專利名稱：：穩(wěn)定蛋白質的方法
技術領域：
：本發(fā)明總地涉及一種通過提供配制在緩沖液中的單體蛋白質本體(bulk)和在該本體溶液(bulksolution)中加入特定輔料來制備穩(wěn)定的單體蛋白質本體溶液的方法。
背景技術：
：干擾素是一類細胞因子，即能在細胞之間傳遞信號的可溶性蛋白質，通過幫助摧毀引起感染的微生物和修復所導致的損傷而在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。干擾素在自然情況下由受感染細胞分泌，在1957年第一次得到鑒定。它們的名字源于它們能“干擾”病毒的復制和繁殖。干擾素顯示具有抗病毒和抗增殖活性。根據其生化及免疫學性能，將天然產生的人干擾素分為三個主要類型干擾素α(白細胞)，干擾素β(成纖維細胞)和干擾素γ(免疫細胞)。干擾素α目前在美國和其他國家已批準用于治療毛細胞白血病、性病疣、卡波濟肉瘤(獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)病人常患的一種癌癥)，以及非甲非乙型慢性肝炎。另外，干擾素(IFNs)是機體對病毒感染應答反應過程中產生的糖蛋白。它們能抑制病毒在受保護細胞中的繁殖。由低分子量蛋白質組成的IFNs的作用非常顯著地沒有特異性，即一種病毒誘導產生的IFN對廣泛范圍的其他病毒也有效。然而它們是物種特異性的，即一種動物產生的IFN只能激發(fā)同種或密切相關種類動物的細胞產生抗病毒活性。IFNs是第一類發(fā)現的具有潛在抗腫瘤和抗病毒活性的細胞因子。IFNs的三種主要類型稱為干擾素α，干擾素β和干擾素γ。IFNs的這些主要類型最初是根據它們的細胞來源(白細胞，成纖維細胞或T細胞)進行分類的。然而現已清楚，一種細胞可產生幾種類型的IFNs。因此，白細胞IFN現稱為干擾素α，成纖維IFN稱為干擾素β，T細胞IFN稱為干擾素γ。還有第四類IFN，即淋巴母細胞樣干擾素，由“Namalwa”細胞系(衍生自伯基特淋巴瘤)產生，該細胞系似乎產生的是白細胞IFN和成纖維細胞IFN的混合物。干擾素單位或國際單位(U或IU，國際單位)，據報告是用作IFN活性的衡量單位，其定義為保護50％的細胞免遭病毒損害所必須的量?？捎糜跈z測其生物活性的試驗是如(Rubinstein，等.1981；Familletti，P.C.，等.，1981)所述的細胞病變作用抑制試驗。在此干擾素抗病毒試驗中，約1U/ml的干擾素是產生50％細胞病變(抑制)作用所必需的量。其單位可用國立衛(wèi)生研究院所提供的人IFN-β國際參考標準品來測定(Pestka，S，1986)。每一類IFN都含有幾種不同亞型。IFN-β和IFN-γ各為單一基因的產物。分類為IFN-α的蛋白質是多樣性最高的一類，包含約15個亞型。IFN-α基因簇位于第九號染色體上，包含至少23個成員，其中15個有活性能被轉錄。成熟的IFN-α是非糖基化的。IFN-α和IFN-β長度幾乎相同(165或166個氨基酸)，具有相似的生物學活性。IFN-γ長146個氨基酸，與IFN-α和IFN-β相似程度較低。只有IFN-γ能夠激活巨噬細胞或誘導T殺傷細胞成熟。這些新型治療劑有時稱為生物反應調節(jié)劑(BRM)，因為它們在機體抗腫瘤反應中具有作用，可通過免疫調節(jié)而影響識別。人成纖維細胞干擾素(IFN-β)具有抗病毒活性，也能激活自然殺傷細胞對抗癌細胞。它是病毒和雙鏈RNA誘導產生的分子量約20,000Da的一種多肽。用重組DNA技術克隆了成纖維細胞干擾素基因的核苷酸序列(Derynk等.1980)，并推斷出該蛋白的完整氨基酸序列。它的長度為166個氨基酸。Shepard等.(1981)描述了第842位堿基的突變(第141位半胱氨酸被取代為酪氨酸)消除了干擾素的抗病毒活性，和缺失了第1119-1121位核苷酸的變體克隆。Mark等(1984)通過在堿基469位用腺嘌呤(A)取代胸腺嘧啶(T)插入一個人造突變，導致該蛋白質的第17位氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸。據報道所產生的IFN-β與“天然的”IFN-β具有相同的活性并且在長期儲存(-70℃)中穩(wěn)定。在干擾素療法中近年開發(fā)的用于治療多發(fā)性硬化癥的Rebif(Serono公司生產的重組人干擾素-β)是IFN-β-1a，由哺乳動物細胞系所產生。其推薦的國際非專利藥名(InternationalNon-proprietaryNamesforPharmaceuticalSubstance，INN)是“干擾素-β-1a”。作為治療劑，和所有的蛋白質為基礎的藥物一樣，IFN-β-1a應用中必須克服的一個主要障礙是由于藥物制劑中該蛋白質的不穩(wěn)定性可能導致的藥物利用度喪失。藥品制劑中危害多肽活性和藥效的物理不穩(wěn)定性包括變性和可溶及不可溶凝聚體的形成。而化學不穩(wěn)定性包括水解、亞胺生成、氧化、外消旋和脫酰胺。已知這些變化中的一些可能導致感興趣蛋白質的藥物活性喪失或降低。其他方面，這些變化的精確影響尚不可知，但所產生的降解產物由于具有潛在的不良副作用而認為在藥學上是不可接受的。藥物組合物中多肽的穩(wěn)定性仍然是一個主要的麻煩和易失誤問題(Wang(1999)Int.J.Pharm.185129-188的綜述；Wang和Hanson(1988)J.ParenteralSci.Tech.42S3-S26)?？杉尤攵嚯乃幬镏苿┲刑岣咂浞€(wěn)定性的輔料包括緩沖劑、糖類、表面活性劑、氨基酸、聚乙二醇和多聚體，但是這些化學添加劑的穩(wěn)定作用根據蛋白質而不同。目前的蛋白質制劑在最終蛋白質制品中采用了輔料。然而這些制品仍然是部分不穩(wěn)定的。此外，具有單體生物學活性的蛋白質，即單體蛋白，在應力(如溫度應力)作用下有聚合和凝聚傾向。因此，需要一種方法來改進蛋白質的可溶性和提高單體蛋白質的穩(wěn)定性以對抗凝聚和寡聚，從而提高它們的藥物利用度。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質本體溶液的方法，該方法包括以下步驟a)提供配制在緩沖液中的單體蛋白質本體，和b)在該本體中加入輔料，所述輔料選自i)抑菌劑，ii)表面活性劑iii)等滲劑iv)氨基酸v)抗氧化劑vi)等滲劑和抗氧化劑vii)等滲劑、抗氧化劑和氨基酸viii)氨基酸和抗氧化劑ix)氨基酸、抗氧化劑和表面活性劑x)抑菌劑和抗氧化劑，和xi)抑菌劑、抗氧化劑和表面活性劑此外，在實施本發(fā)明第一方面所述方法之前或之后，可在特定溫度下培育所述本體蛋白質。第二方面，本發(fā)明提供根據本發(fā)明第一方面所述方法獲得的預配制的本體蛋白質。第三方面，本發(fā)明提供了一種提高和/或維持單體蛋白質穩(wěn)定性的方法，包括本發(fā)明第一方面所述的預配制本體蛋白質的方法。圖1-實驗室小規(guī)模熱解聚方法。圖1顯示實施例1a實驗室小規(guī)模熱解聚方法，涉及培育溫度和培育時間對本體干擾素穩(wěn)定性的影響。圖1與表4相對應。4輪F/T循環(huán)后0.9ml本體樣品的SE-高效液相色譜(SE-HPLC)結果。圖2報告了在29℃經實施例1b所述4輪F/T循環(huán)后實驗室規(guī)模熱解聚的結果。Y軸代表面積百分比。X軸代表檢測到的重組人IFN-β-1a的形式，即凝聚體，二聚體或單體。檢測到的各形式的第一直方柱是對照，對應于室溫2小時融化、然后-4℃貯藏的本體預制劑。檢測到的各形式的第二直方柱對應于室溫2小時融化、然后29℃培育3小時的本體預制劑。檢測到的各形式的第三直方柱對應于室溫2小時融化，然后29℃培育15小時的本體預制劑。檢測到的最后或第四直方柱對應于用水浴融化，然后29℃培育15小時的預制劑。圖2與表11相對應。圖32輪F/T循環(huán)后200ml本體樣品的SE-高效液相色譜(SE-HPLC)結果。圖3報告了在29℃經實施例1b所述的2輪F/T循環(huán)后實驗室規(guī)模的熱解聚結果。Y軸代表面積百分比。X軸代表檢測到的重組人IFN-β1a形式，即凝聚體，二聚體或單體。檢測到的各形式的第一直方柱都是對照，對應于室溫7小時融化，然后-4℃貯藏的本體預制劑。檢測到的各形式的第二直方柱對應于室溫7小時融化，然后29℃培育15小時的本體預制劑。圖3與表12相對應。圖4實驗室規(guī)模F/TX1循環(huán)時的熱解聚動力學。蛋白單體隨時間變化的百分比。圖4顯示在29℃培育1輪F/T循環(huán)后重組人IFN-β1a單體隨時間變化的百分比。Y軸代表面積百分比。X軸代表時間(小時)。圖4的結果見表14。圖5實驗室規(guī)模F/TX1循環(huán)時的熱解聚動力學。二聚體隨時間變化的百分比。圖5顯示在29℃培育1輪F/T循環(huán)后重組人IFN-β1a二聚體隨時間變化的百分比。Y軸代表面積百分比。X軸代表時間(小時)。圖5的結果見表14。圖6實驗室規(guī)模F/TX1循環(huán)時的熱解聚動力學。凝聚體隨時間變化的百分比。圖6顯示29℃培育1輪F/T循環(huán)后重組人IFN-β凝聚體隨時間變化的百分比。Y軸代表面積百分比。X軸代表時間(小時)。圖6結果見表14。圖7實施例2的預配制研究方案。圖7代表實施例2的研究方案，該研究關注從SEC-EL分級至最終劑型(FDF)貯存之間的操作步驟中最大程度減少重組人IFN-β1a的寡聚化，以提供穩(wěn)定的本體干擾素-β。該方案在實施例2的6.2節(jié)中還有描述。圖8實施例3的預配制研究方案。圖8代表實施例3的研究方案，該研究的目的是最大程度減少重組人IFN-β1a的寡聚化。采用了兩種不同的方法速度超離心法和SE-高效液相色譜分析法(SE-HPLC)來測量穩(wěn)定本體IFN-β之后重組人IFN-β1a單體的水平。該方案在實施例3的6.1和6.2節(jié)中還有描述。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質本體溶液的方法，該方法包括以下步驟a)提供配制在緩沖液中的單體蛋白質本體，和b)在該本體中加入輔料，所述輔料選自i)抑菌劑，ii)表面活性劑iii)等滲劑iv)氨基酸v)抗氧化劑vi)等滲劑和抗氧化劑vii)等滲劑、抗氧化劑和氨基酸viii)氨基酸和抗氧化劑ix)氨基酸、抗氧化劑和表面活性劑x)抑菌劑和抗氧化劑，和xi)抑菌劑、抗氧化劑和表面活性劑申請人發(fā)現，如果在本體蛋白質中加入本專利申請書中詳細描述的一種或多種輔料來使其穩(wěn)定，那么這種穩(wěn)定從本體蛋白質中加入一種或者多種輔料時即開始直至最后處理含該蛋白質的制劑，如最終被病人服用。因此，穩(wěn)定不僅發(fā)生在貯存階段，而是貫穿蛋白質在其生命周期直至被處理所面臨的各階段，即貯存前、貯存中及貯存后。本發(fā)明的方法能抵消蛋白質或蛋白質制劑在其生命周期內可能遭受的各種應力的作用。因此，不僅在制造過程中，而且在運輸、貯藏和輸送過程中均能穩(wěn)定。本發(fā)明也包括通過本發(fā)明方法得到的穩(wěn)定的本體，也稱為“預配制的本體(pre-formulatedbulk)”。本文中的術語“預制劑(preformulation)”指含有本體單體蛋白的制劑。這些預制劑的穩(wěn)定性不僅指凝聚和寡聚化較低，還包括氧化、脫酰胺等其他有害過程較輕微。例如，本發(fā)明也包括其他過程，只要這些過程影響到單體蛋白質的穩(wěn)定性。術語“貯藏過程”指制劑或組合物制備后沒有立即給予個體，而是制備后進行包裝以液體形式或適合于給予個體的其他形式貯藏。術語“干燥形式”指通過凍干、噴霧干燥或空氣干燥等方法干燥的制劑或組合物。藥物制劑中單體蛋白或其他組分形成的凝聚體物或寡聚體可能會對單體蛋白質的生物學活性產生不良影響，導致該藥物制劑療效喪失。而且，當用輸液系統(tǒng)給予含單體蛋白質的藥物組合物時，形成的凝聚體或寡聚體可能導致其它一些問題，如堵塞管道、膜或泵。術語“穩(wěn)定性”指蛋白質的活性，如抗病毒活性和/或蛋白質結構等隨時間變化而保持相對恒定，根據需要，有一個功能性定義。術語“穩(wěn)定性”也指本發(fā)明干擾素預制劑的物理、化學和構象穩(wěn)定性(包括生物學效能的維持)。蛋白質分子的化學降解或凝聚形成更高級聚合物、脫糖基、糖基化修飾、氧化或可能導致本發(fā)明單體蛋白質至少一種生物學活性降低的其它結構性修飾，都可能引起蛋白質預制劑的不穩(wěn)定。一種“穩(wěn)定性的(stable)”預制劑是指本文所述蛋白質的降解、修飾、凝聚、生物活性喪失等程度被可接受地控制、不會隨時間推移而不可接受地增加。術語“穩(wěn)定的(stabilized)”指，與缺少本文所述加入到本體單體蛋白質或含單體蛋白質的制劑中的輔料時制備的單體蛋白質或制劑相比，顯示穩(wěn)定性提高和/或保持的本發(fā)明的單體蛋白質或含單體蛋白質的制劑。如本文所用，術語“穩(wěn)定化”可與“降低或/和防止蛋白質凝聚”和/或“降低或/和防止蛋白質寡聚”和/或“降低或/和防止凝聚體形成”和/或“降低和/或防止聚合”和/或“降低或/和防止氧化”和/或“降低和/或防止微膠束形成”和/或“降低和/或防止脫酰胺”和/或“降低和/或防止對單體蛋白質或含單體蛋白質制劑的任何種類有害作用”互換使用。術語“單體”或“單體的”指只含有一條肽鏈的分子。術語“本體蛋白質(bulkprotein)”或“蛋白質本體”或“本體單體蛋白質(bulkmonomericprotein)”或“單體蛋白質本體”本文指已通過制備過程的純化步驟，但還沒有通過最終配制步驟的蛋白質或單體蛋白質狀態(tài)，其允許制備“最終劑型(FDF)”或“藥物組合物”以進行最后包裝和發(fā)送銷售。因此本文認為重組蛋白質本體是在純化步驟結束時產生的產物，但該產物還未通過最后配制步驟。換句話說，可認為本發(fā)明方法包括預配制步驟，其允許獲得預配制的本體，通過加入其它輔料產生最終劑型或藥物組合物。通常先貯藏預配制的或未配制的本體然后制備最終制劑，但也不一定。如果冷凍貯藏，本體蛋白質常需解凍、過濾、然后進入最終配制步驟，但也不一定如此。根據本發(fā)明的具體實施方案，當所述蛋白質是重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)時，在最終層析步驟的洗脫液中加入穩(wěn)定化輔料，所述的層析步驟例如是在進行過濾步驟之前或者是剛好在過濾步驟之后進行分子大小排阻層析(SEC)，本文稱為“SEC-EL”或“SEC-EL2”，(參見實施例)。此時，SEC代表純化過程的最終步驟。在其他純化過程中，最后步驟可采用其他層析技術或分離方法，或者也可采用其他不依賴于分離方法作為最后純化步驟的純化方法；這不意味著限制如術語“本體蛋白質”所定義的本發(fā)明范圍。只要在純化程序之后加入穩(wěn)定性輔料，無論采用哪種純化方法均包括在本發(fā)明范圍內。另外，也可將本發(fā)明所述的穩(wěn)定性輔料加入到最終制劑(FDF)中。因此，FDF中含有的輔料可對應于加入到本體預制劑中的那些輔料，但并不一定如此?！肮丫鄣鞍住盎颉惫丫垠w“本文用于指具有兩個或多個多肽鏈的多亞基蛋白質。有時“寡聚蛋白”指具有兩個或多個相同的亞基多肽鏈的蛋白質。所述寡聚體至少可區(qū)分為3種·快速可逆性非共價小寡聚體(二聚體，三聚體，四聚體等)·不可逆性非共價寡聚體·共價寡聚體(如二硫化物)“多亞基蛋白質”是含有多個亞基的蛋白質?！皝喕敝附M成多聚體蛋白質的相同的或不同的蛋白質分子之一。“寡聚化”指由較大或較小分子產生寡聚體的化學過程。“寡聚化”也指單體或單體混合物轉變成寡聚體的過程。術語“寡聚化”還指單個蛋白分子通過非共價或共價相互反應形成多聚體的過程。寡聚化可以是可逆的，也可以是不可逆的。術語“聚合”描述單體經反復混合而形成長或大的分子聚合物的化學反應過程，或單體或單體混合物轉變?yōu)榫酆衔锏倪^程。術語“凝聚”指主要由于較小物質的非共價粘合而形成較高分子量物質的過程。具體對蛋白質而言，凝聚是一種變性形式，其中二級結構非極性表面，例如通常形成分子內相互作用并且包埋在蛋白內部的α-螺旋和β-折疊的非極性表面，被允許進行分子間相互反應并形成有時不可溶的多聚分子形式。術語“不可溶的”相比較于“可溶的”有時候分別指“不可逆的”相比較于“可逆的”。凝聚體也可定義為大的寡聚蛋白結合體(如10個以上的多聚體)。非共價“凝聚體”可能是可逆的。本發(fā)明不受限于以下定義“凝聚”、“凝聚體”、“寡聚體”、“多聚物”、“寡聚”、“多聚”、“多聚的”、“寡聚的”、“聚合”，無論是那種定義。因此，本發(fā)明的范圍不限于那些術語或者關于這些術語的任何理論。重要的是“凝聚體”和“寡聚體”可通過檢測方法(如SE-HPLC)而彼此區(qū)別，通常利用不同的可鑒別信號，如分離的各個峰；各峰對應于凝聚體或寡聚體。同樣，蛋白質的單體形式對應于一個精確而唯一的明確的峰。術語“緩沖液”或“生理學上可接受的緩沖液”指已知可安全地應用于藥學或獸醫(yī)學制劑中、具有維持或控制該制劑的pH在所需范圍的化合物溶液。能控制pH在溫和酸性pH至溫和堿性pH范圍的可接受的緩沖液包括但不限于磷酸、乙酸、檸檬酸、精氨酸、TRIS和組氨酸這類化合物?！癟RIS”指2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇，和其藥學上可接受的鹽。優(yōu)選的緩沖劑是乙酸緩沖鹽水或可接受的鹽?！暗葷B劑”指生理學上可耐受的化合物，該化合物可以賦予藥物適宜的滲透張力避免水份跨越接觸該藥物的細胞膜凈流動。如甘油等化合物常以已知濃度用于此目的。其他合適的等滲劑包括但不限于氨基酸或蛋白質(如甘氨酸或白蛋白)，鹽類(如氯化鈉)以及糖類(如葡萄糖、甘露醇、蔗糖和乳糖)。等滲劑優(yōu)選甘露醇。術語“抗氧化劑”指可防止氧或氧產生的自由基與其它物質相互反應的化合物?？寡趸瘎┦浅＜尤氲剿幬锵到y(tǒng)中以提高其物理和化學穩(wěn)定性的多種輔料中的一種。加入抗氧化劑是為了最大程度減小或阻滯在一些藥物或輔料接觸氧或存在自由基時所發(fā)生的氧化過程。這些氧化過程常常受到光、溫度、高濃度氫、存在的痕量金屬或過氧化物所催化。亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、硫脲、甲硫氨酸、乙二胺四乙酸鹽(EDTA)、丁基羥基甲苯(BHT)和丁基羥基茴香醚(BHA)常用作藥物中的抗氧化劑。已發(fā)現EDTA鈉鹽可通過與催化氧化反應的金屬離子螯合而增強抗氧化劑的活性。最優(yōu)選的抗氧化劑是甲硫氨酸。抗氧化劑本文也稱為穩(wěn)定劑。甲硫氨酸可以其游離堿形式或鹽形式存在。只要甲硫氨酸以其游離堿或其鹽形式存在，在本發(fā)明的方法中或本發(fā)明的制劑中可采用甲硫氨酸的任何一種立體異構體(如L，D或DL異構體)。優(yōu)選采用L型立體異構體。也可在本發(fā)明的制劑中采用甲硫氨酸的類似物。術語“甲硫氨酸類似物”指自然產生的甲硫氨酸的衍生物。甲硫氨酸類似物可以其游離堿形式或其鹽形式用于本發(fā)明制劑中。加入抗氧化劑(如甲硫氨酸)來提高或者維持穩(wěn)定性是濃度依賴性的。即在本發(fā)明含干擾素-β的制劑中不存在抗氧化劑而正常情況下發(fā)生氧化、形成凝聚體/寡聚體時，提高抗氧化劑的濃度將導致提高和/或維持本發(fā)明含干擾素-β制劑的穩(wěn)定性?？刹捎帽绢I域技術人員通常知道的方法無須過多實驗，不難確定本發(fā)明制劑中為了減少氧化或凝聚體/寡聚體形成所采用的氧化劑(如甲硫氨酸)的量。術語“抑菌劑”指作為抗菌劑加入到制劑中的化合物或組合物。本發(fā)明含干擾素制劑的防腐制劑宜符合為商品化多用途活性產品防腐效果制定的法定或管理指南的要求。抑菌劑的例子包括苯酚、間-甲酚、對-甲酚、鄰-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸烷酯(alkylparaben)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯及其類似物)、氯化苯甲烴銨，氯化芐乙氧胺，脫氫乙酸鈉和硫柳汞。優(yōu)選的抑菌劑是苯甲醇。苯甲醇本文也稱為穩(wěn)定劑。術語“表面活性劑”指能降低液體表面張力或者降低兩液體間或液體與固體間界面張力的化合物，表面張力是作用于液體表面，趨向于最大程度減小表面面積的力。有時在藥物制劑中采用表面活性劑目的包括輸送低分子量藥物和多肽以改進該藥物的吸收或將其輸送給靶組織。優(yōu)選的表面活性劑是Tween20或泊咯沙姆(poloxamer)。更優(yōu)選的表面活性劑為泊咯沙姆188。甚至更優(yōu)選的表面活性劑為TweenTM20。術語“氨基酸”指氨基酸或氨基酸混合物，任何給定的氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。當采用混合氨基酸時，所有的氨基酸可以其游離堿形式存在，或可以其鹽形式存在，或一些以其游離堿形式存在而其他以其鹽形式存在。本發(fā)明方法或制劑中所用的優(yōu)選氨基酸是具有帶電荷側鏈的氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更優(yōu)選的氨基酸為賴氨酸和精氨酸。還要優(yōu)選的氨基酸為賴氨酸。只要某特定氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在，本發(fā)明方法或制劑中可采用該特定氨基酸的任何立體異構體(如L，D，或DL異構體)，或者這些立體異構體的組合物。優(yōu)選采用L-立體異構體。本發(fā)明方法或制劑中也可采用這些優(yōu)選氨基酸的類似物。術語“氨基酸類似物”指自然產生的氨基酸的衍生物。合適的精氨酸類似物包括，例如氨基胍和N-單乙基-L-精氨酸。和優(yōu)選的氨基酸一樣，這些氨基酸類似物以其游離堿形式或其鹽形式用于本發(fā)明方法或制劑中。本文中氨基酸也稱為穩(wěn)定劑。本發(fā)明的方法或制劑中所用的氨基酸能保護治療性活性多肽，使其免遭各種應力的作用，因而提高了或/和維持了單體蛋白質或含單體蛋白質的制劑在該單體蛋白質生命周期(貯藏前、貯藏過程中、貯藏后)中的穩(wěn)定性。這里，術語“應力”包括但不限于熱、冷凍、pH、光、攪拌、氧化、脫水、表面、剪切力、冷凍/解凍、壓力、重金屬、酚類化合物、變性劑等。術語“應力”包括任何能調節(jié)(即降低，維持或提高)(單體)蛋白質或含(單體)蛋白質的制劑穩(wěn)定性的因素。加入氨基酸來提高和/或維持穩(wěn)定性是濃度依賴性的。即當本發(fā)明的單體蛋白質或者含單體蛋白質的制劑中不存在氨基酸通常會形成凝聚體/寡聚體時，提高氨基酸的濃度將導致提高和/或維持本發(fā)明單體蛋白質或含單體蛋白質制劑的穩(wěn)定性?？刹捎帽绢I域技術人員通常知道的方法無須過多實驗，不難確定本發(fā)明方法或制劑中為了減少寡聚體或凝聚體形成，從而提高在該單體蛋白質整個生命周期內單體蛋白質的穩(wěn)定性，和提高所述制劑穩(wěn)定性所采用的特定氨基酸的量?！袄鋬鲑A藏”指將預制備的單體蛋白質水溶液制劑在0℃以下，優(yōu)選-20℃或以下，更加優(yōu)選在-70℃冷凍與保存?！袄鋬?解凍循環(huán)”或“冷凍/解凍操作“指使用凍存的蛋白質樣品時所用的已知技術，其中將蛋白質樣品的溫度提高到使其恢復液體狀態(tài)水平足夠時間以允許使用Rampie后，再將該樣品冷凍到0℃以下回到凍存狀態(tài)，優(yōu)選在-20℃或以下，更優(yōu)選-70℃。本發(fā)明的目的是至少抵消單體蛋白質以及加入本發(fā)明本體蛋白質中的其他試劑、組分或化合物的凝聚和寡聚過程(本發(fā)明不僅限于這些過程)。因此，本發(fā)明能對加入到本發(fā)明本體中和將包含在所述蛋白質的最終劑型或藥物組合物中的所有化合物、試劑(如抑菌劑、等滲劑)、蛋白質、表面活性劑、輔料賦予穩(wěn)定性(如減少和/或抑制寡聚體和凝聚體的形成)。換句話說，不僅僅賦予(單體)蛋白質，而且賦予含(單體)蛋白質的“整個”制劑穩(wěn)定性。凝聚不僅僅損害了生物學活性，而且可產生中和抗體(NAb)導致注射部位反應和免疫原性。本文提供的實施例清楚地表明，在本體單體蛋白制劑中加入特定輔料后，可通過防止和/或抑制凍存或/和反復凍/融循環(huán)期間多肽凝聚體或寡聚體的形成，從而顯著提高單體蛋白質制劑的穩(wěn)定性和溶解性。另外，本發(fā)明證明熱解聚能有效賦予(單體)蛋白質或含該(單體)蛋白質的制劑穩(wěn)定性。術語“熱解聚”本文指多聚體形式的蛋白質在溫度作用下轉變?yōu)榛蛘呓饩鄢蔀檫€原的多聚形式或單體形式(如二聚體蛋白質置于特定溫度下轉變?yōu)閱误w)。制劑中的蛋白質是以復合多聚體形式(二聚體，三聚體等)存在。熱解聚能有效地將所有的多聚體形式轉變或解聚成為還原的多聚體或單體形式。本發(fā)明證明溫度和多聚體解聚之間有相關性。當進行熱解聚時，與未經熱解聚的制劑相比，制劑所含的多聚體形式較少、單體形式增多。優(yōu)選熱解聚將所有的多聚體轉變?yōu)閱误w形式。溫度可立即設定為固定溫度或呈梯度升高至特定溫度。另外，本發(fā)明證明持續(xù)熱解聚能有效穩(wěn)定(單體)蛋白質或含(單體)蛋白質的制劑。本發(fā)明證明熱解聚的持續(xù)時間與多聚體的解聚之間有相關性。實施例表明在熱解聚過程中前幾個小時熱解聚最有效，直至達到某時間點而失效。熱解聚是蛋白質特異性的。本領域技術人員采用常規(guī)技術，不難為某具體蛋白質設定合適的參數，如溫度和持續(xù)時間，以獲得最佳熱解聚。本領域的技術人員知道許多分析方法可用來測定降解產物，如凝聚、氧化、脫酰氨、剪切、表面吸附、表面變性、環(huán)狀亞胺基形成、截短等。檢測穩(wěn)定性的方法包括但不限于高效液相色譜(HPLC)、分子大小排阻HPLC(SEC)(樣品或流動相中含有或者不含有變性劑，如SDS、鹽酸胍、或有機溶劑)、反向(RP)HPLC、離子交換HPLC、電泳、疏水相互作用層析(HIC)、親和層析、SDS-PAGE、用還原劑還原二硫鍵、天然凝膠電泳、毛細管電泳、分析型超離心、光散射、濁度試驗和蛋白質濃度試驗。結構穩(wěn)定性研究可采用園二色性、熒光(內在的和疏水性探針結合的)、UV、FTIR、和/或差別性掃描量熱計量法。因此，某特定輔料對單體蛋白質凝聚或寡聚的影響可通過，例如在溶液中可溶性單體蛋白隨時間的變化來測定。在分子大小排阻HPLC或SEC，也稱為凝膠過濾層析或分子篩層析法中，設計的層析柱裝有多孔基質，其可滯留小于孔徑的分子，較大的分子被排斥而較早洗脫下來。大多數應用中都采用等度(isocratic)梯度。下面從不同方面對本發(fā)明進行描述。第一方面，本發(fā)明提供一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質本體溶液的方法，該方法包括以下步驟a)提供配制在緩沖液中的單體蛋白質本體，和b)在該本體中加入輔料，所述輔料選自i)抑菌劑ii)表面活性劑iii)等滲劑iv)氨基酸v)抗氧化劑vi)等滲劑和抗氧化劑vii)等滲劑、抗氧化劑和氨基酸viii)氨基酸和抗氧化劑ix)氨基酸、抗氧化劑和表面活性劑x)抑菌劑和抗氧化劑，和xi)抑菌劑、抗氧化劑和表面活性劑還可將輔料或其組合物加入到最終制劑(FDF)中，而不是只加入到單體蛋白質本體中。換句話說，可在單體蛋白質本體的各個階段和制備過程的最終配制步驟中加入輔料，但至少在單體蛋白質本體中加入一次。優(yōu)選該單體蛋白質是干擾素。更優(yōu)選該干擾素是IFN-β。還要優(yōu)選該IFN-β是人重組IFN-β。優(yōu)選穩(wěn)定該蛋白質避免凝聚和寡聚。優(yōu)選的抑菌劑是苯甲醇，表面活性劑是Tween20，等滲劑是甘露醇，氨基酸選自賴氨酸或精氨酸，抗氧化劑是甲硫氨酸。優(yōu)選的輔料組合為1.等滲劑是甘露醇、抗氧化劑是甲硫氨酸；2.等滲劑是甘露醇、抗氧化劑是甲硫氨酸、氨基酸是賴氨酸；3.氨基酸是賴氨酸、抗氧化劑是甲硫氨酸；4.氨基酸是賴氨酸、抗氧化劑是甲硫氨酸、表面活性劑是Tween20；5.抑菌劑是苯甲醇、抗氧化劑是甲硫氨酸；或者6.抑菌劑是苯甲醇、抗氧化劑是甲硫氨酸和表面活性劑是Tween20。另外，可在特定溫度下培育本體蛋白質以促進單體蛋白質的熱解聚。優(yōu)選該溫度的范圍是27℃-31℃。最優(yōu)選該溫度設定為29℃?；蛘?，梯度升高溫度直至達到上述的特定溫度。優(yōu)選培育過程至少3小時，或6-40個小時。更優(yōu)選培育過程在15-30小時或10小時、16小時、18.5小時或24小時。甚至更優(yōu)選培育24小時?？稍诒景l(fā)明第一方面所述的預配制步驟之前或之后進行培育，但不限于此。可在制備過程的任何一個階段，即也可以在最終配制步驟中，培育本發(fā)明第一方面所述已經穩(wěn)定化的單體蛋白質。第二方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明第一方面所述方法獲得的預配制的本體蛋白質。本發(fā)明第三方面提供了提高和/或維持單體蛋白質穩(wěn)定性的方法，該方法包括本發(fā)明第一方面所述的蛋白質本體的預配制方法?，F通過優(yōu)選實施方案來描述本發(fā)明的特定單體蛋白質干擾素、更優(yōu)選IFN-β。“干擾素”或“IFN”，如本文所用包括文獻中如此定義的任何分子，這些分子包括，例如在上述“發(fā)明背景”中所提到的任何類型的IFN。具體說，在上述定義中包括IFN-α，IFN-β和IFN-γ。IFN-β是本發(fā)明的優(yōu)選IFN。根據本發(fā)明，合適的IFN-β可從市場上購得，如Rebif(Serono)、Avonex(Biogen)或Betaferon(Schering)。根據本發(fā)明，也優(yōu)選采用人源干擾素。術語干擾素，如本文所用，包括其鹽、功能性衍生物、變體、類似物和活性片段。術語“干擾素-β(IFN-β)”，如本文所用，包括成纖維細胞干擾素，特別是來源于人的，如從生物體液分離得到的、或用DNA重組技術從原核或真核宿主細胞得到的，及其鹽、功能性衍生物、變體、類似物和活性片段。優(yōu)選的IFN-β指干擾素β-1a。術語“突變蛋白”本文用于指IFN的類似物，在該類似物中天然IFN有一個或多個氨基酸殘基替換為不同的氨基酸殘基，或缺失，或在IFN的天然序列中加入了一個或多個氨基酸殘基，但所得產物的活性與野生型IFN相比無顯著改變，得到的產物活性無顯著改變。這些突變蛋白可用已知的合成技術和/或定點誘變技術，或其他已知的合適技術制備。優(yōu)選的突變蛋白包括如Shepard等.(1981)或Mark等.(1984)所述的突變蛋白。任何此類突變蛋白優(yōu)選具有與IFN充分相同的氨基酸序列，因而具有與IFN基本上相似甚至更加優(yōu)良的活性。干擾素的生物學功能是該領域技術人員所熟知的，而且其生物學標準品已建立可從例如國立生物學標準品和控制研究所購賣到(http//immunology.org/links/NIBSC)。IFN活性測定的生物學試驗已有描述。例如可按Rubinstein等.，1981所述進行IFN試驗。因此，可通過常規(guī)實驗測定某給定的突變蛋白是否具有與IFN基本上相似，或者甚至更優(yōu)越的活性。可用于本發(fā)明的IFN突變蛋白，或其編碼核酸，包括根據本文提供的說明和指南無須過多實驗，本領域普通技術人員可用常規(guī)方法獲得的有限的一組基本上相應的序列，如取代的多肽或多聚核苷酸。本發(fā)明突變蛋白的優(yōu)選變化是稱為“保守”取代的變化。本發(fā)明多肽或蛋白質的保守性氨基酸取代，可包括某一組內的同義氨基酸取代，由于同義氨基酸具有基本相似的理化性能，同組內成員之間的取代將保存該分子的生物學功能。已清楚知道，也可在以上定義的序列中插入和缺失氨基酸而不改變其功能，特別是如果該插入或缺失只涉及少數的幾個氨基酸，如30個以下，優(yōu)選10個以下，而不去除或取代那些對功能構象起關鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。通過這種缺失和/或插入所產生的蛋白質和突變蛋白屬于本發(fā)明的范圍。優(yōu)選的同義氨基酸分組是表I中所定義的那些。更優(yōu)選的同義氨基酸分組是表II中所定義的那些；最優(yōu)選的同義氨基酸分組是表III所定義的那些。表I優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義組SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，HisLeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，AsnLysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表II更優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義組SerSerArgHis，Lys，ArgLeuLeu，Ile，Phe，MetProAla，ProThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，IleGlyGlyIleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMet，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表III最優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義組SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet在蛋白質中產生氨基酸取代(可用于本發(fā)明中獲得IFN突變蛋白)的例子包括任何已知方法步驟，如以下專利中所述的方法步驟授予Mark等的美國專利4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的專利5,116,943，授予Namen等的專利4,965,195；授予Chong等的專利4,879,111；和授予Lee等的專利5,017,691；以及美國專利4,904,584(Shaw等)所述的賴氨酸取代的蛋白質。已描述了具體的IFN-β突變蛋白，如Mark等，1984。術語“融合蛋白”指包含融合于另一蛋白質的IFN或IFN突變蛋白的多肽，例如，該融合蛋白在體液中具有延長的停留時間。因此IFN可融合于另一蛋白質、多肽等，例如免疫球蛋白或其片段。本文所用“功能性衍生物”包括IFN衍生物以及它們的突變蛋白和融合蛋白，可用本領域已知的方法從作為殘基側鏈的官能團、或N-或C-末端基團來制備這些功能性衍生物，并且只要它們保持是藥學上可接受的，即它們不破壞與活性IFN基本相同的蛋白質的活性并且不給含有該功能性衍生物的組合物帶來毒性，則這些功能性衍生物都包括在本發(fā)明中。這些衍生物可(例如)包括聚乙二醇側鏈；其可掩蔽抗原基并延長IFN在體液中的停留。其它衍生物包括羧基的脂族酯類、羧基與氨或伯胺或仲胺反應產生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與?；糠?例如烷?；蛱辑h(huán)芳?；?形成的N-?；苌锘蛴坞x羥基(例如絲氨酰或蘇氨酰殘基的游離羥基)與?；糠中纬傻腛-?；苌?。本發(fā)明中的IFN“活性片段”或突變蛋白以及融合蛋白包括該蛋白分子多肽鏈的任何片段或前體，其為單獨的或者和與其相連的分子或殘基(例如糖或磷酸殘基)一起，或該蛋白分子的凝聚物以及糖殘基本身，只要與相應的IFN相比，所述片段的活性沒有顯著降低。術語“鹽”在本文指上述蛋白質或其類似物的羧基成的鹽以及氨基的酸加成鹽?？捎帽绢I域已知的方法形成羧基的鹽，包括無機鹽，例如，鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽等，以及與有機堿形成的鹽，例如與胺(如三乙醇胺)、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等形成的鹽。酸加成鹽包括例如，與無機酸(例如鹽酸或硫酸)形成的鹽，以及與有機酸(例如乙酸或草酸)形成的鹽。當然，這些鹽必須保持與本發(fā)明相關的蛋白質(IFN)的生物活性，即結合相應受體并啟動受體信號轉導的能力。根據本發(fā)明，尤其優(yōu)選采用重組人INF-β以及本發(fā)明的化合物。最近描述了一種特殊種類的干擾素變體。這種所謂的“共有序列干擾素”是非天然存在的IFN變體(美國專利6,013,253)。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，將本發(fā)明的化合物與共有序列干擾素聯用。如本文所用，人干擾素共有序列(IFN-con)指一種非天然存在的多肽，其主要包括在大多數天然存在的人白細胞干擾素亞型序列的IFN-α代表性亞組中共有的氨基酸殘基，在不存在所有亞型共有的氨基酸的那些位置中的一個或多個位置上，該多肽包含在該位置主要存在的氨基酸，并且決不包含任何在至少一種天然存在的亞型中都不存在于該位置的氨基酸。IFN-con包括但不限于美國專利4,695,623、4,897,471和5,541,293中稱為IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列?？扇缟鲜鰧＠龌蛴闷渌鼧藴史椒ㄖ苽渚幋aIFN-con的DNA序列。在另一個優(yōu)選實施方式中，融合蛋白包括與Ig的融合。融合可以是直接連接，或通過短的接頭肽，接頭肽的長度可短至1-3個氨基酸殘基或更長，例如長度為13個氨基酸殘基。所述接頭可以是例如序列為E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或包含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13個氨基酸的接頭序列，該接頭序列介于IFN序列和免疫球蛋白序列之間。產生的融合蛋白可具有改進的性質，如在體液中的停留時間(半衰期)延長、特異活性增加、表達水平提高或有利于融合蛋白的純化。在另一個優(yōu)選的實施方式中，IFN融合于Ig分子的恒定區(qū)。優(yōu)選地，其融合于例如人IgG1的重鏈區(qū)如CH2和CH3結構域。根據本發(fā)明，Ig分子的其它同工型也適于產生融合蛋白，所述其它同工型為例如同工型IgG2、IgG3或IgG4，或其它Ig類別，如IgM或IgA。融合蛋白可為單體或多聚體、異多聚體或均多聚體。在另一個優(yōu)選實施方式中，功能性衍生物包括連接于一個或多個官能團的至少一個部分，所述官能團是氨基酸殘基的一個或多個側鏈。優(yōu)選該部分是聚乙烯(PEG)部分?？捎靡阎椒ㄟM行PEG化，如WO99/55377中所述的方法。本發(fā)明一般可應用于所有種類的干擾素，應用于上述的干擾素，并且還包括天然干擾素、用重組DNA技術產生的干擾素和化學合成或修飾產生的干擾素。術語干擾素還包括來自人或任何其它合適物種的成纖維細胞、白細胞、淋巴細胞或任何其它含有干擾素或產生干擾素的組織的粗制干擾素、半純化干擾素和純化的干擾素。更優(yōu)選地，本發(fā)明可用于人成纖維細胞干擾素(干擾素-β)。預制劑中優(yōu)選IFN-β的濃度為或約為10μg/ml-2000μg/ml，更優(yōu)選為或約為100μg/ml-1000μg/ml，最優(yōu)選為或約為500-810μg/ml。優(yōu)選地，緩沖液的量足以維持所述組合物的pH值在特定pH值的上下0.5單位范圍內，其中所述特定pH值約為3.5-5.5。更優(yōu)選，pH為3.8、4.2或4.7。更優(yōu)選，pH為4.7。優(yōu)選地，緩沖液的濃度為或約為5mM-500mM。整個溶液中的緩沖液濃度可在為或約為5mM、9.5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM至500mM之間變動。優(yōu)選緩沖液濃度為或約為10mM或50mM。尤其優(yōu)選緩沖液為或約為50mM的醋酸鹽離子，pH4.7。優(yōu)選緩沖液為醋酸鹽緩沖液，優(yōu)選的抗衡離子為鈉離子或鉀離子。醋酸鹽緩沖液是本領域熟知的。優(yōu)選等滲劑(例如甘露醇)濃度為或約為0.5mg/m1-500mg/ml。更優(yōu)選等滲劑濃度為或約為55mg/ml。更優(yōu)選等滲劑濃度為或約為150mM，或為或約為300mM或者為或約為600mM。優(yōu)選表面活性劑(即Tween20)濃度為或約為0.01mg/ml-10mg/ml，更優(yōu)選，表面活性劑濃度為或約為0.05mg/ml。優(yōu)選抗氧化劑(例如甲硫氨酸)濃度為或約為0.01-5.0mg/ml。更優(yōu)選抗氧化劑濃度為或約為0.12mg/ml-0.24mg/ml。優(yōu)選氨基酸為賴氨酸或精氨酸。更優(yōu)選氨基酸為賴氨酸。優(yōu)選氨基酸濃度(例如賴氨酸或精氨酸)為或約為20-200mg/ml。優(yōu)選賴氨酸濃度為或約為27mg/ml、為或約為55mg/ml、為或約為82mg/ml、為或約為164mg/ml。優(yōu)選精氨酸濃度為或約為32mg/ml、或為或約為63mg/ml。優(yōu)選抑菌劑(例如苯甲醇)濃度為或約為0.01mg/ml-200mg/ml。更優(yōu)選抑菌劑濃度為或約為5mg/ml、或為或約為10mg/ml。本文引入的所有文獻，包括刊物文章或摘要、公開或未公開的美國或國外專利申請、已授權的美國或國外專利或任何其它參考文獻，均全文納入本文作為參考，包括所引用文獻中的所有數據、表格、圖表和文本。因此，本文參考文獻中引入的文獻的全部內容也整體納入本文作為參考。對已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法的引用并非承認本發(fā)明的任何方面、描述或實施方式在相關領域中被揭示、教導或暗示。以上對具體實施例方式的描述將完全揭示本發(fā)明的總體特性，通過應用本領域一般常識(包括本文所引用的文獻的內容)，其他人可容易地改動這些具體實施方式和/或調整這些具體實施方式的用途，這些改動和調整無需過多試驗，也沒有偏離本發(fā)明的總體概念。因此，根據本發(fā)明的教導和指引，這些調整和改動包括在所公開的實施方式的等同范圍內。應理解，本文所用措詞和術語是用于描述而并非限制，因此，本領域一般技術人員可根據本發(fā)明的教導和指引并結合本領域一般技術人員的知識來解釋本發(fā)明的術語或措詞。實施例以下實施例中使用的分析方法在實施例6中進行描述。實施例1培育溫度和培育時間對本體干擾素穩(wěn)定性的影響(熱解聚)。進行以下實驗以評估解凍溫度、培育溫度和培育時間(持續(xù)時間)對本體干擾素-β穩(wěn)定性的影響。目的是有效和恒定地降低制備過程中干擾素寡聚體和/或干擾素凝聚體的形成。以下實驗主要應用于凍藏的本體干擾素制品(0℃以下，如-20℃或-70℃下貯藏的制品)，將該制品先融化，然后最終在給定的溫度、給定的時間內培育或貯藏以進行進一步的制備處理。這些實驗中的考慮也可應用于0℃以上(例如2-8℃)貯藏因此不經過解凍過程(或溫度變化)但可能經受其它應力作用的制品。術語“靜置的”指凍存制品的融化(如在培育箱，水浴或其他地方)，然后在給定溫度下，在給定的時間內貯藏(如在培育箱，水浴或其他地方)；術語“靜置溫度”指解凍溫度和培育溫度；如果將冷凍制劑直接置于培育箱中，術語“培育溫度”或“靜置溫度”可互換使用?！办o置時間”指在特定溫度下貯存的時間(如培育的時間)和解凍時間之和；如果將冷凍制劑直接置于培育箱中，術語“培育時間”或“靜置時間”可互換使用。1.a各種溫度實驗室小規(guī)模熱解聚實驗在第一次實驗中，測定了解凍溫度為室溫(RT)、或25℃、27℃或29℃，然后在25℃、27℃或29℃培育的效果，共16小時或24小時。該實驗是在不干擾溫度設置的情況下進行的，因此在整個過程中保持穩(wěn)定。表4與圖1總結了此過程。干擾素寡聚體和干擾素凝聚體用新型SEC-HPLC方法，本文稱為NEWSEC來測定。該NEWSEC方法能定量和定性檢測非共價和共價寡聚體。目的是優(yōu)化本體干擾素的熱解聚(TD)，在制備藥物產品(損傷修復)之前，用下面的參數或變量將寡聚和/或凝聚降到最低。1)培育溫度(25℃、27℃和29℃)對熱解聚效率的影響；2)培育持續(xù)時間對熱解聚效率的影響；3)通過在培育箱中解凍來縮短解凍持續(xù)時間。表4*解凍和培育時間共16小時或24小時。室溫對照進行一次，實驗設置1進行了2次，實驗設置2進行了3次。各條件都使用了裝有小規(guī)模模式(里面裝有1.8ml“新鮮”的本體干擾素的2mlNUNC試管，“插入的試管模式”)的250ml試管。培育箱用水保溫夾套或用氣體循環(huán)保溫。詞匯表/縮寫Agg凝聚體COA分析驗證.Dim二聚體Deg降解物FDF最終劑型F/T冷凍和解凍r-hIFN-β1aCHO細胞產生的重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)r-hIFN-βFDF重組人IFN-β1a的最終劑型(r-hIFN-βFDF)SE-HPLC分子大小排阻高效液相色譜SAB50mM醋酸鈉，pH-3.8Temp.溫度1.新型SEC-HPLC方法的設備和材料HPLC系統(tǒng)WatersAlliancesUV檢測器波長214nm的Waters996PDA自動取樣溫度設定4℃層析柱TosoHaasTSKG2000SWXL層析柱溫度室溫流動相pH3.8、含50mMNaCl的50mM醋酸鈉制備將5.84gNaCl溶解于2升pH3.8的50mM醋酸鈉緩沖液中。在滅菌溶液單元中將醋酸加入到WFI中并用10M的NaOH溶液滴定至pH-3.8來制備醋酸緩沖液。流速0.5mL/min注射體積0.34-0.36mg/mL重組人IFN-β1a本體200μL試劑醋酸，Merck編號K31358056NaOH，MerckB19758210MNaOH溶液WFINaCl，JTBAKER產品編號3627-072.步驟—步驟如圖1所述1)將1.8ml新鮮重組人IFN-β1a本體插入(加入)到2mlNUNC試管中，-70℃在含有200ml水的250ml試管中冷凍。2)3個試管在室溫下解凍，分別在25℃、27℃和29℃確證的(validated)培育箱(固定溫度隨時間變化保持恒定)中培育，共16小時。解凍后和16個小時(解凍+培育)后，從試管中取樣用NEWSEC測定。3)3個試管在室溫下解凍，分別在25℃、27℃和29℃確證的培育箱中培育，共24小時。解凍后和24小時(解凍+培育)后，從試管中取樣用NEWSEC測定。4)3個試管分別在25℃、27℃和29℃確證的培育箱中解凍和培育，共16小時。解凍后和16個小時(解凍+培育)后，從試管中取樣用NEWSEC測定。5)3個試管分別在25℃、27℃和29℃確證的培育箱中解凍和培育，共16小時。16個小時(解凍+培育)后從試管中取樣用NEWSEC測定，-此培育箱中解凍后沒有取樣。6)3個試管分別在25℃、27℃和29℃確證的培育箱中解凍和培育，共24小時。24個小時(解凍+培育)后從試管中取樣用NEWSEC測定-此培育箱中解凍后沒有取樣。7)1個試管在室溫下解凍16個小時，在2-8℃下貯藏至多72小時，-此試管取樣作NEW-SEC測定，作為此實驗的對照。8)為了評價對分子的影響，本試驗在選定的條件下進行重復。用NEWSEC，IEF，QUANT-HPLC，ES-MS，BIOASSAY，DEG/OXHPLC，CZE檢測培育的樣品。試驗結果與室溫解凍16小時并在2-8℃貯藏的對照樣品作比較。3.結果％Mon或％單體＝％重組人干擾素-β1a單體％Agg＝％重組人干擾素-β1a凝聚體·室溫解凍和培育共16小時將3×250ml含有插入物的試管-70℃冷凍和室溫解凍，將這些試管溫和地顛倒20次，取樣并立即轉移到3個培育箱(25℃、27℃以及29℃)中，解凍和培育時間共16個小時。樣品2-8℃貯藏直至用NEWSEC-HPLC分析。結果如表5所示。表5**培育持續(xù)時間-10個小時·室溫解凍和培育共24小時將3×250ml含有插入物的試管-70℃冷凍和室溫解凍，將這些試管溫和地顛倒20次，取樣并立即轉移到3個培育箱(25℃、27℃和29℃)中，解凍和培育共24個小時。樣品2-8℃貯藏直至用NEWSEC-HPLC分析。結果如表6所示。表6**培育持續(xù)時間-18.5個小時·培育箱中解凍和培育共16小時將3×250ml含有插入物的試管-70℃冷凍后，分別在3個培育箱(25℃、27℃和29℃)中解凍，解凍和培育共16小時后，將這些試管溫和地顛倒20次。樣品在2-8℃貯藏直至用NEWSEC-HPLC分析。結果如表7所示。表7**培育持續(xù)時間-16個小時·培育箱中解凍和培育共24小時將3×250ml含有插入物的試管-70℃冷凍后，分別在3個培育箱(25℃、27℃和29℃)中解凍，將這些試管溫和地顛倒20次，取樣用NEWSEC-HPLC分析，培育共24小時(解凍+培育)。樣品2-8℃貯藏直至用NEWSEC-HPLC分析。本試驗在另一天重復進行，-這些試管解凍之后沒有取樣。結果如表8a和8b所示。表8a**培育持續(xù)時間24個小時表8b4.結論從以上的實驗可以得出以下幾點·提高培育溫度和持續(xù)時間可以提高熱解聚效率?！づc室溫解凍相比，當樣品在培育箱中解凍時，解凍持續(xù)時間減少，因此可提高單體的水平?！じ鶕Ｒ?guī)SECHPLC、Deg/OxHPLC、Quant-HPLC、ES-MS，生物學試驗和CZE的結果，25℃、27℃和29℃解凍和培育多至24小時對重組人干擾素-β1a分子沒有負面影響。上述實驗證明通過調節(jié)前述凍存的本體干擾素的靜置溫度和靜置時間而降低寡聚獲得了顯著的結果。與制劑如何解凍(如室溫解凍或在培育箱中解凍)無關，提高靜置溫度至一特定溫度對干擾素單體水平具有有益效果。因此，靜置溫度和蛋白質單體水平之間有相關性；將靜置溫度從25℃提高到29℃導致蛋白質單體水平提高。當本體溶液溫度設定在29℃時獲得最好結果。優(yōu)選將本體溶液置于培育箱中29℃培育。比較培育溫度，觀察到從25℃到29℃單體水平增加～5-6％。優(yōu)選將冷凍制劑直接置于培育箱中，在培育之前不在室溫下解凍(而在培育箱中解凍)。結果也顯示培育解凍的本體干擾素10小時已產生了超過95％的單體百分比。如果在室溫下解凍，測定的培育持續(xù)時間為10小時或18.5小時。如果在培育箱中解凍，測定的培育持續(xù)時間為16小時或24小時。同樣的，靜置時間也是一個影響寡聚的因素。與靜置條件(如室溫下解凍后培育或者直接培育)無關，在靜置時間和單體水平之間有相關性；較長的靜置時間提高了蛋白質單體水平。靜置時間24小時可得到最好的結果。比較靜置時間，靜置時間從16小時到24小時可得到～3％的單體增加。優(yōu)選冷凍制劑的靜置時間為24小時。更優(yōu)選將冷凍制劑直接置于培育箱(在培育箱中解凍)中培育時間(靜置時間)為24小時。組合兩個變量(靜置時間和靜置溫度)，可達到～9％的單體增加。當比較培育的制劑與那些沒有培育的制劑時，結果甚至更加顯著。如果在解凍后直接分析制劑(沒有進行培育)，得到77.48％的單體，而當冷凍制劑在29℃培育溫度下直接培育24小時得到97.9％的單體。因此，通過優(yōu)化這兩個變量得到20％的單體水平差異。優(yōu)選將本體干擾素靜置溫度設定為29℃，靜置時間24小時。更優(yōu)選將本體干擾素直接在29℃培育(在培育箱中解凍)，培育時間24小時(最好的結果是產生97.9％的單體)。結論是靜置時間和靜置溫度，和優(yōu)選培育溫度和培育時間是對維持和/或提高本體干擾素預制劑或制劑穩(wěn)定性具有重要影響的重要因素。1.b經不同輪次F/T循環(huán)29℃實驗室規(guī)模熱解聚實驗此報告評價了29℃培育對重組人干擾素-β1a藥物中二聚體和凝聚體水平的影響。1.步驟a采用NEW-SEC法分析如表9中所示經不同輪次F/T循環(huán)解凍后29℃培育15小時或3小時的重組人干擾素-β1a本體樣品。將重組人干擾素-β1a本體轉移到7個15mlcorning試管中(每管0.9ml)。將試管-70℃冷凍。還將干擾素-β-1a本體(事先冷凍并解凍的)轉移到2個250mlcorning試管中(每管200ml)，將試管-70℃冷凍。表9實驗室規(guī)模熱解聚實驗的樣品處理b為了評價培育干擾素-β-1a本體對該分子的影響，采用Deg/Ox-HPLC，IEF，ES-MS，Quant-HPLC，CZE檢測了培育的本體(在1輪F/T循環(huán)后)。c另外，還進行了實驗室規(guī)模的1輪F/T循環(huán)熱解聚的動力學實驗。一輪F/T循環(huán)后，從250ml試管中取出等份重組人干擾素-β1a本體放入15ml試管中在29℃培育箱中培育。2結果1)室溫解凍后，培育重組人干擾素-β1a本體(1F/T)，使單體水平從82.8％上升到97.57％，凝聚體水平從0.7％降到0.2％(見表10)。29℃培育(培育箱中)15小時使二聚體有效解聚；2)水浴解凍后培育重組人干擾素-β1a本體，使單體水平從82.8％上升到96.7％，但凝聚體水平從0.7％升高至1.97％(見表10)。表10一輪F/T循環(huán)后，0.9ml本體樣品的SEC-HPLC檢測結果3)室溫解凍后，培育重組人干擾素-β1a本體(4F/T)3小時，由于二聚體水平降低，單體水平從82.3％上升到89.5％(見表11和圖2)。4)室溫解凍后，培育重組人干擾素-β1a本體(4F/T)15小時，由于二聚體水平降低，單體水平從82.3％進一步上升到93.7％(與培育3小時相比較)(見表11和圖2)。5)水浴解凍后，培育重組人干擾素-β1a本體，由于二聚體水平降低，單體水平從82.3％上升到94.7％(見表11和圖2)。表114輪F/T循環(huán)后，0.9ml本體樣品的SEC-HPLC檢測結果6)室溫解凍后，培育200ml重組人干擾素-β1a本體樣品使單體水平從73％上升到91.2％，凝聚體水平從3.9％下降到2.9％(見表12和圖3)。表122輪F/T循環(huán)后，200ml本體樣品的SEC-HPLC檢測結果7)用以下試驗分析培育的重組人干擾素-β1a本體樣品(0.9ml，1F/T)以及室溫解凍4℃保存的對照樣品(見表13)Deg/Ox-HPLC-與對照樣品(4℃貯藏)相比，培育的樣品中未見氧化水平提高ES-MS-與對照樣品相比，培育樣品中未見糖類水平有差異Quant-HPLC-未見濃度有顯著差異CZE-得到了相同的電泳圖譜IEF-在循環(huán)水浴中解凍的重組人干擾素-β1aF本體樣品顯示在p1-7附近有一條額外條帶。對照樣品和室溫解凍培育15小時的樣品符合規(guī)定要求。表13熱解聚對干擾素的影響如Deg/oxHPLC、ES-MS、Quant-HPLCCZE和IEF所測定的那樣，室溫解凍后培育15小時，不影響IFN-β1a分子的參數。8)1輪F/T熱解聚動力學實驗結果見表14和圖4-6中所示。表14實驗室規(guī)模的F/TX1熱解聚動力學實驗3.結論1)室溫解凍后，29℃培育重組人干擾素-β1a樣品15小時顯著降低了寡聚化水平(主要為二聚體)2)29℃水浴解凍后，29℃培育重組人干擾素-β1a樣品15小時顯著降低了寡聚化水平。3)根據所用的分析方法，如Deg/oxHPLC、ES-MS、Quant-HPLCCZE和IEF所測定的那樣，室溫解凍后，29℃培育重組人干擾素-β1a樣品15小時對IFN-β-1a分子參數沒有負面影響。解聚非共價寡聚體有效，但并非所有的非共價寡聚體都解聚(在250ml試管中有4％的非共價寡聚體沒有解聚)。250ml試管中單體百分比達到94％(29℃培育9小時)而小試管中達到97.57％(29℃培育15個小時)。在熱解聚后寡聚體立即達到平衡(見表和圖)。15ml試管中29℃15小時后熱解聚完成?？傊?，本實驗(1.a和1.b)證明，熱解聚(體現為具體溫度和持續(xù)時間(即靜置溫度和靜置時間或培育時間和培育溫度))對維持和/或提高(單體)蛋白質或含(單體)蛋白質的制劑的穩(wěn)定性非常重要。干擾素-β的熱解聚動力學結果還顯示，經1輪F/T循環(huán)的樣品熱解聚僅在3個小時后就產生了90％的單體，6個小時后幾乎完成，然后在15小時達到“平臺”。優(yōu)選進行熱解聚至少3小時。更優(yōu)選將干擾素-β的熱解聚持續(xù)時間(靜置時間或培育時間)設定在6-40小時。甚至還要優(yōu)選將干擾素-β的熱解聚持續(xù)時間設定在15-30小時，或10小時、16小時、18.5小時或24小時。甚至更優(yōu)選干擾素-β的熱解聚持續(xù)時間為24小時。培育或靜置溫度優(yōu)選設定為27℃-31℃。更優(yōu)選該溫度為29℃。雖然熱解聚動力學實驗結果是在1輪F/T循環(huán)后得到的，但本領域技術人員不難用常規(guī)技術測定經多輪F/T循環(huán)后(如2F/T，4F/T或11F/T；或在其他種類的應力后)熱解聚的動力學，或者甚至測定任何干擾素-β(如重組人干擾素-β1a)或任何單體蛋白質整個制備過程或一部分制備過程中的熱解聚動力學。因此本發(fā)明不限于某具體的培育時間或持續(xù)時間(或靜置時間)。同樣，本領域技術人員不難用常規(guī)技術測定在一輪或多輪F/T循環(huán)后(或在其他種類的應力后)最適宜的培育溫度(或靜置溫度)，或者甚至測定任何干擾素-β(如重組人干擾素-β1a)或任何單體蛋白質整個制備過程或一部分制備過程中的最適宜培育溫度。因此本發(fā)明不限于某具體的培育溫度(或靜置溫度)。實施例2在本體干擾素中加入輔料來穩(wěn)定干擾素-β進行這些實驗以驗證一些輔料如氨基酸、抑菌劑、表面活性劑和等滲劑對保護本體重組人干擾素-β1a減少寡聚和凝聚的效果。進行以下研究時在本體重組人干擾素-β1a預制劑中沒有加入人血清白蛋白(HSA)。1.0詞匯表/縮寫Agg凝聚體COA分析驗證Dim二聚體Deg降解物FDF最終劑型F/T冷凍和解凍r-hIFN-β1aCHO細胞產生的重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)r-hIFN-βFDF重組人IFN-β1a的最終劑型(r-hIFN-βFDF)SE-HPLC分子大小排阻高效液相色譜SAB50mM醋酸鈉，pH-3.8Temp溫度2.0介紹此研究關注從SEC-EL分級到FDF貯藏的制備步驟中最大程度降低r-hIFN-β1a的寡聚化，以提供穩(wěn)定的本體干擾素-β。通過以下步驟最大程度降低應力(如F/T)產生的寡聚1.用輔料和/或其他穩(wěn)定劑但不存在HSA的情況下預配制本體。2.評價貯藏溫度(-20℃、-70℃和2-8℃)對預配制的本體寡聚化的影響。用SE-HPLC分析預配制的本體樣品。3.0目的/范圍最大程度降低本體處理過程中r-hIFN-β1a的寡聚化。4.0設備和材料4.1設備0.2μ過濾裝置P/NMPGL025MilliporeMillex0.2μ針頭式微孔過濾器-P/NSLGV025LSMillipore250ml錐形離心管-Corning1.8ml冷凍管-Nunc4.2材料a.SECel2組分b.D-甘露醇DAB，歐洲藥典(PhEur)，英國藥典(BP)，美國藥典(USP)，美國《食品化學藥典》(FCC)，美國標準E421(編號1.05980，Merck)c.100％冰醋酸(編號1.00063，Merck)d.10M氫氧化鈉e.泊咯沙姆188(Poloxamer188，LutrolF68DAC，美國藥典USP/美國國家處方集NF，Basf)，5163315f.L-甲硫氨酸(1.05707，Merck)g.苯甲醇PhEur，BP，NF(編號1.00987，Merck)h.L-精氨酸單鹽酸鹽(編號1.01544，Merck)i.TweenTM20歐洲藥典(Ph.Eur)，美國國家處方集(NF)，(編號8.17072，Merck)j.賴氨酸(編號1.05701，Merck)k.0.48-0.5mg/ml或0.088mg/ml的重組人干擾素-β1al.pH3.8、50mM或10mM醋酸鹽緩沖液。穩(wěn)定劑氨基酸1.31.6mg/ml精氨酸2.27.4mg/ml賴氨酸3.0.12mg/ml甲硫氨酸(抗氧化劑)表面活性劑1.0.05mg/mlTween202.0.5mg/ml泊咯沙姆188(Pluronicacid)抑菌劑1.5mg/ml苯甲醇等滲劑1.54.6mg/ml甘露醇5.0步驟進行SEC-EL2組分研究。研究的總體方案見圖7所示。不同的預配制條件見15和16所示。表15實驗方案穩(wěn)定劑苯甲醇/L-精氨酸/甘露醇/賴氨酸表16測試的預配制條件6.1溶液制備6.1.11升50mM、pH-3.8醋酸鈉溶液(SAB)的制備將3.003g冰醋酸加入到1000mlWFI中混合5分鐘。加入約0.56ml10M氫氧化鈉調pH至3.8，混合溶液5分鐘，取樣測電導率，用0.2μ濾器過濾。在預制劑中泊咯沙姆188(或PluronicF-68)的水平為0.1％(重要的微膠束濃度(CriticalMicellarConcentration))，以防制備過程中容器表面吸附藥物；較高的濃度可能對產物穩(wěn)定性有負面影響(氧化較高)；較低的濃度可能抑制吸附的效果較差。6.1.2制備1升的以下溶液1.50mM醋酸鹽、pH-3.8，10mg/ml苯甲醇如6.1.1加入10g苯甲醇后加入氫氧化鈉2.50mM醋酸鹽、pH-3.8，5mg/ml苯甲醇如6.1.1加入5g苯甲醇后加入氫氧化鈉3.50mM醋酸鹽、pH-3.8，63.2mg/ml精氨酸如6.1.1加入63.2g精氨酸后加入氫氧化鈉4.50mM醋酸鹽、pH-3.8，31.6mg/ml精氨酸如6.1.1加入31.6g精氨酸后加入氫氧化鈉5.50mM醋酸鹽、pH-3.8，54.8mg/ml賴氨酸如6.1.1加入54.8g賴氨酸后加入氫氧化鈉6.50mM醋酸鹽、pH-3.8，27.4mg/ml賴氨酸如6.1.1加入31.6g精氨酸后加入氫氧化鈉7.50mM醋酸鹽、pH-3.8，600mM甘露醇將3.003g冰醋酸加入到0.926kgWFI中混合溶液5分鐘。在該溶液中加入100.3g甘露醇混合5分鐘。加入約0.56ml10M氫氧化鈉調pH至3.8，混合溶液5分鐘，取樣測電導率，用0.2μ膜過濾。8.50mM醋酸鹽、pH-3.8，600mM甘露醇將3.003g冰醋酸加入到0.966kgWFI中混合溶液5分鐘。在該溶液中加入55.1g甘露醇混合5分鐘。加入約0.56ml10M的氫氧化鈉調pH至3.8，混合溶液5分鐘，取樣測電導率，用0.2μ膜過濾。6.1.3制備1升以下溶液1.50mM醋酸鹽、pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸。如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。2.50mM醋酸鹽pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml泊咯沙姆188如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和50g泊咯沙姆188。3.50mM醋酸鹽、pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5grTween204.50mM醋酸鹽、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸5.50mM醋酸鹽、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml泊咯沙姆188如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和50g泊咯沙姆188。6.50mM醋酸鹽、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5gTween。7.50mM醋酸鹽、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。8.50mM醋酸鹽、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml泊咯沙姆188(Poloxamer188)如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g泊咯沙姆188。9.50mM醋酸鹽、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5gTween。10.50mM醋酸鹽、pH-3.8、27.4mg/ml賴氨酸、12mg/ml甲硫氨酸如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。11.50mM醋酸鹽、pH-3.8、27.4mg/ml賴氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml泊咯沙姆188如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g泊咯沙姆18812.50mM醋酸鹽、pH-3.8、27.4mg/ml賴氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5gTween。6.2本體預制劑本體制備和組成的總體方案見圖7和表15所示。第一階段6.2.1將197g的SEC-EL用SAB、10mg/ml苯甲醇以1∶1w/w稀釋6.2.2將197g的SEC-EL用SAB、63.2mg/ml精氨酸以1∶1w/w稀釋6.2.3將197g的SEC-EL用SAB、600mM甘露醇以1∶1w/w稀釋6.2.4將197g的SEC-EL用SAB、54.8mg/ml賴氨酸以1∶1w/w稀釋6.2.592gSEC-EL用208gSAB稀釋以制備含0.5mg/ml重組人干擾素-β1a的溶液。過濾后，將溶液分入兩個250ml試管(含有130g本體)和6個2ml的試管(含有0.5ml本體)中。一個250ml試管和兩個2ml試管-70℃凍存。一個250ml試管和兩個2ml試管-70℃冷凍，然后轉移到第二個冷凍罐中-20℃貯存。兩個2ml試管2-8℃貯存。用水稀釋SEC-EL以制備6ml含有0.088mg/ml重組人干擾素-β1a的10mM醋酸鹽溶液，pH-3.8。第二階段制備重組人干擾素-β1a濃度為0.5mg/ml的以下溶液。6.2.6將6.2.1中制備的溶液用SAB，5mg/ml苯甲醇稀釋6.2.7將6.2.2中制備的溶液用SAB，31.6mg/ml精氨酸稀釋6.2.8將6.2.3中制備的溶液用SAB，300mM甘露醇稀釋6.2.9將6.2.4中制備的溶液用SAB，27.4mg/ml賴氨酸稀釋6.2.10過濾后，將這4種溶液(6.2.6到6.2.9)分入4個250ml試管(含有130g本體)和6個2ml試管(含有2ml本體)中?？偣?4個250ml試管和18個2ml試管。將這3種溶液的剩余部分進一步加工(第三階段)6.2.11每種溶液2個250ml試管和2個2ml試管-70℃凍存。每種溶液2個250ml試管和2個2ml試管-70℃冷凍，然后轉移到第二個冷凍罐中-20℃貯存。每種溶液2個2ml試管2-8℃貯存。第三階段(1∶100稀釋)6.2.12將6.2.6中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB，5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸稀釋。6.2.13將6.2.6中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物(Pluronic)稀釋。6.2.14將6.2.6中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20稀釋。6.2.15將6.2.7中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸稀釋。6.2.16將6.2.7中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀釋。6.2.17將6.2.7中制備29.7ml的溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20稀釋。6.2.18將6.2.8中制備的29.7m溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸稀釋。6.2.19將6.2.8中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀釋。6.2.20將6.2.8中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20稀釋。6.2.21將6.2.9中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml賴氨酸、12mg/ml甲硫氨酸稀釋。6.2.22將6.2.9中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml賴氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀釋。6.2.23將6.2.9中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml賴氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20稀釋。6.2.24所有的溶液(6.2.12到6.2.23)分別用Millex0.2μ針頭式過濾器過濾。6.2.25將溶液分入2ml試管中(每種溶液至少6個試管)6.2.26每種溶液2個2ml試管-70℃凍存。每種溶液2個2ml試管-70℃冷凍，然后轉移到第二個冷凍罐中-20℃貯存。每種溶液2個2ml試管2-8℃貯存。6.3本體分析室溫解凍2小時后，用SE-HPLC分析在2-8℃、-70℃和-20℃貯存的每種預配制條件的一個2ml試管。將-20℃貯存的樣品在解凍前移回-70℃貯存4小時。結果見表17所示。室溫解凍6小時后，用SE-HPLC分析在條件1、5、9、13和15(見表1)預配制的-70℃貯存的一個250ml試管。結果見表18所示。另外，取1輪F/T循環(huán)后29℃培育8小時的15ml試管中的樣品進行熱解聚研究(F/Tx1后從250ml試管中取出1ml樣品)并用SE-HPLC分析(結果見表19)。7.0結果表17貯存在-70℃、-20℃和2-8℃的Nunc試管(0.5ml)的預配制結果*2-8℃貯存3周。**-70℃冷凍，-20℃貯存16天，移回-70℃貯存4小時。結果為一式二份的平均值。本體緩沖液含50mM醋酸鈉pH-3.8+輔料(BA-苯甲醇、MET-甲硫氨酸、MAN-甘露醇、TW-Tween20、POL-泊咯沙姆)的不同組合。表18在-70℃貯存、29℃培育8個小時(+INC)或不經29℃培育的250ml試管的預配制結果結果為一式二份的平均值。表19經1輪F/T循環(huán)后15ml試管的熱解聚8.0觀察在本體重組人干擾素-β1a中加入輔料一致地降低了二聚體和凝聚體的百分比(因而一致地提高了單體的百分比)。比較熱解聚和所選輔料對重組人干擾素-β的作用，加入輔料可使單體水平輕度升高(降低二聚體和凝聚體水平)。另外，加入輔料而穩(wěn)定的預制劑再經熱解聚(如29℃培育)后甚至顯示出更高的單體水平。1.2ml試管·4℃下不同條件下單體％差異較小(最大的Δ為1.3％)，而含甘露醇的樣品單體水平最高(100％)?！?70℃下甘露醇+Tween20+甲硫氨酸的組合比賴氨酸略好。不同組合中的所有穩(wěn)定劑都能產生≥99％的單體％?！?70℃下并在-20℃貯存賴氨酸+Tween20+甲硫氨酸組合獲得了最高的單體百分比。2.250ml試管·-70℃與其他測試的輔料相比，賴氨酸降低寡聚化水平具有明顯的優(yōu)勢。實施例3用速度超離心、SEC和Deg/OxHPLC分析在本體干擾素中添加輔料后干擾素-β的穩(wěn)定性1.0詞匯表/縮寫Agg凝聚體Dim二聚體Deg降解物FDF最終劑型F/T冷凍和解凍r-hIFN-β1aCHO細胞產生的重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)r-hIFN-βFDF重組人IFN-β1a的最終劑型(r-hIFN-βFDF)SE-HPLC分子大小排阻高效液相色譜SAB50mM醋酸鈉，pH-3.8Temp溫度1.0介紹此研究關注從SEC-EL分級到FDF貯存的制備步驟中最大程度降低r-hIFN-β1a寡聚化以提供穩(wěn)定的本體干擾素。通過以下步驟將寡聚化降到最低1)在-70℃冷凍前，用輔料和/或其他穩(wěn)定劑預配制本體2)用輔料和/或其他穩(wěn)定劑預配制本體，不冷凍，2-8℃運送3)在2-8℃運送未經冷凍的r-hIFN-β1a本體，不進行預配制。用SE-HPLC、Deg/OxHPLC和速度超離心方法分析預配制的本體樣品。SE-HPLC可能只檢測共價寡聚體，而速度超離心還能夠定性和定量檢測非共價寡聚體。3.0目的/范圍最大程度降低在本體處理過程中r-hIFN-β1a的寡聚化。4.0設備和材料4.1設備0.2μ過濾裝置P/NMPGL025Millipore-70℃Revco冰箱蠕動泵250ml錐形離心試管-Corning1.8ml冷凍管-Nunc4.2材料SECel2組分D-甘露醇DAB，歐洲藥典(PhEur)，英國藥典(BP)，美國藥典(USP)，FCC，E421(編號1.05980，Merck)100％冰醋酸(編號1.00063，Merck)10M氫氧化鈉L-甲硫氨酸(1.05707，Merck)L-精氨酸單鹽酸鹽(編號1.01544，Merck)賴氨酸(編號1.05701，Merck)5.0步驟進行SEC-EL2組分研究。研究總體方案見圖8所示。不同的預配制條件見表20所示。表20預配制條件*用quant-HPLC測得。6.4溶液制備按實施例2制備溶液。1.50mM，pH-3.8醋酸鈉溶液(SAB)制備見實施例2。2.0.5升50mM、pH-3.8醋酸鹽溶液、63.2mg/ml精氨酸制備a.稱重0.483kgWFIb.加入31.6g精氨酸c.混合溶液5分鐘使精氨酸溶解d.加入1.5g醋酸e.混合溶液5分鐘f.測pH值時，加入約0.28ml10MNaOH使pH達到3.8g.溶液取樣作電導率和pH測定h.通過0.2微米過濾器過濾溶液3.1升50mM、pH-3.8醋酸鹽溶液、31.6mg/ml精氨酸制備a.稱重0.986kgWFIb.加入31.6g精氨酸c.混合溶液5分鐘使精氨酸溶解d.加入3.002g醋酸e.混合溶液5分鐘f.測pH值時，加入約0.56ml10MNaOH溶液使pH達到3.8g.溶液取樣作電導率和pH測定h.通過0.2微米過濾器過濾溶液4.1升50mM、pH-4.1醋酸鹽溶液、164.4mg/ml賴氨酸制備a.稱重0.835kgWFIb.加入164.4g賴氨酸c.混合溶液5分鐘使精氨酸溶解d.加入3.002g醋酸e.混合溶液5分鐘f.加入0.56ml10MNaOH溶液使pH達到約4.1g.溶液取樣作電導率和pH測定h.通過0.2微米過濾器過濾溶液5.1升50mM、pH-4.0的醋酸鹽溶液、82.2mg/ml賴氨酸制備a.稱重0.92kgWFIb.加入82.2g賴氨酸c.混合溶液5分鐘使賴氨酸溶解d.加入3.002g醋酸e.混合溶液5分鐘f.加入0.56ml10MNaOH溶液使pH達到約4.0g.溶液取樣作電導率和pH測定h.通過0.2微米過濾器過濾溶液6.1升50mM、pH-3.8醋酸鹽溶液、600mM甘露醇、0.24mg/ml甲硫氨酸制備a.稱重0.92kgWFIb.加入110.28g甘露醇c.混合溶液5分鐘使甘露醇溶解d.加入3.002g醋酸e.混合溶液5分鐘f.加入0.24g甲硫氨酸g.混合溶液5分鐘h.測pH值時，加入約0.56ml10MNaOH溶液使pH達到3.8i.溶液取樣作電導率和pH測定j.通過0.2微米過濾器過濾溶液7.2升50mM、pH-3.8醋酸鹽溶液、300mM甘露醇、0.12mg/ml甲硫氨酸制備a.稱重1.93kgWFIb.加入110.28r甘露醇c.混合溶液5分鐘使甘露醇溶解d.加入6.006g醋酸e.混合溶液5分鐘f.加入0.24g甲硫氨酸g.混合溶液5分鐘h.測pH值時，加入約1.12ml10MNaOH溶液使pH達到3.8i.溶液取樣作電導率和pH測定j.通過0.2微米過濾器過濾溶液6.1本體預配制本體預配制和組成的總體方案見圖8和表20所示。以下詳述該預配制過程。SEC-EL經OD280定量測定濃度為1.31mg/ml。第一階段(用不同緩沖液以1∶1w/w稀釋SEC-EL2)6.2.1用155gSAB、164.4mg/ml賴氨酸以1∶1(w/w)稀釋155gSEC-EL6.2.2用78gSAB、63.2mg/ml精氨酸以1∶1(w/w)稀釋78gSEC-EL6.2.3用220gSAB、600mM甘露醇、0.24mg/ml甲硫氨酸以1∶1(w/w)稀釋220gSEC-EL6.2.4用306gSAB稀釋189gSEC-EL以制備含有0.50-mg/mlr-hIFN-β1a的溶液。過濾后將該溶液分入250ml試管和2mlnunc試管中，-70℃或2-8℃貯存，用于2-8℃運送的250ml試管裝滿至蓋。第二階段(最終的本體稀釋至0.50-0.58mg/mlr-hIFN-β1a)制備以下溶液(目的濃度為0.5mg/mlr-hIFN-β1a)6.2.5用90gSAB、82.4mg/ml賴氨酸稀釋310g6.2.1中制備的溶液。6.2.6用48gSAB、31.6mg/ml精氨酸稀釋156g6.2.2中制備的溶液。6.2.7用132gSAB、300mM甘露醇，0.12mg/ml甲硫氨酸稀釋440g6.2.3中制備的溶液。6.2.8過濾后，將這3種溶液(6.2.5-6.2.7)分入250ml試管和2ml試管(含有2ml本體)。6.2.9將含有賴氨酸和精氨酸溶液的250ml試管和2ml試管-70℃凍存，含甘露醇和甲硫氨酸的溶液2-8℃貯存(250ml試管裝滿至蓋)6.3預配制的本體的處理用速度超速離心、Deg/OxHPLC和SE-HPLC測定-70℃和2-8℃貯存的樣品。7.0結果表218.0觀察本研究中用速度超離心和SEC方法證實了實施例2獲得的結果(單體水平％的差異可能是由于SEC只能檢測到共價寡聚體而致)。另外，DEG/OXHPLC顯示在本體r-hIFN-β1a中加入輔料后，氧化形式的水平保持穩(wěn)定。實施例4在過濾步驟前后在本體干擾素中加入輔料穩(wěn)定干擾素-β1.0詞匯表/縮寫Agg凝聚體COA分析驗證.Dim二聚體Deg降解物Deg/Ox-HPLC測定降解物和氧化形式的反相高效液相色譜F/T冷凍和解凍Quant-HPLC定量測定r-hIFN-β1a本體中r-IFNβ量的反相高效液相色譜r-hIFN-β1aCHO細胞產生的重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)r-hIFN-βFDF重組人IFN-β1a的最終劑型(r-hIFN-βFDF)SE-HPLC分子大小排阻高效液相色譜Temp溫度2.0小結采用SE-HPLC和速度超離心方法顯示在本體過濾之前或之后加入300mM甘露醇(冷凍前)預配制IFN-β-1a本體，經1輪F/T和4輪F/T循環(huán)，共價和非共價寡聚體和凝聚體減到最少。過濾前加入300mM甘露醇更顯著地降低了寡聚化水平，尤其是在250ml試管(盛放r-hIFN-β1a本體的常規(guī)容器)中的非共價寡聚體和凝聚體。采用SE-HPLC和速度超離心方法顯示2-8℃貯存的未冷凍的r-hIFN-β1a本體中不形成寡聚體，但在r-hIFN-β1a本體冷凍和解凍過程中形成寡聚體。3.0介紹最大程度程度減少冷凍解凍循環(huán)中r-hIFN-β1a的寡聚和凝聚是所需的目標，因為認為蛋白質凝聚可引起免疫反應導致產生中和抗體。目前用于測定本體中單體水平的分析方法是SE-HPLC。采用速度超離心得到的初步結果似乎表明，SE-HPLC只能檢測到共價寡聚體而速度超速離心還可定性和定量檢測非共價寡聚體(見實施例2)。此項研究采用SE-HPLC和速度超離心作為分析方法，來測定以生產規(guī)模用甘露醇預配制本體對r-hIFN-β1a寡聚和凝聚的影響。4.1目的/范圍4.1.1測定SEC組分中(過濾前和冷凍前)是否有非共價凝聚體。4.1.2測定在本體過濾前或后、冷凍前加入300mM甘露醇，經1輪或4輪F/T循環(huán)后是否能將共價和非共價寡聚體和凝聚體減至最少。4.1.3測定在本體過濾前、冷凍前加入150mM甘露醇，經1輪或4輪F/T循環(huán)后是否能將共價和非共價寡聚體和凝聚體減至最少。4.1.4測定在F/T循環(huán)后，1.8ml測試試管中的非共價凝聚體水平是否與250ml試管的水平相似。5.0設備和材料5.1設備0.2μl50-500ml過濾裝置Nalgene5.2材料SECel2組分-800ml甘露醇-MerckP/N1.05980.905050mM、pH3.8醋酸鹽緩沖液-IPL編號S88RD60050mM、pH3.8、含300mM甘露醇的醋酸鹽緩沖液(54.6g甘露醇/升)50mM、pH3.8、含600mM甘露醇的醋酸鹽緩沖液(109.3g甘露醇/升)50mM、pH3.8、含150mM甘露醇的醋酸鹽緩沖液(27.3g甘露醇/升)250ml錐形離心管-CorningP/N4307761.8ml冷凍管-Nunc試管P/N3754186.0步驟進行SECel2組分的研究。(濃度為1.81mg/ml，根據OD280)6.1本體制備如下制備本體(1)SECel2組分將裝滿的1.8ml試管速度超離心，在2-8℃運送。(2)對照將180mlSECel2組分通過0.2μm過濾裝置過濾，然后用720ml50mM、pH-3.8的醋酸鹽溶液洗滌濾器。-70℃冷凍前，將該本體分入4個250ml試管(每個200ml)和10個1.8ml冷凍管中。其中兩個1.8ml試管不冷凍。將這兩個裝滿的試管的其中一個在速度超離心分析前保存在2-8℃。本體濃度為350μg/ml(根據quant-HPLC)。(3)過濾后加入300mM的甘露醇將180mlSECel2組分通過0.2μm濾器過濾，然后用180ml的50mM醋酸鹽、600mM甘露醇pH-3.8和540ml的50mM醋酸鹽、300mM甘露醇、pH-3.8洗滌濾器。-70℃冷凍前，將該本體分入4個250ml試管(每個200ml)和10個1.8ml冷凍管中。其中兩個1.8ml試管不冷凍。將這兩個裝滿的試管的其中一個在速度超離心分析前保存在2-8℃。甘露醇最終濃度為300mM。該本體的濃度為344μg/ml(根據quant-HPLC)。(4)過濾前加入150mM的甘露醇將200mlSECel2與200ml50mM醋酸鹽、300mM甘露醇溶液混合。將380ml此混合液通過0.2μm過濾器過濾，然后用570ml50mM醋酸鹽、150mM甘露醇、pH-3.8洗滌濾器。-70℃冷凍前，將該本體分入4個250ml試管(每個200ml)和10個1.8ml冷凍管中。其中兩個1.8ml試管不冷凍。將這兩個裝滿的試管的其中一個在速度超離心分析前保存在2-8℃。甘露醇最終濃度為150mM。該本體的濃度為342μg/ml(根據quant-HPLC)。(5)過濾前加入300mM甘露醇將200mlSECel2與200ml50mM醋酸鹽、600mM甘露醇溶液混合。將380ml此混合液通過0.2μm過濾器過濾，然后用400ml50mM醋酸鹽、300mM甘露醇洗滌濾器。-70℃冷凍前，將該本體分入4個250ml試管(每個200ml)和10個1.8ml冷凍管中。其中兩個1.8ml試管不冷凍。將這兩個裝滿的試管的其中一個在速度超離心分析前保存在2-8℃。甘露醇最終濃度為300mM。該本體的濃度為342μg/ml(根據quant-HPLC)。注意通過有4個電控制的閥門的系統(tǒng)，將SEC柱洗脫液平行收集在4個1升玻璃瓶中，該電控制閥門每隔5分鐘交替打開(由LCC500控制器控制)。在SEC-EL2組分過濾前加入甘露醇時，從SEC柱上洗脫時，在在線玻璃瓶中(glassbottleonline)輕輕混合SEC組分和甘露醇溶液(4)或(5)。在SEC過濾后加入甘露醇時(3)，加入甘露醇并通過同一過濾裝置過濾，但在SECEL-2組分之后。6.2冷凍和解凍將250ml試管冷凍至少8個小時、室溫解凍7小時，進行4輪F/T循環(huán)，。然后每輪解凍循環(huán)后25次顛倒混合試管內容物。將1.8ml試管冷凍至少8小時和解凍2個小時，進行4輪F/T循環(huán)。在下輪冷凍循環(huán)前20次顛倒混合試管內容物。對每種本體條件(2-5)，保存經1輪F/T循環(huán)和4輪F/T循環(huán)的2個冷凍250ml試管和2個1.8ml試管作速度超離心分析。每種本體條件的其他兩個250ml試管和1.8ml試管解凍，用SEC-HPLC測試。對解凍24±2小時的樣品進行SE-HPLC試驗和速度超離心。先使甘露醇溶解。表22各批SEC/本體批次測試樣品列表注括號中的數字指總體方案。7.0結果7.1采用SE-HPLC方法，經1輪F/T循環(huán)后，在所有3種條件(3、4和5)下用甘露醇預配制對降低1.8ml試管和250ml試管中的寡聚化水平有輕度影響。(與對照樣品相比純度高～0.4％)。采用超離心方法，經1輪F/T循環(huán)后，在所有3種條件(3、4和5)下甘露醇對1.8ml試管和250ml試管中的寡聚化水平都有顯著作用。在250ml試管中(表25)，與過濾后加入300mM甘露醇(條件3)相比，過濾前加入300mM甘露醇(條件5)對降低寡聚化有更積極(positive)的作用。7.2采用SE-HPLC方法，經4輪F/T循環(huán)后(表26)，在所有3種條件下(3、4和5)甘露醇對1.8ml試管中的寡聚化水平都有顯著作用(與對照樣品相比，當用300mM甘露醇預配制時純度提高～2.6％)采用超離心，經4輪F/T循環(huán)后，在所有3種條件下(3、4和5)甘露醇對1.8ml試管和250ml試管中的寡聚化水平具有顯著作用。然而，在1.8ml試管中這種積極作用更顯著。7.3用SE-HPLC和超離心二方法(表23)測定，2-8℃貯存樣品(未冷凍)中未測到寡聚化。7.4根據SE-HPLC和超離心結果，250ml試管的寡聚化水平顯著高于1.8ml試管。注意表23-27的括號中結果是指凝聚體％。表232-8℃貯藏的1.8ml試管中本體純度％表241輪F/T循環(huán)后1.8ml試管中本體純度％表251輪F/T循環(huán)后250ml試管中的本體純度％樣品取自同一250ml試管表264輪F/T循環(huán)后1.8ml試管中的本體純度％*樣品取自不同的1.8ml試管。表274輪F/T循環(huán)后250ml試管中的本體純度％*樣品取自一個試管。8.0結論8.1采用SE-HPLC和速度超離心兩種方法，當在本體過濾之前或之后加入300mM甘露醇(冷凍前)預配制r-hIFN-β1a本體時，經1輪F/T和4輪F/T循環(huán)后，共價和非共價寡聚體和凝聚體減至最少。然而，過濾前加入300mM甘露醇更顯著地降低了寡聚化水平，特別是250ml試管(IFN-β-1a本體的常規(guī)容器)中的非共價寡聚體和凝聚體。用甘露醇預配制本體，經F/T循環(huán)后，對r-hIFN-β1a寡聚和凝聚的影響在1.8ml試管中與250ml試管中相似(與對照樣品相比，用SE-HPLC測定純度提高約0.4％，而用速度超離心測定提高約13％)。8.2在本體過濾前，冷凍前加入150mM濃度的甘露醇，經1輪F/T循環(huán)和4輪F/T循環(huán)后，減少了共價和非共價寡聚體和凝聚體，但是這種作用不如300mM那樣顯著。8.3SE-HPLC和速度超離心二種方法顯示，在2-8℃貯藏的、未冷凍的r-hIFN-β1a本體和SEC-EL無寡聚體形成，但在r-hIFN-β1a本體冷凍和解凍過程中形成寡聚體。8.4速度超離心得到的初步結果似乎表明，SE-HPLC(與NEWSEC相反)只能檢測出共價寡聚體而速度超離心還可定性和定量檢測非共價寡聚體。未經F/T循環(huán)的4℃(或2-8℃)貯藏的樣品非常穩(wěn)定(根據％單體含量)。不希望受理論的束縛，據信應力，如冷凍/解凍循環(huán)對于分子的作用，均會增加干擾素-β寡聚體的形成。4℃貯存的樣品中，最好的結果是聯用甘露醇和甲硫氨酸和最后補加苯甲醇或Tween20時獲得的，顯示樣品2-8℃貯存沒有寡聚化。優(yōu)選本發(fā)明方法聯用甘露醇和甲硫氨酸作為穩(wěn)定劑，還可加入苯甲醇或Tween20。單單賴氨酸或其任何組合也是可采用的優(yōu)選輔料。一些輔料顯示具有穩(wěn)定活性可對抗F/T循環(huán)所產生的應力，即Tween20、苯甲醇或賴氨酸(即，已證明這些輔料能抵消冷凍/解凍應力)。如果制備過程包括冷凍/解凍循環(huán)，宜將優(yōu)選的輔料，如Tween20、苯甲醇或賴氨酸加入到本體溶液中。因此，當制備過程包括F/T循環(huán)時，也鑒定了優(yōu)選的輔料及其組合。本發(fā)明-20℃貯存的樣品經多輪F/T循環(huán)(試管先-70℃冷凍然后再轉移到第二個冷凍罐中-20℃貯存16天。然后樣品在解凍前移回-70℃貯存4小時。)。根據以上所述，當經歷應力如F/T循環(huán)時，優(yōu)選采用Tween20、苯甲醇和賴氨酸作穩(wěn)定劑。因此，在任何貯存溫度(-70℃，-20℃或4℃)和存在F/T循環(huán)應力時，Tween20、賴氨酸和苯甲醇單獨或聯用是本體干擾素溶液中的優(yōu)選輔料。以下組合尤其優(yōu)選1.賴氨酸和苯甲醇2.賴氨酸和Tween203.賴氨酸和苯甲醇和Tween20，和4.苯甲醇和Tween20以下實施方案是在任何貯存溫度(-70℃、-20℃或4℃)下和在F/T循環(huán)應力存在時最優(yōu)選的實施方案。就單體％和凝聚體％而言，在-20℃以及4℃和-70℃時賴氨酸產生了很好的結果。賴氨酸是經測試的唯一能夠抵抗冷凍/解凍應力而穩(wěn)定干擾素-β的氨基酸。因此，賴氨酸是最優(yōu)選的抗F/T循環(huán)應力的輔料，避免了對抗菌劑(如苯甲醇)或表面活性劑(如Tween20)的需要，它們是顯示了抗F/T應力的穩(wěn)定活性的另外兩種輔料。因此，可考慮預制劑中只包含賴氨酸或賴氨酸與抗氧化劑(如甲硫氨酸)的組合。-20℃時的最好結果事實上是由賴氨酸和甲硫氨酸組合而獲得的。更優(yōu)選本發(fā)明采用賴氨酸和甲硫氨酸的組合。甘露醇、甲硫氨酸和Tween20的組合獲得了高水平的單體百分比(98.12％單體)。苯甲醇和甲硫氨酸的組合產生了很高的單體百分比(～98％單體)。因此，苯甲醇和甲硫氨酸的組合是優(yōu)選的。也可將Tween20加入到這種組合中，產生更高的單體百分比(～99％)。因此，更優(yōu)選苯甲醇、甲硫氨酸和Tween20的組合。在整個制備過程中的兩個特定步驟中進行了實驗。在過濾前或后加入某種輔料(如甘露醇)能降低和/或減少寡聚體和凝聚體的形成。采用SE-HPLC和速度超離心法，在本體過濾前或后加入300mM甘露醇(冷凍前)預配制r-hIFN-β1a本體，經1輪F/T循環(huán)或4輪F/T循環(huán)后，共價和非共價寡聚體和凝聚體降至最低。本發(fā)明因此不應只限于本體蛋白質制備過程中某一特定步驟，而可包括預配制的本體蛋白質的制備和/或貯存所需要的所有步驟(即，可在本體處理的多個不同步驟中加入穩(wěn)定性輔料)。結果顯示就寡聚和凝聚而言沒有很大的不同，但在過濾前加入甘露醇會產生更好的結果，特別是對于250ml試管中的非共價寡聚體和凝聚體。因此優(yōu)選在過濾步驟前加入甘露醇。最后，上述實驗顯示與分別使用時獲得的水平相比，某些輔料與熱解聚相組合可產生更高水平的單體百分比。通過此方法，二聚體和凝聚體的水平顯著減少。因此，本發(fā)明優(yōu)選將通過加入輔料而穩(wěn)定的本體溶液與熱解聚相結合。熱解聚步驟可在生產過程的任何階段實施，不應限于本體處理過程的某一特定步驟。實施例5pH4.7的預制劑研究為評價pH對寡聚體和凝聚體形成的影響，在pH4.7進行了預配制研究。(1)步驟1.通過1∶1混合(1體積的SECE12組分與1體積的50mM、pH7.2(用NaOH滴定)的醋酸鹽溶液混合)，預配制pH為4.7的約0.5mg/ml的第一種本體。2.通過1∶1混合(1體積的SECE12組分與1體積的50mM、pH7.2(用NaOH滴定)、含164.4mg/ml賴氨酸的醋酸鹽溶液混合)，預配制pH為4.7的含82.2mg/ml賴氨酸的第二種本體。3.將這些制劑與用50mM、pH3.8醋酸鹽配的0.5mg/ml對照和用50mM、pH3.9、含82.2mg/ml賴氨酸的醋酸鹽預配制的對照作比較。4.在1.8ml試管中經一輪冷凍解凍循環(huán)后，用新型SEC-HPLC方法檢測樣品。結果表28(2)結論·與pH3.8時相比，pH4.7的預制劑降低了寡聚體和凝聚體的形成(分別為～99％單體比～81％單體，0％凝聚體比0.67％凝聚體)。因此，本發(fā)明的方法宜在pH4.7實施。·含賴氨酸的pH3.9或pH4.7的預制劑寡聚化減少。在pH4.7時，加入賴氨酸產生了99.6％的單體，而不加入賴氨酸產生99.1％的單體。在pH3.8時，加入賴氨酸對減少寡聚有顯著作用，產生99.7％的單體，與之相比不加賴氨酸的單體為81.41％。因此，在本發(fā)明中方法中賴氨酸是優(yōu)選加入的氨基酸?！げ捎胮H4.7預配制和賴氨酸相組合產生了最好的結果。因此，本發(fā)明的方法最優(yōu)選采用pH4.7和加入賴氨酸作為輔料。因此在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法可在pH4.7的本體干擾素中加入優(yōu)選輔料，并結合熱解聚。實施例6-分析方法本實施例描述采用的不同分析方法。采用分子大小排阻(SE)-HPLC、新SE-HPLC本文也稱為“新型SE-HPLC”或“NEWSEC”，和速度超離心(AUC)檢測重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a或r-hβIFN-1a)中的凝聚體和寡聚體水平。所述NEWSE-HPLC和AUC方法能定性和定量檢測共價和非共價寡聚體和凝聚體。a.SE-HPLC-純度測試用SE-HPLC測定IFN-β-1a本體中凝聚體的數量。步驟分析100μl待測IFN-β-1a本體樣品和對照樣品(PRB)。制備以下溶液30％ACN(乙腈)/0.2％TFA(三氟乙酸)/H2O。層析柱(Progel-TSKG2000或等同物)用洗脫液平衡，流速為0.5ml/min，至少1小時。一旦獲得穩(wěn)定的基線，注入100μl樣品液，以0.5ml/min流速用等梯度液洗脫。用214nmUV檢測記錄柱洗脫圖。本體樣品中IFN-β-1a單體的百分比由蛋白質峰整合面積來測定。說明IFN-β-1a本體樣品的主峰面積(對應完整分子)占總峰面積的比例不少于95％，含有不多于1％的凝聚體。冷凍/解凍循環(huán)(F/T)對照樣品的SE-HPLC測試步驟1.從-70℃的冰箱中取出需要量的重組人干擾素-β1a本體/批(batch)。2.大試管(～200ml)室溫解凍6-9小時，小試管/安瓿(1-15ml)2-4小時。(第一輪冷凍/解凍循環(huán))3.按以上本體所需量分成1ml等份(大試管)。4.-70℃冷凍各等份至少2個小時。5.再重復步驟2和步驟4三次。6.在第四輪解凍循環(huán)后，將少量對照樣品用稀釋緩沖液稀釋到0.25mg/ml作檢查。7.各等份應-70℃貯存。8.在進行SE-HPLC試驗之前，將對照F/T各等份試管室溫解凍2小時。b.NEWSE-HPLC在TSKG2000SWXL柱(TosoHaas)或BioSuite柱(Waters)中檢測凝聚體的總含量；用50mM醋酸鹽緩沖液、50mM、pH3.8NaCl，以0.5mL/min流速進行等梯度模式洗脫；波長設定在215nm。運行時間30分鐘。將重組人干擾素-β1a本體(0.35mg/ml)注入到處于飽和相的柱子中(每次注入0.2ml)?！ewSE-HPLC方法的儀器和材料HPLC系統(tǒng)WatersAllianceUV檢測儀Waters996PDA波長214nm自動取樣器溫度設定4℃·TosoHaasTSKG2000SWXL色譜柱柱溫室溫流動相含50mMNaCl的50mM、pH3.8醋酸鹽溶液制備方法取5.84gNaCl溶于2升50mM、pH3.8醋酸鹽緩沖液中。在無菌溶液操作單元中將醋酸加入到WFI中，用10MNaOH滴定至pH-3.8制備該醋酸鹽緩沖液。流速0.5ml/min洗脫液50mMCH3COONa-50mMNaCl、pH3.8激活液50mMHCl-50mMNaCl·試劑醋酸鹽，Merck編號K31358056NaOH，MerckB19758210MNaOH溶液WFINaCl，JTBAKER編號3627-07C.沉降速度分析-AUC1.方法描述將樣品液加載到含2通道-木炭環(huán)氧樹脂中間體(2-channelcharcoal-eponcentrepieces)帶有12mm光通路的加樣小室中。用洗滌劑清洗該中間體和蘭寶石窗口，然后在水中浸泡以盡可能得到最清潔的表面。將對應的安慰劑加載到參比通道中(該儀器的功能類似于雙光束分光光度計)。然后將那些已加樣的小室放入AN-50Ti分析型轉頭中，裝入BeckmanOptimaXL-I分析離心機中，20℃。轉頭加速到3000rpm時，掃描樣品(280nm吸收峰)，以證實加樣小室載量合適。然后將轉頭加速至最終轉速50000rpm。記錄各樣品在此轉速時的50次掃描結果。用PeterSchuck在N.I.H(國立衛(wèi)生研究院)開發(fā)的和在他的分析程序SEDFIT中實施的c(s)方法(8.7版；Schuck，P.(2000).用沉降速度超離心和Lamm方程模型進行大分子的大小分布分析(Size-distributionanalysisofmacromoleculesbysedimentationvelocityultracentrifugationandLammequationmodelling).Biophys.J.78，1606-1619)分析數據。在此方法中，直接擬合許多原始數據產生沉降系數分布曲線，同時模擬擴散對數據的影響以增強解析。基于所有的物質具有相同的總體流體動力學形狀(overallhydrodynamicshape)(由相對于球體摩擦系數的摩擦系數比值f/f0定義所述形狀)的假設，該方法通過為各沉降系數值賦予一個擴散系數來發(fā)揮作用。然后改變f/f0值以發(fā)現各樣品數據的最佳總體擬合值。用0.51最大熵校平法(maximum-entropysmoothing)計算分布。2.分析參數—轉頭類型8孔轉子—轉速50krpm—中間體木炭環(huán)氧樹脂—通道長度12mm—AUC運行溫度20℃—檢測波長280nm—樣品體積432mcl—參比體積442mcl3.設備和軟件分析型超速離心機XL-I型(BeckmanCoulter)SEDFITver8.70b軟件(PeterSchuck-國立衛(wèi)生研究院)Originver6.03軟件(BeckmanCoulter)ProteomeLabXL-A/XL-Iver5.0軟件(BeckmanCoulter)d.用RP-HPLC-QUANT-HPLC定量測定IFN-β-1a下述反相色譜法可用來定量測定本體樣品中的IFN-β-1a。在C4，5μm大孔丁基柱(Wide-PoreButyl)(Baker)中進行蛋白質定量測定；波長設定為214nm，用以下流動相和梯度液以1mL/min流速進行洗脫。步驟用50mM、pH3.8醋酸鈉緩沖液稀釋待測的IFN-β-1a樣品至濃度50-150μg/ml之間。制備以下溶液洗脫液A0.1％TFA水溶液(水/三氟乙酸0.1％)洗脫液B0.1％TFA乙腈溶液(乙腈/三氟乙酸0.1％)洗脫液CACN(乙腈)先用洗脫液C以1.0ml/min流速洗滌C4RP-HPLC柱30分鐘，然后用50％水和50％ACN洗滌15分鐘。用70％洗脫液A和30％的洗脫液B以約1.0ml/min流速平衡此柱15分鐘。一旦得到穩(wěn)定的基線，將IFN-β-1a本體樣品、對照樣品和校準曲線樣品(PRB，1.24-19.8μg)依次注入。每種注入100μl，除了1.24μg校準曲線樣品注入20μl外。流速保持在1.0ml/min。采用以下梯度液表29運行時間＝65分鐘由校準曲線面積的對數回歸曲線計算得到所測樣品中IFN-β-1a的量。說明IFN-β-1a本體含有0.280-0.500mg/ml的IFN-β-1a。e.用反相(RP)-HPLC-DEG/OX測定純度下述反相方法能檢測IFN-β-1a的氧化形式，所述氧化形式在洗脫時與完整分子不同。該氧化形式的定量測定在40℃恒溫C4，SupelcosilLC-304柱(Supelco)中進行；波長被設定為208nm，用以下流動相和梯度液洗脫，流速1mL/min制備以下溶液洗脫液A60％水/40％ACN/0.14％HFBA(水60％/乙腈40％/七氟丁酸酐(Heptafluorobutirricacid)0.14％)洗脫液B20％水/80％ACN/0.14％HFBA(水20％/乙腈80％/七氟丁酸酐0.14％)洗脫液C20％水/80％ACN/0.1％TFA(水20％/乙腈80％/三氟乙酸0.1％)用70％洗脫液A和30％洗脫液B以1ml/min流速平衡C4RP-HPLC柱至少15分鐘(直至獲得穩(wěn)定基線)。注入120μl樣品。用50mM、pH3.8醋酸鈉溶液稀釋待測樣品至濃度0.250-0.280mg/ml。采用以下梯度液表30利用蛋白質峰整合面積計算IFN-β-1a本體樣品的純度百分比。說明IFN-β-1a的主峰面積(對應于完整分子)不低于總峰面積的95％。f.細胞病變效應抑制生物學試驗-CPE生物效能(抗病毒活性)用細胞病變效應(CPE)抑制生物學試驗來測定IFN-β-1a本體的抗病毒活性。用基于IFN-β誘導的保護細胞(WISH細胞-人羊膜組織)對抗病毒(水皰性口炎病毒)的細胞病變作用的抗病毒試驗來檢測生物學活性。干擾素的生物學試驗的原理在于，一些病毒如水皰性口炎病毒(VSV)引起的細胞死亡可用活細胞染色方法觀測。繼而，細胞病變效應可用于定量測定干擾素的細胞保護效果。該試驗通過用活細胞攝取染料四唑鹽MTT(硫代二甲基四唑)的量進行評估來間接測定細胞的死亡。該方法采用自動化分光光度儀測定受保護細胞的百分比和三點平行線試驗對滴度作統(tǒng)計評價。步驟在微量滴定板中進行該試驗。a.將50μl細胞培養(yǎng)液(MEM/5％FBS)加入到各孔中。b.將100μlIFN-β-1a樣品或標準溶液(60-100IUhIFN-β/ml)加入到各孔中，在板中逐行進行3次1∶1.5分步稀釋。c.將50μlWISH細胞懸浮液(0.78-0.82×106細胞/ml)加入各孔中，在5％CO2濕度培育箱中37℃培育微孔板18-20小時。d.將VSV懸液加入各孔中，除細胞對照孔加入MEM/2.5％FBS外。e.在5％CO2濕度培育箱中37℃培育微孔板24個小時。f.用倒置顯微鏡驗證以下情況(1)VSV對照行中至少80％細胞損傷，和(2)在IFN-β標準品存在時，未稀釋的標準品保護百分比平均值為84％；1∶1.5稀釋時為45％，而1∶3稀釋時為27％。然后用特異性染料MTT染色培養(yǎng)的細胞。g.用自動化分光光度儀測定染色強度，讀取592nm值。h.用計算機程序(Colombo軟件)分析OD讀取值，定量測定IFN-β-1a的活性。說明IFN-β-1a本體含量不少于50×106IU/ml。g.用電噴霧電離質譜(ES-MS)法繪制糖圖譜(Carbohydratemapping)用四極質譜儀對IFN-β-1a的糖部分(N-連接于Asn-80殘基)作完整分子的ES-MS分析。步驟該試驗方法包括以下步驟(1)IFN-β-1a本體樣品脫鹽，(2)用四極質譜儀作IFN-β-1a完整糖型類別的ES-MS半定量分析。按照它們的預期分子量(21-24kDa，蛋白鏈分子量20kDa)，用ES-MS譜鑒定完整的糖型。然后，根據其唾液酸化水平(非唾液酸化、單唾液酸化、雙唾液酸化、三唾液酸化)將糖型分組，并根據它們的相對峰高度確定它們的相對豐度％。樣品脫鹽用乙腈/水/醋酸(40/60/1，v/v)室溫透析((Microcon10裝置，Amicon，或等同裝置)給約35μgIFN-β-1a樣品(對照IFN-β-1a樣品和本體測試樣品)脫鹽(最終濃度為每毫升約150μgIFN-β-1a)ES-MS分析在MicromassPlatformLCZ單一四極質譜儀(或等同儀器)中進行陽離子ES-MS分析，用一套灌注泵使脫鹽的樣品直接流入電噴射源，流速約6-10μl/min。用m/z600-2400Da范圍的肌紅蛋白校準該質譜儀，用以下設定運行質譜儀毛細管電壓2.5-4.0KV錐電壓36V電噴源溫度70-100℃以約10秒/掃描的典型掃描速度，掃描600Da-2400Da(肌紅蛋白)和1100-2400Da(IFN-β-1a)獲得質譜結果。多電荷離子的質譜處理和去卷積用MassLynx軟件(或等同軟件)完成。ES-MS結果的解釋代表性去卷積的ES-MS譜顯示MS峰(A-F)代表不同糖型，可根據其唾液酸化程度將這些糖型分為4個主要的糖型組，見下表34所示。表31在IFNβ1a的ES-MS譜中觀察到的糖型*2A＝雙觸(Biantennary)復合型低聚糖；3A＝三觸(Triantennary)復合型低聚糖；4A＝四觸(Tetrantennary)復合型低聚糖；0S＝非唾液酸化；2S＝雙唾液酸化，3S＝三唾液酸化，1F＝巖藻糖基化的(Fucosylated)。如下進行4種主要糖型每種的半定量評估·非唾液酸化糖型百分比F峰高度/總峰高度×100·單唾液酸化糖型百分比B峰高度/總峰高度×100·雙唾液酸化糖型百分比(A+C)峰高度/總峰高度×100·三唾液酸化糖型百分比(D+E)峰度/總峰高度×100總峰高度為A-F所有峰高之和。請注意對應于缺失末端甲硫氨酸的N-末端截短的(2-166aa)2A2S1FIFN-β-1a的約22244Da處未標記的MS峰(圖SPA-1)，在IFN-β-1a雙唾液酸化糖型百分比計算中沒有考慮，通過獨立的本體純度釋放試驗(N-末端截短，N-1NMT6％)來控制這種雜質的水平。說明質譜與預期的IFN-β-1a分布圖(峰高百分比)相一致非唾液酸化糖型不多于5％單唾液酸化糖型6-30％雙唾液酸化糖型56-81％三唾液酸化糖型8-16％h.等電聚焦-IEF用等電聚焦分離IFN-β-1a的同工型，考馬斯亮藍染色觀察。然后將同工型的pl值與PRB的pl值作比較。用密度法(densitometry)測定糖型的面積和pl值。步驟樣品制備將IFN-β-1a樣品用微量離心裝置濃縮至0.7-1.0mg/ml。凝膠制備和等電聚焦制備5％IEF丙烯酰胺凝膠，澆鑄后洗滌除去所有未聚合的丙烯酰胺。然后用兩性電解質(最終2％，pH3-10)、10mM谷氨酸、10mM賴氨酸和3％甘油重建，置入水平電泳裝置中冷卻至15℃。在存在CO2捕獲劑(0.1MNaOH)的氮氣流下，以1W功率將凝膠預先聚焦60分鐘。將約3.5μg本體IFN-β-1a、6μg細胞色素C和合適的pI標準液逐滴(5μl)滴加到凝膠表面。10℃，8000V-小時聚焦IEF凝膠。用20％(w/v)TCA固定凝膠30-35分鐘，然后用Neuhoff等人所述的膠凝程序以考馬斯亮藍染色(Neuhoff，V.，Arold，N.，Taube，D.，Ehrhardt，W.，采用考馬斯亮藍G-250和R-250改進聚丙烯酰凝膠蛋白質的染色，包括等電聚焦產生具有清晰背景的凝膠，納克級靈敏度(ImprovedstainingofproteinsinpolyacrylamidegelsincludingisoelectricfocusinggelswithclearbackgroundatnanogramsensitivityusingCoomassieBrilliantBlueG-250andR-250)，Electrophoresis，19889255-262)。用自動化密度計(ComputingDensitometer，MolecularDynamics，USA，配備ImageQuant3.3程序和其它整合/計算結果所需要的專門化軟件；或等同裝備)定量測定IFN-β-1a同工型和pl值。說明測試樣品獲得的電泳圖與參比標準品(referencehousestandard)獲得的類似1.所得到的電泳圖由3組主要條帶組成，共含有5-10條電泳帶(不包括進樣點處的條帶)，與用參比標準品得到的帶型一致。2.用密度法測定的5條主要條帶，應屬于表32所示的組中。表32-等電聚焦，同工型的說明參考文獻1.DerynkR.等，Nature1980；285，542-547。2.Familletti，P.C.，Rubinstein，S.，和Pestka，S.1981“一種干擾素的方便快速細胞病變作用抑制試驗”，MethodsinEnzymology，Vol.78(S.Pestka，編寫.)，AcademicPress，NewYork，387-394；3.MarkD.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(18)5662-5666(1984)。4.Pestka，S.(1986)“干擾素的標準品和通用縮寫”，MethodsinEnzymology(S.Pestka，編寫.)，AcademicPress，NewYork119，14-23。5.Rubinstein，S.，Familletti，P.C.，和Pestka，S.方便的干擾素試驗，J.Virol1981；37，755-758。6.ShepardH.M.等，Nature1981；294，563-565。權利要求1.一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質本體溶液的方法，所述方法包括如下步驟a)提供配制在緩沖溶液中的單體蛋白質本體，和b)在所述本體中加入輔料，所述輔料選自i)抑菌劑ii)表面活性劑iii)等滲劑iv)氨基酸v)抗氧化劑vi)等滲劑和抗氧化劑vii)等滲劑、抗氧化劑和氨基酸viii)氨基酸和抗氧化劑ix)氨基酸、抗氧化劑和表面活性劑x)抑菌劑和抗氧化劑，和xi)抑菌劑、抗氧化劑和表面活性劑。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述單體蛋白質為干擾素。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述干擾素為IFN-β。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述IFN-β是重組人IFN-β。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質相對于凝聚具有穩(wěn)定性。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質定相對于寡聚化具有穩(wěn)定性。7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑為苯甲醇。8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑是Tween20。9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述等滲劑為甘露醇。10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為賴氨酸或精氨酸。11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗氧化劑為甲硫氨酸。12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述等滲劑為甘露醇、抗氧化劑為甲硫氨酸。13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述等滲劑為甘露醇、抗氧化劑為甲硫氨酸、氨基酸為賴氨酸。14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為賴氨酸、抗氧化劑為甲硫氨酸。15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為賴氨酸、抗氧化劑為甲硫氨酸、表面活性劑為Tween20。16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑為苯甲醇、抗氧化劑為甲硫氨酸。17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑為苯甲醇、抗氧化劑為甲硫氨酸、表面活性劑為Tween20。18.如權利要求1所述的方法，該方法還包括在27℃-31℃溫度范圍內培育所述本體蛋白質的步驟。19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述溫度為29℃。20.如權利要求18或19所述的方法，其特征在于，在權利要求1預配制步驟之前或之后進行所述培育。21.如權利要求18、19或20任何一項所述的方法，其特征在于，所述培育過程至少進行3個小時。22.如權利要求18、19或20任何一項所述的方法，其特征在于，所述培育過程進行6-40個小時。23.如權利要求18、19或20任何一項所述的方法，其特征在于，所述培育過程進行15-30個小時。24.如權利要求18、19或20任何一項所述的方法，其特征在于，所述培育過程進行10、16、18.5或24小時。25.如權利要求18、19或20任何一項所述的方法，其特征在于，所述培育過程進行24小時。26.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述IFN的pH值保持在3.0-6.0范圍內。27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述pH值為4.7。28.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述IFN的濃度約為10μg/ml-2000μg/ml。29.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述IFN的濃度約為500μg/ml或約810μg/ml。30.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的濃度約為5mM-500mM。31.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的濃度約為10mM或約50mM。32.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述等滲劑的濃度約為0.5mg/ml-500mg/ml。33.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述等滲劑的濃度約為55mg/ml或約150mM、或約300mM、或約600mM。34.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述Tween20的濃度約為0.01mg/ml-10mg/ml。35.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述Tween20的濃度約0.5mg/ml。36.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述抗氧化劑的濃度約為0.01mg/ml-5.0mg/ml。37.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述抗氧化劑的濃度約為0.12mg/ml或約0.24mg/ml。38.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述氨基酸的濃度約為20mg/ml-200mg/ml。39.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述賴氨酸的濃度約為27mg/ml，或約55mg/ml、或約82mg/ml、或約164mg/ml。40.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述精氨酸的濃度約為32mg/ml或約63mg/ml。41.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑的濃度約為0.01mg/ml-200mg/ml。42.如以上權利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑的濃度約為5mg/ml或約10mg/ml。43.通過以上權利要求任何一項所述的方法獲得的預配制的本體蛋白質。44.一種提高和/或保持單體蛋白質穩(wěn)定性的方法，其特征在于，該方法包括權利要求1-42任何一項所述的蛋白質本體預配制方法。全文摘要本發(fā)明描述了一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質本體溶液的方法，該方法包括提供配制在緩沖液中的單體蛋白質本體和在該本體中加入輔料，所述輔料選自抑菌劑、表面活性劑、等滲劑、氨基酸、抗氧化劑及其組合。該單體蛋白質優(yōu)選是IFN－β。文檔編號A61K47/00GK1993138SQ200580025660公開日2007年7月4日申請日期2005年5月27日優(yōu)先權日2004年6月1日發(fā)明者A·賈比爾申請人:阿雷斯貿易股份有限公司