專利名稱：改善重組蛋白制備的方法和組合物的制作方法
改善重組蛋白制備的方法和組合物 相關(guān)申請的交叉引用本申請要求遞交日為2004年10月5日的美國專利申請第 60/616,474號的優(yōu)先權(quán)，在此將其全文引用作為參考。發(fā)明背景至少從1980年代的中期就已存在制備重組蛋白的表達載體。通 常，用于重組蛋白表達的基于載體的策略大量地被應(yīng)用于蛋白制劑絕 對純度并不重要的基礎(chǔ)研究和小規(guī)模實驗中。相反，當(dāng)重組蛋白被用 于治療應(yīng)用時，即使是少量的污染，例如錯誤剪接或內(nèi)含子連讀副產(chǎn) 物的存在都會降低所得治療性蛋白的活性和產(chǎn)量。向患者給藥具有錯 誤剪接或連讀蛋白序列的治療性蛋白會增加不希望的副作用的可能 性。這樣的副產(chǎn)物同樣也會給生產(chǎn)造成了麻煩。副產(chǎn)物的存在會對純 化過程造成危害，因為這樣的副產(chǎn)物通常在大小，親合力，或生物活 性方面都與所希望的蛋白非常相似。而且，現(xiàn)已觀察到，與所希望的 產(chǎn)物相比較，使用重組宿主細(xì)胞按比例放大蛋白表達通常都會導(dǎo)致副 產(chǎn)物量的增加，尤其是如果細(xì)胞是在略差于最適細(xì)胞培養(yǎng)條件下進行 培養(yǎng)的。這樣的非最適細(xì)胞培養(yǎng)條件常常出現(xiàn)在大規(guī)模蛋白制備中， 例如，在生物發(fā)酵罐運行的后期，或者，出于其他的原因，當(dāng)所述大 規(guī)模培養(yǎng)物的健康情況惡化時。因此，需要改進重組蛋白制備，尤其是大規(guī)模治療性蛋白制備的 方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了改善重組蛋白或肽表達和/或制備的方法和組合物。 在一個實施方案中，提供了經(jīng)過修飾從而降低或消除錯誤剪接和/或內(nèi) 含子連讀副產(chǎn)物，和/或增強重組蛋白表達的核酸分子。在某些實施方 案中，所述核酸編碼重組抗體(在本文中也可稱為免疫球蛋白)，或其片 段。本發(fā)明還包括經(jīng)過修飾從而降低或消除錯誤剪接和/或內(nèi)含子連 讀副產(chǎn)物和/或從而增強重組蛋白表達的載體(例如，表達載體)；包括 這些核酸分子和載體的宿主細(xì)胞，例如，哺乳動物細(xì)胞；以及培養(yǎng)這 些細(xì)胞從而制備，例如，以大規(guī)模制備所述重組蛋白或肽的方法。本 發(fā)明還公開了基本上不含有錯誤剪接和/或內(nèi)含子連讀產(chǎn)物的重組蛋白 或肽，例如抗體的組合物，'例如藥物組合物。這些組合物適用于治療 性用途，包括，例如，神經(jīng)變性和惡性疾病。特別地，本發(fā)明提供了表達用于治療神經(jīng)變性疾病的治療性抗體 的組合物和方法。這些抗體的完整性尤其重要，因此，例如，每單位 劑量的分子治療活性得以保持且其純化得以改善。亟待改善這些旨在 具有特化功能蛋白的純度，從而在治療某些生物學(xué)適應(yīng)癥，例如神經(jīng) 變性疾病中得以傳遞和使用，在該疾病中治療性多肽能透過血腦屏障 (BBB)并結(jié)合于大腦中的耙抗原。如本發(fā)明所述的示例性抗體是高純度 制備的，其結(jié)合于神經(jīng)變性疾病靶位，例如，阿耳茨海默氏病的淀粉 樣蛋白，即淀粉樣-Z3肽(AP)的抗體。因此，在一方面，本發(fā)明的特征在于核酸分子(例如，修飾的或重 組核酸分子)，所述核酸分子包括了這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列 具有一種或多種內(nèi)含子和外顯子序列，與天然存在的基因組序列相比 較，其中至少一種內(nèi)含子序列被修飾從而增強了蛋白表達和/或降低或 消除了錯誤剪接或內(nèi)含子連讀(IRT)副產(chǎn)物。在一個實施方案中，所述 核酸分子旨在相對于天然存在序列(例如，基因組序列)，增強所希望的 蛋白或肽，例如，抗體或其片段(例如，免疫球蛋白重鏈)的表達和/或降低或消除其內(nèi)含子連讀(IRT)副產(chǎn)物。所述蛋白或肽可以是哺乳動物， 例如人或鼠類來源的，通常是人源的。在本說明書中所述的核酸分子 也可理解為來自天然存在的序列的修飾形式。在某些實施方案中，所 述核酸分子是分離或純化的。在其他實施方案中，所述核酸分子是重 組分子。在一個實施方案中，與天然存在序列(例如，基因組序列)相比，所 述核酸分子具有至少一個，兩個，三個內(nèi)含子或直至除了一個之外的 全部內(nèi)含子缺失。例如，可從所述天然存在序列中缺失一個能夠協(xié)助內(nèi)含子連讀(IRT)的內(nèi)含子。在其他實施方案中，可通過內(nèi)含子/外顯子構(gòu)型重排(例如，內(nèi)含子/外顯子5'到3'順序)； 一個或多個內(nèi)含子部分 的缺失；或用異源內(nèi)含子序列替換內(nèi)含子或其部分的方式中的一種多 種對核酸分子進行修飾，由此產(chǎn)生了蛋白表達的增強和/或錯誤剪接或內(nèi)含子連讀(IRT)副產(chǎn)物的降低或消除。在相關(guān)實施方案中，所述核酸分子包括編碼抗體重鏈或其片段的 核苷酸序列(例如，人基因組序列)。例如，所述核苷酸序列可包括編碼免疫球蛋白亞型，例如免疫球蛋白G亞型(例如，IgGl， IgG2， IgG3 或lgG4抗體亞型)重鏈可變區(qū)，鉸鏈區(qū)，以及第一，第二和第三恒定區(qū) (例如，CH1， Ch2， CH3)的一種或多種核苷酸(例如，外顯子)序列。通 常，所述免疫球蛋白亞型來自于哺乳動物來源，例如鼠類或人。在一 個實施方案中，選擇的是人IgGl或lgG4，或其突變的形式。例如，免疫球蛋白的恒定區(qū)可被突變從而導(dǎo)致以下情況中的一種或多種穩(wěn)定 性增加，效應(yīng)器功能降低，或補體結(jié)合降低。在一個實施方案中，人 IgG4突變，從而增加了穩(wěn)定性，例如，在241位殘基從絲氨酸替換為 脯氨酸從而增加了鉸鏈區(qū)的穩(wěn)定性。在其他實施方案中，恒定區(qū)突變 從而降低了糖基化。在一個實施方案中，對核酸分子進行修飾從而缺失了至少一個協(xié) 助內(nèi)含子連讀該序列的內(nèi)含子。例如，在免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3之間的內(nèi)含子可被缺失。其他可單獨或組合缺失的重鏈免疫球 蛋白內(nèi)含子的例子包括重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)CH1之間 的內(nèi)含子，CH1和鉸鏈區(qū)之間的內(nèi)含子，以及鉸鏈區(qū)和免疫球蛋白重鏈
恒定區(qū)CH2之間的內(nèi)含子。前述內(nèi)含子的任意組合均可被缺失，包括
上述內(nèi)含子的兩個，三個內(nèi)含子的組合，或直至除了一個內(nèi)含子的全 部內(nèi)含子的組合。在一些實施方案中，所述重鏈恒定區(qū)的三個內(nèi)含子，
例如CH1和鉸鏈區(qū)之間的內(nèi)含子，鉸鏈區(qū)和CH2之間的內(nèi)含子，以及 CH2和CH3之間的內(nèi)含子缺失。以下重鏈免疫球蛋白內(nèi)含子缺失的示 例性組合也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)CH1和鉸鏈 區(qū)之間的內(nèi)含子，以及CH2和CH3之間的內(nèi)含子；CH1和鉸鏈區(qū)之間 的內(nèi)含子，以及鉸鏈區(qū)和CH2之間的內(nèi)含子；鉸鏈區(qū)和CH2之間的內(nèi) 含子，以及Ch2和Ch3之向的內(nèi)含子。
在一些實施方案中，所述核酸分子含有如下式所代表的核苷酸序
列
VH-Intl-CHl-Int2-鉸鏈誦Int3-CH2-CH3，
其中VH是編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；
CH1， CH2和CH3是編碼對應(yīng)重鏈恒定區(qū)，例如人IgGl或IgG4 重鏈基因的天然存在或突變形式的核苷酸序列；
鉸鏈?zhǔn)蔷幋a重鏈恒定區(qū)，例如人IgGl或IgG4重鏈基因的天然存 在或突變形式的鉸鏈區(qū)的核苷酸序列；且
Intl， Int2， Int3和Int4是來自重鏈基因組序列的內(nèi)含子。在一個 實施方案中，在CH2和CH3之間，在本說明書中以Int4代表的內(nèi)含子 缺失。在其他實施方案中，在CHl和鉸鏈區(qū)之間，在鉸鏈區(qū)和CH2之 間，和/或在CH2和CH3之間，在本說明書中以Int2， Int3和Int4代表 的內(nèi)含子中的一種，兩種或通常是三種缺失。其他重鏈基因組序列的 內(nèi)含子/外顯子排列示意圖可見于圖1，圖5和圖7。
通常，在核酸分子中存在有至少一種內(nèi)含子，例如，在重鏈可變 區(qū)和CHl之間的內(nèi)含子，在本說明書中以Intl代表。其他可單獨或組合存在的重鏈免疫球蛋白內(nèi)含子示例包括免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)CH1 和鉸鏈區(qū)之間的內(nèi)含子；鉸鏈區(qū)和CH2之間的內(nèi)含子；以及Ch2和CH3
之間的內(nèi)含子。通常希望的是在所修飾的核酸分子中包括至少一個內(nèi) 含子。拋開理論的束縛，可認(rèn)為內(nèi)含子能夠影響蛋白制備過程中的眾
多事件，包括轉(zhuǎn)錄速率，聚腺苷酸化，mRNA輸出，翻譯效率以及mRNA 衰亡。
在一個實施方案中，所述核酸分子含有如下式所代表的核苷酸序
列
VH-Intl-CHl-Int2-鉸鏈-Int3-CH2-CH3，
其中VH是編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；
CH1， CH2和CH3是編碼對應(yīng)重鏈恒定區(qū)，例如人IgGl或IgG4 重鏈基因的天然存在或突變形式的核苷酸序列；
鉸鏈?zhǔn)蔷幋a重鏈恒定區(qū)，例如例如人IgGl或IgG4重鏈基因的天 然存在或突變形式的鉸鏈區(qū)的核苷酸序列；且
Intl， Int2和Int3是來自重鏈基因組序列的內(nèi)含子。在一個實施方 案中，所述核苷酸序列基本上由上述的成分組成，例如，沒有改變結(jié) 構(gòu)或功能的插入序列。
在其他實施方案中，所述核酸分子含有如下式所代表的核苷酸序
列
VH-Intl-CHl-鉸鏈-CH2-CH3，
其中VH是編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；
CH1， CH2和CH3是編碼對應(yīng)重鏈恒定區(qū)，例如人IgGl或IgG4 重鏈基因的天然存在或突變形式的核苷酸序列；
鉸鏈?zhǔn)蔷幋a重鏈恒定區(qū)，例如人IgGl或IgG4重鏈基因的天然存 在或突變形式的鉸鏈區(qū)的核苷酸序列；以及
Intl是來自重鏈基因組序列的內(nèi)含子。在一個實施方案中，所述 核苷酸序列基本上由上述的成分組成，例如，沒有改變其結(jié)構(gòu)或功能 的插入序列。人IgGl的基因組核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列如圖8所示(分
別為SEQIDNO: l和2)。編碼CHl，鉸鏈區(qū)，CH2和CH3的外顯子分 別位于圖8(SEQ ID NO: l)的約231-524， 916-960， 1079-1408，以及 1506-1829位核苷酸。對應(yīng)于來自人IgGl重鏈基因組序列內(nèi)含子的 Intl， Int2, Int3和Int4分別位于圖8(SEQ ID NO: l)的約1-230，約 525-915，約961-1078，和約1409-1505位核苷酸。
突變的人IgG4的基因組核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列如圖9所 示(分別為SEQ ID NO: 3和4)。編碼CH1，鉸鏈區(qū)，CH2和CH3的外 顯子分別位于圖9(SEQIDNO: 3)的約231-524， 916-952， 1071-1400， 以及1498-1820位核苷酸。對應(yīng)于來自人IgG4重鏈基因組序列內(nèi)含子 的Intl， Int2， Int3和Int4分別位于圖9(SEQ ID NO: 3)的約1-230，約 525-916，約953-1070，和約1401-1497位核苷酸。
本發(fā)明中修飾的核酸分子的示例包括缺失了人IgGl的CH2和 CH3之間內(nèi)含子，對應(yīng)于圖S(SEQ ID NO: l)的約1409-1505位核苷酸； 或突變的人IgG4，對應(yīng)于圖9(SEQIDNO: 3)的約1401-1497位核苷酸 的人基因組重鏈恒定區(qū)序列。其他可單獨或組合缺失的重鏈免疫球蛋 白內(nèi)含子示例包括人IgGl重鏈可變區(qū)和CH1之間的內(nèi)含子，對應(yīng)于圖 8(SEQ ID NO: l)的約1-230位核苷酸，或突變的IgG4，對應(yīng)于圖9(SEQ ID NO: 3)的約1-230位核苷酸；人IgGl的CH1和鉸鏈區(qū)之間的內(nèi)含 子，對應(yīng)于圖8(SEQIDNO: l)的約525-915位核苷酸；或突變的IgG4， 對應(yīng)于圖9(SEQ ID NO: 3)的約525-916位核苷酸；以及人IgGl鉸鏈 區(qū)和CH2之間的內(nèi)含子，對應(yīng)于圖8(SEQIDNO: l)的約961-1078位 核苷酸；或突變的IgG4，對應(yīng)于圖9(SEQIDNO: 3)的約953-1070位 核苷酸。前述內(nèi)含子的任意組合均可被缺失，包括上述內(nèi)含子的兩個， 三個內(nèi)含子的組合，或直至除了一個內(nèi)含子的全部內(nèi)含子的組合亦可 被缺失。在一些實施方案中，所述重鏈恒定區(qū)的三個內(nèi)含子，例如CH1 和鉸鏈區(qū)之間的內(nèi)含子，鉸鏈區(qū)和CH2之間的內(nèi)含子，以及CH2和CH3之間的內(nèi)含子缺失。在一些實施方案中，所述核酸分子包括在本發(fā)明 中公開的人IgGl或IgG4，或基本上與其一致序列的一種或多種外顯子 核苷酸序列，以及一種或多種(但不是全部)內(nèi)含子核苷酸序列。在相關(guān)
實施方案中，所述核酸序列具有在本發(fā)明中公開的人IgGl或lgG4，或
基本上與其一致序列的一種或多種(但不是全部)內(nèi)含子核苷酸序列缺 失。
在一個實施方案中，修飾的核酸分子包括編碼如圖IO(SEQ ID NO: 5)所示的人IgGl或基本上與其一致序列(例如，與SEQIDNO: 5 同一性至少為85%, 90%， 95%或99%的序列，或與SEQIDNO: 5的 核苷酸序列相比，具有l(wèi)， 5， 10， 50或更多核苷酸改變的序列)的核苷 酸序列。
在另一個實施方案中，修飾的核酸分子包括編碼如圖ll(SEQ ID NO: 6)所示的人IgG4或基本上與其一致序列(例如，與SEQIDNO: 6 同一性至少為85%， 90%， 95%或99%的序列，或與SEQIDNO: 6的 核苷酸序列相比，具有l(wèi), 5， 10, 50或更多核苷酸改變的序列)的核苷 酸序列。
修飾的核酸分子可包括編碼輕鏈和重鏈抗體或免疫球蛋白序列的 核苷酸序列。這些序列可存在于同一核酸分子(例如，同一表達載體) 中，或者，可在分別的核酸分子(例如，分別的表達載體)中得以表達。 通常，編碼的抗體或免疫球蛋白或其片段可包括至少一條，且優(yōu)選為 兩條全長重鏈，以及至少一條，且優(yōu)選為兩條輕鏈?；蛘撸幋a的免 疫球蛋白或其片段可僅包括抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab， F(ab')2， Fv或 單鏈Fv片段)。抗體或其片段可以是單克隆或單獨特異性抗體?？贵w或 其片段還可以是人抗體，人源化抗體，嵌合抗體，CDR-接枝抗體，或 體外生成的抗體。在又一個實施方案中，所述抗體具有選自，例如， IgGl， IgG2， IgG3， IgG4， IgM, IgAl， IgA2， IgD和IgE的重鏈恒定 區(qū)；更特別地，選自，例如IgGl， IgG2， IgG3和IgG4的重鏈恒定區(qū)。在其他實施方案中，所述抗體具有選自，例如，K或入的輕鏈。
在其他實施方案中，所述核酸分子包括可變區(qū)，例如，人源化的， 嵌合的，CDR-接枝的或體外生成的可變區(qū)。通常，可變區(qū)特異性的結(jié) 合于預(yù)定的抗原，例如，與疾病，例如神經(jīng)變性或惡性疾病關(guān)聯(lián)的抗 原。
在一個實施方案中，所述疾病是神經(jīng)變性疾病，且所述抗體結(jié)合
于淀粉樣蛋白，例如A0肽(例如，人A/5肽)。例如，所述抗體可以是 針對于A/3肽的人源化抗體，其含有來自鼠類抗體一個或多個互補決定 區(qū)(CDR)的重鏈和輕鏈區(qū)，所述鼠類抗體例如鼠抗A/5 3D6抗體，或鼠 抗A/3 12A11抗體，或鼠抗A/3 10D5抗體，或鼠抗A/3 12B4抗體。人 源化抗體的可變區(qū)通常包括人或基本上是人的框架區(qū)。在一個實施方 案中，所述核酸分子包括人源化抗A/3-肽抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于載體(例如，表達載體)，所述載體 包括一種或多種前述的修飾核酸分子。所述載體可額外地包括能夠增 強宿主細(xì)胞中復(fù)制，選擇，mRNA轉(zhuǎn)錄，mRNA穩(wěn)定性，蛋白表達 或蛋白分泌的一種或多種情況的核苷酸序列。例如，所述載體可包括 負(fù)責(zé)復(fù)制或增強子表達，增強子啟動子元件的核苷酸序列，編碼引導(dǎo) 序列的核苷酸序列，編碼選擇性標(biāo)記(例如，DHFR)的基因，內(nèi)部核糖 體進入位點序列(IRES)，和聚腺苷酸化序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了包括一種前述核酸分子和/或載體，例 如表達載體的細(xì)胞，例如，真核宿主細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞(例如， 中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞)。
在另一方面，本發(fā)明提供了增強重組蛋白或肽，例如，抗體的表 達的方法，或與參考序列，例如天然存在基因組序列相比，具有降低 水平(例如，基本上沒有)的錯誤剪接和/或內(nèi)含子連讀產(chǎn)物的重組蛋白或肽的表達，例如抗體的表達的方法。本方法包括如本申請所述的向 宿主細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)引入核酸分子；在允 許表達重組蛋白或肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此制備了宿主細(xì) 胞的培養(yǎng)物；且任選，從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物(例如，宿主細(xì)胞上清液) 中獲得，例如，純化處所述重組蛋白或肽。
所述方法還包括在核酸樣品，例如來自宿主細(xì)胞的mRNA樣品中， 鑒定IRT或IRT產(chǎn)物(例如，檢測和/或測定其水平)的步驟，在允許所 述核酸樣品和探針雜交的條件下，將所述核酸樣品與互補于內(nèi)含子和 鄰近的外顯子序列，或者與互補于鄰近外顯子序列的核酸探針接觸； 檢測所得復(fù)合物，例如，通過PCR擴增所述探針序列。在含有互補于 內(nèi)含子序列核酸探針的樣品中，復(fù)合物，例如，PCR擴增產(chǎn)物的檢出 說明了 IRT或IRT產(chǎn)物的存在。IRT產(chǎn)物的水平可根據(jù)，例如，實施 例1中的描述來定量。
在另一方面，本發(fā)明提供了制備與標(biāo)準(zhǔn)參考，例如天然存在基因. 組序列相比，具有降低(例如，基本上沒有)的內(nèi)含子連讀(IRT)重鏈副 產(chǎn)物的抗體或其片段的方法。本方法包括在允許重鏈和輕鏈表達，以 及，任選，可操作連接的條件下，培養(yǎng)含有如本申請所述核酸分子， 以及，任選，編碼抗體輕鏈核酸的細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞(例如，CHO 細(xì)胞)。任選，可從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化抗體或其片段。通常，所述抗體， 或其片段，具有降低的錯誤剪接或內(nèi)含子連讀(IRT)重鏈副產(chǎn)物。
本方法還包括在樣品，例如，來自宿主細(xì)胞的mRNA樣品中檢測 和/或測定IRT或IRT產(chǎn)物水平的步驟；在允許所述核酸樣品和探針雜 交的條件下，將所述核酸樣品品與互補于內(nèi)含子和鄰近外顯子序列， 或者與互補于鄰近外顯子序列的核酸探針接觸；檢測所得復(fù)合物，例 如，通過PCR擴增所述探針序列。在含有互補于內(nèi)含子序列核酸探針 的樣品中，復(fù)合物，例如，PCR擴增產(chǎn)物的檢出說明了 IRT或IRT產(chǎn) 物的存在。IRT產(chǎn)物的水平可根據(jù)，例如，實施例l中的描述來定量。在另一方面，本發(fā)明提供了通過從所述序列缺失一個協(xié)助IRT的
內(nèi)含子，來降低從基因組重鏈序列表達的內(nèi)含子連讀(IRT)重鏈副產(chǎn)物
的方法。
在又一方面，本發(fā)明的特征在于在樣品，例如核酸樣品中鑒定IRT
或IRT產(chǎn)物(例如，檢測和/或測定其水平)的方法。該方法包括從細(xì)
胞，例如重組細(xì)胞(例如，如本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞)獲得核酸樣品，例
如，mRNA樣品；在允許所述核酸樣品和探針雜交的條件下，將所述 核酸樣品與互補于內(nèi)含子和鄰近外顯子序列，或者與互補于鄰近外顯 子序列的核酸探針接觸；檢測所得復(fù)合物，例如，通過PCR擴增所述 探針序列。在含有互補于內(nèi)含子序列核酸探針的樣品中，復(fù)合物，例 如，PCR擴增產(chǎn)物的檢出說明了 IRT或IRT產(chǎn)物的存在。IRT產(chǎn)物的 水平可根據(jù)，例如，實施例l中的描述來定量。
在又一方面，本發(fā)明的特征在于，與參考，例如，天然存在的基 因組序列相比，按照本發(fā)明公開方法制備的抗體(例如，重組抗體)或其 片段具有降低的(例如，基本上不含有)錯誤剪接和/或內(nèi)含子連讀產(chǎn)物。 在一個實施方案中，所述抗體或其片段是嵌合的，人源化的，CDR-接 枝的或體外生成的。通常，所述抗體或其片段具有特異性結(jié)合于預(yù)定 的抗原，例如，與疾病，例如神經(jīng)變性或惡性疾病關(guān)聯(lián)抗原的可變區(qū)。
在又一方面，本發(fā)明提供了組合物，例如藥物組合物，其含有重 組蛋白或肽，例如抗體，該抗體與參考，例如，天然存在的基因組序 列相比，具有降低的(例如，基本上沒有)錯誤剪接和/或內(nèi)含子連讀產(chǎn)
物，的；以及藥物可接受的載體。這些組合物適用于治療性用途，包 括，例如，治療神經(jīng)變性疾病。
根據(jù)以下詳細(xì)說明和權(quán)利要求可使得本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點顯 而易見。


圖1所示為從含有3D6 IgG基因的表達載體中轉(zhuǎn)錄出來的預(yù)期前
mRNA(頂部)以及正確剪接mRNA(中間)和內(nèi)含子連讀mRNA(底部)。
圖2所示為指明了基因組5'和3'剪接接頭(SEQIDNO: 7)的跨越 了 3D6重鏈表達載體CH2和CH3恒定區(qū)之間內(nèi)含子(稱為第四內(nèi)含子) 的核酸序列。還示出了得自正確(SEQIDNO: 8)和不正確(SEQIDNO: 9)剪接mRNA的多肽預(yù)測的部分氨基酸序列。所述RNA剪接接頭由實 心雙線示出。
圖3是用來評估3D6重鏈基因轉(zhuǎn)錄總水平(含有mRNA轉(zhuǎn)錄本的 CH2的水平)和內(nèi)含子4連讀轉(zhuǎn)錄水平的定量-聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)探 針的示意圖。
圖4是說明含有含有內(nèi)含子4的轉(zhuǎn)錄本的持續(xù)累積隨培養(yǎng)時間和 蛋白表達誘導(dǎo)的變化而變化的條線圖。
圖5所示為3D6內(nèi)含子和外顯子的基因組排列以及用于開發(fā)解決 內(nèi)含子連讀轉(zhuǎn)錄表達載體中的修飾排列。
圖6所示為說明在用修飾表達載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中缺乏內(nèi)含子連 讀重鏈副產(chǎn)物的反相高效液相色譜(RP-HPLC)圖。
圖7所示為在重鏈基因組構(gòu)建體，缺失了最后三個內(nèi)含子序列的 構(gòu)建體，以及不含有內(nèi)含子的cDNA構(gòu)建體中的內(nèi)含子和外顯子的排 列。
圖8所示為人IgGl的基因組核苷酸和對應(yīng)的氨基酸序列(分別為 SEQIDNO:l和2)。編碼(^1，鉸鏈區(qū)，CH2禾n CH3的外顯子分別位于 (SEQ ID NO: l)的約231-524， 916-960， 1079-1408，以及1506-1829 位核苷酸。對應(yīng)于來自人IgGl重鏈基因組序列內(nèi)含子的Intl，Int2，Int3 和Int4分別位于(SEQIDNO: l)的約1-230，約525-915，約961-1078， 和約1409-1505位核苷酸。
圖9所示為人IgG4的基因組核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列(分 別為SEQIDNO: 3和4)。編碼&1，鉸鏈區(qū)，CH2和CH3的外顯子分 別位于(SEQ ID NO: 3)的約231-524， 916-952， 1071-1400，以及1498-1820位核苷酸。對應(yīng)于來自人IgG4重鏈基因組序列內(nèi)含子的 Intl， Int2， Int3和Int4分別位于(SEQ ID NO: 3)的約1-230，約525-916， 約953-1070，和約1401-1497位核苷酸。
圖10所示為缺失了恒定區(qū)CH2和CH3之間內(nèi)含子的人IgGl的 基因組核苷酸序列(SEQIDNO: 5)。
圖11所示為具有以下內(nèi)含子缺失的修飾的人IgG4基因組核苷酸 序列(SEQIDNO: 6): CH1和鉸鏈區(qū)之間的內(nèi)含子，鉸鏈區(qū)和CH2之 間的內(nèi)含子，以及CH2和CH3之間的內(nèi)含子。
圖12-設(shè)定了針對各種其他3D6， 10D5， 12B4和266抗體的重鏈 氨基酸序列。
圖-設(shè)定了針對各種其他3D6， 10D5， 12B4和266抗體的重鏈 氨基酸序列。
發(fā)明的詳細(xì)描述
已采用了多種方法對表達載體進行設(shè)計和構(gòu)建，而在得到合理的 蛋白水平之前，這樣的過程通常都需要相當(dāng)?shù)脑囧e試驗。在設(shè)計過程 中的一個重要的考慮就是在所述載體的構(gòu)建中使用內(nèi)含子序列。在一 個方法中，可將整個基因序列就如同其天然存在的-含有全部內(nèi)含子和 外顯子序列元件的情況進行利用。在這樣的情況下，可預(yù)期在該細(xì)胞 內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后剪接機制會對內(nèi)含子序列進行剪切，從而產(chǎn)生僅含有所述 基因外顯子序列的成熟mRNA。另一種方法是利用僅對應(yīng)于所述基因 cDNA的序列。在這種情況下，預(yù)測不會發(fā)生剪接事件，而且所述前 -mRNA序列也基本上與編碼蛋白成分中的mRNA序列相同。在第三種 情況下，載體構(gòu)建涉及選擇和放置在正常情況下未與原始基因序列相 聯(lián)的內(nèi)含子。
內(nèi)含子序列對載體內(nèi)表達基因序列的作用尚未完全了解。有報道 認(rèn)為，內(nèi)含子可影響蛋白制備過程中的眾多事件，包括轉(zhuǎn)錄速率，聚 腺苷酸化，mRNA輸出，翻譯效率，和mRNA衰亡(Nott等(2003) RNA 9:607-617)。在mRNA表達的環(huán)境中，在考慮到內(nèi)含子對從載體產(chǎn)生蛋白的結(jié)果時，目前還沒有明確的可預(yù)測性。例如，以前有多種報道認(rèn)
為，包括有多種內(nèi)含子序列可引起表達大幅度增加，對mRNA表達沒 有作用，或可降低mRNA表達(Berg等人(19S8) Mol. Cell. Biol. 8:4395-4405; Bourdon等人(2001) EMBO Rep. 2:394-398)。因為絕大多 數(shù)真核基因都含有內(nèi)含子，所以，在缺乏不希望連讀副產(chǎn)物的條件下 以高水平表達含有內(nèi)含子的基因并與所述外顯子序列具有高度一致性 的系統(tǒng)的開發(fā)，可顯著地幫助蛋白表達系統(tǒng)的可預(yù)測發(fā)展。
雖然與內(nèi)含子序列關(guān)聯(lián)的不可預(yù)測性阻礙了可靠的表達載體設(shè) 計，但是，當(dāng)感興趣的蛋白具有可接受遺傳工程技術(shù)的模式時，還是 能夠獲得顯著的設(shè)計益處?？贵w就提供了一個這樣的例子，其中所包 含的內(nèi)含子序列可協(xié)助表達載體的設(shè)計。
以下對某些用于本說明書和權(quán)利要求的術(shù)語進行了定義。
在本文中，術(shù)語"內(nèi)含子"包括經(jīng)過轉(zhuǎn)錄的，但卻從RNA轉(zhuǎn)錄本 中通過將序列(外顯子)兩端的任一端拼接在一起而被去除的DNA片 段。內(nèi)含子被認(rèn)為是基因的蛋白編碼區(qū)內(nèi)的干擾序列，且通常不含有 由該基因產(chǎn)生的蛋白所代表的信息。
術(shù)語"外顯子"包括呈現(xiàn)在含有干擾序列的基因的成熟RNA產(chǎn)物 中的任意片段。外顯子含有被翻譯成蛋白的基因內(nèi)部的信息。
術(shù)語"前-mRNA"包括通過RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄的基因中得到的 初始RNA產(chǎn)物。設(shè)計成前-mRNA的RNA同時含有內(nèi)含子和外顯子序 列，且因此未被細(xì)胞的剪接機制處理。
術(shù)語"mRNA"包括經(jīng)過處理去除了內(nèi)含子，且能夠被翻譯成多 肽的RNA轉(zhuǎn)錄本。術(shù)語"剪接"包括發(fā)生在真核細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞事件，其中內(nèi)含子
被從前-mRNA類型中去除。 一般地，該過程需要剪接酶體復(fù)合物的形 成，其中5'剪接供體位點被帶到3'剪接受體位點附近，同時從所述轉(zhuǎn) 錄本中去除干擾內(nèi)含子序列。
術(shù)語"載體"包括核酸構(gòu)建體，其通常含有感興趣的基因并且還 含有在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄核酸所必需的最基本元件。這樣的構(gòu) 建體可作為染色體外元件存在或可整合入宿主細(xì)胞的基因組。
術(shù)語"內(nèi)含子連讀"("IRT")是指這樣的過程，在該過程中異常 剪接的前-mRNA轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生了大小或氨基酸組成發(fā)生變化的蛋白或 肽?？紤]到從該錯誤剪接轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的最終蛋白，可能會產(chǎn)生不同的 結(jié)果。例如，可能會出現(xiàn)比預(yù)測蛋白更大的蛋白或具有不正確終止密 碼子的蛋白，在這樣的情況下，所述蛋白可能會分別比預(yù)測的蛋白更 長或更短。此外，所述蛋白還可具有不正確或額外的殘基，這些殘基 可協(xié)助用于糖基化，肉豆蔻?；?，磷酰化，泛素化，或其他翻譯后修 飾的蛋白修飾。
術(shù)語"內(nèi)含子連讀副產(chǎn)物"是指從內(nèi)含子連讀所得的異常剪接 mRNA翻譯而來的蛋白或肽，例如，具有不可預(yù)測大小或氨基酸組成 的蛋白質(zhì)。內(nèi)含子連讀副產(chǎn)物可以比由已知氨基酸序列的基因預(yù)測的 和/或由該基因的cDNA預(yù)測的多肽更短或更長。內(nèi)含子連讀副產(chǎn)物還 可與從所述基因正確剪接mRNA所產(chǎn)生的已接受分子量的蛋白具有相 差甚遠(yuǎn)的分子量。而且，術(shù)語"內(nèi)含子連讀副產(chǎn)物"還包括從與感興 趣蛋白非正常關(guān)聯(lián)的蛋白水解加工事件中產(chǎn)生的蛋白，所述蛋白水解 加工可由于內(nèi)含子-外顯子-接頭的連讀而從閱讀框移動的蛋白產(chǎn)物中 潛在地發(fā)生。
術(shù)語"重鏈副產(chǎn)物"是指從內(nèi)含子連讀產(chǎn)生的異常剪接免疫球蛋 白重鏈mRNA翻譯而來的多肽，例如，具有不可預(yù)測大小或氨基酸組成的重鏈蛋白。重鏈副產(chǎn)物可以比由免疫球蛋白的已知氨基酸序列預(yù)
測的和/或由該基因的cDNA預(yù)測的多肽更短或更長。重鏈副產(chǎn)物還可 與從所述重鏈基因正確剪接mRNA所產(chǎn)生的已接受分子量的蛋白具有 相差甚遠(yuǎn)的分子量。而且，術(shù)語"重鏈副產(chǎn)物"還包括從與所述蛋白 非正常關(guān)聯(lián)的蛋白水解加工事件中產(chǎn)生的多肽。
術(shù)語"天然存在序列"或"天然存在基因組序列"是指在自然或 天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含子和外顯子基因構(gòu)造?？梢栽冢?，其天然 染色體位置或其克隆至載體中的位置發(fā)現(xiàn)天然存在序列，只要保留所 述序列的內(nèi)含子和外顯子構(gòu)造。
術(shù)語"免疫球蛋白"或"抗體"(在本文中可交替使用)是指具有由 兩條重鏈和兩條輕鏈組成的4-條多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白，可通過，例如， 鏈間二硫鍵穩(wěn)定所述鏈，其中所述免疫球蛋白或抗體具有選擇性或特 異性結(jié)合于抗原的能力。
術(shù)語A^免疫球蛋白或A^-抗體是指選擇性或特異性結(jié)合A/3肽的 抗體。
術(shù)語"單鏈免疫球蛋白"或"單鏈抗體"(在本文中可交替使用) 是指具有由一條重鏈和一條輕鏈組成的2條-多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白，可通
過，例如，鏈間肽接頭穩(wěn)定所述鏈，其中所述免疫球蛋白或抗體具有 特異性結(jié)合于抗原的能力。
術(shù)語"免疫球蛋白或抗體結(jié)構(gòu)域"是指在重鏈或輕鏈多肽內(nèi)的球 狀區(qū)域，該區(qū)域包括通過，例如/3-折疊片和/或鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定的肽環(huán) (例如，包括3-4肽環(huán))。在本申請中，結(jié)構(gòu)域被進一步稱為"恒定的" 或"可變的"，其中術(shù)語"恒定的"是指在"恒定"結(jié)構(gòu)域的情況下， 各種組件的結(jié)構(gòu)域之內(nèi)相對缺乏序列變異，而其中術(shù)語"可變的"是 指在"可變"結(jié)構(gòu)域的情況下，各種組件的結(jié)構(gòu)域之內(nèi)的顯著變化。在本領(lǐng)域中，抗體或多肽"結(jié)構(gòu)域"經(jīng)?？杀唤惶娴胤Q為抗體或多肽 "區(qū)"。抗體輕鏈的"恒定"結(jié)構(gòu)域可被交替地稱為"輕鏈恒定區(qū)"， "輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域"，"CL"區(qū)或"CL"結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的"恒定"
結(jié)構(gòu)域可被交替地稱為"重鏈恒定區(qū)"，"重鏈恒定結(jié)構(gòu)域"，"CH"
區(qū)或"CH"結(jié)構(gòu)域?？贵w輕鏈的"可變"結(jié)構(gòu)域可被交替地稱為"輕 鏈可變區(qū)"，"輕鏈可變結(jié)構(gòu)域"，"VL"區(qū)或"VL"結(jié)構(gòu)域。抗體 重鏈的"可變"結(jié)構(gòu)域可被交替地稱為"重鏈可變區(qū)"，"重鏈可變 結(jié)構(gòu)域"，"VH"區(qū)或"VH"結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語"區(qū)"還指抗體鏈或抗體鏈結(jié)構(gòu)域的零件或部分(例如，如本 說明書中所定義的，重鏈或輕鏈的零件或部分，或恒定或可變結(jié)構(gòu)域 的零件或部分)，以及所述鏈或結(jié)構(gòu)域的更分散的零件或部分。例如， 如本說明書所定義的，輕鏈和重鏈或輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括散落 在"結(jié)構(gòu)區(qū)"或"FRs"之間的"互補決定區(qū)"或"CDRs"。
免疫球蛋白或抗體可以與單體或多聚體形式存在，例如，以五聚 體形式存在的IgM抗體，和/或以單體，二聚體或多聚體形式存在的IgA 抗體。術(shù)語"片段"是指抗體或抗體鏈的零件或部分，其包括比完整 或全部抗體或抗體鏈更少的氨基酸殘基?？赏ㄟ^對完整或全部抗體或 抗體鏈進行化學(xué)或酶學(xué)處理獲得片段。還可通過重組的方式獲得片段。 示例性的片段包括Fab， Fab'， F(ab')2， Fabc，禾d/或Fv片段。術(shù)語"抗 原結(jié)合片段"是指結(jié)合抗原或與完整抗體(即，與從所述完整抗體得到 的)競爭抗原結(jié)合(即，特異結(jié)合)的免疫球蛋白或抗體的多肽片段。
術(shù)語"構(gòu)象"是指蛋白或多肽的三級結(jié)構(gòu)(例如，抗體，抗體鏈， 及其結(jié)構(gòu)域或區(qū))。例如，短語"輕(或重)鏈構(gòu)象"是指輕(或重)鏈可變 區(qū)的三級結(jié)構(gòu)，而短語"抗體構(gòu)象"或"抗體片段構(gòu)象"則是指抗體 或其片段的三級結(jié)構(gòu)。術(shù)語"構(gòu)象"還可以指從一條或若干條蛋白或 肽鏈的三維關(guān)系所得的四級結(jié)構(gòu)。與抗原決定簇相比，短語"構(gòu)象表 位"是指包括以極其鄰近存在的一或數(shù)個蛋白內(nèi)的氨基酸特定空間排布的抗原決定簇。考慮到抗體的多功能性質(zhì)(即，IgG分子能夠同時結(jié) 合于不止一個蛋白分子上的若干表位的能力)，抗體被認(rèn)為是具有結(jié)合 由若干氨基酸鏈組成的構(gòu)象表位的內(nèi)在性質(zhì)。例如，形成斑的A口的沉 淀提供了構(gòu)象表位，其中一種抗體可以結(jié)合若干鄰近放置的A口肽。
可通過重組DNA技術(shù)，或通過對完整的免疫球蛋白進行酶學(xué)或化 學(xué)剪切制備結(jié)合片段。結(jié)合片段包括Fab， Fab'， F(ab，)2， Fabc， Fv， 單鏈和單鏈抗體。除了 "雙特異性"或"雙功能"免疫球蛋白或抗體， 免疫球蛋白或抗體可被理解為每個結(jié)合位點都是一致的。"雙特異性" 或"雙功能抗體"是人造雜合抗體，其具有兩對不同的重/輕鏈配對以 及兩種不同的結(jié)合位點。可通過包括雜交瘤融合或連接Fab'片段的多 種方法來制備雙特異性抗體?？蓞⒁?，例如，Songsivilai和Lachmann， Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny等，J. Immunol. 148， 1547-1553 (1992)。
抗體的"特異性結(jié)合"或"選擇性結(jié)合"是指抗體表現(xiàn)出的對特 定抗原或表位的顯著親合性，而且，通常并不表現(xiàn)出顯著的交叉反應(yīng) 性。"顯著的"或優(yōu)選的結(jié)合包括以至少106， 107， 108， 1(^M-1或101GM—1 的親合性結(jié)合，大于1(^M—1，優(yōu)選為大于108M—i的親合性是更優(yōu)選的。 在本說明書中設(shè)定的值的中間值也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，同時， 優(yōu)選的結(jié)合親合性可以親合力的范圍進行表示，例如，10、10"M—1，優(yōu) 選為10LlO"M—1，更優(yōu)選為10S-101QM"。"未表現(xiàn)出顯著交叉反應(yīng)性" 的抗體是不能顯著結(jié)合于不希望實體(例如，不希望的蛋白質(zhì)樣的實體) 的抗體。例如，特異性結(jié)合于的抗體可以顯著地結(jié)合于A/3，但不 與非-A/3蛋白或肽(例如，包括于斑內(nèi)的非-A/3蛋白或肽)顯著反應(yīng)。對 特定的表位具有特異性的抗體， 一般不會，例如，與在相同蛋白或肽 上的遠(yuǎn)端表位顯著的交叉反應(yīng)。在示例性的實施方案中，所述抗體并 未表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性(例如，并未與非-A^ 肽或與A/ 上的遠(yuǎn)端表位交叉 反應(yīng))?？筛鶕?jù)任意本領(lǐng)域所認(rèn)可的確定這種結(jié)合的方式來確定特異性 的結(jié)合。優(yōu)選地，可根據(jù)Scatchard分析和/或競爭性結(jié)合分析來確定特異性結(jié)合。
術(shù)語"顯著同一性"是指兩條序列，例如，兩條多肽序列，當(dāng)進
行最佳比對時，例如通過使用默認(rèn)缺口權(quán)重的GAP或BESTFIT程序時， 其享有至少50-60%的序列同一性，優(yōu)選為至少60-70%的序列同一性， 更優(yōu)選為至少70-80%的序列同一性，更優(yōu)選為至少80-90%的同一性， 甚至更優(yōu)選為至少90-95%的同一性，且甚至更優(yōu)選為至少95%的序列 同一性甚至更高的同一性(例如，99%的序列同一性或更高)。術(shù)語"相 當(dāng)?shù)囊恢滦?或"基本上一致"是指兩條序列，例如，兩條多肽序列， 當(dāng)進行最佳比對時，例如通過使用默認(rèn)缺口權(quán)重的GAP或BESTFIT 程序時，其享有至少80-90%的序列同一性，優(yōu)選為至少卯-95%的序列 同一性，且更優(yōu)選為至少95%的序列同一性甚至更高的同一性(例如， 99%的序列同一性或更高)。對序列比較而言，通常將一條序列作為參 考序列，將檢測序列與其進行比較。當(dāng)使用序列比較算法時，將檢測 和參考序列輸入計算機，如果需要的話，指定次級序列坐標(biāo)，并指定 序列算法程序參數(shù)。序列比較算法隨后根據(jù)所制定的程序參數(shù)，計算 出與參考序列相比，檢測序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。
可通過，例如，Smith和Waterman的本地同源性算法，Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)， Needleman和Wunsch的同源性比對算法，J Mol. B';ol. 48:443 (1970)，對Pearson和Lipman的尋找類似性方法，Proc. Nat，l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)，這些算法的計算機應(yīng)用(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP, BESTFIT， FASTA和TFASTA， Genetics Computer Group, 575 Science Dr.， Madison， WI)， 或通過目 視檢查(一般參見Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology) 來進行序列比較的最佳比對。適用于確定序列同一性百分?jǐn)?shù)和序列相 似性的算法示例之一就是BLAST算法，該算法可見于Altsclml等，J. Mol. Biol. 215:403 (1990)的描述。進行BLAST分析的軟件可通過國家 生物工程信息中心(科通過國立衛(wèi)生院的NCBI互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器公開獲得) 公開獲得。通常，可使用默認(rèn)的程序參數(shù)實施序列比較，盡管也可以使用自定義的參數(shù)。對于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用了字長(W) 為3，期望值(E)為10，以及BLOSUM62計分矩陣的默認(rèn)參數(shù)(參見， Henikoff & Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))。
優(yōu)選地，不一致的殘基位置會隨保守氨基酸的取代而有所不同。 出于將氨基酸取代分為保守或不保守的目的，可將氨基酸進行如下分 類I類(疏水側(cè)鏈)leu， met， ala， val， leu， ile; II類(中性親水側(cè)鏈) cys， ser， thr; III類(酸性側(cè)鏈)asp， glu; IV類(堿性側(cè)鏈)asn， gln， his， lys， arg; V類(影響鏈方向的殘基)gly， pro;和VI類(芳香側(cè)鏈) trp， tyr， phe。保守性取代涉及在相同類氨基酸之間的取代。非保守性 取代則包括將這些氨基酸種類中的氨基酸與另一種類中的氨基酸進行 交換。
抗體
本發(fā)明的方法可適用于各種抗體制備過程，其中可檢測出多余或 不希望的副產(chǎn)物。特別地，所述方法可適用于重組抗體，例如嵌合或 人源化單克隆抗體的制備，其中所制備抗體的序列是已知的。
術(shù)語"人源化免疫球蛋白"或"人源化抗體"是指包括至少一種 人源化免疫球蛋白或抗體鏈(g口，至少一種人源化輕鏈或重鏈)的免疫球 蛋白或抗體。術(shù)語"人源化免疫球蛋白鏈"或"人源化抗體鏈"(即， "人源化免疫球蛋白輕鏈"或"人源化免疫球蛋白重鏈")是指具有可 變區(qū)的免疫球蛋白或抗體鏈(即，分別為輕鏈或重鏈)，其包括基本來自 人免疫球蛋白或抗體可變框架區(qū)，以及基本來自非-人免疫球蛋白或抗 體的互補決定區(qū)(CDRs)(例如，至少一個CDR，優(yōu)選為兩個CDR，更 優(yōu)選為三個CDR)，而且還包括恒定區(qū)(例如，在輕鏈的情況下，至少 一個恒定區(qū)或其部分，在重鏈的情況下有選為三個恒定區(qū))。術(shù)語"人 源化可變區(qū)"(例如，"人源化輕鏈可變區(qū)"或"人源化重鏈可變區(qū)") 是指這樣的可變區(qū)，其包括基本來自人免疫球蛋白或抗體的可變框架 區(qū)以及基本來自非-人免疫球蛋白或抗體的互補決定區(qū)(CDR)。短語"基本來自人免疫球蛋白或抗體"或"基本上為人的"是指， 當(dāng)出于比較目的，與人免疫球蛋白或抗體氨基酸進行比對時，所述區(qū)
與人框架或恒定區(qū)序列享有至少80-90°/。， 90-95%，或95-99%同一性 (即，本地序列同一性)，從而允許，例如，保守性取代，共有序列取代， 種系取代，回復(fù)突變等。保守性取代，共有序列取代，種系取代，回 復(fù)突變等的引入，通常是指人源化抗體或鏈的"優(yōu)化"。短語"基本 來自非人免疫球蛋白或抗體"或"基本上非人類的"是指與非人類有 機體，例如，非人類哺乳動物的免疫球蛋白或抗體序列享有至少 80-95%，優(yōu)選為至少90-95%,更優(yōu)選為，96%， 97%， 98%，或99% 同一性的免疫球蛋白或抗體序列。
因此，人源化免疫球蛋白或抗體，或人源化免疫球蛋白或抗體鏈 的全部區(qū)和殘基，可能除了CDRs，都與一種或多種人免疫球蛋白序列 的對應(yīng)區(qū)或殘基基本上一致。術(shù)語"對應(yīng)區(qū)"或"對應(yīng)殘基"是指當(dāng) 出于比較目的對第一條和第二條序列進行最佳比對時，占據(jù)與第一條 氨基酸或核苷酸序列上的區(qū)或殘基相同(即，等同)位置的位于第二條氨 基酸或核苷酸序列上的區(qū)或殘基。
優(yōu)選地，人源化免疫球蛋白或抗體可以對應(yīng)非-人源化抗體3， 4， 或5倍的親合力與抗體結(jié)合。例如，如果非-人源化抗體具有109M—^勺 親合力，則人源化抗體就具有至少3x 109M"， 4x 109M—、或5 x 109M" 的親合力。當(dāng)對免疫球蛋白或抗體的結(jié)合性質(zhì)進行描述時，可根據(jù)該 鏈產(chǎn)生"指導(dǎo)抗原(例如，A/3或5T4)結(jié)合"的能力進行描述。當(dāng)使完 整的免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)具有特異性結(jié)合性質(zhì)或結(jié) 合親合力時，該鏈被稱為"指導(dǎo)抗原結(jié)合的"。與含有缺乏所述突變 的等同鏈的抗體(或其抗原結(jié)合片段)所造成的影響相比，如果突變影響 (例如，降低)含有所述鏈的完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段) 的結(jié)合親合力達到至少一個數(shù)量級，那么就認(rèn)為突變(例如，回復(fù)突變) 在很大程度上影響了重鏈或輕鏈指導(dǎo)結(jié)合抗原的能力。與含有缺乏所述突變的等同鏈的抗體(或其抗原結(jié)合片段)所造成的影響相比，如果其 影響(例如，降低)含有所述鏈的完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合 片段)的結(jié)合親合力僅為其兩倍，三倍或四倍，那么就認(rèn)為突變"未在 很大程度上影響(例如，降低)了鏈指導(dǎo)抗原結(jié)合"。
術(shù)語"嵌合免疫球蛋白"或抗體是指其可變區(qū)得自第一物種而其 恒定區(qū)得自第二物種的免疫球蛋白或抗體?？赏ㄟ^，例如遺傳工程， 從歸屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建嵌合免疫球蛋白或抗 體。術(shù)語"人源化免疫球蛋白"或"人源化抗體"并未意圖包括如本 說明書所定義的嵌合免疫球蛋白或抗體。盡管人源化免疫球蛋白或抗 體在其構(gòu)造上是嵌合的(即，含有來自超過一種蛋白的區(qū))，其還包括在 本發(fā)明所定義的嵌合免疫球蛋白或抗體中未被發(fā)現(xiàn)的其他特征(即，含 有供體CDR殘基和受體框架殘基的可變區(qū))。
可通過本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)，例如在Robinson等人的國 際申請PCT/US86/02269; Akira等人的歐洲專利申請第184,187號； Taniguchi， M的歐洲專利申請第171,496號；Morrison等人的歐洲專利 申請第173,494號；Neuberger等人的PCT國際公開WO 86/01533; Cabilly等人的美國專利第4,816,567號；Cabilly等人的歐洲專利申請 第125,023號；Better等人的(1988) Science 240:1041-1043; Liu等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443; Liu等人(1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura等人(1987) Cane. Res. 47:999-1005; Wood等人(19S5) Nature 314:446-449;以及Shaw等人(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi等人(1986) BioTechniques 4:214; Winter的美國專利第5,225,539號；Jones等人 (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan等人(1988) Science 239:1534;禾口 Beidler等人(1988) J. Immunol. 141:4053-4060所述的方法制備這樣的嵌 合和人源化單克隆抗體。通過例如，缺失，加入，或取代抗體其他部分，例如恒定區(qū)的修 飾得到的單克隆、嵌合和人源化抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，
可對抗體進行以下修飾(i)用其他的恒定區(qū)，例如旨在增加所述抗體 半衰期，穩(wěn)定性或親合性的恒定區(qū)，或來自其他物種或抗體類型的恒 定區(qū)來替換所述恒定區(qū)；或(ii)通過對所述恒定區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基 酸進行修飾，從而改變，例如，糖基化位點的數(shù)量，效應(yīng)細(xì)胞的功能， Fc受體(FcR)結(jié)合，補體結(jié)合等等。改變抗體恒定區(qū)的方法是本領(lǐng)域內(nèi) 公知的?？赏ㄟ^用不同的殘基替換所述抗體恒定區(qū)的至少一個氨基酸，
來制備具有改變的功能，例如，對效應(yīng)配基，例如細(xì)胞上的FcR，或補 體的Cl成分的親合性的抗體(參見，例如，歐洲專利第388,151號A1， 美國專利第5,624,821號和美國專利第5，648，260號，在此將其全文引 用作為參考)。也可對類似的改變類型進行描述，如果應(yīng)用于鼠類，或 其他物種的免疫球蛋白的話，會降低或消除這些功能。
例如，通過使用在其側(cè)鏈上具有適合的官能團的殘基替換特定的 殘基，或通過引入荷電的官能團，例如谷氨酸或天冬氨酸，或可能是 芳香非極性殘基，例如，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸或丙氨酸，有可 能改變抗體(例如，IgG，例如人IgG)的Fc區(qū)，對于FcR(例如，F(xiàn)c Y Rl)， 或?qū)τ贑lq結(jié)合的親合性(參見，例如美國專利第5,624,821號)。
來自轉(zhuǎn)基因動物和噬菌體顯示的人類抗體
可選擇地，現(xiàn)在有可能制備這樣的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)，其能 夠，在免疫之后，在不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的條件下產(chǎn)生人類抗體 的全部組成成分(repertoire)。例如，已有描述認(rèn)為，在嵌合和種系突
變小鼠中抗體重鏈結(jié)合區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致了內(nèi)源性抗體產(chǎn)生
的完全抑制。在這類種系突變小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn) 移導(dǎo)致了在抗原刺激之后人類抗體的產(chǎn)生。參見，例如，美國專利第 6,150,584號；第6,114,598號和第5,770,429號。
從噬菌體顯示文庫中也可以得到全部的人類抗體(Hoogenboom等，J. Mol. Biol.， 227:381 (1991); Marks等，J. Mol. Biol.， 222:581- 597 (腦))。
雙特異性抗體，抗體融合多肽，以及單鏈抗體
雙特異性抗體(BsAbs)是對至少兩個不同表位具有結(jié)合特異性的 抗體。這類抗體可從全長抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab)'2雙特異性抗體) 得到。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。全長雙特異性抗 體的常規(guī)制備是基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中這兩條 鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature, 305:537-539 (1983))。由于 免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機配合，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤)產(chǎn)生了不 同抗體分子的潛在混合物(參見，WO 93/08829以及Traunecker等， EMBOJ.， 10:3655-3659 (1991))。
雙特異性抗體還包括交聯(lián)或"異源結(jié)合物(heteroconjugate)"抗 體。例如，在異源結(jié)合物抗體中的一種可與抗生物素蛋白結(jié)合，而另 一種則與生物素或其他有效載荷(payload)相結(jié)合?？墒褂萌我夥奖?的交聯(lián)方法制備異源結(jié)合物抗體。適合的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域所公知的， 并在美國專利第4，676，980號中得以公開，同時還公開了許多交聯(lián)技術(shù)。
在另一個實施方案中，所述抗體可以化學(xué)或遺傳地，融合到有效 載荷結(jié)構(gòu)域，例如，免疫毒素從而制備出抗體融合多肽。這些有效載 荷包括，例如，免疫毒素，化療劑，以及放射性同位素，所有這些都 是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。
如本發(fā)明所述，單鏈抗體同樣也適用于穩(wěn)定化。該片段包括通過 連接物連接于輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)，其允許每個可變區(qū) 相互接觸并且重新構(gòu)建母抗體(parent antibody)的抗原結(jié)合袋，從中 可得VL和VH區(qū)。參見Gruber等，J. Immunol.， 152:5368 (1994)。
抗-A/3抗體一般地，本發(fā)明的抗體包括通過靶向A^肽，用于治療淀粉樣變性 疾病，尤其是阿耳茨海默氏病的抗體。
術(shù)語"淀粉樣變性(amyloidogenic)疾病"包括任和與不溶性淀 粉樣纖維形成或沉淀相關(guān)(或由此引起)的疾病。示例性的淀粉樣變性疾 病包括，但不限于，系統(tǒng)性淀粉樣變性病，阿耳茨海默氏病，成熟糖 尿病發(fā)作，帕金森氏癥，杭廷頓氏舞蹈病，額顳性癡呆，以及朊病毒-相關(guān)的傳染性海綿狀腦病(人類中的苦魯病和克魯-雅氏病以及分別在 羊和牛中的搔癢病和BSE)。根據(jù)所沉淀纖維多肽成分的性質(zhì)，對不同 的淀粉樣變性疾病進行了定義和表征。例如，在患有阿耳茨海默氏病 的受驗者或患者中，/3-淀粉樣蛋白(例如，野生型，變異的，或截短的/3-淀粉樣蛋白)是淀粉樣沉淀的特征性多肽成分。因此，阿耳茨海默氏病 是例如，在受驗者或患者大腦中"以A/3沉淀為特征的疾病"或"與A/3 沉淀相關(guān)疾病"的示例。術(shù)語"/3-淀粉樣蛋白"，"/3-淀粉樣肽"，"|3-淀粉體"，"A/3"和"A/3肽"在本說明書中可交替使用。在對哺乳動 物進行給藥時，可任意地與佐劑向結(jié)合，"免疫源性劑"或"免疫原" 能夠誘導(dǎo)對該動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
在本說明書中，術(shù)語"A口抗體"，"抗A口抗體"和"抗A口" 可交替使用，且其所指為結(jié)合于APP， A口蛋白或這二者的一個或多個 表位或抗原決定簇的抗體。可以在人淀粉樣前體蛋白(APP)中找到示例 性的表位或抗原決定簇，但優(yōu)選地可在APP的A/3肽中找到。APP以 多種異構(gòu)體形式存在，例如APP695 , APP^禾Q APP77Q?？筛鶕?jù)APP770 同功型的序列對APP內(nèi)的氨基酸分配數(shù)字號碼(參見，例如，GenBank Accession No. P05067)。A/3肽(在本說明書中也可以指卩淀粉樣肽和A" 是約4kDa的APP內(nèi)部的39-43氨基酸片段(A/339， A/340， A/341, A/542 和A/343)。 A/340,例如，由APP的672-711殘基組成，而A/342則由 APP的672-713殘基組成。作為體內(nèi)或原位的不同分泌酶對APP的蛋 白水解處理結(jié)果，可以同時得到"短形式"，長度為40個氨基酸，以 及"長形式"，長度為42-43氨基酸的A0肽。表位或抗原決定簇可定位于A/3肽的N-末端內(nèi)，并包括A/3的1-10氨基酸殘基，優(yōu)選為來自 A/342的1-3， 1-4， 1-5， 1-6， 1-7， 2-7， 3-6或3-7，或在A/3的2-4， 5， 6， 7或S殘基內(nèi)，A/3的3-5， 6， 7， 8或9殘基，或A042的4-7， 8， 9或10殘基。"中間的"表位或抗原決定簇可位于肽的中間或中 間部分，并包括的16-24， 16-23， 16-22， 16-21， 19-21， 19-22， 19-23或19-24位氨基酸。"C-末端"表位或抗原決定簇位于A/3肽的 C-末端內(nèi)，并包括A/3的33-40， 33-41或33-42氨基酸殘基。
在多種實施方案中，A/3抗體具有末端特異性。在本說明書中，術(shù) 語"末端特異性"是指這樣的抗體，其能夠特異性的結(jié)合于肽的 N-末端或C-末端殘基，但當(dāng)存在于含有所述殘基的更長A/3類型或存 在于APP中時，卻不能識別相同的殘基。
在多種實施方案中，A/3抗體具有"C-末端特異性"。在本說明書 中，術(shù)語"C-末端特異性"是指特異性識別A/3肽游離C-末端的抗體。 C-末端特異性抗體的示例包括這樣的情況識別末端在40位殘基 的A/3肽，但卻不能識別末端在41， 42和/或43位殘基A/3肽；識別末 端在42位殘基的A/3肽，但卻不能識別末端在40， 41和/或43位殘基 的A^肽，等等。
在一個實施方案中，所述抗體可以是3D6抗體或其變體，或10D5 抗體或其變體，這二者都可見于美國專利公開第2003/0165496 Al號， 美國專利公開第2004/0087777 Al號，和國際專利公開第WO02/46237 A3號。3D6和10D5的描述還可見于國際專利公開第WO02/088306 A2 號以及國際專利公開第WO02/088307 A2號。3D6是單克隆抗體(mAb)， 其能夠特異性地結(jié)合位于人/3-淀粉樣肽內(nèi)，具體地，殘基1-5的N-末 端表位。相比較而言，10D5也是單克隆抗體(mAb)，其能夠特異性地 結(jié)合位于人P-淀粉樣肽內(nèi)，具體地，殘基3-6的N-末端表位。在又一 個實施方案中，所述抗體可以是12B4抗體或其變體，如美國專利公開 第2004008276 2A1號和國際專利公開第WO03/077858 A2號所述。12B4是單克隆抗體(mAb)，其能夠特異性地結(jié)合位于人/3-淀粉樣肽內(nèi)， 具體地，殘基3-7的N-末端表位。在又一個實施方案中，所述抗體可 以是12A11抗體或其變體，如美國專利申請第10/858,855號和國際專 利申請第PCT/US04/17514號所述。12A11是單克隆抗體(mAb)，其能 夠特異性地結(jié)合位于人/3-淀粉樣肽內(nèi)，具體地，殘基3-7的N-末端表 位。在又一個實施方案中，所述抗體可以是266抗體，如美國專利申 請第10/789,273號和國際專利申請第WO01/62801 A2號所述。設(shè)計成 特異性結(jié)合位于人/3-淀粉樣肽內(nèi)C-末端表位的適用于本發(fā)明的抗體包 括，但不限于369.2B，如美國專利第5,786,160號所述。
在示例性的實施方案中，所述抗體可選自能夠選擇性結(jié)合A/3肽的 人源化的抗A/5肽3D6抗體，人源化的抗A/3肽12A11抗體，人源化的 抗A/3肽10D5抗體，人源化的抗A^肽12B4抗體和人源化的抗A/3肽 266抗體。更具體地，人源化的抗A/3肽3D6抗體被設(shè)計成特異性地結(jié) 合位于人^-淀粉樣1-40或1-42肽內(nèi)的NH2-末端表位，所述淀粉樣肽 是在腦內(nèi)的斑塊沉淀(例如，在罹患阿耳茨海默氏病的患者)中找到的。
Fc融合蛋白
在某些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼融合或嵌合蛋白。融 合蛋白可包括靶向部分，例如，可溶性的受體片段或配體，以及免疫 球蛋白鏈，F(xiàn)c片段，重鏈恒定區(qū)包括各種亞型IgGl， IgG2， IgG3， IgG4， IgM， IgAl， IgA2， IgD和IgE。例如，融合蛋白可包括受體的 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及，例如，融合于人免疫球蛋白Fc鏈(例如，人IgG， 例如，人lgGl或人IgG4，或其突變形式)。在一個實施方案中，人Fc 序列可在一個或多個氨基酸上突變，例如在野生型序列的254和257 殘基上突變從而降低Fc受體結(jié)合。融合蛋白還可額外地包括將第一個 部分與第二個部分，例如免疫球蛋白片段連接起來的連接物序列。例 如，融合蛋白可包括肽連接物，例如，約4-20，更優(yōu)選為5-10個氨基 酸長度的肽連接物；所述長度為8個氨基酸的肽連接物。例如，融合 蛋白可包括具有通式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的肽連接物，其中y為1，2， 3， 4， 5， 6， 7或8。在其他實施方案中，可向融合蛋白的N-或C-末端添加額外的氨基酸序列，從而促進表達，立體結(jié)構(gòu)撓性，測定和/ 或分離或純化。
可通過標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)制備本發(fā)明的嵌合或融合蛋白。例如， 可通過常規(guī)技術(shù)，例如，通過鈍-末端或粘-末端連接，限制性酶消化提 供適當(dāng)?shù)哪┒?，需要時進行粘末端補平，堿性磷酸酶處理以避免不希 望的連接，以及酶連接，將編碼不同多肽序列的DNA片段按讀框連接。 在其他實施方案中，可通過包括自動DNA合成的常規(guī)技術(shù)合成融合基 因。或者，可使用錨定引物進行基因片段的PCR擴增，所述錨定引物 能夠增加兩條連續(xù)基因片段之間的互補突出，這兩條序列可隨后退火 并重新擴增從而產(chǎn)生嵌合的基因序列(參見，例如，Ausubel等人(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992)。 除 此之外，有許多編碼融合部分(例如，免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū))的表達 載體是可商業(yè)獲得的。免疫球蛋白融合多肽是本領(lǐng)域公知的，且可參 見，例如，美國專利第5,516,964號；第5,225,538號；第5,428,130號； 第5,514,582號；第5，714,147號和第5，455,165號的描述。
核酸分子，構(gòu)建體和載體
本發(fā)明示例性實施方案的特征在于設(shè)計成消除不需要或不希望的 副產(chǎn)物，尤其是不需要或不希望的抗體(或免疫球蛋白)副產(chǎn)物的工程化
構(gòu)建體。在某些方面，所述構(gòu)建體包括天然存在的抗體基因序列的成 分，其中該成分可被遺傳化改變，修飾，或工程化(例如，遺傳工程化)
從而使得所得構(gòu)建體能在沒有不需要或不希望副產(chǎn)物的條件下表達感 興趣的所希望蛋白(例如，抗體)?？墒褂帽绢I(lǐng)域所公知的制備重組核酸 分子(例如，包括免疫球蛋白鏈基因的成分)的技術(shù)制備構(gòu)建體，如下詳 述。
抗體基因序列可編碼多種亞型的抗體，包括IgG(例如，IgGl， IgG2， IgG3， IgG4)， IgM， IgAl， IgA2， IgD或IgE。優(yōu)選地，所述抗體基因序列編碼的抗體是IgG亞型。所編碼的免疫球蛋白或抗體分子
可以包括全長(例如，IgGl或IgG4免疫球蛋白)或可以僅包括片段(例 如，F(xiàn)c片段)。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)該理解，使用遺傳密碼和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué) 技術(shù)，可從本申請所述的核苷酸和氨基酸序列，或從本領(lǐng)域公知的其 他來源的免疫球蛋白基因序列得到編碼本發(fā)明抗體的核苷酸序列?？?從公知的免疫球蛋白DNA(例如，cDNA序列)得到本發(fā)明的核酸組成。 特別地，核苷酸序列可與天然的V， D， J，或恒定區(qū)cDNA序列基本 上相同或從其衍生。重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域公知的。 優(yōu)選地，所述恒定區(qū)是人類的，但也可以使用來自其他物種，例如， 嚙齒類(例如，小鼠或大鼠)，靈長類(短尾猿)，駱駝，或兔子的恒定區(qū)。 來自這些物種的恒定區(qū)是本領(lǐng)域所公知的(參見，例如，Kabat， E.A等 人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，且可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增獲得含有這些區(qū)域的DNA片段。重鏈 恒定區(qū)可以是IgGl， IgG2， IgG3， IgG4， IgA， IgE， IgM或IgD的恒 定區(qū)。至于重鏈恒定區(qū)的序列是本領(lǐng)域所公知的，且可以在，例如， NCBINGJ)01019中找到。在一些實施方案中，所述恒定區(qū)是IgGl或 IgG4恒定區(qū)。對Fc片段重鏈基因而言，編碼Fc的DNA可被可操作地 連接于重鏈引導(dǎo)序列(例如，重鏈可變區(qū)引導(dǎo)序列)用于直接表達。
本發(fā)明的其他方面包括拼接的免疫球蛋白DNA盒序列。拼接的免 疫球蛋白盒序列包括由免疫球蛋白DNA盒核苷酸序列編碼的核酸序列 以及氨基酸序列。
在此提供了示例性的人IgGl恒定區(qū)基因組序列
GTGAGTCCTGTCGACTCTAGAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGC CTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGACGCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATGCCCATGAGCCCA
GACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGG
GGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTC
ACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGG
CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA
ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG
CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC
TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGC
ACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGG
AGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCT
GGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAG
GCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCC
CCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAG
GCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCT
GCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAG
CCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCA
TCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCA
AATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTA
AGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGT
GCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGT
GCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCC
TGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG
ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG
TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT
GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGA
GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGG
TGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCT
GCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGG
CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG
GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT
CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG
CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCG
TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCAC
CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT
GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
在此還提供了示例性的IgG4恒定區(qū)基因組序列
CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG
AACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCAC AGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCCCTCCGCAAGGCAGGCCCCATCTGTCTCCTCACCTGGAGGCCTCTGA
CCACCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGATTTTTC
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GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC
CAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAAT GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA (SEQ ID NO:3)抗體制備
本發(fā)明的抗體通常是通過重組表達制備的?？蓪⒕幋a輕鏈和重鏈 的核酸插入到表達載體中?？蓪⑤p鏈和重鏈克隆至相同或不同的表達
載體中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白鏈的DNA片段可操作地連接于表達載體
中確保免疫球蛋白多肽的表達的控制序列。表達控制序列包括，但不 限于，啟動子(例如，天然關(guān)聯(lián)的或異源啟動子)，信號序列，增強元件， 以及轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，表達控制序列是在能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核
宿主細(xì)胞(例如，COS或CHO細(xì)胞)的載體中的真核啟動子系統(tǒng)。
根據(jù)如上所述操作分離的遺傳材料從而提供本發(fā)明多肽后，通常 可將所述基因插入表達載體用于導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述載體可用來制備 所希望量的修飾抗體，這樣的抗體反過來提供了權(quán)利要求所述的多肽。 術(shù)語"載體"包括了核酸構(gòu)建體，其常常包括核酸，例如基因，且還 包括核酸復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定性和/或來自宿主細(xì)胞蛋白表達或分泌所必 需的最少元件。這樣的構(gòu)建體可以染色體外元件的形式存在，或可以 整合入宿主細(xì)胞的基因組。
術(shù)語"表達載體"包括特定類型的載體，其中對所述核酸構(gòu)建體 進行優(yōu)化從而獲得所希望蛋白產(chǎn)物的高水平表達。表達載體常常含有 諸如啟動子和增強子元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其被優(yōu)化從而在特定的細(xì) 胞類型中獲得高水平的轉(zhuǎn)錄，和/或?qū)ζ溥M行優(yōu)化從而使得在使用了特 定的誘導(dǎo)劑時，所述表達是組成型的。表達載體還具有提供適當(dāng)和/或 增強的蛋白翻譯的序列。如本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的，這樣的載 體可方便地選自質(zhì)粒，噬菌體，病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。術(shù)語"表達盒" 包括含有基因和除該基因之外能夠允許在宿主細(xì)胞中適當(dāng)和或增強地 表達所述基因的元件。術(shù)語"可操作地連接"包括毗連(juxtaposition)，其中所述成分 以允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能(例如，功能性連接)的關(guān)系相連。例 如，可將可操作地連接于感興趣多核苷酸的啟動子/增強子連接于所述 多核苷酸，從而在能夠激活由所述啟動子/增強子指導(dǎo)表達的情況下獲 得所述感興趣多核苷酸的表達。至于本說明書所述的發(fā)明，可操作地 連接還包括在感興趣基因的原始轉(zhuǎn)錄物(前-mRNA)中發(fā)現(xiàn)的剪接供體
和剪接受體位點的關(guān)系。 一般地，剪接受體和供體位點是可操作連接 的，其中需要兩個序列，且共同發(fā)揮作用從而產(chǎn)生了所得成熟信使 RNA。
短語"天然可操作連接"是指在其天然或自然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的基因 的內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)(organization)。克隆感興趣基因的方法之 一涉及從所述基因中分離核酸，包括外顯子和內(nèi)含子，并將所述核酸 序列插入載體進而對這些核酸序列進行擴增。還可以將全部基因序列 插入用于在相同或不同物種中表達所述蛋白的表達載體中。當(dāng)含有內(nèi) 含子和外顯子的基因，被發(fā)現(xiàn)正以其天然狀態(tài)存在形式被克隆時，可 認(rèn)為所述內(nèi)含子和外顯子保留了其天然可操作連接。
表達載體在宿主有機體中通常是可復(fù)制的，就像游離體(episome) 或宿主染色體DNA的整合部分一樣。通常，表達載體含有選擇標(biāo)記(例 如，氨芐抗性，潮霉素抗性，四環(huán)素抗性，卡那霉素抗性或新霉素抗 性)從而允許用所希望的DNA序列來檢測那些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(參見，例如， Itakiira等人的美國專利第4,704,362號)。除了免疫球蛋白盒序列，插 入序列和調(diào)控序列，本發(fā)明的重組表達載體還可攜帶其他的序列，例 如能夠在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)載體復(fù)制的序列(例如，復(fù)制原點)和選擇性標(biāo) 記基因序列。選擇性標(biāo)記基因可協(xié)助選擇導(dǎo)入了載體的宿主細(xì)胞(參見， 例如，Axel等人的美國專利第4,399,216號，第4,634,665號和第 5,179,017號)。例如，通常，選擇性標(biāo)記基因都會向?qū)肓怂鲚d體的宿主細(xì)胞賦予藥物抗性，例如G418抗性，潮霉素抗性或氨甲蝶呤抗性。 優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(適用于在 dhft-宿主中進行氨甲蝶吟篩選/擴增)和neo基因(用于G418篩選)。
一旦將載體整合入適當(dāng)?shù)乃拗髦校涂蓪⑺拗鞅３衷谶m于所述核 苷酸序列高水平表達，和收集和純化所希望的抗體的條件下。哺乳動 物細(xì)胞本發(fā)明抗體的表達和制備所優(yōu)選的。參見，例如，Winnacker， F薩Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y.， N. Y. (1987)。真核細(xì)胞 是優(yōu)選的，因為已有多種能夠分泌異源蛋白(例如，完整的免疫球蛋白) 的適合宿主細(xì)胞系在本領(lǐng)域中得到了開發(fā)，包括有CHO細(xì)胞系，各種 COS細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞，優(yōu)選地，骨髓瘤細(xì)胞系，或轉(zhuǎn)化的B-細(xì)胞或 雜交瘤。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是非人類的。優(yōu)選的適于表達本發(fā)明抗體 的哺乳動物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細(xì)胞)(包括dhfTCHO細(xì)胞， 參見Urlaub和Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220， 與DHFR選擇標(biāo)記一起使用，例如，如Kaufman和Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621所述)，淋巴細(xì)胞系，例如，NSO骨髓瘤細(xì)胞和SP2 細(xì)胞，COS細(xì)胞，和得自轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞，例如，乳腺上皮細(xì)胞。 其他適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的。
適用于這些細(xì)胞的表達載體可包括表達控制序列，例如復(fù)制原點， 啟動子，和增強子(Queen等人，Immunol. Rev. 89:49 (1986))，以及必 要的處理信息位點，例如核糖體結(jié)合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷 酸化位點，和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達控制序列是得自免疫球蛋 白基因，SV40，腺病毒，牛乳頭瘤病毒，巨細(xì)胞病毒等等的啟動子。 參見，例如，Co等人，(1992) J. Immunol. 148:1149。優(yōu)選的適用于哺 乳動物宿主細(xì)胞表達的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)哺乳動物中高水平蛋白表達 的病毒元件，例如得自FF-la啟動子和BGH多聚A，巨細(xì)胞病毒 (CMV)(例如CMV啟動子/增強子)，猴腎病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強子)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚啟動子(AdMLP))和多瘤病毒 的啟動子和/或增強子。對病毒調(diào)節(jié)元件，及其序列的進一步描述，請 參見，例如Stinski等人的美國專利第5，168，062號，Bell等人的美國專 利第4，510，245號，和Schaffher等人的美國專利第4,968,615號。在示 例性的實施方案中，可將抗體重鏈和輕鏈基因可操作地連接于增強子/ 啟動子調(diào)節(jié)元件(例如，得自SV40， CMV，腺病毒等，例如CMV增強 子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件) 從而驅(qū)動所述基因的高水平轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的示例性實施方案中，所 述構(gòu)建體包括了內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)從而在真核宿主細(xì)胞中提 供了相對高水平的本發(fā)明多肽。美國專利第6，193，980號公開了相容的 IRES序列，在此將其全文引用作為參考。
或者，可將抗體-編碼序列整合入轉(zhuǎn)基因中，從而引入到轉(zhuǎn)基因動 物的基因組并在該轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中得到隨后的表達(參見，例如， Deboer等人的美國專利第5,741,957號，等人的美國專利第5,304，489 號和Meade等人的美國專利第5,849,992號)。適合的轉(zhuǎn)基因包括輕鏈 和/或重鏈的編碼序列，其可操作地與來自乳腺特異性基因，例如酪蛋 白或/ 乳球蛋白的啟動子和增強子連接。
原核宿主細(xì)胞也可適用于制備本發(fā)明的抗體。E. coli是一種特別 適用于克隆本發(fā)明多核苷酸(例如，DNA序列)的原核宿主。其他適用 于該用途的微生物宿主包括桿菌屬，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，腸桿菌屬，例如大腸桿菌，沙門氏菌和沙雷氏菌，以及各種 假單孢菌類型。在這些原核宿主中，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員同樣可制備 表達載體，所述表達載體可通常含有與該宿主相容的表達控制序列(例 如，復(fù)制原點)。此外，還可存在有任意數(shù)量的各種公知的啟動子，例 如乳糖啟動子系統(tǒng)，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)，/3-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)， 或來自噬菌體A的啟動子系統(tǒng)。所述啟動子通?？刂票磉_，任選通過操縱子來進行，且具有核糖體結(jié)合位點序列等等，從而啟動和完成轉(zhuǎn) 錄和翻譯。
原核生物中的蛋白表達通常都是在E.COli中，采用含有指導(dǎo)融合
或非融合蛋白表達的組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體來進行的。融合載 體可向其中所編碼的抗體，通常是重組抗體的恒定區(qū)上加入多個氨基
酸，而不會影響該抗體的特異性或抗原識別。融合肽氨基酸的加入可
向抗體添加額外的功能，例如作為標(biāo)記(例如，表位標(biāo)簽，例如myc或 flag)。
其他的微生物，例如酵母，同樣也可用于表達。酵母屬 (Saccharomyces)是優(yōu)選的酵母宿主，其具有適合的載體，所述載體 擁有所希望的表達控制序列(例如，啟動子)，復(fù)制原點，終止序列等等。 常見的啟動子包括3-磷酸甘油酯激酶和其他的糖酵解酶?？烧T導(dǎo)的酵 母啟動子包括，特別是，來自乙醇脫氫酶，異細(xì)胞色素C，以及負(fù)責(zé)麥 芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
或者，可在轉(zhuǎn)基因植物(例如，煙草，玉米，大豆和紫花苜蓿)中制 備本發(fā)明的抗體。改良的'植物抗體，載體(Hendy等人(1999) J. Immunol. Methods 231:137-146)和純化策略以及可轉(zhuǎn)化作物品種的增加 使得這樣的方法不僅對人類和動物治療，而且還對工業(yè)應(yīng)用(例如，催 化性抗體)成為制備重組免疫球蛋白的實際和有效的方法。而且，植物 制備的抗體還表現(xiàn)得安全而有效且避免了使用源自動物的材料，且因 此避免了具有傳染性海綿腦病(TSE)制劑的污染風(fēng)險。此外，植物和哺
乳動物細(xì)胞制備抗體的糖基化模式差異對抗體結(jié)合或特異性影響微弱 或沒有影響。而且，在接受源自植物的分泌性二聚體IgA抗體的局部 口服應(yīng)用的患者中也沒有觀察到毒性或HAMA的證據(jù)(參見，例如， Larrick等人(1998) Res. Immunol. 149:603-608)?？墒褂枚喾N方法在轉(zhuǎn)基因植物中表達重組抗體。例如，可將抗體
重鏈和輕鏈獨立地克隆入表達載體(例如，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)載體)，然后使用重組細(xì)菌或直接轉(zhuǎn)化的方法在體外進行 植物組織轉(zhuǎn)化，例如，使用隨后采用轟擊方式被物理性導(dǎo)入植物組織 的載體所包被的顆粒。隨后，將表達單獨鏈的整株植物重建，然后進 行有性雜交，最終制備了完全組裝和具有功能的抗體。類似的規(guī)程已 被用于在煙草植物中表達功能性抗體(參見，例如，Hiatt等人(1989) Nature 342:76-87)。在不同實施方案中，可使用信號序列來啟動所述表 達，通過將所述鏈指引入適當(dāng)?shù)闹参锃h(huán)境(例如，apoplasm或其他特定 植物組織，包括塊莖、果實或種子的水環(huán)境)中對未組裝的抗體鏈進行 結(jié)合和折疊(參見Fiedler等人(1995) Bio/Technology 13:1090-1093)。植 物生物反應(yīng)器同樣可用來提高抗體產(chǎn)量，和明顯降低成本。
適合的宿主細(xì)胞在Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego， Calif—書中
有更詳細(xì)的討論?；蛘撸墒褂?，例如T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合 酶在體外對重組表達載體進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。
可根據(jù)細(xì)胞宿主的各種類型，通過公知的方法，將含有感興趣多 核苷酸序列的載體(例如，重鏈和輕鏈編碼序列和表達控制序列)轉(zhuǎn)入宿 主細(xì)胞中。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染通常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理，電 穿孔，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，基因槍(biolistic)或基于病毒的轉(zhuǎn)染則可用于其 他細(xì)胞宿主(通?？蓞⒁奡ambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press， 2nd ed.， 1989，出于全部 目的在此將其全文引用作為參考)。其他用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的方法 包括聚凝胺(polybrene)，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體，電穿孔，和顯微 注射(通常可參見，Sambrook等人得著作，以上所述)。為了制備轉(zhuǎn)基因動物，可將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精卵中，或整合入胚胎干細(xì)胞的基 因組中，并將這種細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入去核的卵細(xì)胞中。
當(dāng)重鏈和輕鏈被克隆至單獨的表達載體上時，可將所述載體共轉(zhuǎn) 染從而獲得完整免疫球蛋白的表達和組裝。
一旦得以表達，可使用本
領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序，包括硫酸銨沉淀，親合柱，柱層析，HPLC純化，凝
膠電泳等純化本發(fā)明的完整抗體，其二聚體，單獨的輕鏈和重鏈，或
其他免疫球蛋白形式(通?？蓞⒁奡copes ， Protein Purification (Springer-Verlag， N. Y.， (1982))。對制藥而而言，至少約90-95%同質(zhì) 的基本上純的免疫球蛋白是優(yōu)選的，而98-99%或更高的同質(zhì)性是更優(yōu) 選的。
如本發(fā)明所述制備的免疫球蛋白或抗體可進行衍生或連接于其他 功能性分子(例如，其他肽或蛋白)。因此，可對本說明書中本發(fā)明的抗 體或抗體部分或所述抗體的修飾形式進一步地衍生從而用于研究，診 斷和/或治療性范圍。例如，可將本發(fā)明的抗體或抗體部分功能性地連 接于(通過化學(xué)偶聯(lián)，遺傳融合，非共價連接或其他)一種或多種其他分 子實體，例如其他抗體(例如雙特異性抗體或雙特異抗體(diabody))， 可檢測試劑，細(xì)胞毒性劑，藥物制劑，和/或蛋白或肽，這些實體可介 導(dǎo)所述抗體或抗體部分與其他分子(例如鏈親和素核心區(qū)或聚組氨酸標(biāo) 簽)連接。
可通過交聯(lián)兩種或更多種抗體(相同類型或不同類型的，例如，來 制備雙特異性抗體)制備一類衍生抗體。適合的交聯(lián)劑包括那些異源雙 功能的交聯(lián)劑，其具有被適當(dāng)間隔物(例如，m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同源雙官能團(例如，辛二酸二琥珀酰亞胺酯)分 隔的具有不同反應(yīng)活性的基團。這類交聯(lián)劑可購自Pierce Chemical
Company, Rockford， IL。示例性的熒光可檢測劑包括熒光素，熒光素異硫氰酸酯，若丹明， 5-二甲基胺-l-萘磺酰氯，藻紅蛋白等等。也可使用可檢測的酶，例如 堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，P-半乳糖苷酶，乙酰膽堿酯酶，葡萄糖 氧化酶等等對抗體進行衍生。當(dāng)用可檢測的酶對抗體進行衍生時，可
通過加入所述酶用來產(chǎn)生可檢測反應(yīng)產(chǎn)物的其他試劑來進行測定。例 如，當(dāng)存在辣根過氧化物酶檢測劑時，過氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺的加 入可導(dǎo)致有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物是能被檢測的。還可以使用輔基(例 如，鏈親和素/生物素和親和素/生物素)對抗體進行衍生。例如，可使用 生物素對抗體進行衍生，并通過間接測定親和素或鏈親和素結(jié)合的來 進行檢測。適當(dāng)?shù)臒晒獠牧鲜纠▊阈瓮?，熒光素，熒光素異硫?酸酯，若丹明，二氯三嗪基胺熒光素，丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材 料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括熒光素酶，蟲熒光 素和水母發(fā)光蛋白，且適合的放射性材料示例包括1251， 1311， "S或311。
還可將抗體(或其片段)結(jié)合于治療性部分，例如細(xì)胞毒素或其他治療性 蛋白?；蛘?，可將抗體結(jié)合于第二抗體從而形成抗體異源結(jié)合物，如
Segal等人的美國專利第4，676，980號所述。
用于降低或消除不希望的多肽副產(chǎn)物的表達載體 在開發(fā)適用于治療性蛋白的蛋白表達系統(tǒng)過程中，對純化靶產(chǎn)物 的HPLC分析鑒定了意外低分子量(LMW)類型的肽。更具體地，在開 發(fā)用于表達3D6抗體的CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞系中觀察到了意外的 多肽副產(chǎn)物。在別處也有對該抗體的描述，同時該抗體也是開發(fā)適用 于治療阿耳茨海默氏病的免疫治療劑的諸多努力的結(jié)果。其具有對于
八-/3肽的特異性并被證明了可有效清除A-Z3斑塊。除了用于對含有表達 盒細(xì)胞進行選擇性培養(yǎng)的基因，還可使用本領(lǐng)域可接受的方法以及含 有的3D6抗體重鏈和輕鏈的拷貝開發(fā)CHO細(xì)胞系。對所述細(xì)胞的眾多克隆分離物進行的檢測表明，LMW類型的產(chǎn)生 并不是被使用的該克隆特異性現(xiàn)象，即，在全部被測細(xì)胞系中所產(chǎn)生 的全部蛋白只有一少部分是意外的LMW類型。還進一步觀察到，當(dāng)?shù)?白表達受到誘導(dǎo)時，相對于總蛋白LMW類型的比例有所增加。使用質(zhì) 譜對多肽的進一步測定說明，所述LMW類型含有所述基因的外顯子序 列未能預(yù)測出的氨基酸。
圖1的頂部圖版示意性地表示出了具有內(nèi)含子和外顯子關(guān)系以及 內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和二輕葉酸還原酶(DHFR)選擇性標(biāo)記基因 的位置的3D6重鏈表達盒。所示的外顯子是可變區(qū)重鏈(VHl),鉸鏈區(qū) 和恒定區(qū)重鏈l， 2，和3(Ch1， Ch2， Ch3)。所述表達盒的內(nèi)含子被表 示為Intl, Int2， Int3和Int4。圖1還給出了從得自表達盒的mRNA所 預(yù)測的正確的剪接事件。中部的圖版所示為僅含有雙順反子轉(zhuǎn)錄物內(nèi) 含子序列的正確剪接的mRNA。
在表達載體中的內(nèi)含子和外顯子序列進行的仔細(xì)檢查以及質(zhì)譜數(shù) 據(jù)指出了對特異性剪接位點接頭的RNA聚合酶內(nèi)含子連讀(IRT)。因為
在所述表達載體中內(nèi)含子和外顯子以及剪接位點供體和受體位點之間 的組織結(jié)構(gòu)與所述基因原始基因組結(jié)構(gòu)中的情況基本上一致，所以錯 誤間接事件是很難預(yù)測的。
圖1的底部圖版所示為由第四內(nèi)含子的內(nèi)含子連讀所產(chǎn)生的預(yù)測 產(chǎn)物。圖2提供了 3D6抗體表達載體基因組序列第四內(nèi)含子區(qū)域中 DNA序列正義和反義鏈的序列信息。剪接接頭(剪接供體和受體位點) 由與該核酸序列垂直的豎線表示。對應(yīng)于內(nèi)含子序列的DNA以下劃線 和斜體表示。所希望產(chǎn)物的和連讀副產(chǎn)物多肽的預(yù)測氨基酸表示在基 因組DNA的反義鏈下方。得自正確剪接RNA的多肽的氨基酸序列以 粗體的大寫字母表示；得自錯誤剪接RNA的多肽副產(chǎn)物以小寫字體表示。
本發(fā)明描述了設(shè)計蛋白表達盒以及載體的材料和方法，從而使得
可以在很大程度上降低或完全消除內(nèi)含子連讀(IRT)和不希望的多肽副 產(chǎn)物。部分地，本發(fā)明提供了新的載體設(shè)計，其中在編碼感興趣蛋白 的分離核酸中的內(nèi)含子和外顯子天然可操作連接被改變，從而降低或 消除了 IRT，由此降低或消除了不希望的IRT多肽類型。所述獨特的 改變特別適合于IgGl或lgG4抗體，但可用于任意感興趣的基因。此 外，具有改變后的天然可操作連接的內(nèi)含子和外顯子的本發(fā)明載體顯 示，與使用本領(lǐng)域公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)設(shè)計的載體相關(guān)，不僅降低或消除 了IRT副產(chǎn)物，還增加了蛋白表達水平。
實施例 材料與方法
在所有實施例中，除非特別指明，否則所使用的都是下文所例示 的材料和方法
一般地，本發(fā)明的實施采用了在分子生物學(xué)，重組DNA技術(shù)，以 及免疫學(xué)，尤其是，例如抗體技術(shù)領(lǐng)域中公知的技術(shù)。參見，例如， Sambrook， Fritsch and Maniatis， Molecular Cloning (分子克隆)Cold Spring Harbor laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (抗體工程規(guī)程)(Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)方法))， 510， Paul, S,， Human Press (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (抗體工程實用方法)(Practical Approach Series, 169)， McCafferty, Ed IRL Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual (抗 體實驗室手冊)，Harlow等，Cold Spring Harbor Press, (1999);和 Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)最新夫見禾呈)eds. Ausubel等，John Wiley & Sons (1992)。實施例l內(nèi)含子連讀轉(zhuǎn)錄的定量
為了對內(nèi)含子連讀所形成異常轉(zhuǎn)錄本的相對量進行定量，設(shè)計了
定量PCR分析。評價IRT轉(zhuǎn)錄的方法已在圖3中所示。具體地，使用 TaqMan3系統(tǒng)設(shè)計定量PCR分析，其中使用PCR擴增來定量感興趣的 核酸類型。設(shè)計了三組探針引物來確定所產(chǎn)生的內(nèi)含子連讀mRNA部 分。第一組探針引物被設(shè)計成定量與感興趣內(nèi)含子天然可操作連接的 外顯子序列的轉(zhuǎn)錄水平。在3D6重鏈表達盒的情況中，含有3D6第二 恒定區(qū)重鏈(CH2)外顯子的mRNA類型是靶位點。這為3D6 mRNA的 總產(chǎn)物提供了度量方式。第二組探針引物橋接了可操作連接的內(nèi)含子 和外顯子，在這里，連接的是3D6表達盒的CH2外顯子-第四內(nèi)含子的 界面。對來自這一探針引物組的擴增說明了存在有含有5'剪接供體序 列的內(nèi)含子連讀轉(zhuǎn)錄物，以及存在有橋接有CH2外顯子和內(nèi)含子4的 序列。第三組探針引物靶定的是第四內(nèi)含子的序列。這組探針提供了 對含有內(nèi)部內(nèi)含子4序列的錯誤剪接RNA部分的定量分析。
圖4所示為使用所述探針引物組得到的Q-PCR分析結(jié)果。簡言之， 將含有穩(wěn)定整合有表達載體的CHO細(xì)胞接種并在培養(yǎng)基中維持兩周。 在第7天對培養(yǎng)物進行誘導(dǎo)從而提高增強表達。在實驗過程中，將細(xì) 胞培養(yǎng)物的樣本裂解，并使用如前一段中所述的對CH2外顯子或內(nèi)含 子具有特異性的探針和引物組進行分析對RNA含量進行評估。圖表所 示為在誘導(dǎo)之前低水平的錯誤剪接RNA產(chǎn)物，以及在誘導(dǎo)之后含有內(nèi) 含子4的RNA百分比隨時間而增高。在此所述的Q-PCR方法可預(yù)測 這樣的可能性，即含有以天然可操作連接的內(nèi)含子和外顯子的特定表 達盒能夠產(chǎn)生內(nèi)含子連讀副產(chǎn)物。
盡管已經(jīng)清晰地提供了對3D6抗體表達系統(tǒng)的IRT進行定量的詳 細(xì)內(nèi)容，但依然能夠在存在有潛在IRT的任意蛋白表達系統(tǒng)中實施該 項技術(shù)。本發(fā)明的新方法，因此，特別適用于評估是否本發(fā)明的載體(以下詳述)能夠適合特定的感興趣蛋白，從而避免不希望的IRT多肽副產(chǎn) 物的產(chǎn)生。當(dāng)IRT轉(zhuǎn)錄本的豐度大于約0.1%-1%時，可使用具有經(jīng)改 變的天然可操作連接的載體來表達所希望的蛋白。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人 員應(yīng)該很容易理解，測定內(nèi)含子連讀mRNA的方法，以及由此，預(yù)測 是否可將內(nèi)含子連讀多肽應(yīng)用于其中發(fā)生剪接事件的任意蛋白表達系 統(tǒng)的方法。例如，所述系統(tǒng)可用于任意真核細(xì)胞系統(tǒng)，例如，酵母， 果蠅，小鼠，猴子，兔子，大鼠，或基于人類細(xì)胞的系統(tǒng)。
實施例2具有修飾的天然可操作連接的內(nèi)含子和外顯子的載體 可對表達載體進行設(shè)計，其中對內(nèi)含子和外顯子的天然可操作連 接進行修飾。兩種示例性的載體序列可見于圖5。該圖所示為開發(fā)用于 解決內(nèi)含子連讀副產(chǎn)物問題的表達構(gòu)建體。頂部圖板所示為含有可變 區(qū)(Vh)，三個恒定區(qū)(ChI, Ch2， CH3)和鉸鏈區(qū)外顯子的一般性抗體重 鏈的基因組，內(nèi)含子-外顯子組織結(jié)構(gòu)。中部和底部圖板描述了對整合 入表達載體的基因組序列進行的修飾，其能夠消除內(nèi)含子連讀重鏈副 產(chǎn)物。
可使用具有3D6抗體完整基因組重鏈序列或其中內(nèi)含子和外顯子 的天然可操作連接受到修飾的經(jīng)過修飾的3D6重鏈表達載體來轉(zhuǎn)化表 達3D6輕鏈的CHO細(xì)胞?？墒褂萌绮牧吓c方法中所述的用于蛋白表達 目的的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來培養(yǎng)所述細(xì)胞。從經(jīng)過處理的上清液中純化抗體， 并隨后是用變性反相(RP)HPLC進行級分分離(圖6)。通過過柱使得抗 體的重鏈和輕鏈組分得以分離。
在代表3D6基因組克隆蛋白制備組分的頂部軌跡中，重鏈和輕鏈 的峰是顯而易見的。此外，還可在重鏈和輕鏈組分之間辨識到對應(yīng)于 重鏈內(nèi)含子連讀產(chǎn)物的一個小峰。底部的軌跡是減少了內(nèi)含子連讀問題的表達系統(tǒng)的示例。與頂部
的軌跡一樣，輕鏈和重鏈峰都是清晰可見的，然而，IRT的水平卻降低 到了檢測限以下。可將這一發(fā)現(xiàn)擴展到內(nèi)含子和外顯子的天然可操作 連接受到改變的其他載體中去。例如，圖5所示的HCA內(nèi)含子4序列 就類似地將IRT降低至不可檢測的水平。
表1所示為圖5所示HCA內(nèi)含子4序列的詳細(xì)情況。
表1:hu3D6 v2 HC-A4GTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGG CTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGG GCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCC CCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGG GCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGC AGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCC
TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT
CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAA ATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT GCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA
實施例3去除內(nèi)含子增強蛋白表達
為了測定內(nèi)含子去除對抗體表達的效果，可使用不同數(shù)量內(nèi)含子構(gòu)建的抗體的表達構(gòu)建體。12A1W3.1可變區(qū)在CHO細(xì)胞中是穩(wěn)定表 達的，與此同時具有基因組序列、cDNA序列和缺失了三個內(nèi)含子(即， CH1和鉸鏈區(qū)之間的內(nèi)含子，鉸鏈區(qū)和CH2之間的內(nèi)含子，以及CH2 和CH3之間的內(nèi)含子)的基因組序列的三個恒定區(qū)表達構(gòu)建體也可在 CHO細(xì)胞中穩(wěn)定表達。對12Allv3.1而言，內(nèi)含子的去除使得抗體表 達明顯增加。更具體地，與基因組序列相比，缺失了 12Allv3.1的三 個內(nèi)含子的構(gòu)建體測定的表達升高了約5倍。與基因組序列相比，具 有cDNA序列的12Allv3.1構(gòu)建體表現(xiàn)出約6倍的表達升高。然而， 表達良好的抗體通常在CHO-細(xì)胞表達時并不表現(xiàn)出在內(nèi)含子缺失序 列和基因組序列之間之間的明顯變化
雖然出于明確理解的目的已對前述發(fā)明進行了詳細(xì)描述，但顯而 易見可在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)進行某些修飾。出于全部目的，本 說明書所引用的全部出版物和專利文件，以及出現(xiàn)在圖表和序列表中 的全部文字，在此都被全文引用作為參考，其程度就像其中的每個都 被單獨指明那樣。
根據(jù)在此被引作參考的說明書范圍之內(nèi)的參考文獻的教導(dǎo)，可以 完全理解本說明書。在說明書范圍內(nèi)的實施方案提供了在本公開中對
實施方案的說明并且不應(yīng)該被解釋為是對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域 所屬技術(shù)人員可容易地理解許多其他的實施方案都包括在本公開之 內(nèi)。本公開中所有被引用的出版物和專利以及通過獲取號或數(shù)據(jù)庫參
考編號鑒定的序列都被全部引用作為參考。就參考文獻與本說明書中 相互沖突或不一致的材料而言，本說明書可替代任意的這類材料。在 此所引用的任意參考都并非意味著承認(rèn)這些參考是本公開的現(xiàn)有技 術(shù)。
除非特別指明，所有表示成份量，細(xì)胞培養(yǎng)，處理條件，以及用于本說明書中，包括權(quán)利要求中的數(shù)字，都應(yīng)該被理解成在所有情況下都被術(shù)語"約" 所修飾。因此，除非另外表明相反的意思，數(shù)字參數(shù)都是大約值，且可以根 據(jù)旨在獲得本發(fā)明所希望性質(zhì)的情況變化而變化。除非另有所指，可將在一 些列成份之前的術(shù)語"至少"理解為是指該系列中的每一個成份。本領(lǐng)域所 屬技術(shù)人員應(yīng)該意識到，或能夠確定，在不使用超過常規(guī)實驗的條件下，存 在有許多在此所述的本發(fā)明特定實施方案的等同替換。這些等同替換也被包 括在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.編碼Aβ-抗體鏈的核酸分子，所述核酸分子含有具有一或多個內(nèi)含子和外顯子序列的核苷酸序列，與天然存在的基因組序列相比較，其中至少一個內(nèi)含子序列缺失從而降低了錯誤剪接或內(nèi)含子連讀(IRT)副產(chǎn)物。
2. 編碼A/3-抗體鏈的核酸分子，所述核酸分子含有具有一或多個內(nèi)含子和外顯子序列的核苷酸序列，與天然存在的基因組序列相比較， 其中至少一個內(nèi)含子序列缺失從而增強了蛋白表達。
3. 權(quán)利要求1或2的核酸分子，其中至少3個內(nèi)含子序列缺失。
4. 權(quán)利要求1-3任一項的核酸分子，其中所述抗體鏈?zhǔn)侵劓溁蚱?片段。
5. 權(quán)利要求4的核酸分子，其中所述抗體重鏈或其片段含有人免 疫球蛋白G亞型的重鏈可變區(qū)，鉸鏈區(qū)，第一恒定區(qū)(CH1)，第二恒定 區(qū)(CH2)和第三恒定區(qū)(CH3)。
6. 權(quán)利要求5的核酸分子，其中所述免疫球蛋白G亞型是人IgGl 或人IgG4。
7. 權(quán)利要求6的核酸分子，其中所述人IgGl或人IgG4是突變的。
8. 權(quán)利要求5的核酸分子，其中位于所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū) 的CH2區(qū)和CH3區(qū)之間的內(nèi)含子缺失。
9. 權(quán)利要求8的核酸分子，還包括位于CH1區(qū)與鉸鏈區(qū)之間的內(nèi) 含子的缺失。
10. 權(quán)利要求8的核酸分子，還包括位于鉸鏈區(qū)與CH2區(qū)之間的 內(nèi)含子的缺失。
11. 權(quán)利要求5的核酸分子，所述核酸分子具有含有位于重鏈可 變區(qū)與CH1區(qū)之間的一個內(nèi)含子的重鏈。
12. 權(quán)利要求5的核酸分子，其中編碼重鏈鉸鏈區(qū)，以及第一， 第二和第三恒定區(qū)的核苷酸序列含有與圖8(SEQIDNO: l)所示核苷酸 序列至少95%同一性的序列。
13. 權(quán)利要求5的核酸分子，其中編碼重鏈鉸鏈區(qū)，以及第一， 第二和第三恒定區(qū)的核苷酸序列含有與圖9(SEQ ID NO: 3)所示核苷酸 序列至少95。/。同一性的序列。
14. 權(quán)利要求8的核酸分子，其中在CH2和CH3之間內(nèi)含子的缺 失對應(yīng)于圖8(SEQIDNO: l)所示的人IgGl的約1409-1505位核苷酸。
15. 權(quán)利要求8的核酸分子，其中在CH2和CH3之間內(nèi)含子的缺 失對應(yīng)于圖9(SEQIDNO: 3)所示的人IgG4的約1401-1497位核苷酸。
16. 權(quán)利要求9的核酸分子，其中在CH1和鉸鏈區(qū)之間內(nèi)含子的 缺失對應(yīng)于圖8(SEQIDNO: l)所示的人IgGl的約525-915位核苷酸。
17. 權(quán)利要求9的核酸分子，其中在CH1和鉸鏈區(qū)之間內(nèi)含子的 缺失對應(yīng)于圖9(SEQ ID NO: 3)所示的人IgG4的約525-916位核苷酸。
18. 權(quán)利要求10的核酸分子，其中在鉸鏈區(qū)和CH2之間內(nèi)含子的 缺失對應(yīng)于圖8(SEQ ID NO: l)所示的人IgGl的約961-1078位核苷酸。
19. 權(quán)利要求10的核酸分子，其中在鉸鏈區(qū)和CH2之間內(nèi)含子的 缺失對應(yīng)于圖9(SEQ ID NO: 3)所示的人IgG4的約953-1070位核苷酸。
20. 含有編碼人IgGl核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序 列與圖IO(SEQIDNO: 5)所示的序列具有至少卯％的同一性。
21. 含有編碼人IgG4核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序 列與圖ll(SEQIDNO: 6)所示的序列具有至少90%的同一性。
22. 編碼人重鏈恒定區(qū)的基因組核苷酸序列，或其突變形式，其 中所述核苷酸序列缺少至少一個存在于天然存在基因組序列中的內(nèi)含 子，且其中該內(nèi)含子促進內(nèi)含子連讀。
23. 編碼人IgGl的基因組核苷酸序列，或其突變形式，其中所述 核苷酸序列缺少至少一個存在于天然存在基因組序列中的內(nèi)含子，且 其中所述內(nèi)含子促進內(nèi)含子連讀。
24. 權(quán)利要求22或23的核苷酸序列，其中的至少一個內(nèi)含子是 位于恒定區(qū)CH2和CH3之間的內(nèi)含子。
25. 編碼人IgG4的基因組核苷酸序列，或其突變形式，其中所述 基因組序列缺少三個存在于天然存在基因組序列中的內(nèi)含子。
26. 權(quán)利要求25的核苷酸序列，其中所述內(nèi)含子是位于CH1和鉸 鏈區(qū)之間的內(nèi)含子，位于鉸鏈區(qū)與CH2之間的內(nèi)含子，以及位于CH2 和CH3之間的內(nèi)含子。
27. 編碼選擇性結(jié)合A/3肽的抗體的核酸分子，所述核酸分子含有 下式所代表的核苷酸序列VH-Intl-CHl-Int2-鉸鏈-Int3-CH2-CH3，其中vh是編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列； CH1， CH2和CH3是編碼對應(yīng)重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列； 鉸鏈?zhǔn)蔷幋a重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)的核苷酸序列；且 Intl, Int2和Int3是來自重鏈基因組序列的內(nèi)含子。
28. 權(quán)利要求27的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼人免疫 球蛋白G的重鏈。
29. 編碼選擇性結(jié)合A/3肽的抗體的核酸分子，所述核酸分子含有 如下式所代表的核苷酸序列VH-Intl -CH1 -鉸鏈-CH2-CH3 ，其中vh是編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；CH1， Ch2和Ch3是編碼對應(yīng)重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列；鉸鏈?zhǔn)蔷幋a重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)的核苷酸序列；以及Intl是來自重鏈基因組序列的內(nèi)含子。
30. 權(quán)利要求29的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼人免疫 球蛋白G的重鏈。
31. 含有權(quán)利要求5的核酸分子的表達盒。
32. 含有權(quán)利要求5的核酸分子的表達載體。
33. 權(quán)利要求32的表達載體，進一步含有在宿主細(xì)胞中增強復(fù)制， 選擇，mRNA轉(zhuǎn)錄，mRNA穩(wěn)定性，蛋白表達或蛋白分泌的一或多個 核苷酸序列。
34. 含有權(quán)利要求5的核酸分子的宿主細(xì)胞。
35. 含有權(quán)利要求31的表達盒的宿主細(xì)胞。
36. 含有權(quán)利要求32的表達載體的宿主細(xì)胞。
37. 權(quán)利要求36的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO) 細(xì)胞。
38. 表達選擇性結(jié)合A/3肽并且基本上不含內(nèi)含子連讀(IRT)產(chǎn)物 的重組抗體或其片段的方法，所述方法包括向哺乳動物宿主細(xì)胞中引入權(quán)利要求5的核酸分子； 在允許表達重組抗體或其片段的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此 產(chǎn)生了宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物；以及從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中獲得重組抗體或其片段。
39. 權(quán)利要求38的方法，進一步包括在來自所述宿主細(xì)胞的核酸 樣品中鑒定IRT產(chǎn)物的步驟。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述鑒定步驟包括 從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中獲得核酸樣品；在允許所述核酸樣品和探針雜交的條件下，將所述核酸樣品與互 補于內(nèi)含子和鄰近的外顯子序列的核酸探針接觸；檢測所得復(fù)合物，其中使用互補于內(nèi)含子序列的核酸探針在所述 復(fù)合物樣品中的檢測顯示了 IRT產(chǎn)物的存在。
41. 權(quán)利要求3S的方法，其中所述宿主細(xì)胞含有編碼輕鏈可變區(qū) 和恒定區(qū)的核苷酸序列。
42. 增強選擇性結(jié)合A/5肽的重組抗體或其片段的表達的方法，包括向哺乳動物宿主細(xì)胞中引入權(quán)利要求5的核酸分子；在允許表達重組抗體的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此產(chǎn)生了宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物；以及從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中獲得重組抗體。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述宿主細(xì)胞含有編碼輕鏈可變區(qū) 和恒定區(qū)的核苷酸序列。
44. 制備選擇性結(jié)合A/ 肽而且基本上不含內(nèi)含子連讀(IRT)重鏈 副產(chǎn)物的重組抗體或其片段的方法，所述方法包括在使重鏈和輕鏈表達的條件下，培養(yǎng)哺乳動物宿主細(xì)胞，所述哺乳動物宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求5的核酸分子和編碼選擇性結(jié)合A/3肽的 抗體的抗體輕鏈的核酸。
45. 權(quán)利要求44的方法，進一步包括從所述培養(yǎng)物中純化重鏈和 輕鏈。
46. 增強選擇性結(jié)合A/3肽的重組抗體或其片段表達的方法，包括 在使重鏈和輕鏈表達的條件下，培養(yǎng)哺乳動物宿主細(xì)胞，所述哺乳動物細(xì)胞含有權(quán)利要求5的核酸分子和編碼選擇性結(jié)合A/3肽的抗體 的抗體輕鏈的核酸。
47. 權(quán)利要求46的方法，進一步包括從所述培養(yǎng)物中純化重鏈和 輕鏈。
48. 在樣品中檢測IRT產(chǎn)物的方法，包括 從重組細(xì)胞中獲得核酸樣品；在允許所述核酸樣品和探針雜交的條件下，將所述核酸樣品與互 補于內(nèi)含子和鄰近的外顯子序列的核酸探針接觸；檢測所得復(fù)合物，其中使用互補于內(nèi)含子序列的核酸探針，在所 述復(fù)合物樣品中的檢測顯示了 IRT產(chǎn)物的存在。
49. 選擇性結(jié)合A/3肽的抗體或其抗原結(jié)合片段，是在允許抗體或 片段表達和組裝的適當(dāng)條件下，通過包括權(quán)利要求40所述步驟的方法制備的。
50. 權(quán)利要求49的抗體，所述抗體是嵌合抗體，人源化抗體，CDR-接枝抗體或體外生成的抗體。
51. 權(quán)利要求50的抗體，是人源化抗體。
52. 權(quán)利要求51的抗體，結(jié)合于人5T4。
53. 含有權(quán)利要求49的抗體以及藥用載體的藥物組合物。
54. 編碼選擇性結(jié)合A^肽的抗體重鏈的分離的核酸分子，所述核 酸分子含有修飾的可操作連接的人基因組內(nèi)含子和外顯子序列，其中 對內(nèi)含子和外顯子序列的天然可操作連接的修飾降低或消除了內(nèi)含子 連讀重鏈副產(chǎn)物的表達。
55. 權(quán)利要求54的分離的核酸分子，其中與含有天然可操作連接 的人基因組內(nèi)含子和外顯子序列相比，所述重鏈的表達被增強。
56. 權(quán)利要求55的核酸分子，其中的基因組外顯子序列編碼可變 區(qū)，鉸鏈區(qū)，以及第一，第二和第三恒定區(qū)。
57. 權(quán)利要求56的核酸分子，其中第一，第二和第三恒定區(qū)是IgGl 恒定區(qū)。
58.權(quán)利要求56的核酸分子，其中第一，第二和第三恒定區(qū)是IgG4 恒定區(qū)
59. 權(quán)利要求56的核酸分子，其中的可變區(qū)是人源化可變區(qū)。
60. 權(quán)利要求56-59的核酸分子，其中的可變區(qū)特異性結(jié)合于A/3肽。
61. 權(quán)利要求56-59的核酸分子，其中的可變區(qū)含有來自小鼠3D6 抗體的互補決定區(qū)(CDRs)。
62. 權(quán)利要求54的核酸分子，含有一個內(nèi)含子序列。
63. 權(quán)利要求54的核酸分子，含有兩個內(nèi)含子序列。
64. 權(quán)利要求54的核酸分子，含有三個內(nèi)含子序列。
65. 編碼結(jié)合A/3肽的抗體重鏈的核酸分子，所述核酸分子含有編 碼可變區(qū)的外顯子，該外顯子可操作地連接于編碼第一，第二和第三 恒定區(qū)的外顯子，所述核酸分子還含有至少一個內(nèi)含子序列，其中與 不含有所述內(nèi)含子的結(jié)合于A^肽的編碼抗體重鏈的核酸分子相比，所 述內(nèi)含子序列增強了來自所述核酸分子的所述重鏈的表達，且其中所 述核酸分子并未導(dǎo)致內(nèi)含子連讀(IRT)重鏈副產(chǎn)物的翻譯。
66. 含有前述權(quán)利要求任一項所述核酸分子的表達盒。
67. 含有前述權(quán)利要求任一項所述核酸分子的表達載體。
68. 權(quán)利要求67的表達載體，進一步含有編碼選擇性標(biāo)記以及內(nèi) 部核糖體進入位點序列(IRES)的基因。
69. 含有權(quán)利要求54-6S任一項的核酸分子的細(xì)胞。
70. 含有權(quán)利要求66的盒的哺乳動物細(xì)胞。
71. 含有權(quán)利要求67或68的載體的哺乳動物細(xì)胞。
72. 權(quán)利要求70或71的細(xì)胞，所述細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO) 細(xì)胞。
73. 編碼IgGl重鏈的核苷酸序列，所述序列具有以下通式 VH-Int卜CHl-Int2-鉸鏈-Int3-CH2陽CH3其中VH是任意的編碼重鏈可變區(qū)的外顯子；CHI， CH2和CH3是獲自天然存在的IgGl重鏈基因的編碼人重鏈 恒定區(qū)的外顯子；Intl， Int2和Int3是得自所述基因的對應(yīng)內(nèi)含子，且Int2和Int3 可任選存在；且鉸鏈?zhǔn)谦@自所述基因的編碼鉸鏈的外顯子。
74. 權(quán)利要求73的序列，其中存在Int2和Int3。
75. 制備基本上不含內(nèi)含子連讀(IRT)重鏈副產(chǎn)物的抗體制劑的方 法，包括在使重鏈和輕鏈表達，以及在缺乏內(nèi)含子連讀(IRT)重鏈副產(chǎn)物時 將重鏈和輕鏈可操作連接的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求70-72任一項所述的 細(xì)胞，該細(xì)胞進一步包括結(jié)合A/3肽的編碼抗體輕鏈的核酸分子。
76. 權(quán)利要求1或2的核酸分子，其中的抗體鏈具有SEQIDNO: 12所示的序列。
77.權(quán)利要求1或2的核酸分子，其中的抗體鏈具有SEQIDNO: 13所示的序列。77. 含有重鏈的A/3抗體，所述重鏈含有由SEQIDNO: 6-11中任 一核酸編碼的恒定區(qū)和SEQIDNO: 2的核酸編碼的可變區(qū)。
78. 含有重鏈的Ai8抗體，所述重鏈含有由SEQIDNO: 6-11中任 —核酸編碼的恒定區(qū)和SEQIDNO: 4的核酸編碼的可變區(qū)。
79. 含有重鏈的A]3抗體，所述重鏈含有由SEQIDNO: 6-11中任 一核酸編碼的恒定區(qū)和具有圖12-14或16C-D中任一圖所示氨基酸序 列的可變區(qū)。
80. 權(quán)利要求77-80任一項的抗體，還包括圖15或16A-B中一個 圖所示的對應(yīng)輕鏈。
全文摘要
本發(fā)明公開了經(jīng)過修飾從而增強重組蛋白表達，例如，Aβ肽結(jié)合抗體的表達，和/或降低或消除錯誤剪接和/或內(nèi)含子連讀(IRT)副產(chǎn)物的核酸分子。本發(fā)明還提供了在適合重組Aβ肽結(jié)合抗體表達的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，通過表達這樣的核酸分子，制備沒有錯誤剪接和/或內(nèi)含子連讀副產(chǎn)物的Aβ肽結(jié)合抗體的方法。
文檔編號A61K31/70GK101287471SQ200580034045
公開日2008年10月15日 申請日期2005年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月5日
發(fā)明者杰森·勞斯, 馬丁·西納科雷 申請人:艾蘭制藥國際有限公司;惠氏公司