專利名稱：使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖－3抗體的輔助療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖在癌癥治療之后的輔助療法。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)告，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族是存在于細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的新家族。迄今已報(bào)告有五種磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，磷脂酰肌醇蛋白聚糖2，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖4，和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員。該家族的成員有大小均一(約60kDa)的核心蛋白，共有特異、高度保守的半胱氨酸序列，并通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定結(jié)合到細(xì)胞膜上。
通過對(duì)中樞神經(jīng)發(fā)育中細(xì)胞分裂形態(tài)異常的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)突變體進(jìn)行基因篩選，識(shí)別出Dally(division abnormallydelayed，分裂異常延遲)基因。已經(jīng)顯示出Dally的cDNA展示了開放閱讀框(ORF)，所述閱讀框所編碼的產(chǎn)物顯示出與脊椎動(dòng)物膜整合蛋白聚糖(GRIPs)有序列同源性(24-26％同源)，所述GRIPs具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖的全部特點(diǎn)。其后，這就提示了dally在調(diào)節(jié)dpp(decapentaplegia)受體的機(jī)制中發(fā)揮作用，由此，提示了哺乳動(dòng)物的磷脂酰肌醇蛋白聚糖有可能調(diào)節(jié)TGF和BMP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。即，這提示了磷脂酰肌醇蛋白聚糖可以作為一些肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(如，EGF、PDGF、BMP2、FGFs等)的輔受體行使功能。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3作為發(fā)育調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從大鼠小腸中被分離(Filmus，J.，Church，J.G.，和Buick，R.N.(1988)Mol.Cell.Biol.8，4243-4249)，并在之后被識(shí)別為OCI-5，磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的GPI-結(jié)合型硫酸乙酰肝素蛋白多糖，具有分子量69kDa的核心蛋白(Filmus，J.，Shi，W.，Wong，Z.-M.，和Wong，M.J.(1995)Biochem.J.311，561-565)。在人類中，編碼磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因也從人胃癌細(xì)胞株中被分離，稱為MRX-7(Hermann Lage等，Gene 188(1997)151-156)。已經(jīng)報(bào)告磷脂酰肌醇蛋白聚糖3與胰島素樣生長(zhǎng)因子-2構(gòu)成蛋白-蛋白復(fù)合體，并調(diào)節(jié)該生長(zhǎng)因子的功能(Pilia，G.等，(1996)Nat.Genet.12，241-247)。該報(bào)告提示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3未必通過硫酸乙酰肝素鏈與生長(zhǎng)因子相互作用。
利用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為肝細(xì)胞癌標(biāo)記物的可能性也已有報(bào)告(Hey-Chi Hsu等，Cancer Research 57，5179-5184(1997))，另外還有報(bào)告認(rèn)為抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體對(duì)肝癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，作為抗癌劑是有用的(國際公開WO 03/00883)。
但是，對(duì)于應(yīng)用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為肝癌治療后的輔助療法尚沒有報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)反復(fù)專心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體對(duì)癌癥治療之后的輔助療法有用，遂完成了本發(fā)明。另外，因?yàn)樵诎┌Y治療后觀察不到癌細(xì)胞的階段，給藥抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體能防止癌癥復(fù)發(fā)，因此抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為預(yù)防癌癥的藥物或作為預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的藥物是有用的。


圖1是表示對(duì)肝內(nèi)移植小鼠模型給藥本發(fā)明的抗癌劑后的效果圖。
圖2是表示早期對(duì)肝內(nèi)移植小鼠模型給藥本發(fā)明的抗癌劑后的效果圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑，其特征為在癌癥治療后給藥。癌癥治療后優(yōu)選是指在肝癌治療后，其中肝癌的治療特別是指肝癌細(xì)胞切除術(shù)。本發(fā)明的抗癌劑優(yōu)選應(yīng)用于在切除的肝癌細(xì)胞表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的情況下。并且，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體優(yōu)選是單克隆抗體。
本發(fā)明的抗癌劑在輔助療法中尤為有用。即使在癌癥治療、手術(shù)中認(rèn)為癌細(xì)胞已被摘除或死亡的情況下，仍可能殘留觀察不到的癌細(xì)胞。當(dāng)上述癌細(xì)胞仍殘留時(shí)，一定時(shí)間后，癌癥就可能復(fù)發(fā)，因此癌癥治療后必須進(jìn)行繼續(xù)治療以預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。該治療稱作輔助治法或術(shù)后輔助治法。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，癌癥治療指以抑制癌細(xì)胞增殖或殺滅癌細(xì)胞或減少癌細(xì)胞為目的的任何一種治療，如癌切除術(shù)、用抗癌劑化療、放療、經(jīng)皮乙醇注射療法、經(jīng)皮射頻熱凝療法或經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞療法。本發(fā)明中優(yōu)選的癌癥治療是癌切除術(shù)。“癌癥治療后”是指在已經(jīng)進(jìn)行上述治療后。需要說明的是，“癌癥治療后”在本發(fā)明中未必意味著癌癥已經(jīng)治愈。
本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可以在確認(rèn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是否表達(dá)后，給藥至癌癥治療后的患者?？梢杂萌魏畏椒ù_認(rèn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是否表達(dá)，例如，可以用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體等確認(rèn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白的表達(dá)，也可用PCR等方法確認(rèn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因的表達(dá)。
癌癥治療后可以在任何時(shí)間給藥抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，并且給藥可以在癌癥治療后立即進(jìn)行或間隔一些時(shí)間后進(jìn)行。本發(fā)明中優(yōu)選的給藥時(shí)間是從癌癥治療后直至癌癥復(fù)發(fā)的期間。在術(shù)后輔助療法中，通常在治療后12周內(nèi)或6周內(nèi)開始給藥?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法判斷癌癥是否復(fù)發(fā)，例如，通過視覺所見或病理所見來確認(rèn)腫瘤是否發(fā)生進(jìn)行判斷。腫瘤可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確認(rèn)，如成像法和以AFP等腫瘤標(biāo)記物作為指標(biāo)的方法。
使用本發(fā)明的抗癌劑可以治療癌癥，可列舉如肝癌，肺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，胰腺癌和膽管癌等，任何癌癥都可以。本發(fā)明的抗癌劑特別適合用于治療的癌癥是肝癌細(xì)胞。肝癌可以是原發(fā)或繼發(fā)性的，可舉例是肝細(xì)胞癌，肝內(nèi)膽管癌，膽管囊腺癌，混合型肝癌，肝母細(xì)胞瘤，未分化癌，血管肉瘤，肝平滑肌肉瘤和未分化肉瘤。
應(yīng)用本發(fā)明抗癌劑的輔助療法的實(shí)施方式特別優(yōu)選是，在切除肝癌細(xì)胞后通過給藥抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，防止肝癌復(fù)發(fā)。
至于本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的來源、類型(單克隆或多克隆)和形態(tài)，沒有要求。
本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可以通過已知方法形成多克隆或單克隆抗體獲得。本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體特別優(yōu)選源自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。源自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體包括經(jīng)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，和用含有抗體基因的表達(dá)載體經(jīng)遺傳工程技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化后宿主所產(chǎn)生的抗體。
產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞使用已知技術(shù)，可以如下述進(jìn)行制備。即，經(jīng)如下步驟制備以磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為致敏抗原，將其依照通常的免疫方法進(jìn)行免疫化，利用通常的細(xì)胞融合技術(shù)使形成的免疫細(xì)胞與公知的伴侶細(xì)胞融合，然后通過通常的篩選方法篩選出單克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
具體而言，單克隆抗體如下述制備即可。首先，用作生產(chǎn)抗體致敏抗原的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，可以通過誘導(dǎo)由Lage H.等，Gene188(1997)，151-156公開的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(MXR7)基因/氨基酸序列的表達(dá)獲得。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因序列和氨基酸序列分別顯示于序列編號(hào)1和2。即，編碼磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因序列插入公知的表達(dá)載體系統(tǒng)，遺傳轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后，將來自宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基上清液中的目標(biāo)人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白通過公知方法進(jìn)行純化。
接著，將該純化后的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白用作敏化抗原?；蛘?，也可以用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的肽片段作為敏化抗原。這時(shí)，所述肽片段可以由人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸序列經(jīng)化學(xué)合成而獲得。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體依靠細(xì)胞毒性如ADCC或CDC等體現(xiàn)抗癌活性，還在抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體與細(xì)胞毒性物質(zhì)如放射性同位素、化療藥或菌源毒素等結(jié)合時(shí)體顯示抗癌活性。抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體識(shí)別的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的表位不限于特定表位，只要抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可以識(shí)別的存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的任何表位都可。因此，為了制備本發(fā)明抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原，任何存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的含有表位的肽片段，都可以用作制備本發(fā)明抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原。
要用致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物沒有具體限制，并優(yōu)選基于同在細(xì)胞融合中使用的伴侶細(xì)胞的兼容性的考慮來選擇。通常使用嚙齒類動(dòng)物如小鼠、大鼠和倉鼠，或兔、猴等。
可根據(jù)已知技術(shù)用致敏抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。例如，免疫可以通過一般方如向哺乳動(dòng)物腹腔內(nèi)或皮下注射致敏抗原。具體而言，將致敏抗原用適量的PBS(磷酸鹽緩沖液)、生理鹽水等稀釋或懸浮，根據(jù)需要向其中混合通常的佐劑如弗氏完全佐劑，乳化后，每4-21天多次對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行給藥。另外，以致敏抗原免疫期間，也能用適當(dāng)?shù)妮d體。
哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞用作與前述免疫細(xì)胞融合的伴侶細(xì)胞。各種已知的細(xì)胞株適合用作該骨髓瘤細(xì)胞，例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)，P3x63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1-7)，NS-1(Kohler，G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)，MPC-11(Margulies，D.H.等，Cell(1976)8，405-415)，SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)，F(xiàn)O(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)，S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)，和R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)等。.
前述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞融合基本上可根據(jù)已知的方法進(jìn)行，例如，Kohler和Milstein等的方法(Kohler，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)。
更具體而言，所述細(xì)胞融合在例如細(xì)胞融合促進(jìn)劑存在的條件下在通常的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中實(shí)施。例如，聚乙二醇(PEG)，仙臺(tái)病毒(HVJ)等可以用作細(xì)胞融合促進(jìn)劑，根據(jù)需要，還可加入助劑如二甲基亞砜等，以便提高融合效率。
免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞使用比例可任意設(shè)定。舉例，優(yōu)選免疫細(xì)胞的數(shù)量是雜交瘤細(xì)胞的1-10倍。用于上述細(xì)胞融合的培養(yǎng)基可以是，例如，特別適于上述雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞株增殖的RPMI1640培養(yǎng)基或MEM培養(yǎng)基，或者其它用于培養(yǎng)該類型細(xì)胞的通常的培養(yǎng)基，此外，血清添加物如胎牛血清(FCS)等可以與之組合使用。
細(xì)胞融合通過在上述培養(yǎng)基中，充分混合規(guī)定量的上述免疫細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞，加入濃度通常為30-60％(w/v)、預(yù)加熱至大約37℃的PEG溶液(如，平均分子量約1000-約6000)，然后混合形成目標(biāo)融合細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)。接著通過反復(fù)進(jìn)行每次加入合適的培養(yǎng)基然后離心除去上清的程序，清除不利于雜交瘤細(xì)胞增殖的細(xì)胞融合劑等。
這樣得到的雜交瘤細(xì)胞，可以通過通常的選擇培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)選擇。為使除了目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡，就要使在所述HAT培養(yǎng)基上進(jìn)行的培養(yǎng)持續(xù)足夠的時(shí)間(通常為數(shù)天至數(shù)周)。然后進(jìn)行通常的限制稀釋法，之后篩選以及單克隆產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞。
除了通過用抗原免疫非人類動(dòng)物得到上述雜交瘤細(xì)胞之外，也可以通過人淋巴細(xì)胞在體外對(duì)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3敏化，并把敏化的淋巴細(xì)胞與具有永久分裂能力的人源骨髓瘤細(xì)胞融合獲得(見日本特公平1-59878號(hào))所需的具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合活性的人類抗體。另外，將磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為抗原給藥具有完整的人抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后能得到產(chǎn)生抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的細(xì)胞，也可以從將產(chǎn)生抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體細(xì)胞永生化的細(xì)胞中獲得(見國際專利申請(qǐng)公開編號(hào)WO 94/25585號(hào)公報(bào)，WO 93/12227號(hào)公報(bào)，WO92/03918號(hào)公報(bào)，和WO 94/02602號(hào)公報(bào)。
產(chǎn)生這樣制備得到的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞能連續(xù)培養(yǎng)在通常的培養(yǎng)基上，或者可以長(zhǎng)時(shí)間保存在液氮中。
為使單克隆抗體能從該雜交瘤細(xì)胞獲得，一般采用如下方法依照通常方法培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞得到并在培養(yǎng)基上清液中回收單克隆抗體的方法，或者將雜交瘤細(xì)胞施用到與之相容的哺乳動(dòng)物中并使之增殖，在腹水中得到單克隆抗體的方法等。前一個(gè)方法適于得到高純度抗體，而后一個(gè)方法適于抗體的大量產(chǎn)生。
本發(fā)明所用的單克隆抗體可以是重組的單克隆抗體，其制備是通過從雜交瘤細(xì)胞克隆抗體基因，將基因整合在適當(dāng)?shù)妮d體中，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主中，并使宿主通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生(例如，參見Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。
具體而言，編碼抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可變(V)區(qū)的mRNA，從生成抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的雜交瘤細(xì)胞中分離。所述mRNA可以通過已知的方法分離，例如，通過氨基甲脒超離心法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-5299)或AGPC法(Chomczynski，P.等，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制備總RNA，之后用mRNA提純?cè)噭┖?由Pharmacia制造)等制備目標(biāo)mRNA。另外，mRNA也能用QuickPrep mRNA提純?cè)噭┖?由Pharmacia制造)直接制備。
抗體V區(qū)的cDNA可以用逆轉(zhuǎn)錄酶由得到的mRNA合成。CDNA的合成可以用例如，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(ReverseTranscriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit)(由生成化學(xué)工業(yè)公司制造)等。CDNA的合成和擴(kuò)增還能用例如，5′-Ampli FINDER RACE試劑盒(由Clontech制造)和使用了PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002，Belyavsky，A.等，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)等。
將目標(biāo)DNA片段從如此得到的PCR產(chǎn)物純化，然后連接到載體DNA上。另外，由此制備重組載體，然后將其導(dǎo)入大腸桿菌等，再選擇菌落制備所需的重組載體。接著目標(biāo)DNA核苷酸序列用已知的方法證實(shí)，如雙脫氧核糖核酸鏈終止法。
得到編碼目標(biāo)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體V區(qū)的DNA后，該DNA被整合在含有編碼所期望的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA的表達(dá)載體中。
為了制備用于本發(fā)明中的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，抗體基因整合在表達(dá)控制區(qū)例如，增強(qiáng)子和啟動(dòng)子這樣的控制區(qū)，以表達(dá)的表達(dá)載體。接著用該表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并誘導(dǎo)抗體表達(dá)。
抗體基因表達(dá)可以通過編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別整合到表達(dá)載體中，然后用這些載體同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，或者也可以通過編碼H鏈和L鏈的DNA整合在單個(gè)表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參見WO 94/11523)。
不僅是以上列舉的宿主細(xì)胞，還有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也能用于產(chǎn)生重組抗體。例如，融合基因的制備能通過將抗體基因插入在乳汁中產(chǎn)生的編碼蛋白(如山羊β酪蛋白)的基因中。然后將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段，注射到山羊胚胎中，該胚胎導(dǎo)入母山羊。所需的抗體可以從接受胚胎的山羊所生的轉(zhuǎn)基因山羊或其后代所產(chǎn)生的乳汁中得到。此外，可以給轉(zhuǎn)基因山羊施用適當(dāng)?shù)募に?，以便增加轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有所需抗體的乳汁量(Ebert，K.M.等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
除了上面列舉的抗體，本發(fā)明可以利用人工修飾的基因重組抗體，如嵌合抗體和人源化抗體，旨在降低對(duì)人類的異種抗原性。這些修飾的抗體可以通過已知的方法制備。
嵌合抗體的獲得是通過，編碼由上述方法得到的抗體V區(qū)的DNA與編碼人類抗體C區(qū)的DNA連接，將其整合在表達(dá)載體中，然后把載體導(dǎo)入宿主并誘導(dǎo)生產(chǎn)。對(duì)本發(fā)明有用的嵌合抗體能以該已知方法獲得。
人源化抗體，也稱為改型人類抗體，其是通過將非人類哺乳動(dòng)物如小鼠抗體互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region，CDR)，移植到人類抗體的互補(bǔ)決定區(qū)，對(duì)此的常規(guī)基因重組技術(shù)也是已知的(見歐洲專利申請(qǐng)公開No.EP 125023號(hào)公報(bào)和WO 96/02576號(hào)公報(bào))。
具體而言，以連接小鼠抗體CDR與人類抗體骨架區(qū)(FR)設(shè)計(jì)的DNA序列以PCR法合成，其是用與CDR和FR二者的末端區(qū)都具有重疊的區(qū)域而構(gòu)建的數(shù)個(gè)寡核苷酸作為引物(參見WO 98/13388號(hào)公報(bào)中記載的方法)。
其中的互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)成了良好的抗原結(jié)合部位的骨架區(qū)被選作跨CDR連接的人抗體骨架區(qū)?？贵w可變區(qū)中骨架區(qū)的氨基酸必要時(shí)可被取代，以便改型的人類抗體的互補(bǔ)決定區(qū)能構(gòu)成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato，K.等，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗體和人源化抗體的C區(qū)中可以使用人類抗體C區(qū)，例如，Cγ1，Cγ2，Cγ3和Cγ4可用作H鏈，Cκ和Cλ可用作L鏈。另外，可以修飾人類抗體C區(qū)以便改善抗體或其生成的穩(wěn)定性。
嵌合抗體包含源自非人類哺乳動(dòng)物的抗體可變區(qū)和源自人類的抗體恒定區(qū)。另一方面，人源化抗體包含源自非人類哺乳動(dòng)物的抗體互補(bǔ)決定區(qū)和源自人類的抗體骨架區(qū)以及C區(qū)。由于人源化抗體在體內(nèi)的抗原性降低，其可用作本發(fā)明的治療藥的有效成分。
本發(fā)明所用的抗體只要能與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合并且能抑制磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的活性，抗體片段或其修飾體即可，還可以含有二價(jià)抗體和單價(jià)抗體，并不限于整個(gè)抗體分子?？贵w片段的實(shí)例如Fab、F(ab′)2、Fv、具有一個(gè)Fab和一個(gè)完整Fc的Fab/c，或H鏈或L鏈Fv由適當(dāng)?shù)慕宇^連接的單鏈Fv(scFv)。具體而言，抗體片段可以通過用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體而產(chǎn)生，或者可以構(gòu)建編碼所述抗體片段的基因，并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，由適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá)(參見，例如Co，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976，Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.，Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等，Methods in Enzymology(1989)121，663-669，and Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
ScFv通過連接抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)得到。H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)通過接頭并優(yōu)選肽接頭連接在scFv中(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。ScFv的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以是源自本說明書所述的任何抗體。連接V區(qū)的肽接頭可使用例如，包含12-19個(gè)氨基酸殘基的任何單鏈肽。
編碼scFv的DNA可以按下述方法得到編碼上述抗體H鏈或H鏈V區(qū)的DNA，以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA，以編碼前面所述序列的全部或所需的氨基酸序列的DNA部分作為模板，使用指定了末端的引物對(duì)經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，接著重組指定的引物對(duì)，并進(jìn)行擴(kuò)增以使編碼肽接頭區(qū)的DNA和其兩端分別結(jié)合于H鏈和L鏈。
另外，一旦編碼scFv的DNA制備好，含有該DNA的表達(dá)載體和用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主可以依照常法獲得，并且通過應(yīng)用所述宿主，依照常法可以得到scFv。
所述抗體片段可以通過和上述同樣方法，由宿主獲得和表達(dá)其基因并誘導(dǎo)生產(chǎn)。本發(fā)明的“抗體”也包括這些抗體的片段。
修飾抗體還可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種不同分子結(jié)合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體。本發(fā)明的“抗體”也包括這些修飾抗體。所述修飾抗體可以通過實(shí)施化學(xué)修飾已得到的抗體而獲得。需要說明的是，修飾抗體的方法在本領(lǐng)域中已建立。
本發(fā)明所用的抗體還可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體可以是具有識(shí)別磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上不同表位的抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體，或一個(gè)可識(shí)別磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的抗原結(jié)合位點(diǎn)和另一個(gè)可識(shí)別細(xì)胞毒性物質(zhì)如化療藥或細(xì)胞產(chǎn)生的毒素等的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這時(shí)，使得細(xì)胞毒性物質(zhì)能直接作用在表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的細(xì)胞上，從而特異性破壞腫瘤細(xì)胞和抑制腫瘤細(xì)胞增殖。雙特異性抗體可以通過結(jié)合兩種類型的抗體的H-L對(duì)來制備，也可以通過融合能產(chǎn)生不同的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，制成產(chǎn)生雙特異性抗體的融合細(xì)胞來獲取。雙特異性抗體也可以通過基因工程技術(shù)制備。
按上述所構(gòu)建的抗體基因可通過公知的方法表達(dá)和獲得。為哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，基因可以通過常用的有效啟動(dòng)子、要表達(dá)的抗體基因和在其3′下游側(cè)的poly A信號(hào)的功能性連接來表達(dá)。啟動(dòng)子/增強(qiáng)子舉例說明是人巨細(xì)胞病毒的早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
可以用來表達(dá)本發(fā)明所用的抗體的其它啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的實(shí)例包括，來自例如源自逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒或猴病毒40(SV40)的病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，或人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子等。
應(yīng)用SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，基因表達(dá)易于以Mulligan等方法進(jìn)行(Nature(1979)277，108)，應(yīng)用HEF1α啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，基因表達(dá)易于以Mizushima等方法進(jìn)行(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)。
在使用大腸桿菌時(shí)，基因表達(dá)可以通過常用的有效啟動(dòng)子、抗體分泌的信號(hào)序列和要表達(dá)的抗體基因的功能性連接來實(shí)現(xiàn)。舉例說明啟動(dòng)子可以是lacz啟動(dòng)子、araB啟動(dòng)子。用lacz啟動(dòng)子時(shí)，表達(dá)可以通過Ward等方法實(shí)現(xiàn)(Nature(1098)i341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)，而用araB啟動(dòng)子時(shí)，表達(dá)可通過Better等方法實(shí)現(xiàn)(Science(1988)240，1041-1043)。
至于抗體分泌的信號(hào)序列，當(dāng)抗體在大腸桿菌的外周胞質(zhì)中產(chǎn)生時(shí)，可以用pelB信號(hào)序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。當(dāng)外周胞質(zhì)中產(chǎn)生的抗體被分離后，抗體結(jié)構(gòu)被適當(dāng)再折疊并使用。
作為復(fù)制起點(diǎn)適用的是，舉例，源自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳頭瘤病毒(BPV)的復(fù)制起點(diǎn)。此外，為了擴(kuò)增宿主細(xì)胞系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體可以含有例如氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、或二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標(biāo)記。
任何表達(dá)系統(tǒng)，例如真核細(xì)胞系統(tǒng)或原核細(xì)胞系統(tǒng)，都可以用于制備本發(fā)明所用的抗體。真核細(xì)胞的實(shí)例包括例如已建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)或昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，以及絲狀真菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞等的動(dòng)物細(xì)胞等。原核細(xì)胞的實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞。
本發(fā)明所用的抗體優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，如在CHO，COS，骨髓瘤，BHK，Vero，或HeLa細(xì)胞中。
然后轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在體外或體內(nèi)培養(yǎng)，以誘導(dǎo)產(chǎn)生目標(biāo)抗體。宿主細(xì)胞可以根據(jù)已知方法培養(yǎng)。例如，可用DMEM，、MEM、RPMI1640或IMDM作為培養(yǎng)基，也可合用血清添加物如胎牛血清(FCS)等。
使用已知的方法可測(cè)定本發(fā)明所用抗體的抗原結(jié)合活性(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)和其配體-受體結(jié)合抑制活性(Harada，A.等，International Immunology(1993)5，681-690)。
測(cè)定本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原結(jié)合活性，可以用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)、EIA(酶免分析)、RIA(放免分析)或熒光抗體技術(shù)來測(cè)定。舉例，用酶免分析時(shí)，將含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3抗體的樣本，如抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體生成細(xì)胞的培養(yǎng)上清液或純化的抗體，加至涂有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的板上。加入以酶如堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，對(duì)板進(jìn)行培養(yǎng)，清洗后加入酶底物如對(duì)硝基苯磷酸鹽，通過測(cè)定吸光度來評(píng)價(jià)抗原結(jié)合活性。本發(fā)明所用抗體的細(xì)胞毒性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測(cè)定。
可以通過混合效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體測(cè)定，檢查ADCC的程度來測(cè)定ADCC的活性。例如，小鼠脾細(xì)胞或者從骨髓或人外周血分離的單核細(xì)胞等可以用作效應(yīng)細(xì)胞，可以用人類建立的細(xì)胞株如人肝細(xì)胞株HuH-7等作為靶細(xì)胞。預(yù)先用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞，向該細(xì)胞中加入抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，之后培養(yǎng)，然后加入與靶細(xì)胞成適當(dāng)比例的效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。ADCC活性可以用通過收集培養(yǎng)后的上清，計(jì)算上清中的放射活性進(jìn)行測(cè)定。
CDC活性可以通過混合上述標(biāo)記的靶細(xì)胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，然后加入補(bǔ)足物進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)后計(jì)算上清中的放射活性來測(cè)定。
由于Fc區(qū)通常對(duì)于抗體發(fā)揮細(xì)胞毒性是必需的，在本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑利用了抗體細(xì)胞毒活性的那些情況下，本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體優(yōu)選含有Fc區(qū)。
本發(fā)明的抗癌劑用于預(yù)防癌癥或預(yù)防癌癥治療后的癌癥復(fù)發(fā)。本發(fā)明的抗癌劑特別優(yōu)選用于預(yù)防肝癌細(xì)胞切除術(shù)后的肝癌復(fù)發(fā)。
有效劑量選自每次給藥0.001mg-1000mg/kg體重的范圍。或者，劑量可以選自每名患者0.01-100000mg/個(gè)體。但是，本發(fā)明的含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑不受所述劑量的限制。
本發(fā)明的抗癌劑通常以非口服途徑給藥，例如，注射(如皮下，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi))或經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻或經(jīng)肺等途徑，但是，口服給藥也是可能的。
至于本發(fā)明的抗癌劑的給藥時(shí)間，可以在疾病臨床癥狀出現(xiàn)之前或之后給藥。根據(jù)特別優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施方案，本發(fā)明的抗癌劑可以在肝癌細(xì)胞切除術(shù)后作為輔助治療給藥。
含有本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的治療藥可以依照常法配制(Remington′s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A.)并且還可以同時(shí)含有藥用載體和添加劑。
所述載體和藥用添加劑的實(shí)例是，水、藥用有機(jī)溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性右旋糖苷、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙烯醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和適合作為藥物添加劑的表面活性劑。
根據(jù)本發(fā)明的治療藥劑型，實(shí)際的添加劑可以是上述中的一種或多種進(jìn)行適當(dāng)組合，當(dāng)然也不受其限制。例如，可注射制劑的制備如下在溶劑如生理鹽水、緩沖液或葡萄糖溶液中溶解純化的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，然后在溶液中加入防吸附劑如Tween 80、Tween20、明膠、或人血清白蛋白?；蛘撸谑褂们巴ㄟ^溶解重構(gòu)的劑型，可以是凍干制劑，用于凍干的賦形劑可以用如甘露醇和葡萄糖等的糖醇或糖類。
本說明書特意引用的所有專利和參考文獻(xiàn)的內(nèi)容，整體合并作為本說明書的一部分。此外，日本專利申請(qǐng)2004-244273和2005-90945的說明書和附圖的內(nèi)容，是構(gòu)成本發(fā)明持有的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的申請(qǐng)，整體合并作為本說明書的一部分。
實(shí)施例本發(fā)明通過下面提供的實(shí)施例更具體地描述，但這些實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33在肝內(nèi)移植的小鼠模型中的藥效試驗(yàn)(1)甲胎蛋白(AFP)的測(cè)定使用人ELISA試劑盒(由Hope Laboratories公司制造)，測(cè)定血清中的AFP濃度，作為腫瘤標(biāo)記物。ELISA的檢測(cè)限約1ng/mL，低于檢測(cè)限的樣本作為1ng/mL。為了獲取血清，在Separapit S(由セキスイ化學(xué)制造)中通過眼窩采血收集血液，室溫下靜置15分鐘后，以1200×g離心分離20分鐘。
(2)制備肝內(nèi)移植小鼠模型肝內(nèi)移植小鼠模型的制備如下HepG2細(xì)胞(ATCC)用Hanks培養(yǎng)基(由Sigma制造)配制到1×108個(gè)/mL。在戊巴比妥鈉麻醉下，50μL的HepG2細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/小鼠)注射到裸鼠(Charles River)的肝囊內(nèi)。移植后第21天測(cè)定血清中AFP濃度，在10-100ng/mL范圍內(nèi)的個(gè)體被分成兩組(n＝4)。在該時(shí)間點(diǎn)，肝癌細(xì)胞(瘤塊)還沒有視覺可見，將其用作肝臟切除術(shù)后微肝內(nèi)移植存活模型。
(3)抗體給藥給藥當(dāng)天通過用生理鹽水(由大製薬制造)配制小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33(參考下面的參考例)達(dá)0.5mg/mL作為給藥樣本。給藥樣本在腫瘤移植后的第21天和28天，以10mL/kg通過尾靜脈給藥至前述的小鼠模型。陰性對(duì)照中將生理鹽水作為媒介同樣給藥。
(4)抗腫瘤作用的評(píng)價(jià)抗腫瘤作用根據(jù)腫瘤移植后第35天的AFP濃度評(píng)價(jià)。其結(jié)果顯示在圖1中，GC33給藥組與媒介給藥組相比，腫瘤移植后第35天的AFP濃度較低，從而證實(shí)了本發(fā)明抗體的抗腫瘤作用。
如前所顯示，GC33在肝內(nèi)移植模型中表現(xiàn)出具有抗腫瘤的作用，可見本發(fā)明抗體能用在輔助治療中。
實(shí)施例2小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33在肝內(nèi)移植的小鼠模型中的早期給藥試驗(yàn)(1)甲胎蛋白(AFP)的測(cè)定使用人ELISA試劑盒(由Hope Laboratories公司制造)，測(cè)定血清中的AFP濃度，作為腫瘤標(biāo)記物。ELISA的檢測(cè)限約1ng/mL，低于檢測(cè)限的樣本作為1ng/mL。為了獲取血清，在Separapit S(由セキスイ化學(xué)制造)中通過眼窩采血收集血液，室溫下靜置15分鐘后，以1200×g離心分離20分鐘。
(2)制備肝內(nèi)移植小鼠模型肝內(nèi)移植小鼠模型的制備如下HepG2細(xì)胞(ATCC)用Hanks培養(yǎng)基(由Sigma制造)配制到1×108個(gè)/mL。在戊巴比妥鈉麻醉下，50μL的HepG2細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/小鼠)注射到裸鼠(Charles River)的肝囊內(nèi)。移植后的第2天，隨機(jī)分成兩組(n＝10)。雖然HepG2在移植后的第二天的時(shí)間點(diǎn)就存在于小鼠肝內(nèi)，但此時(shí)小鼠血清中測(cè)不到人AFP，這可用作在臨床上更接近于肝臟切除術(shù)后殘余的微肝內(nèi)移植的模型。
(3)抗體給藥給藥當(dāng)天通過用生理鹽水(由大製薬制造)配制小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33(參考下面的參考例)達(dá)0.5mg/mL作為給藥樣本。給藥樣本在腫瘤移植后的第2天和第7天，以10mL/kg通過尾靜脈給藥至前述的小鼠模型。陰性對(duì)照中將生理鹽水作為媒介同樣給藥。
(4)抗腫瘤作用的評(píng)價(jià)抗腫瘤作用根據(jù)腫瘤移植后第15天和第40天的AFP濃度評(píng)價(jià)。其結(jié)果顯示在圖2中，媒介組中觀察到AFP濃度升高，而GC33給藥組兩個(gè)測(cè)定時(shí)間都沒有看到AFP濃度升高。
如前所顯示，在肝癌細(xì)胞肝內(nèi)移植的模型中，通過在AFP尚檢測(cè)不到的早期給與小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33，可以抑制腫瘤增殖，從而提示本發(fā)明抗體能用在輔助治療中。
參考實(shí)施例制備小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33用來自GST和來自磷脂酰肌醇蛋白聚糖3中524位丙氨酸至563位賴氨酸的肽形成的融合蛋白作為免疫原，免疫三只Balb/c小鼠(購自Charles River Japan)和三只MRL/lpr小鼠。在初次免疫中，皮下給與乳劑，所述乳劑用FCA制備并調(diào)節(jié)使之能提供每只(per head)100μgGC-3。兩周后，皮下給藥乳劑，所述乳劑用FIA制備并調(diào)節(jié)使之能提供每只50μg。第五次免疫后，每只最后免疫(50μg)在所有小鼠的尾靜脈中進(jìn)行，并進(jìn)行細(xì)胞融合。用固定有已去除C端側(cè)的疏水區(qū)(564至580的氨基酸)的可溶性GPC3核心蛋白的免疫板，通過ELISA進(jìn)行篩選。對(duì)于陰性對(duì)照，用限制性稀釋法進(jìn)行單克隆化。結(jié)果是獲得了具有對(duì)GPC3的較強(qiáng)結(jié)合活性的GC33抗體。GC33H鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示在序列編號(hào)3中，而L鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示在序列編號(hào)4中。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的抗癌劑適用于預(yù)防癌癥和預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。
序列表<110>中外制藥株式會(huì)社(Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha)<120>使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的輔助療法(Adjuvant Therapy using Anti-Glypican 3 Antibodies)<130>SCT070625-47<150>JP2005-90945<151>2005-03-28<150>JP2004-244273<151>2004-08-24<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1743<212>DNA<213>homo sapiens<400>1atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc120ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca180gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa240taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc300aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc360catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa420gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac480atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc540cagctaatga acccaggcct gcctgattca gccttggaca tcaatgagtg cctccgagga600gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ccaggtttcc660aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga atcttggaat tgaagtgatc720aacacaactg atcacctgaa gttcagtaag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg780tactgctctt actgccaggg actgatgatg gttaaaccct gtggcggtta ctgcaatgtg840gtcatgcaag gctgtatggc aggtgtggtg gagattgaca agtactggag agaatacatt900ctgtcccttg aagaacttgt gaatggcatg tacagaatct atgacatgga gaacgtactg960cttggtctct tttcaacaat ccatgattct atccagtatg tccagaagaa tgcaggaaag1020ctgaccacca ctattggcaa gttatgtgcc cattctcaac aacgccaata tagatctgct1080tattatcctg aagatctctt tattgacaag aaagtattaa aagttgctca tgtagaacat1140gaagaaacct tatccagccg aagaagggaa ctaattcaga agttgaagtc tttcatcagc1200ttctatagtg ctttgcctgg ctacatctgc agccatagcc ctgtggcgga aaacgacacc1260ctttgctgga atggacaaga actcgtggag agatacagcc aaaaggcagc aaggaatgga1320atgaaaaacc agttcaatct ccatgagctg aaaatgaagg gccctgagcc agtggtcagt1380caaattattg acaaactgaa gcacattaac cagctcctga gaaccatgtc tatgcccaaa1440ggtagagttc tggataaaaa cctggatgag gaagggtttg aaagtggaga ctgcggtgat1500gatgaagatg agtgcattgg aggctctggt gatggaatga taaaagtgaa gaatcagctc1560cgcttccttg cagaactggc ctatgatctg gatgtggatg atgcgcctgg aaacagtcag1620caggcaactc cgaaggacaa cgagataagc acctttcaca acctcgggaa cgttcattcc1680ccgctgaagc ttctcaccag catggccatc tcggtggtgt gcttcttctt cctggtgcac1740tga 1743<210>2<211>580<212>PRT
<213>homo sapiens<400>2Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu1 5 10 15Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp20 25 30Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly35 40 45Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val50 55 60Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys65 70 75 80Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala85 90 95Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln100 105 110Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala115 120 125Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe130 135 140Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp145 150 155 160Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro165 170 175Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu180 185 190Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe195 200 205Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln210 215 220Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile225 230 235 240Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu245 250 255Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys260 265 270Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly275 280 285Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu290 295 300Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu305 310 315 320Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys325 330 335Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser340 345 350Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile355 360 365Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu370 375 380Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser
385 390 395 400Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala405 410 415Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr420 425 430Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His435 440 445Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp450 455 460Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys465 470 475 480Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly485 490 495Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly500 505 510Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr515 520 525Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro530 535 540Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser545 550 555 560Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe565 570 575Phe Leu Val His580<210>3<211>115<212>PRT<213>Mus musculus<400>3Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile35 40 45Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ala115<210>4<211>112<212>PRT<213>Mus musculus<400>4
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn85 90 95Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110
權(quán)利要求
1.一種含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑，其中所述抗癌劑在癌癥治療后給藥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗癌劑，其中癌癥治療后是肝癌治療后。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗癌劑，其中肝癌治療是肝癌細(xì)胞切除術(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的抗癌劑，其中所述抗癌劑在切除的肝癌細(xì)胞中表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3時(shí)使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的抗癌劑，其中所述抗體是單克隆抗體。
6.一種預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的方法，所述方法是在癌癥治療后對(duì)患者給藥含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中癌癥治療后是肝癌治療后。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中肝癌治療是肝癌細(xì)胞切除術(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在切除的肝細(xì)胞中表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑，其中所述抗癌劑在癌癥治療后給藥。癌癥治療后優(yōu)選是指在肝癌治療后，其中肝癌的治療特別是指肝癌細(xì)胞切除術(shù)。本發(fā)明的抗癌劑優(yōu)選在切除的肝癌細(xì)胞中表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3時(shí)使用?？沽字＜〈嫉鞍拙厶?抗體優(yōu)選是單克隆抗體。本發(fā)明的抗癌劑適用于預(yù)防癌癥或預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101014367SQ200580028610
公開日2007年8月8日 申請(qǐng)日期2005年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者木下恭子, 杉本正道, 岡部尚文 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社