專利名稱：(二芳基－甲基)－丙二腈和它們作為雌激素受體配體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及(二芳基-甲基)-丙二腈化合物以及它們作為雌激素受體配體的用途。
背景技術(shù)：
雌激素受體配體抑制炎癥基因表達(dá)(引起細(xì)胞因子、趨化因子、黏著分子和炎癥酶的減少)的能力被認(rèn)為提供了治療疾病例如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞(MI)、充血性心力衰竭(CHF)、炎性腸疾病和關(guān)節(jié)炎的炎癥成分的手段。這類分子的其他潛在治療適應(yīng)癥包括II型糖尿病(Cefalu，J.WomensHealth & Gender-basedMed.，2001，10，241和Yuan等人，Science，2001，293，1673)、骨關(guān)節(jié)炎(Pelletier等人，Arthr.& Rheum.，2001，441237和Felson等人，Curr Opinion Rheum，1998，10，269)、哮喘(Chin-Chi Lin等人，Immunol. Lett.，2000，73，57)、阿爾茨海默病(Roth，A.等人，J.Neurosci.Res.，1999，57，399)和自身免疫病例如多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
這些慢性炎癥病癥的共同成分被懷疑是通過(guò)細(xì)胞因子和引起它們募集的黏著分子的表達(dá)增加而造成多形核白細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)入損傷的部位。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL-6)的超量產(chǎn)生與慢性炎癥的狀態(tài)有關(guān)(BauerM.A.，Herrmann F.，Ann.Hematol.，1991，62，203)。IL-6基因的合成通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)而受到誘導(dǎo)。在炎癥過(guò)程的這一步進(jìn)行干預(yù)被認(rèn)為可有效地調(diào)節(jié)在這些慢性病癥中出現(xiàn)的未受控制的增生過(guò)程。
在內(nèi)皮細(xì)胞中，17β-雌二醇(E2)以雌激素受體(ER)依賴方式抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB報(bào)道基因活性和IL-6的表達(dá)(Kurebayashi S.等人，J.SteroidBiochem.Molec.Biol.，1997，60，11)。這據(jù)說(shuō)與E2的體內(nèi)抗炎作用有關(guān)，如已經(jīng)在炎癥的不同動(dòng)物模型中得到確認(rèn)。在動(dòng)脈粥樣硬化的模型中，E2顯示可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性和功能，并減少白細(xì)胞粘連和內(nèi)膜積聚(Adams，M.R.等人，Arterio.，1990，1051，Sullivan，T.R.等人，J.Clin.Invst．1995，96，2482，Nathan，L.等人，Circ. Res.，1999，85，377)。在心肌梗塞(Delyani，J.A.等人，J.Molec.Cell.Cardiol.，1996，28，1001)和充血性心力衰竭的動(dòng)物模型中也已經(jīng)證實(shí)了血管壁上雌激素的相似作用。在臨床上，已經(jīng)證實(shí)雌激素替代療法(ERT)在同時(shí)患有CHF(Reis等人，J.Am.Coll.Cardio.，2000，36，529)和MI(Grodstein，F(xiàn).等人，Ann.Int.Med.，2000，133，933，Alexander等人，J.Am.Coll.Cardio.，2001，38，1和Grodstein F.等人，Ann.Int.Med，2001，135，1)的患者中可降低死亡的風(fēng)險(xiǎn)。在ERT中，臨床研究證實(shí)了E2在降低β-淀粉狀蛋白1-42(Aβ42)——在阿爾茨海默病中老年斑形成關(guān)鍵肽——產(chǎn)生中的影響(Schonknecht，P.等人，Neuroscci. Lett.，2001，307，122)。
但是，17-β-雌二醇也強(qiáng)烈刺激肌酸激酶的表達(dá)。所以，已經(jīng)證實(shí)在ERT中的一些潛在的不可取副作用，如在使用的第一年中心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)增加(Hulley，S.等人，J.Am.Med．Assoc.，1998，280，605)，以及在子宮和乳房組織中的增生作用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及能夠用作雌激素受體配體的化合物。這一類型的優(yōu)選化合物是(二芳基-甲基)-丙二腈。在某些實(shí)施方案中，這類化合物為下式化合物
其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地是氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基、硝基、氰基、烷硫基、CF3、OCF3或OH；且R4為氫、烷基、鏈烯基、芳基烷基、環(huán)烷基-甲基或雜環(huán)基-烷基；條件是R1、R2、R3和R4中至少一個(gè)不是氫；和其可藥用鹽、水合物和溶劑合物。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含一種或多種雌激素受體配體和可藥用載體的藥物組合物。
在其他方面，本發(fā)明涉及在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制慢性炎性疾病的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明化合物。
這類疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、幼年關(guān)節(jié)炎、炎性腸疾病、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、不確定性結(jié)腸炎、銀屑病、哮喘和慢性梗阻性肺疾病。
本發(fā)明也涉及在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制中風(fēng)、缺血或再灌注損傷的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明化合物。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物中降低膽固醇、甘油三酯、Lp(a)和LDL的水平；抑制或治療高膽固醇血癥、高脂血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征、周圍血管疾病、再狹窄或血管痙攣的方法。
仍在其他方面，本發(fā)明的化合物可用于在哺乳動(dòng)物中治療或抑制阿爾茨海默病、認(rèn)知減退、老年癡呆或II型糖尿病。
發(fā)明詳述本發(fā)明優(yōu)選的化合物為在人內(nèi)皮細(xì)胞中以ER依賴性方式阻滯白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)螢光素酶報(bào)道基因活性或白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá)的那些?？捎糜诒景l(fā)明的化合物優(yōu)選不顯示或僅顯示少量與體內(nèi)雌激素有關(guān)的對(duì)子宮和乳房組織的增生作用。在體外通過(guò)肌酸激酶(CK)-典型的雌激素反應(yīng)基因-表達(dá)的缺乏可確認(rèn)不存在雌激素的副作用。本文所述的化合物預(yù)期證明可用于治療和預(yù)防慢性炎性疾病而不會(huì)象典型的雌激素一樣刺激子宮和乳房細(xì)胞的增生。
本發(fā)明的化合物包括(二芳基-甲基)-丙二腈。在一些方面，該化合物可用下式表示 其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地是氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基、硝基、氰基、烷硫基、CF3、OCF3或OH；且R4為氫、烷基、鏈烯基、芳基烷基、環(huán)烷基-甲基或雜環(huán)基-烷基；條件是R1、R2、R3和R4中至少一個(gè)不是氫，和其可藥用鹽、水合物和溶劑合物。
在某些化合物中，R4優(yōu)選是H。在其他的化合物中，R4為烷基、鏈烯基、芳基烷基、環(huán)烷基-甲基或雜環(huán)基-烷基。
在一些實(shí)施方案中，R1、R2、R3中至少一個(gè)是鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基、硝基、氰基、烷硫基、CF3、OCF3或OH。
在一些化合物中，R1和R2優(yōu)選各自獨(dú)立地是氫、鹵素、烷基、烷氧基、氰基、CF3或OH。在某些這些化合物中，R1和R2是相同的。在其他化合物中，R3優(yōu)選是氫、烷基、鏈烯基、烷基芳基或雜環(huán)基-甲基。在某些實(shí)施方案中，R1和R2各自獨(dú)立地是氫、鹵素、烷基或烷氧基。在其他實(shí)施方案中，R3是烷基、烯丙基、芐基。
在某些優(yōu)選的化合物中，R1和R2各自為H，且R3為鹵素、烷基、烷氧基、氰基、CF3或OH。在其他化合物中，R1和R2各自為H，且R3為鹵素、烷基或烷氧基。在某些這些化合物中，R4是H。在其他化合物中，R3為甲基或甲氧基。
本發(fā)明代表性的化合物包括
2-[(2-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(3-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(2-甲基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(4-甲基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(4-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(2-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]-2-甲基丙二腈，和2-[二(1-萘基)甲基]丙二腈。
本發(fā)明也涉及本文所述化合物的全部或任何一種其立體異構(gòu)體和可藥用鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物包含堿性部分時(shí)，可從有機(jī)和無(wú)機(jī)酸形成可藥用鹽，例如乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、丙二酸、扁桃酸、蘋果酸、鄰苯二甲酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、樟腦磺酸和類似的已知可用酸。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有酸性部分時(shí)，從有機(jī)和無(wú)機(jī)堿也可形成鹽，例如堿金屬鹽(例如鈉鹽、鋰鹽或鉀鹽)、堿土金屬鹽、銨鹽、含有1-6個(gè)碳原子的烷基銨鹽或在每一個(gè)烷基中含有1-6個(gè)碳原子的二烷基銨鹽，以及在每一個(gè)烷基中含有1-6個(gè)碳原子的三烷基銨鹽。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“烷基”指的是(C1-C6)直鏈或(C3-C6)支鏈單價(jià)飽和烴部分。飽和烴烷基部分的實(shí)例包括但不限于化學(xué)基團(tuán)如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基；高級(jí)同系物如正戊基、正己基等。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”指的是含有至少一個(gè)雙鍵的(C2-C6)直鏈或(C3-C6)支鏈單價(jià)烴部分。這類烴鏈烯基部分可以是單或多不飽和的，并可以以E或Z構(gòu)型存在。本發(fā)明的化合物意欲包括所有可能的E和Z構(gòu)型。單或多不飽和烴鏈烯基部分的實(shí)例包括但不限于化學(xué)基團(tuán)如乙烯基、2-丙烯基、異丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、丁間二烯基、2-(丁間二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)以及高級(jí)同系物、異構(gòu)體等。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”指的是具有3-10個(gè)碳原子的單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)、稠合、橋連或螺狀單價(jià)飽和烴部分，其中碳原子位于環(huán)系內(nèi)或外。環(huán)烷基部分的任何適宜環(huán)位置可以共價(jià)連接于所定義的化學(xué)結(jié)構(gòu)。環(huán)烷基部分的實(shí)例包括但不限于化學(xué)基團(tuán)如環(huán)丙基、環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己基甲基、環(huán)己基乙基、環(huán)庚基、降冰片基、金剛烷基、螺[4.5]癸基以及同系物、異構(gòu)體等。
除非另有說(shuō)明，單獨(dú)或與其他術(shù)語(yǔ)組合使用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”在本文被定義為氟、氯、溴或碘原子。
除非另有說(shuō)明，單獨(dú)或與其他術(shù)語(yǔ)組合使用的術(shù)語(yǔ)“芳基”在本文被定義為至多20個(gè)碳原子例如6-20個(gè)碳原子的芳族碳環(huán)部分，其可以是單環(huán)(一個(gè)環(huán))或稠合在一起或共價(jià)連接的多環(huán)(二環(huán)，至多三環(huán))。芳基部分的任何適宜環(huán)位置可以共價(jià)連接于所定義的化學(xué)結(jié)構(gòu)。芳基部分的實(shí)例包括但不限于化學(xué)基團(tuán)如苯基、1-萘基、2-萘基、二氫萘基、四氫萘基、聯(lián)苯基、蒽基、菲基、芴基、2，3-二氫化茚基、亞聯(lián)苯基(biphenylenyl)、苊基、亞苊基(acenaphthylenyl)等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“芳基烷基”指的是基團(tuán)-R-Ar，其中Ar為芳基且R為烷基。芳基烷基部分的實(shí)例包括但不限于化學(xué)基團(tuán)如芐基、1-苯基乙基、2-苯基乙基、二苯基甲基、3-苯基丙基、2-苯基丙基、芴基甲基以及同系物、異構(gòu)體等。
術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”或“雜環(huán)基”包括“雜芳基”，除非另有說(shuō)明，其指芳族雜環(huán)系統(tǒng)，其可以是單環(huán)(一個(gè)環(huán))或稠合在一起或共價(jià)連接的多環(huán)(二環(huán)，至多三環(huán))。在一些實(shí)施方案中，雜芳基具有4-20個(gè)碳原子。該環(huán)可含有一至四個(gè)選自氮(N)、氧(O)或硫(S)的雜原子，其中的氮或硫原子任選地被氧化，或氮原子任選地被季銨化。雜芳基部分的任何適宜環(huán)位置可以共價(jià)連接于所定義的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，雜芳基可以是具有一到兩個(gè)獨(dú)立地是氮、氧或硫的雜原子的芳族5元至7元含碳單環(huán)。雜芳基部分的實(shí)例包括但不限于雜環(huán)如呋喃、噻吩、吡咯、N-甲基吡咯、吡唑、N-甲基吡唑、咪唑、N-甲基咪唑、唑、異唑、噻唑、異噻唑、1H-四唑、1-甲基四唑、1，3，4-二唑、1H-1，2，4-三唑、1-甲基-1，2，4-三唑、1，3，4-三唑、1-甲基-1，3，4-三唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪、苯并唑、苯并異唑、苯并噻唑、苯并呋喃、苯并噻吩、噻蒽、二苯并[b，d]呋喃、二苯并[b，d]噻吩、苯并咪唑、N-甲基苯并咪唑、吲哚、吲唑、喹啉、異喹啉、喹唑啉、喹啉、嘌呤、蝶啶、9H-咔唑、β-咔啉等。
如本文前述所定義的雜環(huán)化學(xué)基團(tuán)也包括任選地飽和或部分飽和的雜環(huán)。飽和或部分飽和的雜環(huán)部分的實(shí)例包括但不限于化學(xué)基團(tuán)如氮雜環(huán)丁烷基、1，4-二烷基、六氫氮雜?；⑦哙夯?、哌啶基、吡咯烷基、嗎啉基、硫嗎啉基、二氫苯并咪唑基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基、二氫苯并唑基、二氫呋喃基、二氫咪唑基、二氫吲哚基、二氫異唑基、二氫異噻唑基、二氫二唑基、二氫唑基、二氫吡嗪基、二氫吡唑基、二氫吡啶基、二氫嘧啶基、二氫吡咯基、二氫喹啉基、二氫四唑基、二氫噻二唑基、二氫噻唑基、二氫噻吩基、二氫三唑基、二氫氮雜環(huán)丁烷基、二氫-1，4-二烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基等。
術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基-烷基”指的是基團(tuán)-R-雜環(huán)，其中R為烷基。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“烷氧基”指的是與氧原子共價(jià)鍵合的(C1-C6)直鏈或(C3-C6)支鏈烴。烷氧基部分的實(shí)例包括但不限于化學(xué)基團(tuán)如甲氧基、乙氧基、異丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、癸氧基以及同系物、異構(gòu)體等。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“烷硫基”指的是與硫原子共價(jià)鍵合的(C1-C6)直鏈或(C3-C6)支鏈烴。烷硫基部分的實(shí)例包括但不限于化學(xué)基團(tuán)如甲硫基、乙硫基、異丙硫基、仲丁硫基、叔丁硫基以及同系物、異構(gòu)體等。
每一個(gè)上述術(shù)語(yǔ)(例如烷基、芳基、雜芳基)意欲包括所示基團(tuán)或部分的未取代、單取代和多取代形式。以下提供每一類型部分的取代基。
烷基、鏈烯基、環(huán)烷基、亞烷基、芳基烷基和雜環(huán)基-烷基和?；糠值耐榛糠值娜〈?R′、OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、鹵代-OC(O)R′、-CO2R′、-C(O)NR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR″CO2R′、-NR′C(O)NR′R″、-NH-C(NH2)＝NH、-NR′C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、氰基和硝基，其中R’和R”各自獨(dú)立地為氫、未被取代的(C1-C6)烷基、未被取代的(C3-C7)環(huán)烷基、芳基、芳基-(C1-C3)烷基、芳基氧基-(C1-C3)烷基、芳基硫基-(C1-C3)烷基、雜芳基、雜芳基-(C1-C3)烷基、雜芳基氧基-(C1-C3)烷基或雜芳基硫基-(C1-C3)烷基，或任選地合在一起(當(dāng)R’和R”不是氫時(shí))形成環(huán)。
芳基或雜環(huán)基部分可任選地被取代基單、雙或三取代。代表性的取代基包括-R′、-OR′、-SR′、-C(O)R′、-CO2R′、-烷氧基烷基、烷氧基烷基氧基、氰基、鹵素、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、-NR′R″、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、羥基烷基、-S(O)R′、-S(O)2R′、-SO3R′、-S(O)2NR′R″、-CO2R′和C(O)NR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR″CO2R′、-NR′C(O)NR′R″、-NH-C(NH2)＝NH、-NR′C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR′、-S(O)R′和-S(O)2R′，其中R’和R”各自獨(dú)立地為氫、(C1-C6)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、芳基、芳基-(C1-C3)烷基、芳基氧基-(C1-C3)烷基、芳基硫基-(C1-C3)烷基、雜芳基、雜芳基-(C1-C3)烷基、雜芳基氧基-(C1-C3)烷基或雜芳基硫基-(C1-C3)烷基，或任選地合在一起(當(dāng)R’和R”不是氫時(shí))形成環(huán)。
本發(fā)明的化合物可包含不對(duì)稱的原子，且一些化合物可含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱的原子或中心，所以可產(chǎn)生光學(xué)異構(gòu)體和非對(duì)映體。
在方案1中描述了本發(fā)明化合物的一種合成方法。
方案1 本文所用的起始原料可購(gòu)得或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行制備。這些方法可見(jiàn)于標(biāo)準(zhǔn)的參考文獻(xiàn)例如“Handbook of Reagents forOrganic Synthesis”第1-4卷(John Wiley & Sons，Chichester，UK，1999)和Organic Reactions，第1-55卷(John Wiley & Sons，NY)。
如方案1所示，丙二腈與任選取代的芳族或雜芳族醛在催化劑存在下進(jìn)行縮合產(chǎn)生中間體(1)。催化劑可以是衍生于胺和羧酸的鹽(例如甲酸銨或氨基酸如丙氨酸)(G.Jones，Organic Reactions，1967，15，204；Y.Sumida，Polymer Journal，1981，13，521)，路易斯酸如含四氯化鈦的吡啶(W.Lehnert，Tetrahedron Lett.，1970，54，4723)，或在樹(shù)脂上固定的胺(J.Simpson，Tetrahedron Lett.，1999，40，7031)。近來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)離子性液體可用作堿催化的諾文葛耳反應(yīng)的介質(zhì)。將芳基格利雅或鋰/銅(例如Gilman型)試劑(N.Laitif，J.Chem.Soc.，1974，875；Gupte，J.Org.Chem.，1959，24，1334)邁克爾加成至濃縮產(chǎn)物，產(chǎn)生取代的丙二腈(2)。用烷基鹵或磺酸酯烷基化(2)的陰離子(A.A.Fadda，Ind.J.Chem.，1990，29B，171)，產(chǎn)生所需的二腈(3)。
中間體2(其中Ar1＝萘基，Ar＝苯基)的替代合成法包括二芳基甲基鹵化物(或?qū)Φ任?的合成和隨后用于丙二腈的烷基化。如方案2所示。
方案2 如方案3所示，可獲得方案2中的中間體二芳基甲基-X。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如Ph3P/CCl4、Ph3P/CBr4、碘化甲基三苯氧基、TsCl/Pyr、MsCl/TEA、AC2O/Pyr)，可將醇(3)轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)。
方案3
R4為烯丙基或芐基的化合物的替代合成法包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如諾文葛耳反應(yīng))合成2-二苯基亞甲基-丙二腈，隨后在Mizuno等人的條件下(J.Am Chem Soc 1988 110，1288)加成烯丙基(或芐基)錫烷，如方案4所示。
方案4 實(shí)施例實(shí)施例12-[(2-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈將(1-萘基亞甲基)丙二腈(408mg，2mmol)和10mL無(wú)水四氫呋喃加入燒瓶中。在室溫下，向該攪拌的溶液加入2-甲氧基苯基溴化鎂(2.4mL，2.4mmol，1M四氫呋喃溶液)。將反應(yīng)攪拌1.5小時(shí)，之后用1N鹽酸猝滅并用乙酸乙酯處理。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。用硅膠(20％乙酸乙酯/己烷)純化后，分離出灰白色泡沫狀的551mg產(chǎn)物。
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 8.14(d，1H，J＝8.05Hz)，7.93(m，2H)，7.74(d，1H，J＝7.32Hz)，7.60(d，1H，J＝8.05Hz)，7.53(m，2H)，7.27(t，1H，J＝7.85Hz)，7.21(dd，1H，J＝7.81，1.71Hz)，7.09(d，1H，J＝7.56Hz)，6.89(t，1H，J＝7.75Hz)，6.02(d，1H，J＝10.25)，5.97(d，1H，J＝10.49)，3.89(s，3H)。
MS(APCI)m/z 311[M-H]-；C21H16N2O的分析計(jì)算值C80.75 H5.16 N8.97。實(shí)測(cè)值C80.37H5.05 N8.70。
實(shí)施例22-萘-1-基亞甲基-丙二腈將1-萘甲醛(20g，128mmol)、丙二腈(10.15g，153.7mmol)、哌啶(5.45g，64mmol)、150mL乙醇和100mL甲苯在裝有攪拌棒的燒瓶中合并，并回流除去水達(dá)4小時(shí)，之后將反應(yīng)冷卻并用乙酸乙酯處理。將有機(jī)層用0.1N鹽酸、飽和碳酸氫鈉、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，蒸發(fā)至干。將殘余物從乙酸乙酯中重結(jié)晶，產(chǎn)生8.80g晶體固體產(chǎn)物，mp165-167℃；1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 9.36(s，1H)，8.25(m，2H)，8.17(d，1H，J＝7.3Hz)，8.06(d，1H，J＝7.4Hz)，7.68(m，3H)。
MS(EI)m/z(M)+(204)C14H8N2·0.1mol H2O的分析計(jì)算值C81.62 H4.01 N13.60。實(shí)測(cè)值C81.76 H3.76 N13.75。
實(shí)施例32-[(3-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈將來(lái)自實(shí)施例2的(1-萘基亞甲基)丙二腈(408mg，2mmol)和10mL無(wú)水四氫呋喃加入燒瓶中。在室溫下，向該攪拌的溶液加入3-甲氧基苯基溴化鎂(2.4mL，2.4mmol，1M四氫呋喃溶液)。將反應(yīng)攪拌1.5小時(shí)，之后用1N鹽酸猝滅并用乙酸乙酯處理。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。硅膠(20％乙酸乙酯/己烷)純化后，分離出灰白色泡沫狀的401mg產(chǎn)物。
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 8.30(d，1H，J＝8.29Hz)，7.94(m，2H)，7.80(d，1H，J＝7.32Hz)，7.62(t，1H，J＝8.0Hz)，7.54(m，2H)，7.25(t，1H，J＝8.0Hz)，7.09(t，1H，J＝1.95Hz)，7.04(d，1H，J＝7.08Hz)，6.83(dd，1H，J＝8.30Hz，0.73Hz)，6.11(d，1H，J＝10.49Hz)，5.87(d，1H，J＝10.49Hz)，3.69(s，3H)；MS(EI)m/z，312(M)+；C21H16N2O·0.3mol H2O的分析計(jì)算值C79.37 H5.27 N8.82。實(shí)測(cè)值C79.32 H5.14 N8.62。
實(shí)施例42-[(2-甲基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈將來(lái)自實(shí)施例2的(1-萘基亞甲基)丙二腈(408mg，2mmol)和10mL無(wú)水四氫呋喃加入燒瓶中。在室溫下，向該攪拌的溶液加入鄰-甲苯基溴化鎂(1.2mL，2.4mmol，2M四氫呋喃溶液)。將反應(yīng)攪拌1.5小時(shí)，之后用1N鹽酸猝滅并用乙酸乙酯處理。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。硅膠(20％乙酸乙酯/己烷)純化后，分離出灰白色泡沫狀的455mg產(chǎn)物。
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 8.38(d，1H，J＝8.54Hz)，7.96(d，1H，J＝8.05Hz)，7.91(d，1H，J＝8.05Hz)，7.60(m，1H)，7.54(m，2H)，7.46(m，2H)，7.24(m，1H)，7.20(m，2H)，6.04(d，1H，J＝9.76Hz)，5.95(d，1H，J＝9.76Hz)，2.30(s，3H)；MS(APCI)m/z 295[M-H]-；C21H16N2的分析計(jì)算值C85.11 H5.44 N9.45。實(shí)測(cè)值C84.81 H5.30 N9.43。
實(shí)施例52-[(4-甲基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈將來(lái)自實(shí)施例2的(1-萘基亞甲基)丙二腈(408mg，2mmol)和10mL無(wú)水四氫呋喃加入燒瓶中。在室溫下，向該攪拌的溶液加入4-甲基苯基溴化鎂(2.4mL，2.4mmol，1M四氫呋喃溶液)。將反應(yīng)攪拌1.5小時(shí)，之后用1N鹽酸猝滅并用乙酸乙酯處理。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。硅膠(15％乙酸乙酯/己烷)純化后，分離出灰白色泡沫狀的116mg產(chǎn)物。
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 8.25(d，1H，J＝7.81Hz)，7.92(m，2H)，7.78(d，1H，J＝7.32Hz)，7.61(t，1H，J＝7.44Hz)，7.52(m，2H)，7.37(d，2H，J＝7.56Hz)，7.13(d，2H，J＝7.81Hz)，6.06(d，J＝9.76Hz，1H)，5.85(d，J＝10.49Hz，1H)，2.21(s，3H)；
MS(APCI)m/z 295[M-H]-；C21H16N2·0.15mol H2O的分析計(jì)算值C84.34 H5.49 N9.37。實(shí)測(cè)值C84.03 H5.54 N9.17。
實(shí)施例62-[(4-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈將來(lái)自實(shí)施例2的(1-萘基亞甲基)丙二腈(408mg，2mmol)和10mL無(wú)水四氫呋喃加入燒瓶中。在室溫下，向該攪拌的溶液中加入4-甲氧基苯基溴化鎂(4.8mL，2.4mmol，0.5M四氫呋喃溶液)。將反應(yīng)攪拌1.5小時(shí)，之后用1N鹽酸猝滅并用乙酸乙酯處理。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。硅膠(20％乙酸乙酯/己烷)純化后，分離出灰白色泡沫狀的465mg產(chǎn)物。
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 8.25(m，1H)，7.93(m，1H)，7.90(s，1H)，7.79(d，1H，J＝7.32Hz)，7.61(t，1H，J＝7.81Hz)，7.52(m，2H)，7.40(d，2H，J＝8.79Hz)，6.88(d，2H，J＝8.79Hz)，6.05(d，1H，J＝10.49Hz)，5.84(d，1H，J＝10.49Hz)，3.68(s，3H)；MS(APCI)m/z 330[M+NH4]+；C21H16N2O·0.4mol H2O的分析計(jì)算值C78.93 H5.30 N8.77。實(shí)測(cè)值C79.09 H5.11 N8.47。
實(shí)施例72-[(2-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]-2-甲基丙二腈將實(shí)施例1的2-[(2-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈(196mg，0.63mmol)溶解于10mL四氫呋喃中并冷卻至-35℃。加入六甲基二甲硅烷基氨基鉀(1.14mL，0.75mmol，0.66M甲苯溶液)。移去冷卻浴，溫?zé)岱磻?yīng)至室溫，之后加入甲基碘(0.078mL，125mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，然后用1N鹽酸猝滅并用乙酸乙酯處理。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。硅膠(20％乙酸乙酯/己烷)純化并用甲醇重結(jié)晶后，分離出104mg晶體狀固體產(chǎn)物，mp175-177℃。
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 8.10(m，1H)，7.95(m，3H)，7.64(t，1H，J＝7.75Hz)，7.52(m，2H)，7.31(m，2H)，7.14(d，1H，J＝7.57Hz)，6.91(td，1H，J＝7.57Hz，0.98Hz)，5.93(s，1H)，3.91(s，3H)，1.90(s，3H)；MS(APCI)m/z 327[M+H]+；C22H18N2O的分析計(jì)算值C80.96 H5.56 N8.58，實(shí)測(cè)值C80.91H5.56 N8.55。
實(shí)施例82-[(二(1-萘基)甲基)丙二腈將來(lái)自實(shí)施例2的(1-萘基亞甲基)丙二腈(408mg，2mmol)和10mL無(wú)水四氫呋喃加入燒瓶中。在室溫下，向該攪拌的溶液加入1-萘基溴化鎂(12.5mL，2.5mmol，0.1M四氫呋喃溶液)。將反應(yīng)攪拌2小時(shí)，之后用1N鹽酸猝滅并用乙酸乙酯處理。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。殘余物用乙醇重結(jié)晶，得到231mg晶體狀固體產(chǎn)物，mp179-181℃。
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 8.41(m，2H)，7.96(m，2H)，7.91(d，2H，J＝8.05Hz)，7.60(dd，2H，J＝7.32Hz，0.98Hz)，7.53(m 6H)，6.76(d，1H，J＝9.52Hz)，6.08(d，1H，J＝9.27Hz)；MS(APCI)m/z 331[M-H]-；C24H16N2的分析計(jì)算值C86.72 H4.85 N8.43。實(shí)測(cè)值C86.53 H4.70 N8.51。
實(shí)施例92-(2-氟-亞芐基)-丙二腈將丙二腈(3.303g，50mmol)、2-氟苯甲醛(6.205g，50mmol)、1g分子篩和500mg樹(shù)脂結(jié)合的哌啶(描述于Tetrahedron Lett.，1999，40，7031-33)置于容器中，將該容器用300W單模式微波照射15秒。將反應(yīng)混合物置于乙酸異丙酯中，過(guò)濾，蒸發(fā)，用二氯甲烷處理，通過(guò)Magnasol墊過(guò)濾，蒸發(fā)，用乙醇重結(jié)晶，得到2.435g晶體狀固體標(biāo)題物，mp117-118℃(Can.J.Chem.，1967，45 1001-06)。
1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ 8.58(s，1H)，8.04(td，1H，J＝7.57Hz，1.71Hz)，7.74(m，1H)，7.45(m，2H)；MS(APCI)m/z 172(M)-；C10H5FN2的分析計(jì)算值C69.77 H2.93 N16.27。實(shí)測(cè)值C69.65H2.67 N16.33。
實(shí)施例10體外方法細(xì)胞將T-175燒瓶中100％融合HAECT-1細(xì)胞(無(wú)限增殖化人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)用8ml HBSS(HEPES緩沖的鹽水溶液)洗滌，并用6ml Ad5-wt-hERα病毒(介導(dǎo)CMN啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人ERα表達(dá)的腺病毒轉(zhuǎn)染載體)在含0.25％牛血清白蛋白(EBM-BSA)的不含酚紅內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Clonetics，SanDiego CA，目錄號(hào)CC-3129)中的1∶10稀釋液感染四小時(shí)。四小時(shí)后，將細(xì)胞用EBM-BSA洗滌并在相同培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜。過(guò)夜孵育后，將細(xì)胞用EBA-BSA洗滌，并用6ml Ad5-3x(NFκB).Luc病毒(通過(guò)MHC NFκβ位點(diǎn)5’至胸腺嘧啶激酶啟動(dòng)子的3次重復(fù)驅(qū)動(dòng)的腺病毒螢光素酶表達(dá)載體)在EBM-BSA中的1∶10稀釋液感染2小時(shí)。兩小時(shí)后，洗滌細(xì)胞，在34℃孵育1小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞、用胰酶消化、計(jì)數(shù)并以4×106細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮在95％FBS/5％二甲基亞砜中，并在冷凍管中冷凍為1或5ml的等分試樣，在-150℃儲(chǔ)存。如上所述處理對(duì)照細(xì)胞(無(wú)ER感染)，但未經(jīng)Ad5-wt-hERα病毒感染。
IL-6和肌酸激酶測(cè)定將ERα感染的HAECT-1細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞解凍，在溫?zé)岬腅BA-BSA中稀釋42倍，以0.1ml/孔接種于96孔板并在34℃孵育4小時(shí)。將受試化合物在含有2ng/ml IL-1β(R&D Systems)的EBM-BSA中的2倍原液加入到細(xì)胞中，并將板放回培養(yǎng)箱(34℃)。15-20小時(shí)后，從細(xì)胞中取出100μl培養(yǎng)基等分試樣，使用BioSource人IL-6 ELISA試劑盒測(cè)定IL-6含量。隨后將細(xì)胞用300μl Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，并溶解在50μl細(xì)胞培養(yǎng)溶解試劑(Promega)中。使用10μl裂解物并與100μl Promega螢光素酶測(cè)定試劑混合，在Wallac Victor2發(fā)光計(jì)(Gaithersburg，MD)上測(cè)定螢光素酶。將100μl CK測(cè)定試劑(Sigma，目錄號(hào)No47-10)加入到剩余細(xì)胞裂解物后，從A340處增長(zhǎng)率測(cè)定肌酸激酶。
數(shù)據(jù)分析為了計(jì)算IC50和EC50，將平均IL-6、螢光素酶或CK值相對(duì)于化合物濃度的log10值擬合為四參數(shù)對(duì)數(shù)方程。迭代估計(jì)出IC50/EC50值、“Hill斜率”、曲線的上限和下限。
小鼠將切除卵巢的C57BL/6小鼠(16-20g)(Taconic)分組，每組8只?；謴?fù)5-7天后，小鼠被飼以固型(chow)飼料或致動(dòng)脈粥樣化飼料(15.75％脂肪、1.25％膽固醇和0.5％膽酸鈉)(Purina飼料#21539)。通過(guò)管飼將在甲基纖維素/吐溫載體中的EE或受試化合物每天一次施用(每只小鼠0.1ml)，持續(xù)5周。在試驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，收集肝臟并記錄子宮濕重。
RNA分析使用Trizol試劑(BRL)制備肝臟總RNA。根據(jù)生產(chǎn)商(AppliedBiosystems)的方案，使用ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)、通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR驗(yàn)證了NF-κB靶基因的雌激素和化合物調(diào)節(jié)。使用SequenceDetector vl.7軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)，并使用AppliedBiosystems引物集合將數(shù)據(jù)歸一化為GAPDH。
體外結(jié)果表1總結(jié)了在Ad5-wt-ER感染的細(xì)胞中E2和幾個(gè)“抗炎雌激素”在HAECT-1 NF-κB、IL-6和肌酸激酶測(cè)定中的活性。表2列出了在未感染的細(xì)胞中相同化合物在HAECT-1 NF-κB和肌酸激酶測(cè)定中的活性。
表1.在Ad5-wt-ER感染的HAECT-1細(xì)胞中，17-β-雌二醇對(duì)NF-κB、IL-6和CK表達(dá)的影響
*有效性值相對(duì)于用E2觀察到的最大抑制(NF-κB或IL-6測(cè)定)或刺激(CK測(cè)定)表2.在無(wú)ER感染的HAECT-1細(xì)胞中，17-β-雌二醇對(duì)NF-κB和CK表達(dá)的影響
E2在Ad5-wt-ER感染的HAECT-1細(xì)胞中抑制NF-κB和IL-6表達(dá)，IC50值為1nM左右，并以類似的強(qiáng)度(5.8nM)在相同細(xì)胞中誘導(dǎo)肌酸激酶的表達(dá)(表1)。相反，在Ad5-wt-ER感染的HAECT-1細(xì)胞中，本發(fā)明化合物抑制NF-κB和IL-6表達(dá)，顯示被降低的CK表達(dá)或沒(méi)有CK表達(dá)(表1)。正如它們?cè)谖唇?jīng)Ad5-wt-ER病毒感染的HAECT-1細(xì)胞中無(wú)活性所表明，上述化合物以ER-依賴性的方式抑制NF-κB的表達(dá)(表2)。本化合物抑制NF-κB和IL-6表達(dá)而不誘導(dǎo)CK活性的能力(表1)與它們具有抗炎活性而沒(méi)有典型的雌激素活性相一致。
實(shí)施例11體內(nèi)活性為了測(cè)定在肝臟中雌激素調(diào)節(jié)飲食誘導(dǎo)的炎癥發(fā)展的能力，監(jiān)測(cè)了由致動(dòng)脈粥樣化飲食導(dǎo)致的基因表達(dá)的改變。切除卵巢的C57BL/6小鼠被飼以固型或致動(dòng)脈粥樣化飼料，每天用EE(0.01mg/kg)或受試化合物(10mg/kg)處理(表3)。實(shí)時(shí)RT-PCR分析證實(shí)了致動(dòng)脈粥樣化飲食對(duì)MHC不變鏈(MHI)、VCAM-1、PANTES和TNF-α的mRNA的誘導(dǎo)作用，用EE處理強(qiáng)烈地抑制這些基因的誘導(dǎo)。
用受試化合物處理并不導(dǎo)致顯著誘導(dǎo)子宮濕重增加——與EE有關(guān)的不良活性(表3)。
表3.與載體對(duì)照相比在C57BL/6中EE(0.01mg/kg/天)和受試化合物(10mg/kg/天)對(duì)子宮濕重增加的影響。
在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中使用ERE-報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)法評(píng)價(jià)受試化合物在DMSO中制備受試化合物的儲(chǔ)備液(通常為0.1M)，然后用DMSO稀釋10至100倍以制得1或10mM的工作液。將DMSO儲(chǔ)備液儲(chǔ)藏在4℃(0.1M)或-20℃(＜0.1M)。MCF-7細(xì)胞用生長(zhǎng)培養(yǎng)基[含有10％(v/v)熱滅活胎牛血清、1％(v/v)青霉素-鏈霉素和2mM glutaMax-1的D-MEM/F-12培養(yǎng)基]每周傳代二次。將細(xì)胞維持在5％CO2/95％濕度的空氣培養(yǎng)箱內(nèi)的37℃通風(fēng)燒瓶中。在處理前一天，以25,000細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種入96孔板的生長(zhǎng)培養(yǎng)基并在37℃孵育過(guò)夜。
將細(xì)胞用50μl/孔的腺病毒5-ERE-tk-螢光素酶在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基[含有10％(v/v)熱滅活、碳處理的胎牛血清、1％(v/v)青霉素-鏈霉素、2mMglutaMax-1、1mM丙酮酸鈉的無(wú)酚紅D-MEM/F-12培養(yǎng)基]中的1∶10稀釋液在37℃感染2小時(shí)。然后將各孔用150μl實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基洗滌一次。最后，用150μl/孔的載體(≤0.1 v/v DMSO)或在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中稀釋≥1000倍的化合物以一式8孔在37℃處理細(xì)胞24小時(shí)。
以單獨(dú)測(cè)試的1μM單劑量(雌激素受體激動(dòng)劑模式)或與0.1nM 17β-雌二醇組合(EC80；雌激素受體拮抗劑模式)進(jìn)行受試化合物的初始篩選。每個(gè)96孔板也包括載體對(duì)照組(0.1％v/v DMSO)和雌激素受體激動(dòng)劑對(duì)照組(0.1或1nM 17β-雌二醇)。以雌激素受體激動(dòng)劑模式和/或雌激素受體拮抗劑模式對(duì)活性化合物以10-14至10-5M的對(duì)數(shù)增加進(jìn)行劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。從這些劑量-反應(yīng)曲線可分別得到EC50和IC50值。在每一個(gè)處理組的最后孔含有5μl3×10-5M ICI-182，780(10-6M最終濃度)作為雌激素受體拮抗劑對(duì)照。
在處理后，用25μl/孔的1x細(xì)胞培養(yǎng)溶解試劑(Promega Corporation)在振動(dòng)器中將細(xì)胞溶解15分鐘。將細(xì)胞裂解物(20μl)轉(zhuǎn)移至96孔發(fā)光計(jì)板，使用100μl/孔的熒光素酶底物(Promega Corporation)、在MicroLumat LB96P發(fā)光計(jì)(EG&G Berthold)中測(cè)定螢光素酶的活性。在注射底物前，每孔測(cè)量背景1秒。在注射底物之后，在延遲1秒之后測(cè)量熒光素酶活性10秒。將數(shù)據(jù)從發(fā)光計(jì)轉(zhuǎn)移至Macintosh個(gè)人計(jì)算機(jī)，使用JMP軟件(SAS學(xué)會(huì))對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；該程序減去了每孔螢光素酶測(cè)量值的背景讀數(shù)，然后確定每一處理的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
通過(guò)對(duì)數(shù)變換螢光素酶數(shù)據(jù)，使用Huber M-估計(jì)量以降低外圍變換觀察值的權(quán)重。使用JMP軟件分析經(jīng)變換和加權(quán)的數(shù)據(jù)以進(jìn)行單尾ANOVA(Dunnett檢驗(yàn))。將化合物處理與雌激素受體激動(dòng)劑模式的載體對(duì)照結(jié)果比較，或與雌激素受體拮抗劑模式的陽(yáng)性雌激素受體激動(dòng)劑對(duì)照結(jié)果(0.1nM 17β-雌二醇)比較。對(duì)于初始的單劑量實(shí)驗(yàn)，如果化合物處理結(jié)果與適當(dāng)?shù)膶?duì)照顯著不同(p＜0.05)，那么以相對(duì)于17β-雌二醇對(duì)照的百分?jǐn)?shù)報(bào)告結(jié)果[即((化合物-載體對(duì)照)/(17β-雌二醇對(duì)照-載體對(duì)照))×100]。也使用JMP軟件從非線性劑量-反應(yīng)曲線確定EC50和/或IC50值。
子宮增重(uterotrophic)活性的評(píng)價(jià)根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定受試化合物的子宮增重活性。
方法1從Taconic獲得性未成熟(18日齡)的Sprague-Dawley大鼠，大鼠可自由獲取以酪蛋白為基礎(chǔ)的飼料(Purina Mills 5K96C)和飲水。在第19、20和21天，用17α-乙炔基-17β-雌二醇(0.06μg/只/天)、受試化合物或載體(50％DMSO/50％Dulbecco′s PBS)對(duì)大鼠皮下給藥。為了評(píng)價(jià)雌激素受體拮抗劑，將化合物與17α-乙炔基-17β-雌二醇(0.06μg/只/天)共同施用。每組六只大鼠，在最后注射后約24小時(shí)通過(guò)CO2窒息和氣胸實(shí)施安樂(lè)死。取出子宮，在修剪相關(guān)脂肪并擠出任何內(nèi)部液體后進(jìn)行稱重。也可將組織樣本急速冷凍用于基因表達(dá)分析(例如補(bǔ)體因子3mRNA)。
方法2從Taconic獲得性未成熟(18日齡)的129SvE小鼠，小鼠可自由獲取以酪蛋白為基礎(chǔ)的飼料(Purina Mills 5K96C)和飲水。在第22、23、24和25天，用化合物或載體(玉米油)對(duì)小鼠皮下給藥。每組六只小鼠，在最后注射后約6小時(shí)通過(guò)CO2窒息和氣胸實(shí)施安樂(lè)死。取出子宮，在修剪相關(guān)脂肪并擠出任何內(nèi)部液體后進(jìn)行稱重。
骨質(zhì)疏松和脂類調(diào)節(jié)(心臟保護(hù))的評(píng)價(jià)從Taconic農(nóng)場(chǎng)獲得術(shù)后1天的切除卵巢或經(jīng)假手術(shù)的雌性Sprague-Dawley大鼠(重量240-275g)。它們以3或4只大鼠/籠飼養(yǎng)在12/12(白晝/黑夜)交替的房間內(nèi)，并隨意獲取飼料(Purina 5K96C大鼠固型飼料)和飲水。在到達(dá)后第1天開(kāi)始所有研究的處理，如所示那樣大鼠每周7天給藥，共6周。一組日齡相配的、未進(jìn)行任何處理的假手術(shù)大鼠作為完整的、雌激素充足的對(duì)照組用于每一項(xiàng)研究。
所有受試化合物以所定義的濃度制備在50％DMSO(JT Baker，Phillipsburg，NJ)/1x Dulbecco磷酸鹽鹽水(GibcoBRL，Grand Island，NY)的載體中，以使處理體積為0.1mL/100g體重。將17β-雌二醇溶解在玉米油中(20μg/mL)，以0.1mL/大鼠皮下遞送。以3周間隔根據(jù)組平均體重測(cè)定值調(diào)整所有的劑量，并皮下給藥。
在處理開(kāi)始后五周和研究結(jié)束之前一周，評(píng)價(jià)每一只大鼠的骨礦物質(zhì)密度(BMD)。使用XCT-960M(pQCT；Stratec Medizintechnik，Pforzheim，德國(guó))在麻醉的大鼠中評(píng)價(jià)近端脛骨的總密度和小梁密度。如下進(jìn)行測(cè)定在掃描之前15分鐘，每只大鼠腹膜內(nèi)注射45mg/kg氯胺酮、8.5mg/kg甲苯噻嗪和1.5mg/kg乙酚丙嗪進(jìn)行麻醉。
使右后肢通過(guò)直徑25mm的聚碳酸酯管，并與踝關(guān)節(jié)成90°角和膝關(guān)節(jié)成180°角將其捆在丙烯酸框架上。將聚碳酸酯管固定于滑動(dòng)平臺(tái)，該滑動(dòng)平臺(tái)維持它與pQCT的孔呈垂直。調(diào)整平臺(tái)，使股骨的遠(yuǎn)端和脛骨的近端在掃描場(chǎng)之內(nèi)。以長(zhǎng)度10mm、線分辨率0.2mm進(jìn)行二維探查性掃描。在探查性圖像顯示于監(jiān)視器后，將脛骨的近端定位。距該點(diǎn)3.4mm遠(yuǎn)處開(kāi)始pQCT掃描。該pQCT掃描為1mm厚，體素大小0.140mm(三維象素)，并由通過(guò)切片的145個(gè)投射組成。
在完成pQCT掃描后，圖像被顯示在監(jiān)視器上。畫出包括脛骨但排除腓骨的感興趣區(qū)域。使用迭代算法以數(shù)學(xué)方法除去軟組織。以mg/cm3報(bào)告剩余骨的密度(總密度)。在同心螺旋管中用數(shù)學(xué)方法除去骨頭的外部55％。以mg/cm3報(bào)告剩余骨的密度(小梁密度)。
在BMD評(píng)價(jià)后一周，通過(guò)CO2窒息和氣胸對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死，收集血液用于膽固醇測(cè)定。取出子宮，在修剪相關(guān)脂肪并擠出任何內(nèi)部液體后進(jìn)行稱重。使用Boehringer-Mannheim Hitachi 911臨床分析儀、使用膽固醇/HP試劑盒測(cè)定總膽固醇。使用單向方差分析、以Dunnet檢驗(yàn)比較統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
抗氧化活性的評(píng)價(jià)從屠宰場(chǎng)獲得豬主動(dòng)脈，將其洗滌，在冷卻PBS中運(yùn)輸，并收獲主動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞。為了收獲細(xì)胞，將主動(dòng)脈的肋間血管結(jié)扎并夾住主動(dòng)脈的一端。將新鮮的、無(wú)菌過(guò)濾的0.2％膠原酶(Sigma I型)置于血管中，然后將血管的另一端夾住以形成封閉系統(tǒng)。將主動(dòng)脈在37℃孵育15-20分鐘，之后收集膠原酶溶液，并在2000xg下離心5分鐘。將每一沉淀懸浮在7mL內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由不合酚紅的DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)基組成，補(bǔ)充有碳處理的FBS(5％)、NuSerum(5％)、L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素-鏈霉素(1000U/ml，100μg/ml)和慶大霉素(75μg/ml)，再接種于100mm培養(yǎng)皿，在37℃、5％CO2中孵育。20分鐘后，將細(xì)胞用PBS漂洗并加入新鮮培養(yǎng)基。在24小時(shí)時(shí)重復(fù)這一操作。約1周后細(xì)胞融合。將內(nèi)皮細(xì)胞例行地每周補(bǔ)料兩次，在融合時(shí)，用胰蛋白酶消化并以1∶7的比率接種。在待評(píng)價(jià)化合物(5μM)存在下，使細(xì)胞介導(dǎo)的12.5μg/mL LDL的氧化在37℃進(jìn)行4小時(shí)。結(jié)果通過(guò)用于游離醛分析的TBARS(硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì))法[Yagi，Biochemical Medicine，1976，15，212-6]測(cè)得的氧化過(guò)程的百分抑制來(lái)表示。
孕酮受體mRNA調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)方法可用于評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物的雌激素或抗雌激素活性[Shughrue等人，Endocrinology，1997，138，5476-5484]。
大鼠熱潮紅實(shí)驗(yàn)方法受試化合物對(duì)熱潮紅的影響可在標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法中進(jìn)行評(píng)價(jià)，該實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定受試化合物減弱在使用納洛酮而急性撤藥的嗎啡成癮大鼠中出現(xiàn)的尾皮膚溫度升高中的能力[Merchenthaler等人，Maturitas，1998 30，307-16]。通過(guò)受試化合物和參照雌激素的共同給藥也可用于檢測(cè)雌激素受體拮抗劑的活性。
在離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)中血管舒縮功能的評(píng)價(jià)將Sprague-Dawley大鼠(240-260克)分成4組1.正常未切除卵巢(完整)2.切除卵巢(ovex)載體處理3.切除卵巢17β-雌二醇處理(1mg/kg/天)4.切除卵巢的動(dòng)物用受試化合物處理(多種劑量)在處理之前約3周將動(dòng)物切除卵巢。通過(guò)胃管飼法使每只動(dòng)物接受混懸于含1％吐溫-80的蒸餾或去離子水中的17-β雌二醇硫酸酯(1mg/kg/天)或受試化合物。載體處理的動(dòng)物接受在藥物處理組使用的適當(dāng)體積的載體。
通過(guò)CO2吸入和放血對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。迅速地取出胸大動(dòng)脈并將其放置在具有下列組成(mM)的37℃生理溶液中NaCl(54.7)、KCl(5.0)、NaHCO3(25.0)、MgCl22H2O(2.5)、D-葡萄糖(11.8)和CaCl2(0.2)，用95％/5％的CO2-O2充氣，最終pH為7.4。從外表面除去外膜，將血管切成2-3mm寬的環(huán)。將環(huán)懸掛于10mL的組織浴中，其一端連接于組織浴的底部，另一端連接于力傳感器。在環(huán)上放置1克的靜止張力。將環(huán)平衡1小時(shí)，獲得信號(hào)并分析。
在平衡后，將環(huán)暴露于升高濃度的脫羥腎上腺素(10-8至10-4M)中并記錄張力。然后將組織浴用新鮮緩沖液漂洗3次。在洗完后，將200mML-NAME加入組織浴中并平衡30分鐘。然后重復(fù)脫羥腎上腺素的濃度反應(yīng)曲線。
心臟保護(hù)活性的評(píng)價(jià)從Taconic農(nóng)場(chǎng)獲得載脂蛋白E缺陷的C57/B1J(apo E KO)小鼠。在嚴(yán)格符合IACUC指導(dǎo)原則的條件下進(jìn)行所有的動(dòng)物操作。將4-7周齡的切除卵巢的雌性apo E KO小鼠飼養(yǎng)在鞋盒狀籠子中，小鼠可自由攝食和飲水。根據(jù)體重將動(dòng)物隨機(jī)分組(n＝12-15只小鼠每組)。使用精確給藥的實(shí)驗(yàn)方案，用飼料中的受試化合物或雌激素(17-β雌二醇硫酸酯，1mg/kg/天)對(duì)動(dòng)物給藥，其中每周測(cè)量消耗的飼料量，并根據(jù)動(dòng)物體重相應(yīng)地調(diào)整劑量。所用飼料是由Purina制備的Western風(fēng)格的飼料(57U5)，其含有0.50％膽固醇、20％豬油和25IU/KG維生素E。用這種方法對(duì)動(dòng)物給藥/喂食12周。對(duì)照動(dòng)物飼以Western風(fēng)格的飼料但不接受任何化合物。在研究期結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物安樂(lè)死并獲得血漿樣本。就地灌注心臟，首先用鹽水，然后用中性緩沖的10％福爾馬林溶液。
為了測(cè)定血漿脂類和脂蛋白，使用分別商購(gòu)自Boehringer Mannheim和Wako Biochemicals的試劑盒、利用酶方法測(cè)定總膽固醇和甘油三酯，并使用Boehringer Mannheim Hitachii 911分析儀進(jìn)行分析。使用FPLC尺寸分離法進(jìn)行血漿脂蛋白的分離和定量。簡(jiǎn)言之，過(guò)濾50-100mL血清，并注入串聯(lián)連接的Superose 12和Superose 6柱，并用1mM EDTA鈉和0.15M NaCl以恒定流速洗脫。使用Waters MillenniumTM軟件對(duì)代表VLDL、LDL和HDL的每一曲線的面積進(jìn)行積分，通過(guò)將總膽固醇值與各個(gè)色譜峰面積的相對(duì)百分?jǐn)?shù)相乘來(lái)定量每一種脂蛋白成分。
為了定量主動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化，在處理之前小心地分離主動(dòng)脈并將其放置在福爾馬林固定液中48-72小時(shí)。使用油紅O染色法鑒別動(dòng)脈粥樣硬化性損傷。將血管短暫脫色，然后使用裝備有與作為圖像捕捉軟件的IMAQ Configuration Utility(National Instrument)相兼容的Sony 3CCD電視攝像系統(tǒng)的Nikon SMU800顯微鏡進(jìn)行成像。使用自定閾(custumthreshold)應(yīng)用軟件包(Coleman Technologies)在沿著主動(dòng)脈弓的表面對(duì)損傷進(jìn)行定量。使用程序的閾值函數(shù)對(duì)血管進(jìn)行自動(dòng)損傷評(píng)價(jià)，特別包含在從頭臂干的近端邊緣到左鎖骨下動(dòng)脈的遠(yuǎn)端邊緣的主動(dòng)脈弓內(nèi)的區(qū)域。主動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化數(shù)據(jù)以嚴(yán)格包含在所定義腔區(qū)域之內(nèi)的百分損傷來(lái)表示。
認(rèn)知提高的評(píng)價(jià)在連續(xù)5天的每一天，每天10分鐘使切除卵巢的大鼠(n＝50)習(xí)慣于8臂放射臂迷宮。在習(xí)慣和測(cè)定之前動(dòng)物不得飲水。將100μl水放置在每一臂的末端以起到增強(qiáng)的作用。通過(guò)允許動(dòng)物進(jìn)入一放置誘餌的臂，完成在放射臂迷宮中贏-變換任務(wù)(win-shift task)的習(xí)得。在飲水之后，動(dòng)物退出該臂并重新進(jìn)入中央室，在這里它可以進(jìn)入先前已到過(guò)的臂或進(jìn)入一個(gè)新臂。當(dāng)動(dòng)物選擇進(jìn)入一個(gè)新臂時(shí)記錄正確的反應(yīng)。每只動(dòng)物每天進(jìn)行5次試驗(yàn)，共3天。在最后的習(xí)得試驗(yàn)之后，將動(dòng)物分配到下列4個(gè)組之一1.陰性對(duì)照每天一次注射10％DMSO/芝麻油載體，共6天(1mL/kg，SC)2.陽(yáng)性對(duì)照用17β-雌二醇苯甲酸酯注射2天，在第二次注射后實(shí)驗(yàn)4天(每只大鼠10μg/0.1mL 17β-雌二醇苯甲酸酯)3.雌二醇每日注射17β-雌二醇，共6天(20μg/kg，SC)4.受試化合物每日注射，共6天(劑量變化)。
在習(xí)得最后一天的實(shí)驗(yàn)之后開(kāi)始所有的注射。第1、3和4組的最后注射在工作記憶實(shí)驗(yàn)之前2小時(shí)進(jìn)行。
工作記憶的實(shí)驗(yàn)是延遲型與樣本不匹配任務(wù)(DNMS)，其利用15、30或60秒的延遲。本任務(wù)是習(xí)得任務(wù)的變體，在其中將大鼠放置于中心舞臺(tái)并允許其進(jìn)入如前的一個(gè)臂。一旦大鼠通過(guò)第一個(gè)臂的一半路程就打開(kāi)第二個(gè)臂，并再次要求大鼠選擇這個(gè)臂。當(dāng)它沿著第二個(gè)臂移動(dòng)一半路程時(shí)，將兩個(gè)門都關(guān)閉并開(kāi)始延遲。一旦延遲到期，同時(shí)打開(kāi)最初的兩個(gè)門和第三個(gè)新門。當(dāng)動(dòng)物沿著第三個(gè)新的臂移動(dòng)一半路程時(shí)，記錄為正確的反應(yīng)。當(dāng)動(dòng)物沿著第一或第二臂移動(dòng)一半路程時(shí)，記錄為不正確的反應(yīng)。每一只動(dòng)物在三次延遲間隔的每一次接受5次試驗(yàn)，每一受試者共接受15次試驗(yàn)。
對(duì)胸膜炎影響的評(píng)價(jià)根據(jù)Cuzzocrea的方法[Endocrinology 1411455-63(2000)]，可評(píng)價(jià)減輕實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的大鼠胸膜炎癥狀的能力。
保護(hù)以免于谷氨酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(神經(jīng)保護(hù))的評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物的神經(jīng)保護(hù)活性可以在使用谷氨酸鹽攻擊的體外標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法[Zaulyanov等人，Cellular & Molecular Neurobiology，1999，19，705-18；Prokai等人，Journal of Medicinal Chemistry，2001，44，110-4]中評(píng)價(jià)。
在乳房終芽(end bud)實(shí)驗(yàn)方法中的評(píng)價(jià)乳腺管的完全管伸長(zhǎng)和分支，以及在孕酮影響下小葉-小泡(lobuloalveolar)終芽的后續(xù)發(fā)育需要雌激素。在本實(shí)驗(yàn)方法中，根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法可評(píng)價(jià)本發(fā)明所選化合物的催乳(mammotrophic)活性。將28日齡的Sprague-Dawley大鼠(Taconic農(nóng)場(chǎng)，Germantown，NY)切除卵巢并休養(yǎng)9天。將動(dòng)物在12小時(shí)白晝/黑夜循環(huán)下飼養(yǎng)，飼以以酪蛋白為基礎(chǔ)的Purina實(shí)驗(yàn)室嚙齒類飼料5K96(Purina，Richmond，IN)并允許動(dòng)物自由飲水。然后將大鼠用載體(50％DMSO(JT Baker，Phillipsburg，NJ)/50％1xDulbecco磷酸鹽緩沖的鹽水(GibcoBRL，Grand Island，NY)、17β-雌二醇(0.1mg/kg)或受試化合物(20mg/kg)皮下給藥6天。在最后三天，還用孕酮對(duì)大鼠皮下給藥(30mg/kg)。在第七天，將大鼠安樂(lè)死并切除乳房脂肪墊。分析該脂肪墊的酪蛋白激酶II mRNA作為終芽增生的標(biāo)記。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR分析酪蛋白激酶II mRNA。簡(jiǎn)言之，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明、按照Trizol(GibcoBRL，Grand Island，NY)分離RNA，使用不含DNA的試劑盒(Ambion)、用DNAse處理樣本，使用Taqman Gold方法(PE AppliedBiosystems)通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定酪蛋白激酶II mRNA水平。使用酪蛋白激酶II特有的引物對(duì)(5′引物，CACACGGATGGCGCATACT，SEQ IDNO1；3′引物，CTCGGGATGCACCATGAAG，SEQ ID NO2)和專用探針(TAMRA-CGGCACTGGTTTCCCTCACATGCT-FAM，SEQ ID NO3)一式三份分析共50ng RNA。使用由PE Applied Biosystems提供的引物和探針，將酪蛋白激酶II mRNA水平歸一化為每一個(gè)樣本反應(yīng)中含有的18s核糖體RNA。
在炎性腸疾病的HLA大鼠標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法中的評(píng)價(jià)在模擬人炎性腸疾病的HLA大鼠標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法中可評(píng)價(jià)代表性的化合物。以下簡(jiǎn)要描述所用的方法和獲得的結(jié)果。從Taconic獲得雄性HLA-B27大鼠，大鼠可自由攝食(PMI實(shí)驗(yàn)室飼料5001)和飲水。對(duì)大鼠一日一次用載體(50％DMSO/50％1x Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水)或受試化合物(0.1至10mg/kg)皮下給藥至少一周。每天觀察糞便質(zhì)量并根據(jù)下列評(píng)分表進(jìn)行評(píng)分腹瀉＝3；軟便＝2；正常便＝1。在研究結(jié)束時(shí)，收集血清并儲(chǔ)存在-70℃。制備用于組織學(xué)分析的結(jié)腸切片，分析另一段以確定髓過(guò)氧化物酶活性。
為了組織學(xué)分析，將結(jié)腸組織浸于10％中性緩沖的福爾馬林中。將結(jié)腸的每一標(biāo)本分成用于評(píng)價(jià)的4個(gè)樣本。將福爾馬林固定的組織在TissueTek真空滲入處理機(jī)(Miles，Inc；West Haven，Connecticut)中處理進(jìn)行石蠟包埋。將樣本以5μm切片，然后用蘇木精和曙紅(H&E)染色，使用Boughton-Smith修正后的評(píng)分表進(jìn)行盲法組織學(xué)評(píng)價(jià)。在評(píng)分完成之后將樣本破盲，將數(shù)據(jù)制成表，通過(guò)具有多均值比較的ANOVA線性模型分析數(shù)據(jù)。對(duì)結(jié)腸組織切片進(jìn)行數(shù)種疾病指征的評(píng)價(jià)并給出相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。
在三種關(guān)節(jié)炎模型中的評(píng)價(jià)Lewis大鼠佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)裝備操作程序飼養(yǎng)60只雌性12周齡Lewis大鼠。它們接受標(biāo)準(zhǔn)的攝食方案并自由飲水。每只動(dòng)物通過(guò)標(biāo)示項(xiàng)目組和動(dòng)物號(hào)的籠卡進(jìn)行識(shí)別。每只大鼠的編號(hào)通過(guò)尾部不能拭除的墨水記號(hào)進(jìn)行標(biāo)記。在研究前至少10-21天將它們麻醉并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌手術(shù)技術(shù)切除卵巢。
使用Freund完全佐劑(Sigma Immuno Chemicals，St.Louis，MO)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，每毫升含有1mg熱殺滅并干燥的結(jié)核分支桿菌、0.85mL礦物油和0.15mL二縮甘露醇單油酸酯，批號(hào)為084H8800。
下列為兩種實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)施例。抑制實(shí)驗(yàn)方法將30只大鼠在大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.1mL Freund完全佐劑。將動(dòng)物隨機(jī)分成4組，每組含有6只大鼠。每天各組接受載體(50％DMSO(JT Baker，Phillipsburg，NJ)/1xDulbecco磷酸鹽鹽水(GibcoBRL，Grand Island，NY))或受試化合物(0.1-10mg/kg，皮下施用)。所有大鼠在第1天開(kāi)始處理。
處理實(shí)驗(yàn)方法將30只大鼠在大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.1mL Freund完全佐劑。將動(dòng)物隨機(jī)分成4組，每組含有6只大鼠。每天各組接受載體(50％DMSO(JT Baker，Phillipsburg，NJ)/1x Dulbecco磷酸鹽鹽水(GibcoBRL，Grand Island，NY))或受試化合物(0.1-10mg/kg，皮下施用)。所有大鼠在佐劑注射后的第8天開(kāi)始處理。
使用Abacus Concepts Super ANOVA(Abacus Concepts，Inc.，Berkeley，CA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)所有感興趣的參數(shù)進(jìn)行方差分析以及組間Duncan新多范圍post hoc檢驗(yàn)。自始至終以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示數(shù)據(jù)，如果p＜0.05則認(rèn)為差別是顯著的。
依據(jù)下列疾病指數(shù)每天監(jiān)察關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性的程度后爪紅斑、后爪腫脹、關(guān)節(jié)觸痛、運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)。使用0至3的整數(shù)評(píng)分表來(lái)定量紅斑水平(0＝正常爪、1＝輕微紅斑、2＝中度紅斑、3＝嚴(yán)重紅斑)和腫脹(0＝正常爪、1＝輕微腫脹、2＝中度腫脹、3＝后爪嚴(yán)重腫脹)。每天的最高得分是12。
在研究結(jié)束時(shí)，將大鼠用CO2安樂(lè)死，在尸體剖檢時(shí)取出后肢并固定在10％緩沖的福爾馬林中，將跗關(guān)節(jié)脫鈣并包埋在石蠟中。將組織切片用蘇木精和曙紅或藏紅O-固綠染色。
將載玻片進(jìn)行編碼使得檢查人無(wú)從知曉處理組?；谌缦铝谐龅幕ぴ錾?、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管翳形成[Poole和Coombs，International Archivesof Allergy & Applied Immunology，1997，54，97-113]評(píng)價(jià)來(lái)自跗關(guān)節(jié)的滑膜組織。
除此之外，使用如下所示的Mankin組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)[Mankin等人，Journal of Bone & JointSurgery-American Volume，1971，53，523-37]評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)軟骨和骨。
在關(guān)節(jié)炎HLA-B27大鼠模型中的評(píng)價(jià)在模擬人關(guān)節(jié)炎的HLA-B27大鼠標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法中評(píng)價(jià)代表性的化合物。以下簡(jiǎn)要描述所用的方法。從Taconic獲得雄性HLA-B27大鼠，大鼠可自由攝食(PMI實(shí)驗(yàn)室飼料5001)和飲水。對(duì)大鼠一日一次用載體(50％DMSO/50％1x Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水)或受試化合物(0.1至10mg/kg)皮下給藥至少一周。如上對(duì)于佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎Lewis大鼠模型所述評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)得分和組織學(xué)。
在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中的評(píng)價(jià)在6-8周齡的BALB/c小鼠中評(píng)價(jià)化合物，其中通過(guò)對(duì)抗II型膠原的單克隆抗體加脂多糖(LPS)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。在第0天對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)施用總量為4mg/小鼠的4種不同mAbs的組合，72小時(shí)之后(第3天)靜脈施用25μgLPS。從第3天開(kāi)始，在使用LPS后一小時(shí)，每天一次口服給予受試化合物，共15天。對(duì)于每只動(dòng)物，在第0、5、7、10、14和17天使用帶有水池(直徑12mm)的器官充滿度測(cè)量器測(cè)量?jī)芍缓笞Φ捏w積增加。計(jì)算體積增加的百分抑制。
在體內(nèi)致癌作用模型中的評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物治療或抑制多種惡性腫瘤或過(guò)度增生疾病的能力可在文獻(xiàn)中容易獲得的標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法中評(píng)價(jià)，包括以下兩種方法。
乳癌切除卵巢的無(wú)胸腺nu/nu小鼠(裸鼠)從Charles River實(shí)驗(yàn)室(Wilmington，MA)獲得。在注射腫瘤細(xì)胞的前一天，對(duì)動(dòng)物植入含有0.36-1.7mg 17β-雌二醇的延時(shí)-釋放小丸(在60或90天釋放，InnovativeResearch of America，Sarasota，F(xiàn)L)或安慰劑。使用10號(hào)精密套針將小丸皮下引入到肩胛區(qū)內(nèi)。隨后，將1×107MCF-7細(xì)胞或1×107BG-1細(xì)胞皮下注射入小鼠的乳腺組織。將細(xì)胞與相同體積的matrigel-一種促進(jìn)腫瘤固定的基膜基質(zhì)制劑-混合。通過(guò)在腫瘤細(xì)胞植入后一天給藥(抑制方案)或在腫瘤已經(jīng)達(dá)到一定大小后給藥(治療方案)可評(píng)價(jià)受試化合物。每天腹膜內(nèi)或口服施用含1％吐溫-80鹽水載體中的化合物。每三天或七天評(píng)價(jià)腫瘤的大小。
結(jié)腸癌在Smirnoff的實(shí)驗(yàn)方法[Oncology Research，1999，11，255-64]中可評(píng)價(jià)治療或抑制結(jié)腸癌的能力。
在兩種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法中對(duì)神經(jīng)保護(hù)的評(píng)價(jià)在蒙古沙鼠中的短暫性全腦缺血使用下列的實(shí)驗(yàn)方法，可測(cè)定受試化合物預(yù)防或治療由于缺氧/再灌注造成的腦損傷的作用。
將雌性蒙古沙鼠(60-80g；Charles River實(shí)驗(yàn)室，Kingston，NY)飼養(yǎng)于Wyeth-Ayerst動(dòng)物護(hù)理設(shè)施(獲AAALAC認(rèn)證)中，光周期為12小時(shí)白晝12小時(shí)黑夜，沙鼠可自由飲用自來(lái)水和低雌激素酪蛋白飼料(Purina；Richmond，IN)。在適應(yīng)后(3-5天)，將沙鼠用異氟烷(與O2的2-3％混合物)麻醉，切除卵巢(第0天)。從第二天早晨開(kāi)始(第1天)，每天對(duì)沙鼠皮下注射載體(10％ETOH/玉米油)、17β-雌二醇(1mg/kg)或?qū)嶒?yàn)化合物(0.1-20mg/kg)。在第6天，將沙鼠(n＝4-5只/組)用異氟烷麻醉，通過(guò)正中線頸切開(kāi)術(shù)使頸總動(dòng)脈可視，用非創(chuàng)傷性微動(dòng)脈瘤夾同時(shí)將兩動(dòng)脈阻塞5分鐘。在阻塞之后，移去夾子使大腦再灌注，并用創(chuàng)傷夾關(guān)閉頸切口。在全腦缺血外科手術(shù)之前，將所有動(dòng)物禁食過(guò)夜，這是一項(xiàng)有助于缺血損傷一致的的步驟。在第12天，將沙鼠暴露于致死劑量的CO2，在干冰上將大腦冷凍并儲(chǔ)存在-80℃。
通過(guò)神經(jīng)顆粒素(neurogranin)mRNA的原位雜交分析評(píng)價(jià)神經(jīng)保護(hù)的程度。簡(jiǎn)言之，在明膠包衣的載玻片上收集20μm冠狀恒冷箱切片，干燥并貯存在-80℃。在處理時(shí)，將干燥的載玻片盒溫?zé)嶂潦覝?，將載玻片固定在4％的低聚甲醛中后，用乙酸酐處理，然后用氯仿和乙醇脫脂和脫水。然后將已處理的安放切片的載玻片與200μl(6×106DPM/載玻片)的神經(jīng)顆粒素(35S-UTP-標(biāo)記的NG-241；堿基99-340)的反義或正義(對(duì)照)核糖核酸探針在50％甲酰胺雜交混合液中進(jìn)行雜交，并在55℃在沒(méi)有蓋玻片的潮濕載玻片槽中孵育過(guò)夜。在第二天早晨，將載玻片收集在架子上，浸入2xSSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉；pH7.0)/10mM DTT中，用RNA酶A(20μg/ml)處理并在67℃在0.1xSSC中洗滌(2×30分鐘)以除去非特異性標(biāo)記。在脫水之后，將載玻片對(duì)BioMax(BMR-1；Kodak)X射線膠片過(guò)夜。
用神經(jīng)顆粒素雜交信號(hào)的水平來(lái)定量地評(píng)估在損傷后CA1區(qū)域神經(jīng)元損失的程度并評(píng)價(jià)17β-雌二醇和實(shí)驗(yàn)化合物的有效性。選擇神經(jīng)顆粒素mRNA用于這些研究是因?yàn)樗诎–A1的海馬神經(jīng)元中高度表達(dá)，但在該腦部區(qū)域的神經(jīng)膠質(zhì)和其他細(xì)胞類型中不存在。所以，存在的神經(jīng)顆粒素mRNA的量的測(cè)量值代表了存活的神經(jīng)元。用基于計(jì)算機(jī)的圖像分析系統(tǒng)(C-Imaging Inc.，Pittsburgh，PA)從膠片放射自顯影中獲得神經(jīng)顆粒素雜交信號(hào)的相對(duì)光密度測(cè)定值。將來(lái)自每只動(dòng)物的6個(gè)切片(相隔40μm)的結(jié)果平均并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)。以均值±SEM報(bào)告數(shù)值。使用方差單向分析來(lái)檢驗(yàn)神經(jīng)顆粒素mRNA水平的差別，在結(jié)果部分所有無(wú)差別陳述意味著p＞0.05。
小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞根據(jù)Dubal描述的實(shí)驗(yàn)方法[參閱Dubal等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，2001，98，1952-1957，Dubal等人，Journal of Neuroscience，1999，19，6385-6393]可評(píng)價(jià)神經(jīng)保護(hù)。
排卵抑制標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法該實(shí)驗(yàn)方法用以確定受試化合物是否可抑制或改變排卵時(shí)間。其也可用于確定排出的卵母細(xì)胞的數(shù)量[Lundeen等人，J.Steroid Biochm.Mol.Biol.，2001，78，137-143]。
移植排斥為測(cè)試受試化合物預(yù)防移植排斥的能力?？稍谛呐K移植(Stetson等人，Circulation，2001，104676-682)或移植動(dòng)脈粥樣硬化(Deitrich等人，Arterioscler.Thromb. Vasc Biol.，2000，20343-352；Lou等人，Circulation，1996，94，3355-3361)的動(dòng)物模型中測(cè)試化合物。
再狹窄的預(yù)防該實(shí)驗(yàn)方法用以確定受試化合物是否可抑制類似于球囊血管成形術(shù)后出現(xiàn)的頸動(dòng)脈損傷后血管平滑肌細(xì)胞增生。在先前描述的動(dòng)物模型(Karas等人，Circ Res.，2001，89，534-539；Cerek等人，Atherosclerosis，1997，131，59-66)中可測(cè)試受試化合物。
心肌梗塞的治療在缺血/再灌注動(dòng)物模型中可測(cè)試受試化合物，以確定它們是否可抑制在心肌梗塞中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡。在先前描述的模型中可檢測(cè)該化合物(Delyani等人，J.Mol.&Cell Cardiology，1996，28，1001-1008；Izumi等人，J.Clin.Invest.，2001，108，203-213；Chandrasekar等人，Circulation，2001，103，2296-2302)。
心肌炎和充血性心力衰竭的治療在心力衰竭模型中可測(cè)試受試化合物，以確定化合物是否可有效治療和改善心臟功能?？扇缜八鲈趧?dòng)物中測(cè)試化合物(Yokoseki等人，Circ.Res.，2001，89，1-9；Wallen等人，Hypertension，2000，36，774-779；Toshiaki等人，Circulation，2001，104，1094-1103)。
糖尿病的治療在糖尿病的模型中可測(cè)試受試化合物，以確定它們?cè)谀孓D(zhuǎn)肥胖癥和飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗中的作用?？扇缜八鲈趧?dòng)物模型中測(cè)試化合物(Yuan等人，Science，2001，2931673-1677)。
哮喘的治療肺炎癥模型在第0天和第14天(ip注射)用在明礬中乳化的OVA使小鼠致敏。在第28天和第29天，用OVA氣霧劑激發(fā)20分鐘(1％-5％OVA)，然后在第30天將動(dòng)物處死并收獲BAL和/或肺組織用于肺炎癥分析。
氣道高反應(yīng)性該模型與上述類似，但動(dòng)物連續(xù)3天用OVA氣霧劑激發(fā)，并在最后激發(fā)之后48小時(shí)測(cè)定氣道的高反應(yīng)性。如果需要在該階段也可取得BAL。
為了更直接地觀察對(duì)肥大細(xì)胞連同ER的影響，可使用被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)模型，其中將IgE注射入耳，然后在24小時(shí)之后靜脈注射DNP-HSA。測(cè)量耳的厚度和早期和后期反應(yīng)。此外，在K2中固定組織并包埋入環(huán)氧樹(shù)脂，切成1μm切片。這些可就肥大細(xì)胞染色并對(duì)肥大細(xì)胞脫粒程度進(jìn)行定量。
基于標(biāo)準(zhǔn)藥理實(shí)驗(yàn)方法中獲得的結(jié)果，本發(fā)明的化合物為本文所述的選擇性的抗炎化合物，可用于治療和預(yù)防慢性炎性疾病而不會(huì)如在典型雌激素中發(fā)現(xiàn)的那樣刺激子宮和乳腺細(xì)胞的增生。
相應(yīng)地，本發(fā)明的化合物可用于治療或抑制骨質(zhì)疏松癥、抑制骨脫礦質(zhì)作用，骨脫礦質(zhì)作用可因個(gè)體新骨組織形成和老組織吸收的不平衡而引起并導(dǎo)致凈骨丟失。這類骨缺失在一定范圍的個(gè)體中產(chǎn)生，特別是絕經(jīng)后婦女、雙側(cè)卵巢切除的婦女、正在接受或已經(jīng)接受長(zhǎng)期皮質(zhì)類固醇療法的那些、患有性腺發(fā)育不全的那些以及患有Cushing綜合征的那些。對(duì)于包括牙和口腔骨在內(nèi)的骨替換的特殊需求也可以在骨折、骨結(jié)構(gòu)缺陷以及正在接受骨有關(guān)外科手術(shù)和/或植入假體的那些個(gè)體中使用這些化合物而得到解決。除了上述那些問(wèn)題外，這些化合物可用于治療或抑制骨關(guān)節(jié)炎、低鈣血癥、高鈣血癥、佩吉特病、骨軟化癥、骨鈣質(zhì)缺乏、多發(fā)性骨髓瘤和其他形式對(duì)骨組織具有害作用的癌癥。
本發(fā)明的化合物在腦中也是有活性的，所以可用于抑制或治療阿爾茨海默病、認(rèn)知減退、性欲降低、老年癡呆、神經(jīng)變性疾病、抑郁癥、焦慮、失眠、精神分裂癥和不育。本發(fā)明的化合物也可用于治療或抑制良性或惡性的異常組織生長(zhǎng)，其包括腎小球硬化、前列腺肥大、子宮平滑肌瘤、乳癌、硬皮病、纖維瘤病、子宮內(nèi)膜異位(endometriosis)、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜息肉、良性乳房疾病、子宮內(nèi)膜異位(adenomyosis)、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、CNS癌癥，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形母細(xì)胞瘤(astroblastoma)。
本發(fā)明的化合物是心臟保護(hù)劑和抗氧劑，可用于降低膽固醇、甘油三酯、Lp(a)、LDL水平；抑制或治療高膽固醇血癥、高脂血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、周圍血管疾病、再狹窄和血管痙攣，并抑制來(lái)自導(dǎo)致免疫介導(dǎo)血管損傷的細(xì)胞事件的血管壁損傷。
本發(fā)明的化合物也可用于治療與炎癥或自身免疫病相關(guān)的疾病，包括炎性腸疾病(局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、不確定性結(jié)腸炎)、關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、骨關(guān)節(jié)炎)、胸膜炎、缺血/再灌注損傷(例如中風(fēng)、移植排斥、心肌梗塞等)、哮喘、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、前列腺炎、眼色素層炎、銀屑病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和膿毒病。
本發(fā)明的化合物也可用于治療或抑制眼疾病，包括白內(nèi)障、眼色素層炎和黃斑變性，并治療皮膚病癥如老齡化、脫發(fā)和痤瘡。
本發(fā)明的化合物也可用于治療或抑制代謝性疾病如II型糖尿病、脂類代謝疾病、食欲(例如神經(jīng)性厭食和貪食癥)。
本發(fā)明的化合物也可用于治療或抑制出血性疾病例如遺傳性出血性毛細(xì)管擴(kuò)張、功能障礙性子宮出血，并用于對(duì)抗出血性休克。
本發(fā)明的化合物可用于其中閉經(jīng)有利的疾病狀態(tài)，例如白血病、子宮內(nèi)膜剝離、慢性腎或肝疾病或凝結(jié)疾病或疾患。
依據(jù)受試化合物阻滯炎癥基因表達(dá)并在活性上具有選擇性——因?yàn)槲从^察到子宮濕重誘導(dǎo)——的能力，提示了受試化合物的抗炎作用。
所有專利、出版物和引用其他文件全部引用在此作為參考。
權(quán)利要求
1.下式的化合物和其可藥用鹽、水合物和溶劑合物， 其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地是氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基、硝基、氰基、烷硫基、CF3、OCF3或OH；且R4為氫、烷基、鏈烯基、芳基烷基、環(huán)烷基-甲基或雜環(huán)基-烷基；條件是R1、R2、R3和R4中至少一個(gè)不是氫。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R4是H。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中R1、R2和R3中至少一個(gè)是鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基、硝基、氰基、烷硫基、CF3、OCF3或OH。
4.權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)的化合物，其中R1和R2各自獨(dú)立地是氫、鹵素、烷基、烷氧基、氰基、CF3或OH。
5.權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)的化合物，其中R1和R2是相同的。
6.權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)的化合物，其中R3是氫、烷基、鏈烯基、烷基芳基或雜環(huán)基-甲基。
7.權(quán)利要求1至6任意一項(xiàng)的化合物，其中R1和R2各自是氫、鹵素、烷基或烷氧基。
8.權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)的化合物，其中R3是烷基、烯丙基或芐基。
9.權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)的化合物，其中R1和R2各自為H，且R3為鹵素、烷基、烷氧基、氰基、CF3或OH。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中R1和R2各自為H，且R3為鹵素、烷基或烷氧基。
11.權(quán)利要求1至10任意一項(xiàng)的化合物，其中R4是H。
12.權(quán)利要求9至11任意一項(xiàng)的化合物，其中R3是甲基或甲氧基。
13.權(quán)利要求1的化合物，其為2-[(2-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(3-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(2-甲基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈2-[(4-甲基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(4-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]丙二腈、2-[(2-甲氧基苯基)(1-萘基)甲基]-2-甲基丙二腈，或2-[二(1-萘基)甲基]丙二腈。
14.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物和可藥用賦形劑、稀釋劑或載體。
15.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制慢性炎性疾病的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
16.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎或幼年關(guān)節(jié)炎的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
17.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制炎性腸疾病、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎或不確定性結(jié)腸炎的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
18.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制銀屑病的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
19.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制哮喘或慢性梗阻性肺疾病的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
20.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制中風(fēng)、缺血或再灌注損傷的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
21.在有需要的哺乳動(dòng)物中降低膽固醇、甘油三酯、Lp(a)和LDL的水平、抑制或治療高膽固醇血癥、高脂血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征、周圍血管疾病、再狹窄或血管痙攣的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
22.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制阿爾茨海默病、認(rèn)知減退或老年癡呆的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
23.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制II型糖尿病的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
24.在有需要的哺乳動(dòng)物中治療或抑制膿毒病的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物。
25.權(quán)利要求1至13任意一項(xiàng)的化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于在哺乳動(dòng)物中治療或抑制慢性炎性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、幼年關(guān)節(jié)炎、炎性腸疾病、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、不確定性結(jié)腸炎、銀屑病、哮喘、慢性梗阻性肺疾病、中風(fēng)、缺血、再灌注損傷、高膽固醇血癥、高脂血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征、周圍血管疾病、再狹窄、血管痙攣、阿爾茨海默病、認(rèn)知減退、老年癡呆、II型糖尿病、膿毒病，或用于降低膽固醇、甘油三酯、Lp(a)或LDL的水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)化合物，其中R
文檔編號(hào)A61P29/00GK1989101SQ200580024211
公開(kāi)日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日
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