專(zhuān)利名稱(chēng)：治療糖尿病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖尿病的治療或預(yù)防，具體涉及多肽或相應(yīng)核酸分子在治療或預(yù)防1型或2型糖尿病，或者延遲其發(fā)病中的應(yīng)用。
背景將本說(shuō)明書(shū)中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括任何專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)納入本文作參考。不承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)的討論陳述了作者的主張，本申請(qǐng)人保留質(zhì)詢(xún)引用文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和針對(duì)性的權(quán)利。應(yīng)明確理解，雖然本文提及了許多現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)物，但在澳大利亞或任何其它國(guó)家，此參考文獻(xiàn)不能說(shuō)明任何這些文獻(xiàn)形成了本領(lǐng)域常識(shí)的一部分。
糖尿病是影響人類(lèi)的最常見(jiàn)的嚴(yán)重代謝病?？蓪⑵涠x為慢性高血糖癥，即由于相對(duì)或絕對(duì)缺少胰島素的作用，血液中糖過(guò)多。
糖尿病分為兩種主要形式1和2型糖尿病。1型糖尿病也稱(chēng)為胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM)，它是與產(chǎn)生胰島素的胰腺β-細(xì)胞幾乎全部缺失相關(guān)的自身免疫病。這種β-細(xì)胞缺失導(dǎo)致終身的胰島素依賴(lài)性。1型糖尿病可發(fā)生于任何年齡，估計(jì)約1％的新生兒在其生命中會(huì)患此病。2型糖尿病或非胰島素依賴(lài)性糖尿病(NIDDM)指特征為血液中葡萄糖水平高(高血糖癥)和胰島素抗性的一組疾病，發(fā)生于胰腺β細(xì)胞功能受損的患者。1型患者中缺少胰島素和2型糖尿病的胰島素抗性導(dǎo)致從血流中吸收的糖減少，因此血液中累積過(guò)多糖。這兩種類(lèi)型的糖尿病都伴隨著壽命預(yù)期縮短和重要病癥，如血管病、失明和動(dòng)脈粥樣硬化。提出了稱(chēng)為L(zhǎng)ADA(成年人的潛伏性自身免疫糖尿病)的一種新型糖尿病，以描述診斷有2型糖尿病、也具有1型糖尿病的免疫學(xué)證據(jù)(因?yàn)樗麄兂士?Gad抗體陽(yáng)性)的成年人。
糖尿病是發(fā)達(dá)國(guó)家最普遍的慢性疾病之一，是死亡的主要原因。除臨床發(fā)病率和死亡率外，糖尿病的經(jīng)濟(jì)成本巨大，僅在美國(guó)每年就超過(guò)$900億，預(yù)計(jì)到2010年糖尿病的流行將增加兩倍以上，主要是由于與肥胖相關(guān)的2型糖尿病。
非歐裔人群發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。不遠(yuǎn)的將來(lái)，糖尿病在亞洲，包括南亞會(huì)非常流行。這些個(gè)體在沒(méi)有嚴(yán)重肥胖的情況下發(fā)生糖尿病，因此胰島素缺陷可能是其疾病的主要成分。此外，在印度發(fā)現(xiàn)了與低胰島素水平相關(guān)的兩類(lèi)糖尿病(涉及營(yíng)養(yǎng)不良，纖維結(jié)石性胰腺糖尿病和蛋白質(zhì)缺陷型胰腺糖尿病)。
胰島素由胰腺郎格罕氏島的β-細(xì)胞產(chǎn)生。在胰腺發(fā)育期間，胰島前體細(xì)胞增殖，并最終分化為四種主要胰島細(xì)胞類(lèi)型之一。認(rèn)為β-細(xì)胞的形成具體受各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和激素作用的調(diào)節(jié)。
β-細(xì)胞的數(shù)量和功能對(duì)維持葡萄糖代謝很重要，β-細(xì)胞數(shù)量和/或功能的嚴(yán)重降低導(dǎo)致糖尿病發(fā)病?，F(xiàn)在確定的是，β-細(xì)胞質(zhì)量(mass)是通過(guò)損失和從前體細(xì)胞新生之間的平衡維持的。當(dāng)胰島素抗性使胰島素需求顯著提高(例如由于肥胖)時(shí)，刺激了β-細(xì)胞新生。這導(dǎo)致β-細(xì)胞質(zhì)量的擴(kuò)大，并維持葡萄糖代謝。如果此代償機(jī)制受損，例如在2型糖尿病中，就破壞了葡萄糖代謝。近年來(lái)的研究證明，在2型糖尿病的動(dòng)物模型中，β-細(xì)胞新生受損。因此，刺激β-細(xì)胞新生的因素應(yīng)該能有效預(yù)防糖尿病發(fā)病，從而代表了可能有用的治療方法。
治療所有形式的糖尿病的主要目的相同，即盡可能地將血糖水平降低接近到正常水平，從而最大程度降低該疾病的短期和長(zhǎng)期并發(fā)癥。
糖尿病的長(zhǎng)期控制常常包括胰島素治療，不管患者是1型或2型。在健康個(gè)體中，胰島素增加骨骼肌攝取的葡萄糖并降低肝臟產(chǎn)生的葡萄糖；然而，在患有2型糖尿病的個(gè)體中，胰島素不能起到這種作用。因此，許多2型糖尿病患者不能對(duì)胰島素治療產(chǎn)生良好的反應(yīng)，即使給予高劑量的胰島素。
1型糖尿病的治療必須包括給予取代劑量的胰島素，通常通過(guò)胃腸道外途徑給予胰島素。與飲食療法和血糖水平自我監(jiān)測(cè)相結(jié)合，大部分1型患者可適當(dāng)?shù)乜刂蒲?。?型糖尿病中，初始療法是最佳飲食方案、減少體重和進(jìn)行鍛煉。如果和當(dāng)這些方法不再提供足夠的代謝控制時(shí)，開(kāi)始藥物療法。通常開(kāi)給處方的是促進(jìn)胰島素分泌或通過(guò)其它方式降低葡萄糖水平的藥物。降血糖藥，如磺脲或雙胍，是開(kāi)給這些患者的主要藥物。它們通過(guò)直接刺激β-細(xì)胞而刺激胰島素產(chǎn)生；因此，這些藥物的有效性依賴(lài)胰腺中存留的有功能β-細(xì)胞(β-細(xì)胞質(zhì)量)的數(shù)量。
磺脲在大部分2型糖尿病中無(wú)效；在一項(xiàng)研究中，用磺脲治療的30％新診斷的糖尿病患者在治療的前六年內(nèi)需要胰島素。近來(lái)，據(jù)報(bào)道高達(dá)12％的2型糖尿病患者具有基因變異，即胰島素受體底物-1中的Arg972變異，此變異使他們不能采用這些藥物，因此他們需要胰島素治療。
肽生長(zhǎng)因子參與了各種生理和病理過(guò)程，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞存活、分化、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、免疫應(yīng)答、造血作用、炎癥、組織修復(fù)、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥。在幾乎所有這些過(guò)程中，肽生長(zhǎng)因子通過(guò)與跨膜受體酪氨酸激酶(RTK)的胞外結(jié)構(gòu)域相互作用行使其生物學(xué)作用。大部分RTK屬于高度同源受體的小類(lèi)群，它們結(jié)合相似配體并通過(guò)配體誘導(dǎo)的同源或異源二聚體形成維持受體間相互作用。配體誘導(dǎo)的二聚化發(fā)生后，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的這些受體特異性酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化。磷酸化的酪氨酸殘基用作具有SH2或磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)域的蛋白質(zhì)(如Shc、Grb2和磷酸肌醇3’-激酶(PI3-激酶)的p85亞基)的高親和?？课稽c(diǎn)。這引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如促分裂原活化蛋白激酶途徑的活化，導(dǎo)致復(fù)雜的胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終產(chǎn)生靶細(xì)胞的特定事件。
最徹底研究的RTK亞家族之一是ErbB家族，該家族包括四種已知受體ErbB-1(也稱(chēng)為表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR))、ErbB-2(也稱(chēng)為HER2或Neu)、ErbB-3和ErbB-4。這些受體廣泛分布于不同組織，并且根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和生理?xiàng)l件，用于介導(dǎo)生長(zhǎng)抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化。
許多肽生長(zhǎng)因子是ErbB受體家族的配體。這組因子具有高度序列相似性，尤其是共有六-半胱氨酸的36-40個(gè)氨基酸殘基的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)基序。此基序含有CX7CX4CX10CX1CX8C間隔，形成三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(C1-C3、C2-C4、C5-C6)，具有特征性三環(huán)結(jié)構(gòu)，包括C1-C3二硫環(huán)、C2-C4二硫環(huán)和C5-C6二硫環(huán)。
屬于此家族的生長(zhǎng)因子肽的EGF-基序似乎都是由含有精確定位的間隔內(nèi)含子的兩個(gè)外顯子編碼的，內(nèi)含子對(duì)應(yīng)于將前兩個(gè)二硫環(huán)(A環(huán)，C1-C3；B環(huán)，C2-C4)與第三個(gè)環(huán)(C環(huán)，C5-C6)分開(kāi)的邊界。這些分子的共同特點(diǎn)是它們是作為較大的跨膜前體合成的，跨膜前體經(jīng)蛋白水解切割后釋放該生長(zhǎng)因子的可溶性生物活性形式。
共有EGF-基序?qū)τ诮Y(jié)合和活化ErbB受體酪氨酸激酶家族成員很重要。結(jié)合ErbB受體的配體誘導(dǎo)受體同源或異源二聚化、自身磷酸化和隨后的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化，導(dǎo)致各種生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活。ErbB家族的哺乳動(dòng)物配體包括EGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)、肝素結(jié)合的EGF-樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)、表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)、雙調(diào)蛋白、神經(jīng)-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)亞家族(包括四種基因(NRG1)、NRG2、NRG3和NRG4的產(chǎn)物)和β動(dòng)物纖維素(BTC)。
起初從小鼠胰腺β-細(xì)胞癌(胰島瘤)細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中純化出BTC，它是對(duì)成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞具有促分裂活性的32kDa糖蛋白。人BTC克隆自人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，牛BTC克隆自牛腎細(xì)胞系。
BTC合成為錨定于膜上的前體蛋白，前體蛋白可經(jīng)蛋白水解切割釋放可溶性成熟生長(zhǎng)因子。成熟的BTC結(jié)合并活化ErbB1和ErbB-4同源二聚體，此外，還結(jié)合并活化所有可能的ErbB異源二聚體，包括高度致癌的異源二聚體ErbB2-ErbB3受體復(fù)合物。
許多研究強(qiáng)調(diào)，ErbB1受體和配體TGFα，具體是HB-EGF和BTC在胰腺發(fā)育和功能中可能很重要。在整個(gè)發(fā)育的胰腺中，ErbB配體的表達(dá)豐富。常常死于出生后頭一個(gè)星期的ErbB1-/-小鼠普遍顯示出胰腺上皮細(xì)胞增殖缺陷，伴隨島細(xì)胞延遲分化為產(chǎn)胰島素的β-細(xì)胞，以及發(fā)育的胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的遷移和結(jié)構(gòu)形成受到破壞。這些缺陷表明，ErbB-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)正常β-細(xì)胞發(fā)育很重要。ErbB-3-/-小鼠的胰腺發(fā)育也有嚴(yán)重缺陷。
許多研究證明，在胰腺發(fā)育和功能中，BTC而非EGF或TGFα可具有獨(dú)特的非冗余作用。BTC在胰腺，特別是郎格罕氏島中強(qiáng)烈表達(dá)，刺激各種胰腺細(xì)胞在體外和體內(nèi)增殖和分化。由于胰腺的導(dǎo)管細(xì)胞表達(dá)ErbB-1和ErbB-4，所以認(rèn)為BTC可結(jié)合并活化這些受體以刺激β-細(xì)胞新生。
數(shù)量大得驚人的膜蛋白進(jìn)行另路剪接，另路剪接去除編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的外顯子序列，產(chǎn)生與膜結(jié)合形式功能不同的可溶形式。另路剪接導(dǎo)致的mRNA結(jié)構(gòu)改變可產(chǎn)生在某些組織中、不同的發(fā)育階段和/或在不同的細(xì)胞活化狀態(tài)下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)變體。當(dāng)另路剪接的外顯子編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在功能上對(duì)催化活性或結(jié)合作用很重要時(shí)，得到的蛋白質(zhì)常常顯示出不同、甚至是對(duì)抗性的活性。
我們最近鑒定了一種另路剪接的mRNA轉(zhuǎn)錄物，它編碼人BTC的新同種型(國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU01/00010，GroPep Limited；Dunbar等，2000)。此同種型稱(chēng)為BTC-δ4，它缺少編碼BTC基因的外顯子4的147bp，導(dǎo)致產(chǎn)生編碼缺失了EGF結(jié)構(gòu)域的C-環(huán)和跨膜結(jié)構(gòu)域的異常BTC前體的mRNA，而成熟分子的其余部分，包括A環(huán)和B環(huán)以及“鉸鏈”纈氨酸框內(nèi)融合于截短的C-末端胞質(zhì)尾。保留疏水信號(hào)序列和缺少跨膜結(jié)構(gòu)域說(shuō)明，BTC-δ4可能是分泌蛋白。PCT/AU01/00010提出，此BTC剪接變體可用于調(diào)節(jié)ErbB受體介導(dǎo)的活性，因此可用于治療與ErbB癌基因過(guò)度表達(dá)相關(guān)的疾病，如癌癥。
然后我們證實(shí)，此剪接變體是分泌蛋白。然而，我們發(fā)現(xiàn)，BTC-δ4不結(jié)合或者活化ErbB1或ErbB4受體，不結(jié)合ErbB2或ErbB3同源二聚體；因此我們推論，BTC-δ4不具有功能活性，至少對(duì)于ErbB1和ErbB4受體以及ErbB2和ErbB3同源二聚體如此，BTC-δ4丟失的核心EGF基序可能是活性所必需的(Dunbar等，2000)。
報(bào)道了缺少EGF結(jié)構(gòu)域的第三個(gè)二硫環(huán)的同種型HB-EGF(Loukianov等，1997)。在這種情況下，外顯子III和IV之間94bp插入物引起移碼和成熟前終止，產(chǎn)生保留信號(hào)肽、pro-region、肝素-結(jié)合域和EGF基序的前兩個(gè)保守二硫環(huán)的蛋白，而九個(gè)氨基酸的短尾取代了第三個(gè)二硫環(huán)、跨膜和胞質(zhì)域。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,825,159公開(kāi)了β動(dòng)物纖維素的變體，列為SEQ ID NO.38，該專(zhuān)利提示，此變體具有完整的β動(dòng)物纖維素活性和降低的EGF活性。SEQ ID NO.38與本發(fā)明多肽的不同之處在于它包含了所有六個(gè)半胱氨酸并且C5-C6環(huán)中無(wú)缺陷。
發(fā)明概述盡管BTC-δ4與ErbB受體顯然無(wú)法結(jié)合，但是我們發(fā)現(xiàn)，BTC-δ4刺激β-細(xì)胞分化、增加β-細(xì)胞質(zhì)量、減少β-細(xì)胞功能的降低并增加β-細(xì)胞的胰島素分泌。作為β-細(xì)胞分化刺激物，BTC-δ4比真正的BTC更有效；然而與真正的BTC相比，BTC-δ4沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的方法，該方法包括給予該對(duì)象能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的方法，該方法包括給予該對(duì)象一種核酸，該核酸編碼能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽在糖尿病患者中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的應(yīng)用，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽的核酸在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的應(yīng)用，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽在能在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的藥物制備中的應(yīng)用，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽的核酸在能在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的藥物制備中的應(yīng)用，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽活化對(duì)象的ErbB1和ErbB4受體的能力顯著降低，刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞向胰腺β細(xì)胞分化時(shí)沒(méi)有刺激其它細(xì)胞類(lèi)型的增殖。優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或該活性降低。優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有上皮細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或該活性降低。
優(yōu)選地，所述糖尿病是2型糖尿病或1型糖尿病。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供治療、預(yù)防糖尿病或延遲其發(fā)病的的組合物，該組合物包含能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
在第八個(gè)方面，本發(fā)明提供治療、預(yù)防糖尿病或延遲其發(fā)病的的組合物，該組合物包含編碼能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽的核酸與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有刺激細(xì)胞類(lèi)型增殖的能力或此能力降低，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有活化ErbB1或ErbB4受體的能力或此能力降低。優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或該活性降低。優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有上皮細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或該活性降低。
優(yōu)選地，與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有活化ErbB2或ErbB3同源二聚體的能力或該能力降低。
作為治療的副作用，該多肽使對(duì)象發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)可能低于真正BTC處理產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。
優(yōu)選地，該多肽與EGF家族的成員基本同源。更優(yōu)選地，該多肽與表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、肝素結(jié)合的EGF樣生長(zhǎng)因子、表皮調(diào)節(jié)素、雙調(diào)蛋白、神經(jīng)-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞家族成員(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)或β動(dòng)物纖維素(BTC)基本同源。更優(yōu)選地，該多肽與BTC-δ4基本同源。最優(yōu)選地，該多肽是BTC-δ4。BTC-δ4多肽的氨基酸序列如圖4(SEQ ID NO11-15)所示。
該多肽可以是(a)BTC的剪接變體，其中沒(méi)有C5-C6二硫環(huán)，而編碼真正BTC的基因中通常存在此二硫環(huán)；或
(b)序列與(a)分子基本同源的多肽，或(c)(a)分子的類(lèi)似物、片段、突變體、衍生物或等位基因變體。
該多肽可以是(a)BTC的剪接變體，其中沒(méi)有C5-C6二硫環(huán)，此二硫環(huán)通常由編碼真正BTC的基因中存在的核酸序列編碼，編碼真正BTC多肽分子的核酸序列的其余部分，包括A環(huán)和B環(huán)以及“鉸鏈”纈氨酸框內(nèi)融合于編碼截短的C-末端胞質(zhì)尾的核酸序列；(b)序列與(a)分子基本同源的多肽；或(c)(a)的片段、類(lèi)似物、變體或衍生物。
優(yōu)選地，該多肽能夠用作β-細(xì)胞分化因子、增加β-細(xì)胞質(zhì)量、減少β-細(xì)胞功能的降低和/或增加β-細(xì)胞的胰島素分泌。
所述片段、類(lèi)似物、變體或衍生物可具有以下特征(a)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基，優(yōu)選保守氨基酸殘基取代；所述取代的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的殘基；(b)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基；(c)成熟多肽融合于另一種化合物，以增加該多肽的半衰期；或(d)融合于成熟多肽的其它氨基酸。
作為治療的副作用，該多肽使對(duì)象發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)可能低于BTC治療產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。
優(yōu)選地，對(duì)象具有以下糖尿病風(fēng)險(xiǎn)因素中的一項(xiàng)或多項(xiàng)葡萄糖耐受受損、代謝綜合征、1型或2型糖尿病家族史、肥胖、多囊卵巢綜合征、高血壓或高膽固醇。
應(yīng)該明確理解，本發(fā)明的范圍內(nèi)包括應(yīng)用肽生長(zhǎng)因子的EGF家族的其它成員的變異形式，其能夠用作體外和/或體內(nèi)的β-細(xì)胞分化因子、在體外和/或體內(nèi)增加β-細(xì)胞質(zhì)量、減少β-細(xì)胞功能的降低和/或在體外和/或體內(nèi)增加β-細(xì)胞胰島素分泌，本文將其稱(chēng)為“類(lèi)似的生長(zhǎng)因子變體”。在這些變體形式中，通常存在于真正多肽中的氨基酸殘基缺失，其缺失方式類(lèi)似于BTC-δ4中的缺失。優(yōu)選地，沒(méi)有通常存在于真正分子中的C5-C6二硫環(huán)，類(lèi)似于BTC-δ4中的缺失。選自EGF家族的合適的真正多肽包括表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、肝素結(jié)合的EGF樣生長(zhǎng)因子、表皮調(diào)節(jié)素、雙調(diào)蛋白、神經(jīng)-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞家族成員(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)。預(yù)計(jì)這些變異形式的作用方式類(lèi)似于本發(fā)明BTC-δ4多肽，條件是它們具有上述功能特征。
應(yīng)理解，一旦知曉了本文所述多肽的氨基酸序列，就可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法如固相多肽合成或重組方法合成BTC-δ4和其它生長(zhǎng)因子的類(lèi)似變體。
優(yōu)選地，該多肽分子具有人類(lèi)來(lái)源的氨基酸序列。然而，本發(fā)明也包括應(yīng)用非人哺乳動(dòng)物的BTC-δ4；本發(fā)明BTC-δ4多核苷酸不難用作以本領(lǐng)域常規(guī)方法分離其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞的相應(yīng)多核苷酸的探針。
因此，本發(fā)明多肽可以是重組多肽、分離的天然產(chǎn)生多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
本發(fā)明方法可用于治療2型糖尿病，以及預(yù)防2型糖尿病或延遲其發(fā)病。而且，由于1型糖尿病的特征是β細(xì)胞的缺失和β細(xì)胞功能的完全喪失，本發(fā)明也可用于治療1型糖尿病，或者預(yù)防1型糖尿病或延遲其發(fā)病。
任選地，本發(fā)明多肽可與免疫抑制劑一起給藥。合適的免疫抑制劑包括皮質(zhì)類(lèi)固醇、TNF-α抗體如英利昔單抗(Remicade)和可溶性TNF-α受體如依坦西普(Enbrel)。在1型糖尿病或LADA(任何新β細(xì)胞仍然受免疫攻擊，除非抑制免疫攻擊)中可優(yōu)選這種聯(lián)合療法。
可以想像，與采用真正BTC相比，本發(fā)明方法使致癌風(fēng)險(xiǎn)降低。我們發(fā)現(xiàn)，BTC-δ4不能活化ErbB1和ErbB4受體，因此防止了ErbB-刺激的細(xì)胞增殖，從而降低或避免了成為治療副作用的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
特別考慮到，本發(fā)明方法和組合物適合用于人類(lèi)糖尿病的醫(yī)學(xué)治療，它們也可用于獸醫(yī)治療，包括治療伙伴動(dòng)物如犬和貓，以及家畜如馬、牛和綿羊，或動(dòng)物園動(dòng)物如非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、貓科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、?？苿?dòng)物和有蹄類(lèi)動(dòng)物。
通常以藥物組合物的形式給予本發(fā)明多肽。制備藥物組合物的方法和藥物運(yùn)載體是本領(lǐng)域熟知的，如《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第20版，Williams和Wilkins，美國(guó)賓夕法尼亞州等教科書(shū)所述。
運(yùn)載體或稀釋劑和其它賦形劑將取決于給藥途徑，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?yàn)楦骶唧w情況確定最合適的劑型。
可通過(guò)任何合適途徑給予本發(fā)明化合物和組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?yàn)樗委煹牟“Y確定最合適的途徑和劑量。劑量由主治醫(yī)生或獸醫(yī)確定，取決于所治療病癥的特性和狀態(tài)、所治療對(duì)象的年齡和健康狀況、給藥途徑以及可能已經(jīng)給予的在先治療。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A顯示了用RT-PCR檢測(cè)MCF-7細(xì)胞(泳道1)和人乳房皮膚成纖維細(xì)胞(泳道2)中的真正的人BTC和剪接變體人BTC-δ4。泳道3是無(wú)cDNA模板的對(duì)照。圖1B顯示用包含編碼人BTC氨基酸D32-Y111的多核苷酸的cDNA探針進(jìn)行的相應(yīng)Southern印跡。
圖2A比較了真正人BTC與剪接變體人BTC-δ4的部分核苷酸和推斷出的氨基酸序列(以一字母氨基酸編碼表示)。將圖1A中獲自MCF-7 cDNA的RT-PCR產(chǎn)物克隆入pBluescript II SK，并測(cè)序插入物。顯示了147bp缺失點(diǎn)(用朝下的箭頭表示)周?chē)男蛄?。圖2B顯示了BTC-δ4 cDNA的完整核苷酸序列和推斷出的氨基酸序列。
圖3在假擬比對(duì)中比較了真正人BTC和剪接變體人BTC-δ4的完整氨基酸序列。BTC-δ4序列中的水平虛線(xiàn)表示與真正hBTC序列相比丟失氨基酸的位點(diǎn)。下面的示意圖顯示了與BTC-δ4相比真正人BTC的全局結(jié)構(gòu)。
圖4顯示了BTC-δ4多肽的氨基酸序列(BTC-δ41-129、BTC-δ41-94、BTC-δ432-94、BTC-δ432-129、BTC-δ432-111和BTC-δ495-129)。
圖5說(shuō)明用于BTC和BTC-δ4的重組表達(dá)和純化的構(gòu)建物。圖5A是分別用于BTC和BTC-δ4的構(gòu)建物的示意圖。圖5B顯示了用C4柱的分析RP-HPLC評(píng)價(jià)各BTC或BTC-δ4制劑純度的結(jié)果。
圖6顯示出BTC-δ4是分泌蛋白。A用BTC-FLAG、BTC-δ4-FLAG或空載體(pcDNA3.1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收集培養(yǎng)基并制備細(xì)胞裂解物。用抗-FLAG M2抗體的Western印跡分析培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解物。B如上所述轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用抗-FLAG M2抗體的ELISA分析培養(yǎng)基或非滲透性固定細(xì)胞。需要注意，用抗-BTC胞外域抗體(R&D Systems)也能獲得相似的Western印跡和ELISA結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖7顯示出BTC而非BTC-δ4刺激了Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞增殖，也顯示出BTC而非BTC-δ4在放射性受體試驗(yàn)中結(jié)合ErbB1和ErbB4。Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞與單獨(dú)的濃度增加的BTC或BTC-δ4(A)或在固定濃度的BTC存在下與濃度增加的BTC-δ4(B)一起孵育。在濃度增加的BTC或BTC-δ4存在下[125I]-標(biāo)記的BTC與表達(dá)ErbB1的AG2804細(xì)胞(C、D)或ErbB4轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(E、F)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。
圖8顯示出BTC而非BTC-δ4分別誘導(dǎo)了AG2804和CHO-ErbB4細(xì)胞中的ErbB1和ErbB4受體酪氨酸磷酸化。未處理(-)或處理(10nmol/l BTC，10nmol/l BTC-δ4或10nmol/l BTC+10nmol/l BTC-δ4)的裂解物。用抗-ErbB1(AG2804)或抗-ErbB4(CHO-ErbB4)抗體使細(xì)胞免疫沉淀(IP)，然后用抗-磷酸化酪氨酸抗體(αPY)進(jìn)行印跡和檢測(cè)。也洗提印跡并用抗-ErbB1或抗-ErbB4抗體再檢測(cè)。
圖9顯示出BTC和BTC-δ4誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞分化。AR42J-B20細(xì)胞與2 nM活化素A以及1nM BTC(圖A和C)或BTC-δ4(圖B和D)一起孵育48小時(shí)，然后固定并用抗-胰島素抗體(箭頭“1”)和DAPI(箭頭“2”)染色，DAPI染核。在活化素A和BTC-δ4處理的細(xì)胞中，許多細(xì)胞表達(dá)胰島素，但核被片段化(箭頭“3”)或丟失。放大倍數(shù)，圖A和B×100；圖C和D×400。
圖10顯示出BTC而非BTC-δ4改善了活化素-誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡。用2nM活化素A以及1nM BTC(A)或BTC-δ4(B)處理AR42J-B20細(xì)胞48小時(shí)。用箭頭表示TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞。
圖11顯示出將BTC-δ4給予STZ-處理的大鼠降低血漿葡萄糖濃度并提高葡萄糖耐受。A在第0天(一日齡的新生動(dòng)物)注射STZ(85μg/g)，從第0天開(kāi)始每天注射BTC或BTC-δ4(3pmol/g)，并測(cè)定血漿葡萄糖濃度，共計(jì)5天。值是平均值±S.E.○，STZ組(n＝5)；●，STZ/BTC-δ4組(n＝5)；△，STZ/BTC組(n＝5)；*對(duì)STZ組的P＜0.05。B在2月齡的大鼠上進(jìn)行葡萄糖耐受測(cè)試。左圖，血漿葡萄糖濃度的改變。右圖，血漿胰島素濃度的改變。值是平均值±SE?！穑琒TZ組(n＝5)；●，STZ/BTC-δ4組(n＝5)；△，STZ/BTC組(n＝5)，(---)正常SD大鼠(n＝3)。*對(duì)STZ組的P＜0.05，**對(duì)STZ組的P＜0.01。
圖12顯示出在圖11所述研究的第4天測(cè)定的PDX-1陽(yáng)性導(dǎo)管細(xì)胞(A)和島樣細(xì)胞簇(ICC)(B)的數(shù)量。(A)PDX-1-陽(yáng)性導(dǎo)管細(xì)胞(箭頭“1”)PDX-1(箭頭“2”)細(xì)胞角蛋白。(B)ICC(箭頭“3”)細(xì)胞角蛋白(箭頭“4”)胰島素(箭頭“5”)DAPI。STZ用鹽水處理STZ-注射的大鼠。*對(duì)STZ的p＜0.05。**對(duì)STZ的p＜0.01。放大倍數(shù)，A×400；B×100。
發(fā)明詳述除非另有說(shuō)明，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的含義相同。雖然可采用與本文所屬內(nèi)容相似或等效的任何材料和方法來(lái)實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但描述了優(yōu)選的材料和方法。
定義本文所用單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這種”包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)含義，除非文中明確指出不是如此。因此，例如，提到“一種酶”包括多種這樣的酶，提到“一種氨基酸”指一種或多種氨基酸。
在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中，除了由于表達(dá)語(yǔ)言或必需含義文中另有要求，術(shù)語(yǔ)“包含”用于包括性描述，即說(shuō)明存在所屬特征，但不排除本發(fā)明各種實(shí)施方式中存在或加入了其它特征。
本文所用術(shù)語(yǔ)″對(duì)象″指患有需要用藥學(xué)活性物質(zhì)治療的糖尿病的任何動(dòng)物。對(duì)象可以是人，或者可以是家畜或伙伴動(dòng)物。雖然具體考慮了本發(fā)明化合物適合用于人類(lèi)的醫(yī)學(xué)治療，但其也可用于獸醫(yī)治療，包括治療伙伴動(dòng)物如犬和貓，以及家畜如馬、牛和綿羊，或動(dòng)物園動(dòng)物如非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、貓科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、?？苿?dòng)物和有蹄類(lèi)動(dòng)物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指能有效產(chǎn)生所需治療反應(yīng)，如預(yù)防或治療易于通過(guò)給予藥學(xué)活性物質(zhì)治療的疾病的本發(fā)明化合物的用量。
當(dāng)然，具體的“治療有效量”因各種因素而變化，如所治療的具體疾病、對(duì)象的身體狀況和臨床史、所治療動(dòng)物的類(lèi)型、治療時(shí)間、并行治療(如果有)的特性以及所用具體制劑和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。
治療組合物中的多肽濃度不重要，但應(yīng)該是能有效治療糖尿病或者預(yù)防或延遲其發(fā)病的含量。在采用BTC-δ4多肽的所有方法中，本文所用術(shù)語(yǔ)″有效量″指足以以95％置信水平引起統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性反應(yīng)(即僅由于概率引起的作用的p＜0.05)的量?？赏ㄟ^(guò)經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)體外細(xì)胞對(duì)該多肽或含有該多肽的制劑的反應(yīng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)該多肽或含有該多肽的制劑的反應(yīng)來(lái)測(cè)定多肽用量。多肽用量應(yīng)該足以在體內(nèi)引發(fā)β-細(xì)胞分化、體內(nèi)β-細(xì)胞質(zhì)量增加、體內(nèi)β-細(xì)胞功能下降減少和/或體內(nèi)β-細(xì)胞胰島素分泌增加。平均來(lái)看，體重約75kg的患者的日劑量至少為0.001mg/kg，優(yōu)選0.01mg/kg，至約20mg/kg，優(yōu)選1mg/kg體重。
本文所用″藥物運(yùn)載體″是用于將BTC-δ4和/或其它藥學(xué)活性物質(zhì)遞送給對(duì)象的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑、賦形劑或運(yùn)載體。運(yùn)載體可以是液體或固體，根據(jù)計(jì)劃給藥方式選擇。
本文所用術(shù)語(yǔ)“糖尿病”包括1型糖尿病和2型糖尿病，1型糖尿病也稱(chēng)為胰島素-依賴(lài)性糖尿病(IDMM)，2型糖尿病也稱(chēng)為非胰島素依賴(lài)性糖尿病(NIDDM)。
本發(fā)明的剪接變體稱(chēng)為BTC-δ4，本文將編碼BTC-δ4的多核苷酸稱(chēng)為BTC-δ4多核苷酸。提到BTC時(shí)所用術(shù)語(yǔ)“真正的”指178個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)或成熟的可溶性BTC蛋白。
術(shù)語(yǔ)“基本同源的序列”指功能上等效于本文所述的特定BTC-δ4序列的多肽，特別公開(kāi)的多肽序列中包括取代、缺失或插入。
提到本發(fā)明多肽時(shí)術(shù)語(yǔ)“片段”、“類(lèi)似物”、“變體”和“衍生物”指保留了與此多肽基本相同的生物功能或活性的分子。因此，類(lèi)似物包括前蛋白(proprotein)，它可通過(guò)切割前蛋白部分產(chǎn)生有活性的成熟多肽而活化。
術(shù)語(yǔ)“片段”應(yīng)明確理解為包括全長(zhǎng)序列的任意大小的部分或結(jié)構(gòu)域，只要該片段有功能活性。術(shù)語(yǔ)″序列的片段″或″序列的一部分″指所述原始序列的截短序列。截短序列(核酸或多肽序列)的長(zhǎng)度可以不同，最小尺寸為足以提供至少具有與所述原始序列相當(dāng)?shù)墓δ芎?或活性的序列的尺寸，而最大尺寸并不重要。在一些實(shí)施方式中，最大尺寸通?；旧喜淮笥谔峁┰夹蛄械乃杌钚院?或功能所需的尺寸。截短的氨基酸序列的長(zhǎng)度一般至少約為5個(gè)氨基酸。然而更一般地，該序列的長(zhǎng)度至少約為50個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少約為60、80、100、120、150、200或220個(gè)氨基酸。片段序列可側(cè)接其它氨基酸，或可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法進(jìn)行修飾。修飾的蛋白質(zhì)必須保留天然蛋白質(zhì)的至少一種生物學(xué)活性。該片段可用于氧化或還原形式，或者與偶聯(lián)或保護(hù)基團(tuán)聯(lián)用。例如，可將它們偶聯(lián)于運(yùn)載體分子。
蛋白質(zhì)“變體”包括圖4所示蛋白的同系物和含有能使該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)保持不變的保守取代的蛋白質(zhì)。這種保守取代的例子包括疏水性、大小和電荷與原始的氨基酸殘基基本相同的氨基酸殘基。這種取代通常是蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。例如，保守取代包括脯氨酸取代甘氨酸，反之亦然；丙氨酸或纈氨酸取代甘氨酸，反之亦然；異亮氨酸取代亮氨酸，反之亦然；組氨酸取代賴(lài)氨酸，反之亦然；絲氨酸取代天冬酰胺，反之亦然；蘇氨酸取代半胱氨酸，反之亦然；絲氨酸或丙氨酸取代蘇氨酸，反之亦然；谷氨酰胺取代天冬酰胺，反之亦然；色氨酸取代酪氨酸，反之亦然；精氨酸取代谷氨酸，反之亦然。
術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)“衍生物”包括用20種天然產(chǎn)生氨基酸的天然產(chǎn)生或合成的氨基酸同系物取代了一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。這種同系物的例子是4-羥基脯氨酸、5-羥基賴(lài)氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、甲狀腺素、γ-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等。
本文所用天然氨基酸殘基是蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的20種氨基酸殘基(即丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸和纈氨酸)，并且包括這些氨基酸的D形和L形。
本文所用合成氨基酸殘基包括在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的、天然情況下發(fā)現(xiàn)的或合成產(chǎn)生的任何其它氨基酸殘基的D形和L形。合成氨基酸殘基包括但不限于β-丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、甲狀腺素、γ-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等。
在表示值的范圍時(shí)，應(yīng)明確理解，此范圍包括該范圍的上下限以及上下限之間的所有值。
應(yīng)明確理解，本發(fā)明不限于本文所述的具體材料和方法，因?yàn)樗鼈兛梢愿淖?。也?yīng)理解，本文使用術(shù)語(yǔ)的目的僅僅是描述具體實(shí)施方式
，不旨在限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍僅受所附權(quán)利要求書(shū)的限制。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明采用本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用的常規(guī)的化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、分子生物學(xué)和酶學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域工作人員熟知的，并且在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見(jiàn)例如，Coligan、Dunn、Ploegh、Speicher和Wingfield《蛋白質(zhì)科學(xué)中的現(xiàn)有技術(shù)》(Current protocols in Protein Science)(1999)第I卷和第II卷(JohnWiley和Sons Inc.)；Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloningA Laboratory Manual)(2001)；Shuler，M.L.《生物過(guò)程工程基本概念》(Bioprocess EngineeringBasic Concepts)(第二版，Prentice-Hall International，1991)；Glazer，A.N.、DeLange，R.J.和Sigman，D.S.《蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾》(ChemicalModification of Proteins)(North Holland Publishing Company，阿姆斯特丹，1975)；Graves，D.J.、Martin，B.L.和Wang，J.H.《蛋白質(zhì)的共翻譯和翻譯后修飾化學(xué)原理和生物效應(yīng)》(Co-and post-translational modification of proteinschemical principles和biological effects)(Oxford University Press，1994)Lundblad，R.L.(1995)《蛋白質(zhì)修飾技術(shù)》(Techniques in protein modification).CRC Press，Inc.美國(guó)佛羅里達(dá)州伯克萊屯；和Goding，J.W《單克隆抗體原理和實(shí)踐》(Monoclonal antibodiesprinciplesand practice)(Academic Press，紐約第三版。1996)。
本發(fā)明方法可包括(a)在給予第二種藥學(xué)活性物質(zhì)之前、一起或之后給予BTC-δ4，以治療糖尿?。换?b)聯(lián)合給予BTC-δ4和第二種藥學(xué)活性物質(zhì)，以治療糖尿病。
本文所用縮寫(xiě)如下bp 堿基對(duì)BTC β動(dòng)物纖維素CM 培養(yǎng)基DMEMDulbecco基礎(chǔ)必需培養(yǎng)基EGF 表皮生長(zhǎng)因子
EIA 酶免疫試驗(yàn)ELISA 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)IDMM 胰島素依賴(lài)性糖尿病IGT 葡萄糖耐受受損LADA 成年人的潛伏性自身免疫糖尿病NIDMM 非胰島素依賴(lài)性糖尿病PCR 聚合酶鏈反應(yīng)PP胰多肽PBS 磷酸鹽-緩沖鹽水RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶PCRSD標(biāo)準(zhǔn)差SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳STZ 鏈脲霉素前驅(qū)糖尿病也稱(chēng)為葡萄糖耐受受損(IGT)，影響著約四千一百萬(wàn)美國(guó)人，它是2型糖尿病和心血管病的前兆。美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)將前驅(qū)糖尿病定義為血糖水平高于正常值，但未高至診斷為2型糖尿病的水平的疾病。除了減少體重和增加鍛煉活動(dòng)以外，正進(jìn)行臨床試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)在前驅(qū)糖尿病進(jìn)展為慢性疾病之前含有吡啶甲酸鉻的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物的功效。
可能引起糖尿病或可能與糖尿病綜合征相關(guān)的基礎(chǔ)病癥包括代謝綜合征(高血壓、肥胖/超重和高膽固醇)、血色素沉著、慢性胰腺炎、多囊卵巢綜合征(PCOS)、類(lèi)癌瘤綜合征、胰腺手術(shù)或外傷、垂體活性過(guò)高、腎上腺活性過(guò)高、胰功能不全、肢端肥大癥、庫(kù)欣氏綜合征、囊腫性纖維化、腺癌、生長(zhǎng)抑制素瘤、醛甾酮瘤-誘導(dǎo)的低鉀血、嗜鉻細(xì)胞瘤、原發(fā)性醛固酮癥、沃爾弗臘姆綜合征、短妖精貌綜合征、Rabson-Mendenhall綜合征、僵人綜合征、自身免疫性淋巴增殖綜合征；高催乳素血癥；甲狀腺功能亢進(jìn)；POEMS或Crow-Fukase綜合征(多神經(jīng)病、器官巨大癥、內(nèi)分泌病、M蛋白質(zhì)和皮膚改變)；催乳素瘤；Kearns-Sayre綜合征；煙酸過(guò)量和2型多發(fā)性?xún)?nèi)分泌缺陷綜合征。
具體說(shuō)，2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)因素包括一種或多種IGT、2型糖尿病家族史、肥胖、高血壓、高膽固醇和久坐的生活方式。已知某些種族，具體是非洲人、西班牙人和墨西哥裔美國(guó)人、澳大利亞原住民和太平洋島國(guó)居民中2型糖尿病的發(fā)病率較高。也包括妊娠相關(guān)因素，因?yàn)橹坝腥焉镄蕴悄虿　⒘鳟a(chǎn)、死產(chǎn)或分娩大嬰兒或有先天缺陷的嬰兒的病史都會(huì)伴有2型糖尿病發(fā)病率升高。
近來(lái)有報(bào)道稱(chēng)，與沒(méi)有疾病的個(gè)體相比，1型糖尿病患者中稱(chēng)為小泛素相關(guān)性修飾物(SUMO-4)的基因突變似乎更頻繁，在一些家族中此基因與1型糖尿病有關(guān)(Guo等，2004；Bohren等，2004)。
本領(lǐng)域熟知診斷糖尿病的方法。一般用兩種測(cè)試診斷人的糖尿病(1)禁食的血糖水平診斷糖尿病的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”是禁食過(guò)夜(午夜后不攝入食物)后血糖水平高。至少兩次測(cè)定的值高于140mg/dl則可診斷為糖尿病。正常對(duì)象的禁食糖水平為70-110mg/dl。
口服葡萄糖耐受測(cè)試(OGTT)可在醫(yī)生辦公室或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行口服葡萄糖耐受測(cè)試。在葡萄糖刺激后3小時(shí)中測(cè)定5次血糖水平。對(duì)象在禁食狀態(tài)(除水外沒(méi)有其它的食物或飲料攝入至少10小時(shí)，但不長(zhǎng)于16小時(shí))開(kāi)始測(cè)試。取初始血液樣品，然后給對(duì)象高葡萄糖的飲料(75克葡萄糖；妊娠婦女是100克)。然后在喝下高葡萄糖飲料后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)再取血液樣品。在非糖尿病人中，葡萄糖刺激后血液中的葡萄糖水平升高，但其后迅速回到正常水平。在糖尿病患者中，葡萄糖刺激后葡萄糖水平升高到正常值以上，而回復(fù)到正常水平則要慢得多。
ErbB家族的哺乳動(dòng)物配體包括EGF(Savage等，1972)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)(Marquardt等，1984)、肝素結(jié)合的EGF樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)(Higashiyama等，1991)、表皮調(diào)節(jié)素(Toyoda等，1995)、雙調(diào)蛋白(Shoyab等，1989)、神經(jīng)-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)(Higashiyama等，1997)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)亞家族和β動(dòng)物纖維素(BTC)(Shing等，1993)，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)亞家族包括四種基因的產(chǎn)物(NRG1)(Marchionni等，1993)、NRG2(Chang等，1997；Carraway等，1997)、NRG3(Zhang等，1997)和NRG4(Harari等，1999)。
BTC-δ4多肽和其變體總地如PCT/AU01/00010所述，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作參考。本領(lǐng)域可廣泛獲得產(chǎn)生多肽的合適方法。優(yōu)選采用重組DNA技術(shù)。
例如，BTC-δ4多核苷酸序列分離自MCF-7細(xì)胞。它含有編碼129個(gè)氨基酸的多肽的開(kāi)放閱讀框。該多核苷酸序列與人BTC相同，除了開(kāi)放閱讀框中缺失了147bp(編碼49個(gè)氨基酸)，導(dǎo)致缺少C5-C6二硫環(huán)，該二硫環(huán)通常存在于EGF結(jié)構(gòu)域中(參見(jiàn)圖2B和3)。它的產(chǎn)生是人BTC基因外顯子之一的mRNA另路剪接(外顯子跳過(guò))的結(jié)果。
BTC-δ4多核苷酸可獲自表達(dá)BTC-δ4編碼的mRNA的各種細(xì)胞來(lái)源。本發(fā)明人鑒定了BTC-δ4多核苷酸的許多合適的人細(xì)胞來(lái)源，包括但不限于腎、肝、胰和各種乳腺癌細(xì)胞系如MCF-7。
例如，編碼BTC-δ4多肽的多核苷酸可獲自從細(xì)胞來(lái)源分離和純化的RNA克隆的cDNA?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)制備克隆的cDNA文庫(kù)，可用與BTC基因任何部分基本互補(bǔ)的核苷酸探針篩選該文庫(kù)中的BTC-δ4編碼的DNA。也可利用各種PCR克隆技術(shù)獲得本發(fā)明的BTC-δ4多核苷酸。
因此，可利用寡核苷酸引物用PCR獲得編碼本發(fā)明BTC-δ4多肽的多核苷酸，所述引物包含編碼BTC基因一部分的多核苷酸序列。該引物優(yōu)選包含最末端的5′和3′編碼區(qū)。該寡核苷酸引物更優(yōu)選具有以下序列，或與以下序列基本同源的序列5′GAGCGGGGTTGATGGACCGG 3′(SEQ ID NO1)5′TTAAGCAATATTTGTCTCTTC 3′(SEQ ID NO2)用本發(fā)明載體，如克隆載體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以同樣良好地利用各種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)來(lái)重組表達(dá)BTC-δ4多肽。這種系統(tǒng)包括但不限于微生物如用包含所需BTC-δ4多核苷酸編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用包含所需BTC-δ4多核苷酸編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用包含所需BTC-δ4多核苷酸編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；或用包含所需BTC-δ4多核苷酸編碼序列的合適的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。
可用各種方法將合適的DNA序列插入載體。通常，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將DNA序列插入合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。
插入表達(dá)載體的DNA序列操作性連接于表達(dá)控制序列(啟動(dòng)子)，以指導(dǎo)mRNA合成。根據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，可采用任何合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯元件。例如，用原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)克隆時(shí)，可采用trc或T7啟動(dòng)子；用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)克隆時(shí)，可采用分離自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如小鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或分離自這些細(xì)胞中生長(zhǎng)的病毒的啟動(dòng)子(如人巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動(dòng)子)。也可利用重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄插入序列。表達(dá)載體也含有用于啟動(dòng)翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。也需要特異性啟動(dòng)信號(hào)來(lái)有效翻譯插入的編碼序列。這些信號(hào)包括ATG啟動(dòng)密碼子和相鄰序列。在將整個(gè)BTC-δ4編碼序列(包括其自身的啟動(dòng)密碼子和相鄰序列)插入合適的表達(dá)載體的情況下，不需要額外的翻譯控制信號(hào)。然而，在僅插入一部分BTC-δ4編碼序列的情況下，必須提供外源性翻譯控制信號(hào)，包括ATG啟動(dòng)密碼子。
而且，啟動(dòng)密碼子必須與BTC-δ4編碼序列的閱讀框同相，以保證整個(gè)插入物的翻譯。這些異源翻譯控制信號(hào)和啟動(dòng)密碼子可以是各種來(lái)源的，包括天然和合成來(lái)源?？赏ㄟ^(guò)包含轉(zhuǎn)錄衰減序列、增強(qiáng)子元件等提高表達(dá)效率。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的表型特征，如真核細(xì)胞的新霉素(G418)抗性，或原核細(xì)胞如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性。
可用含有本發(fā)明DNA分子的載體，以及合適的啟動(dòng)子或控制序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主，使該宿主表達(dá)該蛋白。
合適宿主的代表性例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅(Drosophila)和Sf9；以及動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或293細(xì)胞。
可以常規(guī)方式用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建物產(chǎn)生重組序列編碼的基因產(chǎn)物。或者，可用常規(guī)的肽合成儀以合成方法產(chǎn)生本發(fā)明多肽。
可用各種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化上述各種不同載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的本發(fā)明多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和反相高效液相色譜(HPLC)。如果需要，在完成所需多肽構(gòu)型中可采用蛋白質(zhì)再折疊步驟。
該多肽可以是純化產(chǎn)物、分離自組織或細(xì)胞來(lái)源、化學(xué)合成步驟的產(chǎn)物、或通過(guò)重組技術(shù)用原核或真核宿主產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)重組產(chǎn)生步驟中所用的宿主，本發(fā)明多肽可以是糖基化或非糖基化的。
可獲得使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定用于本發(fā)明的、序列與BTC-δ4或BTC-δ4的類(lèi)似物、片段、突變體、衍生物或等位基因變體基本同源的多肽的方法，例如，通過(guò)評(píng)價(jià)該多肽在體外誘導(dǎo)胰細(xì)胞系分化的能力，或評(píng)價(jià)降低糖尿病動(dòng)物模型的糖尿病癥狀嚴(yán)重程度的能力。
用于本發(fā)明的BTC-δ4的類(lèi)似物、片段、突變體、衍生物或等位基因變體優(yōu)選具有以下體外生物學(xué)特性(1)采用實(shí)施例5所述方法時(shí)，該多肽不取代人肺成纖維細(xì)胞(AG2804)的ErbB1或ErbB4受體上放射性標(biāo)記的成熟BTC。
(2)采用實(shí)施例5所述方法時(shí)，該多肽不誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞(AG2804)的ErbB1或ErbB4受體的酪氨酸磷酸化。
(3)采用實(shí)施例6所述方法時(shí)，該多肽就像真正的BTC那樣，與活化素A一起刺激AR42J-B20細(xì)胞分化，但與真正的成熟BTC相比，該多肽促進(jìn)細(xì)胞存活的能力差得多。
可用含有常規(guī)無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、佐劑和載體的劑量單位劑型以口服、直腸、胃腸道外或吸入途徑給予本發(fā)明化合物。本文所用術(shù)語(yǔ)胃腸道外包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸內(nèi)、顱內(nèi)、注射或輸注技術(shù)。
本發(fā)明也提供了合適的局部、口服、氣霧劑和胃腸道外藥物劑型，用于本發(fā)明治療的新方法。口服給予的本發(fā)明化合物可以是片劑、水性或油性懸浮劑、錠劑、藥片、粉末劑、顆粒劑、乳劑、膠囊、糖漿或酏劑?？诜媒M合物可含有選自下組的一種或多種物質(zhì)甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑，目的是產(chǎn)生藥學(xué)上精致和美味的制劑。片劑含有活性成分，混有無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的賦形劑，該賦形劑適用于生產(chǎn)片劑。
這些賦形劑可以是(例如)惰性稀釋劑，如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑和崩解劑，如玉米淀粉或藻酸；粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯樹(shù)膠；或潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是不包衣的，或者可以是用已知技術(shù)包衣的，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)提供緩釋作用。例如，可采用延時(shí)物質(zhì)如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。也可用美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,256,108；4,160,452和4,265,874所述技術(shù)進(jìn)行包衣，以形成用于控釋的等滲治療片劑。
可在胃腸道外通過(guò)注射或逐步灌注單獨(dú)或一起給予用于本發(fā)明方法的BTC-δ4以及藥學(xué)活性物質(zhì)。給藥可以是靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或透皮給藥。在體外研究中，可將藥物加入或溶解于合適的生物學(xué)可接受的緩沖液并加入細(xì)胞或組織。
胃腸道外給藥的制劑包括無(wú)菌水性或非水性溶液、懸液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。水性運(yùn)載體包括水、醇溶液/水溶液、乳劑或懸液，包括鹽水和緩沖培養(yǎng)基。胃腸道外載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉，乳酸化的林格氏靜脈內(nèi)載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物，如基于林格氏右旋糖的補(bǔ)充物等。也可以存在防腐劑和其它添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、生長(zhǎng)因子和惰性氣體等。
通常，本文所用術(shù)語(yǔ)″治療″等指影響對(duì)象、組織或細(xì)胞以獲得所需藥理和/或生理作用。該作用可以是預(yù)防性的，即完全或部分預(yù)防疾病或者其病征或癥狀，和/或可以是治療性的，即部分或完全治愈疾病。本文所用術(shù)語(yǔ)″治療″覆蓋了脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物，特別是人的疾病的任何治療或預(yù)防，包括預(yù)防可能傾向于發(fā)生疾病但仍未診斷患有此病的對(duì)象發(fā)生該疾?。灰种圃摷膊?，即阻滯其發(fā)展；或者緩解或改善該疾病的效應(yīng)，即引起疾病效應(yīng)減退。
本發(fā)明包括用于改善疾病的各種藥物組合物的應(yīng)用。通過(guò)將BTC-δ4，其類(lèi)似物、衍生物或鹽以及一種或多種藥學(xué)活性物質(zhì)或BTC-δ4和一種或多種藥學(xué)活性物質(zhì)的組合合并為適合用運(yùn)載體、賦形劑和添加劑或輔劑給予對(duì)象的形式，來(lái)制備本發(fā)明一種實(shí)施方式的藥物組合物。
常用的運(yùn)載體或輔劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、牛乳蛋白質(zhì)、明膠、淀粉、維生素、纖維素和其衍生物、動(dòng)物和植物油、聚乙二醇和溶劑，如無(wú)菌水、醇、甘油和多元醇。靜脈內(nèi)載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。其它藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體包括水溶液、無(wú)毒賦形劑包括鹽、防腐劑、緩沖液等，如《《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第20版，Williams和Wilkins(2000)和《英國(guó)國(guó)家藥典》(TheBritish National Formulary) 第43版，(British Medical Association and RoyalPharmaceutical Society of Great Britain，2002；http://bnf.rhn.net)所述，將其內(nèi)容納入本文作參考。根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)調(diào)整藥物組合物的各種組分的pH和準(zhǔn)確濃度。參見(jiàn)Goodman和Gilman的《治療的藥理基礎(chǔ)》(The Pharmacological Basis forTherapeutics)(第7版，1985)。
優(yōu)選以劑量單位的形式制備和給予藥物組合物。固體劑量單位包括片劑、膠囊和栓劑。在對(duì)象治療中，根據(jù)化合物活性、給藥方式、疾病的特性和嚴(yán)重程度、對(duì)象的年齡和體重，可采用不同的日劑量。然而在某些情況下，較高或較低的日劑量可能是合適的?？赏ㄟ^(guò)單次給予單個(gè)劑量單位或幾個(gè)較小劑量單位的形式，也可通過(guò)以特定間隔多次給予分開(kāi)的劑量來(lái)給予日劑量。
可局部或全身給予治療有效劑量的本發(fā)明藥物組合物。當(dāng)然，達(dá)到此目的的有效用量取決于疾病的嚴(yán)重程度以及對(duì)象的體重和總體狀況。一般地，體外所用劑量可為藥物組合物原位給藥的用量提供有用指導(dǎo)，可用動(dòng)物模型確定治療細(xì)胞毒性副作用的有效劑量。例如，Langer，Science，2491527，(1990)中描述了各種考慮?？诜┬涂梢允怯裁髂z膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合。它們也可以是軟明膠膠囊的形式，其中活性成分與水或油性介質(zhì)，如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水性懸液通常含有活性物質(zhì)，混有適合生產(chǎn)水性懸液的賦形劑。這種賦形劑可以是懸浮劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪樹(shù)膠和阿拉伯樹(shù)膠；分散劑或濕潤(rùn)劑，可以是(a)天然產(chǎn)生的磷脂如卵磷脂；(b)烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯；(c)環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如，十七碳乙烯氧基十六烷醇；(d)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或(e)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。
藥物組合物可以是無(wú)菌可注射水性或油性懸液的形式?？筛鶕?jù)已知方法用合適的分散劑或濕潤(rùn)劑以及如上所述的懸浮劑配制此懸液。無(wú)菌注射劑也可以是無(wú)毒的胃腸道外可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸液，如1，3-丁二醇的溶液?？刹捎玫目山邮艿妮d體和溶劑是水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌的不揮發(fā)性油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。因此，可采用任何無(wú)刺激性不揮發(fā)性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制備注射劑。
也可以在脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的形式，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡中給予本發(fā)明化合物?？捎筛鞣N磷脂，如膽固醇、十八烷胺硬脂胺或磷脂酰膽堿形成脂質(zhì)體。
BTC-δ4的劑量水平通常約在每千克體重0.5mg-20mg的數(shù)量級(jí)，優(yōu)選的劑量范圍是每千克體重每天約0.5mg-10mg(每患者每天約0.5g-3g)?？膳c運(yùn)載體材料組合以產(chǎn)生單一劑量的活性成分的用量將因所治療宿主和具體的給藥方式而改變。例如，用于人口服給藥的制劑可含有約5mg-1g活性化合物與合適和方便量的運(yùn)載體材料，運(yùn)載體材料可約占總組合物的5-95％。劑量單位形式通常含有約5mg-500mg的活性成分。
然而應(yīng)理解，用于具體患者的特定劑量水平取決于各種因素，包括所用特定化合物的活性、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄率、藥物組合和進(jìn)行治療的具體疾病的嚴(yán)重程度。
此外，本發(fā)明多肽可與其它化合物組合，以提供操作性組合。旨在包括藥學(xué)活性物質(zhì)的任何化學(xué)相容性組合，只要該組合不消除BTC-δ4的活性。
測(cè)定BTC-δ4功效的體外模型AR42J-B20細(xì)胞的分化胰AR42J細(xì)胞衍生自化學(xué)誘導(dǎo)的胰腫瘤，表達(dá)外分泌和神經(jīng)內(nèi)分泌的特性(Rosewicz等，1992)。用活化素A處理后，AR42J-B20細(xì)胞停止生長(zhǎng)，其形態(tài)顯著改變(神經(jīng)突延伸)。此外，活化素-處理的細(xì)胞表達(dá)編碼GLUT2、ATP-敏感性K+通道和胰多肽(PP)的mRNA。因此，活化素A將AR42J細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)分泌細(xì)胞。
用BTC-δ4和活化素A處理這些細(xì)胞能將它們進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞?？稍诳挂葝u素抗體染色細(xì)胞后用免疫熒光法測(cè)定響應(yīng)于BTC-δ4而產(chǎn)生的胰島素?；蛘撸捎肁R42J克隆AR1898-0192定量測(cè)定AR42J細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。此克隆含有分泌型堿性磷酸酶(SEAP)基因，它位于大鼠胰島素II基因啟動(dòng)子下游。用BTC-δ4刺激這些細(xì)胞導(dǎo)致堿性磷酸酶的合成和分泌入培養(yǎng)基，可用酶學(xué)方法測(cè)定。
永生化的上皮細(xì)胞系胰前體細(xì)胞系分離自攜帶溫度敏感型SV40 T抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠(“永生化小鼠(immortomice)”)的胰導(dǎo)管(Sharma等，2001)。當(dāng)在33℃培養(yǎng)這些小鼠的細(xì)胞時(shí)，表達(dá)SV40 T抗原，細(xì)胞變成條件性永生化細(xì)胞；然而在37℃，T抗原表達(dá)被關(guān)閉，細(xì)胞適當(dāng)?shù)胤只?。因此，這些細(xì)胞在33℃培養(yǎng)時(shí)不顯示出島/神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，不能表達(dá)島標(biāo)記。然而，在37℃培養(yǎng)約2周后，約50％的細(xì)胞死亡時(shí)，其余細(xì)胞開(kāi)始分化為顯示出原始的島樣胰島素和胰高血糖素顆粒的細(xì)胞。移植到裸小鼠的腎囊下時(shí)，在兩種溫度下培養(yǎng)的細(xì)胞都發(fā)展出導(dǎo)管樣和島樣表型。
將此細(xì)胞系用于快速靈敏的試驗(yàn)(與上述試驗(yàn)相似)，以測(cè)定胰島素表達(dá)和β-細(xì)胞分化。在這種情況下，用大鼠胰島素1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白(GFP)受體的表達(dá)。這種細(xì)胞系提供了非常靈敏的方法，通過(guò)測(cè)定活細(xì)胞中的GFP熒光鑒定β-細(xì)胞分化因子如BTC-δ4，所述β-細(xì)胞分化因子刺激β-細(xì)胞特異性基因如胰島素的表達(dá)。
2型糖尿病的體內(nèi)模型除鏈脲霉素(STZ)模型(參見(jiàn)實(shí)施例7)以外，2型糖尿病的許多其它動(dòng)物模型均可用于測(cè)試BTC-δ4的體內(nèi)活性。這些模型包括手術(shù)如大鼠的胰切除術(shù)產(chǎn)生的2型糖尿病模型(Bonner-Weir等，1983)和基于選擇性飼喂的遺傳模型。遺傳模型包括Goto-Kakizaki(GK)大鼠、自發(fā)性糖尿病Torii(SDT)大鼠、Otsuka-Long-Evans-Tokushima肥胖(OLETF)大鼠、db/db小鼠和NOD/Ltj小鼠。
Goto-Kakizaki(GK)大鼠顯示出與人糖尿病所見(jiàn)相似的代謝、激素和血管疾病。不像2型糖尿病的許多其它嚙齒類(lèi)模型，GK大鼠并不肥胖。Goto-Kakizaki大鼠的特征包括禁食高血糖癥，在體內(nèi)和分離的胰細(xì)胞中響應(yīng)于葡萄糖的胰島素分泌受損，以及肝和外周的胰島素抗性。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了晚期并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病、微血管病、神經(jīng)病和腎病。
在自發(fā)性糖尿病Torii(SDT)大鼠模型中，14周齡后雄性大鼠自發(fā)地發(fā)生葡萄糖不耐受，同時(shí)胰島素分泌受損；20周齡后發(fā)生伴有顯著高血糖癥和顯著低胰島素血癥的糖尿病。糖尿病Long-Evans大鼠的特征是18周齡后發(fā)生中度肥胖和晚期發(fā)病的高血糖癥，以及與慢性糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥。雖然通過(guò)遺傳分析鑒定了多個(gè)基因座，但這些大鼠中引起糖尿病的原因似乎是胰島素抗性和胰島素分泌受損的組合，類(lèi)似人類(lèi)的2型糖尿病。Otsuka-Long-Evans-Tokushima肥胖(OLETF)大鼠衍生自胰島素抗性和胰島素分泌受損的自發(fā)組合，類(lèi)似人類(lèi)的2型糖尿病。在這些大鼠中，胰島素敏感性隨衰老而降低，即與周齡匹配的對(duì)照Long-Evans Tokushima Otsuka(LETO)大鼠相比，在6周齡時(shí)正常，而在12周齡時(shí)降低40％，18周齡后降低80％。胰島素分泌在40周齡時(shí)受損(14)，對(duì)島β-細(xì)胞的脂毒性(lipotoxicity)可能參與了甘油三酯過(guò)高的OLETF大鼠的島功能障礙發(fā)病。此外，與LETO大鼠相比，OLETF大鼠的胰β-細(xì)胞的再生能力降低(17)。因?yàn)樘悄虿〉穆赃M(jìn)行性形式，OLETF大鼠適用于研究前驅(qū)糖尿病期間的病理生理學(xué)改變。
db/db小鼠的瘦激素(leptin)受體基因中攜帶點(diǎn)突變，出生后8-10周自發(fā)性發(fā)生血糖水平升高和胰β細(xì)胞耗減。約4周齡時(shí)這些小鼠也變得顯著肥胖。
NOD/Ltj小鼠的特征是胰島炎，胰島的白細(xì)胞浸潤(rùn)。約為12周齡的雌性，胰臟的胰島素含量顯著降低，雄性再過(guò)數(shù)周發(fā)生這種現(xiàn)象。糖尿病發(fā)病的標(biāo)志是中度糖尿和未禁食的血漿葡萄糖高于250mg/dl。糖尿病NOD/Ltj小鼠的胰島素分泌過(guò)少且血糖過(guò)多，這表明胰島β細(xì)胞被選擇性破壞。NOD/LtJ小鼠對(duì)IDDM的易感性是多基因性的，環(huán)境，包括飼養(yǎng)條件、健康狀況和飲食對(duì)外顯率具有強(qiáng)烈的影響。NOD/LtJ雌性比雄性的應(yīng)用更廣泛，因?yàn)镮DDM癥狀的發(fā)生更早且發(fā)病率更高(30周齡時(shí)90-100％)。30-40周齡時(shí)NOD/LtJ雄性發(fā)生IDDM的頻率是40-60％。雄性小鼠可用于某些應(yīng)用，包括藥物研究、IDDM的″加速轉(zhuǎn)移″和一些體外研究。NOD小鼠的糖尿病易感性的主要組分是獨(dú)特的MHC單倍型(H2g7＝Kd、Aad、Abg7、Enull、Db)。NOD小鼠也展現(xiàn)多種異常的免疫表型，包括抗原遞呈細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能缺陷、T淋巴細(xì)胞庫(kù)的調(diào)節(jié)缺陷、NK細(xì)胞功能缺陷、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的缺陷(Fan等，2004)和傷口愈合受損。它們也缺少α溶血補(bǔ)體組分C5。NOD/LtJ小鼠的聽(tīng)力也嚴(yán)重受損。已將引起免疫缺陷的各種突變、細(xì)胞因子基因靶向突變和影響免疫功能的轉(zhuǎn)基因回交到NOD/Lt近交株背景中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的測(cè)試本發(fā)明推定多肽以用于本發(fā)明的其它合適方法包括采用上述2型糖尿病的體內(nèi)模型、測(cè)試β-細(xì)胞再生、改善葡萄糖不耐受和改進(jìn)血糖(禁食血清葡萄糖)的控制、當(dāng)血糖水平升高時(shí)刺激胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌，低血糖和測(cè)定β-細(xì)胞功能標(biāo)志的改善如靜脈內(nèi)葡萄糖耐受測(cè)試、精氨酸刺激和高血糖鉗。這些試驗(yàn)也可應(yīng)用于人類(lèi)臨床試驗(yàn)。
下面將通過(guò)參照以下非限制性實(shí)施例和附圖的方式詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1用RT-PCR檢測(cè)BTC-δ4并克隆入pBluescript II SK用Rneasy小抽試劑盒按照廠商說(shuō)明書(shū)(Qiagen，Clifton Hill，Vic.，Australia)分離70-80％匯合的MCF-7細(xì)胞和人乳房皮膚成纖維細(xì)胞的總RNA。由乳房復(fù)位術(shù)中獲得的一塊皮膚制備正常的人乳房皮膚成纖維細(xì)胞。用補(bǔ)充有10％胎牛血清和青霉素-鏈霉素硫酸鹽的DMEM將該皮膚作為外植體培養(yǎng)5天，直到成纖維細(xì)胞長(zhǎng)成單層。然后，按照廠商說(shuō)明書(shū)用Superscript II酶、寡聚dT引物(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)將總RNA(2μg)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用PCR以正義引物和反義引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于人BTC-β的cDNA。
正義引物為(5′CTCGTCGACGAGCGGGGTTGATGGACCGG-3′)(SEQ ID NO3)反義引物為(5′CTCCTGCAGTTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′)(SEQ ID NO4)。
下面劃線(xiàn)的核苷酸對(duì)應(yīng)于SalI(正義引物)和PstI(反義引物)限制性位點(diǎn)。用50μl60mM Tris-SO4、18mM(NH4)2SO4、1.5mM MgSO4(pH9.1)、0.2mM dNTP、200ng各引物、1U eLONGase(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)和1μl cDNA進(jìn)行PCR。一開(kāi)始在94℃孵育3分鐘后，進(jìn)行35個(gè)下述循環(huán)94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，68℃ 1分鐘，最后在68℃延伸4分鐘。用2％瓊脂糖凝膠分離416bp BTC-δ4 PCR產(chǎn)物，用溴乙錠染色后在紫外燈下觀察。PCR標(biāo)記(Promega，Madison，WI)用作分子大小標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)圖1A。電泳后，通過(guò)0.4M NaOH將凝膠Southern轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜(Roche，Castle Hill，NSW，Australia)上。在預(yù)雜交緩沖液(5×SSC，5×Denhardt，0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)和50μg/ml鮭精DNA)中55℃孵育該印跡2小時(shí)，在含有用Gigaprime試劑盒(Geneworks，Adelaide，Australia)以隨機(jī)引物法產(chǎn)生的32P-dCTP-標(biāo)記的人BTC cDNA探針(D32-Y111)的相同緩沖液中雜交16小時(shí)。用2×SSC，0.1％SDS室溫下洗滌5分鐘兩次，然后用0.5×SSC，0.1％SDS在55℃再洗滌15分鐘兩次。然后在-80℃用該印跡曝光Kodak XAR X-線(xiàn)膠片，結(jié)果見(jiàn)圖1B。
通過(guò)以下方法克隆并測(cè)序BTC和BTC-δ4 PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物，用Concert試劑盒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)進(jìn)行凝膠抽提后，回收片段。然后用SalI和PstI消化純化的PCR產(chǎn)物，并亞克隆入SalI/PstI-消化的pBluescript IISK(Strategene，La Jolla，CA)，產(chǎn)生pBlue-BTC和pBlue-BTC-δ4，并引入大腸桿菌JM109。擴(kuò)增重組質(zhì)粒并用雙脫氧核苷酸鏈末端法測(cè)序，測(cè)序采用含有M13 T7和T3啟動(dòng)子引物的Thermosequenase循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham-Pharmacia Biotech，澳大利亞悉尼)。在兩個(gè)方向上測(cè)序PCR產(chǎn)物，以驗(yàn)證序列；對(duì)兩個(gè)獨(dú)立克隆進(jìn)行兩次測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖2A和B。
實(shí)施例2用大腸桿菌表達(dá)和純化重組BTC和BTC-δ4為了表征BTC-δ4的生物學(xué)活性，我們將相應(yīng)的cDNA(Asp32-Ala129；無(wú)信號(hào)肽)克隆入pET-32a表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21trxB(DE3)中將該蛋白表達(dá)為硫氧還蛋白融合物。此菌株的硫氧還蛋白還原酶缺陷，能夠在胞質(zhì)中形成二硫鍵。所用構(gòu)建物的示意圖見(jiàn)圖5A。在細(xì)菌表達(dá)載體pET3.2a中BTC(Asp32-Tyr111)或全長(zhǎng)BTC-δ4(Asp32-Ala129，減去疏水信號(hào)肽Met1-Ala31)的成熟形式表達(dá)為硫氧還蛋白融合蛋白。將pET3.2a-BTC和pET3.2a-BTC-δ4構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)蛋白。誘導(dǎo)后，收集細(xì)胞并裂解，用Ni-NTA瓊脂糖和RP-HPLC純化BTC或BTC-δ4。表達(dá)后，裂解細(xì)胞，用Ni-NTA瓊脂糖純化融合蛋白。用腸激酶切割純化的硫氧還蛋白融合蛋白，以釋放BTC-δ4，用反相HPLC純化BTC-δ4至均一。
通過(guò)PCR以pBlue-BTC-δ4(Dunbar等，2000)為模板用以下引物組擴(kuò)增BTC-δ432-129的開(kāi)放閱讀框序列5′-CGTCCATGGCTGATGGGAATTCCACCAGAAGT-3′(SEQ ID NO5)(正義)和5′-CGTCTCGAGTCATTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′(SEQ ID NO6)(反義)。將NcoI和XhoI識(shí)別位點(diǎn)(下劃線(xiàn))分別連接于正義和反義引物。也用pET系統(tǒng)表達(dá)并純化BTC的氨基酸32-111(BTC32-111)，作為陽(yáng)性對(duì)照，如上所述(Seno等，1996)，或用質(zhì)粒pET32a產(chǎn)生為硫氧還蛋白融合蛋白。在此構(gòu)建物中，通過(guò)PCR以pBlue-BTC-δ4(Dunbar和Goddard，2000)為模板用以下引物組擴(kuò)增BTC32-111的ORF序列5′-CGTCCATGGCTGATGGGAATTCCACCAGAAGT-3′(SEQID NO7)(正義)和5′CGTCTCGAGTCAGTAAAACAAGTCAACTGT-3′(SEQ ID NO8)(反義)。也將NcoI和XhoI識(shí)別位點(diǎn)(下劃線(xiàn))分別連接于正義和反義引物。擴(kuò)增后，用NcoI/XhoI消化PCR產(chǎn)物，并克隆入NcoI/XhoI消化的pET32a載體，如上所述。用大腸桿菌JM109維持得到的質(zhì)粒pETBTC-δ432-129和pETBTC32-111，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21trxB(DE3)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。為了在BL21trxB(DE3)細(xì)胞中表達(dá)BTC或BTC-δ4，將單菌落接種到50ml培養(yǎng)物中，用LB培養(yǎng)基(補(bǔ)充有50μg/ml氨芐青霉素和15μg/ml卡那霉素)37℃培養(yǎng)過(guò)夜，不斷振蕩。然后，用10ml此過(guò)夜培養(yǎng)物接種200ml新鮮的LB培養(yǎng)基。在37℃培養(yǎng)細(xì)胞至OD600nm為0.4-0.5，然后用IPTG(1mmol/l)誘導(dǎo)，3小時(shí)后離心沉淀(4000rpm，4℃，10分鐘)，純化前貯存于-80℃。
為了純化表達(dá)為融合蛋白的BTC或BTC-δ4，在冰上融化冷凍的細(xì)胞沉淀，重懸于含有溶菌酶(100μg/ml)的18ml BugBuster蛋白質(zhì)抽提試劑，室溫下溫和振蕩孵育10分鐘。孵育后，超聲處理(3×5秒脈沖)細(xì)胞裂解物以降低粘度，離心使其澄清(20分鐘，16000rpm，10分鐘)。離心后，將澄清的細(xì)胞裂解物調(diào)整到10mmol/l咪唑中，與6ml Ni-NTA瓊脂糖一起孵育，在50mmol/lNaH2PO4、0.3mol/l NaCl、10mmol/l咪唑(pH8.0)中4℃預(yù)平衡1小時(shí)，溫和振蕩。孵育后，離心樹(shù)脂(5分鐘，15000rpm，4℃)，去除上清，通過(guò)懸浮于50mmol/l NaH2PO4、0.3mol/l NaCl、40mmol/l咪唑(pH8.0)洗滌樹(shù)脂。連續(xù)進(jìn)行三次上述洗滌后，通過(guò)在12ml 50mmol/l NaH2PO4、0.3mol/l NaCl、250mmol/l咪唑(pH8.0)中孵育樹(shù)脂15分鐘洗脫蛋白質(zhì)。得到的上清中含有BTC或BTC-δ4，然后更換幾次腸激酶切割緩沖液(50mmol/l Tris-Cl，1mmol/lCaCl2，0.1％吐溫-20，pH7.4)透析此上清過(guò)夜(Spectra/Por，3.5kDa MWCO，SpectrumLaboratories)。為了去除BTC或BTC-δ4的硫氧還蛋白融合伴侶，加入腸激酶，使終濃度為0.1單位/20μg蛋白質(zhì)，并在37℃溫和混合地孵育過(guò)夜。通過(guò)上述Ni-NTA瓊脂糖親和色譜進(jìn)一步分離BTC或BTC-δ4與硫氧還蛋白融合伴侶。在這種情況下，在樹(shù)脂上捕獲切割的硫氧還蛋白融合伴侶，BTC或BTC-δ4富集于流過(guò)組分中。用反相HPLC進(jìn)一步純化流過(guò)組分中存在的BTC或BTC-δ4。簡(jiǎn)要說(shuō)，用0.1％TFA1∶4(v/v)地稀釋Ni-NTA瓊脂糖流過(guò)組分，將其施加于C4 Prep-Pak反相HPLC柱(25mm×100 mm；300，15μm；Millipore-Waters)，流速為10ml/分鐘。用0.1％TFA洗滌該柱，直到OD214nm回到基線(xiàn)，然后用150分鐘在0.08％TFA的存在下以8-80％梯度(v/v)的乙腈洗脫該柱，流速為10ml/分鐘。收集20ml組分，用SDS-PAGE和山羊抗人BTC胞外域(Asp32-Tyr111)抗體的Western印跡分析各等分(50μl)，以鑒定含有純BTC或BTC-δ4的組分。集合含有BTC或BTC-δ4的組分，用分析RP-HPLC、電子噴霧離子化質(zhì)譜和SDS-PAGE分析純度。用40分鐘通過(guò)Brownlee aquapore C4RP-HPLC柱(2.1×100mm)(Alltech)以8-80％線(xiàn)性梯度(v/v)的乙腈和0.08％TFA進(jìn)行分析RP-HPLC，流速為0.5ml/分鐘。結(jié)果見(jiàn)圖5B。
電子噴霧離子化質(zhì)譜測(cè)定的重組BTC和BTC-δ4的分子質(zhì)量分別為9211.35±0.29Da和11450.26±0.23Da，與9249和11452Da的計(jì)算理論質(zhì)量(數(shù)據(jù)未顯示)一致。SDS-PAGE和銀染后，獲得約為9kDa和11.5kDa的單一條帶，它們對(duì)應(yīng)于還原或非還原條件下檢測(cè)到的BTC和BTC-δ4。通過(guò)N-末端序列分析(5個(gè)循環(huán))進(jìn)一步驗(yàn)證了BTC和BTC-δ4的純度，該分析給出預(yù)計(jì)的N-末端序列，純度約＞95％。
或者，將BTC-δ432-129(含有起始甲硫氨酸殘基)克隆入表達(dá)載體pET3b，重組蛋白溶解，從包含體再折疊，用陽(yáng)離子交換柱和凝膠過(guò)濾柱色譜純化，如前所述(Maeda等，2002)。本研究中制備的所有重組蛋白都被凍干并儲(chǔ)存于-80℃待用。
實(shí)施例3構(gòu)建用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的BTC-δ4表達(dá)質(zhì)粒將全長(zhǎng)BTC-δ4(1-129)克隆入載體pcDNA3.1(Invitrogen)，產(chǎn)生用于哺乳動(dòng)物產(chǎn)生BTC-β(如下所述)的表達(dá)載體。簡(jiǎn)要說(shuō)，用ApaI和BamHI消化實(shí)施例1的pBlue-BTC-δ4，瓊脂糖凝膠電泳后純化釋放的插入物。然后將消化和純化的插入物克隆入ApaI/BamHI-消化的pcDNA3.1中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10細(xì)胞(Invitrogen)中后鑒定重組克隆。為了產(chǎn)生“Flag-標(biāo)記的”pcDNA3.1-BTC-δ4構(gòu)建物(其中Flag表位DYKDDDDK插入氨基酸S35-T36之間，如圖3所示)，將pBlue-BTC-δ4用作PCR模板，采用以下引物5′-CTCGGGAATTCC TCCTGAA-3′(SEQ ID NO9)(正義；下劃線(xiàn)的核苷酸對(duì)應(yīng)于EcoRI限制性位點(diǎn)；雙下劃線(xiàn)的核苷酸編碼FLAG表位標(biāo)簽)和5′-CTCCTGCAGTTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′(SEO ID NO10)(反義；下劃線(xiàn)的核苷酸對(duì)應(yīng)于PstI限制性位點(diǎn))。純化得到的PCR產(chǎn)物，用EcoRI和PstI消化并克隆入EcoRI/Pst1-消化的pBlue-BTC-δ4中。然后，用ApaI/BamH1消化得到的Flag-標(biāo)記的pBlue-BTC-δ4構(gòu)建物，并克隆入ApaI/BamH1-消化的pcDNA3.1，產(chǎn)生pcDNA3.1-FLAG-BTC-δ4。
實(shí)施例4在COS-7細(xì)胞中表達(dá)和分析BTC和BTC-δ4 FLAG-標(biāo)記的構(gòu)建物正如EGF家族的其它成員，BTC合成為跨膜-錨定的前體蛋白(pro-BTC)，它經(jīng)蛋白質(zhì)水解切割后可產(chǎn)生含EGF-基序(Asp32-Tyr111)的可溶性BTC。保留了疏水性信號(hào)肽和不存在跨膜結(jié)構(gòu)域說(shuō)明，BTC-δ4可能是分泌蛋白。為了檢驗(yàn)此推論，工程改造BTC或BTC-δ4的完整開(kāi)放閱讀框，以在氨基酸Ser35和Thr36之間額外摻入了FLAG表位，用于如實(shí)施例3所述的后續(xù)檢測(cè)，將此開(kāi)放閱讀框克隆入表達(dá)載體pcDNA3.1，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后監(jiān)測(cè)分泌。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收集培養(yǎng)物上清和細(xì)胞裂解物，并用ELISA和Western印跡分析分泌的和與細(xì)胞相連的BTC-FLAG和BTC-δ4-FLAG的存在。
在pcDNA3.1-FLAG-BTC-δ4和pcDNA3.1-FLAG-BTC的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，用DMEM/10％FBS將COS-7細(xì)胞接種到12孔板中，密度為2×105細(xì)胞/孔。孵育過(guò)夜后，用Lipofectamine 2000和Optimem-1培養(yǎng)基(均來(lái)自Invitrogen)按照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)以2μg構(gòu)建物DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。12小時(shí)后，洗滌細(xì)胞兩次，補(bǔ)充新鮮的Optimem-1培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收集培養(yǎng)基(CM)，制備細(xì)胞裂解物。通過(guò)離心使CM澄清，用抗FLAG-M2抗體(Sigma)的ELISA或Western印跡分析培養(yǎng)基中BTC或BTC-δ4的存在。用抗FLAG-M2抗體的Western印跡分析細(xì)胞裂解物中存在的BTC或BTC-δ4。去除CM后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后用SDS-PAGE的樣品緩沖液直接裂解細(xì)胞并加熱到95℃5分鐘，從而制備細(xì)胞裂解物。
在CM的ELISA分析中，將90μl CM與10μl 10×包被緩沖液(0.15mol/l Na2CO3，0.35mol/l NaHCO3，pH9.3)混合，加入96孔免疫吸附板中。板在4℃包被過(guò)夜，然后用PBS/0.1％吐溫(PBS-T)中的2％BSA封閉。用PBS-T洗板4次，然后與PBS-T(2.5μg/ml)稀釋的抗-FLAG抗體一起在37℃孵育1小時(shí)。孵育后，如上所述洗板，與PBS-T稀釋的HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體(1∶2000)一起孵育(HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體來(lái)自Silenus Laboratories)。然后用PBS-T洗板4次，用鄰苯二胺(OPD)底物發(fā)色，用2mol/l H2SO4終止。在490nm讀出吸光度。結(jié)果表示為三次重復(fù)測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。為了用ELISA分析細(xì)胞表面上BTC或BTC-δ4的存在，去除CM，用PBS洗滌細(xì)胞3次。然后用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，用抗-FLAG M2抗體染色，如上所述。
在用抗-FLAG M2抗體進(jìn)行的Western印跡分析中，用SDS-PAGE(10-20％Tris-Tricine凝膠)分辨CM或細(xì)胞裂解物。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(Hybond-Cextra；Amersham)上，用小鼠抗-FLAG M2抗體(2.5μg/ml)、隨后用HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體(1∶10000)檢測(cè)膜。用Supersignal West Dura Extended Duration Substrate(Pierce)觀察HRP-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
圖6中小結(jié)了結(jié)果。如圖6A和B所示，用Western印跡(～14kDa)或酶免疫測(cè)定(EIA)明確檢測(cè)到培養(yǎng)物上清中的BTC-δ4-FLAG，細(xì)胞裂解物中或細(xì)胞表面上存在的非常少(圖6A和B)。相反，BTC-FLAG主要存在于細(xì)胞裂解物中(～20kDa)和細(xì)胞表面上(圖6A和B)。因此，不像膜-錨定的pro-BTC是細(xì)胞表面胞外域切割后分泌的，BTC-δ4缺少跨膜結(jié)構(gòu)域，似乎是表達(dá)后直接分泌的。
實(shí)施例5BTC-δ4的ErbB-受體結(jié)合和促分裂活性為了研究BTC-δ4的生物學(xué)活性，我們起初測(cè)試了它刺激表達(dá)ErbB1的Balb/c3T3小鼠成纖維細(xì)胞增殖的能力。如前所述(Dunbar等，1999)測(cè)定BTC和BTC-δ4對(duì)Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞的的促分裂活性。Balb/c 3T3細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
結(jié)果見(jiàn)圖7A和7B。不出所料，BTC以劑量依賴(lài)方式刺激Balb/c 3T3增殖。相反，BTC-δ4不刺激細(xì)胞增殖，即使?jié)舛雀哌_(dá)100nmol/l。此外，在該細(xì)胞系中BTC-δ4不拮抗BTC的作用。
通過(guò)測(cè)定BTC或BTC-δ4競(jìng)爭(zhēng)性取代ErbB1或ErbB4受體上的[125I]-標(biāo)記的重組人BTC的能力確定BTC和BTC-δ4與ErbB受體的結(jié)合親和力，所述ErbB1或ErbB4受體分別存在于AG2804成纖維細(xì)胞(Dunbar等，1999)或ErbB4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(CHO-ErbB4細(xì)胞；(Tzahar等，1996)，以色列魏茨曼學(xué)院的YosefYarden教授友情饋贈(zèng))上。為了完成此測(cè)定，在24-孔板中用DMEM/10％FBS將AG2804或CHO-ErbB4細(xì)胞培養(yǎng)至70-80％匯合。(人肺成纖維細(xì)胞。然后用結(jié)合緩沖液(100mmol/l Hepes，(pH7.6)，120mmol/l NaCl，5mmol/l KCl，1.2mmol/l MgSO4，8mmol/l葡萄糖，0.1％BSA)洗滌細(xì)胞兩次，然后與[125I]-rhBTC(10000-15000cpm，用氯胺-T以Na[125I]標(biāo)記，至比活性約為20μCi/μg)和濃度升高的未標(biāo)記BTC或BTC-δ4(AG2804細(xì)胞是0-100nmol/l，CHO-ErbB4細(xì)胞是0-10nmol/l)一起在結(jié)合緩沖液中4℃孵育18小時(shí)。然后用冰冷的Hank’s緩沖鹽溶液洗滌標(biāo)記的細(xì)胞三次，并用1ml 0.5mol/l NaOH/0.1％(v/v)Triton X-100裂解30分鐘。隨后用γ-計(jì)數(shù)器(Wallac1470)測(cè)定細(xì)胞裂解物的放射性。在未標(biāo)記配體過(guò)量100倍的情況下進(jìn)行該生物試驗(yàn)測(cè)定非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合一般約為總結(jié)合的5％。
我們也比較了BTC和BTC-δ4刺激ErbB1或ErbB4的酪氨酸磷酸化的能力。在10cm培養(yǎng)皿中將過(guò)度表達(dá)ErbB1受體的細(xì)胞系A(chǔ)G2804或過(guò)度表達(dá)ErbB4受體的CHO細(xì)胞(CHO-ErbB4細(xì)胞；以色列魏茨曼學(xué)院的Yosef Yarden教授友情饋贈(zèng))培養(yǎng)至匯合，然后用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育12-14小時(shí)，然后用10nmol/l BTC、BTC-δ4或二者的組合在室溫下刺激細(xì)胞10分鐘。刺激后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，隨后用裂解緩沖液(0.5ml)(50mmol/l Tris-Cl pH7.4，150mmol/l NaCl，1％脫氧膽酸，1％ TritonX-100，0.1％SDS，5mmol/l原釩酸鈉，10mmol/l氟化鈉，1mmol/l EGTA和完全蛋白酶抑制劑TM)裂解。通過(guò)離心(15000g 4℃離心20分鐘)使細(xì)胞裂解物澄清，分別通過(guò)將裂解物與1μg兔多克隆抗-ErbB1抗體(1005)(Santa Cruz)或兔多克隆抗-ErbB4抗體一起在4℃溫和振蕩孵育2小時(shí)免疫沉淀ErbB1或ErbB4。
孵育后，加入蛋白-G瓊脂糖，再在4℃孵育該混合物1小時(shí)。離心收集免疫復(fù)合物，用裂解緩沖液洗滌三次并在SDS-PAGE樣品緩沖液中加熱(3分鐘，95℃)。用SDS-PAGE或10-20％Tricine凝膠分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜(Hybond C，Amersham)上。首先用抗-磷酸化酪氨酸單克隆抗體(PY20)探測(cè)膜，然后用HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體探測(cè)。用酶-聯(lián)化學(xué)發(fā)光(ECL)(Amersham)觀察HRP-標(biāo)記蛋白。為了驗(yàn)證上樣量相等，洗提印跡，用兔多克隆抗-ErbB1或兔多克隆抗-ErbB4抗體和HRP-偶聯(lián)的兔抗-綿羊抗體再探測(cè)?？?ErbB1(1005)、抗-ErbB4(C-18)和抗-磷酸化酪氨酸(PY20)抗體購(gòu)自Santa Cruz，HRP-偶聯(lián)的兔抗-綿羊抗體購(gòu)自Zymed Laboratories。
圖7C-7F和圖8中小結(jié)了結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)，BTC而非BTC-δ4可以取代人肺成纖維細(xì)胞(AG2804)上存在的ErbB1受體的[125I]-BTC(圖7C和D)，并誘導(dǎo)ErbB1受體自身磷酸化(圖8)。類(lèi)似地，BTC而非BTC-δ4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ErbB4受體(圖7E和F)并誘導(dǎo)ErbB4受體酪氨酸磷酸化(圖8)。這些結(jié)果表明，與BTC相反，BTC-δ4沒(méi)有顯示出與ErbB1或ErbB4的親和力。而且，BTC-δ4不活化ErbB1或ErbB4。
這些結(jié)果完全出乎意料。因?yàn)檫@意味著B(niǎo)TC-δ4不刺激細(xì)胞增殖，我們的發(fā)現(xiàn)提示，BTC-δ4比真正BTC的癌癥誘導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)低。而且，似乎BTC-δ4通過(guò)一種仍未鑒定的受體發(fā)揮其作用，而不是通過(guò)ErbB1或ErbB4受體?？捎帽疚乃龇椒ǎ蛴肂IAcore試驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。
實(shí)施例6測(cè)定AR42J細(xì)胞的分化和凋亡已知天然BTC能刺激胰β-細(xì)胞分化(Mashima等，1996；Watada等，1996；Yamamoto等，2000；Li等，2001；Li L等，2003；Li等，2004)，有一些證據(jù)提示，這種作用可能通過(guò)獨(dú)特的非ErbB細(xì)胞表面受體發(fā)生(Ishiyama等，1998)。
為了檢測(cè)BTC-δ4對(duì)胰β-細(xì)胞分化的影響(如通過(guò)評(píng)價(jià)對(duì)胰島素表達(dá)的誘導(dǎo))，我們采用了模式細(xì)胞系A(chǔ)R42J-B20，它是AR42J的亞克隆，是一種分泌淀粉酶的胰腫瘤細(xì)胞系。在這些細(xì)胞中，BTC與活化素A協(xié)同作用，將它們轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素分泌細(xì)胞(Mashima等，1996)。因此，活化素A將分泌淀粉酶的AR42J-B20轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)生胰多肽(PP)的內(nèi)分泌細(xì)胞。活化素A也誘導(dǎo)這些細(xì)胞凋亡，在沒(méi)有存活因子時(shí)，許多活化素-處理的細(xì)胞在轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)生PP的細(xì)胞后通過(guò)凋亡而死亡(Furukawa等，1999)。
BTC在AR42J-B20細(xì)胞中發(fā)揮兩種作用首先，它抑制活化素A誘導(dǎo)的凋亡，其次，它將它們轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)生胰島素的細(xì)胞(Mashima等，1996；Furukawa等，1999)。用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)AR42J-B20細(xì)胞，如前所述(Mashima等，1996)。
為了評(píng)價(jià)向產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的分化，將細(xì)胞與2nmol活化素A和1nmol BTC或BTC-δ4一起孵育48小時(shí)。然后固定細(xì)胞，用抗-胰島素抗體染色，如前所述(Mashima等，1996)，計(jì)數(shù)胰島素-陽(yáng)性細(xì)胞。用DAPI染核。
用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TUNEL)技術(shù)(Wako Pure Chemicals，Osaka，Japan)評(píng)價(jià)凋亡。用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)評(píng)價(jià)活細(xì)胞數(shù)量的改變(Carmichael等，1987)。
如圖9A所示，彩色印刷時(shí)，AR42J-B20細(xì)胞響應(yīng)于活化素A和BTC的組合分化為產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。定量來(lái)看，48小時(shí)后78±6.5％的細(xì)胞(平均值±S.E.，n＝4)變成胰島素陽(yáng)性?；罨谹和BTC處理的細(xì)胞具有延長(zhǎng)的過(guò)程并表達(dá)免疫反應(yīng)性胰島素，如彩色印刷時(shí)的圖9C所示。用活化素A和BTC-δ4的組合處理的細(xì)胞也變成胰島素陽(yáng)性；48小時(shí)后72±4.5％(n＝4)的細(xì)胞變成胰島素陽(yáng)性，如彩色印刷時(shí)的圖9B所示。
與活化素A和BTC處理的細(xì)胞相比，活化素A和BTC-δ4處理的細(xì)胞的形態(tài)非常不同。一些胰島素陽(yáng)性細(xì)胞顯示出延長(zhǎng)的過(guò)程，但大部分看上去保持圓形。這些細(xì)胞的細(xì)胞核是皺縮的，在一些情況下呈片段化或不存在，如彩色印刷時(shí)的圖9B和D所示，這是細(xì)胞通過(guò)凋亡死亡的特征。與凋亡現(xiàn)象一致，用活化素A和BTC-δ4處理的許多細(xì)胞是TUNEL-陽(yáng)性，而僅有一小部分用活化素A和BTC處理的細(xì)胞變?yōu)門(mén)UNEL-陽(yáng)性，如圖10所示。
為了再次確認(rèn)BTC-δ4對(duì)AR42J-B20細(xì)胞存活的影響，我們測(cè)定了活化素A和BTC或BTC-δ4處理后活細(xì)胞數(shù)的改變。48小時(shí)后，用活化素A和BTC處理的培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)為接種的細(xì)胞數(shù)的78.8±4.2％。相比較，用活化素A和BTC-δ4處理的培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)明顯較低(21.8±3.2％)(P＜0.005)。總之，在刺激AR42J-B20細(xì)胞分化方面BTC-δ4與BTC同樣有效；然而，BTC-δ4在促進(jìn)這些細(xì)胞存活方面的功效要小得多。
實(shí)施例7將BTC-δ4給予STZ-處理的大鼠能降低血漿葡萄糖濃度并改善葡萄糖耐受。
為了研究BTC-δ4的體內(nèi)β-細(xì)胞分化活性，我們將BTC-δ4給予STZ-處理的新生大鼠。試驗(yàn)方案由Gunma大學(xué)的動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)批準(zhǔn)。用新鮮溶解于0.05mmol/l檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)的85μg/g鏈脲霉素(STZ)腹膜內(nèi)(ip)注射一日齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠。將幼崽留在母親身邊直到4周齡。在STZ注射1天后(第1天)用Accu-Chek Active(Roche Diagnostics，德國(guó))測(cè)試所有新生動(dòng)物的血糖。只有當(dāng)?shù)谝惶煅菨舛仍?00和350mg/dl之間時(shí)，才將該動(dòng)物包括在該研究中。第一天血糖＞350mg/dl的動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重的糖尿病，在第2天或第3天這些動(dòng)物的血糖濃度＞600mg/dl。
將3pmol/g BTC-δ4、BTC或鹽水每天注射給STZ-處理的新生大鼠，從第0天起共計(jì)5天。在第一周每天測(cè)定禁食血糖濃度和體重，然后每周測(cè)定一次，共測(cè)定8周。STZ處理后2個(gè)月，禁食14小時(shí)后進(jìn)行ip葡萄糖耐受測(cè)試(2g/kg體重)。
在第4天和第8周，以每100g體重1ml溴脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記試劑ip注射動(dòng)物(細(xì)胞增殖試劑盒，Amersham Pharmacia Biotech，英國(guó))，3小時(shí)后處死。切除胰臟，稱(chēng)重，并分為兩份。用4％多聚甲醛/PBS固定一份脾臟節(jié)段(4℃過(guò)夜)，加工后用于石蠟包埋。在各新生動(dòng)物胰臟上以100μm的間隔連續(xù)切4個(gè)切片，成年動(dòng)物的間隔是300μm，進(jìn)行免疫染色和組織化學(xué)。在冷酸-乙醇中勻漿第二部分，在70℃水浴中加熱5分鐘，離心，將上清儲(chǔ)存于-20℃，然后測(cè)定胰島素。通過(guò)如前所述時(shí)間分辨的免疫熒光試驗(yàn)(Mashima等，1996)測(cè)定胰島素。
如前所述(Li等，2001；Li等，2003)進(jìn)行免疫組化。第一抗體的來(lái)源和稀釋如下豚鼠抗-豬胰島素，1∶1000(Gunma大學(xué)的Matozaki博士提供)；兔抗-PDX-1，1∶3000；單克隆小鼠抗-BrdU，1∶100(Amersham)；用于廣譜篩選的兔抗-牛細(xì)胞角蛋白(Ckwss)，1∶1000(DAKO)。第二抗體的來(lái)源和稀釋如下山羊Alexa Flour 568偶聯(lián)的抗-豚鼠IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶聯(lián)的抗-豚鼠IgG，1∶500；山羊Alexa Flour 568偶聯(lián)的抗-小鼠IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶聯(lián)的抗-小鼠IgG，1∶500；山羊Alexa Flour 568偶聯(lián)的抗-兔IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶聯(lián)的抗-兔IgG，1∶500(Molecular Probes Inc.，俄勒岡尤金)。
通過(guò)裝有PXL 1400冷卻-電荷耦合器件照相機(jī)系統(tǒng)(Photometrics，美國(guó)亞利桑那州圖森)的AX70落射熒光顯微鏡(Olympus，日本東京)用圖像分析軟件(NIH圖像)在胰島素-染色的切片上對(duì)β-細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行定量，所述照相機(jī)系統(tǒng)是用IP Lab Spectrum軟件(Signal Analysis，弗吉尼亞維也納)操作的。在一個(gè)切片(來(lái)自各包埋塊的不同連續(xù)切片的三個(gè)切片)上至少隨機(jī)測(cè)定40個(gè)視野(放大倍數(shù)×200)下的胰島素-陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域。如其它地方所述(Li L、Seno M、Yamada H、Kojima I，在90％胰切除的大鼠中β動(dòng)物纖維素能促進(jìn)β-細(xì)胞再生(Promotion of β-cell regeneration by betacellulin inninety percent pancreatectomized rats)，Endocrinology 1425379-5385，2001；Li L，Seno M，Yamada H，Kojima I在鏈脲霉素-處理的小鼠中β動(dòng)物纖維素通過(guò)促進(jìn)島內(nèi)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β-細(xì)胞提高葡萄糖代謝(Betacellulin improves glucose metabolismby promoting conversion of Intraislet precursor cells to β-cells in streptozotocin-treatedmice)，Am J Physiol 285E577-E583，2003)。為了定量β-細(xì)胞新生，我們測(cè)定了島樣細(xì)胞簇(ICC)的數(shù)量(寬度小于5個(gè)細(xì)胞)。測(cè)定用抗胰島素抗體染色的切片中ICC和島的數(shù)量，測(cè)定這些切片的面積。就每個(gè)動(dòng)物而言至少分析5個(gè)切片。結(jié)果表示為平均值±SE，見(jiàn)表1以及圖11和12(圖12彩色印刷時(shí))。在兩組之間的比較中，采用不成對(duì)t-檢驗(yàn)。
表1.
給予BTC或BTC-δ4的STZ-處理的新生大鼠的特征。
數(shù)據(jù)是平均值±S.E.(n)。用BTC、BTC-δ4或鹽水處理STZ-處理的新生大鼠，第8周測(cè)定各種參數(shù)。
*對(duì)STZ組的P＜0.05。**對(duì)STZ組的P＜0.01。
在STZ-處理的新生大鼠中，血漿葡萄糖濃度顯著增加，在第二天達(dá)到峰值(＞400mg/dl)(圖11A)，然后逐漸降低，但2個(gè)月后仍然顯著高于對(duì)照大鼠(表1)。相反，STZ-處理的大鼠給予BTC-δ4后，在第1天血漿葡萄糖濃度顯著較低，峰值大大降低(圖11A)。隨后血漿葡萄糖濃度也降低，直到2個(gè)月后(表1)。與BTC-δ4的作用相比，BTC改善高血糖癥的能力較差(圖11A，表1)。在2月齡時(shí)，進(jìn)行腹膜內(nèi)(ip)葡萄糖耐受測(cè)試。在STZ-處理的大鼠中，對(duì)ip葡萄糖-加載產(chǎn)生的葡萄糖反應(yīng)顯著受損，然而在給予BTC-δ4的STZ-處理的大鼠中，葡萄糖反應(yīng)顯著改善(圖11B)。BTC-δ4也提高了胰島素反應(yīng)，但與正常大鼠相比，對(duì)ip葡萄糖-加載產(chǎn)生的胰島素反應(yīng)仍然被延遲。在BTC-處理的大鼠中，提高了葡萄糖耐受，但BTC的作用小于BTC-δ4(圖11B)。而且，在BTC-δ4-處理的大鼠中胰島素含量和β-細(xì)胞質(zhì)量顯著增加(表1)，在第4天對(duì)胰組織的組織學(xué)分析表明，BTC-δ4顯著增加了PDX-1-陽(yáng)性導(dǎo)管細(xì)胞和ICC的數(shù)量(圖12，彩色印刷時(shí))。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明白，雖然出于闡述和理解的目的詳細(xì)描述了本發(fā)明，但可在不背離本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的發(fā)明構(gòu)思范圍的情況下對(duì)本文所述的實(shí)施方式和方法進(jìn)行各種修飾和改變。
下面列出了本文引用的參考文獻(xiàn)，將其納入本文作參考。
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Cancer Res 47936-942，1987Carraway KL 3rd，Weber JL，Unger MJ，Ledesma J，Yu N，Gassmann M，Lai C一種新型ErbB3/ErbB4-受體酪氨酸激酶配體-神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(Neuregulin-2，anew ligand of ErtbB 3/ErbB4-receptor tyrosine kinases)Nature 1997 387512-6。
Chang H，Riese DJ 2nd，Gilbert W，Stern DF，McMahan UJ神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-樣基因編碼的ErbB-家族受體的配體(ErbB-family receptorsencoded by a neuregulin-like gene)。
Nature 1997 387509-12DunbarA，Goddard C。
缺少EGF基序的C環(huán)和跨膜結(jié)構(gòu)域的人β動(dòng)物纖維素的另路剪接的mRNA轉(zhuǎn)錄物的鑒定(Identification of an alternatively spliced mRNA transcript of humanbetacellulin lacking the C-loop of the EGF motif and the transmembrane domain)。
Growth Fact 18169-176，2000Dunbar AJ，Priebe IK，Belford DA，Goddard C將β動(dòng)物纖維素鑒定為牛奶中的主要肽生長(zhǎng)因子(Identification of betacellulin asa major peptide growth factor in milk)。
Biochem J 344713-721，1999
Dunbar AJ，Priebe IK，Webb H和Goddard C.
泛-Erbβ配體β動(dòng)物纖維素的另路剪接同種型的鑒定和組織特異性表達(dá)(Identification and tissue-specific expression of an alternatively spliced isoform of thepan-Erbβligand betacellulin)。
第十一屆國(guó)際第二信使和磷酸化蛋白質(zhì)大會(huì)，墨爾本，2001Furukawa M，Zhang YQ，Nie L，Shibata H，Kojima I。
MAP激酶和PI3-激酶在HGF誘導(dǎo)的胰AR42J細(xì)胞分化中的作用(Role of MAPkinase and PI 3-kinase in differentiation of pancreatic AR42J cells induced by HGF)。
Diabetologia 42450-456，1999Guo D，Li M，Zhang Y，Yang P，Eckenrode S，Hopkins D，Zheng W，PurohitS，Podolsky RH，Muir A，Wang J，Dong Z，Brusko T，Atkinson M，Pozzilli P，ZeidlerA，Raffel LJ，Jacob CO，Park Y，Serrano-Rios M，Larrad MT，Zhang Z，Garchon HJ，Bach JF，Rotter JI，She JX，Wang CY一種新型IkappaBalpha修飾物-SUMO4的功能變體與1型糖尿病有關(guān)(Afunctional variant of SUMO4，a new IkappaBalpha modifier，is associated with type 1diabetes)Nat Genet.2004 36(8)837-41Harari D，Tzahar E，Romano J，Shelly M，Pierce JH，Andrews GC，Yarden Y.
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4通過(guò)ErbB-4受體酪氨酸激酶起作用的新型生長(zhǎng)因子(Neuregulin-4a novel growth factor that acts through the ErbB-4 receptor tyrosinekinase)。
Oncogene 1999 18(17)2681-9。
Harris RC， Chung E，Coffey RJ.
EGF受體配體(EGF receptor ligands).
Exp Cell Res.2003 284(1)2-13。
Higashiyama S，Abraham JA，Miller J，F(xiàn)iddes JC，Klagsbrun M.
巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞分泌的肝素-結(jié)合生長(zhǎng)因子與EGF有關(guān)(Aheparin-binding growthfactor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF)。
Science 1991 251936-9Higashiyama S，Horikawa M，Yamada K，Ichino N，Nakano N，Nakagawa T，Miyagawa J，Matsushita N，Nagatsu T，Taniguchi N，Ishiguro H.
與ErbB3和ErbB4相互作用的表皮生長(zhǎng)因子家族的新型腦衍生成員(A novelbrain-derived member of the epidermal growth factor family that interacts with ErbB3 andErbB4)。
J Biochem(Tokyo)1997 122(3)675-80。
Ishiyama N，Kanzaki M，Seno M，Yamada H，Kobayashi I，Kojima I.
胰AR42J細(xì)胞中β動(dòng)物纖維素受體的研究(Studies in the betacellulin receptor inpancreatic AR42J cells)。
Diabetologia 41623-628，1998Jones JT，Akita RW，Sliwkowski MX.
egf結(jié)構(gòu)域與ErbB受體的結(jié)合特異性和親和力(Binding specificities and affinitiesof egf domains for ErbB receptors)。
FEBS Letters，1999 447227-231Li L，Seno M，Yamada H，Kojima I。
在90％切除胰臟的大鼠中β動(dòng)物纖維素能促進(jìn)β-細(xì)胞再生(Promotion of β-cellregeneration by betacellulin in ninety percent pancreatectomized rats)。
Endocrinology 1425379-5385，2001Li L，Seno M，Yamada H，Kojima I。
在鏈脲霉素-處理的小鼠中β動(dòng)物纖維素通過(guò)促進(jìn)島內(nèi)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β-細(xì)胞提高葡萄糖代謝(Betacellulin improves glucose metabolism by promoting conversion ofintraislet precursor cells to β-cells in streptozotocin-treated mice)。
Am J Physiol 285E577-E583，2003Li L，Yi Z，Seno M，Kojima I。
活化素A和β動(dòng)物纖維素對(duì)鏈脲霉素-處理的新生大鼠中β細(xì)胞再生的影響(Activin A and betacellulineffect on β-cell regeneration in neonatal streptozotocin-treatedrats)。
Diabetes 53608-615，2004Loukianov E，Loukinanova T，Wiedlocha A，Olnes S.
肝素結(jié)合EGF樣生長(zhǎng)因子的短形式的mRNA表達(dá)(Expression of mRNA for ashort form of heparin-binding EGF-like growth factor)。
Gene 1997 19581-86Maeda T，Kitazoe M，Tada H，de Llorens R，Salomon DS，Ueda M，Yamada H，Seno M嗜酸性細(xì)胞陽(yáng)離子性蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制(Growth inhibition ofmammalian cells by eosinophil cationic protein)。
Eur J Biochem 2002 269307-3 16Marchionni MA，Goodearl AD，Chen MS，Bermingham-McDonogh O，Kirk C，Hendricks M，Danehy F，Misumi D，Sudhalter J，Kobayashi K等神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子是在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的另路剪接的erbB2配體(Glial growthfactors are alternatively spliced erbB2 ligands expressed in the nervous system)。
Nature 1993 362312-8。
Marquardt H，Hunkapiller MW，Hood LE，Todaro GJ.
1型大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)和與表皮生長(zhǎng)因子有關(guān)(Rat transforming growthfactor type 1structure and relation to epidermal growth factor)。
Science 1984 223 1079-82。
Mashima H，Ohnishi H，Wakabayashi K，Miyagawa J，Hanafusa T，Seno M，Yamada H，Kojima I。
β動(dòng)物纖維素和活化素A共同將淀粉酶分泌型胰AR42J細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胰島素分泌細(xì)胞(Betacellulin and activin A coordinately convert amylase-secreting pancreatic AR42Jcells into insulin-secreting cells)。
J Clin Invest 9716647-1654，1996；Miettinen PJ，Huotari M，Koivisto T，Ustinov J，Palgi J，Rasilainen S，LehtonenE，Keski-Oja J，Otonkoski T.在沒(méi)有EGF受體的小鼠中胰島細(xì)胞的遷移受阻和延遲分化(Impaired migration and delayed differentiation of pancreatic islet cells in micelacking EGF-receptors).Development 2000 127(12)2617-27。
Miyagawa J，Hanafusa O，Sasada R，Yamamoto K，Igarashi K，Yamamori K，Seno M，Tada H，Nammo T，Li M，Yamagata K，Nakajima H，Namba M，KuwajimaM，Matsuzawa Y.EGF家族新成員β動(dòng)物纖維素在正常人胰腺和胰島腫瘤細(xì)胞中的免疫組化定位(Immunohistochemical localization of betacellulin，a new member of the EGFfamily，in normal human pancreas and islet tumor cells)。
Endocr J.1999 46(6)755-64。
Pinkas-Kramarski R，Lenferink AE，Bacus SS，Lyass L，van de Poll ML，KlapperLN，Tzahar E，Sela M，van Zoelen EJ，Yarden Y.
致癌性ErbB-2/ErbB-3異源二聚體是表皮生長(zhǎng)因子和β動(dòng)物纖維素的代理受體(The oncogenic ErbB-2/ErbB-3 heterodimer is a surrogate receptor of the epidermalgrowth factor and betacellulin)。
Oncogene 1998，161259-1258。
Plachot C，Movassat J，Portha B.
II型糖尿病的自發(fā)模型-成年Goto-Kakizaki大鼠切除部分胰腺后β細(xì)胞再生受損(Impaired beta-cell regeneration after partial pancreatectomy in the adult Goto-Kakizakirat，a spontaneous model of type II diabetes)。
Histochem Cell Biol.2001 116(2)13 1-9。
Riese DJ 2nd，Bermingham Y，van Raaij TM，Buckley S，Plowman GD，Stern DF.
β動(dòng)物纖維素能活化表皮生長(zhǎng)因子受體和erbB-4，并誘導(dǎo)不同于表皮生長(zhǎng)因子或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-β刺激的細(xì)胞反應(yīng)方式(Betacellulin activates the epidermal growthfactor receptor and erbB-4，and induces cellular response patterns distinct from thosestimulated by epidermal growth factor or neuregulin-beta)。
Oncogene 1996 12345-353Riese DJ，Kim ED，Elenius K，Buckley S，Klagsbrun M，Plowman GD，Stern DF.
表皮生長(zhǎng)因子受體將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、肝素-結(jié)合的表皮生長(zhǎng)因子樣因子和雙調(diào)蛋白偶聯(lián)于Neu、ErbB-3和ErbB-4(The epidermal growth factor receptor couplestransforming growth factor-alpha，heparin-binding epidermal growth factor-like factor，andamphiregulin to Neu，ErbB-3，and ErbB-4)。
J Biol Chem.1996 271(33)20047-52。
Riese DJ 2nd，Bermingham Y，van Raaij TM，Buckley S，Plowman GD，Stern DF.
β動(dòng)物纖維素能活化表皮生長(zhǎng)因子受體和erbB-4，并誘導(dǎo)不同于表皮生長(zhǎng)因子或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-β刺激的細(xì)胞反應(yīng)方式(Betacellulin activates the epidermal growthfactor receptor and erbB-4，and induces cellular response patterns distinct from thosestimulated by epidermal growth factor or neuregulin-beta)。
Oncogene 1996 12(2)345-53。
Rosewicz S，Vogt D，Harth N，Grund C，F(xiàn)ranke WW，Ruppert S，Schweitzer E，Riecken EO，Wiedenmann B兩性分泌的胰細(xì)胞系A(chǔ)R42J細(xì)胞組合了外分泌和神經(jīng)內(nèi)分泌特性(Anamphicrine pancreatic cell lineAR42J cells combine exocrine and neuroendocrineproperties)。
Eur.J.Cell Biol 5980-91Sasada R，Ono Y，Taniyama Y，Shing Y，F(xiàn)olkman J，Igarashi K.
編碼EGF家族的一個(gè)新成員-人β動(dòng)物纖維素的cDNA的克隆和表達(dá)(Cloningand expression of cDNA encoding human betacellulin，a new member of the EGFfamily)。
Biochem.Biophys.Res.Commum.1993 1901604-1607。
Savage CR Jr，Cohen S.
表皮生長(zhǎng)因子和新型衍生物?？焖俜蛛x步驟以及生物和化學(xué)表征(Epidermalgrowth factor and a new derivative.Rapid isolation procedures and biological andchemical characterization)。
J Biol Chem.1972 247(23)7609-11。
Seno M，Tada H，Kosaka M，Sasada R，Igarashi K，Shing Y，F(xiàn)olk，am J，UedaM，Yamada H。
主要在胰腺和小腸中表達(dá)的EGF家族的一個(gè)新成員-人β動(dòng)物纖維素的單體形式具有完全活性(Human betacellulin，a member of the EGF family，dominantly expressedin pancreas and small intestine，is fully active in a monomeric form)。
Growth Fact 13181-191，1996Sesti G，Marini MA，Cardellini M，Sciacqua A，F(xiàn)rontoni S，Andreozzi F，IraceC，Lauro D，Gnasso A，F(xiàn)ederici M，Perticone F，Lauro R.
胰島素受體底物-1的Arg972變體與2型糖尿病患者對(duì)磺酰脲的二次失效風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)(The Arg972 variant in insulin receptor substrate-1 is associated with an increasedrisk of secondary failure to sulfonylurea in patients with type 2 diabetes)。
Diabetes Care 2004 27(6)1394-8Sharma，A.，Taneja，M.，Rietz，P.，Weitekamp，J.，Bonner-Weir，J。
用于研究β細(xì)胞分化的新型胰腺前體細(xì)胞系(Novel pancreatic precursor cell linesfor studying beta-cell differentiation)。
Diabetes 2001 50 s42-s43Shing Y，Christofori G，Hanahan D，Ono Y，Sasada R，Igarashi K，F(xiàn)olkman J.
β動(dòng)物纖維素來(lái)自胰腺β細(xì)胞腫瘤的促分裂原(Betacellulina mitogen frompancreatic beta cell tumors)。
Science 1993 259(5101)1604-7。
Shoyab M，Plowman GD，McDonald VL，Bradley JG，Todaro GJ.
表皮生長(zhǎng)因子家族的一個(gè)成員-人雙調(diào)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能(Structure and functionof human amphiregulina member of the epidermal growth factor family)。
Science.1989 243(4894 Pt 1)1074-6。
Toyoda H，Komurasaki T，Uchida D，Takayama Y，Isobe T，Okuyama T，HanadaK.
表皮調(diào)節(jié)素，一種對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞有促分裂活性的新型表皮生長(zhǎng)因子(Epiregulin.A novel epidermal growth factor with mitogenic activity for rat primaryhepatocytes)。
J Biol Chem.1995 270(13)7495-500。
Tzahar E，Waterman H，Chen X，Levkowitz G，Karunagaran D，Lavi S，RatzkinBJ，Yarden Y。
受體間相互作用的分級(jí)網(wǎng)絡(luò)決定了通過(guò)Neu分化因子/神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和表皮生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(A hierarchical network of inter-receptor interactions determines signaltransduction by Neu differentiation factor/neuregulin and epidermal growth factor)。
Mol Cell Biol 165276-5287，1996Wang LM，Kuo A，Alimandi M，Veri MC，Lee CC，Kapoor V，Ellmore N，ChenXH，Pierce JH.
ErbB2表達(dá)通過(guò)ErbB4增加了配體-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的范圍和效力(ErbB2expression increases the spectrum and potency of ligand-mediated signal transductionthrough ErbB4)。
Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1998 956809-6814Watada H，Kajimoto Y，Miyagawa J，Hanafusa T，Hamaguchi K，Matsuoka T，Yamamoto K，Matsuzawa Y，Kawamori R，Yamasaki Y.
在β動(dòng)物纖維素的存在下PDX-1能誘導(dǎo)BTC克隆6細(xì)胞的胰島素和葡糖激酶基因表達(dá)(PDX-1 induces insulin and glucokinase gene expression in BTC clone 6 cells inthe presence of betacellulin).Diabetes 1996 451826-1831，Watanabe T，Yonemura Y，Yonekura H，Suzuki Y，Miyashita H，Sugiyama K，Moriizumi S，Unno M，Tanaka O，Kondo H等 胰腺β-細(xì)胞復(fù)制和用Reg蛋白改善手術(shù)糖尿病患者(Pancreatic beta-cell replication and amelioration of surgical diabetes byReg protein)。
Proc Natl Acad Sci USA.1994 91(9)3589-92。
Xing Y，Xu O，Lee C.
通過(guò)另路剪接去除跨膜錨定結(jié)構(gòu)域而廣泛產(chǎn)生了新型可溶性蛋白質(zhì)同種型(Widespread production of novel soluble protein isoforms by alternative splicing removalof transmembrane anchoring domains)。
FEBS Letters 2003 555572-578Yamamoto K，Miyagawa J，Waguri M，Sasada R，Igarashi K，Li M，Nammo T，Moriwaki T，Imagawa A，Yamagata K，Nakajima H，Namba M，Tochino Y，HanafusaT，Matsuzawa Y。
在選擇性四氧嘧啶灌注誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中重組β動(dòng)物纖維素能促進(jìn)β細(xì)胞新生并改善葡萄糖耐受(Recombinant betacellulin promotes neogenesis of βcells andameliorates glucose intolerance in mice with diabetes induced by selective alloxanperfusion)。
Diabetes 2000 492021-2027Zhang D，Sliwkowski MX，Mark M，F(xiàn)rantz G，Akita R，Sun Y，Hillan K，CrowleyC，Brush J，Godowski PJ.
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG3)結(jié)合并活化ErbB4的一種新型神經(jīng)組織富集的蛋白(Neuregulin-3(NRG3)a novel neural tissue-enriched protein that binds and activatesErbB4)。
Proc Natl Acad Sci USA.1997 94(18)9562-7。
序列表<110>谷柔派普有限公司(Gropep Limited)<120>治療糖尿病的方法<130>VSAJHFP20106<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>合成<400>1gagcggggtt gatggaccgg 20<210>2<211>21<212>DNA<213>合成<400>2ttaagcaata tttgtctctt c21<210>3<211>29<212>DNA<213>合成<400>3ctcgtcgacg agcggggttg atggaccgg29<210>4<211>30<212>DNA<213>合成<400>4ctcctgcagt taagcaatat ttgtctcttc 30<210>5<211>32<212>DNA<213>合成<400>5cgtccatggc tgatgggaat tccaccagaa gt 32<210>6<211>33<212>DNA<213>合成<400>6cgtctcgagt cattaagcaa tatttgtctc ttc 33<210>7<211>32<212>DNA<213>合成
<400>7cgtccatggc tgatgggaat tccaccagaa gt 32<210>8<211>30<212>DNA<213>合成<400>8cgtctcgagt cagtaaaaca agtcaactgt30<210>9<211>51<212>DNA<213>合成<400>9ctcgggaatt ccgactacaa ggacgacgat gacaagacca gaagtcctga a51<210>10<211>30<212>DNA<213>合成<400>10ctcctgcagt taagcaatat ttgtctcttc30<210>11<211>129<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>11Met Asp Arg Ala Ala Arg Cys Ser Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp20 25 30Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp35 40 45Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly50 55 60His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly65 70 75 80Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Pro Leu85 90 95Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr Leu100 105 110Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr Asn Ile115 120 125
Ala<210>12<211>94<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>12Met Asp Arg Ala Ala Arg Cys Ser Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp20 25 30Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp35 40 45Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly50 55 60His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly65 70 75 80Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val85 90<210>13<211>63<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>13Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly1 5 10 15Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys20 25 30Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys35 40 45Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val50 55 60<210>14<211>98<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly1 5 10 15
Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys20 25 30Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys35 40 45Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Pro50 55 60Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr65 70 75 80Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr Asn85 90 95Ile Ala<210>15<211>35<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Pro Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu1 5 10 15Thr Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr20 25 30Asn Ile Ala3權(quán)利要求
1.一種在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象多肽，該多肽能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞，并且與真正的BTC相比，該多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
2.一種在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象核酸，該核酸編碼能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽，與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
3.能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽在糖尿病患者中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的應(yīng)用，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
4.編碼能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽的核酸在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的應(yīng)用，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
5.能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽在用于在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的藥物制備中的應(yīng)用，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
6.編碼能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽的核酸在用于在患有糖尿病或處于患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中治療、預(yù)防該疾病或延遲其發(fā)病的藥物制備中的應(yīng)用，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法或應(yīng)用，其特征在于，與真正的BTC相比，所述多肽活化所述對(duì)象的ErbB1和ErbB4受體的能力顯著降低。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法或應(yīng)用，其特征在于，刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞向胰腺β細(xì)胞分化時(shí)沒(méi)有刺激其它細(xì)胞類(lèi)型的增殖。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法或應(yīng)用，其特征在于，所述糖尿病是2型糖尿病。
10.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法或應(yīng)用，其特征在于，所述糖尿病是1型糖尿病。
11.一種治療、預(yù)防糖尿病或延遲其發(fā)病的組合物，其包含能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
12.一種治療、預(yù)防糖尿病或延遲其發(fā)病的組合物，其包含編碼能夠刺激島細(xì)胞祖細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞的多肽的核酸和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，其中與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性或此活性降低。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有刺激細(xì)胞類(lèi)型增殖的能力或此能力降低。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有活化ErbB1或ErbB4受體的能力或此能力降低。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，與真正的BTC相比，所述多肽沒(méi)有活化ErbB2或ErbB3同源二聚體的能力或該能力降低。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，與用真正BTC治療產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)相比，作為治療的副作用而在對(duì)象中發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)降低。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述多肽與EGF家族成員基本同源。
18.如權(quán)利要求17所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述多肽與表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、肝素結(jié)合的EGF樣生長(zhǎng)因子、表皮調(diào)節(jié)素、雙調(diào)蛋白、神經(jīng)和胸腺衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞家族成員(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)或β動(dòng)物纖維素(BTC)基本同源。
19.如權(quán)利要求18所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述多肽與BTC-δ4基本同源。
20.如權(quán)利要求19所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述多肽是BTC-δ4。
21.如權(quán)利要求20所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述BTC-δ4多肽具有圖4所示氨基酸序列(SEQ ID NO11)。
22.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述多肽是(a)BTC的剪接變體，其中沒(méi)有C5-C6二硫環(huán)，而編碼真正BTC的基因中通常存在此二硫環(huán)；或(b)序列與(a)基本同源的多肽，或(c)(a)的類(lèi)似物、片段、突變體、衍生物或等位基因變體。
23.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述多肽是(a)BTC的剪接變體，其中沒(méi)有C5-C6二硫環(huán)，而編碼真正BTC的基因中通常存在此二硫環(huán)，成熟分子的其余部分，包括A環(huán)和B環(huán)以及“鉸鏈”纈氨酸框內(nèi)融合于截短的C-末端胞質(zhì)尾；(b)序列與(a)基本同源的多肽；或(c)(a)的片段、類(lèi)似物、變體或衍生物。
24.如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述多肽能夠用作β-細(xì)胞分化因子、增加β-細(xì)胞質(zhì)量、減少β-細(xì)胞功能的降低和/或增加β-細(xì)胞的胰島素分泌。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，與用BTC治療產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)相比，作為治療的副作用而在對(duì)象中發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)降低。
26.如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的方法、應(yīng)用或組合物，其特征在于，所述對(duì)象具有以下糖尿病風(fēng)險(xiǎn)因素中的一項(xiàng)或多項(xiàng)葡萄糖耐受受損、代謝綜合征、1型或2型糖尿病家族史、肥胖、多囊卵巢綜合征、高血壓或高膽固醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療或預(yù)防糖尿病的方法，該方法包括給予能夠刺激胰島β細(xì)胞活性但不結(jié)合或激活ErbB1或ErbB4受體的多肽。也提供了診斷糖尿病的方法，即采用該多肽和含有該多肽的組合物。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101090732SQ200580032419
公開(kāi)日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2005年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日
發(fā)明者A·J·鄧巴, C·戈達(dá)德 申請(qǐng)人:谷柔派普有限公司