專利名稱：用于治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥的組合物和方法。尤 其是，本發(fā)明涉及包含降解草酸鹽或還原草酸鹽的細(xì)菌和酶的組合物 和方法。
背景技術(shù)：
腎-尿路結(jié)石疾病(尿石病)是全世界范圍的主要健康問(wèn)題。大多數(shù) 與尿石病有關(guān)的結(jié)石由單獨(dú)的草酸鈣組成，或者由草酸鈣加上磷酸鈣 組成。其它疾病狀態(tài)也被證實(shí)與過(guò)量的草酸鹽有關(guān)。包括慢性陰部疼 痛(vulvodynia)，與晚期腎病有關(guān)的草酸過(guò)多癥，心臟傳導(dǎo)失調(diào)，克 羅恩氏病及其它腸衣疾病。草酸和/或其鹽，草酸鹽存在于多種食物中，因此是人和動(dòng)物膳食 的許多組分的成分。在食用了含有增加量的草酸的食物后可能發(fā)生草 酸鹽吸收的增加。諸如菠菜和食用大黃的食物公知含有高含量的草酸 鹽，但是大量其它食物和飲料也含有草酸鹽。因?yàn)椴菟猁}存在于如此 多樣的食物中，因此草酸鹽含量低并且同時(shí)還可口的膳食難以配制出 來(lái)。此外，依從低草酸鹽膳食常常也是有疑問(wèn)的。
內(nèi)源性草酸鹽也由正常組織酶代謝產(chǎn)生。包括可以吸收的膳食草 酸鹽的草酸鹽以及代謝產(chǎn)生的草酸鹽不會(huì)被組織酶進(jìn)一步代謝并且因 此必須被排出體外。這樣的排泄主要經(jīng)腎進(jìn)行。腎液中草酸鹽的濃度 非常關(guān)鍵，草酸鹽濃度的增加會(huì)引起高危形成草酸鈣晶體，并隨后由此形成腎結(jié)石。腎結(jié)石的高危形成圍繞著大量目前尚未完全明白的因素。腎或尿 路結(jié)石疾病發(fā)生在西方國(guó)家多至12%的人群中，并且約70%的結(jié)石由 草酸鈣或草酸鈣加上磷酸鈣組成。
一些個(gè)體(例如，患有諸如克羅恩氏病，炎癥性腸病或脂肪痢以及進(jìn)行過(guò)空腸回腸(jejunoileal)分流外科手 術(shù)的病人)在其膳食中比其他來(lái)源吸收更多的草酸鹽。對(duì)于這些個(gè)體， 草酸鹽尿石病的發(fā)病率明顯增加。發(fā)病率的提高是由于腎和尿液中草 酸鹽水平的增加，并且人的這樣最普遍的高草酸尿綜合癥被稱為腸源 性高草酸尿。草酸鹽也是晚期腎病病人的難題并且最近有證據(jù) (Solomons, C. C.， M. H. Melmed， S. M. Heitler [1991] " Calcium citrate for vulvar vestibulitis " Journal of Reproductive Medicine 36 : 879-882)尿 草酸鹽的升高也與外陰前庭炎(慢性陰部疼痛)有關(guān)。降解草酸鹽的細(xì)菌已經(jīng)分離自人的糞便(Amson M. J.， H. M. Cook, D. B. Milne， S. Gallagher, R. V. Clayman [1986] " Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans " J. Nutr. 116455-460)。這些細(xì)菌類似于草酸鹽-還原細(xì)菌，這些草酸鹽還原細(xì)菌分 離自大量動(dòng)物品種的腸渣(Dawson， K. A.， M.J.Allison, P. A. Hartman [1980] " Isolation and some characteristics of anaerobic oxalate-degrading bacteria the rumen " Appl. Environ. Microbiol. 40: 833-839; Allison, M. J.， H. M. Cook [1981] " Oxalate degradation by microbes of the large bowel of herbivores : the effect of dietary oxalate " Science 212 : 675-676; Daniel, S. L.， P. A. Hartman, M. J. Allison [1987] " Microbial degradation of oxalate in the gastrointestinal tracts of rats " Appl. Environ.
Microbiol. 53: 1793-1797)。這些細(xì)菌不同于以前描述的生物體并且已 經(jīng)產(chǎn)生了一個(gè)新種和一個(gè)新屬命名(Allison， M. J.， K. A. Dawson， W. R. Mayberry， J. G. Foss [1985] " Oxalabacter formigenes gen. nov.， sp. nov. : oxalate-degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinal tract " Arch. Microbiol. 141: 1-7)。
并不是所有人在他們的腸道中均攜帶0. formigenes菌群(Allison， M. J., S. L. Daniel, N. A. Comick [1995] " Oxalate-degrading bacteria " In Khan， S. R.(編車葺.)，Calcium Oxalate in Biological Systems CRC Press; Doane， L. T.， M. Liebman， D. R. Caldwell [1989] " Microbial oxalate degradation : effects on oxalate and calcium balance in humans " Nutrition Research 9: 957-964)。在進(jìn)行過(guò)回腸空腸分流外科手術(shù)的人的糞便樣 品中只具有低濃度的草酸鹽降解細(xì)菌或完全缺乏草酸鹽降解細(xì)菌 (Allison等[1986] " Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans " J. Nuti'. 116 : 455-460)。同時(shí)，某些人和動(dòng)物可以維持O. formigenes的菌落，但是因?yàn)椴荒芮宄靼椎睦碛扇匀痪哂羞^(guò)量水平的 草酸鹽。
目前需要治療人和動(dòng)物減少它們體內(nèi)的草酸鹽水平，由此治療或 預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的方法。合乎需要的方法包括施用還原草酸鹽的 組合物。
發(fā)明概述
本發(fā)明包括治療和預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥的組合物和方法。本發(fā)明
的組合物包含可以降低草酸鹽的微生物以及包含還原草酸鹽的酶的組 合物。本發(fā)明的方法包含施用該組合物治療或預(yù)防草酸鹽—相關(guān)的病癥。
一個(gè)實(shí)施方案包括通過(guò)降低腸道中草酸鹽的量降低發(fā)展草酸鹽-相關(guān)的 失調(diào)的危險(xiǎn)的方法。腸道中的這種降低導(dǎo)致系統(tǒng)草酸鹽水平的減少由 此促進(jìn)身體健康。
在一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過(guò)向腸道補(bǔ)充草酸鹽-降解細(xì)菌實(shí)
現(xiàn)草酸鹽吸收的減少。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些細(xì)菌是Oxalobacter formigenes.。這些細(xì)菌使用草酸鹽作為生長(zhǎng)底物。這樣的利用降低了腸 中可溶性草酸鹽的濃度，由此降低了用于吸收的草酸鹽的量。腸道中 草酸鹽的降低還可以從循環(huán)系統(tǒng)除去草酸鹽。本發(fā)明的方法預(yù)計(jì)可以 全面降低個(gè)體體內(nèi)草酸鹽的量。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了向處在患草酸鹽-相關(guān)疾病高 危中的人的腸道遞送O. formigenes的方法和組合物。這些細(xì)菌及其子 代在腸中復(fù)制并從腸道除去草酸鹽，由此降低可用于吸收的草酸鹽的 量并引起從血液向腸中排泄草酸鹽的提高。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，除了利用草酸鹽作為底物的0. formigenes,
降解草酸鹽的微生物也可用于實(shí)現(xiàn)治療性的草酸鹽降解由此降低患尿 石病及其它草酸鹽-相關(guān)疾病的危險(xiǎn)。這樣的其它微生物可以是，例如， 諸如梭狀芽孢桿菌或假單胞桿菌的細(xì)菌。另外，本發(fā)明包括用于給可 用于將最初不能分解草酸鹽的天然微生物轉(zhuǎn)化成能夠還原草酸鹽的微 生物的微生物提供賦予草酸鹽還原功能的外源多核苷酸的方法和組合 物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含用于降解草酸鹽產(chǎn)生使 這些微生物能夠降解草酸鹽的酶的微生物。在其他的實(shí)施方案中，該 組合物可以包含用使轉(zhuǎn)化的微生物能夠降解草酸鹽的多核苷酸序列轉(zhuǎn) 化的微生物。編碼草酸鹽-還原基因的多核苷酸序列包括在本發(fā)明的范 圍內(nèi)。編碼草酸鹽還原微生物，諸如細(xì)菌或真菌中發(fā)現(xiàn)的酶或其它草 酸鹽-還原酶的多核苷酸序列可用于本發(fā)明的方法中。多核苷酸可被用 來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)胞使細(xì)胞具有比天然存在的草酸鹽還原微生物更高的草酸鹽-還原活性，相同的草酸鹽-還原活性，或者更低的草酸鹽-還原活性。多 核苷酸也可用于合成的或者離體系統(tǒng)來(lái)提供具有草酸鹽還原活性的蛋 白。
甲酰基-CoA轉(zhuǎn)移酶和草酰-CoA脫羧酶已經(jīng)被確定為在草酸鹽降 解中起作用。用于本發(fā)明的方法和組合物中的酶包括但不限于甲酰基-CoA轉(zhuǎn)移酶，草酰-CoA脫羧酶，草酸鹽氧化酶，草酸鹽脫羧酶及其它酶，輔因子，以及輔酶，取代草酸鹽降解途徑或者參與草酸鹽代謝途 徑，尤其是草酸鹽還原。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，合適的宿主可以用編碼這些酶或者 相關(guān)活性的酶由此使轉(zhuǎn)化的宿主能夠增加草酸鹽降解的外源多核苷酸 轉(zhuǎn)化。宿主可以是，例如，尤其最適宜于口服和/或定殖于腸的微生物。 或者，宿主可以是一旦轉(zhuǎn)化將產(chǎn)生所需的酶活性，由此當(dāng)消耗該植物 材料時(shí)使這些活性可以被腸利用的植物?；蛘?，轉(zhuǎn)化的植物可以具有 較低量的草酸鹽，任選地由于由轉(zhuǎn)化提供的蛋白的作用，由此當(dāng)消耗 時(shí)，植物將不向膳食提供與未轉(zhuǎn)化的植物一樣多的草酸鹽。本發(fā)明也包括用于用草酸鹽降解或者草酸鹽-還原酶轉(zhuǎn)化的植物 的方法和組合物，其中這些植物具有對(duì)真菌提高的抗性，所述真菌需 要草酸鹽用于使植物致病或者產(chǎn)生草酸使植物致病。本發(fā)明還包括含有用于降低草酸鹽水平以便治療或者預(yù)防草酸鹽 相關(guān)病癥的酶的方法和組合物。例如，通過(guò)施用起降解草酸鹽作用的 酶實(shí)現(xiàn)。這些酶可以是分離和純化的或者可以作為細(xì)胞裂解物施用。細(xì)胞裂解物可以由具有草酸鹽-還原功能的微生物，例如O. formigenes 制成。在特定的實(shí)施方案中，施用的酶是本發(fā)明的一種或多種酶，諸 如但不限于草酸鹽脫羧酶，草酸鹽氧化酶，甲酰基-CoA轉(zhuǎn)移酶和草酰 -CoA脫羧酶。任選地，可以施用改進(jìn)酶活性的其他因子。這些其他因 子可以是例如，草酰CoA， MgCl2和TPP (硫胺素二磷酸，維生素Bi 的活性形式)。包括酶的組合物包含一或多種酶，和任選地，輔因子， 輔酶及其它分別或者組合加強(qiáng)酶活性的因子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)施用由重組微生物諸如大腸桿 菌產(chǎn)生的草酸鹽-降解酶實(shí)現(xiàn)草酸鹽水平的降低，所述大腸桿菌已經(jīng)被 轉(zhuǎn)化表達(dá)草酸鹽-降解酶。重組宿主可以活的或者非-活的形成施用。本 發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及用于口服的藥物組合物和/或營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑。這些 組合物釋放草酸鹽降解微生物或者草酸鹽降解酶到人或者動(dòng)物的腸 內(nèi)。本發(fā)明的組合物包含藥用的制劑。例如，本發(fā)明的方法和組合物 包含向預(yù)定位置提供組合物，諸如向受體的腸遞送組合物的劑量輸送 系統(tǒng)。本發(fā)明的組合物可以作為食物諸如，牛奶，肉和酸奶的成分施 用。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在缺乏草酸鹽-降解細(xì)菌的馴養(yǎng)， 農(nóng)業(yè)或者外來(lái)動(dòng)物中通過(guò)分別或者組和施用草酸鹽-降解微生物，植物 和酶實(shí)現(xiàn)草酸鹽吸收的下降。
本發(fā)明的方法包含通過(guò)施用包括一或多種草酸鹽還原微生物，一 或多種草酸鹽還原酶或者其組合和混合物的有效量的草酸鹽還原組合
物治療或者預(yù)防人和動(dòng)物的草酸鹽相關(guān)的病癥。草酸鹽相關(guān)的病癥包 括但不限于高草酸尿，原發(fā)性高草酸尿，自發(fā)草酸鈣腎結(jié)石疾病(尿石 病)，腸源性高草酸尿，慢性陰部疼痛，與晚期腎病相關(guān)的草酸過(guò)多癥， 心臟傳導(dǎo)失調(diào)，炎癥性腸病，克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。


圖1A是來(lái)自高鈣膳食的數(shù)據(jù)的圖。 圖1B是來(lái)自低鈣膳食的數(shù)據(jù)的圖。
圖2A是排泄的草酸鹽的圖。 圖2B是排泄的草酸鹽的圖。 圖2C是排泄的草酸鹽的圖。 圖3A-C是排泄的草酸鹽的圖。 圖4是排泄的草酸鹽的圖。 發(fā)明概述本發(fā)明包括用于降低草酸鹽的方法和組合物。本發(fā)明的組合物包 含能夠降低草酸鹽的微生物，酶，多核苷酸序列，載體，細(xì)胞，植物和動(dòng)物。組合物包含能夠降低草酸鹽的微生物。這樣的微生物包括但不限于Oxalobacterformigenes，假單胞菌，梭狀芽孢桿菌，乳酸桿菌， 雙歧桿菌(Bifidobacteria), —些或者所有能夠降低草酸鹽，而且包括諸 如用外源的多核苷酸從而使其具有草酸鹽降低能力的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或者 真菌的微生物。另外，本發(fā)明的微生物包括用一或多種草酸鹽降低載 體轉(zhuǎn)化的微生物，所述載體包括編碼草酸鹽-還原酶或者相關(guān)的活性使 得該微生物為"超級(jí)降低劑"的內(nèi)源或者外源的多核苷酸序列。超級(jí) 降低劑具有改進(jìn)的天然草酸鹽降低能力，例如，用其他的草酸鹽降低 序列轉(zhuǎn)化Oxalobactor formigenes，或者最初不具有草酸鹽降低活性用 一或多種編碼產(chǎn)生提高的草酸鹽降低活性的草酸鹽降低肽的一或多種 序列轉(zhuǎn)化的微生物。草酸鹽降低活性編碼序列可能或者可能不插入基 因組中或者微生物中發(fā)現(xiàn)的其它載體中。這樣的轉(zhuǎn)化可以包括供應(yīng)編 碼草酸鹽還原蛋白或者肽或者可以提供諸如反義或者iRNA的阻斷核 苷酸的基因序列。組合物還包含作為草酸鹽還原途徑的組分的酶。這樣的組合物包 含一或多種酶和任選地包括輔因子，輔酶及其它酶活性所需或者希望 的因子。組合物包含一或多種酶，包括但不限于草酸鹽還原酶及其它 參與植物，動(dòng)物或者人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的草酸鹽的代謝酶。組合物包含一種 或多種在這里教導(dǎo)的草酸鹽還原酶。此處所述的術(shù)語(yǔ)"一或多種酶" 是指諸如甲?；鵆oA轉(zhuǎn)移酶的一種酶，或者例如甲酰基CoA轉(zhuǎn)移酶和 草酸鹽脫羧酶的超過(guò)一種的酶。本領(lǐng)域已知，該術(shù)語(yǔ)不指一種酶分子， 而是一或多種酶類型的多種分子。此處所述的術(shù)語(yǔ)草酸鹽-降解酶和草酸鹽-還原酶可互換使用，二者 均指參與任意生物體中的草酸鹽還原或者降解的酶，或者指活性片段 或者包括能夠還原或者降解草酸鹽的活性片段的重組蛋白。
本發(fā)明的酶組合物還可以包含通過(guò)胃或者腸環(huán)境提供對(duì)活性酶分 子以免降解的保護(hù)的制劑。例如，酶的組合物包含可以保護(hù)或者包裹
(cage)酶的組合物。該酶可以與其它包括但不限于PEG的化合物共
價(jià)連接。酶可以包裹或者截留在結(jié)構(gòu)內(nèi)，諸如例如由聚合物制成的三 維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，所述聚合物或者降解釋放酶或者具有使酶離開(kāi)該結(jié)構(gòu) 或者底物穿透該結(jié)構(gòu)達(dá)到酶的孔徑。例如，該孔徑可以使低分子量草 酸鹽和甲酸鹽擴(kuò)散到酶存在的區(qū)域。另外，該酶可以或者不與聚合物 結(jié)構(gòu)共價(jià)連接。保護(hù)活性的酶以免在蛋白水解或者其它對(duì)酶有害的環(huán) 境下降解的方法和裝置。
本發(fā)明的組合物還包含編碼參與草酸鹽還原途徑的肽或者蛋白的 多核苷酸序列。這樣的多核苷酸序列可以獲自任意來(lái)源并且可用于本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法諸如用于轉(zhuǎn)化微生物，植物或者動(dòng)物來(lái)源的 細(xì)胞，并且包括全生物體。
本發(fā)明的組合物還包括具有改變的草酸鹽還原功能的植物和動(dòng) 物。例如，這樣的植物包括已經(jīng)由多核苷酸組合物轉(zhuǎn)化的植物，使得 植物中草酸鹽的量降低或者與未轉(zhuǎn)化的植物比較產(chǎn)生的草酸的量提 高。本發(fā)明的組合物還包含具有提高的還原草酸鹽能力的動(dòng)物。例如， 具有提高的草酸鹽還原能力的動(dòng)物可用作體內(nèi)模型研究草酸鹽相關(guān)病 癥。
本發(fā)明的方法包含制備和利用本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的方法包 含由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些導(dǎo)入外源多核苷酸序列的方法轉(zhuǎn)化細(xì) 胞，植物和動(dòng)物。這樣的多核苷酸序列可以獲自任意來(lái)源并且可用于 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些方法，諸如用于轉(zhuǎn)化微生物，植物或者動(dòng) 物來(lái)源的細(xì)胞，并且包括全生物體。方法還包括制備包含具有草酸鹽 還原活性的細(xì)胞裂解物的組合物，制備包括一或者多種具有草酸鹽還 原活性的酶的組合物，以及制備包括由具有改變的草酸鹽水平的植物
或者微生物制成的膳食組分的組合物。本發(fā)明的方法包含利用本發(fā)明的組合物。這樣的應(yīng)用包括向細(xì)胞 提供多核苷酸序列來(lái)提高或者抑制細(xì)胞的草酸鹽還原能力。本發(fā)明包 括向植物或者動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物的方法，用于改變植物或者動(dòng) 物草酸鹽的水平。方法還包括膳食補(bǔ)充方法，使得本發(fā)明的組合物施 用于食物或者肥源中的植物或者動(dòng)物或者與食物或者肥源同時(shí)施用于 植物或者動(dòng)物來(lái)改變食物中食物降解期間或者由植物吸收期間草酸鹽 的水平。本發(fā)明的方法包含治療或者預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥的方法。方法包 含施用有效改變生物體中草酸鹽水平的量的本發(fā)明的組合物。這樣的 方法可有效治療人以及動(dòng)物的草酸鹽病癥，包括但不限于高草酸尿， 原發(fā)性高草酸尿，自發(fā)草酸鈣腎結(jié)石疾病(尿石病)，腸源性高草酸尿， 慢性陰部疼痛，與晚期腎病有關(guān)的草酸過(guò)多癥，心臟傳導(dǎo)失調(diào)，炎癥 性腸病，克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。本發(fā)明涉及向人或者動(dòng)物腸道中導(dǎo)入包括一或多種草酸鹽-降解 細(xì)菌和/或酶的組合物，其中組合物的活性降低了存在的草酸鹽的量和/ 或濃度由此降低應(yīng)歸因于草酸鹽的患病的危險(xiǎn)。本發(fā)明包括用于治療以及預(yù)防人和動(dòng)物草酸鹽相關(guān)病癥的方法和 組合物。用于治療草酸鹽病癥的方法包括施用包括一或多種草酸鹽-還原酶的組合物。這樣的組合物可以是每天一或多次共一或多天施用， 取決于草酸鹽—相關(guān)病癥的嚴(yán)重性或者人或者動(dòng)物腸或者體液中草酸鹽的量?？梢赃B續(xù)治療只要人或者動(dòng)物體內(nèi)存在不需要的水平的草酸鹽。 例如，酶組合物可以每天施用一或多次，共從1天到數(shù)年的時(shí)間范圍。 對(duì)于患有慢性草酸鹽相關(guān)病癥的人或者動(dòng)物，該組合物可以在人或者 動(dòng)物整個(gè)剩余的壽命時(shí)間內(nèi)施用。
治療和預(yù)防草酸鹽-相關(guān)病癥的方法包含施用含有有效量草酸鹽 還原酶的組合物。組合物中酶的量包括將降低個(gè)體腸中存在的一部分 草酸鹽的草酸鹽-還原酶活性的活性單位量或者將啟動(dòng)草酸鹽還原的量 或者維持個(gè)體與施用組合物以前存在的草酸鹽的量相比草酸鹽降低的 量的草酸鹽-還原酶活性的活性單位水平。可被用于單個(gè)劑量組合物中的草酸鹽-還原酶活性的活性單位量可以為從約0.0001個(gè)單位到約 5,000個(gè)單位，從約5個(gè)單位到IOO個(gè)單位，以及在其中所包括的所有 范圍。該組合物此外可以包括其他的酶，輔因子，底物，輔酶，礦物 質(zhì)及其他有助于草酸鹽還原的因子。酶的單位是在37'C每分鐘降解一 個(gè)微摩爾的草酸鹽的酶量。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備和給人或者動(dòng)物腸道施用 包含Oxalobacter formigenes的草酸鹽降解細(xì)菌的細(xì)胞的組合物的方法， 在所述人或者動(dòng)物腸道中，微生物的活性降低了存在于腸中的草酸鹽 的量，從而引起腎和其他細(xì)胞液中草酸鹽濃度的降低。在另一實(shí)施方 案中，本發(fā)明包括制備和給人或者動(dòng)物腸道施用包含一或多種來(lái)自任 何來(lái)源的草酸鹽-降解酶的方法，在所述人或者動(dòng)物腸道中， 一或多種 酶的活性降低了存在于腸中的草酸鹽的量，并引起腎和其他細(xì)胞液中 草酸鹽濃度的降低。引入的細(xì)胞或者酶降解草酸鹽并且細(xì)菌可能在腸 生物境中復(fù)制或者不復(fù)制以致原始細(xì)胞的后代定殖在腸上并繼續(xù)除去 草酸鹽。草酸鹽還原細(xì)菌或者草酸鹽還原酶的存在降低了形成腎結(jié)石 以及其他由草酸所引起的并發(fā)癥的危險(xiǎn)。在用于人的優(yōu)選實(shí)施方案中， 所使用的具體O. formigenes菌株是分離自人腸樣品的菌株。因此菌株 是正常人腸細(xì)菌群落的一部分。然而，因?yàn)樗麄儾⒉皇谴嬖谟谒腥?的體內(nèi)，或者以不充分的數(shù)目存在，這些生物體的引入糾正了存在于 一些人體內(nèi)的缺陷。雖然并不希望受到任何理論的限制，人們相信腸渣中富集一或多 種草酸鹽降解細(xì)菌或者草酸鹽還原酶將引起腸渣中草酸鹽的降低。一 些細(xì)菌或者施用的酶在吸收的位點(diǎn)或者附近進(jìn)行草酸鹽降解。細(xì)菌或
者所施用的酶的活性降低了吸收膳食草酸鹽的水平。腸中草酸鹽濃度 的下降還可以導(dǎo)致從細(xì)胞和體循環(huán)除去草酸鹽。更具體地說(shuō)，腸中草 酸鹽濃度的降低還可以提高草酸鹽從血液向腸中分泌，由此降低需要 排泄在尿中的草酸鹽的量。由此，本發(fā)明施用草酸鹽還原細(xì)菌或者草 酸鹽還原酶的方法除治療膳食的高草酸尿之外可用于治療或者預(yù)防草 酸鹽相關(guān)的病癥，諸如原發(fā)性高草酸尿。本發(fā)明的組合物和方法尤其 可用于促進(jìn)人和動(dòng)物健康的草酸鹽水平。向腸中單獨(dú)或者組合引入草酸鹽降解細(xì)菌或者一或多種草酸鹽降 解酶的藥物和營(yíng)養(yǎng)組合物包括已經(jīng)以液體或者漿糊形式凍干或者冷凍 并包膠在膠囊中或者其他腸衣保護(hù)層中的細(xì)菌或者酶。凝膠蓋材料優(yōu) 選為形成耐受胃酸度和胃酶降解，但是隨著草酸鹽降解組合物的釋放 由腸中更高pH和膽汁酸內(nèi)容物降解的遞送藥丸或者膠囊的聚合物材 料。然后釋放的組合物將存在于腸中的草酸鹽轉(zhuǎn)化為無(wú)害的產(chǎn)物。藥 物或者營(yíng)養(yǎng)載體也可以與細(xì)菌或者酶組合。這些包括例如，鹽水-磷酸 鹽緩沖液。本發(fā)明的方法包含向人或者動(dòng)物的腸道施用草酸鹽-還原組 合物。包含一或多種草酸鹽還原細(xì)菌或者一或多種草酸鹽還原酶，或者 細(xì)菌和酶的組合的待施用的草酸鹽-還原組合物可以作為設(shè)計(jì)用來(lái)保護(hù) 組合物免于胃酸過(guò)多的副作用的膠囊或者微膠囊進(jìn)行遞送?？梢允褂?若干腸道保護(hù)層方法的一或多種。這樣的腸溶衣的描述包括使用苯二甲酸醋酸纖維素(CAP) (Yacobi， A.， E. H. Walega， 1988， Oral sustained release formulations: Dosing and evaluation, Pergammon Press)。其他圭寸 裝技術(shù)的描述包括美國(guó)專利5，286,495，其在此處引入作為參考。本發(fā) 明的組合物還可以配制為栓劑。向腸施用這些包含一或多種微生物， 一或多種草酸鹽還原酶或者 組合和混合物的組合物的其他方法包括向食物源直接添加組合物。一 或多種細(xì)菌可以新鮮采集的細(xì)胞，凍干的細(xì)胞或者保護(hù)的細(xì)胞的形式
添加。 一或者多種酶可以作為凍干蛋白質(zhì)，包膠或者微囊酶組合物， 與維持酶活性的其他材料復(fù)合的酶，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的向組 合物添加酶的其他方法添加。食物可以補(bǔ)充有不影響食物味道或者外 觀的草酸鹽降解組合物。這些食物可以是例如酸奶酪，牛奶，花生醬 或者巧克力。攝取后，當(dāng)食品被消化并為腸所吸收時(shí)，包括一或多種 微生物， 一或多種酶或者組合的草酸鹽降解組合物降解存在于腸種的 草酸鹽由此降低吸收到血流中的草酸鹽。如上所述，多種食物可以補(bǔ)充以草酸鹽降解組合物。制備這樣包 含草酸鹽降低組合物的食物的方法包括將食物與草酸鹽降低組合物混 合。例如，草酸鹽降低微生物可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或者經(jīng)例如離心作 用與培養(yǎng)基隔開(kāi)。從商業(yè)乳品店獲得的傳統(tǒng)的酸乳培養(yǎng)物可以與草酸 鹽降解微生物培養(yǎng)物混合。然后這些培養(yǎng)物的混合物可以添加到乳品 店堿性酸乳預(yù)混合料中，并不影響味道或者稠度。然后利用傳統(tǒng)的商 業(yè)方法產(chǎn)生和包裝酸乳。在另一實(shí)施例中，草酸鹽降解細(xì)菌可以添加 到已經(jīng)產(chǎn)生的酸乳中。通過(guò)相似的方法，包含一或多種草酸鹽還原酶 的草酸鹽降低組合物可以添加到酸乳細(xì)菌培養(yǎng)物或者酸乳食品中。本發(fā)明方法的另一實(shí)施例是向勻化并殺菌后的牛奶添加草酸鹽降 低組合物。這樣的方法目前被用于向牛奶添加嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilis)微生物的乳品加工業(yè)。包含細(xì)菌的所有食物源 可以通過(guò)補(bǔ)充草酸鹽-降解細(xì)菌使用。這些食品包括在加工期間添加所 希望的微生物的乳酪或者肉制品。包括含有草酸鹽還原酶的草酸鹽降 低組合物的食物不局限于包含微生物的那些食物，而是包括所有可以 添加活性酶的食物源。通常被認(rèn)為是食物材料的材料可以用作酶的載 體材料，以便酶在食物的所有生產(chǎn)或者生長(zhǎng)階段，或者由人或者動(dòng)物 消化的所有階段對(duì)存在于食物中的草酸鹽或者存在于腸中的草酸鹽有 活性。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了新型的酶遞送系統(tǒng)。該
系統(tǒng)包括已經(jīng)轉(zhuǎn)化有異源多核苷酸表達(dá)草酸鹽降解酶的植物。該表達(dá) 酶的轉(zhuǎn)基因植物可以作為例如沙拉的組分施用于病人。此外，表達(dá)酶 的植物可以作為例如飼料的組分施用給動(dòng)物，或者生長(zhǎng)在牧場(chǎng)中?？?以喂給這些產(chǎn)物的動(dòng)物包括，例如，牛，豬，狗和貓。由此，作為向腸施用的替代方法，對(duì)植物進(jìn)行遺傳工程化來(lái)表達(dá) 草酸鹽降解酶。這些轉(zhuǎn)基因植物被添加到膳食中，酶的活性引起草酸 鹽的下降。編碼這些酶的DNA序列是本領(lǐng)域已知的，例如描述在WO98/16632中。除可以用作膳食的組分促進(jìn)人或者動(dòng)物體內(nèi)健康草酸鹽的水平的 植物之外，本發(fā)明提供了對(duì)微生物感染具有增強(qiáng)的抗性的植物。具體 地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物可以抗需要或者利用所存在的草酸鹽對(duì)植物 致病的微生物。本發(fā)明被轉(zhuǎn)化表達(dá)草酸鹽降解酶的植物抗例如某些需 要草酸鹽致病的真菌。編碼酶的基因可以被修飾提高在植物中的表達(dá) 和/或穩(wěn)定性。同時(shí)，表達(dá)可以在指導(dǎo)在特定組織中表達(dá)的啟動(dòng)子的控 制下。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)菌，例如O. formigenes 的菌株是分離自已經(jīng)用來(lái)自正常人或者為動(dòng)物時(shí)，來(lái)自正常動(dòng)物的腸 渣的稀釋物接種的厭氧培養(yǎng)物的純培養(yǎng)物。可以使用包含可以檢測(cè)草 酸鹽降解菌落的包含專用的草酸鈣的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，每 個(gè)菌株的純度可以通過(guò)利用至少2個(gè)隨后的重復(fù)克隆步驟進(jìn)行確認(rèn)。根據(jù)本發(fā)明使用的0. formigenes菌株已經(jīng)基于若干檢驗(yàn)進(jìn)行了表 征，包括細(xì)胞脂肪酸圖譜，細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜，DNA和RNA (Jensen, N. S.， M. J. Allison (1995) " Studies on the diversity among anaerobic oxalate degrading bacteria now in the species Oxalobacter formigenes " Abstr. to the General Meeting of the Amer. Soc. Microbiol" 1-29)，禾口對(duì)寡 核苷酸探針的應(yīng)答(Sidhu等，1996)。已經(jīng)描述了 2組這樣的細(xì)菌(I和
II組，均存在于目前種的描述中)。所使用的菌株是基于草酸鹽降解能 力，以及定殖于人腸道的能力的證據(jù)進(jìn)行選擇的。所選的菌株包括I 以及II組的種的代表。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中包括選擇，制備以及向多種受試者施用 合適的草酸鹽-降解細(xì)菌的方法。主要但不是排他地，這些是在他們的 腸中沒(méi)有這些細(xì)菌的人或者動(dòng)物。利用即使在混合細(xì)菌群落中，諸如 腸渣中發(fā)現(xiàn)的相對(duì)低濃度的生物體，也可以快速并且明確檢測(cè)到0.formigenes的檢驗(yàn)可以鑒定這些沒(méi)有被定殖或者只被微弱定殖的人或 者動(dòng)物。本發(fā)明的方法還可以用于治療由于例如抗生素治療或者手術(shù) 后的情況耗盡了草酸鹽-降解細(xì)菌的個(gè)體或者動(dòng)物。本發(fā)明的方法還可 以用于治療具有草酸鹽-降解細(xì)菌的菌落但是仍然由于例如，草酸鹽敏 感性和/或過(guò)量產(chǎn)生內(nèi)源草酸鹽具有不健康草酸鹽的水平的個(gè)體或者動(dòng) 物。根據(jù)本發(fā)明可以使用的細(xì)菌可以由至少兩種方法進(jìn)行鑒定1) 可以使用這些細(xì)菌的特異性寡核苷酸探針；和/或2) 其中接種具有10 mM草酸鹽的厭氧培養(yǎng)基并在37"C培養(yǎng)1至7 天后的培養(yǎng)物檢驗(yàn)，確定草酸鹽的損失。0. formigenes菌株的純培養(yǎng)物可以在大發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)并利用 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)收獲。來(lái)自選擇的單個(gè)或者或者已知菌株的混合物的細(xì)胞可以根據(jù)需要進(jìn)行處理(例如與海藻糖或者甘油凍干;)來(lái)保存活力然后置于設(shè)計(jì)用來(lái)保護(hù)細(xì)胞通過(guò)傳代到達(dá)酸性胃的膠囊 (腸溶包衣的膠囊)中。根據(jù)個(gè)體需要確定的量和間隔攝取細(xì)胞。有時(shí)候，單個(gè)或者周期 利用可能都需要，在其它情況下可能只需要定期攝取(例如，與飲食一 起)。
本發(fā)明更進(jìn)一步涉及給人或者動(dòng)物腸道施用從草酸鹽降低生物體諸如0. formigenes細(xì)胞或者其他來(lái)源制備的草酸鹽-降解產(chǎn)物或者酶， 或者通過(guò)諸如重組體手段的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以純化草酸 鹽降解酶并制備成用于經(jīng)口消耗的藥物或者營(yíng)養(yǎng)組合物。在優(yōu)選實(shí)施 方案中，這些酶是重組產(chǎn)生的。編碼這些酶的DNA序列是本領(lǐng)域已知 的，例如描述在WO 98/16632中。這些序列，或者其他的編碼草酸鹽-降解蛋白質(zhì)的序列可以表達(dá)在合適的宿主中。宿主可以是例如E. coli 或者乳酸桿菌。轉(zhuǎn)化的宿主將包括合適的調(diào)節(jié)和運(yùn)輸信號(hào)?？梢匀绫?文所述分離，純化和施用表達(dá)的蛋白質(zhì)?；蛘?，可以施用表達(dá)所需的 草酸鹽降解蛋白質(zhì)的重組體宿主。重組體宿主可以活或者非活的形式 施用。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，酶是有涂層的或者配制或者修飾成保 護(hù)酶，使其在胃中不失活，并且在小腸中發(fā)揮其草酸鹽降解活性。這 樣的制劑的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，例如描述在美國(guó)專利5，286，495中。在這里使用的草酸鹽降解酶包括所有參與草酸鹽途徑的酶，并且 包括但不局限于草酸鹽氧化酶，草酸鹽脫羧酶，甲?；鵆oA轉(zhuǎn)移酶和 草酰-CoA脫羧酶。草酸鹽氧化酶表達(dá)在高等植物中，并催化草酸鹽氧 依賴的氧化至C02，同時(shí)伴隨11202的形成。草酸鹽氧化酶純化自許多 來(lái)源，例如大麥苗根和葉；甜菜莖葉；小麥胚芽；高粱葉；和香蕉皮。 己經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于從大麥根獲得草酸鹽氧化酶的快速三步純化方法。己 經(jīng)克隆，測(cè)序并表達(dá)了編碼大麥根草酸鹽氧化酶的基因。草酸鹽脫羧酶主要存在于真菌中。最近已經(jīng)報(bào)到了在B. subtilis 中的細(xì)菌草酸鹽脫羧酶并由yvrk基因編碼。草酸鹽脫羧酶催化游離草 酸鹽降解成C02和甲酸鹽。這些酶已經(jīng)報(bào)道在若干真菌中，包括疣孢 漆斑菌(MyrotheciumVerrucaria)，黑曲霉的某些菌株和白腐真菌，云芝。 編碼金針菇(Flammulina velutipes)草酸鹽脫羧酶的基因已被克隆并測(cè) 序；參見(jiàn)WO 98/42827。草酰-CoA脫羧酶在CoA-激活的底物上有活性并將其轉(zhuǎn)化成甲酰
基-CoA。然后甲?；鵆oA轉(zhuǎn)移酶起作用交換CoA上的甲酸鹽和草酸 鹽。在草酸鹽降解細(xì)菌，存在于土壤中的Pseudomonas oxalaticus和殘 留在包括人的脊椎動(dòng)物胃腸道中的Oxalobacter formigenes中對(duì)這些酶 進(jìn)行了研究。0. formigenes已經(jīng)顯示出與其宿主通過(guò)調(diào)節(jié)腸中吸收的 草酸以及血漿中的草酸水平為共生關(guān)系。缺少這些細(xì)菌已經(jīng)被認(rèn)為是 草酸鹽有關(guān)的紊亂，例如復(fù)發(fā)性的自發(fā)草酸鈣尿石病和回腸空腸分流 手術(shù)繼發(fā)的腸源性的高草酸尿和炎癥性腸病的危險(xiǎn)因素。描述多種草酸鹽-降解酶和編碼這些酶的基因的專利包括美國(guó)專 利5,912,125; 6,090,628禾P 6,214,980。這些專利在此處全文引入作為參 考，與具體引用一樣。術(shù)語(yǔ)草酸鹽-降解酶包括但是不局限于草酸鹽氧 化酶，草酸鹽脫羧酶，草酰-CoA脫羧酶和甲?；鵆oA轉(zhuǎn)移酶，并且包 括能夠與草酸鹽或者草酸相互作用的酶。這些酶可以源自于天然源或 者使用本領(lǐng)域已知的重組方法合成的，并且包括諸如結(jié)合部位，活性 部位或者能夠與草酸鹽或者草酸相互作用的片段的所有的片段。這個(gè) 術(shù)語(yǔ)還包括但是不局限于所有必需的輔因子，輔酶，金屬，或者酶與 草酸鹽或者草酸相互作用必需的結(jié)合或者基質(zhì)材料。本發(fā)明還包括這 些酶的所有的結(jié)合伴侶并且包括結(jié)合于或者與酶相互作用的抗體和抗 體片段。
. formigenes的使用尤其有利，因?yàn)樗遣辉谛柩踅M織環(huán)境中生 長(zhǎng)并且不產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物有毒性的化合物的厭氧菌。作為0. foraiigenes 或者重組宿主的替代，可以使用其它草酸鹽降解細(xì)菌，諸如梭菌，枯 草芽孢桿菌，假單胞菌，乳酸桿菌，雙歧桿菌?？梢允┯脧倪@樣替代 性的細(xì)菌制備的草酸鹽降解酶或者可以施用整個(gè)微生物。此外，上述的實(shí)施方案適用于馴養(yǎng)，農(nóng)業(yè)或者動(dòng)物園飼養(yǎng)的缺乏 草酸鹽降解細(xì)菌的動(dòng)物以及人類。例如，草酸鹽-降解酶和/或微生物可 以施用于寵物，諸如狗，貓，兔，雪貂，豚鼠，倉(cāng)鼠和沙土鼠以及農(nóng) 用牲畜，諸如馬，羊，牛和豬，或者用于育種目的的野生動(dòng)物，諸如 水獺。許多能夠降低草酸鹽的動(dòng)物當(dāng)被捕獲時(shí)就喪失了降低草酸鹽的能力。本發(fā)明包括恢復(fù)喪失或者還原草酸鹽還原活性的方法和組合物。本發(fā)明的一個(gè)方面包括用本發(fā)明教導(dǎo)的組合物處理從野外獲得的喪失 或者降低了草酸鹽還原活性的動(dòng)物。本發(fā)明包括用于向人或者動(dòng)物的胃腸道施用包括一或多種草酸鹽 -降解細(xì)菌， 一或多種酶，或者細(xì)菌和酶的組合的組合物的組合物和方 法。這樣的組合物和方法可有效降低草酸鹽的量和/或濃度。這樣的方法和組合物可有效治療和預(yù)防草酸鹽相關(guān)的病癥。本發(fā)明的一個(gè)方面 包括用于將草酸鹽-降解酶導(dǎo)入人或者動(dòng)物的胃腸道的組合物和方法。本發(fā)明包括向人或者動(dòng)物的胃腸道遞送一或多種草酸鹽-降解酶作為藥 物和/或營(yíng)養(yǎng)載體組合物的方法。這樣的酶包括但不限于草酸鹽氧化酶，草酸鹽脫羧酶，-CoA脫羧酶和甲?；鵆oA轉(zhuǎn)移酶。這些酶可以獲自本 領(lǐng)域公知的來(lái)源。例如，植物酶，草酸鹽氧化酶(OXO)可以純化自大麥 幼苗，草酸鹽脫羧酶可以純化自細(xì)菌或者真菌來(lái)源?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)重組法衍生草酸鹽降解酶。例如，諸如克隆，表 達(dá)和純化的重組法可用來(lái)獲得草酸鹽還原酶，例如枯草芽孢桿菌草酸 鹽脫羧酶。這樣的重組方法是本領(lǐng)域公知的。例如，通常公開(kāi)的是枯 草芽孢桿菌草酸鹽脫羧酶(YvrK)基因的克隆和表達(dá)草酸鹽脫羧酶蛋 白(YvrK)的基因已經(jīng)被克隆到pET-9a和pET-14b質(zhì)粒(Novagen， WI) 中，在強(qiáng)噬菌體T7啟動(dòng)子的控制下，用于過(guò)表達(dá)可溶性cytosolic蛋白。 表達(dá)宿主是E. coli菌株BL 21 (DE3)pLysS，缺乏蛋白酶并且含有在 lacUV5控制下的T7-RNA聚合酶基因的染色體拷貝的入DE3溶源菌。 此外，該菌株攜帶編碼T7溶菌酶的pET-相容的質(zhì)粒，所述T7溶菌酶 是切割細(xì)胞壁肽聚糖層中的鍵并抑制T7 RNA聚合酶的雙功能酶。能夠 更有力的控制未誘導(dǎo)的基態(tài)表達(dá)并使用破裂內(nèi)膜的方法，諸如凍融， 或者溫和洗滌劑，等等，來(lái)有效地裂解細(xì)胞。通過(guò)添加異丙基-e-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的表達(dá)。因此，本發(fā)明的一 個(gè)方面包括含有施用已經(jīng)通過(guò)重組微生物產(chǎn)生的草酸鹽降解酶的方
法?？梢允褂枚喾N表達(dá)載體和宿主來(lái)產(chǎn)生作為重組蛋白的草酸鹽降解 酶，并且這樣的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括通過(guò)給人或者動(dòng)物的胃腸道補(bǔ)充草酸鹽 -降解細(xì)菌降低草酸鹽吸收的方法。這樣的細(xì)菌可以包括但不限于Oxalobacterformigenes,梭菌，乳酸桿菌，雙歧桿菌以及假單胞菌。0. formigenes已經(jīng)分離自人糞便樣品并通過(guò)選擇單個(gè)菌落被克隆。包括最 初由Dr. Milton Allison在1996的Ixion生物技術(shù)獲得的分離物HC-l。 例如，可以使用人菌株HC-1的冷凍原種。本發(fā)明的方法包含使腸富集 一或多種草酸鹽降解細(xì)菌，總體降低腸渣中的草酸鹽，降低腸中吸收 的草酸鹽，降低血液和腎液中的草酸鹽濃度并降低由于草酸鹽的存在 對(duì)身體的有害作用。因此，本發(fā)明一個(gè)方面包括補(bǔ)充草酸鹽-還原細(xì)菌和草酸鹽降解酶 的組合物和方法，所述還原細(xì)菌和草酸鹽降解酶可以降低具有草酸鹽-相關(guān)疾病和/或病癥的高危人腸道中的草酸鹽。這樣的疾病和病癥包括 但不限于高草酸尿，原發(fā)性高草酸尿，自發(fā)草酸鈣腎結(jié)石疾病(尿石病)， 腸源性高草酸尿，慢性陰部疼痛，與晚期腎病有關(guān)的草酸過(guò)多癥，心 臟傳導(dǎo)失調(diào)，炎癥性腸病，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，進(jìn)行回腸空 腸分流外科手術(shù)的人，具有不充分濃度的草酸鹽降解細(xì)菌的人，及其 它腸疾病。進(jìn)行抗生素治療，化學(xué)治療或者其它治療改變了腸內(nèi)菌叢 的人和動(dòng)物可用本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行治療。本發(fā)明可用于恢復(fù) 腸內(nèi)菌叢改變的人或者動(dòng)物的草酸鹽還原能力。尿草酸鹽排泄水平的 提高促進(jìn)腎結(jié)石的形成，有助于腎瘢痕，并且甚至可以引起腎衰竭。 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面包括降低腎結(jié)石的形成的組合物和方法。腸中草酸鹽總濃度的減少還可以使草酸鹽從細(xì)胞和體循環(huán)除去。 更具體地說(shuō)，腸中草酸鹽濃度的降低還可以引起草酸鹽從血液向腸分 泌的加強(qiáng)。盡管不希望受到任何特定理論的限制，人們相信存在草酸 鹽從腸消除的跨上皮梯度。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面包括通過(guò)促進(jìn)草
酸鹽從血液經(jīng)草酸鹽的跨上皮梯度排泄用于結(jié)腸草酸鹽排泄，用于降 低血液草酸鹽的水平以及提高草酸鹽排泄的組合物和方法。本發(fā)明的 方法包括給人或者動(dòng)物的腸提供用于降低草酸鹽濃度或者人或者動(dòng)物 的水平的組合物。這樣的降低可以包含降低腸中，血液中，血清中， 組織液中和其它體液中發(fā)現(xiàn)的草酸鹽的量。本發(fā)明的一個(gè)組合物包括制備用于口服的0. formigenes糊劑。對(duì) 于每一批0. formigenes糊劑，HC-1的單原種瓶用于產(chǎn)生種子培養(yǎng)以便 啟動(dòng)大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵的生長(zhǎng)。來(lái)自每一發(fā)酵的細(xì)菌通過(guò)離心收集并與 防冷凍的賦形劑混合，所述賦形劑提供對(duì)冷凍干燥的保護(hù)作用。細(xì)胞 糊劑還可以進(jìn)行冷凍干燥產(chǎn)生具有107到109 CFUs/克的效價(jià)的細(xì)粉末。 將所產(chǎn)生的粉末置入腸溶包衣的用于向小腸安全遞送細(xì)菌的膠囊中。本發(fā)明的組合物包含由一或多種草酸鹽-還原細(xì)菌的提取物制成 的組合物，范圍從約103到約1(^cfus/克，從約103到約10^cfus/克， 從約105到約1012cfus/gram，從約105到約10"cfus/克，從約107到約 10、fus/克，從約107到約1()8cfus/克以及在這些范圍之間的所有范圍。本發(fā)明的組合物還包括含有一或多種具有還原草酸鹽活性的酶的 組合物。本發(fā)明的一個(gè)方面包括給人或者動(dòng)物的胃腸道施用有效量的 酶組合物。有效量的酶組合物能夠還原腸中部分草酸鹽或者使人或者 動(dòng)物的草酸鹽濃度從施用該組合物之前測(cè)定的水平降低。這樣的測(cè)定 可以是測(cè)定存在于食物來(lái)源的腸中的草酸鹽或者可以是類似血液或者 尿液的體液中測(cè)定的水平。本發(fā)明包括向人或者動(dòng)物的胃腸道施用含有0. formigenes的組合 物的方法。受試者優(yōu)選劑量給藥含有^10、fus的活0. formigenes細(xì)胞 的腸衣膠囊。這樣的劑量給藥優(yōu)選每天發(fā)生兩次，伴隨兩次正餐。本 發(fā)明還包括施用含有一或多種草酸鹽還原微生物， 一或多種草酸鹽還 原酶或者其組合的草酸鹽還原組合物的方法。本發(fā)明的方法含有至少 一天一次施用有效量的草酸鹽還原組合物，其中草酸鹽還原組合物含 有一或多種草酸鹽還原酶。該方法還包括施用這樣的組合物每天超過(guò) 一次，每天超過(guò)兩次，每天超過(guò)三次，并且在每天1到15次的范圍內(nèi)。 這樣的施用可以連續(xù)地每天進(jìn)行持續(xù)幾天，幾周，幾個(gè)月或者幾年， 或者可以發(fā)生在治療或者預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥的特定時(shí)間。例如，可 以給人或者動(dòng)物施用草酸鹽還原組合物至少一天一次共幾年來(lái)治療或 者預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥，或者可以給人或者動(dòng)物施用草酸鹽還原組合物至少一天一次僅僅當(dāng)攝取含有草酸鹽的食物時(shí)，或者限定的時(shí)件段，諸如幾天或者幾周，依照干擾正常細(xì)菌群落的進(jìn)程或者治療。這樣的給藥可以發(fā)生在藥物給藥已知的整個(gè)過(guò)程。通過(guò)口服或者腸途徑給藥 或者與食物材料結(jié)合的給藥也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。人們注意到，在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式的"a"， "an"和"the"包括復(fù)數(shù)對(duì)象除非上下文另有清楚的指示。在這里包括的所有專利，專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)在這里具體地全文 引入作為參考。當(dāng)然，應(yīng)該理解上述僅僅涉及本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，而且可以 進(jìn)行很多的修改或者變化，只要不背離在本發(fā)明闡述的本發(fā)明的精神 和范圍。下面是說(shuō)明用于實(shí)施本發(fā)明的方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)該 以任何方式被理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。相反地，應(yīng)該清楚地理 解，在閱讀了在這里描述后可以暗示本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行多種其它實(shí) 施方案，修改和其等價(jià)物，只要不背離本發(fā)明的精神和/或權(quán)利要求的 范圍。實(shí)施例1 高?；颊叩闹委?br> 用含有冷凍干燥O.formigenes粉末的腸溶包衣膠囊喂養(yǎng)原發(fā)性高 草酸尿病人每天兩次，優(yōu)選與它們每天的兩次正餐一起進(jìn)食。每個(gè)規(guī) 格-2膠囊含約137毫克包括至少l()S個(gè)集落形成單位(CFUs) /克的冷凍 干燥的散粉末。對(duì)于高危受試者而言，可能需要終生的治療。對(duì)受試者進(jìn)行的臨 床研究表明當(dāng)停止治療時(shí)定殖現(xiàn)象減少了。在臨床研究中，進(jìn)行4周 的治療并且根蹤兩周的時(shí)間。4周的治療導(dǎo)致血液中的草酸鹽水平與基 本水平相比顯著下降了。但是在根蹤過(guò)程中，大便計(jì)數(shù)中的草酸桿菌 減少了且血漿和尿液草酸鹽值開(kāi)始增加了。因此，有人提出需要連續(xù) 服用降低草酸鹽的組合物來(lái)提供降低的草酸鹽條件。含有可在內(nèi)臟中定殖和形成的細(xì)菌的組合物可導(dǎo)致對(duì)施用較少草酸鹽-降低組合物的需 求。0. formigenes細(xì)胞的腸溶包衣膠囊可被處于草酸鹽相關(guān)疾病高危 狀態(tài)的病人群體攝食。這些人包括1. 由于例如遺傳缺損類原發(fā)性高草酸尿產(chǎn)生過(guò)多內(nèi)源草酸鹽的人2. 由于腸道疾病(腸源性-高草酸尿)處于具有高尿草酸鹽的尿石 病危險(xiǎn)中的人3. 具有尿石病病史患有多急性發(fā)作自發(fā)性結(jié)石病的人。4. 由于晚期腎病具有高血清草酸鹽水平的人。5. 具有外陰前庭炎的人。6. 諸如在印度和沙特阿拉伯的某些特定地區(qū)和季節(jié)食用高水平草 酸鹽的人。這些也包括偶然優(yōu)先選用草酸鹽含量高諸如菠菜的食物的 個(gè)體。本發(fā)明的組合物提供給了上述的任意人或者動(dòng)物。例如，對(duì)具有 比正常內(nèi)源草酸鹽水平高的人每天用設(shè)計(jì)用于將其內(nèi)含物遞送到大腸 的膠囊治療兩次，其中的膠囊含有約106cfus的a/or/m'gw^。膠囊優(yōu) 選與食物一起施用。
實(shí)施例2低?；颊叩闹委熌c衣保護(hù)的a/onm'gen"細(xì)胞，諸如在腸溶包衣膠囊中提供的， 還可以被處于較低草酸鹽相關(guān)疾病危險(xiǎn)中的個(gè)體攝食。理想地，在用 含有草酸鹽-降低物質(zhì)諸如草酸鹽-還原細(xì)菌的組合物治療一兩次的這 些病人中定殖。這些病人還可以定期接受草酸鹽-降低物質(zhì)的治療，作為補(bǔ)充物或作為食品諸如奶或酸奶的添加劑。這些包括1. 由于用口服抗生素治療或痢疾性疾病而喪失正常的草酸鹽降解 細(xì)菌群體的人。2. 可接種嬰兒使得當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性排斥原理起作用時(shí)正常的草酸桿菌保 護(hù)性群體比隨后的生命階段更容易形成。對(duì)處于低危險(xiǎn)中的人或動(dòng)物用設(shè)計(jì)用于將內(nèi)含物遞送到大腸的膠 囊治療一天兩次，其中膠囊含有至少107 cfus的一或多種降低草酸鹽 的生物，諸如a/o^m'geMM。優(yōu)選地，膠囊與食物一起施用。實(shí)施例3使用來(lái)自O(shè)ca/o6a"er/o環(huán)/gw"的草酸鹽降解酶來(lái)控制高草酸尿 進(jìn)行研究來(lái)評(píng)價(jià)來(lái)自O(shè)m/o^c^/orm/geww的草酸鹽降解酶控制 高草酸尿的效力。使用的動(dòng)物雄性斯普拉格道利(Sprague Dawley)大鼠體重 250-300 g使用的食譜正常的食譜(N. D.): Harlan TekladTD 89222; 0.5% Ca， 0.4% P使用的藥物Oc"/o幻cto"/ormZgwM裂解物(酶源)與草酰CoA， MgCh和TPP的冷凍干燥的混合物。藥物遞送系統(tǒng)(膠囊)規(guī)格9膠囊用于臨床前大鼠研究 (Capsu-Gel)。腸溶包衣Eudragit L-100-55 ( Hulls America, Inc.)。 24小 時(shí)尿液的基線收集。糞便的Ora/o6a"er /orm/g^M分析-大鼠沒(méi)有 (9x"/o6a"er/o簡(jiǎn)/ge"es定殖。
實(shí)驗(yàn)方案A. 長(zhǎng)期研究動(dòng)物方案組l(n-4):喂養(yǎng)草酸鹽與裂解物。大鼠每天在4:00p.m.施用兩 個(gè)膠囊并且在前一天晚上喂食草酸鹽。在白天不給予草酸鹽飲食(8: 00 a. m.至4: 00 p.m.)。組n(n-4):如組i所述喂養(yǎng)草酸鹽飲食(高草酸尿?qū)φ?。在上述治療的第7天和第9天收集24小時(shí)尿液樣品。以上的兩個(gè)組的大鼠平均尿草酸鹽濃度的數(shù)據(jù)顯示與高草酸尿 (對(duì)照組II)相比，喂養(yǎng)草酸桿菌裂解物降低了組I的尿草酸鹽濃度。酶 在胃腸道中不能長(zhǎng)時(shí)間有活性；因此，進(jìn)行如下所述的短期研究。B. 短期研究動(dòng)物方案組I (n = 4):在8:00a.m.喂養(yǎng)1個(gè)膠囊；給草酸鹽飲食兩個(gè)小時(shí)(大鼠禁食過(guò)夜使得它們?cè)谶@個(gè)期間食欲最佳)并且在上午io:oo喂食i個(gè)膠囊。組lI(n-4):如組I所述施用草酸鹽飲食兩個(gè)小時(shí)。 收集所有動(dòng)物接下來(lái)5小時(shí)的時(shí)間的尿液并且分析其草酸鹽的濃度。在第11,12和15天進(jìn)行這些研究。這些研究結(jié)果表明與高草酸尿?qū)φ战M(組II)相比，給予草酸桿菌裂 解物導(dǎo)致組I大鼠給藥草酸鹽和藥物后5小時(shí)時(shí)間中尿草酸鹽的水平顯 著下降。在兩個(gè)大鼠組之間進(jìn)行交叉研究。C. 交叉研究 動(dòng)物方案
組I :每天在上午8 : 00-10:00和下午3 : 00-5:00給與草酸鹽飲食兩次。組n:在給組i喂草酸鹽飲食之前每天每次喂食l個(gè)膠囊共兩次。如部分-B所述，在交叉研究后第2天和第5天進(jìn)行喂食草酸桿菌裂解物對(duì)尿草酸鹽水平的影響的短期研究。交叉研究表明先前高草酸尿的II組大鼠，其被喂食草酸桿菌裂解 物，顯示出尿草酸鹽水平的下降。相反，組-I大鼠因停止藥物回復(fù)為高 草酸尿癥。實(shí)施例4用Ox"/o6a"er/o簡(jiǎn)Zgg"es細(xì)胞治療大鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)當(dāng)Ora/o/^c^/o，/gs"細(xì)胞被包含在飲食中時(shí)，飲食 草酸鹽的去向的研究。方法在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，給雄性威斯塔大鼠喂養(yǎng)正常的鈣(1%)，高草酸鹽(0.5%)飲食，或低鈣(0.02%)，高草酸鹽飲食(0.5%)。在研究 的第1天和第7天給予"C-草酸鹽(2.0y Ci)。在第5-11天，通過(guò)大鼠 飲用水施用Oxa/oMcter/orm/ge""細(xì)胞(380 mg/d)。基于對(duì)糞便、尿液 和呼出氣中"C的分析測(cè)定來(lái)自草酸鹽的"C的去向。大鼠自身用作對(duì) 照并在第1-4天進(jìn)行對(duì)照期間(喂養(yǎng)草酸桿菌細(xì)胞之前)的測(cè)定；在第 7-11天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)期間(當(dāng)喂養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞時(shí))的測(cè)定。結(jié)果1.當(dāng)大鼠給予正常的(r/。)鈣飲食時(shí)，在呼出氣中回收到小于1% 的施用劑量的來(lái)自草酸鹽的"C(如腸中由'"C草酸鹽產(chǎn)生的二氧化碳， 被吸收到血液中然后被呼出)，然而，在所有
反，當(dāng)大鼠進(jìn)料草酸桿菌細(xì)胞時(shí)在實(shí)驗(yàn)期間在呼出氣中回收到超過(guò)50% 來(lái)自草酸鹽的14c為二氧化碳的形式(圖lb)。這些結(jié)果與在對(duì)照期間(給 予草酸桿菌細(xì)胞前)回收到的非常低量的"C(小于5%)明顯不同。因此 將Ocfl/o6acter/ormZgew^細(xì)胞喂食于大鼠顯著地增加了在腸道中降解 的飲食草酸鹽的量。2.喂食草酸桿菌細(xì)胞也降低了在尿液排泄的"C-草酸鹽的量。在對(duì) 照和實(shí)驗(yàn)期間收集4天的值以及在這些期間的單一一天的值分別顯示 于附圖2a和2b中。在大鼠糞便中回收的草酸鹽的量在實(shí)驗(yàn)時(shí)間期間(給 予草酸桿菌細(xì)胞時(shí))也比對(duì)照期間的量降低(圖2c)。大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室大鼠在它們的腸道中不攜帶草酸桿菌(它們不定 殖)。此結(jié)果表明有目的地將這些草酸鹽降解細(xì)菌施用于大鼠導(dǎo)致大部 分的飲食草酸鹽被降解，而且因此較少的來(lái)自飲食的草酸鹽被排泄在 尿液中。飲食鈣對(duì)草酸鹽降解的作用是顯著的。鈣與草酸鹽的復(fù)合物使其 溶解度和被草酸桿菌攻擊的利用率得到限制，并且當(dāng)大鼠喂食高鈣飲 食時(shí)其降解的量比當(dāng)飲食中低鈣時(shí)降解的量少得多。喂食a/Mm/ga"對(duì)豬尿草酸鹽排泄的影響豬天然定殖草酸桿菌。通過(guò)飲食補(bǔ)充抗生素在實(shí)驗(yàn)豬中實(shí)現(xiàn)去定 殖。將培養(yǎng)肉湯中的草酸桿菌喂食給豬，很容易被吸收。豬也被喂養(yǎng) 基于大豆/谷物的飼料，所述詞料補(bǔ)充有1300毫克草酸鹽/公斤?；?飲食中含有680 mg草酸鹽/ kg。三只個(gè)體豬的結(jié)果顯示于圖3a-c中。在所有三只豬的草酸桿菌消耗過(guò)程中，尿草酸鹽顯著降低。在這 三只豬中，草酸鹽排泄的水平降低到最少約6 mg/g肌酐。這與在采取 無(wú)草酸鹽規(guī)則飲食的人中觀察到的8-10mg/g肌酐的水平相當(dāng)。此水平
等于飲食裝載已被消除的人體內(nèi)源合成的水平?？瓷先ミ@個(gè)水平反映 了豬的內(nèi)源合成而且腸吸收已經(jīng)通過(guò)草酸桿菌治療被消除。此外，這 些結(jié)果表明攝食的草酸桿菌能夠除去添加的結(jié)晶草酸鹽以及可生物利 用的食物-來(lái)源的草酸鹽。在該實(shí)驗(yàn)中，各只豬被喂養(yǎng)1.0 g的細(xì)胞糊狀物作為早餐。在0.6的O.D6。。，活細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.1 xl()S細(xì)胞/毫升，其外推至2.1xlO"細(xì)胞/100 L。 100 L發(fā)酵罐運(yùn)轉(zhuǎn)為我們提供了平均來(lái)說(shuō)50-60 gm濕重的細(xì)胞。因 此，lgm濕重的細(xì)胞為大約3.5xl()H的活細(xì)胞。如上所述的3.5x1011活細(xì)胞的劑量可消除每公斤飲食存在的約2.0 gm草酸鹽的腸吸收(1300mg添加的草酸鹽+ 680 mg存在于飲食的草酸 鹽)。動(dòng)物每一餐消耗1 kg飲食。豬的體重大約為200磅且豬的消化系統(tǒng)被認(rèn)為非常接近于人的消 化系統(tǒng)。取決于飲食組成，人的草酸鹽平均日消耗量為大約100-400 毫克，其也分成三餐/天，因此108至l(T活細(xì)胞的平均日劑量足以預(yù) 防草酸鹽的飲食吸收。實(shí)施例60. /orm/gw^補(bǔ)充物對(duì)喂養(yǎng)高草酸飲食的大鼠的尿草酸排泄的影響進(jìn)行研究來(lái)測(cè)定IxOC-3制劑對(duì)定殖狀況以及高草酸飲食后尿草 酸水平的影響。IxOC-3制劑含有草酸還原細(xì)菌的冷凍干燥活細(xì)胞，諸 如a/onm'ge/^。該制劑含有大約10、10、fus/克每劑量。制劑也含有 cyropreservation試齊U ， 諸如trehelose禾口麥芽糊精。方法將雄性哈倫斯普拉格道利(Harlan Sprague Dawley)大鼠隨機(jī)分配 為3個(gè)組(6個(gè)動(dòng)物/組)。組1的動(dòng)物用作對(duì)照組并以10。集落形成單位(CFU)的劑量水平每天兩次通過(guò)口服施用規(guī)格9的腸溶衣安慰劑制劑。 通過(guò)分別口服106和107CFUs的劑量水平對(duì)組2和3的動(dòng)物以規(guī)格9 腸溶衣膠囊的形式施用Ocfl/o^"er/orm/gew"IxOC-3制劑。填喂膠囊 后，通過(guò)用高壓滅菌的自來(lái)水沖洗所有的三個(gè)組。最初的適應(yīng)時(shí)間之 后，對(duì)所有的組喂食補(bǔ)充每克1%草酸的標(biāo)準(zhǔn)飲食。遵循標(biāo)準(zhǔn)方案制備試驗(yàn)材料和安慰劑對(duì)照。在使用前，分析各試 驗(yàn)材料的代表樣品來(lái)證實(shí)同一性、純度以及試驗(yàn)?zāi)z囊的效力，以及來(lái) 證實(shí)劑量給藥期間安慰劑對(duì)照材料中不存在axa/o^"er/or甜'gew^。飲食被限制在早晚兩次填喂15分鐘之后的1小時(shí)內(nèi)以確保膠囊被 空腹給藥。水不限量供給。每天記錄食物消耗兩次。在第1天(草酸補(bǔ) 充物飲食前)以及此后一周一次收集糞便以及24小時(shí)的尿液樣品。通過(guò) 重復(fù)的測(cè)定分析分析尿液數(shù)據(jù)中交叉劑量組以及時(shí)間的平均尿參數(shù)的 差異。也包括劑量組與時(shí)間的相互關(guān)系來(lái)評(píng)價(jià)劑量組和時(shí)間之間任意 可能的相互關(guān)系。結(jié)果分析結(jié)果顯示劑量組和時(shí)間之間有統(tǒng)計(jì)上顯著的相互關(guān)系 (pO.OOOl)，因?yàn)樗袇?shù)表明尿參數(shù)與時(shí)間交叉的分布不同于與劑量 組交叉的分布。為有助于解釋這些相互關(guān)系，根據(jù)各參數(shù)的時(shí)間點(diǎn)對(duì) 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來(lái)測(cè)定劑量組的平均尿參數(shù)之間是否有差異。這些分析 顯示對(duì)于小劑量和高劑量組，從開(kāi)始到第7天尿草酸鹽增加了(兩個(gè)組 的p<0.0001)，但是從第7天到第28天沒(méi)有增加(p = 0.1094小劑量和p =0.6910高劑量)。然而，安慰劑組從開(kāi)始到第28天有增加(p《.0010)。 同樣在21天和28天，安慰劑組I中的平均尿草酸鹽水平顯著地高于低 劑量組(組II)和高(組III)劑量組，但是低劑量和高劑量之間沒(méi)有顯著性 差異。因此，與喂食安慰劑的大鼠相比，治療的大鼠的尿草酸鹽排泄 明顯降低了。
實(shí)施例7口服對(duì)患原發(fā)性高草酸尿(PH)病人的尿草酸鹽水平 的影響。方法有九個(gè)用活組織檢査證明患有原發(fā)性高草酸尿(PH)病人參與該研 究。接收開(kāi)始的基本評(píng)價(jià)后，所有受試者與主餐一起施用Ocfl/oZ^c^ /orm/ge"^ 1 g細(xì)胞糊狀物O10"cfus/克)持續(xù)4周。在此期間，所有病 人繼續(xù)接受正常的藥物治療，食用正常的飲食，并且保持它們的液體 攝入和正常的一樣高。除了菠菜和大黃根，不禁用高草酸鹽的食物。 在第5和6周測(cè)定草酸桿菌定殖及其對(duì)尿和草酸鹽血漿水平的影響。 跟蹤具有正常腎功能的受試者的尿草酸鹽排泄以及患有晚期腎病 (ESRD)的受試者的血漿草酸鹽來(lái)評(píng)價(jià)療效。結(jié)果1. 治療證明了具有正常尿功能的受試者的尿草酸鹽顯著的下降。 九個(gè)受試者之中有七個(gè)受試者的血漿草酸鹽顯著降低?；糆SRD的兩 個(gè)受試者的血槳草酸鹽急劇下降，證明腸道消除了進(jìn)入內(nèi)臟中的內(nèi)源 性草酸鹽以免跨上皮梯度。2. 每一餐消耗從0.25g到2.0g的a/onw'ge"^菌株HC-1可以被接收包含平均或高草酸鹽水平飲食的正常、健康的志愿者所容忍。持 續(xù)28天每天兩次1.0 gm細(xì)胞糊狀物的劑量可以被PH病人較好的耐受。實(shí)施例8用草酸鹽還原酶組合物治療高危病人對(duì)原發(fā)性高草酸尿病人施用一或多種包含凍干草酸鹽-還原酶組 合物腸溶包衣膠囊，所述組合物包括草酸脫羧酶和/或草酸鹽氧化酶， 優(yōu)選與每天的兩次正餐一起每天兩次施用。施用有效量的酶組合物。
例如，每個(gè)規(guī)格-2的膠囊包含大約5-100單位的各種酶。對(duì)于高危受試者而言，應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)給藥，或許是終生性的治 療。當(dāng)治療停止時(shí)，定殖將下降。含有草酸鹽還原酶的草酸鹽還原組合物的腸溶衣膠囊可施用于處 于草酸鹽相關(guān)疾病高危狀態(tài)的病人群體。這些人包括1. 由于例如遺傳缺損類原發(fā)性高草酸尿產(chǎn)生過(guò)多內(nèi)源草酸鹽的人2. 由于腸道疾病(腸源性-高草酸尿)處于具有高尿草酸鹽的尿石病危險(xiǎn)中的人3. 具有尿石病病史患有多急性發(fā)作自發(fā)性結(jié)石病的人。4. 由于晚期腎病具有高血清草酸鹽水平的人。5. 具有外陰前庭炎的人。6. 諸如在印度和沙特阿拉伯的某些特定地區(qū)和季節(jié)食用高水平草 酸鹽的人。這些也包括偶然優(yōu)選用草酸鹽含量高諸如菠菜的食物的個(gè)體。將本發(fā)明的組合物提供給了上述的任意人或者動(dòng)物。例如，用設(shè) 計(jì)用于將其內(nèi)容物遞送到大腸內(nèi)的膠囊對(duì)具有比正常內(nèi)源草酸鹽水平 更高水平的人一天治療兩次，其中膠囊包含大約具有類似于通過(guò)107 cfus的草酸鹽-降低細(xì)菌，例如a/orm/ge^^提供的酶活性的有效量的 酶組合物。膠囊優(yōu)選與食物一起施用。實(shí)施例9用草酸鹽還原酶組合物治療低危病人還可以將包括草酸鹽還原酶，草酸鹽脫羧酶和/或草酸鹽氧化酶的 混合物的腸衣保護(hù)的草酸鹽降低組合物，例如以在腸溶衣膠囊中提供 的，施用于草酸鹽-有關(guān)疾病的低危人群或具有患草酸鹽-有關(guān)病征危險(xiǎn)的人群。以理想的治療方案施用有效量的酶組合物。理想地，將組合物施用于這些他們處于草酸鹽-相關(guān)病征的危險(xiǎn)中 的病人時(shí)較短的時(shí)間或與有助于改善草酸鹽-相關(guān)病征的物質(zhì)一起施 用。這些病人還可以有規(guī)律地接收草酸鹽-降低組合物的治療，作為食 品例如乳或酸奶酪的補(bǔ)充物或添加劑。這些包括因口服抗生素治療或 患痢疾喪失正常草酸鹽降解細(xì)菌菌群的人或嬰幼兒。低危的人或動(dòng)物用設(shè)計(jì)用于將其內(nèi)容物遞送到大腸的膠囊治療一 天兩次，其中膠囊含有有效量的酶組合物。例如，每個(gè)規(guī)格-2的膠囊含有約5-100個(gè)單位的每種酶。膠囊優(yōu)選與食物一起施用。應(yīng)該理解，在這里描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅用于說(shuō)明性的目 的。且對(duì)其進(jìn)行各種的修飾或改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)時(shí)顯而易見(jiàn) 的，并且這些被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.降低草酸鹽濃度的方法，包括，給人和動(dòng)物施用有效量的包含一或者多種草酸鹽還原酶的組合物，其中該量可以有效降低所存在的草酸鹽的比例。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中的一或者多種草酸鹽還原酶為草酸鹽 氧化酶，草酸鹽脫羧酶，草酰-CoA脫羧酶或甲?；?CoA轉(zhuǎn)移酶或其組
3. 權(quán)利要求1的方法，其中的一或者多種草酸鹽還原酶來(lái)自所有來(lái)源。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中的草酸鹽還原酶是重組產(chǎn)生的。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括輔酶，輔因子， 底物和其他草酸鹽降解途徑的替代物。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中的組合物包括腸溶衣。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中通過(guò)口服施用途徑進(jìn)行施用。
8. 治療草酸鹽相關(guān)病癥的方法，包括，給人和動(dòng)物施用有效量的包含一或者多種草酸鹽還原酶的組合 物，其中該量可以有效降低人和動(dòng)物體內(nèi)所存在的草酸鹽的比例。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中的一或者多種草酸鹽還原酶為草酸鹽 氧化酶，草酸鹽脫羧酶，草酰-CoA脫羧酶或甲?；?CoA轉(zhuǎn)移酶或其組
10. 權(quán)利要求8的方法，其中的一或者多種草酸鹽還原酶來(lái)自所 有來(lái)源。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中的草酸鹽還原酶是重組產(chǎn)生的。
12. 權(quán)利要求8的方法，其中的組合物包括腸溶衣。
13. 權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)口服施用途徑進(jìn)行施用。
14. 權(quán)利要求8的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括輔酶，輔因子， 底物和其他草酸鹽降解途徑的替代物。
15. 權(quán)利要求8的方法，其中的組合物每天施用超過(guò)一次。
16. 預(yù)防草酸鹽相關(guān)病癥的方法，包括，給人和動(dòng)物施用有效量的包含一或者多種草酸鹽還原酶的組合 物，其中該量可以有效降低人和動(dòng)物體內(nèi)所存在的草酸鹽的比例。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中的一或者多種草酸鹽還原酶為草酸 鹽氧化酶，草酸鹽脫羧酶，草酰-CoA脫羧酶或甲?；?CoA轉(zhuǎn)移酶或其組合。
18. 權(quán)利要求16的方法，其中的一或者多種草酸鹽還原酶來(lái)自所 有來(lái)源。
19. 權(quán)利要求16的方法，其中的草酸鹽還原酶是重組產(chǎn)生的。
20. 權(quán)利要求16的方法，其中的組合物包括腸溶衣。
21. 權(quán)利要求16的方法，其中通過(guò)口服施用途徑進(jìn)行施用。
22.權(quán)利要求16的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括輔酶，輔因子， 底物和其他草酸鹽降解途徑的替代物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于降低人、動(dòng)植物中的草酸鹽的方法和組合物。例如，本發(fā)明提供了將一或多種草酸鹽-還原酶遞送到人和動(dòng)物腸道中的方法和組合物。該方法和組合物可用于治療和預(yù)防草酸鹽-相關(guān)的病癥。
文檔編號(hào)A61K35/74GK101166421SQ200580024172
公開(kāi)日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2005年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月15日
發(fā)明者哈梅特·錫杜 申請(qǐng)人:奧克斯泰拉公司