專利名稱：：治療多囊病的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多囊疾病領(lǐng)域及涉及該疾病的診斷和治療。
背景技術(shù)：
：常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)是最常見的遺傳性腎病，發(fā)病率為1:1000個(gè)體，其特征表現(xiàn)為在所有腎小管中的病灶囊腫形成(Friedman,J.CysticDiseasesoftheKidney,InPRINCIPLESANDPRACTICEofMEDICALGENETICS(A.EmeryandD.Rimoin，Eds.)pp.1002-1010,ChurchillLivingston,Edinburgh,U.K.(1983);Striker&Striker(1986)Am丄Nephrol.6:161-164.腎外癥狀包括肝和胰腺囊腫，及心血管并發(fā)癥。Gabow&Gr肌tham(1997)PolycysticKidneyDisease,inDISEASESOFTHEKIDNEY(R.Schrier&C.Gottschalk，Eds.)，PP.521-560,LittleBrown,Boston;Welling&Grantham(1996)CysticDiseasesofthekidney,inRENALPATHOLOGY(C.Tisch&B.Brenner,Eds.)pp:1828-1863,Lippincott，Philadelphia。目前為止，僅PKD1和PKD2被認(rèn)為是與這些細(xì)胞異常有關(guān)的分子。'據(jù)報(bào)道，PKD1和PKD2分別占導(dǎo)致這些疾病的原因的85%和15%。Burn,etal.(1995)Hum.Mol.Genet.4:575-582。盡管在對(duì)ADPKD在遺傳性和病理生理方面的了解已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，但是對(duì)于疾病形成基因引發(fā)囊腫形成的突變?nèi)绾芜M(jìn)行和其它分子在囊腫表型中起到什么樣的重要作用仍然是不清楚的。因此，需要表征參與囊腫表型的生物化學(xué)途徑，并能找出另外的治療靶點(diǎn)。本發(fā)明可以滿足這樣的需要，并能提供相關(guān)改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)修飾下述表2到6中所列的至少一個(gè)基因的生物活性來(lái)診斷和治療腎囊腫病的組合物和方法。這里使用的術(shù)語(yǔ)"腎囊腫病"包括(但不限于)大量疾病，包括多囊腎病、vonHippel-Lindau、結(jié)節(jié)性硬化(tuberosclerosis)、腎消耗病、常染色體顯性遺傳多囊腎病(ADPKD)、常染色體隱性遺傳多囊腎病(ARPKD)和獲得性腎囊腫(ACKD)。僅作為舉例說(shuō)明，組織生長(zhǎng)因子a(TGF-a)基因或其表達(dá)產(chǎn)物為下述表2到6中所列基因中的一個(gè)例子。因此，盡管下面要進(jìn)行的討論和實(shí)施例大多數(shù)是涉及TGF-a基因和其生物等同物，但本發(fā)明并不限于此。該申請(qǐng)涉及的發(fā)明包括表2到6中所列的任一個(gè)基因，將它們作為治療和藥物干預(yù)的靶點(diǎn)；TGF-a僅是這些耙點(diǎn)中的一個(gè)。因此，應(yīng)該理解的是，盡管沒(méi)有詳細(xì)說(shuō)明，表2到6中所列的任何一個(gè)基因都可代替本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"TGF-a，'。一方面，本發(fā)明提供了一種修飾表2到6中所列的至少一個(gè)基因的生物活性的方法，通過(guò)將有效量的修飾劑和分子與需要治療的細(xì)胞或組織接觸。該方法中使用的合適的修飾劑包括但不限于小分子、核酶(ribozyme)、反義寡核苷酸、雙鏈RNA、雙鏈干擾RNA(SiRNA)、三鏈RNA、RNA適配物，和結(jié)合到基因產(chǎn)物上并抑制其活性的抗體分子的至少一部分。所述這樣抗體部分的例子包括但不限于完整的抗體分子、單鏈可變區(qū)(ScFv)、單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。所述抗體可以在任何合適的體內(nèi)或體外系統(tǒng)中產(chǎn)生，如猿、小鼠、大鼠或人。合適的抗TGF-a抗體可從Sigma(E3138)、Calbiochem(Ab畫2)、OncogeneScience(GF10或Clone213-9.4)和PeninsulaLaboratories(IHC8040)商業(yè)獲得。所述抗體可任選地結(jié)合到細(xì)胞毒素部分、治療部分、可檢測(cè)部分或抗囊腫制劑上。一方面，所述制劑或分子先被分離，然后再被傳遞。本發(fā)明還提供了治療或改善異常囊機(jī)能障礙和與組織中囊形成相關(guān)的疾病的組合物和方法。所述方法和組合物通過(guò)抑制如TGF-.a基因表達(dá)、TGF-d受體基因表達(dá)或其基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性來(lái)治療和改善組織中病理性膽囊的形成。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，本發(fā)明還提供了治療、抑制或改善與常染色體顯性遺傳多囊腎病(ADPKD)相關(guān)的癥狀的方法。該方法需要向需要治療的病人給藥有效量的抑制劑或分子，如抗TGF-ct抗體，以抑制TGF-a基因、其受體或其表達(dá)產(chǎn)物的多囊生物學(xué)活性。一方面，所述藥物或分子先被分離，然后再被傳遞。另一方面，在由于基因低表達(dá)而導(dǎo)致疾病或癥狀發(fā)生的部位，向該部位給藥能增強(qiáng)表達(dá)的基因或其表達(dá)產(chǎn)物(多肽)。這種藥物是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，編碼肽或多肽本身的多聚核苷酸。本發(fā)明還提供了通過(guò)檢測(cè)基因表達(dá)水平或其表達(dá)產(chǎn)物來(lái)幫助診斷存在于組織中的囊異常的方法。該方法可用于幫助診斷ADPKD相關(guān)腎囊腫和其它器官中存在的囊性異常(這些癥狀通常在ADPKD中出現(xiàn))，所述器官包括肝、胰腺、脾和卵巢。此外，通過(guò)在異常囊腫形成之前檢測(cè)蛋白質(zhì)或多聚核苷酸的過(guò)表達(dá)或低表達(dá)，人們可預(yù)測(cè)患ADPKD的傾向，并及早診斷和/或治療。本發(fā)明進(jìn)一步提供的是實(shí)施所述診斷和預(yù)測(cè)方法的組合套裝(kit)。該組合套裝含有用于這些方法的組合物和使用說(shuō)明。本發(fā)明還提供了用于所述治療和診斷方法的組合物。一方面，該組合物含有包含抗體可變區(qū)的分子，所述抗體可變區(qū)特異性地結(jié)合到TGF-a蛋白質(zhì)(如，SEQIDNO:2)上或其細(xì)胞表面受體上。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是已知的TGF-a受體。Solari等人(2004)Ped.Surg.Int.20:243-247。SEQIDNO:3和4分別表明了EGFR的多聚核苷酸和多肽序列。在治療和診斷使用中，分子可為例如，完整的抗體分子、單鏈可變區(qū)(ScFv)、單克隆抗體、嵌合的或人源化抗體。抗體可在細(xì)胞培養(yǎng)物、在噬菌體中或在各種動(dòng)物中產(chǎn)生，所述動(dòng)物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴子、黑猩猩、猿，等等。所述分子可任選地結(jié)合到細(xì)胞毒素部分、治療部分、可檢測(cè)部分或抗囊腫制劑上。.在另一方面，本發(fā)明提供了抑制TGF-d基因或受體基因表達(dá)的核酸分子。這里所述的核酸包括但不限于核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA、iRNA、三鏈RNA、RNA適配物。一方面，所述核酸以分離的形式被傳遞。所述核酸可從動(dòng)物中分離出來(lái)，或者，可在任何合適的重組系統(tǒng)中經(jīng)重組性產(chǎn)生，所述重組系統(tǒng)為例如細(xì)菌、酵母菌、桿狀病毒(baculoviral)或哺乳動(dòng)物。另一方面，本發(fā)明提供了能提髙、支持、增強(qiáng)或增加基因表達(dá)或其轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物核酸分子。這里所述的核酸分子包括但不限于核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA、iRNA、三鏈RNA或RNA適配物。一方面，所述核酸以分離的被傳遞。所述核酸可從動(dòng)物中分離出來(lái)，或者，可在任何合適的重組系統(tǒng)中經(jīng)重組產(chǎn)生，所述重組系統(tǒng)為例如細(xì)菌、酵母菌、桿狀病毒或哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的又一方面是提供了一種鑒定參與TGF-ci相關(guān)囊腫形成的TGF-a結(jié)合配體的方法。將測(cè)試化合物或藥物，如抗體或抗體衍生物與在合適樣品中的TGF-ci蛋白或其片段在有利于與TGF-a結(jié)合的條件下接觸。如果發(fā)生配體結(jié)合，則將被檢測(cè)出。與蛋白結(jié)合的測(cè)試化合物或藥物被認(rèn)為是TGF-a囊腫調(diào)節(jié)中的配體。抑制TGF-cc與其受體結(jié)合的測(cè)試化合物或藥物被認(rèn)為是可參與TGF-a囊腫調(diào)節(jié)并可作為治療劑的候選者。一方面，所述治療和診斷藥用于與其它制劑聯(lián)合使用。這些制劑或分子與其它藥物或治療劑的共同給藥可收到出人意料的協(xié)同治療益處。在這個(gè)共同給藥方法中，所述制劑或分子通過(guò)減少劑量也用于減小已知療法和治療藥的有害副作用，及那些待發(fā)現(xiàn)的療法和治療藥的有害副作用。一方面，這種有效組合的使用是要提供這樣的治療組合該組合所需的每種成分的總劑量比單獨(dú)使用每個(gè)治療方法、化合物或藥物時(shí)所使用的劑量要低，從而減少有害副作用。因此，本發(fā)明也包括涉及本發(fā)明所述化合物與一種或多種其它活性制劑或方法共同給藥的方法。實(shí)際上，本發(fā)明的另一方面是提供通過(guò)共同給藥本發(fā)明化合物來(lái)提高其它療法和/或藥物組合物的療效的方法。在共同給藥方法中，制劑可以被同時(shí)給藥或先后給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述化合物在給藥其它活性制劑物、進(jìn)行其它一種或多種治療進(jìn)行給藥。藥物劑型和給藥模式可以是本發(fā)明所描述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些中的任何一個(gè)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是確定用來(lái)治療囊腫性損傷的候選藥物的方法，該方法是通過(guò)將表達(dá)TGF-ct基因或其受體配體基因的細(xì)胞與測(cè)試化合物或藥物接觸。如果某測(cè)試化合物減少TGF-a基因或編碼其受體配體的基因的表達(dá)，則該化合物就被認(rèn)為是用來(lái)治療囊腫異常的候選藥物。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)檢測(cè)和量化表達(dá)，如逋過(guò)將細(xì)胞或組織的mRNA與核酸探針雜交，所述核酸探針與TGF-a或受體配體mRNA是互補(bǔ)的。能減少表達(dá)的測(cè)試化合物或制劑被認(rèn)為是用來(lái)治療異常囊腫形成的候選藥物。發(fā)明人還提供了一種組合套裝用來(lái)測(cè)定病態(tài)細(xì)胞或病人是否適合于用本發(fā)明描述的一種或多種治療劑進(jìn)行治療。此外，還提供了能實(shí)施測(cè)試的組合套裝。這些藥盒含有本發(fā)明所述的至少一種組合物及使用說(shuō)明書。圖1是12組表明多克隆中和抗TGF-ct抗體在體外抑制囊腫形成的圖。表的簡(jiǎn)要說(shuō)明表1是篩選到的SAGE文庫(kù)的匯總。其總結(jié)了全部的測(cè)序標(biāo)記和單獨(dú)標(biāo)記。表2列出了在囊腫性肝臟(CL)中前20個(gè)上-和下-調(diào)基因。其中給出了這20個(gè)下-(頂部)或上調(diào)(底部)標(biāo)記(10個(gè)堿基長(zhǎng))及它們?cè)谡８闻K(NL)或囊腫性肝臟(CL)上皮細(xì)胞的文庫(kù)中的數(shù)量、Genebank注冊(cè)號(hào)、基因命名和HUGO分配。標(biāo)簽的第11個(gè)堿基的給出是為了當(dāng)10堿基的標(biāo)記具有數(shù)個(gè)Unigene相配物時(shí)來(lái)幫助區(qū)別這些基因。表3列出了在囊腫性腎臟(CK)中的前20個(gè)上-和下-調(diào)基因。這20個(gè)下-或上-調(diào)標(biāo)記及它們?cè)谡ＤI臟(NL)或囊腫性腎臟臟(CK)中的數(shù)量及其它的內(nèi)容，如表2中所列。表4列出了在肝臟和腎臟上皮細(xì)胞中的大于常見的5倍的(>5xcommon)上調(diào)基因。在CK和CL中上調(diào)的常見基因也在此給出，以及10個(gè)堿基標(biāo)記序列、第11個(gè)堿基、CL/NL和CK/NK比率、Genebank注冊(cè)號(hào)、基因描述和相應(yīng)的HUGO命名。表5A和5B列出了在囊腫疾病中過(guò)度表達(dá)基因的功能組。表5A列出了在CL中上調(diào)基因的功能組。表5B列出了在CK中上調(diào)基因的功能組。表6列出了在CL中過(guò)度表達(dá)的其余的基因。具體實(shí)施例方式在整個(gè)公開中，各種出版物、專利和公開的專利說(shuō)明書通過(guò)引用作為參考。這些出版物、專利和公開的專利說(shuō)明書所公開的內(nèi)容在此通過(guò)參考并入本發(fā)明中以便更充分地描述本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)狀態(tài)。敘除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將采用免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA中常用的技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域的技術(shù)范疇之內(nèi)。見，例如，Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis,MOLECULARCLONING:ALARBORATORYMANUAL,2ndedition(1989);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel，etal.eds.，(1987));theseriesMETHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M丄MacPherson，B.D.HamesandGR.Tayloreds.(1995》，HarlowandLane,eds,(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL,HarlowandLane,eds.(1999)USINGANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL和ANIMALCELLCULTURE(R丄Freshney,ed.(1987))。這里所使用的某些術(shù)語(yǔ)具有下述定義的含義。除非上下文中清楚地說(shuō)明，否則在說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用的單數(shù)形式的和特指形式的名詞包括其復(fù)數(shù)形式。例如，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"包括多個(gè)細(xì)胞，包括這些細(xì)胞的混合物。這里所使用的術(shù)語(yǔ)"包含"是指所述組合物和方法包括所敘述的成份，但是不排除還包括其它成份。當(dāng)使用"基本由...組成"來(lái)定義組合物和方法時(shí)，其是指排除對(duì)組合來(lái)說(shuō)非常明顯的其它成份。因此，基本由本發(fā)明定義的成分組成的組合物不排除來(lái)自分離和純化方法中的痕量污染物和藥學(xué)可接受的載體，如磷酸鹽緩沖的食鹽水、防腐劑，等等。"由...組成"是指排除其它成分和用以給藥本發(fā)明組合物的主要方法步驟中的痕量物質(zhì)。經(jīng)這些過(guò)渡術(shù)語(yǔ)中的每一個(gè)確定的具體實(shí)例在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所有數(shù)字形式的定義，如pH、溫度、時(shí)間、濃度和分子量，包括范圍都是近似值，以變量O.l(+)或(-)變化。盡管沒(méi)有總是明確說(shuō)明，但是應(yīng)當(dāng)理解的是所有的數(shù)字形式的定義都應(yīng)在其前面加上術(shù)語(yǔ)"約"。盡管沒(méi)有總是明確說(shuō)明，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明中公開的試劑僅僅是舉例說(shuō)明，其等同物是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語(yǔ)"多肽"以其最廣泛的含義加以使用，是指兩個(gè)或多個(gè)亞單元氨基酸化合物、氨基酸類似物或仿肽(peptidomimetics)。所述亞單元可以通過(guò)肽鍵連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述亞單元可以通過(guò)其它鍵連接，如酯、醚，等等。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"氨基酸"是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光學(xué)異構(gòu)體，和氨基酸類似物和仿肽。三個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽，如果肽鏈短則通常被稱為寡肽。如果肽鏈長(zhǎng)，則該肽通常被稱為多肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"分離"是指從組分、細(xì)胞或其它中分離出來(lái)，其中的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或它們的片段天然狀態(tài)時(shí)通常是結(jié)合在一起的。本發(fā)明的一方面，將分離的多聚核苷酸從3'和5'個(gè)相鄰核苷中分離出來(lái)，該多聚核苷酸與這些核苷在其固有或天然環(huán)境中通常是結(jié)合在一起的，所述環(huán)境為如在染色體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，非天然生成的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或它們的片段不需要進(jìn)行"分離"以區(qū)別于天然生成的對(duì)應(yīng)物。此外，"濃縮的"、"分離的"或"稀釋的"多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或它們的片段區(qū)別于其天然生成的相應(yīng)物，因?yàn)槊矿w積中的分子濃度或數(shù)目比其天然生成的對(duì)應(yīng)斷鄰縮的"大或比"分離的"小。在一級(jí)序列方面或例如其糖基化模式不同于其天然生成相應(yīng)物的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或它們的片段不需要以其分離形式存在，因?yàn)樗鼈冇捎谄湟患?jí)序列，或者其它特征如糖基化模式而不同于其天然生成的相應(yīng)物而能與后者區(qū)別開來(lái)。因此，非天然生成的多聚核苷酸作為單獨(dú)的不同于經(jīng)分離出的天然生成的多聚核苷酸的實(shí)施方案給出。在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作為單獨(dú)的實(shí)施方案給出，不同于從真核細(xì)胞中分離出的天然生成的蛋白質(zhì)，在真核細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)天然產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)"多聚核苷酸"和"寡聚核苷酸"可相互交換使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或它們的類似物。多聚核苷酸可以有任何三維結(jié)構(gòu)，可以完成已知的或未知的任何功能。下述為多聚核苷酸的非限定性例子基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多聚核苷酸、支鏈多聚核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多聚核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果要對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，該修飾可以在聚合物聚集之前或之后進(jìn)行。核苷酸的序列可經(jīng)非核苷酸成分?jǐn)嚅_。多聚核苷酸可以在聚合之后進(jìn)一步經(jīng)修飾，如通過(guò)與標(biāo)記組分結(jié)合而得到修飾。這個(gè)術(shù)語(yǔ)也指雙鏈和單鏈分子。除非特別提到或需要，本發(fā)明涉及多聚核苷酸的任何實(shí)施方案包括雙鏈形式和兩個(gè)互補(bǔ)單鏈形式中的每一個(gè)，該互補(bǔ)單鏈形式已知或被預(yù)測(cè)為能形成(makeup)雙鏈形式。多聚核苷酸由四個(gè)核苷酸堿基的特定序列組成腺嘌呤(A);胞嘧啶(C);鳥嘌呤(G);胸腺嘧啶(T);當(dāng)多聚核苷酸為RNA時(shí)，對(duì)應(yīng)鳥嘌呤的為尿嘧啶(u)。因此，術(shù)語(yǔ)"多聚核苷酸序列"為多聚核苷酸分子的字母表示形式。這個(gè)字母表示形式可輸入到具有中心處理單元的電腦數(shù)據(jù)庫(kù)中，并用于生物信息應(yīng)用如功能基因?qū)W和同源檢索。"基因"是指含有至少一個(gè)開放閱讀框的多聚核苷酸，其能夠在經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后編碼特定多肽或蛋白質(zhì)。這里所述的多聚核苷酸的任何一個(gè)可以用來(lái)識(shí)別與之相關(guān)的基因的更大片段或全長(zhǎng)編碼序列。分離更大片段序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其中一些在本發(fā)明中也進(jìn)行了描述。"基因產(chǎn)物"或"表達(dá)產(chǎn)物"是指當(dāng)基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后產(chǎn)生的氨基酸(如，肽或多肽)。"在轉(zhuǎn)錄的控制下，，是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語(yǔ)，表明多聚核苷酸序列(通常為DNA序列)的轉(zhuǎn)錄取決于其與能有助于引發(fā)起始(或啟動(dòng))轉(zhuǎn)錄的元件進(jìn)行可操作連接。"可操作連接"是指并列，其中所述要素位于能使它們起作用的位置。"基因傳遞載體"定義為能攜帶插入多聚核苷酸進(jìn)入宿主細(xì)胞的任何分子?；騻鬟f載體的例子是脂質(zhì)體、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽、多糖；脂多糖；人工病毒囊膜；金屬粒子；和細(xì)菌，或病毒，如桿狀病毒、腺病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體、粘粒、質(zhì)粒、真菌載體和其它常用于本領(lǐng)域的重組載體，它們被公開用于在各種真核和原核宿主中表達(dá)，并可用于基因治療和簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)表達(dá)。這里使用的"基因傳遞"、"基因轉(zhuǎn)移"等術(shù)語(yǔ)是指向宿主細(xì)胞中引入外源性多聚核苷酸(有時(shí)也稱作"轉(zhuǎn)基因")，不管引入的方法是什么。這些方法包括各種已知技術(shù)，如載體-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(通過(guò)，例如病毒感染/轉(zhuǎn)染，或各種其它基于蛋白或基于脂的基因轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體)和能促進(jìn)"裸"多聚核苷酸傳遞的技術(shù)(如電穿孔、"基因槍"傳遞和各種其它用于引入多聚核苷酸的技術(shù))。引入的多聚核苷酸可以穩(wěn)定地或短暫地停留在宿主細(xì)胞中。穩(wěn)定停留往往需要引入的多聚核苷酸含有與宿主細(xì)胞相容的復(fù)制原點(diǎn)或者結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞的復(fù)制子中，如染色體外復(fù)制子(如，質(zhì)粒)或核的或線粒體的染色體。許多載體已知可以介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，正如本領(lǐng)域所熟知的那樣，并在本發(fā)明中有所描述。"病毒載體"定義為在體內(nèi)、間接體內(nèi)(exvivo)或體外重組生產(chǎn)的病毒或病毒顆粒，其含有要傳遞到宿主細(xì)胞中的多聚核苷酸。病毒載體的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、(X-病毒載體等。(x-病毒載體，如塞姆利基森林病毒基載體和辛德畢斯病毒基載體已經(jīng)被開發(fā)出來(lái)用于基因治療和免疫治療。見，SchlesingerandDubensky，Curr.Opin.Biotechnol.(1999)5:434-439和Ying，etal.，Nat.Med.(1999)5(7):823-827。在基因轉(zhuǎn)移由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的情況下，載體構(gòu)件體(vectorconstruct)是指含有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組或該基因組一部分的多聚核苷酸，以及治療基因。這里使用的"逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移"或"逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)"含義相同，是指憑借進(jìn)入細(xì)胞的病毒將其基因組整合入宿主細(xì)胞基因組中而將基因或核酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)移進(jìn)入宿主細(xì)胞的方法。所述病毒可通過(guò)正常的感染機(jī)制進(jìn)入宿主細(xì)胞，或經(jīng)過(guò)修飾使其能與不同的宿主細(xì)胞表面受體或配體結(jié)合而進(jìn)入宿主細(xì)胞。這里使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是指能通過(guò)病毒或病毒樣進(jìn)入機(jī)制將外源核酸弓I入到細(xì)胞中的病毒顆粒。逆轉(zhuǎn)錄病毒以RNA形式攜帶它們的基因信息；然而，一旦病毒感染了細(xì)胞，所述RNA就反轉(zhuǎn)錄成DNA形式，該DNA整合進(jìn)入被感染細(xì)胞的基因組DNA中。經(jīng)整合的DNA形式被稱為前病毒。在基因轉(zhuǎn)移由DNA病毒載體介導(dǎo)的情況下，如腺病毒(Ad)或腺相關(guān)病毒(AAV)，載體構(gòu)件體是指含有病毒基因組或該基因組一部分的多聚核苷酸，和轉(zhuǎn)基因多聚核苷酸。腺病毒(Ads)為病毒經(jīng)相對(duì)較好特征化的同源組，包括超過(guò)50個(gè)血清型。見，例如，國(guó)際PCT申請(qǐng)No.WO95/27071。Ads很容易生長(zhǎng)，不需要整合到宿主細(xì)胞基因組中。已經(jīng)構(gòu)建得到重組的Ad衍生的載體，特別是能減少野生型病毒重組和生成的可能性的那些載體。見，國(guó)際PCT申請(qǐng)Nos.WO95/00655和W095/11984。野生型AAV具有高度的感染性和特異地整合到宿主細(xì)胞基因組。見，Hermonat和Muzyczka,(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470和Lebkowski，etal.，(1988)，Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。含有啟動(dòng)子和克隆位點(diǎn)的載體是本領(lǐng)域已知的，其中在所述克隆位點(diǎn)多聚核苷酸可以有效連接。這樣的載體能夠體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA，并且可以提供者處商業(yè)上購(gòu)得，如Stratagen(LaJolla,CA)和PromegaBiotech(Madison,WI)。為了優(yōu)化表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄，可能需要除去、加入或改變克隆物5'和/或3'未翻譯的部分以除去額外的、可能不合適的替代翻譯啟動(dòng)密碼或其它可能在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平干擾或減少表達(dá)的序列。或者，共有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)可被直接插入到啟動(dòng)密碼的5'以提高表達(dá)?；騻鬟f載體也包括若干非病毒載體，包括DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體和靶向病毒蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體。也含有靶向抗體或其片段的脂質(zhì)體也可用在本發(fā)明的方法中。為了提高向細(xì)胞的傳遞，本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)可結(jié)合到抗體或其結(jié)合片段上，該抗體或其結(jié)合片段結(jié)合細(xì)胞表面抗原，如TCR、CD3或CD4上。當(dāng)用于多聚核苷酸操縱這一情況中，"探針"是指寡核苷酸，該寡核苷酸用作試劑，通過(guò)與靶點(diǎn)雜交來(lái)檢測(cè)存在在待測(cè)的樣品中的潛在的靶點(diǎn)。通常，探針包括標(biāo)記(label)或媒介，通過(guò)該媒介，標(biāo)記可以在雜交反應(yīng)前或雜交后進(jìn)行連接。合適的標(biāo)記包括但不限于放射性同位素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光的化合物、染料和蛋白質(zhì)，包括酶。"引物，，是短的、通常具有游離的3'-OH基團(tuán)的多聚核苷酸，其通過(guò)與靶點(diǎn)雜交而結(jié)合到存在在待測(cè)的樣品中潛在的靶點(diǎn)或"模板"上，然后促進(jìn)與耙點(diǎn)互補(bǔ)的多聚核苷酸的聚合。"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"("PCR")為一種反應(yīng)，其中復(fù)制品(replicatecopies)由靶點(diǎn)多聚核苷酸制備，通過(guò)使用"引物對(duì)"或"一套引物"，該"一套引物"由"上游"和"下游"引物組成，和聚合反應(yīng)催化劑，如DNA聚合酶，和典型的熱穩(wěn)定聚合酶。進(jìn)行PCR的方法是本領(lǐng)域已知的，公開在例如，"PCR:APRACTICALAPPROACH"(M.MacPhersonetal.，IRLPressatOxfordUniversityPress(1991))。所有生產(chǎn)多聚核苷酸復(fù)制品的方法，如PCR或基因克隆在本發(fā)明中統(tǒng)稱為"復(fù)制"。引物也可在雜交反應(yīng)中用作探針，所述雜交反應(yīng)如SouthernorNorthernblot分析(S咖brooketal.，上述的)。"數(shù)據(jù)庫(kù)"這一詞表示一組儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)代表序列的集合，該序列反過(guò)來(lái)代表生物相關(guān)材料的集合。術(shù)語(yǔ)"cDNAs"是指互補(bǔ)DNA，即存在在細(xì)胞或有機(jī)體中的利用酶如逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的mRNA分子。"cDNA庫(kù)"是所有存在在細(xì)胞或有機(jī)體中的mRNA的集合，所有mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變成cDNA分子，然后被插入到"載體"中(其它在加入外來(lái)DNA后能繼續(xù)復(fù)制的DNA分子)。用于文庫(kù)的載體的例子包括噬菌體(也稱作"噬菌體")、感染細(xì)菌的病毒，例如，X噬菌體。該文庫(kù)然后可針對(duì)待測(cè)的具體的cDNA(即mRNA)而被探針化。當(dāng)"差異表達(dá)"用于基因時(shí)，其是指從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或由基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的不同產(chǎn)物。與正常的或?qū)φ占?xì)胞的表達(dá)水平相比，差異表達(dá)的基因可以是被過(guò)表達(dá)的或低表達(dá)的。一方面，其是指比在對(duì)照樣品中探測(cè)到的表達(dá)水平高或低2.5倍的差異，或5倍差異，或10倍差異。術(shù)語(yǔ)"差異表達(dá)"也指細(xì)胞或組織中的核苷酸序列，其在對(duì)照細(xì)胞中是沉默的而表達(dá)的或在對(duì)照細(xì)胞中被表達(dá)的地方是沒(méi)有被表達(dá)的。如這里使用的，"固相載體"或"固體載體"是可相互替換的，該定義并不限于具體的載體類型。而許多是可購(gòu)得的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體。固相載體包括硅膠、樹脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化鋁膠。這里使用的"固體載體"也包括合成的存在抗原的基質(zhì)、細(xì)胞和脂質(zhì)體。合適的固體載體可以根據(jù)最終用途和對(duì)各種實(shí)驗(yàn)方案的適合性進(jìn)行選擇。例如，對(duì)于肽合成，固體載體可以指樹脂如聚苯乙烯(如，PAM-樹脂，從BachemInc.,PeninsulaLaboratories,etc獲得)，POLYHIPE⑧樹脂(從Aminotech，Canada獲得)、聚酰胺樹脂(從PeninsulaLaboratories獲得)、接枝了聚乙二醇的聚苯乙烯樹脂(TentaGel,RappPolymere,Tubingen,Germany)或聚二甲基丙烯酰胺樹脂(從Milligen/Biosearch，Galifornia獲得)。多聚核苷酸也可被連到固體載體上以用于高通量篩選分析。例如，國(guó)際PCT申請(qǐng)NoWO97/10365公開了高密度寡聚核苷酸芯片的構(gòu)建。也參見美國(guó)專利Nos.5，405，783、5,412,087和5,445,934。利用這個(gè)方法，在衍生的玻璃表面(也被稱作芯片陣列(chiparrays))上合成探針。將光保護(hù)的亞磷酸胺核苷偶合到玻璃表面，利用光解作用通過(guò)光刻掩膜選擇性地去保護(hù)，并與另一個(gè)經(jīng)保護(hù)的亞磷酸胺核苷反應(yīng)。該偶合/脫保護(hù)過(guò)程重復(fù)進(jìn)行直到完成得到所需的探針。本發(fā)明使用的"表達(dá)"是指一個(gè)過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程多聚核苷酸被轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或一個(gè)過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程被轉(zhuǎn)錄的mRNA接下來(lái)被翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)。如果所述多聚核苷酸衍生自基因組DNA，則表達(dá)可包括mRNA在真核細(xì)胞中的拼接。用于基因的"過(guò)表達(dá)"是指從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的過(guò)生產(chǎn)，或由基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過(guò)生產(chǎn)，比在對(duì)照樣品中探測(cè)到的表達(dá)水平要高2.5倍、或者高5倍，或者高10倍。"雜交"是指一個(gè)反應(yīng)，其中一種或多種多聚核苷酸反應(yīng)形成通過(guò)氫鍵穩(wěn)定的復(fù)合體，該氫鍵在核苷酸殘基堿基的之間形成。所述氫鍵可以通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)、Hoogstein結(jié)合產(chǎn)生，或采用任何其它序列特異性方式產(chǎn)生。所述復(fù)合體可以包括兩個(gè)鏈(形成雙鏈結(jié)構(gòu))，三個(gè)或更多個(gè)鏈(形成多鏈結(jié)構(gòu))，單一自雜交鏈，或它們的任意組合。雜交反應(yīng)可以是一個(gè)更大的方法的一個(gè)步驟，如PCR反應(yīng)的引發(fā)，或通過(guò)核酶進(jìn)行的多聚核苷酸的酶斷裂反應(yīng)。雜交反應(yīng)可以在具有不同"嚴(yán)謹(jǐn)性"的條件下進(jìn)行。通常，低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交反應(yīng)在約40'C在10XSSC中進(jìn)行，或在等價(jià)離子強(qiáng)度/溫度的溶液中進(jìn)行。適中的嚴(yán)謹(jǐn)性雜交典型的是在約5(TC,在6XSSC中進(jìn)行，高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交反應(yīng)通常是在約60°C,在1XSSC中反應(yīng)。當(dāng)雜交以反式平行構(gòu)型在兩個(gè)單鏈聚核苷酸之間發(fā)生時(shí)，該反應(yīng)被稱為"退火"，這些多聚核苷酸被稱為"互補(bǔ)體"。如果雜交能在第一多聚核苷酸鏈中的一個(gè)與第二之間發(fā)生時(shí)，則雙鏈多聚核苷酸可以是另一個(gè)多聚核苷酸的"互補(bǔ)體，，或"同源體"。"互補(bǔ)度"或"同源性"(一個(gè)多聚核苷酸與另一個(gè)核苷酸互補(bǔ)的程度)可以根據(jù)堿基在相對(duì)鏈(被認(rèn)為根據(jù)普遍接受的堿基配對(duì)原則會(huì)相互之間形成氫鍵)中的比例進(jìn)行多聚核苷酸或多聚核苷酸區(qū)(或多肽或多肽區(qū))與另一個(gè)序列具有一定的"序列相似性"百分比是指經(jīng)比對(duì)后，在比較這兩個(gè)序列時(shí)，相同的堿基(或氨基酸)的百分比，例如80%、85%、卯％、95%。這種序列比對(duì)和同源百分比或序列同一性可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的軟件程序確定，例如，在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(RM.Ausubeletal.，eds.,1987)增刊30，7.7.18節(jié)，表7.7.1中描述的那些。優(yōu)選地，缺省參數(shù)可以用于序列比對(duì)。優(yōu)選的序列比對(duì)程序?yàn)槭褂萌笔?shù)的BLAST。特別地，優(yōu)選程序?yàn)锽LASTN和BLASTP，使用下列缺省參數(shù)遺傳密碼(geneticcode)=標(biāo)準(zhǔn)(standard);過(guò)濾器(filter)二無(wú)(none);鏈(strand)-兩個(gè)都有(both);截止值(cutoff)=60;期望值(expect)=10;序列號(hào)(Matrix)=BLOSUM62;定義(Descriptions)=50個(gè)序列；sortby(按…序列)二(高分值)HIGHSCORE;數(shù)據(jù)庫(kù)(Databases)=不冗余(non-redundant)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。這些程序的詳細(xì)內(nèi)容可以在下述網(wǎng)址內(nèi)找到http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。"抑制"細(xì)胞生長(zhǎng)是指下列狀態(tài)的任何一種或所有情況緩慢、推遲和阻止腫瘤生長(zhǎng)，和腫瘤萎縮。細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行評(píng)估，包括但不限于測(cè)量囊腫大小、利用311-胸腺嘧啶脫氧苷整合實(shí)驗(yàn)法判定細(xì)胞是否增生，或細(xì)胞計(jì)數(shù)。"組合物"是指活性劑與另一個(gè)化合物或組合物(惰性的(例如，可檢測(cè)的試劑或標(biāo)記)或活性的，如佐劑)的組合。"藥物組合物"包括活性劑和載體(惰性或活性的)的組合，使該組合物適用于體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)診斷或治療用途。這里所使用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)可接受的載體"包括任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)可接受的載體，如磷酸鹽緩沖的食鹽溶液、水，和乳液，如油/水或水/油乳液，和各種類型的潤(rùn)濕劑。所述組合物還可以包括穩(wěn)定劑和防腐劑。載體、穩(wěn)定劑和佐劑的例子參見Martin,REMINGTON'SPHARM.SCI"15thEd.(MackPubl.Co"Easton(1975))。"有效量"是足以引起有益的或所希望的結(jié)果的量。有效量可以分一次或多次給藥，或一次或多次施用，或一個(gè)或多個(gè)劑量給藥。"受試者""個(gè)體"或"病人"在本發(fā)明中可以互換使用，是指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人類。晡乳動(dòng)物包括，但不限于，小鼠、大鼠、猿、人、農(nóng)畜、工作動(dòng)物(sportanimals)和寵物。"對(duì)照"是指實(shí)驗(yàn)中對(duì)比用的受試者或樣品。對(duì)照可以是"陽(yáng)性的"或"陰性的"。例如，如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是確定基因改變的表達(dá)水平與癌特定類型癥的關(guān)系，則通常優(yōu)選使用陽(yáng)性對(duì)照(受試者或受試者的樣品攜帶這樣的改變和表現(xiàn)出那種疾病的癥狀特征)，和陰性對(duì)照(受試者或來(lái)自受試者的樣品缺少經(jīng)改變的表達(dá)和那種疾病的臨床癥狀)。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-a)通過(guò)他們共同的受體-表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的活性在多囊腎疾病(PKD)中起著重要的病理作用。EGF和TGF-a是結(jié)構(gòu)相關(guān)的酪氨酸激酶受體，即ErbB受體家族的EGF相關(guān)肽配體大家族中最有名的兩個(gè)。KkpperL等人(2000)Adv.CancerRes.77:25-79。EGFR，也稱為ErbB-1，是EGF和TGF-a的受體。EGF類肽結(jié)合至ErbB受體的細(xì)胞外部分，導(dǎo)致受體的二聚作用，酪氨酸激酶被激活，和自體磷酸化。大部分包括磷酸酪氨酸結(jié)合基序的胞漿蛋白，，參與激活ErbB受體。特定生長(zhǎng)因子觸發(fā)的反應(yīng)包括各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和特定轉(zhuǎn)錄因子的激活，其導(dǎo)致了依賴于細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞增殖或分化。MoghalNNeelB(1998)Mol.CellBiol.18:6666-6678。盡管EGFmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)在cpk和pcy小鼠以及Han:SPRD大鼠的腎中顯著下調(diào)(GattoneVH(19卯)Dev.Biol.138:225-230;CowleyBJ,RuppJ(1995)J.Am.Soc.Nephrol.6:1679-1681)，來(lái)自ADPKD，ARPKD和小鼠以及大鼠PKD模型的腎囊腫液體中含有促有絲分裂濃度的多種EGF或EGF類肽，這些EGF肽以可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的量被分泌到囊腫腔中。WilsonP等人(1993)Eur.J.CellBiol.61:131國(guó)138;LeeDC等人(1998)J.Urol.159:291-296。TGF-ctmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)在ADPKD腎中增加。LeeDC等人(1998)J.Urol.159:291-296。過(guò)度表達(dá)TGF-ct的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生腎囊腫疾病，作為轉(zhuǎn)基因的TGF-a的腎表達(dá)加速了pCy小鼠的PKD的進(jìn)展(LowdenD等人(1994)J.Lab.Clin.Med.124:386-394;GattoneVH等人(1996)J.Lab.Clin.Med.127:214-222)。EGF和TGF-a是各種體外系統(tǒng)中促囊腫生成(AvnerE，SweeneyW(1990)Pediatr.Nephrol.4:372-377;NeufeldT.等人(1992)KidneyInt.41:1222-1236)。在人ADPKD和ARPKD以及PKD的cpk、bpk、orpk小鼠模型中，EGFR被過(guò)度表達(dá)并錯(cuò)誤定位到囊腫上皮細(xì)胞的頂(腔)表面(DuJ,WilsonP(1995)Am.J.Physiol.269:C487國(guó)C495;SweeneyW等人(2000)KidneyInt.57:33-40)。EGFR在囊腫列上皮的頂(腔)表面的過(guò)度表達(dá)和異常定位產(chǎn)生了持續(xù)的囊腫中的增生自分泌-旁分泌剌激循環(huán)。DuJ.WilsonPD(1995)supra.。頂部表達(dá)的EGFR表現(xiàn)了對(duì)EGF的高親和的結(jié)合性，對(duì)EGF反應(yīng)的自體磷酸化和當(dāng)被適當(dāng)?shù)氖荏w剌激時(shí)傳送促有絲分裂信號(hào)。治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了治療和/或改善與存在在組織中的囊腫異常有關(guān)的癥狀的方法。一方面，所述囊腫為常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)的癥狀。該疾病的主要表現(xiàn)為腎小管漸進(jìn)式囊腫增大，并最終導(dǎo)致感染的病人中的一半腎衰竭。美國(guó)專利No.5，891，628和Gabow，P.A.，Am.J.KidneyDis.(1990)16:403-413。ADPKD相關(guān)的腎囊腫可能會(huì)增大，以至含有幾升液體，并且腎臟由于漸進(jìn)式增大而導(dǎo)致疼痛。其它異常如血尿、腎和泌尿器官感染、腎癌、鹽水失橫和通常由腎缺陷導(dǎo)致的高血壓。在其它器官中的囊腫異常也經(jīng)常在ADPKD中發(fā)現(xiàn)，所述其它器官包括肝、胰腺、脾臟和卵巢。嚴(yán)重的肝腫大有時(shí)會(huì)導(dǎo)致門靜脈高血壓和肝衰竭。在ADPKD中也觀察到賁門瓣異常和蛛網(wǎng)膜下和其它顱內(nèi)出血頻率增加。美國(guó)專利No.5，891，628。已經(jīng)觀察到的生化異常涉及蛋白質(zhì)分選、細(xì)胞膜標(biāo)識(shí)在腎上皮細(xì)胞中的分配、細(xì)胞外基質(zhì)、離子傳遞、上皮細(xì)胞翻轉(zhuǎn)，和上皮細(xì)胞增生。這些發(fā)現(xiàn)中記載最詳細(xì)的是管狀上皮細(xì)胞組成異常，和細(xì)胞膜蛋白正常極化分布的反轉(zhuǎn)，如Na+ZK+ATPase。Carone,F.A.etal.，Lab.Inv.(l994)70:437-448。因此，本發(fā)明提供了抑制、減少或改善上述與ADPKD相關(guān)的生化的、結(jié)構(gòu)的和生理異常的方法。該方法需要向需要治療的細(xì)胞或組織傳遞有效量的試劑或分子，該試劑或分子能在感染的組織中修飾(抑制或增加)表2到6所列基因的表達(dá)或其表達(dá)產(chǎn)物。一方面，申請(qǐng)人出人意料地發(fā)現(xiàn)，TGF-cl基因在組織中的過(guò)表達(dá)與囊腫異常有關(guān)，并且該基因或其表達(dá)產(chǎn)物的向下調(diào)節(jié)能治療或改善與囊腫異常有關(guān)的癥狀。抑制TGF-cl與細(xì)胞表面受體的結(jié)合也可治療或改善與囊腫異常有關(guān)的癥狀。在感染的細(xì)胞或組織中，TGF-ct的受體是EGF受體，其在ADPKD和ARPKD囊腫的頂膜中過(guò)渡表達(dá)和異常定位。在ADPKD的早期，腎囊腫與腎單位連接，從其伸展，從而，抗體可以很容易接近這些囊腫?？墒?，當(dāng)囊腫增大至2-3mm時(shí)，其中大多數(shù)從腎單元分離。在ADPKD中，27%的囊腫保持其與腎單元的連接，而大約73。％的囊腫分離。GranthamJJ，(1996)AmJKidneyDis.28:788。目標(biāo)為中和囊腫內(nèi)TGF-a的抗體治療方法能治療從腎單元分離的囊腫并不是顯而易見的。真的沒(méi)想到抑制TGF-a信號(hào)能夠抑制囊腫形成及其相關(guān)疾病。據(jù)報(bào)道，人TGF-a的cDNA含有起始點(diǎn)位于位置1的4119個(gè)核苷酸的開放閱讀框。CDNA編碼160個(gè)氨基酸的肽。mRNA序列也可以在GenBankNo:NM—003236中獲取，其在SEQIDNO:1中表明。從這個(gè)序列中表達(dá)的160個(gè)氨基酸的多肽可在GenBankNo:NP_003227中獲取，其在SEQIDNO:2中表明。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"治療"或類似詞語(yǔ)是指獲得所希望的藥理和/或生理效果。該效果就完全或部分預(yù)防疾病或體癥或其癥狀方面是預(yù)防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由于該疾病導(dǎo)致的副反應(yīng)時(shí)是治療性的。"治療"也包括所有對(duì)哺乳動(dòng)物疾病的治療，包括(a)防止疾病在可能感染該疾病(但是還沒(méi)有被診斷感染了該疾病)的受試者體內(nèi)發(fā)生；(b)抑制疾病，即阻止疾病的發(fā)展；或(c)減輕或改善疾病，如使疾病(如ADPKD)消退。這里使用的進(jìn)行"治療"包括與病理相關(guān)的癥狀的全身性改善和/或癥狀發(fā)作的推遲。"治療"的臨床和亞臨床證據(jù)會(huì)因病理、個(gè)體和治療的變化而改變。表2到6中所列基因的過(guò)度表達(dá)或在某些情況下的低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞和/或組織的病理狀態(tài)，然后該細(xì)胞和/或組織就可以用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。這些細(xì)胞或組織可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行識(shí)別，這些方法可以對(duì)基因的不同表達(dá)或其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別。實(shí)例性方法在本文給出。治療劑可以給藥到合適的細(xì)胞、組織或個(gè)體，或此外給藥到可能會(huì)感染或具有囊異常患病危險(xiǎn)的個(gè)體。當(dāng)將治療劑給藥到受試者如小鼠、大鼠或病人時(shí)，可以將該治療劑加到藥學(xué)可接受的載體中，并全身性地或局部地給藥到受試者。為了判定病人能收到有益治療，需要檢驗(yàn)?zāi)夷[得到了消退。治療量可以憑經(jīng)驗(yàn)判斷，并根據(jù)進(jìn)行治療的病癥、進(jìn)行治療的受試者和治療的效果和毒性而變化。體內(nèi)給藥可以在整個(gè)治療過(guò)程中連續(xù)或間歇以一個(gè)劑量起作用。確定最有效的給藥途徑和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并根據(jù)用于治療的組合物、治療目的、進(jìn)行治療的靶細(xì)胞和進(jìn)行治療的受試者而變化。根據(jù)主治醫(yī)師選擇的劑量和形式也可進(jìn)行單一或多次給藥。進(jìn)行治療劑給藥的合適的劑量制劑和方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的藥劑和組合物通過(guò)按照常規(guī)步驟給藥(如作為在藥物組合物中的活性成分)而用于制備用于治療人和其它動(dòng)物的藥物。本發(fā)明的藥劑可以通過(guò)任何合適的途徑進(jìn)行給藥治療，所述途徑包括經(jīng)鼻、局部、(包括透皮、氣霧劑、口腔和舌下)，parental(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))和經(jīng)肺?？梢岳斫獾氖?，優(yōu)選的途徑將隨接受者的身體狀況和年齡，及進(jìn)行治療的疾病而變化。用于本發(fā)明方法的多聚核苷酸可以利用PCR復(fù)制。PCR技術(shù)是美國(guó)專利Nos,4，683,195;4,800,159;4,754,065和4,683,202的發(fā)明主題，并在PCR中描述THEPOLYMERASECHAINREACTION(Mullisetal.eds，BirkhauserPress,Boston(1994))，及其中引用的參考文獻(xiàn)中?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用本發(fā)明提供的序列和購(gòu)得的DNA合成儀來(lái)復(fù)制DNA。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了通過(guò)給出多聚核苷酸線性序列、合適的引物分子、化學(xué)制品(如酶)和對(duì)它們復(fù)制的說(shuō)明，和化學(xué)復(fù)制或?qū)⒃摵塑账嵋哉_的方向連接來(lái)獲得本發(fā)明多聚核苷酸的方法。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，這些多聚核苷酸被進(jìn)一步分離。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將多聚核苷酸插入到合適的復(fù)制載體中，并將該載體插入到合適的宿主細(xì)胞中(原核或真核)以進(jìn)行復(fù)制和放大。如此經(jīng)過(guò)放大的DNA可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從細(xì)胞中分離出來(lái)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于通過(guò)這個(gè)方法得到多聚核苷酸的步驟，和由此得到的多聚核苷酸。RNA可以通過(guò)首先將DNA多聚核苷酸插入到合適的宿主細(xì)胞中獲得。該DNA可以通過(guò)任何合適的方法插入，如通過(guò)使用合適的基因傳遞媒介(如，脂質(zhì)體、質(zhì)粒或載體)或通過(guò)電穿孔。當(dāng)細(xì)胞復(fù)制和DNA被轉(zhuǎn)錄為RNA時(shí)；該RNA可以隨之通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離出來(lái)，如在Sambrook等(1989)supra中描述的那樣。例如，mRNA可以根據(jù)Sambrook，等(1989)supra中描述的步驟使用各種細(xì)胞溶解性酶或化學(xué)溶液分離出來(lái)，或按照生產(chǎn)商提供的說(shuō)明用核酸結(jié)合樹脂提取出來(lái)。反義核酸是DNA或RNA分子，它們與特定轉(zhuǎn)錄RNA分子的至少一部分是互補(bǔ)的。在細(xì)胞中，該反義核酸雜交到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本RNA中，形成雙鏈分子，從而干擾mRNA的翻譯，因?yàn)榧?xì)胞不翻譯雙鏈mRNA。約15個(gè)核苷酸的反義寡聚體是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀缀铣桑遗c較大分子相比，它們較少可能地產(chǎn)生問(wèn)題。使用反義方法抑制基因體外翻譯是本領(lǐng)域已知的。Marcus-Sakura，Anal.Biochem.(1988)172:289和DeMesmaeker，等，Curr.Opin.Struct.Biol.(1995)5:343-355。這些出版物中公開的信息是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們與本發(fā)明的說(shuō)明書結(jié)合就可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員了解和使用反義DNA或RNA分子作為治療劑。用低聚核苷酸阻止轉(zhuǎn)錄是已知的三螺旋策略(triplextrategy)，因?yàn)樵摰途畚飮@在雙螺旋DNA周圍，形成三鏈螺旋。三螺旋化合物被設(shè)計(jì)成能識(shí)別所選基因上的唯一位點(diǎn)。Maher,等，AntisenseRes.AndDev.(1991)1(3):227，Helene，C.，AnticancerDrugDesign(1991)6(6):569。核酶是具有專一性切斷其它單鏈RNA能力的RNA分子，采取的方式類似于DNA限制性內(nèi)切酶。通過(guò)修飾編碼這些RNAs的核苷酸序列就可能設(shè)計(jì)出能識(shí)別RNA分子中的專一核苷酸序列的分子，并將其切斷。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是僅具有特定序列的mRNA因其序列專一性而被失活。美國(guó)專利No.6，458，559公開了如何生產(chǎn)和使用RNA適配體分子來(lái)抑制基因表達(dá)。該專利中公開的內(nèi)容和本發(fā)明的說(shuō)明書結(jié)合可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員制備和使用適配體作為TGF-ct抑制分子。美國(guó)公開的專利文件US20030180744公開了生產(chǎn)和使用對(duì)生長(zhǎng)因子具有高親和力的低聚核苷酸配體的方法。該專利中公開的內(nèi)容和本發(fā)明的說(shuō)明書結(jié)合可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員制備和使用低聚核苷酸配體作為治療分子。美國(guó)公開的專利文件US20030051263公開了將雙鏈RNA引入到活細(xì)胞中從而在該細(xì)胞中抑制靶基因基因表達(dá)的方法。抑制是序列專--性的，因?yàn)镽NA的雙螺旋區(qū)的核苷酸序列和靶基因的一部分的核苷酸序列是相同的。該專利中公開的內(nèi)容和本發(fā)明的說(shuō)明書結(jié)合可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員制備并使用雙鏈RNA分子作為治療劑。見，如Elbashir，S.M等，Nature(2001)411:494。當(dāng)治療劑是核酸時(shí)，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法將其加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述方法包括但不限于磷酸鈣沉淀、微注射或電穿孔法。它們可以單獨(dú)加入或與合適的載體(如藥學(xué)可接受的載體如磷酸鹽緩沖的食鹽水)一起加入?；蛘呋虼送猓梢詫⒃摵怂嵴系奖磉_(dá)或插入載體中以整合進(jìn)入細(xì)胞中。即含有啟動(dòng)子又含有克隆位點(diǎn)(其中多聚核苷酸可以有效地與該位點(diǎn)連接)的載體是本領(lǐng)域已知的。這樣的載體可以體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA，并可從如Stratagen(LaJolla，CA)和PromegaBiotech(Madison,WI)這樣的供源處購(gòu)得。為了使表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄最優(yōu)化，有必要在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平除去、加入或改變克隆物中5鄰減3'未翻譯部分，以排除另外的、潛在的不合適的替代翻譯起始密碼或其它可能會(huì)干擾或減少表達(dá)的序列。或者，共有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)可以被緊鄰插入到起始密碼的5'中以提高表達(dá)。載體的例子為病毒，如桿狀病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體、腺病毒、腺相關(guān)病毒、粘粒、質(zhì)粒、真菌載體和其它常用于本領(lǐng)域的重組載體，它們已經(jīng)被公開在各種真核和原核宿主中進(jìn)行表達(dá)，并可以用于基因治療和用于簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)表達(dá)。在這些載體中，有一些非病毒載體，包括DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，及靶向的病毒蛋白DNA復(fù)合物。為了提高向細(xì)胞的傳遞，本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)可以共軛到結(jié)合細(xì)胞表面抗原的抗體上或其結(jié)合片段上。脂質(zhì)體(也包括靶向抗體或其片段)可以用在本發(fā)明的方法中。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明公開的方法中的靶向復(fù)合物。使用本領(lǐng)域已知的方法將多聚核苷酸插入載體基因組中。例如，插入物和載體DNA可以在合適的條件下與限制酶接觸以在每個(gè)分子(可以相互配對(duì)，并通過(guò)連接酶連在一起)上產(chǎn)生互補(bǔ)端?；蛘撸梢詫⒑铣傻暮怂徇B接子(linker)連接在被限制的多聚核苷酸的末端。這些合成的連接子含有對(duì)應(yīng)于載體DNA中特定限制位點(diǎn)的核酸序列。此外，含有終止編碼子和合適的限制位點(diǎn)的低聚核苷酸可經(jīng)連接以用于插入載體中，該載體含有，例如，下述中的一些或全部可選擇的標(biāo)記基因，如用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染選擇的新霉素基因；用于高水平轉(zhuǎn)錄的來(lái)自人類CMV立即早期基因的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列；用于mRNA穩(wěn)定的來(lái)自SV40的轉(zhuǎn)錄終止序列和RNA加工信號(hào)；用于合適的附加型復(fù)制的復(fù)制SV40多起源點(diǎn)和ColEl;通用的多克隆位點(diǎn)；和用于體外正義和反義RNA轉(zhuǎn)錄的T7和SP6RNA啟動(dòng)子。其它方法是本領(lǐng)域已知的，可以得到。本發(fā)明還涉及被分離的由表2到表6所列基因(如，TGF-a基因)編碼的多肽。一方面，所述TGF-a多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。另一方面，該多肽通過(guò)用保守氨基酸取代得到修飾。另一方面，通過(guò)使用后面給出的實(shí)施例可以確定該多肽具有與SEQIDNO:2多肽相同的功能，并且該多肽經(jīng)在合適的條件下運(yùn)行的序列比對(duì)程序.如BLAT確定，其與SEQIDNO:2的序列同源性大于80%，或者大于85%，或者大于卯％，或者大于95%，或者大于97%,或者大于98%或99%。一方面，該程序是在默認(rèn)參數(shù)的條件下進(jìn)行的。本發(fā)明還涉及這些實(shí)施方案中的活性片段。本發(fā)明方法中使用的肽通過(guò)任何常用的方法獲得。例如，肽可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的化學(xué)合成來(lái)制備。特別方便的方法是固相肽合成技術(shù)。自動(dòng)的肽合成儀可以購(gòu)得，它們用途所需的試劑也可以購(gòu)得。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明經(jīng)分離的肽可以使用合適的固相合成方法進(jìn)行合成。StewardandYoung,eds.(1968)SOLIDPHASEPEPTIDESYNTHESIS,Freemantle,SanFrancisco,Calif.—個(gè)方法就是Merrifield方法。Merrifield,RecentProgressinHormoneRes.(1967)23:451。一旦得到本發(fā)明經(jīng)分離的肽，其可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化，這些方法包括色譜法(如，離子交換、親和及體積柱色譜(sizingcolumnchromatography))、離心、溶解度差異或通過(guò)任何其它用于蛋白質(zhì)分離的常規(guī)技術(shù)。對(duì)于免疫親和色譜，抗原決定表位的分離可以是通過(guò)與含有抗體(該抗體用于對(duì)抗該肽，或本發(fā)明中的相關(guān)肽)的親和柱結(jié)合進(jìn)行的，并且所述抗體附在固定的載體物上?；蛘撸梢詫⒂H和標(biāo)簽，如hexa-His(Invitrogen)、Maltose結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NewEnglandBiolabs)、流感殼序列(Kolodziej等，MethodsEnzymol.(1991)194:508-509)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與本發(fā)明的肽相連，從而能使肽在通過(guò)合適的親和柱后較容易地得到純化。經(jīng)分離的肽也可以利用諸如蛋白質(zhì)水解、核磁共振和X射線結(jié)晶等方法進(jìn)行物理性表征。或者，所述多聚核苷酸可以通過(guò)PCR或基因克隆技術(shù)進(jìn)行復(fù)制。這樣，本發(fā)明還涉及有效連接在某些元件上的本發(fā)明的多聚核苷酸，這些對(duì)于這些多聚核苷酸在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯是必需的。一方面，所述多聚核苷酸是用于插入到宿主細(xì)胞中的基因傳遞媒介物的組分。用于將表達(dá)重組體(expressionconstruct)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法包括但不限于微注射、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣顆粒轟擊介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移或者直接注射核酸序列，或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式(Sambrook等，(1989)supra)。轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)參見，如Keown等，MethodsinEnzmology(19卯)185:527-537。宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞和原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞、酵母菌細(xì)胞、猿細(xì)胞、鼠細(xì)胞和人細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是培養(yǎng)的或臨時(shí)從受試者分離的。宿主細(xì)胞在多肽重組生產(chǎn)或多聚核苷酸重組復(fù)制所必需的條件下培養(yǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及重組生產(chǎn)的多聚核苷酸和/或多聚核苷酸。本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括在翻譯期間或翻譯后經(jīng)不同修飾的多肽，例如通過(guò)磷酸化、糖基化、交聯(lián)、乙?；?、蛋白裂解、與抗體分子，膜分子或其它配體相連。Ferguson等，Ann.Rev.Biochem.(1988)57:285-320。這可以通過(guò)各種化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)，或通過(guò)在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)多聚核苷酸實(shí)現(xiàn)，所述宿主細(xì)胞例如，細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母菌或昆蟲細(xì)胞。本發(fā)明還提供了單獨(dú)的或與載體結(jié)合的肽片段，如免疫原或抗原部分。本發(fā)明的抗原肽可以以各種制劑形式使用，制劑形式根據(jù)使用目的而變化。本發(fā)明的抗原肽可以共價(jià)或非共價(jià)連接(復(fù)合)到各種其它分子上，其類型可以根據(jù)具體目的而變化。例如，本發(fā)明的肽可以共價(jià)或非共價(jià)復(fù)合到大分子載體上，該載體包括但不限于天然和合成的聚合物、蛋白質(zhì)、多糖、多(氨基酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮，和脂質(zhì)。肽可以偶聯(lián)到脂肪酸上以用于引入到脂質(zhì)體中。美國(guó)專利No.5，837，249。本發(fā)明的合成肽可以共價(jià)地或非共價(jià)地與固相載體物復(fù)合，許多固相載體物是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的抗原肽表位可以與含有或不含有共刺激分子的抗原遞呈基質(zhì)(antigen-presenting)相連，這一點(diǎn)下面要詳細(xì)描述。蛋白質(zhì)載體物的例子包括但不限于超抗原、血清蛋白、破傷風(fēng)類毒素、卵蛋白素、甲狀腺球蛋白、肌球蛋白和免疫球蛋白。肽蛋白載體聚合物可以使用常用的交聯(lián)劑形成，所述交聯(lián)劑為如碳二酰亞胺。碳二酰亞胺的例子為1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二酰亞胺(CMC)、l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亞胺(EDC)和1-乙基-3-(4-氮絲(a咖ia)-44-二甲基戊基)碳二酰亞胺。其它合適的交聯(lián)劑為溴化氰、戊二醛和丁二酸酐。通常，可以使用同雙官能試劑中的任何一個(gè)，所述同雙官能試劑包括同雙官能乙醛、同雙官能環(huán)氧化物、同雙官能亞氨酸酯、同雙官能N-羥基琥珀酰亞胺酯、同雙官能馬來(lái)酰亞胺、同雙官能垸基鹵代物、同雙官能吡啶基二硫化物、同雙官能芳基鹵代物、同雙官能酰肼、同雙官能重氮衍生物和同雙官能光反應(yīng)化合物。還包括雜雙官能化合物，如具有胺反應(yīng)基團(tuán)和巰基反應(yīng)基團(tuán)的化合物和具有胺反應(yīng)基團(tuán)和光反應(yīng)基團(tuán)的化合物，和具有羰基反應(yīng)基團(tuán)和巰基反應(yīng)基團(tuán)的化合物。這樣的同雙官能交聯(lián)劑的具體例子包括雙官能N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-hydroxysuccinimideesters),二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)(dithiobis(succinimidylpropionate)、二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(disuccinimidylsuberate)和二琥珀酰亞胺基酒石酸酉旨(disuccinimidyltartarate);雙官能酰亞胺酯二甲基己二酰亞胺酯(imidoestersdimethyladipimidate)、二甲基庚二酰亞胺酯(dimethylpimelimidate)和二甲基亞胺(dimethylsuberimidate);雙官能巰基反應(yīng)交聯(lián)劑1,4-二-[3'-(2'-吡啶二硫代)戊酮(propion)-酰亞胺]丁烷、雙馬來(lái)酰亞胺己垸(bismaleimidohexane)和雙-N-馬來(lái)酰亞胺-1,8-辛烷；雙官能芳基鹵代物1,5-二氟-2,4-二硝基苯和4，4'國(guó)二氟-3，3'國(guó)二硝基苯基砜(1,5-difluoro國(guó)2，4-dinitrobenzeneand4，4'-difluoro-3，3'-dinitrophenylsulfone);雙官能光反應(yīng)試劑如雙-[b-(4-疊氮基水揚(yáng)基氨基)乙基]二硫化物；雙官能醛類，甲醛、丙二醛、琥珀醛、戊二醛和己二醛(adipaldehyde);雙官能環(huán)氧化物，如1,4-丁二醇(butaneodiol)二縮水甘油醚、雙官能酰肼脂肪酸二酰肼(dihydrazide)，羰酰肼(carbohydrazide)和琥珀酸二酰肼；雙官能二氮鑰(diazoniums)鄰甲基苯胺、二氮化的和雙二氮化的對(duì)二氨基聯(lián)苯；雙官能鹵代烷基，NlN'-亞乙基-雙(碘代乙酰胺)，NIN'-環(huán)己基-雙(碘代乙酰胺)，NlN-十一亞甲基-雙(碘代乙酰胺)，和鹵代苯甲烷(benzylhalides)和鹵代芥子氣(halomustards)，分別如ala'-二碘代-對(duì)二甲苯磺酸和三(2-氯乙基)胺。其它常見的能使蛋白質(zhì)結(jié)合到肽上的雜雙官能交聯(lián)劑的例子包括但不限于SMCC琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)(maleimidomethyl)環(huán)己烷-l-羧酸酯、MBS(間馬來(lái)酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、SIAB(N-琥珀酰亞胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯)、SMPB(琥珀酰亞胺基-4-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸酯)、GMBS(N-(馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯)、MPBH(4-(4-N-馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸酰肼、M2C2H(4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-l-羧基-酰肼)、SMPT(琥珀酰亞胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯)和SPDP(N-琥珀酰亞胺基3-(2-卩比啶基二硫代)丙酸酯)。交聯(lián)可以通過(guò)還原氨化將羰基偶聯(lián)到胺基團(tuán)或酰肼基團(tuán)上完成。本發(fā)明的肽可以作為單體的非共價(jià)附屬物通過(guò)離子的、吸附的或生物專一性的相互作用進(jìn)行配制。具有高正電荷或負(fù)電荷分子的肽復(fù)合物可以在低離子強(qiáng)度的環(huán)境中(如在去離子水中)通過(guò)形成鹽橋來(lái)制備。大的復(fù)合物可以使用帶電荷的聚合物如分別帶有大量負(fù)電荷和正電荷的聚-(L-谷氨酸)或聚-(L-賴氨酸)制備。肽也可被吸附到諸如微粒、乳膠?；蚱渌杷酆衔锏谋砻妫纬赡苡行M交聯(lián)的或化學(xué)聚合的蛋白質(zhì)的非共價(jià)連接的肽-超抗原復(fù)合物。最后，肽可以通過(guò)利用與其它分子之間的生物專一性相互作用進(jìn)行非共價(jià)連接。例如，利用生物素對(duì)蛋白質(zhì)(如抗生物素蛋白或鏈霉親和素或它們的衍生物)的強(qiáng)親和力可以形成肽復(fù)合物。這些生物素結(jié)合蛋白質(zhì)含有四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可以在溶液中與生物素相互作用，或可以經(jīng)共價(jià)連接到另一分子上。Wilchek，AnalBiochem.(1988)171:1-32?？梢允褂贸Ｒ姷纳锼?酰)化試劑對(duì)肽進(jìn)行修飾以使其擁有生物素基團(tuán)，所述生物素(酰)化試劑為如D-生物素(NHS-生物素)的N-羥基琥珀酰亞胺酯，該試劑與蛋白質(zhì)上的胺基團(tuán)反應(yīng)。然后，生物素(酰)化的肽可以與抗生物素蛋白或鏈霉親和素一起孵育以產(chǎn)生大的復(fù)合物。這樣得到的聚合物的分子量可以通過(guò)仔細(xì)控制生物素(酰)化的肽對(duì)抗生物素蛋白或鏈霉親和素的摩爾比率進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明還提供了共軛連接到用于診斷方法中的可檢測(cè)試劑上的本發(fā)明描述的肽和多肽。例如，經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記的肽和多肽可以結(jié)合到柱上，并用于檢測(cè)和純化抗體。它們也可以用作免疫原用來(lái)生產(chǎn)抗體，如下所述。本發(fā)明的肽也可以與各種液相載體結(jié)合，所述液相載體為如無(wú)菌的或含水溶液，藥學(xué)可接受的載體、懸浮液和乳液。非水溶劑的例子包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。當(dāng)被用于制備抗體時(shí)，這些載體也可以包括佐劑以用于非專一性增加特定免疫反應(yīng)。熟練技術(shù)人員可以很容易地判定是否需要佐劑，和選擇哪一種佐劑。然而，為了說(shuō)明目的，合適的佐劑包括但不限于弗氏完全或不完全佐劑(Freund'sCompleteandIncomplete),礦物鹽和多聚核苷酸。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽可以通過(guò)利用商業(yè)可購(gòu)得的自動(dòng)合成儀進(jìn)行的化學(xué)合成獲得，所述合成儀為如由PerkinElmer/AppliedBiosystemsInc，430A或431A型，F(xiàn)osterCity,CA，USA制造的那些。經(jīng)合成的蛋白質(zhì)或多肽可以經(jīng)沉淀和進(jìn)一步純化，例如通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供通過(guò)提供蛋白質(zhì)序列和試劑(如氨基酸和酶)，并將所述氨基酸按正確的方向連接來(lái)化學(xué)合成該蛋白質(zhì)的方法，及線性序列。人們可以通過(guò)細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化或TGF-ct過(guò)表達(dá)減少來(lái)判斷本發(fā)明的方法的目的(即，細(xì)胞或組織的病理狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn))是否完成。細(xì)胞分化可以通過(guò)組織學(xué)方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，或通過(guò)某些細(xì)胞表面標(biāo)記是否存在或丟失而監(jiān)測(cè)。人體內(nèi)病理狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)可以例如通過(guò)使用NMR來(lái)測(cè)量膀胱(cystic)(或腎)的體積的減小而檢測(cè)。該方法也可以通過(guò)向感染的組織傳遞有效量的治療劑(如阻斷或抑制抗體或其衍生物或小分子)來(lái)實(shí)施。實(shí)例性抗體在下文中將提到。它們可以單獨(dú)傳遞或與載體如藥學(xué)可接受的載體結(jié)合傳遞。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以很容易地生產(chǎn)另外的能專一性結(jié)合到蛋白質(zhì)或其片段上的抗體。這樣的抗體可以是單克隆或多克隆的。它們可以是嵌合的、人源化的或完全人類抗體?？梢允褂每贵w的任何功能片段或衍生物，包括Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)ab2，F(xiàn)ab'2，和任何單鏈可變區(qū)。抗體可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中、在噬菌體中或在各種動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生，所述動(dòng)物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴子、猩猩、猿等。只要所述片段或衍生物對(duì)蛋白質(zhì)或其片段保持結(jié)合專一性，其就可以使用。抗體的結(jié)合專一性可以通過(guò)在給定的一組條件下將其與合適抗原結(jié)合和其與不相關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合進(jìn)行比較來(lái)測(cè)試。如果抗體與合適抗原的結(jié)合比其與不相關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合多2、5、7，優(yōu)選10倍，則該抗體被認(rèn)為是專一性的。制備這種從部分到完全人抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，任何這樣的技術(shù)都可以使用。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，完全人類抗體序列是在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)制備的，該轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)被改造來(lái)表達(dá)人類重或輕鏈抗體基因。已經(jīng)制備了這種轉(zhuǎn)基因小鼠的多個(gè)品系，其可以產(chǎn)生不同種類的抗體。能產(chǎn)生所需抗體的來(lái)自轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞可經(jīng)融合后制備雜交瘤細(xì)胞系用于所需抗體的連續(xù)生產(chǎn)。見，例如，Russel,N.D.等，InfectionandImmunity(2000)20004月1820-1826;Gallo,M.L.等，EuropeanJ.ofImmun.(2000)30:534-540;Green,L.L.，J.ofImmun.Methods(1999)231:11-23;Yang,X-D等，J.ofLeukocyteBiology(1999A)66:401-410;Yang，X國(guó)D,CancerResearch(1999B)59(6):1236-1243;Jakobovits,A.，AdvancedDrugDeliveryReviews(1998)31:33-42;Green,L.andJakobovits,A.,J.Exp.Med.(1998)188(3):483-495;Jakobovits,A.，Exp.Opin.InvestDrugs(1998)7(4):607-614;Tsuda，H.等，Genomics(1997)42:413-421;Sherman國(guó)Gold，R"GeneticEngineeringNews(1997)17(14);Mendez,M.等，NatureGenetics(1997)15:146-156;Jakobovits,A"WEIR'SHANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY,THEINTEGRATEDIMMUNESYSTEMVOL.IV,(1996)194.1-194.7;Jakobovits,A.，CurrentOpinioninBiotechnology(1995)6:561國(guó)566;Mendez，M.等，Genomics(1995)26:294-307;Jakobovits,A.，CurrentBiology(1994)4(8):761-763;Arbones，M,等，Immunity(1994)1(4):247-260;Jakobovits,A.，Nature(1993)362(6417):255-258;Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA(1993)卯(6):2551-2555;Kucherlapati，等，美國(guó)專利No.6,075，181?？贵w還可以通過(guò)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行制備。這樣的技術(shù)用于分離起始抗體或用于產(chǎn)生具有不同專一性或親和力特征的變體。也可以使用單鏈Fv，其是方便的。如果需要，它們可以從經(jīng)接種的轉(zhuǎn)基因小鼠制備?？贵w也可以在細(xì)胞培養(yǎng)物、噬菌體或在各種動(dòng)物中生產(chǎn)，所述動(dòng)物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴子、猩猩、猿等?？贵w可以用可檢測(cè)部分進(jìn)行標(biāo)記，所述可檢測(cè)部分為如放射性原子、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)等。這種經(jīng)標(biāo)記的抗體可以用于在體內(nèi)或在分離的測(cè)試樣品中進(jìn)行的診斷技術(shù)?？贵w也可以共軛連接到例如藥物中(如化學(xué)治療藥物或毒素)。它們可以連接到細(xì)胞因子、配體或另一個(gè)抗體上。用于結(jié)合到抗體上以獲得抗腫瘤效果的合適的制劑包括細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素2(IL-2)和腫瘤壞死因子(TNF);用在光動(dòng)力治療中的光敏劑，包括四磺酸酞菁鋁(m)、血卟啉和酞菁；放射性核素，如碘-131(1311)、紀(jì)-90(90Y)、鉍畫212(212Bi)、秘-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、錸-186(186Re)和錸-188(188Re);抗生素類，如阿霉素(doxorubicin)、阿霉素(adriamycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、甲氨喋呤、道諾霉素(daunomycin)、新抑癌蛋白和卡鉑(carboplatin);細(xì)菌、植物和其它毒素，如白喉毒素、假單胞菌外毒素A、葡萄菌外毒素A、相思豆A毒素、蓖麻毒蛋白A(去糖基化蓖麻毒蛋白A和天然蓖麻毒蛋白A)、TGF-a毒素、來(lái)自中國(guó)眼鏡蛇的細(xì)胞毒素(浙江眼鏡蛇(najanajaatra)和白樹毒素(gelonin)(植物毒素)；來(lái)自植物、細(xì)菌和真菌的核糖體失活蛋白質(zhì)，如局限曲菌素(restrictodn)(由局限曲霉產(chǎn)生的核糖體失活蛋白質(zhì))、皂草素(saporin)(來(lái)自石堿花的核糖體失活蛋白質(zhì))和RNase;酪氨酸激酶抑制劑；ly207702(二氟化(difluprednate)嘌呤核苷酸)；含有抗囊腫劑的脂質(zhì)體(如，反義低聚核苷酸、編碼毒素的質(zhì)粒、甲氨喋呤，等)；和其它抗體或抗體片段，如F(ab)。診斷方法一方面，本發(fā)明提供了一種有助于診斷存在組織中的囊腫異常的方法。通過(guò)TGF-a基因、針對(duì)其受體(EGFR)的基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的差異表達(dá)來(lái)識(shí)別細(xì)胞或組織的病理狀態(tài)。通常，基因表達(dá)是通過(guò)關(guān)注測(cè)試系統(tǒng)中基因表達(dá)的量(如果有，例如發(fā)生改變)進(jìn)行判斷的，例如，表達(dá)差異是通過(guò)從基因轉(zhuǎn)錄過(guò)來(lái)的mRNA水平的增加(或在某些方面減少)至少2.5倍，優(yōu)選5倍，更優(yōu)選10倍來(lái)判斷的。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，由基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)水平的增加說(shuō)明細(xì)胞存在病理狀態(tài)。該方法可以用于幫助診斷ADPKD相關(guān)的腎囊腫和在其它器官(包括肝臟、胰腺、脾臟和卵巢)中通常會(huì)在ADPKD中發(fā)現(xiàn)的囊腫異常。此外，通過(guò)在異常囊腫形成之前檢測(cè)蛋白質(zhì)或基因表達(dá)異常，人們就可以預(yù)測(cè)患囊腫異常的可能性和/或可以較早進(jìn)行診斷和治療。用于本發(fā)明的細(xì)胞或組織樣品包括體液、實(shí)體組織樣品、組織培養(yǎng)物或從它們衍生得到的細(xì)胞和它們的子代，及從這些來(lái)源中的任何一個(gè)制備的切片或涂片，或任何其它可能含有具有表達(dá)異常細(xì)胞的樣品。優(yōu)選的樣品是從受試者腎小管中制備得到的樣品。利用重組DNA技術(shù)和生物信息學(xué)的診斷方法一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)測(cè)定TGF-a基因的表達(dá)水平或其受體，并將測(cè)定的表達(dá)水平和疾病或其進(jìn)展聯(lián)系起來(lái)進(jìn)行診斷或監(jiān)測(cè)囊腫異常(如與ADPKD疾病相關(guān)的那些)的組合物和方法。己知有許多方法可以用來(lái)量化感興趣的基因的表達(dá)，所述方法包括但不限于雜交分析(RNA印記分析)和基于PCR的雜交分析。在分析mRNA水平變化時(shí)，首先要將樣品中的核酸根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法提取出來(lái)。例如，根據(jù)上述Sambrook等(1989)描述的步驟利用各種細(xì)胞溶酶或化學(xué)溶液將mRNA分離出來(lái)，或者通過(guò)核酸結(jié)合樹脂按照制造商提供的說(shuō)明提取出來(lái)。作為例子，在提取的核酸樣品中的TGF-ctmRNA可以接著按照標(biāo)準(zhǔn)步驟分別通過(guò)使用核酸探針和/或引物的通過(guò)雜交(如，RNA印記分析)和/或擴(kuò)增程序進(jìn)行檢測(cè)。在診斷方法中，具有至少IO個(gè)核苷酸的、對(duì)TGF-(i表現(xiàn)出序列互補(bǔ)或同源性的核酸分子可用作TGF-d雜交探針或TGF-aPCR引物。本領(lǐng)域已知的是，特定雜交不需要"完美相配"的探針。由于取代、消除或插入少量數(shù)目的堿基而導(dǎo)致的探針序列的細(xì)小變化不會(huì)影響雜交專一性。通常，可以允許多達(dá)20%的堿基對(duì)錯(cuò)配(當(dāng)最佳比對(duì)時(shí))。例如，用于檢測(cè)TGF-amRNA的探針與含在在先識(shí)別的序列(如，見SEQIDNO:1)中的相同大小的同源區(qū)中的至少80%相同。或者，在與同源區(qū)比對(duì)后，所述探針與相應(yīng)基因序列的至少85%，或至少卯%相同。片段的總長(zhǎng)度，和互補(bǔ)序列段的長(zhǎng)度依賴于特定核酸片段的應(yīng)用用途。基因的更小片段通?？梢杂糜陔s交方案中，其中根據(jù)人們希望檢測(cè)的互補(bǔ)序列，互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度會(huì)發(fā)生變化，如從約10個(gè)到約100核苷酸，或甚至是全長(zhǎng)。具有在長(zhǎng)度上多于10個(gè)核苷酸的互補(bǔ)序列段的核苷酸探針能增加穩(wěn)定性和雜交的選擇性，從而提高所得特定雜交分子的專一性。人們可以設(shè)計(jì)含有在長(zhǎng)度上具有大于約25個(gè)甚至更多，優(yōu)選多于約50個(gè)核苷酸的基因互補(bǔ)序列段的核酸分子，或者根據(jù)需要該互補(bǔ)序列段可以更長(zhǎng)。這樣的片段可以很容易進(jìn)行制備，例如，通過(guò)化學(xué)方法經(jīng)由通過(guò)核酸復(fù)制技術(shù)直接合成該片段，所述核酸復(fù)制技術(shù)為如在美國(guó)專利No.4，603，102中公開的具有兩個(gè)引物低聚核苷酸的PCR技術(shù)，或者將選擇的序列引入到重組載體中以進(jìn)行重組生產(chǎn)。在特定實(shí)施方案中，有利的是采用本發(fā)明的核酸序列，并與合適的手段相結(jié)合，如標(biāo)簽，用于檢測(cè)雜交并由此得到的互補(bǔ)序列。許多種合適的指示方式是本領(lǐng)域己知的，包括熒光的、放射性的、酶的或其它配體，如抗生物素蛋白/生物素，它們可以提供可檢測(cè)的信號(hào)。也可以使用熒光標(biāo)簽或酶標(biāo)志(如脲酶、堿性磷酸酶或過(guò)氧化酶)以代替放射性的或其它對(duì)環(huán)境不利的試劑。在使用酶標(biāo)志的情況下，比色指示劑物質(zhì)是已知的，可以采用該物質(zhì)以提供一種人眼可視或通過(guò)分光光度計(jì)能檢測(cè)的方法以識(shí)別含有互補(bǔ)核酸的樣品的特定雜環(huán)。雜交反應(yīng)可以在不同"嚴(yán)謹(jǐn)"的條件下進(jìn)行。相關(guān)的條件包括溫度、離子強(qiáng)度、孵育時(shí)間、反應(yīng)混合物中其它溶質(zhì)的存在(如甲酰胺)，和洗滌步驟。較高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件是如較高的溫度和較低鈉離子濃度，這樣的條件需要雜交元素之間較高的最低互補(bǔ)度以形成穩(wěn)定的雜環(huán)復(fù)合體。增加雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件是公知的，并公開在現(xiàn)有技術(shù)中。見，上述Sambrook等，(1989)。人們也可以使用定量PCR或利用高通量分析如在Velculescu，V.等，Science(1995)270:484-487中描述的基因表達(dá)系列分析進(jìn)行檢測(cè)并量化mRNA水平或其表達(dá)。簡(jiǎn)言之，該方法包括從被認(rèn)為含有該轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞或組織樣品中分離多mRNAs。任選地，所述基因轉(zhuǎn)錄本可以被轉(zhuǎn)化為cDNA。基因轉(zhuǎn)錄的樣品經(jīng)序列專一性分析和量化。將這些基因轉(zhuǎn)錄本序列的豐度與參考數(shù)據(jù)庫(kù)序列豐度(包括患病的和健康病人的正常數(shù)據(jù)組)對(duì)比。病人患有與病人的數(shù)據(jù)組大多數(shù)緊密相關(guān)的疾病，并且對(duì)于本申請(qǐng)而言包括轉(zhuǎn)錄差異。本發(fā)明的核苷酸探針也可用作引物用于基因或基因轉(zhuǎn)錄本的增殖和檢測(cè)。用于檢測(cè)差異表達(dá)的mRNA的引物與相同長(zhǎng)度的基因或多聚核苷酸的同源區(qū)有至少約80%相同。為了本發(fā)明的目的，增殖是指采用能夠以合理可信度復(fù)制靶序列的引物依賴型聚合酶的任何方法。增殖可以通過(guò)天然或重組DNA-聚合酶如T7DNA聚合酶、E.coliDNA聚合酶的Klenow片段和反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行。PCR的常用步驟在MacPherson等，PCR:APracticalApproach,(IRLPressatOxfordUniversityPress(1991))中公開。然而，針對(duì)每個(gè)反應(yīng)所使用的PCR條件要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷。許多參數(shù)影響反應(yīng)的成功。其中，退火溫度和時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、Mg^ATP濃度、pH和引物的相對(duì)濃度、模板和脫氧核苷酸。在增殖后，所得DNA片段可以通過(guò)凝膠電泳，然后溴化乙錠著色和紫外光照進(jìn)行檢測(cè)。感興趣的差異表達(dá)基因的特定增殖可以通過(guò)證明該增殖的DNA片段具有預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度、具有預(yù)期的限制性消化圖譜和/或雜交到正確的經(jīng)克隆的DNA序列上得到證實(shí)。探針也可以利用本領(lǐng)域己知的方法連接到固體載體上以用在高通量篩選分析中。例如，國(guó)際PCT申請(qǐng)No.WO97/10365和美國(guó)專利號(hào)5,405,783、5,412,087和5,445,934公開了含有一個(gè)或多個(gè)序列的高密度低聚核苷酸芯片的構(gòu)建。該芯片可以在衍生的玻璃表面上利用美國(guó)專利Nos.5，405，783、5,412，087和5，445，934中公開的方法進(jìn)行合成?？梢詫⒐獗Ｗo(hù)的亞磷酸核苷酸結(jié)合到玻璃表面上，利用光刻掩膜通過(guò)光解進(jìn)行選擇性地脫保護(hù)，并與另一種經(jīng)保護(hù)的亞磷酸核苷酸反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行。重復(fù)該結(jié)合/脫保護(hù)過(guò)程直到得到所需要的探針。基因表達(dá)水平可以通過(guò)將被猜測(cè)含有多聚核苷酸的樣品暴露在探針修飾的芯片上來(lái)檢測(cè)。對(duì)提取出的核酸優(yōu)選在增殖步驟進(jìn)行標(biāo)記，例如，用熒光標(biāo)簽。經(jīng)標(biāo)記的樣品的雜交是在合適的嚴(yán)謹(jǐn)水平進(jìn)行的。探針-核酸雜交的程度利用檢測(cè)設(shè)備(如共聚焦顯微鏡)定量測(cè)量。見，美國(guó)專利Nos.5，578，832和5,631,734。將所得的測(cè)量結(jié)果直接與基因表達(dá)水平聯(lián)系起來(lái)。所述探針和高密度低聚核酸酸探針陣列也提供了監(jiān)測(cè)基因多樣性表達(dá)的有效方法，其中之一就包括該基因。因此，該表達(dá)監(jiān)測(cè)方法可以用在許多情況中，包括疾病的檢測(cè)、鑒別從同一病人經(jīng)一段時(shí)間間隔分離得到的樣品之間的差異基因表達(dá)或篩選在同一時(shí)間(或者相反，在一段時(shí)間內(nèi))上調(diào)或下調(diào)基因表達(dá)的組合物。雜交的探針和樣品核酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)行檢測(cè)。例如，經(jīng)雜交的核酸可以通過(guò)檢測(cè)與樣品核酸相連的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。該標(biāo)記可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的眾多方法中的任何一個(gè)進(jìn)行結(jié)合。一方面，該標(biāo)記是在制備樣品核酸中在增殖步驟中同時(shí)結(jié)合的。這樣，例如，與經(jīng)標(biāo)記的引物或經(jīng)標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)將提供經(jīng)標(biāo)記的增殖產(chǎn)物。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，如上所述，使用經(jīng)標(biāo)記的核苷酸(如，熒光標(biāo)記的UTP和/或CTP)的轉(zhuǎn)錄增殖將標(biāo)記結(jié)合進(jìn)入到轉(zhuǎn)錄核酸中?；蛘撸梢詫?biāo)記直接加到起始核酸樣品中(如，mRNA、polyA、mRNA、cDNA，等)或在增殖完成后直接加到增殖產(chǎn)物中。將標(biāo)記連接到核酸上的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括例如，通過(guò)核酸激酶進(jìn)行的缺口平移或末端標(biāo)記(如，使用標(biāo)記的RNA)，然后將連接樣品核酸的連接子與標(biāo)記(如，熒光團(tuán))相連。適用于本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)記包括任何通過(guò)分光鏡的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、電學(xué)的、光學(xué)的或化學(xué)方法可檢測(cè)的任何組合物。本發(fā)明有用的標(biāo)記包括用標(biāo)記的鏈霉素親和素共軛物著色的生物素、磁珠(如，DynabeadsTM)、熒光染料(如，熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白質(zhì)等等)、放射標(biāo)記物(如，3H、1251、35S、"C或34)酶(如，辣根過(guò)氧化酶、生物堿磷酸酶和其它ELISA中常使用的酶)和比色標(biāo)記，如膠體金或彩色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯、聚丙烯、橡膠，等等)珠。公開這些標(biāo)記的用途的專利包括美國(guó)專利Nos,3，817,837;3,850,752;3，939，350;3，996，345;4,277,437;4，275'149;和4,366,241。檢測(cè)這些標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。因此，例如，放射標(biāo)記可以使用膠巻或閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)，熒光標(biāo)記物可以使用光電探測(cè)器來(lái)檢測(cè)發(fā)射出的光。酶標(biāo)記通過(guò)將酶與底物接觸，并對(duì)酶在底物上作用時(shí)產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，比色標(biāo)記可以通過(guò)簡(jiǎn)單觀察彩色標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。專利公開WO97/10365公開了在雜交之前，或在雜交之后將標(biāo)記加到靶(樣品)核酸中的方法。這些是在雜交之前直接連接到或結(jié)合進(jìn)入靶(樣品)核酸中的可檢測(cè)的標(biāo)記。相反，"非直接標(biāo)記"是在雜交之后連接到雜環(huán)雙鏈上。通常，所述非直接標(biāo)記是與在雜交之前已經(jīng)連接到耙核酸上的結(jié)合部分相連。這樣，例如，靶核酸可能在雜交之前經(jīng)生物素化。在雜交之后，抗生物素蛋白-共軛的熒光團(tuán)將結(jié)合到含有雜交雙鏈的生物素上，從而得到可很容易檢測(cè)到的標(biāo)記。有關(guān)標(biāo)記核酸和檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的雜交核酸的方法的詳細(xì)綜述參見LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY,24巻HybridizationwithNucleicAcidProbes,R丁^jssen,ed.Elsevier,N.Y(199:3)。核酸樣品也可利用在國(guó)際PCT申請(qǐng)No.W097/10365中公開的方法在雜交之前經(jīng)修飾成高密度探針陣列，以減少樣品復(fù)雜度，從而減少背景信號(hào)和提高測(cè)量敏感度。從芯片分析得到的結(jié)果通過(guò)利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析。見，例如，EP0717113A2和WO95/20681。將雜交數(shù)據(jù)讀進(jìn)程序，其會(huì)計(jì)算靶基因的表達(dá)水平。將該圖與現(xiàn)存的針對(duì)患病的和健康的個(gè)體的基因表達(dá)數(shù)據(jù)組對(duì)比。所得數(shù)據(jù)和患病個(gè)體數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)說(shuō)明疾病已經(jīng)在受試病人體內(nèi)發(fā)生。檢測(cè)和量化蛋白質(zhì)或多肽的診斷方法另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)檢測(cè)和/或量化經(jīng)下面表2到6中所列的存在在樣品中的基因表達(dá)所得的蛋白質(zhì)或多肽或其受體來(lái)診斷或檢測(cè)囊腫異常(如與ADPKD疾病相關(guān)的那些)的方法和組合物。本領(lǐng)域有許多技術(shù)可用于蛋白質(zhì)分析，包括但不限于放射免疫分析、ELISA(酶連免疫放射性分析)、"三明治"免疫分析、免疫放射性分析，原位免疫分析(使用例如，膠體金、酶或放射同位素標(biāo)記)、western印記分析、免疫沉淀分析、免疫熒光分析和PAGE-SDS。在診斷由基因差異表達(dá)表征的疾病時(shí)，人們通常進(jìn)行受試者與合適的對(duì)照物之間的比較分析。優(yōu)選地，診斷測(cè)試包括衍生自受試者的對(duì)照樣品(下面統(tǒng)稱為"陽(yáng)性對(duì)照")，其表現(xiàn)出病理的或異常的基因表達(dá)水平。有用的，還要包括"陰性對(duì)照"，該對(duì)照缺少病理狀態(tài)的臨床特征，并且其基因表達(dá)水平在正常的范圍內(nèi)。受試者與陽(yáng)性對(duì)照之間在經(jīng)確定的改變方面具有陽(yáng)性關(guān)系，則說(shuō)明患有或可能會(huì)患有疾病。受試者和陰性對(duì)照之間缺少關(guān)聯(lián)則肯定了診斷結(jié)果。人們也可以改變己知的免疫分析方法以檢測(cè)和量化表達(dá)?；虍a(chǎn)品的確定需要測(cè)量發(fā)生在對(duì)抗體基因產(chǎn)品的反應(yīng)之間的免疫專一性結(jié)合的量。為了檢測(cè)和量化免疫專一性結(jié)合，或在雜交或增殖步驟產(chǎn)生的信號(hào)，可以采用數(shù)字影像分析系統(tǒng)，其包括但不限于使用檢測(cè)探針?lè)派湫曰蚧瘜W(xué)發(fā)光的數(shù)字影像分析系統(tǒng)。確定治療劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供了用于確定先導(dǎo)藥物(leads)的篩選和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞或組織病理狀態(tài)的方法，或選擇性抑制細(xì)胞或組織生長(zhǎng)或增生的方法。一方面，所述篩選確定了能用于治療囊腫異常或治療或改善與ADPKD相關(guān)的癥狀的先導(dǎo)化合物或生物制劑。該篩選可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。一方面，需要確定能結(jié)合到本發(fā)明可溶TGF-ci的候選藥物。在某些應(yīng)用中，希望得到能夠抑制蛋白質(zhì)與其受體結(jié)合的候選藥物。對(duì)于某些應(yīng)用，能夠結(jié)合受體的候選藥物的確定可能用作傳遞治療劑或診斷劑或阻止TGF-ci與其受體結(jié)合的方法。對(duì)于其它應(yīng)用，希望得到能模擬天然配體活性的候選藥物。這樣，通過(guò)操縱結(jié)合配體復(fù)合體的結(jié)合，人們就可以促進(jìn)或抑制囊腫病灶的發(fā)展。用于篩選的實(shí)驗(yàn)物質(zhì)可以通過(guò)各種來(lái)源獲得。它們可以來(lái)自天然產(chǎn)物庫(kù)、組合化學(xué)庫(kù)、通過(guò)重組庫(kù)得到的生物產(chǎn)品，等等。實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的來(lái)源對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不是重要的。本發(fā)明提供了篩選化合物和組合物的方法，所述化合物和組合物可能在先前的其它篩選方案中被忽略了。為了進(jìn)行體外篩選和分析，首先要得到合適的細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物。所述細(xì)胞可能是經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞或經(jīng)基因修飾的差異表達(dá)基因的細(xì)胞?；蛘撸黾?xì)胞可以來(lái)自組織切片。美國(guó)專利No.5,789，189公開了生產(chǎn)多囊腎病細(xì)胞(來(lái)自體外囊腫)培養(yǎng)物的方法。該細(xì)胞在一定條件(溫度、生長(zhǎng)或培養(yǎng)介質(zhì)和氣體(C02))下培養(yǎng)足夠的時(shí)間以獲得指數(shù)增生而沒(méi)有密度依賴型限制的細(xì)胞。也希望保留另外的單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)物；沒(méi)有給予待測(cè)試藥物的培養(yǎng)物作為對(duì)照。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以顯然易見的是，將合適的細(xì)胞在微孔板上培養(yǎng)，幾個(gè)制劑可以通過(guò)觀察遺傳型變化、表型變化和/或細(xì)胞死亡而同時(shí)測(cè)試。一方面，所述篩選使用了下文中要提到的組合物和MDCK囊腫分析方法。當(dāng)制劑是組合物而不是DNA或RNA核酸分子時(shí)，可以將合適的條件直接施用到細(xì)胞培養(yǎng)物上或加到培養(yǎng)介質(zhì)中以進(jìn)行添加。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是，"有效"量必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。所述篩選包括將制劑與差異表達(dá)基因的測(cè)試細(xì)胞接觸，然后分析細(xì)胞的基因表達(dá)水平。在某些方面，可能需要在分析之前確定基因的表達(dá)水平。這提供一個(gè)基線以對(duì)比在向細(xì)胞培養(yǎng)物給予所述制劑之后的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，測(cè)試細(xì)胞是從已建立的差異表達(dá)TGF-ci基因的細(xì)胞系得到的經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。如果一個(gè)制劑能將基因表達(dá)恢復(fù)(減少和增加)到正常細(xì)胞中存在的狀態(tài)，則該制劑就是治療劑。再一方面，將測(cè)試細(xì)胞或組織樣品從要進(jìn)行治療的受試者中分離出來(lái)，篩選出一個(gè)或多個(gè)有潛能的制劑來(lái)針對(duì)那個(gè)病人確定最佳治療和/或療程。例如，腎或肝組織適合這種分析。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，"制劑"包括但不限于生物或化學(xué)化合物如簡(jiǎn)單的或復(fù)雜的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)或低聚核苷酸?？梢院铣纱罅康幕衔?，例如，低聚體如寡肽和寡核苷酸，和基于各種核心結(jié)構(gòu)的合成有機(jī)化合物也包括在術(shù)語(yǔ)"制劑"中。此外，各種天然來(lái)源也能為篩選提供化合物，如植物或動(dòng)物提取物，等等。應(yīng)該可以理解的是，盡管沒(méi)有總是詳細(xì)說(shuō)明，但是所述制劑可以單獨(dú)使用或與其它用本發(fā)明篩選確定的具有相同或不同生物活性的制劑一起使用。這些制劑和方法也可與其它治療結(jié)合使用。它們可以同時(shí)給藥或順序給藥。所述篩選在動(dòng)物如大鼠或小鼠中的應(yīng)用，該方法提供了一種方便的動(dòng)物模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在治療劑臨床實(shí)驗(yàn)前使用或者用于先導(dǎo)物優(yōu)化。在這個(gè)系統(tǒng)中，如果基因表達(dá)與未經(jīng)處理的具有病理細(xì)胞的動(dòng)物相比恢復(fù)到正常水平或與含有TGF-a基因差異表達(dá)的細(xì)胞的存在相關(guān)的癥狀得到改善，則該候選藥物是具有潛力的藥物，可能適合進(jìn)一步開發(fā)。在該篩選中使用單獨(dú)的健康的和未經(jīng)處理的細(xì)胞或動(dòng)物的陰性對(duì)照組也是有用的，可以提供另一個(gè)比較基準(zhǔn)。己經(jīng)描述了許多具有非常類似人PKD(如，囊腫的形態(tài)學(xué)、囊腫位置、疾病進(jìn)展)的突變型的多囊腎疾病的(PKD)鼠類模型。例如，參見GretaN.等人(1996)Nephrol.Dial.Transplant11:46-51;SchierenG.等人(1996)Nephrol.Dial.Transplant11:38-45;Guay-WoodfordL.(2003)Am.J.RenalPhysiol.285:F1034-F1049。這些PKD鼠類模型包括，但不局限于下面描述的那些。先天多囊腎小鼠(cpk)是自發(fā)突變中首次被描述的模型。PremingerG等人(1982)J.Urol.127:556-560;FryJ.等人(1985)J.Urol.134:828-833。突變誘發(fā)了巨大的腎囊腫疾病以及進(jìn)行性腎功能不全，其模式非常類似人ARPKD。幼年囊腫腎小鼠(jck)突變發(fā)生在具有MMTV/c-myc轉(zhuǎn)基因的小鼠系。AtalaA.等人(1993)KidneyInt.43:1081-1085。在感染的小鼠中，病灶腎囊腫最早在生后3天明顯，腎囊腫疾病進(jìn)展很慢。多囊腫腎疾病(pcy)突變首先發(fā)生在糖尿病易感KK小鼠株。TakahashiH.等人(1986)J.Urol.135:1280-1283;TakahashiH.等人(1991)J.Am.Soc.Nephral.1:980-989。在腎囊腫位置和緩慢的疾病進(jìn)展方面表現(xiàn)型類似人的ADPKD。突變?cè)谏?周誘發(fā)腎增大，生后18周發(fā)生進(jìn)展的氮血癥和間質(zhì)纖維化。-由于腎衰而導(dǎo)致的死亡發(fā)生在出生后30-36周。Han:SPRD大鼠已被很詳細(xì)的描述并作為ADPKD模型被廣泛研究。CowleyB.等人(1993)KidneyInt.49:522-534;GretzN.等人(1996)Nephrol.Dial.Transplant11:46畫51;Kaspareit國(guó)RittinghausenJ.等人(19卯)Transpl.Proc.22:2582畫2583;SchaferK.等人(1994)KidneyInt.46:134-152。突變?cè)赟prague-Dawley系中自發(fā)產(chǎn)生，早期分析表明其作為常染色體顯性遺傳。在雜合子中，腎囊腫損傷在生后前幾周內(nèi)明顯，主要涉及近端小管，且進(jìn)展緩慢。在疾病表現(xiàn)中具有性別二態(tài)性。腎增大和囊腫改變?cè)谛坌噪s合子中比同齡的雌性雜合子中發(fā)展更快。CowleyB.等人(1997)Am.J.KidneyDis.29:265-272;GretzN.等人(1995)KidneyInt.48:496-500。診斷和治療性抗體組合物本發(fā)明也提供了一種能專一性地與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽形成復(fù)合體的抗體，其可用于本發(fā)明的診斷和治療方法中。術(shù)語(yǔ)"抗體"包括多克隆抗體和單克隆抗體及它們的衍生物(如上所述)?？贵w包括但不限于小鼠、大鼠、兔或人抗體?？贵w可以在細(xì)胞培養(yǎng)物、噬菌體或各種動(dòng)物中產(chǎn)生，所述動(dòng)物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴子、黑猩猩、猿等等。該抗體還可用于識(shí)別和純化治療性和域診斷用多肽。制備多克隆抗體和單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)室方法，和推導(dǎo)出它們相應(yīng)的核酸序列的方法是本領(lǐng)域已知的，見上述Harlow和Lane(1988)和(1999)和上述Sambrook等，(1989)。本發(fā)明的單克隆抗體可以通過(guò)將蛋白質(zhì)或其片段引入到動(dòng)物(如小鼠或兔)體內(nèi)進(jìn)行生物性生產(chǎn)。將在動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)抗體的細(xì)胞分離出來(lái)，并與骨髓瘤細(xì)胞或異骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。為了進(jìn)行說(shuō)明，抗TGF-ci抗體是可以購(gòu)得的，結(jié)合已知的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以生成和篩選本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞和具有結(jié)合TGF-a或其受體能力的抗體。如果經(jīng)測(cè)試的單克隆抗體與蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合，則該經(jīng)測(cè)試的抗體和本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞提供的抗體是等價(jià)的。也可以不進(jìn)行過(guò)多實(shí)驗(yàn)就確定一個(gè)抗體是否與本發(fā)明的單克隆抗體具有相同的專一性，方式是通過(guò)確定經(jīng)測(cè)試的抗體是否阻止本發(fā)明單克隆抗體與蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合(通常，所述的單克隆抗體對(duì)蛋白質(zhì)和多肽是有反應(yīng)的)。如果進(jìn)行測(cè)試的抗體與本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)(表現(xiàn)為本發(fā)明的單克隆抗體的結(jié)合降低)，則說(shuō)明可能兩種抗體結(jié)合到相同的或非常相似的表位上。或者，人們可以預(yù)先將本發(fā)明的單克隆抗體與通常該抗體會(huì)對(duì)其有反應(yīng)的蛋白質(zhì)一起，并確定進(jìn)行測(cè)試的單克隆抗體與抗原結(jié)合的能力是否受收到抑制。如果進(jìn)行測(cè)試的單克隆抗受到抑制，則非常有可能的是，該抗體與本發(fā)明的單克隆抗體具有相同或非常相關(guān)的表位專一性。術(shù)語(yǔ)"抗體"也包括所有同型抗體。單克隆抗體特定的同型可以直接通過(guò)從起始融合中選擇進(jìn)行制備，或其次，從分泌不同同型單克隆抗體的親本雜交瘤通過(guò)使用同系選擇技術(shù)(sibselectiontechnique)來(lái)分離類別轉(zhuǎn)換變體(classswitchvariants),使用Steplewski，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(l985)82:8653或Spira等，J.Immunol.Methods(1984)74:307中描述的方法。本發(fā)明還提供了上述多克隆和單克隆抗體的生物活性片段。這些"抗體片段"保留了某些選擇性地與其抗原或免疫抗原結(jié)合的能力。這樣的抗體片段包括但不限于Fab;Fab';F(ab')2;Fv，和SCA。"生物活性抗體片段"的具體例子是抗體的CDR區(qū)。制備這些片段的方法是本領(lǐng)域已知的，見例如，上述Harlow和上述的Lane(1988)和(1999)。本發(fā)明的抗體可以經(jīng)修飾后產(chǎn)生嵌合抗體和人化抗體。Oi，等，BioTechniques(1986)4(3):214。嵌合抗體是那些其中抗體的各種重和輕鏈結(jié)構(gòu)域是由來(lái)自一種以上種類的DNA編碼的。能分泌具有本發(fā)明單克隆抗體專一性的單克隆抗體的其它雜交瘤細(xì)胞的分離也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體來(lái)完成。Herlyn，等，Science(1986)232:100?？躬?dú)特型抗體是能識(shí)別存在在單克隆抗體(由感興趣的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生)上的唯一決定簇的抗體。兩個(gè)雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體之間的獨(dú)特性識(shí)別說(shuō)明兩個(gè)單克隆抗體在對(duì)相同的表位決定簇識(shí)別方面是一樣的。因此，通過(guò)使用針對(duì)存在在單克隆抗體上的表位決定簇抗體就可以識(shí)別其它表達(dá)具有相同表位專一性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。也可以使用抗獨(dú)特型抗體技術(shù)生產(chǎn)能模擬表位的單克隆抗體。例如，針對(duì)第一個(gè)單克隆抗體制備的抗獨(dú)特型單克隆抗體將在高變區(qū)具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該高變區(qū)是由第一個(gè)單克隆抗體結(jié)合的表位的鏡像。這樣，在這種情況下，所述抗獨(dú)特型單克隆抗體可以用于免疫作用以生產(chǎn)這些抗體。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"表位"包括對(duì)本發(fā)明的單克隆抗體具有專一親和力的任何決定簇。表位決定簇通常由分子如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成，并通常具有專門的三維結(jié)構(gòu)特征，和專門的電荷特征。本發(fā)明的抗體可以連接到可檢測(cè)的制劑或標(biāo)記上。有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同的標(biāo)記和標(biāo)記方法。將抗體結(jié)合到小分子量的半抗原上會(huì)增加分析的敏感度。然后，通過(guò)另一個(gè)反應(yīng)對(duì)所述半抗原進(jìn)行專一性檢測(cè)。例如，通常使用半抗原如生物素，其會(huì)與抗生物素蛋白反應(yīng)，或者二硝基苯酚、吡咳醛和熒光素，它們會(huì)與專門的抗半抗原抗體反應(yīng)。見上述Harlow和上述的Lane(1988)和(1999)。本發(fā)明的抗體也可與許多不同的載體結(jié)合。因此，本發(fā)明還提供組合物，該組合物含有所述抗體和另一種活性或惰性物質(zhì)。已知的載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵石。這些載體的性質(zhì)可以是可溶的或不可溶的，根據(jù)發(fā)明的目的決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解用于結(jié)合單克隆抗體的其它合適的載體，或能夠根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判斷。含有抗體、其片段或產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞系的組合物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)這些組合物用于藥物用途時(shí)，它們也可以與藥學(xué)可接受的載體結(jié)合。下面實(shí)施例用于解釋而不是限制本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)方法1.EGFR被過(guò)度表達(dá)并錯(cuò)定位至在jck小鼠腎和cpk小鼠腎的囊腫上皮的頂膜。A.免疫組化分析jck(50天)或cpk(10天)45^多聚甲醛/PBS固定/石蠟包埋小鼠腎切片(5iim)在100%二甲苯溶液中孵育5分鐘，兩次，在100%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在95%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在80%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在蒸餾水中孵育5分鐘，兩次，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中孵育5分鐘，兩次。在含有3%(重量/體積)牛血清白蛋白(PBS/BSA)的PBS中封閉(block)30分鐘。根據(jù)廠家推薦，在室溫下在胰蛋白酶溶液(Sigma/Aldrich，StLouis，MO)將切片孵育30分鐘，暴露抗原，隨后將每片切片在5PBS中清洗5分鐘。將兔抗EGFR(CellSignaling,Beverly,MA)在12.5ug/mlPBS/BSA中在室溫下孵育2小時(shí)，隨后用5PBS清洗5分鐘。將抗-兔Cy3抗體(Sigma/Aldrich)在1:100稀釋度(vol/vol)的PBS/BSA中孵育1小時(shí)，隨后用5PBS清洗5分鐘。B.WestemBlot分析使用組織均質(zhì)化儀器，將來(lái)自于野生型、jck(20和50天)或cpk(20天)(小鼠來(lái)自于JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)在冰上在7倍體積的含有250mM的蔗糖、lmMPMSF和完全的蛋白酶抑制劑混合物(Roche,Basel,Switzerland)的pH7.4的lOmM的Hepes緩沖液中均質(zhì)化。1000g離心后除去大的細(xì)胞碎片。用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce,Rockford，IL)測(cè)量蛋白濃度。使用SDS-PAGE(3-12%梯度)分離蛋白(lOOug)，并根據(jù)Sambrook等人，1989中的描述在20mMTris、150mM甘氮酸和20%甲醇中用2小時(shí)將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至ImmobilonP膜上(Millipore，Bedford,MA)。在封閉緩沖液(含有0.05%Tween20/5。/。無(wú)脂干奶的Tris鹽緩沖液(TBS))中，在室溫下將膜飽和2小時(shí)，而后，用山羊抗EGFR抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)在室溫下在封閉緩沖液中標(biāo)記2小時(shí)。然后在含有0.05%Tween20(TBS-T)的TBS中清洗膜。將驢抗山羊辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)抗體(SantaCruzBiotechnology)以1:10000的稀釋度在封閉緩沖液中在室溫下孵育1小時(shí)，隨后在TBS-T中清洗3次。使用增強(qiáng)的化學(xué)熒光(Amersham/PharmaciaBiotech,LittleChalfontBuckinghamshire,England)檢測(cè)免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。II.在jck囊腫上皮和cpk囊腫上皮中表達(dá)TGF-a免疫組化分析jck(50天)或cpk(10天)4X多聚甲醛/PBS固定/石蠟包埋小鼠腎切片(5um)在100%二甲苯溶液中孵育5分鐘，兩次，在100%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在95%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在80%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在蒸餾水中孵育5分鐘，兩次，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中孵育5分鐘，兩次。在含有3。Z(重量/體積)牛血清白蛋白(PBS/BSA)的PBS中阻斷30分鐘。根據(jù)廠家推薦，在室溫下在胰蛋白酶溶液(Sigma/Aldrich,StLouis，MO)將切片孵育30分鐘，暴露抗原，隨后將每片切片在5PBS中清洗5分鐘。將小鼠抗TGF-a(Calbiochem，SanDiego，CA)在5ug/mlPBS/BSA中在室溫下孵育2小時(shí)，隨后用5PBS清洗5分鐘。將抗小鼠FITC抗體(Sigma/Aldrich)在1:100稀釋度(vol/vol)的PBS/BSA中孵育1小時(shí)，隨后用5PBS清洗5分鐘。HI.在jck和pcy小鼠的囊腫液中分泌TGF-a收集50天的jck小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)和100天的pcy小鼠(V.H.GattoneII,Ph.D.，IndianaUniversitySchoolofMedicine)的被C02窒息處死的動(dòng)物的腎，并快速切碎以收集囊腫液。通過(guò)200g離心除去細(xì)胞碎片。用心內(nèi)穿剌法收集血液，根據(jù)廠家推薦(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)使用BDMicrotainer^血清分類管離心分離血清。根據(jù)廠家推薦(R&DSystems,Minneapolis,MN)使用抗TGF-a捕獲和檢測(cè)抗體通過(guò)ELISA測(cè)定在血清中和囊腫液中的TGF-a濃度。IV.抗-TGF-a抗體在體外抑制囊腫形成使用三維MDCK(Madin-Darbycaninekidney)細(xì)胞培養(yǎng)分析檢測(cè)抗-TGF-a阻斷的抗體。MDCK細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清、100U/ml的青霉素、10ug/ml鏈霉素和ImM的丙酮酸納(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA)的高葡萄糖Dulbecco，sModifiedEagleMedium(DMEM)中生長(zhǎng)。用Hanks'緩沖液沖洗亞融合的MDCK細(xì)胞單層兩次，并用含有0.25X胰蛋白酶/lmMEDTA(Gibcol/Invitrogen)的Hanks'緩沖液分離。將細(xì)胞以4X1(T個(gè)細(xì)胞/ml的密度分散于膠原質(zhì)凝膠溶液(補(bǔ)充有10%胎牛血清、100U/ml的青霉素、10ng/ml鏈霉素和ImM的丙酮酸納、2.8mM的Na0H、1.34mg/mlNaHC03和0.84mg/ml膠原質(zhì)的高葡萄糖DMEM)中，并覆蓋在無(wú)細(xì)胞的硬性膠原質(zhì)凝膠溶液頂部。10分鐘后在37-C下為使細(xì)胞/膠原質(zhì)混合物變硬，加入MDCK培養(yǎng)基。在加入多克隆中和抗TGF-ct抗體前，允許囊腫形成72小時(shí)。在不同濃度下以2倍稀釋的增幅在MDCK生長(zhǎng)培養(yǎng)基中從100ug至0.1lig/ml檢測(cè)多克隆中和抗TGF-ct抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN)。V.抗TGF-ci抗體在Han:SPRD(cy/+)大鼠中抑制囊腫生成A)早期處理(媒介、低劑量、高劑量)對(duì)新生(最大l周)Han:SPRD大鼠(B.Cowley,M.D.UniversityofKansas)腹腔注射低劑量抗TGF-a抗體(0.5mg/kg)、高劑量抗TGF-a抗體(5mg/kg)或無(wú)關(guān)的抗體媒介，每周2次。3周齡后，將動(dòng)物分性別，稱重，然后麻醉。測(cè)量血清肌氨酸酐水平。除去腎臟并進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。移除肝臟，稱重，粗測(cè)囊腫表達(dá)，而后定表現(xiàn)型。處理A結(jié)果對(duì)照(野生型)雄性接受低劑量抗體治療的大鼠身體重生長(zhǎng)比接受高劑量或媒介治療的大鼠高。腎的尺寸也增加，低劑量組中的腎重量明顯超過(guò)高劑量組。腎體重的比率在這些組中并無(wú)明顯不同，盡管在高劑量組中有低的腎體重比率的傾向。血清肌氨酸酐水平不受低劑量抗體的影響，但在接受高劑量治療的組中增加。對(duì)照(野生型)雌性在身體或腎尺寸，或血清肌氨酸酐方面各組間無(wú)差別。雜合子(cy/+)雄性與高劑量組和媒介組相比，低劑量抗體組的身體重量增加。低劑量組中的總腎重量增加，盡管在一定程度上與體重增加成比例。與低劑量組相比，高劑量抗體組的身體重量、腎重量和腎身體重量比率降低。各組中的血清肌氨酸酐無(wú)差別。雜合子(cy/+)雌性在低劑量組中身體和腎重量增加，但這種改變成比例所以腎身體重量沒(méi)有變化。各組的血清肌氨酸酐無(wú)差別。與低劑量組相比，高劑量抗體組的腎和身體重量降低，但腎身體重量比例和血清肌氨酸酐相似。純合子(cy/cy)雄性和雌性表現(xiàn)出非常增大的腎，以及腎身體重量比例，和明顯增加的血清肌氨酸酐。各組間無(wú)顯著差別。B)進(jìn)一步分析處理起始天(1天及7天)的早期處理A(以上)結(jié)果的再分析處理B結(jié)果雜合子(cy/+)雄性開始于第7天的低劑量治療導(dǎo)致了身體和腎的生長(zhǎng)，盡管血清肌氨酸酐不受影響。這些效果在從生后1天的處理大鼠中看不到。開始于生后7天的高劑量組，對(duì)身體或腎的尺寸沒(méi)有顯著影響。與媒介處理的大鼠相比，具有低的血清肌氨酸酐的趨勢(shì)。無(wú)論是開始于生后1天或7天，高劑量抗體組的囊腫重量顯著降低。雜合子(cy/+)雌性無(wú)論處理開始于生后1天或7天，低劑量與大的身體和腎尺寸相關(guān)，但在腎身體重量比例上沒(méi)有變化。開始于生后7天的高劑量處理增加了腎尺寸，而開始于生后1天的沒(méi)有，腎身體重量比例沒(méi)有變化。在生后1天接受髙劑量處理的大鼠與生后7天開始接受這些處理的大鼠相比，總腎重量顯著降低，但腎身體重量比例沒(méi)有變化。在所有組中，血清肌氨酸酐值相似。在生后7天開始的高劑量抗體顯著降低囊腫重量，甚至比開始于生后1天的更有效。C)后期處理(媒介、低劑量、高劑量)向3周齡的雄性雜合(cy/+)Han:SPRD大鼠腹腔注射低劑量抗TGF-ct抗體(0.5mg/kg)、高劑量抗TGF-a抗體(5mg/kg)或不相關(guān)抗體媒介，每周2次。在第6周齡，清醒測(cè)量所有大鼠的收縮血壓、尾巴血血清肌氨酸酐水平。收集24小時(shí)尿測(cè)量蛋白和肌氨酸酐(用于計(jì)算肌氨酸酐清除)。用3%水楊磺酸沉淀尿蛋白并測(cè)量。用分光譜測(cè)量肌氨酸酐。在10周齡，重復(fù)測(cè)量血壓和代謝籠收集物(metaboliccagecollections)。然后將大鼠稱重、麻醉。取出腎、稱重、并進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。取出肝，粗略檢測(cè)囊腫表達(dá)，然后定基因型。處理C結(jié)果在所有組中，身體重量隨時(shí)間的增加相似。在所有組中，收縮血壓有增高的趨勢(shì)，但僅在低劑量組中顯著增加。蛋白尿在所有組中適度并相同的增加。肌氨酸酐清除值僅在接受媒介的組中顯著增加。在研究最后，三組表現(xiàn)相同的身體重量、腎重量、腎身體重量比例、收縮血壓、肌氨酸酐清除和蛋白尿。可以理解的是，盡管本發(fā)明結(jié)合上述實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明，但是前述說(shuō)明和實(shí)施例僅用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)點(diǎn)及改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，本發(fā)明也涉及這些內(nèi)容。表1.SAGE庫(kù)的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>5-細(xì)胞骨架<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>6-細(xì)胞外基質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>7-蛋白酶<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>8-離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>9-其它<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表6CL中其余的上調(diào)5倍的基因Tag序列AAACATCCTAAAGGGCGCGGACAGCGCTGAACAGTGCTTGACATTTCCAAACCCCTAACAACCCGATGGCACTGTGGCGGACTTTCCAAAAGAAGACAGAAGCACGACCCAGCAGTCCCCAGGCATTGAAAGGCCTTGGTATCTTGAAAGATGGTGGGGGCAAGACGGTCCACTACTTCACL單基因(Unigene)簇中的上調(diào)基因無(wú)相配標(biāo)記膜聯(lián)蛋白A3Hs.442733主要組織相容復(fù)合物II型，DRbeta3Hs.308026蛋白磷酸酶2(以前的2A)催化亞單位，0異構(gòu)Hs.80350公認(rèn)的淋巴細(xì)胞G0/G1轉(zhuǎn)化基因Hs.432132無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記食道特異的正常粘膜lHs.112242無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記聯(lián)腦蛋白1HS.89434無(wú)相配標(biāo)記核轉(zhuǎn)移因子2HS.356630CMP-NeuAC:(e)-N-半乳糖乙酰基(a)2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶VI成員Hs.109672類核小體組裝蛋白11Hs.419776鋅指蛋白36，C3H型，同源(小鼠)Hs.343586無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記CAGGCTCCTG原纖維蛋白2(先天性攣縮性細(xì)長(zhǎng)指(趾))Hs.79432假定蛋白LOC283680Hs.356494層粘連蛋白，P3HS.436983羥基類固醇(17-e)脫氫酶2Hs.155109膜相關(guān)蛋白17HS.431099細(xì)胞球蛋白Hs.95120序列相似性20的家族，膜CHs.134742villin2(埃茲蛋白)Hs.403997PNAS-123Hs.40092無(wú)相配標(biāo)記RhoGDP分離抑制子(GDI)PHS.292738CCAAGGGTCCCCATTGAAACCCCAGAGCTCCCGGCCCTACCCTGGGTCTCCGCCCGTCGTCGGAACACCGCTAATGCAAACTCCCCAGGCCTGGCCCGAGCTGGCGCGAGCTGTGAGACCCTGTGCCAATCTTCTGCTGGGACCTGCGGCGAGCTTTTGAGAGGCAGCTGGAGGCCTCAGGATGCGAGGAGCAGTTCTGAGCCCCTCAGCGGAAGGCCCCGGATCCCAACGGATTTCATCGGCGCCGGGGGCGGGACCAGGGGAAGCGAGGGGGCGCCRhoGDP分;l制子(GDI)13HS.292738IgG的Fc片段，受體，運(yùn)送子，aHs.111903接頭相關(guān)蛋白復(fù)合物2，P1亞單位，Hs.370123脫氫酶/還原酶(SDR家族)成員3HS.17144ARP1激動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1同源物A，中心體肌動(dòng)蛋白a(酵母)Hs.153961假定的蛋白FLJ13081HS.180638類鳥嘌吟核苷酸結(jié)合蛋白1Hs.83147泛素結(jié)合酶E2R2.Hs.11184sema結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(lg)，短基結(jié)構(gòu)域，分泌的，(信號(hào)素)3FHs.32981II型主要組織相容復(fù)合物，DR!33Hs.308026泛素結(jié)合酶E2R2.HS.11184無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記睪丸特異的轉(zhuǎn)錄因子，丫-連接Hs.412918激酶(PRKA)瞄定蛋白(gravin)12Hs.197081無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記溶解載體家族25(線粒體載體；腺苷酸GGTGACCACCGTACCTGTAGGTCGAAGGACGTCTGGGGGAGTCTTAAAGTGTGCGAAGGAGTGGAGGTGGGTGGCTTCATGTTGGGAAGAGTTTCAGGAGTAGGAAACACTAGTTGTAGGTATGAATACTTCATTCATCTTCCGCTTCGGTCGCTTGCTTTCTGGCAGTATGCCCTCAGATGGCTTGCTCTGGTGTATGCTGTATGCCGTTTCAGTGCCCTTGCTGCCAGTTGGGGGTT酪〗TTGTGTTGAG移位子)，成員6Hs.350927人cDNA:FLJ21545fis，克隆COL06195Hs.83623無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記單甘油酯脂酶Hs.409826過(guò)氧岐化酶2，線粒體Hs.384944無(wú)相配標(biāo)記含有1的葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域Hs.511400含3的Rho相關(guān)的BTB結(jié)構(gòu)域Hs.31653前列腺的六個(gè)跨膜抗原Hs.61635l酸蛋白磷酸酶，非受體型底物1Hs.156"4DEAD(Asp-Glu-Ala—Asp)盒多肽42Hs.8765假定的蛋白CL25022Hs.5324軟骨素硫酸鹽蛋白多糖2(versican)Hs.434488人cDNAFU44489fis，克隆UTERU2035114Hs.307962無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記karyopherin(importin)]33Hs."3503lipocalin2(致癌基因24p3)Hs.204238順鉑抗性相關(guān)過(guò)度表達(dá)蛋白Hs.130293無(wú)相配標(biāo)記類核因子(紅細(xì)胞衍生的2)1Hs.83469葡萄糖6磷酸酶催化亞單位3Hs.294005脂多糖誘導(dǎo)的具錨蛋白(ankyrin)重復(fù)的分子(MAIL),小鼠同源Hs.390476與蛋白sp:P02794(人)FRIH—HUMAN鐵蛋重鏈非常類似的人轉(zhuǎn)錄序列(鐵蛋白H亞單位Hs.446345無(wú)相配標(biāo)記CCCTCCTGGGGCACTGAATAGGAGTGTGCGGTGCCGGAGGCATTTGTAATACTTTCCAAAGCAATACCCCGCCCTTTCTCGTCTTAAAGTTATGAATGCTTGGATATCAGGAAAAATGGGGAAAAGTTTCGTACGGAGATGTGTCAGATATATGTGCCACGCTTGCAAAACACGCGATAGCCTCAGCCTGGGGATTAAAGGTAAGTGTACTACCGCCCGTTCACCGGTCATCTGTCAAGAAAAGTTCGTAACCAGCCAGA染色體9開放閱讀框16Hs.409585淀粉樣蛋白P(A4)類前體蛋白2Hs.279518離子鈣結(jié)合配體分子2Hs.4944無(wú)相配標(biāo)記與蛋白ref:NP—060312.1假定的蛋白FLJ20489稍類似的人轉(zhuǎn)錄序列Hs.467256無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記甘露糖受體，C型2Hs.7835過(guò)氧化岐化酶2，線粒體Hs.384944軟骨素硫酸鹽蛋白多糖2多功能蛋白聚糖(versican)Hs.434488daudin1Hs.7327過(guò)氧化岐化酶2，線粒體Hs.384944趨化因子(C-X-C基序)配體5Hs.89714血管細(xì)胞粘附分子1Hs.109225纖維連接蛋白1Hs.418138上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2癌基因Hs.293257過(guò)氧化岐化酶2，線粒體Hs.384944無(wú)相配標(biāo)記無(wú)相配標(biāo)記黑素瘤細(xì)胞黏附分子Hs.511397無(wú)相配標(biāo)記染色體7開放閱讀框21Hs.238513(肌動(dòng)蛋白)凝溶膠蛋白(gelsolin)(淀粉樣變性病，芬蘭型)Hs.446537ATP合成酶，H+轉(zhuǎn)運(yùn)，線粒體F1復(fù)合物，〇亞單位(寡霉素敏感比照(conferring)蛋白質(zhì))Hs.409140destrin(激動(dòng)蛋白解聚因子)Hs.408576無(wú)相配標(biāo)記AGTAGGTGGCCAGTCTGTGACCTGCCCCGCCTGGTGGGCCGAGCAAATCTGAGTCATTGAGTCGGAGGACGTGCTATTCTTCTGTTCTGGTTGGGGGTTTTTTGAAATGATTTGCTGTAGAATGC丁TGATACAAATCCTTACGGAAAGGAAGAGGTGTAGCAAAGCAACGCACACCCCTGCCACTCCTCCCCAGGGGAGACCTAATGTGTCTAAGACTTTC丁GATGCCCAGAAAGAGCTGGAAGAACAAG無(wú)相配標(biāo)記令丑蛋白Hs.75350溶解載體家族34(磷酸納)，成員2Hs.441716碳酸酐酶XIIHs.279916無(wú)相配標(biāo)記人cDNAFLJ37644fis，克隆BRHIP2000239.Hs掘582無(wú)相配標(biāo)記B7同源3Hs.77873細(xì)胞分裂周期34Hs.423615與蛋白sp:P02794(人)FRIH—HUMAN鐵蛋白重鏈非常類似的人轉(zhuǎn)錄序列(鐵蛋白H亞單位)Hs.446345亞精胺/精胺N1-?；D(zhuǎn)移酶Hs.28491腫瘤壞死因子(配體)超家族，成員10Hs.387871視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白7Hs.406078FK506結(jié)合蛋白1A，12kDaHs.374638纖維蛋白原，B3多肽Hs.300774無(wú)相配標(biāo)記絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑，cladeE(連接蛋白(nexin)，纖溶酶原激活物抑制劑1型)成員2Hs.21858孕酮受體成員成分1Hs.90061細(xì)胞死亡防御劑1Hs.8289Q干擾素，a誘導(dǎo)蛋白27Hs.278613IaminB2Hs.76084無(wú)相配標(biāo)記KIAA0063基因產(chǎn)物Hs.3094H2A組蛋白家族，成員XHs.147097亞精胺/精胺N1-?；D(zhuǎn)移酶Hs.28491GAGAAGGGCAGCCGAGCCAGGGCCGAGGAATCGCTGCTTTTGCCCTCAGA丁GGCCCGACGTTGACTCCGAAGGTGGCAAGCGCCCGTCGTHs,134742GACCCCTGTCGCGATTCCGGAAGAGGCAAGAAGCCAG丁TTACGATTGATGACTTATTATGACTTGCGCTAAGATCTCGTTATCACTTGGGATGAGTGATAATGCCCAATGCCGGGCGCGCCTACCAAGCCCTCTGGAGGCCTGAGGAAT鞘氨醇激酶1Hs.68061無(wú)相配標(biāo)記原纖維蛋白1(Marfan綜合病癥)Hs.750無(wú)相配標(biāo)記lipocalin2(癌基因24p3)Hs.204238nudix(核苷酸二磷酸連接部分X)型基序1Hs.413078TEA結(jié)構(gòu)域家族成員1(SV40轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子)Hs.153408人轉(zhuǎn)錄序列Hs.526560具有序列相似性20的家族，成員C跨膜運(yùn)輸?shù)鞍譎s.74137CTD(碳端結(jié)構(gòu)域，RNA聚合酶II，多肽A)小磷酸酶1Hs.444468無(wú)相配標(biāo)記腫瘤壞死因子(配體)超家族，成員10Hs.387871載脂蛋白A-I結(jié)合蛋白Hs.446535核心蛋白聚糖Hs.156316無(wú)相配標(biāo)記POU結(jié)構(gòu)域，族3，轉(zhuǎn)錄因子3Hs.248158染色體3開框區(qū)6HS.55098假定的蛋白FLJ12448Hs.432996類核因子(紅細(xì)胞衍生的2)2HS.155396酪氨酸3-單氧化酶/色氨酸5-單氧化酶激活蛋白，theta多肽Hs.74405無(wú)相配標(biāo)記P450(細(xì)胞色素)氧化還原酶Hs.354056脂多糖誘導(dǎo)的具錨蛋白重復(fù)的分子(MAIL),小鼠同源Hs.390476CGACCCCACGCGCGGCGGCCGGCTAGGAACTACTTTTAGCTCATAAGGGGGCCCAGCGGTCGAAGGACGTTTCTCTGGTAGCAGCAATTCAATCAAGATCTGCAAATTTGTGACCTCTTTGATTGCGATTGGGGCTTC載脂蛋白EHs.110675C1q相關(guān)因子Hs.134012人cDNA克隆MGC:16614IMAGE:4111344，完整的cdsHs.406882KIAA1363蛋白Hs.22941無(wú)相配標(biāo)記高爾基體(Agolgi)相關(guān)，含Y銜接蛋白耳結(jié)構(gòu)(gammaadaptinearcontaining)的ARF結(jié)合蛋白1HS.405689無(wú)相配標(biāo)記假定的蛋白MGC14288Hs.388645溶解的載體家族39(鋅運(yùn)載體)，成員8Hs.284205酪氨酸3-單氧化酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白，eta多肽Hs.226755微管蛋白PMGC4083Hs.274398長(zhǎng)祐基磷酸甘露糖基轉(zhuǎn)移酶-多肽2，調(diào)節(jié)亞單位Hs.108973與蛋白ref:NP_055131.1稍微相似的人轉(zhuǎn)錄序歹ij，鈣調(diào)熱穩(wěn)定蛋白(24kDa)Hs.513334促進(jìn)細(xì)胞分裂后期復(fù)合物亞單位7Hs.27084權(quán)利要求1.在適當(dāng)?shù)慕M織中抑制囊腫疾病或異常的方法，該方法通過(guò)使組織與有效量的調(diào)節(jié)表2-6中的基因或多聚核苷酸的生物活性的試劑接觸，從而抑制囊腫異常。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該適當(dāng)?shù)慕M織選自管狀腎組織、肝組織或胰腺組織。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該適當(dāng)?shù)慕M織從患ADPKD的受試者中分離。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中該調(diào)節(jié)試劑是調(diào)節(jié)表2-6中列出的多聚核苷酸或基因的活性或表達(dá)的多聚核苷酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中該試劑是特異性結(jié)合基因或多聚核苷酸表達(dá)產(chǎn)物的抗體或配體。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中該試劑選自反義多聚核苷酸、核酶或多價(jià)RNA核酸適體。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中該試劑是抗體或抗體衍生物。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中該試劑是多克隆抗體或單克隆抗體。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中該抗體衍生物選自抗體片段、人源抗體或嵌合型抗體。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該試劑是調(diào)節(jié)、阻斷或增強(qiáng)該基因或多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后修飾的小分子。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該試劑是調(diào)節(jié)該多聚核苷酸或基因表達(dá)產(chǎn)物的前體的活性的小分子。12.抑制受試者中多發(fā)囊腫損傷的形成的方法，包括向受試者投遞有效劑量的調(diào)節(jié)表2-6中列出的基因的生物活性的試劑，從而抑制多發(fā)囊腫損傷的形成。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該調(diào)節(jié)試劑是抑制或增強(qiáng)TGF-ct多聚核苷酸的活性或表達(dá)的多聚核苷酸。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該試劑是特異性結(jié)合該棊因或該多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物的抗體或配體。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該試劑逸自反義多聚核苷酸、核酶或多價(jià)RNA核酸適體。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該試劑是抗體或抗體衍生物。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該試劑是多克隆抗體或單克隆抗體。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中該抗體衍生物選自抗體片段、人源抗體或嵌合型抗體。19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該試劑是調(diào)節(jié)、阻斷或增強(qiáng)表2-6中列出的多聚核苷酸或基因的翻譯后修飾的小分子。20.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該試劑是調(diào)節(jié)表2-6列出的該多聚核苷酸或基因的表達(dá)產(chǎn)物的前體活性的分子。21.預(yù)防或治療適當(dāng)?shù)氖茉囌叩某Ｈ旧w顯性多囊腎疾病(ADPKD)的方法，包括向需要的受試者投遞有效量的調(diào)節(jié)表2-6中列出的基因或其表達(dá)產(chǎn)物的多囊性生物活性的分離的分子。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中該分離的分子是調(diào)節(jié)TGF-d多聚核苷酸的活性或表達(dá)的多聚核苷酸。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中該分子是特異性結(jié)合該基因或該多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物的抗體。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中分子選自反義多聚核苷酸、小分子、核酶或多價(jià)RNA核酸適體。25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中該分子是抗體或抗體衍生物。26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中該試劑是多克隆抗體或單克隆抗體。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中該抗體衍生物是選自抗體片段、人源抗體或嵌合型抗體、28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中該分子是調(diào)節(jié)、抑制或增強(qiáng)表2-6中列出的基因或多聚核苷酸或基因的表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后修飾的小分子。29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中該分子是調(diào)節(jié)表2-6中列出的多聚核苷酸或基因的表達(dá)產(chǎn)物的前體的活性的分子。全文摘要本發(fā)明涉及通過(guò)抑制目前與多囊病表現(xiàn)相關(guān)的基因來(lái)診斷和治療該疾病的組合物和方法。僅作為舉例說(shuō)明，組織生長(zhǎng)因子α基因(TGF-α)即為這樣的基因之一。本發(fā)明還涉及治療或改善異常囊腫機(jī)能障礙和與組織中囊腫形成相關(guān)的疾病的方法和組合物。所述方法和組合物通過(guò)抑制或增加基因表達(dá)或該基因表達(dá)產(chǎn)物或其受體的生物活性來(lái)治療和改善組織中病態(tài)囊腫形成。文檔編號(hào)A61K48/00GK101443046SQ200580027619公開日2009年5月27日申請(qǐng)日期2005年6月23日優(yōu)先權(quán)日2004年6月23日發(fā)明者J·M·麥克弗森,O·別斯克羅夫那婭申請(qǐng)人:建新公司