70％。
2個月后患者表示兩膝疼痛相比外體治療前改善了80％。WOMAC評分相比治療前的值繼續(xù)顯著改善。
14.4.3實施例C外體治療前的狀態(tài)患者是20歲的女性，患有青少年型Morbus Still(已知8年)，伴有膝攣縮、兩側(cè)髖內(nèi)假體、兩側(cè)側(cè)膝軟骨降解、骨質(zhì)疏松和心包心肌炎。她曾經(jīng)接受長期類固醇治療，認為用例如抗TNF、類固醇、MTX及其組合難以治愈她的疾病。驗血顯示CRP 20mg/ml，BSR 98，所有其它參數(shù)都證實有嚴重免疫缺陷；白細胞增多為22900/nl，血小板增多為560000/nl。由于缺乏療效，對象選擇放棄她之前的治療，之后半年血液參數(shù)基本未變。CRP值在12.3和11.5mg/ml之間，白細胞增多為22300/nl。濃縮外體治療期間為給予其它臨床治療形式。
外體治療。如14.3所述從自體外周血制備外體。向兩膝分別關節(jié)內(nèi)注射1ml制備自20ml調(diào)理血清的濃縮外體，未出現(xiàn)并發(fā)癥。
2周后，向兩肩分別關節(jié)內(nèi)注射1ml制備自20ml調(diào)理血清的濃縮外體，無并發(fā)癥。
第一次注射4周后，患者表示，相比治療前的值，左肩疼痛改善100％，右肩改善70％，兩膝改善100％。
第一次注射8周后，向右肩關節(jié)內(nèi)注射1ml制備自20ml調(diào)理血清的濃縮外體。
第一次注射15周后，CRP從12.3mg/ml降至8.3mg/ml，對象報告說她的膝蓋好轉(zhuǎn)80％，肩好轉(zhuǎn)60％。
第一次注射16周后，向兩膝關節(jié)內(nèi)注射濃縮外體。對象報告說膝和肩改善了80％，并聲稱其它關節(jié)也有50％以上的改善?；颊弑硎?，考慮到濃縮外體治療后的改善，她不會再繼續(xù)常規(guī)治療。
第一次注射外體7個月后，患者經(jīng)歷了有益臨床效果略微減退，并決定以增加外體劑量6倍。此時，CRP為8.6mg/ml，白細胞為22500/nl。向兩肩分別關節(jié)內(nèi)注射高劑量外體，即制備自100ml調(diào)理血清的5ml濃縮外體。
1周后，患者發(fā)現(xiàn)相比開始高劑量外體注射前改善了80％，肩運動得到改善，能外展30度；同時膝和手改善了50％。盡管只對肩進行了高劑量注射，但膝的WOMAC評分戲劇性地提高了50％以上。CRP降至7.2mg/dl，白細胞降至18800/ml。
14.4.4實施例D外體治療前的狀態(tài)患者49歲，有18年花粉熱史并證實對草和花粉過敏。
外體治療。如14.3所述從自體外周血制備外體。通過皮下注射給予5ml制備自100ml調(diào)理血清的濃縮外體，2周后，諸如打噴嚏和眼鼻發(fā)炎等花粉熱癥狀顯著減輕。打噴嚏的頻率從每天124次降至每天0次。效果在花粉熱季節(jié)持續(xù)。治療未造成任何不良副作用。
14.5采用Orthokine血清進行的其它臨床研究如上文14.1節(jié)和Meier等(Inflam Res.521-4(2003))的描述制備血清。對這些患者未使用其它外部IL-1ra，且未采用100000g離心步驟濃縮外體。因此，除未濃縮的外體群體還存在自體細胞因子和生長因子。
通過每周兩次向各受影響的RA關節(jié)注射Orthokine血清(2ml/注射)、共注射4-6次來治療56名之前用常規(guī)療法治療過或之前未治療過的類風濕性關節(jié)炎和手關節(jié)改變的患者。臨床隨訪最多持續(xù)4年。相比治療前的值，3個月后的平均疼痛改善為65.31％SE 7.00。響應率(responder rate)為68.8％，說明3個月后，這些患者受影響關節(jié)的疼痛相比注射前的值至少改善了50％。平均而言，這些值的下降是治療后時間的函數(shù)。向受影響的關節(jié)再同時注射類固醇相比Orthokine血清注射對3個月的療效沒有有益的、統(tǒng)計上顯著的效果。未發(fā)生副作用。
本發(fā)明不限于這里具體描述的實施方案。實際上，除這里描述的實施方案外，通過上面的描述和附圖，本發(fā)明的各種修飾是精通本領域的技術(shù)人員顯見的。這種修飾在附加權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
這里應用的各種公開的內(nèi)容被全文納入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種在需要抑制免疫應答的對象中抑制免疫應答的方法，所述方法包括，給予所述對象有效量的從抗原呈遞細胞培養(yǎng)物制備的外體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原呈遞細胞被暴露于培養(yǎng)物中的增強劑。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原呈遞細胞經(jīng)基因工程改造以表達所述增強劑。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述抗原呈遞細胞是樹突細胞。
5.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述增強劑是IL-4。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述增強劑是IL-4。
7.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述增強劑是IL-10。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述增強劑是IL-10。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述增強劑是FasL。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述增強劑是FasL。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答表現(xiàn)為關節(jié)炎。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述是類風濕性關節(jié)炎。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答是與創(chuàng)傷相關的炎癥。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答表現(xiàn)為變態(tài)反應。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答表現(xiàn)為哮喘。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答表現(xiàn)為I型糖尿病。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答是自身免疫應答。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述自身免疫應答表現(xiàn)為選自下組的自身免疫疾病類風濕性關節(jié)炎、青少年型類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、舍格倫綜合征、I型糖尿病、韋格納肉芽腫病、多發(fā)性硬化、克羅恩病、銀屑病、格雷夫斯病、口炎性腹瀉、斑禿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、古德帕斯丘綜合征、自身免疫性溶血性貧血、格-巴二氏綜合征、結(jié)節(jié)性多動脈炎、特發(fā)性血小板性紫癜、巨細胞動脈炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、阿狄森病、強直性脊柱炎、萊特爾綜合征、大動脈炎和白癲風。
19.一種在需要抑制免疫應答的對象中抑制免疫應答的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的從血清制備的濃縮的外體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，用于制備血清的外周血在有玻璃珠存在的條件下培育過。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，在有玻璃珠存在的條件下培育之前在所述外周血中加入增強劑。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述增強劑是白細胞介素1受體拮抗蛋白。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答表現(xiàn)為關節(jié)炎。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述關節(jié)炎是類風濕性關節(jié)炎。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答是與創(chuàng)傷相關的炎癥。
26.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答表現(xiàn)為變態(tài)反應。
27.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答表現(xiàn)為哮喘。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答表現(xiàn)為I型糖尿病。
29.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述要抑制的免疫應答是自身免疫應答。
30.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述自身免疫應答表現(xiàn)為選自下組的自身免疫疾病類風濕性關節(jié)炎、青少年型類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、舍格倫綜合征、I型糖尿病、韋格納肉芽腫病、多發(fā)性硬化、克羅恩病、銀屑病、格雷夫斯病、口炎性腹瀉、斑禿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、古德帕斯丘綜合征、自身免疫性溶血性貧血、格-巴二氏綜合征、結(jié)節(jié)性多動脈炎、特發(fā)性血小板性紫癜、巨細胞動脈炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、阿狄森病、強直性脊柱炎、萊特爾綜合征、大動脈炎和白癲風。
31.一種包含外體的組合物，所述外體通過在存在增強劑時培養(yǎng)抗原呈遞細胞并從培養(yǎng)物上清收集外體而制備。
32.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是細胞因子。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述增強劑選自白細胞介素4或白細胞介素10。
34.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是細胞因子抑制劑。
35.如權(quán)利要求34所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是白細胞介素-1受體拮抗蛋白。
36.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是NFκB抑制劑。
37.一種包含外體的組合物，所述外體通過培養(yǎng)經(jīng)改造以表達增強劑的抗原呈遞細胞并從培養(yǎng)物上清收集外體而制備。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是細胞因子。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述增強劑選自白細胞介素4或白細胞介素10。
40.如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是細胞因子抑制劑。
41.如權(quán)利要求40所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是白細胞介素-1受體拮抗劑蛋白。
42.如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是FasL。
43.一種包含外體的組合物，所述外體通過從血清收集外體而制備。
44.一種包含外體的組合物，所述外體通過從血清收集外體來制備，所述血清制備自外周血樣品，所述外周血樣品與玻璃珠一起培育過。
45.如權(quán)利要求44所述的組合物，其特征在于，在培育的外周血樣品中加入增強劑。
46.如權(quán)利要求45所述的組合物，其特征在于，所述增強劑是白細胞介素1受體拮抗蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于介導免疫抑制反應的方法和組合物。本發(fā)明的組合物包含具有免疫抑制活性的外體。這種外體可衍生自各種不同細胞類型，其中包括抗原呈遞細胞，如樹突細胞和巨噬細胞。分離外體之前可通過基因工程改造細胞以使其表達能夠增強所述外體免疫抑制活性的分子，和/或使細胞接觸一種或多種試劑，如細胞因子或細胞因子抑制劑，這樣也能夠增強外體的免疫抑制活性。本發(fā)明還涉及這些外體在治療與免疫系統(tǒng)不希望的活化有關的疾病和病癥中的應用。本發(fā)明還包括直接分離自己顯示被免疫抑制的血清的外體。
文檔編號A61K39/38GK101022824SQ200580022591
公開日2007年8月22日 申請日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月1日
發(fā)明者P·D·羅賓斯, 金善嬉, P·韋林 申請人:匹茲堡大學聯(lián)邦系統(tǒng)高等教育, 奧索根股份公司