專利名稱：具有變異Fc區(qū)的抗體的鑒定和工程化以及使用方法
專利說(shuō)明具有變異Fc區(qū)的抗體的鑒定和工程化以及使用方法 本申請(qǐng)要求美國(guó)申請(qǐng)No.10/902,588的優(yōu)先權(quán)，其是2004年1月9日提交的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)No.10/754,922的部分延續(xù)，美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)No.10/754,922要求了分別于2003年1月9日、2003年3月19日和2003年10月23日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)Nos.60/439,498、60/456,041和60/514,549的優(yōu)先權(quán)；通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。本申請(qǐng)還根據(jù)美國(guó)法案§119(e)Title 35要求2004年7月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/587,257的權(quán)利，通過(guò)完全引用將它合并在此。
1.發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分子，具體是多肽，更具體地是免疫球蛋白(例如，抗體)，其包括變異Fc區(qū)，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，該變異Fc區(qū)以更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA。本發(fā)明的分子在預(yù)防、治療或改善與疾病、失調(diào)或感染有關(guān)的一種或多種癥狀方面是特別有用的。本發(fā)明的分子對(duì)于疾病或失調(diào)的治療或預(yù)防是特別有用的，在所述疾病或失調(diào)中，由FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的增強(qiáng)的效力(例如，ADCC)是期望的，例如，癌癥、傳染性疾病，并且，在增強(qiáng)其效果由ADCC介導(dǎo)的治療性抗體的治療效力方面是特別有用的。
2.
背景技術(shù)：
2.1Fc受體和它們?cè)诿庖呦到y(tǒng)中的作用
抗體-抗原復(fù)合物與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的相互作用引起廣泛的系列反應(yīng)，從效應(yīng)物功能，例如抗體依賴性細(xì)胞毒性、肥大細(xì)胞脫粒和吞噬作用到免疫調(diào)節(jié)信號(hào)，例如調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用都是通過(guò)抗體或免疫復(fù)合物的Fc結(jié)構(gòu)域與造血細(xì)胞上特化的細(xì)胞表面受體的結(jié)合來(lái)啟動(dòng)的。由抗體和免疫復(fù)合物觸發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)的多樣性是由Fc受體的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性引起的。Fc受體共有結(jié)構(gòu)上相關(guān)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其可能介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

蛋白質(zhì)的免疫球蛋白基因超家族的成員，F(xiàn)c受體，是可以結(jié)合免疫球蛋白的Fc部分的表面糖蛋白。家族的每個(gè)成員通過(guò)Fc受體的α鏈上的識(shí)別結(jié)構(gòu)域來(lái)識(shí)別一種或多種同種型的免疫球蛋白。Fc受體是由它們對(duì)免疫球蛋白亞型的特異性定義的。IgG的Fc受體被稱為FcγR，IgE的稱為FεR，IgA的稱為FcαR。不同的輔助細(xì)胞帶有不同同種型抗體的Fc受體，抗體的同種型確定了哪個(gè)輔助細(xì)胞將參與給定的反應(yīng)(由Ravetch J.V.et al.1991，Annu.Rev.Immunol.9457-92；Gerber J.S.et al.2001 Microbes and Infection，3131-139；Billadeau D.D.et al.2002，The Journal of Clinical Investigation，2(109)161-1681；Ravetch J.V.et al.2000，Science，29084-89；RavetchJ.V.et al.，2001 Annu.Rev.Immunol.19275-90；Ravetch J.V.1994，Cell，78(4)553-60綜述)。在表1中概述了不同的Fc受體、表達(dá)它們的細(xì)胞和它們的同種型特異性(改編自ImmunobiologyTheImmune System in Health and Disease，4th ed.1999，Elsevier ScienceLtd/Garland Publishing，New York)。
Fcγ受體
這個(gè)家族的每個(gè)成員都是整合的膜糖蛋白，具有與免疫球蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域的C2組有關(guān)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和可變長(zhǎng)度的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域。存在三種已知的FcγR，稱為FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。這三種受體由不同的基因編碼；然而，在三個(gè)家族成員之間的廣泛同源性表明它們可能由于基因多重化而起源于共同的祖先。
FcγRII(CD32)
FcγRII蛋白是40KDa整合的膜糖蛋白，由于與單體Ig的低親合性(106M-1)，其僅結(jié)合復(fù)合的IgG。這個(gè)受體是最廣泛表達(dá)的FcγR，存在于所有造血細(xì)胞上，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、肥大細(xì)胞和血小板。FcγRII在其免疫球蛋白結(jié)合鏈中僅具有兩個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域，因而相比Fcγ/RI與IgG的親合性低得多。存在三種人類FcγRII基因(FcγRII-A、FcγRII-B、FcγRII-C)，所有的都結(jié)合聚集物或免疫復(fù)合物中的IgG。

FcγRII-A和FcγRII-B的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域間的明顯不同產(chǎn)生了對(duì)受體連接的兩種功能上異型的反應(yīng)。基本的差異是A同種型啟動(dòng)引起細(xì)胞活化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如吞噬作用和呼吸性噴發(fā)(respiratoryburst)，而B(niǎo)同種型啟動(dòng)抑制性信號(hào)，例如抑制B細(xì)胞活化。
通過(guò)FcγR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
活化和抑制信號(hào)都在連接之后通過(guò)FcγR轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些徑直相反的功能是由不同的受體同種型之間的結(jié)構(gòu)差異引起的。在受體的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域內(nèi)、稱為基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)或基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，是所述不同的反應(yīng)的原因。不同的細(xì)胞質(zhì)酶對(duì)這些結(jié)構(gòu)的補(bǔ)充決定了FcγR介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的結(jié)局。含有ITAM的FcγR復(fù)合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，而含有ITIM的復(fù)合物僅包括FcγRIIB。

人類嗜中性白細(xì)胞表達(dá)FcγRIIA基因。FcγRIIA經(jīng)由免疫復(fù)合物或特異性抗體交聯(lián)的群集用來(lái)聚集ITAM和受體相關(guān)的激酶，所述激酶促進(jìn)ITAM的磷酸化。ITAM的磷酸化充當(dāng)了Syk激酶的對(duì)接位點(diǎn)，所述Syk激酶的活化引起下游底物(例如，PI3K)的活化。細(xì)胞活化引起前炎癥性介體(proinflammatory mediator)的釋放。

FcγRIIB基因在B淋巴細(xì)胞上表達(dá)；它的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與FcγRIIA 96％相同，并以不可區(qū)別的方式結(jié)合IgG復(fù)合物。在FcγRIIB的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中ITIM的存在決定了FcγR的這種抑制性子類。近來(lái)，確定了這種抑制作用的分子基礎(chǔ)。當(dāng)與活化FcγR捆綁時(shí)，F(xiàn)cγRIIB中的ITIM變?yōu)榱姿峄?，并吸引肌醇多磷?′-磷酸酶(SHIP)的SH2結(jié)構(gòu)域，所述肌醇多磷酸5′-磷酸酶(SHIP)水解磷酸肌醇信使，從而防止細(xì)胞內(nèi)Ca++的流入，所述磷酸肌醇信使是作為含ITAM的FcγR介導(dǎo)的酪氨酸激酶活化的結(jié)果而釋放的。因而，F(xiàn)cγRIIB的交聯(lián)阻抑了對(duì)FcγR連接的活化反應(yīng)，并抑制細(xì)胞應(yīng)答。因而中止了B細(xì)胞活化、B細(xì)胞增殖和抗體分泌。

2.2相關(guān)的疾病 2.2.1癌癥
贅生物或腫瘤是由可能為良性或惡性的異常不受控細(xì)胞生長(zhǎng)引起的贅生的胞塊。良性腫瘤一般保持局部化。惡性腫瘤被集體稱為癌癥。術(shù)語(yǔ)“惡性”一般指腫瘤可以侵入和破壞鄰近的身體結(jié)構(gòu)并擴(kuò)散到遠(yuǎn)離的位點(diǎn)而導(dǎo)致死亡(關(guān)于綜述，參見(jiàn)，Robbins and Angell，1976，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PP.68-122)。癌癥可能在身體的許多位置出現(xiàn)，取決于它的發(fā)源表現(xiàn)不同。癌細(xì)胞破壞它們發(fā)源部分的身體，然后擴(kuò)散到身體的其他部分，在那里它們開(kāi)始新的生長(zhǎng)并導(dǎo)致更大的破壞。

每年有超過(guò)120萬(wàn)美國(guó)人患上癌癥。在美國(guó)癌癥是死亡第二大主要原因，如果當(dāng)前的趨勢(shì)繼續(xù)下去，預(yù)計(jì)到2010年癌癥將成為死亡的主要原因。在美國(guó)肺癌和前列腺癌是男性的最大癌癥殺手。在美國(guó)肺癌和乳腺癌是女性的最大癌癥殺手。在美國(guó)兩名男性中的一人在他一生中的某個(gè)時(shí)期將被診斷為癌癥。在美國(guó)三名女性中的一人在她一生中的某個(gè)時(shí)期將被診斷為癌癥。

還未發(fā)現(xiàn)癌癥的治愈法。當(dāng)前的治療選擇，例如手術(shù)、化療和放射治療通常不是無(wú)效就是存在嚴(yán)重的副作用。
癌癥治療
當(dāng)前，癌癥治療可能包括手術(shù)、化療、激素治療和/或放射治療以消滅患者體內(nèi)的贅生性細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Stockdale，1998，“Principles of Cancer Patient Management”，in Scientific AmericanMedicine，vol.3，Rubenstein and Federman，eds.，Chapter 12，SectionIV)。近來(lái)，癌癥治療也可能包括生物學(xué)療法或免疫療法。所有這些方法對(duì)于患者都有顯著的缺陷。例如，手術(shù)可能由于患者的健康狀況是禁忌的，或可能是患者不接受的。另外，手術(shù)可能不能完全地除去贅生的組織。當(dāng)贅生組織展現(xiàn)出比正常組織更高的放射敏感性時(shí)放射療法才是有效的，放射療法也常?？赡芤l(fā)嚴(yán)重的副作用。雖然可能是有效的，激素治療很少作為單獨(dú)的藥劑來(lái)給予，常被用于在其他治療已經(jīng)除去大多數(shù)癌細(xì)胞之后防止或延遲癌癥的復(fù)發(fā)。生物學(xué)療法/免疫療法在數(shù)量方面有限制，并且可能產(chǎn)生副作用，例如皮疹或腫脹、流感樣癥狀，包括發(fā)燒、寒戰(zhàn)和疲勞，消化道問(wèn)題或過(guò)敏性反應(yīng)。

對(duì)于化療，存在各種可用于癌癥治療的化學(xué)治療劑。絕大多數(shù)的癌癥化學(xué)治療通過(guò)抑制脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽前體的生物合成、直接地或間接地抑制DNA合成，來(lái)防止DNA復(fù)制和伴隨的細(xì)胞分裂(參見(jiàn)，例如，Gilman et al.，Goodman and Gilman’sThePharmacological Basis of Therapeutics，Eighth Ed.(PergamomPress，New York，1990))。這些試劑包括烷化劑，例如亞硝基脲，抗代謝產(chǎn)物，例如氨甲蝶呤和羥基脲，和其他試劑，例如etoposides、campathecins、博來(lái)霉素、阿霉素、紅比霉素等等，盡管不一定是細(xì)胞周期特異性的，由于它們對(duì)DNA復(fù)制的作用在S期期間殺死細(xì)胞。其他試劑，特別是秋水仙堿和長(zhǎng)春花生物堿，例如長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿，干擾微管組裝引起有絲分裂的延滯。化療方案一般包括使用化學(xué)治療劑的組合以增加治療的效力。

盡管有各種化學(xué)治療劑的可用性，化學(xué)療法有許多缺陷(參見(jiàn)，例如Stockdale，1998，“Principles Of Cancer Patient Management”in Scientific American Medicine，vol.3，Rubenstein and Federman，eds.，ch.12，sect.10)。幾乎所有的化學(xué)治療劑都是有毒的，化學(xué)療法引起顯著的、常常是危險(xiǎn)的副作用，包括嚴(yán)重的惡心、骨髓降低、免疫抑制，等等。另外，即使使用化學(xué)治療劑的組合，許多腫瘤細(xì)胞是有抗性的，或發(fā)展出對(duì)化學(xué)治療劑的抗性。實(shí)際上，對(duì)治療方案中使用的特定化學(xué)治療劑有抗性的那些細(xì)胞常常證明是對(duì)其他藥物有抗性的，甚至是那些通過(guò)與特定治療中使用的藥物的作用機(jī)制不同的機(jī)制起作用的那些藥劑；這種現(xiàn)象被稱為多效性藥物抗性或多藥物抗性。因而，由于藥物抗性，許多癌癥被證明是標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)治療方案難以治療的。

存在著對(duì)可選擇的癌癥治療的顯著需求，特別是對(duì)于已經(jīng)被證明標(biāo)準(zhǔn)的癌癥治療，例如，手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法和激素治療難以治療的癌癥的治療。有前景的選擇是免疫療法，其中癌細(xì)胞被癌癥抗原特異性抗體特異性地靶定。主要的努力已經(jīng)針對(duì)免疫反應(yīng)特異性的無(wú)害性，例如，雜交瘤技術(shù)已經(jīng)允許開(kāi)發(fā)腫瘤選擇性單克隆抗體(參見(jiàn)，Green M.C.et al.，2000 Cancer Treat Rev.，26269-286；WeinerLM，1999Semin Oncol.26(suppl.14)43-51)，在過(guò)去幾年中，食品和藥品管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了用于非Hodgkin’s淋巴瘤的Rituxin(抗CD20)和用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌(Suzanne A.Eccles，2001，Breast CancerRes.，386-90)的Herceptin[抗(c-erb-2/HER-2)]的第一批用于癌癥治療的MAb。然而，抗體效應(yīng)物功能的效力，例如，介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(“ADCC”)，是這種治療的障礙。因而需要改善這種免疫療法的效力的方法。
2.2.2炎癥疾病和自體免疫疾病
炎癥是一種過(guò)程，通過(guò)這種過(guò)程身體的白血球和化學(xué)物質(zhì)保護(hù)我們的身體免于外來(lái)物質(zhì)，例如細(xì)菌和病毒的感染。這通常以受影響區(qū)域的疼痛、腫脹、熱度和紅色為特征。稱為細(xì)胞因子和前列腺素的化學(xué)物質(zhì)控制這種過(guò)程，以有序和自我限制的級(jí)聯(lián)釋放到血液或受影響組織中。化學(xué)物質(zhì)的這種釋放增加了流向損傷或感染區(qū)域的血液，并可能引起紅色和熱度。某些化學(xué)物質(zhì)使得液體滲漏入組織中，導(dǎo)致腫脹。這種保護(hù)性的過(guò)程可能刺激神經(jīng)并導(dǎo)致疼痛。這些變化當(dāng)在相關(guān)區(qū)域在有限的時(shí)期中發(fā)生時(shí)，對(duì)身體是有利的。

在自體免疫和/或炎癥性失調(diào)中，在沒(méi)有需要對(duì)抗的外來(lái)物質(zhì)時(shí)免疫系統(tǒng)觸發(fā)炎癥性反應(yīng)，身體正常保護(hù)性的免疫系統(tǒng)通過(guò)錯(cuò)誤地攻擊自身引起對(duì)他自己的組織的損害。存在著以不同方式影響身體的許多不同的自體免疫失調(diào)。例如，在患有多發(fā)性硬化的個(gè)體中大腦受到影響，在患有Crohn’s病的個(gè)體中腸受到影響，在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中各種關(guān)節(jié)的滑膜、骨骼和軟骨受到影響。隨著自體免疫失調(diào)不斷破壞一種或多種類型的身體組織，可能產(chǎn)生器官的異常生長(zhǎng)、或器官功能方面的變化。自體免疫失調(diào)可能僅影響一個(gè)器官或組織類型，或者可能影響多個(gè)器官和組織。通常受自體免疫失調(diào)影響的器官和組織包括紅細(xì)胞、血管、結(jié)締組織、內(nèi)分泌腺(例如，甲狀腺或胰腺)、肌肉、關(guān)節(jié)和皮膚。自體免疫失調(diào)的實(shí)例包括但不限于，Hashimoto’s甲狀腺炎、惡性貧血、Addison’s病、1型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、皮肌炎、Sjogren’s綜合癥、皮肌炎、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自體免疫內(nèi)耳疾病重癥肌無(wú)力、Reiter’s綜合癥、Graves病、自體免疫肝炎、家族性腺瘤息肉和潰瘍性結(jié)腸炎。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是炎癥性關(guān)節(jié)炎的類型。關(guān)節(jié)炎是描述關(guān)節(jié)中的炎癥的通稱。某些、但不是所有種類的關(guān)節(jié)炎是指向錯(cuò)誤的炎癥的結(jié)果。除了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之外，與炎癥相關(guān)的其他類型的關(guān)節(jié)炎包括以下的牛皮癬關(guān)節(jié)炎、Reiter’s綜合癥、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是在身體的雙側(cè)關(guān)節(jié)(例如，雙手、雙腕或雙膝)中發(fā)生的一種慢性關(guān)節(jié)炎。這種對(duì)稱性有助于從其他種類的關(guān)節(jié)炎中辨別出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。除了影響關(guān)節(jié)之外，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能偶爾地影響皮膚、眼、肺、心臟、血液或神經(jīng)。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎影響了約1％的世界人口并潛在地使人殘廢。在美國(guó)存在約290萬(wàn)例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。與男性相比，兩到三倍的女性受到影響。發(fā)生類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一般年齡在25到50歲之間。青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎影響了71,000名青年美國(guó)人(年齡十八以下)，影響男孩數(shù)量六倍的女孩。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種自體免疫失調(diào)，其中身體的免疫系統(tǒng)不正確地將關(guān)節(jié)中分泌潤(rùn)滑液的滑膜識(shí)別為外源的。產(chǎn)生了炎癥，在關(guān)節(jié)中和周?chē)能浌呛徒M織被損壞或破壞。在嚴(yán)重的病例中，這種炎癥延伸到其他關(guān)節(jié)組織和環(huán)繞的軟骨，在此處它可能侵蝕或破壞骨骼和軟骨并引起關(guān)節(jié)畸形。身體用瘢痕組織替換損傷的組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)的正?？臻g變得狹窄并導(dǎo)致骨骼融合在一起。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生僵硬、腫脹、疲勞、貧血、失重、發(fā)燒，以及通常地，傷殘?zhí)弁础ｎ愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的某些共同癥狀包括在醒來(lái)時(shí)持續(xù)一小時(shí)或更久的關(guān)節(jié)僵硬；特定手指或腕關(guān)節(jié)中的腫脹；關(guān)節(jié)周?chē)浗M織中的腫脹；和雙側(cè)關(guān)節(jié)的腫脹。腫脹可以伴有或不伴有疼痛而發(fā)生，可能逐漸地惡化，或在發(fā)展之前保持相同數(shù)年。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷基于因素的組合，包括疼痛關(guān)節(jié)的特定位置和對(duì)稱性，早晨關(guān)節(jié)僵硬的存在，皮膚下腫塊和結(jié)節(jié)的存在(類風(fēng)濕結(jié)節(jié))，暗示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的X射線測(cè)試的結(jié)果，和/或稱為類風(fēng)濕因子的血液測(cè)試的陽(yáng)性結(jié)果。許多但不是所有患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人在他們的血液中具有類風(fēng)濕因子抗體。類風(fēng)濕因子可能在沒(méi)有患上類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人群中存在。其他疾病也可能引起類風(fēng)濕因子在血液中產(chǎn)生。這就是為什么類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷基于幾種因素的組合，而不是僅基于血液中類風(fēng)濕因子的存在。

該疾病的典型病程是持久性但起伏的關(guān)節(jié)癥狀之一，約10年后，90％的患者將顯示骨骼和軟骨的結(jié)構(gòu)損傷。小部分人將患有完全消除的短期病癥，另一小部分人將患有非常嚴(yán)重的疾病，伴有許多關(guān)節(jié)畸形和偶爾地疾病的其他表現(xiàn)。炎癥性過(guò)程引起關(guān)節(jié)中的潰瘍或骨骼和軟骨的破壞。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，存在著持久性的抗原呈現(xiàn)、T細(xì)胞刺激、細(xì)胞因子分泌、滑膜細(xì)胞活化和關(guān)節(jié)破壞的自體免疫循環(huán)。該疾病對(duì)于個(gè)體和社會(huì)都有重要影響，引起顯著的疼痛、損害的功能和無(wú)能力，以及在保健花費(fèi)和損失工資方面數(shù)百萬(wàn)美元的耗費(fèi)。(參見(jiàn)，例如NIH網(wǎng)站和NIAID網(wǎng)站)。

對(duì)于關(guān)節(jié)炎當(dāng)前可獲得的治療集中于用抗炎或免疫抑制藥物降低關(guān)節(jié)的炎癥。任何關(guān)節(jié)炎的第一線治療通常是抗炎藥，例如阿斯匹林、布洛芬和Cox-2抑制物，例如celecoxib和rofecoxib?！暗诙€藥物”包括金、氨甲蝶呤和類固醇。雖然這些是很好地建立的關(guān)節(jié)炎治療，非常少數(shù)的患者單獨(dú)地豁免于(remit)這些治療線。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理方面的了解的新發(fā)展已經(jīng)引致與針對(duì)細(xì)胞因子的抗體或重組可溶性受體共同使用氨甲蝶呤。例如，腫瘤壞死因子(TNF)-α的重組可溶性受體已經(jīng)用于在關(guān)節(jié)炎的治療中與氨甲蝶呤組合。然而，用氨甲蝶呤和抗TNF-α試劑例如TNF-α的重組可溶性受體的組合治療的僅約50％的患者顯示了臨床上顯著的改善。許多患者保持了不論治療法的難治療性。對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者仍然存在困難的治療問(wèn)題。許多當(dāng)前的治療具有高幾率的副作用，或者不能完全防止疾病發(fā)展。迄今為止，沒(méi)有治療是理想的，不存在治愈。需要更有效地治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自體免疫失調(diào)的新的治療劑。
2.1.3傳染性疾病
引起疾病的傳染原分成五個(gè)組病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和寄生蟲(chóng)(蠕蟲(chóng))。這些病原體的可觀的多樣性引起了適應(yīng)性免疫的兩個(gè)決定性特征的自然選擇。首先，能夠識(shí)別大范圍的不同病原體的益處驅(qū)使了在相當(dāng)?shù)幕蚋蠖鄻有缘腂和T細(xì)胞上受體的發(fā)展。第二，病原體的不同孳生地和生命周期必須由一系列不同的效應(yīng)物機(jī)制補(bǔ)償。每種病原體的特征是它的傳播方式、它的復(fù)制機(jī)制、它的病理或它引起疾病的方式、和它引發(fā)的反應(yīng)。

人類患上、或由于天花、霍亂、斑疹傷寒、痢疾、瘧疾等等死亡的記錄確立了傳染性疾病的重要性。不論在由改善的環(huán)境衛(wèi)生、免疫和抗菌治療提供的控制方面的顯著成功，傳染性疾病仍然是近代醫(yī)學(xué)的常見(jiàn)和重要的問(wèn)題。最常見(jiàn)的人類疾病，感冒，是傳染性疾病，令人恐懼的現(xiàn)代疾病AIDS也是。以前被認(rèn)為是退行性疾病的某些慢性神經(jīng)疾病已經(jīng)被證明是傳染性的。毫無(wú)疑問(wèn)，將來(lái)會(huì)繼續(xù)顯現(xiàn)出傳染性疾病是主要的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。

巨大數(shù)目的人類和動(dòng)物疾病是由上述傳染原的任何一種的毒性和隨機(jī)的感染引起的(參見(jiàn)，Belshe(Ed.)1984 Textbook of HumanVirology，PSG Publishing，Littleton，MA)。

例如，傳染性疾病的一個(gè)種類是病毒感染。廣泛的組織，包括呼吸道、CNS、皮膚、泌尿生殖道、眼、耳、免疫系統(tǒng)、胃腸道和肌骨胳系統(tǒng)的病毒疾病影響了各個(gè)年齡的許多人(參見(jiàn)Table 328-2InWyngaarden and Smith，1988，Cecil Textbook of Medicine，18th Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PP.1750-1753)。盡管在有效的抗病毒治療的設(shè)計(jì)中已經(jīng)投入了可觀的努力，病毒感染持續(xù)威脅著世界范圍內(nèi)數(shù)百萬(wàn)人的生命。一般地，開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的努力集中于病毒生命周期的幾個(gè)階段(參見(jiàn)，例如Mitsuya et al.，1991，F(xiàn)ASEB J.52369-2381，討論HIV)。然而，與使用許多當(dāng)前的抗病毒藥物有關(guān)的常見(jiàn)障礙是它們的有害副作用，例如，對(duì)宿主的毒性，或某些病毒株的抗性。
3.發(fā)明概述
本發(fā)明部分地基于使用酵母展示系統(tǒng)鑒定具有對(duì)FcγR受體(例如，活化性FcγR、抑制性FcγR)的改變的親合性的、突變的人類IgG1重鏈Fc區(qū)。體內(nèi)動(dòng)物建模和臨床實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)c區(qū)在確定單克隆抗體治療的結(jié)局方面起到了重要作用。優(yōu)化治療性單克隆抗體和與Fc區(qū)融合的可溶多肽的Fc區(qū)功能(例如，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC))方面的當(dāng)前方法集中于根據(jù)結(jié)構(gòu)分析和/或計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的有限數(shù)量的單氨基酸改變。工程化Fc區(qū)的可選擇方法集中于Fc區(qū)的糖基化來(lái)優(yōu)化Fc區(qū)功能。本發(fā)明部分地基于從Fc變體的無(wú)偏庫(kù)(unbiased library)中選擇在一種或多種Fc功能活性中改變的可能的突變體，所述Fc功能活性例如但不限于ADCC和CDC。本發(fā)明提供了在由結(jié)構(gòu)研究鑒定的預(yù)期區(qū)域之外工程化Fc區(qū)并鑒定和篩選新的Fc變體的方法。在此使用的預(yù)期區(qū)域是指根據(jù)結(jié)構(gòu)和/或生物化學(xué)研究與Fc配體接觸的那些區(qū)域。

本發(fā)明提供了通過(guò)組合基于細(xì)胞的功能分析和用現(xiàn)階段自動(dòng)裝置構(gòu)建的組合庫(kù)、鑒定具有一種或多種Fc效應(yīng)物功能方面的改善的Fc變體的開(kāi)發(fā)平臺(tái)。本發(fā)明通過(guò)用覆蓋所有可能的氨基酸變化的修飾使Fc內(nèi)目標(biāo)區(qū)域飽和來(lái)組合完全的組合庫(kù)。將使用一組結(jié)合和功能分析根據(jù)改善的生物學(xué)功能選擇突變體來(lái)測(cè)試組合庫(kù)。

因此，本發(fā)明涉及分子、優(yōu)選的多肽、更優(yōu)選的免疫球蛋白(例如，抗體)，其包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換，但也包括插入或刪除)的變異Fc區(qū)，所述修飾改變，例如，提高或降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγR的親合性。優(yōu)選的，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾增加所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子進(jìn)一步以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子(即，與本發(fā)明的分子相比除了Fc區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾之外具有相同的氨基酸序列)結(jié)合FcγRIIB的更低的親合性特異性地結(jié)合FcγRIIB(經(jīng)由Fc區(qū))。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有變異Fc區(qū)的分子，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于具有野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性并增強(qiáng)所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有變異Fc區(qū)的分子，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于具有野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性但不改變所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。優(yōu)選的實(shí)施方式是一種變異Fc區(qū)，其相對(duì)于具有野生型Fc區(qū)的可比較分子具有對(duì)FcγRIIIA和FcγRIIA增強(qiáng)的親合性但對(duì)FcγRIIB降低的親合性。

本發(fā)明的Fc變體可以與其他Fc修飾組合，包括但不限于改變效應(yīng)物功能的修飾。本發(fā)明包括組合本發(fā)明的Fc變體與其他Fc修飾來(lái)提供抗體或Fc融合物中相加的、協(xié)同的或新的性質(zhì)。優(yōu)選的，本發(fā)明的Fc變體增強(qiáng)與它們相組合的修飾的表型。例如，如果本發(fā)明的Fc變體與突變體組合，已知所述突變體以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更高的親合性結(jié)合FcγRIIIA；與本發(fā)明的突變體的組合導(dǎo)致FcγRIIIA親合性方面更高倍數(shù)的增強(qiáng)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體可以與其他已知的Fc變體組合，例如在Duncan et al，1988，Nature 332563-564；Lund et al.，1991，J.Immunol 1472657-2662；Lund et al，1992，Mol Immunol2953-59；Alegre et al，1994，Transplantation 571537-1543；Hutchinset al.，1995，Proc Natl.Acad Sci U S A 9211980-11984；Jefferis et al，1995，Immunol Lett.44111-117；Lund et al.，1995，F(xiàn)aseb J 9115-119；Jefferis et al，1996，Immunol Lett 54101-104；Lund et al，1996，JImmunol 15749634969；Armour et aL，1999，Eur J Immunol292613-2624；Idusogie et al，2000，J Immunol 16441784184；Reddyet al，2000，J Immunol 1641925-1933；Xu et al.，2000，Cell Immunol20016-26；Idusogie et al，2001，J Immunol 1662571-2575；Shields etal.，2001，J Biol Chem 2766591-6604；Jefferis et al，2002，ImmunolLett 8257-65；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30487-490)；US 5,624,821；US 5,885,573；US 6,194,551；PCT WO 00/42072；PCTWO 99/58572中公開(kāi)的那些，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

本發(fā)明包括作為Fc區(qū)的同二聚體或異二聚體的分子。包含F(xiàn)c區(qū)的異二聚體是指其中兩條Fc鏈具有相同或不同序列的分子。在某些實(shí)施方式中，在包含變異Fc區(qū)的異二聚分子中，每條鏈具有與另一條鏈不同的一個(gè)或多個(gè)修飾。在其他實(shí)施方式中，在包含變異Fc區(qū)的異二聚分子中，一條鏈含有野生型Fc區(qū)，另一條鏈包含一個(gè)或多個(gè)修飾。工程化含異二聚Fc的分子的方法是本領(lǐng)域已知的，并涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分析(例如，體外分析)測(cè)定的，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述變異Fc區(qū)不結(jié)合任何FcγR或以降低的親合性結(jié)合。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述變異Fc區(qū)僅僅結(jié)合一種FcγR，其中所述FcγR是FcγIIIA。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述變異Fc區(qū)僅僅結(jié)合一種FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述變異Fc區(qū)僅僅結(jié)合一種FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。

本發(fā)明的分子對(duì)FcγR的親合性和結(jié)合性質(zhì)最初使用本領(lǐng)域已知用于測(cè)定Fc-FcγR相互作用，即，F(xiàn)c區(qū)與FcγR的特異性結(jié)合的體外分析(基于生物化學(xué)或免疫學(xué)的分析)來(lái)測(cè)定，包括但不限于ELISA分析、表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析、免測(cè)沉淀分析(參見(jiàn)5.2.1節(jié))。優(yōu)選的，本發(fā)明的分子的結(jié)合性質(zhì)也通過(guò)用于測(cè)定一種或多種FcγR介體效應(yīng)細(xì)胞功能的體外功能性分析來(lái)表征(參見(jiàn)5.2.6節(jié))。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子在體內(nèi)模型(例如，在此描述和公開(kāi)的那些)中具有與基于體外的分析的那些所類似的結(jié)合性質(zhì)。然而，本發(fā)明不排除在基于體外的分析中不展現(xiàn)期望的表型、但在體內(nèi)展現(xiàn)期望的表型的本發(fā)明的分子。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性特異性地結(jié)合FcγRIIIA，條件是所述變異Fc區(qū)不單獨(dú)地具有在位置329、331或332的任何一處的替換，并且不包括或不單獨(dú)地用位置256、290、298、312、333、334、359、360、326或430的任何一處的丙氨酸；位置330的賴氨酸；位置339的蘇氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的絲氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的組氨酸；位置334的纈氨酸；位置334的亮氨酸；位置335的賴氨酸的任何一個(gè)替換。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIA更大的親合性特異性地結(jié)合FcγRIIA，條件是所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾不包括或不單獨(dú)地用位置256、290、326、255、258、267、272、276、280、283、285、286、331、337、268、272或430的任何一處的丙氨酸；位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；位置290的絲氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸、位置326的絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的賴氨酸、位置335的谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸的任何一個(gè)替換。

在優(yōu)選的特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述分子具有對(duì)FcγR的改變的親合性，條件是所述變異Fc區(qū)不具有一些位置處的替換，根據(jù)例如Sondermann等(2000Nature，406267-273，通過(guò)完全引用將其合并在此)所公開(kāi)的那些的Fc-FcγR相互作用的結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析，所述位置與FcγR進(jìn)行直接接觸。與FcγR進(jìn)行直接接觸的Fc區(qū)內(nèi)的位置的實(shí)例是氨基酸234-239(絞鏈區(qū))、氨基酸265-269(B/C環(huán))、氨基酸297-299(C’/E環(huán))和氨基酸327-332(F/G)環(huán)。在某些實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子包含至少一個(gè)殘基的修飾，根據(jù)結(jié)構(gòu)或結(jié)晶分析所述修飾不與FcγR進(jìn)行直接接觸，例如，不在Fc-FcγR結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子所述分子以改變的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述至少一個(gè)氨基酸修飾不包括或不單獨(dú)地在位置255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439的任何一處替換。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子所述分子以改變的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述變異Fc區(qū)不包括或不單獨(dú)地在位置255、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439的任何一處替換，并且不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360、326或430的任一處的丙氨酸；位置330的賴氨酸；位置339的蘇氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的絲氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的組氨酸；位置334的纈氨酸；或位置334的亮氨酸；位置335的賴氨酸；位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；位置290的絲氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸；位置326的絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的賴氨酸；位置335的谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)不包括或不單獨(dú)地在位置268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439的任何一處替換，并且不具有位置280的組氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸；位置290的絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或酪氨酸，位置300的亮氨酸或異亮氨酸；位置294的天冬酰胺，位置296的脯氨酸；位置298的脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或纈氨酸；位置295的賴氨酸。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子所述分子以降低的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述變異Fc區(qū)做不具有或不單獨(dú)具有在位置252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439的任何一處的替換。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子所述分子以增強(qiáng)的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述變異Fc區(qū)不具有或不單獨(dú)地具有位置280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430的任何一處的替換。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)不包括替換或不單獨(dú)地具有位置330、243、247、298、241、240、244、263、262、235、269或328任何一處的替換，并且不具有位置243的亮氨酸、位置298的天冬酰胺，位置241的亮氨酸，和位置240的異亮氨酸或丙氨酸，位置244的組氨酸，位置330的纈氨酸，或位置328的異亮氨酸。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)的變異Fc區(qū)，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性到至少2倍。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)的變異Fc區(qū)，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性至大于2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子以相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子更大至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、至少100％、至少150％、至少200％的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA。這種測(cè)量?jī)?yōu)選的是體外分析。

本發(fā)明涵蓋對(duì)活化性和/或抑制性Fcγ受體有改變的親合性的分子。特別是，本發(fā)明預(yù)期具有變異Fc區(qū)的分子，其具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于具有野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性，但是降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有變異Fc區(qū)的分子，其具有一個(gè)或多氨基酸修飾，相對(duì)于具有野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性，并且也降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有變異Fc區(qū)的分子，相對(duì)于具有野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性，但是不改變所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有變異Fc區(qū)的分子，相對(duì)于具有野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性，但是降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含變異Fc區(qū)，其具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)，相對(duì)于包含以野生型親合性結(jié)合FcγRIIIA和FcγRIIB的野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述一個(gè)或多個(gè)修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性并且降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在某些實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾不是在位置256、298、333或334的任一處用丙氨酸替換。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含變異Fc區(qū)，其具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)，相對(duì)于包含以野生型親合性結(jié)合FcγRIIA和FcγRIIB的野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述一個(gè)或多個(gè)修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIA的親合性并且降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在某些實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾不是在位置320處用精氨酸替換。

在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有對(duì)活化性和/或抑制性受體的改變的親合性、具有變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾是在位置288用天冬酰胺、在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc10)(參見(jiàn)表5)；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用絲氨酸替換(MgFc13)；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸替換(MgFc27)；或在位置392用蘇氨酸、在位置396用亮氨酸替換(MgFc38)；或在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用組氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用天冬氨酸替換(MgFc42)；或在位置240用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc52)；或在位置410用組氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc53)；或在位置243用亮氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc54)；或在位置255用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc55)；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc59)。

用于篩選和鑒定包含具有改變的FcγR親合性(例如，增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性)的變異Fc區(qū)的分子的優(yōu)選的方法是酵母表面展示技術(shù)(關(guān)于綜述參見(jiàn)，Boder and Wittrup，2000，Methods inEnzymology，328430-444，通過(guò)完全引用將其合并在此)。具體地，酵母表面展示是一種遺傳學(xué)方法，通過(guò)這種方法包含F(xiàn)c突變的多肽以對(duì)于與FcγR相互作用可接近的形式在酵母細(xì)胞壁上表達(dá)。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)或在此描述的特定方法來(lái)進(jìn)行含有突變Fc的本發(fā)明的多肽的酵母表面展示。酵母展示提供了好處，利用與期望的受體的實(shí)際結(jié)合來(lái)鑒定具有對(duì)該受體增強(qiáng)的結(jié)合的變異Fc區(qū)。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了選擇具有期望的結(jié)合性質(zhì)的突變Fc融合蛋白的方法，所述結(jié)合性質(zhì)例如，所述突變Fc融合蛋白以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA的能力。可以篩選和通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于評(píng)估結(jié)合相互作用的任何基于生物化學(xué)或免疫學(xué)的分析來(lái)表征展示突變Fc融合蛋白的酵母細(xì)胞。在特定的實(shí)施方式中，篩選突變Fc融合蛋白使用一種或多種基于生物化學(xué)的分析，例如ELISA分析來(lái)進(jìn)行。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，篩選和鑒定包含具有改變的FcγR親合性(例如，增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性)的變異Fc區(qū)的分子，使用在此描述的酵母展示技術(shù)結(jié)合一種或多種基于生物化學(xué)的分析，優(yōu)選的以高通量方式來(lái)進(jìn)行。所述一種或多種生物化學(xué)的分析可以是本領(lǐng)域已知用于鑒定Fc-FcγR相互作用，即Fc區(qū)與FcγR的特異性結(jié)合的任何分析，包括但不限于，ELISA分析、表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析、免測(cè)沉淀法分析、親和層析和平衡透析。在某些實(shí)施方式中，篩選和鑒定包含具有改變的FcγR親合性(例如，增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性)的變異Fc區(qū)的分子，使用在此描述的酵母展示技術(shù)結(jié)合一種或多種基于功能分析，優(yōu)選的以高通量方式來(lái)進(jìn)行?；诠δ艿姆治隹梢允潜绢I(lǐng)域已知用于表征一種或多種FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的任何分析，例如在此的5.2.6節(jié)中描述的那些。根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用的效應(yīng)細(xì)胞功能的非限制性實(shí)例包括但不限于，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、抗體依賴性吞噬作用、吞噬作用、調(diào)理作用、調(diào)理吞噬作用(opsonophagocytosis)、細(xì)胞結(jié)合、叢簇、C1q結(jié)合以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。在某些實(shí)施方式中，篩選和鑒定包含具有改變的FcγR親合性(例如，增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性)的變異Fc區(qū)的分子，使用在此描述的酵母展示技術(shù)結(jié)合一種或多種基于生物化學(xué)的分析、組合或并用一種或多種基于功能的分析，優(yōu)選的以高通量方式來(lái)進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明用于測(cè)量FcγR-Fc相互作用的優(yōu)選的方法是由發(fā)明人開(kāi)發(fā)的分析，其容許檢測(cè)和定量相互作用，不論受體對(duì)其配體的固有地弱的親合性，例如，對(duì)于FcγRIIB和FcγRIIIA以微摩爾的范圍。所述方法包括形成FcγR復(fù)合物(例如，F(xiàn)cγRIIIA、FcγRIIB)，所述FcγR復(fù)合物相對(duì)于未復(fù)合的FcγR具有對(duì)Fc區(qū)的改善的親合力。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋產(chǎn)生四聚FcγR復(fù)合物的方法，其中相對(duì)于單體FcγR對(duì)Fc區(qū)的親合性，所述四聚復(fù)合物具有對(duì)Fc區(qū)增強(qiáng)的親合性，所述方法包括(i)產(chǎn)生融合蛋白，從而15個(gè)氨基酸的AVITAG序列與FcγR的可溶區(qū)操作性地連接；(ii)使用E.coli BirA酶生物素化所產(chǎn)生的蛋白；(iii)以合適的摩爾比將產(chǎn)生的生物素化的蛋白與streptaividn-藻紅素混合，從而形成四聚的FcγR復(fù)合物。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含F(xiàn)c區(qū)的多肽以比它們結(jié)合單體未復(fù)合FcγR至少高7倍的親合性結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的方法形成的四聚FcγR復(fù)合物。包含F(xiàn)c區(qū)的多肽與所述四聚FcγR復(fù)合物的結(jié)合可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，實(shí)例例如，熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)、放射性免疫分析、ELISA分析等等來(lái)測(cè)定。

本發(fā)明涵蓋使用根據(jù)如上所述的方法形成的免疫復(fù)合物來(lái)在基于細(xì)胞的或無(wú)細(xì)胞的分析中測(cè)定包含F(xiàn)c區(qū)的分子的功能。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性、包含變異Fc區(qū)的修飾的免疫球蛋白。這種免疫球蛋白包括天然地含有FcγR結(jié)合區(qū)(例如，F(xiàn)cγRIIIA和/或FcγRIIB結(jié)合區(qū))的IgG分子，或已經(jīng)工程化來(lái)含有FcγR結(jié)合區(qū)(例如，F(xiàn)cγRIIIA和/或FcγRIIB結(jié)合區(qū))的免疫球蛋白衍生物。本發(fā)明的修飾的免疫球蛋白包括任何免疫球蛋白分子并含有FcγR結(jié)合區(qū)(例如，F(xiàn)cγRIIIA和/或FcγRIIB結(jié)合區(qū))，所述免疫球蛋白分子結(jié)合，優(yōu)選的免疫特異性地，即，通過(guò)本領(lǐng)域公知用于分析特異性抗原-抗體結(jié)合的免疫分析測(cè)定的、競(jìng)爭(zhēng)排除非特異性結(jié)合，抗原。這種抗體包括但不限于，多克隆的、單克隆的、雙特異性的、多特異性的、人類的、人源化的、嵌合的抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫化物連接的Fvs、以及含有VL或VH結(jié)構(gòu)域乃至特異性結(jié)合抗原的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、在某些情況下被工程化以含有或融合到FcγR結(jié)合區(qū)的片段。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的變異Fc區(qū)的免疫球蛋白，從而所述免疫球蛋白具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，例如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。本發(fā)明的分子的效應(yīng)物功能可以使用在此描述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何分析來(lái)進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，包含具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的變異Fc區(qū)的免疫球蛋白具有增強(qiáng)的ADCC活性，是相對(duì)于野生型的至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。

本發(fā)明涵蓋在Fc區(qū)中通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化人類的或人源化的治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)，所述修飾調(diào)節(jié)所述治療性抗體對(duì)FcγR活化性受體和/或FcγR抑制性受體的親合性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在Fc區(qū)中通過(guò)修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化人類的或人源化的治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)，所述修飾提高所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在Fc中通過(guò)修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化人類的或人源化的治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)，所述修飾提高所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性，并進(jìn)一步降低Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。工程化的治療性抗體可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，例如，增強(qiáng)的ADCC活性、吞噬作用活性等等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化特異于Her2/neu原癌基因的人源化單克隆抗體(例如，在Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285-9中公開(kāi)的Ab4D5人源化抗體)，所述修飾提高所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，修飾人源化Her2/neu單克隆抗體也可以進(jìn)一步降低Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在又一個(gè)特定實(shí)施方式中，特異于Her2/neu的工程化的人源化單克隆抗體可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，如本領(lǐng)域已知的以及在此公開(kāi)和例示的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化小鼠人類嵌合抗CD20單克隆抗體2H7，所述修飾增加Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，抗CD20單克隆抗體2H7的修飾也可以進(jìn)一步降低Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在又一個(gè)特定實(shí)施方式中，工程化的抗CD20單克隆抗體2H7可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，如本領(lǐng)域已知的以及在此公開(kāi)和例示的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化抗FcγRIIB抗體，所述抗體包括但不限于在2002年8月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/403,266和具有代理編號(hào)No.011183-010-999的2003年8月14提交的美國(guó)申請(qǐng)No.10/643,857中公開(kāi)的任何抗體，所述修飾提高Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法被工程化的抗FcγRIIB抗體的實(shí)例是具有ATCC登記號(hào)PTA-4591的2B6單克隆抗體、和具有ATCC登記號(hào)PTA-4592的3H7(保藏在ATCC，10801 University Boulevard，Manassas，VA 02209-2011，通過(guò)完全引用將其合并在此。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，抗FcγRIIB抗體的修飾也可以進(jìn)一步降低Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在又一個(gè)特定實(shí)施方式中，工程化的抗FcγRIIB抗體可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，如本領(lǐng)域已知的以及在此公開(kāi)和例示的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。在特定的實(shí)施方式中，2B6單克隆抗體包含在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、以及在位置366用絲氨酸替換(MgFc13)；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸替換(MgFc27)；或在位置243用異亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用纈氨酸替換(MgFc29)；或在位置392用蘇氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc38)；或在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用組氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用aspartic(MgFc42)；或在位置410用組氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc53)；或在位置243用亮氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc54)；或在位置255用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc55)；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc59)。

本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的分子的多核苷酸，所述分子包括通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的多肽和抗體。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法可以獲得編碼本發(fā)明的分子的多核苷酸，測(cè)定所述多核苷酸的核苷酸序列。本發(fā)明設(shè)計(jì)編碼本發(fā)明的分子的分離的核酸。本發(fā)明還提供了包含所述核酸的載體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有本發(fā)明的載體或多核苷酸的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生本發(fā)明的分子的方法。本發(fā)明的分子，包括多肽和抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，特別是通過(guò)重組表達(dá)來(lái)產(chǎn)生。在特定的實(shí)施方式中。本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生本發(fā)明的分子的方法，所述方法包括(i)在適合于表達(dá)所述分子的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼所述分子的核酸的宿主細(xì)胞；和(ii)從所述培養(yǎng)基中回收所述分子。

根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的分子在預(yù)防、治療或改善與疾病、失調(diào)或感染有關(guān)的一種或多種癥狀方面是有用的。本發(fā)明的分子對(duì)于疾病或失調(diào)的治療或預(yù)防是特別有用的，在所述疾病或失調(diào)中，由FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的增強(qiáng)的效力(例如，ADCC)是期望的，例如，癌癥、傳染性疾病，并且，在增強(qiáng)其效果由ADCC介導(dǎo)的治療性抗體的治療效力方面是特別有用的。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋在患有以癌癥抗原為特征的癌癥的患者中治療癌癥的方法，所述方法包括施用結(jié)合所述癌癥抗原的、治療有效量的治療性抗體，所述抗體已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法被工程化。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋在患有以癌癥抗原為特征的癌癥的患者中治療癌癥的方法，所述方法包括施用特異性結(jié)合所述癌癥抗原的、治療有效量的治療性抗體，所述治療性抗體包含變異Fc區(qū)，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述治療性抗體以比包含野生型Fc區(qū)的治療性抗體結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，條件是所述變異Fc區(qū)不具有位置329、331或332的替換，并且不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360或430的任何一處的丙氨酸；在位置330的賴氨酸；在位置339的蘇氨酸；在位置320的甲硫氨酸；在位置326的絲氨酸；在位置326的天冬酰胺；在位置326的天冬氨酸；在位置326的谷氨酸；在位置334的谷氨酰胺；在位置334的谷氨酸；在位置334的甲硫氨酸；在位置334的組氨酸；在位置334的纈氨酸；或在位置334的亮氨酸。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋在患有以癌癥抗原為特征的癌癥的患者中治療癌癥的方法，所述方法包含施用特異性結(jié)合癌癥抗原的、治療有效量的治療性抗體；所述治療性抗體包含變異Fc區(qū)，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述治療性抗體以比包含野生型Fc區(qū)的治療性抗體結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，所述治療性抗體進(jìn)一步以比包含野生型Fc區(qū)的治療性抗體結(jié)合FcγRIIB更低親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，條件是所述變異Fc區(qū)不具有在位置256、298、333或334的任何一處的丙氨酸。本發(fā)明涵蓋在以癌癥抗原為特征的患者中治療癌癥對(duì)方法，所述方法包括施用特異性結(jié)合所述癌癥抗原的、治療有效量對(duì)治療性抗體，所述治療性抗體包含變異Fc區(qū)，從而所述抗體具有增強(qiáng)的ADCC活性。

本發(fā)明涵蓋在有需要的患者中治療自體免疫失調(diào)和/或炎癥性失調(diào)的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述分子以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更大親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，并且所述分子進(jìn)一步以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更低親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，并且所述分子結(jié)合免疫復(fù)合物(例如，抗原/抗體復(fù)合物)。本發(fā)明涵蓋治療自體免疫失調(diào)和/或炎癥性失調(diào)的方法，進(jìn)一步包括施用用于治療和/或預(yù)防這些疾病的一個(gè)或多個(gè)附加的預(yù)防性或治療性藥劑，例如，免疫調(diào)節(jié)藥劑，抗炎癥藥劑。

本發(fā)明還涵蓋在受試者中治療或預(yù)防傳染性疾病的方法，包括施用結(jié)合傳染原或其細(xì)胞受體的、治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的分子。可以通過(guò)本發(fā)明的分子治療或預(yù)防的傳染性疾病是由傳染原，包括但不限于病毒、細(xì)菌、真菌、protozae和病毒引起的。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子具有針對(duì)傳染原，例如，病原性蛋白的增強(qiáng)的抗體效應(yīng)物功能。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子通過(guò)增強(qiáng)對(duì)引起傳染性疾病的傳染原的吞噬作用和/或調(diào)理作用來(lái)增強(qiáng)傳染性疾病治療的效力。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子通過(guò)增強(qiáng)對(duì)引起傳染性疾病的受感染細(xì)胞的ADCC來(lái)增強(qiáng)傳染性疾病治療的效力。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于治療或預(yù)防傳染性疾病的、治療或預(yù)防有效量的一種或額外的治療藥劑組合施用。本發(fā)明預(yù)期使用本發(fā)明的分子與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于治療和/或預(yù)防傳染性疾病的抗生素組合。

本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的分子，例如包含變異Fc區(qū)的多肽、包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白、根據(jù)本發(fā)明工程化的治療性抗體，和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明額外提供了藥物組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種額外的治療劑，包括但不限于，抗癌癥藥劑、抗炎癥藥劑、免疫調(diào)節(jié)藥劑。
3.1定義
如在此使用的，使用術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”來(lái)定義IgG重鏈的C-末端區(qū)域。盡管邊界可以稍微地不同，人類IgG重鏈Fc區(qū)被定義為從Cys226延伸到羧基末端。IgG的Fc區(qū)包含兩個(gè)恒定區(qū)，CH2和CH3。人類IgG Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域通常從氨基酸231延伸到氨基酸341。人類IgG Fc區(qū)的CH3結(jié)構(gòu)域通常從氨基酸342延伸到447。人類IgGFc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域(也稱為“Cγ2”結(jié)構(gòu)域)通常從氨基酸231延伸到340。CH2結(jié)構(gòu)域是獨(dú)特的，因?yàn)樗慌c另一個(gè)結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。更確切地，兩個(gè)N-連接的分支碳水化物鏈被插入到完整的天然IgG的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。

在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，IgG重鏈中殘基的編號(hào)是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，NH1，MD(1991)中EU索引的編號(hào)，通過(guò)引用明確地合并在此?！癒abat的EU索引”是指人類IgG1EU抗體的編號(hào)。

“鉸鏈區(qū)”一般被定義為從人類IgG1的Glu216延伸到Pro230。通過(guò)將形成重鏈內(nèi)S-S結(jié)合的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基放在相同位置，其他IgG同種型的絞鏈區(qū)可以與IgG1序列比對(duì)。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”和“多個(gè)抗體”是指單克隆抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝化抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物連接的雙特異性Fv(sdFv)、內(nèi)抗體(intrabodies)和抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括，例如，針對(duì)本發(fā)明的抗體的抗Id和抗抗Id抗體)和任何上述抗體的表位結(jié)合片段。特別是，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、種類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子類。

如在此使用的，在多肽或蛋白質(zhì)的上下文中術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指包含已經(jīng)通過(guò)引入氨基酸殘基替換、刪除或添加而改變的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“衍生物”還指一種多肽或蛋白質(zhì)，其已經(jīng)被修飾，即，通過(guò)將任何類型的分子共價(jià)附著到多肽或蛋白質(zhì)上。例如，而不是限制，抗體可以被修飾，例如，通過(guò)糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白水解性裂解、連接到細(xì)胞配體或其他蛋白，等等?？梢酝ㄟ^(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行化學(xué)修飾，包括但不限于特異性化學(xué)裂解、乙?；?、甲?；?、衣霉素的代謝合成，等等，來(lái)產(chǎn)生衍生多肽或蛋白。進(jìn)一步的，衍生的多肽或蛋白衍生物具有與衍生它們的多肽或蛋白類似的或相同的功能。

如在此使用的，在非蛋白類衍生物的上下文中術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指基于第一有機(jī)或無(wú)機(jī)分子的結(jié)構(gòu)形成的第二有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。有機(jī)分子的衍生物包括但不限于，例如通過(guò)添加或刪除羥基、甲基、乙基、羧基或胺基修飾的分子。有機(jī)分子也可以被酯化、烴化和/或磷酸化。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“失調(diào)”和“疾病”可互換地使用來(lái)指受試者中是狀況。特別地，術(shù)語(yǔ)“自體免疫疾病”與術(shù)語(yǔ)“自體免疫失調(diào)”可互換地使用，來(lái)指在受試者中以由受試者對(duì)他自己的細(xì)胞、組織和/或器官的免疫反應(yīng)引起的細(xì)胞、組織和/或器官損傷為特征的狀況。術(shù)語(yǔ)“炎癥疾病”與術(shù)語(yǔ)“炎癥失調(diào)”可互換地使用，來(lái)指在受試者中以炎癥、優(yōu)選的慢性炎癥為特征的狀況。自體免疫失調(diào)可能或可能不與炎癥相關(guān)。此外，炎癥可能或可能不由自體免疫失調(diào)引起。因而，某些失調(diào)可能以自體免疫和炎癥性失調(diào)為特征。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指由異常的不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)引起的贅生物或腫瘤。如在此使用的，癌癥明確地包括白血病和淋巴瘤。在某些實(shí)施方式中，癌癥是指良性腫瘤，其是保持局部化的。在其他實(shí)施方式中，癌癥是指惡性腫瘤，其侵入和破壞了鄰近的身體結(jié)構(gòu)并擴(kuò)散到遠(yuǎn)離的位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，癌癥與特異性癌癥抗原有關(guān)。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)試劑”和其變體是指調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)的試劑。在某些實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)試劑是免疫抑制劑試劑。在某些其他實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)試劑是免疫刺激試劑。免疫調(diào)節(jié)試劑包括但不限于小分子、肽、多肽、融合蛋白、抗體、無(wú)機(jī)分子、模擬試劑和有機(jī)分子。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“表位”是指在動(dòng)物中、優(yōu)選的在哺乳動(dòng)物中、和最優(yōu)選的在人類中具有抗原性或免疫原性的活性的多肽或蛋白或非蛋白分子的片段。具有免疫原性活性的表位是在動(dòng)物中引發(fā)抗體反應(yīng)的多肽或蛋白的片段。具有抗原性活性的表位是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法，例如通過(guò)免疫分析來(lái)測(cè)定的、抗體免疫特異性結(jié)合的多肽或蛋白質(zhì)的片段?？乖员砦徊槐匾欢ㄊ敲庖咴缘?。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“片段”是指肽或多肽，其包含另一個(gè)多肽的氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少70個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少連續(xù)80個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)90個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)100個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)125個(gè)氨基酸殘基、至少150個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少連續(xù)175個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)200個(gè)氨基酸殘基或至少連續(xù)250個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。在特定的實(shí)施方式中，多肽的片段保持了所述多肽的至少一種功能。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA和RNA分子的組合或雜交DNA/RNA分子，和DNA或RNA分子的類似物?？梢允褂美绾塑账犷愃莆飦?lái)產(chǎn)生這種類似物，所述核苷酸類似物包括但不限于次黃苷或三甲基化堿基。這種類似物也可以包含DNA或RNA分子，其包含給分子帶來(lái)有益特質(zhì)的修飾的主干，所述特質(zhì)例如核酸酶抗性或提高的跨細(xì)胞膜能力。所述核酸或核苷酸序列可以是單鏈的、雙鏈的，可以含有單鏈和雙鏈的部分，可以含有三鏈的部分，但優(yōu)選的是雙鏈DNA。

如在此使用的，“治療有效量”是指足夠治療或應(yīng)付疾病或失調(diào)的治療試劑的數(shù)量。治療有效量可以指足夠延遲或最小化疾病的發(fā)作，例如延遲或最小化癌癥的擴(kuò)散的治療試劑的數(shù)量。治療有效量也可以指在疾病的治療或控制中提供治療益處的治療試劑的數(shù)量。進(jìn)一步的，對(duì)于本發(fā)明的治療試劑治療有效量意思是在疾病的治療或控制中提供治療益處的、單獨(dú)的或與其他治療劑組合的治療試劑的數(shù)量。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防試劑”或“多個(gè)預(yù)防試劑”是指可用于預(yù)防失調(diào)或預(yù)防失調(diào)的復(fù)發(fā)或擴(kuò)散的任何試劑。預(yù)防有效量可以指足以在患者，包括但不限于易感染高增殖性疾病的那些患者，例如遺傳地易感染癌癥或早先暴露于致癌物質(zhì)的那些患者中，防止高增殖性疾病、特別是癌癥的復(fù)發(fā)或擴(kuò)散、或這種疾病的發(fā)生的預(yù)防試劑的數(shù)量。預(yù)防有效量也可以指在疾病的預(yù)防中提供預(yù)防性益處的預(yù)防試劑的數(shù)量。進(jìn)一步的，對(duì)于本發(fā)明的預(yù)防試劑預(yù)防有效量意思是在疾病的預(yù)防中提供預(yù)防益處的、單獨(dú)的或與其他試劑組合的預(yù)防試劑的數(shù)量。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防(“prevent”，“preventing”和“prevention”)”是指作為施用預(yù)防或治療試劑的結(jié)果在受試者中防止失調(diào)的一種或多種癥狀的復(fù)發(fā)或發(fā)作。

如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“組合”是指使用超過(guò)一種預(yù)防和/或治療試劑。使用術(shù)語(yǔ)“組合”不限制向患有失調(diào)的受試者施用預(yù)防性和/或治療試劑的順序。第一預(yù)防或治療試劑可以在向患有失調(diào)的受試者施用第二預(yù)防或治療試劑之前(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)、伴隨地、或隨后(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之后)施用。

如在此使用的“效應(yīng)物功能”是指由抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體的相互作用引起的生物化學(xué)事件。效應(yīng)物功能包括但不限于抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)，和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。效應(yīng)物功能包括在抗原的結(jié)合之后起作用的那些以及獨(dú)立于抗原結(jié)合操作的那些。

如在此使用的“效應(yīng)細(xì)胞”是指表達(dá)一種或多種Fc受體并介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)物功能的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞包括但不限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、Langerhans′細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞，可以來(lái)自任何有機(jī)體，包括但不限于人類、小鼠、大鼠、兔和猴。

如在此使用的“Fc配體”是指來(lái)自任何有機(jī)體的一種分子、優(yōu)選的一種多肽，其結(jié)合抗體的Fc區(qū)以形成Fc-配體復(fù)合物。Fc配體包括但不限于FcγRs、FcγRs、FcγRs、FcRn、C1q、C3、葡萄球菌蛋白A、鏈球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配體可以包括結(jié)合Fc的未被發(fā)現(xiàn)的分子。
4.附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明 附

圖1重組可溶性FcγR的SDS-PAGE分析
通過(guò)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳評(píng)估重組可溶性FcγR蛋白的純度。凝膠用考馬斯藍(lán)染色。泳道1純化的重組可溶性FcγRIIIA；泳道2分子量標(biāo)記物；泳道3分子量標(biāo)記物；泳道4純化的重組可溶性FcγRIIB。長(zhǎng)劃線是指標(biāo)記物的分子量，從上到下它們分別相應(yīng)于98、50、36和22KDa的分子量。
附圖2重組可溶性FcγR的ELISA分析
使用ELISA分析測(cè)定純化的重組可溶性FcγRIIIA與聚集的和單體的IgG的直接結(jié)合。與3G8聚集的IgG(▲)；生物素化的IgG(◆)；聚集的IgG(■)；與小鼠IgG1聚集的IgG(X)的結(jié)合。
附圖.3A和B使用ELISA分析表征FcγRIIIA四聚復(fù)合物 A.可溶的四聚FcγRIIIA復(fù)合物特異性地結(jié)合可溶的單體人類IgG?？扇艿乃木跢cγRIIIA與人類IgG的結(jié)合被小鼠抗FcγIIIA單克隆抗體3G8阻斷(◆)；攜帶D265A突變的4-4-20單克隆抗體不能阻斷可溶的四聚FcγRIIIA與聚集的人類IgG的結(jié)合(Δ)。
B.比較可溶的四聚FcγRIIIA復(fù)合物與可溶的單體人類IgG的結(jié)合(■)和單體的可溶FcγRIIIA與可溶的單體人類IgG的結(jié)合(◆)。
附圖4和B使用磁性珠子分析表征FcγRIIIA四聚復(fù)合物 A.FcγRIIIA復(fù)合物兩個(gè)FcγRIIIA(實(shí)心形狀)由單克隆抗體DJ130c(1stAb)連接；抗小鼠F(ab)2與PE軛合(圓圈)。
B.與Fc包被的珠子結(jié)合的FcγRIIIA的FACS分析(a)單獨(dú)的珠子；(b)無(wú)FcγRIIIA的復(fù)合物；(c)與FcγRIIIA的復(fù)合物；(d)與FcγRIIIA和LNK16的復(fù)合物。
附圖5含F(xiàn)c的構(gòu)建體的示意性呈示
呈現(xiàn)了克隆到pYD1中的IgG1Fc結(jié)構(gòu)域的示意圖?？招暮写磴q鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域；平行垂線代表CH1結(jié)構(gòu)域。對(duì)于GIF206和227構(gòu)建體，顯示了N-末端氨基酸。下劃線的殘基相應(yīng)于絞鏈區(qū)；＊代表Xpress表位tag；畫(huà)陰影線的盒子代表Gly4-Ser接頭，點(diǎn)畫(huà)的盒子代表Aga2p基因。
附圖6A-H在酵母細(xì)胞壁上Fc融合蛋白的FACS分析
用結(jié)合PE的山羊抗人類Fc抗體(附圖6A-D)或用小鼠抗人類IgG1Fc(CH3)特異性單克隆抗體HP6017(Sigma)(附圖6E-H)孵育細(xì)胞。A和E表示單獨(dú)的載體；畫(huà)面B和F表示CH1-CH3構(gòu)建體；畫(huà)面C和G表示GIF227；畫(huà)面D和H表示GIF 206構(gòu)建體。
附圖7A-C可溶的四聚FcγRIIIA與表面展示的Fc融合蛋白的結(jié)合
含有pYD1-CH1(A)；pYD-CH1-D265A(B)；和pYD載體(C)的細(xì)胞在一定條件下生長(zhǎng)以在細(xì)胞表面表達(dá)Aga2p融合蛋白。分別在0.15mM、7.5mM和7.5mM用FcγRIIIA孵育細(xì)胞，通過(guò)FACS分析。
附圖8表征可溶的四聚FcγRIIIA與表面展示的Fc融合蛋白的結(jié)合
分析在酵母細(xì)胞表面上FcγRIIIA四聚復(fù)合物與Fc融合蛋白的結(jié)合。結(jié)合PE的FcγRIIIA四聚復(fù)合物與不同濃度的3G8(◆)、LNK(▲)或不相關(guān)的同種型對(duì)照(■)預(yù)先孵育，隨后與酵母細(xì)胞孵育。通過(guò)FACS分析細(xì)胞的PE熒光。結(jié)合FcγRIIIA四聚復(fù)合物的細(xì)胞百分比在y軸上標(biāo)繪。
附圖9用于選擇具有對(duì)FcγRIIIA提高的結(jié)合的Fc突變體的分選門(mén)的實(shí)施例
用結(jié)合PE的FcγRIIIA四聚復(fù)合物(y軸)和結(jié)合抗Fc-FITC的抗體(x軸)染色細(xì)胞。方框的區(qū)域表示設(shè)置以選擇～1.0％的細(xì)胞群體的分選門(mén)。
附圖10A-N被鑒定具有對(duì)FcγRIIIA四聚復(fù)合物的提高的親合性的一些Fc突變體的FACS分析
攜帶含有含有的Fc突變的pYD-CH1質(zhì)粒的單個(gè)克隆在含有葡萄糖的選擇培養(yǎng)基上擴(kuò)增，在含半乳糖的選擇培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Fc表達(dá)，并隨后通過(guò)FACs分析。附圖10A和B表示攜帶野生型Fc的細(xì)胞；附圖10C和D表示突變體#5；附圖10E和F表示突變體#20；附圖10G和H表示突變體#21；附圖10I和J表示突變體#24；附圖10K和L表示突變體#25；附圖10M和N表示突變體#27。用FcγRIIIA四聚復(fù)合物(附圖10A、C、E、G、I、K和M)或FcγRIIB四聚復(fù)合物(附圖10B、D、F、H、J、L和N)染色細(xì)胞。
附圖11A-B通過(guò)ELISA表征4-4-20單克隆抗體中的Fc突變體
將來(lái)自pYD-CH1質(zhì)粒的Fc結(jié)構(gòu)域克隆到嵌合4-4-20單克隆抗體的重鏈中。在293細(xì)胞中表達(dá)4-4-20單克隆抗體，收集上清液。用結(jié)合熒光素的BSA包被ELISA平板來(lái)捕獲嵌合的4-4-20突變抗體。然后將FcγRIIIA(A)和FcγRIIB(B)受體包被在已經(jīng)吸收了4-4-20單克隆抗體的ELISA平板上，以測(cè)定變異受體對(duì)Fc結(jié)構(gòu)域的相對(duì)親合性。突變體#15和#29是作為對(duì)照包括的非結(jié)合分離物。
附圖12在4-4-20單克隆抗體中突變體的ADCC活性
評(píng)估含有突變Fc區(qū)的4-4-20抗體的ADCC活性，并與野生型4-4-20抗體的ADCC活性比較。分析的突變體如下MGFc-10(K288N、A330S、P396L)、MGFc-26(D265A)、MGFc-27(G316D、A378V、D399E)、MGFc28(N315I、A379M、D399E)、MGFc29(F243I、V379L、G420V)、MGFc30(F275V)、MGFc-31(P247L、N421K)、MGFc-32(D280E、S354F、A431D、L441I)、MGFc-33(K317N、F423deleted)、MGFc-34(F241L、E258G)、MGFc-35(R255Q、K326E)、MGFc-36(K218R、G281D、G385R) 附圖13A和B在HER2/NEU人源化單克隆抗體中突變體的ADCC活性 A.評(píng)估含有突變Fc區(qū)的人源化HER2/neu單克隆抗體的ADCC活性，并與野生型Her2/neu抗體的ADCC活性比較。分析的突變體如下MGFc-5(V379M)、MGFc-9(F243I、V379L)、MGFc-10(K288N、A330S、P396L)、MGFc-13(K334E、T359N、T366S)、MGFc-27(G316D、A378V、D399E)。
B.在人源化Her2/neu單克隆抗體的環(huán)境中額外的突變的ADCC活性MGFc-37(K248M)、MGFc-39(E293V Q295E、A327T)、MGFc-38(K392T、P396L)、MGFc-41(H268N、P396L)、MGFc-23(K334E、R292L)、MGFc-44、MGFc-45。每個(gè)突變測(cè)試了兩個(gè)獨(dú)立的克隆。
附圖14在BSA-FITC表面上捕獲CH 4-4-20抗體
將濃度大約20μg/ml的6μL抗體以5μL/min注射到BSA-熒光異硫氰酸鹽(FITC)表面上。顯示了在BSA-FITC固定化的傳感器船的表面上ch抗體與突變Fc區(qū)的結(jié)合的BIAcore sensogram。在野生型捕獲的抗體反應(yīng)上設(shè)置標(biāo)記。
附圖15FcγRIIIA與攜帶變異Fc區(qū)的CH 4-4-20抗體的實(shí)時(shí)結(jié)合的SENSOGRAM
在200nM濃度分析FcγRIIIA與攜帶變異Fc區(qū)的ch-4-4-20抗體的結(jié)合。在為野生型獲得的ch-4-4-20抗體的水平處將反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。

使用的突變?nèi)缦翸ut 6(S219V)、Mut 10(P396L、A330S、K288N)；Mut 18(K326E)；Mut 14(K334E、K288N)；Mut 11(R255L、F243L)；Mut 16(F372Y)；Mut 19(K334N、K246I)。
附圖16A-H FcγRIIIA結(jié)合攜帶變異Fc區(qū)的抗體的動(dòng)力參數(shù)的分析
通過(guò)對(duì)200nM和800nM產(chǎn)生獨(dú)立的最佳似合曲線來(lái)獲得FcγRIIIA結(jié)合攜帶變異Fc區(qū)的抗體的動(dòng)力參數(shù)。實(shí)線表明了相關(guān)似合，其是根據(jù)對(duì)32-34秒間隔的解離曲線計(jì)算的koff值獲得的。Kd和koff值代表兩個(gè)濃度的平均數(shù)。
附圖17FcγRIIB-Fc融合蛋白與攜帶變異Fc區(qū)的抗體的實(shí)時(shí)結(jié)合的SENSOGRAM
在200nM濃度分析了FcγRIIB-Fc融合蛋白與攜帶變異Fc區(qū)的ch-4-4-20抗體的結(jié)合。在為野生型獲得的ch-4-4-20抗體的水平處將反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。
附圖18A-CFcγRIIB-Fc融合蛋白對(duì)攜帶變異Fc區(qū)的抗體的動(dòng)力參數(shù)的分析
通過(guò)對(duì)200nM和800nM產(chǎn)生獨(dú)立的最佳似合曲線來(lái)獲得FcγRIIB-Fc結(jié)合攜帶變異Fc區(qū)的抗體的動(dòng)力參數(shù)。實(shí)線表明了相關(guān)似合，其是根據(jù)對(duì)32-34秒間隔的解離曲線計(jì)算的koff值獲得的。Kd和koff值代表兩個(gè)濃度的平均數(shù)。

使用的突變?nèi)缦翸ut 6(S219V)、Mut 10(P396L、A330S、K288N)；Mut 18(K326E)；Mut 14(K334E、K288N)；Mut 11(R255L、F243L)；Mut 16(F372Y)；Mut 19(K334N，K246I)。
附圖19相對(duì)于ADCC數(shù)據(jù)標(biāo)繪的FcγRIIIA-Fc的Koff(WT)/Koff(MUT)比例
比一個(gè)數(shù)字更高的數(shù)字顯示了相對(duì)于野生型、FcγRIIIA結(jié)合的降低的離解速率和FcγRIIB-Fc結(jié)合的提高的離解速率。方框中突變對(duì)于FcγRIIIA結(jié)合具有更低的off速率，對(duì)于FcγRIIB-Fc結(jié)合有更高的off速率。
附圖20與未標(biāo)記FcγRIIIA競(jìng)爭(zhēng)
進(jìn)行動(dòng)力學(xué)篩選來(lái)鑒定具有結(jié)合FcγRIIIA的改善的Koff速率的Fc區(qū)突變。含有P396L突變的Fc區(qū)變體的庫(kù)用0.1μM生物素化的FcγRIIIA-接頭-Avitag孵育一小時(shí)然后洗滌。隨后0.8μM未標(biāo)記FcγRIIIA與標(biāo)記的酵母孵育不同的時(shí)點(diǎn)。旋轉(zhuǎn)沉淀酵母，除去未標(biāo)記FcγRIIIA，結(jié)合受體的酵母用SA(鏈霉抗生物素蛋白):PE(藻紅素)染色用于FACS分析。
附圖21A-C基于動(dòng)力學(xué)篩選的FACS分析
根據(jù)來(lái)自附圖20中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)計(jì)算的Koff，選擇一分鐘時(shí)點(diǎn)選擇。用0.1μM生物素化的FcγRIIIA-接頭-Avitag單體孵育10倍過(guò)量的庫(kù)；洗滌細(xì)胞并用未標(biāo)記的配體孵育一分鐘，然后洗滌并用SA:PE標(biāo)記。然后通過(guò)FACS分選細(xì)胞，選擇上面0.3％binders。將未選擇的P396L庫(kù)與通過(guò)FACS選擇了改善的結(jié)合的酵母細(xì)胞比較。直方圖顯示了用FcγRIIIA/PE和山羊抗人類Fc/FITC共染色的細(xì)胞的百分比。
附圖22A-B根據(jù)FcγRIIB Fc BINDERS的固相耗盡的選擇
A.使用磁性珠子根據(jù)FcγRIIB耗盡和FcγRIIIA選擇來(lái)篩選P396L庫(kù)。通過(guò)磁性珠子的FcγRIIB耗盡重復(fù)5次。分析產(chǎn)生的酵母群體，發(fā)現(xiàn)顯示了超過(guò)50％的山羊人抗Fc染色的細(xì)胞，和非常小百分比的FcγRIIIA染色的細(xì)胞。隨后，使用0.1μM生物素化的FcγRIIIA接頭-avitag通過(guò)FACS選擇細(xì)胞兩次。在每次分選后分析酵母細(xì)胞的FcγRIIIA和FcγRIIB結(jié)合并與野生型結(jié)合比較。
B.使用生物素化的FcγRIIIA 158F接頭avitag單體作為配體從耗盡FcγRIIB的酵母群體中選擇Fc突變體。設(shè)置分選門(mén)來(lái)選擇頂部0.25％FcγRIIIA 158F binders。通過(guò)FACS分析產(chǎn)生的富集群體與不同的FcγRIIIA(158F和158V)、FcγRIIIB和FcγRIIA(131R)的結(jié)合。
附圖23由攜帶Fc突變體的嵌合4D5介導(dǎo)的SKBR3目標(biāo)細(xì)胞裂解的相對(duì)比例
為每個(gè)測(cè)試的Fc突變體計(jì)算了裂解的相對(duì)比例。帶有Fc突變體的4D5抗體的裂解率除以由野生型4D5抗體介導(dǎo)的裂解的比率。將來(lái)自至少2個(gè)獨(dú)立的分析的數(shù)據(jù)平均，標(biāo)繪在直方圖上。對(duì)每個(gè)Fc突變體，顯示了來(lái)自兩種不同抗體濃度的數(shù)據(jù)。選擇抗體濃度，來(lái)側(cè)翼于曲線上裂解為～50％處的點(diǎn)。
附圖24由攜帶Fc突變體的嵌合2H7介導(dǎo)的DAUDI細(xì)胞裂解的相對(duì)比例
為每個(gè)測(cè)試的Fc突變體計(jì)算了裂解的相對(duì)比例。帶有Fc突變體的2H7抗體的裂解率除以由野生型2H7抗體介導(dǎo)的裂解的比率。將來(lái)自至少1-2個(gè)獨(dú)立的分析的數(shù)據(jù)平均，標(biāo)繪在直方圖上。對(duì)每個(gè)Fc突變體，顯示了來(lái)自兩種不同抗體濃度的數(shù)據(jù)。根據(jù)曲線上裂解為～50％處的點(diǎn)來(lái)選擇抗體濃度。
附圖25庫(kù)產(chǎn)生的方案
顯示了DNA鏈。正向箭頭代表含有突變密碼子的引物。反向箭頭代表反向的基因特異性低聚物。
附圖26通過(guò)構(gòu)建基因方案產(chǎn)生庫(kù)的策略
矩形方框分別代表鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。短的黑線代表具有5’突出的雙鏈低聚物。
附圖27新的Fc突變體在SKBR3細(xì)胞中改善PBMC介導(dǎo)的ADCC
圖表顯示了標(biāo)準(zhǔn)ADCC分析的線性回歸分析。使用75∶1的效應(yīng)物對(duì)目標(biāo)比，在3logs上滴定抗體。裂解％＝(實(shí)驗(yàn)的釋放-SR)/(MR-SR)＊100。
附圖28新的Fc突變體在DAUDI細(xì)胞中改善PBMC介導(dǎo)的ADCC
圖表顯示了標(biāo)準(zhǔn)ADCC分析的線性回歸分析。使用75∶1的效應(yīng)物對(duì)目標(biāo)比，在3logs上滴定抗體。裂解％＝(實(shí)驗(yàn)的釋放-SR)/(MR-SR)＊100。
附圖29在單核細(xì)胞的細(xì)胞因子處理時(shí)通過(guò)FACS的Fc受體分布型
單核細(xì)胞的細(xì)胞因子處理提高了Fc受體表達(dá)的低親合性。使用特異性細(xì)胞因子在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)淘選的單核細(xì)胞。使用FACS分析Fc受體分布型。
附圖30在基于ADCC的巨噬細(xì)胞衍生的單核細(xì)胞中使用Fc突變體改善的腫瘤細(xì)胞殺傷
使用35∶1的效應(yīng)物目標(biāo)比例測(cè)試2logs上的Ch4D5MAb濃度計(jì)算裂解百分比，在附圖28中。
附圖31補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性分析流程圖
該流程圖概括了所使用的CDC分析。
附圖32補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性活性
顯示了對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的結(jié)合的Fc突變體也顯示了改善的補(bǔ)體活性。滴定了3個(gè)數(shù)量級(jí)上的抗CD20ChMAb。計(jì)算裂解百分比，在附圖28中。
附圖33選擇Fc突變體的判定樹(shù)
選擇Fc突變體的示例性方案。
附圖34C1q結(jié)合2B6抗體
A.圖表描繪了分析2B6結(jié)合補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的第一個(gè)成分的BIAcore形式。

B.攜帶變異Fc區(qū)的2B6抗體與C1q的實(shí)時(shí)結(jié)合的Sensogram。
附圖35A-D C1q結(jié)合2B6突變抗體
2B6突變體與C1q的實(shí)時(shí)結(jié)合的Sensogram(3.25nM)。描繪的突變體MgFc51(Q419H、P396L)；畫(huà)面A中MgFc51/60；MgFc55和MgFc55/60(畫(huà)面B)，MgFc59和MgFc59/60(畫(huà)面C)；和MgFc31/60(畫(huà)面D)。
附圖36A-D具有與FcγRIIB降低的結(jié)合的Fc變體
FcR與ch4D5抗體結(jié)合來(lái)比較D270E(60)對(duì)R255L、P396L雙突變體(MgFc55)的影響。在不同的FcR濃度；400nM CD16A 158V；800nM CD16A 158F；200nM CD32B；200nM CD32A 131H分析KD。使用Biacore 3000軟件使用獨(dú)立的KD進(jìn)行分析。
附圖37A-D從FcγRIIB耗盡/FcγRIIAH131選擇中選出的4D5突變體的動(dòng)力學(xué)特征
FcR與ch4D5抗體的結(jié)合，所述抗體攜帶通過(guò)CD32B耗盡和CD32A H131篩選策略選擇的不同F(xiàn)c突變?cè)诓煌腇cR濃度；400nM CD16A 158V；800nM CD16A 158F；200nM CD32B；200nMCD32A 131H分析KD。使用Biacore 3000軟件使用獨(dú)立的KD進(jìn)行分析。
附圖38MDM ADCC數(shù)據(jù)相對(duì)KOFF的圖表，KOFF是如BIACORE所測(cè)定的針對(duì)CD32A 131H結(jié)合確定的。

突變?nèi)缦翸gFc 25(E333A、K334A、S298A)；MgFc68(D270E)；MgFc38(K392T、P396L)；MgFc55(R255L、P396L)；MgFc31(P247L、N421K)；MgFc59(K370E、P396L)。
5.優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明
本發(fā)明涉及分子、優(yōu)選的多肽、更優(yōu)選的免疫球蛋白(例如，抗體)，其包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換，但也包括插入或刪除)的變異Fc區(qū)，所述修飾改變，例如，提高或降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγR的親合性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于測(cè)定Fc-FcγR相互作用的方法和在此公開(kāi)的方法，例如ELISA分析或表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析所測(cè)定的，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，即與具有變異Fc區(qū)的所述分子相同但不具有所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的分子，所述變異Fc區(qū)以更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子所述變異Fc區(qū)以降低的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子進(jìn)一步以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIB更低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB(經(jīng)由Fc區(qū))。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子所述變異Fc區(qū)以更高的親合性結(jié)合FcγRIIIA和FcγRIIB。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子所述變異Fc區(qū)以更高的親合性結(jié)合FcγRIIB。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子所述變異Fc區(qū)以降低的親合性結(jié)合FcγRIIB。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子所述變異Fc區(qū)不顯示與任何FcγR的可檢測(cè)的結(jié)合(例如，通過(guò)例ELISA分析所測(cè)定的，不結(jié)合FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIIA)。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述變異Fc區(qū)僅結(jié)合一種FcγR，其中所述FcγR是FcγIIIA。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述變異Fc區(qū)僅結(jié)合一種FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述變異Fc區(qū)僅結(jié)合一種FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。本發(fā)明特別涉及通過(guò)增強(qiáng)，例如，治療性抗體的效應(yīng)物功能，例如增強(qiáng)ADCC來(lái)修飾人類或人源化治療性抗體(例如，腫瘤特異性抗血管生成或抗炎性單克隆抗體)用于增強(qiáng)治療性抗體的效力。

本發(fā)明的分子對(duì)FcγR的親合性和結(jié)合性質(zhì)最初使用本領(lǐng)域已知用于測(cè)定Fc-FcγR相互作用，即，F(xiàn)c區(qū)與FcγR的特異性結(jié)合的體外分析(基于生物化學(xué)或免疫學(xué)的分析)來(lái)測(cè)定，包括但不限于ELISA分析、表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析、免測(cè)沉淀分析(參見(jiàn)5.2.1節(jié))。優(yōu)選的，本發(fā)明的分子的結(jié)合性質(zhì)也通過(guò)用于測(cè)定一種或多種FcγR介體效應(yīng)細(xì)胞功能的體外功能分析來(lái)表征(參見(jiàn)5.2.6節(jié))。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子在體內(nèi)模型(例如，在此描述和公開(kāi)的那些)中具有與基于體外的分析的那些所類似的結(jié)合性質(zhì)。然而，本發(fā)明不排除在基于體外的分析中不展現(xiàn)期望的表型、但在體內(nèi)展現(xiàn)期望的表型的本發(fā)明的分子。

在某些實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子包含在Fc區(qū)的CH3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述CH3結(jié)構(gòu)域被定義為從氨基酸342延伸到447。在其他實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子包含在Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸修飾，所述CH2結(jié)構(gòu)域被定義為從氨基酸231延伸到341。在某些實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子包含至少兩個(gè)氨基酸修飾，其中一個(gè)修飾在CH3區(qū)中，一個(gè)修飾在CH2區(qū)中。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋在絞鏈區(qū)中的氨基酸修飾。如使用在此描述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測(cè)定的，在CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的本發(fā)明的分子具有對(duì)FcγR的改變的親合性。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋在Fc區(qū)的CH1結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾。

在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異具有提高的對(duì)FcγRIIA(CD32A)的結(jié)合和/或提高的ADCC活性，如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和在此例示的方法所測(cè)定的。根據(jù)本發(fā)明的方法使用的ADCC分析可以是NK依賴性或巨噬細(xì)胞依賴性的。

本發(fā)明的Fc變體可以與其他已知的Fc修飾組合，包括但不限于改變效應(yīng)物功能的修飾和改變FcγR結(jié)合親合性的修飾。在特定的實(shí)施方式中，包含CH3結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域或絞鏈區(qū)中的第一氨基酸修飾的本發(fā)明的Fc變體，可以與第二Fc修飾組合，使得所述第二Fc修飾不處在與第一修飾相同的結(jié)構(gòu)域，從而第一氨基酸修飾對(duì)所述第二氨基酸修飾賦予相加的、協(xié)同的或新的性質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體不具有CH2結(jié)構(gòu)域中的任何氨基酸修飾。

本發(fā)明的Fc變體可以與本領(lǐng)域已知的Fc修飾的任一種組合，例如在以下的表2中公開(kāi)的那些。
表2.
在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體可以與本領(lǐng)域已知的任何Fc修飾組合，例如在以下表3A和B中公開(kāi)的那些。
表3A


表3B



＊＊注意，該表格使用Kabat中的EU編號(hào)。

在優(yōu)選的特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述分子具有對(duì)FcγR的改變的親合性，條件是所述變異Fc區(qū)不具有一些位置處的替換，根據(jù)例如Sondermann等(2000Nature，406267-273，通過(guò)完全引用將其合并在此)所公開(kāi)的那些的Fc-FcγR相互作用的結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析，所述位置與FcγR進(jìn)行直接接觸。與FcγR進(jìn)行直接接觸的Fc區(qū)內(nèi)的位置的實(shí)例是氨基酸234-239(絞鏈區(qū))、氨基酸265-269(B/C環(huán))、氨基酸297-299(C′/E環(huán))和氨基酸327-332(F/G)環(huán)。在某些實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子包含至少一個(gè)殘基的修飾，根據(jù)結(jié)構(gòu)或結(jié)晶分析所述修飾不與FcγR進(jìn)行直接接觸。

FcγR相互作用結(jié)構(gòu)域定位于IgG重鏈的較低絞鏈區(qū)和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的選擇位點(diǎn)。如根據(jù)誘變研究和使用小肽抑制物的研究分別表明的(Sondermann et al.，2000Nature，406267-273；Diesenhofer et al.，1981，Biochemistry，202361-2370；Shields et al.，2001，J.Biol.Chem.2766591-6604；通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此)，側(cè)翼于實(shí)際接觸位置的氨基酸殘基和CH3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基在IgG/FcγR相互作用中起了作用。如在此使用的直接接觸是指相互處在至少1A、至少2或至少3埃之內(nèi)、或處在1

、1.2

、1.5

、1.7

或2

范德華半徑內(nèi)的那些氨基酸。影響Fc相互作用蛋白的結(jié)合、在Fc上早先鑒定的位點(diǎn)的示范性列表在以下的表4中列出。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋在下列的位點(diǎn)處不具有任何修飾的Fc變體。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋Fc變體，其包含在下列一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的氨基酸修飾以及在此公開(kāi)的其他修飾，從而這樣的修飾對(duì)突變體的性質(zhì)具有協(xié)同的或相加的效果。
表4.影響Fc相互作用蛋白的結(jié)合、在Fc上的早先鑒定的位點(diǎn)
表4列出了Fc區(qū)內(nèi)的位點(diǎn)，它們?cè)缦缺昏b定對(duì)于Fc-FcR相互作用是重要的。標(biāo)為FcR-Fc的列指明了FcR接觸的Fc鏈。字母指明引用了數(shù)據(jù)的參考文獻(xiàn)。C是Shields et al.，2001，J.Biol.Chem.2766591-6604；D是Jefferis et al.，1995，Immunol.Lett.44111-7；E是Hinton et al；2004，J.Biol.Chem.279(8)6213-6；F是Idusogieet al.，2000，J.Immunol.1644178-4184；通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子所述分子以改變的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述變異Fc區(qū)不具有或不單獨(dú)地在位置255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439的任何一處替換。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子所述分子以改變的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述變異Fc區(qū)不具有或不單獨(dú)地在位置255、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439的任何一處替換，并且不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360、326或430的任何一處的丙氨酸；位置330的賴氨酸；位置339的蘇氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的絲氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的組氨酸；位置334的纈氨酸；或位置334的亮氨酸；位置335的賴氨酸位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；位置290的絲氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸；位置326的絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的賴氨酸；位置335的谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)不具有或不單獨(dú)地在位置268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439任何一處替換，并且不具有位置280的組氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸；位置290的絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或酪氨酸，位置300的亮氨酸或異亮氨酸；位置294的天冬酰胺，位置296的脯氨酸；位置298的脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或纈氨酸；位置295的賴氨酸。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子所述分子以降低的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述變異Fc區(qū)不具有或不單獨(dú)具有在位置252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439的任何一處的替換。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子所述分子以增強(qiáng)的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述變異Fc區(qū)不具有或不單獨(dú)地具有位置280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430的任何一處的替換。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)不包括或不單獨(dú)地在位置330、243、247、298、241、240、244、263、262、235、269或328任何一處替換，并且不具有位置243的亮氨酸、位置298的天冬酰胺，位置241的亮氨酸，和位置240的異亮氨酸或丙氨酸，位置244的組氨酸，位置330的纈氨酸，或位置328的異亮氨酸。

在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有對(duì)活化性和/或抑制性受體的改變的親合性、具有變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾是在位置288用天冬酰胺、在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc10)(參見(jiàn)表5)；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用絲氨酸替換(MgFc13)；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸替換(MgFc27)；或在位置392用蘇氨酸、在位置396用亮氨酸替換(MgFc38)；或在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用組氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用天冬氨酸替換(MgFc42)；或在位置240用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc52)；或在位置410用組氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc53)；或在位置243用亮氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc54)；或在位置255用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc55)；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc59)。

在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置396用亮氨酸、在位置270用谷氨酸以及在位置243用亮氨酸替換。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述分子進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，所述修飾例如在此公開(kāi)的那些。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，所述變異Fc區(qū)在一個(gè)或多個(gè)以下位置具有氨基酸修飾185、142、192、141、132、149、133、125、162、147、119、166、251、292、290、291、252、288、268、256、262、218、214、205，215、247、275、202、289、258、219、279、222、246、233、246、268、244、217、253、246、224、298、280、255、218、281、284、216、223、235、221、252、241、258、227、231、215、274、287、244、229、287、291、240、281、232、269、225、246、246、293、295、248、276、268、210、288、227、221、217、261、210、242、255、240、250、247、258、246、282、219、225、270、263、272、292、233、247、254、243、347、339、392、399、301、315、383、396、385、348、333、334、310、337、371、359、366、359、379、330、318、395、319、380、305、309、335、370、378、394、386、377、358、384、397，372、326、320、375、327、381、354、385、335、387、353、375、383、397、345、375、389、335、394、316、399、315、394、382、390、369、377、304、323、313、388、339、317、365、367、340、311、312、398、343、352、362、303、308、327、307、344、328、393、355、360、306、361、355、415、408、409、407、424、401、402、435、421、431、441、440、435、431、442、400、422、406、411、422、433、406、423、420、412、447、443、414、433、428、446、402、419、410、404、427、417、433、436、438、416。優(yōu)選的這些突變產(chǎn)生分子，所述分子具有對(duì)FcγR的改變的親合性和/或具有改變的效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的功能，如使用在此公開(kāi)和例示以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測(cè)定的。

本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，所述變異Fc區(qū)包含或由以下在表5中列出的任何突變組成。
表5.示范性的突變



在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，所述變異Fc區(qū)具有超過(guò)兩個(gè)氨基酸修飾。這種變體的非限制性實(shí)例在以下的表格(表6)中列出。本發(fā)明涵蓋表6中列出的突變，其進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，所述修飾例如在此公開(kāi)的那些。
表6.示范性的組合變體
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述分子、優(yōu)選的免疫球蛋白，進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，從而一個(gè)或多個(gè)碳水化物部分共價(jià)地附著到所述分子上。優(yōu)選的，具有在Fc區(qū)中一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)和/或一個(gè)或多個(gè)修飾的本發(fā)明的抗體具有增強(qiáng)的抗體介導(dǎo)的效應(yīng)物功能，例如，增強(qiáng)的ADCC活性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步包含抗體，其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，所述氨基酸已知直接或間接地于抗體的碳水化物部分相互作用，包括但不限于位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301的氨基酸。直接或間接地于抗體的碳水化物部分相互作用的氨基酸是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)，例如Jefferis et al.，1995ImmunologyLetters，44111-7，通過(guò)完全引用將它合并在此。

本發(fā)明涵蓋抗體，所述抗體已經(jīng)通過(guò)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)到抗體的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)來(lái)修飾，優(yōu)選的不改變所述抗體的功能，例如對(duì)FcγR的結(jié)合活性。糖基化位點(diǎn)可以導(dǎo)入到本發(fā)明的抗體的可變區(qū)或恒定區(qū)。如在此使用的，“糖基化位點(diǎn)”包括抗體中的任何特定氨基酸序列，低聚糖(即，含有連接在一起的兩個(gè)或多個(gè)單糖的碳水化物)將特異性地和共價(jià)地連接到所述序列。低聚糖側(cè)鏈一般經(jīng)由N-或O-鍵與抗體的主干連接。N-連接的糖基化是指低聚糖部分附著到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。O-連接的糖基化是指低聚糖部分附著到羥氨基酸，例如絲氨酸、蘇氨酸上。本發(fā)明的抗體可以包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，包括N-連接的和O-連接的糖基化位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明可以使用本領(lǐng)域已知的用于N-連接或O-連接的糖基化的任何糖基化位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的方法有用的示范性的N-連接的糖基化位點(diǎn)是氨基酸序列Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任何氨基酸，Thr/Ser代表蘇氨酸或絲氨酸。可以使用本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中公知的方法將這樣的位點(diǎn)導(dǎo)入本發(fā)明的抗體中。參見(jiàn)，例如，″In Vitro Mutagenesis，″Recombinant DNAA Short Course，J.D.Watson，et al.W.H.Freemanand Company，New York，1983，chapter 8，PP.106-116，通過(guò)完全引用將它合并在此。將糖基化位點(diǎn)導(dǎo)入本發(fā)明的抗體的示范性的方法可以包括修飾或突變抗體的氨基酸序列，從而獲得期望的Asn-X-Thr/Ser序列。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)添加或刪除糖基化位點(diǎn)來(lái)修飾本發(fā)明的抗體的碳水化合物含量的方法。修飾抗體的碳水化合物含量的方法是本領(lǐng)域公知的并涵蓋在本發(fā)明中，美國(guó)專利No.6,218,149；EP 0 359 096 B1；美國(guó)公開(kāi)No.US 2002/0028486；WO03/035835；美國(guó)公開(kāi)No.2003/0115614；美國(guó)專利No.6,218,149；美國(guó)專利No.6,472,511；通過(guò)完全引用將它們所有的合并在此。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)刪除抗體的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性碳水化物部分來(lái)修飾本發(fā)明的抗體的碳水化合物含量的方法。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾鄰近于297的位置來(lái)移動(dòng)抗體的Fc區(qū)的糖基化位點(diǎn)。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋修飾位置296，從而位置296而不是位置297被糖基化。
5.1具有變異Fc區(qū)的多肽和抗體
本發(fā)明部分地基于使用酵母展示系統(tǒng)鑒定具有對(duì)不同的FcγR受體的改變的親合性的、突變的人類IgG1重鏈Fc區(qū)。因而，本發(fā)明涉及分子、優(yōu)選的多肽、更優(yōu)選的免疫球蛋白(例如，抗體)，其包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換，但也包括插入或刪除)的變異Fc區(qū)，所述修飾改變所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγR的親合性。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，除了氨基酸替換之外，本發(fā)明預(yù)期Fc區(qū)氨基酸序列的其他修飾，來(lái)產(chǎn)生具有一種或多種改變的性質(zhì)，例如，改變的效應(yīng)物功能的Fc區(qū)變體。本發(fā)明預(yù)期刪除Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來(lái)降低與FcγR的結(jié)合。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式，不超過(guò)5個(gè)、不超過(guò)10個(gè)、不超過(guò)20個(gè)、不超過(guò)30個(gè)、不超過(guò)50個(gè)Fc區(qū)殘基將被刪除。此處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸刪除的Fc區(qū)優(yōu)選的保持了野生型Fc區(qū)的至少約80％、和優(yōu)選的至少約90％、和更優(yōu)選的至少約95％。在某些實(shí)施方式中，維持了所述分子的一種或多種性質(zhì)，例如，非免疫原性、FcγRIIIA結(jié)合、FcγRIIA結(jié)合，或這些性質(zhì)的組合。

在可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋氨基酸插入以產(chǎn)生Fc區(qū)變體，所述變體具有改變的性質(zhì)，包括改變的效應(yīng)物功能。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋將至少一個(gè)氨基酸殘基，例如一到兩個(gè)氨基酸殘基和優(yōu)選的不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基導(dǎo)入鄰近于在此鑒定的一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)位置。在可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋將至少一個(gè)氨基酸殘基，例如一到兩個(gè)氨基酸殘基和優(yōu)選的不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基導(dǎo)入鄰近于本領(lǐng)域已知影響FcγR相互作用和/或結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)位置。

本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋摻入非天然氨基酸來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的Fc變體。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如使用天然的生物合成機(jī)制來(lái)容許將非天然氨基酸摻入到蛋白質(zhì)中，參見(jiàn)，例如，Wang et al.，2002Chem.Comm.11-11；Wang et al.，2001，Science，292498-500；van Hest et al.，2001.Chem.Comm.191897-1904，通過(guò)完全引用將它們的每一個(gè)合并在此?？蛇x擇的策略集中于有關(guān)氨基?；鵷RNA的生物合成的酶，參見(jiàn)，例如，Tang et al.，2001，J.Am.Chem.123(44)11089-11090；Kiick et al.，2001，F(xiàn)EBS Lett.505(3)465，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

本發(fā)明的分子對(duì)FcγR的親合性和結(jié)合性質(zhì)最初使用本領(lǐng)域已知用于測(cè)定Fc-FcγR相互作用，即，F(xiàn)c區(qū)與FcγR的特異性結(jié)合的體外分析(基于生物化學(xué)或免疫學(xué)的分析)來(lái)測(cè)定，包括但不限于ELISA分析、表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析、免測(cè)沉淀分析(參見(jiàn)5.2.1節(jié))。優(yōu)選的，本發(fā)明的分子的結(jié)合性質(zhì)也通過(guò)用于測(cè)定一種或多種FcγR介體效應(yīng)細(xì)胞功能的體外功能性分析來(lái)表征(參見(jiàn)5.2.6節(jié))。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子在體內(nèi)模型(例如，在此描述和公開(kāi)的那些)中具有與基于體外的分析的那些所類似的結(jié)合性質(zhì)。然而，本發(fā)明不排除在基于體外的分析中不展現(xiàn)期望的表型、但在體內(nèi)展現(xiàn)期望的表型的本發(fā)明的分子。在附圖33中描述了篩選和表征本發(fā)明的分子的代表性的流程圖。

本發(fā)明涵蓋包含以更大的親合性結(jié)合一種或多種FcγR的變異Fc區(qū)的分子。如下文討論的，這種分子優(yōu)選的更有效地介導(dǎo)效應(yīng)物功能。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含以更弱的親合性結(jié)合一種或多種FcγR的變異Fc區(qū)的分子。在某些情況下效應(yīng)物功能的降低或消除是可取的，例如，對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)，所述抗體的作用機(jī)制涉及阻斷或拮抗而不是殺死攜帶目標(biāo)抗原的細(xì)胞。在自體免疫疾病的情況下，其中人體將阻斷效應(yīng)細(xì)胞中FcγR活化受體(這種類型的功能將在宿主細(xì)胞中呈現(xiàn))，效應(yīng)物功能降低或消除將是可取的。一般地，提高的效應(yīng)物功能將針對(duì)腫瘤和外源細(xì)胞。

本發(fā)明的Fc變體可以與其他Fc修飾組合，包括但不限于改變效應(yīng)物功能的那些。本發(fā)明涵蓋組合本發(fā)明的Fc變體與其他Fc修飾來(lái)提供抗體或Fc融合物中相加的、協(xié)同的、或新的性質(zhì)。優(yōu)選的本發(fā)明的Fc變體增強(qiáng)它們與之組合的修飾的表型。例如，如果本發(fā)明的Fc變體與一種突變體組合，所述突變體已知以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更高親合性結(jié)合FcγRIIIA；與本發(fā)明的突變的組合引起在FcγRIIIA親合性上更大倍數(shù)的增強(qiáng)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體可以與其他已知的Fc變體組合，例如在Duncan et al，1988，Nature 332563-564；Lund etal.，1991，J.Immunol 1472657-2662；Lund et al，1992，Mol Immunol2953-59；Alegre et al，1994，Transplantation 571537-1543；Hutchinset al.，1995，Proc Natl.Acad Sci U S A 9211980-11984；Jefferis et al，1995，Immunol Lett.44111-117；Lund et al.，1995，F(xiàn)aseb J 9115-119；Jefferis et al，1996，Immunol Lett 54101-104；Lund et al，1996，JImmunol 15749634969；Armour et aL，1999，Eur J Immunol292613-2624；Idusogie et al，2000，J Immunol 16441784184；Reddyet al，2000，J Immunol 1641925-1933；Xu et al.，2000，Cell Immunol20016-26；Idusogie et al，2001，J Immunol 1662571-2575；Shields etal.，2001，J Biol Chem 2766591-6604；Jefferis et al，2002，ImmunolLett 8257-65；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30487-490)；US 5,624,821；US 5,885,573；US 6,194,551；PCT WO 00/42072；PCTWO 99/58572中公開(kāi)的那些；通過(guò)完全引用將它們的每一個(gè)合并在此。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體被摻入到包含一種或多種工程化的glycoforms的抗體或Fc融合物中，所述glycoforms即，共價(jià)附著于包含F(xiàn)c區(qū)的分子的碳水化物成分，其中所述碳水化物成分化學(xué)上不同于包含F(xiàn)c區(qū)的親本分子的。工程化的glycoforms可以用于各種目的，包括但不限于增強(qiáng)或降低效應(yīng)物功能。工程化的glycoforms可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法產(chǎn)生，例如通過(guò)使用工程化的或變異的表達(dá)菌株，通過(guò)與一種或多種酶共表達(dá)，例如，DI N-乙酰基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTI11)，通過(guò)在各種有機(jī)體或來(lái)自各種有機(jī)體的細(xì)胞系中表達(dá)包含F(xiàn)c區(qū)的分子，或通過(guò)在已經(jīng)表達(dá)包含F(xiàn)c區(qū)的分子之后修飾碳水化物。產(chǎn)生工程化的glycoforms的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于在Umana et al，1999，Nat.Biotechnol 17176-180；Davies et al.，20017Biotechnol Bioeng74288-294；Shields et al，2002，J Biol Chem 27726733-26740；Shinkawa et aL，2003，J Biol Chem 2783466-3473)US 6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotillegentTM technology(Biowa，Inc.Princeton，NJ)；GlycoMAbTMglycosylation engineering technology(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland)中描述的那些，通過(guò)完全引用將它們的每一個(gè)合并在此。參見(jiàn)，例如，WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki et al.，2004，JMB，3361239-49，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

本發(fā)明的Fc變體可以為各種性質(zhì)優(yōu)化?？梢詢?yōu)化的性質(zhì)包括但不限于增強(qiáng)或降低的對(duì)FcγR的親合性、增強(qiáng)或降低的效應(yīng)物功能。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體被優(yōu)化以具有對(duì)人類活化性FcγR，優(yōu)選的FcγR、FcγRIIA、FcγRIIc、FcγRIIIA和FcγRIIIB，最優(yōu)選的FcγRIIIA的增強(qiáng)的親合性。在可選擇的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述Fc變體被優(yōu)化以具有對(duì)人類抑制性受體FcγRIIB的降低的親合性。這些優(yōu)選的實(shí)施方式是預(yù)期的，來(lái)提供在人類中具有增強(qiáng)的治療性質(zhì)的抗體和Fc融合物，所述治療性質(zhì)例如在此描述和例示的增強(qiáng)的效應(yīng)物功能和更大的抗癌效力。這些優(yōu)選的實(shí)施方式是預(yù)期的，來(lái)提供在小鼠異種移植腫瘤模型中具有增強(qiáng)的腫瘤消除的抗體和Fc融合物。

在可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體被優(yōu)化以具有對(duì)人類FcγR的降低的親合性，包括但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA和FcγRIIIB。這些實(shí)施方式是預(yù)期的，來(lái)提供在人類中具有增強(qiáng)的治療性質(zhì)的抗體和Fc融合物，所述治療性質(zhì)例如降低的效應(yīng)物功能和降低的毒性。

在可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體具有增強(qiáng)或降低的對(duì)來(lái)自非人有機(jī)體的FcγR的親合性，所述非人有機(jī)體包括但不限于小鼠、大鼠、兔和猴。優(yōu)化了與非人類FcγR的結(jié)合的Fc變體可以在實(shí)驗(yàn)中獲得應(yīng)用。例如，各種疾病的小鼠模型是可獲得的，其容許測(cè)試一些性質(zhì)，例如給定藥物候選物的效力、毒性和藥物動(dòng)力學(xué)。如本領(lǐng)域中已知的，癌細(xì)胞可以移植或注射到小鼠中來(lái)模擬人類癌癥，一種稱為異種移植的過(guò)程。測(cè)試包含為一種或多種小鼠FcγR優(yōu)化的Fc變體的抗體或Fc融合物，可以提供關(guān)于該抗體或Fc融合物的效力、它的作用機(jī)制等等的有價(jià)值的信息。

雖然優(yōu)選的是改變與FcγR的結(jié)合，本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期具有對(duì)新生受體(FcRn)的改變的結(jié)合親合性的Fc變體。雖然不希望局限于特定的作用機(jī)制，具有對(duì)FcRn的改善的親合性的Fc區(qū)變體預(yù)期具有更長(zhǎng)的血清半衰期，這種分子將在期望施用的多肽的長(zhǎng)半衰期的哺乳動(dòng)物治療方法中具有有用的應(yīng)用，例如，來(lái)治療慢性疾病或失調(diào)。雖然不希望局限于特定的作用機(jī)制，具有降低的FcRn結(jié)合親合性的Fc區(qū)變體，相反地，預(yù)期具有較短的半衰期，這樣的分子可以，例如，施用給哺乳動(dòng)物，其中縮短的循環(huán)時(shí)間可能是有益的，例如，用于體內(nèi)診斷成像，或用于某些多肽，當(dāng)留在血流中循環(huán)延長(zhǎng)的時(shí)間時(shí)這些多肽具有毒性副作用。具有降低的FcRn結(jié)合親合性的Fc區(qū)變體預(yù)期不太可能跨越胎盤(pán)，因而可以用于孕婦中疾病或失調(diào)的治療。

在其他實(shí)施方式中，這些變體可以與具有改變的FcRn親合性的其他已知的Fc修飾組合，例如在國(guó)際公開(kāi)No.WO 98/23289和WO 97/34631；和美國(guó)專利No.6,277,375中公開(kāi)的那些，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

本發(fā)明涵蓋用于產(chǎn)生具有提高的體內(nèi)半衰期的抗體的本領(lǐng)域已知的任何其他方法，例如，通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(即，替換、插入或刪除)到IgG恒定區(qū)區(qū)、或其FcRn結(jié)合片段(優(yōu)選的Fc或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域片段)中。參見(jiàn)，例如，國(guó)際公開(kāi)No.WO 98/23289和WO 97/34631；和美國(guó)No.6,277,375，通過(guò)引用將它們每一個(gè)合并在此來(lái)與本發(fā)明的Fc變體一同使用。進(jìn)一步的，本發(fā)明的抗體可以與白蛋白結(jié)合來(lái)產(chǎn)生體內(nèi)更穩(wěn)定的或具有更長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的抗體或抗體片段。這些技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)，例如，國(guó)際公開(kāi)No.WO93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137，和歐洲專利No.EP 413,622，通過(guò)完全引用將它們所有的合并在此。

在此描述的變體可以經(jīng)受進(jìn)一步的修飾，常常取決于所述變體的預(yù)定用途。這些修飾可以包括進(jìn)一步改變氨基酸序列(替換、插入和/或刪除氨基酸殘基)、融合到異源多肽和/或共價(jià)修飾?？梢栽诖颂幑_(kāi)的產(chǎn)生改變的性質(zhì)例如改變的Fc受體結(jié)合和/或ADCC活性的氨基酸修飾之前、同時(shí)地、或隨后來(lái)進(jìn)行這種進(jìn)一步的修飾。

做為選擇或另外地，本發(fā)明涵蓋組合在此公開(kāi)的氨基酸修飾和一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的氨基酸修飾，所述進(jìn)一步的氨基酸修飾如體外或體內(nèi)測(cè)定的改變所述Fc區(qū)的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性功能。優(yōu)選的，在此特別的感興趣的起始分子通常是結(jié)合C1q并顯示補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的分子。在此描述的進(jìn)一步的氨基酸替換一般將用來(lái)改變所述起始分子結(jié)合C1q的能力或修飾它的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性功能，例如，來(lái)降低和優(yōu)選的消除這些效應(yīng)物功能。在其他實(shí)施方式中，具有改善的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)功能、包含在一個(gè)或多個(gè)描述的位置的替換的分子是此處預(yù)期的。例如，起始分子可能不結(jié)合C1q和/或介導(dǎo)CDC，可以根據(jù)此處的教導(dǎo)被修飾從而獲得這些進(jìn)一步的效應(yīng)物功能。此外，具有先存的C1q結(jié)合活性、任選的進(jìn)一步具有介導(dǎo)CDC的能力的分子可以被修飾，從而一種或兩種這些活性被改變，例如，增強(qiáng)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有改變的CDC活性、在C1q結(jié)合上沒(méi)有任何改變的變異Fc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有改變的CDC活性和改變的C1q結(jié)合的變異Fc區(qū)。

為了產(chǎn)生具有改變的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)功能的Fc區(qū)，要修飾的氨基酸位置一般選自位置270、322、326、327、329、331、333和334，其中IgG重鏈中殘基的編號(hào)是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(199)中的EU索引。這些氨基酸修飾可以與在此公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)Fc修飾組合，來(lái)提供在C1q結(jié)合和/或CDC活性上的協(xié)同或相加的效果。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有改變的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)功能的Fc變體，其包含在位置396用亮氨酸以及在位置255用亮氨酸的氨基酸替換；或在位置396用亮氨酸以及在位置419用組氨酸的氨基酸替換；在位置396用亮氨酸以及在位置370用谷氨酸的氨基酸替換；在位置396用亮氨酸以及在位置240用丙氨酸的氨基酸替換；在位置396用亮氨酸和在位置92用蘇氨酸的氨基酸替換；在位置247用亮氨酸和在位置421用賴氨酸的氨基酸替換。本發(fā)明涵蓋改變C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)功能的任何已知的Fc區(qū)修飾，例如在Idusogie et al.，2001，J.Immunol.166(4)2571-5；Idusogie et al.，J.Immunol.2000164(8)4178-4184中公開(kāi)的那些，通過(guò)完全引用將它們的每一個(gè)合并在此。

如以上公開(kāi)的，本發(fā)明涵蓋具有改變的效應(yīng)物功能的Fc區(qū)，例如，修飾的C1q結(jié)合和/或FcR結(jié)合以及因而改變的CDC活性和/或ADCC活性。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有改善的C1q結(jié)合和改善的FcγRIII結(jié)合的變異Fc區(qū)；例如，具有改善ADCC活性以及改善的CDC活性。在可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性的變異Fc區(qū)。在其他實(shí)施方式中，可以僅提高這些活性的一種，任選的也降低另一種活性，例如，來(lái)產(chǎn)生具有改善的ADCC活性、但降低的CDC活性的Fc區(qū)，反之亦然。
A.具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增強(qiáng)的改變親合性的突變
本發(fā)明涵蓋包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)的變異Fc區(qū)的分子，其中這些修飾改變所述變異Fc區(qū)對(duì)活化性FcγR的親合性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)的變異Fc區(qū)，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性至至少2倍。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)的變異Fc區(qū)，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性至大于2倍。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性至至少3倍、4倍、5倍、6倍、8倍或10倍。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性至少至1/3、1/4、1/5、1/6、1/8或1/10。這種倍數(shù)增加優(yōu)選的是通過(guò)ELISA或表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析測(cè)定的。在特定的實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾不包括或不單獨(dú)地在位置329、331或322的任一處用任何氨基酸替換。在某些實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾不包括或不單獨(dú)地是在位置256、290、298、312、333、334、359、360或430任何一處的丙氨酸；在位置339用蘇氨酸；在位置320用甲硫氨酸；在位置326用絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸，在位置334用谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、纈氨酸或亮氨酸的替換。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾不包括或不單獨(dú)地是位置280、290、300、294或295的任一處的替換。在另一個(gè)更特定的實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾不包括或不單獨(dú)地是在位置300用亮氨酸或異亮氨酸；在位置295用賴氨酸；在位置294用天冬酰胺；在位置298用纈氨酸；天冬氨酸脯氨酸，天冬酰胺或纈氨酸；在位置280用組氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸；在位置290用絲氨酸、甘氨酸、theonine或酪氨酸的替換。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIA更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIA，條件是所述變異Fc區(qū)不具有在位置256、290、326、255、258、267、272、276、280、283、285、286、331、337、268、272或430的任一處的丙氨酸；位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；位置290的絲氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸；位置326的絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的賴氨酸；位置335的谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)的變異Fc區(qū)，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾將所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIA的親合性提高到至少2倍。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)的變異Fc區(qū)，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾將所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIA的親合性提高到大于2倍。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾將所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIA的親合性提高到至少3倍、4倍、5倍、6倍、8倍或10倍。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋分子、優(yōu)選的多肽、更優(yōu)選的免疫球蛋白(例如，抗體)，包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換，但也包括插入或刪除)的變異Fc區(qū)，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少150％和至少200％。

在特定的實(shí)施方式中，提高所述變異Fc區(qū)的親合性的所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾包含在位置347用組氨酸以及在位置339用纈氨酸替換；或在位置425用異亮氨酸以及在位置215用苯丙氨酸替換；或在位置408用異亮氨酸、在位置215用異亮氨酸以及在125用亮氨酸替換；或在位置385用谷氨酸以及在位置247用組氨酸替換；或在位置348用甲硫氨酸、在位置334用天冬酰胺、在位置275用異亮氨酸、在位置202用甲硫氨酸以及在位置147用蘇氨酸替換；或在位置275用異亮氨酸、在位置334用天冬酰胺以及在位置348用甲硫氨酸替換；或在位置279用亮氨酸以及在位置395用絲氨酸替換；或在位置246用蘇氨酸以及在位置319用苯丙氨酸；或在位置243用異亮氨酸以及在位置379用亮氨酸；或在位置243用亮氨酸、在位置255用亮氨酸以及在位置318用賴氨酸替換；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用絲氨酸替換；或在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸替換；或在位置334用谷氨酸以及在位置380用天冬氨酸替換；或在位置256用絲氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置334用谷氨酸以及在位置390用絲氨酸替換；或在位置335用天冬酰胺、在位置370用谷氨酸、在位置378用纈氨酸、在位置394用甲硫氨酸以及在位置424用亮氨酸替換；或在位置233用天冬氨酸以及在位置334用谷氨酸替換；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、在位置366用絲氨酸以及在位置386用精氨酸替換；或在位置246用蘇氨酸以及在位置396用組氨酸替換；或在位置268用天冬氨酸以及在位置318用天冬氨酸替換；或在位置288用天冬酰胺、在330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置244用組氨酸、在位置358用甲硫氨酸、在位置379用甲硫氨酸、在位置384用賴氨酸以及在397用甲硫氨酸替換；或在位置217用絲氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置408用精氨酸替換；或在位置247用亮氨酸、在位置253用天冬酰胺以及在位置334用天冬酰胺替換；或在位置246用異亮氨酸以及在位置334用天冬酰胺替換；或在位置320用谷氨酸以及在位置326用谷氨酸替換；或在位置375用半胱氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。引起體外對(duì)FcγRIIIA的增強(qiáng)的親合性的其他氨基酸替換的實(shí)例在以下公開(kāi)，并在表5中概述。

本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置243用異亮氨酸和在位置379用亮氨酸替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約1.5倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置288用天冬酰胺、在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約5倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置243用亮氨酸以及在位置255用亮氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約1倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用絲氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約1.5倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約3倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置316用天冬氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約1.5倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置315用異亮氨酸、在位置379用甲硫氨酸以及在位置399用谷氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約1倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置243用異亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用纈氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約2.5倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置247用亮氨酸以及在位置421用賴氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約3倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置392用蘇氨酸以及在位置396用亮氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約4.5倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置293用纈氨酸、在位置295用谷氨酸以及在位置327用蘇氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約1.5倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置268用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約2倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含在位置319用苯丙氨酸、在352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸的替換，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述分子以包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA約2倍的親合性結(jié)合FcγRIIIA。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置396用組氨酸替換。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置248用甲硫氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以同包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽類似的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置392用精氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以同包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽類似的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置315用異亮氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以同包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽類似的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置132用異亮氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以同包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽類似的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置162用纈氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置396用亮氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置379用甲硫氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置219用酪氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置282用甲硫氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置401用纈氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置222用天冬酰胺替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置334用谷氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置377用苯丙氨酸(phenylalaine)替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置334用異亮氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置247用亮氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置326用谷氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置372用酪氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置224用亮氨酸替換。

本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置275用酪氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置398用纈氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置334用天冬酰胺替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置400用脯氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置407用異亮氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置372用酪氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以同包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽類似的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置366用天冬酰胺替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽降低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置414用天冬酰胺替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽降低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置225用絲氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽降低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置377用天冬酰胺替換。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更高1倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置379用甲硫氨酸替換。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽約1.5倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置248用甲硫氨酸替換。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的改變的親合性，如使用本領(lǐng)域已知用于測(cè)定Fc-FcγR相互作用，即，F(xiàn)c區(qū)與FcγR的特異性結(jié)合的體外分析(基于生物化學(xué)或免疫學(xué)的分析)所測(cè)定的，包括但不限于ELISA分析、表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析、免測(cè)沉淀法分析(參見(jiàn)5.2.1節(jié))。優(yōu)選的，具有對(duì)活化性FcγR受體的改變的親合性的這些分子的結(jié)合性質(zhì)也與它們的活性相關(guān)，如用于測(cè)定一種或多種FcγR介體效應(yīng)細(xì)胞功能(參見(jiàn)5.2.6節(jié))的體外功能性分析所測(cè)定的，例如，具有對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的親合性的變異Fc區(qū)的分子具有增強(qiáng)的ADCC活性。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，在體外分析中具有對(duì)活化性Fc受體，例如FcγRIIIA的改變的結(jié)合性質(zhì)的本發(fā)明的分子也在體內(nèi)模型(例如在此描述和公開(kāi)的那些)中具有改變的結(jié)合性質(zhì)。然而，本發(fā)明不排除在基于體外的分析中不展現(xiàn)改變的FcγR結(jié)合、但在體內(nèi)展現(xiàn)期望的表型的本發(fā)明的分子。
B.具有對(duì)FcγRIIIA的增強(qiáng)的親合性以及對(duì)FcγRIIB降低的或無(wú)親合性的突變體
在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，替換)的變異Fc區(qū)，相對(duì)于以野生型親合性結(jié)合FcγRIIIA和FcγRIIB的包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述一種或多種修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性并降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性，在某些實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾不包括或不單獨(dú)地是在位置256、298、333、334、280、290、294、298或296的任何一處的丙氨酸替換；或在位置298用天冬酰胺、纈氨酸、天冬氨酸或脯氨酸替換；或用絲氨酸替換290。在某些氨基實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％，并降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％。

在特定的實(shí)施方式中，如使用攜帶變異Fc區(qū)的ch-4-4-20抗體根據(jù)ELISA分析和/或基于ADCC的分析所測(cè)定的，所述變異Fc區(qū)具有對(duì)FcγRIIIA的增強(qiáng)的親合性以及對(duì)FcγRIIB的降低的親合性或無(wú)親合性，包含所述變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子包含以下任何的替換，位置275用異亮氨酸、在位置334用天冬酰胺以及在位置348用甲硫氨酸；或在位置279用亮氨酸以及在位置395用絲氨酸替換；或在位置246用蘇氨酸以及在位置319用苯丙氨酸替換；或在位置243用亮氨酸、在位置255用亮氨酸以及在位置318用賴氨酸替換；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用絲氨酸替換；或在位置334用谷氨酸以及在位置380用天冬氨酸替換；或在位置256用絲氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置334用谷氨酸以及在位置390用絲氨酸替換；或在位置335用天冬酰胺、在位置370用谷氨酸、在位置378用纈氨酸、在位置394用甲硫氨酸以及在位置424用亮氨酸替換；或在位置233用天冬氨酸以及在位置334用谷氨酸替換；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、在位置366用絲氨酸以及在位置386用精氨酸替換；或在位置312用谷氨酸、在位置327用天冬酰胺以及在位置378用絲氨酸替換；或在位置288用天冬酰胺以及在位置326用天冬酰胺替換；或在位置247用亮氨酸以及在位置421用賴氨酸替換；或在位置298用天冬酰胺以及在位置381用精氨酸替換；或在位置280用谷氨酸、在位置354用苯丙氨酸、在位置431用天冬氨酸以及在位置441用異亮氨酸替換；或在位置255用谷氨酰胺以及在位置326用谷氨酸替換；或在位置218用精氨酸、在位置281用天冬氨酸以及在位置385用精氨酸替換；或在位置247用亮氨酸、在位置330用蘇氨酸以及在位置440用甘氨酸替換；或在位置284用丙氨酸以及在位置372用亮氨酸替換，或在位置335用天冬酰胺、在位置387用絲氨酸以及在位置435用谷氨酰胺替換；或在位置247用亮氨酸、在位置431用纈氨酸以及在位置442用苯丙氨酸替換。

在特定的實(shí)施方式中，如使用攜帶變異Fc區(qū)的ch-4-4-20抗體根據(jù)ELISA分析和/或基于ADCC的分析所測(cè)定的，所述變異Fc區(qū)具有對(duì)FcγRIIIA的增強(qiáng)的親合性以及對(duì)FcγRIIB的降低的親合性或無(wú)親合性，包含所述變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子包含在位置379用甲硫氨酸；在位置219用酪氨酸；在位置282用甲硫氨酸；在位置401用纈氨酸；在位置222用天冬酰胺；在位置334用異亮氨酸；位置334用谷氨酸；在位置275用酪氨酸；在位置398用纈氨酸替換。

本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽約1/3的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置288用天冬酰胺，在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽約1/10-15的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置316用天冬酰胺，在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽約1/10倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置315用異亮氨酸，在位置379用甲硫氨酸以及在位置399用谷氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽約1/7的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置243用異亮氨酸，在位置379用亮氨酸以及在位置420用纈氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽約1/3的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置392用蘇氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽約1/5的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置268用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替換。本發(fā)明還涵蓋包含變異Fc區(qū)的分離的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而如ELISA分析所測(cè)定的，所述多肽以包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽約1/2的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置319用苯丙氨酸、在位置352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。
C.具有對(duì)FcγRIIIA和FcγRIIB增強(qiáng)的親合性的突變體
本發(fā)明涵蓋具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的變異Fc區(qū)，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和FcγRIIB的親合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％，并且降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％。在特定的實(shí)施方式中，包含具有對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的親合性和對(duì)FcγRIIB增強(qiáng)的親合性的變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子(如使用攜帶在此描述的變異Fc區(qū)的ch-4-4-20根據(jù)ELISA分析和/或基于ADCC的分析所測(cè)定的)包含在位置415用異亮氨酸以及在位置251用苯丙氨酸替換；或在位置399用谷氨酸、在位置292用亮氨酸以及在位置185用甲硫氨酸替換；或在位置408用異亮氨酸、在位置215用異亮氨酸以及在位置125用亮氨酸替換；或在位置385用谷氨酸以及在位置247用組氨酸替換；或在位置348用甲硫氨酸、在位置334用天冬酰胺、在位置275用異亮氨酸、在位置202用甲硫氨酸以及在位置147用蘇氨酸替換；或在位置246用蘇氨酸以及在位置396用組氨酸替換；或在位置268用天冬氨酸以及在位置318用天冬氨酸替換；或在位置288用天冬酰胺、在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置224用組氨酸、在位置358用甲硫氨酸、在位置379用甲硫氨酸、在位置384用賴氨酸以及在位置397用甲硫氨酸替換；或在位置217用絲氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置408用精氨酸替換；或在位置247用亮氨酸、在位置253用天冬酰胺以及在位置334用天冬酰胺替換；或在位置246用異亮氨酸以及在位置334用天冬酰胺替換；或在位置320用谷氨酸以及在位置326用谷氨酸替換；或在位置375用半胱氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置343用絲氨酸、在位置353用亮氨酸、在位置375用異亮氨酸、在位置383用天冬酰胺替換；或在位置394用甲硫氨酸以及在位置397用甲硫氨酸替換；或在位置216用天冬氨酸、在位置345用賴氨酸以及在位置375用異亮氨酸替換；或在位置288用天冬酰胺、在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置247用亮氨酸亮氨酸以及在位置389用甘氨酸替換；或在位置222用天冬酰胺、在位置335用天冬酰胺、在位置370用谷氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置394用甲硫氨酸替換；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸替換；或在位置315用異亮氨酸、在位置379用甲硫氨酸以及在位置394用甲硫氨酸替換；或在位置290用蘇氨酸以及在位置371用天冬氨酸替換；或在位置247用亮氨酸以及在位置398用谷氨酰胺替換；或在位置326用谷氨酰胺；在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用絲氨酸替換；或在位置247用亮氨酸以及在位置377用苯丙氨酸替換；或在位置378用纈氨酸、在位置390用異亮氨酸以及在位置422用異亮氨酸替換；或在位置326用谷氨酸以及在位置385用谷氨酸替換；或在位置282用谷氨酸、在位置369用異亮氨酸以及在位置406用苯丙氨酸替換；或在位置397用甲硫氨酸；在位置411用丙氨酸以及在位置415用天冬酰胺替換；或在位置223用異亮氨酸、在位置256用絲氨酸以及在位置406用苯丙氨酸替換；或在位置298用天冬酰胺以及在位置407用精氨酸替換；或在位置246用精氨酸、在位置298用天冬酰胺以及在位置377用苯丙氨酸替換；或在位置235用脯氨酸、在位置382用甲硫氨酸、在位置304用甘氨酸、在位置305用異亮氨酸以及在位置323用異亮氨酸替換；或在位置247用亮氨酸、在位置313用精氨酸以及在位置388用甘氨酸替換；或在位置221用酪氨酸、在位置252用異亮氨酸、在位置330用甘氨酸、在位置339用蘇氨酸、在位置359用天冬酰胺、在位置422用異亮氨酸以及在位置433用亮氨酸替換；或在位置258用天冬氨酸以及在位置384用賴氨酸替換；或在位置241用亮氨酸以及在位置258用甘氨酸替換；或在位置370用天冬酰胺以及在位置440用天冬酰胺替換；或在位置317用天冬酰胺替換以及在位置423刪除；或在位置243用異亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用纈氨酸替換；或在位置227用絲氨酸以及在位置290用谷氨酸替換；或在位置231用纈氨酸、在位置386用組氨酸以及在位置412用甲硫氨酸替換；或在位置215用脯氨酸、在位置274用天冬酰胺、在位置287用甘氨酸、在位置334用天冬酰胺、在位置365用纈氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置293用纈氨酸、在位置295用谷氨酸以及在位置327用蘇氨酸替換；或在位置319用苯丙氨酸、在位置352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置392用蘇氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；在位置268用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置290用蘇氨酸、在位置390用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置326用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置268用天冬氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置210用甲硫氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置358用脯氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置288用精氨酸、在位置307用丙氨酸、在位置344用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置273用異亮氨酸、在位置326用谷氨酸、在位置328用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置326用異亮氨酸、在位置408用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置334用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置379用甲硫氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置227用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置217用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置261用天冬酰胺、在位置210用甲硫氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置419用組氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置242用苯丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置255用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置240用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置250用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置247用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置410用組氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置419用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置427用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置258用天冬氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置384用賴氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置323用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置244用組氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置305用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置400用苯丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置303用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置243用亮氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置290用谷氨酸、在位置369用丙氨酸、在位置393用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置210用天冬酰胺、在位置222用異亮氨酸、在位置320用甲硫氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置217用絲氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置309用亮氨酸、在位置390用組氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置246用天冬酰胺；在位置419用精氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置217用丙氨酸、在位置359用丙氨酸以及位置396用亮氨酸替換；或在位置215用異亮氨酸、在位置290用纈氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置275用亮氨酸、在位置362用組氨酸、在位置384用賴氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置334用天冬酰胺替換；或在位置400用脯氨酸替換；或在位置407用異亮氨酸替換；或在位置372用酪氨酸替換；或在位置366用天冬酰胺替換；或在位置414用天冬酰胺替換；或在位置352用亮氨酸替換；或在位置225用絲氨酸替換；或在位置377用天冬酰胺替換；或在位置248用甲硫氨酸替換。
D.不結(jié)合任何FcγR的突變
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，如本領(lǐng)域已知和在此公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述變異Fc區(qū)不結(jié)合任何FcγR。在特定的實(shí)施方式中，所述消除與所有FcγR的結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾包含在位置232用絲氨酸以及在位置304用甘氨酸替換；或在位置269用賴氨酸、在位置290用天冬酰胺、在位置311用精氨酸以及在位置433用酪氨酸替換；或在位置252用亮氨酸替換；或在位置216用天冬氨酸、在位置334用精氨酸以及在位置375用異亮氨酸替換；或在位置247用亮氨酸以及在位置406用苯丙氨酸替換，或在位置335用天冬酰胺、在位置387用絲氨酸以及在位置435用谷氨酰胺替換；或在位置334用谷氨酸、在位置380用天冬氨酸以及在位置446用纈氨酸替換；或在位置303用異亮氨酸、在位置369用苯丙氨酸以及在位置428用亮氨酸替換；或在位置251用苯丙氨酸以及在位置372用亮氨酸替換；或在位置246用谷氨酸、在位置284用甲硫氨酸以及在位置308用丙氨酸替換；或在位置399用谷氨酸以及在位置402用天冬氨酸替換；或在位置399用谷氨酸以及在位置428用亮氨酸替換。
D.具有改變的FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)物功能的突變
本發(fā)明涵蓋包含具有改變的效應(yīng)物功能的Fc變體的免疫球蛋白。在某些實(shí)施方式中，包含F(xiàn)c變體的免疫球蛋白在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)更有效地介導(dǎo)效應(yīng)物功能，如使用本領(lǐng)域已知和在此例示的分析所測(cè)定的。在其他實(shí)施方式中，包含F(xiàn)c變體的免疫球蛋白在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)更低效地介導(dǎo)效應(yīng)物功能，如使用本領(lǐng)域已知和在此例示的分析所測(cè)定的。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體可以與改變效應(yīng)物功能的其他已知的Fc修飾組合，從而這種組合具有相加的、協(xié)同的效果。本發(fā)明的Fc變體具有體外和/或體內(nèi)的改變的效應(yīng)物功能。

在特定的實(shí)施方式中，具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的本發(fā)明的免疫球蛋白具有增強(qiáng)的FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)物功能，如使用在此公開(kāi)的ADCC活性分析所測(cè)定的?？梢杂杀景l(fā)明的分子介導(dǎo)的效應(yīng)物功能的實(shí)例包括但不限于，C1q結(jié)合、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用，等等。本發(fā)明的分子的效應(yīng)物功能可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)分析，所述方法的實(shí)例在5.2.6節(jié)中公開(kāi)。在特定的實(shí)施方式中，包含具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增強(qiáng)的親合性的變異Fc區(qū)的本發(fā)明的免疫球蛋白比包含野生型Fc區(qū)的免疫球蛋白更有效1倍地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在其他實(shí)施方式中，包含具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的變異Fc區(qū)的本發(fā)明的免疫球蛋白以包含野生型Fc區(qū)的免疫球蛋白的至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少104倍、至少105倍的有效性介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的本發(fā)明的免疫球蛋白具有改變的C1q結(jié)合活性。在某些實(shí)施方式中，具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的本發(fā)明的免疫球蛋白具有包含野生型Fc區(qū)的免疫球蛋白的至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少104倍、至少105倍的C1q結(jié)合活性。在又一個(gè)特定的實(shí)施方式中，具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增強(qiáng)的親合性的本發(fā)明的免疫球蛋白具有改變的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。在又一個(gè)特定的實(shí)施方式中，具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增強(qiáng)的親合性的本發(fā)明的免疫球蛋白具有比包含野生型Fc區(qū)的免疫球蛋白增強(qiáng)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。在某些實(shí)施方式中，具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的本發(fā)明的免疫球蛋白具有包含野生型Fc區(qū)的免疫球蛋白的至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少104倍、至少105倍的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。

在其他實(shí)施方式中，具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的本發(fā)明的免疫球蛋白具有相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的免疫球蛋白增強(qiáng)的吞噬作用活性，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或在此公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。在某些實(shí)施方式中，具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA增強(qiáng)的親合性的本發(fā)明的免疫球蛋白具有相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的免疫球蛋白至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍的吞噬作用活性。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的變異Fc區(qū)的、具有對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增強(qiáng)的親合性的免疫球蛋白，從而所述免疫球蛋白具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，例如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或吞噬作用。在特定的實(shí)施方式中，所述提高變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性并且提高免疫球蛋白的ADCC活性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾包含在位置379用甲硫氨酸替換；或在位置243用異亮氨酸以及在位置379用亮氨酸替換；或在位置288用天冬酰胺、在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置243用亮氨酸以及在位置255用亮氨酸替換；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用絲氨酸替換；或在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸替換；或在位置334用谷氨酸以及在位置292用亮氨酸替換；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸替換；或在位置315用異亮氨酸、在位置379用甲硫氨酸以及在位置399用谷氨酸替換；或在位置243用異亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用纈氨酸替換；或在位置247用亮氨酸以及在位置421用賴氨酸替換；或在位置248用甲硫氨酸替換；或在位置392用蘇氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置293用纈氨酸、在位置295用谷氨酸以及在位置327用蘇氨酸替換；或在位置268用asapragine以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置319用苯丙氨酸、在位置352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，提高免疫球蛋白的ADCC活性的所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾是以下表7中列出的突變的任何一個(gè)。
表7.提高ADCC的氨基酸修飾
做為選擇或另外地，將上述氨基酸修飾或任何在此公開(kāi)的氨基酸修飾與改變Fc區(qū)的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性功能的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的氨基酸修飾組合可能是有用的。在此特別的感興趣的起始分子通常是結(jié)合C1q并顯示補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的分子。在此描述的進(jìn)一步的氨基酸替換一般將用來(lái)改變所述起始分子結(jié)合C1q的能力或修飾它的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性功能，例如，來(lái)降低和優(yōu)選的消除這些效應(yīng)物功能。然而，具有改善的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)功能、包含在一個(gè)或多個(gè)描述的位置的替換的分子是此處預(yù)期的。例如，起始分子可能不結(jié)合C1q和/或介導(dǎo)CDC，可以根據(jù)此處的教導(dǎo)被修飾從而獲得這些進(jìn)一步的效應(yīng)物功能。此外，具有先存的C1q結(jié)合活性、任選的進(jìn)一步具有介導(dǎo)CDC的能力的分子可以被修飾，從而一種或兩種這些活性被增強(qiáng)。

如以上公開(kāi)的，可以設(shè)計(jì)具有改變的效應(yīng)物功能的Fc區(qū)，例如，通過(guò)修飾C1q結(jié)合和/或FcR結(jié)合以及因而改變CDC活性和/或ADCC活性。例如，可以產(chǎn)生具有改善的C1q結(jié)合和改善的FcγRIII結(jié)合的變異Fc區(qū)；例如，具有改善ADCC活性以及改善的CDC活性。做為選擇，當(dāng)期望降低或消除效應(yīng)物功能時(shí)，可以工程化具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性的變異Fc區(qū)。在其他實(shí)施方式中，可以僅提高這些活性的一種，任選的也降低另一種活性，例如，來(lái)產(chǎn)生具有改善的ADCC活性、但降低的CDC活性的Fc區(qū)，反之亦然。

本發(fā)明涵蓋Fc區(qū)的特定變體，其是使用本發(fā)明的方法在第2-第4輪分選之后從突變體的酵母庫(kù)中鑒定的，在表8中列出。表8概述了使用本發(fā)明的方法鑒定各種突變體。使用ELISA分析來(lái)分析突變體用于測(cè)定與FcγRIIIA和FcγRIIB的結(jié)合。通過(guò)使用在此公開(kāi)和例示的方法將Fc變體克隆到4-4-20抗體中，還在ADCC分析中測(cè)試了這些突變體。粗體的項(xiàng)目是指一些實(shí)驗(yàn)，在其中在ADCC分析之前純化了ch4-4-20。使用的抗體濃度在0.5μg/mL-1.0μg/mL的范圍。

















在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有變異Fc區(qū)的修飾的免疫球蛋白分子(例如，抗體)，所述變異Fc區(qū)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾提高所述分子對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。這種免疫球蛋白包括天然地含有FcγR結(jié)合區(qū)(例如，F(xiàn)cγRIIIA和/或FcγRIIB結(jié)合區(qū))的IgG分子，或已經(jīng)被工程化以含有FcγR結(jié)合區(qū)(例如，F(xiàn)cγRIIIA和/或FcγRIIB結(jié)合區(qū))的免疫球蛋白衍生物。本發(fā)明的修飾的免疫球蛋白包括任何免疫球蛋白分子，如通過(guò)本領(lǐng)域公知用于分析特異性抗原-抗體結(jié)合的免疫分析所測(cè)定的，所述免疫球蛋白分子結(jié)合，優(yōu)選的免疫特異性地結(jié)合，即，競(jìng)爭(zhēng)排除非特異性結(jié)合，抗原，并且含有FcγR結(jié)合區(qū)(例如，F(xiàn)cγRIIIA和/或FcγRIIB結(jié)合區(qū))。這種抗體包括但不限于，多克隆的、單克隆的、雙特異性的、多特異性的、人類的、人源化的、嵌合的抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫化物連接的Fvs、以及含有VL或VH結(jié)構(gòu)域乃至特異性結(jié)合抗原的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、在某些情況下被工程化以含有或融合到FcγR結(jié)合區(qū)的片段。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含F(xiàn)c區(qū)的部分。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)的部分”是指Fc區(qū)的片段，優(yōu)選的具有效應(yīng)物活性和/或FcγR結(jié)合活性的部分(或缺乏這種活性的突變體的可比較區(qū)域)。Fc區(qū)的片段大小可以從5個(gè)氨基酸到完整Fc區(qū)減去一個(gè)氨基酸。Fc區(qū)的部分可以從N-末端或C-末端缺少多達(dá)10、多達(dá)20、多達(dá)30個(gè)氨基酸。

本發(fā)明的IgG分子優(yōu)選的是IgG的IgG1子類，但也可以是給定動(dòng)物的任何其他IgG子類。例如，在人類中，IgG種類包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；小鼠IgG包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。

免疫球蛋白(和在此使用的其他多肽)可以來(lái)自任何動(dòng)物來(lái)源，包括鳥(niǎo)類以及哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的，所述抗體是人類、嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的。如在此使用的，“人類抗體”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，并包括從人免疫球蛋白庫(kù)或從為了一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因并且不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白的動(dòng)物分離的抗體，如在下文以及例如Kucherlapati等的美國(guó)專利No.5,939,598中描述的。

本發(fā)明的抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性的，或更大的多特異性的。多特異性抗體可以特異于多肽的不同表位，或可以特異于異源表位，例如，異源多肽或固相支持材料。參見(jiàn)，例如PCT公開(kāi)WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt，et al.，J.Immunol.，14760-69，1991；U.S.Patent Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.，J.Immunol.，1481547-1553，1992。

多特異性抗體具有對(duì)至少兩個(gè)不同抗原的結(jié)合特異性。雖然這些分子通常將僅結(jié)合兩種抗原(即，雙特異性抗體，BsAbs)，具有額外的特異性的抗體，例如三特異性抗體被本發(fā)明涵蓋。BsAbs的實(shí)例無(wú)限制地包括具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原的一個(gè)臂和針對(duì)細(xì)胞毒分子的另一個(gè)臂的那些。

制造雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)是根據(jù)共表達(dá)兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)，其中兩個(gè)鏈具有不同的特異性(Millstein et al.，Nature，305537-539(1983)；通過(guò)完全引用將它合并在此。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生10個(gè)不同抗體分子的潛在混合物，在其中僅有一個(gè)具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化，是相當(dāng)繁瑣的，產(chǎn)物產(chǎn)率很低。在WO 93/08829和在Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)中公開(kāi)了類似的步驟。

根據(jù)不同的方法，將具有期望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。所述融合優(yōu)選的是與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合，至少包含鉸鏈、CH2和CH3區(qū)域的部分。具有包含為輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH1)是優(yōu)選的，存在于至少一個(gè)所述融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物的DNA、和如果期望的編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA，插入到獨(dú)立的表達(dá)載體中，共轉(zhuǎn)染到適合的宿主生物中。當(dāng)用于構(gòu)建時(shí)三個(gè)多肽鏈的不等比例提供了最適的產(chǎn)量時(shí)，在實(shí)施方式中這為調(diào)整所述三個(gè)多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩個(gè)多肽鏈以相等的比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)，或當(dāng)所述比例沒(méi)有特別的意義時(shí)，有可能將兩個(gè)或全部三個(gè)多肽鏈編碼序列插入到一個(gè)表達(dá)載體中。

在這個(gè)方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體由在一條臂上具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈、和在另一條臂上的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。據(jù)發(fā)現(xiàn)，這個(gè)不對(duì)稱的結(jié)構(gòu)便于從不需要的免疫球蛋白鏈結(jié)合物中離期望的雙特異性化合物，在僅半個(gè)所述雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈提供了容易的分離路線。在WO 94/04690中公開(kāi)了這個(gè)方法。產(chǎn)生雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，參見(jiàn)，例如，Suresh等，Methods in Enzymology121210(1986)。根據(jù)在WO 96/27011中描述的另一種方法，可以工程化抗體分子的配對(duì)來(lái)最大化從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收異二聚物的百分比。優(yōu)選的接觸面至少包含抗體恒定區(qū)的CH3區(qū)的一部分。在這個(gè)方法中，來(lái)自第一抗體分子的接觸面的一個(gè)或多個(gè)小的氨基酸側(cè)鏈被較大的側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替換。通過(guò)用較小的氨基酸側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)替換大的氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的接觸面上產(chǎn)生與大的側(cè)鏈相同或類似大小的補(bǔ)償“腔”。這提供了一種相對(duì)其他不需要的終產(chǎn)物，例如同型二聚體、用于增加異二聚體的產(chǎn)量的機(jī)制。

雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異共軛的”抗體。例如，在異共軛物中的一個(gè)抗體可以與抗生物素蛋白聯(lián)結(jié)，另一個(gè)與生物素聯(lián)結(jié)。這種抗體已經(jīng)，例如，用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利No.4,676,980)，和用于治療HIV感染(WO 91/00360、WO92/200373和EP 03089)。可以利用任何方便的交聯(lián)方法來(lái)制造異共軛物抗體。適合的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域公知的，在美國(guó)專利No.4,676,980中隨同許多交聯(lián)技術(shù)一起被公開(kāi)。

具有超過(guò)兩個(gè)化合價(jià)的抗體是期待的。例如，可以利用化學(xué)連接來(lái)制備三特異性抗體。參見(jiàn)，例如，Tutt et al.J.Immunol.14760(1991)，通過(guò)引用將它合并在此。

本發(fā)明的抗體包括另外修飾的衍生物，即，通過(guò)共價(jià)附著任何類型的分子到抗體上，從而共價(jià)附著不阻礙抗體結(jié)合抗原和/或產(chǎn)生抗同種型反應(yīng)。例如，而不是限制，抗體衍生物包括已經(jīng)被修飾的抗體，例如，通過(guò)糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白水解性裂解、連接到細(xì)胞配體或其他蛋白，等等?？梢酝ㄟ^(guò)已知的技術(shù)進(jìn)行各種化學(xué)修飾，包括但不限于特異性化學(xué)裂解、乙?；?、甲?；?、衣霉素的代謝合成，等等。此外，衍生物可以含有一種或多種非典型的氨基酸。

對(duì)于某些應(yīng)用，包括在人類中抗體的體內(nèi)使用和體外檢測(cè)分析，使用嵌合的、人源化的或人類抗體是優(yōu)選的。嵌合抗體是一種分子，其中抗體不同的部分來(lái)自不同的動(dòng)物物種，例如，具有來(lái)自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和來(lái)自人免疫球蛋白的恒定區(qū)的抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如Morrison，Science，2291202，1985；Oi et al.，BioTechniques，42141986；Gillies et al.，J.Immunol.Methods，125191-202，1989；美國(guó)專利No.5,807,715；4,816,567；和4,816,397，通過(guò)完全引用將它們合并在此。人源化抗體是來(lái)自非人類物種、結(jié)合期望的抗原的抗體分子，具有來(lái)自非人類物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來(lái)自人免疫球蛋白分子的骨架區(qū)和恒定區(qū)。通常，人類骨架區(qū)中的骨架殘基將被來(lái)自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基替換，來(lái)改變，優(yōu)選的改善抗原結(jié)合。這些骨架替換通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)鑒別，例如，通過(guò)對(duì)CDR和骨架殘基的相互作用建模來(lái)鑒定對(duì)于抗原結(jié)合重要的骨架殘基，和通過(guò)序列比較來(lái)鑒定特定位置不尋常的骨架殘基。參見(jiàn)，例如Queen et al.，美國(guó)專利No.5,585,089；Riechmannet al.，Nature，332323，1988，通過(guò)完全引用將它們合并在此。可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)將抗體人源化，包括，例如，CDR移植(EP 239,400；PCT公開(kāi)WO 91/09967；美國(guó)專利No.5,225,539；5,530,101和5,585,089)，veneering或resurfacing(EP 592,106；EP519,596；Padlan，Molecular Immunology，28(4/5)489-498，1991；Studnicka et al.，Protein Engineering，7(6)805-814，1994；Roguskaet al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，91969-973，1994)，和鏈shuffling(美國(guó)專利No.5,565,332)，通過(guò)完全引用將它們所有的合并在此。可以使用在美國(guó)專利No.5,693,762(Protein Design Labs)、5,693,761、(Protein Design Labs)5,585,089(Protein Design Labs)、6,180,370(Protein Design Labs)和美國(guó)公開(kāi)No.20040049014、200300229208中公開(kāi)的任何方法來(lái)產(chǎn)生人源化抗體，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

完全的人類抗體是用于人類患者的治療特別優(yōu)選的。人類抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生，包括如上所述使用來(lái)源于人免疫球蛋白序列的抗體庫(kù)的噬菌體顯示方法。參見(jiàn)美國(guó)專利No.4,444,887和4,716,111；和PCT公開(kāi)WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

也可以使用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白、但可以表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)產(chǎn)生人類抗體。對(duì)于生產(chǎn)人類抗體的這種技術(shù)的綜述，參見(jiàn)Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.，1365-93，1995。對(duì)于生產(chǎn)人類抗體和人類單克隆抗體的這種技術(shù)和生產(chǎn)這種抗體的方案的詳細(xì)論述，參見(jiàn)，例如PCT公開(kāi)WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735、歐洲專利No.0598877、美國(guó)專利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598，通過(guò)完全引用將它們合并在此。此外，可以請(qǐng)例如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)、Medarex(NJ)和Genpharm(San Jose，CA)的公司使用類似上述的技術(shù)來(lái)提供針對(duì)選定抗原的人類抗體。

可以使用稱為“指導(dǎo)選擇(guided selection)”的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生識(shí)別選定表位的完全的人類抗體。在這種方法中，選定的非人類單克隆抗體，例如，小鼠抗體，被用于指導(dǎo)識(shí)別相同表位的完全人類抗體的選擇(Jespers et al.，Bio/technology，12899-903，1988)。

本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)至少一個(gè)氨基酸殘基在Fc區(qū)中工程化人類或人源化的治療抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)，所述修飾提高所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾至少一個(gè)氨基酸殘基在Fc區(qū)中工程化人類或人源化的治療抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)，所述修飾提高所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性并且進(jìn)一步降低所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。工程化的治療性抗體可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，例如，增強(qiáng)的ADCC活性、吞噬作用活性等等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化特異于Her2/neu原癌基因的人源化單克隆抗體(例如，如Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285-9中公開(kāi)的Ab4D5人源化抗體)，所述修飾提高所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，修飾人源化Her2/neu單克隆抗體也可以進(jìn)一步降低所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在又一個(gè)特定實(shí)施方式中，特異于Her2/neu的工程化的人源化單克隆抗體可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，如本領(lǐng)域已知的以及在此公開(kāi)和例示的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化小鼠人類嵌合抗CD20單克隆抗體2H7，所述修飾提高所述Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，修飾抗CD20單克隆抗體2H7也可以進(jìn)一步降低Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在又一個(gè)特定實(shí)施方式中，工程化的抗CD20單克隆抗體2H7可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，如本領(lǐng)域已知的以及在此公開(kāi)和例示的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化抗FcγRIIB抗體，所述抗FcγRIIB抗體包括但不限于在2002年8月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/403,266和2003年8月14日提交的、具有AttorneyDocket No.011183-010-999美國(guó)申請(qǐng)No.10/643,857，2004年4月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/562,804(具有Attorney Docket No.011183-014-888)；2004年5月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/569,882(具有Attorney Docket No.011183-013-888)和在2004年6月21日提交的具有Attorney Docket Nos.011183-016-888、011183-017-888和011183-018-888的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)Nos.____中公開(kāi)的任何抗體，所述修飾提高Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。通過(guò)完全引用將上述申請(qǐng)的每一個(gè)合并在此。可以根據(jù)本發(fā)明的方法工程化的抗FcγRIIB抗體的實(shí)例是具有ATCC登記號(hào)PTA-4591的2B6單克隆抗體和具有ATCC登記號(hào)PTA-4592的3H7、具有ATCC登記號(hào)PTA-5958的1D5單克隆抗體、具有ATCC登記號(hào)PTA-5959的1F2單克隆抗體、具有ATCC登記號(hào)PTA-5960的2D11單克隆抗體、具有ATCC登記號(hào)PTA-5961的2E1單克隆抗體和具有ATCC登記號(hào)PTA-5962的2H9單克隆抗體(所有的都保藏在10801University Boulevard，Manassas，VA 02209-2011)，通過(guò)引用將它們合并在此。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，修飾抗FcγRIIB抗體也可以進(jìn)一步降低Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在又一個(gè)特定實(shí)施方式中，工程化的抗FcγRIIB抗體可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，如本領(lǐng)域已知的以及在此公開(kāi)和例示的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。在特定的實(shí)施方式中，2B6單克隆抗體包含在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、以及在位置366用絲氨酸替換(MgFc13)；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸替換(MgFc27)；或在位置243用異亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用纈氨酸替換(MgFc29)；或在位置392用蘇氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc38)；或在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用組氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用aspartic(MgFc42)；或在位置410用組氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc53)；或在位置243用亮氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc54)；或在位置255用異亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc55)；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替換(MgFc59)(參見(jiàn)表5)。
1.1.1多肽和抗體結(jié)合
包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子(即，多肽，抗體)可以重組地融合或化學(xué)地結(jié)合(包括共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合)到異源多肽(即，無(wú)關(guān)的多肽；或其部分，優(yōu)選的所述多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個(gè)氨基酸)來(lái)產(chǎn)生融合蛋白。融合不一定需要是直接的，可以通過(guò)接頭序列來(lái)發(fā)生。

進(jìn)一步的，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子(即，多肽，抗體)可以結(jié)合到修飾給定的生物反應(yīng)的治療試劑或藥物部分。治療試劑或藥物部分不應(yīng)被認(rèn)為限于標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)治療試劑。例如，藥物部分可以是具有期望的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)或多肽。這些蛋白質(zhì)可以包括，例如，毒素，例如相思豆毒素、篦麻毒素A、假單胞菌外毒素(即，PE-40)或白喉毒素、篦麻毒素、gelonin和商陸抗病毒蛋白，蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子、干擾素，包括但不限于α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、組織纖溶酶原激活物(TPA)、細(xì)胞凋亡試劑(例如TNF-α、TNF-β、AIM I，如PCT公開(kāi)No.WO97/33899中公開(kāi)的)、AIM II(參見(jiàn)，PCT公開(kāi)No.WO97/34911)、Fas配體(Takahashi et al.，J.Immunol.，61567-1574，1994)和VEGI(PCT公開(kāi)No.WO99/23105)、血栓試劑或抗血管生成試劑(例如，angiostatin或endostatin)，或生體應(yīng)答修飾物，例如，淋巴因子(例如，白細(xì)胞介素-1(“IL-1”)、白細(xì)胞介素-2(“IL-2”白細(xì)胞介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“M-CSF”)或生長(zhǎng)因子(例如，生長(zhǎng)激素(“GH”)；蛋白酶或核酸酶。

本發(fā)明的分子(即，多肽，抗體)可以融合到標(biāo)記物序列，例如肽來(lái)便于純化。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，標(biāo)記物氨基酸序列是六組氨酸肽，例如在特別是pQE載體(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的tag，它們的許多是商業(yè)上可獲得的。例如，如Gentz et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86821-824中描述的，六組氨酸提供了純化融合蛋白的便利。對(duì)純化有用的其他肽tag包括但不限于，血球凝集素“HA”tag，其相應(yīng)于來(lái)自流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson et al.，Cell，377671984)，和“flag”tag(Knappik et al.，Biotechniques，17(4)754-761，1994)。

通過(guò)基因shuffling、基序shuffling、外顯子shuffling和/或密碼子shuffling(共同稱為“DNA shuffling”)的技術(shù)，可以產(chǎn)生其他的融合蛋白?？梢圆捎肈NA shuffling來(lái)改變本發(fā)明的分子的活性(例如，具有更高親合性和更低離解速率的抗體)。參見(jiàn)，一般地，美國(guó)專利No.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458，和Patten et al.，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.1676；Hansson，et al.，1999，J.Mol.Biol.287265；以及Lorenzo and Blasco，1998，BioTechniques 24308(通過(guò)完全引用將專利和出版物的每一個(gè)合并在此)。包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子，或編碼本發(fā)明的分子的核酸，可以通過(guò)error-pronePCR、隨機(jī)核苷酸插入或其他先于重組的方法經(jīng)歷隨機(jī)誘變來(lái)進(jìn)一步改變。編碼本發(fā)明的分子的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)部分可以與一種或多種異源分子的一個(gè)或多個(gè)成分、基序、段、部分、結(jié)構(gòu)域、片段等等重組。

本發(fā)明還涵蓋與診斷或治療試劑或期望提高血清半衰期和/或靶向特定細(xì)胞子集的任何其他分子結(jié)合的、包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子(即，抗體，多肽)。本發(fā)明的分子可以診斷性地使用，例如，作為臨床試驗(yàn)過(guò)程的部分來(lái)監(jiān)視疾病、失調(diào)或感染的發(fā)展或進(jìn)展，例如，來(lái)確定給定治療方式的效力。通過(guò)將本發(fā)明的分子與可檢測(cè)物質(zhì)聯(lián)結(jié)可以使檢測(cè)便利化?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性物質(zhì)、正電子發(fā)射金屬和非放射性的順磁性金屬離子?？蓹z測(cè)物質(zhì)可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)直接地或通過(guò)中間物(例如，本領(lǐng)域已知的接頭)間接地聯(lián)結(jié)或結(jié)合到本發(fā)明的分子。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.4,741,900關(guān)于可以結(jié)合到抗體用作根據(jù)本發(fā)明的診斷的金屬離子。這種診斷和檢測(cè)可以通過(guò)將本發(fā)明的分子聯(lián)結(jié)到可檢測(cè)物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述可檢測(cè)物質(zhì)包括但不限于各種酶，酶包括但不限于，辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基復(fù)合物，例如但不限于，鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光材料，例如但不限于，傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、二氯三嗪基胺、熒光素、丹磺酰氯或藻紅素；發(fā)光材料，例如但不限于，魯米諾；生物發(fā)光材料，例如但不限于，熒光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；放射性物質(zhì)，例如但不限于，鉍(213Bi)、碳(14C)、鉻(51Cr)、鈷(57Co)、氟(18F)、釓(153Gd、159Gd)、鎵(68Ga、67Ga)、鍺(68Ge)、鈥(166Ho)、銦(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、鑭(140La)、镥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬(99Mo)、鈀(103Pd)、磷(32P)、鐠(142Pr)、钷(149Pm)、錸(186Re、188Re)、銠(105Rh)、釕(97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鍶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、鉈(201Ti)、錫(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、鐿(169Yb、175Yb)、釔(90Y)、鋅(65Zn)；利用各種正電子發(fā)射成像的正電子發(fā)射金屬，非放射性的順磁性金屬離子。

包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子可以結(jié)合到治療部分，例如細(xì)胞毒素(例如，抑制細(xì)胞的或殺細(xì)胞的試劑)、治療試劑或放射性元素(例如，α發(fā)射體、γ發(fā)射體，等等)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒試劑包括對(duì)細(xì)胞有害的的任何試劑。實(shí)例包括paclitaxol、細(xì)胞分裂抑素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、etoposide、tenoposide、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙堿、阿霉素、紅比霉素、二羥炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-2-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、萘異丙促胺和嘌呤霉素，和它們的類似物或同系物。治療試劑但不限于，抗代謝物(例如，氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化劑(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亞硝脲氮芥bsnu BSNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂霉素C和順式二氯氨鉑(II)(DDP)順式鉑氨)、anthracyclines(例如，紅比霉素(以前的道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素(以前的納霉素)、博來(lái)霉素、光輝霉素和氨茴霉素(AMC)、和抗有絲分裂試劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)。

此外，本發(fā)明的分子可以結(jié)合到治療部分，例如放射性物質(zhì)或?qū)Y(jié)合放射金屬離子(實(shí)例參見(jiàn)上述的放射性物質(zhì))有用的大環(huán)的螯合劑。在某些實(shí)施方式中，大環(huán)的螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，其可以經(jīng)由接頭分子附著到抗體上。這種接頭分子是本領(lǐng)域一般已知的，在Denardo et al.，1998，ClinCancer Res.42483-90；Peterson et al.，1999，Bioconjug.Chem.10553；和Zimmerman et al.，1999，Nucl.Med.Biol.26943-50中描述了，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

將這種治療部分結(jié)合到抗體的技術(shù)是公知的；參見(jiàn)，例如，Arnon et al.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，1985，pp.243-56，Alan R.Liss，Inc.)；Hellstromet al.，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，1987，pp.623-53，Marcel Dekker，Inc.)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapyA Review”，in Monoclonal Antibodies‘84Biological AndClinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，1985，pp.475-506)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，1985，pp.303-16，Academic Press；和Thorpe et al.，Immunol.Rev.，62119-58，1982。

在一個(gè)實(shí)施方式中，其中本發(fā)明的分子是包含變異Fc區(qū)的抗體，它可以在有或沒(méi)有結(jié)合到其上的治療部分的情況下施用、單獨(dú)地施用、或與用于治療的細(xì)胞毒因子和/或細(xì)胞因子共同施用。做為選擇，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合到第二抗體來(lái)形成如Segal在美國(guó)專利No.4,676,980中描述的抗體異共軛物，通過(guò)完全引用將它合并在此。本發(fā)明的抗體也可以附著于固相支持物，其對(duì)于免疫分析或目標(biāo)抗原的純化是特別有用的。這種固相支持物包括但不限于，玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
1.2篩選具有變異Fc區(qū)的分子的增強(qiáng)的FcγRIII結(jié)合并表征它們
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，篩選和鑒定包含具有改變的FcγR親合性(例如，增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性)的變異Fc區(qū)的分子，使用在此描述的酵母展示技術(shù)結(jié)合一種或多種基于生物化學(xué)的分析，優(yōu)選的以高通量方式來(lái)進(jìn)行。所述一種或多種生物化學(xué)的分析可以是本領(lǐng)域已知用于鑒定Fc-FcγR相互作用，即Fc區(qū)與FcγR的特異性結(jié)合的任何分析，包括但不限于，ELISA分析、表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析、免測(cè)沉淀法分析、親和層析和平衡透析。在某些實(shí)施方式中，篩選和鑒定包含具有改變的FcγR親合性(例如，增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性)的變異Fc區(qū)的分子，使用在此描述的酵母展示技術(shù)結(jié)合一種或多種基于功能性的分析，優(yōu)選的以高通量方式來(lái)進(jìn)行?；诠δ艿姆治隹梢允潜绢I(lǐng)域已知用于表征一種或多種FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的任何分析，例如在此的5.2.7節(jié)中描述的那些。根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用的效應(yīng)細(xì)胞功能的非限制性實(shí)例包括但不限于，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、抗體依賴性吞噬作用、吞噬作用、調(diào)理作用、調(diào)理吞噬作用(opsonophagocytosis)、細(xì)胞結(jié)合、叢簇、C1q結(jié)合以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。在某些實(shí)施方式中，篩選和鑒定包含具有改變的FcγR親合性(例如，增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性)的變異Fc區(qū)的分子，使用在此描述的酵母展示技術(shù)結(jié)合一種或多種基于生物化學(xué)的分析、組合或并用一種或多種基于功能的分析，優(yōu)選的以高通量方式來(lái)進(jìn)行。

術(shù)語(yǔ)Fc區(qū)與FcγR的“特異性結(jié)合”是指Fc區(qū)和特定的FcγR的相互作用，其對(duì)于單體FcγRIIIA來(lái)說(shuō)具有至少約150nM的親合常數(shù)，對(duì)于二聚FcγRIIB來(lái)說(shuō)至少約60nM的親和常數(shù)，如使用例如ELISA或表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析(例如，BIAcoreTM)所測(cè)定的。Fc區(qū)對(duì)單體FcγRIIIA的親合常數(shù)可以是150nM、200nM或300nM。Fc區(qū)對(duì)二聚FcγRIIB的親合常數(shù)可以是60nM、80nM、90nM或100nM。用于本發(fā)明的方法的二聚FcγRIIB可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生。一般地，F(xiàn)cγRIIB的細(xì)胞外區(qū)域與能夠二聚化的異源多肽共價(jià)連接，從而產(chǎn)生的融合蛋白是二聚體，例如，參見(jiàn)，2003年1月13日提交的美國(guó)申請(qǐng)No.60/439,709(Attorney Docket No.11183-005-888)，通過(guò)完全引用將它合并在此。特異性相互作用一般在生理?xiàng)l件是穩(wěn)定的，所述生理?xiàng)l件包括，例如，在活的個(gè)體例如人類或其他脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物中出現(xiàn)的條件，以及在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的條件，這樣的條件被用于維持和培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或來(lái)自另一種脊椎動(dòng)物有機(jī)體或無(wú)脊椎動(dòng)物有機(jī)體的細(xì)胞。

在特定的實(shí)施方式中，篩選和鑒定包含變異Fc區(qū)的分子和改變的FcγR親合性包括在酵母表面展示包含變異Fc區(qū)的分子；以及使用用于測(cè)定Fc-FcγR相互作用的生物化學(xué)分析，優(yōu)選的基于ELISA的分析來(lái)表征包含變異Fc區(qū)的分子與FcγR(一種或多種)的結(jié)合。通過(guò)至少一種基于生物化學(xué)的分析，例如，ELISA分析，一旦包含變異Fc區(qū)的分子被表征了它與一種或多種FcγR的相互作用并測(cè)定了具有對(duì)一種或多種FcγR的改變的親合性，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)方法，該分子可以被工程化為完全的免疫球蛋白，包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用于進(jìn)一步的生物化學(xué)表征。其中導(dǎo)入了本發(fā)明的變異Fc區(qū)的免疫球蛋白(例如，替換該免疫球蛋白的Fc區(qū))可以是任何免疫球蛋白，包括但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體和嵌合抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，變異Fc區(qū)被導(dǎo)入特異于細(xì)胞表面受體、腫瘤抗原或癌癥抗原的免疫球蛋白。其中導(dǎo)入了本發(fā)明的變異Fc區(qū)的免疫球蛋白可以特異性結(jié)合癌癥或腫瘤抗原，例如，包括但不限于，KS 1/4泛癌抗原(Perez and Walker，1990，J.Immunol.1423662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)407-415)，、卵巢癌抗原(CA125)(Yu et al.，1991，Cancer Res.51(2)468-475)、前列腺酸磷酸鹽(Tailor et al.，1990，Nucl.Acids Res.18(16)4928)、前列腺特異性抗原(Henttu and Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)903-910；Israeli et al.，1993，Cancer Res.53227-230)、黑素瘤相關(guān)抗原p97(Estin et al.，1989，J.Natl.Cancer Instit.81(6)445-446)、黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl et al.，1990，J.Exp.Med.171(4)1375-1380)、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali et al.，1987，Cancer 5955-63；Mittelman et al.，1990，J.Clin.Invest.862136-2144)、前列腺特異性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foonet al.，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13294)、多態(tài)性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、結(jié)腸直腸腫瘤相關(guān)抗原例如CEA、TAG-72(Yokata et al.，1992，Cancer Res.523402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar et al.，1993，Int.J.Cancer 53751-758)；GICA 19-9(Herlyn et al.，1982，J.Clin.Immunol.2135)、CTA-1和LEA、Burkitt′s淋巴瘤抗原-38.13、CD19(Ghetie et al.，1994，Blood 831329-1336)、人類B淋巴瘤抗原-CD20(Reff et al.，1994，Blood83435-445)、CD33(Sgouros et al.，1993，J.Nucl.Med.34422-430)、黑素瘤特異性抗原例如神經(jīng)節(jié)苷脂GD2(Saleh et al.，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)、神經(jīng)節(jié)苷脂GD3(Shitara et al.，1993，Cancer Immunol.Immunother.36373-380)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2(Livingston et al.，1994，J.Clin.Oncol.121036-1044)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(Hoon et al.，1993，Cancer Res.535244-5250)、細(xì)胞表面抗原的腫瘤特異性移植類型(TSTA)例如virally誘導(dǎo)的腫瘤抗原，包括T抗原DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原-甲胎蛋白例如結(jié)腸的CEA、膀胱腫瘤癌胚抗原(Hellstrom et al.，1985，Cancer.Res.452210-2188)，differentiation antigen such as humanlung carcinoma antigen L6，L20(Hellstrom et al.，1986，Cancer Res.463917-3923)、纖維肉瘤的抗原、人類白血病T細(xì)胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al.，1988，J.of Immun.1411398-1403)、neoglycoprotein、鞘脂類、乳癌抗原例如EGFR(E pidermal growthfactor receptor)、HER2抗原(p185HER2)、多態(tài)上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens et al.，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17359)、惡性人類淋巴細(xì)胞抗原-APO-1(Bernhard et al.，1989，Science 245301-304)、分化抗原(Feizi，1985，Nature 31453-57)例如胎兒紅血球中發(fā)現(xiàn)的I抗原、成年人紅血球中發(fā)現(xiàn)的原內(nèi)胚層I抗原、胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的植入前(preimplantation)胚，I(Ma)、乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的M18、M39、骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的SSEA-1、結(jié)腸直腸癌中發(fā)現(xiàn)的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、TRA-1-85(血群H)、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的C14、肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的F3、胃癌中發(fā)現(xiàn)的AH6、Y半抗原、胚胎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Ley、TL5(血群A)、A431細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的EGF受體、胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的E1系列(血群B)、胚胎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的FC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中發(fā)現(xiàn)的CO-514(血群Lea)、腺癌中發(fā)現(xiàn)的NS-10、CO-43(血群Leb)、A431細(xì)胞的EGF受體中發(fā)現(xiàn)的G49、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的MH2(血群ALeb/Ley)、結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的T5A7、黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的R24、4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和胚胎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的M1:22:25:8，和4到8細(xì)胞期胚中發(fā)現(xiàn)的SSEA-3和SSEA-4。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原是來(lái)自皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的T細(xì)胞受體衍生的肽(參見(jiàn)，Edelson，1998，The Cancer Journal 462)。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異Fc區(qū)被導(dǎo)入抗熒光素單克隆抗體4-4-20(Kranz et al.，1982 J.Biol.Chem.257(12)6987-6995；通過(guò)完全引用將它合并在此)。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異Fc區(qū)被導(dǎo)入小鼠人類嵌合抗CD20單克隆抗體2H7，其識(shí)別B細(xì)胞上的CD20細(xì)胞表面磷蛋白(Liu et al.，1987，Journal ofImmunology，1393521-6；通過(guò)完全引用將它合并在此)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異Fc區(qū)被導(dǎo)入如Carter等描述的針對(duì)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(p185HER2)的人源化抗體(Ab4D5)(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285-9；通過(guò)完全引用將它合并在此)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異Fc區(qū)被導(dǎo)入人源化抗TAG72抗體(CC49)(Sha et al.，1994Cancer Biother.9(4)341-9)。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異Fc區(qū)被導(dǎo)入用于治療淋巴瘤的Rituxan。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)修飾(例如，替換、插入、刪除)至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)工程化抗FcγRIIB抗體，所述抗FcγRIIB抗體包括但不限于在2002年8月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/403,266和2003年8月14日提交的美國(guó)申請(qǐng)No.10/643,857(具有Attorney Docket No.011183-010-999)，2004年4月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/562,804(具有Attorney Docket No.011183-014-888)；2004年5月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/569,882(具有Attorney Docket No.011183-013-888)和在2004年6月21日提交的具有Attorney Docket Nos.011183-016-888、011183-017-888和011183-018-888的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)Nos.____中公開(kāi)的任何抗體，所述修飾提高Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。可以根據(jù)本發(fā)明的方法工程化的抗FcγRIIB抗體的實(shí)例是具有ATCC登記號(hào)PTA-4591的2B6單克隆抗體和具有ATCC登記號(hào)PTA-4592的3H7、具有ATCC登記號(hào)PTA-5958的1D5單克隆抗體、具有ATCC登記號(hào)PTA-5959的1F2單克隆抗體、具有ATCC登記號(hào)PTA-5960的2D11單克隆抗體、具有ATCC登記號(hào)PTA-5961的2E1單克隆抗體和具有ATCC登記號(hào)PTA-5962的2H9單克隆抗體(所有的都保藏在10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 02209-2011)，通過(guò)引用將它們合并在此。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，修飾抗FcγRIIB抗體也可以進(jìn)一步降低Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在又一個(gè)特定實(shí)施方式中，工程化的抗FcγRIIB抗體可以進(jìn)一步具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，如本領(lǐng)域已知的以及在此公開(kāi)和例示的標(biāo)準(zhǔn)分析所測(cè)定的。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異Fc區(qū)被導(dǎo)入特異于癌癥抗原或細(xì)胞表面受體的治療性單克隆抗體，包括但不限于，ErbituxTM(也稱為IMC-C225)(ImCloneSystems Inc.)、針對(duì)EGFR的嵌合單克隆抗體；HERCEPTIN

(Trastuzumab)(Genentech，CA)，其是用于治療患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者的人源化抗HER2單克隆抗體；REOPRO

(abciximab)(Centocor)，其是用于防止凝塊形成的抗血小板上的糖蛋白IIb/IIIa受體；ZENAPAX

(daclizumab)(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)，其是用于防止急性的腎臟異體移植排斥的免疫抑制性、人源化抗CD25單克隆抗體。其他實(shí)例是人源化的抗-CD18F(ab′)2(Genentech)；CDP860，其是人源化的抗-CD18F(ab′)2(Celltech，UK)；PRO542，其是與CD4融合的抗-HIV gp120抗體(Progenics/Genzyme Transgenics)；C14其是抗-CD14抗體(ICOSPharm)；人源化的抗-VEGF IgG1抗體(Genentech)；OVAREXTM其是鼠抗-CA 125抗體(Altarex)；PANOREXTM，其是鼠抗-17-IA細(xì)胞表面抗原IgG2a抗體(Glaxo Wellcome/Centocor)；IMC-C225其是嵌合的抗-EGFR IgG抗體(ImClone System)；VITAXINTM，其是人源化的抗-αVβ3整聯(lián)蛋白抗體(Applied MolecularEvolution/MedImmune)；Campath 1H/LDP-03，其是人源化的抗CD52IgG1抗體(Leukosite)；Smart M195，其是人源化的抗-CD33IgG抗體(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXANTM，其是嵌合的抗-CD20IgG1抗體(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDETM，其是人源化的抗-CD22IgG抗體(Immunomedics)；Smart ID10，其是人源化的抗-HLA抗體(ProteinDesign Lab)；ONCOLYMTM(Lym-1)是放射標(biāo)記的鼠抗-HLA DR抗體(Techniclone)；抗-CD11a是人源化的抗IgG1抗體(Genetech/Xoma)；ICM3是人源化的抗-ICAM3抗體(ICOSPharm)；IDEC-114是靈長(zhǎng)化的抗-CD80抗體(IDECPharm/Mitsubishi)；ZEVALINTM是放射標(biāo)記的鼠抗-CD20抗體(IDEC/Schering AG)；IDEC-131是人源化的抗-CD40L抗體(IDEC/Eisai)；IDEC-151是靈長(zhǎng)化的抗-CD4抗體(IDEC)；IDEC-152是靈長(zhǎng)化的抗-CD23抗體(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化的抗-CD3IgG(Protein Design Lab)；5G1.1是人源化的抗-補(bǔ)體因子5(C5)抗體(Alexion Pharm)；IDEC-151是靈長(zhǎng)化的抗-CD4IgG1抗體(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4是人類抗-CD4IgG抗體(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化的抗-TNF-αIgG4抗體(Celltech)；LDP-02是人源化的抗-α4β7抗體(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化的抗-CD4IgG抗體(Ortho Biotech)；ANTOVATM是人源化的抗-CD40L IgG抗體(Biogen)；ANTEGRENTM是人源化的抗-VLA-4IgG抗體(Elan)；MDX-33是人類抗-CD64(FcγR)抗體(Medarex/Centeon)；；rhuMab-E25是人源化的抗-IgE IgG1抗體(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems)；IDEC-152其是靈長(zhǎng)化的抗-CD23抗體(IDEC Pharm)；ABX-CBL是鼠抗CD-147IgM抗體(Abgenix)；BTI-322是大鼠抗-CD2IgG抗體(Medimmune/BioTransplant)；Orthoclone/OKT3是鼠抗-CD3IgG2a抗體(orthoBiotech)；SIMULECTTM是嵌合的抗-CD25IgG1抗體(NovartisPharm)；LDP-01是人源化的抗-β2-整聯(lián)蛋白IgG抗體(LeukoSite)；Anti-LFA-1是鼠抗CD18F(ab′)2(Pasteur-Merieux/Immunotech)；CAT-152是人類抗-TGF-β2抗體(Cambridge Ab Tech)；以及CorsevinM是嵌合的抗-Factor VII抗體(Centocor)。

本發(fā)明的變異Fc區(qū)，優(yōu)選的的在免疫球蛋白的背景中，可以進(jìn)一步使用一種或多種生物化學(xué)的分析和/或一種或多種功能性分析，優(yōu)選的以高通量方式來(lái)表征。在某些可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異Fc區(qū)不被導(dǎo)入免疫球蛋白，進(jìn)一步使用一種或多種基于生物化學(xué)的分析和/或一種或多種功能性分析，優(yōu)選的以高通量方式來(lái)表征。所述一種或多種生物化學(xué)的分析可以是本領(lǐng)域已知用于鑒定Fc-FcγR相互作用任何分析，包括但不限于，ELISA分析、用于測(cè)定Fc-FcγR相互作用的動(dòng)力參數(shù)的基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振的分析，例如，BIAcore分析。一種或多種功能性分析可以是本領(lǐng)域已知用于表征一種或多種FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能的任何分析，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或在此描述的。在特定的實(shí)施方式中，在ELISA分析中分析包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白與一種或多種FcγR，例如，F(xiàn)cγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIA的結(jié)合；繼之以一種或多種ADCC分析。在某些實(shí)施方式中，進(jìn)一步使用基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振的分析，例BIAcore來(lái)分析包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白?；诒砻姘|(zhì)團(tuán)共振的分析是本領(lǐng)域公知的，在5.2.7節(jié)中進(jìn)一步討論了，在此在實(shí)施例6.8中例示了。

用于表征包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白的示范性的高通量分析可以包括通過(guò)例如標(biāo)準(zhǔn)的DNA重組技術(shù)方法將本發(fā)明的變異Fc區(qū)導(dǎo)4-4-20抗體中；在ELISA分析中表征包含變異Fc區(qū)的4-4-20抗體與FcγR(例如，F(xiàn)cγRIIIA、FcγRIIB)的特異性結(jié)合；在ADCC分析中表征包含變異Fc區(qū)的4-4-20抗體(使用在此公開(kāi)的方法)，其中用包含變異Fc區(qū)的4-4-20抗體調(diào)理靶細(xì)胞；然后可以將變異Fc區(qū)克隆到第二免疫球蛋白中，例4D5、2H7，在ADCC分析中表征第二免疫球蛋白，其中用包含變異Fc區(qū)的第二抗體調(diào)理目標(biāo)細(xì)胞。然后使用基于ELISA的分析來(lái)進(jìn)一步分析包含變異Fc區(qū)的第二抗體來(lái)證實(shí)與FcγR的特異性結(jié)合。

優(yōu)選的，如在ELISA分析中測(cè)定的，本發(fā)明的變異Fc區(qū)以比野生型Fc區(qū)更高的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA。最優(yōu)選的，如在ELISA分析中測(cè)定的，本發(fā)明的變異Fc區(qū)以比野生型Fc區(qū)更高的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，更低的親合性結(jié)合FcγRIIB。在某些實(shí)施方式中，如在ELISA分析中測(cè)定的，所述變異Fc區(qū)以野生型Fc區(qū)結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA至少2倍高、至少4倍高、更優(yōu)選的至少6倍高、最優(yōu)選的至少8到10倍高的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，并以野生型Fc區(qū)結(jié)合FcγRIIB至少1/2、至少1/4、更優(yōu)選的至少1/6、最優(yōu)選的至少1/8到1/10的親合性結(jié)合FcγRIIB。

使用在此公開(kāi)合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以在任何點(diǎn)使用用于定義Fc-FcγR相互作用的動(dòng)力參數(shù)的、基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振的分析，來(lái)分析包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白。優(yōu)選的，如通過(guò)BIAcore分析所測(cè)定的，本發(fā)明的變異Fc區(qū)結(jié)合單體FcγRIIIA和/或FcγRIIA的Kd是月100nM、優(yōu)選的約70nM、最優(yōu)選的約40nM；本發(fā)明的變異Fc區(qū)結(jié)合二聚FcγRIIB的Kd是約80nM、約100nM、更優(yōu)選的約200nM。

在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)一步在動(dòng)物模型中表征包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白與FcγR的相互作用。用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選的動(dòng)物模型是，例如，表達(dá)人類FcγR的轉(zhuǎn)基因小鼠，例如，在美國(guó)專利No.5,877,397和6,676,927中描述的任何小鼠模型，通過(guò)完全引用將它們合并在此。在本發(fā)明的方法中使用的轉(zhuǎn)基因小鼠包括但不限于，攜帶人類FcγRIIIA的天生敲除FcγRIIIA的小鼠；攜帶人類FcγRIIA的天生敲除FcγRIIIA的小鼠；攜帶人類FcγRIIB和人類FcγRIIIA的天生敲除FcγRIIIA的小鼠；攜帶人類FcγRIIB和人類FcγRIIA的天生敲除FcγRIIIA的小鼠；攜帶人類FcγRIIIA和FcγRIIA的天生敲除FcγRIIIA和FcγRIIA的小鼠以及攜帶人類FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRIIB的天生敲除FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRIIB的小鼠。
5.2.1設(shè)計(jì)策略
本發(fā)明涵蓋工程方法來(lái)產(chǎn)生Fc變體，包括但不限于計(jì)算設(shè)計(jì)策略、庫(kù)產(chǎn)生方法以及實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)和篩選方法。這些策略可以獨(dú)立地或各種組合應(yīng)用來(lái)工程化本發(fā)明的Fc變體。

在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程方法包含一些方法，在其中Fc區(qū)和Fc配體間接口處的氨基酸不被修飾。Fc配體包括但不限于，F(xiàn)cγR、C1q、FcRn、C3、甘露糖受體、蛋白A、蛋白G、甘露糖受體以及尚未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合Fc的分子。Fc區(qū)和Fc配體之間接口處的氨基酸被定義為那些氨基酸，它們?cè)贔c區(qū)和配體間產(chǎn)生直接和/或間接接觸，在確定接口的構(gòu)象中起到結(jié)構(gòu)性作用，或如通過(guò)結(jié)構(gòu)分析例如X-射線晶體衍射和分子建模所測(cè)定的，相互在至少3埃、優(yōu)選的至少2埃之內(nèi)。Fc區(qū)和Fc配體之間接口處的氨基酸包括根據(jù)Fc-FcγR相互作用的結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析，例如Sondermann等公開(kāi)的(2000，Nature，406267-273；通過(guò)完全引用將它合并在此)，與FcγR進(jìn)行直接接觸的那些氨基酸。與FcγR進(jìn)行直接接觸的Fc區(qū)內(nèi)的位置的實(shí)例是氨基酸234-239(絞鏈區(qū))、氨基酸265-269(B/C環(huán))、氨基酸297-299(C′/E環(huán))和氨基酸327-332(F/G)環(huán)。在某些實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子包含至少一個(gè)殘基的修飾，根據(jù)結(jié)構(gòu)或結(jié)晶分析所述修飾不與FcγR進(jìn)行直接接觸，例如，不在Fc-FcγR結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。

優(yōu)選的，本發(fā)明的工程方法不修飾如Shields等所鑒定的任何氨基酸，它們位于靠近絞鏈區(qū)的Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中，例如Leu234-Pro238；Ala327、Pro329，并影響Fc區(qū)與所有人類FcγR的結(jié)合。

在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋具有改變的FcγR親合性和/或改變的效應(yīng)物功能的Fc變體，從而所述Fc變體不具有在Fc區(qū)和Fc配體之間接口處位置的氨基酸修飾。優(yōu)選的，這樣的Fc變體結(jié)合在Fc區(qū)和Fc配體之間接口處的一個(gè)或多個(gè)其他氨基酸修飾對(duì)特別改變的性質(zhì)，例如改變的FcγR親合性具有進(jìn)一步的影響。修飾Fc和Fc配體之間接口處的氨基酸可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行，例如，根據(jù)Fc-配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析。例如而不是限制，通過(guò)探索在Fc位置影響結(jié)合接口的能量有利性替換，可以工程化產(chǎn)生新的接口構(gòu)象的變體，它們中的一些可能改善與Fc配體的結(jié)合，它們的一些可能降低Fc配體結(jié)合，它們中的一些可能具有其他有利的性質(zhì)。這些新的接口構(gòu)象可能是，例如，與形成接口的Fc配體殘基的直接相互作用的結(jié)果，或由氨基酸修飾引起的間接效果，例如側(cè)鏈或主干構(gòu)象的擾動(dòng)的結(jié)果。

本發(fā)明涵蓋工程化Fc變體，所述Fc變體包含在此公開(kāi)的任何氨基酸修飾結(jié)合其他修飾，其中在位置297處Fc碳水化物的構(gòu)象被改變。本發(fā)明涵蓋在N297碳水化物中構(gòu)象和成分的變化，其產(chǎn)生期望的性質(zhì)，例如對(duì)FcγR提高的或降低的親合性。這種修飾可以進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明的Fc變體的原始氨基酸修飾的表型。盡管不希望受特定作用機(jī)制的限制，這種策略得到了觀察結(jié)果的支持，所述觀察結(jié)果是碳水化物結(jié)構(gòu)和構(gòu)象顯著地影響Fc-FcγR和Fc/Clq結(jié)合(Umahaet aL，1999，Nat Biotechnol 17176-180；Davies et aL，2001，BiotechnolBioeng 74288-294；Mimura et aL，2001，J Biol Chem 27645539；Radaev et aL，2001，J Biol Chem 27616478-16483；Shields et aL2002，J Biol Chem 27726733-26740；Shinkawa et aL，2003，J BiolChem 2783466-3473)。

提供了用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的Fc變體的另一種設(shè)計(jì)策略，其中Fc變體被重新工程化來(lái)消除糖基化方面的結(jié)構(gòu)和功能依賴。這種設(shè)計(jì)策略包括在不存在N297碳水化物的情況下優(yōu)化Fc結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和/或Fc功能(例如，F(xiàn)c對(duì)一種或多種Fc配體的親合性)。在一種方法中，未糖基化時(shí)暴露于溶劑的位置被工程化，從而它們是穩(wěn)定的、與Fc結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)上一致的、并且沒(méi)有聚集的傾向。優(yōu)化糖基化的Fc的方法可以包括但不限于，通過(guò)摻入朝向Cg2-Cg2二聚體軸的極性或帶電殘基，和通過(guò)設(shè)計(jì)直接增強(qiáng)糖基化Fc-FcγR接口或糖基化Fc與其他Fc配體的接口的氨基酸修飾，來(lái)設(shè)計(jì)增強(qiáng)糖基化Fc穩(wěn)定性和/或溶解性的氨基酸修飾。

本發(fā)明的Fc變體可以與其他Fc修飾組合，包括但不限于改變效應(yīng)物功能的那些。本發(fā)明涵蓋組合本發(fā)明的Fc變體與其他Fc修飾來(lái)提供抗體或Fc融合物中附加的、協(xié)同的、或新的性質(zhì)。這種修飾可以位于CH1、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域或它們的組合中。優(yōu)選的本發(fā)明的Fc變體增強(qiáng)它們與之組合的修飾的性質(zhì)。例如，如果本發(fā)明的Fc變體與一種突變體組合，所述突變體已知以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更高親合性結(jié)合FcγRIIIA；與本發(fā)明的突變的組合引起在FcγRIIIA親合性上更大倍數(shù)的增強(qiáng)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體可以與其他已知的Fc變體組合，例如在Duncan et al，1988，Nature 332563-564；Lund etal.，1991，J.Immunol 1472657-2662；Lund et al，1992，Mol Immunol2953-59；Alegre et al，1994，Transplantation 571537-1543；Hutchinset al.，1995，Proc Natl.Acad Sci U S A 9211980-11984；Jefferis et al，1995，Immunol Lett.44111-117；Lund et al.，1995，F(xiàn)aseb J 9115-119；Jefferis et al，1996，Immunol Lett 54101-104；Lund et al，1996，JImmunol 15749634969；Armour et aL，1999，Eur J Immunol292613-2624；Idusogie et al，2000，J Immunol 16441784184；Reddyet al，2000，J Immunol 1641925-1933；Xu et al.，2000，Cell Immunol20016-26；Idusogie et al，2001，J Immunol 1662571-2575；Shields etal.，2001，J Biol Chem 2766591-6604；Jefferis et al，2002，ImmunolLett 8257-65；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30487-490)；US 5,624,821；US 5,885,573；US 6,194,551；PCT WO 00/42072；PCTWO 99/58572中公開(kāi)的那些，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。
5.2.2FcγR-Fc結(jié)合分析
開(kāi)發(fā)了FcγR-Fc結(jié)合分析用于測(cè)定包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子與FcγR的結(jié)合，其容許相互作用的檢測(cè)和定量，不論受體對(duì)它的配體的固有地弱的親合性，例如，對(duì)于FcγRIIB和FcγRIIIA在微摩爾的范圍內(nèi)。所述方法包括形成FcγR復(fù)合物，相對(duì)于未復(fù)合的FcγR，其具有對(duì)Fc區(qū)的改善的親合力。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的分子復(fù)合物是四聚的免疫復(fù)合物，包括(a)FcγR的可溶區(qū)域(例如，F(xiàn)cγRIIIA、FcγRIIA或FcγRIIB的可溶區(qū))；(b)與FcγR的可溶區(qū)域(例如，F(xiàn)cγRIIIA、FcγRIIA或FcγRIIB的可溶區(qū)域)的C-末端可操作連接的生物素化的15氨基酸AVITAG序列(AVITAG)；和(c)鏈霉抗生物素蛋白-藻紅素(SA-PE)；以一定摩爾比來(lái)形成四聚FcγR復(fù)合物(優(yōu)選的以5∶1的摩爾比)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，所述融合蛋白以酶學(xué)手段生物素化，使用例如，E.coli Bir A酶，一種特異地將AVITAG序列中15氨基酸上的賴氨酸殘基生物素化的生物素連接酶。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，85％的融合蛋白被生物素化的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法所測(cè)定的，包括但不限于鏈霉抗生物素蛋白移動(dòng)分析。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，以1X SA-PE:5X生物素化可溶FcγR的摩爾比將生物素化的可溶FcγR蛋白與SA-PE混合，來(lái)形成四聚FcγR復(fù)合物。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含F(xiàn)c區(qū)的多肽以比單體未復(fù)合的FcγR高至少7倍的親合性結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的方法形成的四聚FcγR復(fù)合物。包含F(xiàn)c區(qū)的多肽與四聚FcγR復(fù)合物的結(jié)合可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)測(cè)定，實(shí)例例如，熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)、放射性免疫分析、ELISA分析，等等。

本發(fā)明涵蓋使用根據(jù)如上所述的方法形成的免疫復(fù)合物來(lái)在基于細(xì)胞的或無(wú)細(xì)胞的分析中測(cè)定包含F(xiàn)c區(qū)的分子的功能。

為了方便，可以以分析試劑盒來(lái)提供試劑，即，用于分析包含變異Fc區(qū)的分子結(jié)合FcγR四聚復(fù)合物的能力的試劑的封裝組合。用于測(cè)定Fc-FcγR相互作用的其他形式的分子復(fù)合物也預(yù)期用于本發(fā)明的方法中，例如，如2003年1月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/439,709(Attorney Docket No.11183-005-888)中描述所形成的融合蛋白；通過(guò)完全引用將它合并在此。
5.2.3酵母展示庫(kù)的誘變和構(gòu)建
IgG Fc和Fc受體之間的分子相互作用早先已經(jīng)通過(guò)結(jié)構(gòu)和遺傳技術(shù)研究了。這些研究鑒定了對(duì)于Fc與不同的FcγR的功能性結(jié)合是關(guān)鍵性的氨基酸殘基。這些變化在動(dòng)物模型中都沒(méi)有顯示改善人類FcγR介導(dǎo)的治療抗體的效力。還沒(méi)有報(bào)道在這些殘基或其他潛在重要的殘基處的所有潛在氨基酸變化的完整分析。在此描述的平臺(tái)具有構(gòu)建帶有所有可能的氨基酸變化的突變體庫(kù)、使用多種功能性分析來(lái)篩選庫(kù)、最后在人源化的動(dòng)物模型中分析庫(kù)的能力。

本發(fā)明涵蓋根據(jù)本領(lǐng)域已知的或正在發(fā)展的遺傳和結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)構(gòu)建多個(gè)庫(kù)。此處描述和例示的方法包括構(gòu)建單獨(dú)的庫(kù)，其含有在Fc區(qū)的3-6個(gè)殘基之間測(cè)試所有20種氨基酸變化的突變體。突變的完整集合匯集到所有可能的突變組合中。產(chǎn)生的獨(dú)立突變的數(shù)目基于在庫(kù)組裝期間被飽和的位點(diǎn)的數(shù)目(以下的表9)。庫(kù)大小將決定初步篩選的選擇和用于最初克隆步驟的載體的選擇。
表9根據(jù)目標(biāo)位點(diǎn)數(shù)目的獨(dú)立突變的數(shù)目
本發(fā)明涵蓋構(gòu)建組合庫(kù)，其集中于有限數(shù)量的關(guān)鍵性殘基(例如，3-6個(gè))。使用隨機(jī)誘變的IgG1 Fc的庫(kù)和在此描述和例示的篩選分析，鑒定Fc變體。在最初幾輪中，根據(jù)FcR結(jié)合分布型和功能活性選擇最好的5個(gè)突變。采用205個(gè)單獨(dú)突變來(lái)覆蓋5個(gè)位置處的所有可能的氨基酸變化和它們的組合。產(chǎn)生對(duì)每個(gè)突變具有至少10倍覆蓋度的庫(kù)。此外，根據(jù)可獲得的信息，例如晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)、小鼠/人類同種型FcγR結(jié)合差異、遺傳學(xué)數(shù)據(jù)和通過(guò)誘變鑒定的其他位點(diǎn)，來(lái)選擇區(qū)域。

當(dāng)前的針對(duì)位點(diǎn)的誘變方案最大的缺點(diǎn)是產(chǎn)生偏離的群體，在某些區(qū)域過(guò)度出現(xiàn)的變異以及在其他區(qū)域過(guò)低出現(xiàn)的或完全缺乏突變。本發(fā)明通過(guò)使用很好地開(kāi)發(fā)的基因建筑技術(shù)產(chǎn)生期望的Fc突變的無(wú)偏排列克服了這個(gè)難題，來(lái)消除由基于PCR的方法，例如重疊PCR和反向PCR引入的偏差。本發(fā)明的方法的主要區(qū)別是1)采用對(duì)每個(gè)目標(biāo)密碼子的20個(gè)單獨(dú)的oligo的等摩爾混合物，取代簡(jiǎn)并引物。這樣每個(gè)氨基酸由單個(gè)的、最常用的密碼子來(lái)呈現(xiàn)，而簡(jiǎn)并引物過(guò)度呈現(xiàn)由更多密碼子編碼的那些氨基酸，超過(guò)了由更少的密碼子編碼的那些氨基酸。2)通過(guò)鏈替換方法構(gòu)建突變體。這確保了無(wú)偏差地將所有期望的變化引入最終產(chǎn)物中。

方案示范性的方案包含以下步驟1)磷酸化的oligos，呈現(xiàn)在一個(gè)或幾個(gè)位置所有期望的變化，全部與相同的鏈互補(bǔ)，添加到模板以及熱穩(wěn)定的、5’＞3’核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶和連接酶(附圖25a)。2)組合的混合物經(jīng)歷多個(gè)聚合/連接循環(huán)，足以產(chǎn)生期望數(shù)量的產(chǎn)物。當(dāng)熱穩(wěn)定的連接酶將單獨(dú)的引物-延伸的片段組裝到連續(xù)的單鏈的鏈上時(shí)，使用5′＞3′核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶確保了引物序列和它的磷酸鹽殘基的完整性。反應(yīng)循環(huán)可以繼續(xù)直到完全耗盡oligos庫(kù)，而不向最終產(chǎn)物中引入偏差(附圖25b)。3)通過(guò)向反應(yīng)添加反向的基因特異性引物將產(chǎn)生的單鏈突變體的庫(kù)轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA(附圖251c)。4)雙鏈的產(chǎn)物在末端設(shè)計(jì)的限制性位點(diǎn)得以消化，并克隆到合適的表達(dá)載體中(附圖251d)。

為了確保庫(kù)的質(zhì)量，通過(guò)電泳分析PCR擴(kuò)增的片段來(lái)確定最終PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。如果99％的PCR產(chǎn)物具有預(yù)期的長(zhǎng)度，將反應(yīng)表征為成功的。最終的庫(kù)被克隆到表達(dá)載體中。突變庫(kù)的部分將被測(cè)序來(lái)確定突變密碼子摻入的比率。測(cè)序的片段的數(shù)目基于突變的目標(biāo)位點(diǎn)的數(shù)目，通過(guò)觀察的目標(biāo)位點(diǎn)的突變比率來(lái)確定庫(kù)的有效性(表10)。沒(méi)有插入物的載體的比率應(yīng)當(dāng)?shù)陀?％。在非目標(biāo)位點(diǎn)的突變的比率應(yīng)低于8％。含有具有＞90％正確插入的克隆的庫(kù)將允許我們維持篩選時(shí)間線。
表10庫(kù)的預(yù)期的突變比率

在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋用于構(gòu)建庫(kù)的重疊或反向PCR。為了保持無(wú)偏差，使用每個(gè)密碼子的單獨(dú)的引物而不是簡(jiǎn)并的引物。采用與以上公開(kāi)的類似的有效性方案。

采用最優(yōu)選的自動(dòng)化方案用于高通量庫(kù)產(chǎn)生。自動(dòng)裝置容許為需要冗長(zhǎng)的重復(fù)操作的任務(wù)改善通過(guò)量、離人的操作、以及實(shí)驗(yàn)誤差的總體下降。Oligo合成能力基于2Mermade DNA合成儀(Bioautomation，Inc.)為575個(gè)60mer Oligos/12小時(shí)的總輸出能力。專用軟件處理了設(shè)計(jì)、合成和最終寡核苷酸存儲(chǔ)的所有方面。采用機(jī)器人化的液體處理機(jī)來(lái)布置用于全長(zhǎng)Fc突變體的合成的oligos，并建立用于將突變Fc摻入抗體重鏈表達(dá)載體的連接反應(yīng)。在連接之后，估計(jì)將花費(fèi)1FTE～10天來(lái)排列庫(kù)克隆并產(chǎn)生～8000個(gè)minipreps，相當(dāng)于3個(gè)位點(diǎn)飽和的組合庫(kù)。在細(xì)菌轉(zhuǎn)化之后，使用Qpix-2克隆挑取者機(jī)器人來(lái)挑取菌落到96深孔平板中。使用磁懸浮攪拌器進(jìn)行培養(yǎng)物生長(zhǎng)，能夠孵育12個(gè)平板并在37℃在12-16hr內(nèi)產(chǎn)生稠密的生長(zhǎng)。使用Qiagen miniprep機(jī)器人以2.5小時(shí)內(nèi)4個(gè)96孔平板的速率來(lái)進(jìn)行DNA制備。通過(guò)重疊任務(wù)，可以在9個(gè)月內(nèi)以1FTE構(gòu)建5個(gè)這樣的庫(kù)。

親合性成熟(affinity maturation)需要從預(yù)選的突變庫(kù)或基因家族的成員中組裝一套新的突變組合，其可以通過(guò)選擇方案來(lái)富集。重復(fù)該過(guò)程幾次直到實(shí)現(xiàn)具有期望表型的突變體的分離。當(dāng)前的酶學(xué)方法、DNA shuffling實(shí)現(xiàn)這個(gè)過(guò)程的缺點(diǎn)是偏差、最終裝配的庫(kù)中特定突變的優(yōu)勢(shì)性、以及損失最終的庫(kù)中某些原始的突變，所述偏差可能由于基因內(nèi)對(duì)于核酸酶是熱點(diǎn)的特異性位點(diǎn)而引入。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，使用build-a-gene(BAG)技術(shù)來(lái)產(chǎn)生Fc突變的高度復(fù)合的庫(kù)，所述Fc突變含有在對(duì)于受體結(jié)合可能重要的所有潛在位置處的隨機(jī)的氨基酸變化。使用覆蓋IgG Fc的特定區(qū)域的簡(jiǎn)并oligo的集合(參見(jiàn)，附圖26)。

Oligo為～30nt，構(gòu)建改變一個(gè)或兩個(gè)AA(8oligos)的合成的簡(jiǎn)并oligos。設(shè)計(jì)oligos來(lái)無(wú)缺口地重疊。每個(gè)寡核苷酸采取～200個(gè)oligos來(lái)適應(yīng)所有單個(gè)AA變化，～2000個(gè)來(lái)改變兩個(gè)AA。使用以上列出的方案(A.20)，單獨(dú)地或組合地使用所有2000+個(gè)oligos來(lái)產(chǎn)生Fc突變的系列。我們使用內(nèi)部編寫(xiě)的隨機(jī)發(fā)生器程序和機(jī)器人液體處理機(jī)用于集中突變和野生型oligos的選擇的組合。將大的庫(kù)克隆到載體中，所述載體容許使用酵母表面展示進(jìn)行篩選。這種方法利用了磁性珠子選擇，繼之以流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，已經(jīng)成功地應(yīng)用于具有＞109的復(fù)雜度的庫(kù)(Feldhaus et al.，2003，Nat.Biotech.21(2)163-170；通過(guò)完全引用將它合并在此)。這限制了在任一個(gè)庫(kù)中測(cè)試的位點(diǎn)數(shù)目為7，產(chǎn)生～1.3×109種可能的突變/庫(kù)。

為了確保庫(kù)的質(zhì)量，通過(guò)電泳分析PCR擴(kuò)增的片段來(lái)確定最終PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。如果99％的PCR產(chǎn)物具有預(yù)期的長(zhǎng)度，將反應(yīng)表征為成功的。突變庫(kù)的部分將被測(cè)序來(lái)確定突變密碼子摻入的比率。測(cè)序的片段的數(shù)目基于突變的目標(biāo)位點(diǎn)的數(shù)目，通過(guò)觀察的目標(biāo)位點(diǎn)的突變比率來(lái)確定庫(kù)的有效性(表10)。沒(méi)有插入物的載體的比率應(yīng)當(dāng)?shù)陀?％。在非目標(biāo)位點(diǎn)的突變的比率應(yīng)低于8％。

通過(guò)測(cè)序克隆的子集，確定通過(guò)這種方法產(chǎn)生期望的誘變有效水平的能力。對(duì)BAG可選擇的是使用“DNA shuffle”方案。這需要集中所有的突變體，單個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)，等等。在DNA制備之后，使用選擇性擴(kuò)增Fc的突變區(qū)～700bp的側(cè)翼引物通過(guò)PCR擴(kuò)增Fc區(qū)。經(jīng)由DNAseI處理擴(kuò)增的DNA和分離150-200bp片段，通過(guò)reshuffling突變來(lái)構(gòu)建新的突變體(參見(jiàn)，例如Stemmer et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9110747-51。重新連接片段，用嵌套引物PCR擴(kuò)增，并克隆到酵母表面展示載體pYD1中。如在此描述和例示的，在酵母Fc展示篩選中重新選擇重組的庫(kù)。

BAG庫(kù)利用大多數(shù)相同的設(shè)備作為組合庫(kù)。然而，克隆處在適合于酵母表面展示的載體中，并且不需要排列單獨(dú)的克隆，因?yàn)樽畛醪捎媒湍副砻嬲故居糜诖髱?kù)的富集。在合適水平的富集之后，排列單獨(dú)的克隆。

使用本領(lǐng)域已知的任何基于隨機(jī)的誘變技術(shù)來(lái)產(chǎn)生包含變異Fc區(qū)的分子的初始庫(kù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何誘變技術(shù)獲得Fc區(qū)的氨基酸序列變體。在此簡(jiǎn)要地描述這些技術(shù)中的一些，然而，要認(rèn)識(shí)到可選擇的過(guò)程可以產(chǎn)生等同的結(jié)果。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子通過(guò)如下文實(shí)施例6中例舉的error-prone PCR來(lái)制備(參見(jiàn)Leung etal.，1989，Technique，111)。特別優(yōu)選的是，具有2-3bp/Kb的差錯(cuò)率用于本發(fā)明的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用error prone PCR獲得2-3突變/kb的突變頻率。

誘變可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來(lái)進(jìn)行，包括但不限于，合成寡核苷酸，所述寡核苷酸具有待修飾的抗體的Fc區(qū)或包含F(xiàn)c區(qū)(例如，CH2或CH3結(jié)構(gòu)域)的多肽的序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)修飾。位點(diǎn)特異性誘變?nèi)菰S通過(guò)使用編碼期望的突變的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足夠數(shù)量的鄰近核苷酸來(lái)產(chǎn)生突變體，來(lái)提供足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，以在被橫越的刪除接頭的兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈體。一般地，長(zhǎng)度約30到約45個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)的引物是優(yōu)選的，在序列接頭的兩側(cè)約10個(gè)到約25個(gè)或更多殘基被改變?？梢允褂迷谝粋€(gè)或多個(gè)位置引入各種不同突變的多種這樣的引物來(lái)產(chǎn)生突變體的庫(kù)。

位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，如各種出版物所例示的(參見(jiàn)，例如Kunkel et al.，Methods Enzymol.，154367-82，1987，通過(guò)完全引用將它合并在此)。一般地，通過(guò)首先獲得單鏈載體、或熔化開(kāi)雙鏈載體的兩條鏈，來(lái)進(jìn)行針對(duì)位點(diǎn)的誘變，所述載體在它的序列中包括編碼期望的肽的DNA序列。制備攜帶期望的突變序列的寡核苷酸引物，一般是合成地制備。然后將這種引物與單鏈的載體退火，經(jīng)受DNA聚合酶例如T7 DNA聚合酶，來(lái)完成攜帶突變的鏈的合成。因而，形成異雙鏈體，其中一條鏈編碼原始的未突變序列，第二條鏈攜帶期望的突變。然后將這種異雙鏈體用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適合的細(xì)胞，例如E.coli細(xì)胞，選擇包括帶有突變序列配置的重組載體的克隆。要理解的是，該技術(shù)一般采用噬菌體載體，其以單鏈和雙鏈形式存在。在針對(duì)位點(diǎn)的誘變中有用的典型載體包括例如M13噬菌體的載體。這些噬菌體是商業(yè)上可容易地獲得的，它們的使用一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。雙鏈的質(zhì)粒通常也在針對(duì)位點(diǎn)的誘變中采用，其消除了將目標(biāo)基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到噬菌體的步驟。

做為選擇，使用具有商業(yè)上可獲得的耐熱酶例如Taq DNA聚合酶的PCRTM可以用來(lái)將誘變寡核苷酸引物摻入擴(kuò)增的DNA片段，所述DNA片段因而可被克隆到合適的克隆或表達(dá)載體中。對(duì)于PCR介導(dǎo)的誘變過(guò)程，參見(jiàn)，例如Tomic et al.，Nucleic Acids Res.，18(6)1656，1987和Upender et al.，Biotechniques，18(1)29-30，32，1995，通過(guò)完全引用將它們合并在此。采用除熱穩(wěn)定聚合酶之外的熱穩(wěn)定連接酶的PCRTM也可以用來(lái)將磷酸化的誘變寡核苷酸摻入到擴(kuò)增的DNA片段中，所述DNA片段因而可被克隆到合適的克隆或表達(dá)載體中(參見(jiàn)，例如Michael，Biotechniques，16(3)410-2，1994，通過(guò)完全引用將它合并在此)。

制備用于本發(fā)明的變體的另一個(gè)方法是基于Wells等(1985，Gene，34315)描述的技術(shù)的盒誘變。起始材料是包含期望的DNA的質(zhì)粒，所述DNA編碼要突變的蛋白(例如，編碼包含F(xiàn)c區(qū)的多肽的DNA)。鑒定了DNA序列中要突變的密碼子；在鑒定的突變位點(diǎn)的每一側(cè)必須有獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果不存在這樣的限制性位點(diǎn)，可以通過(guò)寡核苷酸指導(dǎo)的誘變來(lái)產(chǎn)生在將限制性位點(diǎn)導(dǎo)入質(zhì)粒之后，在這些位點(diǎn)切割質(zhì)粒并線性化。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序合成雙鏈寡核苷酸，所述寡核苷酸編碼限制性位點(diǎn)之間的DNA序列但含有突變。所述雙鏈寡核苷酸被稱為盒。這種盒被設(shè)計(jì)為具有與線性化的質(zhì)粒的末端兼容的3′和5′末端，從而它可以直接連接到質(zhì)粒。

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法，用于產(chǎn)生包含F(xiàn)c區(qū)的抗體或多肽的Fc區(qū)的序列變體。例如，可以用誘變劑，例如羥胺處理編碼抗體或其片段的恒定區(qū)氨基酸序列的重組載體，來(lái)獲得序列變體。

一旦根據(jù)所描述的方法產(chǎn)生了突變庫(kù)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)乙酸鋰轉(zhuǎn)化方案(ref)，將誘變的庫(kù)轉(zhuǎn)化到酵母菌株中，優(yōu)選的，EBY100(Invitrogen)，MATa ura3-52trpl leu2Δl his3Δ200pep4::HIS3prb1Δ1.6R can1 GAL::GAL-AGA1。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，一旦根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定了(參見(jiàn)5.1節(jié)和表2)具有期望的結(jié)合性質(zhì)(例如，具有有至少一個(gè)氨基酸修飾的變異Fc區(qū)的分子，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾增強(qiáng)所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性)的分子，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)和任何已知的技術(shù)，如本節(jié)中所描述的，工程化其他分子(例如，治療抗體)來(lái)產(chǎn)生攜帶所鑒定的突變位點(diǎn)的工程化的分子。
5.2.4酵母表面展示
篩選和鑒定包含具有改變的FcγR親合性(例如，增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性和/或FcγRIIA)的變異Fc區(qū)的分子的優(yōu)選的方法是酵母表面展示技術(shù)(綜述參見(jiàn)，Boder and Wittrup，2000，Methods inEnzymology，328430-444，通過(guò)完全引用將它合并在此)，其解決了先有技術(shù)中為篩選細(xì)胞外翻譯后修飾的蛋白的結(jié)合相互作用的缺陷。具體地，酵母表面展示是一種遺傳學(xué)方法，通過(guò)這種方法包含F(xiàn)c突變的多肽以對(duì)于與FcγR相互作用可接近的形式在酵母細(xì)胞壁上表達(dá)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來(lái)進(jìn)行含有突變Fc的本發(fā)明的多肽的酵母表面展示。參見(jiàn)美國(guó)專利No.6,423,538、6,114,147和6,300,065，通過(guò)完全引用將它們所有的合并在此。參見(jiàn)Boder et al.，1997Nat.Biotechnol.，15553-7；Boder et al.，1998Biotechnol.Prog.，1455-62；Boder et al.，2000Methods Enzymol.，328430-44；Boder etal.，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，9710701-5；Shusta et al.，1998 Nat.Biotechnol.，1998，16773-7；Shusta et al.，1999J.Mol.Biol.，292949-56；Shusta et al.，1999 Curr.Opin.Biotechnol.，10117-22；Shusta et al.，2000 Nat.Biotechnol.，18754-9；Wittrup et al.，1994 Ann.N.Y.Acad.Sci.，745321-30；Wittrup et al.，1994 Cytometry，16206-13；Wittrup，1995 Curr.Opin.Biotechnol.，6203-8；Wittrup，1999Trends Biotechnol.，17423-4；Wittrup，2000 Nat.Biotechnol.，181039-40；Wittrup，2001 Curr.Opin.Biotechnol.，12395-9。

酵母表面展示用于富集含有＞107個(gè)獨(dú)立克隆的庫(kù)。這種方法將提供在單次分選中將大庫(kù)富集＞20倍的能力。將具有＞10,000個(gè)獨(dú)立突變的Fc突變庫(kù)(4個(gè)或更多個(gè)位點(diǎn))克隆到用于酵母表面展示的合適的載體中，并通過(guò)FACS分選富集直到＜8000個(gè)突變體能夠通過(guò)如下所述的其他生物化學(xué)的和功能性的分析來(lái)測(cè)試。

本發(fā)明提供了在酵母中構(gòu)建Fc突變庫(kù)的方法，用于展示包含F(xiàn)c區(qū)的分子，所述Fc區(qū)已經(jīng)如5.2.2節(jié)中描述的突變了。優(yōu)選的，用于本發(fā)明的方法的Fc突變庫(kù)含有至少107個(gè)細(xì)胞，至多109個(gè)細(xì)胞。構(gòu)建用于本發(fā)明的方法的Fc庫(kù)的一種示范性的方法包含以下的將編碼包含F(xiàn)c區(qū)的分子的核酸克隆到來(lái)自酵母復(fù)制載體例如，pCT302的載體的多克隆位點(diǎn)；從而編碼Fc的核酸在GAL1半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下、并且與編碼接合凝集素細(xì)胞壁蛋白Aga2p的核苷酸序列按讀碼框表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將編碼包含F(xiàn)c區(qū)的分子的核酸克隆到Aga2p編碼區(qū)的C-末端，從而編碼Fc區(qū)Aga2p融合蛋白。使用本發(fā)明的優(yōu)選的構(gòu)建體，包含Aga2p蛋白以及含F(xiàn)c區(qū)的多肽的融合蛋白被細(xì)胞外地分泌，并經(jīng)由與整合細(xì)胞壁蛋白Aga1p蛋白的二硫鍵展示到細(xì)胞壁上。在可選擇的實(shí)施方式中，構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含編碼表位tag的核苷酸序列?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何表位tag核苷酸編碼序列，包括但不限于編碼血球凝集素(HA)、c-myc Xpress TAG、His-TAG或V5TAG的核苷酸序列?？梢允褂肍ACS分析、共焦熒光顯微術(shù)或標(biāo)準(zhǔn)的免疫染色方法來(lái)檢測(cè)酵母細(xì)胞表面上融合蛋白的存在，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用Fc特異性單克隆抗體(CH3特異性)來(lái)檢測(cè)酵母細(xì)胞表面本發(fā)明的Fc融合蛋白的存在，所述抗體包括但不限于IgG1 Fc特異性單克隆抗體HP6017(Sigma)、JL512(Immunotech)和在Partridge et al.，1986，Molecular Immunology，23(12)1365-72中公開(kāi)的任何抗體，通過(guò)引用將它合并在此。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)通過(guò)表位tag的免疫熒光標(biāo)記來(lái)檢測(cè)本發(fā)明的Fc融合蛋白的存在。在本發(fā)明的方法中特別有用的是，使用編碼表位tag的核苷酸序列側(cè)翼于編碼Fc融合蛋白的核酸，作為內(nèi)部對(duì)照，來(lái)檢測(cè)融合蛋白是否以部分proteolyzed形式展示在細(xì)胞壁上。
5.2.5篩選酵母顯示庫(kù)
本發(fā)明涵蓋使用基于免疫學(xué)的分析、包括但不限于基于細(xì)胞的分析、基于溶液的分析和基于固相的分析來(lái)篩選酵母顯示庫(kù)。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并涵蓋在此的親合性成熟方法鑒定具有改變的FcγR親合性的Fc突變體。簡(jiǎn)要地，親合性成熟通過(guò)隨機(jī)重組在突變庫(kù)中出現(xiàn)的單個(gè)突變產(chǎn)生新的等位基因，參見(jiàn)，例如Hawkins et al.，1992，J.Mol.Biol.226889-896；Stemmer et al.，1994Nature，370389-91，通過(guò)完全引用將它們合并在此。它已經(jīng)被成功地使用來(lái)提高抗體、T細(xì)胞受體和其他蛋白質(zhì)的親合性。本發(fā)明涵蓋使用顯示了提高的FcγR結(jié)合的突變作為基準(zhǔn)線，來(lái)構(gòu)建具有增強(qiáng)的表型的新的突變庫(kù)。使用本發(fā)明的方法，可以挑選通過(guò)酵母表面展示富集的IgG1 Fc突變體群體的提高的對(duì)FcγR，例如FcγRIIIA的結(jié)合。在DNA制備之后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的以及在此公開(kāi)或例示的方法，使用～700bp的、選擇性擴(kuò)增Fc的突變區(qū)的側(cè)翼引物通過(guò)PCR擴(kuò)增Fc區(qū)。使用例如Stemmeret al.，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-51公開(kāi)的那些方法，通過(guò)完全引用將它合并在此，經(jīng)由DNAseI處理擴(kuò)增的DNA并分離片段，通過(guò)Fc區(qū)中突變的reshuffling來(lái)構(gòu)建新的突變體。然后可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法重新連接片段，用嵌套引物PCR擴(kuò)增，并克隆到酵母表面展示載體例如pYD1中。然后在酵母Fc展示篩選中重新選擇重組的庫(kù)。使用本領(lǐng)域已知的方法，例如中公開(kāi)的那些，通過(guò)完全引用將它合并在此，由于KD降低低于10nM，根據(jù)FcγRIIIA配體從Fc受體的解離速率的降低，可以確定條件以容許親合性的進(jìn)一步提高。本發(fā)明涵蓋酵母庫(kù)的動(dòng)力學(xué)篩選。通過(guò)用標(biāo)記的配體，例如熒光配體將展示Fc的細(xì)胞標(biāo)記到飽和，繼之以與過(guò)量的未標(biāo)記配體孵育預(yù)定的時(shí)間，可以建立動(dòng)力學(xué)篩選。通過(guò)添加過(guò)量緩沖液(例如，1X PBS、0.5mg/ml BSA)終止反應(yīng)之后，通過(guò)FACS和設(shè)置用于選擇的分選門(mén)來(lái)分析細(xì)胞。在每輪富集之后，可以檢測(cè)單個(gè)突變?cè)谟H合性上的提高倍數(shù)，并為多樣性進(jìn)行測(cè)序。可以重復(fù)體外重組過(guò)程。在某些實(shí)施方式中，所述體外過(guò)程重復(fù)至少3次。

可以使用任何FcγR，包括但不限于FcγR的多態(tài)性變體來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的Fc變體的選擇。在某些實(shí)施方式中，使用在位置158含有苯丙氨酸的FcγRIIIA的多態(tài)性變體來(lái)進(jìn)行Fc變體的選擇。在其他實(shí)施方式中，使用在位置158含有纈氨酸的FcγRIIIA的多態(tài)性變體來(lái)進(jìn)行Fc變體的選擇。FcγRIIIA 158V顯示了比158F更高的IgG1親合性和提高的ADCC活性(參見(jiàn)，例如Koene et al.，1997，Blood，901109-14；Wu et al.，1997，J.Clin.Invest.1001059-70，通過(guò)完全引用將它們兩個(gè)合并在此)；根據(jù)近來(lái)由IgG1-FcγRIIIA共結(jié)晶研究顯示的，這個(gè)殘基實(shí)際上與IgG1的較低的絞鏈區(qū)直接相互作用，參見(jiàn)，例如Sonderman et al.，2000，Nature，1001059-70，通過(guò)完全引用將它合并在此。研究顯示，在某些情況下治療性抗體在FcγRIIIA-158V純合的患者中具有改善的效力。例如，與FcγRIIIA 158F純合的患者相比，在FcγRIIIA158V純合的患者中人源化抗CD20單克隆抗體Rituximab治療上更有效(參見(jiàn)，例如，Cartron et al.，2002Blood，99(3)754-8)。盡管不希望受特定作用機(jī)制的限制，用FcγRIIIA158F同種型來(lái)選擇本發(fā)明的Fc變體能夠提供這樣的變體，所述變體一旦被工程化為治療性抗體，將在臨床上對(duì)FcγRIIIA 158F純合的患者更有效。

本發(fā)明涵蓋根據(jù)FcγRIIB耗盡和FcγRIIIA選擇來(lái)篩選酵母庫(kù)，從而選擇不僅具有對(duì)FcγRIIIIA的增強(qiáng)的親合性而且具有對(duì)FcγRIIB的降低的親合性的Fc突變體。通過(guò)連續(xù)的耗盡方法，例如，通過(guò)孵育酵母庫(kù)與包被FcγRIIB的磁性珠子，可以富集酵母庫(kù)中具有降低的FcγRIIB親合性的克隆。優(yōu)選的連續(xù)地進(jìn)行FcγRIIB耗盡，從而富集所述庫(kù)中具有降低的FcγRIIB親合性的克隆。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)cγRIIB耗盡產(chǎn)生了細(xì)胞的群體，從而僅30％、優(yōu)選的僅10％、更優(yōu)選的僅5％、最優(yōu)選的低于1％結(jié)合FcγRIIB。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)cγRIIB耗盡進(jìn)行在3個(gè)循環(huán)、至少4個(gè)循環(huán)、至少6個(gè)循環(huán)。FcγRIIB耗盡步驟優(yōu)選的與FcγRIIIIA選擇步驟組合，例如使用FACS分選，從而選擇具有增強(qiáng)的FcγRIIIIA親合性的Fc變體。
5.2.5.1FACS分析；固相分析和基于免疫學(xué)的分析
本發(fā)明涵蓋根據(jù)5.2.3節(jié)中描述的方法表征酵母表面細(xì)胞壁上展示的突變Fc融合蛋白。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了選擇具有期望的結(jié)合性質(zhì)的突變Fc融合蛋白的方法，所述結(jié)合性質(zhì)具體是，所述突變Fc融合蛋白以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA的能力。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了選擇具有期望的結(jié)合性質(zhì)的突變Fc融合蛋白的方法，所述結(jié)合性質(zhì)具體是，所述突變體Fc融合蛋白以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA的能力，以及進(jìn)一步的所述突變ü融合蛋白以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIB更低的親合性結(jié)合FcγRIIB的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，可以使用本發(fā)明的方法用于鑒定和篩選具有任何期望的結(jié)合特征的、分子的Fc區(qū)中的任何突變。

可以篩選和通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于評(píng)估結(jié)合相互作用的任何基于生物化學(xué)或免疫學(xué)的分析來(lái)表征展示突變Fc融合蛋白的酵母細(xì)胞。

優(yōu)選的，運(yùn)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)的熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)被用于篩選酵母細(xì)胞表面上展示的突變Fc融合蛋白與FcγRIIIA、優(yōu)選的FcγRIIIA四聚復(fù)合物、或可選的FcγRIIB的結(jié)合。流式分選機(jī)能夠快速地檢查大量的含有庫(kù)插入物的單獨(dú)的細(xì)胞(例如，每小時(shí)1000-10000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)(Shapiro et al.，Practical FlowCytometry，1995)。此外，用于優(yōu)化的特定參數(shù)包括但不限于，配體濃度(即，F(xiàn)cγRIIIA四聚復(fù)合物)、動(dòng)力學(xué)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間或FACS嚴(yán)格度可以變化，以選擇展示了具有特定結(jié)合性質(zhì)的Fc融合蛋白的細(xì)胞，所述特定結(jié)合性質(zhì)例如與包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽相比更高的FcγRIIIA親合性。用于分選和檢查生物細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)是本領(lǐng)域公知的。例如，在美國(guó)專利No.4,347,935、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,643,796和6,211,477中描述了已知的流式細(xì)胞計(jì)；通過(guò)引用將它們的完整內(nèi)容合并在此。其他已知的流式細(xì)胞計(jì)是BectonDickinson and Company制造的FACS VantageTM系統(tǒng)，和UnionBiometrica制造的COPASTM系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，通過(guò)熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)來(lái)分析酵母細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，以反復(fù)的方式進(jìn)行酵母細(xì)胞的FACS分析，至少兩次、至少三次、或至少5次。在每一輪選擇之間，使細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)，從而Fc區(qū)在最大數(shù)量的酵母細(xì)胞表面上展示。盡管不希望受特定作用方式的限制，這種重復(fù)過(guò)程有助于富集具有特定表型，例如對(duì)FcγRIIIA的高結(jié)合性的細(xì)胞群體。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，篩選本發(fā)明的Fc變體包含具有多輪篩選，例如至少兩輪篩選的選擇過(guò)程。在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選具有對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的親合性的Fc變體可以包含以下步驟在第一輪篩選中，使用例如標(biāo)記的四聚FcγRIIIA來(lái)選擇具有增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性的Fc變體，通過(guò)FACS，優(yōu)選的以重復(fù)的方式，來(lái)富集酵母細(xì)胞的庫(kù)，例如107個(gè)細(xì)胞的天然庫(kù)；被選擇具有期望的表型，例如，對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的結(jié)合的變異Fc區(qū)然后被導(dǎo)入抗體，例如4-4-20抗體中，使用第二篩選，例如ELISA來(lái)分析工程化的抗體與FcγR的結(jié)合。在第二輪篩選中，可以根據(jù)第一次篩選產(chǎn)生單突變庫(kù)，從而Fc區(qū)攜帶顯示了增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性的變體；在存在和不存在未標(biāo)記的受體的情況下，使用例如標(biāo)記的單體FcγRIIIA通過(guò)FACS來(lái)富集；然后將變異Fc區(qū)導(dǎo)入抗體，例如4-4-20抗體中，使用第二篩選，例如ELISA來(lái)分析工程化的抗體與FcγR的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，第二篩選可以進(jìn)一步包括使用在此公開(kāi)的方法在基于ADCC或BIAcore的分析中表征包含F(xiàn)c變體的抗體。

本發(fā)明涵蓋在平衡或動(dòng)力條件下突變酵母庫(kù)的FACS篩選。當(dāng)篩選在平衡條件下進(jìn)行時(shí)，攜帶Fc突變體的過(guò)量的酵母庫(kù)以Kd的1/5-10的濃度與FcγRIIIA、優(yōu)選的標(biāo)記的FcγRIIIA孵育至少一小時(shí)以容許在平衡條件下Fc突變體與FcγRIIIA的結(jié)合。當(dāng)篩選在動(dòng)力條件下進(jìn)行時(shí)，突變酵母庫(kù)與標(biāo)記的FcγRIIIA孵育；然后細(xì)胞與等摩爾未標(biāo)記的FcγRIIIA孵育預(yù)定時(shí)間，然后監(jiān)視結(jié)合的FcγRIIIA。

用FACS分析酵母細(xì)胞表達(dá)突變Fc融合蛋白的一個(gè)示范性的方法是共染色帶有FcγRIIIA四聚復(fù)合物的細(xì)胞和抗Fc抗體，所述FcγRIIIA四聚復(fù)合物已經(jīng)用熒光標(biāo)記例如PE標(biāo)記了，所述抗Fc抗體例如已經(jīng)熒光標(biāo)記了的F(ab)2抗-Fc。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的酵母庫(kù)的熒光測(cè)量?jī)?yōu)選的包括與對(duì)照比較；例如，缺乏插入物的酵母細(xì)胞，所述插入物編碼包含F(xiàn)c區(qū)的分子(陰性對(duì)照)。流式分選機(jī)合不僅具有快速地測(cè)量細(xì)胞中的熒光信號(hào)的能力，而且具有收集具有特定熒光性質(zhì)的細(xì)胞的能力。這種特征可以應(yīng)用于本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式來(lái)富集初始庫(kù)群體中表達(dá)具有特定結(jié)合特征的Fc融合蛋白的細(xì)胞，所述結(jié)合特征例如與包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽相比對(duì)FcγRIIIA更高的親合性。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)FACS和分選門(mén)來(lái)分析酵母細(xì)胞，所述分選門(mén)被建立以選擇相對(duì)于酵母細(xì)胞上的Fc表達(dá)數(shù)量顯示了對(duì)FcγRIIIA的最高親合性的細(xì)胞。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，建立了四個(gè)連續(xù)的分選，其中對(duì)每個(gè)連續(xù)分選的門(mén)是5.5％、1％、0.2％和0.1％。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的方法形成的酵母展示庫(kù)被過(guò)量取樣至少10倍，以提高分離稀有克隆的概率(例如，分析107個(gè)克隆的庫(kù)的～108個(gè)細(xì)胞)。做為選擇，建立25次分選來(lái)選擇期望表型的細(xì)胞?？梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)性地建立分選門(mén)。

在其他優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用基于固相的分析，例如，使用磁性珠子的分析，例如，由Dynal所提供的，優(yōu)選的以高通量的方式篩選酵母細(xì)胞表面上展示的突變Fc融合蛋白與FcγR，例如FcγRIIIA的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，磁性珠子分析可以用于鑒定具有對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的親合性和/或?qū)cγRIIB降低的親合性的突變體。鑒定具有對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的親合性和對(duì)FcγRIIB降低的親合性的突變體的示范性的分析可以包括，通過(guò)使用包被FcγRIIB的磁性珠子的連續(xù)固相耗盡、繼之以用包被FcγRIIIA的磁性珠子進(jìn)行選擇，來(lái)選擇突變體。例如，一種分析可以包括以下步驟與包被FcγRIIB的磁性珠子孵育根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的酵母細(xì)胞的庫(kù)；通過(guò)將混合物置于磁場(chǎng)中來(lái)從未結(jié)合的部分中分離與珠子結(jié)合的酵母細(xì)胞，移除未結(jié)合的酵母細(xì)胞并將它們置于新鮮培養(yǎng)基中；使酵母細(xì)胞與包被FcγRIIIA的珠子結(jié)合，通過(guò)將混合物置于磁場(chǎng)中來(lái)從未結(jié)合的部分中分離與珠子結(jié)合的酵母細(xì)胞，移除未結(jié)合的酵母細(xì)胞；通過(guò)劇烈的旋渦移除結(jié)合的細(xì)胞；在含葡萄糖的培養(yǎng)基中使回收的細(xì)胞生長(zhǎng)；在含有半乳糖的選擇培養(yǎng)基中重新誘導(dǎo)。重復(fù)選擇過(guò)程至少一次。然后使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，例如，PCR來(lái)擴(kuò)增含有Fc結(jié)構(gòu)域的插入物，通過(guò)已經(jīng)描述了進(jìn)一步的特征的方法導(dǎo)入抗體。

在可選擇的實(shí)施方式中，非基于酵母的系統(tǒng)被用于表征本發(fā)明的分子的結(jié)合性質(zhì)。用于表征本發(fā)明的分子的示范性的系統(tǒng)包括含有抗熒光素單克隆抗體4-4-20的重鏈的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，編碼具有變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子的核酸被克隆到所述載體中。產(chǎn)生的重組克隆在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系(即，人類腎臟細(xì)胞系293H)中表示，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)分析，包括但不限于ELISA和FACS，來(lái)分析產(chǎn)生的重組免疫球蛋白與FcγR的結(jié)合。

可以以各種方法表征本發(fā)明的分子(例如，抗體、融合蛋白、結(jié)合的分子)。特別地，包含修飾的Fc區(qū)的本發(fā)明的分子可以被分析與配體，例如FcγRIIIA四聚復(fù)合物免疫特異性結(jié)合的能力。這種分析可以在溶液中(例如，Houghten，Bio/Techniques，13412-421，1992)、在珠子上(Lam，Nature，35482-84，1991，on chips(Fodor，Nature，364555-556，1993)、在細(xì)菌上(美國(guó)專利No.5,223,409)、在孢子上(美國(guó)專利No.5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、在質(zhì)粒上(Cullet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，891865-1869，1992)、或在噬菌體上(Scott and Smith，Science，249386-390，1990；Devlin，Science，249404-406，1990；Cwirla et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876378-6382，1990；和Felici，J.Mol.Biol.，222301-310，1991)進(jìn)行(通過(guò)完全引用將這些參考文獻(xiàn)的每一個(gè)合并在此)。已經(jīng)被鑒定與配體，例如FcγRIIIA免疫特異性結(jié)合的分子，然后可以分析它們對(duì)該配體的特異性和親合性。

已經(jīng)被工程化以包含修飾的Fc區(qū)(例如，治療性抗體)或已經(jīng)在酵母展示系統(tǒng)中鑒定具有期望的表型(參見(jiàn)5.1節(jié))的本發(fā)明的分子，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法分析與抗原(例如，癌癥抗原)的免疫特異性結(jié)合以及與其他抗原(例如，F(xiàn)cγR)的交叉反應(yīng)性?？捎糜诜治雒庖咛禺愋越Y(jié)合和交叉反應(yīng)性的免疫分析包括但不限于，使用例如Western印跡的技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性分析系統(tǒng)、放射性免疫分析、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)、“三夾心”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散分析、凝集分析、互補(bǔ)-定影分析、免疫放射分析、熒光免疫分析、蛋白質(zhì)A免疫分析、to name but a few。這些分析是常規(guī)的和本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)，例如，Ausubel et al.，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York；通過(guò)完全引用將它合并在此)。

可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析來(lái)測(cè)定包含修飾的Fc區(qū)的本發(fā)明的分子與配體，例如，F(xiàn)cγR四聚復(fù)合物的結(jié)合親合性和相互作用的解離速率。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析的一個(gè)實(shí)例是放射免疫分析，包括在存在提高著數(shù)量的未標(biāo)記配體例如四聚FcγR的情況下，孵育標(biāo)記的配體例如四聚FcγR(例如，3H或125I)與目標(biāo)分子(例如，包含修飾的Fc區(qū)的本發(fā)明的分子)，并檢測(cè)與標(biāo)記的配體結(jié)合的分子。通過(guò)scatchard分析根據(jù)飽和度數(shù)據(jù)，可以測(cè)定本發(fā)明的分子與配體的親合性和結(jié)合解離速率。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用BIAcore動(dòng)力學(xué)分析來(lái)測(cè)定本發(fā)明的分子與配體例如FcγR的結(jié)合和解離速率。BIAcore動(dòng)力學(xué)分析包括分析配體從芯片的結(jié)合和分離，所述芯片在它們的表面上具有固定化的分子(例如，包含修飾的Fc區(qū)的分子)。
5.2.6突變體的測(cè)序
任何本領(lǐng)域已知的各種測(cè)序反應(yīng)可以被用于直接測(cè)序包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子。序列反應(yīng)的實(shí)例包括基于由Maxim和Gilbert(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74560，1977)或Sanger(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463，1977)所開(kāi)發(fā)的技術(shù)的那些。同樣預(yù)期的是，可以使用各種自動(dòng)化測(cè)序過(guò)程的任一種(Bio/Techniques，19448，1995)，包括通過(guò)質(zhì)譜法的測(cè)序(參見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)No.WO 94/16101，Cohen et al.，Adv.Chromatogr.，36127-162，1996和Griffin et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.，38147-159，1993)。
5.2.7具有變異Fc區(qū)的分子的功能分析
本發(fā)明涵蓋使用本領(lǐng)域已知用于鑒定分子的效應(yīng)細(xì)胞功能的分析來(lái)表征本發(fā)明的分子(例如，包含通過(guò)上述酵母展示技術(shù)鑒定的變異Fc區(qū)的分子；或根據(jù)本發(fā)明的方法工程化的治療性單克隆抗體)的方法。特別地，本發(fā)明涵蓋表征本發(fā)明的分子的FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能。根據(jù)本發(fā)明可以分析的效應(yīng)細(xì)胞功能的實(shí)例包括但不限于，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、吞噬作用、調(diào)理作用、調(diào)理吞噬作用(opsonophagocytosis)、C1q結(jié)合以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知用于測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞功能活性的任何基于細(xì)胞的或無(wú)細(xì)胞的分析(對(duì)于效應(yīng)細(xì)胞分析，參見(jiàn)，Perussiaet al.，2000，Methods Mol.Biol.121179-92；Baggiolini et al.，1998Experientia，44(10)841-8；Lehmann et al.，2000 J.Immunol.Methods，243(1-2)229-42；Brown EJ.1994，Methods Cell Biol.，45147-64；Munn et al.，1990 J.Exp.Med.，172231-237，Abdul-Majidet al.，2002Scand.J.Immunol.5570-81；Ding et al.，1998，Immunity8403-411，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，可以在人類單核細(xì)胞中分析本發(fā)明的分子的FcγR介導(dǎo)的吞噬作用。做為選擇，本發(fā)明的分子的FcγR介導(dǎo)的吞噬作用可以在其他吞噬細(xì)胞中分析，例如嗜中性白細(xì)胞(多形核白細(xì)胞；PMN)；人類外周血單核細(xì)胞，單核細(xì)胞衍生的，其可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程來(lái)獲得(例如，參見(jiàn)Brown EJ.1994，Methods Cell Biol.，45147-164)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)早先描述的方法(Tridandapani et al.，2000，J.Biol.Chem.27520480-7)，通過(guò)測(cè)量THP-1細(xì)胞吞噬熒光化的IgG調(diào)理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的能力，來(lái)表征本發(fā)明的分子的功能。例如，測(cè)量包含具有增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性的變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子的吞噬作用的示范性的分析包括用本發(fā)明的分子或不結(jié)合FcγRIIIA的對(duì)照抗體處理THP-1細(xì)胞，比較所述細(xì)胞的活性水平，其中細(xì)胞的活性(例如，叢簇活性(結(jié)合包被IgG的SRBC的THP-1細(xì)胞的數(shù)目)、附著活性(結(jié)合到THP-1細(xì)胞的SRBC的總數(shù))、和吞噬速率)方面的差異將指明本發(fā)明的分子的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，這種示范性的分析可以用于分析通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的任何分子。

用于測(cè)定本發(fā)明的分子的吞噬作用的另一個(gè)示范性的分析是抗體依賴性調(diào)理吞噬作用分析(ADCP)，其可以包括以下用(i)針對(duì)熒光素的抗體(參見(jiàn)Bedzyk et al.，1989，J.Biol.Chem，264(3)1565-1569，通過(guò)完全引用將它合并在此)野生型4-4-20抗體，作為FcγR依賴性ADCP的對(duì)照抗體；或(iii)攜帶破壞了對(duì)FcγRIII的結(jié)合的D265A突變的4-4-20抗體，作為FcγR依賴性ADCP的背景對(duì)照，(iii)帶有通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定、如實(shí)施例6.6中的例示產(chǎn)生的變異Fc區(qū)的4-4-20抗體包被目標(biāo)生物粒子，例如Escherichia coli標(biāo)記的FITC(Molecular Probes)或Staphylococcus aureus-FITC；并形成調(diào)理的粒子；以60∶1的比例將任何所描述的調(diào)理的粒子(i-iii)添加到THP-1效應(yīng)細(xì)胞(可從ATCC獲得的單核細(xì)胞系)以容許FcγR介導(dǎo)的吞噬作用發(fā)生；優(yōu)選的在37℃孵育細(xì)胞和E.coli-FITC/抗體1.5小時(shí)；孵育(優(yōu)選的在室溫下2-3分鐘)之后向細(xì)胞添加錐石藍(lán)，來(lái)淬滅附著于細(xì)胞表面之外沒(méi)有被內(nèi)在化的細(xì)菌的熒光；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到FACS緩沖液(例如，PBS中的0.1％BSA，0.1％疊氮化鈉)中，使用FACS(例如，BDFACS Calibur)分析THP1細(xì)胞的熒光。優(yōu)選的，通過(guò)FACS來(lái)分析在分析中使用的THP-1細(xì)胞的細(xì)胞表面FcγR的表達(dá)。THP-1細(xì)胞表達(dá)CD32A和CD64。CD64是高親合性FcγR，其在根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行ADCP分析時(shí)被封閉。優(yōu)選的用100mg/mL可溶性IgG1或10％人類血清封閉THP-1細(xì)胞。為了分析ADCP的程度，優(yōu)選的將門(mén)設(shè)置在THP-1細(xì)胞上，測(cè)量中值熒光強(qiáng)度。計(jì)算單個(gè)突變體的ADCP活性，作為對(duì)獲得的野生型chMab 4-4-20的標(biāo)準(zhǔn)值來(lái)報(bào)道。將調(diào)理的粒子添加到THP-1細(xì)胞，從而調(diào)理的粒子與THP-1細(xì)胞的比例是30∶1或60∶1。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，連同對(duì)照，例如培養(yǎng)基中的E.coli-FITC、E.coli-FITC和THP-1細(xì)胞(作為FcγR非依賴性ADCP活性)，E.coli-FITC、THP-1細(xì)胞和野生型4-4-20抗體(作為FcγR依賴性ADCP活性)，Ecoli-FITC、THP-1細(xì)胞、4-4-20D265A(作為FcγR依賴性ADCP活性的背景對(duì)照)，進(jìn)行ADCP分析。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法，在效應(yīng)細(xì)胞例如天然殺傷細(xì)胞中分析本發(fā)明的分子的FcγR介導(dǎo)的ADCC活性(參見(jiàn)，例如，Perussia et al.，2000，Methods Mol.Biol.121179-92)。測(cè)定本發(fā)明的分子的ADCC活性的示范性的分析是基于51Cr釋放分析，包括用[51Cr]Na2CrO4(這種細(xì)胞膜可透過(guò)的分子一般被用于標(biāo)記，因?yàn)樗Y(jié)合胞漿蛋白，雖然緩慢動(dòng)力學(xué)的從細(xì)胞天然地釋放，在目標(biāo)細(xì)胞壞死之后大量地釋放)標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞；用包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子調(diào)理目標(biāo)細(xì)胞；在微量滴定板上以合適的目標(biāo)細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞比例來(lái)組合調(diào)理的放射性標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞；在37℃孵育細(xì)胞的混合物16-18小時(shí)；并分析放射性。因而可以測(cè)定本發(fā)明的分子的細(xì)胞毒性，例如，使用以下公式裂解％＝(實(shí)驗(yàn)的cpm-目標(biāo)滲漏cpm)/(洗滌劑裂解cpm-目標(biāo)滲漏cpm)x 100％。做為選擇，裂解％＝(ADCC-AICC)/(最大釋放-自然的釋放)。特異性裂解可以使用以下公式計(jì)算特異性裂解＝本發(fā)明的分子的裂解％-不存在本發(fā)明分子時(shí)的裂解％。通過(guò)改變目標(biāo)效應(yīng)細(xì)胞比例或抗體濃度，可以產(chǎn)生圖表。

在又一個(gè)實(shí)施方式中，表征了本發(fā)明的分子的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)，參見(jiàn)，例如，Ding et al.，Immunity，1998，8403-11；通過(guò)完全引用將它合并在此。

優(yōu)選的，在本發(fā)明的ADCC分析中使用的效應(yīng)細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞(PBMC)，其優(yōu)選的是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如使用Ficoll-Paque密度梯度離心從正常人血液純化的。在本發(fā)明的方法中使用的優(yōu)選的效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)不同的FcγR活化性受體。本發(fā)明涵蓋效應(yīng)細(xì)胞，表達(dá)FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIB的THP-1，以及來(lái)自全人血、表達(dá)FcγRIIIA和FcγRIIB的單核細(xì)胞衍生的原始巨噬細(xì)胞，來(lái)測(cè)定Fc抗體突變體是否顯示相對(duì)于野生型IgG1抗體的提高的ADCC活性和吞噬作用。

人類單核細(xì)胞系THP-1通過(guò)高親合性受體FcγRI和低親合性受體FcγRIIA的表達(dá)來(lái)活化吞噬作用(Fleit et al.，1991，J.Leuk.Biol.49556)。THP-1細(xì)胞不組成性地表達(dá)FcγRIIA或FcγRIIB。用細(xì)胞因子刺激這些細(xì)胞影響FcR表達(dá)模式(Pricop et al.，2000J.Immunol.166531-7)。在存在細(xì)胞因子IL4的情況下THP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)誘導(dǎo)FcγRIIB表達(dá)并引起FcγRIIA和FcγRI表達(dá)的減少。FcγRIIB表達(dá)也可以通過(guò)提高細(xì)胞密度來(lái)增強(qiáng)(Tridandapani et al.，2002，J.Biol Chem.2775082-9)。相比之下，已經(jīng)報(bào)道了IFNg可以引起FcγRIIIA的表達(dá)(Pearse et al.，1993PNAS USA 904314-8)。細(xì)胞表面上受體的存在或缺乏可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法通過(guò)FACS來(lái)測(cè)定。在細(xì)胞表面上細(xì)胞因子誘導(dǎo)的FcγR表達(dá)提供了在存在FcγRIIB的情況下測(cè)試活化作用和抑制作用的系統(tǒng)。如果THP-1細(xì)胞不能表達(dá)FcγRIIB，本發(fā)明還涵蓋另一種人類單核細(xì)胞系，U937。這些細(xì)胞已經(jīng)顯示了在存在IFNg和TNF的情況下末期分化成巨噬細(xì)胞(Koren etal.，1979，Nature 279328-331)。

在小鼠腫瘤模型中FcγR依賴性腫瘤細(xì)胞殺傷是由巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的(Clynes et al.，1998，PNAS USA 95652-656)。本發(fā)明涵蓋使用來(lái)自供體的淘選的單核細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞來(lái)分析Fc突變體在吞噬作用和ADCC分析中觸發(fā)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性的效力。FcγRI、FcγRIIIA和FcγRIIB的表達(dá)模式受不同生長(zhǎng)條件的影響。單核細(xì)胞、新鮮淘選的單核細(xì)胞、維持在10％FBS中的單核細(xì)胞、培養(yǎng)在FBS+GM-CSF和/或在人類血清中的單核細(xì)胞的FcγR表達(dá)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來(lái)測(cè)定。例如，細(xì)胞可以用FcγR特異性抗體染色并通過(guò)FACS來(lái)分析以確定FcR分布型。然后將最好地模擬巨噬細(xì)胞體內(nèi)FcγR表達(dá)的條件用于本發(fā)明的方法。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋使用小鼠細(xì)胞，特別是在不能獲得具有正確FcγR分布型的人類細(xì)胞時(shí)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(ATCC)，其可以使用本領(lǐng)域已知的方法用人類FcγRIIIA轉(zhuǎn)染并分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子，參見(jiàn)，例如，Ralph et al.，J.Immunol.119950-4)。使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)通過(guò)FACS分析可以測(cè)定轉(zhuǎn)染子的FcγRIIIA表達(dá)，高表達(dá)體可以用于本發(fā)明的ADCC分析。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋從敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠，例如在此公開(kāi)的那些小鼠分離表達(dá)人類FcγR的脾腹巨噬細(xì)胞。

使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)從供體的外周血(PBM)收獲淋巴細(xì)胞。在分離的單核的細(xì)胞群體中，大多數(shù)ADCC活性經(jīng)由在其表面含有FcγRIIIA而沒(méi)有FcγRIIB的天然殺傷細(xì)胞(NK)發(fā)生。這些細(xì)胞的結(jié)果表明了突變體觸發(fā)NK細(xì)胞ADCC的效力，并確定了用淘選的單核細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試的試劑。

用于本發(fā)明的ADCC的目標(biāo)細(xì)胞包括但不限于，乳腺癌細(xì)胞系，例如，具有ATCC登記號(hào)HTB-30的SK-BR-3(參見(jiàn)，例如Trempet al.，1976，Cancer Res.33-41)；B-淋巴細(xì)胞；來(lái)自Burkitts淋巴瘤的細(xì)胞，例如具有ATCC登記號(hào)CCL-86的Raji細(xì)胞(參見(jiàn)，例如Epstein et al.，1965，J.Natl.Cancer Inst.34231-240)，和具有ATCC登記號(hào)CCL-213的Daudi細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Klein et al.，1968，CancerRes.281300-10)。目標(biāo)細(xì)胞必須被要分析的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別。

ADCC分析是基于NK細(xì)胞經(jīng)由細(xì)胞凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力。NK細(xì)胞部分地通過(guò)FcγRIIIA識(shí)別細(xì)胞表面上結(jié)合到抗原的IgG來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞死亡。根據(jù)本發(fā)明的方法使用的ADCC分析可以是基于放射性的分析或基于熒光的分析。用于表征包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子的ADCC分析包括，標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞，例如SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji、Daudi細(xì)胞，用抗體調(diào)理目標(biāo)細(xì)胞，所述抗體僅有它的抗原結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體；以合適的比例組合標(biāo)記的調(diào)理的目標(biāo)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，所述比例可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定；收獲細(xì)胞；根據(jù)所使用的標(biāo)記使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方案，檢測(cè)裂解的目標(biāo)細(xì)胞的上清液中的標(biāo)記?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞。例如，標(biāo)記包括但不限于，[51Cr]Na2CrO4；和熒光增強(qiáng)配體的乙?；谆?，2，2’6’，2”-terpyridine-6-6”-二羧酸(TDA)。

在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，時(shí)間分辨的熒光分析被用于測(cè)量針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的ADCC活性，所述目標(biāo)細(xì)胞已經(jīng)用熒光增強(qiáng)配體的乙酸基甲基酯，2，2’6’，2”-terpyridine-6-6”-二羧酸(TDA)標(biāo)記。這種熒光分析是本領(lǐng)域已知的，例如，參見(jiàn)Blomberg et al.，1996，Journalof Immunological Methods，193199-206；通過(guò)完全引用將它合并在此。簡(jiǎn)要地，用TDA的膜可透性乙酸基甲基二酯(二(乙酸基甲基)2，2’6’，2”-terpyridine-6-6”-二羧酸，(BATDA)來(lái)標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞，其快速地?cái)U(kuò)散跨越活細(xì)胞的細(xì)胞膜。細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解酯基，重新產(chǎn)生的膜不透性TDA分子被捕獲在細(xì)胞內(nèi)部。在37℃、5％CO2下孵育效應(yīng)物和目標(biāo)細(xì)胞，例如，至少兩個(gè)小時(shí)、多至3.5小時(shí)之后，用Eu3+螯合從裂解的目標(biāo)細(xì)胞釋放的TDA，在時(shí)間分辨的熒光計(jì)(例如，Victor 1420，Perkin Elmer/Wallac)中測(cè)定所形成的銪-TDA螯合物的熒光。

在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，用于表征包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子的ADCC分析包括以下步驟用二(乙酸基甲基)2，2’6’，2”-terpyridine-t-6”二羧酸(DELFIA BATDA 試劑，PerkinElmer/Wallac)標(biāo)記優(yōu)選的4-5×106個(gè)目標(biāo)細(xì)胞(例如，SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji細(xì)胞)。對(duì)于最佳的標(biāo)記效力，用于ADCC分析的目標(biāo)細(xì)胞是數(shù)目應(yīng)優(yōu)選的不超過(guò)5×106個(gè)。將BATDA試劑添加到細(xì)胞，在37℃、優(yōu)選的在5％CO2下孵育混合物至少30分鐘。然后用生理學(xué)的緩沖液，例如，有0.125mM sulfinpyrazole的PBS，和含有0.125mM sulfinpyrazole的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。然后用包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子，即，包含本發(fā)明的變異Fc區(qū)的免疫球蛋白，包括但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體或嵌合抗體，來(lái)調(diào)理(包被)標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在ADCC分析中使用的包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白特異于細(xì)胞表面受體、腫瘤抗原或癌癥抗原。其中導(dǎo)入了本發(fā)明的變異Fc區(qū)的免疫球蛋白可以特異性結(jié)合任何癌癥或腫瘤抗原，例如，5.4節(jié)列出的那些。另外，其中導(dǎo)入了本發(fā)明的變異Fc區(qū)的免疫球蛋白可以是特異于癌癥抗原的任何治療性抗體，例如5.4節(jié)中列出的那些。在某些實(shí)施方式中，在ADCC分析中使用的包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白是抗熒光素單克隆抗體4-4-20(Kranz et al.，1982 J.Biol.Chem.257(12)6987-6995)、小鼠-人類嵌合抗CD20單克隆抗體2H7(Liu et al.，1987，Journal of Immunology，1393521-6)；或針對(duì)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(p185HER2)的人源化抗體(Ab4D5)(Carteret al.(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285-9)。根據(jù)其中導(dǎo)入了本發(fā)明的變異Fc區(qū)的免疫球蛋白選擇ADCC分析中的目標(biāo)細(xì)胞，從而所述免疫球蛋白特異性地結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞表面受體。優(yōu)選的，使用攜帶本發(fā)明的Fc變體的超過(guò)一種工程化的抗體，例如，抗Her2/neu、4-4-20、2B6、Rituxan和2H7，進(jìn)行本發(fā)明的ADCC分析。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體被導(dǎo)入至少3種抗體，測(cè)試它們的ADCC活性。雖然不希望受特定作用機(jī)制的限制，在這些功能分析中檢查至少3中抗體將減少錯(cuò)誤地除去可行的Fc突變的機(jī)會(huì)。

將調(diào)理的目標(biāo)細(xì)胞添加到效應(yīng)細(xì)胞，例如，PBMC，來(lái)產(chǎn)生約50∶1、75∶1或100∶1的效應(yīng)目標(biāo)比例。在特定的實(shí)施方式中，當(dāng)包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白具有4-4-20的可變區(qū)時(shí)，效應(yīng)目標(biāo)是75∶1。在37℃、在5％CO2下，孵育效應(yīng)細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞至少兩小時(shí)、多至3.5小時(shí)。收獲細(xì)胞上清液并添加到酸性銪溶液(例如，DELFIA銪溶液，Perkin Elmer/Wallac)。在時(shí)間分辨的熒光計(jì)(例如，Victor1420，Perkin Elmer/Wallac)中測(cè)定形成的銪-TDA螯合物的熒光。通過(guò)與1％TX-100和單獨(dú)的培養(yǎng)基分別孵育目標(biāo)細(xì)胞，測(cè)定最大釋放(MR)和自然的釋放(SR)。通過(guò)在不存在抗體的情況下孵育目標(biāo)和效應(yīng)細(xì)胞，測(cè)量抗體依賴性細(xì)胞毒性(AICC)。每個(gè)分析優(yōu)選的進(jìn)行三份。將特異性裂解平均百分比計(jì)算為實(shí)驗(yàn)釋放(ADCC)-AICC)/(MR-SR)×100
本發(fā)明涵蓋在NK依賴性和巨噬細(xì)胞依賴性ADCC分析中表征Fc變體。本發(fā)明的Fc變體具有改變的表型，例如改變的效應(yīng)物功能，如在NK依賴性或巨噬細(xì)胞依賴性分析中所分析的。

本發(fā)明涵蓋本領(lǐng)域已知和在此例示的分析，來(lái)結(jié)合C1q和介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。為了測(cè)定C1q結(jié)合，可以進(jìn)行C1q結(jié)合ELISA。示范性的分析可以包含以下的用多肽變體或起始多肽(對(duì)照)在包被緩沖液中包被分析平板在4℃過(guò)夜。然和可以洗滌和封閉平板。在洗滌之后，將等分量的人類C1q添加到每個(gè)孔，在室溫下孵育2小時(shí)。進(jìn)一步的洗滌之后，可以將100uL綿羊抗補(bǔ)體C1q過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗體添加到每個(gè)孔，在室溫下孵育1小時(shí)?？梢栽俅斡孟礈炀彌_液洗滌平板，將含有OPD(O-間苯二胺二氫氯化物(Sigma))的100ul底物緩沖液添加到每個(gè)孔中。通過(guò)黃色的外觀觀察到的氧化反應(yīng)可以容許進(jìn)行30分鐘，通過(guò)添加100ul 4.5NH2 SO4來(lái)停止。然后可以在(492-405)nm讀取吸光度。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的變體是顯示了C1q結(jié)合的明顯減少的變體，如在這種分析或類似的分析中所檢測(cè)和測(cè)量的。優(yōu)選的，與具有未突變的IgG1 Fc區(qū)的對(duì)照抗體相比，包含F(xiàn)c變體的分析顯示了C1q結(jié)合中約50倍的降低、約60倍、約80倍、或約90倍降低。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含F(xiàn)c變體的分子不結(jié)合C1q，即，與對(duì)照抗體相比，所述變體顯示了C1q結(jié)合中約100倍或更多的降低。

另一種示范性的變體是與包含野生型Fc區(qū)的分子相比具有對(duì)人類C1q更好的結(jié)合親合性的變體。與包含野生型Fc區(qū)的親本分子相比，這種分子可以顯示在人類C1q結(jié)合中，例如，約兩倍或更多，優(yōu)選的約五倍或更多的改善。例如，與包含野生型Fc區(qū)的分子相比，人類C1q結(jié)合可以被改善約兩倍到約500倍，優(yōu)選的從約兩倍或從約5倍到約1000倍。

為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)分析，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202163(1996)中所描述的，通過(guò)完全引用將其合并在此。簡(jiǎn)要地，可以用緩沖液稀釋這種濃度的包含變異Fc區(qū)的分子和人類補(bǔ)體。表達(dá)被包含變異Fc區(qū)的分子所結(jié)合的抗原的細(xì)胞可以被稀釋到約1×106細(xì)胞/ml的密度。包含變異Fc區(qū)的分子、稀釋的人類補(bǔ)體和表達(dá)抗原的細(xì)胞的混合物可以添加到平底組織培養(yǎng)96孔平板上，容許在37℃、5％CO2下孵育2小時(shí)以促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。然后可以向每個(gè)孔添加50uL的alamar藍(lán)(Accumed International)，并在37℃孵育過(guò)夜。用530nm的激發(fā)和590nm的發(fā)射，使用96孔熒光計(jì)測(cè)量吸光度。結(jié)果以相對(duì)熒光單位(RFU)表示?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，為每個(gè)感興趣的變體報(bào)告與非變異分子，即，包含野生型Fc區(qū)的分子相比的百分比活性。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc變體不活化補(bǔ)體。優(yōu)選的，所述變體在上述CDC分析中不顯現(xiàn)具有任何CDC活性。本發(fā)明還涉及與親本分子(包含野生型Fc區(qū)的分子)相比具有增強(qiáng)的CDC的變體，例如，在體外或體內(nèi)顯示了CDC活性方面約兩倍到約100倍的改善(例如，以每個(gè)被比較分子的IC50)。可以用豚鼠、兔或人類血清進(jìn)行補(bǔ)體分析。通過(guò)監(jiān)視細(xì)胞內(nèi)酶，例如乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，如Korzeniewski et al.，1983Immunol.Methods 64(3)313-20；和Decker et al.，1988 J.ImmunolMethods 115(1)61-9所描述的，通過(guò)完全引用將每一個(gè)合并在此；或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記，例如Europium、鉻51或銦111的釋放，其中目標(biāo)細(xì)胞如在此描述的進(jìn)行標(biāo)記，可以檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞的補(bǔ)體裂解。
5.2.8其他分析
包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子也可以使用本領(lǐng)域已知用于表征Fc-FcγR相互作用結(jié)合的動(dòng)力參數(shù)的任何基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振的分析來(lái)分析。包括但不限于可從Biacore AB(Uppsala，Sweden)獲得的BIAcore儀器；可從Affinity Sensors(Franklin，MA.)獲得的IAsys儀器；可從Windsor Scientific Limited(Berks，UK)獲得的IBIS系統(tǒng)，可從Nippon Laser and Electronics Lab(Hokkaido，Japan)獲得的SPR-CELLIA系統(tǒng)以及可從Texas Instruments(Dallas，TX)獲得的SPR Detector Spreeta的任何SPR儀器可以用于本發(fā)明?；赟PR的技術(shù)的綜述參見(jiàn)Mullet et al.，2000，Methods 2277-91；Donget al.，2002，Review in Mol.Biotech.，82303-23；Fivash et al.，1998，Current Opinion in Biotechnology 997-101；Rich et al.，2000，CurrentOpinion in Biotechnology 1154-61，通過(guò)完全引用將它們所有的合并在此。此外，在美國(guó)專利No.6,373,577；6,289,286；5,322,798；5,341，215；6,268,125中描述用于測(cè)量蛋白-蛋白相互作用的任何SPR儀器和基于SPR的方法是本發(fā)明的方法所預(yù)期的，通過(guò)完全引用將它們所有的合并在此。

簡(jiǎn)要地，基于SPR的分析包括將結(jié)合配對(duì)的成員固定在表面上，在溶液中實(shí)時(shí)地監(jiān)視它與結(jié)合配對(duì)的另一個(gè)成員的相互作用。SPR基于測(cè)量在發(fā)生復(fù)合物形成或分離的表面附近溶劑折射率的變化。在其上發(fā)生固定作用的表面是傳感器芯片，它是SPR技術(shù)的核心；它由包被有金的薄層的玻璃表面組成，形成了一批專門(mén)化的表面的基礎(chǔ)，所述表面被設(shè)計(jì)以優(yōu)化分子與表面的結(jié)合。各種傳感器芯片是商業(yè)上可獲得的，特別是來(lái)自以上列出的公司，所有這些都可以用于本發(fā)明的方法中。傳感器芯片的實(shí)例包括可從BIAcore AB，Inc.獲得的那些，例如，傳感器芯片CM5、SA、NTA和HPA。可以使用本領(lǐng)域已知的任何固定方法和化學(xué)作用將本發(fā)明的分子固定在傳感器芯片的表面上，包括但不限于，經(jīng)由胺基的直接共價(jià)聯(lián)結(jié)、經(jīng)由硫氫基的直接共價(jià)聯(lián)結(jié)、生物素附著到抗生物素蛋白包被的表面、醛聯(lián)結(jié)到碳水化物基團(tuán)、以及通過(guò)組氨酸t(yī)ag與NTA芯片附著。

在某些實(shí)施方式中，可以使用BIAcore儀器(例如，BIAcore儀器1000，BIAcore Inc.，Piscataway，NJ)來(lái)測(cè)定包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子，例如包含變異Fc區(qū)的免疫球蛋白，與FcγR的結(jié)合的動(dòng)力參數(shù)。任何FcγR可以用于評(píng)估與包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子的相互作用。在特定的實(shí)施方式中，F(xiàn)cγR是FcγRIIIA，優(yōu)選的是可溶的單體FcγRIIIA。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，可溶的單體FcγRIIIA是連接到接頭-AVITAG序列的FcγRIIIA的細(xì)胞外區(qū)域(參見(jiàn)，2003年1月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/439,498(Attorney Docket No.11183-004-888)和2003年3月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/456,041，通過(guò)完全引用將它們合并在此)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述FcγR是FcγRIIB，優(yōu)選的是可溶的二聚FcγRIIB。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)在2003年1月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/439,709中描述的方法制備可溶的二聚FcγRIIB蛋白，通過(guò)完全引用將它合并在此。

使用BIAcore儀器測(cè)定包含變異Fc區(qū)的分子與FcγR的動(dòng)力參數(shù)的示范性的分析包括以下，其中所述分子是4-4-20抗體將BSA-FITC固定在傳感器芯片表面的四組流動(dòng)細(xì)胞之一上，優(yōu)選的通過(guò)胺聯(lián)結(jié)化學(xué)作用，從而B(niǎo)SA-FITC的約5000個(gè)應(yīng)答單位(RU)被固定在表面上。一旦制備了表面，使攜帶Fc突變的4-4-20抗體通過(guò)所述表面，優(yōu)選的通過(guò)以5μL/mL的流速、20μg/mL溶液的一分鐘注射。結(jié)合到表面的4-4-20抗體的水平在400和700RU之間。然后，將HBS-P緩沖液(20mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA，pH 7.5)中受體(FcγRIIA和FcγRIIB-Fc融合蛋白)的稀釋系列以100μL/min注射到表面上。不同的受體稀釋度之間的抗體再生優(yōu)選的通過(guò)100mMNaHCO3pH 9.4；3M NaCl的單次5秒注射液來(lái)進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的任何再生技術(shù)是本發(fā)明的方法預(yù)期的。

一旦收集到完整的數(shù)據(jù)集，使用由SPR儀器廠家，例如BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的計(jì)算機(jī)算法將產(chǎn)生的結(jié)合曲線全局性地?cái)M合。這些算法計(jì)算Kon和Koff，從中作為兩個(gè)速率常數(shù)的比例(即，Koff/Kon)推斷出表觀平衡結(jié)合常數(shù)Kd。如何產(chǎn)生單獨(dú)的速率常數(shù)的更詳細(xì)的處理可以在BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)中找到。使用本領(lǐng)域已知的任何方法可以進(jìn)行對(duì)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的分析。解釋所產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的各種方法的綜述，參見(jiàn)Myszka，1997，Current Opinion in Biotechnology850-7；Fisher et al.，1994，Current Opinion in Biotechnology 5389-95；O’Shannessy，1994，Current Opinion in Biotechnology，565-71；Chaiken et al.，1992，Analytical Biochemistry，201197-210；Mortonet al.，1995，Analytical Biochemistry 227176-85；O’Shannessy et al.，1996，Analytical Biochemistry 236275-83，通過(guò)完全引用將它們所有的合并在此。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用SPR分析例如BIAcore確定的動(dòng)力參數(shù)可以用作本發(fā)明的分子在功能分析例如ADCC中如何起作用的預(yù)示性度量。根據(jù)從SPR分析獲得的動(dòng)力參數(shù)預(yù)測(cè)本發(fā)明的分子的效力的示范性的方法可以包括以下的測(cè)定本發(fā)明的分子結(jié)合FcγRIIIA和FcγRIIB的Koff值；相對(duì)ADCC數(shù)據(jù)標(biāo)繪(1)FcγRIIIA的Koff(wt)/Koff(mut)；(2)FcγRIIB的Koff(mut)/Koff(wt)。比一高的數(shù)字顯示了相對(duì)于野生型、對(duì)FcγRIIIA降低的離解速率和對(duì)FcγRIIB升高的離解速率；并具有增強(qiáng)的ADCC功能。
5.3重組產(chǎn)生本發(fā)明的分子的方法 5.3.1編碼本發(fā)明的分子的多核苷酸
本分子還包括編碼分子的多核苷酸，所述分子包括通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的多肽和抗體。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法可以獲得編碼本發(fā)明的分子的多核苷酸，測(cè)定所述多核苷酸的核苷酸序列。

一旦確定了通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的分子(例如，抗體)的核苷酸序列，可以使用本領(lǐng)域公知的方法操作該核苷酸序列，例如，重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR，等等(參見(jiàn)，例如，在Sambrook etal.，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；和Ausubel etal.，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY中描述的技術(shù)，通過(guò)完全引用將它們合并在此)，通過(guò)例如產(chǎn)生氨基酸替換、刪除和/或插入來(lái)產(chǎn)生，例如，具有不同氨基酸序列的抗體。

在特定的實(shí)施方式中，當(dāng)核酸編碼抗體時(shí)，使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)將一個(gè)或多個(gè)CDR插入到骨架區(qū)內(nèi)。骨架區(qū)可以是天然發(fā)生的或共有的骨架區(qū)，優(yōu)選的是人類骨架區(qū)(參見(jiàn)，例如，Chothia etal.，1998，J.Mol.Biol.278457-479關(guān)于人類骨架區(qū)的列表)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本領(lǐng)域中可用的人類庫(kù)或任何其他庫(kù)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)篩選，以克隆編碼本發(fā)明的分子的核酸。
5.3.2本發(fā)明的分子的重組表達(dá)
一旦獲得了編碼本發(fā)明的分子(例如，抗體)的核酸序列，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過(guò)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生用于生產(chǎn)該分子的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可用于構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明的分子的編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)、合成的技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。(參見(jiàn)，例如在Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY和Ausubel et al.eds.，1998，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY中描述的技術(shù))。

包含通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的分子(例如，抗體)的核苷酸序列的表達(dá)載體，可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)(例如，電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和磷酸鈣沉淀)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的分子。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子的表達(dá)受到組成型、可誘導(dǎo)的、或組織特異性啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。

用于表達(dá)通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的分子的宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌，或優(yōu)選的，是真核細(xì)胞，特別是對(duì)于完全重組免疫球蛋白分子的表達(dá)。特別地，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，以及載體，例如來(lái)自人類巨細(xì)胞病毒的主要中間早期基因啟動(dòng)子元件，是免疫球蛋白的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking et al.，1998，Gene 45101；Cockett et al.，1990，Bio/Technology 82)。

可以利用各種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的分子。這種宿主-表達(dá)系統(tǒng)代表載體，通過(guò)所述載體可以產(chǎn)生和隨后純化本發(fā)明的分子的編碼序列，還代表細(xì)胞，當(dāng)用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，所述細(xì)胞可以原位表達(dá)本發(fā)明的分子。這些包括但不限于，用含有通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的分子的編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物例如細(xì)菌(例如，E.coli和B.subtilis)；用含有編碼本發(fā)明的方法鑒定的分子的序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，SaccharomycesPichia)；用含有編碼本發(fā)明的方法鑒定的分子的序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用含有編碼本發(fā)明的方法鑒定的分子的序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)和煙草花葉病毒(TMV)感染的，或重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或攜帶重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(參見(jiàn)U.S.5,807,715)、Per C.6細(xì)胞(由Crucell開(kāi)發(fā)的人類視網(wǎng)膜細(xì)胞)，所述構(gòu)建體含有來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)。

在細(xì)菌系統(tǒng)中，取決于要表達(dá)的分子的預(yù)定用途，可以有利地選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)要生產(chǎn)大量的這種蛋白，用于抗體的藥物組合物的生產(chǎn)時(shí)，指導(dǎo)易于純化的融合蛋白產(chǎn)物的高水平表達(dá)的載體是期望的。這種載體包括但不限于，E.coli表達(dá)載體pUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.21791)，其中抗體編碼序列可以與lac Z編碼區(qū)按讀碼框地單獨(dú)連接到載體中，從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109；VanHeeke&Schuster，1989，J.Biol.Chem.245503-5509)；等等。pGEX載體也可以用于將外源多肽表達(dá)為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。一般地，這種融合蛋白是可溶的，通過(guò)吸附和結(jié)合到基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖珠子繼之以在存在游離谷胱甘肽的情況下的洗脫，可以容易地從裂解的細(xì)胞制備。pGEX載體被設(shè)計(jì)以包括凝血酶或因子X(jué)a蛋白酶裂解位點(diǎn)，從而克隆的目標(biāo)基因產(chǎn)物可以從GST部分釋放。

在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，Autographa californica核多角體病病毒(AcNPV)被用作載體來(lái)表達(dá)外源基因。病毒在Spodoptera frugeperda細(xì)胞中生長(zhǎng)?？贵w編碼序列可以單獨(dú)地克隆到病毒的非關(guān)鍵區(qū)(例如，polyhedrin基因)并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如，polyhedrin啟動(dòng)子)的控制之下。

在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以利用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在腺病毒用作表達(dá)載體的情況下，感興趣的抗體編碼序列可以連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，例如，晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)的前導(dǎo)序列。然后可以通過(guò)體外或體內(nèi)重組將這種嵌合基因插入腺病毒基因組。在病毒基因組的非關(guān)鍵區(qū)(例如，區(qū)域E1或E3)中的插入將產(chǎn)生存活的和能在感染的宿主中表達(dá)免疫球蛋白分子的重組病毒(例如，參見(jiàn)，Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81355-359)。特定的起始信號(hào)也可能是插入的抗體編碼序列的有效翻譯所需的。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和鄰近的序列。此外，起始密碼子必須與期望的編碼序列的閱讀框相符以確保完整插入物的翻譯。這些外源的翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是各種來(lái)源的，天然的或合成的。通過(guò)包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子，等等，可以增強(qiáng)表達(dá)的效力(參見(jiàn)，Bittner et al.，1987，Methods in Enzymol.15351-544)。

此外，可以選擇宿主細(xì)胞菌株，其調(diào)節(jié)插入的序列的表達(dá)，或以期望的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的這種修飾(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)對(duì)于蛋白質(zhì)的功能可能是重要的。不同的宿主細(xì)胞對(duì)于翻譯后加工和蛋白與基因產(chǎn)物的修飾具有特征性和特定的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)來(lái)確保所表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和加工。為此，可以使用真核的宿主細(xì)胞，其具有用于原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的適當(dāng)加工、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制。這種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。

對(duì)于長(zhǎng)期的、高產(chǎn)量的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如，可以工程化穩(wěn)定表達(dá)本發(fā)明的抗體的細(xì)胞系。不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以用由適合的表達(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸位點(diǎn)，等等)控制的DNA和選擇標(biāo)記來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入外源DNA之后，可以容許工程化的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記賦予了對(duì)選擇的抗性，容許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到它們的染色體中，并生長(zhǎng)形成foci，其隨后可被克隆和擴(kuò)大成細(xì)胞系。這種方法可以有利地用于工程化表達(dá)本發(fā)明的抗體的細(xì)胞系。這種工程化的細(xì)胞系在篩選和評(píng)估與本發(fā)明的抗體直接或間接作用的化合物中是特別有用的。

可以使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純性皰疹病毒胸苷激酶((Wigler et al.，1977，Cell 11223)、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖莖酶(Szybalska&Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48202)，和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy et al.，1980，Cell 22817)基因，可以分別應(yīng)用于tk細(xì)胞、hgprt細(xì)胞或aprt細(xì)胞。并且，抗代謝物抗性可以用作以下基因的選擇的基礎(chǔ)dhfr，其賦予對(duì)氨甲蝶呤的抗性((Wigler et al.，1980，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 77357；O’Hareet al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，其賦予對(duì)霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；neo，其孵育對(duì)氨基糖苷類G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12488-505；Wu and Wu，1991，387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science 260926-932；and Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIB TECH 11(5)155-215)?？梢允褂玫腄NA重組技術(shù)領(lǐng)域通常已知的方法是Ausubel et al.(eds.)，1993，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；and in Chapters 12and 13，Dracopoli et al.(eds)，1994，CurrentProtocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY.；Colberre-Garapin et al.，1981，J.Mol.Biol.1501中描述的；和hygro，其賦予對(duì)勻霉素的抗性(Santerre et al.，1984，Gene 30147)。

通過(guò)載體擴(kuò)增(對(duì)于綜述，參見(jiàn)Bebbington and Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3(AcademicPress，New York，1987)，可以提高本發(fā)明的抗體的表達(dá)水平。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記物是可擴(kuò)增的時(shí)，宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中存在的抑制物水平的提高將提高標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。由于擴(kuò)增的區(qū)域與抗體的核苷酸序列相連，抗體的生產(chǎn)也將提高(Crouse et al.，1983，Mol.Cell.Biol.3257)。

可以用本發(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，第一載體編碼重鏈衍生的多肽，第二載體編碼輕鏈衍生的多肽。兩種載體可以含有相同的選擇標(biāo)記，其允許重鏈和輕鏈多肽的等量表達(dá)。做為選擇，可以使用編碼重鏈和輕鏈多肽的單個(gè)載體。在這種情況中，輕鏈應(yīng)當(dāng)置于重鏈之前以避免過(guò)量的毒性游離重鏈(Proudfoot，1986，Nature32252；Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包括cDNA或基因組DNA。

一旦重組表達(dá)了本發(fā)明的分子(即，抗體)，它可以通過(guò)本領(lǐng)域已知用于多肽或抗體的純化的任何方法來(lái)純化，例如，通過(guò)層析(例如，離子交換、親合性、特別是通過(guò)蛋白A對(duì)特定抗原的親合性，和大小柱層析)、離心、差異溶解，或通過(guò)用于多肽或抗體的純化的任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
5.4預(yù)防和治療方法
本發(fā)明涵蓋向動(dòng)物、優(yōu)選的哺乳動(dòng)物、最優(yōu)選的人類施用一種或多種本發(fā)明的分子(例如，抗體)來(lái)預(yù)防、治療或改善與疾病、失調(diào)或感染有關(guān)的一種或多種癥狀。本發(fā)明的分子對(duì)于疾病或失調(diào)的治療或預(yù)防是特別有用的，在所述治療或預(yù)防中由FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能(例如，ADCC)的增強(qiáng)的效力是期望的。本發(fā)明的方法和組合物對(duì)于原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤疾病(即，癌癥)和傳染性疾病的治療和預(yù)防是特別有用的。本發(fā)明的分子可以如本領(lǐng)域已知的或如在此描述的以藥學(xué)上可接受的組合物來(lái)提供。如以下詳述的，本發(fā)明的分子可以用于治療或預(yù)防癌癥(特別在被動(dòng)免疫治療中)、自體免疫疾病、炎癥性失調(diào)或傳染性疾病的方法中。

本發(fā)明的分子也可以有利地與本領(lǐng)域已知用于癌癥、自體免疫疾病、炎癥性失調(diào)或傳染性疾病的治療或預(yù)防的其他治療試劑一同使用。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子可以與單克隆或嵌合抗體、淋巴因子、造血的生長(zhǎng)因子(例如，IL-2、IL-3和IL-7)組合使用，它們被用來(lái)提高與所述分子作用的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目或活性，和提高免疫反應(yīng)。本發(fā)明的分子也可以有利地與用于治療疾病、失調(diào)或感染藥物組合使用，例如抗癌藥劑、抗炎癥藥劑或抗病毒劑，例如以下的5.4.1.2和5.4.2.1節(jié)中詳述的。
5.4.1癌癥
本發(fā)明涵蓋用于在受試者中治療或預(yù)防癌癥或轉(zhuǎn)移的方法和組合物，包括向受試者施用治療有效量的包含變異Fc區(qū)的一種或多種分子。

包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子(即，多肽、抗體)可以用于防止、抑制或降低原發(fā)腫瘤或癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含變異Fc，所述變異Fc以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，和/或所述變異Fc區(qū)具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，例如，ADCC、CDC、吞噬作用、調(diào)理作用，等等。這種分子可以單獨(dú)使用來(lái)治療或預(yù)防癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含變異Fc區(qū)，所述變異Fc區(qū)以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，并進(jìn)一步以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIB更低的親合性結(jié)合FcγRIIB，和/或所述變異Fc區(qū)具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能，例如ADCC、CDC、吞噬作用、調(diào)理作用，等等。這種分子也可以單獨(dú)使用來(lái)治療或預(yù)防癌癥。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋在具有FcγR多態(tài)性的受試者，例如對(duì)FgRIIIA-158V或FcγRIIIA-158F等位基因純合的那些受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法和組合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋根據(jù)本發(fā)明的方法工程化治療性抗體，例如，腫瘤特異性單克隆抗體，從而工程化的抗體在FcγRIIIA(158F)的低親合性等位基因純合的患者中具有增強(qiáng)的效力。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋根據(jù)本發(fā)明的方法工程化治療性抗體，例如，腫瘤特異性單克隆抗體，從而工程化的抗體在FcγRIIIA(158V)的高親合性等位基因純合的患者中具有增強(qiáng)的效力。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程化的抗體在治療和/或預(yù)防非Hodgkin’s淋巴瘤(NHL)中是特別有效的。本發(fā)明的工程的抗體比NHL的當(dāng)前治療方式，包括但不限于化學(xué)療法和使用抗CD20mAb，Rituximab的免疫治療是治療上更有效的。然而抗CD20單克隆抗體的效力取決于受試者的FcγR多態(tài)性(Carton et al.，2002Blood，99754-8；Weng et al.，2003 J Clin Oncol.21(21)3940-7，通過(guò)完全引用將它們兩個(gè)合并在此。這些受體在效應(yīng)細(xì)胞表面表達(dá)并介導(dǎo)ADCC。低親合性活化受體的高親合性等位基因改善效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力。本發(fā)明的方法容許攜帶Fc突變的工程化的抗-CD20抗體經(jīng)由它們改變的Fc結(jié)構(gòu)域來(lái)增強(qiáng)它們對(duì)效應(yīng)細(xì)胞上FcγR的親合性。本發(fā)明的工程化的抗體為患者提供了不考慮患者的FcγR多態(tài)性的更好的免疫治療試劑。

在受試者中測(cè)定工程化的抗-CD20抗體的效力的示范性的方法可以包括以下的攜帶具有Fc突變的嵌合抗-HER2/neu重鏈基因的質(zhì)粒，可以用作主干來(lái)轉(zhuǎn)移來(lái)自Rituximab重鏈基因的可變區(qū)，所述Fc突變顯示了ADCC中實(shí)質(zhì)上提高的殺傷。用來(lái)自Rituximab的可變區(qū)替換抗-HER2/neu Fc變體的可變區(qū)。含有野生型Fc結(jié)構(gòu)域或取消FcR結(jié)合的D265A突變、或抗-CD20Fc變體的質(zhì)粒，與Rituximab輕鏈基因短暫地共轉(zhuǎn)染到293H細(xì)胞中，在蛋白G柱上使用常規(guī)方法純化條件培養(yǎng)基和抗體。

使用培養(yǎng)的B細(xì)胞系通過(guò)ADCC測(cè)試攜帶Fc變體的抗-CD20mAbs，來(lái)測(cè)定Fc突變?cè)鰪?qiáng)ADCC的能力。使用在此公開(kāi)的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的ADCC。使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)從供體的外周血收獲淋巴細(xì)胞。用Europium(PerkinElmer)加載目標(biāo)Daudi細(xì)胞、表達(dá)CD20的B細(xì)胞系，在37℃與效應(yīng)物孵育4小時(shí)。使用熒光板讀數(shù)器(Wallac)檢測(cè)釋放的Europium。產(chǎn)生的ADCC數(shù)據(jù)表明Fc變體觸發(fā)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的效力，并確定了哪些抗-CD20Fc變體可以用患者樣品和淘選的單核細(xì)胞來(lái)測(cè)試。然后使用來(lái)自患者的PBMC在ADCC分析中測(cè)試顯示了增強(qiáng)抗-CD20抗體的效力的最大可能性的Fc變體。來(lái)自健康供體的PBMC用作效應(yīng)細(xì)胞。在來(lái)自患有濾泡性淋巴瘤的患者的原始淋巴瘤細(xì)胞中進(jìn)行使用抗-CD20變體和Rituximab的體外ADCC分析。使用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定供體的特定FcγR多態(tài)性并編目。通過(guò)來(lái)自具有不同的FcγRIIIA和FcγRIIA基因型的患者的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行ADCC分析。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子(例如，抗體)，相對(duì)于含有野生型Fc區(qū)的分子，通過(guò)提高的抗體效應(yīng)物功能的效力，例如，ADCC、CDC、吞噬作用、調(diào)理作用等等，來(lái)增強(qiáng)癌癥免疫治療的效力。在特定的實(shí)施方式中，使用具有變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子增強(qiáng)了抗體依賴性細(xì)胞毒性和/或腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。本發(fā)明的分子可以通過(guò)增強(qiáng)至少一種抗體介導(dǎo)的效應(yīng)物功能來(lái)增強(qiáng)免疫療法癌癥治療的效力。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子通過(guò)增強(qiáng)補(bǔ)體依賴性級(jí)聯(lián)來(lái)增強(qiáng)免疫療法治療的效力。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子通過(guò)增強(qiáng)目標(biāo)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和/或調(diào)理作用來(lái)增強(qiáng)免疫療法治療的效力。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子通過(guò)在目標(biāo)腫瘤細(xì)胞的破壞中促進(jìn)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(“ADCC”)來(lái)增強(qiáng)治療的效力。

本發(fā)明進(jìn)一步期待工程化的治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)用于增強(qiáng)治療性抗體的治療效力，例如，通過(guò)增強(qiáng)所述治療性抗體的效應(yīng)物功能(例如，ADCC)。優(yōu)選的，所述治療性抗體是細(xì)胞毒的和/或調(diào)理抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，一旦根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定了(參見(jiàn)5.2節(jié)和表8)具有期望的結(jié)合性質(zhì)(例如，具有有至少一個(gè)氨基酸修飾的變異Fc區(qū)的分子，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述修飾增強(qiáng)所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性)的分子，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)和任何已知的技術(shù)，如5.2.2節(jié)中所描述的，工程化治療抗體來(lái)產(chǎn)生攜帶具有期望的結(jié)合性質(zhì)的所鑒定突變位點(diǎn)的工程化的治療劑。已經(jīng)在癌癥治療中證明了治療實(shí)用性的表9中所列的任何治療性抗體，可以根據(jù)本發(fā)明的方法工程化，例如，通過(guò)修飾Fc區(qū)以具有與具野生型Fc區(qū)的治療性抗體相比的、對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增強(qiáng)的親合性，并用于以癌癥抗原為特征的癌癥的治療和/或預(yù)防。其他治療性抗體包括針對(duì)病原體的那些，例如針對(duì)Streptococcus pneumoniae血清型6B的那些，參見(jiàn)，例如Sun et al.，1999，Infection and Immunity，67(3)1172-9。

本發(fā)明的Fc變體可以摻入治療性抗體，例如在此公開(kāi)的那些，或其他Fc融合物臨床候選物，即，已經(jīng)批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)的包含F(xiàn)c區(qū)的分子，或其他任何可得益于本發(fā)明的Fc變體的分子，它們的人源化的、親合性成熟的、修飾的或工程化的型式。

本發(fā)明還涵蓋根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)工程化具有治療實(shí)用性包含F(xiàn)c區(qū)的任何其他多肽，包括但不限于ENBREL，來(lái)增強(qiáng)這些多肽的治療效力，例如，通過(guò)增強(qiáng)包含F(xiàn)c區(qū)的多肽的效應(yīng)物功能。
表9.可以根據(jù)本發(fā)明的方法被工程化的治療性抗體






因此，本發(fā)明提供了使用治療性抗體預(yù)防或治療以癌癥抗原為特征的癌癥的方法，所述治療性抗體結(jié)合癌癥抗原，并且是細(xì)胞毒性的，已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明在Fc區(qū)中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)修飾，以比親本治療性抗體更高的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，和/或更有效地介導(dǎo)效應(yīng)物功能(例如，ADCC、吞噬作用)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了使用治療性抗體預(yù)防或治療以癌癥抗原為特征的癌癥的方法，所述治療性抗體結(jié)合癌癥抗原，并且是細(xì)胞毒性的，已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法工程化，來(lái)以比親本治療性抗體更高的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA并以更低的親合性結(jié)合FcγRIIB，和/或更有效地介導(dǎo)效應(yīng)物功能(例如，ADCC、吞噬作用)。根據(jù)本發(fā)明工程化的治療性抗體對(duì)于癌癥的預(yù)防或治療是有用的，因?yàn)樗鼈兙哂性鰪?qiáng)的細(xì)胞毒活性(例如，增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷和/或增強(qiáng)的，例如ADCC活性或CDC活性)。

與癌癥抗原相關(guān)的癌癥可以通過(guò)施用治療性抗體來(lái)治療或預(yù)防，所述治療性抗體結(jié)合癌癥抗原并且是細(xì)胞毒的，并且已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法工程化以具有例如增強(qiáng)的效應(yīng)物功能。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法工程化的治療性抗體增強(qiáng)了針對(duì)特定癌癥抗原的抗體的抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒效果。例如而不是為了限制，與以下癌癥抗原相關(guān)的癌癥可以通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物來(lái)治療或預(yù)防KS 1/4泛癌抗原(Perez and Walker，1990，J.Immunol.14232-37；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)407-415)、卵巢癌抗原(CA125)(Yuet al.，1991，Cancer Res.51(2)48-475)、前列腺酸磷酸鹽(Tailor etal.，1990，Nucl.Acids Res.18(1)4928)、前列腺特異性抗原(Henttuand Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.10(2)903-910；Israeliet al.，1993，Cancer Res.53227-230)、黑素瘤相關(guān)抗原p97(Estin etal.，1989，J.Natl.Cancer Instit.81(6)445-44)、黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl et al.，1990，J.Exp.Med.171(4)1375-1380)、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali et al.，1987，Cancer5955-3；Mittelman et al.，1990，J.Clin.Invest.862136-2144))、前列腺特異性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foon et al.，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13294)、多態(tài)性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、結(jié)腸直腸腫瘤相關(guān)抗原例如CEA、TAG-72(Yokata et al.，1992，CancerRes.523402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar et al.，1993，Int.J.Cancer53751-758)；GICA 19-9(Herlyn et al.，1982，J.Clin.Immunol.2135)、CTA-1和LEA，Burkitt’s淋巴瘤抗原-38.13，CD19(Ghetie etal.，1994，Blood 831329-1336)、人類B淋巴瘤抗原-CD20(Reff et al.，1994，Blood 83435-445)、CD33(Sgouros et al.，1993，J.Nucl.Med.34422-430)、黑素瘤特異性抗原例如神經(jīng)節(jié)苷脂GD2(Saleh et al.，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)、神經(jīng)節(jié)苷脂GD3(Shitara et al.，1993，Cancer Immunol.Immunother.36373-380)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2(Livingston et al.，1994，J.Clin.Oncol.121036-1044)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(Hoon et al.，1993，Cancer Res.535244-5250)、細(xì)胞表面抗原的腫瘤特異性移植類型(TSTA)例如virally誘導(dǎo)的腫瘤抗原，包括T抗原DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原-甲胎蛋白例如結(jié)腸的CEA、膀胱腫瘤癌胚抗原(Hellstrom et al.，1985，Cancer.Res.452210-2188)、分化抗原，例如人類肺癌抗原L6，L20(Hellstrom et al.，1986，Cancer Res.463917-3923)、纖維肉瘤的抗原、人類白血病T細(xì)胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al.，1988，J.of Immun.1411398-1403)、新糖蛋白(neoglycoprotein)、鞘脂類、乳癌抗原例如EGFR(Epidermal growth factor receptor)、HER2抗原(p185HER2)、多態(tài)上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens et al.，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17359)、惡性人類淋巴細(xì)胞抗原-APO-1(Bernhard et al.，1989，Science 245301-304)、分化抗原(Feizi，1985，Nature 31453-57)例如胎兒紅細(xì)胞和原內(nèi)胚層中發(fā)現(xiàn)的I抗原、胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的I(Ma)、乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的M18和M39、骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的SSEA-1、結(jié)腸直腸癌癥中發(fā)現(xiàn)的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5和D156-22、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的TRA-1-85(血群H)、C14、肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的F3、胃癌中發(fā)現(xiàn)的AH6、Y半抗原、胚胎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Ley、TL5(血群A)、A431細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的EGF受體、胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的E1系列(血群B)、胚胎癌細(xì)胞、胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的FC10.2、腺癌中發(fā)現(xiàn)的CO-514(血群Lea)、腺癌中發(fā)現(xiàn)的NS-10、CO-43(血群Leb)、G49、EGF受體、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的(血群ALeb/Ley)、胃癌粘蛋白、結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的19.9、骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的T5A7、黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的R24、胚胎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8和4-8細(xì)胞分裂期胚中發(fā)現(xiàn)的SSEA-3、SSEA-4。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原是來(lái)自皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的T細(xì)胞受體衍生的肽(參見(jiàn)Edelson，1998，The Cancer Journal 462)。

可以通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物治療或預(yù)防的癌癥和相關(guān)的失調(diào)包括但不限于以下的白血病，包括但不限于，急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病，例如，myeloblastic、promyelocytic、骨髓單核的、單核細(xì)胞的、紅白血病白血病和脊髓發(fā)育不良綜合征，慢性白血病，例如但不限于，慢性的髓細(xì)胞的(granulocytic)白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞白血??；脾大性紅細(xì)胞增多；淋巴瘤，例如但不限于Hodgkin’s病、非Hodgkin’s??；多發(fā)性骨髓瘤，例如但不限于郁積多發(fā)性骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、骨硬化的骨髓瘤、漿細(xì)胞性白血病、孤立性漿細(xì)胞瘤和髓外漿細(xì)胞瘤；

巨球蛋白血癥；未確定顯著性的單克隆的免疫球蛋白病；良性的單克隆免疫球蛋白??；重鏈??；骨骼和結(jié)締組織肉瘤，例如但不限于，骨骼肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、Ewing’s肉瘤、惡性巨細(xì)胞瘤、骨纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤(血管內(nèi)皮瘤)、纖維肉瘤、Kaposi’s肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、neurilemmoma、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤；腦腫瘤，包括但不限于，膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、寡枝神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、nonglial腫瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、顱咽管瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、pineocytoma、成松果體細(xì)胞瘤、原發(fā)腦淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于，腺癌、小葉(小細(xì)胞)癌、管內(nèi)癌、髓質(zhì)乳腺癌、粘質(zhì)乳腺癌、管性乳腺癌、乳頭乳腺癌、Paget’s病和炎癥性的乳腺癌；腎上腺癌癥，包括但不限于，pheochromocytom和腎上腺皮質(zhì)癌；甲狀腺癌，例如但不限于，乳頭狀的或卵泡的甲狀腺癌、髓質(zhì)甲狀腺癌和退行的甲狀腺癌；胰腺癌，包括但不限于，胰島瘤、胃泌素瘤、胰升血糖素瘤、舒血管腸肽瘤(vipoma)、促生長(zhǎng)素釋放抑制因子分泌腫瘤、和類癌瘤或胰島細(xì)胞瘤；垂體癌癥，包括但不限于，Cushing’s病、分泌促黃體分泌素的腫瘤、肢端肥大癥和糖尿病insipius；眼癌癥，包括但不限于，眼黑素瘤，例如虹膜黑素瘤、脈絡(luò)膜黑素瘤和cilliary體黑素瘤，和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；陰道的癌癥，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和黑素瘤；陰部癌癥，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤、腺癌、基底細(xì)胞癌、肉瘤和Paget’s?。蛔訉m頸癌癥，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌和腺癌；子宮癌，包括但不限于，子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤；卵巢癌癥，包括但不限于，卵巢上皮癌、界線腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤和基質(zhì)腫瘤；食管癌癥，包括但不限于，鱗狀癌癥、腺癌、adenoidcyctic癌、粘液表皮樣癌、腺鱗癌、肉瘤、黑素瘤、漿細(xì)胞瘤、疣狀癌和oat細(xì)胞(小細(xì)胞)癌；胃癌，包括但不限于，腺癌、真菌樣生長(zhǎng)(息肉樣)、潰爛、淺表散布、廣泛地散布、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和癌肉瘤；結(jié)腸癌；直腸癌；肝癌，包括但不限于肝細(xì)胞癌和肝胚細(xì)胞瘤，膽囊癌癥，包括但不限于腺癌；膽管細(xì)胞癌，包括但不限于，pappillary、結(jié)節(jié)的和彌漫的；肺癌，包括但不限于，非小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌(表皮樣癌)、腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌；睪丸癌癥，包括但不限于，生殖腫瘤、精原細(xì)胞瘤、退性發(fā)育的、經(jīng)典的(典型的)、精細(xì)胞的、非精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、惡性合胞體瘤(卵黃囊腫瘤)、前列腺癌癥，包括但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤和橫紋肌肉瘤；penal癌癥；口腔癌，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌；基底癌癥；唾液腺癌癥，包括但不限于，腺癌、粘液表皮樣癌和腺胞囊癌；咽癌，包括但不限于，扁平細(xì)胞癌癥和疣；皮膚癌，包括但不限于，基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和黑素瘤，淺表散布黑素瘤、結(jié)節(jié)的黑素瘤、斑點(diǎn)惡性黑色素瘤、肢端的斑點(diǎn)的黑素瘤；腎癌，包括但不限于，腎臟細(xì)胞癌癥、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、移行細(xì)胞癌癥(腎盂和/或uterer)；Wilms’腫瘤；膀胱癌，包括但不限于，轉(zhuǎn)移細(xì)胞癌、扁平細(xì)胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌癥包括粘液肉瘤、骨肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、lymphangioendotheliosarcoma、間皮瘤、滑膜瘤、成血管細(xì)胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支氣管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(這些疾病的綜述，參見(jiàn)Fishman etal.，1985，Medicine，2d Ed.，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia andMurphy et al.，1997，Informed DecisionsThe Complete Book of CancerDiagnosis，Treatment，and Recovery，Viking Penguin，Penguin BooksU.S.A.，Inc.，United States of America)。

因此，本發(fā)明的方法和組合物在各種癌癥或其他異常增殖性疾病的治療或預(yù)防中也是有用的，包括(但不限于)以下的癌，包括膀胱、乳腺、結(jié)腸、腎臟、肝臟、肺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、宮頸、甲狀腺和皮膚的癌；包括鱗狀細(xì)胞癌；淋巴系統(tǒng)的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、Burketts淋巴瘤；骨髓系統(tǒng)的造血腫瘤，包括急性和慢性粒性白血病和早幼粒細(xì)胞性白血??；間質(zhì)來(lái)源的腫瘤，包括纖維肉瘤和rhabdomyoscarcoma；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、tetratocarcinoma、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤；中央和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤和許旺氏細(xì)胞瘤；間質(zhì)來(lái)源的腫瘤，包括fibrosafcoma、rhabdomyoscarama和骨肉瘤；和其他腫瘤，包括黑素瘤、xenoderma pegmentosum、keratoactanthoma、精原細(xì)胞瘤、甲狀腺卵泡的癌癥和畸胎癌。還預(yù)期的是由細(xì)胞凋亡中的畸變引起的癌癥也將通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物來(lái)治療。這些癌癥可以包括但不限于，濾泡性淋巴瘤、p53突變的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依賴性腫瘤，和癌前期病變，例如家族性腺瘤息肉病，和脊髓發(fā)育不良綜合征。在特定的實(shí)施方式中，惡性腫瘤或不正常的增殖變化(例如組織化生和發(fā)育異常)，或超增殖性失調(diào)，在卵巢、膀胱、乳腺、結(jié)腸、肺、皮膚、胰腺或子宮中，通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物來(lái)治療或預(yù)防。在其他特定實(shí)施方式中，肉瘤、黑素瘤或白血病通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物來(lái)治療或預(yù)防。

在特定的實(shí)施方式中，相對(duì)于不存在本發(fā)明的所述分子的情況下原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)，本發(fā)明的分子(例如，包含變異Fc區(qū)的抗體，或根據(jù)本發(fā)明的方法工程化的治療性單克隆抗體)抑制或降低原發(fā)腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。
5.4.1.1組合治療
本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋施用本發(fā)明的分子連同本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于癌癥的治療或預(yù)防的其他治療，包括但不限于，當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)的和實(shí)驗(yàn)的化學(xué)療法、激素治療、生物學(xué)治療、免疫治療、放射治療或手術(shù)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子可以連同治療或預(yù)防有效量的一種或多種抗癌癥試劑、治療性抗體(例如，表9中所列的抗體)，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于癌癥的治療和/或預(yù)防的其他試劑(參見(jiàn)5.4.1.2節(jié))來(lái)施用。

在某些實(shí)施方式中，同時(shí)地隨同一種或多種對(duì)癌癥的治療有用的其他治療試劑向哺乳動(dòng)物、優(yōu)選的人類使用一種或多種本發(fā)明的分子。術(shù)語(yǔ)“同時(shí)地”不限于在完全相同的時(shí)間施用預(yù)防或治療試劑，而是它意味著，按順序和在一定時(shí)間間隔內(nèi)向哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的分子和另一種那些，從而本發(fā)明的分子可以與另一種試劑一同起作用，來(lái)提供與另外地施用它們相比提高的效益。例如，每種預(yù)防或治療試劑(例如，化學(xué)療法、放射療法、激素治療或生物學(xué)療法)可以同時(shí)地施用或者以任何順序在不同的時(shí)點(diǎn)次序地施用；然而，如果不是同時(shí)施用的，它們應(yīng)當(dāng)在時(shí)間上足夠接近地施用以便提供期望的治療或預(yù)防效果。每種治療試劑可以單獨(dú)地、以任何合適的形式和通過(guò)任何適合的途徑來(lái)施用。在各種實(shí)施方式中，以低于1小時(shí)的間隔、約1小時(shí)的間隔、約1小時(shí)到約2小時(shí)的間隔、約2小時(shí)到約3小時(shí)的間隔、約3小時(shí)到約4小時(shí)的間隔、約4小時(shí)到約5小時(shí)的間隔、約5小時(shí)到約6小時(shí)的間隔、約6小時(shí)到約7小時(shí)的間隔、約7小時(shí)到約8小時(shí)的間隔、約8小時(shí)到約9小時(shí)的間隔、約9小時(shí)到約10小時(shí)的間隔、約10小時(shí)到約11小時(shí)的間隔、約11小時(shí)到約12小時(shí)的間隔、不超過(guò)24小時(shí)的間隔或不超過(guò)48小時(shí)的間隔，來(lái)施用預(yù)防或治療試劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在就診的相同患者內(nèi)施用兩種或多種成分。

在其他實(shí)施方式中，預(yù)防或治療試劑以約2到4天的間隔、約4到6天的間隔、約1周的間隔、約1到2周的間隔、或超過(guò)2周的間隔施用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在兩種試劑都仍然有效的時(shí)間框內(nèi)施用預(yù)防或治療試劑。通過(guò)測(cè)定施用的試劑的半衰期，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能確定這種時(shí)間框。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的預(yù)防或治療試劑循環(huán)地施用給受試者。循環(huán)治療包括施用第一試劑一段時(shí)間，隨后施用第二試劑和/或第三試劑一段時(shí)間，并重復(fù)這種連續(xù)的施用。循環(huán)治療可以降低對(duì)一種或多種治療的抗性的發(fā)展，避免或降低治療之一的副作用，和/或改善治療的效力。

在某些實(shí)施方式中，以不超過(guò)3周的循環(huán)、每?jī)芍芗s1次、每10天約1次或每周約1次施用預(yù)防或治療試劑。一個(gè)循環(huán)可以包括，通過(guò)每個(gè)循環(huán)約90分鐘、每個(gè)循環(huán)約1小時(shí)、每個(gè)循環(huán)約45分鐘的輸注來(lái)施用治療或預(yù)防試劑。每個(gè)循環(huán)可以包括至少1周的靜止、至少2周的靜止、至少3周的靜止。所施用的循環(huán)的數(shù)目從約1到約12個(gè)循環(huán)、更一般地從約2到約10個(gè)循環(huán)、更一般地從約2到約8個(gè)循環(huán)。

在再其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療和預(yù)防試劑以節(jié)奏給藥方式施用，通過(guò)沒(méi)有延伸的靜止期的連續(xù)的輸注或常見(jiàn)的施用。這種節(jié)奏施用可以包括以沒(méi)有靜止期的穩(wěn)定間隔給藥。一般地，治療試劑、特別是細(xì)胞毒的試劑以較低的劑量使用。這種給藥方式涵蓋相對(duì)低劑量的長(zhǎng)期每天施用持續(xù)的時(shí)間周期。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，較低劑量的使用可以最小化毒性副作用并消除靜止期。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)從約24小時(shí)到約2天、到約1周、到約2周、到約3周、到約1個(gè)月、到約2個(gè)月、到約3個(gè)月、到約4個(gè)月、到約5個(gè)月、到約6個(gè)月的長(zhǎng)期低劑量或連續(xù)輸注，來(lái)遞送治療和預(yù)防試劑。這種給藥方式的進(jìn)度表可以由熟練的腫瘤學(xué)家來(lái)優(yōu)化。

在其他實(shí)施方式中，同時(shí)地向哺乳動(dòng)物施用治療的進(jìn)程，即，施用單獨(dú)的治療劑的劑量但又在一定時(shí)間間隔之內(nèi)，從而本發(fā)明的分子可以與其他試劑一同工作。例如，與另一種成分一同地，一種成分可以每周施用一次，所述另一種成分每?jī)芍苁┯靡淮位蛎咳苁┯靡淮?。換句話說(shuō)，即使治療劑不被同時(shí)地施用或在相同的就診患者內(nèi)，也同時(shí)地進(jìn)行治療劑的給藥方式。

當(dāng)與其他預(yù)防試劑和/或治療試劑組合使用時(shí)，本發(fā)明的分子和所述預(yù)防試劑和/或治療試劑可以附加地、或更優(yōu)選的協(xié)同地起作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子與一種或多種治療試劑在相同的藥物組合物中同時(shí)施用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子與一種或多種其他治療試劑在獨(dú)立的藥物組合物中同時(shí)施用。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子在另一種預(yù)防或治療試劑的施用之前或之后施用。本發(fā)明預(yù)期通過(guò)相同或不同的給藥途徑，例如口服和胃腸外途徑，與其他預(yù)防或治療試劑組合施用本發(fā)明的分子。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)與可能產(chǎn)生不良副作用，包括但不限于毒性的另一種預(yù)防或治療試劑同時(shí)地施用本發(fā)明的分子時(shí)，可以有利地以低于引發(fā)不良副作用的閾值的劑量施用所述預(yù)防或治療試劑。

在此提供的給藥數(shù)量和施用頻率被術(shù)語(yǔ)治療有效的和預(yù)防有效的涵蓋。根據(jù)特異于每個(gè)患者的因素、取決于所施用的特定治療或預(yù)防試劑、癌癥的嚴(yán)重度和類型、給藥途徑、以及年齡、體重、反應(yīng)和患者的以往病史，劑量和頻率進(jìn)一步地一般將不同。通過(guò)考慮這些因素，并通過(guò)遵循，例如，在文獻(xiàn)中報(bào)道的以及在Physician’s DeskReference(56th ed.，2002)中推薦的劑量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適合的服法。
5.4.1.2其他治療/預(yù)防試劑
在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法涵蓋施用一種或多種本發(fā)明的分子和用于癌癥的治療和/或預(yù)防的一種或多種治療試劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，血管生成抑制物可以與本發(fā)明的分子組合施用?？捎糜诒景l(fā)明的方法和組合物的血管生成抑制物包括但不限于Angiostatin(血纖維蛋白溶解酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay 12-9566；Benefin；Bevacizumab；BMS-275291；軟骨衍生的抑制物(CDI)；CAI；CD59補(bǔ)體片段；CEP-7055；Col 3；Combretastatin A-4；Endostatin(膠原蛋白XVIII片段)；纖連蛋白片段；Gro-beta；Halofuginone；肝素酶；肝素己糖片段；HMV833；人絨毛膜促性腺激素(hCG)；IM-862；干擾素alpha/beta/gamma；干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP-10)；白細(xì)胞介素-12；Kringle5(血纖維蛋白溶酶原片段)；Marimastat；金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)；2-甲氧雌甾二醇；MMI 270(CGS 27023A)；MoAbIMC-1C11；Neovastat；NM-3；Panzem；PI-88；胎盤(pán)核糖核酸酶抑制物；纖溶酶原激活物抑制物；血小板因子-4(PF4)；Prinomastat；促黃體分泌素16kD片段；Proliferin相關(guān)蛋白(PRP)；PTK 787/ZK222594；類視黃醇；Solimastat；Squalamine；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氫皮質(zhì)醇-S；四硫鉬酸鹽；酞胺哌啶酮；Thrombospondin-1(TSP-1)；TNP-470；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta(TGF-b)；Vasculostatin；Vasostatin(calreticulin片段)；ZD6126；ZD 6474；法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制物(FTI)；和雙膦酸鹽類。

可以在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中與本發(fā)明的分子，包括本發(fā)明的藥物組合物和劑型和試劑盒組合使用的抗癌試劑包括但不限于阿西維辛；阿柔比星；鹽酸阿柔比星；阿克羅寧；阿多來(lái)新；阿地白介素；六甲蜜胺；二霉素；醋酸阿美蒽醌；氨基苯乙哌啶酮；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴馬司他；苯佐替派；比卡魯胺；鹽酸比生群；bisnafidedimesylate；比折來(lái)新；硫酸博來(lái)霉素；布喹那鈉；溴匹立明；白消安；放線菌素C；二甲睪酮；卡醋胺；卡貝替姆；卡鉑；亞硝脲氮芥；鹽酸卡柔比星；卡折來(lái)新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西羅霉素；順式鉑氨；克拉屈濱；甲磺酸克立那托；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；氮烯唑胺；放線菌素；鹽酸紅比霉素；地西他濱；右?jiàn)W馬鉑；地扎胍寧；甲磺酸dezaguanine；地吖醌；多西紫杉醇；阿霉素；鹽酸阿霉素；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；重氮霉素；依達(dá)曲沙；鹽酸依氟鳥(niǎo)氨酸；依沙蘆星；恩洛鉑；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比星；雌氮芥；雌氮芥磷酸鈉；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；鹽酸法洛唑啉；法扎拉濱；芬維A胺；5-氟脫氧尿苷；磷酸氟達(dá)拉濱；氟尿嘧啶；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星鈉；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；羥基脲；鹽酸依達(dá)比星；異環(huán)磷酰胺；依莫福新；白細(xì)胞介素II(包括重組白細(xì)胞介素II或rIL2)，干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α-n1；干擾素α-n3；干擾素β-Ia；干擾素γ-Ib；異丙鉑；鹽酸依立替康；醋酸蘭瑞肽；來(lái)曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索鈉；環(huán)己亞硝脲；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；鹽酸氮芥；甲地孕酮；十六次甲基甲地孕酮；苯丙氨酸氮芥；美諾立爾；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；氨甲蝶呤鈉；氯苯氨啶；米得派；米丁度胺；mitocarcin；絲裂紅素；絲裂吉霉素；絲裂馬菌素；絲裂霉素；米托司培；米托坦；鹽酸米托蒽醌；霉酚酸；諾考達(dá)啉；諾加霉素；奧馬鉑；亞磺酰吡啶；紫杉醇；天門(mén)冬酰胺酶；佩里霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；雙溴丙基哌嗪；保釋芬；鹽酸吡羅蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆鈉；甲基絲裂霉素；松龍苯芥；鹽酸甲基芐肼；嘌呤霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；羅谷亞胺；沙芬戈；鹽酸沙芬戈；甲基環(huán)己亞硝脲；二甲二苯四氮烯；磷乙酰天冬氨酸鈉；稀疏霉素；鹽酸螺旋鍺；螺莫司?。宦葶K；鏈黑菌素；鏈脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替克加蘭鈉；替加氟；鹽酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替羅昔?。徊G丸內(nèi)酯；硫咪嘌呤；硫鳥(niǎo)嘌呤；硫替派；噻唑呋林；替拉扎明；枸櫞酸托瑞米芬；醋酸曲托龍；磷酸曲西立濱；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；鹽酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亞胺；伐普肽；維替泊芬；硫酸長(zhǎng)春堿；硫酸醛基長(zhǎng)春堿；去乙酰長(zhǎng)春酰胺；硫酸去乙酰長(zhǎng)春酰胺；硫酸長(zhǎng)春匹定；硫酸長(zhǎng)春甘酯；硫酸環(huán)氧長(zhǎng)春堿；酒石酸長(zhǎng)春瑞濱；硫酸長(zhǎng)春羅定；硫酸長(zhǎng)春利定；呋氯唑；折尼鉑；凈司他??；鹽酸佐柔比星。其他抗癌藥物包括，但不限于20-epi-1，25二羥維生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龍；阿柔比星；酰基富烯；adecypenol；阿多來(lái)新；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲蜜胺；氨莫司??；amidox；氨磷?。话被阴１?；氨柔比星；氨吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心蓮內(nèi)酯；血管發(fā)生抑制物；拮抗劑D；拮抗劑G；安雷利克斯；抗背部化形態(tài)發(fā)生蛋白-1；抗雄激素物質(zhì)，前列腺癌；抗雌激素物質(zhì)；抗腫瘤物質(zhì)；反義寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)物；細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)物；脫嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脫氨基酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司??；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司瓊；阿扎毒素；重氮酪氨酸；漿果赤霉素III衍生物；balanol；巴馬司他；BCR/ABL拮抗劑；苯佐利定；benzoylstaurosporine；β內(nèi)酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycinB；白樺脂酸；bFGF抑制物；比卡魯胺；比生群；bisaziridinylspermine；雙奈法德；bistratene A；比折來(lái)新；breflate；溴匹立明；布度鈦；buthionine sulfoximine；卡泊三醇；鈣感光蛋白C；喜樹(shù)堿衍生物；雀痘IL-2；卡培他濱；羧酸胺-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；軟骨衍生的抑制物；carzelesin；酪蛋白激酶抑制物(ICOS)；castanospermine；天蠶素B；西曲瑞克；chlorlns；磺胺氯喹喔啉；西卡前列素；順式-卟啉；克拉曲濱；氯米芬類似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他汀A4；考布他汀類似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托；collismycin 8；cryptophycinA衍生物；curacin A；環(huán)五蒽醌；cycloplatam；cypemycin；cytarabineocfosfate；溶細(xì)胞因子；cytostatin；達(dá)昔單抗；地西他濱；dehydrodidemnin B；地洛瑞林；地塞米松；dexifosfamide；右雷佐生；右維拉帕米；地吖醌；代代寧B；didox；diethylnorspermine；二氫-5-阿扎胞苷；二氫紫杉醇，9-；dioxamycin；聯(lián)苯螺莫司汀；多西紫杉醇；二十二烷醇；多拉司瓊；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycin SA；依布硒；依考莫司?。灰赖馗Ｐ?；依決洛單抗；依氟鳥(niǎo)氨酸；欖烯；乙嘧替氟；表柔比星；愛(ài)普列特；雌莫司汀類似物；雌激素激動(dòng)劑；雌激素拮抗劑；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯??；fluasterone；氟達(dá)拉濱；fluorodaunorunicin hydrochloride；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司?。籫adolinium texaphyrin；硝酸鎵；加洛他濱；加尼瑞克；明膠酶抑制物；吉西他濱；谷胱甘肽抑制物；hepsulfam；heregulin；環(huán)己二乙酰胺；金絲桃素；伊班膦酸；依達(dá)比星；艾多昔芬；伊決孟酮；伊莫福新；伊洛馬司他；imidazoacridones；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體抑制物；干擾素激動(dòng)劑；干擾素類；白介素；碘芐胍；碘阿霉素；甘薯苦醇，4-；伊羅普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrinB；伊他司瓊；jasplakinolide；kahalalide F；lamellarin-N triacetate；蘭瑞肽；新生霉素；來(lái)格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；來(lái)曲唑；白血病抑制因子；白血病α干擾素；亮丙瑞林+雌激素+黃體酮；亮丙瑞林；左旋四咪唑；利阿唑；線性聚胺類似物；親脂性二糖肽；親脂性鉑化合物；lissoclinamide 7；洛鉑；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼達(dá)明；洛索蒽醌；洛伐他??；洛索立賓；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；溶胞肽；美坦新；mannostatin A；馬立馬司他；馬索羅酚；maspin；基質(zhì)溶解因子抑制物；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物；美諾立爾；汞溴紅；美替瑞林；乙硫磷酶；滅吐靈；MIF抑制物；米非司酮；米替福新；米立司亭；錯(cuò)配的雙鏈RNA；米托胍腙；二溴衛(wèi)矛醇；絲裂霉素類似物；米托萘胺；米托毒素；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-皂草素；米托蒽醌；莫法羅??；莫拉司亭；單克隆抗體，人類絨毛促性腺激素；單磷酰基脂質(zhì)A+myobacterium細(xì)胞壁sk；莫哌達(dá)醇；多藥物抗性基因抑制物；基于多腫瘤抑制物1的治療；芥子抗癌試劑；mycaperoxideB；mycobacterial細(xì)胞壁提取物；myriaporone；N-乙?；啬橇?；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替噴；納洛酮+噴他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈達(dá)鉑；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性內(nèi)肽酶；尼魯米特；nisamycin；氮氧化物調(diào)節(jié)物；硝基氧抗氧化劑；nitrullyn；O6-苯甲基鳥(niǎo)嘌呤；奧曲肽；okicenone；寡核苷酸；奧那司酮；昂丹司瓊；昂丹司瓊；oracin；口細(xì)胞因子誘導(dǎo)物；奧馬鉑；奧沙特??；奧沙利鉑；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇類似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米磷酸；人參三醇；帕諾米芬；parabactin；帕折普??；天門(mén)冬酰胺酶；培得星；戊聚糖多硫酸鈉；噴司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；perillylalcohol；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸脂酶抑制物；picibanil；鹽酸匹魯卡品；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；血纖維蛋白溶酶原激活物抑制物；鉑復(fù)合物；鉑化合物；鉑-三胺復(fù)合物；卟菲爾鈉；甲基絲裂霉素；強(qiáng)的松；丙基二-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶體抑制物；基于蛋白A的免疫調(diào)節(jié)物；蛋白激酶C抑制物；蛋白激酶C抑制物，microalgal；蛋白酪氨酸磷酸酯酶抑制物；嘌呤核苷磷酸化酶抑制物；羥基茜草素；吡唑啉吖啶；磷酸吡哆醛血紅蛋白聚氧乙烯基結(jié)合物；raf拮抗劑；雷替曲塞；雷莫司瓊；ras法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制物；ras抑制物；ras-GAP抑制物；脫甲基的瑞替普??；rhenium Re 186etidronate；根霉素；核酶；RII維胺酯；羅谷亞胺；rohitukine；羅莫肽；羅喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1模擬物；司莫司汀；衰老衍生的抑制物1；有義寡核苷酸；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物；單鏈抗原結(jié)合蛋白；西佐喃；索布佐生；sodiumborocaptate；乙酸苯酯鈉；solverol；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素結(jié)合蛋白；索納明；sparfosic acid；spicamycin D；螺莫司?。籹plenopentin；spongistatin 1；角鯊胺；干細(xì)胞抑制物；干細(xì)胞分化抑制物；stipiamide；基質(zhì)降解酶抑制物；sulfinosine；超活性血管活性腸肽拮抗劑；suradista；蘇拉明，；swainsonine；合成糖胺聚糖；他莫司汀；三苯氧胺甲碘化物；?；悄就?；他扎羅??；tecogalan sodium；替加氟；tellurapyrylium；端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制物；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；tetrachlorodecaoxide；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模擬物；胸腺法新；促胸腺生成素受體激動(dòng)劑；胸腺曲南；甲狀腺刺激激素；tinethyl etiopurpurin；替拉扎明；二氯鈦省；topsentin；托瑞米芬；全能性干細(xì)胞因子；翻譯抑制物；維甲酸；三乙?；蜞奏?；曲西立濱；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司瓊；妥羅雄脲；酪氨酸激酶抑制物；tyrphostins；UBC抑制物；烏苯美司；泌尿生殖竇衍生的生長(zhǎng)抑制因子；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽；variolin B；載體系統(tǒng)，紅細(xì)胞基因治療；維拉雷瑣；藜蘆明；verdins；維替泊芬；長(zhǎng)春瑞濱；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎諾特?。徽勰徙K；zilascorb；和凈司他丁激動(dòng)劑。優(yōu)選的其他抗癌藥物是5-氟尿嘧啶和亞葉酸。

可以用于本發(fā)明的方法的治療性抗體的實(shí)例包括但不限于ZENAPAX

(daclizumab)(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)，其是用于防止急性的腎臟異體移植排斥的免疫抑制性、人源化抗CD25單克隆抗體；PANOREXTM，其是鼠抗17-IA細(xì)胞表面抗原IgG2a抗體(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC2，其是鼠抗獨(dú)特型(GD3epitope)IgG抗體(ImClone System)；IMC-C225，其是嵌合的抗EGFRIgG抗體(ImClone System)；VITAXINTM，其是人源化的抗-αVβ3整聯(lián)蛋白抗體(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；SmartM195，其是人源化的抗-CD33IgG抗體(Protein DesignLab/Kanebo)；LYMPHOCIDETM，其是人源化的抗-CD22IgG抗體(Immunomedics)；ICM3是人源化抗-ICAM3抗體(ICOS Pharm)；IDEC-114是靈長(zhǎng)化的抗-CD80抗體(IDEC Pharm/Mitsubishi)；IDEC-131是人源化抗-CD40L抗體(IDEC/Eisai)；IDEC-151，其是靈長(zhǎng)化的抗-CD4抗體(IDEC)；IDEC-152，其是靈長(zhǎng)化的抗-CD23抗體(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化的抗-CD3 IgG(Protein Design Lab)；5G1.1是人源化的抗-互補(bǔ)因子5(C5)抗體(Alexion Pharm)；D2E7是人源化的抗-TNF-α抗體(CAT/BASF)；CDP870是人源化的抗-TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151其是靈長(zhǎng)化的抗-CD4IgG1抗體(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4是人類抗-CD4IgG抗體(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化的抗-TNF-αIgG4抗體(Celltech)；LDP-02是人源化的抗-α4β7抗體(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化的抗-CD4IgG抗體(Ortho Biotech)；ANTOVATM是人源化的抗-CD40LIgG抗體(Biogen)；ANTEGRENTM是人源化的抗-VLA-4IgG抗體(Elan)；和CAT-152是人類抗-TGF-β2抗體(Cambridge Ab Tech)?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的治療性抗體的其他實(shí)例在表9中列出。
5.4.2自體免疫疾病和炎癥性疾病
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的變異Fc區(qū)，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性但降低所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親合性。具有這種結(jié)合特征的本發(fā)明的分子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，例如，抑制與自體免疫疾病或炎癥性疾病有關(guān)的免疫反應(yīng)方面是有用的。雖然不希望受任何作用機(jī)制的限制，具有對(duì)FcγRIIB增強(qiáng)的親合性和對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的親合性的本發(fā)明的分子能夠引起對(duì)FcγR的活化反應(yīng)的抑制和細(xì)胞應(yīng)答的抑制。

在某些實(shí)施方式中，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子不是免疫球蛋白，并包含至少一個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的分子，所述修飾提高所述變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性。在其他實(shí)施方式中，所述分子進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，所述修飾降低分子對(duì)活化性FcγR的親合性。在某些實(shí)施方式中，所述分子是可溶的(即，非膜結(jié)合的)Fc區(qū)。本發(fā)明預(yù)期在可溶Fc區(qū)內(nèi)的其他氨基酸修飾，其調(diào)節(jié)它對(duì)各種Fc受體的親合性，包括如在此描述的本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的那些。在其他實(shí)施方式中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和在此描述的技術(shù)修飾所述分子(例如，包含至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的Fc區(qū))來(lái)提高Fc區(qū)的體內(nèi)半衰期。這種分子在治療和/或預(yù)防自體免疫失調(diào)中具有治療實(shí)用性。雖然不希望受任何作用機(jī)制的限制，具有增強(qiáng)的FcγRIIB親合性的這種分子將引起對(duì)活化性受體的阻抑，因而引起免疫反應(yīng)的阻抑，并具有治療和/或預(yù)防自體免疫失調(diào)的治療效力。

在某些實(shí)施方式中，提高變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性但降低變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾包含在位置246用蘇氨酸以及在位置396用組氨酸替換；或在位置268用天冬氨酸以及在位置318用天冬氨酸替換；或在位置217用絲氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置408用精氨酸替換；或在位置375用半胱氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；或在位置246用異亮氨酸以及在位置334用天冬酰胺替換。在一個(gè)實(shí)施方式中，提高變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性但降低變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾包括在位置247用亮氨酸替換。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提高變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性但降低變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾包括在位置372用酪氨酸替換。在又一個(gè)實(shí)施方式中，提高變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性但降低變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾包括在位置326用谷氨酸替換。在一個(gè)實(shí)施方式中，提高變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIB的親合性但降低變異Fc區(qū)對(duì)FcγRIIIA的親合性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾包括在位置224用亮氨酸替換。

相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子具有對(duì)FcγRIIB增強(qiáng)的親合性以及對(duì)FcγRIII和/或FcγRIIA降低的親合性的變異Fc區(qū)可用于治療或預(yù)防自體免疫疾病或炎癥性疾病。本發(fā)明提供了在受試者中預(yù)防、治療或控制與自體免疫或炎癥性失調(diào)相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，包括向所述受試者施用治療或預(yù)防有效量的具有變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述變異Fc區(qū)具有對(duì)FcγRIIB增強(qiáng)的親合性以及對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的親合性。

本發(fā)明還提供了在受試者中預(yù)防、治療或控制與炎癥性失調(diào)相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，進(jìn)一步包括向所述受試者施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種抗炎癥試劑。本發(fā)明還提供了預(yù)防、治療或控制與自體免疫疾病相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，進(jìn)一步包括向所述受試者施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種免疫調(diào)節(jié)試劑。5.4.2.1節(jié)提供了抗炎癥試劑和免疫調(diào)節(jié)試劑的非限制性實(shí)例。

可以通過(guò)施用本發(fā)明的分子治療的自體免疫失調(diào)的實(shí)例包括但不限于，斑形脫發(fā)、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、抗磷脂綜合癥、自體免疫Addison’s病、腎上腺的自體免疫疾病、自身免疫性溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫卵巢炎和睪丸炎、自體免疫血小板減少、Behcet’s病、大皰天皰瘡、心肌炎、腹口炎性皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合癥(CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)病、Churg-Strauss綜合癥、瘢痕性天皰瘡、CREST綜合癥、冷凝集素病、Crohn’s病、盤(pán)狀狼瘡、基本混合的冷球蛋白血癥、fibromyalgia-纖維肌炎、血管球性腎炎、Graves’病、Guillain-Barre、Hashimoto’s甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、突發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA神經(jīng)病、少年關(guān)節(jié)炎、扁平苔癬、紅斑狼瘡、Ménière’s病、混合結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、1型或免疫介導(dǎo)的糖尿病、重癥肌無(wú)力、尋常天皰瘡、惡性貧血、多發(fā)性結(jié)節(jié)性動(dòng)脈炎、polychrondritis、多腺綜合癥、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發(fā)丙種球蛋白缺乏癥、夏科氏肝硬變、牛皮癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、Raynauld’s現(xiàn)象、Reiter’s綜合癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮癥、

綜合癥、全身肌強(qiáng)直綜合癥、全身性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、takayasu動(dòng)脈炎、temporal arteristis/巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、vasculitides例如皰疹樣皮炎、脈管炎、白斑病和Wegener’s肉芽腫病。炎癥性失調(diào)的實(shí)例包括但不限于，哮喘、encephilitis、炎癥性腸病、慢性阻塞性肺病(COPD)、變應(yīng)性紊亂、膿毒性休克、肺纖維化、未分化的spondyloarthropathy、未分化的關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)炎、炎癥性骨質(zhì)溶解和由長(zhǎng)期的病毒或細(xì)菌感染引起的慢性炎癥。如在此的2.2.2節(jié)中描述的，某些自體免疫失調(diào)與炎癥性狀況相關(guān)。因而，存在著被認(rèn)為是自體免疫失調(diào)和炎癥性失調(diào)的重疊。因此，某些自體免疫失調(diào)也可能被表征為炎癥性失調(diào)。可以根據(jù)本發(fā)明的方法預(yù)防、治療或控制的炎癥性失調(diào)的實(shí)例包括但不限于，哮喘、encephilitis、炎癥性腸病、慢性阻塞性肺病(COPD)、變應(yīng)性紊亂、膿毒性休克、肺纖維化、未分化的spondyloarthropathy、未分化的關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)炎、炎癥性骨質(zhì)溶解和由長(zhǎng)期的病毒或細(xì)菌感染引起的慢性炎癥。

具有變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子也可以用于降低患有炎癥性失調(diào)的動(dòng)物、特別是哺乳動(dòng)物所經(jīng)歷的炎癥，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述變異Fc區(qū)具有對(duì)FcγRIIB增強(qiáng)的親合性和對(duì)FcγRIIIA降低的親合性。在特定的實(shí)施方式中，相對(duì)于沒(méi)有施用本發(fā)明的分子的動(dòng)物中的炎癥，本發(fā)明的分子降低動(dòng)物中的炎癥至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。

具有變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子也可以用于預(yù)防移植排斥，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述變異Fc區(qū)具有對(duì)FcγRIIB增強(qiáng)的親合性和對(duì)FcγRIIIA降低的親合性。

本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期工程化本領(lǐng)域已知用于治療和/或預(yù)防自體免疫疾病或炎癥性疾病的任何抗體，從而所述抗體包含變異Fc區(qū)，所述變異Fc區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，其通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定來(lái)具有相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子對(duì)FcγRIIB增強(qiáng)的親合性和對(duì)FcγRIIIA降低的親合性?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明工程化的、用于炎癥性失調(diào)的治療或預(yù)防的抗體的非限制性實(shí)例在表10A中呈現(xiàn)，用于自體免疫失調(diào)的治療或預(yù)防的抗體的非限制性實(shí)例在表10B中呈現(xiàn)。
表10A可以根據(jù)本發(fā)明工程化的用于炎癥性疾病和自體免疫疾病的抗體 附圖10B可以根據(jù)本發(fā)明工程化的用于自體免疫失調(diào)的抗體 5.4.2.1免疫調(diào)節(jié)試劑和抗炎癥試劑
本發(fā)明提供了治療自體免疫疾病和炎癥性疾病的方法，包括連同其他治療試劑一起施用具有變異Fc區(qū)的分子，所述變異Fc區(qū)具有對(duì)FcγRIIB增強(qiáng)的親合性和對(duì)FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的親合性。免疫調(diào)節(jié)試劑的實(shí)例包括但不限于，methothrexate、ENBREL、REMICADETM、leflunomide、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素A和大環(huán)內(nèi)酯抗生素(例如，F(xiàn)K506(tacrolimus))、甲基強(qiáng)的松龍(MP)、皮質(zhì)類固醇、steriods、mycophenolate mofetil、雷帕霉素(sirolimus)、mizoribine、deoxyspergualin、brequinar、malononitriloamindes(例如，leflunamide)、T細(xì)胞調(diào)節(jié)物和細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)物。

抗炎癥試劑已經(jīng)在炎癥性和自體免疫失調(diào)的治療中展現(xiàn)了成功，現(xiàn)在是這些失調(diào)的常規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的療法。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何抗炎癥試劑都可以用于本發(fā)明的方法?？寡装Y試劑的非限制性實(shí)例包括非甾族抗炎藥物(NSAID)、甾族的抗炎藥物、beta-激動(dòng)劑、anticholingeric試劑和甲基黃嘌呤。NSAID的實(shí)例包括但不限于阿斯匹林、布洛芬、celecoxib(CELEBREXTM)、diclofenac(VOLTARENTM)、etodolac(LODINETM)、fenoprofen(NALFONTM)、indomethacin(INDOCINTM)、ketoralac(TORADOLTM)、oxaprozin(DAYPROTM)、nabumentone(RELAFENTM)、sulindac(CLINORILTM)、tolmentin(TOLECTINTM)、rofecoxib(VIOXXTM)、naproxen(ALEVETM、NAPROSYNTM)、ketoprofen(ACTRONTM)和nabumetone(RELAFENTM)。這些NSAID通過(guò)已知的環(huán)氧合酶(例如，COX-1和/或COX-2)來(lái)起作用。甾族抗炎藥物的實(shí)例包括但不限于，糖皮質(zhì)激素、地塞米松(DECADRONTM)、可的松、氫化可的松、脫氫可的松(DELTASONETM)、氫化潑尼松、氟羥脫氫皮質(zhì)醇、柳氮磺胺吡啶和類花生酸類物質(zhì)(eicosanoids)例如前列腺素、凝血烷和白細(xì)胞三烯。
5.4.3傳染性疾病
本發(fā)明還涵蓋在受試者中治療或預(yù)防傳染性疾病的方法，包括施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的分子?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明的分子治療或預(yù)防的傳染性疾病是由傳染原，包括但不限于病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒引起的。

可以使用本發(fā)明的分子連同本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的病毒疾病包括但不限于，由A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流感、水痘、腺病毒、單純性皰疹I(lǐng)型(HSV-I)、單純性皰疹I(lǐng)I型(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多泡病毒、巨細(xì)胞病毒、echinovirus、蟲(chóng)媒病毒、huntavirus、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、骨髓灰白質(zhì)炎病毒、小痘、Epstein Barr病毒、人類免疫缺陷性病毒I型(HIV-I)、人類免疫缺陷性病毒II型(HIV-II)，和病毒疾病例如viral miningitis、腦炎、登革熱或小痘的病原體引起的那些。

可以使用本發(fā)明的分子連同本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的、起因于細(xì)菌的細(xì)菌疾病包括但不限于，分支桿菌立克次氏體、支原體、奈瑟氏菌屬、S.pneumonia、Borrelia burgdorferi(Lyme病)、Bacillusantracis(炭疽)、破傷風(fēng)、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、分枝桿菌屬、破傷風(fēng)、pertissus、霍亂、瘟疫、diptheria、衣原體、S.aureus和legionella。

可以使用本發(fā)明的分子連同本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的、起因于原生動(dòng)物的原生動(dòng)物疾病包括但不限于，利什曼蟲(chóng)、kokzidioa、錐蟲(chóng)屬或瘧疾。

可以使用本發(fā)明的分子連同本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的、起因于寄生蟲(chóng)的寄生蟲(chóng)疾病包括但不限于，衣原體和立克次氏體。。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子具有針對(duì)傳染原，例如，病原性蛋白的增強(qiáng)的抗體效應(yīng)物功能。傳染原的實(shí)例包括但不限于細(xì)菌(例如Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecials，Candida albicans，Proteus vulgaris，Staphylococcus viridans，and Pseudomonas aeruginosa)，病原體(例如B-親淋巴性的乳多空病毒(LPV)；Bordatella pertussis；Borna病病毒(BDV)；牛冠狀病毒；脈絡(luò)叢腦膜炎病毒；登革熱病毒；病毒，E.coli；Ebola；艾柯病毒1；艾柯病毒-11(EV)；內(nèi)毒素(LPS)；腸細(xì)菌；腸孤兒病毒；腸道病毒；貓白血病毒；口蹄疫病毒；長(zhǎng)臂猿猿白血病毒(GALV)；革蘭氏陰性細(xì)菌；Heliobacter pylori；乙型肝炎病毒(HBV)；單純性皰疹病毒；HIV-1；人類巨細(xì)胞病毒；人類冠狀病毒；流感A、B&C；Legionella；Leishmania mexicana；Listeriamonocytogenes；麻疹病毒；腦膜炎球菌；麻疹病毒；小鼠肝炎病毒；鼠白血病毒；鼠γ皰疹病毒；鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒；鼠冠狀病毒小鼠肝炎病毒；鳥(niǎo)分枝桿菌-M；淋病奈瑟氏菌；新城疫病毒；細(xì)小病毒B19；惡性瘧原蟲(chóng)；痘病毒；假單胞菌；輪狀病毒；Samonella typhiurium；志賀氏菌；鏈球菌；T細(xì)胞親淋巴性的病毒1；牛痘病毒)。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子通過(guò)增強(qiáng)對(duì)引起傳染性疾病的傳染原的吞噬作用和/或調(diào)理作用來(lái)增強(qiáng)傳染性疾病治療的效力。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子通過(guò)增強(qiáng)對(duì)引起傳染性疾病的受感染細(xì)胞的ADCC來(lái)增強(qiáng)傳染性疾病治療的效力。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于治療或預(yù)防傳染性疾病的、治療或預(yù)防有效量的一種或額外的治療藥劑組合施用。本發(fā)明預(yù)期使用本發(fā)明的分子與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于治療和/或預(yù)防傳染性疾病的抗生素組合。可用于與本發(fā)明的分子組合的抗生素包括但不限于，大環(huán)內(nèi)酯(例如，托普霉素(Tobi

))，頭孢菌素(例如，頭孢氨芐(Keflex

)，頭孢霉定(Velosef

)，頭孢呋辛(Ceftin

)，頭孢羅齊(Cefzil

)，頭孢可克洛(Ceclor

)，頭孢克肟(Suprax

)或頭孢羥氨芐(Duricef

))，克拉霉素(例如，克拉霉素(Biaxin

))，紅霉素(例如，紅霉素(EMycin

))，青霉素(例如，青霉素V(V-Cillin K

或Pen Vee K

))或喹諾酮(例如，氧氟沙星(Floxin

)，環(huán)丙沙星(Cipro

)或諾氟沙星(Noroxin

))，氨基糖苷類抗生素(例如，安普霉素、阿貝卡星、班貝霉素、丁胺菌素、地貝卡星、新霉素、新霉素、十一碳烯酸酯、奈替米星、巴龍霉素、核糖霉素、紫蘇霉素和奇霉素)，酰胺醇抗生素(例如，疊氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考和甲砜氯霉素)、利福抗生素(例如，利福酰胺和利福平)、碳頭孢烯類(例如，氯碳頭孢)、碳青霉素烯類(例如，比阿培南和亞胺培南)、頭孢菌素(例如，頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢羥唑、頭孢曲嗪、頭孢西酮、頭孢唑蘭、頭孢咪唑、頭孢匹胺和頭孢匹羅)、頭霉素類(例如，頭孢拉宗、頭孢美他唑、和頭孢米諾)，單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(例如，氨曲南、卡蘆莫南和替吉莫南)、氧頭孢烯類(例如，氟氧頭孢和拉氧頭孢)、青霉素類(例如氮卓西林、匹伏基氮卓西林、阿莫西林、巴氨西林、芐青霉素酸、芐青霉素鈉、依匹西林、芬貝西林、氟氯西林、培那西林、penethamate hydriodide、盤(pán)尼西林o-苯乙芐胺、青霉素0、青霉素V、芐星青霉素V、青霉素Vhydrabamine、青哌四環(huán)素和phencihicillin potassium)、lincosamides(例如，氯林肯霉素、和林肯霉素)、安福霉素、桿菌肽、卷曲霉素、粘菌素、持久殺霉素、恩維霉素、四環(huán)素類(例如，阿哌環(huán)素、氯四環(huán)素、氯莫環(huán)素、和地美環(huán)素)、2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)、硝基呋喃類(例如，呋喃它酮和呋噻咪唑氯)、喹諾酮類和其類似物(例如西諾沙星、克林沙星、氟甲喹和grepagloxacin)、磺胺類(例如，乙?；前坊拎?、苯甲基磺胺、諾丙磺胺、鄰苯二酰基磺胺醋酰、磺胺柯定和sulfacytine)、砜(例如，地百里砜、葡糖砜鈉和苯丙砜)、環(huán)絲氨酸、莫匹羅星和抗結(jié)核菌素。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子可以與治療或預(yù)防有效量一種或多種抗真菌劑一同施用?？捎糜谂c本發(fā)明的分子組合的抗真菌劑包括但不限于兩性霉素B、依曲康唑、酮康唑、氟康唑、膜內(nèi)的、氟胞嘧啶、咪康唑、布康唑、克霉唑、制霉菌素、特康唑、噻康唑、環(huán)吡酮、益康唑、鹵丙烷、萘替芬、特比萘芬、十一烯酸酯和灰黃霉素。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子可以與治療或預(yù)防有效量一種或多種抗病毒劑一同施用?？捎糜谂c本發(fā)明的分子組合的有用的抗病毒劑包括但不限于，蛋白酶抑制物、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物和核苷類似物?？共《緞┑膶?shí)例包括但不限于，疊氮胸苷、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷、gangcyclovir、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷和病毒唑，以及膦甲酸、金剛烷胺、金剛烷乙胺、沙奎那韋、茚地那韋、安潑那韋、洛匹那韋、利托那韋、alpha干擾素；阿德福韋、clevadine、恩替卡韋、普來(lái)可那立。
5.5疫苗治療
本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋使用本發(fā)明的組合物來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)抗原或免疫原的免疫反應(yīng)，包括但不限于，癌癥抗原和傳染性疾病抗原(其實(shí)例在下文公開(kāi))。本發(fā)明的疫苗組合物包含一種或多種抗原或免疫原，針對(duì)它們的免疫反應(yīng)是期望的，其中所述一種或多種抗原或免疫原被包被具有增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性的、本發(fā)明的變異抗體。雖然不希望受特定作用機(jī)制的限制，用具有增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性的本發(fā)明的變異抗體包被抗原或免疫原，通過(guò)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)增強(qiáng)了對(duì)期望的抗原或免疫原的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的疫苗組合物在引發(fā)免疫反應(yīng)、特別是針對(duì)抗原或免疫原的保護(hù)性免疫反應(yīng)方面是特別有效的。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗組合物中的抗原或免疫原包括病毒，針對(duì)所述病毒的免疫反應(yīng)是期望的。病毒可以是重組或嵌合的，優(yōu)選的是減毒的。重組、嵌合和減毒的病毒的生產(chǎn)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明涵蓋根據(jù)本發(fā)明配制的活重組病毒疫苗或滅活重組病毒疫苗。活疫苗是優(yōu)選的，因?yàn)樵谒拗髦械脑鲋钞a(chǎn)生與自然感染中發(fā)生的相類似的種類和數(shù)量的延長(zhǎng)的刺激，因而賦予了相當(dāng)?shù)?、持久的免疫性。這種活重組病毒疫苗制劑的生產(chǎn)可以使用常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)，包括在細(xì)胞培養(yǎng)物或雞胚的尿囊中增殖病毒隨后純化。

在特定的實(shí)施方式中，重組病毒對(duì)于施用它的受試者是非致病的。在這點(diǎn)上，使用為疫苗目的遺傳工程化的病毒需要這些毒株中減毒特征的存在。向用于轉(zhuǎn)染的模板中導(dǎo)入合適的突變(例如，刪除)可以提供具有減毒特征的新的病毒。例如，可以進(jìn)行與溫度敏感性或冷適應(yīng)相關(guān)的特定錯(cuò)義突變變成刪除突變。這些突變應(yīng)當(dāng)比與冷或溫度敏感突變體相關(guān)的點(diǎn)突變更穩(wěn)定，并且回復(fù)頻率應(yīng)當(dāng)極其低。用于工程化重組病毒的重組DNA技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并涵蓋在本發(fā)明中。例如，修飾負(fù)鏈RNA病毒的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,166,057，通過(guò)完全引用將它合并在此。

做為選擇，可以構(gòu)建具有“自殺”特征的嵌合病毒用于本發(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑。這種病毒在宿主內(nèi)將僅經(jīng)歷一輪或幾輪復(fù)制。當(dāng)用作疫苗時(shí)，重組病毒將經(jīng)歷有限的復(fù)制循環(huán)，并誘導(dǎo)足夠水平的免疫反應(yīng)，但它不會(huì)在人類宿主中走得更遠(yuǎn)和引起疾病。做為選擇，根據(jù)本發(fā)明可以配制滅活的(殺死的)病毒。使用常規(guī)技術(shù)來(lái)“殺死”嵌合病毒可以制備滅活疫苗制劑。在它們的傳染性被破壞的意義上，滅活疫苗是“死的”。理想地，病毒的傳染性被破壞而不影響它的免疫原性。為了制備滅活疫苗，可以在細(xì)胞培養(yǎng)物或雞胚的尿囊中生長(zhǎng)嵌合病毒，通過(guò)區(qū)域超速離心法純化、通過(guò)甲醛或β-丙內(nèi)酯來(lái)滅活，并集中。

在某些實(shí)施方式中，完全外源的表位，包括來(lái)自其他病毒或非病毒病原體的抗原，可以被工程化到病毒中用于本發(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑。例如，非相關(guān)病毒的抗原，例如HIV(gp160、gp120、gp41)、寄生蟲(chóng)抗原(例如，瘧疾)、細(xì)菌或真菌抗原或腫瘤抗原可以被工程化到減毒的毒株中。

實(shí)際上任何異源基因序列都可以被構(gòu)建入本發(fā)明的嵌合病毒用于皮內(nèi)疫苗制劑。優(yōu)選的，異源基因序列是作用生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物的部分和肽。優(yōu)選的，誘導(dǎo)針對(duì)任何各種病原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)的表位、或結(jié)合中和抗體的抗原，可以被嵌合病毒或作為嵌合病毒的部分表達(dá)。例如，可以被構(gòu)建入本發(fā)明的嵌合病毒的異源基因序列包括但不限于，流感和副流感血球凝集素神經(jīng)氨糖酸苷酶和融合糖蛋白例如人類PIV3的HN和F基因。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以被工程化入嵌合病毒的異源基因序列包括編碼具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)的那些。免疫調(diào)節(jié)蛋白的實(shí)例包括但不限于，細(xì)胞因子、1型干擾素、γ干擾素、集落刺激因子、白細(xì)胞介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、12，和這些試劑的拮抗劑。

在再其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋病原性的細(xì)胞或病毒，優(yōu)選的減毒病毒，其在它們的表面表達(dá)變異抗體。

在可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗組合物包含融合多肽，其中抗原或免疫原可操作地連接到具有增強(qiáng)的FcγRIIIA親合性的本發(fā)明的變異抗體。使用常規(guī)DNA重組技術(shù)方法進(jìn)行用于本發(fā)明的疫苗組合物的融合多肽的工程化，處于普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋通過(guò)施用本發(fā)明的組合物在受試者中誘導(dǎo)耐受性的方法。優(yōu)選的，適合于在受試者中誘導(dǎo)耐受性的組合物包含包被了本發(fā)明的變異抗體的抗原或免疫原，其中所述變異抗體具有對(duì)FcγRIIB更高的親合性。雖然不希望受特定作用機(jī)制的限制，通過(guò)活化FcγRIIB介導(dǎo)的抑制途徑，這種組合物在誘導(dǎo)耐受性方面是有效的。
5.6組合物和施用方法
本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的分子(即，抗體、多肽)的方法和藥物組合物，所述分子包含變異Fc區(qū)。本發(fā)明還提供了通過(guò)向受試者施用有效量的本發(fā)明的融合蛋白或軛合的分子、或包含本發(fā)明的融合蛋白或軛合的分子的藥物組合物來(lái)治療、預(yù)防和改善與疾病、失調(diào)或感染相關(guān)的一種或多種癥狀的方法。在優(yōu)選的方面，抗體、融合蛋白或軛合的分子是基本上純的(即，基本上不含限制它的效果或產(chǎn)生不期望的副作用的物質(zhì))。在特定的實(shí)施方式中，受試者是動(dòng)物，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物，例如非靈長(zhǎng)類(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠，等等)和靈長(zhǎng)類(例如，猴，如cynomolgous猴和人類)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試者是人。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體來(lái)自與受試者相同的物種。

各種遞送系統(tǒng)是已知的，可以用于施用包含本發(fā)明的分子(即，抗體、多肽)的組合物，本發(fā)明的分子包含變異Fc區(qū)，例如，封裝在脂質(zhì)體、微粒、微囊、能表達(dá)抗體或融合蛋白的重組細(xì)胞中，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見(jiàn)，例如Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，構(gòu)建核酸作為逆病毒或其他載體的部分，等等。施用本發(fā)明的分子的方法包括但不限于，腸胃外施用(例如，皮內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的和皮下的)、硬膜外的和粘膜的(例如，鼻內(nèi)和口腔途徑)。在特定實(shí)施方式中，肌肉內(nèi)地、靜脈內(nèi)地或皮下地施用本發(fā)明的分子?？梢酝ㄟ^(guò)任何便利的途徑施用組合物，例如，通過(guò)輸注或彈丸注射，通過(guò)上皮或粘膜皮膚內(nèi)層(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜，等等)的吸收，并且可以與其他生物活性試劑一同施用。施用可以是全身性或局部的。此外，也可以采用肺部施用，例如，通過(guò)使用吸入器或噴霧器，和具有霧化試劑的制劑。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公開(kāi)No.WO92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO99/66903，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

本發(fā)明還提供了，包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子(例如，抗體、多肽)被封裝在標(biāo)明了抗體數(shù)量的密閉容器例如安瓿瓶或小袋中。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子作為密閉容器中的干燥滅菌凍干粉劑或無(wú)水濃縮物來(lái)提供，并可以用例如水或鹽水重構(gòu)成合適的濃度用于向受試者施用。優(yōu)選的，本發(fā)明的分子以至少5mg、更優(yōu)選的至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、或至少75mg的單位劑量在密閉容器中作為干燥的無(wú)菌凍干粉劑來(lái)提供。凍干的本發(fā)明的分子應(yīng)在它們的原始的容器中存儲(chǔ)在2到8℃之間，分子應(yīng)當(dāng)在重構(gòu)后12小時(shí)、優(yōu)選的6小時(shí)、5小時(shí)、3小時(shí)、或1小時(shí)之內(nèi)施用。在可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子在標(biāo)明所述分子、融合蛋白或軛合分子的數(shù)量和濃度的密閉容器中以液體形式提供。優(yōu)選的，本發(fā)明的分子的液體形式以至少1mg/ml、更優(yōu)選的至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml所述分子在密閉容器中提供。

在治療、預(yù)防或改善與失調(diào)相關(guān)的一種或多種癥狀中有效的本發(fā)明的組合物的數(shù)量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)來(lái)測(cè)定。在制劑中采用的準(zhǔn)確劑量也將取決于給藥途徑、狀況的嚴(yán)重度，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)師的判斷和每個(gè)患者的環(huán)境來(lái)決定。有效的劑量可以從來(lái)源于體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線推斷。

對(duì)于本發(fā)明涵蓋的抗體，向患者施用的劑量一般是0.0001mg/kg到100mg/kg患者體重。優(yōu)選的，向患者施用的劑量在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg、0.0001mg/kg到0.25mg/kg、0.0001到0.15mg/kg、0.0001到0.10mg/kg、0.001到0.5mg/kg、0.01到0.25mg/kg或0.01到0.10mg/kg患者體重之間。一般地，由于對(duì)外源多肽的免疫反應(yīng)，人類抗體在人體內(nèi)比來(lái)自其他物種的抗體具有更長(zhǎng)的半衰期。因而，降低劑量的人類抗體和較低頻率的施用常常是可能的。進(jìn)一步的，通過(guò)修飾例如脂質(zhì)化來(lái)增強(qiáng)抗體的攝取和組織穿透性，可以降低本發(fā)明的抗體或其片段的施用劑量和頻率。

在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)用作單試劑治療時(shí)，向患者施用的本發(fā)明的分子的劑量是0.01mg到1000mg/天。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子用于與其他治療組合物組合，向患者施用的劑量比所述分子用作單試劑治療時(shí)的更低。

在特定的實(shí)施方式中，期望的是局部地向需要治療的區(qū)域施用本發(fā)明的藥物組合物；這可以通過(guò)，例如但不是限制，局部輸注、通過(guò)注射、或通過(guò)植入物的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述植入物是多孔的、無(wú)孔的或凝膠狀材料，包括膜，例如sialastic膜，或纖維。優(yōu)選的，當(dāng)施用本發(fā)明的分子時(shí)，必須小心使用不吸附所述分子的材料。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物可以在囊、特別是脂質(zhì)體中遞送(參見(jiàn)Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat et al.，inLiposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，ibid.，pp.317-327；一般地參見(jiàn)同上)。

在又一個(gè)實(shí)施方式中，組合物可以在控釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)中遞送。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)可以用于生產(chǎn)包含一種或多種本發(fā)明的分子的持續(xù)釋放制劑。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.4,526,938；PCT公開(kāi)WO 91/05548；PCT公開(kāi)WO 96/20698；Ning et al.，1996，“Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon CancerXenograft Using a Sustained-Release Gel，”Radiotherapy&Oncology39179-189，Song et al.，1995，“Antibody Mediated Lung Targeting ofLong-Circulating Emulsions，”P(pán)DA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50372-397；Cleek et al.，1997，“Biodegradable PolymericCarriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application，”P(pán)ro.Iht’l.SFmp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854；和Lam et al.，1997，“Microencapsulation of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody for Local Delivery，”P(pán)roc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24759-760，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。在一個(gè)實(shí)施方式中，泵可以用于控釋系統(tǒng)(參見(jiàn)Langer，supra；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.1420；Buchwald et al.，1980，Surgery88507；和Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，聚合材料可以用于實(shí)現(xiàn)抗體的控釋。(參見(jiàn)，例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen andBall(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；還參見(jiàn)Levy et al.，1985，Science 228190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71105)；美國(guó)專利No.5,679,377；美國(guó)專利No.5,916,597；美國(guó)專利No.5,912,015；美國(guó)專利No.5,989,463；美國(guó)專利No.5,128,326；PCT公開(kāi)No.WO 99/15154；和PCT公開(kāi)No.WO 99/20253)。用于持續(xù)釋放制劑的聚合物的實(shí)例包括但不限于，但不限于聚(2-羥基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-co-乙烯基醋酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙二醇類(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)，和polyorthoesters。在又一個(gè)實(shí)施方式中，控釋系統(tǒng)可以置于治療目標(biāo)(例如，肺)附近，因而僅需要全身性劑量的一部分(參見(jiàn)，例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)Dunnet al.(參見(jiàn)U.S.5,945,155)使用作為控釋植入物有用的聚合的組合物。這種特殊方法是基于來(lái)自聚合物系統(tǒng)的生物活性材料的原位受控釋放的治療效果。植入一般可以在需要治療的患者體內(nèi)任何位置進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用非聚合的持續(xù)釋放系統(tǒng)，其中受試者體內(nèi)的非聚合的植入物被用作藥物遞送系統(tǒng)。在植入體內(nèi)之時(shí)，植入物的有機(jī)溶劑將從組合物中消散、分散或浸出到周?chē)慕M織液，非聚合材料將逐漸地凝結(jié)或沉淀來(lái)形成固體的、多微孔的基質(zhì)(參見(jiàn)U.S.5,888,533)。

在Langer的綜述(1990，Science 2491527-1533)中討論了控釋系統(tǒng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)可以用于生產(chǎn)包含一種或多種本發(fā)明的治療試劑的持續(xù)釋放制劑。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利No.4,526,938；國(guó)際公開(kāi)No.WO 91/05548和WO 96/20698；Ning et al.，1996，Radiotherapy&Oncology 39179-189；Song et al.，1995，PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology 50372-397；Cleek etal.，1997，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854；和Lam et al.，1997，Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24759-760，通過(guò)完全引用將它們每一個(gè)合并在此。

在特定的實(shí)施方式中，其中本發(fā)明的組合物是編碼抗體的核酸，所述核酸可以體內(nèi)施用來(lái)促進(jìn)它編碼的抗體的表達(dá)，通過(guò)將所述核酸構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的部分并施用，使它成為細(xì)胞內(nèi)的，例如，通過(guò)施用逆病毒載體(參見(jiàn)美國(guó)專利No.4,980,286)，或通過(guò)直接注射，同通過(guò)使用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)，或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包被，或通過(guò)連接到已知進(jìn)入核內(nèi)的間源盒樣肽來(lái)施用它(參見(jiàn)，例如，Joliot et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868)等等。做為選擇，可以通過(guò)同源重組將核酸細(xì)胞內(nèi)地導(dǎo)入并摻入宿主細(xì)胞DNA中用于表達(dá)。

對(duì)于抗體，向受試者施用的治療或預(yù)防有效劑量一般是0.1mg/kg到200mg/kg受試者體重。優(yōu)選的，向受試者施用的劑量在0.1mg/kg和20mg/kg受試者體重之間，更優(yōu)選的向受試者施用的劑量在1mg/kg到10mg/kg受試者體重之間。進(jìn)一步的，通過(guò)修飾例如脂質(zhì)化來(lái)增強(qiáng)抗體或融合蛋白的攝取和組織穿透性(例如，進(jìn)入肺)，也可以降低本發(fā)明的抗體的施用劑量和頻率。

用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的分子治療受試者可以包括單次治療，或優(yōu)選的包括系列的治療。在優(yōu)選的實(shí)施例中，在約0.1到30mg/kg體重的范圍內(nèi)，每周一次地持續(xù)約1到10周之間、優(yōu)選的2到8周之間、更優(yōu)選的約3到7周之間、再更優(yōu)選的約4、5或6周，用本發(fā)明的分子治療受試者。在其他實(shí)施方式中，每天一次、每天兩次、或每天三次地施用本發(fā)明的藥物組合物。在其他實(shí)施方式中，每周一次、每周兩次、每?jī)芍芤淮?、每月一次、每六周一次、每?jī)稍乱淮?、每年兩次或每年一次地施用藥物組合物。還要理解的是，用于治療的分子的有效劑量可以在特定治療的過(guò)程中提高或降低。
5.6.1藥物組合物
本發(fā)明的組合物包括在藥物組合物的制造中有用的散裝藥物組合物(例如，不純的或非無(wú)菌的組合物)和可用于單位劑型的制備的藥物組合物(即，適合于向受試者或患者施用的組合物)。這種組合物包含預(yù)防或治療有效量的在此公開(kāi)的預(yù)防或治療試劑，或這些試劑和藥學(xué)上可接受的載體的組合。優(yōu)選的，本發(fā)明的組合物包含預(yù)防或治療有效量的一種或多種本發(fā)明的分子和藥學(xué)上可接受的載體。

在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含治療有效量一種或多種包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子，其中所述變異Fc區(qū)以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，和/或所述變異Fc區(qū)比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更有效至少1倍地介導(dǎo)效應(yīng)物功能，和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物包含治療有效量的一種或多種包含變異Fc區(qū)的本發(fā)明的分子，其中所述變異Fc區(qū)以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性結(jié)合FcγRIIIA，并且所述變異Fc區(qū)以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子結(jié)合FcγRIIB更低的親合性結(jié)合FcγRIIB，和/或所述變異Fc區(qū)比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更有效至少1倍地介導(dǎo)效應(yīng)物功能，和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含一種或多種抗癌試劑。

本發(fā)明還涵蓋包含特異于特定癌癥抗原的治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，所述治療性抗體包含根據(jù)本發(fā)明確定的Fc區(qū)中的一種或多種氨基酸修飾。

在特定的實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或在美國(guó)藥典或其他一般公認(rèn)的藥典中列出的，用于動(dòng)物、更特別地用于人類。術(shù)語(yǔ)“載體”是指稀釋劑、佐劑(例如，F(xiàn)reund’s佐劑(完全的和不完全的)、賦形劑或載體(vehicle)，伴隨它們施用治療劑。這種藥物載體可以是無(wú)菌的液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的那些，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)靜脈內(nèi)地施用藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可以被用作液體載體，特別是對(duì)于可注射的溶液。適合的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、碳酸鈣、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果希望，合物也可包含少量的濕潤(rùn)或乳化劑、或pH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳劑、片劑、藥丸、膠囊劑、粉劑、持續(xù)釋放的制劑等形式。

一般地，在單位劑型中分別地或混合地提供本發(fā)明的組合物的成分，例如，在密閉容器例如標(biāo)明了活性試劑數(shù)量的安瓿瓶或者小袋中，作為干燥的凍干粉末或無(wú)水的濃縮物。當(dāng)通過(guò)輸注來(lái)施用組合物時(shí)，可以用含有無(wú)菌的藥物級(jí)水或鹽水的輸液瓶進(jìn)行配藥。當(dāng)通過(guò)注射施用組合物時(shí)，可以提供滅菌注射水或鹽水的安瓿瓶以便在施用前將配料混合。

本發(fā)明的組合物可以被配制為中性的或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于，與例如來(lái)自鹽酸、磷、乙酸、草酸、酒石酸等等的陰離子形成的那些，和與例如來(lái)自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的陽(yáng)離子形成的那些。
5.6.2基因治療
在特定的實(shí)施方式中，施用包含編碼本發(fā)明的分子的序列的核酸，通過(guò)基因治療的方法來(lái)治療、預(yù)防或改善與疾病、失調(diào)或感染相關(guān)的一種或多種癥狀?；蛑委熓侵竿ㄟ^(guò)向受試者施用表達(dá)的或可表達(dá)的核酸來(lái)進(jìn)行的治療。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式中，核酸產(chǎn)生它們編碼的抗體或融合蛋白，所述抗體或融合蛋白介導(dǎo)治療或預(yù)防效果。

本領(lǐng)域中可用的基因治療的任何方法都可以根據(jù)本發(fā)明使用。示范性的方法描述如下。

對(duì)于基因治療的方法的一般性綜述，參見(jiàn)Goldspiel et al.，1993，Clinical Pharmacy 12488-505；Wu and Wu，1991，Biotherapy387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，Science 260926-932(1993)；和Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)155-215。在Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，NY(1993)；and Kriegler，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中描述了DNA重組技術(shù)領(lǐng)域一般已知的、可以使用的方法。

在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的組合物包含編碼抗體的核酸，所述核酸是表達(dá)載體的部分，所述表達(dá)載體在適合的宿主中表達(dá)所述抗體。特別地，這種核酸具有可操作地與抗體編碼區(qū)連接的啟動(dòng)子、優(yōu)選的異源啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的或組成型的，任選的，是組織特異性的。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，使用核酸分子，在所述核酸分子中，抗體編碼序列和任何其他期望的序列側(cè)翼是促進(jìn)基因組中期望位點(diǎn)處的同源重組的區(qū)域，因而提供了所述抗體編碼核酸的染色體內(nèi)的表達(dá)(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；and Zijlstra et al.，1989，Nature 342435-438)。

在另一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的組合物包含編碼融合蛋白的核酸，所述核酸是表達(dá)載體的一部分，所述表達(dá)載體在適合的宿主中表達(dá)所述融合蛋白。特別地，這種核酸具有可操作地與融合蛋白的編碼區(qū)連接的啟動(dòng)子、優(yōu)選的異源啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的或組成型的，任選的，是組織特異性的。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，使用核酸分子，在所述核酸分子中，融合蛋白編碼序列和任何其他期望的序列側(cè)翼是促進(jìn)基因組中期望位點(diǎn)處的同源重組的區(qū)域，因而提供了所述融合蛋白的染色體內(nèi)的表達(dá)。

遞送核酸到受試者中可以是直接的，在這種情況下，受試者直接暴露于所述核酸或攜帶核酸的載體，或者是間接的，在這種情況下，首先用所述核酸體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植到受試者中。作為體內(nèi)或體外基因治療，這兩種方法分別是已知的。

在特定的實(shí)施方式中，所述核酸序列直接地體內(nèi)施用，其中它被表達(dá)以產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。這可以伴隨有本領(lǐng)域已知的許多方法的任一種，例如通過(guò)作為合適的核酸表達(dá)載體的部分來(lái)構(gòu)建它們并施用所述載體以使它們成為細(xì)胞內(nèi)的，例如通過(guò)使用缺陷的或減毒的逆病毒或其他病毒載體進(jìn)行感染(例如，美國(guó)專利No.4,980,286)，或通過(guò)直接注射裸露的DNA，或通過(guò)使用微粒轟擊(例如，基因槍；BiolisticDupont)，或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包被，封裝在脂質(zhì)體、微粒或微囊中，或通過(guò)連接到已知進(jìn)入核內(nèi)的肽來(lái)施用它們，或通過(guò)連接到遭受受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體來(lái)施用它(參見(jiàn)，例如，Wu andWu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)(其可用于靶向特異性表達(dá)受體的細(xì)胞類型)，等等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以形成核酸-配體復(fù)合物，其中配體包括fusogenic病毒肽以破壞內(nèi)涵體，容許核酸避免溶酶體降解。在又一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)靶向特異性受體，核酸可以在體內(nèi)被靶向用于細(xì)胞特異性攝取和表達(dá)(參見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188；WO93/20221)。做為選擇，可以細(xì)胞內(nèi)地導(dǎo)入核酸并通過(guò)同源重組摻入用于表達(dá)的宿主細(xì)胞DNA內(nèi)(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；and Zijlstra et al.，1989，Nature 342435-438)。

在特定實(shí)施方式中，使用含有編碼本發(fā)明的分子(例如，抗體或融合蛋白)的核酸序列的病毒載體。例如，可以使用逆病毒載體(參見(jiàn)，Miller et al.，1993，Meth.Enzymol.217581-599)。這些逆病毒載體含有病毒基因組的正確封裝和整合如宿主細(xì)胞DNA所必需的成分。用于基因治療、編碼抗體或融合蛋白的核酸序列可被克隆到一種或多種載體中，其促進(jìn)所述核苷酸序列向受試者中的遞送。關(guān)于逆病毒載體的更多細(xì)節(jié)可以在Boesen et al.(1994，Biotherapy 6291-302)中找到，其描述了使用逆病毒載體來(lái)遞送mdr 1基因到造血干細(xì)胞中以使所述干細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法更有抗性。說(shuō)明在基因治療中使用逆病毒載體的其他參考文獻(xiàn)是Clowes et al.，1994，J.Clin.Invest.93644-651；Klein et al.，1994，Blood 831467-1473；Salmons andGunzberg，1993，Human Gene Therapy 4129-141；和Grossman andWilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3110-114。

腺病毒是可用于基因治療的其他病毒載體。腺病毒用于將基因遞送到呼吸上皮的特別有吸引力的載體。腺病毒天然地感染呼吸上皮，其中它們引起輕微的疾病?；谙俨《镜倪f送系統(tǒng)的其他目標(biāo)是肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。Kozarsky和Wilson(Current Opinion in Genetics andDevelopment 3499-503，1993，陳述了基于腺病毒的基因治療的綜述。Bout et al.，(Human Gene Therapy，53-10，1994)表明了腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移到恒河猴的呼吸上皮的用途。在基因治療中使用腺病毒的其他例子可以在Rosenfeld et al.，1991，Science 252431-434；Rosenfeld et al.，1992，Cell 68143-155；Mastrangeli et al.，1993，J.Clin.Invest.91225-234；PCT公開(kāi)W094/12649；和Wang et al.，1995，GeneTherapy 2775-783中找到。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用腺病毒載體。

腺病毒相關(guān)病毒(AAV)也被建議用于基因治療。(參見(jiàn)，例如Walsh et al.，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300和美國(guó)專利No.5,436,146)。

基因治療的另一種方法包括通過(guò)如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染這些方法將基因轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)中的細(xì)胞。通常，轉(zhuǎn)移的方法包括將選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移到細(xì)胞。然后將這些細(xì)胞置于選擇之下以分離已經(jīng)取得了并在表達(dá)轉(zhuǎn)移的基因的那些細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞遞送給受試者。

在這個(gè)實(shí)施方式中，在體內(nèi)施用產(chǎn)生的重組細(xì)胞之前將核酸導(dǎo)入細(xì)胞。這種導(dǎo)入可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)進(jìn)行，包括但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用病毒或噬菌體載體感染、包涵核酸序列、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)融合，等等。許多技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，用于將外源基因?qū)爰?xì)胞中(參見(jiàn)，例如Loeffler and Behr，1993，Meth.Enzymol.217599-618，Cohen et al.，1993，Meth.Enzymol.217618-644；and Clin.Pharma.Ther.2969-92，1985)，并可以根據(jù)本發(fā)明來(lái)使用，只要不破壞受體細(xì)胞的必需的發(fā)育和生理功能。所述技術(shù)應(yīng)當(dāng)提供核酸對(duì)細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移，從而所述核酸是可由所述細(xì)胞表達(dá)的，優(yōu)選的可遺傳的和可由它的細(xì)胞子代表達(dá)。

產(chǎn)生的重組細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法遞送給受試者。優(yōu)選的靜脈內(nèi)地施用重組血細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)。預(yù)定使用的細(xì)胞數(shù)量取決于期望的效果、患者狀態(tài)等等，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

其中可以導(dǎo)入核酸用于基因治療目的的細(xì)胞涵蓋任何期望的、可獲得的細(xì)胞類型，包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞例如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如，從骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟獲得的，等等。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于基因治療的細(xì)胞對(duì)于受試者是自體的。

在重組細(xì)胞被用于基因治療的實(shí)施方式中，將編碼抗體或融合蛋白的核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而它們可被細(xì)胞或它們的子代表達(dá)，然后為了治療效果體內(nèi)施用重組細(xì)胞。在特定的實(shí)施方式中，使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞?？梢苑蛛x和在體外維持的任何干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞潛在地可以根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式使用。(參見(jiàn)例如，PCT公開(kāi)WO 94/08598；Stemple and Anderson，1992，Cell 71973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A229；和Pittelkow and Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61771)。

在特定實(shí)施方式中，為了基因治療的目的導(dǎo)入的核酸包括與編碼區(qū)可操作連接的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，從而通過(guò)控制合適的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的存在或缺乏，所述核酸是可控制的。
5.6.3試劑盒
本發(fā)明提供了藥物包裝或試劑盒，其包含裝有本發(fā)明的分子(即，包含變異Fc區(qū)的抗體、多肽)的一個(gè)或多個(gè)容器。此外，對(duì)疾病的治療有用的一種或多種其他預(yù)防或治療試劑也可以被包括入藥物包裝或試劑盒。本發(fā)明還提供了藥物包裝或試劑盒，其包含裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成分的一個(gè)或多個(gè)容器。任選的，與這種容器相關(guān)的可以是管理廠家的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式、藥物或生物制品的使用或銷售的提示，所述提示反應(yīng)廠家機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，用于人類施用的使用或銷售。

本發(fā)明還提供了可在上述方法中使用的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含一種或多種本發(fā)明的分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步在一個(gè)或多個(gè)容器中包含對(duì)癌癥治療有用的一種或多種其他預(yù)防或治療試劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，，試劑盒進(jìn)一步包含結(jié)合與癌癥相關(guān)的一種或多種癌癥抗原的一種或多種細(xì)胞毒抗體。在某些實(shí)施方式中，所述其他預(yù)防或治療試劑是化學(xué)治療劑。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的預(yù)防或治療試劑是生物學(xué)的或激素的治療劑。
5.7治療劑應(yīng)用的表征和展示
藥物組合物的幾個(gè)方面，本發(fā)明的預(yù)防試劑或治療試劑優(yōu)選的在人類使用之前在體外、在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中、在動(dòng)物模型有機(jī)體，例如嚙齒動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試期望的治療活性。例如，可用于確定特定藥物組合物的施用是否是期望的的分析，包括細(xì)胞培養(yǎng)分析，其中在培養(yǎng)中生長(zhǎng)患者組織樣品，并暴露于或與本發(fā)明的藥物組合物接觸，并觀察這種組合物對(duì)組織樣品的影響。可以通過(guò)患者的活組織檢查獲得組織樣品。這種測(cè)試容許鑒定對(duì)單個(gè)患者治療上最有效的預(yù)防或治療分子。在各種特定的實(shí)施方式中，可以用涉及自體免疫或炎癥性失調(diào)的細(xì)胞類型的代表性的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)進(jìn)行體外分析，來(lái)確定本發(fā)明的藥物組合物是否對(duì)這些細(xì)胞類型具有期望的效果。

可以在人類使用之前在適合的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試預(yù)防試劑和/或治療試劑的組合。這種動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于，大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔，等等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的任何動(dòng)物系統(tǒng)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，在小鼠模型系統(tǒng)中測(cè)試預(yù)防試劑和/或治療試劑的組合。這種模型系統(tǒng)是廣泛使用的，并且是技術(shù)人員公知的?？梢灾貜?fù)地施用預(yù)防試劑和/或治療試劑。該過(guò)程的幾個(gè)方面可以不同。所述方面包括施用預(yù)防試劑和/或治療試劑的時(shí)間方式，以及這些試劑是單獨(dú)地還是作為混合物施用。

用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選的動(dòng)物模型是，例如，在小鼠效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)人類FcγR的轉(zhuǎn)基因小鼠，例如，在美國(guó)專利No.5,877,396中(通過(guò)完全引用將它合并在此)描述的任何小鼠模型，可以用于本發(fā)明。用于本發(fā)明的方法的轉(zhuǎn)基因小鼠包括但不限于，攜帶人類FcγRIIIA的小鼠；攜帶人類FcγRIIA的小鼠；攜帶人類FcγRIIB和人類FcγRIIIA的小鼠；攜帶人類FcγRIIB和人類FcγRIIA的小鼠。

優(yōu)選的，在如上所述的功能分析中顯示了最高的活性水平的突變?cè)谌祟愂褂弥皽y(cè)試在動(dòng)物模型研究中的使用。攜帶使用本發(fā)明的方法鑒定的和在ADCC中分析中測(cè)試的Fc突變體的抗體包括兩種抗-Erb-B2抗體ch4D5和ch520C9，和一種抗-TAG72抗體，優(yōu)選的用于動(dòng)物模型中，因?yàn)樵缦纫呀?jīng)在異種移植小鼠模型中使用了它們(Hudsiak et al.，1989，Mol.Cell Biol.91165-72；Lewis et al.，1993，Cancer Immunol.Immunother.37255-63；Bergman et al.，2001 Clin.Cancer Res.72050-6；Johnson et al.，1995，Anticancer Res.1387-93)?？梢允褂靡陨厦枋龅姆椒?，例如，使用在此公開(kāi)和例示的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和IgG純化方法，制備足夠數(shù)量的抗體用于動(dòng)物模型中。一般的實(shí)驗(yàn)需要至少約5.4mg突變抗體。這種計(jì)算是基于遵循4μg/g的加載劑量和每周的維持劑量2μg/g十周，保護(hù)8-10只30g小鼠所需的野生型抗體的平均數(shù)量。本發(fā)明涵蓋作為異種移植腫瘤的來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系，例如來(lái)自患有乳腺癌的患者的SK-BR-3、BT474和HT29細(xì)胞。這些細(xì)胞在它們的表面具有Erb-B2和促黃體分泌素受體。已經(jīng)在ADCC和異種移植腫瘤模型中成功地使用了SK-BR-3細(xì)胞。在其他分析中可以使用來(lái)自人類卵巢腺癌的OVCAR3細(xì)胞。這些細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)抗原TAG72，可以與chCC49抗體共同使用。使用不同的抗體和多種腫瘤模型將避免由于抗體特異性Fc突變不相容性的任何特定突變的損失。

小鼠異種移植模型可以用于檢查小鼠抗體的效力，所述小鼠抗體是根據(jù)抗體分子的CDR區(qū)的親合性和特異性針對(duì)腫瘤特異性目標(biāo)產(chǎn)生的，以及抗體的Fc區(qū)引發(fā)免疫反應(yīng)的能力(Wu et al.，2001，Trends Cell Biol.11S2-9)。在小鼠效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)人類FcγR的轉(zhuǎn)基因小鼠是獨(dú)特的，是定制的動(dòng)物模型，來(lái)測(cè)試人類Fc-FcγR相互作用的效力?？梢允褂迷贒r.Jeffrey Ravetch的實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生的FcγRIIIA、FcγRIIIB和FcγRIIA轉(zhuǎn)基因小鼠的配對(duì)(經(jīng)過(guò)Rockefeller U.和SloanKettering Cancer center的許可)，如以下表11列出的那些。
表11小鼠品系
優(yōu)選的，在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中測(cè)試Fc突變體，所述Fc突變體顯示了對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的結(jié)合和對(duì)FcγRIIB降低的結(jié)合、ADCC和吞噬作用分析中的提高的活性。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)檢查在FcγRIIIA轉(zhuǎn)基因的、nude mCD16A敲除小鼠中與已經(jīng)施用天然抗體的對(duì)照相比攜帶Fc突變的抗體效力的增加。優(yōu)選的，使用標(biāo)準(zhǔn)方案檢查8-10只小鼠的組。示范性的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)可以包含以下步驟在乳腺癌模型中，在第1天用與Matrigel(Becton Dickinson)混合的0.1mL PBS皮下地注射～2×106個(gè)SK-BR-3細(xì)胞。首先，施用野生型嵌合抗體和同種型對(duì)照來(lái)確定預(yù)定治療劑量的曲線，在第1天以4μg/g的初始劑量，繼之以每周2μg/g的注射靜脈內(nèi)注射4D5。監(jiān)視腫瘤體積6-8周來(lái)測(cè)量疾病的進(jìn)展。在注射了同種型對(duì)照的動(dòng)物中，腫瘤體積應(yīng)隨時(shí)間線性地提高。相比之下，在注射4D5的組中應(yīng)出現(xiàn)極少的腫瘤生長(zhǎng)。標(biāo)準(zhǔn)劑量研究的結(jié)果被用于設(shè)置測(cè)試Fc突變體的實(shí)驗(yàn)的上限。使用含F(xiàn)c突變的抗體的亞治療劑量進(jìn)行這些研究。在用FcγRIIB敲除小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中對(duì)異種移植模型使用十分之一的劑量，參見(jiàn)Clynes etal.，2000，Nat.Med.6443-6，具有產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的阻斷。由于本發(fā)明的突變優(yōu)選地顯示了FcγRIIIA活化的提高和FcγRIIB結(jié)合的降低，以十分之一的治療劑量檢查突變體。以不同的間隔檢查腫瘤大小表面了所述抗體在較低劑量的效力。使用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析提供了確定數(shù)據(jù)是否顯著的方法。以逐漸降低的劑量測(cè)試顯示了提高的效力的Fc突變體，來(lái)確定最小可能的劑量作用它們的效力的度量。

通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的和在Crofford L.J.and Wilder R.L.，“Arthritis and Autoimmunity in Animals”，in Arthritis and AlliedConditionsA Textbook of Rheumatology，McCarty et al.(eds.)，Chapter 30(Lee and Febiger，1993)中描述的炎癥性關(guān)節(jié)炎的各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，可以確定本發(fā)明的組合治療的抗炎活性。炎癥性關(guān)節(jié)炎和自體免疫風(fēng)濕疾病的實(shí)驗(yàn)的和天然的動(dòng)物模型也可以用于評(píng)定本發(fā)明的組合治療的抗炎活性。以下是作為實(shí)例而不是為了限制而提供的一些分析。

本領(lǐng)域已知和廣泛使用的關(guān)節(jié)炎或炎癥性疾病的原則動(dòng)物模型包括佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型、膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠和小鼠模型，和抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠、兔和倉(cāng)鼠模型，所有的都在Crofford L.J.and Wilder R.L.，“Arthritis and Autoimmunity inAnimals”，in Arthritis and Allied ConditionsA Textbook ofRheumatology，McCarty et al.(eds.)，Chapter 30(Lee and Febiger，1993)中描述，通過(guò)完全引用將它合并在此。

本發(fā)明的組合治療的抗炎活性可以使用角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型來(lái)評(píng)定。角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎也已經(jīng)在慢性關(guān)節(jié)炎或炎癥的研究中用于兔、狗和豬。定量的histomorphometric評(píng)定被用于測(cè)定治療效力。在Hansra P.et al.，“Carrageenan-Induced Arthritis inthe Rat，”Inflammation，24(2)141-155，(2000)中描述了使用這種角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的方法。通常還使用的是本領(lǐng)域已知和已描述的酵母多糖誘導(dǎo)的炎癥動(dòng)物模型。

本發(fā)明的組合治療的抗炎活性也可以通過(guò)使用Winter C.A.et al.，“Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as anAssay for Anti-inflammatory Drugs”P(pán)roc.Soc.Exp.Biol Med.111，544-547，(1962)中描述的方法的修改體、測(cè)量大鼠中對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的爪水腫的抑制來(lái)評(píng)定。這種分析已經(jīng)用于大多數(shù)NSAID的抗炎活性的初步體內(nèi)篩選，并認(rèn)為是人類效力的預(yù)示。測(cè)試的預(yù)防或治療試劑的抗炎活性被表示為測(cè)試組相對(duì)于載體給藥的對(duì)照組在后爪重量增加方面的抑制百分比。

另外，炎癥性腸病的動(dòng)物模型也可以用于評(píng)定本發(fā)明的組合治療的效力(Kim et al.，1992，Scand.J.Gastroentrol.27529-537；Strober，1985，Dig.Dis.Sci.30(12Suppl)3S-10S)。潰瘍性的cholitis和Crohn’s病是可以在動(dòng)物中誘導(dǎo)的人類炎癥性腸病。可以向動(dòng)物口頭地施用硫酸化的多聚糖，包括但不限于，支鏈淀粉、角叉菜、硫酸支鏈淀粉和硫酸葡聚糖或化學(xué)刺激物包括但不限于三硝基苯磺酸(TNBS)和乙酸來(lái)誘導(dǎo)炎癥性腸病。

自體免疫失調(diào)的動(dòng)物模型也可以用于評(píng)定本發(fā)明的組合治療的效力。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了自體免疫失調(diào)的動(dòng)物模型例如1型糖尿病、甲狀腺自體免疫、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和血管球性腎炎(Flanders et al.，1999，Autoimmunity 29235-246；Krogh et al.，1999，Biochimie 81511-515；Foster，1999，Semin.Nephrol.1912-24)。

進(jìn)一步的，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何分析可以用于評(píng)估在此公開(kāi)的組合治療對(duì)于自體免疫和/或炎癥性疾病的預(yù)防和/或治療實(shí)用性。

本發(fā)明的預(yù)防和/或治療方案的毒性和效力可以通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)過(guò)程來(lái)測(cè)定，例如，測(cè)定LD50(對(duì)50％群體的致死劑量)和ED50(在50％的群體中治療有效的劑量)。在有毒/治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，它可以被表示為L(zhǎng)D50/ED50之間的比例。顯示了大的治療指數(shù)的預(yù)防和/或治療試劑是優(yōu)選的。當(dāng)使用展現(xiàn)了毒性副作用的預(yù)防和/或治療試劑時(shí)，應(yīng)當(dāng)小心地設(shè)計(jì)遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)將這些試劑靶向受感染組織以最小化對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損害，從而降低副作用。

從細(xì)胞培養(yǎng)分析和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人類的預(yù)防和/或治療試劑的劑量范圍。這些試劑的劑量?jī)?yōu)選地處在包括很小或沒(méi)有毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于采用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在這個(gè)范圍內(nèi)變動(dòng)。對(duì)于用于本發(fā)明的方法任何試劑，可以最初地從細(xì)胞培養(yǎng)分析來(lái)估計(jì)治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量來(lái)達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50的循環(huán)血漿濃度范圍(即，達(dá)到癥狀的半最大抑制的測(cè)試化合物的濃度)。這種信息可用于更精確地測(cè)定人類中有用的劑量?？梢酝ㄟ^(guò)例如高效液相層析法測(cè)定血漿中的水平。

根據(jù)本發(fā)明使用的治療的抗癌活性也可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知和在Relevance of Tumor Models for A nticancer Drug Development(1999，eds.Fiebig and Burger)；Contributions to Oncology(1999，Karger)；The Nude Mouse in Oncology Research(1991，eds.Boven andWinograd)；and Anticancer Drug Development Guide(1997 ed.Teicher)中描述的各種用于癌癥研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，例如SCID小鼠模型或轉(zhuǎn)基因小鼠或具有人類異種移植的nude小鼠，動(dòng)物模型，例如倉(cāng)鼠、兔等等，來(lái)測(cè)定，通過(guò)完全引用將它們合并在此。

用于測(cè)定本發(fā)明的分子的治療效力的優(yōu)選的動(dòng)物模型時(shí)小鼠異種移植模型。可以用作異種移植腫瘤的來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系包括但不限于SKBR3和MCF7細(xì)胞，其可以來(lái)自患有乳腺癌的患者。這些細(xì)胞具有erbB2和促黃體分泌素受體。已經(jīng)在本領(lǐng)域中常規(guī)地使用SKBR3細(xì)胞作為ADCC和異種移植腫瘤模型。做為選擇，來(lái)自人類卵巢癌的OVCAR3細(xì)胞可被用作異種移植腫瘤的來(lái)源。

在人類使用前，優(yōu)選的在體外、然后在體內(nèi)測(cè)試本發(fā)明的方案和組合物的期望的治療或預(yù)防活性。可以使用腫瘤或惡性細(xì)胞系的細(xì)胞篩選治療試劑和方法。本領(lǐng)域的許多標(biāo)準(zhǔn)分析可以用于評(píng)定這種存活率和/或生長(zhǎng)，例如，通過(guò)測(cè)量3H-胸腺嘧啶核苷摻入、通過(guò)直接細(xì)胞計(jì)數(shù)、通過(guò)檢測(cè)已知基因例如原癌基因(例如，fos、myc)或細(xì)胞周期標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄活性的變化可以分析細(xì)胞增殖；通過(guò)錐石藍(lán)染色可以評(píng)定細(xì)胞生存力，根據(jù)形態(tài)學(xué)、降低的生長(zhǎng)和/或在軟瓊脂中的集落形成或在三維的基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)制備物中的管性網(wǎng)絡(luò)形成，可以視覺(jué)上地評(píng)定分化。

可以在人類中測(cè)試之前在適合的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試治療中使用的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔、倉(cāng)鼠等等，例如，如上所述的動(dòng)物模型。然后可以在合適的臨床試驗(yàn)中使用化合物。

進(jìn)一步的，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何分析可以用于評(píng)估在此公開(kāi)的組合治療對(duì)于癌癥、炎癥性失調(diào)或自體免疫疾病的治療或預(yù)防的預(yù)防和/或治療實(shí)用性。
6.實(shí)施例
使用酵母展示系統(tǒng)，篩選突變的人類IgG1重鏈Fc區(qū)的對(duì)不同F(xiàn)c受體的修改的親合性。特別地，通過(guò)error-prone PCR(Genemorph，Stratagene)產(chǎn)生突變Fc庫(kù)，然后將突變的Fc蛋白融合到Aga2p細(xì)胞壁蛋白，其容許融合蛋白細(xì)胞外地分泌并展示在酵母細(xì)胞壁上。

克隆人類受體(FcγRIIIA和FcγRIIB)的可溶形式。然而，由于FcγR對(duì)它的配體的低親合性，在酵母細(xì)胞表面檢測(cè)IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域被防礙。為了規(guī)避這種局限，使用AVITAG序列形成可溶的FcγR四聚復(fù)合物，所述AVITAG序列可以以酶學(xué)手段生物素化，隨后與結(jié)合到藻紅素的鏈霉抗生物素蛋白(SA-PE；Molecular Probes)反應(yīng)來(lái)形成可溶的四聚FcγR復(fù)合物。ELISA分析證實(shí)了相對(duì)于單體的FcγR，可溶的FcγR四聚復(fù)合物對(duì)人類IgG1具有更高的親合力。如通過(guò)FACS分析評(píng)定的，酵母細(xì)胞表面的Fc融合蛋白也結(jié)合可溶的FcγR四聚復(fù)合物。

酵母細(xì)胞表面表達(dá)的Fc融合蛋白與可溶的四聚FcγR復(fù)合物的差異結(jié)合通過(guò)FACS分析來(lái)監(jiān)視。因而鑒定了對(duì)一種或多種可溶的四聚FcγR復(fù)合物具有改變的親合性的Fc融合蛋白，然后摻入完整的免疫球蛋白并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。將哺乳動(dòng)物表達(dá)的產(chǎn)物用于ELISA分析來(lái)證實(shí)酵母表面展示系統(tǒng)中獲得的結(jié)果。最后，對(duì)突變Fc區(qū)測(cè)序來(lái)確認(rèn)改變的殘基。
6.1FcγRIIIA的克隆、表達(dá)和純化 材料和方法
可溶的FcγRIIB和FcγRIIIA如下克隆獲得人類FcγR基因(FcγRIIB和FcγRIIIA)的cDNA克隆(Ravetch實(shí)驗(yàn)室的惠贈(zèng))。通過(guò)PCR(表12)擴(kuò)增FcγRIIIA基因的可溶區(qū)(氨基酸7-203)，用BamHI/HindIII消化并連接到pET25載體(Novagen)中。用Sall/Notl消化這個(gè)載體，凝膠分離370by片段。用BamHI/Sall消化載體hu3A(J.Ravetch的惠贈(zèng))，分離含有FcγRIIIA的N-末端的270by片段。兩個(gè)片段共同連接到用BamH/NotI切割的pcDNA3.1中來(lái)產(chǎn)生pcDNA3-FcγRIIIA。通過(guò)PCR(表12)控制FcγRIIB的可溶區(qū)(氨基酸33-180)，用BglII/HindIII消化并連接到pET25b(+)(Novagen)中。用BamHI/Notl消化這個(gè)載體，凝膠分離140bp片段。用BamHI/EcoRI消化載體huRIIb1(J.Ravetch的惠贈(zèng))，分離440bp N-末端FcγRIIB片段。兩個(gè)片段共同連接到用BamHI/Notl切割的pcDNA3.1來(lái)產(chǎn)生pcDNA3-FcγRIIB(氨基酸1-180)。將重組克隆轉(zhuǎn)染到293H細(xì)胞中，從細(xì)胞培養(yǎng)物收集上清液，在IgG瓊脂糖柱上純化可溶的重組FcγR(rFcγR)蛋白。
結(jié)果 重組可溶FcγRIIIA(rFcγRIIIA)和重組可溶FcγRIIB(rFcγRIIB)被純化到同質(zhì)。

在表達(dá)和在IgG瓊脂糖柱上純化重組可溶FcγR蛋白之后，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定重組純化的可溶受體蛋白的純度和表觀分子量。如附圖1所示，可溶rFcγRIIIA(附圖1，泳道1)具有35KDa的預(yù)期表觀分子量，可溶rFcγRIIB(附圖1，泳道4)具有～20KDa的預(yù)期表觀分子量。如附圖1所示，可溶rFcγRIIIA作為彌散的“模糊”條帶遷移，其歸因于FcγRIIIA上正常地存在的高度的糖基化(Jefferis，et al.，1995Immunol Lett.44，111-117)。
6.1.1純化的重組可溶FcγRIIIA的表征 材料和方法
使用ELISA分析，來(lái)分析如上所述獲得的純化的可溶rFcγRIIIA與人類單體或聚集的IgG的直接結(jié)合。用10ng可溶rFcγRIIIA在1X PBS中包被平板過(guò)夜。在包被之后，在1X PBS/0.1％吐溫20中洗滌平板三次。將人類IgG，生物素化的單體IgG或生物素化的聚集的IgG，以0.03mg/mL到2mg/mL的濃度范圍添加到孔中，容許與可溶rFcγRIIIA結(jié)合。在37℃進(jìn)行反應(yīng)一小時(shí)。再次用1XPBS/0.1％吐溫20洗滌平板三次。通過(guò)監(jiān)視650nm處的吸光度，用鏈霉抗生物素蛋白辣根過(guò)氧化酶軛合來(lái)檢測(cè)人類IgG與可溶rFcγRIIIA的結(jié)合。650nm處的吸光度與結(jié)合的聚集IgG成比例。

在阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)中，監(jiān)視FcγRIIIA單克隆抗體、小鼠抗FcγRIIIA抗體3G8(Pharmingen)阻斷受體與聚集的IgG結(jié)合的能力。洗滌和孵育條件與上述的相同，只是在添加IgG之前，添加5倍摩爾過(guò)量的3G8，并容許在37℃孵育30分鐘。
結(jié)果
純化的、重組可溶性FcγRIIIA特異性地結(jié)合聚集的IgG。

使用ELISA分析測(cè)試純化的重組可溶FcγRIIIA與聚集的和單體的IgG的直接結(jié)合(附圖2)。在2μg/ml的IgG濃度處，觀察到與聚集的IgG的強(qiáng)勁結(jié)合。然而，在類似的濃度，沒(méi)有檢測(cè)到與單體IgG的結(jié)合。與聚集的IgG的結(jié)合被3G8阻斷，3G8是封閉配體結(jié)合位點(diǎn)的小鼠抗FcγRIIIA單克隆抗體，表明聚集的IgG結(jié)合是經(jīng)由正常的FcγRIIIA配體結(jié)合位點(diǎn)的(附圖2)。還表征了可溶rFcγRIIB，并顯示具有與可溶rFcγRIIIA類似特征的對(duì)IgG的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
6.2可溶FcγR四聚復(fù)合物的形成 材料和方法 構(gòu)建用于表達(dá)融合到AVITAG肽的可溶FcRγIIIA和FcRγIIB的質(zhì)粒
為了產(chǎn)生可溶的FcγR四聚復(fù)合物，通過(guò)PCR(表12)擴(kuò)增人類FcRgIIIA基因的可溶區(qū)(氨基酸7-203)，用BamHI/HindIII消化并連接到pET25b(+)(Novagen)中。用SalI/Not1消化這個(gè)載體，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離370bp片段。用BamHI/SalI消化載體hu3A(J.Ravetch的惠贈(zèng))，分離含有FcRγIIIA的N-末端的270bp片段。兩個(gè)片段共同連接到用BamH/NotI消化的pcDNA3.1(Invitrogen)中，來(lái)產(chǎn)生pcDNA3-FcRgIIIA(氨基酸1-203)。

通過(guò)PCR(表I)擴(kuò)增FcRγIIB的可溶區(qū)(氨基酸33-180)，用BglII/HindIII消化并連接到pET25b(+)(Novagen)中。用BamHI/NotI消化這個(gè)載體，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離140bp片段。用BamHI/EcoRI消化載體huRIIb1(J.Ravetch的惠贈(zèng))，分離440byFcRγIIB N-末端片段。兩個(gè)片段共同連接到已經(jīng)用BamHI/Notl消化的pcDNA3.1中，來(lái)產(chǎn)生pcDNA3-FcRγIIB(氨基酸1-180)。隨后，將接頭AVITAG序列融合到FcγRIIIA和FcγRIIB的C-末端。為了產(chǎn)生FcγRIIIA-接頭-avitag和FcγRIIB-接頭-avitag構(gòu)建體，用Not I和XbaI消化pcDNA3.1FcγRIIIA和FcγRIIB構(gòu)建體(都插入載體序列中)，將包括5’末端的NotI位點(diǎn)和3’末端的XbaI的86堿基對(duì)雙鏈寡核苷酸連接到載體中。通過(guò)將具有已經(jīng)預(yù)先設(shè)計(jì)的NotI和XbaI限制性位點(diǎn)的兩個(gè)5’磷酸化反向互補(bǔ)寡核苷酸(表12中示出，為5’和3’接頭avitag引物)退火，來(lái)產(chǎn)生這個(gè)86bp片段。將100ng每ul的等體積每種引物混合，將DNA加熱到90℃15分鐘，在室溫下冷卻一小時(shí)來(lái)退火。這產(chǎn)生了預(yù)備與用各自的酶消化的pcDNA3.1-FcγRIIIA和FcγRIIB構(gòu)建體連接的雙鏈DNA片段。因而，構(gòu)建了pcDNA3.1-FcRγIIIA-接頭-AVITAG和pcDNA3.1-FcRγIIB-接頭-AVITAG。
表12用于FcγR和IgG載體的構(gòu)建的引物 通過(guò)BirA生物素化
通過(guò)使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，CA)短暫地轉(zhuǎn)染293H細(xì)胞，產(chǎn)生克隆到pcDNA3.1中、在蛋白質(zhì)的C-末端融合到15氨基酸AVITAG序列(Avidity，CO)(Schatz P.J.，1993，Biotechology，111138-1143)的可溶Fc受體(FcγR)。從培養(yǎng)物收集上清液，通過(guò)使上清液通過(guò)IgG瓊脂糖柱來(lái)純化可溶FcR蛋白。通過(guò)280nm處的吸光度測(cè)定可溶FcR-AVITAG融合蛋白的濃度。根據(jù)廠家的方案(Avidity，CO)用一種生物素連接酶E.coli BirA酶將可溶FcR蛋白上呈現(xiàn)的AVITAG生物素化。將1100最終稀釋度的蛋白酶抑制物的混合物(cocktail)(Sigma catalog#_P8849)和1mg/ml終濃度的亮抑蛋白酶肽(Sigma L-8511)添加到混合物以防止蛋白的降解。在室溫下孵育BirA反應(yīng)過(guò)夜，隨后使用Biomax 10K-ultrafiltration裝置(Millipore)通過(guò)在4℃3500rpm離心來(lái)濃縮溶液。在Tris-HCl(20mM，pH 8.0)、50mM NaCl中將蛋白加載到FPLCSuperdex 200HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)上，來(lái)從游離生物素分離標(biāo)記的可溶FcγR。
通過(guò)鏈霉抗生物素蛋白移動(dòng)分析來(lái)測(cè)定生物素化的程度
約80-85％的蛋白質(zhì)被BirA酶(Avidity，CO)生物素化。鏈霉抗生物素蛋白移動(dòng)分析被用于測(cè)定蛋白質(zhì)的生物素化的程度。以不同的比例將生物素化的蛋白與鏈霉抗生物素蛋白(MW 60,000Daltons)孵育。單獨(dú)的未生物素化的蛋白質(zhì)和單獨(dú)的鏈霉抗生物素蛋白被包括作為對(duì)照，來(lái)測(cè)定生物素化的程度。孵育在冰上進(jìn)行2小時(shí)或在4℃進(jìn)行過(guò)夜。用還原劑并且不煮沸樣品在4-12％Bis-Tris(Invitrogen，CA)上分析樣品。結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白的生物素化的蛋白質(zhì)作為高分子量條帶遷移。通過(guò)樣品中留下的單體蛋白質(zhì)的數(shù)量估計(jì)生物素化的程度。單體的低分子量種類的缺乏和具有大于單獨(dú)的鏈霉抗生物素蛋白的分子量的復(fù)合物的存在，表面高度的生物素化。
FcγR四聚復(fù)合物的形成
根據(jù)針對(duì)MHC I類四聚物早先建立的方法(參見(jiàn)，Busch，D.H.et al.，1998Immunity8353-362；Altman，J.D.et al.，1996，Science 27494-96)進(jìn)行FcγR四聚復(fù)合物的形成。根據(jù)280nm的吸光度計(jì)算生物素化的單體FcγR的濃度。一個(gè)分子的鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋百(SA-PE)(Molecular Probes，OR)具有結(jié)合4分子生物素的能力。使用5∶1摩爾比的單體生物素化的FcγR和SA-PE(5X單體生物素化的FcγR1X SA-PE)來(lái)確保過(guò)量的生物素化的蛋白。SA-PE的計(jì)算的分子量是300,000道爾頓，因此303mL a 1 mg/mL鏈霉抗生物素蛋白-PE的溶液具有1nmole SA-PE，將它添加到5nmole蛋白中。四聚蛋白的有效形成需要以逐步式增加的方式來(lái)添加SA-PE。首先添加一半數(shù)量的SA-PE，其余的SA-PE在黑暗中在4℃每20-30分鐘添加小的等分量。添加其余SA-PE的間隔是靈活的。在添加SA-PE完成之后，將溶液濃縮，如上述在磷酸鹽緩沖鹽水、pH 7.4中加載到FPLC大小排阻柱上。收集在空隙容積中洗脫的具有大于單獨(dú)的SA-PE的分子量的餾分。再添加蛋白酶抑制物來(lái)防止蛋白降解。濃縮溶液，添加其他蛋白酶抑制物到最終的復(fù)合物中用于保存。根據(jù)生物素化的單體蛋白的起始濃度計(jì)算可溶的FcγR四聚復(fù)合物的終濃度。例如，如果500μg生物素化的蛋白被用于制造四聚復(fù)合物，最終濃縮的四聚物在500μL的體積中，濃度估計(jì)是約1mg/mL(不考慮濃縮期間的損失，因?yàn)殡y以精確地測(cè)定在四聚物形成的每個(gè)步驟中損失了多少。由于PE的干擾，也不可能的是采用280nm的吸光度來(lái)測(cè)量濃度)。在-80℃以小的等分量分配可溶FcγR四聚復(fù)合物用于伴有蛋白酶抑制物的長(zhǎng)期保存。不向這些制備物中添加疊氮化鈉，因?yàn)樗木畚锉挥糜诤Y選酵母顯示庫(kù)。在解凍等分量時(shí)，將四聚物保存在4℃直至1周。
用于表征四聚FcγR復(fù)合物的ELISA分析
ELISA被用于表征四聚FcγR復(fù)合物。用PBS緩沖液中25ng的人類IgG包被Maxisorb F96孔平板(Nunc)，在4℃孵育過(guò)夜。用PBS/0.5％BSA/0.1％Tween 20(洗滌和稀釋緩沖液)洗滌平板，之后添加FcγRIIIA四聚物和測(cè)試抗體的組合來(lái)測(cè)定用小鼠抗人類FcγRIIIA抗體的阻斷，如下所述阻斷步驟如下進(jìn)行固定的0.5mg/ml終濃度的可溶FcγRIIIA四聚物與抗體在緩沖液PBS/0.5％BSA/0.1％Tween 20中在室溫下預(yù)孵育1h?？贵w的終濃度從60mg/mL到0.25mg/mL。3G8是小鼠抗人類FcγRIIIA抗體，對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，使用嵌合的版本，即抗體的可變區(qū)是小鼠抗人類FcγRIIIA，重鏈和輕鏈的恒定區(qū)來(lái)自IgG1人類區(qū)域。嵌合的4.4.20.D265A也用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，其是抗熒光素抗體，從而Fc區(qū)含有位置265處的突變，其中天冬氨酸被人類IgG1中的丙氨酸替換，其導(dǎo)致與FcγR的降低的結(jié)合。這個(gè)抗體先前已經(jīng)被表征(參見(jiàn)Clynes et al.，2000，Nat.Med.6443-446；Shields et al.，2001，J.Biol.Chem.，2766591-6604)。這個(gè)抗體被用作陰性同種型對(duì)照。

通過(guò)在室溫下預(yù)孵育1小時(shí)，容許抗體與FcγRIIIA四聚物結(jié)合。然后將混合物添加到洗滌的平板上的IgG，在室溫下另外孵育1小時(shí)。用緩沖液洗滌平板，以1∶5000稀釋度添加DJ130c(從DAKO，Denmark獲得的小鼠抗人類FcγRIIIA抗體；它的表位不同于3G8抗體的表位)，容許在室溫下孵育1小時(shí)以檢測(cè)結(jié)合的FcRIIIA四聚物。用緩沖液洗去未結(jié)合的抗體，用山羊抗小鼠過(guò)氧化物酶(Jackson實(shí)驗(yàn)室)檢測(cè)結(jié)合的DJ130c。這個(gè)試劑將不檢測(cè)人類Fc。在洗去未結(jié)合的結(jié)合過(guò)氧化物酶的抗體之后，添加底物TMB試劑(BioFx)來(lái)檢測(cè)相比同種型對(duì)照的3G8阻斷程度，在650nm讀取產(chǎn)生的顏色。

通過(guò)ELISA，對(duì)于可溶四聚FcγRIIIA與IgG的直接結(jié)合，如上所述用25ng IgG包被maxisorb平板。從20mg/mL到0.1mg/mL添加可溶四聚FcγRIIIA，以20mg/mL到0.16mg/mL的濃度范圍添加生物素化的單體可溶四聚FcγRIIIA。檢測(cè)與上述用DJ130c的相同，繼之以山羊抗小鼠過(guò)氧化物酶抗體。用TMB試劑生產(chǎn)顏色，在650納米讀取平板。
結(jié)果 可溶的FcγRIIIA四聚復(fù)合物經(jīng)由它的正常配體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合單體人類IgG
使用ELISA分析，如在材料和方法一節(jié)中描述的，產(chǎn)生、分離和分析可溶的FcγRIIIA-AVITAG融合蛋白，顯示了具有與非AVITAG可溶FcγRIIIA蛋白類似的性質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。將融合蛋白生物素化，如上所述產(chǎn)生四聚復(fù)合物。

然后使用ELISA分析來(lái)評(píng)定可溶的FcγR四聚復(fù)合物與其配體、單體人類IgG的結(jié)合。ELISA的分析顯示，可溶的四聚FcγR復(fù)合物。特異性地結(jié)合單體人類IgG。如附圖3A所示，如650nm處的吸光度所監(jiān)測(cè)的，可溶四聚FcγRIIIA與單體人類IgG的結(jié)合被小鼠抗人類FcγIIIA單克隆抗體3G8阻斷。另一方面，攜帶D265A突變的4-4-20單克隆抗體不能阻斷可溶四聚FcγRIIIA與單體人類IgG的結(jié)合(附圖3A)。因而這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了可溶四聚FcγRIIIA復(fù)合物的結(jié)合通過(guò)天然的配體結(jié)合位點(diǎn)來(lái)發(fā)生。
可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物以比單體可溶FcγRIIIA更大的親合力結(jié)合單體人類IgG
使用ELISA分析來(lái)評(píng)定可溶四聚FcγRIIIA與聚集的人類IgG的直接結(jié)合，并與可溶單體FcγRIIIA與單體人類IgG的直接結(jié)合相比較。如附圖3B所示，可溶四聚FcγRIIIA以比可溶單體受體更高的親合力(8-10倍)結(jié)合人類IgG，如450nm處的吸光度所監(jiān)測(cè)的。

也使用包被了從IgG1純化的Fc片段的磁性珠子來(lái)分析可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物的結(jié)合(附圖4)。在未檢測(cè)到單體結(jié)合的條件下，可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物與IgG1 Fc包被的珠子結(jié)合。通過(guò)預(yù)先孵育受體復(fù)合物和阻斷Fc結(jié)合的抗FcγRIIIA單克隆抗體LNK16，顯示了結(jié)合的特異性。這個(gè)分析進(jìn)一步證實(shí)了，可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物通過(guò)它的正常配體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合單體IgG，由于復(fù)合物內(nèi)的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，提高了受體的親合力。
6.3用于展示突變IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域的酵母菌株的構(gòu)建 材料和方法
pYD1載體(Invitrogen)是直接從酵母復(fù)制載體pCT302衍生的(Shusta，et al.，2000Nat.Biotechnol.18754-759，其已經(jīng)被成功地用于展示T細(xì)胞受體和許多scFV。這種質(zhì)粒是著絲粒的并攜帶TRP1基因，容許在trpl酵母菌株中每個(gè)細(xì)胞1-2個(gè)質(zhì)粒的相對(duì)恒定的拷貝數(shù)。方向性克隆到多聚接頭中將目標(biāo)基因置于GAL1啟動(dòng)子的控制下并與AGA2處在讀碼框內(nèi)。IgG Fc結(jié)構(gòu)域與酵母Aga2p的融合引起了Aga2-Fc融合蛋白的細(xì)胞外分泌和隨后的經(jīng)由到酵母Aga lp蛋白的二硫鍵在細(xì)胞壁上展示Fc蛋白，Aga lp蛋白是整合的細(xì)胞壁蛋白。

為了優(yōu)化展示水平，通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)自IgG1重鏈的不同片段并克隆到pYD1中。具體地，通過(guò)PCR從IMAGE克隆182740擴(kuò)增IgG1重鏈的Fc區(qū)(同種型IG1m(a)；氨基酸206-447)，用EcoRI/SaII消化并連接到pYD1載體(Invitrogen)中。來(lái)自IMAGE的最初的克隆含有在位置319的單個(gè)核苷酸刪除，其通過(guò)體外定點(diǎn)誘變來(lái)糾正，以構(gòu)建pYD-GIF206(Quickchange，Stratagene)。

使用5’oligo(mcr025；chl(f))和3’oligo(H021)(參見(jiàn)表8)從pCINEO載體中的MAb B6.2的重鏈克隆擴(kuò)增CH1-CH3片段(氨基酸118-447)。用BamHI/NotI消化這個(gè)片段，并連接到pYD1載體中來(lái)構(gòu)建pYD-CH1。

附圖5顯示了構(gòu)建體的示意圖。CH1-CH3構(gòu)建體除了重鏈的鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域之外含有CH1結(jié)構(gòu)域，GIF206含有鉸鏈上游的6個(gè)氨基酸殘基，GIF227在內(nèi)源蛋白水解裂解位點(diǎn)的絞鏈區(qū)內(nèi)開(kāi)始(Jendeberg et al.，1997J.Immunol.Meth.20125-34)。
6.4酵母細(xì)胞壁上Fc結(jié)構(gòu)域的免疫定位和表征 材料和方法
使用標(biāo)準(zhǔn)的乙酸鋰酵母轉(zhuǎn)化方案(Gietz et al.，1992NucleicAcids Res.201425)，將含有Aga2p-Fc融合蛋白的構(gòu)建體和沒(méi)有任何插入物的對(duì)照載體pYDI轉(zhuǎn)化到酵母菌株EBY100(Invitrogen)MATaura3-52trpl leu2Δl his3Δ200pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL::GAL-AGA1中。隨后，在合成培養(yǎng)基上選擇色氨酸原養(yǎng)型微生物。獨(dú)立細(xì)胞群體的擴(kuò)增以及Agalp和Aga2p-Fc融合蛋白的誘導(dǎo)伴隨著在葡萄糖中的生長(zhǎng)，隨后在含有半乳糖作為原始碳源的培養(yǎng)基中在20℃生長(zhǎng)24-48小時(shí)。半乳糖中生長(zhǎng)經(jīng)由GAL1啟動(dòng)子誘導(dǎo)Aga2-Fc融合蛋白的表達(dá)，其隨后引起Fc融合蛋白在酵母細(xì)胞表面的展示。
結(jié)果 Fc融合蛋白的FACS分析
使用PE-軛合的多克隆F(ab)2山羊抗人FcγR和HP6017(Sigma)抗體(Jackson Immununoresearch Laboratories，Inc.)通過(guò)免疫染色來(lái)分析酵母細(xì)胞表面Fc融合蛋白的表達(dá)。熒光顯微術(shù)顯示了對(duì)三種Fc融合蛋白的周?chē)旧?。攜帶單獨(dú)的載體的對(duì)照菌株顯示了極少的或沒(méi)有染色(數(shù)據(jù)未顯示)。FACS分析被用于定量染色(附圖6)。含有CH1-CH3融合物的酵母菌株顯示了最高百分比的用兩種抗體染色的細(xì)胞(附圖6B和F)。GIF227構(gòu)建體顯示了最大的平均熒光強(qiáng)度(附圖6，畫(huà)面C和G)。
表征酵母細(xì)胞表面表達(dá)的Fc融合蛋白的結(jié)合
Fc和FcγR蛋白的天然環(huán)境將受體置于細(xì)胞表面并使Fc作為可溶配體；然而酵母Fc表面展示反轉(zhuǎn)了這種天然相互作用的幾何結(jié)構(gòu)。酵母細(xì)胞壁的表面上IgGl Fc蛋白的檢測(cè)，由于FcγR對(duì)其配體的低親合性和展示系統(tǒng)固有的反轉(zhuǎn)幾何結(jié)構(gòu)而被復(fù)雜化。雖然后一點(diǎn)不能被改變，如以上解釋的通過(guò)形成可溶的FcγR四聚復(fù)合物改善了配體的親合力，其容許檢測(cè)結(jié)合到酵母細(xì)胞壁表面表達(dá)的Fc融合蛋白的FcγR。

為了表征可溶的四聚FcγR復(fù)合物與表面展示的Fc融合蛋白的結(jié)合，將表達(dá)不同F(xiàn)c構(gòu)建體的酵母細(xì)胞與可溶的rFcγRIIIA四聚復(fù)合物孵育并通過(guò)FACS分析。如FACS分析所示，攜帶pYD-CH1、展示野生型CH1-CH3構(gòu)建體的酵母細(xì)胞被可溶的rFcγRIIIA四聚復(fù)合物結(jié)合。然而，如FACS分析所示，GIF206和GIF227株顯示了很少的或沒(méi)有與可溶的rFcγRIIIA四聚復(fù)合物的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。

已經(jīng)鑒定了Fc區(qū)中阻斷與FcγR的結(jié)合的突變(Shields etal.，2001；J Biol.Chem.2766591-6604)。這些突變之一，D265A，被摻入pYD-CH1中，這個(gè)突變體在酵母細(xì)胞表面上表達(dá)。使用高濃度的配體(0.15mM Fc；7.5mM D265A)與可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物孵育這些細(xì)胞，F(xiàn)ACS分析表明，可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物與野生型Fc結(jié)合(附圖7A)，但可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物不與D265A-Fc突變體結(jié)合，表明FcγR與較低的鉸鏈-CH2區(qū)中的正常FcR結(jié)合位點(diǎn)相互作用(附圖7B)。

如FACS分析的，針對(duì)FcγRIIIA配體結(jié)合位點(diǎn)的抗體阻斷可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物與酵母細(xì)胞壁表面展示的野生型Fc蛋白的結(jié)合(附圖8)?？扇蹻cγRIIIA四聚復(fù)合物的結(jié)合被3G8抗體以及另一種抗FcγRIIIA單克隆抗體LNK16抗體(Advanced Immunological)(Tam et al.，1996J.Immunol.157，1576-1581)阻斷，但不被不相關(guān)的同種型對(duì)照阻斷。因此，可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物與酵母細(xì)胞表面展示的Fc蛋白的結(jié)合通過(guò)正常的配體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生。FcγRIIIA四聚復(fù)合物的有限結(jié)合表明，細(xì)胞的亞群具有FcγR可接近的正確折疊的Fc。為何僅細(xì)胞的亞群能夠結(jié)合配體存在多種原因，例如，它們可能處在細(xì)胞周期的不同階段或融合蛋白可能未被輸出。

為了確定與酵母細(xì)胞表面的Fc融合蛋白結(jié)合的FcγRIIIA四聚物的離解常數(shù)，使用FACS分析了一系列FcγRIIIA四聚復(fù)合物的結(jié)合。在1.4μM到0.0006μM的濃度滴定FcγRIIIA四聚復(fù)合物。使用平均熒光強(qiáng)度作為結(jié)合親合性和非線性回歸分析的度量，測(cè)定KD為0.006μM(+/-0.001)(數(shù)據(jù)未顯示)。
6.5Fc突變庫(kù)的構(gòu)建
使用側(cè)翼于Fc-CH1構(gòu)建體中Fc片段的引物和error-pronePCR(Genemorph，Stratagene)構(gòu)建突變Fc庫(kù)。使誘變PCR(Genemorph，Stratagene)擴(kuò)增載體pYD-CHI中插入的CH1-CH3。使用pYD-上游和pYD-下游引物(Invitrogen)進(jìn)行五個(gè)反應(yīng)。用XHOI/BamHI消化產(chǎn)生的擴(kuò)增的片段并連接到pYD1中。然后將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到XL10超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)中，這產(chǎn)生～1×106個(gè)轉(zhuǎn)化體，80％的轉(zhuǎn)化體含有插入物。

來(lái)自庫(kù)的28個(gè)隨機(jī)質(zhì)粒的序列分析表明～2-3個(gè)突變/kb的突變頻率，40％保守核苷酸變化和60％引起氨基酸變化的突變的破壞。

將庫(kù)轉(zhuǎn)化到酵母菌株EBY100，MATα ura3-52trp l leu2Δ1his3Δ200pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can l GAL GAL-A GA 1::URA3中達(dá)到高效率，～3.3×105個(gè)轉(zhuǎn)化體/ug，在20個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，產(chǎn)生總共～107個(gè)酵母轉(zhuǎn)化體(Gietz，et al.，1992，Nucleic Acids Res.201425)。集中庫(kù)，通過(guò)在葡萄糖中生長(zhǎng)來(lái)擴(kuò)增。
6.6Fc突變體的選擇和分析 材料和方法 篩選Fc突變體的ELISA分析
ELISA平板(Nunc F96MaxiSorp Immunoplate)在4℃在碳酸鹽緩沖液中用50ml/孔的0.5mg/ml BSA-FITC包被，容許孵育過(guò)夜。平板用1X PBS/0.1％Tween 20(PBST)洗滌3次。添加200ml/孔的PBST/0.5％BSA，在室溫下將平板孵育30分鐘。用PBST另外洗滌平板三次。野生型或含有Fc突變體的50ml/孔1∶4稀釋的4-4-20抗體(大約3mg/mL，其將產(chǎn)生0.7-0.8mg/孔的終濃度)在PBST/0.5％BSA中從條件培養(yǎng)基添加，在室溫下孵育2小時(shí)。用PBST洗滌平板三次。添3mg/ml(PBST/0.5％BSA中)的純化的生物素化的單體FcγRIIIA(50μl/孔)到平板中，容許在室溫下孵育1.5小時(shí)。用PBST洗滌平板三次。添PBST/0.5％BSA中50ml/孔1∶5000稀釋度的鏈霉抗生物素蛋白-HRP(Pharmacia，RPN 123v)，在室溫下孵育平板30分鐘。用PBST洗滌平板三次。然后將80ml/孔TMB試劑(BioFX)添加到平板上，容許在室溫下在暗處孵育10-15分鐘。通過(guò)添加40ml/孔停止溶液(0.18M硫磺酸)最終停止反應(yīng)。然后監(jiān)視平板酯450nm處的吸光度。在第一次篩選之后，在基于免疫復(fù)合物的結(jié)合ELISA中通過(guò)4-4-20-Fc突變體的連續(xù)滴定來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)感興趣的候選物。在這種ELISA中進(jìn)行了幾種修改。為了包被平板，使用2mg/mlBSA-FITC。根據(jù)IgG定量結(jié)果，來(lái)自條件培養(yǎng)基的稀釋的4-4-20Fc(野生型或突變體)在PBST-/0.5％BSA中添加到1、0.5、0.25、0.125、0.063和0mg/ml的終濃度。
細(xì)胞表面展示的Fc蛋白的FACS篩選
在具有葡萄糖的至少10mls的HSM-Trp-Ura pH 5.5中生長(zhǎng)細(xì)胞16-24小時(shí)，或直到OD600大于2.0。在～2000rpm旋轉(zhuǎn)沉淀細(xì)胞5分鐘。將細(xì)胞重懸浮在具有半乳糖的等體積的HSM-Trp-Ura pH7.0中。在125ml燒瓶中，添36mls半乳糖培養(yǎng)基，用9mls的培養(yǎng)基接種，在20℃搖動(dòng)孵育20-48小時(shí)。通過(guò)8-16小時(shí)間隔測(cè)量OD600來(lái)監(jiān)視生長(zhǎng)。2K rpm 5分鐘收獲細(xì)胞，重懸浮在等體積的1XPBS，pH 7.4中。

平衡篩選在維持過(guò)量的配體時(shí)孵育合適數(shù)量的細(xì)胞。例如，優(yōu)選的是以確保庫(kù)的10倍覆蓋度所需的細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始。對(duì)于含有107個(gè)轉(zhuǎn)化體的庫(kù)的第一次分選，使用108個(gè)細(xì)胞。實(shí)際上，最好是以109個(gè)細(xì)胞開(kāi)始，來(lái)補(bǔ)償染色方案中的損失。

一般在1.5mL試管中以20-100mls體積在旋轉(zhuǎn)器上在暗處在4℃進(jìn)行孵育1小時(shí)(孵育緩沖液1XPBS pH7.4；1mg/ml BSA)。在500ml孵育緩沖液中洗滌細(xì)胞一次，在4K rpm旋轉(zhuǎn)沉淀細(xì)胞2.5分鐘。將細(xì)胞重懸浮在100ml孵育緩沖液中，并與第二染色試劑孵育。對(duì)于Fc-CH1，F(xiàn)(ab)2山羊抗hFc F(ab)-FITC抗體(JacksonImmunoresearch Laboratories，Inc.)可用于CH1表達(dá)的染色。用1mL進(jìn)行30分鐘染色。在500mL孵育緩沖液中另外洗滌細(xì)胞，在4K rpm旋轉(zhuǎn)沉淀細(xì)胞2.5分鐘，重懸浮在1mL IX PBS 1mg/mL BSA中，并通過(guò)FACS進(jìn)行分析。

典型的平衡篩選分選門(mén)和收集的細(xì)胞的數(shù)目在表13中示出。
表13.分選門(mén)和分選的細(xì)胞的數(shù)目
在第3和第4次分選之后，將細(xì)胞直接涂覆到-trp-ura平板上來(lái)鑒定單獨(dú)的突變。這一般回收每個(gè)平板～200-400個(gè)菌落。在收集之后，將細(xì)胞置于50mL錐形管中10mLs葡萄糖培養(yǎng)基中，在30℃生長(zhǎng)。重復(fù)全部過(guò)程。
結(jié)果 Fc突變體的FACS分析
在半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)之后，收獲細(xì)胞，用PE標(biāo)記的可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物和FITC標(biāo)記的小鼠抗人Fc(JacksonImmunoresearch Laboratories，Inc.)共染色。通過(guò)FACS分析細(xì)胞，使用分選門(mén)來(lái)選擇顯示了相對(duì)于細(xì)胞表面Fc表達(dá)的數(shù)量對(duì)可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物的最高親合性的細(xì)胞(附圖9)。例如，含有更好地結(jié)合可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物的突變Fc的細(xì)胞可能在酵母細(xì)胞表面表達(dá)較少的Fc融合蛋白，這種細(xì)胞將處在分選門(mén)的較低的左手邊角。

進(jìn)行四次連續(xù)分選來(lái)富集顯示了對(duì)可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物最高親合性的那些突變體。每次連續(xù)分選的門(mén)是5.5％、1％、0.2％和0.1％。在最后一次分選之后，將細(xì)胞涂覆在選擇培養(yǎng)基上，分離單獨(dú)的菌落。每個(gè)單獨(dú)的菌落代表攜帶Aga2-Fc融合蛋白內(nèi)的單個(gè)Fc突變體的細(xì)胞的克隆群體。首先挑選32個(gè)獨(dú)立的群體，通過(guò)FACS測(cè)試與可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物的結(jié)合(附圖10)。如被可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物結(jié)合的細(xì)胞百分比和結(jié)合的細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度所測(cè)量的，十八個(gè)突變體顯示了結(jié)合強(qiáng)度的增加。

還測(cè)試了顯示與FcγRIIIA的結(jié)合提高的突變與可溶FcγRIIB四聚復(fù)合物的結(jié)合(附圖10)。引起與可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物的結(jié)合提高的大多數(shù)突變也產(chǎn)生了FcγRIIB四聚復(fù)合物染色的檢測(cè)(附圖10)。根據(jù)早先的物理的和遺傳學(xué)的數(shù)據(jù)，提高與FcγRIIIA的結(jié)合的某些突變，預(yù)期也提高與FcγRIIB的結(jié)合(Shields et al.，2001，JBiol.Chem.2766591-6604；Sondermann et al.，2000，Nature 406267-273)。
分析人類細(xì)胞系中產(chǎn)生的4-4-20MAb中的突變體
在酵母系統(tǒng)中分離和分析突變?nèi)菰S快速鑒定新的突變等位基因。使用異源系統(tǒng)來(lái)分離突變可以產(chǎn)生突變的鑒定，所述突變通過(guò)引起錯(cuò)誤折疊的改變或特異于酵母的糖基化的改變?cè)鰪?qiáng)的結(jié)合。為了分析在人類細(xì)胞中產(chǎn)生的免疫球蛋白分子中的Fc突變，將突變體亞克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體含有抗熒光素單克隆抗體4-4-20的重鏈(Kranz et al.，1982 J.Biol.Chem，257(12)6987-6995)。突變的4-4-20重鏈與輕鏈克隆在人類腎臟細(xì)胞系(293H)中短暫地共表達(dá)。收集上清液并通過(guò)ELISA分析(附圖11)。

根據(jù)ELISA分析，當(dāng)出現(xiàn)在人類細(xì)胞系中產(chǎn)生的4-4-20單克隆抗體的Fc區(qū)中時(shí)，大多數(shù)突變體被鑒定為具有對(duì)可溶單體FcγRIIIA復(fù)合物的增強(qiáng)的親合性，在隨后的FACS分析中，也顯示了與可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物的結(jié)合的提高(附圖11A)。然而，兩個(gè)突變體，編號(hào)16和編號(hào)19顯示了與可溶FcγRIIIA單體復(fù)合物的結(jié)合的降低。

表14概括了已經(jīng)鑒定的突變和它們與FcγRIIIA和FcγRIIB的相應(yīng)的結(jié)合特征，如基于酵母展示的分析和ELISA所測(cè)定的。在表14中，符號(hào)代表如下與包含野生型Fc區(qū)的可比較分子相比，·相應(yīng)于親合性中的1倍提高；+相應(yīng)于親合性中的50％提高；-相應(yīng)于親合性中的1倍降低；→相應(yīng)于親合性的無(wú)變化。
表14鑒定的突變和結(jié)合特征
可溶FcγRIIB四聚復(fù)合物結(jié)合的分析顯示，顯示了與可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物的結(jié)合提高的8個(gè)突變體中的7個(gè)也具有與可溶FcγRIIB四聚復(fù)合物的提高的結(jié)合(附圖11B)。一個(gè)突變體，編號(hào)8，顯示了可溶FcγRIIB四聚復(fù)合物結(jié)合的下降。突變體中的三個(gè)在與可溶FcγRIIIA四聚復(fù)合物或可溶FcγRIIB四聚復(fù)合物的結(jié)合中沒(méi)有顯示差異，可能是由于引起酵母特異性改變的突變。
6.7Fc突變體的ADCC分析
效應(yīng)細(xì)胞制備通過(guò)Ficoll-Paque(Pharmacia，17-1440-02)Ficoll-Paque密度梯度離心從正常的外周人類血液純化外周血單核細(xì)胞(PBMC)(Biowhittaker/Poietics，1W-406)。血液在環(huán)境溫度在同一天裝運(yùn)，在PBS和葡萄糖(1g/1L)中1∶1稀釋，在15mL錐形管(3mL Ficoll；4mL PBS/血液)或50mL錐形管(15mLFicoll；20mL PBS/血液)中在Ficoll上分層。在室溫下在1500rpm(400rcf)進(jìn)行離心40分鐘。除去PBMC層(從50mL錐形管中大約4-6mL)并在50mL錐形管中在PBS(其不含Ca2+或Mg2+)1∶10稀釋，在室溫下在1200rpm(250rcf)另外旋轉(zhuǎn)十分鐘。除去上清液，將團(tuán)粒重懸浮在10-12mL PBS(其不含Ca2+或Mg2+)中，轉(zhuǎn)移到15mL錐形管，在室溫下在1200rpm再旋轉(zhuǎn)10分鐘。除去上清液，將團(tuán)粒重懸浮再最小體積(1-2mL)的培養(yǎng)基(Isocove’s培養(yǎng)基(IMDM)+10％胎兒牛血清(FBS)，4mM Gln，青霉素/鏈霉素(P/S))中。將重懸浮的PBMC稀釋到合適的體積用于ADCC分析；在ELISA96孔板(Nunc F96MaxiSorp Immunoplate)中進(jìn)行兩倍的稀釋。PBMC的產(chǎn)量是每40-50mL全血大約3-5×107個(gè)細(xì)胞。

目標(biāo)細(xì)胞制備在分析中使用的目標(biāo)細(xì)胞是SK-BR-3(ATCC登記號(hào)HTB-30；Trempe et al.，1976，Cancer Res.33-41)，Raji(ATCC登記號(hào)CCL-86；Epstein et al.，1965，J.Natl.Cancer Inst.34231-40)或Daudi細(xì)胞(ATCC登記號(hào)CCL-213；Klein et al.，1968，Cancer Res.281300-10)(重懸浮在0.5mL IMDM培養(yǎng)基中)，它們用銪螯合雙(乙酰氧基甲基)2，2”6’，2”terpyridine 6，6’dicarboxylate(BATDA試劑；Perkin Elmer DELFIA試劑；C136-100)標(biāo)記。使用K562細(xì)胞(ATCC登記號(hào)CCL-243)作為NK活性的對(duì)照細(xì)胞。旋轉(zhuǎn)沉淀Daudi和Raji細(xì)胞；在37℃，5％CO2將SK-BR-3細(xì)胞胰蛋白酶化2-5分鐘，在200-350G旋轉(zhuǎn)沉淀之前中和培養(yǎng)基。用于分析的目標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量約4-5×106個(gè)細(xì)胞，它不超過(guò)5×106個(gè)，因?yàn)樯僦?×106個(gè)細(xì)胞時(shí)標(biāo)記效力是最好的。一旦將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)沉淀，將培養(yǎng)基吸出至0.5mL，置于15mL Falcon試管中。添加2.5μl BATDA試劑，在37℃、5％CO2孵育混合物30分鐘。在10mL PBS和0.125mM sulfinpyrazole(“SP”；SIGMA S-9509)中洗滌細(xì)胞兩次，在10mL分析培養(yǎng)基(細(xì)胞培養(yǎng)基+0.125mM sulfinpyrazole)中洗滌兩次。將細(xì)胞重懸浮在1mL分析培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并稀釋。

當(dāng)在第一次PBS/SP洗滌后SK-BR-3細(xì)胞被用作目標(biāo)細(xì)胞時(shí)，吸出PBS/SP，添加500μg/mL FITC(PIERCE 461110)到含有SP、Gln和P/S的IMDM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2孵育30分鐘。用分析培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次；重懸浮在1mL分析培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并稀釋。

抗體調(diào)理作用一旦如上述制備了目標(biāo)細(xì)胞，用合適的抗體調(diào)理它們。對(duì)于Fc變體來(lái)說(shuō)，將50μL的1×105個(gè)細(xì)胞/mL添加到2×濃度的攜帶Fc變體的抗體中。終濃度如下Ch-4-4-20終濃度為0.5-1μg/mL；Ch4D5終濃度是30ng/mL-ng/mL。

對(duì)于具有Fc變體的4-4-20抗體來(lái)說(shuō)，將調(diào)理的目標(biāo)細(xì)胞添加到效應(yīng)細(xì)胞以產(chǎn)生75∶1的效應(yīng)目標(biāo)比例。對(duì)于具有Fc變體的Ch4D5抗體來(lái)說(shuō)，達(dá)到50∶1或75∶1的效應(yīng)目標(biāo)比例。用于分析的有效的PBMC梯度從100∶1到1∶1。在室溫下在57G在Beckman離心機(jī)中以200rpm將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)沉淀1分鐘。在37℃、5％CO2孵育細(xì)胞3-3.5小時(shí)。孵育之后，在10℃在Beckman離心機(jī)中以1000rpm(約220xg)旋轉(zhuǎn)細(xì)胞五分鐘。收集20μl上清液；添加200μL Eu溶液，在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上以120rpm在室溫下?lián)u動(dòng)混合物15分鐘。在時(shí)間分辨的熒光計(jì)(Victor 1420，Perkin Elmer)中測(cè)定熒光。
結(jié)果
如上所述，將變異Fc區(qū)亞克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體含有抗熒光素單克隆抗體4-4-20(Kranz et al.，1982J.Biol.Chem，257(12)6987-6995)的重鏈。變體4-4-20重鏈與輕鏈克隆在人類腎臟細(xì)胞系(293H)中短暫地共表達(dá)。收集上清液，使用ADCC分析進(jìn)行分析。附圖12顯示了突變體的ADCC活性是濃度依賴性的。如表8中概括的，五種具有變異Fc區(qū)的免疫球蛋白具有相對(duì)于野生型ch 4-4-20的增強(qiáng)的ADCC活性。五種突變體如下＝MGFc-27(G316D、A378V、D399E)；MGFc-31(P247L、N421K)；MGFc-10(K288N、A330S、P396L)；MGFc-28(N315I、V379M、T394M)；MGFc-29(F243I、V379L、G420V)。

分析了具有變異Fc區(qū)的其他4-4-20免疫球蛋白的相對(duì)于具有野生型Fc區(qū)的4-4-20免疫球蛋白的ADCC活性。這些結(jié)果在表15中概括。

如早先對(duì)4-4-20抗體所描述的相同方案也進(jìn)行ADCC分析，然而，變異Fc區(qū)被克隆到特異于人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2/neu)的人源化抗體(Ab4D5)中。在這種情況下，SK-BR-3細(xì)胞被用作目標(biāo)細(xì)胞，其用攜帶變異Fc區(qū)的HER2/neu抗體調(diào)理。HER2/neu是由SK-BR-3細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的，因而呈現(xiàn)在這些細(xì)胞表面。附圖13顯示了攜帶變異Fc區(qū)的HER2/neu抗體的ADCC活性。表16概括了在HER2/neu抗體的環(huán)境中突變體的ADCC活性。通過(guò)比較突變體和特定細(xì)胞裂解百分比值所需的野生型抗體的濃度，來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

如附圖13所示，相對(duì)于野生抗體，克隆到人源化抗HER2/neu抗體中的MGFc-5(V379M)，MGFc-9(P243I，V379L)，MGFc-10(K288N，A330S，P396L)，MGFc-13(K334E，T359N，T366S)，和MGFc-27(G316D，A378V，D399E)突變體展現(xiàn)了更高％的SK-BR-3細(xì)胞裂解。


6.8Fc突變體的動(dòng)力參數(shù)的分析
使用BIAcore分析(BIAcore instrument 1000，BIAcore Inc.，Piscataway，N.J.)來(lái)分析攜帶Fc突變的ch4-4-20抗體與FcγRIIIA和FcγRIIB結(jié)合的動(dòng)力參數(shù)。用于這個(gè)分析中是是可溶的單體蛋白，如以上6.2節(jié)所述FcγRIIIA的細(xì)胞外區(qū)連接到接頭AVITAG序列。用于這個(gè)分析的FcγRIIB是根據(jù)在2003年1月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/439,709中描述的方法制備的可溶二聚蛋白，通過(guò)完全引用將它合并在此。簡(jiǎn)要地，使用的FcγRIIB是融合到人類IgG2的鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的FcγRIIB的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。

通過(guò)胺聯(lián)結(jié)化學(xué)作用(通過(guò)用NHS/EDC的混合物修飾羧甲基基團(tuán))將BSA-FITC(10mM醋酸鹽緩沖液中36μg/mL，pH 5.0)傳感器芯片表面的四組流動(dòng)細(xì)胞之一(流動(dòng)細(xì)胞2)上，從而約5000應(yīng)答單位(RU)的BSA-FITC被固定在表面上。在這之后，用1MEt-NH2的注射“脫帽”未反應(yīng)的活性酯。一旦制備了合適的表面，通過(guò)以5μL/mL的流速20μg/mL溶液的一分鐘注射使攜帶Fc突變的ch 4-4-20抗體經(jīng)過(guò)表面。結(jié)合到表面的ch4-4-20抗體的水平在400和700RU之間。然后，以100μL/min將HBS-P緩沖液(10mM HEPES，150mM NaCl，.005％表面活性劑P20，3mM EDTA，pH 7.4)中受體(FcγRIIIA和FcγRIIB-Fc融合蛋白)的稀釋系列注射到表面上。不同的受體稀釋度之間的抗體再生優(yōu)選的通過(guò)100mM NaHCO3 pH9.4；3M NaCl的單次5秒注射液來(lái)進(jìn)行。

在分析的開(kāi)始和結(jié)束將受體的相同稀釋度注射到?jīng)]有任何ch-4-4-20抗體的BSA-FITC表面作為查考注射。

一旦收集到完整的數(shù)據(jù)集，使用由廠家BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的計(jì)算機(jī)算法將產(chǎn)生的結(jié)合曲線全局性地?cái)M合。這些算法計(jì)算Kon和Koff，從中作為兩個(gè)速率常數(shù)的比例(即，Koff/Kon)推斷出表觀平衡結(jié)合常數(shù)Kd。如何產(chǎn)生單獨(dú)的速率常數(shù)的更詳細(xì)的處理可以在BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)中找到。

比對(duì)兩種不同濃度(對(duì)FcγRIIIA為200nM和800nM，對(duì)FcγRIIB融合蛋白為200nM和400nM)的結(jié)合曲線，反應(yīng)調(diào)節(jié)到相同水平的捕獲的抗體，從實(shí)驗(yàn)曲線中減去參考曲線。締合合解離階段單獨(dú)地?cái)M合。離解速率常數(shù)從解離階段的32-34秒間隔獲得；締合階段擬合通過(guò)1∶1Langmuir模型獲得，在基礎(chǔ)Rmax和chi2指標(biāo)上選擇基礎(chǔ)擬合。
結(jié)果
附圖14顯示了在BSA-FITC固定化的傳感器芯片上具有突變Fc區(qū)的ch 4-4-20抗體的捕獲。約20μg/mL濃度的6μL抗體以5mL/min注射到BSA-FITC表面上。附圖15是FcγRIIIA與攜帶變異Fc區(qū)的ch-4-4-20抗體的實(shí)時(shí)結(jié)合的sensogram。在200nM濃度分析FcγRIIIA的結(jié)合，在野生型ch-4-4-20抗體獲得的反應(yīng)水平處將共振信號(hào)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)擬合在兩種不同F(xiàn)cγRIIIA濃度200和800nM獲得的數(shù)據(jù)來(lái)獲得\FcγRIIIA與ch-4-4-20抗體結(jié)合的動(dòng)力參數(shù)(附圖16)。實(shí)線表明了締合似合，其是根據(jù)對(duì)32-34秒間隔的解離曲線計(jì)算的Koff值獲得的。KD和Koff代表從所使用的兩種不同F(xiàn)cγRIIIA濃度計(jì)算的平均數(shù)。附圖17是FcγRIIB-Fc融合蛋白與攜帶變異Fc區(qū)的ch-4-4-20抗體的實(shí)時(shí)結(jié)合的sensogram。在200nM濃度分析FcγRIIB-Fc融合蛋白的結(jié)合，在野生型ch-4-4-20抗體獲得的反應(yīng)水平處將共振信號(hào)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)擬合在兩種不同F(xiàn)cγRIIB-Fc融合蛋白濃度200和800nM獲得的數(shù)據(jù)來(lái)獲得FcγRIIB-Fc融合蛋白與ch-4-4-20抗體結(jié)合的動(dòng)力參數(shù)(附圖18)。實(shí)線表明了締合擬合，其是根據(jù)對(duì)32-34秒間隔的解離曲線計(jì)算的Koff值獲得的。KD和Koff代表從所使用的兩種不同F(xiàn)cγRIIB-Fc融合蛋白濃度計(jì)算的平均數(shù)。

從BIAcore分析測(cè)定的動(dòng)力參數(shù)(Kon和Koff)與通過(guò)ELISA分析測(cè)定的突變體的特征以及在ADCC分析中測(cè)定的突變體的功能活性相關(guān)。具體地，如表17中所見(jiàn)，具有相對(duì)于野生型蛋白增強(qiáng)的ADCC活性、以及如ELISA分析測(cè)定的具有增強(qiáng)的對(duì)FcγRIIIA的結(jié)合的突變體，具有對(duì)FcγRIIIA的改善的Koff(即，更低的Koff)。因此，相對(duì)于野生型蛋白突變Fc蛋白對(duì)FcγRIIIA的更低的Koff值可能具有增強(qiáng)的ADCC功能。另一方面，如表18中所見(jiàn)，具有相對(duì)于野生型蛋白增強(qiáng)的ADCC活性、以及如ELISA分析測(cè)定的具有對(duì)FcγRIIB-Fc融合蛋白降低的結(jié)合的突變體，具有對(duì)FcγRIIB-Fc融合蛋白更高的Koff。

因而，對(duì)于FcγRIIIA和FcγRIIB的Koff值可用作突變體將在功能分析例如ADCC分析中如何表現(xiàn)的預(yù)示性度量。實(shí)際上，相對(duì)于ADCC數(shù)據(jù)標(biāo)繪了突變體與野生型蛋白對(duì)于FcγRIIIA和FcγRIIB-Fc融合蛋白的Koff值的比值(附圖19)。具體地，就對(duì)于FcγRIIIA的Koff值來(lái)說(shuō)，相對(duì)與ADCC數(shù)據(jù)標(biāo)繪了Koff(wt)/Koff(mutant)的比值；就對(duì)于FcγRIIB的Koff值來(lái)說(shuō)，相對(duì)于ADCC數(shù)據(jù)標(biāo)繪了Koff(mut)/Koff(wt)的比值。高于一(1)的數(shù)字顯示了相對(duì)于野生型對(duì)于FcγRIIIA降低的離解速率合對(duì)于FcγRIIB-Fc提高的離解速率。落入標(biāo)明的框中的突變體具有對(duì)于FcγRIIIA結(jié)合的更低的解離速率，以及對(duì)于FcγRIIB-Fc結(jié)合的更高的解離速率，并具有增強(qiáng)的ADCC功能。
表17.通過(guò)200nM和800nM的結(jié)合曲線的“獨(dú)立擬合”獲得的FcRIIIa與ch4-4-20Ab結(jié)合的動(dòng)力參數(shù) 突出的突變體不適合根據(jù)ELISA或ADCC數(shù)據(jù)的組。
表18.通過(guò)200nM和800nM結(jié)合曲線的“獨(dú)立擬合”獲得的FcRIIB-Fc與野生型合突變ch4-4-20Ab結(jié)合的動(dòng)力參數(shù)。
6.9使用固相分析使用多輪富集篩選Fc突變體
以下的突變體篩選目的在于鑒定顯示了提高的與FcγRIIIA的結(jié)合和降低的與FcγRIIB的結(jié)合的其他組突變體。通過(guò)ELISA繼之以在4-4-20系統(tǒng)中測(cè)試ADCC來(lái)進(jìn)行選定的Fc變體的二次篩選。然后使用熒光素包衣的SK-BR3細(xì)胞作為目標(biāo)和從人類供體分離的PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞群體，主要根據(jù)它們經(jīng)由4-4-20介導(dǎo)ADCC的能力來(lái)選擇突變體。顯示了ADCC中相關(guān)的提高，例如因子為2的增強(qiáng)的Fc突變，然后被克隆到抗-HER2/neu或抗-CD20chAbs中，使用合適的腫瘤細(xì)胞作為目標(biāo)在ADCC分析中測(cè)試。還通過(guò)BIAcore分析突變體，測(cè)定它們相關(guān)的Koff。

篩選1使用包被FcγRIIB的磁性珠子的連續(xù)的固相耗盡和選擇，繼之以用包被FcγRIIIA的磁性珠子選擇這個(gè)篩選的目的是鑒定不再結(jié)合FcγRIIB或顯示了降低的與FcγRIIB的結(jié)合的Fc突變體。用包被FcγRIIB的磁性珠子(“My One”，Dynal)孵育10倍過(guò)量的天然庫(kù)(～107個(gè)細(xì)胞)。通過(guò)將含有混合物的試管置于磁場(chǎng)中從未結(jié)合的部分中分離與珠子結(jié)合的酵母。除去未與珠子結(jié)合的那些酵母細(xì)胞并置于新鮮培養(yǎng)基中。然后將它們與包被FcγRIIIA的珠子結(jié)合。通過(guò)將含有混合物的試管置于磁場(chǎng)中從未結(jié)合的部分中分離與珠子結(jié)合的酵母。除去未結(jié)合的酵母，通過(guò)強(qiáng)力的旋渦除去結(jié)合的細(xì)胞回收的細(xì)胞重新再含有葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在含有半乳糖的選擇培養(yǎng)基中重新誘導(dǎo)。重復(fù)選擇過(guò)程。最終的培養(yǎng)物然后用于俘獲DNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增含有Fc結(jié)構(gòu)域的插入物并克隆到4-4-20中。通過(guò)4-4-20ELISA和ADCC分析篩選大約90個(gè)Fc突變體，產(chǎn)生的陽(yáng)性突變體在表19中示出。
表19通過(guò)使用包被FcγRIIB的磁性珠子的連續(xù)的固相耗盡和選擇，繼之以用包被FcγRIIIA的磁性珠子選擇來(lái)選擇的突變體

篩選2&3通過(guò)FACS、平衡和動(dòng)力學(xué)篩選選擇的篩選第一次庫(kù)篩選鑒定了在位置396、氨基酸從脯氨酸變化到亮氨酸(P396L)的突變。這個(gè)Fc變體顯示了與FcγRIIIA和FcγRIIB都提高的結(jié)合。使用P396L作為基礎(chǔ)系構(gòu)建了第二個(gè)庫(kù)。使用PCR誘變來(lái)產(chǎn)生～107個(gè)突變體，它們每一個(gè)都含有P396L突變并含有其他的核苷酸變化。使用兩組條件篩選P396L庫(kù)。

使用生物素化的FcγRIIIA-接頭-avitag作為單體、使用已經(jīng)描述的方法進(jìn)行平衡篩選。在0.5mL大約7nM FcγRIIIA中孵育大約10倍過(guò)量的庫(kù)(108個(gè)細(xì)胞)1小時(shí)。通過(guò)FACS分選混合物，選擇binders的上1.2％。選擇的酵母細(xì)胞在含有葡萄糖的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在含有半乳糖的選擇培養(yǎng)基中誘導(dǎo)。平衡篩選重復(fù)第二次，設(shè)置分選門(mén)來(lái)收集binders的上0.2％。然后將選擇的酵母細(xì)胞在葡萄糖中在選擇條件下生長(zhǎng)。這個(gè)培養(yǎng)物然后用于俘獲DNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增含有Fc結(jié)構(gòu)域的插入物，使用已經(jīng)描述的方法克隆到編碼4-4-20可變區(qū)的核苷酸序列中。通過(guò)4-4-20ELISA和ADCC分析篩選大約90個(gè)Fc突變體，產(chǎn)生的陽(yáng)性突變體在表20中示出。
表20使用平衡篩選用大約7nM的FcRIIIA濃度選擇的突變體

還進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)的篩選來(lái)鑒定在結(jié)合FcγRIIIA中具有改善的Koff的突變體。確定條件用于使用具有展示在酵母表面的P396L Fc變體的菌株篩選P396L庫(kù)。簡(jiǎn)要地，用0.1μM生物素化的FcγRIIIA-接頭-avitag單體孵育在誘導(dǎo)條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞1小時(shí)。洗滌細(xì)胞來(lái)除去標(biāo)記的配體。然后用0.1μM未標(biāo)記的FcγRIIIA-接頭-avitag單體孵育標(biāo)記的細(xì)胞不同的時(shí)間，洗滌，然后用SA:PE染色用于FACS分析(附圖20)。還用山羊抗人Fc來(lái)染色細(xì)胞來(lái)顯示在實(shí)驗(yàn)期間維持了Fc展示。

根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)研究，確定了1分鐘的孵育引起了約50％的細(xì)胞染色損失。選擇這個(gè)時(shí)點(diǎn)用于使用P396L庫(kù)的動(dòng)力學(xué)篩選。在0.5mL體積中與0.1μM生物素化的FcγRIIIA-接頭-avitag單體孵育大約10倍過(guò)量的庫(kù)(108個(gè)細(xì)胞)。洗滌細(xì)胞，然后與未標(biāo)記配體孵育1分鐘。隨后，洗滌細(xì)胞并用SA:PE標(biāo)記。通過(guò)FACS分選混合物，選擇binders的上0.3％。選擇的酵母細(xì)胞在含有葡萄糖的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在含有半乳糖的選擇培養(yǎng)基中誘導(dǎo)。動(dòng)力學(xué)篩選重復(fù)第二次，設(shè)置分選門(mén)來(lái)收集binders的上0.2％。將未選擇的P396L庫(kù)與通過(guò)FACS選擇了改善的結(jié)合的酵母細(xì)胞比較(附圖21)。直方圖顯示了用FcγRIIIA/PE和山羊抗人類Fc/FITC共染色的細(xì)胞的百分比(右上方)。

然后將來(lái)自第二次分選的選擇的酵母細(xì)胞在葡萄糖中在選擇條件下生長(zhǎng)。這個(gè)培養(yǎng)物然后用于俘獲DNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增含有Fc結(jié)構(gòu)域的插入物，使用如上所述的方法克隆到編碼4-4-20可變區(qū)的核苷酸序列中。通過(guò)4-4-21ELISA和ADCC分析篩選大約90個(gè)Fc突變體，產(chǎn)生的陽(yáng)性突變體在表21中示出。
表21通過(guò)FACS使用等摩爾量未標(biāo)記的CD16A動(dòng)力學(xué)篩選1分鐘選擇的突變體
篩選4和5使用FcγRIIIA 158V等位基因，組合固相FcγRIIB耗盡步驟和通過(guò)FACS分選的FcγRIIIA選擇
分析來(lái)自篩選1的Fc變體顯示了從第二次篩選選擇的突變具有對(duì)FcγRIIIA和FcγRIIB都改善的結(jié)合。因此，數(shù)據(jù)表明在建立的條件下使用磁性珠子(固相)連續(xù)耗盡和選擇未能有效地選擇FcγRIIIA和FcγRIIB的差異結(jié)合。因此，為了更有效地篩選結(jié)合FcγRIIIA、而具有降低的FcγRIIB結(jié)合或不與FcγRIIB結(jié)合的突變體，將固相FcγRIIB耗盡步驟與通過(guò)FACS分選的FcγRIIIA選擇組合。這種組合鑒定了以大于或等于野生型Fc的親合性結(jié)合FcγRIIIA的Fc變體。

用包被FcγRIIB的磁性珠子孵育10倍過(guò)量的天然庫(kù)(～107個(gè)細(xì)胞)。通過(guò)將含有混合物的試管置于磁場(chǎng)中從未結(jié)合的部分中分離與珠子結(jié)合的酵母。除去未與珠子結(jié)合的那些酵母細(xì)胞并置于新鮮培養(yǎng)基中，隨后在含有半乳糖的培養(yǎng)基中重新誘導(dǎo)。通過(guò)磁性珠子的FcγRIIB耗盡重復(fù)5次。分析產(chǎn)生的酵母群體，發(fā)現(xiàn)顯示了超過(guò)50％的山羊人抗人Fc染色的細(xì)胞，和非常小百分比的細(xì)胞被FcγRIIIA染色。然后使用0.1μM生物素化的FcγRIIIA接頭-avitag通過(guò)FACS分選來(lái)選擇這些細(xì)胞兩次(數(shù)據(jù)未顯示)。FcγRIIIA是158V同種型。在每次分選之后分析酵母細(xì)胞對(duì)FcγRIIIA和FcγRIIB的結(jié)合，并與野生型Fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)合相比較(附圖22A-B)。

然后將來(lái)自第二次分選的選擇的酵母細(xì)胞在葡萄糖中在選擇條件下生長(zhǎng)。這個(gè)培養(yǎng)物然后用于捕撈DNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增含有Fc結(jié)構(gòu)域的插入物，克隆到編碼4-4-20可變區(qū)的核苷酸序列中。通過(guò)4-4-22ELISA和ADCC分析來(lái)篩選大約90個(gè)Fc突變體，產(chǎn)生的陽(yáng)性突變體在表22中示出(突變體61-66)。
表22通過(guò)使用包被CD32B的珠子的磁性珠子耗盡和最終通過(guò)FACS使用FcγRIIIA 158纈氨酸或158苯丙氨酸的選擇來(lái)選擇的突變體

使用FcγRIIIA的158F等位基因篩選Fc突變體存在著具有不同的IgG1Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合親合性的FcγRIIIA受體的兩種不同的等位基因(Koene et al.，1997，Blood 901109-1114；Wu et al.，1997，J.Clin.Invest.1001059-70)。158F等位基因以158V等位基因低1/5-10的結(jié)合常數(shù)結(jié)合Fc結(jié)構(gòu)域。早先所有使用酵母顯示的Fc篩選都是使用高結(jié)合158V等位基因作為配體進(jìn)行的。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用生物素化的的FcγRIIIA158F-接頭-avitag單體作為配體從FcγRIIB耗盡的酵母群體中選擇Fc突變體。分選門(mén)被設(shè)置為選擇FcγRIIIA 158Fbinders的上百分之0.25。通過(guò)FACS分析產(chǎn)生的富集的群體(附圖22B)。然后分離單獨(dú)的克隆，通過(guò)FACS來(lái)分析它們與不同F(xiàn)cγR的結(jié)合(附圖22B)。分析來(lái)自群體的單獨(dú)克隆引起了鑒定處攜帶5個(gè)突變的單個(gè)突變體MgFc67(V284M、S298N、K334E、R355W、R416S)，其具有對(duì)FcγRIIIA增強(qiáng)的結(jié)合和對(duì)FcγRIIB降低的結(jié)合。
通過(guò)對(duì)篩選1、2和3的ADCC分析來(lái)第二次篩選突變體
然后使用標(biāo)準(zhǔn)的ADCC分析來(lái)分析上述篩選中選出的突變體，以確定由攜帶Fc突變體的ch4-4-20介導(dǎo)的裂解的相對(duì)速率。使用已經(jīng)如上所述的方法構(gòu)建攜帶Fc變體的ch4-4-20抗體。SK-BR3細(xì)胞被用作目標(biāo)，效應(yīng)細(xì)胞是如上描述的(6.7節(jié))使用Ficoll梯度從供體分離的PBMC。突變體產(chǎn)生的ADCC活性在表23中概括。

如在表23中所見(jiàn)，使用上述基于FcγRIIB耗盡和FcγRIIIA選擇的第一和第二次篩選分離的突變體顯示了相對(duì)于野生型的增強(qiáng)的ADCC活性。
表23在用熒光素包被的SKBR3細(xì)胞上由4-4-20抗熒光素抗體介導(dǎo)的ADCC的分析

使用0.5μg/mL ch4-4-20分析突變體37、38、39、41、43。所有其他抗體在1μg/mL測(cè)試。所有速率針對(duì)野生型ch4-4-20(IgG1)標(biāo)準(zhǔn)化。

通過(guò)替換單克隆抗體的Fc結(jié)構(gòu)域，將突變體另外地克隆到抗腫瘤單克隆抗體4D5(抗HER2/neu)和抗CD20單克隆抗體2H7的重鏈中。使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)短暫的轉(zhuǎn)染入293H細(xì)胞和在蛋白G柱上純化，來(lái)表達(dá)和純化這些嵌合的單克隆抗體，并在ADCC分析中測(cè)試。使用SK-BR3細(xì)胞作為目標(biāo)在ADCC分析中測(cè)試嵌合的4D5抗體(附圖23)，而使用Daudi細(xì)胞作為目標(biāo)在ADCC分析中測(cè)試嵌合的2H7抗體(附圖24)。

經(jīng)由BIAcore的突變體的第二次篩選然后通過(guò)BIAcore來(lái)分析在以上的篩選中選擇的突變體，以確定結(jié)合FcγRIIIA(158V)和FcγRIIB的動(dòng)力參數(shù)。使用的方法與上文6.8節(jié)中公開(kāi)的類似。

如從使用ch4-4-20單克隆抗體中的Fc突變體的實(shí)驗(yàn)測(cè)定的，顯示的數(shù)據(jù)是相對(duì)于野生型解離速率的Koff值。相對(duì)數(shù)大于一表明Koff速率的降低。小于一的數(shù)字表明解離速率的提高。

顯示了對(duì)FcγRIIIA的解離速率的降低的突變體是MgFc38(K392、P396L)、MgFc43(Y319F、P352L、P396L)、MgFc42(D221E、D270E、V308A、Q311H、P396L、G402D)、MgFc43b(K288R、T307A、K344E、P396L)、MgFc44(K334N、P396L)、MgFc46(P217S、P396L)、MgFc49(K261N、K210M、P396L)。顯示了對(duì)FcγRIIB的解離速率的降低的突變體是MgFc38(K392、P396L)、MgFc39(E293V、Q295E、A327T)、MgFc43(K288R、T307A、K344E、P396L)、MgFc44(K334N、P396L)。Biacore數(shù)據(jù)在表24中概括。
表24BIAcore數(shù)據(jù)。

6.10PBMC介導(dǎo)的ADCC分析
材料和方法
通過(guò)基于PBMC的ADCC使用60∶1的效應(yīng)目標(biāo)比例測(cè)試了顯示與FcγRIIIA的改善的結(jié)合的Fc變體。使用兩種不同的腫瘤模型系統(tǒng)作為目標(biāo)，SK-BR3(抗HER2/neu)和Daudi(抗CD20)。對(duì)每個(gè)突變體測(cè)定特異性裂解百分比。使用線性回歸分析來(lái)標(biāo)繪數(shù)據(jù)，設(shè)置最大裂解百分比為100％。

經(jīng)由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞上激活A(yù)DCC，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是由低親合性FcγR和免疫復(fù)合物之間的相互作用觸發(fā)的。效應(yīng)細(xì)胞群體來(lái)自原始血液或活化的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MDM)。用銪加載目標(biāo)細(xì)胞，與MAb孵育，隨后與效應(yīng)細(xì)胞群體孵育。銪與51Cr起到同樣的作用，但它是非放射性的，在熒光平板讀取器中檢測(cè)釋放的銪。使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)從供體的外周血(PBM)收獲的淋巴細(xì)胞主要含有天然殺傷細(xì)胞(NK)。大多數(shù)ADCC活性將經(jīng)由在它們表面含有FcγRIIIA而不是FcγRIIB的NK發(fā)生。

使用分別表達(dá)HER2/neu和CD20的兩種不同的目標(biāo)細(xì)胞群體SK-BR-3和Daudi進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用Ch4-4-20/FITC包被的SK-BR-3、Ch4D5/SKBR3和Rituxan/Daudi來(lái)建立ADCC分析(數(shù)據(jù)未顯示)。使用鑒定的Fc突變修飾嵌合的MAb。將Fc突變體克隆到Ch4D5中。使用純化的Ab來(lái)調(diào)理SK-BR-3細(xì)胞或Dau di細(xì)胞。將Fc突變體克隆到Ch4D5中。

結(jié)果。Fc突變?cè)赟K BR3細(xì)胞中顯示了改善的PBMC介導(dǎo)的ADCC活性(附圖27)。圖表顯示了標(biāo)準(zhǔn)ADCC分析的線性回歸分析。使用75∶1的效應(yīng)物對(duì)目標(biāo)比，在3logs上滴定抗體。裂解％＝(實(shí)驗(yàn)的釋放-SR)/(MR-SR)＊100。

Fc突變?cè)贒audi細(xì)胞中顯示了改善的PBMC介導(dǎo)的ADCC活性(附圖28)。
6.11基于單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MDM)的ADCC分析
在小鼠腫瘤模型中FcγR依賴性腫瘤細(xì)胞殺傷是由巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的(Clynes et al.，1998，PNAS USA，95652-6)。來(lái)自供體的淘選的單核細(xì)胞被用作效應(yīng)細(xì)胞來(lái)分析Fc突變體在ADCC分析中觸發(fā)細(xì)胞的細(xì)胞毒性的效力。FcγRI、FcγR3A和FcγR2B的表達(dá)模式受不同生長(zhǎng)條件的影響。使用FcR特異性MAb通過(guò)FACS檢查冷凍的單核細(xì)胞的FcγR表達(dá)，所述單核細(xì)胞培養(yǎng)在含有不同組合的細(xì)胞因子和人類血清的培養(yǎng)基中。(附圖29)。培養(yǎng)的細(xì)胞用FcγR特異性抗體染色并通過(guò)FACS來(lái)分析以確定MDM FcR分布型。最好地模擬巨噬細(xì)胞體內(nèi)FcγR表達(dá)，即，顯示了最大部分的表達(dá)CD16和CD32B的細(xì)胞的條件被用于基于單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MDM)的ADCC分析。對(duì)于附圖29中的實(shí)驗(yàn)，冷凍淘選的單核細(xì)胞在含有M-CSF(條件1)或GM-CSF(條件2)的DMEM和20％FBS中生長(zhǎng)8天。對(duì)于附圖30中的實(shí)驗(yàn)，在ADCC分析之前，冷凍淘選的單核細(xì)胞在含有GM-CSF、IL-2和IFNγ的DMEM和20％FBS中培養(yǎng)2天。也已經(jīng)開(kāi)發(fā)了容許高水平的CD16和CD32B表達(dá)的無(wú)血清條件(數(shù)據(jù)未顯示)。簡(jiǎn)要地，純化的單核細(xì)胞在含有GM-CSF、M-CSF、IL-6、IL-10 IL-1β的Macrophage-SFM(Invitrogen)中生長(zhǎng)6-8天。雖然使用細(xì)胞因子的混合物在這些培養(yǎng)物中CD32B+/CD16+細(xì)胞的發(fā)生率是最高的，兩種或多種細(xì)胞因子的組合也會(huì)提高FcγR表達(dá)(M-CSF/IL-6、M-CSF/IL-10；或M-CSF/IL-1β)。對(duì)于ADCC分析，添加IFNγ持續(xù)最后的24-48小時(shí)。

基于MDM的ADCC需要＞16小時(shí)的孵育時(shí)間來(lái)過(guò)程目標(biāo)細(xì)胞殺傷。用銦-111加載目標(biāo)細(xì)胞，其長(zhǎng)孵育期地在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)保持。使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定銦釋放。所有其他試劑、Abs和目標(biāo)細(xì)胞都類似于基于PBMC的ADCC分析。由于FcγRI的ADCC活性可以使用抗FcRI阻斷抗體(M21，Ancell)來(lái)有效地阻斷。分析條件稍微不同于基于PBMC的分析。20∶1目標(biāo)比效應(yīng)；在37℃18-14小時(shí)孵育。

測(cè)試了顯示改善的PBMC ADCC、提高的對(duì)FcγRIIIA的結(jié)合、或降低的對(duì)FcγRIIB的結(jié)合的Fc突變體(附圖30)。
6.12Fc突變對(duì)補(bǔ)體活性的影響
最初根據(jù)它們對(duì)FcγRIIIA的提高的結(jié)合鑒定了Fc突變體。隨后驗(yàn)證這些突變體對(duì)所有低親合性受體的改善的親合性，和在很多情況下在由PBMC介導(dǎo)的ADCC中的改善的活性。體內(nèi)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)生。除了ADCC之外，其他可能的機(jī)制包括補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和細(xì)胞凋亡。C1q與免疫球蛋白的Fc區(qū)的結(jié)合啟動(dòng)級(jí)聯(lián)，引起通過(guò)CDC的細(xì)胞裂解。已經(jīng)在一系列Fc突變體中研究了C1q和Fc之間的相互作用。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，C1q和低親合性FcR結(jié)合Fc的重疊區(qū)，然而Fc內(nèi)確切的接觸殘基不同。

檢查了在基于PBMC的分析中顯示了改善的ADCC的突變體在CDC中的效果。在抗CD20Ch-mAb 2H7中分析了抗體。對(duì)于測(cè)試的每一個(gè)突變ch-mAb我們檢測(cè)了改善的CDC。有趣地，即使這些突變體是為了它們改善的ADCC而選擇的，它們也顯示了增強(qiáng)的CDC。

材料和方法。CDC分析被用于測(cè)試Fc突變體，使用抗CD20和Daudi細(xì)胞作為目標(biāo)。豚鼠血清用作補(bǔ)體的來(lái)源(US Biological)。CDC分析類似于基于PBMC的ADCC。用銪加載目標(biāo)細(xì)胞并用ChMAb調(diào)理。然而，添加補(bǔ)體，豚鼠血清，替代效應(yīng)細(xì)胞。附圖31顯示了分析的流程圖。在3個(gè)數(shù)量級(jí)上滴定抗CD20ChMab。計(jì)算裂解％。Daudi細(xì)胞(3×106)用BADTA試劑標(biāo)記。1×104個(gè)細(xì)胞等分到96孔板的孔中。使用3倍稀釋度將抗體滴入孔中。容許調(diào)理反應(yīng)在37℃在5％CO2中進(jìn)行30-40分鐘。添加豚鼠血清到20％的終濃度。容許反應(yīng)在37℃在5％CO2中進(jìn)行3.5小時(shí)。隨后，添加100uls細(xì)胞培養(yǎng)基到反應(yīng)中，使細(xì)胞旋轉(zhuǎn)沉淀。為了檢測(cè)，將20uls上清液添加到200uls的銪溶液中，在Victor2(Wallac)中讀取平板。

結(jié)果將顯示了對(duì)活化性FcR或C1q的改善的結(jié)合的所有突變體置于CDC分析中(附圖32)。顯示了對(duì)FcγRIIIA的增強(qiáng)的結(jié)合的Fc突變體也顯示了改善的補(bǔ)體活性。每個(gè)突變體顯示了相比野生型增強(qiáng)的補(bǔ)體活性。測(cè)試的突變體是雙突變體。在每種情況下，存在的突變之一是P396L。

為了確定CDC的提高是否與C1q和IgG1 Fc的提高的結(jié)合相關(guān)，使用表面胞質(zhì)團(tuán)共振實(shí)時(shí)地測(cè)量?jī)煞N蛋白之間的結(jié)合。為了檢查C1q和IgG1Fc之間的結(jié)合，將Fc變體克隆到抗CD32B ch-mAb 2B6中。這容許我們經(jīng)由可溶的CD32B蛋白將wt和突變抗體捕獲到玻璃載片上(附圖34A)。在CDC中測(cè)試的四個(gè)突變體中三個(gè)也在Biacore中檢查。所有3種都顯示了相比野生型Fc的增強(qiáng)的Koff(附圖34B)。C1q結(jié)合2B6突變體的Biacore形式證明了具有P396L突變的突變體的增強(qiáng)的結(jié)合(附圖35)。突變D270E可以不同的程度地降低C1q結(jié)合。FcγR和C1q結(jié)合的動(dòng)力學(xué)分析的概述在以下的表25中描繪。
表25結(jié)合突變體2B6的FcγR和C1q的動(dòng)力學(xué)分析
6.13設(shè)計(jì)具有與FcγRIIB降低的結(jié)合的Fc變體
根據(jù)降低與FcγRIIB的結(jié)合并提高與FcγRIIA 131H的結(jié)合的Fc突變體的選擇，鑒定了許多包括D270E的突變體。單獨(dú)地測(cè)試了每個(gè)突變與低親合性Fc受體的結(jié)合以及它們的等位變體。

D270E具有結(jié)合特征，所述結(jié)合特征暗示了它將特異性地降低FcγRIIB結(jié)合。與一些突變組合測(cè)試了D270E，所述突變是早先根據(jù)它們與所有FcR的改善的結(jié)合鑒定的。

結(jié)果。如表26和27以及附圖36和37所示，增加D270E突變?cè)鰪?qiáng)了FcγRIIIA和FcγRIIA H131結(jié)合并降低了與FcγRIIB的結(jié)合。附圖38顯示了相對(duì)于Koff的MDM ADCC數(shù)據(jù)的標(biāo)繪圖，Koff是對(duì)CD32A H131H結(jié)合選擇突變體所測(cè)定的。
表26.增加D270E突變?cè)鰪?qiáng)了FcγRIIIA和FcγRIIA H131結(jié)合并降低了FcγRIIB結(jié)合 表274D5突變體的動(dòng)力學(xué)特征

在此描述和要求權(quán)利的發(fā)明不被限制在此處公開(kāi)的特定實(shí)施方式的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些實(shí)施方式意欲作為本發(fā)明的幾個(gè)方面的例示。任何等同的實(shí)施方式都將處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，根據(jù)以上的說(shuō)明，除了在此顯示和描述的之外，本發(fā)明的各種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。這種修改也將落在附隨的權(quán)利要求的范圍之中。

引用了整個(gè)申請(qǐng)中的各種出版物。為了所有目的，通過(guò)完全引用將它們的內(nèi)容合并到本申請(qǐng)中。
序列表
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<120>具有變異Fc區(qū)的抗體的鑒定和工程化以及使用方法
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<150>60/439,498
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<160>10
<170>FastSEQ for Windows Version4.0
<210>1
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物5’接頭.avitag
<400>1
ggccgcaggt ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggt ctgaacgaca tcttcgaggc 60
tcagaaaatc gaatggcacg aatgat 86
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<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物3’接頭.avitag
<400>2
ctagatcatt cgtgccattc gattttctga gcctcgaaga tgtcgttcag accagaacca 60
ccaccaccag aaccaccacc acctgc 86
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物FcR3A左側(cè)
<400>3
gttggatcct ccaactgctc tgctacttct agttt35
<210>4
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<220>
<223>引物FcR3A右側(cè)
<400>4
gaaaagctta aagaatgatg agatggttga cact 34
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<212>DNA
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<220>
<223>引物FcR2B右側(cè)
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gaagtcgacaatgatcccca ttggtgaaga g 31
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<220>
<223>引物FcR2B左側(cè)
<400>6
gttagatctt gctgtgctat tcctggctcc 30
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gtctgctcga agcattaacc20
權(quán)利要求
1.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的多肽的改變的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述至少一個(gè)氨基酸修飾不單獨(dú)地是位置255、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439的任一處的替換，或不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360、326或430的任一處的丙氨酸；位置330的賴氨酸；位置339的蘇氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的絲氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的組氨酸；位置334的纈氨酸；或位置334的亮氨酸；位置335的賴氨酸位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；位置290的絲氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸；位置326的絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的賴氨酸；位置335谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸。
2.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，條件是所述至少一個(gè)氨基酸修飾不單獨(dú)地是在位置329、331或332的替換，或不具有位置256、290、298、312、326、333、334、359、360或430的任一處的丙氨酸；位置330的賴氨酸；位置339的蘇氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的絲氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334甲硫氨酸；位置334的組氨酸；位置334的纈氨酸；位置330的賴氨酸；位置335的賴氨酸；或位置334的亮氨酸。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含選自以下構(gòu)成的組的一組替換在位置339用纈氨酸以及在位置347用組氨酸替換；在位置251用脯氨酸以及在位置415用異亮氨酸替換；在位置185用甲硫氨酸、和在位置218用天冬酰胺、和在位置292用亮氨酸、和在位置399用谷氨酸替換；在位置290用脯氨酸以及在位置142用脯氨酸替換；在位置141用纈氨酸、在位置268用亮氨酸、在位置288用谷氨酸以及在位置291用絲氨酸替換；在位置133用甲硫氨酸、在位置149用酪氨酸、在位置205用谷氨酸、在位置334用天冬酰胺以及在位置384用賴氨酸替換；在位置125用亮氨酸、在位置215用異亮氨酸以及在位置408用異亮氨酸替換；在位置395用異亮氨酸替換；在位置247用組氨酸替換；在位置396用組氨酸替換；在位置392用精氨酸替換；在位置415用異亮氨酸以及在位置251用苯丙氨酸替換；在位置301用半胱氨酸、在位置252用亮氨酸以及在位置192用蘇氨酸替換；在位置315用異亮氨酸替換；在位置132用異亮氨酸替換；在位置162用纈氨酸替換；在位置348用甲硫氨酸、在位置334用天冬酰胺、在位置275用異亮氨酸、在位置202用甲硫氨酸以及在位置147用蘇氨酸替換；在位置310用酪氨酸、在位置289用丙氨酸以及位置337用谷氨酸替換；在位置119用苯丙氨酸、在位置371用絲氨酸、在位置407用纈氨酸以及在位置258用天冬氨酸替換；在位置409用精氨酸以及在位置166用天冬酰胺替換；在位置408用異亮氨酸、在位置215用異亮氨酸以及在位置125用異亮氨酸替換；在位置396用亮氨酸替換；在位置385用谷氨酸以及在位置247用組氨酸替換；在位置379用甲硫氨酸替換；在位置219用酪氨酸替換；在位置282用甲硫氨酸替換；在位置276用異亮氨酸、在位置334用天冬酰胺以及在位置348用甲硫氨酸替換；在位置401用纈氨酸替換；在位置280用亮氨酸以及在位置395用絲氨酸替換；在位置222用天冬酰胺替換；在位置246用蘇氨酸以及在位置319用苯丙氨酸替換；在位置243用異亮氨酸以及在位置379用亮氨酸替換；在位置246用蘇氨酸以及在位置396用組氨酸替換；在位置268用天冬氨酸以及在位置318用天冬氨酸替換；在位置288用天冬酰胺、在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；在位置243用亮氨酸、在位置255用亮氨酸以及在位置318用賴氨酸替換；在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用絲氨酸替換；在位置377用苯丙氨酸替換；在位置334用異亮氨酸替換；在位置244用組氨酸、在位置358用甲硫氨酸、在位置379用甲硫氨酸、在位置384用賴氨酸以及在位置378用甲硫氨酸替換；在位置247用用亮氨酸替換；在位置217用絲氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置408用精氨酸替換；在位置247用亮氨酸、在位置253用天冬酰胺以及在位置334用天冬酰胺替換；在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸替換；在位置334用谷氨酸以及在位置380用天冬氨酸替換；在位置256用絲氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置334用谷氨酸以及在位置390用絲氨酸替換；在位置372用酪氨酸替換；在位置246用異亮氨酸以及在位置334用天冬酰胺替換；在位置335用天冬酰胺、在位置370用谷氨酸、在位置378用谷氨酸、在位置394用甲硫氨酸以及在位置424用亮氨酸替換；在位置320用谷氨酸以及在位置326用谷氨酸替換；在位置224用亮氨酸替換；在位置375用半胱氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；在位置233用天冬氨酸以及在位置334用谷氨酸替換；和在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、在位置366用絲氨酸以及在位置386用精氨酸替換。
4.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，并且所述多肽進(jìn)一步以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIB更低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，條件是所述變異Fc區(qū)不具有在位置256、298、333或334的任一處的丙氨酸。
5.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述修飾包含在Fc區(qū)中的至少一個(gè)氨基酸替換。
6.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述氨基酸修飾包含在Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸修飾。
7.權(quán)利要求6的多肽，其中所述氨基酸修飾包含Pro 247用另一個(gè)氨基酸在該位置的替換。
8.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述氨基酸修飾包含在Fc區(qū)的CH3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸修飾。
9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述氨基酸修飾包含在位置396用另一個(gè)氨基酸在該位置的替換。
10.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述氨基酸修飾包含在Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸修飾和在CH3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸修飾。
11.權(quán)利要求6的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾包含在位置251、292、268、288、291或247用另一個(gè)氨基酸在該位置替換。
12.權(quán)利要求8的多肽，其中所述CH3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾包含在位置347、415、399、383、384、407、395或396用另一個(gè)氨基酸在該位置替換。
13.權(quán)利要求10的多肽，進(jìn)一步包含在Fc區(qū)的絞鏈區(qū)中的至少一個(gè)氨基酸修飾。
14.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述氨基酸修飾包含在Fc區(qū)的絞鏈區(qū)中的至少一個(gè)氨基酸修飾。
15.權(quán)利要求1、2或4的任一項(xiàng)的多肽，其中親本多肽的Fc區(qū)是人類IgG Fc區(qū)。
16.權(quán)利要求15的多肽，其中所述人類IgG Fc區(qū)是人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。
17.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽是抗體。
18.包含變異Fc區(qū)的抗體，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述抗體以比包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，和所述抗體進(jìn)一步的以比包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體結(jié)合FcγRIIB更低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，條件是所述變異Fc區(qū)不具有在位置256、298、333或334的任一處的丙氨酸。
19.權(quán)利要求17的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體、人源化抗體或人類抗體。
20.包含編碼權(quán)利要求1或2的任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列的核酸。
21.包含權(quán)利要求20的核酸的載體。
22.權(quán)利要求21的載體，其是表達(dá)載體。
23.包含權(quán)利要求22的核酸的宿主細(xì)胞。
24.重組生產(chǎn)權(quán)利要求1或2的多肽的方法，所述方法包括(i)在適合于所述多肽的表達(dá)的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼所述多肽的核酸的宿主細(xì)胞；和(ii)從所述培養(yǎng)基回收所述多肽。
25.權(quán)利要求17或18的抗體，其中所述抗體以比包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體結(jié)合FcγRIIIA高至少一倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
26.特異性結(jié)合癌癥抗原的治療性抗體，所述治療性抗體包含變異Fc區(qū)，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述治療性抗體以比包含野生型Fc區(qū)的治療性抗體結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，條件是所述至少一個(gè)氨基酸修飾不單獨(dú)地是在位置329、331或332處的替換，或不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360或430的任一處的丙氨酸；位置330的賴氨酸；位置339的蘇氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的絲氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的組氨酸；位置334的纈氨酸；或位置334的亮氨酸。
27.特異性結(jié)合癌癥抗原的治療性抗體，所述治療性抗體包含變異Fc區(qū)，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述治療性抗體以比包含野生型Fc區(qū)的治療性抗體結(jié)合FcγRIIIA更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，和所述治療性抗體進(jìn)一步的以比包含野生型Fc區(qū)的治療性抗體結(jié)合FcγRIIB更低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，條件是所述變異Fc區(qū)不單獨(dú)地具有在位置256、298、333或334任一處的丙氨酸。
28.權(quán)利要求26或27的治療性抗體，其中所述治療性抗體比包含野生型Fc區(qū)的治療性抗體更有效1倍地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
29.權(quán)利要求26或27的治療性抗體，其中所述治療性抗體是
、
、IC14、PANOREXTM、IMC-225、VITAXINTM、Campath 1H/LDP-03、LYMPHOCIDETM或ZEVLINTM。
30.權(quán)利要求26或27的治療性抗體，其中所述癌癥抗原是MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙?；咸前坊D(zhuǎn)移酶、p15、β-連結(jié)蛋白、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人類乳頭狀瘤病毒-E6、人類乳頭狀瘤病毒-E7或MUC-1。
31.在患有以癌癥抗原為特征的癌癥的患者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求26或27的治療性抗體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述癌癥抗原是MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙?；咸前坊D(zhuǎn)移酶、p15、β-連結(jié)蛋白、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人類乳頭狀瘤病毒-E6、人類乳頭狀瘤病毒-E7或MUC-1。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述癌癥抗原是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮頸癌或胰腺癌抗原。
34.權(quán)利要求31的方法，進(jìn)一步包括施用一種或多種其他癌癥治療。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述其他癌癥治療選自由化學(xué)治療、免疫治療、放射治療、激素治療或手術(shù)構(gòu)成的組。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述患者是人類。
37.藥物組合物，包含治療有效量的一種或多種權(quán)利要求1或2的多肽，和藥學(xué)上可接受的載體。
38.藥物組合物，包含治療有效量的一種或多種權(quán)利要求17或18的抗體，和藥學(xué)上可接受的載體。
39.藥物組合物，包含治療有效量的一種或多種權(quán)利要求26或27的治療性抗體，和藥學(xué)上可接受的載體。
40.權(quán)利要求26或27的藥物組合物，進(jìn)一步包含一種或多種其他抗癌試劑。
41.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述抗癌試劑是化學(xué)治療試劑、放射治療試劑、激素治療試劑或免疫治療試劑。
42.包含編碼權(quán)利要求17或18的任一項(xiàng)的抗體的重鏈的核苷酸序列的核酸。
43.包含權(quán)利要求42的核酸的載體。
44.權(quán)利要求43的載體，其是表達(dá)載體。
45.包含權(quán)利要求44的核酸的宿主細(xì)胞。
46.重組生產(chǎn)權(quán)利要求17或18的抗體的方法，所述方法包括(i)在適合于所述抗體的表達(dá)的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼所述抗體的核酸的宿主細(xì)胞；和(ii)從所述培養(yǎng)基回收所述抗體。
47.產(chǎn)生四聚FcγR復(fù)合物的方法，其中相對(duì)于單體FcγR對(duì)Fc區(qū)的親合性，所述四聚復(fù)合物具有對(duì)Fc區(qū)增強(qiáng)的親合性，包括
(a)產(chǎn)生融合蛋白，從而15氨基酸AVITAG序列可操作地連接到FcγR的可溶區(qū)；
(b)使步驟(a)中產(chǎn)生的蛋白生物素化；
(c)以合適的摩爾比混合步驟(b)中產(chǎn)生的生物素化的蛋白和鏈霉抗生物素蛋白-藻紅素，
從而形成四聚FcγR復(fù)合物。
48.通過(guò)權(quán)利要求47的方法產(chǎn)生的四聚FcγR復(fù)合物。
49.權(quán)利要求48的四聚FcγR復(fù)合物，其中所述復(fù)合物以比單體FcγR復(fù)合物結(jié)合Fc區(qū)更高7倍的親和性結(jié)合Fc區(qū)。
50.權(quán)利要求48的四聚FcγR復(fù)合物，其中所述復(fù)合物以比單體FcγR復(fù)合物結(jié)合Fc區(qū)更高9倍的親和性結(jié)合Fc區(qū)。
51.權(quán)利要求47的方法，其中所述四聚FcγR復(fù)合物是四聚FcγRIIIA復(fù)合物，以及步驟(a)中使用的所述可溶區(qū)是FcγRIIIA的可溶區(qū)。
52.權(quán)利要求47的方法，其中所述四聚FcγR復(fù)合物是四聚FcγRIIB復(fù)合物，以及步驟(a)中使用的所述可溶區(qū)是FcγRIIB的可溶區(qū)。
53.權(quán)利要求47的方法，其中步驟(a)中產(chǎn)生的蛋白以酶學(xué)手段生物素化。
54.權(quán)利要求47的方法，其中步驟(a)中產(chǎn)生的蛋白用E.coli BirA酶生物素化。
55.權(quán)利要求47的方法，其中步驟(a)中產(chǎn)生的生物素化的蛋白以1∶5摩爾比與鏈霉抗生物素蛋白-藻紅素混合(1X鏈霉抗生物素蛋白-藻紅素5X生物素化的蛋白)。
56.在患有以癌癥抗原為特征的癌癥的患者中治療或控制癌癥的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的一種或多種權(quán)利要求17、18、26或27的抗體。
57.在患有以癌癥抗原為特征的癌癥的患者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述患者施用特異性結(jié)合所述癌癥抗原的治療有效量的一種或多種權(quán)利要求17、18、26或27的抗體。
58.在有需要的患者中治療自體免疫失調(diào)的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述分子以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，和所述分子進(jìn)一步的以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述自體免疫失調(diào)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、Rieter’s綜合癥、銀屑病或紅斑狼瘡。
60.權(quán)利要求58的方法，進(jìn)一步包括向所述患者施用治療有效量的一種或多種抗炎癥試劑。
61.權(quán)利要求58的方法，進(jìn)一步包括向所述患者施用治療有效量的一種或多種免疫調(diào)節(jié)試劑。
62.權(quán)利要求61的方法，其中至少一種免疫調(diào)節(jié)試劑是小的有機(jī)分子。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述小的有機(jī)分子是氨甲蝶呤、leflunomide、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素A、FK506、mycophenolate mofetil、雷帕霉素、mizoribine、deoxyspergualin、brequinar、malonitrolamide、類固醇或皮質(zhì)類固醇。
64.權(quán)利要求60的方法，其中所述至少一種抗炎癥試劑是非甾族抗炎癥藥物。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述非甾族抗炎癥藥物是阿斯匹林、布洛芬、diclofenac、nabumetone、甲氧萘丙酸或ketoproten。
66.在有需要的患者中治療傳染性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的包含變異Fc區(qū)的分子，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述分子以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，和所述分子進(jìn)一步的以比包含野生型Fc區(qū)的可比較分子更低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
67.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA更大3倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
68.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA更大7倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
69.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA更大9倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
70.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIIA更大99倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
71.權(quán)利要求17或18的抗體，其中所述抗體以比包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體結(jié)合FcγRIIIA更大3倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
72.權(quán)利要求17或18的抗體，其中所述抗體以比包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體結(jié)合FcγRIIIA更大7倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
73.權(quán)利要求17或18的抗體，其中所述抗體以比包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體結(jié)合FcγRIIIA更大9倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
74.權(quán)利要求17或18的抗體，其中所述抗體以比包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體結(jié)合FcγRIIIA更大99倍的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA。
75.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽更大的親合性特異性結(jié)合FcγRIIIA，和所述多肽進(jìn)一步的以比包含野生型Fc區(qū)的可比較多肽結(jié)合FcγRIIB更低的親合性特異性結(jié)合FcγRIIB，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含選自以下構(gòu)成的組的一組替換，在位置243用異亮氨酸以及在位置379用亮氨酸替換；在位置288用天冬酰胺、在位置330用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；在位置243用亮氨酸以及在位置255用亮氨酸替換；在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸替換；在位置316用天冬氨酸、在位置378用纈氨酸以及在位置399用谷氨酸替換；在位置315用異亮氨酸、在位置379用甲硫氨酸以及在位置399用谷氨酸替換；在位置243用異亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用纈氨酸替換；在位置392用蘇氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；在位置293用纈氨酸、在位置295用谷氨酸以及在位置327用蘇氨酸替換；在位置268用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替換；在位置319用苯丙氨酸、在位置352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換；在位置248用甲硫氨酸替換；在位置247用亮氨酸以及在位置420用纈氨酸替換；334用谷氨酸以及在位置292用亮氨酸替換。
76.權(quán)利要求75的多肽，其中所述多肽是抗體。
77.權(quán)利要求76的抗體，其中所述抗體具有相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體增強(qiáng)的ADCC活性。
78.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置255用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。
79.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。
80.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置392用蘇氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。
81.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用組氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用天冬氨酸替換。
82.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置243用亮氨酸、在位置305用異亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用絲氨酸以及在位置396用亮氨酸替換。
83.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置284用甲硫氨酸、在位置298用天冬酰胺、在位置334用谷氨酸、在位置355用色氨酸以及在位置416用蘇氨酸替換。
84.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的多肽改變的親合性結(jié)合FcγR，條件是所述至少一個(gè)氨基酸修飾不處在Fc-FcγR的接口區(qū)域。
85.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽具有相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的多肽改變的CDC活性，條件是所述至少一個(gè)氨基酸修飾不處在Fc-FcγR的接口區(qū)域。
86.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽具有相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的多肽改變的ADCC活性，條件是所述至少一個(gè)氨基酸修飾不處在Fc-FcγR的接口區(qū)域。
87.權(quán)利要求85的多肽，其中所述多肽進(jìn)一步具有改變的ADCC活性。
88.權(quán)利要求84的多肽，其中所述多肽具有增強(qiáng)的CDC活性，從而所述多肽具有增強(qiáng)的Clq結(jié)合親合性。
89.權(quán)利要求85的多肽，其中所述CDC活性被增強(qiáng)，從而所述多肽具有增強(qiáng)的Clq結(jié)合親合性。
90.權(quán)利要求84的多肽，其中所述多肽具有增強(qiáng)的CDC活性，從而Clq結(jié)合親合性不被改變。
91.權(quán)利要求85的多肽，其中所述CDC活性被增強(qiáng)，從而Clq結(jié)合親合性不被改變。
92.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置247用亮氨酸、在位置421用賴氨酸以及在位置270用谷氨酸替換。
93.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置419用組氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替換。
94.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置370用谷氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替換。
95.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置255用亮氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替換。
96.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置240用丙氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替換。
97.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置392用蘇氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替換。
98.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置292用脯氨酸以及在位置305用異亮氨酸替換。
99.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置270用谷氨酸、在位置316用天冬氨酸以及在位置416用甘氨酸替換。
100.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸修飾，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾包含在位置284用甲硫氨酸、在位置292用亮氨酸以及在位置370用天冬酰胺替換。
101.包含變異Fc區(qū)的多肽，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，從而所述多肽以與包含野生型Fc區(qū)的多肽相比改變的親合性結(jié)合FcγR，其中所述至少一個(gè)氨基酸修飾處在Fc區(qū)的CH1結(jié)構(gòu)域中。
102.權(quán)利要求101的多肽，其中所述多肽是抗體。
103.權(quán)利要求102的多肽，其中所述抗體具有相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體增強(qiáng)的ADCC活性。
104.權(quán)利要求102的多肽，其中所述抗體具有相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較抗體增強(qiáng)的CDC活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含變異Fc區(qū)的分子，特別是多肽，更特別的是免疫球蛋白(例如，抗體)，其中所述變異Fc區(qū)包含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，相對(duì)于包含野生型Fc區(qū)的可比較分子，所述變異Fc區(qū)以更大的親和性結(jié)合FcγRIIIA和/或FcγRIIA。本發(fā)明的分子在預(yù)防、治療或改善與疾病、失調(diào)或感染有關(guān)的一種或多種癥狀方面是特別有用的。本發(fā)明的分子在疾病或失調(diào)的治療或預(yù)防中特別有用，其中由FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞功能(例如，ADCC)的增強(qiáng)的效力是期望的，例如，癌癥、傳染性疾病，以及在提高效力由ADCC介導(dǎo)的治療性抗體的治療效力方面特別有用。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101189028SQ200580030452
公開(kāi)日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2005年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月12日
發(fā)明者J·斯塔文哈根, S·維, C·蘭金, S·戈?duì)柪蟹? 玲 黃 申請(qǐng)人:馬克羅基因公司