專利名稱：：干擾素-α多肽和偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及多核苷酸及其編碼的多肽，多肽的偶聯(lián)物，以及載體，細胞，抗體和使用及制備該多核苷酸，多肽和偶聯(lián)物的方法。
背景技術(shù)：
：干擾素-oc是多種細胞因子基因螺旋束超家族的成員(Sprang,S.R.等(1993)Curr.Opin.Struct.Biol.3:815-827)。人干擾素-a由含有20多個串聯(lián)復(fù)制的非等位基因以及假基因的家族編碼，這些人干擾素-a在氨基酸水平上有85-98%的序列同一性(Henco,K.等(1985)J.Mol.Biol.185:227-260)。表達活性干擾素-a蛋白質(zhì)的基因可根據(jù)基因座分為13個家族。已知表達的人干擾素-a蛋白質(zhì)及其等位基因變體公開于AllenG.andDiazM.O.(1996)J.InterferonAndCytokineRes.16:181-184中。干擾素-a可抑制多種類型的細胞增生，具體可用于治療多種細胞增生性疾病，這些疾病常常與癌癥，具體是血液學(xué)惡性疾病諸如白血病相關(guān)。這些蛋白質(zhì)顯示出對以下疾病的抗增生活性多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病、低級淋巴瘤、卡波西肉瘤、慢性髓性白血病、腎細胞癌、尿道膀胱腫瘤和卵巢癌(Bonnem,E.M.等(1984)J.Biol.ResponseModifiers3:580;Oldham,R.K(1985)HospitalPractice20:71)。干擾素-a也可用于抗多種類型的病毒感染(Finter,N.B等(1991)Drugs42(5):749)。千擾素-a還顯示出抗人乳頭瘤病毒感染，乙肝病毒和丙肝病毒感染的活性(Finter,N.B.等，1991,文獻同上；Kashima,H等(1988)Laryngoscope98:334;Dusheiko,G.M.等(1986)J.Hematology3(增刊2):S199;Davis,GL等(1989)N.EnglandJ.Med.321:1501)。另外，還研究了干擾素和干擾素受體在一些自身免疫和炎性疾病的發(fā)病機理中的作用(Benoit,P.等(1993)J.Immunol.150(3):707)。盡管這些蛋白質(zhì)對多種疾病都有治療價值，但尚未使它們最優(yōu)化以用作藥物。例如，劑量限制性毒性、受體交叉反應(yīng)性和短的血清半壽期顯著減少了多種此類細胞因子的臨床應(yīng)用(Dusheiko,G.(1997)Hepatology26:112S-121S;Vial,T.andDescotes，J.(1994)DrugExperience10:115150;Funke，I.等(1994)Ann.Hematol.68:49-52;Schomburg，A.等(1993)J.CancerRes.Clin.Oncol.119:745-755)。與施用干擾素相伴的多種多樣的嚴重副作用"i普(profile)包括流感樣癥狀，疲勞，幻覺，發(fā)熱，肝酶升高和白細胞減少(Pontzer,C.H.等(1991)CancerRes.51:5304;Oldham，1985，文獻同上)。丙型肝炎病毒(HCV)是非宿主整合型RNA病毒，其具有非常高的復(fù)制率，因此其伴隨高度遺傳多樣性。已經(jīng)鑒定了HCVRNA的至少六種基因型和超過30種亞型。HCV基因型是IFN-a治療的預(yù)測物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)感染HCV基因型2和3的患者通常對干擾素治療反應(yīng)良好。感染基因型4，5和6的患者傾向于反應(yīng)較差。感染HCV基因型1的患者傾向于對干擾素治療反應(yīng)非常差，大約50%的基因型1患者被歸類為對IFN-a治療的"無反應(yīng)者"?；蛐蚻是丙型肝炎目前最普遍的形式，在美國的感染患者中占大約為70%而在歐洲為50%。4艮明顯，迫切需要對HCV，特別是基因型l種型感染的更有效治療。遺傳和生物化學(xué)證據(jù)顯示基因型1HCV(和其它亞型)通過抑制關(guān)鍵IFN反應(yīng)性蛋白質(zhì)諸如dsRNA活化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PKR而主動地減弱IFN-a信號通路(KatzeM.G.,等,(2002)Nat.Rev.Immunol.2(9):675-687)。作為該遺傳多樣性和抗病毒反應(yīng)的主動抑制的可能結(jié)果，HCV(具體是基因型l)具有逃脫宿主免疫監(jiān)視的能力，這導(dǎo)致高比率的慢性感染。HCV的廣泛遺傳異質(zhì)性存在嚴重的診斷和臨床問題，可能導(dǎo)致臨床過程的改變，疫苗發(fā)展中的困難，以及缺乏對治療的反應(yīng)。本發(fā)明說明了對表現(xiàn)增強的抗病毒和/或免疫調(diào)節(jié)效力的干擾素-a分子的需要。本發(fā)明提供了新的干擾素-a多肽和多肽偶聯(lián)物，編碼所述多肽的核酸，和使用所述分子的方法。所述分子將在多種應(yīng)用中有益，包括例如，治療性和預(yù)防性處理，具體是針對病毒感染以及與病毒感染有關(guān)的疾病。本發(fā)明滿足這些及其它需要。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了新的多肽，包括其變體和含有所述多肽的融合蛋白。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明多肽的偶聯(lián)物，所述多肽與一個或多個非多肽部分共價連接。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明任何多肽的核酸，以及包含所述核酸的載體和宿主細胞。此外，本發(fā)明提供了制備和使用所述多肽、偶聯(lián)物和核酸的方法，以及根據(jù)進一步描述而顯而易見的其它特征。一方面，本發(fā)明提供了分離的或重組的多肽，該多肽包含被鑒定為SEQIDNO:2-35和SEQIDNO:37-44之一的序歹'J(諸如SEQIDNO:2，SEQIDNO:3,SEQIDNO:4，SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:IO,SEQIDNO:ll,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16，SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19，SEQIDNO:20,SEQIDNO:21，SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24，SEQIDNO:25,SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30，SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35，SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41,SEQIDNO:42，SEQIDNO:43和SEQIDNO:44之一)。本發(fā)明還提供了含有上述任何一種多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的核酸以及制備和使用所述多肽的方法。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:l在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:l而言，含有選自下列的一個或多個取代F48A/L;V51P;F55A;F65A;F68P;L111A和V114P。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:l在1，2,3,4,5,6，7,8,9，10，11,12，13，14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，1-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，1-5個氨基酸位置，1-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或l-2個氨基酸位置中不同的序列。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;V51A;Q52P/E;A53T;F55S;L56V;F57L;Y58H;M61I;N113K;V114E和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。本發(fā)明還提供了含有上述任何一種多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的核酸以及制備和使用所述多肽的方法。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:13在0-16個氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一個或多個第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第111位的Ala和第114位的Pro(相對于SEQIDNO:13的位置編號)。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:13在0，1，2,3，4,5,6,7，8,9，10，11,12,13,14，15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在0-15個氨基酸位置，0-14個氨基酸位置，0-13個氨基酸位置，0-12個氨基酸位置，0-ll個氨基酸位置，0-10個氨基酸位置，0-9個氨基酸位置，0-8個氨基酸位置，0-7個氨基酸位置，0-6個氨基酸位置，0-5個氨基酸位置，0-4個氨基酸位置，0-3個氨基酸位置，0-2個氨基酸位置或0-l個氨基酸位置中不同的序列。一些這樣的多肽在第48位含有Ala或Leu。一些這樣的多肽在第48位含有Ala。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:13而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;V51A;Q52P/E;A53T;F55S;L56V;F57L;Y58H;M61I;N113K;V114E和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些這樣的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，以及編碼所述多肽的分離或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:36而言，含有選自下列的一個或多個取代M21A;I24P;F48A/L;T51P;S55A;F65A;F68P;F90A;M93P;L111A;V114P;F124A;I127P和E160D。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:36在1，2，3,4,5,6,7,8,9，10,11,12，13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，1-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:36而言，還含有選自下列的一個或多個取代P26L;H47Q;T51V;S55P/F;V56L;H58Y;L60M;F90Y;M93L;N95D;N113K;V114E;R125Q;T132K和L154F。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。本發(fā)明還提供了含有上述任何一種多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的核酸以及制備和使用所述多肽的方法。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:38在0-16個氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一個或多個第21位的Ala;第24位的Pro;第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第90位的Ala;第93位的Pro;第111位的Ala;第114位的Pro;第124位的Ala;第127位的Pro;和第160位的Glu(相對于SEQIDNO:38的位置編號)。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:38在0，1,2,3,4,5,6,7，8,9，10，11,12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在0-15個氨基酸位置，0-14個氨基酸位置，0-13個氨基酸位置，0-12個氨基酸位置，0-11個氨基酸位置，0-10個氨基酸位置，0-9個氨基酸位置，0-8個氨基酸位置，0-7個氨基酸位置，0-6個氨基酸位置，0-5個氨基酸位置，0-4個氨基酸位置，0-3個氨基酸位置，0-2個氨基酸位置或0-l個氨基酸位置中不同的序列。一些這樣的多肽在第48位含有Ala或Leu。一些這樣的多肽在第48位含有Ala。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:38而言，還含有選自下列的一個或多個取代P26L;H47Q;V51T;F55P/S;L56V;Y58H;L60M;F90Y;M93L;N95D;N113K;V114E;R125Q;T132K和F154L。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些這樣的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的核酸以及制備和使用所述多肽的方法。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其包含本發(fā)明的多肽，諸如上述任何本發(fā)明的多肽以及至少一種與所述多肽的連接基團相連接的非多肽部分，其中所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出干擾素-a活性。在一些情況下，非多肽部分是聚合物(諸如聚環(huán)氧烷分子，如聚乙二醇(PEG),如單曱氧基聚乙二醇(mPEG)),或糖部分。例如，所述至少一種非多肽部分可與半胱氨酸、賴氨酸、所述多肽的N-末端氨基或所述多肽的體內(nèi)糖基化位點連接。本發(fā)明還提供了制備和使用所述偶聯(lián)物的方法。本發(fā)明還提供了分離的或重組的核酸，該核酸編碼本發(fā)明的任何多肽。本發(fā)明還提供了包含所述核酸的載體和宿主細胞，以及制備本發(fā)明多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)含有所述核酸的宿主細胞。另一方面，本發(fā)明提供了抑制感染了病毒的細胞中的病毒復(fù)制的方法，該方法包括將感染了病毒的細胞與本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物相接觸。本發(fā)明還提供了降低感染了病毒的細胞中的病毒拷貝數(shù)量的方法，該方法包括將感染了病毒的細胞與本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物相接觸。另一方面，本發(fā)明提供了治療對干擾素-a有反應(yīng)的疾病的方法，所述方法包括給受疾病折磨的受試者施用有效量的能緩解疾病相關(guān)癥狀的組合物，所述組合物含有本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的偶聯(lián)物。所述疾病包括慢性丙型肝炎感染、慢性乙型肝炎感染、多毛細胞白血病、惡性黑素瘤、濾泡性淋巴瘤、尖銳濕疣、與AIDS-相關(guān)的卡波西肉瘤、非何杰金氏淋巴瘤、慢性髓性白血病、基細胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤、膀胱癌、節(jié)段性回腸炎、皮膚T細胞淋巴瘤、腎細胞癌、多發(fā)性硬化和AIDS。以下詳細的描述聯(lián)同附圖將更為清楚地顯示本發(fā)明的這些以及其它目的和特征。圖1A和1B顯示了IFN-ot治療后感染了HCV的細胞的病毒清除二相時程(biphasictimecourse)(A.無反應(yīng)者(Nonresponder)動力學(xué)；B.反應(yīng)者(responder)動力學(xué))。圖2顯示了本發(fā)明多肽的序列(SEQIDNO:13)與以下人干擾素-a(huIFN-a)多肽序列的比對huIFN-ala(SEQIDNO:45)，huIFN-a2b(SEQIDNO:46),huIFN-a4b(SEQIDNO:48)，huIFN-a5(SEQIDNO:49)，huIFN-a6(SEQIDNO:50)，huIFN-a7(SEQIDNO:51),huIFN-a8b(SEQIDNO:52)，huIFN-a10a(SEQIDNO:53)，huIFN-a14a(SEQIDNO:54),huIFN-al6(SEQIDNO:55),huIFN-a17b(SEQIDNO:56)和huIFN-a21b(SEQIDNO:57)。huIFN-a序列的命名原則參照AllenG.和DiazM.O.(1996)J.InterferonandCytokineRes.16:181-184。SEQIDNO:45-46和48-57中與SEQIDNO:13相同的氨基酸殘基位置用點(.)標(biāo)示，而序列中的缺口用短線(-)標(biāo)示。圖3顯示了本發(fā)明多肽的序列(SEQIDNO:38)與人干擾素-a多肽序列SEQIDNO:45-46和48-57的比對。SEQIDNO:45-46和48-57中與SEQIDNO:38相同的氨基酸殘基位置用點(.)標(biāo)示，而序列中的缺口用短線(-)標(biāo)示。圖4顯示了BLOSUM62取代矩陣。圖5A,5B和5C顯示了計算用于測定最佳序列比對的比對評分實例，其中采用如下參數(shù)BLOSUM62矩陣，缺口開放罰分=11，缺口延伸罰分=1。圖6和7顯示了分別-故稱為OripBR-URA3-lacI_14epil8-mut2和OripBR-URA3-lacI—25epil9-mut的大腸桿菌表達載體。圖8顯示了經(jīng)由陽離子交換HPLC分離例舉的PEG化干擾素-a偶聯(lián)物的位置異構(gòu)體。圖9顯示了圖8陽離子交換HPLC分離級分的SDS—PAGE凝膠。發(fā)明詳述定義除非本說明書其余部分的上下文中另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般理解的含義相同。根據(jù)上下文，"多肽序列"(例如蛋白質(zhì)，多肽，肽等)是氨基酸的聚合物，其中包含天然的氨基酸或人工氨基酸類似物，或代表氨基酸聚合物的字符串。根據(jù)遺傳密碼的簡并性，編碼具體多肽序列的一種或多種核酸，或其互補核酸可從該多肽序列來確定。根據(jù)上下文，"多核苷酸序列"(例如，核酸，多核苷酸，寡核苷酸等)是核苷酸的聚合物，其中包含核苷酸A,C,T,U,G,或者是其它天然核苷酸或人工核芬酸類似物，或代表核酸的字符串。由任何具體的多核苷酸序列可確定給定的核酸或其互補核酸。當(dāng)任何給定聚合物組分(如氨基酸，核苷酸，也在類屬上稱為"殘基")的位置通過參照選定氨基酸或核酸聚合物中的相同或等效位置，而不是給定聚合物中的組分的實際編號位置來命名時，給定氨基酸聚合物或核苷酸聚合物的編號"相應(yīng)于"或"對應(yīng)于"選定氨基酸聚合物或核酸聚合物的編號。因此，例如給定多肽序列中給定位置氨基酸的編號對應(yīng)于用作參照序列的選定多肽序列中的相同或等效氨基酸位置。"等效位置(equivalentposition)"(例如，"等效氨基酸位置，，或"等效核酸位置"或"等效殘基位置")在本文中被定義為受試多肽(或受試多核苷酸)序列中的位置(諸如，氨基酸位置或核酸位置或殘基位置)，當(dāng)采用本文所述的比對算法進行最佳比對時，其與參照多肽(或參照多核苷酸)序列的相應(yīng)位置相對應(yīng)。受試多肽的等效氨基酸位置無須具有與參照多肽的相應(yīng)位置相同的位置編號；類似地，受試多核苷酸的等效核酸位置無須具有與參照多核芬酸的相應(yīng)位置相同的位置編號。作為實例，圖2顯示了與多種已知人千擾素-a多肽序列最佳對應(yīng)的本發(fā)明多肽的序列(SEQIDNO:13)。在該實例中，SEQIDNO:13的氨基酸位置48被認為是SEQIDNO:46(huIFN-a2b)的氨基酸位置47的等效氨基酸位置(即"與其等效")，因為SEQIDNO:13的第48位氨基酸與SEQIDNO:46的第47位氨基酸相對應(yīng)。換言之，SEQIDNO:13的第48位氨基酸"對應(yīng)于"SEQIDNO:46的第47位氨基酸。類似地，SEQIDNO:13中的殘基A48(Ala48)被認為對應(yīng)于例如SEQIDNO:1中的殘基F48(Phe48)，由此例如相對于SEQIDNO:13的取代A48L被認為對應(yīng)于相對于例如，SEQIDNO:1中的取代F48L(等等)。當(dāng)使用限定的參數(shù)，即限定的氨基酸取代矩陣、缺口存在罰分(也被稱為缺口開放罰分)和缺口延伸罰分比對兩個多肽序列，以至于達到序列配對所可能達到的最高相似性評分時，即可認為這兩個序列被"最佳比對"。在多肽序列比對算法(如BLASTP)中，BLOSUM62矩陣(HenikoffandHenikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(22):10915-10919)常被用作缺省評分取代矩陣。在一個被比對的序列中導(dǎo)入單個氨基酸缺口應(yīng)加上缺口存在罰分，缺口中的每個殘基位置都要加上缺口延伸罰分。除非另有說明，本文所用的比對參數(shù)是BLOSUM62評分矩陣、缺口存在罰分=11和缺口延伸罰分=1。比對評分由每個序列中比對開始和結(jié)束處的氨基酸位置(例如比對窗口)限定，任選由一個或兩個序列中一個或多個缺口的插入限定，以至于達到可能的最高相似性評分，下文題為"序列同一性百分比"的小節(jié)中將對此進行更詳細的描述。用于鑒定氨基酸位置和氨基酸取代的命名方法描述如下F48表示參照氨基酸序列例如SEQIDNO:l中第48位被苯丙氨酸(Phe)殘基占據(jù)。F48A表示第48位苯丙氨酸殘基被丙氨酸(Ala)殘基取代?？蛇x的取代用"/"表示，例如，F(xiàn)48A/L是指這樣的氨基酸序列，其中第48位的苯丙氨酸殘基被丙氨酸或亮氨酸殘基取代。多重取代有時可用"+"表示，例如H47Q+F48A/L是指這樣的氨基酸序列，其中包含第47位組氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代以及第48位的苯丙氨酸殘基被丙氨酸或亮氨酸殘基取代。缺失用星號表示，例如，H47+表示第47位組氨酸殘基缺失。兩個或多個連續(xù)氨基酸的缺失可如下表示，例如，R16"-E166承表示殘基R161-E166包含性(inclusive)缺失(即，殘基161，162,163,164，164和166缺失)。插入按如下方式表示將在第47位組氨酸殘基后其它絲氨酸殘基的插入表示為H47HS。聯(lián)合取代和插入按如下方式表示第47位組氨酸殘基被絲氨酸殘基的取代且第47位氨基酸殘基后丙氨酸殘基的插入表示為H47SA。除非另有所述，本文所述氨基酸殘基的位置編號均相對于氨基酸序列SEQIDNO:1。應(yīng)當(dāng)理解雖然親本多肽的實例和修飾通常在本文中相對序列SEQIDNO:1(或相對于其它具體序列)給出，關(guān)于本文所述本發(fā)明的其它多肽的實例和修飾可在本文所述任何其它多肽的等效氨基酸位置中進行。因此，例如相對于SEQIDNO:1的取代F48L被認為對應(yīng)于SEQIDNO:13中的取代A48L，等等。術(shù)語"表現(xiàn)出(例如表現(xiàn)或具有)干擾素-a活性"意指本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物具有至少一種由參照干擾素-a多肽(諸如人干擾素-a多肽，例如，在本文中鑒定為SEQIDNO:46的huIFN-oc2b，在本文中鑒定為SEQIDNO:47的huIFN-a2a，在本文中鑒定為SEQIDNO:51的hIFN-a8b，或本領(lǐng)域中已知的任何其它干擾素a多肽，例如，AllenG.和DiazM.O.(1996,文獻同上)所列的那些多肽)表現(xiàn)出的活性。所述活性包括通過千擾素-oc受體產(chǎn)生信號的能力，如，例如以下一或多種活性所證明的抑制感染了病毒的細胞中的病毒復(fù)制("抗病毒活性")；增強初始T細胞至TH1表型的分化和/或抑制初始T細胞至Th2表型的分化("Th1分化活性")；或抑制細胞增殖("抗增殖活性")。一種或多種干擾素-a活性可采用本領(lǐng)域已知的和/或?qū)嵤├兴龅臏y定法進行測定。表現(xiàn)出干擾素-a活性的多肽或偶聯(lián)物被認為當(dāng)其顯示可檢測活性(例如，可檢測的抗病毒活性，抗增殖活性，或TH1分化活性)時其具有所述活性(例如，如本領(lǐng)域已知的和/或?qū)嵤├兴龅臏y定法所測定的)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解可檢測活性的構(gòu)成依賴于采取的測定法的特性，但作為一般指導(dǎo)，可檢測的活性是這樣的活性，其中在存在受試化合物(例如，本發(fā)明的多肽)時產(chǎn)生的測定信號的定量與不存在該受試化合物時產(chǎn)生的測定信號的定量不同。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物無須表現(xiàn)出具體參照干擾素-a的所有已知活性，或表現(xiàn)出與參照干擾素-a相同程度的活性。在一些情況下，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物所表現(xiàn)出的活性(例如由EC5o,比活，或其它與活性相關(guān)的值所呈現(xiàn)的)可大約等于，低于，或高于參照干擾素-a表現(xiàn)出的具體活性。"變體"是包含一種序列的多肽，所述序列在一個或多個氨基酸位置中與親本多肽序列不同。例如，變體可包括這樣的序列，該序列與親本多肽序列在該親本多肽序列高達10%的殘基總數(shù)，諸如在高達8%殘基，例如，在該親本多肽序列高達6%,5%，4%,3%,2%或1%的殘基總數(shù)中存在不同。例如，SEQIDNO:l的變體可包括與SEQIDNO:l在1-16個氨基酸位置(諸如1,2,3,4，5,6,7,8，9,10,11,12,13,14,15或16個氨基酸位置)，例如在l-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，1-10個氨基酸位置，1-9個氨基酸位置，1-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，l-3個氨基酸位置，或l-2個氨基酸位置中不同的序列。術(shù)語"親本多肽"或"親本干擾素-a"意指將根據(jù)本發(fā)明而進行修飾的多肽序列。親本多肽序列可以是天然的IFN-a的序列(諸如哺乳動物IFN-a，例如，靈長類IFN-a,諸如人IFN-a,諸如在本文中被鑒定為SEQIDNO:45-57的huIFN-a多肽，或本文所述和/或在AllenG.和DiazM.O.(1996),文獻同上中所述的其它huIFN-a序列)。親本多肽序列可以是非天然的(即"合成的")干擾素-a的序列，諸如IFN-aConl(SEQIDNO:58)。在一些情況下，待修飾的親本多肽自身可以是本發(fā)明的多肽，諸如，SEQIDNO:2-35和SEQIDNO:37-44的任一個。用于對象(object)的"天然的"是指如下事實，天然的該對象與人工制備的不同。例如，存在于生物體(包括病毒，細菌，原生動物，昆蟲，植物或哺乳動物組織)中的多肽或多核苷酸序列，如果可從天然來源中分離并且尚未在實驗室中經(jīng)過有意的人工修飾則是天然的。用于對象的"非天然的"(也稱為"合成的"或"人工的")是指該對象不是天然的，即不能在自然界中發(fā)現(xiàn)該對象不同于人工合成形式的形式。"片段"或"亞序列"是完整序列的任意部分，最多為但不包括完整序列。因此，片段或亞序列是指包括較長的氨基酸(例如，多肽)或核酸(例如，多核苷酸)的部分的氨基酸或核酸的序列。本發(fā)明所涉及的一類片段是這樣的片段，其中從親本多肽的N末端或C末端(或二者)去除氨基酸殘基的片段；所述多肽被分別稱為"N末端截短的"或"C末端截短的"。已知從N末端缺失至少四個氨基酸不會顯著影響干擾素-a活性(Lydon,N.B.,(1985)Biochemistry24:4131-41)。此外，保留干擾素-a活性的變體已得到描述，其中7-11個氨基酸已從C末端缺失(CheethamB.F.,(1991)AntiviralRes.15(1):27-39;ChangN.T"(1983)Arch.BiochemBiophys.221(2):585-589;FrankeA.E"(1982)DNA1(3):223-230)。"受體"例如，"干擾素-a受體"(也稱為"I型干擾素受體")是細胞中被千擾素-a活化的受體，例如，與干擾素-a結(jié)合并起動細胞內(nèi)信號發(fā)生，諸如包含亞單位IFNAR-2和IFNAR-1的I型千擾素受體(Domanski等，(1998)J.Biol.Chem.273(6):3144-3147;Mogensen等，(1999)JournalofInterferonandCytokineResearch,19:1069-1098)。在本文中，受體還意在包括全長受體分子的截短形式，例如缺少膜結(jié)合部分的受體分子，諸如包含細胞外結(jié)合域的受體分子可溶形式(也稱為"可溶性受體")，所述細胞外結(jié)合域結(jié)合干擾素-a,但無須結(jié)合膜和/或起動細胞內(nèi)信號發(fā)生。兩種分子，例如配體和受體之間的"特異性結(jié)合親和力"是指在一種分子優(yōu)先與分子混合物中的另一種分子結(jié)合。如果結(jié)合親和力約為lxl04NT1至約lxlO9M"或更高(即，Ko約為104至10—SM或更低)，則分子的結(jié)合通常被認為是特異性的。配體和受體的結(jié)合親和力可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行檢測。檢測結(jié)合親和力的眾所周知的技術(shù)的非限制性實例包括Biacore技術(shù)(BiacoreAB,Sweden),等溫滴定孩i量熱法(isothermaltitrationmicrocalorimetry)(MicroCalLLC,Northampton,MAUSA),ELISA和FACS。例如，F(xiàn)ACS或其它分選法可用于選擇分子群(諸如，細胞表面呈現(xiàn)的配體)，所述分子群特異性與相關(guān)結(jié)合對成員(諸如受體，例如，可溶性受體)結(jié)合。配體-受體復(fù)合物可通過例如，熒光(例如，通過將復(fù)合物與識別復(fù)合物的熒光抗體反應(yīng))進行檢測和分選。收集與相關(guān)結(jié)合對(例如，受體)結(jié)合的有意義的分子，然后在存在較低濃度受體的情況下進行再分選。通過在存在濃度漸增(示例性濃度數(shù)量級范圍為1C)^M至10-9M,即，l微摩爾OiM)至l毫微摩爾(nM)，或更低，這依賴于配體-受體相互作用的性質(zhì))的受體的情況下實施多次分選，可分離出對受體表現(xiàn)出特異性結(jié)合親和力的有意義的分子群。肽、多肽、蛋白質(zhì)(包括復(fù)合物，例如與天然序列相伴隨的聚合酶和核糖體)、核酸、細胞、合成試劑、細胞雜質(zhì)、細胞組分等)，例如與其所來源的細胞的"。當(dāng)多肽、核酸或其它組分與其天然環(huán)境中的其它組分部分或完全分離或從中部分或完全回收，使得它們在組合物，混合物或組分收集物中作為占優(yōu)勢的種類存在(即以摩爾數(shù)計，它們比組合物中的任何其它各個種類的含量更高)時，所述多肽、核酸或其它組分是分離的。在一些情況下，制備物由大于約60%、70%或75%，一般大于約80%，或優(yōu)選大于約90%的分離的種類組成。"基本上純的"或"分離的"核酸(例如RNA或DNA)、多肽、蛋白質(zhì)或組分也指目標(biāo)種類(例如核酸或多肽)占所存在的所有大分子種類之重量(以摩爾計)的至少約50,60或70%?；旧霞兊幕蚍蛛x的組分也可以占組合物中所存在的所有大分子種類之重量的至少約80,90或95%。分離的目的雜質(zhì)種類)，其中所述組分基本由單一大分子種類的衍生物組成。術(shù)語"純化的"通常是指在電泳凝膠中通常基本上產(chǎn)生一條帶的核酸，多肽，或蛋白質(zhì)。其通常是指核酸，多肽，或蛋白質(zhì)的純度為至少約50%,60%,70%，75%,更優(yōu)選至少約85%，最優(yōu)選至少約99%。術(shù)語"分離的核酸"可以指這樣的核酸(如DNA或RNA),其不與^f汙生出本發(fā)明核酸的生物體的天然基因組中與該核酸緊鄰的兩個編碼序列(即一個在5，末端，一個在3，末端)相緊鄰。因此，該術(shù)語包括例如通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或限制性內(nèi)切核酸酶處理而產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段，而不論該cDNA或基因組DNA片段是被摻入載體，整合至與其所來源的生物體相同或不同物種(包括例如病毒)的基因組中，還是與其它編碼序列連接形成編碼嵌合多肽的雜合基因，或者是不依賴于任何其它DNA序列。DNA可以是雙鏈或單鏈，有義或反義。"重組多核苷酸"或"重組多肽"是非天然的多核苷酸或多肽，其可分別包含來自一種以上來源核酸或多肽的核酸或氨基酸序列，所述來源核酸或多肽可以是天然的核酸或多肽，或其自身可經(jīng)過誘變或其它類型的修飾。當(dāng)核酸或多肽為合成的或人工的或經(jīng)改造的，或者衍生自合成的或人工的或改造的蛋白質(zhì)或核酸時，可以說它們是"重組的"。術(shù)語"重組核酸"(例如DNA或RNA)分子指的是例如非天然的核脊酸序列，或通過至少兩個一般不同時出現(xiàn)，彼此不相關(guān)，或者要不然彼此是分開的序列片段的組合(例如人工組合)而制備的核苷酸序列。重組核酸可含有通過將不同來源的和/或人工合成的核酸片段連接在一起或組合起來而形成的核酸分子。"重組多肽"通常分別指由克隆的或重組的基因或核酸產(chǎn)生的多肽。例如，衍生出不同核酸或氨基酸序列的來源多核苷酸或多肽有時具有同源性(即，具有，或編碼具有相同或相似結(jié)構(gòu)和/或功能的多肽)，其通常來自于生物體的不同分離物、血清型、品系、物種或來自不同的疾病狀態(tài)。當(dāng)用于談及例如細胞、多核苷酸、載體、蛋白質(zhì)或多肽時，術(shù)語"重組"一般表示已通過導(dǎo)入異源(或外源)核酸或改變天然核酸來修飾所述細胞、多核苷酸或載體，或者表示已通過導(dǎo)入異源氨基酸來修飾蛋白質(zhì)或多肽，或者表示細胞源自經(jīng)所述修飾的細胞。重組細胞表達在細胞的天然(非-重組)形式中未曾發(fā)現(xiàn)過的核酸序列，或者表達可能會被異常表達、少量表達或根本不表達的天然核酸序列。當(dāng)涉及細胞時，術(shù)語"重組"是指復(fù)制異源核酸或表達由異源核酸編碼的多肽的細胞。重組細胞可包含在天然(非重組)形式的細胞中未被發(fā)現(xiàn)的編碼序列。重組細胞還可包含在天然形式的細胞中。該術(shù)語還包括含有核酸的細胞，所述核酸對已經(jīng)過修飾且未從細胞中去除該核酸的細胞而言是內(nèi)源的；所述修飾包括通過基因取代、定點突變、重組以及相關(guān)技術(shù)獲得的那些。所述方法包括化學(xué)合成方法，核酸區(qū)段的循環(huán)(recursive)序列重組或其它核香酸多樣性的生成方法(例如改組(shuffling)),或通過例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因工程技術(shù)對分離的核酸區(qū)段進行操作。"重組表達的"一般指這樣的技術(shù)，其在體外產(chǎn)生重組核酸，在體內(nèi)，體外或離體將重組核酸轉(zhuǎn)移至細胞中，使該核酸在所述細胞中表達或增殖。"重組表達盒"或簡稱"表達盒"是一種核酸構(gòu)建體，其由重組或合成方法產(chǎn)生，并具有能影響與所述序列相容的宿主中結(jié)構(gòu)基因的表達的核酸元件。表達盒至少包括啟動子以及任選地包括轉(zhuǎn)錄終止信號。通常，重組表達盒包括要被轉(zhuǎn)錄的核酸(例如，編碼所需多肽的核酸)和啟動子。影響表達的其它必需或輔助性的因子也可如本文所述進行使用。例如，表達盒還可包括編碼信號序列的核香酸序列，所述信號序列可指導(dǎo)所表達的蛋白質(zhì)從宿主細胞的分泌。轉(zhuǎn)錄終止信號、增強子和其它可影響基因表達的核酸序列也可被包含在表達盒中。"免疫原"指的是能引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)。免疫原的例子包括例如抗原，在誘導(dǎo)自身免疫病中起作用的自身抗原，和癌細胞上表達的腫瘤-相關(guān)抗原。免疫反應(yīng)通常是指針對試劑，諸如抗原或其片段或編碼所述試劑的核酸產(chǎn)生細胞或抗體介導(dǎo)的反應(yīng)。在一些情況下，所述反應(yīng)包括產(chǎn)生CTL、B細胞或多種類型的T細胞(其可特異性針對表達有意義抗原的抗原呈遞細胞)中的至少一種或其組合。"抗原"是這樣一種物質(zhì)，它能在宿主中引發(fā)抗體形成，或者能產(chǎn)生與所述物質(zhì)反應(yīng)的特異性淋巴細胞群體?？乖话銥閷λ拗鞫詾橥庠吹拇蠓肿?例如蛋白質(zhì)和多糖)。"佐劑"是指能夠增強抗原的免疫刺激特性或藥物的藥理學(xué)作用的物質(zhì)。佐劑可以非特異性地增強針對抗原的免疫反應(yīng)。例如，"弗氏完全佐劑"是一種油和水的乳劑，其包含免疫原，乳化劑和分枝桿菌(mycobacteria)。另一實例，"弗氏不完全佐劑"與之相同，但不含分枝桿菌。載體是便于由選定核酸進行細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染，或在細胞中表達該核酸的成分或組合物。載體包括例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、YAC、細菌、多聚-賴氨酸等。"表達載體"是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體或序列，它具有一系列允許在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄特定核酸的特定核酸元件。表達載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。表達載體一般包括與啟動子可操作相連的待轉(zhuǎn)錄核酸。要被轉(zhuǎn)錄的核酸通常處于啟動子的指導(dǎo)或控制下。"基本上多核苷酸序列的全長"或"基本上多肽序列的全長"指多核苷酸序列或多肽序列長度的至少50%,—般至少約為60%，70%或75%,—4殳至少約為80%，或通常至少約為85%,卯％，91%,92%，93%，94%,95%，96%,97%,98%或99%或更長。術(shù)語"免疫測定法"包括使用抗體或免疫原來結(jié)合或特異性結(jié)合抗原的檢測法。免疫測定法的常見特征在于利用具體抗體的特異性結(jié)合特性來分離、靶向和/或定量抗原。本文所用術(shù)語"受試者"包括但不限于生物體；哺乳動物，包括例如人、非人靈長類動物(如狒狒、猩猩、猴)、小鼠、豬、牛、山羊、兔、大鼠、豚鼠、倉鼠、馬、猴、綿羊或其它非人哺乳動物；非-哺乳動物，包括例如非-哺乳類脊推動物，如鳥類(如雞或鴨)或魚；和非-哺乳類無脊推動物。術(shù)語"藥物組合物"指的是適于給予包括動物或人的受試者以用作藥物的組合物。藥物組合物一般包含有效量的活性劑和載體，包括例如可藥用的載體。術(shù)語"有效量"指的是足以產(chǎn)生所需效果的劑量或量。所需效果包括在所述劑量或量的受體中產(chǎn)生的客觀或主觀的改善。"預(yù)防性治療"是這樣的治療，其被給予未顯示出疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的體征或癥狀，或〗又顯示出疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的早期體;f正或癥狀的受試者，由此該治療的目的在于減輕，防止疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥或減少患疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的可能性。預(yù)防性治療的作用是預(yù)防性地治療疾病或病癥。"預(yù)防活性"指諸如核酸、載體、基因、多肽、蛋白質(zhì)、物質(zhì)或其組合物的藥劑在施用于未顯示出疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的體征或癥狀，或僅顯示出疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的早期體征或癥狀的受試者時，能減輕，防止疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥或減少受試者患疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的可能性的活性。"預(yù)防上有用的"藥劑或化合物(如核酸或多肽)指的是可用于減輕，防止，治療疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥或減少疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的發(fā)生的藥劑或化合物。"治療性治療"是對顯示出疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的癥狀或體征的受試者所施用的治療，其中對所述受試者施用該治療的目的是減輕或消除所述疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的體征或癥狀。"治療活性"指諸如核酸、載體、基因、多肽、蛋白質(zhì)、物質(zhì)或其組合物的藥劑施用于顯示出疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的體征或癥狀的受試者時，能消除或減弱疾病、病理或醫(yī)學(xué)的體征或癥狀的活性。"治療上有用的"藥劑或化合物(如核酸或多肽)指的是可用于減弱，治療或消除疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的所述體征或癥狀的藥劑或化合物。術(shù)語"基因"廣義地指任何與生物學(xué)功能相關(guān)的DNA片段?；虬ㄆ浔磉_所需的編碼序列和/或調(diào)控序列?；蛞舶ǚ?表達型的DNA核酸片段，例如形成其它蛋白質(zhì)的識別序列的片段(例如啟動子、增強子或其它調(diào)節(jié)區(qū))。基因可獲自多種來源，包括由感興趣的來源所克隆的或由已知或預(yù)測的序列信息合成的基因，且可包括被設(shè)計為具有所需參數(shù)的序列。一般說來，下文所用的術(shù)語和下文所述的細胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、核酸化學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)的實驗室方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的和常用的那些術(shù)語和方法。如Sambrook等，分子克隆-實驗室手冊(第2版)，Vol.1-3，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989(下文簡稱為"Sambrook，,)和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等編,CurrentProtocols，GreenePublishingAssociates,Inc和JohnWiley&Sons,Inc(1999年增補)(下文簡稱為"Ausubel")中所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于重組核酸方法、核酸合成、細胞培養(yǎng)方法和轉(zhuǎn)基因摻入，如電穿孔、注射、基因槍、透皮加壓(impressingthroughtheskin)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。一般情況下，根據(jù)說明書進行寡核苷酸合成和純化步驟。一般根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和本文中提供的多篇普通參考文獻進行技術(shù)和方法的操作。其中的方法據(jù)信是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，為了方便讀者，提供了這些方法。本文所用的"抗體"指的是蛋白質(zhì)，其含有一種或多種基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼的多肽。術(shù)語抗體用于意指完整抗體及其結(jié)合片段。公知的免疫球蛋白基因包括k,X,oc,y，5,s和ii恒定區(qū)基因，以及各種免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分為k或X。重鏈被分為Y，ot,S或s,它們反過來也將免疫球蛋白的類型分別限定為IgG，IgM,IgA，IgD和IgE。常見的免疫球蛋白(如抗體)結(jié)構(gòu)單位含有四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對多肽鏈具有一條"輕鏈"(約25kD)和一條"重鏈"(約50-70kD)。每條鏈的N-末端限定約100至IIO或更多個氨基酸的可變區(qū)，所述可變區(qū)主要負責(zé)抗原識別。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈CVH)分別指的是這些輕鏈和重鏈?？贵w包括單克隆抗體、單鏈抗體(包括單鏈Fv(sFv)抗體，其中可變重鏈和可變輕鏈(直接或通過肽接頭)連接在一起，形成連續(xù)的多肽)以及雙抗體(diabody)、三抗體(tribody)、四抗體(tetrabody)(Pack等，(1995)JMolBiol246:28;Biotechnol11:1271;和Biochemistry31:1579)。所述抗體是例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段、通過Fab表達文庫產(chǎn)生的片段等。術(shù)語"表位"是指能夠特異性結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由分子的化學(xué)活性表面簇諸如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并通常具有獨特的三維結(jié)構(gòu)特性以及獨特的電荷特性。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于存在變性溶劑時，與前者的結(jié)合喪失，而與后者的結(jié)合不喪失?？贵w的"抗原-結(jié)合片段"是抗體中與抗原結(jié)合的肽或多肽片段?？贵w中有益于、參與、或影響與抗原的結(jié)合的那些氨基酸形成了抗原-結(jié)合位點。參見Scott,T.A和Mercer,E.I.，ConciseEncyclopedia:BiochemistryandMolecularBiology(deGruyter,第3版,1997)和Watson,J.D等，RecombinantDNA(第2版，1992)[下文筒稱為"Watson,RecombinantDNA"],各文獻均全文引入本文作為參考。術(shù)語"篩選"通常是指鑒定本發(fā)明最優(yōu)分子，例如本發(fā)明的多肽，和包含其的相關(guān)融合多肽，和編碼所有所述分子的核酸的過程。各種分子的數(shù)種特性可用于選擇和篩選中，例如各分子結(jié)合配體或受體的能力，抑制細胞增殖的能力，抑制感染了病毒的細胞中的病毒復(fù)制的能力，誘導(dǎo)或抑制細胞細胞因子產(chǎn)生的能力，改變免疫反應(yīng)的能力，例如，在受試系統(tǒng)或體外，離體或體內(nèi)應(yīng)用中誘導(dǎo)或抑制所需免疫反應(yīng)。在抗原的情況下，抗原的數(shù)種特性可用于選擇和篩選中，包括抗原表達、折疊、穩(wěn)定性、免疫原性和對數(shù)種相關(guān)抗原表位的呈遞。"選擇"是一種篩選方式，其中鑒定和物理分離同時進行，例如，通過表達選擇標(biāo)志，該標(biāo)志在一些遺傳環(huán)境下能使細胞表達該標(biāo)志而存活但其它細胞則死亡(或反之)。篩選標(biāo)記物包括，例如螢光素酶、(3-半乳糖苷酶和綠色熒光蛋白等。選擇標(biāo)志包括藥物和抗毒素性基因等。其它形式的選擇包括的基于可檢測事件的物理分選，所述事件諸如配體與受體的結(jié)合，底物與酶的反應(yīng)，或任何其它直接(例如，通過使用顯色型底物或配體)或間接(例如，通過與顯色性第二抗體反應(yīng))產(chǎn)生可^r測信號的物理過程。通過物理分選的選擇可通過多種方法實現(xiàn)，例如通過在全細胞或微滴形式中的FACS。本文所使用的"外源核酸"、"外源DNA區(qū)段"、"異源序列"或"異源核酸"來自于具體宿主細胞以外的來源，或如果來自相同來源，是由其原始形式修飾而來的。因此，宿主細胞中的異源基因包括對具體宿主細胞內(nèi)源的，但未經(jīng)修飾的基因。本文所述在應(yīng)用中對異源序列的修飾通常通過使用重復(fù)序列重組發(fā)生。術(shù)語是指這樣的DNA片段，其是對細胞外源或異源的，或是對細胞同源但位于宿主細胞核酸中通常無該元件的位置。外源DNA片段被表達以生成外源多肽。術(shù)語"核酸"是指是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非有具體限制，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述核苷酸具有與參照核酸相似的結(jié)合特性并以與天然的核苷酸相似的方式進行代謝。除非另有所示，具體核酸序列還隱含地包括其保守性修飾變體(例如，簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指示的序列。具體而言，簡并密碼子取代可通過產(chǎn)生這樣的序列來實現(xiàn)，所述序列中一個或多個選定的(或全部)密碼子的第三個位點被混合的堿基和/或脫氧次黃苷殘基取代(Batzer,(1991)NucleicAcidRes19:5081;Ohtsuka，(1985)JBiolChem260:2605-2608;Cassol,(1992);Rossolini,(1994)MolCellProbes8:91-98)。術(shù)語核酸可與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA互換使用。"來源于基因的核酸"是指其合成最終以基因或其亞序列作為模板的核酸。因此，mRNA、從mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA、從該cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA、從cDNA擴增的DNA、從擴增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA等全都來源于該基因，且檢測所述來源產(chǎn)物可指示樣品中存在和/或有大量原始基因和/或基因轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)核酸與另一核酸序列發(fā)生功能關(guān)系時，該核酸被"可操作地連接"。例如，如果啟動子或增強子增加編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子可操作地連接于編碼序列。可操作地連接是指被連接的DNA序列通常是連續(xù)的，并且當(dāng)需要連接兩個蛋白編碼區(qū)時，所述DNA序列是連續(xù)的且在讀框內(nèi)。然而，因為增強子在與啟動子被數(shù)千堿基隔開時通常發(fā)揮作用，且內(nèi)含子序列可以具有可變的長度，一些多核苷酸元件可以是可操作地連接但不連續(xù)。術(shù)語"細胞因子"包括，例如，白細胞介素、干擾素、趨化因子、造血生長因子，腫瘤壞死因子和轉(zhuǎn)化生長因子。一般來說，它們是低分子量蛋白質(zhì)，其可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的細胞的成熟、活化、增殖和分化。在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求中，任何涉及"一種，，組分(例如在有關(guān)非多肽部分、氨基酸殘基、取代、緩沖液、陽離子等的內(nèi)容中)的內(nèi)容意指一種或多種所述組分，除非另有所述或除非從具體上下文中清楚地得出并非該情況。例如，術(shù)語"選自A,B和C組成的組的組分"意指包括A，B和C的所有組合，例如，A,B,C，A+B,A+C,B+C或A+B+C。多種其它術(shù)語在此處給出定義或進行定性。本發(fā)明的分子和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的分子(例如本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的偶聯(lián)物和編碼所述多肽的核酸)可用于治療對干擾素-a治療有反應(yīng)的疾病，特別是與病毒感染相關(guān)的疾病，例如HCV感染。慢性HCV感染患者在治療前通常具有104—1(^拷貝的HCVRNA/ml血清的病毒載量。通過用IFN-a治療，這些患者中的病毒載量特征性地歷經(jīng)兩個不同的對線性衰減期(圖IB;NeumannA.U.，(1998)Science282:103-107)。IFN-a治療的前兩日中發(fā)生的病毒載量的起始快速下降，被認為是由于干擾素-a介導(dǎo)的病毒在被感染肝細胞中的生成減少及原始細胞對抗感染的伴隨保護。在約二日時，病毒產(chǎn)生的速率達到新的穩(wěn)定狀態(tài)，此時可觀測到病毒清除率的第二個快速對數(shù)線性期(速率較低)。病毒清除率的該第二期通常被認為部分由于T細胞介導(dǎo)的對感染的肝細胞的殺傷(Neumann等，文獻同上)。IFN-a被認為在該生物反應(yīng)中通過刺激抗原特異性T細胞分化為TH1細胞而發(fā)揮關(guān)鍵性作用。此外，利巴韋林的作用模式被認為是由于THl反應(yīng)的放大，且被認為是其與IFN-a治療聯(lián)合效力的機理基礎(chǔ)。對目前使用的干擾素-a治療無反應(yīng)的感染了HCV的患者(通常被稱為"無反應(yīng)者")表現(xiàn)出更淺的(shallow)病毒載量清除圖(圖IA)。雖然本發(fā)明并非意在受潛在機制的具體理論的限制，應(yīng)當(dāng)理解替代(surrogate)測定系統(tǒng)(諸如本文更詳細描述的那些系統(tǒng))中的抗病毒活性可作為干擾素-a分子效力(例如在病毒清除率第一相)的預(yù)測物。示例性抗病毒測定法(實施例章節(jié)中所述)監(jiān)測IFN-a保護HuH7人肝來源細胞，使其免受腦心肌炎病毒(EMCV)的致細胞病變效應(yīng)的有效性，其可作為抗人肝細胞中HCV的有效性的替代系統(tǒng)。其它有用的病毒/細胞測定系統(tǒng)包括EMCV在WISH人羊膜-衍生細胞中、EMCV在HeLa人宮頸癌細胞中、水泡性口炎病毒(VSV)在HuH7細胞中、痘苗病毒(VV)在HeLa細胞中、黃熱病毒(YFV)在H印G2人肝癌細胞中以及人類免疫缺陷病毒(HIV)在原代CD4+T細胞中。實施例2顯示了本發(fā)明的代表性多肽在EMCV/HuH7和EMCV/HeLa抗病毒活性測定中的抗病毒活性。其它可用于在感染肝細胞中監(jiān)測抗HCV的有效性的替代測定系統(tǒng)包括HCV復(fù)制子系統(tǒng)，例如LohmannV.等，(1999)Science285(5424):285-3;RandallG.和RiceC.M.(2001)CurrOpinInfectDis14(6):743-7;和Bartenschlager，R.(2002)NatureReviews/DrugDiscovery1:911中所述?？捎糜诒O(jiān)測HCV抗病毒效力的體內(nèi)宿主系統(tǒng)的實例是嵌合人肝SCID小鼠，如Mercer,(2001)NatureMedicine7(8):927-933中所述。不受理論的限制，還認為由IFN-oc導(dǎo)致的TH1分化增強和/或TH2分化的抑制可以是干擾素-a效力的促成因素，例如在病毒清除率第二階段中。根據(jù)該理論，預(yù)計這些生物活性(即，TH1分化的増強和/或Th2分化的抑制)方面的效力增強的改進型IFN-a具有相對例如目前批準(zhǔn)的治療性干擾素-a分子(以相同劑量施用)而言增加的效力。示例性測定法(實施例章節(jié)中所述)借助ELISA或借助細胞內(nèi)染色及FACS分選來測定與ThI-表型(例如，IFN-力和/或Th2-表型(例如，IL-5,IL4)相關(guān)的細胞因子的產(chǎn)生，從而監(jiān)測IFN-a對TH0細胞的TH1分化的增強和/或TH2分化的抑制。實施例3顯示了本發(fā)明的代表性多肽的TH1分化活性。IFN-a分子的治療效果會部分由于劑量限制性毒性(dose-limitingtoxicity),例如血小板減少和中性白細胞減少而出現(xiàn)降低。雖然本發(fā)明并非意在受潛在機制的具體理論的限制，應(yīng)當(dāng)理解所述毒性或許與IFN-a對血小板和中性白細胞前體的抗增殖作用相關(guān)，而在替代測定系統(tǒng)(諸如本文所述的那些系統(tǒng))中的抗增殖活性可作為干擾素-oc分子的相對毒性的預(yù)測物。因此，與IFN-a治療相關(guān)的劑量限制性毒性可在IFN-a分子中減少，所述分子表現(xiàn)出相對于例如目前批準(zhǔn)的治療性干擾素-a分子諸如ROFERON⑧-A(干擾素a-2a,重組；Hoffmann-LaRocheInc.)、INTRON⑧A(干擾素-a-2b,重組；ScheringCorporation)和INFERGEN⑧(干擾素otcon-1;InterMune,Inc.)而言減低的抗增殖活性。示例性抗增殖活性測定法(實施例章節(jié)中所述)監(jiān)測IFN-a對人Daudi淋巴細胞增殖的作用?？蛇x地，或此外，施用更具治療活性的分子可產(chǎn)生劑量限制性毒性，所述分子的給藥濃度或頻率可低于目前批準(zhǔn)的分子的給藥濃度或頻率。實施例4顯示了本發(fā)明的代表性多肽的Daudi抗增殖活性。本發(fā)明的一個目的是提供新的干擾素-oc多肽，和編碼該多肽的核酸。本發(fā)明的多肽可用于治療對干擾素-oc治療有反應(yīng)的疾病，特別是與病毒感染相關(guān)的疾病，例如HCV感染。一些本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性，例如，抗病毒活性，抗增殖活性，和/或Th1分化活性。一些本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出以下特性的一種或多種與參照IFN-a多肽相比抗病毒活性增加或降低；與參照IFN-ot多肽相比TH1分化活性增加或降低；與參照IFN-a多肽相比抗增殖活性增加或降低。參照IFN-oc多肽可包括非天然的千擾素-cc的序列，諸如IFN-aConl(SEQIDNO:58),或可包含天然的(即，野生型)干擾素-a多肽的序列。天然的干擾素-a多肽的序列的實例包括人IFN-ot多肽的序列，例如，huIFN-a2b(SEQIDNO:46),huIFN-a2a(SEQIDNO:47),huIFN-a2c(34位-Arg的SEQIDNO:46),huIFN-a8b(SEQIDNO:52),huIFN-a8a(98位二Val,99位二Leu,100位=Cys,和101位二Asp的SEQIDNO:52)，huIFN-a8c(161位Asp且162-166位氨基酸缺失的SEQIDNO:52),huIFN-al4a(SEQIDNO:54)，huIFN陽al4c(152位二Leu的SEQIDNO:54)，或任何其它天然的人千擾素a多肽的序列，諸如AllenG.和DiazM.O.(1996)，文獻同上中所列。另一方面，本發(fā)明提供了干擾素-a多肽，與參照干擾素-a分子，諸如目前用作治療劑的參照干擾素-a分子(例如，ROFERON-A，INTRONA或INFERGEN)相比，該多肽從^皮病毒感染的細胞中清除病毒的效力增強。例舉的病毒包括但不限于黃病毒科家族的病毒，例如丙肝病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒、登革病毒和牛病毒性腹瀉病毒；嗜肝DNA病毒科家族的病毒，例如，乙肝病毒；小RNA病毒科家族的病毒，例如腦心肌炎病毒、人鼻病毒和曱肝病毒；反錄病毒科家族的病毒，例如人類免疫缺陷病毒、猴免疫缺損病毒、人T-嗜淋巴性病毒和勞斯肉瘤病毒；冠狀病毒科家族的病毒，例如SARS冠狀病毒；彈狀病毒科家族的病毒，例如狂犬病病毒和水泡性口炎病毒；副粘病毒^f家力矣的病毒，例如呼p及道合力包病毒和副流感病毒；乳頭狀瘤病毒科家族的病毒，例如人乳頭狀瘤病毒以及皰滲病毒科家族的病毒，例如單純皰疹病毒。所述增強的效力可來自相對參照分子增強的抗病毒活性、增強的Th1-分化活性或逸雨者。例如，本發(fā)明的一些干擾素-a多肽特別適用于清除對目前使用的干擾素-a分子治療反應(yīng)較弱的病毒或病毒株，所述毒抹例如是，HCV基因型1。一些本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出與參照IFN-a分子相比增高的(抗病毒活性/抗增殖活性)比率，和/或與參照IFN-a分子相比增高的(THl分化活性/抗增殖活性)比率。表現(xiàn)出所述特性的多肽對于治療病毒感染，諸如上述病毒的感染特別有效。例如，一些所述多肽在雙階段病毒清除圖譜的一個或兩個二階段中在對HCV的治療中的治療效力高于目前批準(zhǔn)的干擾素-a分子，和/或可表現(xiàn)出降低的毒性。一些所述多肽在對HCV基因型1的治療中的治療效力超過現(xiàn)今批準(zhǔn)的千擾素-a分子的治療效力。本發(fā)明的另一目的是提供偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含一個或多個與本發(fā)明的多肽連接的非多肽部分，所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出千擾素-oc活性(諸如上述活性的一種或多種)，并任選地表現(xiàn)出其它所需特性，諸如相對于非偶聯(lián)型多肽增強的血清半壽期和/或功能性體內(nèi)半壽期，和/或降低的抗原性。一些所述偶聯(lián)物在從被病毒感染的細胞中清除病毒方面的效力比參照千擾素-a分子的所述效力更強，所述參照干擾素-a分子諸如目前用作治療劑的干擾素-a偶聯(lián)物(例如，PEGASYS⑧(Peg化的干擾素a-2a;Hoffmann-LaRoche，Inc.)或PEG-INTRON(Peg化的干擾素ot-2b;ScheringCorporation)。例舉的病毒包括但不限于黃病毒科家族的病毒，例如丙肝病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒、登革病毒和牛病毒性腹瀉病毒；嗜肝DNA病毒科家族的病毒，例如，乙肝病毒；小RNA病毒壽牛家》矣的病毒，例如腦心月幾炎病毒、人鼻病毒和甲肝病毒；反錄病毒科家族的病毒，例如人類免疫缺陷病毒、猴免疫缺損病毒、人T-嗜淋巴性病毒和勞斯肉瘤病毒；冠狀病毒科家族的病毒，例如SARS冠狀病毒；彈狀病毒科家族的病毒，例如狂犬病病毒和水泡性口炎病毒；副粘病毒科家族的病毒，例如呼吸道合胞病毒和副流感病毒；乳頭狀瘤病毒科家族的病毒，例如人乳頭狀瘤病毒以及皰滲病毒科家族的病毒，例如單純皰滲病毒。所述增強的效力可來自相對參照分子而言增強的抗病毒活性、增強的Th1-分化活性或逸雨者。例如，本發(fā)明的一些干擾素-a偶聯(lián)物特別適用于清除對目前使用的干擾素-a分子治療反應(yīng)較弱的病毒或病毒抹，所述毒株例如是HCV基因型1。一些本發(fā)明的偶聯(lián)物表現(xiàn)出與參照IFN-a分子相比增高的(抗病毒活性/抗增殖活性)比率，和/或與參照IFN-a分子相比增高的(THl分化活性/抗增殖活性)比率。表現(xiàn)出所述特性的偶聯(lián)物對于治療病毒感染諸如上述病毒，如HCV的感染特別有效。例如，一些所述偶聯(lián)物在雙階段病毒清除圖譜的一或兩個二階段中對HCV的治療效力高于目前批準(zhǔn)的干擾素-a分子，和/或可表現(xiàn)出降低的毒性。一些所述偶聯(lián)物在對HCV基因型1的治療中的治療效力超過現(xiàn)今批準(zhǔn)的干擾素-ct分子的治療效力。本發(fā)明的另一目的是提供抑制感染了病毒的細胞中的病毒復(fù)制的方法，該方法包括對感染了病毒的細胞施用本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物，所述多肽或偶聯(lián)物的量能有效抑制所述細胞中的病毒復(fù)制。本發(fā)明還提供了降低感染了病毒的細胞中病毒拷貝數(shù)的方法，該方法包括對感染了病毒的細胞本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物，所述多肽或偶聯(lián)物的量能有效降低所述細胞中病毒的拷貝數(shù)。病毒可以是黃病毒科家族的病毒，例如丙肝病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒、登革病毒或牛病毒性腹瀉病毒；嗜肝DNA病毒科家力臭的病毒，例如，乙肝病毒；小RNA病毒禾+家族的病毒，例如腦心肌炎病毒、人鼻病毒或曱肝病毒；反錄病毒科家族的病毒，例如人類免疫缺陷病毒、猴免疫缺損病毒、人T-嗜淋巴性病毒或勞斯肉瘤病毒；冠狀病毒科家族的病毒，例如SARS冠狀病毒；彈狀病毒科家族的病毒，例如狂犬病病毒或水泡性口炎病毒；副粘病毒科家族的病毒，例如呼吸道合胞病毒或副流感病毒；乳頭狀瘤病毒科家族的病毒，例如人乳頭狀瘤病毒；或皰滲病毒科家族的病毒，例如單純皰滲病毒。例如，所述病毒可以是RNA病毒，諸如HCV，DNA病毒，諸如HBV,或反錄病毒，諸如HIV。所述細胞可在培養(yǎng)物中或從哺乳動物中分離(即，體外或離體)，或可以在體內(nèi)，例如，在哺乳動物(例如SCID小鼠模型，如Mercer,(2001)NatureMedicine.7(8):927-933所述)、靈長類或人中。本發(fā)明還提供了增強TH0細胞的TH1分化的方法，該方法包括對包含TH0細胞的細胞群施用本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物，所述多肽或偶聯(lián)物的量能有效增加在所述細胞群中與THl-表型相關(guān)的細胞因子(例如，IFN-力的產(chǎn)生和/或降低與TH2-表型相關(guān)的細胞因子(例如，IL-4或IL-5)的產(chǎn)生。所述細胞可在培養(yǎng)物中或從哺乳動物中分離(即，體外或離體)，或可以在體內(nèi)，例如在哺乳動物，靈長類或人中。本發(fā)明還提供了抑制細胞群增殖的方法，包括將該細胞群與本發(fā)明的多肽，變體，或偶聯(lián)物接觸，所述多肽，變體或偶聯(lián)物的量可有效地降低細胞群的增殖。該細胞群可在培養(yǎng)物中的或v^人哺乳動物中分離(即，體外或離體)，或可以在體內(nèi)，例如，在哺乳動物，靈長類或人中。以下將對本發(fā)明的這些和其它目的進行詳細描述。本發(fā)明的多肽本發(fā)明提供了新的干擾素-OC多肽，在本文中統(tǒng)稱為"本發(fā)明的多肽"。"本發(fā)明的多肽"通篇意指包括本文所述的多肽序列的變體。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明多肽的融合蛋白，和包含本發(fā)明多肽的偶聯(lián)物。多種干擾素-a編碼序列的片段被循環(huán)重組以便形成包含重組多核苷酸的文庫，從中產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。獲得重組多核苷酸文庫的方法和/或在用作循環(huán)序列重組基質(zhì)的核酸中得到多樣性的方法同樣描述如下。示例性本發(fā)明的多肽包括含有如下序列的多肽，所述序列在本文中被鑒定為SEQIDNO:2-35和SEQIDNO:37-44(即SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4，SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20，SEQIDNO:21，SEQIDNO:22，SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28，SEQIDNO:29,SEQIDNO:30，SEQIDNO:31，SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38，SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43和SEQIDNO:44)。一些所述多肽還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了包含這些多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，和編碼這些多肽的分離的或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:l在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:l而言，含有選自下列的一個或多個取代F48A/L;V51P;F55A;F65A;F68P;L111A和V114P。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:l在1,2,3,4,5，6,7,8,9,10,11，12，13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，1-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，1-5個氨基酸位置，1-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;V51A;Q52P/E;A53T;F55S;L56V;F57L;Y58H;M61I;N113K;V114E和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干4尤素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有這些多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的分離的或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:l在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:l而言，含有取代F48A/L。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:l在1,2,3，4,5,6,7,8,9,10，11,12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列,例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，1-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。一些所述多肽相對于SEQIDNO:l而言，含有取代F48A。一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個耳又代H47Q;V51A/P;Q52P/E;A53T;F55A/S;L56V;F65A;F57L;Y58H;M61I;F68P;L111A;N113K;V114E/P和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有這些多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的分離的或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:1在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:l而言，含有取代F55A。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:1在1，2，3，4,5,6,7，8，9,10,11，12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，1-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，1-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;F48A/L;V51A/P;Q52P/E;A53T;L56V;F65A;F57L;Y58H;M61I;F68P;L111A;N113K;V114E/P和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有這些多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的分離的或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:l在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:l而言，含有取代F65A。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:l在1,2,3，4,5，6,7,8，9,10,11,12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，1-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，1-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;F48A/L;V51A/P;Q52P/E;A53T;F55A/S;L56V;F57L;Y58H;M61I;F68P;L111A;N113K;V114E/P和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-ot活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有這些多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的分離的或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDN0:1在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDN0:1而言，含有取代L111A。一些這樣的多肽含有與SEQIDN0:1在1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12，13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列,例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。一些所述多肽相對于SEQIDN0:1而言，含有取代F48A。一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;F48A/L;V51A/P;Q52P/E;A53T;F55A/S;L56V;F65A;F57L;Y58H;M61I;F68P;N113K;V114E/P和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-ot活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述多肽還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至N-末端的曱石克氨酸。本發(fā)明還提供了含有這些多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，編碼所述多肽的分離的或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDN0:13在0-16個氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一個或多個第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第111位的Ala和第114位的Pro(相對于SEQIDNO:13的位置編號)。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:13在0，1,2,3,4,5,6,7,8,9，10,11,12，13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在0-15個氨基酸位置，0-14個氨基酸位置，0-13個氨基酸位置，0-12個氨基酸位置，0-ll個氨基酸位置，0-10個氨基酸位置，0-9個氨基酸位置，0-8個氨基酸位置，0-7個氨基酸位置，0-6個氨基酸位置，0-5個氨基酸位置，0-4個氨基酸位置，0-3個氨基酸位置，0-2個氨基酸位置或0-1個氨基酸位置中不同的序列。一些這樣的多肽在第48位含有Ala或Leu。一些這樣的多肽在第48位含有Ala。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:13而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;V51A;Q52P/E;A53T;F55S;L56V;F57L;Y58H;M61I;N113K;V114E和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-oc活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些這樣的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，以及編碼所述多肽的分離或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:36而言，含有選自下列的一個或多個取代M21A;I24P;F48A/L;T51P;S55A;F65A;F68P;F90A;M93P;L111A;V114P;F124A;I127P和E160D。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:36在1,2，3，4,5,6,7，8,9,10,11，12,13,14，15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:36而言，還含有選自下列的一個或多個耳又代P26L;H47Q;T51V;S55P/F;V56L;H58Y;L60M;F90Y;M93L;N95D;N113K;V114E;R125Q;T132K和L154F。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些這樣的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，以及編碼所述多肽的分離或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:36而言，含有取代F48A/L。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:36在1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列,例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，卜ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，1-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。一些所述多肽相對于SEQIDNO:36而言，含有耳又代F48A。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:36而言，還含有選自下列的一個或多個取代M21A;I24P;P26L;H47Q;T51V/P;S55P/F/A;V56L;H58Y;L60M;F65A;F68P;F90Y/A;M93L/P;N95D;L111A;N113K;V114E/P;F124A;R125Q;I127P;T132K;L154F和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些這樣的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，以及編碼所述多肽的分離或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:36而言，含有耳又代F90A。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:36在1,2,3，4,5,6,7,8,9，10，11，12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:36而言，還含有選自下列的一個或多個取代M21A;I24P;P26L;H47Q;F48A/L;T51V/P;S55P/F/A;V56L;H58Y;L60M;F65A;F68P;M93L/P;N95D;L111A;N113K;V114E/P;F124A;R125Q;I127P;T132K;L154F和E160D。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-oc活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些這樣的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，以及編碼所述多肽的分離或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:36而言，含有取代E160D。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:36在1,2,3,4,5,6,7，8,9,10,11，12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列,例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:36而言，還含有選自下列的一個或多個耳又4戈M21A;I24P;P26L;H47Q;F48A/L;T51V/P;S55P/F/A;V56L;H58Y;L60M;F65A;F68P;F90Y/A;M93L/P;N95D;L111A;N113K;V114E/P;F124A;R125Q;I127P;T132K和L154F。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些這樣的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，以及編碼所述多肽的分離或重組的核酸。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各包含這樣的序列，所述序列(a)與SEQIDNO:38在0-16個氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一個或多個第21位的Ala;第24位的Pro;第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第90位的Ala;第93位的Pro;第111位的Ala;第114位的Pro;第124位的Ala;第127位的Pro;和第160位的Glu(相對于SEQIDNO:38的位置編號)。一些這樣的多肽含有與SEQIDNO:38在0,1,2,3,4,5,6,7,8,9，10,11,12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的序列，例如在0-15個氨基酸位置，0-14個氨基酸位置，0-13個氨基酸位置，0-12個氨基酸位置，0-11個氨基酸位置，0-10個氨基酸位置，0-9個氨基酸位置，0-8個氨基酸位置，0-7個氨基酸位置，0-6個氨基酸位置，0-5個氨基酸位置，0-4個氨基酸位置，0-3個氨基酸位置，0-2個氨基酸位置或0-1個氨基酸位置中不同的序列。一些這樣的多肽在第48位含有Ala或Leu。一些這樣的多肽在第48位含有Ala。在一些情況下，該多肽相對于SEQIDNO:38而言，還含有選自下列的一個或多個取代P26L;H47Q;V51T;F55P/S;L56V;Y58H;L60M;F90Y;M93L;N95D;N113K;V114E;R125Q;T132K和F154L。在一些情況下，該多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性，TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些這樣的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了含有所述多肽的融合蛋白和偶聯(lián)物，以及編碼所述多肽的分離或重組的核酸。本發(fā)明多肽的其它修飾包括下文和題目為"干擾素-a偶聯(lián)物"的章節(jié)中所述的那些修飾。應(yīng)當(dāng)理解雖然本文提供的實施例和對親本多肽的修飾是相對于序列SEQIDNO:l而言的(或相對于SEQIDNO:36或相對于一些其它特定序列而言)，所/>開的修飾還可在本文所述本發(fā)明的任何其它多肽(例如包含選自SEQIDNO:2-35和SEQIDNO:37-44的序列的多肽)的等效氨基酸位置上進行。因此，作為實例，相對于SEQIDNO:l的取代F48L應(yīng)被理解為對應(yīng)于SEQIDNO:13中的取代A48L，等等。下表提供了本發(fā)明一些干擾素-a多肽的序列。為了清楚地描述，所述序列相對于SEQIDNO:l(表l)或SEQIDNO:36(表2)進行顯示。一些所述多肽顯示干擾素-a活性，諸如抗病毒活性，THl分化活性和/或抗增殖活性。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>序列變異如上所述，本發(fā)明的多肽包括含有這樣的序列的多肽，所述序列與SEQIDNO:l在l-16個氨基酸位置中不同，并且相對于SEQIDNO:1還含有一個或多個選自下列的取代F48A/L;V51P;F55A;F65A;F68P;L111A和V114P。本發(fā)明的多肽還包括含有這樣的序列的多肽，所述序列與SEQIDNO:36在l-16個氨基酸位置中不同，并且相對于SEQIDNO:36還含有一個或多個選自下列的取代M21A;I24P;F48A/L;T51P;S55A;F65A;F68P;F90A;M93P;L111A;V114P;F124A;I127P和E160D。一些所述多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性。例如，一些本發(fā)明的所述多肽包含長度約為151個氨基酸，諸如約151，152,153,154,155,156,157,158,159，160，161,162,163,164或165個氨基酸的序歹'J，對應(yīng)相對于親本多肽序歹'J(例如，SEQIDNO:2-35或37-44)的1-15個氨基酸的缺失。在一些情況下，從C末端去除1-11個氨基酸，例如，1-10，諸如1-7,例如1-5,諸如l-3個氨基酸，即多肽與親本多肽序列之一(例如，SEQIDNO:2-35或37-44之一)相比，前者在C末端截短了1-11個氨基酸殘基(例如1,2,3,4,5,6,7,8，9,10或11個氨基酸殘基)，諸如1-10,1-7個，例如，1-5或1-3個氨基酸殘基。可選或此外，一些所述多肽是與親本多肽序歹'](諸如，SEQIDNO:2-35或37-44之一)相比在N末端截短1-4個氨基酸殘基(例如1,2，3或4個氨基酸殘基)，例如，從N末端去除1-4,1-3,l-2或1個氨基酸殘基。一些所述多肽還包括位于N末端的曱硫氨酸。一些所述多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性。再例如，一些本發(fā)明的多肽包括這樣的序列，其相對于SEQIDNO:l含有l(wèi)-16個氨基酸取代(例如1,2，3，4,5,6,7，8,9,10，11,12，13,14,15或16個氨基酸取代)，諸如1-14或1-12或1-10或1-8或1-6或1-5或1-4或1-3或l-2個氨基酸取代，其中至少一個取代選自F48A/L;V51P;F55A;F65A;F68P;L111A和V114P。本發(fā)明的其它多肽包括這樣的序列，其相對于SEQIDNO:36含有1-16個氨基酸取代(例如1，2,3，4,5，6,7，8,9,10，11,12，13,14，15或16個氨基酸取4戈)，諸如1-14或1-12或1-10或1-8或1-6或1-5或1-4或1-3或1-2個氨基酸取代，其中至少一個取代選自M21A;I24P;F48A/L;T51P;S55A;F65A;F68P;F90A;M93P;L111A;V114P;F124A;1127P和E160D?？筛鶕?jù)例如取代基(如保守的取代基)，例如下文所列之一，在多肽序列中進行一個或多個其它的氨基酸取代?；蛘?，或另外，可在多肽序列中進行一個或多個其它的氨基酸取代，所述取代導(dǎo)入或除去了包含非—多肽部分連接基團的氨基酸殘基。實例包括導(dǎo)入一個或多個N-糖基化位點，導(dǎo)入一個或多個半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基，除去一個或多個N-糖基化位點，和/或除去一個或多個賴氨酸或組氨酸。一些所述多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性。作為非限制性的實例，本發(fā)明的多肽可含有這樣的序列，該序列與SEQIDNO:l在總共多達16個位置中有所不同(其可以是氨基酸取代、缺失和/或插入的組合，包括上述的那些)。在一些情況下，沒有、部分或全部取代是根據(jù)下文限定的取代基的取代。根據(jù)本發(fā)明的氨基酸取代可包括但不限于一個或多個保守的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域眾所周知的。下表(表3)中提供了一個實例，表中列出了包含氨基酸的六組示例性基團，所述氨基酸可被認為互為"保守取代"。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>可推定氨基酸的其它取代基團。例如，氨基酸可根據(jù)相似的功能或化學(xué)結(jié)構(gòu)或組成進行分類(例如，酸性、堿性、脂肪族、芳香族、含硫的)。例如，脂肪族的組包括甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)。包含被認為互為保守取代的氨基酸的其它類別包括芳香族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫的曱硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);堿性精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。對于其它氨基酸組，還可參見Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman和Company。本文的多肽序列列表，if關(guān)合上述耳又代基團，提供了所有保守性取代的多肽序列的明確列表。序列同一性百分比一方面，本發(fā)明提供了分離的或重組的多肽，其各自包含這樣的序列，該序列具有與SEQIDNO:l-35中的任一個至少90%的序列同一性(例如，至少約91%,至少約92%,至少約93%,至少約94%,至少約95%,至少約96%,至少約97%,至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性)，其中，該序列包括以下的一種或多種氨基酸第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第111位的Ala;和第114位的Pro，其中氨基酸位置是相對于SEQIDNO:l而言的。在一些情況下，所述多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多肽，其各自包含這樣的序列，該序列具有與SEQIDNO:36-44中的任一個至少90%的序列同一性(例如，至少約91%,至少約92%,至少約93%,至少約94%,至少約95%,至少約96%,至少約97%,至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性)，其中，該序列包括以下的一種或多種氨基酸第21位的Ala;第24位的Pro;第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第90位的Ala;第93位的Pro;第111位的Ala;第114位的Pro;第124位的Ala;第127位的Pro;和第160位的Asp;其中氨基酸位置是相對于SEQIDNO:36而言的。在一些情況下，所述多肽表現(xiàn)出干擾素-ot活性。一個序列(多肽或核酸)與另一序列的相似程度提供了兩個序列相似結(jié)構(gòu)和功能特性的指示。因此，在本發(fā)明的上下文中，具有與任何給定示例序列相似的序列的那些序列是本發(fā)明的特征。具體，具有下述百分序列同一性的序列是本發(fā)明的特征?？梢允褂枚喾N測定序列關(guān)系的方法，包括人工比對和計算機輔助的序列比對以及分析。多種用于執(zhí)行序列比對的計算機程序是可得到的，或可以按下文所述由專業(yè)技術(shù)人員人工進行比對。如上所述，本發(fā)明中使用的核酸和多肽的序列無需是相同的，而可以與本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的核酸的相應(yīng)序列基本相同。例如，可對本發(fā)明的多肽實施多種改變，諸如一個或多個氨基酸插入、缺失和/或取代，其可為保守或非保守的，包括這樣的情況，例如所述改變可為所述多肽的諸如治療或預(yù)防用途或給藥或診斷應(yīng)用提供一些優(yōu)勢。還可對本發(fā)明的核酸實施多種改變，諸如，一個或多個核酸的一個或多個密碼子中的一種或多種取代，以便具體密碼子編碼相同或不同氨基酸，導(dǎo)致沉默變異(如本文所定義的)或非沉默變異，或序列中一個或多個核酸(或密碼子)的一種或多種缺失。核酸也可被修飾為包含使其在表達系統(tǒng)(例如，細菌或哺乳動物)中最優(yōu)表達的一個或多個密碼子，若有需要，所述一個或多個密碼子仍然編碼相同氨基酸。所述核酸改變可為其治療或預(yù)防用途或給藥或診斷應(yīng)用提供一些優(yōu)勢。核酸和多肽可用多種方式進行修飾，只要其包含與本發(fā)明的各個核酸或多肽中的序列基本相同的序列(如下面的定義)即可。在兩個或多個核酸或多肽序列的情況中，術(shù)語"相同的"或"同一性"是指當(dāng)比較或比對兩個或多個序列的最大相似性時，所述序列是相同的或具有一定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸，如利用下文所述的序列比對算法或通過觀察(visualinspection)所測定。受試序列與參照(即查詢)序列的"百分比序列同一性(％同一性)"是指，受試序列在比較長度上，具有與查詢序列一定百分比的同一性(即，對于多肽序列以氨基酸-對-氨基酸(aminoacid-by-amicoacid)為基礎(chǔ)，或?qū)τ诙嗪朔宜嵝蛄幸院塑账?對-核苷酸為基礎(chǔ))。受試序列與查詢序列的百分序列同一性計算如下。首先，采用具體的比對參數(shù)，以序列比較算法確定兩序列的最佳比對。該最佳比對的測定可以用計算機實施，或可以人工計算，如下所述。然后，在比較長度中比較兩個最佳比對的序列，并測定最佳比對中兩個序列出現(xiàn)相同殘基的位置的數(shù)目，由此提供了匹配位置的數(shù)目。然后用匹配位置的數(shù)目除以比較長度(除非另有說明，其為查詢序列的長度)中的位置總數(shù)，然后將結(jié)果乘以100,得出受試序列對查詢序列的百分序列同一性。關(guān)于多肽序列，通常將一個序列作為"查詢序列"(例如，本發(fā)明的多肽序列)，相對于該序列比較對一個或多個其它序列，即，"受試序列"(例如，存在于序列數(shù)據(jù)庫中的序列)。序列比較算法使用指定的比對參數(shù)來測定查詢序列和受試序列之間的最佳比對。當(dāng)將比較查詢序列與序列數(shù)據(jù)庫例如GENBANK(GeneticSequenceDataBank;U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)或GENESEQ(ThomsonDerwent;alsoavailableasDGENEonSTN)時，通常僅將查詢序列和比對參數(shù)輸入計算機；通常，對于達到所需數(shù)目的受試序列，將返回輸入查詢序列和數(shù)據(jù)庫中存在的各受試序列之間的最佳比對。當(dāng)使用確定的參數(shù)(即，確定的氨基酸取代矩陣，缺口存在罰分(也稱為缺口開放罰分)和缺口延伸罰分)對兩個多肽序列進行比對時(以便取得該序列對的最高可能相似性得分)，這兩個多肽序列是"最佳比對的"。BLOSUM62矩陣(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl,Acad.Sci.USA89(22):10915-10919)通常被用作多肽序列比對算法(諸如下面描述的BLASTP)中的默認評分取代矩陣。為在一個被對比的序列中導(dǎo)入單個氨基酸缺口，加上缺口存在罰分，對于缺口中的各個殘基位置，加上缺口延伸罰分。除非另有說明，在本文中采用的比對參數(shù)是BLOSUM62評分矩陣，缺口存在罰分=11,和缺口延伸罰分=1。通過各序列在對比開始和結(jié)束(例如對比窗口)處的氨基酸位置，以及任選地通過在一個或兩個序列中插入缺口或多個缺口，以便取得最高可能相似性得分，來確定比對得分。雖然兩個或多個序列之間最佳比對可以人工測定(如下所述)，該過程可通過如下過程而得以簡化通過使用計算機執(zhí)行的比對算法諸如BLAST(NationalLibraryofMedicine),例如，對于多肽序列的BLASTP和對于核酸序列的BLASTN(Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402中所述，并通過不同來源諸如NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)使得公眾可得。在使用計算機化的BLAST界面時，如果存在使用"低復(fù)雜性濾器(lowcomplexityfilter)"的選項，應(yīng)將該選項關(guān)掉(即，無濾器)。兩個多肽序列之間的最佳比對也可以通過BLASTP算法的人工計算(即，不用計算機幫助)，使用與上述具體的比對參數(shù)相同的參數(shù)(矩陣=BLOSUM62，缺口開放罰分=11，和缺口延伸罰分=1)進行測定。開始，兩個序列開始通過觀察進行比對。然后如下計算初始比對得分對于比對的各個位置(即，對于每對被比對的殘基)，根據(jù)BLOSUM62矩陣賦予數(shù)值(圖4)。在比對中對每對殘基所賦的值的總和是初始比對得分。如果被比對的兩個序列高度相似，該初始比對通常提供了最高可能比對得分。具有最高可能比對得分的比對是根據(jù)使用的比對參數(shù)的最佳比對。圖5A顯示了兩個序列的比對得分的示例性計算，"查詢"序歹'J，在此處被鑒定為SEQIDNO:l(上)的殘基29-50,和"受試"序列，在此處被鑒定為SEQIDNO:8(下)的殘基30-52。通過觀察比對序列，并且通過BLOSUM62矩陣對每對被比對的氨基酸所賦的數(shù)值顯示在所述比對中的各位置下方(為了幫助觀察，在比對中每個相同的氨基酸對用黑體字顯示)。在這個實例中，該初始比對提供了最高可能比對得分(每個被比對的位置下方所示數(shù)值的和)；這兩個序列的任何其它比對(有或沒有缺口)，將得到較低的比對得分。在一些情況下，通過在比對中引入一個或多個缺口可獲得較高的比對得分。每當(dāng)在比對中引入缺口時，給定缺口開放罰分，此外評估該缺口內(nèi)每個殘基位置的另外的缺口延伸罰分。因此，使用上述比對參數(shù)(包括缺口開放罰分=11和缺口延伸罰分=1),比對中一個殘基的缺口符合賦予缺口的值-(ll+(lxl))二12;三個殘基的缺口符合賦予缺口的值-(ll+(3xl));14,等等。對于在比對中引入的各缺口，重復(fù)所述計算。圖5B和5C顯示了一個實例，說明無論缺口罰分為何值，在比對中引入缺口如何得到較高的比對得分。圖5B顯示了SEQIDNO:l(上，查詢)的殘基29-50和SEQIDNO:46(下，受試)的殘基30-50通過目測得到的初始對比，其初始比對得分為67。圖5C顯示了在SEQIDNO:46中導(dǎo)入一個殘基缺口對比對得分影響；盡管缺口罰分為-12，兩個序列的總比對得分增加到88。在這個實例中，圖5C中所示比對提供了最高可能比對得分，因此是這兩個序列的最佳比對；這兩個序列的任何其它比對(有或沒有缺口)將得到較低的比對得分。應(yīng)當(dāng)理解，上述序列比對計算的實例(使用相對短的序列)僅以說明的目的提供；實際上，釆用的比對參數(shù)(BLOSUM62矩陣，缺口開放罰分=11，和缺口延伸罰分=1)對于85個或更長氨基酸的多肽序列一般是最理想的。NCBI網(wǎng)站為其它長度的序列(適用于計算機輔助的以及人工比對計算，使用如上述相同的步驟)提供了下列比對參數(shù)。長度為50-85個氨基酸的序列，最佳的參數(shù)是BLOSUM80矩陣(Henikoff和Henikoff，文獻同上)，缺口開放罰分=10，和缺口延伸罰分=1。對于長度為35-50個氨基酸的序列，最佳的參數(shù)是PAM70矩陣(Dayhoff,M.O.，Schwartz,R.M.&Orcutt，B.C.(1978)"Amodelofevolutionarychangeinproteins."InAtlasofProteinSequenceandStructure,vol.5,suppl.3,M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,DC.)，缺口開放罰分=10,和缺口延伸罰分=1。長度少于35個氨基酸的序列，最佳的參數(shù)是PAM30矩陣(Dayhoff,M.O.,文獻同上)，缺口開放罰分=9，和缺口延伸罰分二l。序列一經(jīng)最佳對比，通過計算最佳的比對中包含相同殘基對的位置數(shù)來計算受試序列相對于查詢序列的百分比同一性，用其除以比較長度(除非另有說明，是查詢序列中殘基的數(shù)目)中殘基的數(shù)目，然后用所得數(shù)值乘以100。參考圖5中所示實例，在各個實例中，指定為查詢序列的序列長度為22個氨基酸。參考圖5A的比對，在查詢序列(上)與受試序列(下)的最佳的比對中，20個被比對的氨基酸殘基對(黑體字顯示)是相同的。因此，該具體受試序列具有與查詢序列(20/22)><100=91.1%的同一性；換句話說，圖5A所示比對中的受試序列具有與查詢序列至少為91%的氨基酸序列同一性。在圖5C中顯示的比對中，在最佳的比對中有18對氨基酸殘基(黑體字顯示)是相同的；因此該具體受試序列具有與查詢序列(18/22>100=81.8%的同一性；換句話說，圖5C所示比對中的受試序列具有與查詢序列至少為81%的氨基酸序列同一性。當(dāng)應(yīng)用于多肽時，術(shù)語"基本上的同一性"(或"基本上相同的")通常是指，當(dāng)使用上述適當(dāng)?shù)膮?shù)、采用BLASTP算法(人工或通過計算機)兩個氨基酸序歹'J(即查詢序列和受試序列)為最佳比對時，受試序列具有與查詢序列至少約60%，70%,75%,80%,85%,卯％，91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更高百分比的氨基酸序列同一性。在一些情況下，基本上的同一性存在與至少約100個氨基酸殘基，諸如，至少約110，120，125,130,135,140,145,150，155,156，157，158,159，160,161,162,163,164，165或166個氨基酸殘基的比較長度。相似地，如在兩個核酸序列的上下文中使用的，術(shù)語基本上的同一性(或基本上相同)是指當(dāng)采用適當(dāng)?shù)南率鰠?shù)、使用BLASTN算法(人工或通過計算機)為兩個核酸序列(即查詢序列和受試序列)為最佳比對時，受試序列具有與查詢序列至少約60%,70%,75%，80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%，96%，97%,98%,99%或更高百分比的核酸序列同一性。用于核酸序列比對的參數(shù)是匹配獎分1，錯配罰分-3,缺口存在罰分5,缺口延伸罰分2(取代矩陣不用于BLASTN算法中)。在一些情況下，基本上的同一性存在與至少約300個核香酸，諸如，至少大約330,360，375，390，405，420:435，450，465,480,483,486,489,492,495或498個核苷酸的比4交長度。其它方面本發(fā)明的任何多肽可以作為較大多肽序列例如融合蛋白而存在，諸如在加入一個或多個結(jié)構(gòu)域或亞序列以穩(wěn)定或檢測或純化多肽的情況下存在。多肽純化亞序列可包含例如，表位標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、多組氨酸序列、GST融合物或本領(lǐng)域已知的任何其它檢測/純化亞序列或"標(biāo)記"。這些其它區(qū)域或亞序列對本發(fā)明多肽活性的影響很小或沒有影響，或可以通過后合成處理步驟，諸如通過用蛋白酶包括內(nèi)蛋白(intein)等處理而被去除。本發(fā)明包括含有本發(fā)明多肽，例如本文所述多肽的融合蛋白以及編碼所述融合蛋白的核苷酸序列，其中所述多肽與Ig分子，例如人IgGFc("可結(jié)晶片段"，或能與補體結(jié)合的片段)絞鏈、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域融合。Fc是負責(zé)與細胞上的抗體受體和補體的Clq組分結(jié)合的抗體部分。這些融合蛋白及其編碼核酸可用作預(yù)防和/或治療藥物或用作診斷工具(參見例如Challita-Eid，P.etal.(1998)J.Immunol160:3419-3426;Sturmhoefel,K.etal.(1999)CancerRes59:4964-4972)。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明多肽的融合蛋白以及編碼所述融合蛋白的核苷酸序列，其中所述多肽與白蛋白分子，如人血清白蛋白(HSA)融合，參見例如美國專利5,876,969。Ig和白蛋白融合蛋白可表現(xiàn)出增加的多肽血清半壽期和/或功能性的體內(nèi)半壽期，降低的多肽抗原性，增加的多肽儲存穩(wěn)定性或增加的生物利用度，例如增加的AUCsc,因此，可用作預(yù)防和/或治療藥物。任何本發(fā)明的多肽也可以包含一個或多個經(jīng)過修飾的氨基酸。經(jīng)過修飾的氨基酸可以是，例如，糖基化的氨基酸、PEG化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙?；陌被?、生物素化的氨基酸、與脂質(zhì)部分偶聯(lián)的氨基酸或與有機衍生試劑偶聯(lián)的氨基酸。存在經(jīng)修飾的氨基酸有益于，例如，(a)增加多肽血清半壽期和/或功能性的體內(nèi)半壽期，(b)降低多肽抗原性，(C)增加多肽儲存穩(wěn)定性，或(d)提高生物利用度，例如增加AUCSC。例如，氨基酸在重組制備期間例如在共翻譯時或翻譯后進行修飾(例如，哺乳動物細胞中表達期間N-X-S/T基序上的N-連接糖基化)或用合成方法進行修飾。這方面在本文中題目為"干擾素-a偶聯(lián)物"的章節(jié)中被更詳細地描述。本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含至少一種本發(fā)明的多肽，和賦形劑或載體。該組合物可以是包含可藥用賦形劑或載體的組合物。示例性組合物和賦形劑和載體如下述。制備多肽本文描述了生產(chǎn)和分離本發(fā)明多肽的重組方法。除了重組生產(chǎn)以外，可通過使用固相技術(shù)的直接肽合成來生產(chǎn)多肽(參見Stewart等(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo,SanFrancisco;Merrifield,J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154)?？墒褂萌斯ぜ夹g(shù)或通過自動化來進行肽合成。例如，根據(jù)廠商提供的說明使用AppliedBiosystems431APeptideSynthesizer(PerkinElmer,FosterCity,Calif.)即可進4亍自動合成。例如，可以分別化學(xué)合成亞序列，并使用化學(xué)方法將它們組合在一起以提供全長多肽常地，本發(fā)明的多肽可通過表達編碼核酸和回收多肽來制備，例如下述。本發(fā)明還包括制備本發(fā)明多肽的方法。一種所述方法包括，在細胞群體中導(dǎo)入本發(fā)明所述的任何核酸(其與有效產(chǎn)生編碼多肽的調(diào)節(jié)序列可操作地相連)，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以表達該多肽，和從細胞或培養(yǎng)基中分離所述多肽?？墒褂米阋源龠M被細胞攝取(轉(zhuǎn)染)和/或多肽表達的量的核酸。可通過本文所述任何遞送方法將該核酸導(dǎo)入所述細胞中，所述方法包括例如，注射、基因槍、被動攝取等。核酸可以是載體(諸如重組表達載體包括DNA質(zhì)粒載體，或本文所述任何載體)的一部分。核酸或包含本發(fā)明的核酸的載體可按本文上述進行制備和配制。所述核酸或表達載體可在體內(nèi)導(dǎo)入哺乳動物細胞群，或選定的哺乳動物細胞(例如，腫瘤細胞)可自哺乳動物取出，并將所述核酸表達載體以足以導(dǎo)致所編碼多肽被攝取和表達的量在體外導(dǎo)入所述細胞中?；蛘撸怂峄虬景l(fā)明核酸的載體采用在體外培養(yǎng)的細胞進行制備。一方面，制備本發(fā)明多肽的方法包括將重組表達載體導(dǎo)入細胞群中，所述重組表達載體包含本文所述本發(fā)明的任何核酸，其量和配制將可導(dǎo)致載體的攝取和所編碼多肽的表達；通過本文所述任何導(dǎo)入/遞送方式將該表達載體施用于哺乳動物體內(nèi)；和從該哺乳動物或從該哺乳動物的副產(chǎn)品中分離所述多肽。抗體在本發(fā)明的另一方面，使用本發(fā)明的多肽(或其抗原性片段)生產(chǎn)抗體，所述抗體具有例如診斷、預(yù)防和治療用途，例如與所述多肽及其片段的活性，分布和表達相關(guān)。通過本領(lǐng)域眾所周知的方法可以產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的抗體。所述抗體包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合的，人源化的、單鏈、Fab片段和通過Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。對治療或預(yù)防用途而言，抗體例如阻斷受體結(jié)合的抗體是特別優(yōu)選的。用于誘導(dǎo)抗體的多肽無需具有生物活性；然而，所述多肽或肽必須具備抗原性。用于誘導(dǎo)特定抗體的肽可具有由至少約IO個氨基酸，優(yōu)選至少約15或20個氨基酸或至少25或30個氨基酸組成的氨基酸序列。多肽的短片革爻可與另一種蛋白質(zhì)，如匙孑L血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin)融合，并產(chǎn)生抗嵌合分子抗體。產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，很多抗體是可以4尋到的。參見例^口Coligan(1991)CurrentProtocolsinImmunologyWiley/Greene,NY;andHarlowandLane(1989)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,NY;Stites等(編)BasicandClinicalImmunology(4thed.)LangeMedicalPublications,LosAltos,CA和其中提及的參考文獻；Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(2ded.)AcademicPress,NewYork,NY;以及KohlerandMilstein(1975)Nature256:495-497。其它適當(dāng)?shù)目贵w制備技術(shù)包括在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體文庫，參見Huse等(1989)Science246:1275-1281和Ward等(1989)Nature341:544-546。特異性的單克隆和多克隆抗體及抗血清通常以至少約為0.1pM,優(yōu)選至少約為O.Ol(iM或更好，最常見并優(yōu)選為0.001piM或更好的Kd結(jié)合。制備嵌合(人源化)抗體的詳細方法可見于美國專利5,482,856。有關(guān)人源化和其它抗體制備和改造技術(shù)的其它細節(jié)可參見Borrebaeck(編)(1995)AntibodyEngineering,2nEdition,FreemanandCompany,NY(Borrebaeck);McCafferty等(1996)AntibodyEngineering,APracticalApproach,IRLatOxfordPress,Oxford,England(McCafferty)和Paul(1995)AntibodyEngineeringProtocols,HumanaPress,Towata,NJ(Paul)。一方面，本發(fā)明提供了完全人源化的抗本發(fā)明多肽或其片段的抗體。在抗體被用作人患者的體內(nèi)預(yù)防劑和/或治療劑的應(yīng)用中，人源化抗體特別合乎需要。人抗體的特征為由人免疫球蛋白序列組成?？梢允褂煤芏喾N方法生產(chǎn)本發(fā)明的人抗體(參見例如Larrick等，美國專利5,001,065以及BorrebaeckMcCafferty與Paul,文獻同上，綜述)。一方面，起初在三元雜交瘤細胞中生產(chǎn)本發(fā)明的人抗體。然后將編碼該抗體的基因克隆至其它細胞如非人哺乳動物細胞，并在其中表達。通過三元雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)人抗體的一般方法描述于Ostberg等(1983)，Hybridoma2:361367,Ostberg,美國專利4，634，664和Engelman等，美國專利4,634,666。通過此方法獲得的產(chǎn)抗體細胞系被稱為三元雜交瘤，因為它們是三個細胞即兩個人型細胞和一個小鼠細胞的后代。已發(fā)現(xiàn)與制備自人細胞的普通雜交瘤相比，三元雜交瘤能更加穩(wěn)定地生產(chǎn)抗體。本說明書通篇給出本發(fā)明多肽的其它用途。干擾素-oc偶聯(lián)物另一方面，本發(fā)明涉及偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含表現(xiàn)出干擾素-a活性、含SEQIDNO:2-35和SEQIDNO:37-44中任一氨基酸序列的多肽以及至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6,1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。應(yīng)當(dāng)理解所述偶聯(lián)物也可表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如，抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。另一方面，偶聯(lián)物包含表現(xiàn)出干擾素-oc活性的多肽，所述多肽包含這樣的氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:l在1至16個氨基酸位置中不同，并且，相對于SEQIDNO:l而言，含有一個或多個選自下列的取代F48A/L;V51P;F55A;F65A;F68P;L111A和V114P;所述偶聯(lián)物還含有至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的l-6，1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。在一些情況下，氨基酸序列還包含一個或多個取代，所述取代導(dǎo)入了非多肽部分的連接基團(例如，通過用包含非多肽部分的連接基團的不同殘基取代氨基酸殘基，或通過插入包含非多肽部分的連接基團的其它氨基酸殘基)。應(yīng)當(dāng)理解偶聯(lián)物也表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如，抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:l在l-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:l而言，含有取代F48A/L,所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連4妻的1-6,1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:l在1，2,3,4,5,6，7，8,9,10，11,12,13,14，15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，1-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。一些所述偶聯(lián)物相對于SEQIDNO:l而言，含有取代F48A。一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;V51A/P;Q52P/E;A53T;F55A/S;L56V;F65A;F57L;Y58H;M61I;F68P;L111A;N113K;V114E/P和E160D。一些所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出千擾素-a活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:l在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:l而言，含有取代F55A,所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6,1-5,1-4，1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:l在1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13，14,15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在l-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，1-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或l-2個氨基酸位置中不同的序列。一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;F48A/L;V51A/P;Q52P/E;A53T;L56V;F65A;F57L;Y58H;M61I;F68P;L111A;N113K;VI14E/P和E160D。一些所述偶耳關(guān)物表現(xiàn)出干擾素-oc活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:l在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:l而言，含有取代F65A,所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的l-6，1-5，1-4，1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:l在1,2，3,4,5,6,7,8,9,10,11，12,13,14，15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在l-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，1-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或l-2個氨基酸位置中不同的序列。一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個耳又代H47Q;F48A/L;V51A/P;Q52P/E;A53T;F55A/S;L56V;F57L;Y58H;M61I;F68P;L111A;N113K;V114E/P和E160D。一些所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:1在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:1而言，含有取代L111A,所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6,1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:l在1,2,3,4,5,6，7，8,9，10,11,12,13，14,15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，1-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或l-2個氨基酸位置中不同的序列。一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:l而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;F48A/L;V51A/P;Q52P/E;A53T;F55A/S;L56V;F65A;F57L;Y58H;M61I;F68P;N113K;V114E/P和E160D。一些所述偶耳關(guān)物表現(xiàn)出千擾素-a活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:13在0-16個氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一個或多個第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第111位的Ala和第114位的Pro(相對于SEQIDNO:13的位置編號)，所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6，1-5,1-4，1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:13在O,1,2,3,4,5,6，7,8,9,10,11，12:13,14,15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在0-15個氨基酸位置，0-14個氨基酸位置，0-13個氨基酸位置，0-12個氨基酸位置，0-11個氨基酸位置，0-10個氨基酸位置，0-9個氨基酸位置，0-8個氨基酸位置，0-7個氨基酸位置，0-6個氨基酸位置，0-5個氨基酸位置，0-4個氨基酸位置，0-3個氨基酸位置，0-2個氨基酸位置或0-1個氨基酸位置中不同的序列。一些這樣的偶聯(lián)物包含的多肽序列在第48位含有Ala或Leu。一些這樣的偶聯(lián)物包含的多肽序列在第48位含有Ala。在一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:13而言，還含有選自下列的一個或多個fl代H47Q;V51A;Q52P/E;A53T;F55S;L56V;F57L;Y58H;M61I;N113K;V114E和E160D。一些所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。另一方面，偶聯(lián)物包含表現(xiàn)出干擾素-a活性的多肽，所述多肽包含這樣的氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:36在1至16個氨基酸位置中不同，并且，相對于SEQIDNO:36而言，含有一個或多個選自下列的耳又代M21A;I24P;F48A/L;T51P;S55A;F65A;F68P;F90A;M93P;L111A;V114P;F124A;1127P和E160D;所述偶聯(lián)物還含有至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6，1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。在一些情況下，氨基酸序列還包含一個或多個取代，所述取代導(dǎo)入了非多肽部分的連接基團(例如，通過用包含非多肽部分的連接基團的不同殘基取代氨基酸殘基，或通過插入包含非多肽部分的連接基團的其它氨基酸殘基)。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:36而言，含有取代F48A/L,所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6，1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:36在1，2,3,4,5,6，7，8，9,10,11,12,13,14,15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，1-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或l-2個氨基酸位置中不同的序列。一些所述偶聯(lián)物相對于SEQIDNO:36而言，含有取代F48A。一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:36而言，還含有選自下列的一個或多個取代M21A;I24P;P26L;H47Q;T51V/P;S55P/F/A;V56L;H58Y;L60M;F65A;F68P;F90Y/A;M93L/P;N95D;L111A;N113K;V114E/P;F124A;R125Q;I127P;T132K;L154F和E160D。一些所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:36而言，含有取代F90A,所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6,1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:36在1，2,3，4,5,6,7,8,9,10,11,12,13，14,15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置中不同的序列。一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:36而言，還含有選自下列的一個或多個取代M21A;I24P;P26L;H47Q;F48A/L;T51V/P;S55P/F/A;V56L;H58Y;L60M;F65A;F68P;M93L/P;N95D;L111A;N113K;V114E/P;F124A;R125Q;I127P;T132K;L154F和E160D。一些所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同，并且(b)相對于SEQIDNO:36而言，含有取代E160D,所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6,1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:36在1,2,3,4,5，6,7,8,9,10,11,12,13,14，15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，1-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，l-3個氨基酸位置或l-2個氨基酸位置中不同的序列。一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:36而言，還含有選自下列的一個或多個取代M21A;I24P;P26L;H47Q;F48A/L;T51V/P;S55P/F/A;V56L;H58Y;L60M;F65A;F68P;F90Y/A;M93L/P;N95D;L111A;N113K;V114E/P;F124A;R125Q;I127P;T132K和L154F。一些所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出干擾素-oc活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物還包括一個或多個其它氨基酸，例如添加至多肽N-末端的曱硫氨酸。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物，其各包含這樣的多肽，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:38在0-16個氨基酸位置中不同，并且(b)含有下述氨基酸中的一個或多個第21位的Ala;第24位的Pro;第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第90位的Ala;第93位的Pro;第111位的Ala;第114位的Pro;第124位的Ala;第127位的Pro;和第160位的Glu(相對于SEQIDNO:38的位置編號)，所述偶聯(lián)物還包含至少一個與多肽連接的非多肽部分，諸如與多肽連接的1-6,1-5,1-4,1-3,例如1或2個非多肽部分。一些這樣的偶聯(lián)物含有與SEQIDNO:38在0，1,2,3，4,5，6,7,8,9,10,11，12，13，14，15或16個氨基酸位置中不同的多肽序列，例如在0-15個氨基酸位置，0-14個氨基酸位置，0-13個氨基酸位置，0-12個氨基酸位置，0-ll個氨基酸位置，0-10個氨基酸位置，0-9個氨基酸位置，0-8個氨基酸位置，0-7個氨基酸位置，0-6個氨基酸位置，0-5個氨基酸位置，0-4個氨基酸位置，0-3個氨基酸位置，0-2個氨基酸位置或0-1個氨基酸位置中不同的序列。一些這樣的偶聯(lián)物包含的多肽序列在第48位含有Ala或Leu。一些這樣的偶聯(lián)物包含的多肽序列在第48位含有Ala。在一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:38而言，還含有選自下列的一個或多個取代P26L;H47Q;V51T;F55P/S;L56V;Y58H;L60M;F90Y;M93L;N95D;N113K;V114E;R125Q;T132K和F154L。一些所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出干擾素-a活性(諸如抗病毒活性、TH1分化活性和/或抗增殖活性)。一些所述偶聯(lián)物包含的多肽序列還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。術(shù)語"偶聯(lián)物"(或可互換的"多肽偶聯(lián)物"或"偶聯(lián)的多肽")意指由一個或多個本發(fā)明的多肽共價連接到一個或多個非多肽部分上形成的異源(就組合物而言(inthesenseofcomposite))分子。術(shù)語"共價連接"的意思是多肽和非多肽部分直接4皮此共價連接，或者通過諸如橋接(bridge),間隔物(spacer),或連接部分等的一個或多個間插部分(interveningmoiety)間才妻4皮此共價連接。優(yōu)選的是，偶聯(lián)的多肽在有關(guān)濃度和條件下是可溶的，即在諸如血液等生理學(xué)液體中是可溶的。本發(fā)明偶聯(lián)的多肽的例子包括糖基化和/或PEG化多肽。對于偶聯(lián)的多肽的多肽部分可使用術(shù)語"非偶聯(lián)型多肽"。術(shù)語"非多肽部分"意指能與多肽的連接基團偶聯(lián)的分子。非肽部分的優(yōu)選例子包括聚合物分子，親脂性化合物，或有機衍生物，具體是聚合物分子或糖部分。應(yīng)當(dāng)理解非多肽部分經(jīng)由多肽的連接基團而與該多肽連接。除非在與多肽連接的非多肽部分，諸如聚合物分子的數(shù)量被指明的情況，對與多肽連接的或本發(fā)明中使用的其它"非多肽部分"的每一個指稱均應(yīng)指與多肽連接的一個或多個非多肽部分。術(shù)語"聚合物分子"定義為由兩個或多個單體共價連接形成的分子，其中沒有一個單體是氨基酸殘基。術(shù)語"聚合物"可與術(shù)語"聚合物分子"互換使用。術(shù)語"糖部分"意指通過體內(nèi)或體外糖基化，諸如N-或O-糖基化連接的碳水化合物分子。"N-糖基化位點"具有序列N-X-S/T/C，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，S/T/C是絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，最優(yōu)選蘇氨酸。"O-糖基化位點"是絲氨酸或蘇氨酸殘基的-OH基。術(shù)語"連接基團"意指能偶聯(lián)到諸如聚合物分子或糖部分的有關(guān)非多肽部分上的氨基酸殘基基團。下表4中提供了有用的連接基團及一些相應(yīng)非多肽部分的非限制性實例。表4有用的連接基團和相應(yīng)非多肽部分的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>對于體內(nèi)N-糖基化而言，術(shù)語"連接基團"以非常規(guī)的方式使用，指組成N-糖基化位點(具有序列N-X-S/T/C,其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸殘基，N是天冬酰胺，S/T/C是絲氨酸，蘇氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，且最優(yōu)選蘇氨酸)的氨基酸殘基。盡管N-糖基化位點的天冬酰胺殘基是糖部分在糖基化期間所連接的殘基，但除非存在N-糖基化位點的其它氨基酸殘基，否則將不能實現(xiàn)該連接。因此，當(dāng)非多肽部分是糖部分，且偶聯(lián)是通過N-糖基化實現(xiàn)時，與本發(fā)明多肽的氨基酸序列改變關(guān)聯(lián)使用的術(shù)語"含有非多肽部分連接基團的氨基酸殘基"應(yīng)理解為，組成N-糖基化位點的一個，兩個或所有氨基酸殘基將以這樣的方式改變，即將功能性N-糖基化位點引入氨基酸序列或從所述序列中去掉該位點，或在所述氨基酸序列中保留了功能性N-糖基化位點(例如，通過用蘇氨酸殘基取代作為部分N-糖基化位點的絲氨酸殘基，反之亦然)。術(shù)語"引入"(即，"引入的"氨基酸殘基，氨基酸殘基的"引入")主要是指現(xiàn)有氨基酸殘基被取代為另一氨基酸殘基，但也可指插入其它的氨基酸殘基。術(shù)語"去除"(即，"去除的"氨基酸殘基，"氨基酸殘基的去除")主要是指待去除的氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代，但也指待去除的氨基酸殘基的缺失(沒有取代)。術(shù)語"含有非多肽部分連接基團的氨基酸殘基"是與非多肽部分結(jié)合的氨基酸殘基(對于引入的氨基酸殘基而言)，或可與該非多肽部分結(jié)合的氨基酸殘基(對于去除的氨基酸殘基而言)。術(shù)語"功能性體內(nèi)半壽期"使用其通常的含義，即多肽在體內(nèi)/靶器官中仍具有50%生物活性的時間，或者多肽的活性為最初活性的50%的時間。功能性體內(nèi)半壽期可在受試動物，諸如大鼠，小鼠，兔，犬或猴中測定。優(yōu)選地，功能性體內(nèi)半壽期在非人靈長類，諸如猴中測定。此外，可對測定已通過靜脈內(nèi)或皮下施用的樣品的功能性體內(nèi)半壽期。作為測定功能性體內(nèi)半壽期的可選方式，可測定"血清半壽期，，，即，50%的多肽在被清除之前在血漿或血流中循環(huán)的時間。血清半壽期的測定常常比功能性體內(nèi)半壽期的測定簡單，并且血清半壽期的量級通?？梢院芎玫刂甘竟δ苄泽w內(nèi)半壽期的量級。血清半壽期的其它可替換術(shù)語包括"血漿半壽期"、"循環(huán)半壽期"、"血清清除"、"血漿清除"和"清除半壽期"。血清半壽期可按照上述與功能性體內(nèi)半壽期測定相關(guān)的內(nèi)容進行測定。術(shù)語"血清，，使用其通常的含義，即不含纖維蛋白原和其它凝血因子的血漿。涉及功能性體內(nèi)半壽期或血清半壽期的術(shù)語"增加"用于指，本發(fā)明的偶聯(lián)物的相關(guān)半壽期相對于參照分子的所述半壽期而言有統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加，所述參照分子諸如野生型干擾素-a,例如，人干擾素-a,諸如SEQIDNO:45-SEQIDNO:56之一(或如本文和/或AllenG.和DiazM.O.(1996),文獻同上所述的其它huIFN-a序列)或相應(yīng)的非偶聯(lián)型的多肽。因此，本發(fā)明的興趣偶聯(lián)物包括與上述參照分子相比，其功能性體內(nèi)半壽期或血清半壽期增加的偶聯(lián)物。術(shù)語"AUCsc"或"皮下給藥時的曲線下面積"用其常規(guī)含義，即血清干擾素-a活性-時間曲線以下的面積，這里所述的偶聯(lián)分子經(jīng)皮下給藥受試動物。一旦測定了實驗干擾素-a活性-時間點，就可利用計算機程序，諸如GraphPadPrism3.01常規(guī)計算AUCsc。涉及AUCse的術(shù)語"增加"用于指，當(dāng)靜脈給藥并且在可比條件下測定時，本發(fā)明偶聯(lián)物的曲線下面積相對于參照分子的所述面積有統(tǒng)計學(xué)顯著的增加，所述參照分子諸如野生型干擾素-a,例如人千擾素-a,諸如SEQIDNO:45-SEQIDNO:56之一(或如本文和/或AllenG.和DiazM.O.(1996),文獻同上所述的其它huIFN-oc序列)，或相應(yīng)非偶聯(lián)型多肽。顯然，本發(fā)明偶聯(lián)物與參照分子所用的干擾素-a活性量應(yīng)該相同。結(jié)果是，為了直接比較不同的干擾素-a分子，可將AUCse值標(biāo)準(zhǔn)化，即它們可表示為AUCJ施用劑量。術(shù)語"Tmaxsc，，用于指血清干擾素-a活性-時間曲線中，觀察到血清中最高水平干擾素-Ot活性的時間。應(yīng)當(dāng)理解雖然本文提供的實施例和對親本多肽的修飾是相對于序列SEQIDNO:l而言的，所7>開的修飾還可在本文所述本發(fā)明的任何其它多肽(包括SEQIDNO:2_35和3744和其變體)的等效氨基酸位置進行。通過去除和/或引入包含偶聯(lián)非多肽部分的連接基團的氨基酸殘基，可以特異性地改造多肽，以便使得該分子更易于與所選非多肽部分偶聯(lián)，以便最優(yōu)化偶聯(lián)模式(例如確保干擾素-a分子的表面非多肽部分的最優(yōu)分布，由此例如有效地保護(shield)表位和多肽的其它表面部分而不會顯著地破壞其功能)。例如，通過引入連接基團，干擾素-a多肽中與非多肽部分所結(jié)合的具體氨基酸殘基的含量改變，由此實現(xiàn)更有效、特異和/或廣泛的偶聯(lián)。通過去除一個或多個連接基團，可以避免與其中該偶聯(lián)是不利的部分多肽中的非多肽部分發(fā)生偶聯(lián)，例如與位于多肽功能位點上或附近的氨基酸殘基(因為在所述位點的偶聯(lián)會導(dǎo)致合成的偶聯(lián)物的干擾素-ot活性失活或降低，這是由于受體識別被破壞)。更進一步，去除位于其它連接基團附近的連接基團是有利的。應(yīng)當(dāng)理解，包含非多肽部分的連接基團的氨基酸殘基(無論被去除或是引入)基于非多肽部分的性質(zhì)選出且，在一些情況下基于使用的偶聯(lián)方法。例如，當(dāng)非多肽部分是聚合物分子時，諸如聚乙二醇或聚烯基氧化物衍生的分子，能作為連接基團發(fā)揮功能的氨基酸殘基可選自半胱氨酸、賴氨酸(和/或多肽的N末端氨基)、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸或精氨酸。當(dāng)非多肽部分是糖部分時，連接基團是體內(nèi)或體外N-糖基化位點或O-糖基化位點，優(yōu)選N-糖基化位點。在一些情況下，當(dāng)非多肽部分的連接基團要引入到干擾素-a多肽或從干擾素-a多肽去除時，要被修飾的干擾素-a多肽的位置可如下方便地選擇被修飾的位置可以位于干擾素-a多肽的表面，諸如被一種氨基酸殘基占據(jù)的位置，所述氨基酸殘基大于25%的側(cè)鏈暴露于溶劑，諸如其大于50%的側(cè)鏈暴露于溶劑。以人干擾素-a2a分子3D結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)鑒定所述位置，如在本文"材料和方法"章節(jié)中所述。為了測定連接基團的最佳分布，以干擾素-a多肽的3D結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，計算位于干擾素-a分子表面的氨基酸殘基間的距離。更具體地，包含所述連接基團的氨基酸殘基的CB間的距離，或測定一個氨基酸殘基的官能團(賴氨酸的NZ,天冬氨酸的CG,谷氨酸的CD,半胱氨酸的SG)和包含連接基團的另一氨基酸殘基的CB間的距離。在甘氨酸的情況中，用CA代替CB。在本發(fā)明偶聯(lián)物的干擾素-a多肽部分中，為了避免或減少異源偶聯(lián)并提供連接基團的均勻分布，例如為了表位保護的目的，任何所述距離可大于8A，諸如大于10A。此外，在本發(fā)明偶聯(lián)物的干擾素-a多肽部分中，在一些情況下，位于干擾素-a的受體結(jié)合部位或其附近的連接基團被去除，諸如通過包含所述基團的氨基酸殘基的取代。在一些情況下，包含非多肽部分的連接基團的氨基酸殘基，諸如半胱氨酸或賴氨酸，不常被引入到干擾素a分子的受體結(jié)合部位或附近。修飾千擾素-a多肽的其它方式是通過與非多肽部分的偶聯(lián)，保護并由此修飾或破壞或滅活存在于親本千擾素-a中的表位。干擾素-a多肽的表位可使用本領(lǐng)域已知方法鑒定，也稱為表位作圖，參見例如Romagnoli等，J.BiolChem.，1999,380(5):553-9，DeLisserHM,MethodsMolBiol,1999,96:11-20，VandeWater等,ClinImmunolImmunopathol,1997，85(3):229-35,Saint-RemyJM,Toxicology,1997，119(1):77-81,和LaneDP和StephenCW,CurrOpinImmunol,1993，5(2):268-71。一種方法是建立噬菌體展示文庫，其表達例如，9氨基酸殘基的任意寡肽。通過免疫沉淀純化來自特異性抗血清的抗人干擾素-ocIgGl抗體，通過免疫印跡識別活性噬菌體。通過對純化的活性噬菌體DNA的序列測定，然后將該序列定位于千擾素-oc的3D結(jié)構(gòu)，可以測定寡肽的序列?？蛇x地，依照美國專利5，041，376描述的方法可以鑒定表位。由此鑒定的該結(jié)構(gòu)上的區(qū)構(gòu)成表位，其可被選出作為用于引入偶聯(lián)非多肽部分的連接基團的靶區(qū)。優(yōu)選地，干擾素-a的至少一個表位，諸如兩個，三個或四個表位可被根據(jù)本發(fā)明的非多肽部分保護。因此，在一個方面中，與野生型人干擾素-a(包括任何商業(yè)上可以得到的干擾素-a)相比，本發(fā)明的偶聯(lián)物具有至少一個受到保護的表位。這可以通過將非多肽部分的連接基團引入至位于給定表位鄰近的位置(即在初始序列中4個氨基酸殘基之內(nèi)或在三級序列中約10A之內(nèi))來實現(xiàn)。在CB(在甘氨酸的情況下為CA)之間測定10A。以下章節(jié)中描述了所述具體引入。在去除連接基團的情況下，包括所述基團并占據(jù)上述位置的相關(guān)氨基酸殘基可被不包含用于偶聯(lián)目的非多肽部分的連接基團的不同氨基酸殘基取代，或可被缺失。N-糖基化基團的去除也可通過插入或去除基序N-X-S/T/C中的氨基酸殘基而實現(xiàn)。在引入連接基團的情況下，將包含所述基團的氨基酸殘基引入所述位置中，諸如通過取代占據(jù)所述位置的氨基酸殘基?？捎糜谂悸?lián)并存在于干擾素-a多肽中的連接基團的準(zhǔn)確數(shù)目依賴于需要通過偶聯(lián)來實現(xiàn)的效果。例如，欲得到的效果例如依賴于偶聯(lián)的性質(zhì)和程度(例如非多肽部分的鑒定，需要或可能與多肽偶聯(lián)的非多肽部分的數(shù)量，其應(yīng)被偶聯(lián)或應(yīng)避免所述偶聯(lián)的情況等)。例如，如果需要降低的免疫原性，連接基團的數(shù)量(和位置)應(yīng)足以保護大多數(shù)或全部表位。這通常在保護較大比例的干擾素-a多肽時實現(xiàn)。表位的有效保護通常在可用于偶聯(lián)的連接基團的總數(shù)為l-6個連接基團，例如，1-5個，諸如l-3個，諸如l，2,或3個連接基團時得以實現(xiàn)。功能性體內(nèi)半壽期依賴于偶聯(lián)物的分子量，提供增加的半壽期所需的連接基團的數(shù)量，由此依賴于目的非多肽部分的分子量。一些所述偶聯(lián)物包含1-6,例如，1-5，諸如1-3，例如1,2或3個非多肽部分，其各自的MW為約2-40kDa,諸如約2kDa,約5kDa,約12kDa，約15kDa，約20kDa，約30kDa或約40kDa。在本發(fā)明的偶聯(lián)物中，一些、大多數(shù)、和基本上全部可偶聯(lián)的連接基團可被相關(guān)的非多肽部分占據(jù)。本發(fā)明的偶聯(lián)物可表現(xiàn)出一種或多種以下改善的特性例如，與人干擾素-ot(諸如在本文中被確定為SEQIDNO:45-57的任何多肽，或本文和/或如上文AllenG.和DiazM.O.(1996),文獻同上所述的4壬何其它huIFN-a)或相應(yīng)的非偶聯(lián)型的多肽相比，所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出降低的免疫原性，例如與非偶聯(lián)型的多肽或人干擾素-a相比，降低了至少10%,諸如降低了至少25%,諸如降低了至少50%，例如降低了至少75%。另一方面，偶聯(lián)物可表現(xiàn)出與來自用人干擾素-a(諸如在本文中被確定為SEQIDNO:45-57的任何多肽，或本文和/或如上文AllenG.和DiazM.O.(1996),文獻同上所述的任何其它huIFN-a)或與相應(yīng)非偶聯(lián)型的多肽所治療患者的中和抗體的反應(yīng)降低或無反應(yīng)，例如中和降低至少10%,諸如至少25%，諸如至少50%,例如至少75%。在本發(fā)明的另一方面，與參照分子諸如人干擾素-a(諸如在本文中被確定為SEQIDNO:45-57的任何多肽，或本文和/或如上文AllenG.和DiazM.O.(1996)，文獻同上所述的任何其它huIFN-a)或相應(yīng)的非偶聯(lián)型多肽相比，所述偶聯(lián)物可表現(xiàn)出增加的體內(nèi)半壽期和/或增加的血清半壽期。具體優(yōu)選的偶聯(lián)物是這樣的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物的功能性體內(nèi)半壽期(或血清半壽期)與所述參照分子的功能性體內(nèi)半壽期(或血清半壽期)之間的比率為至少1.25,諸如至少1.50，-渚如至少1.75，》者如至少2,-諸如至少3,t者如至少4,諸如至少5,諸如至少6,諸如至少7，諸如至少8。如上所述，半壽期可在受試動物諸如大鼠或猴中方便地測定，且基于靜脈內(nèi)或皮下給藥。另一方面，與參照分子諸如人干擾素-a(諸如在本文中被確定為SEQIDNO:45-57的任何多肽，或本文和/或如上文AllenG.和DiazM.O.(1996),文獻同上所述的任何其它huIFN-a)或相應(yīng)的非偶聯(lián)型多肽相比，所述偶耳關(guān)物可表現(xiàn)出增加的生物利用度。例如，與參照分子諸如人干擾素-a或相應(yīng)的非偶聯(lián)型多肽相比，偶聯(lián)物可表現(xiàn)出增高的AUCSC。因此，示例性偶聯(lián)物這樣的偶聯(lián)物，當(dāng)經(jīng)皮下施用時，具體是經(jīng)皮下施用于受試動物諸如大鼠或猴時，所述偶聯(lián)物的AUCSC與所述參照分子的AUCse之間的比率為至少1.25,:諾如至少1.5,諸如至少2,諸如至少3，諸如至少4,-諸如至少5或至少6,諸如至少7,諸如至少8,諸如至少9或至少10,諸如至少12,諸如至少14，例如至少16,至少18或至少20。類似;也，當(dāng)經(jīng)皮下施用時，具體是經(jīng)皮下施用于受試動物諸如大鼠或猴時，本發(fā)明的一些偶聯(lián)物是這樣的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物的Tmax與所述參照分子諸如人干擾素-a或相應(yīng)的非偶聯(lián)型多肽的Tm肌之間的比率為至少1.2，諸如至少1.4,例如至少1.6,諸如至少1.8,諸如至少2,例如至少2.5,諸如至少3,諸如至少4,例如至少5,-諾如至少6,諸如至少7，例如至少8,諸如至少9,諸如至少10。在一些情況下，本發(fā)明偶聯(lián)物的抗病毒活性量級(magnitude)與人干擾素-a(諸如在本文中被確定為SEQIDNO:45-57的任何多肽，或本文和/或如上文AllenG.和DiazM.O.(1996),文獻同上所述的4壬何其它huIFN-a)或相應(yīng)的非偶聯(lián)型多肽的所述活性相比降低(例如降低至少約75%,至少約50%,至少約25%,至少約10%)或增加(例如增加至少約10%)或是大約相等(例如在約+/-10%或約+/-5%之內(nèi))。在一些情況下，與本發(fā)明偶聯(lián)物的抗增殖活性相比，抗病毒活性的程度(degree)可有所變化，由此可高于、低于或大約等于人干擾素-a或相應(yīng)非偶聯(lián)型多肽的程度。本發(fā)終^偶凝參，^詐単,農(nóng)傘^與^我^豸差4'AMt端W麼錄合一方面，本發(fā)明涉及這樣的偶聯(lián)物，其表現(xiàn)出干擾素-a活性且包括至少一個非多肽部分，該非多肽部分與干擾素-a多肽的至少一個賴氨酸殘基和/或N-末端氨基偶4關(guān)，所述干擾素-a多肽含有選自SEQIDNO:2-35和37-44的序列。一些所述偶聯(lián)物含有與賴氨酸殘基連接的非多肽部分，所述賴氨酸殘基選自K31，K50,K71，K84,K122,K134,K135和K165;例如選自K31，K122,K135和K165。一些所述偶聯(lián)物含有與選自K31,K122和K135的賴氨酸殘基連接的非多肽部分。一些所述偶聯(lián)物含有與選自K122和K135的賴氨酸殘基連接的非多肽部分。一些所述偶聯(lián)物含有與選自K31和K122;或K31和K135的賴氨酸殘基連接的非多肽部分。另一方面，本發(fā)明涉及這樣的偶聯(lián)物，其表現(xiàn)出千擾素-a活性且包括至少一個非多肽部分，該非多肽部分與干擾素-a多肽的至少一個賴氨酸殘基，或與N-末端氨基偶聯(lián)，所述干擾素-a多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:l在1-16個氨基酸位置中不同(例如在1-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，1-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，1-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，l-3個氨基酸位置或在1-2個氨基酸位置中存在不同)，(b)相對于SEQIDNO:1含有一個或多個選自下列的取代F48A/L;V51P;F55A;F65A;F68P;L111A和V114P。一些所述偶聯(lián)物包含的多肽序列還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。一些根據(jù)此方面的偶聯(lián)物含有至少一個被去除的賴氨酸殘基和/或至少一個被去除的組氨酸殘基，和/或至少一個被引入的賴氨酸殘基。另一方面，本發(fā)明涉及這樣的偶聯(lián)物，其表現(xiàn)出干擾素-a活性且包括至少一個非多肽部分，該非多肽部分與干擾素-a多肽的至少一個賴氨酸殘基，或與N-末端氨基偶聯(lián)，所述干擾素-ot多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:13在0-16個氨基酸位置中不同(例如在0-15個氨基酸位置，0-14個氨基酸位置，0-13個氨基酸位置，0-12個氨基酸位置，0-11個氨基酸位置，0-10個氨基酸位置，0-9個氨基酸位置，0-8個氨基酸位置，0-7個氨基酸位置，0-6個氨基酸位置，0-5個氨基酸位置，0-4個氨基酸位置，0-3個氨基酸位置，0-2個氨基酸位置或0-1個氨基酸位置中存在不同)，并且(b)含有下述氨基酸中的一個或多個第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第111位的Ala和第114位的Pro(相對于SEQIDNO:13的位置編號)。一些這樣的偶^4物包含的多肽序列在第48位含有Ala或Leu。一些這樣的偶聯(lián)物包含的多肽序列在第48位含有Ala。在一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:13而言，還含有選自下列的一個或多個取代H47Q;V51A;Q52P/E;A53T;F55S;L56V;F57L;Y58H;M61I;N113K;V114E和E160D。一些所述偶聯(lián)物包含的多肽序列還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。一些根據(jù)此方面的偶聯(lián)物含有至少一個被去除的賴氨酸殘基和/或至少一個被去除的組氨酸殘基，和/或至少一個被引入的賴氨酸殘基。另一方面，本發(fā)明涉及這樣的偶聯(lián)物，其表現(xiàn)出干擾素-a活性且包括至少一個非多肽部分，該非多肽部分與干擾素-a多肽的至少一個賴氨酸殘基，或與N-末端氨基偶聯(lián)，所述干擾素-a多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同(例如在1-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或在1-2個氨基酸位置中存在不同)，(b)相對于SEQIDNO:36含有一個或多個選自下列的取代M21A;I24P;F48A/L;T51P;S55A;F65A;F68P;F90A;M93P;L111A;V114P;F124A;I127P和E160D。一些所述偶聯(lián)物包含的多肽序列還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱A乾氨酸。一些根據(jù)此方面的偶聯(lián)物含有至少一個被去除的賴氨酸殘基和/或至少一個被去除的組氨酸殘基，和/或至少一個被引入的賴氨酸殘基。本發(fā)明還提供了這樣的偶聯(lián)物，其表現(xiàn)出干擾素-a活性且包括至少一個非多肽部分，該非多肽部分與干擾素-a多肽的至少一個賴氨酸殘基，或與N-末端氨基偶聯(lián)，所述干擾素-a多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:38在0-16個氨基酸位置中不同(例如在0-15個氨基酸位置，0-14個氨基酸位置，0-13個氨基酸位置，0-12個氨基酸位置，0-ll個氨基酸位置，0-10個氨基酸位置，0-9個氨基酸位置，0-8個氨基酸位置，0-7個氨基酸位置，0-6個氨基酸位置，0-5個氨基酸位置，0-4個氨基酸位置，0-3個氨基酸位置，0-2個氨基酸位置或0-1個氨基酸位置中存在不同)，并且(b)含有下述氨基酸中的一個或多個第21位的Ala;第24位的Pro;第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第90位的Ala;第93位的Pro;第111位的Ala;第114位的Pro;第124位的Ala;第127位的Pro;和第160位的Glu(相對于SEQIDNO:38的位置編號)。一些這樣的偶聯(lián)物包含的多肽序列在第48位含有Ala或Leu。一些這樣的偶聯(lián)物包含的多肽序列在第48位含有Ala。在一些情況下，該偶聯(lián)物的多肽部分相對于SEQIDNO:38而言，還含有選自下列的一個或多個取代P26L;H47Q;V51T;F55P/S;L56V;Y58H;L60M;F90Y;M93L;N95D;N113K;V114E;R125Q;T132K和F154L。一些所述偶聯(lián)物包含的多肽序列還含有一個或多個其它的氨基酸，例如添加至N-末端的曱硫氨酸。一些根據(jù)此方面的偶聯(lián)物含有至少一個被去除的賴氨酸殘基和/或至少一個被去除的組氨酸殘基，和/或至少一個被引入的賴氨酸殘基。本發(fā)明的一些偶聯(lián)物包含的多肽序列含有氨基酸殘基對不同氨基酸殘基的取代或氨基酸殘基的缺失，所述取代或缺失從本發(fā)明的多肽，例如SEQIDNO:2-35和37-44之一中去除了一個或多個賴氨酸，例如K31,K50,K71，K84,K122,K133,K134，K135和/或K165中的一個或多個。被去除的一個或多個賴氨酸殘基可被任何其它氨基酸所取代，可被Arg(R)或Gln(Q)所取代，或可被缺失。在使用胺反應(yīng)性偶聯(lián)化學(xué)時，避免或?qū)⑴c組氨酸殘基偶聯(lián)的可能性最小化是有益的。因此，一些本發(fā)明的偶聯(lián)物包括一種多肽序列，該多肽序列含有從任何本發(fā)明的多肽中去除一個或多個組氨酸例如H7，Hll，H34和/或H47(相對于SEQIDNO:l)的取代或缺失，所述本發(fā)明的多肽序列例如為SEQIDNO:2-35和37-44之一。要,皮去除的一個或多個組氨酸殘基可以^皮任何其它氨基酸取代，可被Arg(R)或Gln(Q)取代，或被缺失。一些所述偶聯(lián)物包含取代H34Q;H47Q;或H34Q+H47Q?？蛇x地，或此外，一些本發(fā)明的偶聯(lián)物包括含有修飾的多肽序列，所述修飾將賴氨酸引入親本序列(例如，SEQIDNO:2-35和37-44之一)，引入位置是被暴露于該分子表面的氨基酸殘基所占據(jù)的位置，所述氨基酸殘基例如是至少25%,諸如至少50%的側(cè)鏈暴露于表面的氨基酸殘基。一些所述偶聯(lián)物包括這樣的多肽序列，該多肽序列包含一種或多種以下取代(相對于SEQIDNO:l),其將賴氨酸殘基引入據(jù)預(yù)測會暴露于該分子表面且具有超過25%分數(shù)ASA的位置D2K，L3K,P4K，Q5K,T6K，H7K,S8K,L9K，G10K,R12K,R13K,M16K，A19K,Q20K，R22K，R23K,I24K,S25K,L26K,F27K,S28K,L30K,R33K,H34K,D35K,R37K,Q40K,E41K,E42K,D44K,N46K,H47K，Q49K,V51K，Q52K，E59K，Q62K,Q63K,N66K，S69K,T70K,D72K,S74K,A75K，D78K，E79K,T80K,L81K,E83K,I87K,F90K，Q91K，N94K,D95K,E97K,A98K，V100K,M101K,Q102K，E103K,V104K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K,L111K，M112K,N113K,V114K,D115K,L118K,R121K，Q125K,R126K,T128K，L129K,T132K,E133K,Y136K，S137K，P138K,A146K,M149K,R150K,S153K,F154K,N157K,Q159K,E160K,S161K,L162K,R163K，S164K和E166K,所述氨基酸殘基位置相對于SEQIDNO:1。本發(fā)明的一些所述偶聯(lián)物包括這樣的多肽序列，該多肽序列包含一種或多種以下取代(相對于SEQIDNO:l)，其將賴氨酸殘基引入據(jù)預(yù)測會暴露于該分子表面且具有超過50%分數(shù)ASA的位置D2K,L3K，P4K,Q5K，T6K,H7K,S8K,L9K,R12K,R13K,M16K,A19K，S25K,F27K,S28K,R33K,H34K:D35K,R37K,E41K,D44K,N46K,H47K,Q49K,N66K,A75K，D78K,E79K,T80K,E83K,187K，F(xiàn)90K,Q91K,N94K，D95K,M101K,Q102K,E103K,G105K,E107K,E108K,T109K,P110K,L111K，V114K,D115K,L118K，R121K,Q125K,R126K,L129K,T132K,E133K,P138K，R150K，E160K，L162K，R163K,S164K和E166K,所述氨基酸殘基位置相對于SEQIDNO:l。應(yīng)當(dāng)理解，雖然在本文中對親本多肽修飾的實例通常相對于序列SEQIDNO:l(或相對于一些其它特定序列)給出，所公開的修飾還可在本文所述本發(fā)明任何其它多肽(包括SEQIDNO:2-35和37-44及其變體)的等效氨基酸位置實施。因此，作為實例，相對于SEQIDNO:l的取代H47K被認為對應(yīng)于SEQIDNO:37中的Q47K,等等。在本發(fā)明的該方面中涉及的非多肽部分包含聚合物分子，諸如在題目為"與聚合物分子偶聯(lián)"的章節(jié)中描述的任何分子，諸如PEG或mPEG或mPEG2。包含賴氨酸的多肽和聚合物分子之間的偶聯(lián)可以用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄍ瓿桑珙}目為"與聚合物分子偶聯(lián)"的章節(jié)中所述，例如使用所述章節(jié)描述的一步法或逐步法。PEG化干擾素-a多肽的示例性方法是如本文實施例5所述，采用賴氨酸反應(yīng)性PEG將PEG與賴氨酸殘基共價連接。許多高特異性賴氨酸反應(yīng)性PEG(琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA)，琥珀酰亞胺丁酸酯(SBA),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和醛(例如ButyrALD))以及大小不同的線性或分枝PEG(例如2-40kDa，諸如2kDa,5kDa,12kDa,15kDa,20kDa，30kDa或40kDa)可購4尋，例如獲自NektarTherapeuticsInc.,Huntsville,AL,USA或SunBio，AnyangCity,SouthKorea。另一方面，本發(fā)明包括含有偶聯(lián)物群體的組合物，其中所述群體中的大多數(shù)偶聯(lián)物各含有與多肽的單個賴氨酸殘基或N-末端氨基共價連接的單個非多肽部分(例如單個聚合物分子，如單個PEG,如線性PEG或分枝PEG)。例如，本發(fā)明的"單偶聯(lián)的"(如"單PEG化的")組合物含有所述偶聯(lián)物的一個或多個"位置異構(gòu)體"，其中每個位置異構(gòu)體含有與多肽的單個賴氨酸殘基共價連接的單個非多肽部分(如單個PEG分子)。本發(fā)明包括含有偶聯(lián)物群體的單PEG化組合物，其中所述群體中的大多數(shù)偶聯(lián)物是位置異構(gòu)體，所述異構(gòu)體各含有與本發(fā)明多肽的單個賴氨酸殘基共價連接的單個PEG分子(如線性或分枝PEG,如2kDa,5kDa，12kDa，15kDa，20kDa,30kDa或40kDamPEG或mPEG2分子)。一些所述位置異構(gòu)體含有與選自K31,K50,K71，K84,K122，K134,K135和K165的賴氨酸殘基共價連接的單個PEG分子。一些所述位置異構(gòu)體含有與選自K31，K122,K135和K165的賴氨酸殘基共價連接的單個PEG分子。一些所述位置異構(gòu)體含有與選自K31，K122和K135的賴氨酸殘基共價連接的單個PEG分子，例如與選自K31和K122;K31和K135;或K122和K135的賴氨酸^基共價連接的單個PEG分子。本文實施例5描述了本發(fā)明的單PEG化組合物的制備。根據(jù)實施例5的方法，被鑒定為14epil8(SEQIDNO:13)的本發(fā)明多肽與40kDa分枝PEG(mPEG2-NHS)反應(yīng)得到單PEG化組合物，所述組合物主要含有兩個位置異構(gòu)體，一個具有與Lysl22共價連接的單個PEG部分，另一個具有與Lysl35共價連接的單個PEG部分。因此，本發(fā)明包括組合物(如單PEG化組合物)，所述組合物包括含有序列SEQIDNO:13的多肽偶聯(lián)物，其中PEG部分與Lysl22或Lysl35共價連接。本發(fā)明還包括組合物(如單PEG化組合物)，所述組合物包括含有序列SEQIDNO:13的多肽偶聯(lián)物，其中40kDaPEG部分(如40kDa分枝PEG部分)與Lysl22或Lysl35共價連接。當(dāng)根據(jù)實施例5的方法，另一例被鑒定為25epil9(SEQIDNO:38)的本發(fā)明多肽與40kDa分枝PEG(mPEG2-NHS)反應(yīng)得到單PEG化組合物，所述組合物主要含有三個位置異構(gòu)體，一個具有與Lys31共價連接的單個PEG部分，另一個具有與Lysl22共價連接的單個PEG部分，另一個具有與Lysl35共價連接的單個PEG部分。因此，本發(fā)明包括組合物(如單PEG化組合物)，所述組合物包括含有序列SEQIDNO:38的多肽偶耳關(guān)物，其中PEG部分與Lys31,Lysl22或Lysl35共價連接。本發(fā)明還包括組合物(如單PEG化組合物)，所述組合物包括含有序列SEQIDNO:38的多肽偶聯(lián)物，其中40kDaPEG部分(如40kDa分枝PEG部分)與Lys31,Lys122或Lys135共價連接。本發(fā)效W偶炎參，^哞卒/農(nóng)舉為、與"f應(yīng)^^減差潛合一方面，本發(fā)明涉及這樣的偶聯(lián)物，其表現(xiàn)干擾素-a活性并包含至少一個非多肽部分，所述非多肽部分與干擾素-a多肽的至少一個半胱氨酸殘基偶聯(lián)，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:l在1至16個氨基酸位置上不同(如在l-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，1-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，l-3個氨基酸位置或l-2個氨基酸位置上不同)和(b)相對于SEQIDNO:l,含有一個或多個選自F48A/L;V51P;F55A;F65A;F68P;L111A和V114P的取代。根據(jù)此方面的一些偶聯(lián)物含有至少一個引入的半胱氨酸殘基。另一方面，本發(fā)明涉及這樣的偶聯(lián)物，其表現(xiàn)干擾素-a活性并包含至少一個非多肽部分，所述非多肽部分與干擾素-a多肽的至少一個半胱氨酸殘基偶聯(lián)，所述多肽包含的序列(a)與SEQIDNO:36在1至16個氨基酸位置上不同(如在1-15個氨基酸位置，l-14個氨基酸位置，1-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，1-5個氨基酸位置，1-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置上不同)和(b)相對于SEQIDNO:36,含有一個或多個選自M21A;I24P;F48A/L;T51P;S55A;F65A;F68P;F90A;M93P;L111A;V114P;F124A;I127P和E160D的取代。根據(jù)此方面的一些偶聯(lián)物含有至少一個引入的半胱氨酸殘基。例如，一些本發(fā)明的偶聯(lián)物包含的多肽序列相對于SEQIDNO:1還含有一個或多個下列取代，所述取代將半胱氨酸殘基引入據(jù)預(yù)測會暴露于分子表面并具有超過25°/。分數(shù)ASA的位置D2C,L3C,P4C，Q5C，T6C，H7C,S8C,L9C,G10C,R12C,R13C,M16C，A19C,Q20C,R22C,R23C，I24C,S25C，L26C，F(xiàn)27C,S28C,L30C，K31C,R33C,H34C,D35C,R37C，Q40C，E41C，E42C，D44C,N46C,H47C,Q49C,K50C，V51C，Q52C,E59C,Q62C,Q63C，N66C,S69C,T70C,K71C,D72C,S74C,A75C,D78C，E79C,T80C，L81C，E83C，K84C,I87C,F90C，Q91C，N94C,D95C,E97C,A98C,V100C,M101C,Q102C，E103C,V104C，G105C,E107C，E108C，T109C，P110C,L111C，M112C,N113C,V114C，D115C,L118C，R121C，K122C，Q125C，R126C，T128C,L129C,T132C，E133C,K134C，K135C,Y136C,S137C，P138C,A146CM149C,R150C,S153C,F154C，N157C,Q159C,E160C，S161C，L162C，R163C，S164C,K165C和E166C，其中所述氨基酸殘基位置是相對于SEQIDN0:1而言的。一些本發(fā)明的偶聯(lián)物包含的多肽序列相對于SEQIDNO:l還含有一個或多個下列取代，所述取代將半胱氨酸殘基引入據(jù)預(yù)測會暴露于分子表面并具有超過50%分數(shù)ASA的位置D2C,L3C,P4C,Q5C,T6C,H7C,S8C,L9C:R12C,R13C,M16C,A19C,S25C,F27C,S28C，K31C,R33C，H34C,D35C，R37C,E41C,D44C,N46C,H47C,Q49C,K50C，N66C,K71C，A75C,D78C，E79C,T80C,E83C,K84C,187C，F(xiàn)90C,Q91C，N94C，D95C,M101C,Q102C,E103C,G105C,E107C，E108C，T109C,P110C,L111C,V114C,D115C,L118C,R121C,K122C,Q125C,R126C,L129C,T132C,E133C,K135C,P138C,R150C,E160C,L162C,R163C，S164C,K165C和E166C,其中所述氨基酸殘基位置是相對于SEQIDN0:1而言的。IDNO:l(或相對于一些其它特定序列)給出，所公開的修飾還可在本發(fā)明其它多肽(包括SEQIDNO:2-35和37-44及其變體)的等效氨基酸位置實施。因此，作為實例，相對于SEQIDN0:1的取代H47C被認為對應(yīng)于SEQIDNO:37中的Q47C,等等。在一些情況下，為了避免兩個或多個引入的半胱氨酸殘基之間形成二硫橋，僅引入單個半胱氨酸殘基。在干擾素-ot中，在1/99位和29/139位的半胱氨酸之間形成二碌^建。二硫鍵29/139對生物活性是必要的，而減少1/99鍵不會顯著影響生物學(xué)活性(BeilharzM.W.等，(1986)J.InterferonRes.6(6):677畫685)。因此，在本發(fā)明的另一方面中，優(yōu)選通過取代去除C1或C99之一，例如C1S或C99S，從而保留可用于與非多肽部分偶聯(lián)的其它半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的該方面中預(yù)期的非多肽部分包含聚合物分子，諸如在題目為"與聚合物分子偶聯(lián)"的章節(jié)中描述的任何分子，諸如PEG或mPEG。包含半胱氨酸的多肽和聚合物分子之間的偶聯(lián)可以用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄍ瓿?，例如題目為"與聚合物分子偶聯(lián)"的章節(jié)中所述，例如使用所述章節(jié)描述的一步法或逐步法。PEG化干擾素-cx多肽的示例性方法是采用半胱氨酸反應(yīng)性PEG將PEG與半胱氨酸殘基共價連接。許多具有不同基團(例如正吡啶基-二硫化物(OPSS)、馬來酰亞胺(MAL)和乙烯砜(VS))的高特異性，半胱氨酸反應(yīng)性PEG以及大小不同的線性或分枝PEG(例如2-40kDa,諸如2kDa,5kDa,12kDa,15kDa,20kDa,30kDa或40kDa)可購得，例如獲自NektarTherapeuticsInc.,Huntsville,AL,USA或SunBio，AnyangCity,South本發(fā)'效偶炎參^#^炎部為、如上所述，本發(fā)明偶聯(lián)物的非多肽部分一般選自聚合物分子、親脂化合物、糖部分(例如通過體內(nèi)糖基化)和有機衍生試劑。所有這些試劑可賦予該偶聯(lián)物的多肽部分所需的特性，諸如降低的免疫原性，增加的功能性體內(nèi)半壽期，增加的血清半壽期，增加的生物利用度和/或增加AUCse。偶聯(lián)物的多肽部分一般僅偶聯(lián)一種類型的非多肽部分，但也可偶聯(lián)兩種或多種不同類型的非多肽部分，例如偶聯(lián)聚合物分子和糖部分等。與兩個或多個不同非多肽部分的偶聯(lián)可同時或依次進行。非多肽部分/多個部分的選擇具體依賴于需要通過偶聯(lián)實現(xiàn)的效果。例如，發(fā)現(xiàn)糖部分具體適用于降低免疫原性，而聚合物分子諸如PEG具體適用于增加功能性體內(nèi)半壽期和/或血清半壽期。釆用聚合物分子和糖部分的組合可增強免疫原性的降低以及功能性體內(nèi)或血清半壽期的增加。在以下章節(jié)"與親脂化合物的偶聯(lián)"，"與聚合物分子的偶聯(lián)"，"與糖部分的偶聯(lián)"和"與有機衍生試劑的偶聯(lián)"中，描述與具體類型的非多肽部分的偶聯(lián)。力#腐必合游^偶聯(lián)為了與親脂化合物偶聯(lián)，以下多肽基團可發(fā)揮連接基團的功能多肽的N末端或C末端、氨基酸殘基Ser,Thr或Tyr的羥基、Lys的e-氨基、Cys的巰基或Asp和Glu的羧基。所述多肽和親脂化合物可直接或者通過使用接頭互相偶聯(lián)。親脂化合物可以是天然化合物，例如飽和或不飽和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯(terpene)、前列腺素、維生素、類胡蘿卜素或類固醇，或者是合成的化合物，例如具有一個或多個烷基、芳香基、鏈烯基或其它多個不飽和化合物的碳素酸(carbonacid)、醇、胺和石黃酸。所述多肽和親脂化合物之間任選通過接頭的偶聯(lián)可按照本領(lǐng)域已知的方法進行，例如，Bodanszky在PeptideSynthesis,JohnWiley，紐約，1976和在WO96/12505中所述?！└埠蠀椤W偶聯(lián)與多肽偶聯(lián)的聚合物分子可以是任意合適的聚合物分子，諸如天然或合成的同聚物或雜聚物，一般具有的分子量范圍是約300-100,000Da，例如約1000-50,000Da，更優(yōu)選約1000-40，000Da。更具體地，聚合物分子，諸如PEG具體是mPEG，通常具有約2,5,10，12,15,20,30，40或50kDa的分子量，尤其是約5kDa，約10kDa,約12kDa，約15kDa,約20kDa，約30kDa或約40kDa的分子量。PEG分子可以是支化的(例如，mPEG2),或可以是非支化的(即線性的)。當(dāng)與本文中聚合物分子有關(guān)時，術(shù)語"約"是指大約的平均分子量且反映出這樣的事實，給定聚合物制備物中通常有一定的分子量分布。同聚物的例子包括多元醇(即poly-OH)、多胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)。雜聚物是一種聚合物，它包含一個或多個不同的偶聯(lián)基團，諸如羥基和胺基。合適的聚合物分子的例子包括選自下組的聚合物分子聚環(huán)氧烷(PAO),包括聚亞烷基二醇(PAG),例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG),支化的PEG,聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯-共-馬來酸酐，聚苯乙烯-共-馬來酸酐，葡聚糖，包括羧曱基葡聚糖，或者適合于降低免疫原性和/或增加功能性體內(nèi)半壽期和/或血清半壽期的任何其它生物聚合物。一般來說，聚亞烷基二醇衍生的聚合物是生物相容性的，無毒，無抗原性，無免疫原性的，具有不同水溶性特性，且容易從活生物體排泄掉。PEG是優(yōu)選的待用聚合物分子，因為它與例如，諸如葡聚糖等的多糖相比僅具有較少的能交聯(lián)的反應(yīng)基團。具體來說，單功能性PEG,例如單曱氧基聚乙二醇(mPEG)是令人感興趣的，因為其偶聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)相對筒單(僅一個反應(yīng)基團可用于與多肽上的連接基團偶聯(lián))。因此，消除了交聯(lián)的風(fēng)險，所得的多肽偶聯(lián)物均一性更好且聚合物分子與多肽的反應(yīng)更易于控制。為了實現(xiàn)聚合物分子與多肽的共價連接，聚合物分子的羥基末端基團必須以活化形式提供，即，具有反應(yīng)性官能團(該基團的例子包括伯胺基團、酰肼(HZ)、巰基、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)、羧曱基化琥珀酰亞胺(SCM)、笨并三唑碳酸酯(BTC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、醛、硝基苯碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。適當(dāng)活化的聚合物分子是商業(yè)上可獲得的，例々n/人ShearwaterPolymer,Inc.,Huntsville,AL,USA;PolyMASCPharmaceuticalspic,UK或SunBioCorporation,AnyangCity,SouthKorea獲得。另外，聚合物分子可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法活化，例如按WO90/13540公開的方法。用于本發(fā)明的活化的線性或支化聚合物分子的具體例子在NektarTherapeutics,Inc.2003年產(chǎn)品目錄("NektarMoleculeEngineering:PolyethyleneGlycolandDerivativesforAdvancedPEGylation",將其引入此處作為參考)中描述?；罨腜EG聚合物的具體例子包括下列線性PEG:NHS-PEG,SPA-PEG,SSPA-PEG,SBA-PEG,SS-PEG，SSA-PEG,SC-PEG,SG-PEG，SCM-PEG,NOR-PEG,BTC-PEG,EPOX-PEG,NCO-PEG,NPC-PEG,CDI-PEG,ALD-PEG,TRES-PEG，VS-PEG，OPSS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG,以及分枝PEG,例如PEG2-NHS，PEG2-MAL和在US5，932,462和US5,643,575中公開的那些分子，將這兩篇文獻引入此處作為和/或PEG連接的化學(xué)性質(zhì)US5,824,778，US5,476,653，WO97/32607,EP229,108,EP402,378，US4,902,502,US5,281,698,US5，122，614，US5，219，564:WO92/16555,WO94/04193，WO94/14758,WO94/17039,WO94/18247,WO94/28024，WO95/00162，WO95/11924,WO95/13090,WO95/33490,WO96/00080，WO97/18832,WO98/41562，WO98/48837，WO99/32134,WO99/32139,WO99/32140，WO96/40791,WO98/32466,WO95/06058，EP439508，WO97/03106,WO96/21469,WO95/13312,EP921131,US5,736,625,WO98/05363，EP809996,US5,629,384,WO96/41813，WO96/07670，US5,473,034,US5,516,673,EP605963，US5,382,657,EP510356，EP400472,EP183503和EP154316。多肽與活化的聚合物分子的偶聯(lián)經(jīng)過使用任何常規(guī)方法進行，例如按下列文獻所述的方法(它們也描述了用于活化聚合物分子的合適方法)Harris和Zalipsky,Eds"Poly(ethyleneglycol)ChemistryandBiologicalApplications,AZC,華盛頓；R.F.Taylor,(1991)，"Proteinimmobilisation.Fundamentalandapplications",MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong，(1992),"ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking"，CRC出版社,BocaRaton;G.T.Hermanson等,(1993),"ImmobilizedAffinityLigandTechniques",學(xué)術(shù)出版社，紐約)。對于半胱氨酸殘基的PEG化，通常要在PEG化之前將多肽與還原劑諸如二硫蘇糖醇(DDT)反應(yīng)。隨后通過任何常規(guī)方法，諸如通過脫鹽去除還原劑。PEG與半胱氨酸的偶聯(lián)通常在以下條件實施適宜的緩沖液中，pH6-9,溫度4。C-25。C,時間大約為16小時。用于偶聯(lián)半胱氨酸殘基的活化PEG聚合物的實例包括以下線性和支化PEG:乙烯砜-PEG(PEG-VS),諸如乙烯砜-mPEG(mPEG-VS);鄰吡啶基-二硫-PEG(PEG-OPSS),諸如鄰吡啶基-二硫-mPEG(mPEG-OPSS);和馬來酰亞胺-PEG(PEG-MAL),諸如馬來酰亞胺-mPEG(mPEG-MAL)和支化馬來酰亞胺-mPEG2(mPEG2-MAL)。賴氨酸的PEG化通常采用PEG-N-羥基琥珀酰亞胺(例如，mPEG-NHS或mPEG2-NHS),或酯諸如PEG琥珀酰亞胺丙酸酯(例如，mPEG-SPA)或PEG琥珀酰亞胺丁酸酯(例如，mPEG-SBA)。如果混合等摩爾量的PEG和蛋白質(zhì)，可將一個或多個PEG可在30分鐘內(nèi)、pH8-9.5、室溫連接至蛋白質(zhì)。通常PEG與蛋白質(zhì)氨基的摩爾比率是1-5-1即可滿足。升高pH可提高反應(yīng)速率，而降低pH則減低反應(yīng)速率。這些強反應(yīng)性酯可在生理pH條件下發(fā)生偶聯(lián)，但低反應(yīng)性衍生物通常需要較高pH。如果使用不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，則還可采用低溫。在低溫條件，可采用較長的反應(yīng)時間。N末端氨基酸的a-氨基(7.6to8.0)和賴氨酸的s-氨基(10)的pKa差異可促進N末端PEG化。N末端氨基的PEG化通常采用PEG-醛(諸如mPEG-丙醛或mPEG-丁醛)，其具有對胺的更高的選擇性，因此與組氨酸的咪唑基團的反應(yīng)的可能性較低；此外，用于賴氨酸偶聯(lián)的PEG試劑(諸如mPEG-SPA、mPEG-SBA或mPEG-NHS)還可用于N末端胺的偶聯(lián)。PEG-醛與N末端氨基的偶聯(lián)通常如下實施在適宜的緩沖液(諸如，100mM醋酸鈉或lOOmM二磷酸鈉緩沖液與20mM氰基硼氫化鈉)中pH~5.0,于約4。C-25。C的溫度過夜?？捎玫腘末端PEG化方法和化學(xué)還公開于美國專利5,985,265和美國專利6,077,939中，其均引入此處作為參考。通常，線性PEG或mPEG聚合物的分子量為約5kDa,約10kDa,約12kDa,約15kDa,約20kDa，或約30kDa。支化PEG(PEG2或mPEG2)聚合物通常具有的分子量為約10kDa,約20kDa，或約40kDa。在一些情況下，可使用較高分子量的支化PEG2試劑，諸如20kDa或40kDaPEG2,例如包括用于賴氨酸PEG化的mPEG2-NHS,用于半胱氨酸PEG化的mPEG2-MAL,或用于N末端PEG化的MPEG2-醛(所有試劑均獲自NektarTherapeutics,Inc,HuntsvilleAL)。PEG2化合物的支化結(jié)構(gòu)導(dǎo)致相對大的分子體積，因此很少有連接的分子(或，一個連接的分子)可賦予PEG化分子的所需特性。技術(shù)人員將明白所用的活化方法和/或偶聯(lián)化學(xué)依賴于干擾素-a多肽的連接基團以及聚合物的官能團(例如，是氨基、羥基、羧基、醛或巰基)。PEG化可針對與多肽上所有可獲得的連接基團(即暴露于多肽表面的連接基團)的偶聯(lián)或者可針對具體連接基團，例如半胱氨酸殘基、賴氨酸殘基或N-末端氨基(US5,985,265)。另外，偶聯(lián)可用一步法或者以逐步方式實現(xiàn)(例如按WO99/55377所述)。在一些情況下，在意圖使盡可能多的聚合物連接基團與聚合物分子反應(yīng)的條件下進行聚合物的偶聯(lián)。這可通過使與多肽相關(guān)聚合物的摩爾數(shù)適宜地過量實現(xiàn)。通常，活化型聚合物分子與多肽的摩爾比是1000-1，諸如200-1，優(yōu)選100-1。然而，在一些情況下，該比率可更低，諸如最低至約50-1,10-1或5-1。然而，也可使用等摩爾比率。本發(fā)明還涉及通過接頭偶聯(lián)聚合物分子與多肽。合適的接頭是技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的例子是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem,252，3578-3581;US4,179,337;Shafer等，(1986),J.Polym.Sci.Polym.Chem，Ed.,24,375-378)。偶聯(lián)后，按照本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過向反應(yīng)混合物中加入伯胺封閉殘余的活化型聚合物分子，并通過合適的方法去除所得的失活型聚合物分子?？墒褂锰擒张c干擾素-a的氨基酸殘基的共價體外偶聯(lián)來修飾或增加糖組分的數(shù)目或特性。根據(jù)使用的偶聯(lián)方式，糖類可連于a)精氨酸和組氨酸(Lundblad和Noyes,ChemicalReagentsforProteinModification,CRCPressInc.BocaRaton,FI),b)游離羧基(例如C末端氨基酸殘基，天冬酰胺或谷氨酰胺的游離羧基)，c)游離巰基，例如半胱氨酸的游離巰基，d)游離羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或羥脯氨酸的游離羥基，e)芳香族殘基，例如苯丙氨酸或色氨酸的芳香基或者f)谷氨酰胺的酰胺基。這些氨基酸殘基組成糖部分的連接基團的例子，可在本發(fā)明偶聯(lián)物的干擾素-a多肽中引入和/或去除所述殘基。體外偶聯(lián)的合適方法在例如，WO87/05330和Aplin等，CRCCritRev.Biochem,第259-306頁，1981中描述。糖部分或PEG與蛋白質(zhì)和肽結(jié)合的Gln-殘基的體外偶聯(lián)可通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGases)實現(xiàn)，例如，按Sato等，1996，所0c/2em&^y,35,13072-13080或在EP725145中所述。力潛舉為、的偶聯(lián)為了實現(xiàn)通過引入一個或多個體內(nèi)糖基化位點修飾的干擾素-a多肽(見"本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽部分是糖部分"章節(jié))的體內(nèi)糖基化，將編碼該偶聯(lián)物的多肽部分的核香酸序列插入糖基化真核表達宿主中。表達宿主細胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)，昆蟲，哺乳動物細胞，來自轉(zhuǎn)基因植物細胞或來自轉(zhuǎn)基因動物。另外，當(dāng)在基因治療中使用編碼本發(fā)明的偶聯(lián)物的多肽部分或本發(fā)明多肽的核苷酸序列時可在人體內(nèi)實現(xiàn)糖基化。在一個方面中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，例如CHO細胞，BHK或者HEK細月包，例如HEK293,或昆蟲細胞，例如SF9纟田胞，或者酵母細胞，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),畢赤酵母(Pichiapastoris)或者任何其它合適的糖基化型宿主，例如如下所述。任選，通過體內(nèi)糖基化連接到干擾素-a多肽的糖部分可通過使用糖基轉(zhuǎn)移酶，例如，使用Neose，Horsham,PA,USA上市的GlycoAdvance技術(shù)進一步修飾。從而可以增加，例如表達后糖基化的IFNG多肽的唾液酸化以及CHO細胞的體內(nèi)糖基化。々才在射試浙W偶農(nóng)干擾素-a多肽的共價修飾可通過將多肽的連接基團與有機衍生試劑反應(yīng)來進行。合適的衍生試劑和方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，最常見的半胱氨酰殘基與a-面代乙酸(和相應(yīng)的胺)，諸如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)以產(chǎn)生羧曱基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰殘基也通過與溴三氟丙酮、a-溴—P—(4-咪唑基)丙酸、氯乙?；姿狨?、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-p比啶基二硫化物、曱基2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯曱酸、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-l,3-二唑反應(yīng)而得以衍生化。組氨酰殘基經(jīng)過與焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0反應(yīng)而得以衍生化，因為該試劑對組氨酸側(cè)鏈具有相對特異性。對溴苯曱酰甲基溴化物(Para-bromophenacylbromide)也是有用的；反應(yīng)優(yōu)選在0.1M卡可酸鈉中在pH6.0下進行。賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸或其它羧酸酐反應(yīng)。與這些試劑的衍生化具有逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷的效應(yīng)。用于衍生含a-氨基的殘基的其它合適試劑包括亞氨酸酯，例如甲基吡啶亞酰胺；磷酸吡。多醛；吡。多醛；氯代硼氫化物；三硝基苯石黃酸；O-曱基異脲；2,4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。精氨酰殘基通過與笨基乙二醛，2,3-丁二酮，1,2-環(huán)己二酮和茚三酮中的一種或數(shù)種常規(guī)試劑反應(yīng)得以修飾。精氨酸殘基的衍生化需要在堿性條件下進行反應(yīng)，因為胍官能團具有高pKa。另外，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸胍基反應(yīng)。通過與碳二亞胺(R-NON-R')反應(yīng)可選擇性修飾羧基側(cè)基團(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R'是不同的烷基基團，例如l-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或l-乙基-3-(4-氮鐵-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰殘基通過與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)變成天冬酰胺?；凸劝滨０孵；Ｒ驗檫^量聚合物偶聯(lián)可導(dǎo)致與聚合物偶聯(lián)的干擾素-oc多肽活性喪失，故此去掉位于功能性位點的連接基團或者通過在偶聯(lián)前封閉功能性位點是有益的。后一種策略組成本發(fā)明的其它方面(第一種策略在上文舉例說明，例如通過去掉靠近功能性位點的賴氨酸殘基來進行)。更具體的說，根據(jù)第二種策略，干擾素-a多肽和非多肽部分之間的偶聯(lián)在多肽的功能性位點被能與多肽功能性位點結(jié)合的輔助分子封閉的條件下進行?？蛇x，輔助分子是特異性識別多肽的功能性位點的分子，例如受體，具體是I型干擾素受體。另外，輔助分子可以是抗體，具體是識別千擾素-a多肽的單克隆抗體。具體地說，輔助分子可以是中和型單克隆抗體。實現(xiàn)偶聯(lián)前使得多肽與輔助分子相互作用。這樣保證多肽的功能性位點被保護或保護且隨后不被諸如聚合物等的非多肽部分衍生化。其從輔助分子洗脫后，可回收具有至少部分受保護的功能性位點的非多肽部分與多肽之間的偶聯(lián)物。隨后，具有已被封閉的功能性位點的多肽與聚合物，親脂化合物，糖部分，有機衍生試劑或任意其它化合物以正常方式偶聯(lián)，例如，按標(biāo)題為"與……偶聯(lián)"的上述章節(jié)所述進行。無論用于防止多肽的功能性位點發(fā)生偶聯(lián)的輔助分子的性質(zhì)如何，都需要該輔助分子不含或僅包含很少用于連接所選非多肽部分的連接基團，其在該分子的一部分中，其中與所述基團的偶聯(lián)將妨礙已偶聯(lián)的多肽從輔助分子脫附。因此，可獲得與多肽未受保護的部分中存在的連接基團的選擇性偶聯(lián)，且可以再將輔助分子用于偶聯(lián)的重復(fù)循環(huán)中。例如，如果非多肽部分是聚合物分子諸如PEG，其具有賴氨酸或N末端氨基酸殘基的S氨基作為連接基團，則需要輔助分子基本上不含可結(jié)合的S氨基，優(yōu)選不含任何S氨基。因此，在一些情況下，輔助分子是能結(jié)合多肽的功能性位點的蛋白質(zhì)或肽，所述蛋白質(zhì)或肽不含用于偶聯(lián)所選非多肽部分的任何可偶聯(lián)的連接基團。在另一方面中，輔助分子首先共價連接到諸如柱填充材料，例如交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖珠的固相或者表面例如反應(yīng)器表面。隨后，將多肽上樣到攜帶輔助分子的柱材料上且按照本領(lǐng)域已知的方法進行偶聯(lián)，例如，按標(biāo)題為"與……偶聯(lián)"的上述章節(jié)所述進行。該方法允許通過洗脫從輔助分子分離多肽偶聯(lián)物。在不導(dǎo)致多肽偶聯(lián)物大量降解的物理化學(xué)條件下以常規(guī)技術(shù)洗脫該多肽偶聯(lián)物。含有多肽偶聯(lián)物的液相從與輔助分子保持共價連接的固相分離。分離可用其它方式實現(xiàn)例如，用可被特異性結(jié)合劑(例如鏈霉抗生物素蛋白)識別的第二分子(例如生物素)衍生化該輔助分子。特異性結(jié)合劑可連接到固相上，從而允許通過第二輔助固相柱而從輔助分子-第二分子復(fù)合物中分離多肽偶聯(lián)物，所述柱在隨后洗脫時滯留輔助分子-第二分子復(fù)合物而不是多肽偶聯(lián)物。可用任何合適的方式從輔助分子釋放多肽偶聯(lián)物。通過提供輔助分子從其結(jié)合的干擾素-a功能性位點解離的條件實現(xiàn)去保護。例如，偶聯(lián)聚合物的抗體與抗獨特型抗體間的復(fù)合物可通過將pH調(diào)到酸性或堿性pH來解離。標(biāo)記的于^€^偶聯(lián)另一方面，千擾素-a多肽以具有標(biāo)記的融合蛋白被表達，即一般由1-30個，例如l-20或1-15或1-10或1-5個氨基酸殘基(例如加至多肽的N末端或C末端)組成的氨基酸序列或肽鏈。除了允許快速且容易的純化外，標(biāo)記是實現(xiàn)標(biāo)記的多肽與非多肽部分之間的偶聯(lián)的一種常規(guī)工具。具體地說，標(biāo)記可用于在通過標(biāo)記固定化經(jīng)標(biāo)記的多肽的微量滴定板或其它載體例如順磁珠(paramagneticbead)中實現(xiàn)偶聯(lián)。在例如微量滴定板中與標(biāo)記的多肽偶聯(lián)的優(yōu)勢在于標(biāo)記的多肽可直接分離自液體培養(yǎng)基而在微量滴定板中固定化(原則上不需任何純化)和進行偶聯(lián)。因此，減少了加工步驟(從表達到偶聯(lián))的總數(shù)。另外，標(biāo)記可充當(dāng)間隔分子以保證提高待偶聯(lián)的固定化多肽的可用性。標(biāo)記的多肽可與本文^^開的任意非多肽部分偶^L，例如，諸如于PEG的聚合物分子偶聯(lián)。使用的特異性標(biāo)記特性(identity)并不重要，只要該標(biāo)記能與多肽一起表達且能被固定化在合適的表面或載體材料上。許多合適的標(biāo)記是商業(yè)上可獲得的，例如從丹麥，Unizyme實驗室獲得。針對所述標(biāo)記的抗體可從商業(yè)獲得,例如從ADI，AvesLab和ResearchDiagnostics獲得。本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明提供了分離的或重組的核酸(本文也稱為多核苷酸)，統(tǒng)稱為"本發(fā)明的核酸(或多核苷酸)"，其編碼本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的多核苷酸可用于多種用途。如上所述，多核苷酸可用于制備本發(fā)明的多肽。此外，本發(fā)明的多核苷酸可摻入用于基因治療、DNA疫苗接種和免疫治療的表達載體中，如下更詳細的描述。一方面，本發(fā)明提供了分離的或重組的多核苷酸，其各包含編碼含有選自SEQIDNO:2-35和37-44的氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互補核酸序列。根據(jù)本發(fā)明此方面的核酸序列的例子包括但不限于SEQIDNO:59-61,其各編碼含有序列SEQIDNO:IO的多肽；SEQIDNO:62-64和89,其各編碼含有序列SEQIDNO:13的多肽；SEQIDNO:65-67,其各編碼含有序列SEQIDNO:15的多肽；SEQIDNO:68-70，其各編碼含有序列SEQIDNO:23的多肽；SEQIDNO:71-73,其各編碼含有序列SEQIDNO:27的多肽；SEQIDNO:74-76，其各編碼含有序列SEQIDNO:30的多肽；SEQIDNO:77-79,其各編碼含有序列SEQIDNO:37的多肽；SEQIDNO:80-82和90,其各編碼含有序列SEQIDNO:38的多肽；SEQIDNO:83-85，其各編碼含有序列SEQIDNO:41的多肽；和SEQIDNO:86-88,其各編碼含有序列SEQIDNO:44的多肽。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多核苷酸，其各包含編碼含有氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互補核酸序列，其中所述氨基酸序列(a)與SEQIDNO:l在1至16個氨基酸位置上不同(例如在1,2，3,4，5,6,7,8,9，10，11,12,13,14,15或16個氨基酸位置，如在1-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，1-11個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置上不同)和(b)相對于SEQIDNO:l,含有一個或多個選自F48A/L;V51P;F55A;F65A;F68P;L111A和V114P的取代。一些由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，如添加至N-末端的曱硫氨酸。在一些情況下，所編碼的多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多核苷酸，其各包含編碼含有氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互補核酸序列，其中所述氨基酸序列(a)與SEQIDNO:36在1至16個氨基酸位置上不同(例如在1，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14，15或16個氨基酸位置，如在1-15個氨基酸位置，1-14個氨基酸位置，l-13個氨基酸位置，l-12個氨基酸位置，l-ll個氨基酸位置，l-10個氨基酸位置，l-9個氨基酸位置，l-8個氨基酸位置，l-7個氨基酸位置，l-6個氨基酸位置，l-5個氨基酸位置，l-4個氨基酸位置，1-3個氨基酸位置或1-2個氨基酸位置上不同)和(b)相對于SEQIDNO:36,含有一個或多個選自M21A,I24P,F48A/L,T51P，S55A,F65A,F68P,F90A,M93P，L111A，V114P,F124A,I127P和E160D的取代。一些由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，如添加至N-末端的曱石克氨酸。在一些情況下，所編碼的多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多核苷酸，其各包含編碼含有氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互補核酸序列，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:l-35中的任一個具有至少90%的序列同一性(例如至少約91%，至少約92%,至少約93%,至少約94%,至少約95%,至少約96%,至少約97%,至少約98%或至少約99%的氨基酸序列同一性)，其中氨基酸序列含有下述氨基酸中的一個或多個第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第111位的Ala和第114位的Pro(相對于SEQIDNO:l的位置編號)。一些由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，如添加至N-末端的曱硫氨酸。在一些情況下，所編碼的多肽表現(xiàn)出干擾素-(X活性。本發(fā)明還提供了分離的或重組的多核苷酸，其各包含編碼含有氨基酸序列的多肽的核酸序列，或其互補核酸序列，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:36-44中的任一個具有至少90%的序列同一性(例如至少約91%,至少約92%,至少約93%,至少約94%,至少約95%，至少約96%,至少約97%，至少約98%或至少約99%的氨基酸序列同一性)，其中氨基酸序列含有下述氨基酸中的一個或多個第21位的Ala;第24位的Pro;第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第卯位的Ala;第93位的Pro;第111位的Ala;第114位的Pro;第124位的Ala;第127位的Pro;和第160位的Asp(相對于SEQIDNO:36的位置編號)。一些由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽還含有一個或多個其它的氨基酸，如添加至N-末端的曱硫氨酸。在一些情況下，所編碼的多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性。本發(fā)明的任何多核苷酸(包括上述那些多核苷酸)可編碼包含至少一種其它氨基酸序列的融合蛋白，例如，分泌/定位序列，用于增溶或固定多肽的序列(例如，為了細胞表面展示)，用于檢測和/或純化多肽的序列(例如，多肽純化序列，諸如表位標(biāo)記，聚組氨基序列等)。另一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明的多核苷酸的細胞。所述細胞可以表達由本發(fā)明的多核苷酸編碼的一種或多種多肽。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明任何多核苷酸的載體。所述載體可包含質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或病毒片段。所述載體可包含表達載體，如有需要，核酸可操作地連接于啟動子，包括此處或以下描述的。此外，另一方面，本發(fā)明提供了包含賦形劑或載體和至少一種本發(fā)明的任何多核苷酸，或載體，細胞，或包含所述核酸的宿主的組合物。所述組合物可以是藥學(xué)組合物，賦形劑或載體可以是可藥用的賦形劑或載體。本發(fā)明還包括包含兩種或多種本發(fā)明的核酸，或其片段(例如，作為重組底物)的組合物。該組合物可包含重組核酸的文庫，其中文庫包含至少2種，至少3種，至少5種，至少10種，至少20種，至少50種，或至少100種或更多種上述核酸。所述核酸可任選地克隆至表達載體中，來提供表達文庫。本發(fā)明的多核苷酸及其片段，以及包含所述多核苷酸的載體可與適宜的載體，諸如藥用載體聯(lián)用而用于治療性或預(yù)防性用途。所述組合物包含治療上和/或預(yù)防上有效量的化合物，以及可藥用的載體或賦形劑。所述載體或賦形劑包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。配制方式應(yīng)與給藥模式相適應(yīng)。施用核酸、多肽和蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并在下文中進一步討論。本發(fā)明還包括通過用限制性內(nèi)切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化一種或多種本發(fā)明的核酸(在上述一些重組形式中進行)而產(chǎn)生的組合物；以及通過用機械方式(例如超聲處理，渦旋等)片段化或剪切一種或多種本發(fā)明的核酸而產(chǎn)生的組合物，該組合物也可提供在上述方法用于重組的底物。本發(fā)明還提供了通過切割至少一種本發(fā)明的核酸而產(chǎn)生的組合物。所述剪切包括機械性，化學(xué)性，和酶切割，酶切割包括用限制性內(nèi)切核酸酶，RNA酶或DNA酶的切割。本發(fā)明還包括通過在核糖核苷酸或脫氧核糖核苷三磷酸和核酸聚合酶的存在下保溫一種或多種片段化的核酸組而產(chǎn)生的組合物。所得組合物形成重組混合物，可用于上述多種重組形式。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶，DNA聚合酶或RNA-指導(dǎo)導(dǎo)的DNA聚合酶(例如"逆轉(zhuǎn)錄酶")；聚合酶可以是例如熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(例如VENT,TAQ等)。類似地，含有多組對應(yīng)于一種以上本發(fā)明核酸的寡核苷酸的組合物也可用作重組底物，并且也是本發(fā)明的特征。為了方便起見，將這些經(jīng)片段化，經(jīng)剪切的或寡核苦酸合成的混合物稱為片段化的核酸組。本發(fā)明還提供了編碼多肽的分離的或重組的核酸，所述多肽表現(xiàn)出干擾素-a活性，其通過突變或重組至少一種本發(fā)明的核酸產(chǎn)生?？筛鶕?jù)已知的合成方法，通過標(biāo)準(zhǔn)的固相方法制備本發(fā)明的多核苷酸、寡核苦酸和核酸片段。一般說來，單獨合成長約100個核苷酸堿基的片段，然后(通過例如酶促或化學(xué)連接法，或聚合酶介導(dǎo)的重組方法)將它們連接起來，以形成基本上任何所需的連續(xù)序列。例如，本發(fā)明的多核苷酸和寡核苷酸可通過化學(xué)合成制備，其使用Beaucage等，(1981)TetrahedronLetters22:1859-69所述的經(jīng)典亞磷酰胺法，或Matthes等，(1984)EMBOJ,3:801-05所述的方法(例如，這些方法一般在自動合成方法中實施)。根據(jù)亞磷酰胺法，在例如自動化的DNA合成儀中合成寡核苷酸，然后進行純化，退火，連接，并克隆入適當(dāng)?shù)妮d體。另外，基本上任何核酸都可從多個商家中的任何一家訂購得到，諸如OperonTechnologiesInc.(Alameda,CA)和4艮多其它的^i^司。類似地，肽和抗體也可從多個商家中的任何一家訂購得到，例如CeltekPeptides(Nashville,TN);WashingtonBiotechnology,Inc.(BaltimoreMD);GlobalPeptideServices(Ft.CollinCO)和很多其它的公司。也可通過使用寡核普酸探針篩選cDNA文庫(例如通過如常規(guī)重復(fù)序列重組法中那樣通過重組同源核酸而產(chǎn)生的文庫)得到本發(fā)明的某些多核苷酸，其中所述寡核苷酸探針能與編碼干擾素a多肽及其片段的多核苷酸雜交或PC.R-擴增編碼干擾素a多肽及其片段的多核苷酸。篩選和分離cDNA克隆的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。該技術(shù)描述于例如BergerandKimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymol.Vol.152，Acad.Press,Inc.,SanDiego,CA("Berger");Sambrook，文南史同上，禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel,文獻同上。一些本發(fā)明的多核苷酸可通過改變(例如通過誘變，重復(fù)序列重組(例如改組)，或寡核苷酸重組)天然的序列而獲得。在其它情況下，所述多核苷酸可通過insilico方法制備或通過寡核苷酸重組方法，按其中所引用的參考文獻所述進行制備。如本文所詳述，本發(fā)明的多核苷酸包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列，與這些多核苷酸序列互補的多核苷酸序列，和在至少嚴緊條件下與本文定義的序列雜交的多核苦酸。編碼序列是指編碼具體多肽或所述多肽的結(jié)構(gòu)域、區(qū)域或片段的多核苦酸序列。編碼序列可編碼(編碼)表現(xiàn)出如上述干擾素a活性的本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA的形式，或者是DNA的形式，包括mRNA,cRNA,合成RNA和DNA，和cDNA。多核苷酸可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，則可以是編碼型鏈或非-編碼型(反義，互補)鏈。本發(fā)明的多核苷酸包括本發(fā)明多肽的編碼序列的(i)分離形式，(ii)與其它編碼序列聯(lián)合以編碼例如融合蛋白，前-蛋白質(zhì)，前原-蛋白質(zhì)(prepro-protein)等，(iii)與能在適宜宿主中有效表達編碼序列的非-編碼型序列，如啟動子，終止元件，或5，和/或3'非翻譯區(qū)聯(lián)合，和/或(iv)在載體、細胞或宿主環(huán)境中，其中編碼序列是異源基因。本發(fā)明的多核苷酸還可與核酸常見組合制劑聯(lián)合，包括與載體、緩沖液、佐劑、賦形劑等組合，這一點是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。多核苷酸片段通常包含至少約200個核苷酸堿基，諸如至少約250,300,350,400,450,460，470或更多個堿基。本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸片段可在高嚴緊條件下與本文所述多核苷酸序列雜交和/或編碼具有本發(fā)明多肽的至少一種特性的氨基酸序列。發(fā)輛薦麟/(/本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得，修飾編碼序列以增強其在具體宿主中的表達是有利的。遺傳密碼是豐余的，它具有64個可能的密碼子，但大多數(shù)生物偏好使用這些密碼子中的一部分(subset)。在物種中最常使用的密碼子被稱為最佳密碼子，那些不常使用的密碼子被分為稀有或不常用密碼子(例見ZhangS.R等(1991)Gene105:61-72)。可取代密碼子以反映宿主的優(yōu)選密碼子使用情況，該方法被稱為"密碼子最優(yōu)化"或"物種密碼子偏向(speciescodonbias)的4空制"?？梢灾苽涑龊芯唧w原核或真核宿主所偏好的密碼子(參見Murray,E.等(1989)NucAcidsRes17:477-508)的修飾的編碼序列，例如使與未經(jīng)最優(yōu)化的序列所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物相比，能提高翻譯速率，或產(chǎn)生具有所需特性如較長半壽期的重組RNA轉(zhuǎn)錄物。也可以修飾翻i奪終止密碼子以反映出宿主的偏好。例如，S良酒酵母和哺乳動物的優(yōu)選終止密碼子分別為UAA和UGA。單子葉植物的優(yōu)選終止密碼子是UGA,而昆蟲和大腸桿菌優(yōu)選使用UAA作為終止密碼子(DalphinM.E.等(1996)NucAcidsRes24:216-218)。為了多種原因，可對本發(fā)明的多核苷酸序列進行改造以改變本發(fā)明的編碼序列，所述改變包括但不限于修飾基因產(chǎn)物的克隆，加工和/或表達的改變。例如，可使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，例如定點誘變引入改變，以插入新的限制性位點，改變糖基化模式，引入或去除連接基團(例如，用于聚乙二醇化或其它結(jié)合)，改變密碼子的偏好，引入拼接位點等。因為遺傳密碼的簡并性，大量功能性相同的核酸編碼任何給定多肽。例如，下述密碼子表(表5)顯示了密碼子AGA,AGG,CGA，CGC,CGG和CGU均編碼氨基酸精氨酸。因此，在核酸序列中編碼精氨酸的密碼子的每個位置上，密碼子可被改變?yōu)槿魏紊鲜鱿鄳?yīng)的密碼子而不會改變所編碼的多肽。所述核苷酸變異為"沉默變異"。應(yīng)當(dāng)理解RNA序列中的U對應(yīng)于DNA序列中的T。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得由于遺傳密碼的簡并性，可產(chǎn)生很多種編碼本發(fā)明多肽的核酸序列，其中的一些與本文清楚公開的核酸序列有最小序列同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)修飾核酸中的每一個密碼子(除了AUG和UGC,其通常分別是曱硫氨酸和色氨酸唯一的密碼子)以編碼功能相同的多肽。因此，編碼多肽的核酸的每一種沉默變異可見于任何所述序列。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的任何可能變異，它們可通過選擇基于可能的密碼子選擇的組合而產(chǎn)生。根據(jù)編碼本發(fā)明多肽的核酸序列所用的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體(密碼子)遺傳密碼(如表5所示)制備這些組合。通過考慮序列以及遺傳密碼，具體提供并描述了本文每一種核酸的所有上述變異體。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠產(chǎn)生本文所列序列的任何沉默取代。本發(fā)明的多核苷酸具有多種用途，例如，本發(fā)明多肽的重組制備(即表來進行；作為治療劑；作為預(yù)防劑；作為診斷工具；作為免疫原；作為佐劑；作為診斷存在互補或部分互補核酸(包括一全測野生型干擾素-a核酸)的診斷性探針，作為進一步反應(yīng)的底物，所述反應(yīng)例如重復(fù)序列重組反應(yīng)或制備新和/或改良變體的突變反應(yīng)等。戎傳、^^子^k表這屑鍵本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體，其含有一種或多種本文所寬泛描述的核酸序列。所述構(gòu)建體包括載體，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)等，其中以正向或反向插入了本發(fā)明的核酸序列。在一些情況下，構(gòu)建體還含有調(diào)節(jié)序列，包括例如與該核酸序列可操作連接的啟動子。大量適當(dāng)?shù)妮d體和啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，也可以購得。描述本文所用分子生物學(xué)技術(shù)，包括載體、啟動子的利用和很多其它相關(guān)論題的普通教科書包括Berger，文獻同上；Sambrook(1989),文獻同上，和Ausubel,文獻同上。足以教導(dǎo)熟練技術(shù)人員進行體外擴增方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、QP-復(fù)制酶擴增和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如NASBA),例如為了產(chǎn)生本發(fā)明的同源核酸的技術(shù)的實例可參見例如Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等(1987)，美國專利4,683,202;1997年7月28日公開的美國專利4,683,195;PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis等編)Academic出片反乂/^司,SanDiego,CA(1990)(Innis);Arnheim&Levinson(1990年10月1曰)C&EN36-47;TheJournalOfNIHResearch(1991)3,81-94;Kwoh等，(1989)Proc.NatlAcad.Sci.USA86,1173-1177;Guatelli等，(1990)Proc.NatlAcad.Sci.USA87,1874-1878;Lomell等，(1989)JClinChem,35,1826-1831;Landegren等，(1988)Science241,1077-1080;VanBrunt(1990)Biotechnology8,291-294;Wu和Wallace(1989)Gene4,560-569;Barringer等，(1990)Gene89,117-122以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13:563-564?？寺〗?jīng)體外擴增的核酸的改良方法描述于Wallace等，美國專利5,426,039。通過PCR擴增大核酸的改良方法簡述于Cheng等，(1994)Nature369:684-685和其中的參考文獻，其中產(chǎn)生了長至40kb的PCR擴增子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得實質(zhì)上使用逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶可將任何RNA轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于限制性消化，PCR擴展和測序的雙鏈DNA。參見Ausubel,Sambrook和Berger，文獻同上。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞，和通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。用本發(fā)明的載體對宿主細胞進行基因改造(即轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述載體可以是例如克隆載體或表達載體。載體可以是例如質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。經(jīng)改造的宿主細胞可在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)修飾而適于活化啟動子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴增基因。如溫度，pH等的培養(yǎng)條件與被選擇用于表達的宿主細胞先前所用的相同，它們對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，也可參見本文提及的參考文獻，包括例^口Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版，Wiley-Liss,紐約和其中提及的參考文獻。也可在非-動物細胞，如植物，酵母，真菌，細菌等中生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。除了Sambrook,Berger和Ausubel夕卜，有關(guān)細胞培養(yǎng)的詳細資料可參見Payne等,(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystems,JohnWiley&Sons,Inc.紐約，NY;Gamborg和Phillips(編)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture;FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)以及Atlas和Parks(編)，TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993),CRC出版社，BocaRaton,FL?？蓪⒈景l(fā)明的多核苷酸和其片段包含在多個表達載體的任一個中以表達多肽。所述載體包括染色體，非染色體和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細菌質(zhì)粒；噬菌體DNA;桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA,病毒DNA，如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒，腺伴隨病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和很多其它病毒之組合的載體?？梢允褂萌魏文軐⑦z傳物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞，并且當(dāng)需要復(fù)制時可以復(fù)制并在相關(guān)宿主中能存活的載體。表達載體中的核酸序列與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄控制序列(啟動子)可操作相連以介導(dǎo)mRNA合成。所述啟動子的例子包括LTR或SV40啟動子，大腸桿菌lac或trp啟動子，噬菌體dY啟動子和其它已知能控制原核或真核細胞或其病毒中的基因表達的啟動子。表達載體還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。載體任選包括用于擴增表達的適當(dāng)序列。另外，表達載體還任選含有一種或多種選擇標(biāo)記基因以提供表型性狀，用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，如針對真核細胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或針對大腸桿菌的四環(huán)素或氨千青霉素抗性?？墒褂煤芯幋a本發(fā)明多肽的適宜DNA序列，以及適當(dāng)啟動子或控制序列的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主，以使宿主表達多肽。適當(dāng)表達宿主的例子包括細菌細胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬(5^e;tom;^e力和鼠傷寒沙門氏菌(Sa/wowe〃"(yp/z/wMn'Mm);真菌纟田月包,如酉良酒酵母(iSacc/7flra附y(tǒng)ceycerev&z'"e),巴斯德畢赤氏酵母GP/c//fl/7aston》和粗糙鏈孢霉(A^Mra^oracm^");昆蟲細月包，^口果蟲是CDrosop/n7a)禾口草J4夜蟲我0S/O(iop/era^h/g^enia」；哺吝'L動4勿細胞，如CHO,COS，BHK,HEK293或Bowes黑素瘤；植物細胞等。應(yīng)理解不是所有細胞或細胞系都需要能夠產(chǎn)生完全功能性的本發(fā)明的多肽或其片段；例如，可在細菌或其它表達系統(tǒng)中產(chǎn)生多肽的抗原性片段。本發(fā)明并不受所用宿主細胞的限制。例如，當(dāng)需要大量多肽或其片段以誘導(dǎo)抗體時，則需要能指導(dǎo)高水平表達易于純化的融合蛋白的載體。所述載體包括但不限于多功能的大腸桿菌克隆和表達載體，諸如BLUESCRIPT(Stratagene),其中核苷酸編碼序列^皮連接至載體中，與氨基末端的Met序列和隨后的(3-半乳糖苦酶的7個殘基位于同一讀碼框內(nèi)，從而產(chǎn)生雜合蛋白；pIN載體(VanHeeke&Schuster(1989)JBiolChem264:5503-5509);pET載體(Novagen，MadisonWI)等。類似地，在酵母釀酒酵母中，可使用多種含有組成型或誘導(dǎo)型啟動子，如a因子，醇氧化酶和PGH的載體來生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。有關(guān)評述可參見Ausubel等，(文獻同上)和Grant等，(1987;MethodsinEnzymology153:516-544)。在哺乳動物宿主細胞中，可利用多種表達系統(tǒng)，如基于病毒的系統(tǒng)。當(dāng)使用腺病毒作為表達載體時，任選將編碼序列連接至腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合物中，所述復(fù)合物由晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成。插入病毒基因組中非必需的El或E3區(qū)域會導(dǎo)致產(chǎn)生能在被感染的宿主細胞中表達本發(fā)明多肽的存活病毒(Logan和Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655-3659)。另外，可使用轉(zhuǎn)錄增強子，如Rous肉瘤病毒(RSV)增強子來增強哺乳動物宿主細胞中的表達。宿主細胞、培養(yǎng)基、表達系統(tǒng)和制備方法包括已知用于克隆和表達多種哺乳動物干擾素-a(例如，人干擾素-a)的那些內(nèi)容。^它或這^斧具體的起始信號有助于本發(fā)明多核苦酸編碼序列和/或其片段的有效翻譯。這些信號包括例如ATG起始密碼子和鄰接的序列。當(dāng)將編碼序列，其起始密碼子和上游序列被插入適當(dāng)表達載體時，無需其它的翻譯控制信號。然而，當(dāng)僅插入編碼序列(如成熟蛋白質(zhì)的編碼序列)或其部分時，必須提供外源轉(zhuǎn)錄控制信號，包括ATG起始密碼子。另外，起始密碼子必須位于正確的讀碼框內(nèi)以確保完整插入物的轉(zhuǎn)錄。外源轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是不同的來源，可以是天然的和合成的。通過包含適于所用細胞系統(tǒng)的增強子，可以增強表達效力(Scharf,D.等(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:125-62;Bittner等(1987)MethodsinEnzymol，153:516-544)。為、泌/;t在y^本發(fā)明編碼多肽的多核苷酸也可以與編碼分泌/定位序列的核酸發(fā)生融合例如框內(nèi)融合，從而將多肽表達靶向至所需的細胞區(qū)室，膜或細胞器，或者介導(dǎo)多肽分泌至周質(zhì)間隙或細胞培養(yǎng)基中。所述序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括分泌前導(dǎo)肽，細胞器靶向序列(例如核定位序列，ER滯留信號，線粒體轉(zhuǎn)位序列，葉綠體轉(zhuǎn)位序列)，膜定位/錨著(anchor)序列(如終止轉(zhuǎn)移序列，GPI錨著序列)等。在其它方面中，本發(fā)明涉及含有任何上述核酸、載體或本發(fā)明的構(gòu)建體的宿主細胞。宿主細胞可以是真核細胞，如哺乳動物細胞，酵母細胞或植物細胞，或宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。通過磷酸鉤轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、基因或疫苗槍、注射或其它用于體內(nèi)、離體或體外方法的普通技術(shù)(Davis,L.,Dibner，M和Battey,I.(1986)BasicMethodsinMolecularBiology),可將構(gòu)建體引入宿主細胞。任選根據(jù)細胞調(diào)節(jié)插入序列的表達或按所需方式加工經(jīng)表達的蛋白質(zhì)的能力來選擇宿主細胞抹。蛋白質(zhì)的所述修飾包括但不限于乙?；?、羧基化、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和?；Ａ呀獾鞍踪|(zhì)的"前"或"前原"形式的翻譯后加工對于正確插入，折疊和/或行使功能是重要的。對于這種翻i奪后的活性而言，諸如CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等的不同宿主細胞具有具體的細胞器和特征性的機制，可選擇所述宿主細胞以確保正確修飾和加工引入的外源蛋白質(zhì)。穩(wěn)定的表達可用于長期、高產(chǎn)地生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。例如，可使用表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)能穩(wěn)定表達本發(fā)明多肽的細胞系，所述表達載體含有病毒復(fù)制起點或內(nèi)源性表達元件和選擇標(biāo)記基因。引入載體之后，使細胞在加料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1至2天，然后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基中。選擇性標(biāo)記的目的是賦和回收。例如，使用適于所述細胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)可使被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細月包的4元'性群(resistantclump)增歹直。任選在適于表達并從細胞培養(yǎng)物中回收編碼蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)被編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞。根據(jù)所用序列和/或載體的不同，由重組細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或其片段可被分泌，與膜結(jié)合或包含在細胞內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得可設(shè)計含有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達載體，所述載體具有指導(dǎo)成熟多肽通過原核或真核細胞膜的分泌的信號序列。本發(fā)明的多核苷酸任選地包含與標(biāo)記序列(例如便于純化所編碼多肽的序列)在框內(nèi)融合的編碼序列。所述純化亞序列包括但不限于允許在固定化的金屬上純化的金屬螯合肽如組氨酸-色氨酸組件(module)，與谷胱甘肽結(jié)合的序列(如GST)，血凝素(HA)標(biāo)記(對應(yīng)于流感病毒血凝素蛋白的表位；Wilson,I.等(1984)Cell37:767)，麥芽糖結(jié)合蛋白序列，F(xiàn)LAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(ImmunexCorp.,Seattle,WA)中所用的FLAG表位等。在純化結(jié)構(gòu)域和多肽序列之間包含可被蛋白酶裂解的多肽接頭序列有利于純化。例如，可用于本文所述組合物和方法中的一種表達載體提供了融合蛋白的表達，所述融合蛋白含有與多聚組氨酸區(qū)域融合的本發(fā)明多肽，它們之間被腸激酶裂解位點隔開。組氨酸殘基促進在IMIAC(固定化金屬離子親和層析，如Porath等(1992)ProteinExpressionandPurification3:263-281)上純化，而腸激酶裂解位點提供了從多組氨酸區(qū)域分離出所需多肽的方法。pGEX載體(Promega;Madison,WI)可^皮任選地用于將外源多肽表達成與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，所述融合蛋白是可溶性的，通過吸附至配體-瓊脂糖珠(例如，當(dāng)與GST融合時為谷胱甘肽-瓊脂糖)，接著在游離配體的存在下進行洗脫，可以容易地從裂解的細胞中純化出融合蛋白。本文所述組合物和方法的其它構(gòu)建體用于蛋白質(zhì)，及其編碼核酸，例如包括與Ig分子，例如，人IgGFc("可結(jié)晶片段"或與補體結(jié)合的片段)鉸鏈，CH2區(qū)和CH3區(qū)(和編碼它們的核苷酸序列)融合的本文所述本發(fā)明的多肽(或其一個或多個片段)。Fc是抗體的一部分，負責(zé)結(jié)合細胞上的抗體受體和補體的Clq組分。這些融合蛋白或其片段及其編碼核酸任選地可用于預(yù)防性和/或治療性藥物或作為診斷工具(同樣參見，例如，Challita-Eid，P"(1998)JImmunol160:3419-3426;Sturmhoefel,K"(1999)CancerRes59:4964-4972).轉(zhuǎn)導(dǎo)適當(dāng)?shù)乃拗髂ú⑺拗髦昱囵B(yǎng)至適當(dāng)?shù)募毎芏戎?，通過適當(dāng)?shù)姆绞?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)試劑誘導(dǎo))誘導(dǎo)選定的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。一般通過離心收集細胞，用物理或化學(xué)方法破壞細胞，保留所得粗提取物以進行進一步純化。可通過任何便利的方法破壞表達蛋白質(zhì)所用的真核或細菌細胞，包括反復(fù)凍融，超聲處理，機械破碎或使用細胞裂解劑或其它方法，所述方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。如上所述，很多篇參考文獻可用于培養(yǎng)和生產(chǎn)很多種細胞，包括源自細菌，植物，動物(具體是哺乳動物)和古細菌的細胞。參見例如Sambrook，Ausubel和Berger(文南大同上),以及Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版，Wiley-Liss,紐約和其中提及的參考文獻,Doyle和Griffiths(1997)MammalianCellCulture:EssentialTechniques,JohnWiley和Sons,紐約；Humason(1979)AnimalTissueTechniques,第4版,W.H.Freeman和Company;和Ricciardelli等(1989)/"v/加CellDevBiol,25:1016-1024。關(guān)于植物細胞培養(yǎng)和再生，可參見Payne等(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystems,JohnWiley&Sons,Inc.,紐約,NY;Gamborg和Phillips(編)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture;FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)禾口PlantMolecularBiology(1993)R.R.D.Croy編，BiosScientificPublishers,Oxford,U.K.ISBN0121983706。細胞培養(yǎng)基通?？蓞⒁夾tlas和Parks(編)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRC出版社，BocaRaton,FL。有關(guān)細胞培養(yǎng)的其它資料可參見商家提供的文獻，例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)提供的生命科學(xué)研究，細胞培養(yǎng)目錄("Sigma-LSRCCC")，和例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)提供的植物培養(yǎng)目錄和增補本("Sigma-PCCS")。也可通過本領(lǐng)域眾所周知的多種方法中的任一種，從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析(如使用本文所述的任何標(biāo)記系統(tǒng))、羥基磷灰石層析和凝集素層析。需要時，在完成成熟蛋白質(zhì)或其片段的構(gòu)型時，可以利用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最終，在最后的純化步驟中可以使用高效液相層析(HPLC)。除了上文提及的參考文獻外，多種純化方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例如Sandana(1997)BioseparationofProteins,Academic出片反乂^司；禾口Bollag等(1996)ProteinMethods,第2版，Wiley-Liss,紐約；Walker(1996)TheProteinProtocolsHandbook,Humana出片反^土,NJ,Harris禾口Angal(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproach,牛;聿IRL出片反牙土，牛;聿，英國；Harris禾口Angal，ProteinPurificationMethods:APracticalApproach,牛；聿IRL出片反;f土,牛津，英國；Scopes(1993)ProteinPurification:PrinciplesandPractice,第3版，SpringerVerlag，紐約；Janson和Ryden(1998)ProteinPurification:Principles,HighResolutionMethodsandApplications，第2版,Wiley-VCH，紐約；和Walker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROM,Humana出片反一土，NJ。謬斧或這,秀鍵也可使用本發(fā)明的多核苷酸，利用無細胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。幾種這樣的系統(tǒng)可以購得。體外轉(zhuǎn)錄和翻譯方法的一般性指南可參見Tymms(1995)/"WraTranscriptionandTranslationProtocols:MethodsinMolecularBiology,第37巻，GarlandPublishing,紐約。編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，或該多核苷酸的互補序列(包括例如，反有用的產(chǎn)物。這些體內(nèi)應(yīng)用，包括基因治療，包括多種技術(shù)，通過這些技術(shù)可改變細胞中的基因表達。例如，所述方法包括引入基因，其用于表達例如在治療性和/或預(yù)防性上有用的多肽諸如本發(fā)明的多肽。沐力/農(nóng)或迷使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸特別適用于體內(nèi)治療應(yīng)用。例如，用至少一種本發(fā)明的多核苷酸(DNA或RNA)或/和其它編碼例如至少一種抗原、細胞因子、其它共刺激分子，佐劑等的多核苷酸等對所培養(yǎng)的細胞在離體條件下進行改造，然后將經(jīng)改造的細胞返回至患者體內(nèi)。也可在體內(nèi)對細胞進行改造，以便在體內(nèi)表達一種或多種多肽，所述多肽包括本發(fā)明的多肽和/或抗原性肽。已知多種病毒載體適于生物體的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達。所述載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Miller(1992)CurrTopMicrobiolImmunol158:1-24;Salmons和Gunzburg(1993)HumanGeneTherapy4:129-141;Miller等(1994)MethodsinEnzymology217:581-599)和腺-伴隨病毒載體(參見Carter(1992)CurrOpinionBiotech3:533-539;Muzcyzka(1992)CurrTopMicrobiolImmunol158:97-129)?？梢允褂玫钠渌《据d體包括腺病毒載體，皰滲病毒載體和新培斯病毒載體，一般描述于例如Jolly(1994)CancerGeneTherapy1:51-64;Latchman(1994)MolecBiotechnol2:179-195;和Johanning等(1995)NuclAcidsRes23:1495陽1501。一方面，可使用痘病毒載體。用編碼本發(fā)明的多肽(諸如eIL-2多肽)的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染痘病毒載體，且所述痘病毒載體可用于需要改善免疫反應(yīng)，諸如增加或改善T細胞增殖的預(yù)防性，治療性和-〖貪斷性的應(yīng)用中。參見例如，Berencsi等，JInfectDis(2001)183(8):1171-9;Rosenwirth等，Vaccine2001Feb8;19(13-14):1661-70;Kittlesen等，JImmunol(2000)164(8):4204-11;Brown等，GeneTher20007(19):1680-9;Kanesa國thasan等，Vaccine(2000)19(4-5):483-91;Sten(2000)Drug60(2):249-71中所^^開的病毒載體。包含所述載體和可接受賦形劑的組合物也是本發(fā)明的特征?；蛑委熀突蛞呙缣峁┝硕喾N方法用于抵抗慢性傳染病(例如HIV感染，病毒性肝炎)，以及非-傳染性疾病，包括癌癥和一些形式的先天性缺陷，如酶缺陷，所述方法可使用本發(fā)明的多核苷酸，包括，例如，包含所述多核苦酸的載體和細胞。已使用了數(shù)種方法在體內(nèi)，離體和體外條件下將本發(fā)明的核酸引入細胞，所述方法可使用本發(fā)明的多核苷酸和包含所述多核苷酸的載體。這些方法包括基于脂質(zhì)體的基因傳遞(Debs和Zhu(1993)WO93/24640和美國專利5,641,662;Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques6(7):682-691;Rose,美國專利5,279,833;Brigham(1991)WO91/06309;和Feigner等(1987)Proc.NatlAcad.Sci.USA84:7413-7414);Brigham等(1989)AmJMedSci298:278-281;Nabel等(1990)Science249:1285-1288;Hazinski等(1991)Am.J.Resp.CellMolec.Biol4:206-209;以及Wang和Huang(1987)Proc.NatlAcad.Sci.(USA)84:7851-7855);腺病毒載體介導(dǎo)的基因傳遞，例如用于治療癌癥(參見例如Chen等(1994)Proc.NatlAcad.Sci.USA91:3054-3057;Tong等(1996)Gynecol.Oncol.61:175-179;Clayman等(1995)CancerRes5:1-6;O'Malley等(1995)CancerRes55:1080-1085;Hwang等(1995)Am.J.Respir.CellMol.Biol,13:7-16;Haddada等(1995)CurrTopMicrobiolImmunol199(Pt.3):297-306;Addison等(1995)Proc.NatlAcad.Sci.USA92:8522-8526;Colak等(1995)BrainRes691:76-82;Crystal(1995)Science270:404-410;Elshami等(1996)HumanGeneTher7:141-148;Vincent等(1996)JNeurosurg85:648-654),和很多其它的。另外，已使用復(fù)制-缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其含有治療性的多核苷酸序列作為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分，其中具體應(yīng)提及簡單的MuLV載體，參見例如Miller等(1990)MolCellBiol10:4239(1990);Kolberg(1992)JNIHRes4:43,和Cornetta等(1991)HumGeneTher2:215)。另外，還使用了與配體-特異性的，基于陽離子的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相偶聯(lián)的核酸轉(zhuǎn)運(Wu和Wu(1988)JBiolChem263:14621-14624)。也已描述了棵露的DNA表達載體(Nabel等(19卯)，文獻同上；Wolff等(1990)Science247:1465-1468)。通常，通過將編碼本發(fā)明多肽核酸摻入適當(dāng)載體，可以使這些方法適應(yīng)于本發(fā)明。描述基因治療方法，通過將本發(fā)明的核酸引入患者而適應(yīng)于本發(fā)明的普通教科書包括Robbins(1996)GeneTherapyProtocols,Humana出版社，NJ,和Joyner(1993)GeneTargeting:APracticalApproach,IRL出版社，牛津，英國。除了表達本發(fā)明的核酸作為基因替代核酸外，一旦或當(dāng)細胞中不再需要表達所述核酸時，所述核酸還可用于有義和反義地抑制表達，例如下調(diào)本發(fā)明核酸的表達。類似地，也可使用本發(fā)明的核酸，或其亞序列或反義序列阻斷天然的同源性核酸的表達。多種有義和反義技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例3口可參見Nellen(1997)AntisenseTechnology:APracticalApproach，IRL出版社，牛津大學(xué)，牛津，英國和Agrawal(1996)AntisenseTherapeutics,Humana出版社，NJ和其中提及的參考文獻。財豕奸本文還預(yù)期了一般具有至少12個堿基，優(yōu)選至少15個堿基，更優(yōu)選至少20,至少30或至少50個堿基的多核香酸(本文也稱之為寡核香酸)的用途，所述多核苷酸能在至少高度嚴緊的條件下與本發(fā)明的多核苷酸，或其片段雜交。根據(jù)上述文獻中所述的方法，所述多核苷酸可用作探針、引物、有義和反義試劑等。當(dāng)核酸相互結(jié)合(一般在溶液中進行)時即為"雜交"。核酸雜交是由于多種已確定的物理-化學(xué)力，如氫鍵，溶劑排斥，堿基堆積等。有關(guān)核酸雜交的i豐盡指導(dǎo)可參見Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I邢分，第2章,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",以及Ausubel,文獻同上。Hames和Higgins(1995)GeneProbes1,牛津大學(xué)出版社的IRL出版社，牛津，英國(Hames和Higginsl)和Hames與Higgins(1995)GeneProbes2，牛津大學(xué)出版社的IRL出版社，牛津，英國(Hames和Higgins2)提供了有關(guān)合成、標(biāo)記、檢測和定量DNA和RNA包括寡核香酸的細節(jié)。兩種核酸序列基本上相同的指標(biāo)是兩種分子在至少嚴緊條件下彼此雜交。術(shù)語"特異性雜交"是指當(dāng)序列存在于(例如，總細胞)DNA或RNA復(fù)合混合物中時，在嚴緊條件下，分子僅于具體核苦酸序列結(jié)合，形成雙鏈，或雜交。"基本上結(jié)合"是指探針核酸和靶核酸之間的互補雜交，且包含可通過降低雜交介質(zhì)的嚴緊度以便實現(xiàn)靶多核苷酸序列所需檢測而進行調(diào)節(jié)的較小錯配。在核酸雜交實^驗，如Southern和Northern雜交的上下文中"嚴緊雜交洗滌條件"和"嚴緊雜交條件"取決于序列，在不同的環(huán)境參數(shù)下也是不同的。有關(guān)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參見Tijssen(1993),文獻同上和Hames和Higgins1與Hames和Higgins2，文獻同上。為了本發(fā)明的目的，通常將"高度嚴緊的"雜交和洗滌條件選定為在確定的離子強度和pH下比具體序列的熱解鏈溫度(TJ低約5。C或更低(如下文所述，也可以用相當(dāng)?shù)男g(shù)語描述高度嚴緊的條件)。Tm是50。/。的受試序列與精確匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和pH下)。換言之，Tm是核酸雙鏈體在給定條件下其50%發(fā)生變性的溫度，該溫度可代表對核酸雜合體穩(wěn)定性的直接測定。因此，Tm相當(dāng)于從螺旋到隨機巻曲的轉(zhuǎn)變中點所對應(yīng)的溫度；對于長的核香酸序列片段而言，它取決于長度，核香酸組成和離子強度。一般而言，在"嚴緊條件"下，探針將與其靶序列雜交，而不與其它序列雜交。"非常嚴緊的條件"被選定為與具體探針的Tm相等。雜交之后，可通過一系列的洗滌去除未雜交的核酸物質(zhì)，可根據(jù)所需結(jié)果調(diào)整洗滌的嚴緊度。低嚴緊度的洗滌條件(例如使用較高的鹽濃度和較低的溫度)增加敏感性，但可產(chǎn)生非特異性雜交信號和較強的背景信號。較高嚴緊度的條件(例如使用較低的鹽濃度和接近雜交溫度的較高溫度)能降低背景信號，一般僅留下特異性信號。參見Rapley,R和Walker,J.M編，MolecularBiomethodsHandbook(Humana出版公司1998)(下文稱之為"Rapley和Walker")，其全文列入本文作為參考。使用公式(l)可估計DNA-DNA雙鏈體的Tm:Tra(°C)=81.5°C+16.6(log10M)+0.41(%G+C)—0.72(%f)—500/n,其中M是單價陽離子(通常是Na+)的重量摩爾濃度，(。/。G+C)是鳥苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，。/。f是曱酰胺的百分比，n是雜合體的核苦酸堿基數(shù)目(即長度)，參見Rapley和Walker,文獻同上。采用公式(2)可估計RNA-DNA雙鏈體的Tm:Tm(。C^79.8。C+18.5(logjoM)+0.58(。/oG+C)-11.8(%G+C)2-0.56(%f)-820/n,其中M是單價陽離子(通常是Na+)的重量摩爾濃度，(。/。G+C)是鳥苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，。/。f是曱酰胺的百分比，n是雜合體的核苷酸堿基數(shù)目(即長度)，同上。等式1和2—般僅對長于100-200個核苷酸的雜合雙鏈體準(zhǔn)確，同上?？砂聪率焦烙嫸逃?0個核苷酸的核酸序列的Tm:Tm(°C)=4(G+C)+2(A+T),其中A(腺噤呤)，C,T(胸腺嘧啶)和G是相應(yīng)核苷酸的數(shù)目。在Southern或Northern印跡中的濾膜上使具有100個以上互補殘基的互補核酸雜交的嚴緊雜交條件例子是在含lmg肝素的50%福爾馬林中，42。C雜交過夜。嚴緊洗滌條件的例子是0.2xSSC,65'C洗滌15分鐘(有關(guān)SSC緩沖液的描述可參見Sambrook,文獻同上)。經(jīng)常先用低嚴緊度的洗滌然后以高嚴緊度的洗滌,去除背景探針信號。低嚴緊度洗滌的例子是2xSSC，40。C洗涂15分鐘。高嚴緊度洗滌的例子是0.15MNaCl，72。C洗滌15分鐘。雙鏈體例如超過100個核苷酸的中等嚴緊度洗滌的例子是lxSSC,45。C洗滌15分鐘。對于雙鏈體(例如，大于100個核苷酸)的低嚴緊洗滌的實例是4-6xSSC,40°C15分鐘。對于短探針(例如，約10個-50個核苦酸)而言，嚴緊條件通常包括，鹽濃度小于約l.OMNa+離子，通常是約0.01-1.0MNa+離子濃度(或其它鹽)，pH7.0-8.3,和溫度通常至少約30。C.嚴緊條件還可通過加入去穩(wěn)定劑諸如曱酰胺而實現(xiàn)。通常，在具體的雜交受試中，如果利用不相關(guān)探針時觀察到2.5x-5x(或更高)的信號噪聲比，則表明檢測到特異性雜交。在本發(fā)明的上下文中，檢測到兩個序列之間至少嚴緊的雜交則表明與例如本文序列表中提供的本發(fā)明的核酸相比具有相對較高的結(jié)構(gòu)相似性或同源性。如上所述，將"高度嚴緊的"條件選定為比具體序列在確定的離子強度和pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5。C或更低?？稍诟叨葒谰o的條件下鑒定與感興趣的核苷酸序列(例如"探針")密切相關(guān)或相同的靶序列。較低嚴緊度的條件適用于互補性較差的序列，參見例如Raoley和Walker,同上。可使用比較性雜交(comparativehybridization)來鑒定本發(fā)明的核酸，這種比較性雜交法是區(qū)分本發(fā)明核酸的優(yōu)選方法。在本發(fā)明的上下文中，檢測到兩個序列之間高度嚴緊的雜交表明與例如本文序列表中提供的核酸相比具有相對較高的結(jié)構(gòu)相似性/同源性。兩個核苷酸序列之間高度嚴緊的雜交表明了比通過嚴緊雜交條件檢測到的更高的結(jié)構(gòu)、核苷酸堿基組成、排列或順序的相似性或同源性水平。具體是，在本發(fā)明的上下文中，檢測到高度嚴緊的雜交表明與例如本文序列表中提供的核酸相比具有較高的結(jié)構(gòu)相似性或結(jié)構(gòu)同源性(例如核苦酸結(jié)構(gòu)，堿基組成，排列或順序)。例如，需要鑒定能在嚴緊條件下與本文所例舉的核酸雜交的受試核酸。因此，對嚴緊條件的一個衡量標(biāo)準(zhǔn)是能在高度嚴緊的條件(或很嚴緊的條件，或超-高度嚴緊的雜交條件，或超-超-高度嚴緊的雜交條件)下，與本發(fā)明所列核酸(例如核酸序列SEQIDNO:59-88，及其互補多核苷酸序列)之一雜交。對任何受試核酸而言，都可憑經(jīng)驗容易地確定嚴緊條件(包括例如高度嚴緊，超-高度嚴緊或超-超-高度嚴緊的雜交條件)和洗滌條件。例如，在確定高度嚴緊的雜交和洗滌條件時，可逐漸提高雜交和洗滌條件(例如通過在雜交或洗滌過程中升高溫度，降低鹽濃度，提高去污劑濃度和/或提高有機溶劑如福爾馬林的濃度)，直至達到一套選定的標(biāo)準(zhǔn)。例如，逐漸提高雜交和洗滌條件，直至探針(包含一種或多種選自SEQIDNO:59-88的核酸序列，和其互補多核普酸序列)能結(jié)合精確匹配的互補靶(該靶核酸同樣含有一種或多種選自SEQIDNO:59-88及其互補多核苷酸序列的核酸序2.5x，任選5x于或更高倍。此時，不匹配的靶是對應(yīng)于已知a干擾素核酸序列(例如遞交本申請時，如GenBank的公共數(shù)據(jù)庫中存在的a干擾素核酸序列)的核酸。在如下情況下可以說受試核酸與探針核酸特異性雜交當(dāng)受試核酸與探針核酸的雜交程度為探針與精確匹配的互補靶的雜交程度的至少1/2,即信號噪聲比探針與所述靶在一定條件下雜交時的至少1/2時，其中在所述雜交的條件下，精確匹配的探針與精確匹配的互補靶結(jié)合，其信號噪聲為該探針與任何不匹配的耙核酸諸如上述已知的干擾素-a核酸序列雜交時所觀測到的相應(yīng)數(shù)值的至少約2.5倍-10倍，一般5倍-10倍。對于一些所述核酸而言，選擇嚴緊條件以便使與編碼寡核苦酸精確互補的寡核苷酸與該編碼寡核苷酸雜交時的信號噪聲比與完全互補性寡核苷酸與對應(yīng)于上述已知干擾素-a序列的對照核酸雜交時的信號噪聲比相比高至少5倍。超-高度嚴緊的雜交和洗滌條件是如下所述的條件，其中提高雜交和洗滌條件的嚴緊度，直至探針與精確匹配的互補靶核酸結(jié)合的信號噪聲比為該探針與任何不匹配的靶核酸諸如上述已知的干擾素-a核酸序列雜交時所觀測到的相應(yīng)數(shù)值的至少10倍。如果靶核酸能在這種條件下與探針雜交，且信號噪聲比為至少為精確匹配的互補靶核酸的1/2,即可以說該靶核酸與探針能在超-高度嚴緊的條件下結(jié)合。類似地，通過逐漸提高相關(guān)雜交受試的雜交和/或洗滌條件，可以確定甚至更高的嚴緊水平。例如，那些其中雜交和洗滌條件的嚴緊度被提高直至探針與精確匹配的互補耙核酸結(jié)合的信號噪聲比為探針與任何不匹配的輩巴核酸諸如上述已知的干擾素-ot核酸序列雜交時所觀測到的相應(yīng)數(shù)值的至少10倍，20倍，50倍，100倍或500倍或更高倍。如果耙核酸能在這種條件下與探針雜交，且信號噪聲比為精確匹配的互補靶核酸的至少1/2,即可以說該靶核酸與探針能在超-超-高度嚴緊的條件下結(jié)合。能在高度，超-高度和超-超-高度嚴緊條件下與SEQIDNO:59-88所示核酸雜交的靶核酸是本發(fā)明的特征。所述核酸的例子包括與給定核酸序列相比，具有一個或一些沉默或保守核酸取代的核酸。治療用途多種干擾素-a多肽和干擾素-a偶聯(lián)物已被批準(zhǔn)或正處于臨床開發(fā)階段，它們可用于治療多種疾病，例如慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、多毛細胞白血病、惡性黑素瘤、濾泡性淋巴瘤、尖銳濕疣、與AIDS-相關(guān)的卡波西肉瘤、非何杰金氏淋巴瘤、慢性髓性白血病、基細胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、類癌瘤、膀胱癌、節(jié)段性回腸炎、皮膚T細胞淋巴瘤、腎細胞癌、多發(fā)性硬化和AIDS。因此，本發(fā)明包括治療對干擾素-a有反應(yīng)的疾病，如上述疾病的方法，所述方法包括給受疾病折磨的受試者施用含有本發(fā)明多肽或本發(fā)明偶聯(lián)物的組合物，所述組合物的量能有效減輕與疾病相關(guān)的癥狀。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明多肽或本發(fā)明偶聯(lián)物的組合物(即"本發(fā)明的組合物")用于治療對干擾素-a有反應(yīng)的疾病，如上述疾病或任何其它對本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的偶聯(lián)物有反應(yīng)的疾病的用途。治;^病毒^染和與^毒^染一"^一方面，本發(fā)明提供了治療被病毒感染的受試者的方法，所述方法包括給受試者施用本發(fā)明的組合物，所述組合物的量能有效降低受試者體內(nèi)的病毒水平和/或減輕與病毒感染相關(guān)的癥狀或病情。本發(fā)明的治療方法欲包括的病毒感染的實例包括但不限于下述病毒的感染黃病毒科家族的病毒，例如丙肝病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒、登革病毒或牛病毒性腹瀉病毒；嗜肝DNA病毒科家族的病毒，例如，乙肝病毒；小RNA病毒科家族的病毒，例如腦心肌炎病毒、人鼻病毒或曱肝病毒；反錄病毒科家族的病毒，例如人類免疫缺陷病毒、猴免疫缺損病毒、人T-嗜淋巴性病毒或勞斯肉瘤病毒；冠狀病毒科家族的病毒，例如SARS冠狀病毒；彈狀病毒科家族的病毒，例如狂犬病病毒或水泡性口炎病毒；副粘病毒科家族的病毒，例如呼吸道合胞病毒或副流感病毒；乳頭狀瘤病毒科家族的病毒，例如人乳頭狀瘤病毒以及皰疹病毒科家族的病毒，例如單純皰滲病毒。下文提供了使用本發(fā)明的多肽和偶聯(lián)物治療例舉的病毒感染和與所述感染相關(guān)的疾病的非限制性例子，其中包括建議的本發(fā)明多肽和偶聯(lián)物的劑量方案，以及監(jiān)測所述治療效力的方法。由此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物用于治療其它病毒感染和與之相關(guān)的疾病時的劑量方案，以及監(jiān)測所述治療效力的方法。在本發(fā)明的一個方面中，提供了治療丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的方法，包括對患者施用有效量的本發(fā)明的組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了用于治療HCV感染患者的組合物，其包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物和可藥用的載體或賦形劑。診斷為HCV感染的患者包括其血液中顯示HCVRNA的和/或血清中顯示抗HCV抗體的患者。包含本發(fā)明多肽的組合物的施用劑量和頻率通常與采用臨床批準(zhǔn)的干擾素-oc多肽的HCV治療方案中所使用的相似，所述臨床批準(zhǔn)的干擾素-a多肽是例如ROFERON⑧A(干擾素a-2a，重組；Hoffmann-LaRocheInc.)、INTRON⑧A(干擾素a-2b,重組；ScheringCorporation)和INFERGEN(干擾素acon-1;InterMune,Inc.)。ROFERON或INTRONA治療慢性HCV的示例性推薦劑量方案是3百萬IU(大約15微克(mcg》每周三次，皮下注射，例如，24-48周。INFERGEN治療慢性HCV的示例性推薦劑量方案是9meg每周三次，皮下注射，例如，24-48周。根據(jù)多種因素(包括但不限于本發(fā)明多肽的活性和藥代動力學(xué)以及患者的體型和健康)，多肽可采用比上述更低的劑量(例如，約2,3,4,5,6,7或8mcg)和/或更低的頻率(諸如每周一次或每周兩次)進行施用。同樣地，包含本發(fā)明的偶聯(lián)物的組合物的施用劑量和頻率通常與采用臨床批準(zhǔn)的干擾素-a偶聯(lián)物的HCV治療方案中所使用的相似，所述臨床批準(zhǔn)的干擾素-a偶聯(lián)物例如為，PEGASYS⑧(Peg化干擾素a-2a;Hoffmann-LaRoche,Inc.)或PEG-INTRON(peg化干擾素a-2b;ScheringCorporation)。PEGASYS治療慢性HCV的示例性推薦劑量方案是180mcg每周一次，皮下注射，例如，24-48周。根據(jù)多種因素(包括但不限于本發(fā)明的偶聯(lián)物的分子量、活性和藥代動力學(xué)以及患者的體型和健康)，偶聯(lián)物可采用比上述更低的劑量(例如，約25,50,75,100,125或150mcg)和/或更低的頻率(諸如每io日一次，或每兩周一次)進行施用。在一些情況下，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物聯(lián)合一種或多種其它治療劑進行施用。例如，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可與小分子抗病毒藥諸如Ribavirin(其商品名為COPEGUS(Hoffmann-LaRoche,Inc)和REBETOL(ScheringCorporation))聯(lián)合施用?；蛘?，或除了小分子抗病毒藥外，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可聯(lián)合一種或多種其它細胞因子進行施用，例如IFN-y(其商品名為Actimmune(干擾素y-lb;InterMune,Inc.))、IL-2(其商品名為PROLEUKINIL-2(aldesleukin重組人白介素-2(rhIL-2);ChironCorp.)或IL-12(白介素-12)。本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的精確施用量和頻率應(yīng)依賴于多種因素諸如多肽或偶聯(lián)物的比活性和藥代動力學(xué)特性，以及需要治療的病癥的特性(諸如，被治療的丙型肝炎病毒的基因型)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。一般情況下，劑量應(yīng)能預(yù)防或減輕要治療癥狀的嚴重度或擴散。所述劑量可稱為"有效的"或"治療上有效的"量。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物的有效量要依賴于(尤其是)要治療的病癥，劑量，給藥方案，多肽或偶聯(lián)物或組合物是單獨或與其它治療劑聯(lián)合施用，血清半壽期和多肽，偶聯(lián)物或組合物的其它藥代動力學(xué)特性，以及患者的體型，年齡，和一般健康狀況。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知技術(shù)可確定給藥劑量和頻率。治療有效性可通過以下方法確定采用本領(lǐng)域已知的方法，例如通過使用基于PCR的定量檢測，諸如COBASAMPLICOR⑧HCVTest,v2.0或COBASAMPLICORHCVMONITORTest,v2.0(均獲自RocheDiagnostics)監(jiān)測病毒RNA水平，檢測病毒載量，例如測定血清或血漿中的病毒滴度或水平。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是這樣的量，其足以實現(xiàn)在治療過程中，與治療前的病毒載量(對于慢性HCV患者，其一般是105-107拷貝HCVRNA/ml)相比，將病毒載量降低至少2對數(shù)單位，至少3對數(shù)單位，至少4對數(shù)單位，至少5對數(shù)單位，至少6對數(shù)單位或至少7對數(shù)單位。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是足以將病毒載量降至基本上不可檢測的水平，例如，小于約500拷貝/ml血清或小于約100拷貝/ml血清的量。本發(fā)明包括降低感染了HCV的患者血清中HCVRNA水平的方法，其包括對患者施用本發(fā)明的組合物，與治療開始前存在的HCVRNA水平相比，所述組合物的量能有效降低HCVRNA水平。通過檢測指示HCV感染伴隨癥狀例如肝損傷的參數(shù)可以可選地或另外地測定治療效果。例如，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平可采用標(biāo)準(zhǔn)測定法進行檢測。一般而言，ALT水平小于約50國際單位/ml(IU/ml)血清被認為是正常的。較高的ALT水平可作為存在肝損傷的指征。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是能在具有高于正常ALT水平的患者中將ALT水平有效降至小于約50IU/ml血清的量。因此，本發(fā)明包括降低HCV感染的患者的血清ALT水平的方法，所述患者表現(xiàn)出起始ALT水平高于50IU/ml,所述方法包括對患者施用本發(fā)明的組合物，所述組合物的量能有效地將ALT水平降至小于約50IU/ml。乂類^建^潛^獸在本發(fā)明的另一個方面中，提供了治療人類免疫缺陷病毒(HIV),如HIV-l或HIV-2感染患者或與HIV感染相關(guān)之疾病，如與AIDS-相關(guān)的卡波西肉瘤的方法，包括給患者施用有效量的本發(fā)明的組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物，所述組合物任選與下述的其它抗病毒治療劑聯(lián)合使用。本發(fā)明還提供了用于治療HIV感染患者或與HIV感染相關(guān)之疾病的組合物，其包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物和可藥用的載體或賦形劑。診斷為HIV感染的患者包括其血液中顯示出可測水平的HIVRNA或原病毒DNA和/或血清中顯示出可測水平的p24抗原或抗HIV抗體的患者。包含本發(fā)明多肽的組合物的施用劑量和頻率通常與采用干擾素-a多肽的HIV治療方案中所使用的相似，所述千擾素-a多肽是例如ROFERON⑧A(干擾素a-2a，重組；Hoffmann-LaRocheInc.)、INTRON⑧A(干擾素a-2b,重組;ScheringCorporation)和INFERGEN(干擾素acon-1;InterMune，Inc.)。如上所述，ROFERON或INTRONA治療慢性HCV的示例性推薦劑量方案是3百萬IU(大約15微克(mcg))每周三次，皮下注射，例如，24-48周。INFERGEN治療慢性HCV的示例性推薦劑量方案是9meg每周三次，皮下注射，例如，24-48周。ROFERON治療與AIDS-相關(guān)的卡波西肉瘤的示例性推薦劑量方案是每天3千6百萬單位用10至12周，然后每周三次，每天用3千6百萬單位。INTRONA治療與AIDS-相關(guān)的卡波西肉瘤的示例性推薦劑量方案是3千萬IU/m2，每周三次，皮下注射。所述劑量方案提供了本發(fā)明多肽的有用的劑量范圍，所述劑量范圍可治療HIV或與HIV感染有關(guān)的疾病。根據(jù)多種因素(包括但不限于本發(fā)明多肽的活性和藥代動力學(xué)以及患者的體型、年齡和健康)，本發(fā)明多肽可采用比上述更低的劑量和/或更低的頻率進行施用。同樣地，包含本發(fā)明的偶聯(lián)物的組合物的施用劑量和頻率通常與釆用干擾素-oc偶^:物的HIV治療方案中所使用的相似，所述干擾素-ot偶if關(guān)物例如為，PEGASYS⑧(Peg化干擾素ot-2a;Hoffmann-LaRoche,Inc.)或PEG-INTRON⑧(peg化干擾素oc-2b;ScheringCorporation)。PEG-INTRON治療HIV的示例性劑量方案是約1.0mcg/kg/周至3.0mcg/kg/周，皮下注射，例如，24-48周。所述劑量方案提供了本發(fā)明的偶聯(lián)物用于治療HIV的有用藥代動力學(xué)以及患者的體型、年齡和健康狀況)，偶聯(lián)物可采用比上述更低的劑量(例如，約0.1,0.25,0J0或0."mcg/kg/周)和/或更低的頻率(諸如每10日一次，或每兩周一次)進行施用。在一些情況下，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物聯(lián)合一種或多種其它治療劑進行施用。目前對人HIV-1感染的臨床治療包括多種藥物聯(lián)合療法，一般稱之為高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法("HAART，，)。因此，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可與HAART或其它抗病毒治療性化合物聯(lián)合使用。HAART的典型組分包括核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑("NRTI")、非-核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑("NNRTT，)和HIV蛋白酶抑制劑("PI")的多種組合，其描述于例如A.M.Vandammeetal.(1998)AntiviralChemistry&Chemotherapy,9:187-203'，"DrugsforHIVInfection"inTheMedicalLetterVol.39(Issue1015)December5,1997,pages111-116;和已公開的美國專利申請US20020182179A1;所述文獻各列入本文作為參考。如果HIV-感染患者也感染了HCV,本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可與抗病毒藥諸如Ribavirin(其商品名為COPEGUS(Hoffmann-LaRoche,Inc)和REBETOL(ScheringCorporation))以及HAART聯(lián)合施用。本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的精確施用量和頻率，以及其它治療劑，如HAART和/或Ribavirin的^l青確施用量和頻率應(yīng)依賴于多種因素諸如多肽或偶聯(lián)物的比活性和藥代動力學(xué)特性，以及需要治療的病癥的特性(諸如，其它病毒感染，如HCV的存在)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。一般情況下，劑量應(yīng)能預(yù)防或減輕要治療癥狀的嚴重度或擴散。所述劑量可稱為"有效的"或"治療上有效的"量。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物的有效量要依賴于(尤其是)要治療的病癥、劑量、給藥方案，多肽或偶聯(lián)物或組合物是單獨或與其它治療劑聯(lián)合施用，血清半壽期和多肽，偶聯(lián)物或組合物的其它藥代動力學(xué)特性，以及患者的體型、年齡和一般健康狀況。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知技術(shù)可確定給藥劑量和步貞率。除了上述一般性用途外，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可施用給下述HIV感染患者亞群作為例如上述HAART的輔助療法；在病毒載量一般較高的早期患者中作為單一療法或聯(lián)合療法；在經(jīng)受結(jié)構(gòu)性治療中斷(STI)或"藥物假期"的患者中作為聯(lián)合抗病毒和免疫調(diào)制劑；在HAART選擇受限的患者中作為搶救療法；作為無需啟動HAART療法即能控制病毒載量的抗病毒治療方法，以延遲HAART抗性病毒的出現(xiàn)。治療有效性可通過以下方法確定采用本領(lǐng)域已知的方法，例如通過使用基于RT-PCR的定量斗企測，諸如AMPLICORHIV-1MONITOR⑧Test,vl.5(RocheDiagnostics)監(jiān)測HIV-1病毒RNA水平，檢測病毒載量，例如測定血清或血漿中的病毒滴度或水平。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是這樣的量，其足以實現(xiàn)在治療過程中，與治療前的病毒載量相比，將病毒載量降低至少0.5對數(shù)單位，至少l對數(shù)單位，至少2對數(shù)單位，至少3對數(shù)單位，至少4對數(shù)單位，至少5對數(shù)單位，至少6對數(shù)單位或至少7對數(shù)單位。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是足以將病毒載量降至基本上不可檢測的水平，例如，小于約50-100拷貝HIV-1RNA/ml血清的量。本發(fā)明包括降低感染了HIV的患者血清中HIV-1RNA水平的方法，其包括對患者施用本發(fā)明的組合物，與治療開始前存在的HIVRNA水平相比，所述組合物的量能有效降低HIVRNA水平。或者，或另外，通過血液中HIV復(fù)制的血清標(biāo)記物，如HIVp24抗原的存在可測定治療的效力。在一些情況下，本發(fā)明組合物的有效量是足以將血液中p24抗原的水平降低為開始治療前存在的水平的50%,25%,10%或5%的量。在一些情況下，本發(fā)明組合物的有效量是足以將p24抗原的水平降低為實質(zhì)上不可測的水平的量。本發(fā)明包括降低HIV感染患者血清中的p24抗原水平的方法，所述方法包括給患者施用有效量的本發(fā)明的組合物，以使p24抗原的水平與治療開始前存在的p24抗原水平相比有所降低。乙型肝炎病毒另一方面，本發(fā)明提供了治療乙型肝炎病毒(HBV)感染患者的方法，包括對患者施用有效量的本發(fā)明的組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了用于治療HBV感染患者的組合物，其包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物以及可藥用的載體或賦形劑。診斷為HBV感染的患者包括血清中表現(xiàn)出可檢測的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。慢性HBV感染還可進一步分類為"復(fù)制型"或"非復(fù)制型"。在復(fù)制型感染中，患者通常具有相對高的病毒DNA血清濃度和可檢測的HBeAg,其是HBV前核心基因的可選經(jīng)加工的蛋白，其在高病毒復(fù)制的條件下合成。然而，在具有前核心基因突變的罕見HBV株中，復(fù)制型感染可在不存在可見的血清HBeAg時出現(xiàn)。慢性乙型肝炎和復(fù)制型感染患者與無HBeAg的患者相比，通常具有較差的預(yù)后且發(fā)生肝硬化和/或肝細胞癌的可能性較高。在非復(fù)制型感染中，肝中的病毒復(fù)制速率低，血清HBVDNA濃度一般低且檢測不到肝炎Be抗原(HBeAg)。包含本發(fā)明多肽的組合物的施用劑量和頻率通常與采用臨床批準(zhǔn)的干擾素-a多肽的HBV治療方案中所使用的相似，所述臨床批準(zhǔn)的干擾素-a多肽是例如INTRON⑧A(干擾素a-2b，重組；ScheringCorporation)。INTRONA治療成年人中慢性HBV的示例性推薦劑量方案是30-35百萬IU每周，皮下或肌內(nèi)注射，或以5百萬IU每曰(qd)或以10百萬IU每周三次(tiw),16周。根據(jù)多種因素(包括但不限于本發(fā)明多肽的活性和藥代動力學(xué)，以及患者的體型和健康)，本發(fā)明的多肽可采用比上述更低的劑量(例如，約5,10,15,20或25百萬IU每周)和/或更低的頻率(諸如每周一次或每周兩次)進行施用。同樣地，包含本發(fā)明的偶聯(lián)物的組合物的施用劑量和頻率通常與采用目前處于臨床受試中的干擾素-a偶聯(lián)物的HBV治療方案中所使用的相似，所述臨床批準(zhǔn)的干擾素-a偶聯(lián)物例如為，PEGASYS⑧(Peg化干擾素a-2a;Hoffmann-LaRoche,Inc.)。PEGASYS治療慢性HBV的示例性推薦劑量方案是90mcg-270mcg，每周注射一次，總共24周。根據(jù)多種因素(包括但不限于本發(fā)明的偶聯(lián)物的分子量、活性和藥代動力學(xué)以及患者的體型和健康)，偶聯(lián)物可采用比上述更低的劑量(例如，約25,50,75,100，125，150或200mcg)和/或更低的頻率(諸如每10日一次，或每兩周一次)進行施用。在一些情況下，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物聯(lián)合一種或多種其它治療劑進行施用。例如，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可與抗病毒藥諸如拉米夫定(lamivudine)稱為3TC),其商品名為Epivir-HBV(GlaxoSmithKline)，或阿德福韋二匹伏酉旨(adefovirdipivoxil)，其商品名為Hepsera(GileadSciences)聯(lián)合施用。本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的精確施用量和頻率應(yīng)依賴于多種因素諸如多肽或偶聯(lián)物的比活性和藥代動力學(xué)特性，以及需要治療的病癥的特性(諸如，在HBV感染的情況下，感染是否是復(fù)制型或非復(fù)制型)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。一般情況下，劑量應(yīng)能預(yù)防或減輕要治療癥狀的嚴重度或擴散。所述劑量可稱"有效的"或"治療上有效的"量。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物的有效量要依賴于(尤其是)要治療的病癥，劑量，給藥方案，多肽或偶聯(lián)物或組合物是單獨或與其它治療劑聯(lián)合施用，血清半壽期和多肽，偶聯(lián)物或組合物的其它藥代動力學(xué)特性，以及患者的體型，年齡，和一般健康狀況。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知技術(shù)可確定給藥劑量和頻率?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的方法，例如通過4全測病毒載量，例如血清或血漿中的病毒DNA的水平測定治療效果。檢測HBVDNA水平的方法包括基于PCR的定量4全測，諸如COBASAMPLICORHCVTest，v2.0或COBASAMPLICORHCVMONITOR⑧Test,v2.0(均獲自RocheDiagnostics)。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是足以將病毒DNA降至，例如小于約500,000拷貝/ml血清或小于約100,000拷貝/ml血清或小于約10,000拷貝/ml血清，或至基本上不可檢測的水平(例如，小于約1000拷貝/ml血清，小于約500拷貝/ml血清，或小于約200拷貝/ml血清)的量。本發(fā)明包括降低HBV感染患者血清中HBVRNA水平的方法，其包括對患者施用本發(fā)明的組合物，與治療開始前存在的HBVDNA水平相比，所述組合物的量能有效降低HBVDNA水平?；蛘?，或另夕卜，通過檢測HBV復(fù)制的其它血清標(biāo)記物，諸如HBeAg可以測定治療效果。在一些情況下，本發(fā)明組合物的有效量是足以將血清中HBeAg的水平降4氐為開始治療前存在的水平的50%，25%,10%或5%的量。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是將HBeAg降至基本上不可檢測的水平的量。本發(fā)明包括降低感染了HBV的患者的血清HBeAg水平的方法，所述方法包括對患者施用本發(fā)明的組合物，與治療開始前的HBeAg水平相比，所述組合物的量能有效減低HBeAg水平。如上所述，指示HBV感染的其它血清標(biāo)記是HBsAg。因此，或者或另外，通過檢測血清中HBsAg的水平可以測定治療效果。在一些情況下，本發(fā)明組合物的有效量是足以將血清中HBsAg的水平降低為開始治療前存在的水平的50%，25%,10%或5%的量。在一些情況下，在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是足以將HBsAg降至實質(zhì)上不可檢測的水平的量。本發(fā)明包括降低HBV感染的患者的血清HBsAg水平的方法，所述方法包括對患者施用本發(fā)明的組合物，與治療開始前的HBsAg水平相比，所述組合物的量能有效減低HBsAg水平。通過檢測指示HBV感染伴隨癥狀例如肝損傷的參數(shù)可以可選地或另外地測定治療效果。例如，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平可采用標(biāo)準(zhǔn)測定法進行檢測。一般而言，ALT水平小于約50國際單位/ml(IU/ml)血清被認為是正常的。較高的ALT水平可作為存在肝損傷的指征。在一些情況下，在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是能在具有高于正常ALT水平的患者中將ALT水平有效降至小于約50IU/ml血清的量。因此，本發(fā)明包括降低HBV感染的患者的血清ALT水平的方法，所述患者表現(xiàn)出起始ALT水平高于50IU/ml，所述方法包括對患者施用本發(fā)明的組合物，所述組合物的量能有效地將ALT水平降至小于約50IU/ml。人r-嗜沐s遂病毒j藝在本發(fā)明的另一個方面中，提供了治療人T-嗜淋巴性病毒1型(HTLV-1)感染患者或與HTLV-1感染相關(guān)之疾病，如成人T-細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、與HTLV-1相關(guān)的脊髓病(HAM)、熱帶痙攣性下肢輕癱(TSP)、眼色素層炎或關(guān)節(jié)病的方法。所述方法包括給患者施用有效量的本發(fā)明的組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了用于治療HTLV-1感染患者或與HTLV-1感染相關(guān)之疾病的組合物，所述組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物和可藥用的載體或賦形劑。診斷為HTLV-1感染的患者包括其血液中顯示出HTLV-1原病毒DNA和/或血清中顯示出抗HTLV-1抗原的抗體的患者。包含本發(fā)明多肽的組合物的施用劑量和頻率通常與采用臨床批準(zhǔn)的干擾素-a多肽的HCV或腫瘤學(xué)治療方案中所使用的相似，所述臨床批準(zhǔn)的干擾素-oc多肽是例如R0FER0N⑧A(干擾素a-2a,重組；Hoffmann-LaRoche1Inc.)和INTRON⑧A(干擾素a-2b,重組；ScheringCorporation)。ROFERON或INTRONA治療慢性HCV的示例性推薦劑量方案是3百萬IU(大約15微克(mcg))每周三次，皮下注射，例如，24_48周。ROFERON治療多毛細胞白血病的示例性推薦劑量方案是每天3-5百萬單位，皮下注射16-24周，然后3百萬單位每周三次以維持劑量。INTRONA治療多毛細胞白血病的示例性推薦劑量方案是2百萬IU/m、體表的平方米數(shù))，皮下給藥，每周3次，共6個月。所述劑量方案提供了本發(fā)明的多肽用于治療HTLV-1感染或與HTLV-1感染相關(guān)之疾病，如成人T-細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、與HTLV-1相關(guān)的脊髓病(HAM)或熱帶痙攣性下肢輕癱(TSP)的有用劑量范圍。根據(jù)多種因素(包括但不限于本發(fā)明多肽的活性和藥代動力學(xué)以及患者的體型、年齡和健康狀況)，多肽可采用比上述更低的劑量和/或更低的頻率進行施用。同樣地，包含本發(fā)明的偶聯(lián)物的組合物的施用劑量和頻率通常與采用臨床批準(zhǔn)的干擾素-a偶聯(lián)物的HCV治療或腫瘤學(xué)治療方案中所使用的相似，所述臨床批準(zhǔn)的干擾素-a偶聯(lián)物例如為，PEGASYS⑧(Peg化干擾素a-2a;Hoffmann-LaRoche,Inc.)或PEG-INTRON(peg化干擾素a-2b;ScheringCorporation)。PEGASYS治療慢性HCV的示例性推薦劑量方案是180mcg每周一次，皮下注射，例如，24-48周。PEG-INTRON治療慢性髓性白血病的示例性推薦劑量方案是6mcg/kg體重，每周一次，皮下注射，例如，52周。所述劑量方案提供了本發(fā)明的偶聯(lián)物用于治療HTLV-1感染或與HTLV-1感染相關(guān)之疾病，如成人T-細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、與HTLV-1相關(guān)的脊髓病(HAM)或熱帶痙攣性下肢輕癱(TSP)的有用劑量范圍。根據(jù)多種因素(包括但不限于本發(fā)明偶聯(lián)物的分子量、活性和藥代動力學(xué)以及患者的體型、年齡和健康狀況)，偶聯(lián)物可采用比上述更低的劑量和/或更低的頻率進行施用。在一些情況下，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物聯(lián)合一種或多種其它治療劑進行施用。例如，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥諸如疊氮胸苷(AZT)和/或拉米夫定(lamivudine)(3TC)聯(lián)合使用。也可以與外周血干細胞移植、常規(guī)化學(xué)療法或伴隨自體或同種異體骨髓移植的高劑量化學(xué)療法聯(lián)合使用?；蛘?，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可與其它免疫療法聯(lián)合使用，例如與抗-白介素-2受體單克隆抗體或注射針對病毒抗原的細胞毒T-細胞聯(lián)合使用。本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的精確施用量和頻率應(yīng)依賴于多種因素諸如多肽或偶聯(lián)物的比活性和藥代動力學(xué)特性，以及需要治療的病癥的特性，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。一般情況下，劑量應(yīng)能預(yù)防或減輕要治療癥狀的嚴重度或擴散。所述劑量可稱"有效的"或"治療上有效的"量。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物的有效量要依賴于(尤其是)要治療的病癥，劑量，給藥方案，多肽或偶聯(lián)物或組合物是單獨或與其它治療劑聯(lián)合施用，血清半壽期和多肽，偶聯(lián)物或組合物的其它藥代動力學(xué)特性，以及患者的體型，年齡，和一般健康狀況。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知技術(shù)可確定給藥劑量和頻率。治療有效性可通過以下方法確定采用本領(lǐng)域已知的方法，例如通過使用Saito等，(2004)J.InfectDis.189(1):29-40所述的定量PCR檢測HTLV陽l病毒載量，例如檢測血液中的HTLV-1原病毒DNA水平。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是這樣的量，其足以實現(xiàn)在治療過程中，與治療前的病毒載量相比，將病毒載量降低至少0.5對數(shù)單位，如至少1對數(shù)單位，至少2對數(shù)單位，至少3對數(shù)單位，至少4對數(shù)單位，至少5對數(shù)單位，至少6對數(shù)單位或至少7對數(shù)單位。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是足以將病毒載量降至實質(zhì)上不可檢測的水平的量。本發(fā)明包括降低感染了HTLV-1的患者血液中HTLV-1原病毒DNA水平的方法，其包括對患者施用本發(fā)明的組合物，與治療開始前存在的HTLV-1原病毒DNA水平相比，所述組合物的量能有效降低HTLV-1原病毒DNA水平?；蛘撸蛄硗?，通過使用本領(lǐng)域已知的方法，例如通過可商購的試驗，如INNO-LIAHTLVI/II(Innogenetics;GentBelgium)和AbbottHTLV-I/HTLV-IIEIA(AbbottLaboratories;AbbottPark,IL)測定血清中抗-HTLV-l抗體的滴度，即可測定治療的效力。在一些情況下，本發(fā)明組合物的有效量是足以將血清中抗-HTLV-l抗體的滴度降低為開始治療前存在的滴度的50%，25%，10%或5%的量。在一些情況下，本發(fā)明組合物的有效量是足以將血清中抗-HTLV-1抗體的滴度降低為實質(zhì)上不可測的水平的量。本發(fā)明包括降低HTLV-1感染患者血清中的抗-HTLV-l抗體的滴度的方法，所述方法包括給患者施用有效量的本發(fā)明的組合物，以使血清中的抗-HTLV-l抗體的滴度與治療開始前存在的滴度相比有所降低。人乳頭狀瘤病毒在本發(fā)明的另一個方面，提供了治療人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染患者或與HPV感染相關(guān)之疾病，如手足疣以及口腔、肛門和生殖腔粘膜損害的方法。盡管很多種HPV是相對無害的，但很多其它類型的HPV通過性接觸傳播，造成生殖器或性病濕疣(被稱為尖銳濕疣)，所述濕疣可導(dǎo)致宮頸癌和其它生殖器癌。所述方法包括給HPV感染患者施用有效量的本發(fā)明的組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了用于治療HPV感染患者或與HPV感染相關(guān)之疾病的組合物，所述組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物和可藥用的載體或賦形劑。診斷為HPV感染的患者包括其活檢生殖器組織中顯示出HPV病毒DNA，有時(但不總是)顯示出可見的生殖器組織損害的患者。包含本發(fā)明多肽的組合物的施用劑量和頻率通常與采用臨床批準(zhǔn)的干擾素-a多肽的HPV治療方案中所使用的相似，所述臨床批準(zhǔn)的干擾素-a多肽是例如INTRON⑧A(千擾素ot-2b，重組；ScheringCorporation)。INTRONA治療尖銳濕疣的推薦劑量是使用結(jié)核菌素或類似的注射器和25-至30-號針頭，每周3次，每隔一天在每個損害處注射l.O百萬IU,可多達5個損害，共3周?；加?至10個濕疣的患者可按上述劑量方案接受第二(相繼的)療程，每個療程治療多達5個其它的濕疣?；加?0個以上濕疣的患者可繼續(xù)接受另一療程，這取決于多個濕疣的大小。或者，或另外，干擾素可以局部使用，例如以乳劑或軟膏的形式使用(如Stentella等.(1996)Clin.Exp.Obstet.Gynecol.23(1):29-36所述)。所述劑量方案提供了本發(fā)明的多肽用于治療HPV感染或與HPV感染相關(guān)之疾病，如尖銳濕疣的有用劑量范圍。根據(jù)多種因素(包括但不限于本發(fā)明多肽的活性和藥代動力學(xué)以及患者的體型、年齡和健康狀況)，本發(fā)明多肽可采用比上述更低的劑量和/或更低的頻率進行施用。類似地，含有本發(fā)明偶聯(lián)物的組合物一般可以例如在損害內(nèi)或局部使用，使用的劑量能有效降低受影響組織中的HPV病毒DNA的量，或減少受感染個體生殖器損害的大小和/或數(shù)目。在一些情況下，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物聯(lián)合一種或多種其它治療劑進行施用。例如，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可與抗-HPV治療劑諸如PodofUox(Condylox)和/或鬼臼素(Pododerm,Podocon-25)4關(guān)合4吏用。本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的精確施用量和頻率應(yīng)依賴于多種因素諸如多肽或偶聯(lián)物的比活性和藥代動力學(xué)特性，以及需要治療的病癥的特性，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。一般情況下，劑量應(yīng)能預(yù)防或減輕要治療癥狀的嚴重度或擴散。所述劑量可稱"有效的"或"治療上有效的"量。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物的有效量要依賴于(尤其是)要治療的病癥，劑量，給藥方案，多肽或偶聯(lián)物或組合物是單獨或與其它治療劑聯(lián)合施用，血清半壽期和多肽，偶聯(lián)物或組合物的其它藥代動力學(xué)特性，以及患者的體型，年齡，和一般健康狀況。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知技術(shù)可確定給藥劑量和頻率。通過檢測HPV病毒載量，例如檢測活檢組織中HPV病毒DNA的水平，即可測定治療的有效性。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是這樣的量，其足以實現(xiàn)在治療過程中，與治療前的病毒載量相比，將病毒載量降低至少0.5對數(shù)單位，如至少1對數(shù)單位，至少2對數(shù)單位，至少3對數(shù)單位，至少4對數(shù)單位，至少5對數(shù)單位，至少6對數(shù)單位或至少7對數(shù)單位。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是足以將病毒載量降至實質(zhì)上不可檢測的水平的量。本發(fā)明包括降低感染了HPV的患者組織中HPV病毒DNA水平的方法，其包括給患者施用本發(fā)明的組合物，與治療開始前存在的水平相比，所述組合物的量能有效降低HPV病毒DNA水平?；蛘?，或另外，通過觀察被感染個體中生殖器損害(濕疣)的大小或數(shù)目，可以測定治療的有效性。在一些情況下，本發(fā)明的組合物的有效量是足以降低被感染個體中濕疣的大小或數(shù)目的量。本發(fā)明包括降低HPV感染患者的濕疣大小或數(shù)目的方法，其包括給患者施用本發(fā)明的組合物，與治療開始前存在的濕疣的大小或數(shù)目相比，所述組合物的量能有效降低濕疣的大小或數(shù)目。制劑和給藥途徑本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的治療性制劑通常在包括一種或多種可藥用的載體或賦形劑的組合物中施用。所述組合物可采用本領(lǐng)域本身已知的方法進行制備，從而導(dǎo)致具有足夠的貯存穩(wěn)定性并適宜施用于人類或動物的多肽藥物。軀"本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可以是其鹽形式和/或在其鹽形式中。適宜的鹽包括(但不限于)堿金屬或堿土金屬，諸如鈉、鉀、鈣和鎂的鹽，以及鋅鹽。這些鹽或復(fù)合物可具有晶體和/或無定形結(jié)構(gòu)。"可藥用"是指載體或賦形劑的施用劑量和濃度不會在其所給藥患者中導(dǎo)致任何不良作用。所述可藥用的載體和賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的(參見Remington'sPharmaceuticalSciences,18thedition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPublishingCompany(1990);PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptides和Proteins,S.Frokjaer和L.Hovgaard,Eds.,Taylor&Francis(2000);和HandbookofPharmaceuticalExcipients,3rdedition,A.Kibbe,Ed.,PharmaceuticalPress(2000》.本發(fā)明的藥物組合物可單獨或與其它治療劑聯(lián)合施用。例如，利巴韋林經(jīng)常與IFN-ot共同施用，并已顯示出可以增高抗病毒治療，如HCV治療的效果。正在開發(fā)針對病毒靶(病毒蛋白酶，病毒聚合酶，病毒復(fù)制復(fù)合物的組裝)和宿主靶(病毒加工需要的宿主蛋白酶，病毒靶磷酸化需要的宿主激酶諸如NS5A和有效利用病毒IRES的宿主因子的抑制劑)的多種小分子?？晒餐┯闷渌毎蜃?，諸如IL-2，IL-12，IL-23,IL-27,或IFN-y。這些藥劑可被摻入作為相同藥物組合物的部分或可與本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物分開施用(同時或或根據(jù)其它治療方案)。此外，本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或藥物組合物可用作其它治療的佐劑。用于本發(fā)明目的的"患者"包括人和其它哺乳動物。因此所述方法適用于人類治療和獸醫(yī)應(yīng)用。邀合參類型和-繪秀it徑包含本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的藥物組合物可被制成多種形式，例如液體、凝膠、凍干或壓縮固體。優(yōu)選的形式應(yīng)根據(jù)要治療的具體病癥且對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。本發(fā)明的制劑的給藥可用多種方法實施，所述方法包括但不限于口服、經(jīng)皮下、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)腦內(nèi)、經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)腹膜內(nèi)、經(jīng)肌內(nèi)、經(jīng)肺內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、經(jīng)眼內(nèi)或其它可接受的方式。雖然彈丸推注是可接受的，所述制劑可通過輸注連續(xù)地施用，其采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)諸如泵(例如，皮下滲透泵)或植入)。在一些情況下，所述制劑可采用溶液或噴霧劑直接施用。単應(yīng)道給秀^l簡^一藥物組合物的實例是設(shè)計成非腸道給藥的溶液劑。盡管在很多情況下，藥物溶液劑可以以適用于立即使用的液體制劑形式提供，但所述非腸道制劑也可以以冷凍或凍干形式提供。在前者情況下，所述組合物在使用前必須解凍。后一劑型通常用于增強組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩(wěn)定性，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，凍干制劑通常比其液體相應(yīng)物更穩(wěn)定。所述凍干制劑在使用前通過加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如滅菌注射用水或滅菌生理鹽水溶液重新配制。在非腸道給藥的情況下，制成凍干制劑或水溶液備用，如通過將具有所需純度的多肽與一種或多種本領(lǐng)域常用的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(統(tǒng)稱為"賦形劑")適當(dāng)混合來制備，賦形劑如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子去污劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。緩沖劑有助于將pH保持在接近生理條件的范圍中。它們通常以大約2mM-50mM的濃度范圍存在。本發(fā)明使用的合適緩沖劑包括有機和無機酸及其鹽如檸檬酸鹽緩沖劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(如，富馬酸-富馬酸-鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸-鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)鹽緩沖劑(如，葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氬氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三曱胺鹽如Tris。加入防腐劑來阻滯樣i生物生長，加入的量通常約為0.2%-l%(w/v)。本發(fā)明使用的合適防腐劑包括酚、苯曱醇、間曱酚、羥苯曱酸曱酯(methylparaben)、羥苯曱酸丙酯、十八烷基二甲基苯曱基銨氯化物、苯亞曱基卣化物(如苯亞曱基氯化物、溴化物或碘化物)、氯化六曱季4妄(hexamethoniumchloride)、羥苯曱酸烷基酯(alkylparaben)如曱酯或丙酯、兒茶酚(catechol)、間苯二酚(resorcinol)、環(huán)己醇和3-戊醇。可以加入等滲劑來確保液體組合物的等滲性，等滲劑包括多羥糖醇，優(yōu)選三羥或更高級糖醇，如甘油、赤蘚醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇(xylitol)、山梨糖醇和甘露糖醇。多羥基醇的量可為0.1%-25%重量比，通常為1%-5%,以其它組分的相對量計算。穩(wěn)定劑涉及一大類賦形劑，其功能范圍從膨脹劑到溶解治療劑的或有助于防止變性或與容器壁粘合的添加劑。通常的穩(wěn)定劑可以是多羥糖醇(上文列舉的)；氨基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等，有機糖或糖醇，如乳糖、海藻糖(trehalose)、水蘇糖(stachyose)、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇，甘油等，包括環(huán)醇如環(huán)己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸(thiocticacid)、巰基乙酸鈉、硫代甘油、a-單硫代甘油和硫代A乾酸鈉；低分子量多肽(即<10個殘基)；蛋白質(zhì)如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖，甘露糖，果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖(ra伍nose),和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白質(zhì)重量計算，穩(wěn)定劑通常的存在范圍為0.1-10000重量份?？梢源嬖诜请x子表面活性劑或清潔劑(也稱作"濕潤劑")以有助于溶解治療劑以及保護治療性多肽來避免攪拌誘導(dǎo)的聚集，其也允許配方劑暴露于剪切表面應(yīng)力而沒有引起多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酸酉旨(polysorbate)(20,80等)、polyoxamer(184,188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(吐溫20、吐溫80等)。其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E)和共溶劑?；钚越M分也可以被包裹在制備的孩i囊中，例如通過coascervation技術(shù)或通過界面聚合(interfacialpolymerization)制備的，例如羥曱基纖維素、明膠或聚(曱基曱丙烯酸酯)微嚢，包裹在膠體狀藥物釋放體系(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑(microemulsion)、納米顆粒和納米膠嚢)中或包裹在大乳劑(macroemulsion)中。在Remington'sPharmaceuticalSciences(文南大同上)中公開了這些技術(shù)。在本發(fā)明的一個方面中，組合物是液體組合物，諸如含水組合物，且包含下式的石黃烷基醚環(huán)糊精(sulfoalkylethercyclodextrin)衍生物其中n是4，5或6;RPR2，R3,R4,R5，R6,R7,R8,和Rg各自獨立地是，-0-或-0-((^2-(:6烷基)-803-基團，其中至少一個&或113獨立地為-0-(c2-C6烷基)國S03-基團；而S"S2,S3,S4，S5,S6,S7，S8，和Sq各自獨立地.是可藥用的陽離子，包4舌H+。應(yīng)當(dāng)注意的是，當(dāng)n=4時，石黃烷基醚環(huán)糊精還可被稱為a-石黃烷基醚環(huán)糊精。以相似的方式，但11=5時，可使用術(shù)語P-磺烷基醚環(huán)糊精而當(dāng)n=6時，磺烷基醚環(huán)糊精還可被稱為y-磺烷基醚環(huán)糊精。在其它實施方案中，n是5或6。在優(yōu)選實施方案中，n=6。而在其它實施方案中，Rh112或R3獨立地選自-OCH2CH2CH2SOr,-001120"12012012803-或-00120^2012012012803-。最優(yōu)選地，R1;R2或R3獨立地是-OCH2CH2CH2CH2S03國。在其它實施方案中，Sl5S2，S3,S4,S5,S6，S7,Ss和Sg各自獨立地是可藥用的陽離子，其選自H+,堿金屬(例如Li+,a+,K+)，堿土金屬(例如，Ca+2,Mg+2),銨離子和胺陽離子諸如(C廣C6)烷基胺，哌啶，吡溱，(d-Q)烷醇胺或(CpC8)環(huán)烷醇胺的陽離子。最優(yōu)選地，Si,s2，S3,S4,S5，S6，S7,S8,和S9各自獨立地是可藥用的陽離子，其選自H+，Li+,Na+或K+，具體是Na+。磺烷基醚環(huán)糊精可包括1-18個磺烷基(當(dāng)n=4時)，1-21個磺烷基(當(dāng)n=5時)或1-21個(當(dāng)n=6時)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，n=5且磺烷基醚衍生物平均包含，2-20個磺烷基(尤其是磺丁基)，諸如3-10個磺烷基(尤其是磺丁基)，更優(yōu)選4-9個磺烷基(尤其是磺丁基)，更優(yōu)選5-9個磺烷基(尤其是磺丁基)，諸如6-8個磺烷基(尤其是磺丁基)，例如7個磺烷基(尤其是磺丁基)。在一些情況下，磺烷基醚環(huán)糊精衍生物是P-環(huán)糊精-黃丁基醚(即11=5)的鹽，具體是鈉鹽，其平均包含7個磺丁基。該磧烷基醚環(huán)糊精衍生物還被命名為SBE7-p-CD且可以作為Captisol⑧(Cydex，OverlandPark,Kansas)獲得。術(shù)語"d-C6烷基"表示具有l(wèi)-6個碳原子的支化的或直鏈烷基。常見的C廣C6烷基包括(但不限于)曱基乙基，n-丙基，異-丙基，n-丁基，異-丁基，仲-丁基，叔-丁基，n-戊基，異-戊基，n-己基和異-己基。術(shù)語"C2-C6烷基"表示具有2-6個碳原子的分枝或直鏈烷基。典型的C2-C6烷基包括(但不限于)乙基，n-丙基，異-丙基，n-丁基，異-丁基，仲-丁基，叔-丁基，n-戊基，異-戊基，n-己基和異-己基。關(guān)于本文所述多肽和磺烷基醚環(huán)糊精衍生物的組合物的進一步細節(jié)可見于WO03/002152,尤其是題目為"磺烷基醚環(huán)糊精衍生物"的章節(jié)，37-49頁，該文件引入此處作為參考。用于體內(nèi)施用的胃腸外制劑必須是無菌的。其可通過，例如經(jīng)過過濾膜的過濾而便易地獲得。掙錄斧放辦^持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有多肽或偶聯(lián)物的固體疏水聚合物半滲透材料、具有合適形式如膜或微囊的材料。持續(xù)釋放材料的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基甲丙烯酸酯(2-1^&(丫6{1^1-methacrylate))或聚(乙烯醇))、聚交酯(polylactide)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技術(shù)或LupronDepot⑧(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)構(gòu)成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能夠長時間釋放分子如長達或超過100天，一些水凝膠在較短時間內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。包嚢化的多肽長時間保留在體內(nèi)時，它們因暴露于37。C潮濕的環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致喪失生物活性并且其免疫原性可能改變。合理的穩(wěn)定策略可根據(jù)所涉及的機理設(shè)計。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機理是通過硫代二硫化物相互交換形成分子內(nèi)S-S鍵，那么可通過修飾巰基，從酸性溶液凍干、控制含濕量、使用適宜的添加劑和開發(fā)特異性聚合物型組合物來達到穩(wěn)定。口麼發(fā)秀對于口服用藥，藥用組合物可以是固體或液體形式，例如，以膠嚢、片劑、懸液、乳劑或溶液的形式。藥用組合物優(yōu)選制備為含有給定量活性成分的劑量單位的形式。用于人或其它哺乳動物的合適的每日劑量可根據(jù)病人的疾病以及其它因素大幅度變化，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用常規(guī)方法測定?？诜盟幍墓腆w劑型可包括膠嚢、片劑、栓劑、粉末和顆粒。在該固體劑型中，活性化合物可與至少一種惰性稀釋劑，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。該劑型也可包括，如正常實踐中的添加物質(zhì)，例如潤滑劑如硬脂酸鎂。對于膠嚢、片劑和丸劑，劑型也可包括緩沖劑。片劑和九劑還可具有腸衣。多肽或偶聯(lián)物可與諸如乳糖、蔗糖、淀粉粉末、鏈烷酸的纖維素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉和4丐鹽、阿拉伯膠、明膠、藻酸鈉、聚乙烯-他咯烷和/或聚乙烯醇的佐劑混合，并作成片劑或包成膠嚢用于常規(guī)用藥?？蛇x地，它們可溶于鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、油類(例如玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黃芪膠(tragacanthgum)和/或各種緩沖液中。其它佐劑和用藥方式是制藥領(lǐng)域熟知的。載體或稀釋劑可包括時間延遲材料(timedelaymaterial),例如單獨或與石蠟一起的甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者本領(lǐng)域熟知的其它材料。可對藥用組合物進行諸如滅菌的常規(guī)制藥操作和/或藥用組合物可含有常規(guī)佐劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、緩沖液、填充物等，例如，i口在本文別處所述。口服用藥的液體劑型可包括可藥用的乳劑、溶液、懸液、糖漿和酏劑，其含有諸如水等本領(lǐng)域常用惰性稀釋劑。該組合物也可包括佐劑，例如潤濕劑、鄰"未劑、調(diào)p未劑和香p未劑。單舉遽這適合于噴射或者超聲噴霧器的配制劑一般包含以，例如每mL溶液大約0.01到25mg偶聯(lián)物，優(yōu)選大約0.1到10mg/mL的濃度溶于水中的多肽或偶聯(lián)物。配制劑也可包括緩沖液和筒單糖類(例如，用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定化和滲透壓調(diào)節(jié))，和/或濃度范圍從0.1到10mg/ml的人血清白蛋白。可使用的緩沖液的例子是乙酸鈉，檸檬酸鹽和甘氨酸。優(yōu)選的是，緩沖液具有適合于將溶液調(diào)到pH為3至9范圍的組成成分和體積摩爾濃度。一般來說，從1mM到50mM的緩沖液摩爾濃度適合于該目的?？墒褂玫奶穷惖睦邮侨樘?，麥芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，和木糖，通常的含量范圍是配制劑重量的1%到10%。噴霧配制劑也可含有表面活性劑以降低或防止在形成氣溶膠時由溶液的霧化引起的表面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集?？墒褂酶鞣N常規(guī)表面活性劑，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。其含量范圍一般為配制劑重量的0.001%和4%之間。用于本發(fā)明目的的特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧化乙烯山梨聚糖單油酸酯(polyoxyethylenesorbitanmonooleate)。具體配制劑和產(chǎn)生合適分散的本發(fā)明的液體顆粒的方法在WO94/20069，US5,915,378，US5,960,792,US5,957,124，US5,934,272,US5,915,378，US5,855,564，US5,826,570和US5,522,385中描述,在此引用以供參考。用于帶有劑量刻度的吸入器裝置的配制劑一般包含磨碎的(finelydivided)4分末。該4分末可通過凍干并然后磨制液體偶聯(lián)物配制劑來生產(chǎn)且也可含有穩(wěn)定劑，例如人血清白蛋白(HSA)。一般來說，加入超過0.5%(w/w)的HAS。另外，如果需要可向該制劑中加入一種或多種糖或糖醇。其例子包括乳糖，麥芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木糖。加入配制劑中的該偶聯(lián)物的量的范圍從大約0.01到200%(w/w),優(yōu)選從大約1到50%。然后凍干該配制劑并磨制成所需的顆粒大小。然后將合適大小的顆粒借助于表面活性劑懸浮于推進劑中。推進劑可以是用于該目的的任何常規(guī)材料，例如含氯氟烴，氫氯氟碳，氬氟碳，或碳氫化合物，包括三氯氟曱烷、二氯二氟曱烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷或其組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。然后將該混合物裝入遞送裝置中。適用于本發(fā)明的商業(yè)上可獲得的計量型吸入器(meteredinhaler)例子是由GlaxoInc.,ResearchTrianglePark,NC,USA生產(chǎn)的Ventolin計量型吸入器。用于粉末吸入器的配制劑包含含有偶聯(lián)物的磨碎的干粉且也可包括膨脹劑，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇，其含量可幫助粉末從裝置中散布，例如，占配制劑重量的50%到90%。粉末的顆粒在肺中應(yīng)具有相當(dāng)于一種顆粒的空氣動力學(xué)特性，所述顆粒密度大約1g/cm2、中值直徑小于10微米，優(yōu)選在0.5和5微米之間，最優(yōu)選在1.5和3.5微米之間。根據(jù)本文的教導(dǎo)適用的粉末吸入器的例子是由FisonsCorp.,Bedford,MA，USA生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器。以US5,997,848,US5,993,783,US5,985,248,US5,976,574，US5,922,354，US5,785,049和US5,654,0077>開的方法可產(chǎn)生和/或遞送這些裝置中的粉末。設(shè)計用于治療產(chǎn)品的肺部遞送的機械裝置包括但不限于噴霧器，計量型吸入器，和粉末吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。適用于本發(fā)明實踐的商業(yè)上可獲得的裝置的具體例子是由Mallinckrodt,Inc.,StLouis，MO,USA生產(chǎn)的Ultravent噴霧器；由MarquestMedicalProducts,Englewood，CO.,USA生產(chǎn)的AcornII噴霧器；由GlaxoInc.,ResearchTrianglePark,NC,USA生產(chǎn)的Ventolin計量型吸入器；由FisonsCorp.,Bedford,MA,USA生產(chǎn)的Spinhaler粉末吸入器；InhaleTherapeuticSystems,Inc.,SanCarlos,CA,USA的"靜置云(standingcloud)"裝置；Alkermes,Cambridge,MA，USA生產(chǎn)的AIR吸入器；和AradigmCorporation,Hayward,CA,USA生產(chǎn)的AERx肺部藥物遞送系統(tǒng)。試劑盒本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的多肽、偶聯(lián)物、多核苷酸、表達載體、細胞、方法、組合物，系統(tǒng)和裝置的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒任選包括至少一種以下本發(fā)明的內(nèi)容(l)本文所述的裝置，系統(tǒng)，系統(tǒng)組件或裝置組件；(2)包括本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物或多核苷酸的至少一種試劑盒組分；編碼本發(fā)明多肽的質(zhì)粒表達載體；表達本發(fā)明多肽的細胞；或包含至少一種任何所述組分的組合物；(3)實施本文所述任何方法(包括治療性或預(yù)防性方法)的說明，使用(2)中確定的任何組分或所述組分的任何組合的說明，和/或操作本文所述任何裝置、系統(tǒng)或組分的說明；(4)放置保持所述至少一種所述組分或組合的容器；和(5)包裝材料。另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的任何裝置，組件，組合物或試劑實施例以下實施例用以舉例說明本發(fā)明，而并非以任何形式限制本發(fā)明的精神和范圍。材料和方法I.確定表面可及的殘基^"凝近^必^(^^」用計算機程序Access(B.Lee和F.M.Richards,J.Mol.Biol.55:379-400(1W1))版本2(1983YaleUniversity)計算該結(jié)構(gòu)中各原子的可接近表面區(qū)(ASA)。該方法一般使用1.4A大小的探針且可將可接近表面區(qū)(ASA)定義為由探針中心形成的區(qū)域。在該計算前，從坐標(biāo)系中去除所有水分子，氫原子和與該蛋白質(zhì)不直接相關(guān)的其它原子。離的為、炎栩通過用側(cè)鏈中該原子的ASA總和除以代表延伸ALA-x-ALA三肽中該殘基類型的側(cè)鏈原子ASA值來計算側(cè)鏈原子的分數(shù)ASA。參見Hubbard,Campbell&Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在該實施例中，將CA原子視為甘氨酸殘基側(cè)鏈的一部分但不視為其余殘基的一部分。下表用作側(cè)鏈的標(biāo)準(zhǔn)100%ASA(表6):Ala69.23A2Leu140.76A2Arg200.35A2Lys162.50A2Asn106.25A2Met156.08A2Asp102.06A2Phe163.90A2Cys96.69A2Pro119.65A2Gin140.58A2Ser78.16A2Glu134.61A2Thr101.67A2Gly32.28A2Trp210.89A2His147.00A2Tyr176.61A2lie137.91A2Val114.14A2在該結(jié)構(gòu)中未檢測到的殘基定義為100%暴露，因為其被認為位于彈性區(qū)域。在分析NMR結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的情況下，使用總體平均ASA值。^不Tl存三^潛溝#衷面^虞/4'差的都定當(dāng)無不可獲得三維結(jié)構(gòu)或如果該結(jié)構(gòu)描述不詳細而不足以確定表面可接近性時(例如如果僅已知CA原子的位置)，表面可接近性可從如下構(gòu)建的序列比對中推斷出A:如果結(jié)構(gòu)已知^旦描述不詳細而不足以確定表面可4妻近性時采用可從MolecularSimulations,Inc.獲得的MODELER程序，將詳細度較低的結(jié)構(gòu)與該序列家族的已知結(jié)構(gòu)進行基于結(jié)構(gòu)的序列比對。B:如果結(jié)構(gòu)未知將序列與預(yù)先確定的序列比對進行比對，包括該序列家族的已知結(jié)構(gòu)的序列，其可釆用程序ClustalW的"圖譜/結(jié)構(gòu)對比"選項制備(Thompson,(1994)NucleicResearch22:4673-4680)。通過A或B所得的序列比對中，序列中位于與至少一個具有已知結(jié)構(gòu)的其它序列中暴露的殘基等效的位置上的待分析殘基被確定為暴露的。暴露程度為其它序列中等效殘基的最大值。在待分析的序列為插入的情況下(即其它序列中無等效殘基)，該殘基被確定為完全暴露，因為其最可能位于轉(zhuǎn)角/環(huán)區(qū)。在存在詳細度低的結(jié)構(gòu)的情況下，該結(jié)構(gòu)中未檢測到的那些殘基被確定為完全暴露，因為其被認為位于柔性區(qū)域。解定^子河的距,.-4吏用分子圖形庫欠件，例如獲自MolecularSimulations,Inc的Insightll98.0測定原子間的距離。II.蛋白質(zhì)的表達和純化A.從CHO細胞的表達和純化一些本發(fā)明的多肽在中國倉鼠卵巢(CHO)Kl細胞(ATCC:CCL-61)中制備，所述細胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并用G418選擇以建立克隆的細胞系。1.CHO表達構(gòu)建體編碼本發(fā)明多肽的核酸-故克隆至CHO表達載體中，處于SV40啟動子的控制之下，且與編碼N-末端前導(dǎo)序列的序列以及任選一個或兩個C-末端標(biāo)記序列置于同一讀框內(nèi)。前導(dǎo)序列可以是普通的前導(dǎo)序列，IFNa6前導(dǎo)序列或經(jīng)修飾的IFNa6前導(dǎo)序列，C-末端標(biāo)記包括E-標(biāo)記(AmershamBiosciences)和/或His-標(biāo)記。在XL1-Blue細胞中產(chǎn)生質(zhì)粒。2.選擇表達IFN-ot多肽的穩(wěn)定亞克隆膽培養(yǎng)基含有G418,FBS和青霉素，鏈霉素和谷氨酰胺[PSG]的DMEM-F12(PSG;Gibco/Invitrogen);lxPBS(Gibco/Invitrogen);胰蛋白酶/EDTA抗E-Tag抗體-HRP偶4關(guān)物(AmershamBiosciences)ECLPlus\Vestem印跡斗企觀'H式劑(AmershamBiosciences)#凝在用G418選擇的條件下，在含有FBS和青霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中生成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。將細胞分裝至含有50ml選擇培養(yǎng)基的T175瓶中，然后在C02溫箱中，于37。C保溫24小時或直至細胞達到80%鋪滿。通過PBS洗滌，然后加入2.5ml胰蛋白酶/EDTA和于37。C保溫3-5分鐘，收獲細胞。通過使用BeckmanModel臺式離心機以1000g離心30分鐘來收集并回收細胞。細胞在PBS中洗滌一次，然后在含有1%FBS的3mlPBS中重懸浮。測定細胞密度然后用PBS/FBS調(diào)至lxl(^細胞/ml。對于各IFN-a基的2-5個96孔板中。將培養(yǎng)板在37。C溫箱中保溫10-14日以便使經(jīng)分選的細胞生長。首先通過點印跡分析選擇高水平表達每種IFN-a多肽的兩個亞克隆，隨后采用抗-E標(biāo)記抗體-HRP偶4關(guān)物和化學(xué)發(fā)光4全測，通過Western印跡分析來驗證所述亞克隆。3.蛋白質(zhì)表達/沐DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco/Invitrogen)UltraCHO培養(yǎng)基(BioWhittaker)CHOIIIA培養(yǎng)基(Gibco/Invitrogen)Ex-Cyte生長增強i咅養(yǎng)基補充劑(SerologicalsProteins)ITSA(胰島素、運4失蛋白、用于貼壁培養(yǎng)的竭補充劑；Gibco/Invitrogen)青霉素/鏈霉素(P/S)FBS,PBS,胰蛋白酶第l日將來自一個T-175瓶的細胞轉(zhuǎn)移至一個搖瓶(1700cm2),所述搖瓶中有300ml含10%FBS和lxP/S的DMEM-F12,然后在37°CC02溫箱中生長。第3日將培養(yǎng)基換為300ml新鮮DMEM-F12-FBS-P/S。第5日將培養(yǎng)基換為300ml含有1/1000Ex-Cyte和P/S的UltraCHO。第7日用300mlCHOIIIA+P/S生產(chǎn)培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在第8,9和10日收集上清。使用BeckmanCoulterAllegra6R臺式離心機，以2000g離心上清20分鐘，然后用0.2|iiPESbottletop無菌濾器過濾，保存于4。C以備純化。4.蛋白質(zhì)純化一些本發(fā)明的多肽被表達為包含位于C末端的13個氨基酸E-tag序列的融合蛋白。所述多肽用E-tag親和層析柱進行純化，方法如下。:重組噬菌體抗體系統(tǒng)純化組件(AmershamBiosciences,Cat.No.l7-1362-01)。純化試劑盒包含直徑16mmx高25mm(5ml柱床體積)的抗E-Tag柱和相關(guān)緩沖液。#嚴'釆用2800xg離心20分鐘并聯(lián)用0.2|_iPESbottletop濾器組件過濾澄清從搖瓶中的CHO-HK1細胞收集的上清。將上清以150cm/h(5ml/分鐘)加載于用RPAS結(jié)合緩沖液平衡過的E-標(biāo)記柱上。用5CV(柱體積)的結(jié)合緩沖液洗柱，然后用RPAS洗脫緩沖液以75cm/h(2.5ml/分鐘)洗脫蛋白質(zhì)。洗脫級分用0.05體積的lMTris-CLpH8.0中和，透析入PBS,濃縮至0.1-1.5mg/ml并將等分試樣冷凍保存于-80。C。在含有0.5%BSA的PBS中將用于測定的樣品配制成50|ag/ml,然后將等分試樣冷凍保存于-8(TC。通過SDS-PAGE,然后通過采用獲自INVITROGEN的材料、試劑和4喿作步驟進行考馬斯染色，從而對樣品進行常規(guī)分析。通過BCA測定，釆用IFN-ot標(biāo)準(zhǔn)(其濃度已通過氨基酸分析進行證實)常規(guī)測定蛋白質(zhì)濃度。B.從大腸桿菌中的表達和純化一些本發(fā)明的多肽作為包涵體在大腸桿菌中制備，其按下述進行純化和重折疊。la.大腸桿菌表達構(gòu)建體在一些情況下，對編碼本發(fā)明多肽的核酸進行修飾以使在大腸桿菌中的表達得以改善。所述修飾包括各用大腸桿菌偏好的Arg-Arg密碼子對，如CGTCGC取代稀有的Arg-Arg密碼子對AGGAGG(位于核苷酸位置34-39)和AGGAGA(位于核香酸位置64-69)(所述位置編號是相對于SEQIDNO:59而言的)，或用大腸桿菌偏好的Arg密碼子CGC或CGT取代編碼序列中的大多數(shù)或所有罕見的Arg密碼子AGA和AGG。還在編碼序列的5'末端添加曱硫氨酸密碼子(ATG)。按照此方式修飾的編碼序列的實例包括SEQIDNO:60-61,63-64,66-67，69-70，72-73,75-76,78-79,81-82，84-85和87-88。將編碼序列插入含有卡那霉素選4奪標(biāo)記的pET-42表達載體(Novagen)，置于T7啟動子的控制之下，或插入含有卡那霉素選4奪標(biāo)記的pQE80-Kan表達載體(Qiagen),置于T5啟動子的控制之下lb.蛋白質(zhì)表達采用標(biāo)準(zhǔn)方法將包含干擾素編碼序列的pET-42載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌抹，如BL21(DE3)中，然后鋪于包含50iig/ml卡那霉素的瓊脂平板上，然后于37。C保溫。18-24小時后，選取三個單獨的菌落，將其轉(zhuǎn)入包含含有50嗎/ml卡那霉素的5ml2xYT的試管中，于37。C保溫過夜。用過夜培養(yǎng)物接種2組包含含有50嗎/ml卡那霉素的100ml2xYT的燒瓶中。于OD鋼監(jiān)測培養(yǎng)物在37。C的生長。當(dāng)OD咖為0.5-0.8時，用1mMIPTG在37。C誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物3小時。采用SDS-PAGE通過在SDS樣品緩沖液中裂解沉淀的細胞來分析IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的表達。通過加入25。/。甘油并于-80。C以lml等分試樣冷凍細胞，將相應(yīng)的未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物組制備成冷凍貯存物。將含有干擾素編碼序列的pQE80-Kan載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌抹W3110或W3110-fhuA。纟安上述方法i正實表達。通過用25ml過夜培養(yǎng)物接種4xlL2xYT培養(yǎng)基+卡那霉素來進行較大規(guī)模的搖瓶表達。以O(shè)D60()監(jiān)測培養(yǎng)物，達到0.5-0.8OD單位時用lmMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物。誘導(dǎo)3小時后，以5000g離心以收集細胞，并于-80。C冷凍儲存。通過2-3次穿過French壓榨機或10,000psi的APV1000勻漿器來破碎細胞，按"IB的分離"和隨后的章節(jié)所述進行處理。以10L的規(guī)模在B.Braun生物反應(yīng)器中進行補料分批發(fā)酵，培養(yǎng)基為添加有孩i量元素溶液和40mg/L卡那霉素的TerrificBroth(TB)培養(yǎng)基。通過將400ml過夜培養(yǎng)物接種至生物反應(yīng)器內(nèi)的TB培養(yǎng)基中以開始發(fā)酵。在最初的生長期，通過改變攪拌速率將溶解氧(DO)維持在50%。當(dāng)培養(yǎng)物的OD6。。達到5.0時，開始以0.5ml/分鐘補加甘油/氨基酸料，將攪拌速率設(shè)置為1000rpm。調(diào)整補料速率以將剩余發(fā)酵過程的DO維持在40。/。。當(dāng)OD600達到25時，通過加入終濃度為1mM的IPTG來誘導(dǎo)培養(yǎng)物。誘導(dǎo)3小時后，通過用Beckman離心機以lOOOOxg離心收集細胞，將細胞膏狀物儲存于-60。C。收集細胞時的OD6QQ—般為35-40左右。2&.大腸桿菌表達構(gòu)建體(用于高水平表達)以下實施例顯示出兩例本發(fā)明多肽的表達，所述多肽的編碼序列被克隆至能在大腸桿菌中高水平表達真核基因的大腸桿菌表達系統(tǒng)(如EP0972838所述)。根據(jù)密碼子-使用和mRNA二級結(jié)構(gòu)(Griswoldetal.，ProteinExprPurif.2003Jan;27(l):134-42)，使用序列分析程序GCG(GeneticComputerGroup,Inc.,WisconsinUSA,Version7.1，March1992)，用功能"backtranslate"/"EcoHigh-database，，防止出現(xiàn)稀有的密碼子，用功能MFold/Plotfold(-menu=f或-meni^g)預(yù)測和預(yù)防可能對基因表達不利的二級結(jié)構(gòu)，從而最優(yōu)化對應(yīng)于14epil8(SEQIDNO:13)和25epil9(SEQIDNO:38)的氨基酸序列(它們的N-末端都另外含有Met)的編碼序列。按照此方式最優(yōu)化的編碼序列分別為SEQIDNO:89和SEQIDNO:90。將最優(yōu)化的DNA序列克隆至具有另外的/"c/基因的OripBR-URA3。將,皮稱為OripBR-URA3-lacI_14epil8-mut2(圖6)和OripBR-URA3-lac1—"epil9-mut(圖"的所得載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌UT5600(ApyrF)細胞(如EP0972838所述)。在未加尿嘧啶的基本M9-培養(yǎng)基瓊脂平板上選才奪轉(zhuǎn)化細胞。M9-瓊脂平板無菌的瓊脂糖貯液(終濃度為15g/l)430mlM9-鹽;容液50mllMMgS040.5ml1MCaCl20.05ml20%葡萄糖5ml維生素Bl(c=lmg/ml)2.5ml10%酪蛋白氨基酸25mlL-色氨酸(c二5mg/ml)5mlL-亮氨酸(c二5mg/ml)5mlL-脯氨酸(c二5mg/ml)2.5ml2b.蛋白質(zhì)表達將根據(jù)上文2a,的轉(zhuǎn)化細胞接種至搖瓶中，并于37。C培養(yǎng)。通過加入lmMIPTG，在OD578=l時進行誘導(dǎo)。7小時后收集細胞，在SDS-PAGE凝膠上分析細胞沉淀物。所用培養(yǎng)基如下120g19g"g5.5g5.5g85g91.5g8.0g17.17.mlml酪蛋白氨基酸NH4C1色氨酸亮氨酸脯氨酸甘油溶解于4300mlH20和K2HP04*3H20檸檬酸溶解于600mlH20和維生素Bl(5mg/ml)MgS04x7H20(lM)PH=7.0用水調(diào)整至5000ml3.包涵體(IB)的分離、溶解、石黃化和重折疊為了分離IB，在lxPBS中以10mlPBS/克細胞濕重重懸浮融化的細胞膏狀物，混合，直至獲得均一的懸浮液。在微型流化器中，以17,000-19，000psi、使細胞通過儀器2次而使細胞破碎。將細胞裂解物調(diào)整至1%TritonX-100,混合10分鐘，于2-8°C以1O，OOOg離心60分鐘以回收IB。通過在含有1%TritonX-100的PBS中重懸浮將IB沉淀物洗滌一次，按上述離心回收IB,于-80°C冷凍4諸存。3a.溶解/重折疊方法1:為了溶解IB，以每克細胞膏狀物10ml緩沖液的量將IB沉淀物重懸浮于脲緩沖液(50mMTris-Cl,200mMNaCl，8Murea,2mMDTT，1mMEDTA,pH8.0)。將懸浮液混合30分鐘，于2-8。C以lO,OOOg離心30分鐘。通過用不含DTT的脲緩沖液重懸浮將沉淀物洗滌一次，按上述進行離心，用水洗滌兩次。以每克沉淀物10ml緩沖液的量用胍緩沖液(50mMTris-Cl,200mMNaCl,8M胍-HCl,1mMEDTA,pH8.0)溶解經(jīng)洗滌的沉淀物，混合30-60分鐘，于2-8。C以10,000g離心30分鐘。將含有溶解的IFN的上清液調(diào)整至10mg/ml亞硫酸鈉和5mg/ml連四硫酸鈉中以啟動石黃化過程，所述石黃化過程在2-8。C進行16小時?；腔?，用水將IFN溶液稀釋2倍。于2-8。C以10,000g離心以回收IFN沉淀物。用水將沉淀物洗滌兩次，將沉淀物重懸浮于上述的胍緩沖液中。通過280nm下的光吸收值測定石黃化IFN的蛋白質(zhì)濃度。于2-8。C,用重折疊緩沖液(50mMTris-Cl,20mMNaCl,2mM還原的谷胱甘肽，lmM氧化的谷胱甘肽)將溶于胍緩沖液中的磺化IFN稀釋至終濃度為100mg/ml,從而啟動重折疊過程。于2-8。C，緩慢混合以進行重折疊達6-8小時，接著加入CuS04至終濃度為2!iM,然后再進行重折疊達16-20小時。通過SDS-PAGE和反相HPLC監(jiān)測重折疊反應(yīng)的進程。3b.溶解/重折疊方法2:為了溶解14epil8,以每克IB膏狀物4ml緩沖液的量將IB沉淀物重懸浮于胍緩沖液(7M胍，20mMNa2HP04,10mMDTE，pH8.0)。將懸浮液混合2小時，溶解后，于室溫下，使用10kDa截留膜，對著至少8倍體積的含有7M胍緩沖液和20mMNaH2P04pH5.0的緩沖液進行滲濾。為了進行重折疊，將溶解的蛋白質(zhì)稀釋至含有20mMNa2HP04,0.8M精氨酸和2nMCuS04,pH7.5的折疊緩沖液中。于2-8。C,以最終的蛋白質(zhì)濃度約為0.5mg/ml蛋白質(zhì)，緩慢混合以進行重折疊達72小時。通過反相HPLC監(jiān)測重折疊反應(yīng)的進程。3c.溶解/重折疊方法3:為了溶解25epil9,將IB漿狀物重懸浮于溶解纟爰沖液(8M鹽酸胍，100mMDTT,50mMTrispH8.3)。室溫下將懸浮液混合30分鐘。隨后用HC1將pH調(diào)整至4.5。使用5K膜進一步濃縮溶解液，并對著10倍體積的已用HC1調(diào)整至pH4.5的7.2M鹽酸胍進4亍:參濾。為了進行重折疊，將溶解的蛋白質(zhì)稀釋至折疊緩沖液(0.8M精氨酸，50mM磷酸鉀，2mMGSH,1mMGSSGpH7.8)。于2-8。C,以最終的蛋白質(zhì)濃度約為lmg/ml蛋白質(zhì)進行重折疊過夜。4.純化4a.純4匕方法1:使用三個層析步驟純化重折疊的IFN。將重折疊溶液調(diào)整至80%(重量/體積)飽和濃度的硫酸銨中，通過0.2iiM濾器進行過濾，以200cm/h加載于20ml用Equil緩沖液(50mMTris-Cl,0.8M硫酸銨，pH8.0)平衡過的ButylSepharoseFastFlow疏水作用層析(HIC)柱(AmershamBiosciences)。先用8倍柱體積(CV)的Equil緩沖液，再用8CV的洗滌緩沖液(50mMTris-Cl,0.5M硫酸銨，pH8.0)洗滌HIC柱。用含或不含15%飽和濃度硫酸銨的50mMTris-Cl,pH8.0洗脫IFN。^f吏用0.5M醋酸鈉，pH4.5貯液將HIC收集液調(diào)整至50mM醋酸鈉并稀釋2倍。以90cm/h將調(diào)整過的收集液加載于5ml用50mM醋酸鈉，100mMNaCl,pH5.0平4軒過的HiTrapCMSepharoseFastFlow^f主(AmershamBiosciences)。加載后，在平衡條件下用5CV緩沖液洗滌柱，使用20CV梯度為100-650mM的NaCl洗脫IFN。根據(jù)280nm下的光吸收值收集含有IFN的峰級分。使用2M1,3二氨基丙烷，pH~10貯液將CMSepharose收集液調(diào)整至20mM1,3二氨基丙烷。以200cm/h將樣品加載于5ml用50mM1,3二氨基丙烷，100mMNaCl,pH10.0平衡過的HiTrapQSepharoseFastFlow柱(AmershamBiosciences),加載后，在平衡條件下用5CV緩沖液洗滌柱，使用20CV梯度為100-650mM的NaCl或100-1000mM的NaCl洗脫IFN。根據(jù)280nm下的光吸收值收集含有IFN的級分，立即對著250-500體積50mM醋酸鈉，150mMNaCl,pH5.0或50mM硼酸鈉，pH9.0進行透析。透析后，在有生物研究安全性的櫥拒中，使用0.2laM濾器無菌過濾IFN樣品，根據(jù)280nm下的光吸收值測定濃度，將樣品儲存于2-8。C長達1周，或分成等分試樣儲存于-80。C以延長儲存期。為了測定活性，一般將樣品在0.5%BSA,PBSpH7.4中配制成5，20和50ug/ml，分成等分試樣在-80。C冷凍貯存。4b.純化方法2:使用兩個層析步驟純化重折疊的14epil8。用KC1將重折疊溶液調(diào)整至pH8.0和約190mS/cm，通過5(am濾器進行過濾，以75cm/h加載于用由2.0MKCl，20mMK2HP04,0.8M精氨酸，pH8.0組成的平ff緩沖液平Hf過的Butyl-SepharoseFastFlow疏水作用層析(HIC)柱(GeneralElectricHealthcare)。用5倍柱體積(CV)的2.0MKCl,20mMK2HP04,0.8M精氨酸，pH8.0洗滌HIC柱。用0.4MKCl，20mMK2HPO4,pH8.0洗脫14epil8。通過反相HPLC監(jiān)測洗脫液。用蒸餾水稀釋洗脫液，使傳導(dǎo)率約為3mS/cm。將pH調(diào)整至6.8。以50cm/h將調(diào)整過的收集液加載于用25mM醋酸銨，pH6.8平衡過的Q-SepharoseFastFlow柱(GEHealthcare)。力口載后，用平tf緩沖液洗滌柱。用直至pH4.0的線性梯度洗脫14epil8。根據(jù)反相HPLC分析收集含有折疊的14epil8的峰》及分。4c.純化方法3:使用兩個層析步驟純化重折疊的25epil9。將重折疊溶液調(diào)整至1.3MNaCl,通過兩個濾器的組合(先是0.8/0.3pm,接著是0.45/0.2inm)過濾溶液。以50-150cm/h將蛋白質(zhì)加載于用平衡緩沖液(0.8M精氨酸，1.3M氯化鈉，50mM磷酸鉀，pH8.0)平tf過的ButylSepharoseFastFlow柱(GeneralElectricHealthcare)。將樣品上樣后，用3CV平tf緩沖液和3CV洗滌緩沖液(20mM磷酸鉀，2M氯化鈉，pH7.5)洗滌柱。通過以50-100cm/h的流速使用洗脫緩沖液(20mM磷酸鉀，pH7.5)以進行洗脫步驟。根據(jù)UV280測定結(jié)果收集峰。在確定傳導(dǎo)率低于10mS/cm后，以50-75cm/h,將收集液加載于用30mM醋酸銨，pH5.9平衡過的Q-SepharoseFastFlow柱(GEHealthcare)。加載后，用平衡緩沖液洗滌柱，直至到達基線值(UV280)。用直至pH3.5的線性梯度洗脫25epil9。根據(jù)反相HPLC分析和SDS-PAGE收集含有折疊的25epil9的峰級分。III.活性測定Al.HuH7-EMCV抗病毒測定以下提供了本發(fā)明的干擾素-a多肽和偶聯(lián)物的抗病毒活性的示例性測定法。該測定法是基于細胞的劑量-反應(yīng)測定法，用于評估藥物的抗病毒效力，其有時被稱為"保護免受細胞病變效應(yīng)"(或PCPE)測定法，也被稱為抑制細胞病變效應(yīng)(CPE)測定法。筒言之，用藥物與細胞一起保溫，然后暴露于病毒。在不存在藥物時，暴露于病毒的細胞死亡。隨著藥物濃度的增加，存活細胞的比率增加。可直接(例如，通過肉眼計凄t)或間接地通過估計代謝率檢測存活細胞的數(shù)量。例如，代謝染料諸如MTT或WST-1可被用作細胞存活的間接檢測。存活細胞代謝所述染料而生成代謝產(chǎn)物，該產(chǎn)物可通過分光光度法(光密度)進行定量。材沖+和試劑HuH7細胞人肝瘤細胞系(得自MichaelLai醫(yī)生，USC-外科，LosAngeles,CA)。該纟田月包系也可4尋自JapaneseCollectionofResearchBioresources(JCRB)/HealthScienceResearchResourcesBank(HSRRB)，Osaka,Japan的細胞庫。HuH7細胞系最初是在J.Sato醫(yī)生(Okayama大學(xué)醫(yī)學(xué)院)的實驗室中從患有良好分化的肝細胞癌的57歲日本男性中建立的(Nakabayashi，H"etal.(1982)CancerRes.42(9):3858-63)。該細胞系的乙型肝炎表面抗原為陰性。VERO細胞非洲綠猴腎細胞系(ATCC#CCL-81)。1962年，日本千葉的千葉大學(xué)由正常成年非洲綠猴的腎中獲得了此細胞系。1964年，#93代VERO細胞系被轉(zhuǎn)移至國立衛(wèi)生研究院(NIH)。腦心肌炎病毒(EMCV):組織培養(yǎng)適應(yīng)林(ATCC#VR-129B)。腦心肌炎病毒(EMCV)的組織培養(yǎng)適應(yīng)抹購自ATCC(#VR-129B)。為了進行HuH7抗病毒測定法，在VERO非洲綠猴腎細胞中產(chǎn)生高滴度病毒原液。通過在度為l.lxl08PFU/ml。完全DMEM:Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM,Gibco貨號11965-092)100/o胎牛血清(FBS,Hyclone貨號SH30071.03)lx青霉素-《連霉素(PS，Gibco貨號15140-122)減少血清的DMEM:Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM,Gibco貨號11965-092)2。/o胎牛血清(FBS，Hyclone貨號SH30071.03)lx青霉素-鏈霉素(PS,Gibco貨號15140-122)胰蛋白酶/EDTA(Gibco貨號25300-054)WST-1(Roche;貨號1644807)將HuH7細胞在5%C02溫箱中，于37。C保持在完全DMEM中。用胰蛋白酶收集細胞并每周兩次在鋪滿時于T175瓶中分成終密度l-2xl(^個細胞每25ml。測定的前一天，用胰蛋白酶處理細胞然后以4.5xl(^個細胞每25ml的密度接種于新T175瓶中以便確保在測定前所述細胞處于對數(shù)期。HuH7-EMCV抗病毒測定法的步驟在VERO細胞中擴增高滴度的EMCV病毒原液。通過HuH7單層細胞的EMCV病毒殺傷曲線測定95%的細胞被殺死的致死濃度(LC9s)。簡言之，在第一日將HuH7細胞以6xl04細胞/孔鋪于96孔微量滴定板。在DMEM+2%FBS中以10個稀釋點按1:3連續(xù)稀釋所述病毒，然后在第二日將其加至細胞。感染后24小時，通過四哇鹽代謝測定法WST-1(Roche)來測定細胞存活。HuH7-EMCV測定法所測定的LC95對應(yīng)于0.034的MOI(PFU/細胞)。通過L929細胞的標(biāo)準(zhǔn)噬斑試驗測定病毒原液的滴度。在測定的第一日，用胰蛋白酶收集對數(shù)期HuH7細胞，在減少了血清的DMEM中重懸浮然后通過離心濃縮。細月包沉淀物(對應(yīng)于5個Tl75并瓦的細胞)在10ml減少了血清的DMEM中重懸浮，經(jīng)40微米尼龍細胞濾器(Nyloncellstrainer)過濾然后用血細胞儀(hemocytometer)計數(shù)。通過臺盼藍染色排除法測定細胞生存力。細胞在減少了血清的DMEM中重懸浮至終密度為6xl05細胞/ml。將lOOjal稀釋的細胞加入96孔測定板的各孔中(6x104細胞/孔)，然后將測定4反在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫4小時。采用劑量反應(yīng)分析測定"參照"干擾素a和本發(fā)明的干擾素-a多肽(也稱為"受試樣品")的效力。每板中通常存在一種受試樣品和一種參照IFN-a,各具有IFN-a處理的/EMCV攻擊的細胞的三條重復(fù)型曲線和單獨用IFN-a處理的細胞的兩條重復(fù)型曲線。測定后者作為IFN-a對HuH7細胞的潛在抗增殖效應(yīng)的對照。參照IFN-a的劑量反應(yīng)曲線通常由100ng/ml-0.05ng/ml的8個三倍稀釋度組成。對于IFN-a實驗樣品，所述三倍稀釋度通常為5ng/ml-0.002ng/ml。各自包含用病毒處理且無IFN-a處理的細胞以及僅包含細胞的八個孔也作為對照。采用減少了血清的DMEM制備IFN-a稀釋液。將100|al稀釋的IFN-a制品轉(zhuǎn)移至測定板中。然后將測定板在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫12小時。在第二日，用EMC病毒攻擊細胞。從測定板的各孔中吸出培養(yǎng)液。在DMEM+2%FBS中以1:5400稀釋EMCV原液。將100|al稀釋的病毒(相當(dāng)于0.034病毒顆粒/最初接種的細胞)力。入各孔中。然后將細胞在潮濕的5%C02溫箱中于37。C與病毒一同保溫24小時。在第三日，通過WST-1對各孔中存活細胞的數(shù)量進行定量。從測定板的各孔中吸出培養(yǎng)液。在減少了血清的DMEM中以1:20稀釋W(xué)ST-1試劑，將100稀釋的WST-1試劑加入各孔中然后將細胞在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫60分鐘。通過在讀板器上4企測450nm的OD來對各孔中存活細胞的數(shù)量進行定量。分析采用以下公式計算IFN-a參照物和受試樣品的抗病毒效力抗病毒效力=(存活細胞C+I+V-存活細胞c+v)/(存活細胞C+I-存活細胞c+v)*100%其中C+V=HuH7細胞+EMCV,C+I=HuH7細胞+IFN-ot,而C+I+V=HuH7細胞+IFN-a+EMCV采用GraphPadPrism4(GraphPadSoftwareInc.)通過非線性回歸分析劑量反應(yīng)曲線。將以下公式用于曲線擬合Y=B。tt。m+(T叩-日。她)1+10(LogEC50-X).HillSlope其中Bottom是位于底部平臺(bottomplateau)的Y值；Top是位于頂部平臺(topplateau)的Y值，LogEC50是當(dāng)反應(yīng)在Bottom和Top中間的X值。3,Levenberg-Marquardt法用fH尤^匕算法。A2.HeLa-EMCV和WISH-EMCV抗病毒測定抑制EMCV對HeLa(人宮頸癌衍生的細胞系)和WISH(人羊膜組織衍生的細胞系)細胞的細胞病變效應(yīng)還提供了有用的替代測定法，可用于評價本發(fā)明的干擾素-a多肽和偶聯(lián)物的抗病毒效力。按照類似于上述HuH7-EMCV測定法的方式進行這些測定法，方法的改動之處如下。材料和試劑HeLa細胞人宮頸癌細胞系(ATCC#CCL-2)。HeLa細胞系衍生自35歲女性的宮頸腺癌。據(jù)報道HeLa細胞含有人乳頭狀瘤病毒(HPV-18)序列。第107代細胞系被ATCC接收。WISH細胞人上皮細胞系(ATCC#CCL-25)。WISH細胞系是由培養(yǎng)35天后原代人羊膜細胞傳代培養(yǎng)物中出現(xiàn)的有所改變的集落建立的。WISH細胞系含有HeLa標(biāo)記染色體。#170代細胞被ATCC接收。L-929細胞鼠成纖維細胞系(ATCC#CCL-l)。L-929細胞系是1948年分離自親本抹L抹第95代的單細胞克隆。L抹分離自正常的100天齡雄性C[3]H/An小鼠的皮下蜂窩和脂肪組織。EMCV:組織培養(yǎng)適應(yīng)抹(ATCC#VR-129B)。腦心肌炎病毒(EMCV)的組織培養(yǎng)適應(yīng)抹購自ATCC(#VR-129B)。為了進行HeLa和WISH抗病毒測定法，在L929細胞中產(chǎn)生高滴度EMCV原液。根據(jù)在L929細胞上進行的噬斑試-瞼的結(jié)果，由L929產(chǎn)生的病毒原液的病毒滴度為4.0xl08PFU/ml。完全MEM:極限必需培養(yǎng)基(MEM,Gibco貨號10370-021)100/o胎牛血清(FBS,Hyclone貨號SH30071.03)lx青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(PSG,Gibco貨號10378-016)lmM丙酮酸鈉(Gibco貨號#11360-070)減少血清的MEM:才及限必需i告養(yǎng)基(MEM，Gibco貨號10370-021)2。/o胎牛血清(FBS,Hyclone貨號SH30071.03)lx青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(PSG,Gibco貨號10378-016)lmM丙酮酸鈉(Gibco貨號#11360-070)將HeLa細胞在潮濕的5%C02溫箱中，于37°C保持在完全MEM中。用胰蛋白酶收集細胞并每周兩次在鋪滿時于T175瓶中分成終密度2-4xl06個細胞每25ml。測定的前一天，用胰蛋白酶處理細胞然后以6xl(^個細胞每25ml的密度接種于新T175瓶中以便確保在測定前所述細胞處于對數(shù)期。將WISH細胞在潮濕的5%C02溫箱中，于37。C保持在完全MEM中。用胰蛋白酶收集細胞并每周兩次在鋪滿時于T175瓶中分成終密度5-6xl06個細胞每25ml。測定的前一天，用胰蛋白酶處理細胞然后以10xl(^個細胞每25ml的密度接種于新T175瓶中以便確保在測定前所述細胞處于對數(shù)期。HeLa-EMCV抗病毒試驗的方法在測定的第一日，用胰蛋白酶收集對數(shù)期HeLa細胞，在減少了血清的MEM中重懸浮然后通過離心濃縮。細月包沉淀物(對應(yīng)于5個T175并瓦的細月包)在10ml減少了血清的MEM中重懸浮，經(jīng)40微米尼龍細胞濾器(Nyloncellstrainer)過濾然后用Coulter計凄t器計凄t。通過用血細月包4義(hemocytometer)進行臺盼藍染色排除法測定細胞生存力。細胞在減少了血清的MEM中重懸浮至終密度為lxl()S細胞/ml。將100|^1稀釋的細胞加入96孔測定板的各孔中(lxl(^細胞/孔)，然后將測定板在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫24小時。釆用劑量反應(yīng)分析測定"參照"干擾素oc和本發(fā)明的干擾素-(x多肽(也稱為"受試樣品")的效力。每板中通常存在一種受試樣品和一種參照IFN-a,各具有IFN-a處理的/EMCV攻擊的細胞的三條重復(fù)型曲線和單獨用IFN-a處理的細胞的兩條重復(fù)型曲線。測定后者作為IFN-a對HeLa細胞的潛在抗增殖效應(yīng)的對照。參照IFN-a的劑量反應(yīng)曲線通常由60ng/ml-0.0008ng/ml的8個五倍稀釋度組成。對于IFN-a實驗樣品，所述五倍稀釋度通常為5ng/ml-0.00006ng/ml。各自包含用病毒處理且無IFN-cx處理的細胞以及僅包含細胞的八個孔也作為對照。采用減少了血清的MEM制備IFN-a稀釋液。將100jliI稀釋的IFN-a制品轉(zhuǎn)移至測定板中。然后將測定板在潮濕的5°/。C02溫箱中于37。C保溫12小時。在第三日，用EMC病毒攻擊細胞。從測定板的各孔中吸出培養(yǎng)液。在MEM+2%FBS中以1:133稀釋EMCV原液。將100(il稀釋的病毒(相當(dāng)于3xl()S個病毒顆粒)加入各孔中。然后將細胞在潮濕的5%C02溫箱中于37。C與病毒一同保溫24小時。在第四日，通過WST-1對各孔中存活細胞的數(shù)量進行定量。從測定板的各孔中吸出培養(yǎng)液。在減少了血清的MEM中以1:20稀釋W(xué)ST-1試劑，將100pl稀釋的WST-1試劑加入各孔中然后將細胞在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫60分鐘。通過在讀板器上檢測450nm的OD來對各孔中存活細胞的數(shù)量進行定量。WISH-EMCV抗病毒試馬會的方法在測定的第一日，用胰蛋白酶收集對數(shù)期WISH細胞，在減少了血清的MEM中重懸浮然后通過離心濃縮。細胞沉淀物(對應(yīng)于5個T175瓶的細胞)在10ml減少了血清的MEM中重懸浮，經(jīng)40微米尼龍細胞濾器(Nyloncellstrainer)過濾然后用Coulter計凄t器計凄t。通過用血細月包4義(hemocytometer)進行臺盼藍染色排除法測定細胞生存力。細胞在減少了血清的MEM中重懸浮至終密度為3xl05細胞/ml。將lOOpl稀釋的細胞加入96孔測定板的各孔中(3xl04細胞/孔)，然后將測定板在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫4小時。采用劑量反應(yīng)分析測定"參照"干擾素a和本發(fā)明的干擾素-ot多肽(也稱為"受試樣品")的效力。每板中通常存在一種受試樣品和一種參照IFN-oc,各具有IFN-a處理的/EMCV攻擊的細胞的三條重復(fù)型曲線和單獨用IFN-a處理的細胞的兩條重復(fù)型曲線。測定后者作為IFN-a對HeLa細胞的潛在抗增殖效應(yīng)的對照。參照IFN-a的劑量反應(yīng)曲線通常由100ng/ml-0.0001ng/ml的8個十倍稀釋度組成。對于IFN-ot實驗樣品，所述五倍稀釋度通常為5ng/ml-0.00006ng/ml。各自包含用病毒處理且無IFN-a處理的細胞以及僅包含細胞的八個孔也作為對照。采用減少了血清的MEM制備IFN-a稀釋液。將100|ul稀釋的IFN-a制品轉(zhuǎn)移至測定板中。然后將測定板在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫16小時。在第二日，用EMC病毒攻擊細胞。從測定板的各孔中吸出培養(yǎng)液。在MEM+2%FBS中以1:267稀釋EMCV原液。將100(il稀釋的病毒(相當(dāng)于MOI約為5)加入各孔中。然后將細胞在潮濕的5%C02溫箱中于37。C與病毒一同保溫24小時。在第三日，通過WST-1對各孔中存活細胞的數(shù)量進行定量。從測定板的各孔中吸出培養(yǎng)液。在減少了血清的MEM中以1:20稀釋W(xué)ST-1試劑，將100(il稀釋的WST-1試劑加入各孔中然后將細胞在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫60分鐘。通過在讀板器上檢測450nm的OD來對各孔中存活細胞的數(shù)量進行定量。B.TH1分化測定法以下提供了本發(fā)明的干擾素-a多肽和偶聯(lián)物的TH1分化活性的示例性測定法。測定步驟在測定起始日(測定日的前一天)，在斯坦福血庫(StanfordBloodBank)收集從500ml血中制備的包含粒細胞和紅細胞的人血沉棕黃層(Humanbuffycoat)(25-30ml)，于室溫保存過夜。將各血沉棕黃層小心地轉(zhuǎn)移至T75瓶中，然后用PBS稀釋至100ml。對于各血沉棕黃層，將13mlHistopaque/Ficoll(SigmaH8889)移液至四個50ml的離心管中，然后在Histopaque/Ficoll頂部小心地覆蓋25ml稀釋的血液樣品而不破壞其界面。然后將所述管離心(20。C，2500rpm)20分鐘。采用3ml塑料移液管，將含PBMC的單核細胞層轉(zhuǎn)移至兩個50ml錐形管(將來自2個Histopaque/Ficoll/血沉棕黃層管的細胞置于一個管中)。然后用PBS將PBMC稀釋至50ml/管，然后離心(20°C,1000rpm)10分鐘以便去除血小板。去除PBS后，混合PBMC和剩余的RBC以防止聚集。加入10mlRBC裂解緩沖液(氯化銨緩沖液)，然后將兩個管的細胞合并至一個管。將各管(現(xiàn)在包含來自從一個供體分離的總PBMC和RBC)在室溫保溫10分鐘。通過用細胞過濾器(70um，F(xiàn)alcon貨號2350)過濾細胞去除可能的血細胞凝塊。加入PBS至總體積為50ml,然后離心(20。C,1000rpm)10分鐘。最后采用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞數(shù)目。然后，對各個PBMC制品的一部分進行預(yù)染并通過FACS分析以選才奪初始TH0細胞百分比大于15%的PBMC制品。用20(ilFITC偶聯(lián)的抗人CD45RA(Pharmigen，貨號555488),20|ulCy-鉻偶聯(lián)的抗人CD4(Pharmigen,貨號555348),5iulPE-偶聯(lián)的抗人CD8(Pharmigen,貨號555367)，5piPE-偶聯(lián)的抗人CD14(Pharmigen,貨號555398),和5|ilPE-偶聯(lián)的抗人CD20(Pharmigen,貨號555623)染色300(^1PBMC,然后在冰上保溫45分鐘。用PBS洗滌細胞，在1mlPBS中重懸浮，然后用40(am細胞過濾器(Falcon，貨號2340)過濾。通過FACS定量初始TH0細胞(CD4和CD45RA陽性而CD8,CD14,CD20陰性)的百分數(shù)，然后選擇含有超過15%初始TH0細胞的PBMC進行測定。選擇的PBMC制品用500|ilFITC偶聯(lián)的抗人CD45RA,500piCy-鉻偶聯(lián)的抗人CD4,200|ilPE-偶聯(lián)的抗人CD8,50^ilPE-偶聯(lián)的抗人CD14,和50)alPE-偶聯(lián)的抗人CD20進行染色，然后在冰上保溫60分鐘。用PBS洗滌細月包，加入PI,用10mlPBS稀釋細月包，然后用40)im細月包過濾器過濾。通過FACS分選該細胞，將lxl()4初始TH0細胞(CD4和CD45RA陽性而CD8、CD14、CD20陰性)通過MOFLO轉(zhuǎn)移至96孔圓底板的各孔中，所述孔中包含160DMEM加青霉素-鏈霉素加2mM谷氨酰胺和10%胎牛血清(Hyclone貨號SH30071.03)。在每孔中加入1.7^1DynabeadsCD3/CD28T細胞膨脹劑(Dynal，貨號111.32)。在受試前校準(zhǔn)Dynabeads的刺激效應(yīng)以避免批與批之間的差異。然后，在測定板中加入20lil/孔的蛋白質(zhì)樣品。通常，IL-4和IL-12標(biāo)準(zhǔn)物(獲自R&DSystems)的濃度范圍是0.04pg/ml-10ng/ml,而IFN-a受試樣品和IFN-a參照樣品的濃度范圍是0.76pg/ml-200ng/ml。在潮濕的5。/。C02溫箱中于37。C保溫所述細胞6日。從各孔收集上清，通過采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA(R&DSystems,Cat.#DIF50)定量IFN-y的含量來測定TH1分化程度。分析反應(yīng)二IFN-y濃度，pg/ml。將以下公式用于曲線擬合Yb(Top-Bottom)=0。m+1+1Q[LogEC50—X).HillSlope變量Bottom是位于底部平臺的Y值；Top是位于頂部平臺的Y值，LogEC50是當(dāng)反應(yīng)在Bottom和Top中間時的X值。將Levenberg-Marquardt法用作優(yōu)化算法。C.Daudi抗增殖測定法以下提供了本發(fā)明的干擾素-oc多肽和偶聯(lián)物抗增殖活性的示例性測定法。材料Daudi細胞人伯杰特淋巴瘤細胞(ATCC號#CCL-213)。1967年，Daudi細胞系衍生自患有伯杰特淋巴瘤的16歲黑人男性。該細胞系為Epstein-Barr病毒陽性。完全RPMI:RPMI1640(RPMI,Gibco貨號11875-143)100/。胎牛血清(FBS,Hyclone貨號SH30071.03)lx青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(PSG,Gibco貨號10378-016)于37。C在潮濕的5%C02溫箱中，將混懸液中生長的Daudi伯杰特淋巴瘤細胞保持在T175組織培養(yǎng)瓶中(包含50ml完全RPMI)。當(dāng)鋪滿時，將細胞以1:10分離。測定步驟將Daudi細胞旋轉(zhuǎn)沉降并用lxPBS洗滌。將細胞數(shù)量調(diào)整為105細胞/ml。在96孔圓底測定板的每個孔中加入80|il培養(yǎng)基，然后將100)il細胞轉(zhuǎn)移至各孔(104細胞/孔)。利用培養(yǎng)基在稀釋板中制備11個稀釋度的IFN-a參照物和IFN-a受試樣品(200ng/ml-0.2pg/ml(4倍稀釋度)。然后將20|al稀釋的IFN-oc制品轉(zhuǎn)移至測定4反。在潮濕的5%C02溫箱中于37°C保溫細胞。48小時后，在每孔中加入l|uCi曱基-3H胸苷(AmershamPharmacia,貨號TRK758),然后在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫24小時。次日收集細胞，然后測定胸普的摻入。或者，根據(jù)經(jīng)干擾素處理后，培養(yǎng)物孔中存在的ATP量測定存活的有代謝活性的Daudi細胞的數(shù)目，以進行Daudi抗增殖測定法。在此方法中，將8000個Daudi細胞鋪于96孔圓底測定板的每個孔中(體積為50pl)。然后在5%C02溫箱中于37。C保溫細胞2小時，再加入干擾素稀釋液。一般從5-10ng/ml開始將干擾素稀釋6倍(9-點)。加入干擾素之后，在潮濕的5%C02溫箱中于37。C保溫細胞72小時。然后通過加入100(ilCellTiter-Glo(Promega,Cat#G7572)測定每孑L中存活纟田胞的數(shù)目。將細胞與CellTiter-GloTM試劑混合2分鐘，室溫下于暗處保溫30-60分鐘。使用AnalystHT儀器測定每孔中的發(fā)光信號的量。分析采用以下公式計算IFN-a參考物和樣品的EC50:(Top—Bottom)Y=Bottom+-^~^-^-1+ltJ[IJ3gEC50-X).HniSlope其中Bottom是位于底部平臺的Y值；Top是位于頂部平臺的Y值，LogEC50是當(dāng)反應(yīng)在Bottom和Top中間的X值。將Levenberg-Marquardt法用作優(yōu)化算法。實施例l:測定干擾素-a的表面可及殘基人干說#-a2a嫂差的襲根據(jù)Klaus等，J.Mol.Biol.,274:661-675(1997)報道的人干擾素-a2a的24NMR結(jié)構(gòu)，計算側(cè)鏈的分數(shù)ASA。以下使用的序列編號基于人干擾素-a2a蛋白質(zhì)的成熟序歹'J(在本文中被鑒定為SEQIDNO:47)。應(yīng)當(dāng)注意該結(jié)構(gòu)包含兩個分別包含Cysl-Cys98和Cys29-Cys138的二硫橋。通過計算ASA和分數(shù)ASA并取24個結(jié)構(gòu)的平均值，對于(focusingon)側(cè)鏈的ASA,以下殘基被測定為具有大于25%分數(shù)ASA:D2,L3,P4,Q5,T6,H7,S8，L9,G10，R12,R13，M16,A19,Q20,R22，K23,124,S25,L26,F27,S28,L30，K31，R33,H34,D35，G37，Q40,E41,E42,G44,N45，Q46,Q48,K49,A50,E51,E58,Q61，Q62，N65,S68，T69，K70,D71,S73,A74,D77,E78，T79，L80,D82,K83,T86,Y89,Q90，N93，D94，E96，A97,V99,1100,QlOl,G102,V103,G104,T106,E107,T108,P109,LllO,Mill,K112,E113,D114,L117,R120,K121,Q124,R125,T127,L128,K131,E132，K133,K134,Y135,S136,P137,C138,A145，M148,R149,S152,L153,N156,Q158,E159,S160,L161,R162,S163,K164和El65，所述位置相對于在本文中被鑒定為SEQIDNO:47的干擾素-a2a序列編號。T6，H7,S8,L9,R12，R13,M16，A19,S25,F27,S28，K31,R33,H34,D35,G37,E41,G44，N45,Q46,Q48，K49,N65，K70,A74,D77,E78，T79,D82,K83,T86,Y89,Q90,N93,D94，1100，QlOl,G102,G104,T106,E107,T108,P109,LllO，E113,D114，L117，R120,K121，Q124，R125,L128，K131,E132,K134,P137,R149,E159,L161,R162,S163,K164和E165,所述位置相對于在本文中被鑒定為SEQIDNO:47的干擾素-oc2a序列編號。與iVa/的/4'差的4由于在很多干擾素a序歹'J(包括所有已知人干擾素a序歹'J(除IFN-a2亞型外)和本發(fā)明的具體多肽)中，一個氨基酸在人干擾素-a2亞型(例如，干擾素-a2b(SEQIDNO:46)和干擾素-a2a(SEQIDNO:47))第44位后的插入，所述表面暴露的殘基的位置編號相對于hIFNa2b(SEQIDNO:46)所示序列的編號將在例如比對圖2中所示序列中的第44位以后產(chǎn)生一個殘基的位移。才艮據(jù)上述分析，以下位置(相對于SEQIDNO:l編號)被認為包含這樣的氨基酸殘基，其具有大于25%分數(shù)ASA:位置2，3,4，5,6,7，8,9，10,12,13，16,19,20,22,23,24,25,26,27,28,30,31，33，34，35，37，40,41,42,44,46,4749，50,51，52,59,62,63,66，69,70,71，72，74,75,78,79,80，81,83，84，87，9091,94,95，97，98，100，101，102，103，104，105，107,108,109，110,111,112,113，114，115，118，121,122,125，126,128，129,132,133,134,135，136,137，138,139,146,149,150,153,154,157，159,160，161,162，163,164,165,和166。同樣地，以下位置(同樣相對于SEQIDNO:l編號)被認為包含這樣的氨基酸殘基，所述殘基的側(cè)鏈具有平均大于50%分數(shù)ASA:2,3,4,5,6,7,8,9,12,13,16,19,25,27,28,31,33，34,35,37，41,44,46，47，49,50，66,71,75,7879，80,83，84，87，90，91，94，95，101,102，103，105，107，108,109,110,111,114，115，118,121,122,125，126,129,132,133,135,138,150,160,162，163，164，165和166。實施例2干擾素-a多肽的抗病毒活性慢性HCV感染患者的起始病毒載量為104-107拷貝的HCVRNA/ml。通過用IFN-a治療，病毒載量特征性地歷經(jīng)兩個不同的對數(shù)線性衰減期，這反映了兩種不同的機制(圖1B)。病毒載量在大約第一個兩日中出現(xiàn)首次下降，其被認為是由于感染的肝細胞對干擾素-a治療作出反應(yīng)而導(dǎo)致的病毒生成速率降低。HCV造成的主要技術(shù)挑戰(zhàn)是該病毒不能在體外生長，僅僅最近能在馴順的動物模型中進行培養(yǎng)。然而，一些能在體外復(fù)制的病毒被認為可用作HCV病毒復(fù)制的替代品。認為可預(yù)測體內(nèi)HCV抗病毒活性的體外替代測定法包括上文"材料和方法"一節(jié)中所述的測定法，其通過在人細胞系HuH7(來源于肝癌)、HeLa(來源于宮頸癌)和WISH(來源于羊膜組織)中使用腦心肌炎病毒(EMCV)來檢測受試分子保護細胞使其免受病毒感染的致細胞病變效應(yīng)(CPE)的能力。下表7提供了多種IFN-a多肽在按照上文"材料和方法"一節(jié)所述進行的代表性CPE測定法中的相對抗病毒活性。通過TwoWayANOVA(因素樣品，實驗)(a=0.05)，接著通過Bonferroni，spost-hoctest進行平均值比較(a二0.05)或進行Fisher'spost-hoctest,從而測定活性的顯著差異。符號(+/-)表示在統(tǒng)計學(xué)上與參照干擾素不可區(qū)分的抗病毒活性；ND表示未測定。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table>實施例3干擾素-a多肽的TH1活性設(shè)計THl測定法以監(jiān)測通過在培養(yǎng)物上清液中檢測到的IFN-Y的量測定的IFN-a對初始T細胞分化成TH1細胞的增強作用。表8提供了按上文"材料和方法"章節(jié)中所述測定的多種IFN-a多肽的相對THl活性。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table>實施例4干擾素-a多肽的抗增殖活性IFN-a可抑制多種細胞類型的增殖，雖然該抗增殖作用通常在高于抗病毒反應(yīng)所需的劑量下發(fā)生。Daudi細胞是人來源的EVB所轉(zhuǎn)化的B細胞系，其對IFN-a敏感。該IFN-a反應(yīng)性細胞系可用作本發(fā)明的IFN-oc的抗增殖作用的探針。此外，高劑量的IFN-a對巨核細胞和嗜中性細胞的抗增殖活性被認為可分別促使血小板減少(thrombocytopenia)、和中性粒細月包減少殖作用的替代測定法。下表9提供了按照上文"材料和方法"一節(jié)所述測定的多種IFN-a多肽的相對抗增殖活性，其^皮表示為相對于huIFN-a2a的抗增殖活性倍lt(EC50huIFN-oc2a/EC5。樣品)。在所用檢測條件下，可檢測到至少約為參照干擾素的0.014咅的抗增殖活性。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table>實施例5:干擾素-a多肽的PEG化下文提供了制備本發(fā)明的偶聯(lián)物的示例性步驟。包含游離半胱氨酸的本發(fā)明多肽可以按下述被半胱氨酸-PEG化。首先于4°C,在50mMMES，100mMNaCl,pH6.0中，用等摩爾濃度的TCEP(三羧乙基膦)對該多肽進行部分還原30分鐘。然后于4。C,在相同條件下使被還原的多肽與過量四倍摩爾量的mPEG-MAL試劑(具有PEG部分諸如20kDa或30kDa線性mPEG,或40kDa支化mPEG2)反應(yīng)1小時。將PEG化反應(yīng)混合物加樣至用50mMMES,pH6.0,lOOmMNaCl平tf過的SP-SepharoseHP柱。在10CV(柱體積)洗滌步驟后，用0-600mMNaCl的梯度來對PEG化和未PEG化的級分進行分級。收集級分然后通過SDS-PAGE分析等分試樣。集中包含單PEG化種類(monoPEGylatedspecies)的級分，對其配制以便進行上述干擾素-oc活性測定。7V^端i^G化采用mPEG-丁醛(具有PEG部分諸如20kDa或30kDa線性mPEG,或40kDa支化mPEG2)的N末端PEG化可在以下條件下進行4°C,用過量5倍摩爾量的PEG試劑多肽，在50mMMES,pH5.5,100mMNaCl和20mM氰基硼氬化鈉，或在50mM醋酸鈉，pH5.5，100mMNaCl和20mM氰基硼氳化鈉中實施反應(yīng)4-8小時。采用50mMMES,pH5.5中的100-600mMNaCl梯度，通過利用在50mMMESpH5.5，100mMNaCl中平衡過的SP-SepharoseHP進行層析來分離偶耳關(guān)物。集中包含單PEG化種類的級分，進行配制以便實施上述干擾素-a活性測定，并通過例如使用分析性HPLC、氨基酸分析和/或MALDI-TOF質(zhì)語分析法進一步鑒定所述級分。麼^凝P五G必通常釆用實質(zhì)上如Foser，(2003)ProteinExpression&Purification30:78-87所述的方法可進行賴氨酸-PEG化。簡言之，于4°C,將多肽與40kDamPEG-NHS試劑以mPEG-NHS:多肽的摩爾比約為3:1至5:1在50mM硼酸鹽緩沖液，pH9.0中反應(yīng)約1小時至過夜。通過陽離子交換層析分離偶聯(lián)物。集中包含單PEG化種類的級分，進行配制以便進行上述干擾素-a活性測定。根據(jù)上述方法制備的單PEG化IFN-a偶聯(lián)物在HeLa-EMCV測定法中表現(xiàn)出抗病毒活性，但所述活性低于親代未經(jīng)PEG化的多肽的活性。在一些情況下，使用PolysulfoethylA柱(2.1mmlDx200mmL,5m，1000A。,得自PolyLC)進行陽離子交換HPLC,以進一步分析按上述方法獲得的單PEG化收集物，從而鑒定出PEG-異構(gòu)體分布圖。移動相是緩沖液A:5mMKH2P04,40%l-丙醇，1%二甘醇，pH3.0和緩沖液B:與含200mMNaCl的緩沖液A相同。于20°C，在80分鐘內(nèi)使用以0.1ml/分鐘的速度流動的50%-75%移動相B梯度分離PEG位置異構(gòu)體，在214nm處進行檢測。圖8顯示了經(jīng)由陽離子交換HPLC分離單PEG化收集物，所述收集物是根據(jù)上述方法由干擾素-a多肽B9xl4EC4與40kDamPEG2-NHS反應(yīng)獲得的。收集峰并在SDS-PAGE上進行分析(圖9)。圖9的泳道2和9顯示出上樣至HPLC柱之前的樣品主要包含單PEG化蛋白質(zhì)。峰l-4(圖9的泳道3-6)對應(yīng)于單PEG化收集物中少部分的雙PEG化IFN。弱峰5(圖9的泳道7)含有大致相同比例的雙PEG化、單PEG化和較小分子量的種類。峰6-11(圖9的泳道10-15)對應(yīng)于單PEG化IFN多肽的位置異構(gòu)體。按下述使多肽14epil8(SEQIDNO:13)賴氨酸-PEG化。將Q-S印harose層析步驟的洗脫液(根據(jù)上文"材料和方法"一節(jié)所述獲得)濃縮至c<2mg/ml。為了進行PEG化，將緩沖液換成50mM硼酸鈉，pH9.0。基本上如Foser等(2003;ProteinExpression&Purification30:78-87)所述，以PEG試劑與蛋白質(zhì)的摩爾比為4:1或5:1,使多肽與40kDamPEG2-NHS反應(yīng)。于4。C將PEG化反應(yīng)進行1.5小時。通過陽離子交換層析從反應(yīng)混合物中純化單PEG化14epil8。使用鹽濃度逐步增加至1M的NaCl，分三步進行洗脫以分離寡PEG化、單PEG化和未-PEG化的種類。將單PEG化14epi18峰配制成濃度為0.33mg/ml以供進一步分析。所得單PEG化14epil8組合物產(chǎn)生一群主要在Lysl22和Lysl35單PEG化的位置異構(gòu)體。按下述使多肽25epil9(SEQIDNO:38)賴氨酸-PEG化。將Q-Sepharose層析步驟的洗脫液(根據(jù)上文"材料和方法"一節(jié)所述獲得)濃縮至c<2mg/ml。為了進行PEG化，將緩沖液換成50mM硼酸鈉，pH9.0。基本上如Foser等(2003;ProteinExpression&Purification30:78-87)所述，以PEG試劑與蛋白質(zhì)的摩爾比為4:1，使多肽與40kDamPEG2-NHS反應(yīng)。于4°C將PEG化反應(yīng)過夜進行。通過陽離子交換層析從反應(yīng)混合物中純化單PEG化25epil9。使用鹽濃度逐步增加至750mM的NaCl,分三步進行洗脫以分離寡PEG化、單PEG化和未-PEG化的種類。將單PEG化25epi19峰在洗脫緩沖液中濃縮至<2mg/ml,并進行配制以供進一步分析。所得單PEG化25epil9組合物產(chǎn)生一群主要在Lys31,Lysl22和Lysl35單PEG化的位置異構(gòu)體。在HeLa-EMCV抗病毒測定法中，按上述制備的單PEG化14epil8和單PEG化25epil9都表現(xiàn)出比單PEG化IFN-a2a高10倍以上的抗病毒活性。實施例6:差示掃描量熱術(shù)進行差示掃描量熱術(shù)(DSC)實驗以估計本發(fā)明的一些多肽的穩(wěn)定性。將濃度為100至325嗎/ml的蛋白質(zhì)樣品中的緩沖液換成磷酸緩沖鹽水(PBS),使用MicroCalVP-DSC(MicroCal,Northampton,MA)進行DSC。由熱容(Cp)對溫度的作圖估計解鏈溫度(TJ。估計出的L為B9X14EC4(SEQIDNO:l)58.4°C;14epil6(SEQIDNO:ll)64.2。C和14epil8(SEQIDNO:13)59.5。C。用第48位隱蔽的苯丙氨酸殘基(SEQIDNO:l)取代亮氨酸(SEQIDNO:ll)或丙氨酸(SEQIDNO:13)似乎對多肽的穩(wěn)定性沒有不利的影響。實施例7:體內(nèi)測定按文獻中記載的多種方法檢測生物學(xué)或血清半壽期。例如，可采用ELISA法測定生物學(xué)半壽期來檢測在例如皮下或肌內(nèi)施用后干擾素-a的血清水平。使用ELISA法4全測皮下施用的干擾素-a的藥代動力學(xué)在例如Rostaing等，(1998),J.Am.Soc.Nephrol.9(12):2344-48中描述。Merimsky等，(1991)，CancerChemother.Pharmacol.27(5):406-8描述了測定肌內(nèi)施用的干擾素-oc的血清水平。例如，可根據(jù)下述方法，在獼猴(7W^caca/os"'c^/anX)中研究本發(fā)明偶聯(lián)物的藥代動力學(xué)(PK)和藥物動力學(xué)(PD)分布圖。研究中使用了平均體重為5-6kg的3至4歲雌性動物。在到達后和開始治療前這段時間，動物至少需用6周時間來適應(yīng)新環(huán)境，最少需要3周來適應(yīng)研究地的居住條件。動物被單獨圈養(yǎng)在不銹鋼網(wǎng)籠中(至少540x810x760mm),食用膨脹的完全商業(yè)化的靈長類動物飼料(100g/動物/天)，經(jīng)分析，所述飼料不含化學(xué)藥品和細菌污染物。另外，動物每天都攝取水果(蘋果或香蕉)。在所有需要麻醉的步驟之前，給動物禁食。在開始研究之前的3天和開始研究的當(dāng)天施用化合物之前，從所有動物體內(nèi)采集血液樣品。在研究過程中，從未經(jīng)麻醉、用手固定的動物的股血管或頭/隱血管抽取血液樣品(lml全血)。在釆血過程中，維持正常的飼喂方案。將血樣采集至不加抗凝劑的管內(nèi)，接著，于4。C,以3000rpm(約1760g)離心10分鐘。然后將血清樣品分成兩個等分試樣(各約為200W)，儲存于-20。C。開始研究之前，在20mM醋酸鈉(pH6.0)和140mM氯化鈉中配制本發(fā)明的偶聯(lián)物。研究開始時，先用酒精水溶液局部消毒，再使用皮下導(dǎo)入的無菌注射器和針頭，以30mcg偶聯(lián)物/kg動物體重(4只動物)或300mcg/kg(4只動物)的量給每只動物施用一次偶聯(lián)物。在施用偶聯(lián)物之后的下述時間點采集血樣4小時，8小時，12小時，24小時，48小時，72小時，144小時，240小時，336小時，456小時，552小時，600小時，624小時，648小時，672小時，696小時，720小時和744小時。每天觀察動物以檢測任何臨床病征或?qū)χ委煹姆磻?yīng)。每天憑肉眼觀察評價注射位點以評價局部耐受性。開始治療前和研究結(jié)束時進行詳細的臨床檢查。完成研究之后，使用ELISA測定法測定分離的血清樣品中的偶聯(lián)物濃度。然后，基于特定時間點化合物的血清濃度測定偶聯(lián)物在獼猴體內(nèi)的半壽期。分別使用商購的RIA(EikenChemicalCo.,Tokyo)和商購的ELISA(IBLImmunoBiologicalLaboratories,Hamburg.),測定每個血清樣品中的2',5，-寡腺苷酸合成酶和新蝶呤水平，從而評價獼猴對本發(fā)明偶聯(lián)物治療的藥物動力學(xué)反應(yīng)。根據(jù)在血清樣品中測定的這兩個干擾素活性生物標(biāo)記物的濃度，測定曲線下的面積(AUC),以定量取這兩個劑量中的每個劑量的每種化合物的體內(nèi)活性。ELISA法測定，所述ELISA法檢測分子相對于參照分子或制劑(一般是已知的干擾素-a蛋白質(zhì))的免疫反應(yīng)性。該ELISA法基于來自用參照蛋白質(zhì)治療的患者的抗體。當(dāng)本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物在該測定中的反應(yīng)在統(tǒng)計學(xué)上顯著低于參照分子或制劑的所述反應(yīng)時，前者免疫原性被認為是降低的。盡管為了闡明和理解的目的，已較詳細描述了上述發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀此公開內(nèi)容可以清楚地知道對形式和細節(jié)的多種改變并不背離本發(fā)明真正的范圍。應(yīng)當(dāng)理解的是本文所述的實施例和實施方案僅作為例舉說明的目的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解其中的多種修飾和改變，而且其被包含在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。例如，可以以多種組合方式使用上文所述的所有技術(shù)、方法、組合物、裝置和系統(tǒng)。為了所有的目的，本申請中提及的所有出版物，專利，專利申請或其它文件都全文列入本文作為參考，就象每個單獨的出版物，專利，專利申請或其它文件為了所有目的被單獨地提到需列入本文作為參考一樣。權(quán)利要求1.分離的或重組的多肽，其包含的序列(a)與SEQIDNO1在1-16個氨基酸位置中不同和(b)相對于SEQIDNO1，含有一個或多個選自F48A/L；V51P；F55A；F65A；F68P；L111A和V114P的取代；所述多肽表現(xiàn)出抗病毒活性。2.權(quán)利要求1的多肽，其包含與SEQIDNO:l在l-10個氨基酸位置中不同的序列。3.權(quán)利要求1的多肽，其包含與SEQIDNO:l在l-8個氨基酸位置中不同的序列。4.權(quán)利要求1的多肽，其還包含一個或多個選自H47Q;V51A;Q52P/E;A53T;F55S;L56V;F57L;Y58H;M61I;N113K;V114E和E160D的取代。5.權(quán)利要求l的多肽，其包含選自SEQIDNO:2-35的序列。6.權(quán)利要求1的多肽，其序列相對于SEQIDNO:1含有取代F48A/L。7.權(quán)利要求6的多肽，其含有選自SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12，SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:25，SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:30,SEQIDNO:34和SEQIDNO:35的序列。8.分離的或重組的多肽，其包含的序列(a)與SEQIDNO:13在0-16個氨基酸位置中不同和(b)含有下述的一個或多個氨基酸第48位的Ala或Leu;笫51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第111位的Ala;和第114位的Pro;所述多肽表現(xiàn)出抗病毒活性。9.權(quán)利要求8的多肽，其序列的第48位含有Ala或Leu。10.權(quán)利要求8的多肽，其包含與SEQIDNO:13在0-8個氨基酸位置中不同的序列。11.分離的或重組的多肽，其含有序列SEQIDNO:13，任選還在N-末端含有曱硫氨酸，所述多肽表現(xiàn)出抗病毒活性。12.分離的或重組的多肽，其包含的序列(a)與SEQIDNO:36在1-16個氨基酸位置中不同和(b)相對于SEQIDNO:36,含有一個或多個選自M21A,I24P,F48A/L，T51P,S55A,F65A,F68P,F90A,M93P,L111A,V114P,F124A,I127P和E160D的耳)U戈；所述多肽表現(xiàn)出抗病毒活性。13.權(quán)利要求12的多肽，其包含與SEQIDNO:36在1-10個氨基酸位置中不同的序列。14.權(quán)利要求12的多肽，其包含與SEQIDNO:36在1-8個氨基酸位置中不同的序列。15.權(quán)利要求12的多肽，其還包含一個或多個選自P26L,H47Q,T51V，S55P/F，V56L,H58Y，L60M,F90Y,M93L,N95D,N113K,V114E,R125Q，T132K和L154F的取代。16.權(quán)利要求12的多肽，其包含選自SEQIDNO:37-44的序列。17.權(quán)利要求12的多肽，其序列相對于SEQIDNO:36含有取代F48A/L。18.權(quán)利要求17的多肽，其含有選自SEQIDNO:37，SEQIDNO:38，SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41,SEQIDNO:42和SEQIDNO:43的序列。19.權(quán)利要求12的多肽，其含有序列SEQIDNO:44。20.分離的或重組的多肽，其包含的序列(a)與SEQIDNO:3S在0-M個氨基酸位置中不同和(b)含有下述的一個或多個氨基酸第21位的Ala;第24位的Pro;第48位的Ala或Leu;第51位的Pro;第55位的Ala;第65位的Ala;第68位的Pro;第90位的Ala;第93位的Pro;第111位的Ala;第114位的Pro;第124位的Ala;第127位的Pro;和第160位的Glu;所述多肽表現(xiàn)出抗病毒活性。21.權(quán)利要求20的多肽，其序列的第48位含有Ala或Leu。22.權(quán)利要求20的多肽，其包含與SEQIDNO:38在0-8個氨基酸位置中不同的序列。23.分離的或重組的多肽，其含有序列SEQIDNO:38,任選還在N-末端含有甲硫氨酸，所述多肽表現(xiàn)出抗病毒活性。24.權(quán)利要求1至23的多肽，其中所述多肽的抗病毒活性等于或大于huIFN-a2b或huIFN-a2a的抗病毒活性。25.權(quán)利要求24的多肽，其中所述多肽的抗病毒活性比huIFN-a2b或huIFN-a2a的抗病毒活性大至少兩4咅。26.權(quán)利要求1至23的多肽，其中所述多肽所表現(xiàn)出的抗病毒活性/抗增殖活性比率比huIFN-ot2b或huIFN-a2a所表現(xiàn)出的抗病毒活性/抗增殖活性比率大至少兩倍。27.偶聯(lián)物，其包含(a)權(quán)利要求1至26的多肽；和(b)與該多肽共價連接的非多肽部分。28.權(quán)利要求27的偶聯(lián)物，其包含至少兩種非多肽部分。29.權(quán)利要求27的偶聯(lián)物，其包含與半胱氨酸殘基共價連接的非多肽部分。30.權(quán)利要求27的偶聯(lián)物，其包含與賴氨酸殘基或與N末端氨基共價連接的非多肽部分。31.權(quán)利要求27的偶聯(lián)物，其包含與賴氨酸殘基共價連接的非多肽部分。32.權(quán)利要求27的偶聯(lián)物，其包含與N末端氨基共價連接的非多肽部分。33.權(quán)利要求27的偶聯(lián)物，其中所述非多肽部分是聚合物。34.權(quán)利要求33的偶聯(lián)物，其中所述聚合物是聚乙二醇。35.權(quán)利要求34的偶聯(lián)物，其中所述聚乙二醇是與賴氨酸殘基共價連接的40kDamPEG2。36.權(quán)利要求27的偶聯(lián)物，其中所述非多肽部分是糖。37.權(quán)利要求36的偶聯(lián)物，其中所述糖連接于多肽的N-糖基化位點。38.偶聯(lián)物，其含有(a)含有序列SEQIDNO:13的多肽，任選還在N-末端含有曱硫氨酸；和(b)與所述多肽的賴氨酸殘基共價連接的PEG部分，所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出4元病毒活小生。39.權(quán)利要求38的偶聯(lián)物，其中PEG部分是40kDamPEG2部分。40.權(quán)利要求39的偶聯(lián)物，其中40kDamPEG2部分與選自Lysl22和Lysl35的賴氨酸殘基共價連接。41.偶聯(lián)物，其含有(a)含有序列SEQIDNO:38的多肽，任選還在N-末端含有曱碌^氨酸；和(b)與所述多肽的賴氨酸殘基共價連接的PEG部分，所述偶聯(lián)物表現(xiàn)出4元病毒活寸生。42.權(quán)利要求41的偶聯(lián)物，其中PEG部分是40kDamPEG2部分。43.權(quán)利要求42的偶聯(lián)物，其中40kDamPEG2部分與選自Lys31,Lysl22和Lysl35的賴氨酸殘基共價連接。44.組合物，其含有(a)偶聯(lián)物，其包含含有序列SEQIDNO:13的多肽以及與Lysl22共價連接的40kDamPEG2部分，所述多肽任選還在N-末端含有曱硫氨酸；和(b)偶聯(lián)物，其包含含有序列SEQIDNO:13的多肽以及與Lysl35共價連接的40kDamPEG2部分，所述多肽任選還在N-末端含有曱碌u氨酸；所述組合物表現(xiàn)出抗病毒活性。45.組合物，其含有(a)偶聯(lián)物，其包含含有序列SEQIDNO:38的多肽以及與Lys31共價連接的40kDamPEG2部分，所述多肽任選還在N-末端含有曱硫氨酸；(b)偶聯(lián)物，其包含含有序列SEQIDNO:38的多肽以及與Lysl22共價連接的40kDamPEG2部分，所述多肽任選還在N-末端含有曱硫氨酸；和(c)偶聯(lián)物，其包含含有序列SEQIDNO:38的多肽以及與Lysl35共價連接的40kDamPEG2部分，所述多肽任選還在N-末端含有曱硫氨酸；所述組合物表現(xiàn)出抗病毒活性。46.組合物，其包含權(quán)利要求1至26的多肽以及可藥用的賦形劑。47.組合物，其包含權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物以及可藥用的賦形劑。48.權(quán)利要求44至45的組合物，還含有可藥用的賦形劑。49.分離的或重組的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1至26的多肽的核酸序列。50.權(quán)利要求49的多核苷酸，其包含編碼含有序列SEQIDNO:13的多肽的核酸序列。51.4又利要求50的多核香酸，其包含選自SEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:64和SEQIDNO:89的核酸序列。52.權(quán)利要求49的多核苷酸，其包含編碼含有序列SEQIDNO:38的多肽的核酸序列。53.權(quán)利要求52的多核苷酸，其包含選自SEQIDNO:80，SEQIDNO:81，SEQIDNO:82和SEQIDNO:90的核酸序列。54.宿主細胞，其包含權(quán)利要求49的多核苷酸。55.載體，其包含權(quán)利要求49的多核苷酸。56.權(quán)利要求55的載體，其是表達載體，包含與啟動子可操作地連接的多核苷酸。57.宿主細胞，其包含權(quán)利要求56的載體。58.組合物，其包含權(quán)利要求49的多核苷酸以及賦形劑。59.制備權(quán)利要求1至26的多肽的方法，該方法包括提供包含宿主細胞的培養(yǎng)物，所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含與多核苷酸可操作地連接的啟動子，所述多核苷酸包含編碼所述多肽的核酸序列，在允許該多肽表達的條件下培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，和回收該多肽。60.權(quán)利要求59的方法，其中宿主細胞是糖基化宿主細胞。61.權(quán)利要求59的方法，其中宿主細胞是細菌宿主細胞。62.權(quán)利要求59的方法，其中細菌宿主細胞是大腸桿菌。63.權(quán)利要求62的方法，其中回收多肽的步驟包括(a)分離含有多肽的包涵體(IB);(b)溶解IB,從而獲得未折疊的多肽；(c)重折疊未折疊的多肽，從而獲得重折疊的多肽；和(d)純化重折疊的多肽。64.制備偶聯(lián)物的方法，所述方法包括提供權(quán)利要求1至26的多肽，和(ii)將至少一種非多肽部分與所述多肽相連，其中得到的偶聯(lián)物表現(xiàn)出4元病毒活性。65.權(quán)利要求64的方法，其中提供多肽的步驟包括提供包含宿主細胞的培養(yǎng)物，所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含與多核苦酸可操作地連接的啟動子，所述多核苷酸包含編碼所述多肽的核酸序列，在允許該多肽表達的條件下培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，和回收該多肽。66.權(quán)利要求65的方法，其中所述宿主細胞是糖基化宿主細胞或細菌宿主細胞。67.權(quán)利要求66的方法，其中細菌宿主細胞是大腸桿菌。68.權(quán)利要求67的方法，其中回收多肽的步驟包括(a)分離含有多肽的包涵體(IB);(b)溶解IB,從而獲得未折疊的多肽；(c)重折疊未折疊的多肽，從而獲得重折疊的多肽；和(d)純化重折疊的多肽。69.權(quán)利要求64的方法，其中使至少一種非多肽部分與所述多肽相連的步驟包括于4°C,pH9的條件下，以mPEG2-NHS:多肽的摩爾比約為3:1至5:1使多肽與40kDamPEG2-NHS反應(yīng)1小時至過夜。70.降低感染了病毒的細胞中的病毒拷貝數(shù)的方法，所述方法包括給細胞施用其用量能有效降低細胞中病毒拷貝數(shù)的權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或權(quán)利要求44至48的組合物，由此降低所述細胞中的病毒拷貝數(shù)。71.降低感染了HCV的患者血清中的HCVRNA水平的方法，所述方法包括給患者施用權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或^l利要求44至48的組合物，與開始治療前存在的HCVRNA水平相比，其用量能有效降低HCVRNA水平。72.降低感染了HBV的患者血清中的HBVDNA水平的方法，所述方法包括給患者施用權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或權(quán)利要求44至48的組合物，與開始治療前存在的HBVDNA水平相比，其用量能有效降低HBVDNA水平。73.降低感染了HIV的患者血清中的HIVRNA水平的方法，所述方法包括給患者施用權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或權(quán)利要求44至48的組合物，與開始治療前存在的HIVRNA水平相比，其用量能有效降低HIVRNA水平。74.權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或權(quán)利要求44至48的組合物，其用作藥物。75.權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或權(quán)利要求44至48的組合物在制備用于治療疾病的藥物中的用途。76.權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或權(quán)利要求44至48的組合物在制備用于治療病毒疾病的藥物中的用途。77.權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或權(quán)利要求44至48的組合物在制備用于降低感染了病毒的細胞中該病毒拷貝數(shù)的藥物中的用途。78.權(quán)利要求1至26的多肽，權(quán)利要求27至43的偶聯(lián)物，或權(quán)利要求44至48的組合物在制備用于降低感染了病毒的患者血清中的病毒水平的藥物中的用途。79.根據(jù)權(quán)利要求61-63中任一項的用途，其中所述病毒是HCV,HBV或HIV。全文摘要本發(fā)明提供了干擾素-α多肽和偶聯(lián)物，以及編碼這些多肽的核酸。本發(fā)明還提供了含有這些多肽、偶聯(lián)物和核酸的組合物；含有或表達所述多肽、偶聯(lián)物和核酸的細胞；制備所述多肽、偶聯(lián)物和核酸的方法；以及所述多肽、偶聯(lián)物和核酸的使用方法。文檔編號A61K47/48GK101115769SQ200580024147公開日2008年1月30日申請日期2005年5月18日優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日發(fā)明者哈拉爾德·克羅普肖弗,安妮·沃格特,安德烈亞斯·肖布馬,弗里德里克·赫斯,托本·L·尼森,拉爾夫·舒馬赫,斯蒂芬·西伯,斯蒂芬·費希爾,斯里達·維斯瓦納撒恩,漢斯·科爾,羅伯托·福爾肯斯坦,菲利普·A·帕滕,阿德爾伯特·格羅斯曼,馬庫斯·登鮑斯基申請人:馬克西根公司;霍夫曼-拉羅奇有限公司