專利名稱：通過花色素苷和花色素分泌胰島素的制作方法
相關申請的交叉參考本申請要求于2004年7月29日提交的序列號為60/591,806的臨時專利申請的優(yōu)先權。
政府權益本發(fā)明受到USDA基金No.2003-35504-13618的資助。美國政府對本發(fā)明有一定權利。
背景技術：
(1)發(fā)明領域本發(fā)明涉及使用花色素苷、花色素或其混合物增加細胞中胰島素產生的方法。本發(fā)明還涉及用于該方法中增加胰島素產生的組合物。所述方法和組合物可以為體內或體外。
(2)相關領域的描述胰島素的功能是保持正常血液葡萄糖水平，這或是通過抑制葡萄糖從肝中的輸出或通過刺激葡萄糖吸收和代謝(Ross，S.A.，等，Chemistry and Biochemistry of diabetes.Chem.Rev.104 1255-1282(2004))而實現的。在靶標組織中胰島素釋放的不充足或胰島素作用的喪失導致異常葡萄糖和脂肪代謝。這就導致血中葡萄糖水平的升高，即糖尿病的特點(Jovanovic，L.，等2-type diabetesThe epidemicof new millennium.Ann.Clin.Lab.Sci.29 33-42(1999))。存在兩種類型的糖尿病，1-型(胰島素-依賴型糖尿病)和2-型糖尿病(非胰島素-依賴型糖尿病)。1-型糖尿病由胰腺β-細胞被自身免疫破壞導致，胰腺β-細胞是分泌胰島素的細胞，從而導致胰島素缺乏。2-型糖尿病更普遍，其是由β-細胞不能分泌足夠量胰島素以克服由遺傳和環(huán)境因素建立的胰島素抗性導致的(Henquin，J.C，Diabetes 49 1751-1760(2000))。胰島素抗性是一種病癥，其中在骨骼肌肉和脂肪中胰島素不能充分刺激葡萄糖轉運，不能充分抑制肝臟葡萄糖產生。發(fā)病機制包括阻止β-細胞分泌足夠量的胰島素以克服就要建立的外周胰島素抗性?？诜笛撬幹苯哟碳ひ葝u素從β-細胞的釋放(例如基于磺酰脲的藥物)，但是，已經表明從2-型糖尿病患者胰島分泌的胰島素可以充分升高以克服外周胰島素抗性和使血液葡萄糖水平正常。使用基于磺酰脲的藥物的缺點之一是不能控制正常血液葡萄糖水平(Pfeiffer，A.F.H.，Oral hypoglycemic agentsSulfonylureas and meglitinides.InB.J.Goldstein，等，(Eds.)、Test book of Type-2 Diabetes.MartinDunitz Ltd.，London第77-85頁(2003))。這些藥物對β-細胞分泌胰島素能力也有不利的影響，并導致重量增加((Pfeiffer，A.F.H.，Oralhypoglycemic agentsSulfonylureas and meglitinides.In B.J.Goldstein，等，(Eds.)、Test book of Type-2 Diabetes.Martin DunitzLtd.，London第77-85頁(2003))。因此，對飲食成分的控制具有調節(jié)血液葡萄糖水平或誘導胰腺β-細胞產生胰島素的作用。
飲食消費量中脂肪量少和抗氧化劑豐富可減少肥胖癥和胰島素抗性的危險(Blakely，S.，等，J.Nutr.133 2838-2844(2003))?；ㄉ剀諏儆诳寡趸缘亩嘣樱嬖谟诟鞣N食物和飲料中?；ㄉ剀盏南M量與幾種退行性疾病例如動脈粥樣硬化、心血管疾病、癌癥和糖尿病危險的減小相關(Jayaprakasam，B.，等，Potent lipid peroxidationinhibitors from Withania somnifera.″Tetrahedron 60 3109-3121(2004))。這些化合物是眾所周知的游離基清除劑，被報導為有效的化學預防物質(Duthie，G.G.，等，Nutr.Res.Rev.13 719-106(2000))。例如通過食用草莓、櫻桃和紅酒增加血清的抗氧化能力(Kang，S.Y.，等，Cane.Lett.194 13-19(2003)；Van Velden，D.P.，等，Ann.New YorkAcad.Sci.957 337-340(2002)；和Wang，H.，等，J.Nat.Prod.62294-296(1999))。最近的研究表明花色素苷、花青素3-糖苷減少高脂肪飲食誘導的小鼠肥胖癥(Tsuda，T.，等，J.Nut.133 2125-2130(2003))。因此，存在于食物中的天然色素由于它們的安全、營養(yǎng)和治療價值而吸引消費者(Espin，J.C，等，J.Agri.Food Chem.481588-1592(2000))。由于花色素苷被廣泛消費，這些化合物另外的生物學活性將引起極大的興趣。
山茱萸種屬果實是花色素苷的豐富來源。歐亞山茱萸(Cornus masL.)的果實還被稱作歐亞山茱萸(European and Asiatic corneliancherry)，在歐洲用于飲料的制備(Millspaugh，CF.，In AmericanMedicinal plants；Dover PublicationsNew York，282(1974))。在傳統(tǒng)藥物學中，已知山茱萸果實的鎮(zhèn)痛和利尿活性(Kim，D.K.，等，Arch.Pharm.Res.21 787-789(1998))。在亞洲國家中山茱萸果實還是幾種抗糖尿病草藥制劑的主要成分之一(Yamahara，J.，等，Yakugaku Zasshi 101 86-90(1981))。我們對歐亞山茱萸和山茱萸果實的早期研究表明兩者均含有高水平的花色素苷(Seeram，N.P.，等，J.Agri.Food chem..50 2519-2523(2002))。
目的因此本發(fā)明的目的是提供增加體外或體內胰島素產生的方法和組合物。從下列描述和附圖中進一步的目的將變得更清楚。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及使分泌胰島素的胰腺細胞增加胰島素分泌的方法，包含提供用于胰腺β細胞的花色素苷或花色素或其混合物，用來使胰島素的分泌比沒有花色素苷時增加?；ㄉ剀諆?yōu)選從果實、蔬菜和花中分離。優(yōu)選在該方法中，花色素苷選自以下組花青素-3-糖苷(Cyanidin-3-glycoside)、飛燕草素-3-糖苷(delphinidin-3-glycoside)、花葵素-3-糖苷(pelargonidin-3-glycoside)及其混合物。胰腺細胞可以為體內的。胰腺細胞可以為體外的。優(yōu)選在該方法中將花色素或花色素苷或其混合物分離和純化。
本發(fā)明還涉及花色素苷或花色素或其混合物作為劑量單位用于增加體內胰島素從胰腺細胞的產生。
優(yōu)選在組合物中花色素苷是從果實、蔬菜和花中分離的。優(yōu)選在組合物中花色素苷選自下組花青素-3-糖苷、飛燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷及其混合物。優(yōu)選在組合物中花色素或花色素苷或其混合物是被分離和純化的。“糖苷”是指任何含有碳水化合物分子(糖)的化合物，特別是指在植物中任何這樣的天然產物，通過水解裂解可轉化為糖和非糖成分(糖苷配基)，并且根據含的糖特別命名為糖苷(葡萄糖)、戊糖苷(戊糖)、果糖苷(果糖)等。
花色素苷引起果實、蔬菜和花多種的明亮的顏色包括紅色、藍色和紫色，作為飲食多元酚被消費。含有花色素苷的果實與減少冠心病有關聯，且用于抗糖尿病制劑。本發(fā)明顯示在體外嚙齒動物胰腺β細胞(INS-I 813/32)中花色素苷、花青素-3-糖苷(1)、飛燕草素-3-糖苷(2)、花青素-3-半乳糖苷(3)和花葵素-3-半乳糖苷(4)；和花色素、花青素(5)、飛燕草素(delphinidin)(6)、花葵素(7)、錦葵色素(8)，和矮牽牛素(petunidin)(9)刺激胰島素分泌的能力。所述化合物在4和10mM葡萄糖濃度存在下進行實驗。在4和10mM葡萄糖濃度下花色素苷和花色素實驗中，花青素-3-糖苷(1)和飛燕草素-3-糖苷(2)是最有效的胰島素促分泌劑?；?3-半乳糖苷是主要花色素苷之一，它的糖苷配基花葵素，在4mM葡萄糖濃度下導致胰島素分泌增加1.4倍。所測試的其余的花色素苷和花色素在4和10mM葡萄糖濃度下對胰島素僅僅有邊際影響。


圖1是顯示花色素苷1-4和花色素5-9結構的圖。
圖2A顯示在4和10mM葡萄糖存在下，被化合物1和2引起的每毫克蛋白胰島素分泌的量，圖2B顯示在4和10mM葡萄糖存在下，被化合物5和6引起的每毫克蛋白胰島素分泌的量。在分析孔中最終DMSO濃度為0.1％。結果被表示為三次或五次獨立試驗的平均值，對每個樣品進行重復分析。使用t-檢驗通過LSD確定由化合物1、2、5和6引起的胰島素分泌顯著性*(95％或p≤0.05)或**(99％或p≤0.01)。
圖3顯示在4和10mM葡萄糖濃度下由化合物3、7-9引起胰島素分泌的圖。胰島素分泌的量對毫克蛋白標準化。在分析孔中最終DMSO濃度為0.1％。結果被表示為三次獨立試驗的平均值，對每個樣品進行重復分析。使用t-檢驗通過LSD確定由化合物3、7-9引起的胰島素分泌顯著性*(95％或p≤0.05)。
優(yōu)選實施方案的描述實施例材料和方法化學品。從Invitrogen(Grand Island，NY)獲得胎牛血清(FBS)和RPMI-1640介質。使用的所有有機溶劑為ACS試劑級的。用于制備緩沖液的HEPES、青霉素-鏈霉素、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、胰島素-EDTA、BSA(牛白蛋白；RIA級)、Folin-Ciolatues試劑和化學品從Sigma-Aldrich化學品公司(St.Louis，MO)購買。用于分析的花色素、花青素、飛燕草素、花葵素、錦葵色素和矮牽牛素從Chromadex(Laguna Hills，CA)購買。
花色素苷。飛燕草素-3-糖苷(2)從山茱萸果實中純化?；ㄇ嗨?3-半乳糖苷(3)和花葵素-3-半乳糖苷(4)從歐亞山茱萸果實中分離。用于該研究的純的花青素-3-糖苷(1)來自我們在-20℃的儲藏品。
花色素苷的分離和純化。將山茱萸果實與水(pH＝3)混合并過濾。將濾液在柱中通過XAD-16琥珀色樹脂，吸收花色素苷的樹脂用水(17)反復洗滌。然后用酸性MeOH(pH＝3)洗脫XAD-16樹脂，將得到的溶液在減壓下濃縮得到粗品花色素苷部分。將該部分通過MPLC柱(C18硅膠)使用MeOH∶H2O(pH＝3)在梯度條件下純化。用MeOH∶H2O(65∶35，v/v)溶劑系統(tǒng)洗脫花色素苷。化合物的純度通過HPLC(Waters Corp.)使用Capcell C18分析柱在梯度條件下檢驗。使用的溶劑為ATFA∶H2O(99.9∶0.1；v/v)和BH2O∶CH3CN∶CH3COOH∶TFA(50.4∶48.5∶1.0∶0.1；v/v/v/v)。梯度在流速0.8ml/min下在26分鐘20％B至60％B，在30分鐘至20％B。在520nm使用PDA檢測峰。
胰島素分泌研究。將INS-1 832/13細胞(由NC Duke大學的Christopher Newgard博士友好提供)(18)在含有11.1mM葡萄糖和補充有10％FBS(胎牛血清)、10mM HEPES、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、4mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉和50μM 2-巰基乙醇的RPMI-1640介質中在5％CO2/空氣中37℃下常規(guī)培養(yǎng)。在分開胰島素-EDTA后每周傳遞細胞。為進行靜止分泌研究，將細胞以每孔0.64×106細胞的密度放入24孔板中，培養(yǎng)24小時。然后將細胞在含有4mM葡萄糖和上述補充劑的RPMI-1640中再培養(yǎng)24小時。然后將細胞在含有4mM葡萄糖和0.1％BSA的Krebs Ringer Bicarbonate緩沖液(KRBB)中培養(yǎng)兩次30分鐘。將細胞用KRBB快速洗滌，在含有4或10mM葡萄糖含有或沒有指定的花色素苷或花色素中培養(yǎng)60分鐘。為確定胰島素釋放然后除去介質。然后將細胞用PBS洗滌兩次，溶解在1M NaOH中。然后通過Lowry分析測定細胞內蛋白濃度。將花色素苷和花色素溶解在DMSO中獲得所需的濃度。DMSO最終濃度為0.1％。由細胞分泌到介質中的胰島素通過放射免疫分析測定，對總細胞蛋白標準化。
放射免疫分析(RIA)。RIA試劑盒從LINCO Research Inc.(StCharles，MO)購買，根據生產者的指導進行分析。簡要地說，將0.1-10ng胰島素標準品(100μl)加入12×75mm實驗管中。類似地，將來自胰島素分泌研究的樣品(25μl)也加入到實驗管中。向其中加入等份(75μl)的分析緩沖液。然后向每個實驗管中加入125I標記的胰島素(100μl)。將100μL等份的抗大鼠胰島素抗體加入到管中，混合并在4℃培養(yǎng)24小時，進一步用1ml等份的沉淀試劑在4℃培養(yǎng)20分鐘以沉淀與抗體結合的胰島素。然后離心試管，使用γ計數器測定放射活性。
Lowry蛋白分析。在分析孔中蛋白的量通過Lowry方法測定(Francis，J.A.，等，Helv.Chim.Acta 87 317-326(2004))。通過將Lowry溶液、CuSO4.5H2O(1％)和酒石酸鈉(1％)混合制備Lowry分析溶液。簡要地說，將蛋白樣品(100μl)和Lowry混合物(1mL)在實驗管(12×75)中混合。向這些管中加入Folin-Ciolatues試劑(100μl)、混合并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。所得到溶液的光密度使用紫外可見分光光度計在700nm讀數。
結果和討論山茱萸果實被用于抗糖尿病中藥處方藥例如“HachimiGan”(Yamahara，J.，等，Yakugaku Zasshi，101 86-90(1981))中。最近報導了花色素苷在山茱萸果實中的定量(Seeram，N.P.，等，J.Agri.Food Chem.50 2519-2523(2002))。山茱萸果實研究表明它們中的主要生物活性成分是花青素、飛燕草素和花葵素糖苷。因此，我們使用胰腺β細胞集中關注這些花色素苷和它們的糖苷配基的胰島素分泌能力，以證實在傳聞抗糖尿病制劑中山茱萸果實的用途。矮牽牛素、錦葵色素和芍藥素糖苷配基也包括在該分析中，因為它們在其它果實中是含量豐富的。
花色素苷為水溶的化合物。歐亞山茱萸果實水溶液萃取物中含有糖、生物類黃酮和花色素苷，因此通過XAD-16樹脂分離。從樹脂中洗脫得到的花色素苷部分通過MPLC純化得到純的花色素苷。在4、10和16mM葡萄糖濃度下，測定由INS-1 832/13細胞葡萄糖-誘導胰島素的產生，發(fā)現在10mM葡萄糖濃度下胰島素分泌達到停滯期(數據沒有給出)。在4mM水平的葡萄糖濃度是人正常葡萄糖水平的代表值(Christison，G.B.，等，Med.Boil.Eng.Comp 31 284-290(1993))。在10mM葡萄糖下細胞每mg蛋白的胰島素分泌經比較是在4mM葡萄糖濃度下胰島素分泌的3倍多。
還將花色素苷和花色素在細胞生長介質中在4和10mM葡萄糖負載下測試。花色素苷和花色素最初在50μg/mL濃度下分析。在4mM葡萄糖下花色素苷、花青素3-糖苷(1)顯示增加胰島素分泌達到9ng/mg蛋白(1.3倍)，然而在10mM葡萄糖濃度下其增強胰島素分泌1.43倍(119ng/mg蛋白)(圖2A)。飛燕草素-3-糖苷(2)是活性最強的受試花色素苷，在4mM葡萄糖濃度下顯示胰島素分泌1.8-倍的增加(49ng/mg蛋白)。但是，在10mM葡萄糖下它僅顯示出胰島素產生的1.4-倍(113ng)的增加(圖2A)。在該分析中在4和10mM葡萄糖濃度下細胞分泌的胰島素分別為每mg蛋白27和83ng胰島素?；ㄉ剀铡⒒ㄇ嗨?3-半乳糖苷(3)和花葵素-3-半乳糖苷(4)在4mM葡萄糖濃度下不增加胰島素分泌。但是花青素-3-半乳糖苷顯示在10mM葡萄糖濃度下17ng胰島素/mg蛋白(1.2倍)的增加(圖3)。由于樣品限制，花葵素-3-半乳糖苷(4)僅僅被實驗一次。
花色素苷花青素-3-糖苷(1)被評價了在5、10、50、100和250μg/mL濃度下的劑量依賴性胰島素分泌。用于該分析中的葡萄糖濃度為4mM水平，其是人正常葡萄糖水平的代表值(Christison，G.B.，等，Med.Boil.Eng.Comp.31 284-290(1993))。在該濃度下，未處理的細胞分泌33ng胰島素/mg蛋白。被花青素-3-糖苷(1)在5μg/mL下處理的細胞分泌胰島素為46ng胰島素/mg蛋白。但是，在化合物1濃度10、50、100和250μg/mL下胰島素分泌沒有顯著的差異。我們沒有足夠量的飛燕草素-3-糖苷完成劑量依賴分析。
花色素在50μg/mL濃度下分析?；ㄇ嗨?3-糖苷的糖苷配基，花青素(5)在4mM葡萄糖下增強胰島素分泌達到1.5倍(29ng/mg蛋白)，然而在10mM葡萄糖下它分泌88ng/mg蛋白(圖2B)。在該組分析中，未處理的細胞在4和10mM葡萄糖下分別分泌19和83ng胰島素/mg蛋白。糖苷配基飛燕草素(6)顯示在4mM葡萄糖濃度下增加胰島素分泌6ng/mg蛋白，不是顯著的。飛燕草素在10mM葡萄糖下不顯示葡萄糖-誘導的胰島素分泌(圖2B)?；厥腔钚宰顝姷幕ㄉ兀湓?和10mM葡萄糖下分別分泌49(1.4倍)和91(1.2倍)ng胰島素/mg蛋白(圖3)。糖苷配基矮牽牛素(9)在4mM葡萄糖濃度下增加胰島素分泌4ng胰島素/mg蛋白。但是對于未處理的細胞，錦葵色素(8)沒有顯示增加出胰島素分泌作用。
報導顯示果實和蔬菜尤其是富含多元酚的果實和蔬菜的消費降低2-型糖尿病的發(fā)病率(Anderson，R.A.，等，J.Agric.Food Chem.507182-7186(2002)；Anderson，R.A.，等，J.Agric.Food Chem.52 65-70(2004)；和Landrault，N.，等，J.Agric.Food Chem.51 311-3188(2003))。而且，還已知飲食中的抗氧化劑保護胰腺β-細胞免受葡萄糖誘導的氧化應力?；ㄉ剀赵诠麑?、蔬菜和加工的產品例如葡萄酒、蘋果酒和茶中是含量豐富的；但是，對其降低或預防糖尿病的能力還知之甚少。我們的結果提示花色素苷和花色素都是胰島素促分泌劑。在它們中最有效的是飛燕草素-3-糖苷，與未處理的細胞比較其在4和10mM葡萄糖濃度下顯著誘導胰島素分泌。盡管花青素-3-糖苷在較低的葡萄糖濃度下比飛燕草素-3-糖苷活性較小，在較高的葡萄糖濃度下它活性更高。在半乳糖苷中，花葵素-3-半乳糖苷在4和10mM葡萄糖濃度下不誘導胰島素分泌，然而花青素-3-半乳糖苷顯示顯著的增加胰島素分泌作用?；ㄉ剀辗置谝葝u素能力研究表明按增加的次序是飛燕草素-3-糖苷＞花青素-3-糖苷＞花葵素-3-半乳糖苷。這表明在花色素苷B-環(huán)中的羥基數在它們的分泌胰島素能力中發(fā)揮著重要的作用。在受試的花色素中，在4mM葡萄糖下花葵素活性是最高的。其它糖苷配基在4或10mM葡萄糖濃度下不顯著增加胰島素分泌。
本文是通過花色素苷和花色素暴露給胰腺β細胞引起胰島素分泌的第一個報導。我們的結果提示含有這些花色素苷的山茱萸果實、櫻桃和漿果用于預防2-型糖尿病。而且從果實和蔬菜中分離和純化的花色素苷和花色素可以用于治療2-型糖尿病。
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花色素苷和花色素的分離和生產方法在美國專利6,194,469；6,423,365；6,623,743；6,676,978和6,656,914；以及2002年2月27日提交的美國專利申請S.N.10/084,575中描述，本文將其全部內容引入作為參考。
前面描述的目的僅僅在于舉例說明本發(fā)明，本發(fā)明只受下文所附的權利要求限制。
權利要求
1.增加分泌胰島素的胰腺細胞的胰島素分泌的方法，其包含提供花色素苷或花色素或其混合物給胰腺β細胞以使胰島素分泌比沒有花色素苷時的胰島素分泌增加。
2.權利要求1的方法，其中花色素苷是從果實、蔬菜和花中分離的。
3.權利要求1的方法，其中花色素苷選自花青素-3-糖苷、飛燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷及其混合物。
4.權利要求1、2或3任何一項的方法，其中胰腺細胞是在體內的。
5.權利要求1、2或3任何一項的方法，其中胰腺細胞是在體外的。
6.作為劑量單位的花色素苷或花色素或其混合物，用于在體內增加胰島素從胰腺細胞產生。
7.權利要求6的組合物，其中花色素苷從果實、蔬菜和花中分離。
8.權利要求6的組合物，其中花色素苷選自花青素-3-糖苷、飛燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷及其混合物。
9.權利要求1的方法，其中花色素或花色素苷或其混合物是被分離和純化的。
10.權利要求6的組合物，其中花色素或花色素苷或其混合物是被分離和純化的。
11.權利要求1的方法，其中花色素苷或花色素或其混合物是在果實或蔬菜的汁液中的。
全文摘要
通過花色素和花色素苷刺激胰島素分泌的方法。所述分泌可以為在哺乳動物包括人的體內，或體外。
文檔編號A61K31/70GK1993135SQ200580025636
公開日2007年7月4日 申請日期2005年6月21日 優(yōu)先權日2004年7月29日
發(fā)明者M·G·奈爾, B·亞亞普拉卡薩姆, L·K·奧爾森, S·K·瓦里德 申請人:密執(zhí)安州大學