專利名稱：含蜂蠟的抗血管發(fā)生組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含協(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟的組合物。具體而言，本發(fā)明涉及包含鯊魚肉提取物或者貝類肉提取物以及蜂蠟的組合物。本發(fā)明還涉及一種治療或者預防可期望用本發(fā)明的組合物抑制血管發(fā)生的疾病或障礙的方法。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生是新血管的生長和增殖。在很多生理和病理狀況中血管發(fā)生起重要作用。在健康身體中，在創(chuàng)傷愈合的增殖期間出現(xiàn)血管發(fā)生，用于在損傷或損害之后恢復血液向組織流動，還出現(xiàn)在女性每月生殖周期和妊娠期間。
健康身體通過一系列“開”和“關(guān)”轉(zhuǎn)換器(switch)控制血管發(fā)生。已知“開”轉(zhuǎn)換器是刺激血管發(fā)生的生長因子，“關(guān)”轉(zhuǎn)換器被稱為血管發(fā)生抑制劑。在正常健康身體中，血管發(fā)生生長因子和血管發(fā)生抑制劑的表達被精確地平衡，以促進血管發(fā)生的活化和抑制。
血管發(fā)生失控可以導致很多嚴重疾病狀態(tài)。很多已知的病況由所謂的“過度血管發(fā)生”所導致。這些病況包括關(guān)節(jié)炎(Giatromanolaki etal.，Arthritis Research & Therapy，5R193-201；DeBusk et al.，Arthritis& Rheumatism，482461-71)、視網(wǎng)膜病(Bainbridge et al.，ClinicalScience，104561-75；Umeda et al.，Ophthalmic Research，35217-23)、黃斑變性(Bainbridge et al.，Clinical Science，104561-75；Yamaza et al.，Journal of Electron Microscopy，51127-31；Ohno-Matsui et al.，Journalof Cellular Physiology，189323-33)和腫瘤(Sivridis et al.，Journal ofPathology，201173-80；Longo et al.，Angiogenesis，5237-56)。血管發(fā)生抑制劑將阻礙這些病況的進展。
已有很多已知的抗血管發(fā)生化合物和制劑(Scappaticci，ExpertOpinion on Investigational Drugs，12923-32；Caceres and Gonzalez，Puerto Rico Health Sciences Journal，22149-51)，包括基于脂質(zhì)的制劑。其中之一來源于幾種鯊魚的肌組織。
知道鯊魚軟骨具有抗血管發(fā)生活性已經(jīng)有一段時間。最近研究已經(jīng)顯示，當通過體外和體內(nèi)方法評估時，從鯊魚肉獲得的提取物具有顯著的抗血管發(fā)生活性(見PCT/NZ01/00285，公開號WO 02/49654)。
通過溶劑萃取/然后去除溶劑所獲得的鯊肉提取物是粘性油，其中含有某些在放置時趨向沉降的顆粒物質(zhì)。在明膠膠囊中，這種沉降可以導致膠囊形狀的變形。為了解決這種問題，將蜂蠟加入所述提取物。
然而，令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)蜂蠟不僅減少了膠囊形狀的變形，而且蜂蠟和提取物的組合增強了提取物的抗血管發(fā)生作用。從蜂蠟的已知特性中根本預見不到這一點。
然后考慮蜂蠟的存在是否可以增強具有抗血管發(fā)生活性的其他天然產(chǎn)物提取物的活性。申請人發(fā)現(xiàn)蜂蠟能夠增強來自貝殼魚肉提取物的抗血管發(fā)生活性。申請人也發(fā)現(xiàn)在蜂蠟存在時，鯊肉提取物與蘑菇提取物組合的抗血管發(fā)生活性得到增強。
蜂蠟能增強一系列天然產(chǎn)物提取物的血管發(fā)生活性這一驚人發(fā)現(xiàn)構(gòu)成了本發(fā)明的基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供包含協(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟的抗血管發(fā)生組合物，或者至少提供有用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在第一個方面中，本發(fā)明提供一種抗血管發(fā)生組合物，其包含協(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述提取物是鯊肉提取物，優(yōu)選鯊肉是鯊魚的肌肉組織。作為替代，所述提取物可以是貝類肉提取物，優(yōu)選新西蘭青口貝-青邊貽貝(Perna canaliculus)。
在進一步實施方案中，抗血管發(fā)生提取物是鯊肉提取物和蘑菇提取物的組合。蘑菇提取物可以是具有抗血管發(fā)生活性的任何蘑菇的提取物，但是優(yōu)選朝鮮蘑菇(裂蹄針層孔菌(Phellinus linteus))或者灰樹花(Maitake)蘑菇(貝葉多孔菌(Grifola frondosa))。
優(yōu)選所述組合物進一步包含食用油，例如橄欖油。也優(yōu)選所述組合物包含維生素E。
所述組合物可以包含將產(chǎn)生協(xié)同抗血管發(fā)生作用的任何比率的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟量，但是該比率優(yōu)選為1∶1-10∶1，最優(yōu)選約為4∶1或5∶1。
在本發(fā)明的第二個方面中，提供一種治療或預防期望抑制血管發(fā)生的疾病或障礙的方法，其包含向?qū)ο笫┯煤瑓f(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟的抗血管發(fā)生組合物。
本發(fā)明也提供包含協(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟的抗血管發(fā)生組合物的用途，其用于制備用于預防或治療期望抑制血管發(fā)生的疾病或障礙的藥物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，疾病或障礙是關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病、黃斑變性、或癌癥。優(yōu)選對象是人。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種抗血管發(fā)生組合物，其包含協(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟。具體而言，本發(fā)明涉及包含協(xié)同有效量的鯊肉提取物或貝類肉提取物與蜂蠟一起的抗血管發(fā)生組合物，任選還包含蘑菇提取物。
本文所用術(shù)語“提取物”意指通過任何提取方法獲得的物質(zhì)，無論粗提取物是否已經(jīng)通過常用方法如色譜和過濾進行分級或者純化。提取方法包括，但不限于溶劑提取?？梢允褂萌魏芜m合的溶劑。溶劑可以是有機溶劑或者水性溶劑、或者有機和水性溶劑的混合物。乙醇是典型使用的有機溶劑(或者水乙醇混合物)，但也可以使用其他有機溶劑。提取溶劑也可以是超臨界流體如超臨界CO2。
本文使用的術(shù)語“鯊肉”意指任何鯊魚或者鯊魚樣生物的任何肉(meat or flesh)，所述鯊魚樣生物包括但不限于，角鯊(dogfish)、rig(lemonfish)、翅鯊(school shark)、魔鬼鯊(ghost shark)、灰鯖鯊(mako)、藍鯊(blue shark)、象鼻鯊(elephant fish)、salmon shark、和黑鰭礁鯊(blacktip reef shark)。
本文所用術(shù)語“貝類提取物”意指從任何貝殼魚品種的肉獲得的提取物，其包括但不限于，新西蘭青口貝(青邊貽貝)和藍貝(紫貽貝(Mytilus edulis))。
本文所用術(shù)語“蘑菇提取物”意指從任何蘑菇獲得的提取物，其包括但不限于，朝鮮蘑菇(裂蹄針層孔菌)或者灰樹花(貝葉多孔菌)。
本文所用術(shù)語“蜂蠟”意指含任何類型蜂蠟的任何組合物或制劑。蜂蠟可以是cappings wax、melt out wax、或者任何其他適合形式或類型的蜂蠟。
申請人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)含蜂蠟以及抗血管發(fā)生提取物如鯊肉提取物或者貝類提取物的組合物，與無蜂蠟的提取物相比顯示出顯著增強的抗血管發(fā)生活性。
表1(下面)顯示含鯊肉提取物制品和蜂蠟的組合物的抗血管發(fā)生活性。當加入蜂蠟時，提取物的抗血管發(fā)生活性加倍還要多。在100μg/ml高濃度下，蜂蠟僅僅產(chǎn)生47％的抑制。這種蜂蠟濃度大約是鯊肉提取物-蜂蠟混合物中蜂蠟濃度的40倍。因此，經(jīng)提取物-蜂蠟組合所證實的52.3％抑制指示了通過組合蜂蠟和鯊肉提取物產(chǎn)生協(xié)同抗血管發(fā)生作用。
也針對青口貝提取物以及含該提取物和蜂蠟的組合物測試了它們的抗血管發(fā)生活性。單獨貝類提取物只具有比鯊肉提取物略低的抗血管發(fā)生作用。表2(下面)顯示貝類提取物以及含該提取物和蜂蠟的組合物的活性。當將蜂蠟加入青口貝提取物時，其抗血管發(fā)生活性顯著增加(三倍)。
同樣，單獨蜂蠟的抗血管發(fā)生活性相對于蜂蠟和青口貝提取物的組合的抗血管發(fā)生活性是最小的。高濃度(100μg/ml)的蜂蠟溶液引起約50％的抑制，而40倍稀釋的蜂蠟溶液增加貝類提取物的抗血管發(fā)生活性超過三倍。
起初認為蜂蠟僅僅維持含鯊肉提取物的明膠膠囊的完整性和形狀。迄今為止，還沒有證據(jù)提示蜂蠟本身具有任何抗血管發(fā)生活性。因此已經(jīng)假設(shè)，蜂蠟應當是惰性組分。然而，當以4∶1的比率加入蜂蠟時，驚訝地發(fā)現(xiàn)將蜂蠟加入提取物使抗血管發(fā)生活性加倍。
蜂蠟對抗血管發(fā)生活性的這種作用進一步得到青口貝提取物的數(shù)據(jù)支持。該貝類提取物具有相對低的抗血管發(fā)生活性(事實上，它的抗炎活性更被熟知)。然而，令人驚奇的是，以4∶1比率加入蜂蠟使其抗血管發(fā)生活性增加超過三倍。
蜂蠟調(diào)節(jié)鯊肉提取物和貝類提取物的抗血管發(fā)生活性的事實指示，蜂蠟可以對一定范圍具有抗血管發(fā)生活性的其他天然產(chǎn)物提取物發(fā)揮協(xié)同作用。
參考以下實施例進一步描述本發(fā)明。應該理解本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例實施例1體外抗血管發(fā)生試驗從大鼠中取出主動脈，并且在將其切成約3mm大小的環(huán)之前，清除粘附的脂肪和結(jié)締組織。將纖維蛋白原鋪層到多孔培養(yǎng)板的孔底，并且經(jīng)凝血酶作用使之形成凝膠。然后將環(huán)鋪層在每個凝膠的頂部，并在其上再放置一層纖維蛋白。在補充抗生素的MCDB131培養(yǎng)基中制備纖維蛋白原。然后用含測試材料的MCDB131覆蓋雙層纖維蛋白。在37℃下，在3％CO2/97％空氣的環(huán)境中培養(yǎng)所述凝膠。使用倒置顯微鏡檢查所述環(huán)，并且觀察從每個環(huán)周邊的微血管生長。每2天拍攝這些的數(shù)字圖象，并用NIH圖象軟件確定相對于環(huán)大小的微血管生長程度。由此可以確定每個孔的微血管生長速率。每種測試物質(zhì)試驗三次并計算平均生長速率。
實施例2鯊肉提取物和蜂蠟通過用乙醇提取粉末或凍干鯊肉隨后過濾并去除溶劑而獲得的鯊肉提取物，以及該提取物加蜂蠟，根據(jù)實施例1的方法測試它們的抗血管發(fā)生活性。結(jié)果顯示于表1。
表1血管發(fā)生的抑制百分數(shù)

實施例3貝類提取物和蜂蠟通過用乙醇提取粉末或凍干貝類肉隨后過濾并去除溶劑而獲得的青口貝提取物，以及該貝類提取物加蜂蠟，根據(jù)實施例1的方法測試它們的抗血管發(fā)生活性。結(jié)果顯示于表2。
表2血管發(fā)生的抑制百分數(shù)

實施例4鯊肉提取物/蘑菇提取物和蜂蠟使用實施例1的方法，鯊肉提取物和朝鮮蘑菇(裂蹄針層孔菌)提取物(用乙醇提取粉末化蘑菇接著過濾并去除溶劑而獲得)以9∶1的重量比的混合物，顯示具有顯著的抗血管發(fā)生活性。當將蜂蠟加入該混合物使蜂蠟與提取物混合物的比例為1∶4，其活性進一步增強(表3)。
使用灰樹花蘑菇(貝葉多孔菌)提取物和鯊肉提取物制備類似制劑。再次，蜂蠟的加入增強其抗血管發(fā)生活性。
表3血管發(fā)生的抑制百分數(shù)

對于鯊肉提取物/裂蹄針層孔菌提取物(9∶1)和鯊肉提取物/貝葉多孔菌提取物(9∶1)，蜂蠟的加入使其抗血管發(fā)生活性都提高了62-65％。
盡管已經(jīng)通過參考實施例描述了本發(fā)明，但是應當理解不偏離本發(fā)明的范圍可以做出變化和修改。而且，對于具體特征所存在的已知等同物，這些等同物也被并入本發(fā)明，就像在本說明書中具體描述。
工業(yè)實用性本發(fā)明的抗血管發(fā)生組合物可用于治療或預防廣泛的疾病。這些包括與血管發(fā)生相關(guān)的疾病，如關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病、黃斑變性、和癌癥。
權(quán)利要求
1.一種抗血管發(fā)生組合物，其含有協(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中抗血管發(fā)生提取物是鯊肉提取物。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中鯊肉提取物是鯊魚肌肉組織提取物。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中抗血管發(fā)生提取物是貝類肉提取物。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中貝類肉從新西蘭青口貝獲得。
6.權(quán)利要求3的組合物，其另外還包含蘑菇提取物。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中蘑菇是朝鮮蘑菇(裂蹄針層孔菌(Phellinus linteus))或者灰樹花蘑菇(貝葉多孔菌(Grifola frondosa))。
8.前述任一項權(quán)利要求的組合物，進一步含食用油。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中食用油是橄欖油。
10.前述任一項權(quán)利要求的組合物，進一步含維生素E。
11.前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中抗血管發(fā)生提取物與蜂蠟的比率為1∶1-10∶1。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中比率約為4∶1-5∶1。
13.一種治療或預防可期望抑制血管發(fā)生的疾病或障礙的方法，其包含向?qū)ο笫┯煤瑓f(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟的抗血管發(fā)生組合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中疾病或障礙是關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病、黃斑變性、或癌癥。
15.含協(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟的抗血管發(fā)生組合物的用途，其用于制備用于預防或治療可期望抑制血管發(fā)生的疾病或障礙的藥物。
16.權(quán)利要求15的用途，其中疾病或障礙是關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病、黃斑變性、或癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含協(xié)同有效量的抗血管發(fā)生提取物和蜂蠟的組合物。本發(fā)明尤其涉及包含鯊魚肉提取物或者貝類提取物以及蜂蠟的組合物，任選地還包括蘑菇提取物。本發(fā)明還涉及一種治療或者預防可期望用本發(fā)明的組合物抑制血管發(fā)生的疾病或障礙的方法。
文檔編號A61K35/64GK101027068SQ200580024757
公開日2007年8月29日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者保羅·弗蘭克·戴維斯 申請人:奧塔哥大學, 免疫研究有限公司