專利名稱：施陶丁格連接在用于顯像和治療的顯像和治療目的試劑盒中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于醫(yī)學顯像和治療中的新化合物、試劑盒和方法。本發(fā)明還涉及用于預靶向顯像和/或治療的新化合物和試劑盒，以及其制造方法和用途。
背景技術：
Bertozzi及合作者采用基于疊氮化物和膦間經(jīng)典施陶丁格(Staudinger)反應(圖1的反應路線1)的化學選擇性連接研究了細胞表面糖基化[參見Kohn & Breinbauer(2004)Angew.Chem.Int.Ed.43，3106-3116]。
進一步改進稱作無痕跡的施陶丁格連接(traceless Staudingerligation)，并示于圖2中。使用施陶丁格連接，Bertozzi及合作者證實，N-疊氮基乙酰基甘露糖胺(ManNAz)經(jīng)代謝轉化成相應的唾液酸并混合進細胞表面復合糖中。在細胞表面上的疊氮基可與外源性膦試劑進行施陶丁格連接。對照實驗證實，沒有發(fā)生因內(nèi)源性單硫醇(如谷胱甘肽)使疊氮基減少和因膦探針使細胞表面上的二硫化物減少。
這種技術(″代謝干擾″(metabolic interference))的用途包括通過在細胞上化學構建新糖基化模式構造細胞表面組分(探查糖基化功能)。這種反應也已被用于在細胞環(huán)境中設置標簽。例如，通過非天然氨基酸將疊氮基加到蛋白中，并將這些蛋白靶向于細胞溶解產(chǎn)物內(nèi)的共價修飾[Kiick等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99，19-24]。當在甲硫氨酸缺失的細菌培養(yǎng)物中表達該蛋白時，疊氮基高丙氨酸(azidohomoalanine)被大腸桿菌的甲硫氨?；?t-RNA合成酶活化，并替代了甲硫氨酸。一種應用是用受施陶丁格連接活化的前熒光(pro-fluorescent)香豆素染料修飾蛋白，從而使得在細胞內(nèi)運輸?shù)牡鞍罪@像[Lemieux等人(2003)J.Am.Chem.Soc.125，4708-4709]。
施陶丁格連接已經(jīng)成功地用于多種目的，如肽連接、內(nèi)酰胺合成、生物結合物(bioconjugate)、細胞內(nèi)標簽、代謝細胞工程、和制造微陣列。施陶丁格連接已被表明可以在體內(nèi)(大鼠)中進行，疊氮化物和膦衍生物被證明在體外和體內(nèi)均無毒性[Prescher等人(2004)Nature 430，873-877]。用于分子顯像的這種反應的普遍用途很大程度上仍未進行研究。
在醫(yī)學顯像形式中，已經(jīng)成功使用造影劑(增強圖像例如在不同器官或組織之間或在正常和異常組織之間的對比的材料)。與疾病相關的具體分子靶標的顯像允許較早診斷和更好地控制疾病。因此，特別有益的是借助于活性靶標使造影劑優(yōu)先分布在個別身體部位例如腫瘤細胞。通過使對比增強部分直接或間接地與靶標構造結合實現(xiàn)這種活性靶標。靶標構造與細胞表面結合或與靶標部位的其他表面結合，或被細胞吸收。
用在活的人和動物上的成功顯像劑的重要標準在于，其表現(xiàn)出高的靶標吸收，同時表現(xiàn)出從非靶標組織和從血液中的快速清除(通過腎和/或肝膽系統(tǒng))，從而在靶標和周圍組織之間實現(xiàn)高對比。然而，這經(jīng)常引起問題。例如，人體中顯像研究表明，腫瘤部位的抗體最大濃度在24h內(nèi)達到，但是在循環(huán)中標記的抗體降低到成功進行顯像所需的足夠低的水平之前需要幾天。對于核探針而言這尤其是個挑戰(zhàn)，因為它們通過衰變持續(xù)地產(chǎn)生信號。因此，必須在示蹤劑的幾個半衰期內(nèi)達到相對于背景水平足夠信號。對于MRI探針，在顯像之前可以等待足夠長的時間以使背景信號減小。此外，MRI途徑中存在可活化探針或″智能探針″；它們僅當與靶標或酶相互作用時才產(chǎn)生信號(參見US專利6,770,261)。然而，對于用于MRI的足夠的信號積聚而言，內(nèi)源性受體密度經(jīng)常過低。
在靶標組織中積聚較慢或不充足，從非靶標區(qū)域清除較慢和低造影劑濃度(特別是對于MRI)這些問題已經(jīng)導致預尋靶方案(pre-targeting scheme)的應用。圖3所示為典型預尋靶方案。在預尋靶步驟中，經(jīng)由一級尋靶部分選擇性識別一級靶標，如相關受體。為了允許在結合后檢測，一級尋靶部分與還帶有二級靶標的預尋靶平臺(pre-targeting scaffold)連接。在第二尋靶步驟中，給予將與預尋靶平臺上的二級靶標結合的二級尋靶部分。二級尋靶部分本身與攜帶有對比提供單元(contrast providing unit)的二級尋靶骨架結合。二級靶標/二級尋靶部分對的典型例子是生物素/鏈親和素或抗原/抗體體系。
現(xiàn)有(預)靶向顯像存在幾個問題和缺點。主要問題在于尋靶僅依賴于天然/生物尋靶構造(即內(nèi)源性受體、生物素/鏈親和素)。這產(chǎn)生了多種缺點，尤其是在尺寸和其內(nèi)源性性質方面。
通常在生物學(如抗體-抗原)中和特別是在預尋靶(生物素-鏈親和素，寡核苷酸作為二級尋靶部分)中實施高度選擇性相互作用的實體極大。由于尺寸原因，預尋靶構思迄今基本上限于血管體系內(nèi)應用。因此，不能實現(xiàn)具有肽和小有機尋靶裝置作為一級配體以及具有代謝顯像和細胞內(nèi)靶向顯像的預尋靶，因為二級尋靶部分的尺寸排除了使用小的一級配體。大體積的二級尋靶部分影響預尋靶構造以及顯像探針的性能(即轉運、清除、靶標親和性/相互作用)。此外，顯像探針的對比提供單元也可能影響二級尋靶部分的性能(例如對于抗生物素蛋白，生物素結合物的親和性損失)。
此外，預尋靶用的許多化合物被身體分解。生物素是內(nèi)源性分子，其結合物可被血清酶生物素酰胺酶分解。當使用反義預尋靶時，寡核苷酸受RNAse和DNAse攻擊。蛋白和肽也經(jīng)歷天然分解途徑。
各配對之間的相互作用可被它們的非共價和動態(tài)性質進一步削弱。此外，內(nèi)源性生物素與生物素結合物競爭與鏈親和素結合。鏈親和素可誘導免疫反應。最后，天然靶標如細胞表面受體存在的量并不總是足以在顯像中產(chǎn)生對比。
預尋靶技術被證實對于抗體基顯像極為有用，因為盡管其藥物動力學經(jīng)常對于顯像應用太低，但其對抗原具有高選擇性和特異性[Sung等人(1992)，Cancer Res.52，377-384；Juweid等人(1992)癌癥Res.52，5144-5153]。盡管較小的尋靶構造如抗體片段、肽和有機分子具有更適合的藥物動力學，但是它們也得益于預尋靶技術，因為這些構造仍具有尋靶和清除慢(即在致密組織中、或在細胞內(nèi)顯像中)或積聚不充足(低受體密度、生長慢或腫瘤小)的缺點。此外，在清除途徑如肝膽或腎中的積聚也遮掩了相關組織。
顯像領域中近期的發(fā)展方向是一般化的示蹤劑，其中示蹤化學沒有較大變化，但是基礎分子結構容易被修飾以使新分子靶標顯像。對于新顯像劑而言，這使研發(fā)時間/成本下降。預尋靶技術允許將該一般化用于對多種靶標，因為對比提供基團對于不同應用總是相同。因此，可以預期新分子顯像能夠很快得到FDA核準，因為僅有預尋靶基團需要FDA核準。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供探針和前體，探針和前體的試劑盒，制造這種探針和前體的方法，和在醫(yī)學顯像和治療中應用探針和前體的方法。
在最廣泛方面，本發(fā)明涉及彼此相互作用形成穩(wěn)定的共價生物正交鍵的兩種成分。這些成分可用在醫(yī)學顯像和治療中，更特別是在靶向和預靶向顯像和治療中。
根據(jù)本發(fā)明特定實施方案，通過施陶丁格連接得到所述共價生物正交鍵，本發(fā)明的每一種成分分別包括施陶丁格連接用的反應配偶子(reaction partner)，即膦和疊氮基。
本發(fā)明的第一方面涉及例如存在于試劑盒中的所述兩種成分。本發(fā)明的試劑盒包括至少一個尋靶探針，其包括一級尋靶部分和二級靶標，和至少一個另外的探針，其是包括二級尋靶部分和標記的顯像探針?？蛇x擇地，所述第二成分是包括二級尋靶部分和藥物活性化合物的治療探針。根據(jù)本發(fā)明，所述尋靶探針或所述顯像或治療探針中的任一個包括至少一個疊氮基，分別作為二級靶標和二級尋靶部分，而另一個探針包括至少一個膦基團，所述膦和所述疊氮基是施陶丁格連接用的反應配偶子。
本發(fā)明特定實施方案涉及尋靶探針，其中一級尋靶部分與血管體系內(nèi)或其外部的成分結合，或具體而言與胞間隙中的成分結合或與細胞內(nèi)成分結合。
這里描述了本發(fā)明試劑盒中用的適宜的一級尋靶部分的特定實施方案，包括受體結合肽和抗體。本發(fā)明特定實施方案涉及應用小的尋靶部分如肽從而得到細胞滲透性尋靶探針的用途。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種開發(fā)(developing)用于本發(fā)明中的尋靶探針的方法。本發(fā)明的這一方面的特定實施方案涉及通過組合化學制造用于靶向于受體的尋靶探針，其中在化合物庫的合成中引入疊氮基。更特別地，本發(fā)明涉及一種研制對靶標具有優(yōu)化的結合親和性和對顯像或治療探針具有優(yōu)化的反應的尋靶探針的方法，所述方法包括制備所述尋靶探針的尋靶部分的化合物庫，其中在所述尋靶部分上的不同部位引入二級靶標，以及篩選這樣得到的化合物庫，以與靶標結合并與顯像和/或治療探針結合。因此，本發(fā)明還提供在相同或不同氨基酸處用至少一個疊氮基修飾的先導尋靶部分庫。本發(fā)明還提供特異肽的衍生物或變體的庫，其特征在于，所述衍生物在所述肽的氨基酸鏈中的不同氨基酸位置處被疊氮基修飾。
本發(fā)明另一個特定實施方案涉及一種上述尋靶探針和一個或多個顯像探針和/或治療探針的試劑盒以及其用途。除了作為本發(fā)明生物正交反應中的一個反應配偶子的二級尋靶部分之外，這種顯像探針還應包括可檢測標記，特別是傳統(tǒng)顯像系統(tǒng)中所用的造影劑，其選自MRI可顯像劑，自旋標記，光學標記如發(fā)光、生物發(fā)光和化學發(fā)光標記，F(xiàn)RET型標記和Raman型標記，超聲反應性試劑，X射線-響應劑，單光子發(fā)射計算機斷層顯像(single photon emissioncomputed tomography，SPECT)和正電子發(fā)射斷層顯像(PositronEmission Tomography，PET)用的放射性核素，它們的適合的例子對于本領域技術人員是已知的，并在本文中提供。
本發(fā)明特定實施方案涉及小尺寸有機PET和SPECT標記作為可檢測標記的用途，其提供了細胞滲透性顯像探針。
本發(fā)明另一個特定實施方案涉及包括″智能″或″響應性″MRI造影劑作為可檢測標記的顯像探針以及其在本發(fā)明的試劑盒和方法中的用途。更特別地，本發(fā)明涉及一種包括MRI顯像劑和膦基團的顯像探針，其可以在施陶丁格連接中與疊氮基反應，其中顯像劑的金屬原子通過含有膦基團的連接基團(link)與一個或者多個羧酸配位。
本發(fā)明另一個特定實施方案涉及一種上述尋靶探針和治療探針的試劑盒，和其在靶向治療中的用途。
本發(fā)明的顯像探針可以任選地還包括治療活性化合物，例如可以是藥物或放射性同位素。可選擇地，除了可檢測標記之外，顯像探針還可包括治療活性化合物。
本發(fā)明的另一個方面提供特別適于醫(yī)學顯像的探針。因此，本發(fā)明提供一種包括二級尋靶部分和標記的顯像探針，其中所述顯像探針包括作為二級尋靶部分的至少一個疊氮基或至少一個膦基團，所述膦或疊氮基是適于施陶丁格連接用的反應配偶子，所述標記是適于使用經(jīng)典技術包括MRI、X-射線、超聲等顯像的顯像標記。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種醫(yī)學顯像和/或治療用的組合探針，其包括一級尋靶部分和可檢測標記或藥物活性化合物，其中尋靶部分通過酰胺鍵或三苯基膦氧化物部分與可檢測標記連接。在本發(fā)明這一方面的特定實施方案中，所述一級尋靶部分是肽。
本發(fā)明還涉及一種體外制備包括一級尋靶部分和可檢測標記或藥物活性劑的組合的尋靶和顯像或治療探針的方法，所述方法包括如下步驟使包括膦的可檢測標記與包括疊氮基的一級尋靶部分反應或使包括疊氮基的可檢測標記與包括膦的一級尋靶部分反應。
本發(fā)明還涉及一種研制用于醫(yī)學顯像或治療的、對靶標具有優(yōu)化的結合親和性和優(yōu)化的顯像或治療功效的組合探針的方法，所述方法包括制備所述組合探針的尋靶部分的化合物庫，其中在所述尋靶部分上的不同部位引入二級靶標，使所述庫的化合物與標記或藥物活性化合物連接，并篩選這樣得到的化合物庫，以與靶標結合和/或發(fā)揮治療功效。這種方法特別適用于其中一級尋靶部分是肽或蛋白的組合探針。
在本發(fā)明的另一個方面中，在生物正交共價反應中相互作用的兩種成分一方面是靶標代謝前體而另一方面是顯像或治療探針。
因此，在特定實施方案中，本發(fā)明提供一種靶向醫(yī)學顯像或治療用的試劑盒，所述試劑盒包括至少一個靶標代謝前體和至少一個另外的探針，所述靶標代謝前體包括二級靶標，所述另外的探針選自包括二級尋靶部分和標記的顯像探針或包括二級尋靶部分和藥物活性化合物的治療探針，其中所述靶標代謝底物或所述顯像或治療探針中的任一個包括至少一個疊氮基，分別作為二級靶標和二級尋靶部分，而所述顯像或治療探針包括至少一個膦基團，所述膦和所述疊氮基是施陶丁格連接用的反應配偶子。
本發(fā)明這一方面的特定實施方案涉及上述試劑盒，其中靶標代謝前體包括至少一個疊氮基，和其中顯像或治療探針包括至少一個膦基團。
本發(fā)明另一個特定實施方案涉及包括選自糖、氨基酸、核堿(nucleobases)和膽堿的代謝前體的試劑盒。
本發(fā)明另一個特定實施方案涉及包括代謝前體和顯像探針特別是包括可檢測標記的顯像探針的試劑盒，所述可檢測標記是傳統(tǒng)顯像系統(tǒng)中所用的造影劑。這種可檢測標記可以是但不限于選自如下的標記MRI可顯像劑、自旋標記、光學標記、超聲反應性試劑、X射線反應性試劑、放射性核素、和FRET型染料。
在本發(fā)明特定實施方案中使用了報道探針。這種報道探針可以是酶特別是非細胞內(nèi)源性而是通過基因治療或感染外來物質而引入的酶的底物。提及細胞或組織中基因時所述的非內(nèi)源性用于表明基因不是在該細胞或組織中天然存在和/或表達的?？蛇x擇地，這種報道探針是通過受體或泵引入細胞中的分子，所述受體或者泵可以是內(nèi)源性的或通過基因治療或感染外來物質而引入細胞中的。可選擇地，所述報道探針是與細胞或組織環(huán)境內(nèi)的某些(變化著的)條件反應的分子。
因此，本發(fā)明提供用于醫(yī)學顯像和治療的探針和試劑盒。此外，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明兩種成分的顯像方法和治療方法。根據(jù)特定實施方案，本發(fā)明提供用于靶向和預靶向顯像和治療的探針和試劑盒。因此，本發(fā)明涉及利用作為生物正交反應如施陶丁格連接中的配對成分的至少兩種成分使細胞、組織、器官、外來成分顯像的方法。所述兩種成分一方面是尋靶探針、靶標代謝前體或報道探針，另一方面是顯像探針。此外，本發(fā)明涉及利用作為生物正交反應如施陶丁格連接中的配對成分的至少兩種成分來預防或治療、靶向于細胞、組織、器官、外來成分的方法。所述兩種成分一方面是尋靶探針、靶標代謝前體或報道探針，另一方面是治療探針。本發(fā)明還涉及制造本發(fā)明的顯像和治療中所用的工具的方法。


圖1表明反應路線1中的施陶丁格反應和反應路線2中的施陶丁格連接。
圖2表明反應路線3無痕跡的施陶丁格連接。
圖3表明預尋靶構思的一般方案。
圖4表明顯像探針的反應，顯像探針包括膦基團和″智能″MRI造影劑和存在于與靶標結合的尋靶探針上的疊氮基，由此實現(xiàn)信號強度。
圖5表明怎樣將標記或治療化合物的結合部位包括在用于識別針對特定靶標的新先導的組合庫的設計中。
圖6提供在基因治療中的報道基因如編碼青霉素酰胺酶的基因的顯像。
圖7提供顯像探針的一般合成路線，其中顯像劑通過胺或羧酸與疊氮部分或膦部分連接。
具體實施例方式
下面結合特定實施方案并結合某些

本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此，而是由權利要求限定。權利要求中的任何參考標記不應被解釋為限制其范圍。所示的附圖僅是示意性的和非限制性的。在附圖中，為說明目的，一些元件尺寸被夸大，而沒有按比例繪制。在說明書和權利要求書中使用的術語″包括″不排除其他元件或步驟。當指代單數(shù)名詞時，如果使用不定冠詞或定冠詞例如″a″或″an″，″the″，則也包括該名詞的復數(shù)，除非另有具體說明。
此外，應注意到，在說明書和權利要求書中使用的術語″包括″不應被解釋為限制到其后所列的手段；其不排除其他元件或步驟。因此，表達″一種裝置，其包括部件A和B″的范圍不應被限制為僅由部件A和B構成的裝置。這是指，該裝置與本發(fā)明相關的部件僅是A和B。
本發(fā)明對現(xiàn)有(預)靶向顯像的上述限制提供一種解決方案，使用共價連接，特別是生物相容的共價連接而不是生物基相互作用，例如施陶丁格連接，這是一種選擇性化學和生物正交反應，[Saxon &Bertozzi(2000)Science 287，2007-2010；Saxon等人(2002)J.Am.Chem.Soc.124，14893-14902]。
使用在兩個分子之間的生物相容的、但不是自然發(fā)生的直接共價反應解決了不同應用中基于共價反應的識別機理所遇到的缺點。更具體而言，其在預尋靶中表現(xiàn)出多種特別有益的優(yōu)點，并且是分子顯像中強大的新工具。
本發(fā)明的實施方案提供一種化學反應，其中參與的兩個官能團比在現(xiàn)有預尋靶組合中的生物配對物(counterpart)更小。在本發(fā)明的方法中，使用的兩個參與官能團，例如疊氮基和膦，等于在許多生物過程如抗體-抗原結合中發(fā)生的非共價識別事件的極大的選擇性。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，選擇具有經(jīng)細微調節(jié)的反應性的兩個參與官能團，從而避免了與共存官能團的干擾。根據(jù)本發(fā)明另一方面，選擇的非生物的反應性配對成分在生理條件下形成穩(wěn)定的加成物，并且僅彼此識別而忽視它們的細胞/生理環(huán)境，即它們是生物正交的。生物環(huán)境所施加的選擇性需求排除了對大多數(shù)其他常規(guī)反應的使用。施陶丁格連接對于在細胞環(huán)境中進行的本發(fā)明方法是優(yōu)選的反應。對于本發(fā)明的方法和化合物，可以使用非無痕跡的和無痕跡的施陶丁格連接。
使用本發(fā)明的方法和化合物，由于尺寸小，顯像探針可以例如通過腎從身體快速排出，并可提供所需的高腫瘤積聚以及相對低的非靶向積聚。在核醫(yī)學顯像中，預尋靶的構思是有利的，因為可以在不使用放射性同位素情況下進行耗時的預尋靶步驟，同時可以使用與包括二級尋靶部分的小的疊氮化物或膦偶聯(lián)的放射性同位素更快速地進行二級尋靶步驟。后者允許使用短壽命的放射性核素，其優(yōu)點在于例如最小化對患者的放射劑量并允許使用PET即正電子發(fā)射斷層顯像劑代替SPECT即單光子發(fā)射計算機斷層顯像劑。在超聲顯像中，常規(guī)造影劑基于氣泡，并具有受限的造影劑壽命。根據(jù)本發(fā)明的預尋靶構思可以克服受限的造影劑壽命問題，使得使用通用造影劑成為可能。此外，本發(fā)明特別適用于多模顯像(multimodalimaging)，任選地使用不同的顯像劑來使相同的靶標可視化。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，預尋靶方法與多齒配體體系如樹枝狀聚合物、聚合物、或脂質體組合使用，從而可以在靶標部位實現(xiàn)信號放大，例如MRI信號。
在分子顯像中使用施陶丁格連接使得所有類型和尺寸的尋靶構造均可進行預尋靶。這使得細胞內(nèi)和代謝顯像可得益于可通過預尋靶積聚得到的高靶標積聚和低背景。同樣，預靶向信號放大方案，例如聚疊氮基和/或聚膦樹枝狀聚合物或脂質體，可用于較小和更多的不同尋靶裝置。因為反應配偶子是非生物的和生物正交的，因此以施陶丁格連接進行預尋靶不受內(nèi)源性競爭和代謝/分解的妨礙，并提供穩(wěn)定的共價鍵。借助于在例如腫瘤細胞中比正常細胞中更高的流量選擇靶向代謝途徑和相應的疊氮基-代謝物衍生物，在靶標細胞的表面上建立高密度人工疊氮基受體或其他化學把手(chemicalhandle)，從而避免了使用有時是低水平的內(nèi)源性細胞表面受體。
最后，施陶丁格連接的正交性質使其成為在預尋靶方案的一般化中，或在各種尋靶裝置和/或具有各種官能團的顯像劑的結合化學中成為優(yōu)先選擇的反應。
本發(fā)明提出施陶丁格連接作為生物相容的并可用于人或動物體中的共價連接體系的例子的新穎應用。其被認為是生物正交的。本申請中所指的″施陶丁格連接″指施陶丁格反應的改進。在″施陶丁格反應″中，在膦和疊氮化物之間發(fā)生反應生成氮葉立德(aza-ylide)(圖1，反應路線1)。在水存在下，該中間體自發(fā)地水解生成伯胺和相應的膦氧化物。膦和疊氮化物在水中于室溫下高產(chǎn)率地迅速相互反應。
在施陶丁格連接中，施陶丁格反應被改進以防止氮葉立德中間體水解。為此，設計了帶有親電阱(electrophylic trap)例如甲基酯的膦，在水解進行之前，其可以使不穩(wěn)定的親核氮葉立德中間體進行分子內(nèi)重排形成穩(wěn)定的加成物。因此，通過使這種修飾和生物結合的三芳基膦與疊氮化物結合物反應進行施陶丁格連接，其后分子內(nèi)環(huán)化得到酰胺鍵和膦氧化物。這種連接被稱作″非無痕跡的″施陶丁格連接(圖1，反應路線2)，因為連接產(chǎn)物含有附加的三苯基膦氧化物殘基。在圖1中，例示了施陶丁格反應。所述的芳基是優(yōu)選的例子，但可選擇地，這些基團可以被任何烷基或環(huán)烷基替代。
在圖1的反應路線2中，R為a)在尋靶探針情況下是一級尋靶部分，b)在顯像探針的情況下是可檢測標記，或c)在治療探針的情況下是治療化合物。R′為a)在尋靶探針情況下是一級尋靶部分，b)在顯像探針的情況下是可檢測標記，或c)在治療探針的情況下是治療化合物。在反應路線1和2中，R′與一個芳基連接。應該理解，R′也可以與膦分子的任何其他適合部分連接。
然而，″無痕跡的″施陶丁格連接后來發(fā)展成從疊氮化物和膦試劑產(chǎn)生簡單酰胺鍵(圖2)。這種反應利用帶有可轉移的?；撵?。在中間體氮葉立德重排和水解之后與疊氮化物的反應生成酰胺連接的產(chǎn)物和釋放的膦氧化物。在圖2中，芳基是優(yōu)選的例子，其可以被任何烷基或環(huán)烷基替代。在圖2中，″X″代表雜原子如氧或硫。R′為a)在尋靶探針情況下是一級尋靶部分，b)在顯像探針的情況下是可檢測標記，或c)在治療探針的情況下是治療化合物。在″無痕跡的″施陶丁格連接中，R′與親電阱連接。R為a)在尋靶探針情況下是一級尋靶部分，b)在顯像探針的情況下是可檢測標記，或c)在治療探針的情況下是治療化合物。使用″非無痕跡的″和″無痕跡的″施陶丁格連接都在本發(fā)明的范圍中。
本發(fā)明中使用的″一級靶標″涉及要通過顯像檢測的靶標。例如，一級靶標可以是有機體、組織或細胞中存在的任何分子。用于顯像的靶標包括細胞表面靶標，例如受體，糖蛋白；結構蛋白，例如淀粉斑；細胞內(nèi)靶標，例如高爾基體的表面，線粒體的表面，RNA，DNA，酶，細胞信號途徑成分；和/或外來體，例如病原體如病毒，細菌，真菌，酵母菌或其部分。一級靶標的例子包括化合物，如其存在或表達水平與某些組織或細胞類型相關的蛋白，或其表達水平在某些紊亂中上調或下調的蛋白。根據(jù)本發(fā)明特定實施方案，一級靶標是蛋白如受體。可選擇地，一級靶標可以是在疾病例如傳染病或癌癥中上調的代謝途徑，如DNA合成，蛋白合成，膜合成和糖類吸收。在患有疾病的組織，上述標記可以與健康組織相區(qū)別，并提供獨特的早期檢測、特異診斷和治療尤其是靶向治療的可能性。
本文中應用″尋靶探針″指能與一級靶標結合的探針。尋靶探針包括″一級尋靶部分″和″二級靶標″。
本發(fā)明中使用的″一級尋靶部分″涉及能與一級靶標結合的尋靶探針部分。一級尋靶部分的特定例子是能與受體結合的肽或蛋白。一級尋靶部分的其他例子是能與細胞化合物反應的抗體或其片段。抗體可被培養(yǎng)成非蛋白質的化合物以及培養(yǎng)成蛋白或肽。其他一級尋靶部分可以由適體，寡肽，寡核苷酸，寡糖，以及擬肽和有機藥物化合物構成。一級尋靶部分的結合優(yōu)選具有高特異性，高親和性，且與一級靶標的結合在體內(nèi)優(yōu)選是穩(wěn)定的。
本發(fā)明中使用的″二級靶標″涉及尋靶探針的能提供共價連接例如在下述顯像或治療探針的二級尋靶部分上存在的施陶丁格連接的反應配偶子的部分。在具體實施方案中，二級靶標將是一個或多個疊氮基。然而，在其他特定實施方案中，可以預期其中二級靶標是一個或多個膦基團的應用。
本文中″靶標代謝前體″指包括共價連接例如施陶丁格連接的反應配偶子的代謝途徑的底物，即作為二級靶標，根據(jù)本發(fā)明其與下述顯像或治療探針的二級尋靶部分反應。所述代謝途徑可以是每個細胞中存在的途徑(如DNA合成、蛋白合成和膜合成)，并可在例如癌癥或炎癥/感染中被上調?？蛇x擇地，所述代謝途徑可以對特定細胞類型例如癌細胞具有特異性。
″顯像探針″包括″二級尋靶部分″和可檢測標記，例如對比提供單元。
″二級尋靶部分″涉及顯像探針的包括共價連接例如施陶丁格連接的反應配偶子的部分，其與一級尋靶探針上的二級靶標反應。在特定實施方案中，二級尋靶部分將包括一個或多個膦基團。
本文中″可檢測標記″涉及顯像探針的例如當存在于細胞、組織或有機體中時允許檢測所述探針的部分。本發(fā)明中可預期的一類可檢測標記是對比提供劑。本發(fā)明中可預期并在本文中公開了不同類型的可檢測標記。
本文中″治療探針″指包括二級尋靶部分和藥物活性化合物例如但不限于治療化合物的探針。本文提供了藥物活性化合物的例子。治療探針任選地還包括可檢測標記。
本文中″組合探針″，即″組合的尋靶和顯像探針″或″組合的尋靶和治療探針″或″組合的尋靶和顯像和治療探針″指通過使尋靶探針的二級靶標例如疊氮基或膦分別與顯像探針的二級尋靶部分例如膦或疊氮基結合形成的化合物。該結合可以是體外的。因此，這種組合探針包括一級尋靶部分和可檢測標記。
本文中術語″分離的″指存在于身體之外或細胞或細胞部分例如細胞溶解產(chǎn)物之外的化合物。在本發(fā)明中，就屬于分離的探針或組合探針例如一級尋靶探針、顯像探針或治療探針或其組合的特定特征而言，這指存在于人或動物體、組織或細胞之外的探針。不是指在將所述結合物的構成成分連續(xù)加到所述身體組織或細胞之后在身體、組織或細胞內(nèi)形成的結合物。
在第一方面中，本發(fā)明涉及一種使用能在共價連接例如施陶丁格連接中反應的化合物預尋靶的方法。
預尋靶的總體構思就顯像而言繪于圖3中。相關標記存在于例如某些疾病組織的細胞表面上。這種標記稱作″一級靶標″。在第一預尋靶步驟中，尋靶探針通過一級尋靶部分與一級靶標結合。尋靶探針也帶有二級靶標，這將允許與顯像探針特異地結合。任選地，一旦尋靶探針到達一級靶標，并與其結合，例如耗時24小時，那么如果自然清除不足，可以使用清除劑從組織或有機體除去過量的尋靶探針。在第二溫育步驟中，例如1-6小時，提供了用于所述顯像方式的可檢測標記的顯像探針通過其二級尋靶基團與(預)-結合的尋靶探針結合。
在預尋靶策略中使用施陶丁格連接的優(yōu)點在于，膦和疊氮化物都是非生物的，并且基本上對細胞和所有其他區(qū)域如血清等之中或表面上的生物分子沒有反應性。因此，本發(fā)明的化合物和方法可用于活細胞、組織或有機體中。此外，疊氮基較小，可以在沒有明顯改變生物學尺寸的情況下引入生物樣品或活有機體中。使用施陶丁格連接，有可能使用小的反應配偶子例如疊氮化物和膦，使大尺寸的一級尋靶部分例如抗體與標記或其他分子結合。更有利的是，使用(匹配的)小反應配偶子例如疊氮化物和膦，相對較小的一級尋靶部分例如肽可以與標記或其他分子結合。二級靶標和二級尋靶部分對尋靶探針和顯像探針的尺寸和性能沒有大的影響，從而允許小的尋靶部分可用于(預)尋靶方案。因此，與采用抗體-鏈親和素的現(xiàn)有預尋靶不同，本發(fā)明可靶向于其他組織，即探針的目標不限于血管體系和細胞間隙。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明用于靶向顯像。根據(jù)該實施方案，通過特異性結合尋靶探針的一級尋靶部分和并使用可檢測標記檢測這種結合來實現(xiàn)特定一級靶標的顯像。
根據(jù)本發(fā)明，一級靶標可以選自人或動物體內(nèi)或病原體或寄生蟲上任何適合的靶標，例如選自細胞如細胞膜和細胞壁，受體如細胞膜受體，細胞內(nèi)結構如高爾基體或線粒體、酶、受體、DNA、RNA、病毒或病毒顆粒、抗體、蛋白、碳水化合物、單糖、多糖、細胞因子、激素、甾類、促生長素抑制素受體、單胺氧化酶、蕈毒堿受體、心肌交感神經(jīng)系統(tǒng)、例如在白細胞上的白三烯受體、尿激酶纖溶酶原激活劑受體(uPAR)、葉酸鹽受體、凋亡標記、(抗)血管生成標記、胃泌激素受體、多巴胺能系統(tǒng)、血清素系統(tǒng)、GABAergic系統(tǒng)、腎上腺素能系統(tǒng)、膽堿能系統(tǒng)、阿片受體、GPIIb/IIIa受體和其他血栓相關的受體、纖維蛋白、降鈣素受體、促吞噬素受體、整合素受體、VEGF/EGF受體、基質金屬蛋白酶(MMP)、P/E/L-選擇素受體、LDL受體、P-糖蛋白、神經(jīng)降壓肽受體、神經(jīng)肽受體、物質P受體、NK受體、CCK受體、σ受體、白介素受體、單純皰疹病毒酪氨酸激酶，人酪氨酸激酶。
為允許對上列一級靶標的特異性尋靶，尋靶探針的一級尋靶部分可以包括化合物，包括但不限于抗體、抗體片段、例如Fab2、Fab、scFV、聚合物(通過EPR作用而靶向于腫瘤)、蛋白、肽例如奧曲肽和衍生物、VIP、MSH、LHRH、趨化肽、蛙皮素、彈性蛋白、肽模擬物、碳水化合物、單糖、多糖、病毒、藥物、化療劑、受體激動劑和拮抗劑、細胞因子、激素、甾類。本發(fā)明中可預期的有機化合物的例子是或衍生于雌激素例如雌二醇、雄激素、孕激素、皮質甾類、紫杉醇、依托泊苷、多柔比星、氨甲蝶呤、葉酸、和膽固醇。
根據(jù)本發(fā)明特定實施方案，一級靶標是受體，適合的一級尋靶部分包括但不限于這種受體的配體或仍與受體結合的配體的部分，例如在受體結合蛋白配體情況下的受體結合肽。
蛋白性質的一級尋靶部分的其他例子包括干擾素，例如α，β，和γ干擾素，白介素，和蛋白生長因子，如腫瘤生長因子，例如α，β腫瘤生長因子，血小板衍生的生長因子(PDGF)，uPAR靶向蛋白，脫脂載脂蛋白，LDL，膜聯(lián)蛋白V，內(nèi)皮抑素，和血管生成抑制素(angiostatin)。
一級尋靶部分的可選擇例子包括例如與一級靶標互補的DNA，RNA，PNA和LNA。
根據(jù)本發(fā)明特定實施方案，使用可以與細胞內(nèi)一級靶標結合的小的親脂性一級尋靶部分。
根據(jù)本發(fā)明另一個特定實施方案，選擇一級靶標和一級尋靶部分，使得對組織或疾病的靶向具有特異性或增強，所述組織或疾病如癌癥，炎癥，感染，心血管疾病，例如血栓，動脈粥樣硬化損傷，缺氧性部位(hypoxic site)，例如中風，腫瘤，心血管紊亂，腦紊亂，凋亡，血管生成，器官，和報道基因/酶。通過選擇具有組織-，細胞-或疾病-特異性表達的一級靶標可以實現(xiàn)這一點。例如，膜葉酸受體介導葉酸鹽和其類似物如氨甲蝶呤的細胞內(nèi)積聚。表達于正常組織中受限，但是受體在各種腫瘤細胞類型中過表達。
根據(jù)一個實施方案，尋靶探針和顯像探針可以是多聚化合物，包括多個一級和/或二級靶標和/或二級尋靶部分。這些多聚化合物可以是聚合物，樹枝狀聚合物，脂質體，聚合物顆粒，或其他聚合構造。對于放大檢測信號特別有益的是具有一個以上二級靶標的尋靶探針，其允許結合幾個顯像探針。
根據(jù)本發(fā)明特定實施方案，本發(fā)明的化合物和方法用于顯像，特別是醫(yī)學顯像。為識別一級靶標，使用包括一個或多個可檢測標記的顯像探針。顯像探針的可檢測標記的特定例子是傳統(tǒng)顯像系統(tǒng)中所用的造影劑，如MRI可顯像劑、自旋標記、光學標記、超聲反應性試劑、X射線反應性試劑、放射性核素、(生物)發(fā)光和FRET型染料。本發(fā)明中可預期的示例性可檢測標記包括但不限于熒光分子，例如自身熒光分子，與試劑等接觸時發(fā)熒光的分子，放射性標記；生物素，例如，通過生物素和抗生物素蛋白的反應檢測；熒光標簽，包括順磁性金屬的MRI用的顯像劑，顯像試劑，例如，記載在美國專利4,741,900和5,326,856中的那些)等。
用于顯像的放射性核素可以是例如選自如下的同位素3H、11C、13N、15O、18F、51Cr、52Fe、52mMn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、80mBr、82mBr、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113mIn、114mIn、117mSn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193mPt、195mPt、201Tl、203Pb。在某些應用中，也可以使用例如用于治療的其他元素和同位素來顯像。
MRI-可顯像劑可以是順磁離子或超順磁顆粒。順磁離子可以是選自如下的元素Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl。本發(fā)明特定實施方案涉及使用后面更詳細說明的″智能″或″響應性″MRI造影劑。
超聲反應性試劑可以包括微泡，其外殼由磷脂，和/或(生物可降解的)聚合物，和/或人血清白蛋白構成。微泡可以用氟化氣體或液體填充。
X射線反應性試劑包括但不限于碘、鋇、硫酸鋇、泛影葡胺(gastrografin)或可以包括用碘化合物和/或硫酸鋇填充的泡囊、脂質體或聚合物膠囊。
此外，本發(fā)明中可預期的可檢測標記還包括可通過抗體結合檢測例如通過結合可檢測標記的抗體或通過夾心型分析(sandwich-type analysis)檢測結合的抗體結構的肽或多肽。
在一個實施方案中，可檢測標記是小尺寸有機PET和SPECT標記，如18F、11C或133I。由于尺寸小，有機PET或SPECT標記，例如18F、11C或123I，理想地適用于監(jiān)控細胞內(nèi)事件，因為它們通常對尋靶裝置的性能特別是其膜轉運沒有大影響。同樣，疊氮部分較小，并可用作蛋白、mRNA、信號途徑等的細胞內(nèi)顯像的標記。包括PET標記和三苯基膦作為二級尋靶部分的顯像探針是親脂性的，并能被動地擴散進出細胞，直到找到其結合配對成分。此外，兩種成分都不排除穿過血腦屏障并因此允許在大腦中的區(qū)域顯像。
根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的化合物和方法用于靶向治療。這通過使用包括二級尋靶部分和一種或多種藥物活性劑(即藥物或放療用的放射性同位素)的治療探針來實現(xiàn)。靶向藥物輸送中用的適合的藥物是本領域已知的。任選地，治療探針還包括可檢測標記，如一種或多種顯像劑。用于治療的放射性核素可以是選自如下的同位素24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra、225Ac。
現(xiàn)有已知的多種治療化合物已經(jīng)含有疊氮基，因此代表可用于能夠與尋靶探針組合使用的治療探針而用于靶向治療以改進其功效。例如使用預尋靶策略，光動力癌癥治療用的疊氮基-染料結合物(參見WO 03/003806)可更有效地靶向于疾病組織。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過選擇性地將本發(fā)明的二級靶標加到靶標細胞或組織中可代替使用尋靶探針。使用細胞途徑中涉及的分子如代謝前體分子可實現(xiàn)這一點，其包括二級靶標，例如疊氮基反應配偶子，可通過細胞的代謝加到生物分子中。細胞途徑中設計的分子也稱作構造塊。按此方式靶向于的代謝途徑可以是所有細胞細胞共同的途徑，如DNA合成、蛋白合成和膜合成。任選地，這些是在疾病如癌癥或炎癥/感染中上調的代謝途徑?？蛇x擇地，作為靶標的代謝途徑對于特定類型的細胞或組織具有特異性。本發(fā)明中使用的靶標代謝前體包括代謝前體分子，例如但不限于氨基酸和核酸、氨基糖、脂質、脂肪酸和膽堿。這些化合物如氨基酸的顯像可以反映氨基酸吸收和/或蛋白合成中的差異。各種糖可用于標記碳水化合物結構。脂肪酸可用于標記例如細胞膜中的脂質。
此外，許多代謝前體的類似物在本領域中是已知的，用于在本發(fā)明中其可提供特別的優(yōu)點?？梢杂茂B氮基或膦標記的代謝途徑和相應代謝前體非限制性地列舉于下文。其中一些臨時積聚在細胞中，而其他的加到生物大分子中。
胸苷磷酸化酶是催化胸苷水解成胸腺嘧啶和去氧核醣-1-磷酸酯的酶。據(jù)報道胸苷磷酸化酶的高水平表達與結腸直腸，頭或頸，膀胱，和子宮癌癥中的存活下降相關，也與腫瘤的血管生成活性相關。由于酶也催化逆反應(即，胸腺嘧啶轉化成胸苷)，所以其可用作細胞內(nèi)捕集胸腺嘧啶治療類似物的手段，如卡培他濱，其可轉化成氟尿嘧啶。
增殖-靶向顯像劑優(yōu)選對惡性腫瘤具有高特異性，并可用于區(qū)分良性或低級腫瘤與高級損傷，檢測低級腫瘤中的高級轉化，或設計診斷性活組織檢查、外科切除、或放療的優(yōu)化途徑。FDG和甲硫氨酸也適用于該目的。大多數(shù)研究集中于被結合到復制的DNA鏈中的DNA類似物，如胸苷或溴脫氧尿苷(BrdU)。溴-2′-氟-2′-脫氧尿苷(BFU)是更耐降解并具有高結合速率的類似物。通過使用西瞇替丁抑制物質的腎清除可以提高短的血漿半衰期。其他適合的核苷類似物包括1′-氟-5-(C-甲基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶(FMAU)，脫氧尿苷；和5-碘-1-(2-氟-2-去氧-β-D-阿拉伯呋喃糖)-尿嘧啶(FIAU)。
本發(fā)明特定實施方案涉及使用報道探針，即由于涉及細胞過程中而允許使過程或細胞類型可視化的分子。這種探針可以利用細胞的內(nèi)源性機制，例如提供了底物的內(nèi)源性酶?？蛇x擇地，這種探針通過被稱作報道基因的外來基因起作用。報道基因產(chǎn)物可以是使報道探針轉化成選擇性地在細胞內(nèi)被捕集的代謝物的酶。可選擇地，報道基因可以編碼受體或轉運子或泵，從而使探針積聚進細胞中。
氟胸苷是被胸苷激酶-1(TK1)磷酸化的胸苷類似物，TK1可用作報道基因，造成細胞捕集。在細胞培養(yǎng)中，吸收與TK1活性和細胞增殖相關。
根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案，報道探針是響應于細胞或組織中特定環(huán)境的分子。組織缺氧是腦血管疾病，缺血性心臟疾病，外周血管疾病，和炎性關節(jié)炎致病的重要因素。其也是惡性實體腫瘤生長的一般特征，其與腫瘤的進攻性具有正性關系，與對化療或放療的響應可能性具有負性關系。近期工作表明，在這些情況的每一個中都存在對缺氧響應的共同途徑。2-硝基咪唑化合物被還原并被捕集在缺氧性細胞中，因此在缺血性心肌和腫瘤中可用作氧張力的傳感器。例子包括氟米索硝唑，氟赤式硝基咪唑，硝基咪唑-阿拉伯糖苷，乙烯基米索硝唑，RP-170(1-[2-羥基-1-(羥基甲基)-乙氧基]甲基-2-硝基咪唑)和SR 4554(N-(2-羥基-3，3，3-三氟丙基)-2-(2-硝基-1-咪唑基)乙酰胺)。HL91是具有腫瘤吸收的非硝基咪唑化合物。另一種適合的化合物是二乙酰基-雙(N4-甲基縮氨基硫脲)-銅(II)(ATSM)。
任選地，尋靶探針或代謝前體或構造塊或報道探針已經(jīng)包括可檢測標記。優(yōu)選地，這種標記不同于可使用施陶丁格連接在下一步中引入的標記。兩種顯像標記的組合對于更好的靶向定位，人工清除，非相關(清除)途徑的描述具有潛在優(yōu)點。
根據(jù)本發(fā)明，一方面尋靶探針或靶標代謝前體分子或另一方面顯像探針或治療探針可以包括膦或疊氮基，分別作為二級靶標或二級尋靶部分，從而允許通過施陶丁格連接結合這些探針。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，膦可由以下通式結構代表Y-Z-PR2R3其中Z選自用R1取代的烷基，環(huán)烷基和芳基，優(yōu)選用R1取代的芳基，其中R1優(yōu)選在芳環(huán)上相對于PR2R3的鄰位；和其中R1是用以捕集例如穩(wěn)定氮葉立德基團的親電子基團，包括但不限于羧酸，酯，例如烷基酯如低級烷基酯，例如1～4個碳原子的烷基酯，芐基酯，芳基酯，取代的芳基酯，醛，酰胺，例如烷基酰胺如低級烷基酰胺，例如1～4個碳原子的烷基酰胺，芳基酰胺，烷基鹵，如低級烷基鹵，例如1～4個碳原子的烷基鹵，硫代酯，磺?；?，烷基酮，如低級烷基酮，例如1～4個碳原子的烷基酮，芳基酮，取代的芳基酮，鹵代磺?；?，腈，硝基等；R2和R3通常是芳基，包括取代的芳基，或環(huán)烷基，例如，環(huán)己基，其中R2和R3可以相同或不同，優(yōu)選相同；和Y對應于如下之一a)在尋靶探針情況下是一級尋靶部分，b)在顯像探針的情況下是可檢測標記，或c)在治療探針的情況下是治療化合物。Y可以在氫處與膦連接或在芳基Z任何位置例如對位、間位、鄰位處與另一種反應性基團連接；示例性反應基團包括但不限于羧基，胺，例如烷基胺，如例如包括1～4個碳原子的低級烷基胺，芳基胺，酯，例如烷基酯如例如包括1～4個碳原子的低級烷基酯，芐基酯，芳基酯，取代的芳基酯，硫代酯，磺酰鹵，醇，硫醇，琥珀酰亞胺酯，異硫代氰酸酯，碘代乙酰胺，馬來酰亞胺，肼，等?？蛇x擇地，Y可以通過連接基與膦成分連接。在圖1和2中，Y由R′代表。
Y可以與Z連接或與膦的任何其他適合部分連接。
可選擇地，尋靶或顯像探針上存在的膦的結構被修飾成包括可離去的連接基，其通式如下Y-X1-R4-PR2R3
其中X1是親電體，優(yōu)選用作可離去的連接基的羰基或硫代羰基；和通常在X1和R4之間存在雜原子，如氧或硫。
R4是親電體的連接基，可以是烷基或取代或未取代的芳基；和Y，R2和R3如上所述。
在′無痕跡的′施陶丁格連接中這種膦基團將與疊氮基反應。在無痕跡的施陶丁格連接中，Y與親電阱連接。
R4-PR2R3的例子公開在美國申請2003/0199084中。該申請中也公開了幾種制備膦衍生物的合成方法，因此引入該申請作為參考。
包括疊氮基并適用于本發(fā)明中的分子以及制備適用于本發(fā)明中的包括疊氮基的分子的方法在本領域中是已知的。
圖7提供了制備顯像探針的合成路線的一般方案，其中包括胺或羧酸的顯像劑與膦或疊氮部分連接。相似的合成路線適于分別從適當?shù)膸в邪坊螋然膶ぐ胁糠?、藥物化合物或代謝前體制備尋靶探針、治療探針、或靶標代謝前體。
根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案，治療探針與顯像探針組合使用。在此實施方案中，直接給予包括治療化合物和二級尋靶部分的治療探針，例如沒有尋靶探針，并且二級尋靶部分用于以顯像探針檢測。因此，根據(jù)此實施方案，實際上用作二級靶標的治療探針的二級尋靶部分和顯像探針的二級尋靶部分是施陶丁格連接中的配對。此實施方案用在例如AZT(疊氮基胸苷)治療設計和監(jiān)控中。AZT(1)是一種抗-逆轉錄酶病毒藥物，是第一種被核準用于治療HIV的抗病毒治療。在糖部分上也安裝有疊氮基。疊氮基可用作把手來結合標記的施陶丁格膦探針，從而允許在患者中AZT顯像。

本發(fā)明的包括疊氮基或膦的尋靶、顯像和治療探針是生物相容的，并可以與目前醫(yī)學顯像或治療中所用的常規(guī)分子相同或相似的方式給予。此外，可檢測標記對于本領域技術人員是已知的，并且需要常規(guī)方法和設備。
根據(jù)本發(fā)明特定實施方案，所述的化合物和方法在體內(nèi)用于動物或人體中組織或細胞類型的顯像或檢測?？蛇x擇地，它們同樣可在體外用于檢測活組織檢查或其他身體樣品，或者檢測在手術后除去的組織。
如本文中所述，根據(jù)特定實施方案，本發(fā)明相繼提供了尋靶探針和顯像或治療探針，從而使尋靶探針可與其一級靶標結合，并且任選地在提供標記或治療化合物之前除去過量的尋靶探針。這樣確保在圖像中具有較高的信噪比和/或較高治療功效，這通常稱作′預尋靶′或′兩步′尋靶。本發(fā)明的化合物允許兩步尋靶方法，其中克服了通常與二級靶標和二級尋靶部分相關的問題(向靶標擴散和從有機體清除過長，顯像化合物衰變)(確保在兩步之間的識別和結合)。此外，這種′兩步′尋靶允許開發(fā)出可與所需的′尋靶探針′組合使用的′通用′顯像探針。
根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的方法和化合物用于靶向信號放大和/或多價態(tài)安裝。這里，尋靶探針的一級尋靶部分與含有多個三苯基膦部分的樹枝狀聚合物，聚合物或脂質體結合。在尋靶探針通過其一級尋靶部分與受體結合之后，注射包括與一種或多種MRI造影劑例如Gd螯合物或超聲報道物(ultrasound reporter)例如微泡結合的疊氮基的顯像探針。這里，所述造影劑或微泡包括二級尋靶部分。隨后的施陶丁格連接使MRI造影劑在靶標組織處具有高濃度。此外，靶標部位的多價態(tài)將增強與疊氮基報道結合物(顯像探針)反應的動力學，從而提供MRI造影劑或微泡于靶標處的有效積聚。
可選擇地，疊氮基也可以包括在上述尋靶探針中，并且三苯基膦與顯像探針中的報道物結合。
根據(jù)另一個方面，所使用的本發(fā)明的方法和化合物沒有一級尋靶部分，但通過細胞的代謝將二級靶標結合進待結合進生物分子中的前體分子內(nèi)。以此方式，可靶向于一般代謝途徑。上述膦或疊氮化物與例如糖，氨基酸或核苷酸連接，然后給予至細胞或有機體，并通過正常代謝被結合進生物分子中和/或在細胞中被捕集?，F(xiàn)有技術中記載了結合進活有機體，真核培養(yǎng)的細胞或重組蛋白表達體系(細菌，酵母，高級真核細胞)的例子[Lemieux等人2003，上述文獻，Hang等人(2003)Proc Natl.Acad Sci.USA 100，14846-14851；Wang等人(2003)Bioconjugate Chem.14，697-701]。
在本發(fā)明這一方面的特定實施方案中，靶向于在疾病如感染/炎癥或癌癥中上調的代謝途徑。在疾病狀態(tài)中被上調的成分包括例如DNA，蛋白，膜合成和糖攝取。用于靶向于這些途徑的適合的構造塊包括疊氮基-標記的氨基酸，糖，核堿和膽堿和乙酸酯。這些疊氮基標記的構造塊在功能上與現(xiàn)有使用的代謝示蹤劑[11C]-甲硫氨酸，[18F]-氟去氧葡萄糖(FDG)，去氧-[18F]-氟胸苷(FLT)，[11C]-乙酸酯和[11C]-膽堿類似。高代謝或增殖的細胞對這些構造塊具有較高吸收。疊氮基-衍生物可以進入這些途徑，并在細胞中和/或其上積聚。在充分積聚并清除自由構造塊之后，顯像探針例如包括放射性標記和(細胞滲透性)施陶丁格膦作為二級尋靶部分的探針被輸入以結合積聚的疊氮基代謝物。與正常FDG-型顯像相比的優(yōu)點在于，在結合放射性成分之前有足夠時間允許尋靶探針高度積聚，因此提高了信噪比。可選擇地，可靶向于對疾病有特異性的代謝途徑和/或代謝物。
本發(fā)明的另一個方面涉及″智能″或響應性MRJ造影劑在基于無痕跡的施陶丁格連接的靶向顯像中的應用。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，包括膦基團和低松馳并因此低信號強度的″智能″MRI造影劑的顯像探針，在與尋靶探針上的疊氮基反應時實現(xiàn)了信號強度。包括膦基團例如作為二級尋靶部分的這種″智能″MRI顯像探針具有如下通式結構(2) 其中M是順磁性金屬離子，選自Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl；A、B、C和D是單鍵或雙鍵；X1、X2、和X3是-OH、-COO-、-CH2OH-、CH2COO-、C(O)N-；R1-R10是氫、烷基、芳基、磷部分，和其中Y是二級尋靶部分，更特別是取代的三苯基膦如(CH2)2-COO-C6H4N(CH2COOH)2-P-(C6H5)2或允許在取代的膦和順磁性金屬之間有一個或多個配位的另一種取代的三苯基膦。
這方面的實施方案示于圖4中。使包括疊氮基作為二級靶標的尋靶探針與其靶標(2)結合。隨后，給予由Gd-DOTA三苯基膦結合物(1)構成的顯像探針。在此結合物中，兩個突出的羧酸阻斷了兩個在Gd螯合配位化合物內(nèi)球中的水配位位置，從而使該構造具有低的松弛性。這在MRI中產(chǎn)生低信號強度。當尋靶探針的疊氮基與顯像探針的三苯基膦部分反應時，無痕跡的連接除去了所帶的羧酸，同時使活化的MRI探針與靶標(3)結合。因此，結合事件為水提供了兩個可用的配位位置，這樣使結合時的信號增強。這允許標記在組織內(nèi)MRI顯像，因為成分1和2在胞間隙內(nèi)快速擴散。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供用于顯像和治療中的組合的尋靶和顯像或治療探針。因此，根據(jù)這一方面，在給予至細胞、組織或有機體之前，允許尋靶探針的二級靶標和顯像探針或治療探針的二級尋靶部分在體外反應。當使用施陶丁格連接特別是無痕跡的施陶丁格連接連接本發(fā)明的尋靶探針和顯像或治療探針時，尺寸幾乎沒有任何增大，這是化學反應本身典型的特征。因此，組合的尋靶探針和顯像探針能夠足夠小，以允許向靶標快速擴散和從身體快速清除。因此，預期施陶丁格連接是正交的，并是使顯像劑與尋靶構造結合的一般途徑。通常，所有上述一級尋靶部分和可檢測標記的組合可以在體外制備并用于這種應用中。應該理解，對于體內(nèi)優(yōu)化使用而言，一級尋靶部分和標記的組合尺寸應允許向一級靶標的擴散足夠快并從身體快速清除。
根據(jù)本發(fā)明上述方面的特定實施方案，組合的尋靶和顯像/治療探針包括與其他蛋白如受體相互作用的肽作為一級尋靶部分。
根據(jù)本發(fā)明上述方面的另一個特定實施方案，可檢測標記選自有機PET標記的輔基，PET、SPECT或MRI用的金屬配位化合物，超聲顯像用的微泡，和含有碘或鋇的分子或泡囊。
制造本發(fā)明的組合的尋靶和顯像或治療探針的重要優(yōu)點在于，施陶丁格連接的各試劑(即，包括二級靶標的尋靶探針和包括二級尋靶部分的顯像或治療探針)是穩(wěn)定的，且它們之間的反應在水中進行。
因此，可以制備并單獨保存包括懸掛的(pendent)疊氮部分的顯像探針和包括三苯基膦衍生物的尋靶探針，或反之亦可，并預先作為制備的一部分加以組合或者就在終端使用者使用之前組合。該反應快速，產(chǎn)率高，并且組合產(chǎn)物不需要費力純化。
因此，本發(fā)明也預期組合的尋靶和顯像或治療探針，或包括一個或多個用于與一個或多個顯像或治療探針組合的尋靶探針的試劑盒。根據(jù)一個特定實施方案，兩種成分在體外反應，例如就在顯像過程之前反應，并照此使用組合的探針。根據(jù)一個實施方案，組合探針的特征在于，因膦和疊氮基在無痕跡的施陶丁格連接中反應因此存在酰胺鍵。使用非無痕跡的連接，包括一級尋靶部分和可檢測標記的組合探針將包括膦氧化物。例如，一級尋靶部分和可檢測標記可以與三苯基膦的苯基上的取代基結合。特別預期用于核顯像劑的施陶丁格試劑盒應用。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及包括根據(jù)本發(fā)明的顯像探針的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及一種制備顯像用的診斷組合物的方法，其包括使用根據(jù)本發(fā)明的顯像探針。
本發(fā)明的另一個方面涉及使用組合肽合成制備用于本發(fā)明中的適合的尋靶探針。在肽的情況下，用疊氮基或三苯基膦基團標記可能擾亂受體親和性能。因此，在標記尋靶部分之后，可能需要額外的耗時的優(yōu)化過程以確保尋靶探針具有所需的藥理性能和受體親和性。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，疊氮基或三苯基膦包括在用于識別特定靶標的新先導的組合庫的設計中。通過這種方法產(chǎn)生的先導不需要額外的改進，而是可以直接用作本發(fā)明的尋靶探針。根據(jù)特定實施方案，帶有疊氮殘基的氨基酸構造塊(5)(圖5)在肽庫(6)的組合制備過程中在肽鏈任何所需位置加入。篩選肽-疊氮化物探針，以優(yōu)化受體結合親和性。因此，優(yōu)化的肽疊氮探針可被識別用于預尋靶。
本發(fā)明的另一個方面涉及施陶丁格連接在制備對應于此處所述的組合探針靶向顯像或治療劑中的應用。
通常，通過用標記如放射性同位素、金屬螯合物或有機熒光團標記已知的尋靶基團如受體-結合部分，例如生物活性肽或有機藥物類結構研制靶向顯像劑。經(jīng)常通過螯合物基團例如SPECT劑或對于鹵素標記的芳香輔基來結合核同位素。相似地，通過使已知的尋靶基團與治療化合物連接開發(fā)靶向治療化合物。這些加入的標記基團或治療化合物可以明顯改變尋靶部分的性能和受體親和性，從而得到次優(yōu)化的靶向顯像劑或治療劑。因此，對于各標記的尋靶部分而言，結合物需要額外的耗時的對藥理性能和靶標親和性優(yōu)化的過程。根據(jù)本發(fā)明，施陶丁格連接可用于促進這種靶向顯像或治療劑的開發(fā)。在用作尋靶部分的肽合成中包括在不同位置選擇性結合的疊氮基或三苯基膦。這種優(yōu)化可用于基于已知的肽部分開發(fā)靶向探針或治療劑，即在已知肽序列的不同位置結合疊氮基或三苯基膦?？蛇x擇地，這可例如通過在組合庫的設計中加入針對特定靶標的新先導而應用于開發(fā)新的尋靶部分。然后使用施陶丁格連接，使組合庫與所需的標記或治療劑結合，并對優(yōu)化的靶標結合親和性和標記/治療功效進行篩選。
任選地，將與冷同位素例如非放射性F，I等連接的施陶丁格膦與所有的疊氮-官能化的庫成員偶聯(lián)，以研究結合親和性。然后通過使疊氮-肽與相應的熱同位素標記的施陶丁格膦偶聯(lián)得到″熱″類似物。
通過這種方法產(chǎn)生的先導不需要額外的修飾，而是在使標記或治療化合物與提供的結合部位結合之后，即可直接用作顯像和/或治療劑。
根據(jù)特定實施方案，在肽庫(6)的組合制備過程中，在肽鏈任何所需位置加入帶有疊氮殘基的氨基酸構造塊(5)(圖5)。然后，鑒定出具有優(yōu)化的受體結合親和性的肽-疊氮化物-標記或肽-疊氮化物-治療劑結合物，以分別用于靶向顯像或靶向治療。這樣得到的組合庫可以包括預先鑒定出的其中在不同位置引入帶有疊氮殘基的氨基酸構造塊的先導分子的陣列，通過篩選鑒定出標記/治療劑與先導結合至其靶標的相互作用最小的分子。
本發(fā)明的探針和試劑盒可用于醫(yī)學顯像和治療，特別是′靶向′顯像和治療。術語′靶向′涉及顯像標記或藥物活性化合物在被給予至患者后與靶標分子發(fā)生特異性相互作用或并入其中。根據(jù)本發(fā)明通過使用包括尋靶部分的尋靶探針或使用靶標代謝底物可以實現(xiàn)這一點?？蛇x擇地，通過提供組合的尋靶和顯像或治療探針(即給予本發(fā)明的兩種成分作為組合探針)實現(xiàn)這一點。該靶標分子對于特定類型的細胞或組織可以是特異性的，或對于身體中的所有細胞或組織可以是共有的。本發(fā)明的特定方面涉及′預尋靶′顯像或治療。這方面需要單獨使用本發(fā)明的兩種成分，并涉及將給予患者包括尋靶部分或由于是特定反應的底物而確保了尋靶的成分和給予患者確保顯像或治療效果的成分的時間分開。給予兩種成分之間的時間可以變化，范圍從約10分鐘至幾小時或甚至幾天。
本發(fā)明的探針可以通過不同途徑給予，包括靜脈注射，口服給予，直腸給予和吸入。適用于這些不同給予類型的制劑對于本領域技術人員是已知的。
根據(jù)本發(fā)明的包括藥物組合物的治療探針或顯像探針可以與藥物學可接受的載體一起給予。用于此處的適宜的藥物載體涉及適于醫(yī)學或獸醫(yī)用的載體，沒有毒性且不是在其他方面不可接受的。這種載體在本領域是公知的，包括鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇、和其組合。制劑應適于給予模式。
實施例實施例1神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的預靶向顯像包括促生長素抑制素受體-結合肽的尋靶探針；例如代表根據(jù)圖3的一級尋靶部分，與例如作為二級靶標的疊氮基連接，被注射進受試者。在尋靶探針與例如在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤上高濃度存在的一級靶標如促生長素抑制素受體結合，并清除未結合的尋靶探針之后，用作二級尋靶部分的包括18F-標記的顯像探針，即與施陶丁格膦基團連接的放射性物質被注射進受試者，例如動物或人中；在那里與固定的疊氮基結合。因此，通過提供對比的放射性同位素可以使神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的存在可視化?？蛇x擇地，顯像探針的二級尋靶部分含有疊氮基，而三苯基膦是尋靶探針中的二級靶標。膦-(3)或疊氮基-標記的(4)氨基酸可以并入受體-結合肽中以制備尋靶探針。
實施例2用于治療方案的乳房腫瘤組織的預靶向顯像將由疊氮基-雌激素衍生物構成的尋靶探針給予至乳腺癌患者。在雌激素受體結合之后，注射與99mTc螯合物結合的施陶丁格膦基團作為顯像探針，并結合、可視化固定的疊氮基。用疊氮基官能化的幾種乳腺癌-靶向構造是已知的。然而，它們均未用于基于施陶丁格連接的顯像方法中。
實施例3骨腫瘤組織的顯像將二膦酸酯與施陶丁格膦基團的結合物作為尋靶探針給予至骨癌癥患者。在積聚至骨之后，將用懸掛的疊氮基官能化的99mTc螯合物注射進患者中作為顯像探針?？蛇x擇地，在骨癌癥治療中，由螯合物-疊氮基結合物構成的顯像探針還攜帶治療核素?？蛇x擇地，在尋靶探針中，二膦酸酯與疊氮基連接(5)，并且在顯像探針中，二級尋靶基團是與標記(Tc螯合物)連接的膦基團。

實施例4腦組織的預靶向顯像將疊氮基-莨菪烷衍生物作為尋靶探針注射進患有例如帕金森(Parkinson)疾病的受試者中。在多巴胺能系統(tǒng)中靶向結合之后，將18F-標記的施陶丁格膦探針作為顯像探針注射，并與固定的疊氮基結合。
實施例5缺氧性組織的預靶向顯像將例如下圖(6)、(7)的疊氮基官能化的硝基咪唑衍生物用作探針使缺氧顯像。在缺氧性細胞中，硝基部分被還原成自由基，然后在與細胞內(nèi)大分子反應時被捕集。隨后，注射親脂性18F-標記的施陶丁格膦基團例如作為顯像探針，以結合積聚的疊氮基。
實施例6預尋靶信號放大和/或多價態(tài)安裝將一級尋靶部分與含有多個三苯基膦部分的樹枝狀聚合物或聚合物結合。在使一級尋靶部分與其一級靶標例如受體結合之后，注射與一種或多種MRI造影劑例如Gd螯合物或與超聲報道劑例如微泡結合的疊氮基作為顯像探針。隨后的施陶丁格連接使MRI造影劑在靶標部位處具有高濃度。此外，靶標部位的多價態(tài)將增強與疊氮基報道結合物反應的動力學，從而提供MRI造影劑或微泡在靶標處的有效積聚。可選擇地，尋靶探針包括在樹枝狀聚合物中的疊氮基，并且三苯基膦與顯像探針中的標記結合。
實施例7使用無痕跡的施陶丁格連接的″智能″或響應性MRI造影劑的預尋靶。
該實施例示于圖4中。使包括疊氮基的尋靶探針結合其靶標(2)。隨后，給予顯像探針Gd-DOTA三苯基膦結合物(1)。兩個羧酸阻斷了兩個水在Gd螯合配位化合物內(nèi)球中的配位位置，從而使該構造具有低松弛，并因此在構造的MRI中產(chǎn)生低信號強度。當疊氮基與三苯基膦部分反應時，無痕跡的施陶丁格連接除去懸掛的羧酸，同時使活化的MRI探針與靶標(3)結合。因此，結合事件為水提供了兩個可利用的配位位置，這樣使信號經(jīng)結合增強。此外，這種構思允許標記在組織內(nèi)MRI顯像，因為成分1和2在胞間隙內(nèi)快速擴散。
實施例8在基因治療中使報道基因顯像在這種應用中，使用了其中表達治療基團并表達酶HSV 1-TK的報道基因的運載體。這種酶經(jīng)代謝在細胞中捕集尿嘧啶類似物和無環(huán)鳥甙類似物。在此實施方案中，尿嘧啶和無環(huán)鳥甙類似物被疊氮部分官能化。這些分子經(jīng)代謝被捕集在組織中，報道基因于此表達(因此也表達治療基因)。隨后，注射18F-標記的施陶丁格膦探針，以結合積聚的包括疊氮基的尿嘧啶和無環(huán)鳥甙類似物。
實施例9在基因治療中使報道基因顯像。
該實施例示于圖6中。報道酶活化細胞內(nèi)輸送的疊氮基前體，該前體反過來與施陶丁格膦探針結合。掩蔽的疊氮基-衍生物4包括與疊氮部分(B)結合的跨膜尋靶肽(A)。疊氮部分被作為先前由Gopin等人公開[(2003)Angew.Chem.Int.Ed.，42，327-332]的酶-敏感性觸發(fā)裝置(C)的一部分的酯基團保護。報道基因對應于酶青霉素酰胺酶，其裂解(C)中的芐基酰胺部分。生成的伯胺重排成亞甲基環(huán)己二烯亞胺，并釋放出疊氮基-酯。自發(fā)的脫羧作用產(chǎn)生活性疊氮基，然后該活性疊氮基可捕集標記的施陶丁格膦探針。
實施例10施陶丁格連接在固定嵌入脂質體表面中的Gd-Dotam配位化合物的應用。
通過在磷脂雙分子層中插入硬脂?；鶜埢梢杂镁哂袘覓斓挠仓；|殘基的配位化合物8覆蓋脂質體的表面。接下來，通過多官能團施陶丁格膦探針9(三肽)使懸掛的疊氮基分子間交聯(lián)。與脂質中的未交聯(lián)的Gd配位化合物相比，交聯(lián)的Gd配位化合物的旋轉顯著下降，從而增強了在MRI中的松馳性。
實施例11合成三苯基膦-DOTA顯像/治療探針26，28和29。
實驗下述化合物的合成由Eindhoven，The Netherlands的SyMO-Chem承擔并實施。
儀器在Bruker 400MHz光譜儀，Varian Gemini 300MHz光譜儀，和Varian Mercury 200MHz光譜儀上記錄NMR譜。在PerkinElmer 1600 FT-IR上測量紅外光譜。在Perseptive Biosystems VoyagerDE-Pro MALDI-TOF質譜儀上得到MALDI-TOF譜(加速電壓20kV；柵電壓74.0％，導線電壓0.030％，延遲200ms，低質量門900amu)。通過將聚合物的THF溶液(20μl，c＝1mg/ml)加到α-氰基-4-羥基肉桂酸的THF溶液(10μl，c＝20mg/ml)中，然后充分混合，從而制備了MALDI-TOF樣品。將該混合物(0.3μl)置于樣品板上，并蒸發(fā)溶劑。在使用之前用分子篩干燥溶劑。吸濕性化合物保存在含有P2O5的干燥器中。所有反應都在氬氣中進行。
使用以下縮略語DCM＝二氯甲烷，DMF＝二甲基甲酰胺，DIPEA＝二異丙基乙基胺，TFA＝三氟乙酸，HBTU＝O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸脲鹽，DCC＝N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺。
膦-構造塊 a).1)HCl，NaNO2/H2O；2)KI/H2Ob).HPPh2，Pd(OAc)2，Et3N(4eq)，CH3CN，80℃，3dc).Boc2O，對于13用二噁烷，對于15用DCM，20℃
d).HBTU，DIPEA，DMF，RT，2he).TFA，DCM，20℃，4h氨基酸10由Aldrich市售，作為二胺14。根據(jù)Saxon等人US2003199084制備碘化物11，改進該專利中報道的關于膦12的制備方法以提高產(chǎn)率。
化合物12向火焰干燥的燒瓶中加入乙腈(30mL)，三乙胺(5.32g；52.3mmol)，化合物11(3.06g；10.0mmol)和醋酸鈀(42mg；0.2mmol)?；旌衔镎婵彰摎狻Ｔ跉鍤庵袛嚢?，通過注射器將二苯基膦(2.16g；11.6mmol)加到燒瓶中。得到的溶液在80℃下加熱3d，然后冷卻至rt并濃縮。殘渣溶解在DCM(175mL)中，用H2O(175mL)和1M鹽酸(2×50mL)洗滌，并濃縮。粗產(chǎn)物溶解在熱MeOH(100mL)中并冷卻到4℃。過濾提供金黃色固體產(chǎn)物(2.87g；78％)，mp＝206℃。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ10.8(br.s，1H)，8.07(d，2H，J＝1)，7.67(d，1H，J＝3.4)，7.37-7.25(m，10H)，3.75(s，3H)ppm。13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ170.58，166.68，141.46(d，J＝29.5)，138.90(d，J＝19.1)，136.89(d，10.0)，135.56，133.83(d，J＝10.0)，131.90，130.56，129.70，129.02，128.65(d，J＝7.1)，52.35ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ4.04ppm。FT-IR(ATR)ν2952，2846，2536，1726，1686，1434，1262，1244，1106，1057，743cm-1。
N-單(叔丁氧基羰基)-乙二胺(13)二-叔丁基-二碳酸酯(40.77g；0.187mol)溶解在二噁烷(200mL)中，滴加到乙二胺(89.82g；1.49mol)的二噁烷(500mL)溶液中。30分鐘后，將懸浮液蒸發(fā)至干，加入H2O(500mL)。過濾掉白色固體，水層用DCM(3×250mL)萃取。合并有機層，用Na2SO4干燥，并濃縮。得到無色液體產(chǎn)物(23.75g；79％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.32(br.s，1H)，3.17(q，2H，J＝6.0)，2.80(t，2H，J＝6.0)，1.45(s，9H)，1.30(s，2H)ppm。13C-NMR(75MHz，CDCl3)δ156.09，78.84，43.19，41.65，28.20ppm。FT-IR(ATR)ν3363，2975，2932，1689，1518，1364，1249，1166，873cm-1。
化合物15市售二胺14(10.7g；72.2mmol)溶解在DCM(400mL)中，溶液在油浴中加熱到40-45℃，保持在氬氣中。分三次加入二-叔丁基-二碳酸酯(總共15.9g；72.8mmol)，溶液在40-45℃下氬氣中攪拌過夜。溶液冷卻，真空濃縮，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜使用氯仿/MeOH/異丙胺＝20/2/1純化，分離油狀產(chǎn)物(7.8g；44％)。1H NMR(CDCl3)δ＝5.2(bs，1H)，3.5-3.35(8H)，3.2(q，2H)，2.75(t，2H)，1.35(s，9H)，1.25(b，2H)。13C NMR(CDCl3)δ＝155.7(C＝O)，78.5(CCH3)，73.2和69.9(CH2O)，41.5和40.0(CH2N)，28.1(CCH3)。
化合物16HBTU(3.64g；9.61mmol)溶解在無水DMF(40mL)中，加入DIPEA(2.48g；19.22mmol)和羧酸12(3.50g；9.61mmol)。混合物在氬氣中rt下攪拌10分鐘，然后加入胺13(1.69g；10.57mmol)的DMF(4mL)溶液。混合物攪拌2h，然后用乙醚稀釋(500mL)，用飽和NaHCO3(3×400mL)和0.1M HCl(400mL)洗滌。有機層用Na2SO4干燥，濃縮，得到黃色固體(4.59g；94％)。1H-NMR(300MHZ，CDCl3)δ8.07(dd，1H，J＝3.3，7.8)，7.75(dd，1H，J＝1.8，8.1)，7.38-7.27(m，11H)，6.93(br.s，1H)，4.85(br.s，1H)，3.75(s，3H)，3.44(q，2H，J＝6.0)，3.31(q，2H，J＝6.0)，1.42(s，9H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.88ppm。FT-IR(ATR)ν3343，2974，1716，1708，1687，1637，1535，1435，1274，1255，1184，1165，1116，743，695cm-1。
化合物17Boc-保護的胺16(4.59g；9.06mmol)溶解在DCM(20mL)和TFA(20mL)中，在rt下攪拌4h。濃縮混合物，在DCM(100mL)中再溶解，用飽和Na2CO3(200mL)洗滌。水層用DCM(50mL)反萃取，合并有機層，用Na2SO4干燥，蒸發(fā)至干，得到黃色泡沫(3.51g；97％)。1H-NMR(200MHZ，CDCl3)δ8.08(dd，1H，J＝3.6，7.8)，7.81(dd，1H，J＝1.6，8.2)，7.37-7.23(m，11H)，6.57(br.s，1H)，3.72(s，3H)，3.33(q，2H，J＝5.6)，2.79(t，2H，J＝5.9)，1.14(br.s，2H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.87ppm。FT-IR(ATR)ν3301，2949，1717，1641，1537，1433，1271，1251，1114，742，695cm-1。
化合物18HBTU(2.08g；5.49mmol)溶解在無水DMF(25mL)中，加入DIPEA(1.42g；5.49mmol)和羧酸12(2.00g；5.49mmol)?；旌衔镌跉鍤庵衦t下攪拌10分鐘，然后加入胺15(1.50g；6.04mmol)的DMF(2mL)溶液?；旌衔飻嚢?h，然后用乙醚稀釋(300mL)，用飽和NaHCO3(3×200mL)和0.1M HCl(200mL)洗滌。有機層用Na2SO4干燥，濃縮，得到黃色泡沫(2.90g；89％)。1H-NMR(200MHZ，CDCl3)δ8.08(1H)，7.79(1H)，7.33-7.27(11H)，6.41(1H)，4.94(1H)，3.74(3H)，3.59-3.51(10H)，3.30(2H)，1.43(9H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.82ppm。FT-IR(ATR)ν3334，2896，1714，1648，1525，1271，1249，1166，1112，744，696cm-1。
化合物19Boc-保護的胺18(2.90g；4.88mmol)溶解在DCM(15mL)和TFA(15mL)中，在rt下攪拌2h。濃縮混合物，在DCM(50mL)中再溶解，用飽和Na2CO3(40mL)洗滌。水層用DCM(50mL)反萃取，合并有機層，用Na2SO4干燥，蒸發(fā)至干，得到黃色泡沫(2.27g；94％)。1H-NMR(200MHZ，CDCl3)δ8.07(dd，1H)，7.81(dd，1H)，7.37-7.26(m，11H)，6.74(br.s，1H)，3.74(s，3H)，3.59-3.46(m，10H)，2.81(t，2H)，1.68(s，2H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.82ppm。FT-IR(ATR)ν3302，2866，1717，1648，1536，1433，1271，1251，1113，744，696cm-1。
DOTA-構造塊 a).Boc2O，Et3N，CHCl3，0℃b).溴乙酸芐酯，DIPEA，乙腈，65℃，18hc).TFA，DCM，20℃，4hd).溴乙酸叔丁酯，K2CO3，乙腈，20℃，4he).H2，Pd/C，MeOH，H2O，20℃，18h20的合成報道在例如E.Kimura，J.Am.Chem.Soc，1997，119，3068-3076中?；衔?1報道在以下日本專利(日本語)中。Miyake，Muneharu；Kusama，Tadashi；Masuko，Takashi。作為NMDA受體抑制劑的新穎的含氮環(huán)狀化合物的制備，PCT國際申請(2004)，57pp?；衔?2-24報道在A.Heppeler等人，Chem.EwJ.1999，5，7，1974-1981中。
化合物20使用JACS，1997，119，3068-3076中報道的方法得到這種化合物。使用己烷-乙酸乙酯混合物作為洗脫劑通過硅膠柱色譜分離產(chǎn)物。
1H NMR(CDCl3)δ＝3.6(b，4H，CH2N)，3.35(b，1H，NH)，3.25(b，8H，CH2N)，2.8(b，4H，CH2N)，1.4(s，9H，CH3)，1.4(s，18H，CH3)。13C NMR(CDCl3)δ＝156-155(多信號C＝O)，79.8-79.1(多信號C-CH3)，51.5-48.5和46.5-44.5(多信號CH2-N)，28.6(CH3)，28.4(CH3)。MALDI-TOF-MS[M+H]+＝473，[M+Na]+＝495，[M+K]+＝511。
化合物21三-Boc保護的化合物20(15.2g；32.2mmol)溶解在20mL乙腈中，其后加入在乙腈(10mL)中的二異丙基乙基胺(19mL)和溴乙酸芐酯(7.9g；34.5mmol)。溶液加熱到60-65℃，氬氣中攪拌過夜。通過蒸發(fā)溶劑濃縮混合物，在DCM中溶解，用1M NaOH洗滌溶液。有機層用Na2SO4干燥，然后蒸發(fā)溶劑，并與甲苯一起蒸發(fā)。使用己烷/乙酸乙酯＝1/1作為洗脫劑通過硅膠柱色譜分離出純產(chǎn)物。產(chǎn)率約90％。1H NMR(CDCl3)δ＝7.4(m，5H，Ph-H)，5.15(s，2H，CH2Ph)，3.6(s，2H，CH2C(O))，3.6-3.2(不同的b，12H，CH2N)，2.9(b，4H，CH2N)，1.45(s，9H，CH3)，1.4(s，18H，CH3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝170.3(C＝O酯)，156-155(多信號C＝O氨基甲酸酯)，135.5和128.6-128.2(苯環(huán)碳)，79.5-79.2(多信號C-CH3)，66.2(CH2-O)，55.0，53.5，51.2，49.9和47.4-46.9(CH2-N)，28.6(CH3)，28.4(CH3)ppm。
化合物22三-Boc保護的單乙酸芐酯環(huán)烯21(5.4g；8.7mmol)溶解在甲苯(50mL)中，蒸發(fā)溶劑除去如果存在的痕量水。產(chǎn)物溶解在新蒸餾的DCM(35mL)和TFA(35mL)的混合物中，在氮氣中攪拌約3小時。蒸發(fā)溶劑(低于30℃)，在TFA(30mL)中再次溶解，再攪拌2小時，然后蒸發(fā)揮發(fā)物(低于30℃)。用甲苯抽提剩余的鹽兩次，盡可能多地除去TFA以得到產(chǎn)物22，經(jīng)分離用于下一步中。1H NMR(CDCl3)δ＝7.4(m，5H，Ph-H)，5.1(s，2H，CH2Ph)，3.5(s，2H，CH2C(O))，3.05(b，4H，CH2N)，3.0(b，4H，CH2N)，2.9(b，4H，CH2N)，2.8(b，4H，CH2N)ppm。
化合物23混合粗產(chǎn)物22，乙腈(50mL)和碳酸鉀(10.6g；7.67mmol)，劇烈磁力攪拌15分鐘，得到細懸浮液。然后，滴加溴乙酸叔丁酯(6.8g；34.9mmol)的乙腈(20mL)溶液。攪拌4～5小時后，真空濃縮混濁的混合物。殘渣轉移至含有氯仿(200mL)和水(200mL)的分液漏斗。分離氯仿層，用鹽水洗滌。過濾，蒸發(fā)氯仿，得到液體(約12g)，使用硅膠柱色譜純化，首先用DCM洗脫除去雜質如溴乙酸叔丁酯，然后用DCM/EtOH＝600/30洗脫以收集白色固體產(chǎn)物(5.35g，93％)。TLCRf＝0.23(DCM/EtOH＝8/1)，在10％KI水溶液中用I2顯色。1H NMR(CDCl3)δ＝7.4-7.3(m，5H，Ph-H)，5.10(s，2H，CH2Ph)，3.6-2.0(寬，24H，烯環(huán)N-CH2和CH2COOR)，1.45(s，9H，C(CHs)3)，1.40(s，18H，C(CH3)3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝173.5，172.9和172.8(C＝O)，135.0，128.6，128.5和128.3(苯環(huán))，81.9(C(CH3)3)，66.8(CH2O)，55.8，55.7和54.9(CH2-C(O))，52.3和48.7(兩個極寬的，CH2N)，27.8(C(CH3)3)ppm。FT-IR(cm-1)ν＝2977-2830(w)，1724(vs，C＝O酯)，1368(vs)，1227(vs)，1157(vs)，1105(vs)cm-1。MALDI-TOF-MS[M+H]+＝663Da和[M+Na]+＝685Da。
化合物24芐基酯23(5.3g；7.99mmol)溶解在甲醇(100mL)和去礦物水(50mL)中，溶液轉移至厚壁Parr氫化反應容器中。氮氣鼓泡通過溶液，加入Pd/C 10％催化劑(305mg)?；旌衔镌?0psi氫氣過壓力下?lián)u動4小時。過濾混合物，真空濃縮濾液。與乙腈(40mL)一起蒸發(fā)除去殘余水。進一步干燥產(chǎn)物，并保存在真空干燥器中的P2O5上，得到泡沫狀淺黃色固體(4.33g；95％)。產(chǎn)物極具吸濕性。1H NMR(CDCl3)δ＝3.7-3.2，3.2-2.6和2.6-2.0(所有三個均極寬并重疊，CH2N)，1.41(s，18H，(CH3)3)，1.39(s，9H，C(CH3)3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝174.2和172.3(C＝O)，82.1和81.9(C(CH3)3)，55.9，55.7和55.3(CH2-C(O))，53.5-50.5和50.5-47.0(兩個極寬的，CH2N)，27.9和27.7(C(CH3)3)ppm。FT-IR(cm-1)v＝2976(w，CH-伸縮振動)，2824(w；CH-伸縮振動)，1725(vs，C＝O，伸縮振動酯和酸)cm-1。MALDI-TOF-MS[M+H]+＝573Da和[M+Na]+＝595Da。
膦-DOTA探針26的組裝f).HBTU，DIPEA，DMF，20℃，2hg).TFA，DCM，20℃化合物25HBTU(0.664g；1.75mmol)溶解在無水DMF(7mL)中，加入DIPEA(0.45g；3.50mmol)和羧酸24(1.00g；1.75mmol)。混合物在氬氣中rt下攪拌10分鐘，然后加入胺17(0.85g；2.10mmol)?；旌衔飻嚢?h，然后用乙醚稀釋(200mL)，用飽和NaHCO3(3×100mL)洗滌。有機層用Na2SO4干燥，并濃縮。粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，CHCl3作為初始洗脫劑，然后用CHCl3中的4％MeOH溶液作為洗脫劑。得到黃色泡沫產(chǎn)物(900mg；55％)。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ8.06(dd，1H)，7.86(dd，1H)，7.53(dd，1H)，7.32(m，10H)，7.02(br.t，1H)，6.62(br.t，1H)，3.73(s，3H)，3.6-2.0(br.m，28H)，1.46(s，9H)，1.40(s，18H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.97ppm。FT-IR(ATR)ν3426，2978，2826，1724，1677，1524，1369，1228，1159，1107，837，734cm-1。MALDI-TOFm/z[M+H]+961.4Da；[M+Na]+983.4Da。
化合物26三-tBu-保護的25溶解在DCM(6mL)和TFA(6mL)中，在rt下攪拌1h。濃縮混合物，再次溶解在DCM(6mL)和TFA(6mL)中，再攪拌2h。濃縮混合物，與CHCl3一起蒸發(fā)2次，然后在真空中充分干燥。產(chǎn)物溶解在H2O(30ml)中，凍干，得到蓬松黃色粉末(541mg，94％)。1H-NMR(200MHZ，MeOD)δ8.05(dd，1H，J＝3.6，8.2)，7.84(dd，1H，J＝1.6，8.2)，7.51(dd，1H，J＝3.6，1.6)，7.37-7.23(m，10H)，4.1-3.7(br.s，8H)，3.67(s，3H)，3.6-3.1(br.m，20H)ppm。31P-NMR(80MHz，MeOD)δ34.34(小，膦氧化物)，-3.80(大，產(chǎn)物)，-15.20(t，HPO2F2，J＝953)ppm。FT-IR(ATR)ν3301，3073，2856，2541，1717，1667，1539，1435，1292，1188，1131，720，698cm-1。MALDI-TOFm/z[M+H]+793.3Da。
PS雜質二氟磷酸(HPO2F2)源于六氟磷酸根陰離子(PF6-)，在與HBTU的偶聯(lián)反應之后部分地留在樣品中。在酸性條件下，該陰離子轉化成二氟磷酸。(Kolditz，L.Z.Anorg.Chem.1957，293，155-167)。
膦-DOTA探針28的組裝
f).HBTU，DIPEA，DMF，20℃，2hg).TFA，DCM，20℃化合物27HBTU(1.32g；3.49mmol)溶解在無水DMF(15mL)中，加入DIPEA(0.90g；6.98mmol)和羧酸24(2.00g；3.49mmol)。混合物在氬氣中rt下攪拌10分鐘，然后加入胺19(1.90g；3.84mmol)的DMF(5mL)溶液?；旌衔飻嚢?h，濃縮，在DCM(100mL)中再次溶解，然后用飽和NaHCO3(3×50mL)，H2O(3×50mL)，和1M NaOH(50mL)洗滌。有機層用Na2SO4干燥，并濃縮。粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化，CHCl3作為初始洗脫劑，然后用CHCl3中的5％MeOH溶液作為洗脫劑。得到黃色泡沫產(chǎn)物(1.21g；33％)。1H-NMR(200MHZ，CDCl3)δ8.05(dd，1H)，7.81(dd，1H)，7.41-7.27(m，11H)，6.52(br.m，2H)，3.74(s，3H)，3.60(m，10H)，3.39(t，2H)，3.3-2.0(br.m，24H)，1.45(s，27H)ppm。31P-NMR(80MHz，CDCl3)δ-3.82ppm。FT-IR(ATR)ν3424，2976，2827，1724，1674，1536，1369，1228，1161，1106，838，749cm-1。LC-MSm/z[M+H]+計算值1049.2Da，觀測值1049.5Da。
化合物28三-tBu-保護的27溶解在DCM(7mL)和TFA(5mL)中，在rt下攪拌1h。濃縮混合物，再次溶解在DCM(7mL)和TFA(5mL)中，再攪拌2h。濃縮混合物，與CHCl3一起蒸發(fā)2次，然后在真空中充分干燥。產(chǎn)物溶解在H2O(30ml)中，凍干，得到蓬松黃色粉末(1.16g，96％)。1H-NMR(200MHz，MeOD)δ8.04(dd，1H，J＝3.7，8.1)，7.79(dd，1H，J＝1.7，8.1)，7.45(dd，1H，J＝3.7，1.7)，7.4-7.2(m，10H)，4.05-3.7(br.m，8H)，3.68(s，3H)，3.6-3.1(br.m，28H)ppm。31P-NMR(80MHz，MeOD)δ33.82(小，膦氧化物)，-3.91(大，產(chǎn)物)，-15.19(t，HPO2F2，J＝953)ppm。FT-IR(ATR)ν3287，3074，2872，2546，1718，1651，1547，1435，1292，1189，1130，745，720，698cm-1。MALDI-TOFm/z[M+H]+881.4Da。
合成探針28與Eu的配位化合物(29) h)EuCl3·6H2O，NH4OAc，H2O，20℃，2hEu3+-配位化合物29化合物28(100mg；0.114mmol)和乙酸銨(87.9mg；1.14mmol)溶解在脫氣的超純H2O(60mL)中。加入EuCl3·6H2O(37.4mg；0.102mmol)，略微混濁的混合物在Ar中rt下攪拌2h。然后，過濾，凍干，得到黃色固體配位化合物(123mg)。1H-NMR(200MHz，H2O)δ7.8-7.0(br.m)，3.6-2.4(br.m)ppm。31P-NMR(80MHz，D2O)δ37.02(小，膦氧化物)，-5.30(大，產(chǎn)物)，-15.01(t，HPO2F2，J＝962)ppm。FT-IR(ATR)ν3050，1664，1590，1403，1292，1128，721cm-1。MALDI-TOFm/z[M+H]+1031.1Da。
實施例12用于合成疊氮基-官能化的尋靶探針的水溶性的疊氮化物與活性酯(34)。
實驗參見實施例11。
化合物30叔BuOK(12.0g；107mol)分次加到攪拌的二乙二醇(27.0g；0.254mol)和叔丁醇(110mL)的混合物中。溶液保持在氬氣中，在溫水浴(約40℃)中攪拌以溶解鉀鹽。90分鐘后將溶液冷卻到15℃，5分鐘內(nèi)加入溴乙酸叔丁酯(26.8g；0.137mol)。形成沉淀(KBr)，混合物在室溫下攪拌過夜。蒸發(fā)溶劑，混合物溶解在水中，用乙醚/戊烷萃取水層以除去雜質。用DCM(3次)萃取收集產(chǎn)物。有機層用Na2SO4干燥，濃縮。粗產(chǎn)物使用己烷/二甲氧基乙烷梯度混合物用硅膠柱色譜純化。得到無色油狀產(chǎn)物(產(chǎn)率25％)。TLC(硅膠，己烷/二甲氧基乙烷1/1)Rf＝0.30。1H NMR(CDCl3)δ＝3.95(s，2H，CH2C(O))，3.7-3.6(6H)，3.55(t，2H)，2.75(t，1H，OH)，1.4(s，9H，CH3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝169.5(C＝O)，81.5(CCH3)，72.5，70.7，70.2和68.8(CH2O)，61.5(CH2OH)，27.9(CH3)ppm。
化合物31對甲苯磺酰氯(11.9g；62.4mmol)分次加到醇30(11.7g；52.9mmol)和無水吡啶(30mL)的攪拌和冷卻下的混合物中。溶液在氬氣中在4℃下攪拌過夜，出現(xiàn)沉淀(吡啶鹽氯化物)。將冰水加到混合物中，然后攪拌5分鐘，水解過量的對甲苯磺酰氯。用乙醚萃取水層(3次)，合并有機層，用冷HCl溶液和冷水洗滌，然后用Na2SO4干燥醚。蒸發(fā)溶劑，得到油狀產(chǎn)物(16g，80％)。1H NMR(CDCl3)δ＝7.8(m，2H，Ar-H)和7.3(m，2H，Ar-H)，4.1(t，2H)，3.95(s，2H，CH2C(O))，3.7-3.5(6H)，2.4(s，3H，Ar-CH3)1.4(s，9H，CH3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝169.5(C＝O)，144.7，132.9，129.7和127.9(苯環(huán)碳)，81.5(CCH3)，70.6，70.5，69.1，68.9和68.6(CH2O)，28.0(CH3)，21.5(Ar-CH3)ppm。
化合物32將對甲苯磺酸酯31(15g；40.0mmol)加到NaN3(3.20g；49.2mmol)的二甲基亞砜(90mL)溶液中?；旌衔飻嚢?d，同時保持在氬氣中。加入水，用醚萃取(3次)，合并有機層，用水洗滌，用Na2SO4干燥，濃縮，得到油狀產(chǎn)物(9.9g；100％)。1H NMR(CDCl3)δ＝3.95(s，2H，CH2C(O))，3.7-3.6(6H)，3.4(t，2H，CH2N3)，1.4(s，9H，CH3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝169.5(C＝O)，81.5(CCH3)，70.7，70.6，69.9和69.0(CH2O)，50.6(CH2N3)，28.0(CH3)ppm。
化合物33將疊氮化物32(9.9g；40.0mmol)加到水(10mL)，MeOH(50mL)和NaOH(2.05g；51.3mmol)的攪拌溶液中，得到的混濁混合物在室溫下攪拌過夜。在加入一些HCl-溶液降低pH為約7后，蒸發(fā)甲醇。加入水，使用DCM分幾次萃取產(chǎn)物。合并有機層，用少量水洗滌，然后用Na2SO4干燥。濃縮溶液，得到接近無色的油狀產(chǎn)物(7.3g；95％)。1H NMR(CDCl3)δ＝10.0(b，1H，COOH)，4.2(s，2H，CH2C(O))，3.8-3.6(6H)，3.4(t，2H，CH2N3)ppm。13C NMR(CDCl3)δ＝174.5(C＝O)，71.1，70.4，70.0和68.3(CH2O)，50.5(CH2N3)ppm。
化合物34將酸33(310mg；1.64mmol)，N-羥基磺基琥珀酰亞胺鈉(316mg；1.46mmol)，DCC(640mg；3.11mmol)和3mL無水DMF混合，得到的懸浮液在水浴中于50℃超聲處理1小時，然后在室溫下攪拌3天?；旌衔镌?℃下保持幾小時，然后用玻璃過濾器過濾，并用少量無水DMF和乙腈洗滌。將無水乙酸乙酯(30mL)和醚(200mL)加到透明濾液中，得到乳狀懸浮液。離心，得到白色粉末，向其中加入醚；再次離心懸浮液。真空干燥粉末。產(chǎn)率200mg(35％)。
小心保持化合物干燥，因為其略具吸濕性，并會水解回到起始化合物！
權利要求
1.一種用于靶向醫(yī)學顯像或治療的試劑盒，其包括至少一個尋靶探針，其包括一級尋靶部分和二級靶標；和至少一個另外的探針，其選自包括二級尋靶部分和標記的顯像探針；或包括二級尋靶部分和藥物活性化合物的治療探針，其特征在于，所述尋靶探針或所述顯像或治療探針中的任一個包括至少一個疊氮基，分別作為二級靶標和二級尋靶部分，而另一個探針包括至少一個膦基團，所述膦和所述疊氮基是施陶丁格連接用的反應配偶子。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其中所述尋靶探針包括所述至少一個疊氮基，而所述顯像或治療探針包括所述至少一個膦基團。
3.如權利要求1～2中任一項所述的試劑盒，其中所述一級尋靶部分與血管體系內(nèi)的成分結合。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其中所述一級尋靶部分與受體結合。
5.如權利要求1～4中任一項所述的試劑盒，其中所述一級尋靶部分與細胞內(nèi)成分結合。
6.如權利要求1～5中任一項所述的試劑盒，其中所述一級尋靶部分是抗體。
7.如權利要求1～6中任一項所述的試劑盒，其中所述一級尋靶部分是細胞滲透性的。
8.如權利要求1～7中任一項所述的試劑盒，其包括顯像探針。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其中所述顯像探針包括可檢測標記，其是傳統(tǒng)顯像系統(tǒng)中所用的造影劑，選自MRI可顯像劑、自旋標記、光學標記、超聲反應性試劑、X射線反應性試劑、放射性核素、和FRET型染料。
10.如權利要求8所述的試劑盒，其中所述可檢測標記選自(生物)發(fā)光或熒光分子或標簽、放射性標記、生物素、順磁或超順磁顯像試劑。
11.如權利要求8所述的試劑盒，其中所述標記包括選自如下的放射性核素3H、11C、13N、15O、18F、51Cr、52Fe、52mMn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、80mBr、82mBr、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113mIn、114mIn、117mSn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193mPt、195mPt、201Tl、203Pb。
12.如權利要求8所述的試劑盒，其中所述標記包括選自如下的順磁離子Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl。
13.如權利要求8所述的試劑盒，其中所述標記是小尺寸有機PET(正電子發(fā)射斷層顯像)或SPECT標記。
14.如權利要求8～13中任一項所述的試劑盒，其中所述顯像探針還包括藥物活性化合物。
15.如權利要求1～4中任一項所述的試劑盒，其包括治療探針。
16.一種包括二級尋靶部分和標記的顯像探針，其特征在于，所述顯像探針包括作為二級靶標的至少一個疊氮基或至少一個膦基團，所述膦或所述疊氮基是適于施陶丁格連接用的反應配偶子，而所述標記是顯像標記。
17.如權利要求16所述的顯像探針，其中所述標記選自金屬顆粒，有機PET或SPECT標記的輔基，光學標記，PET、SPECT或MRI用的金屬配位化合物，微泡，或含有碘或鋇的分子或泡囊。
18.藥物組合物，其包括如權利要求16所述的顯像探針。
19.制備顯像用的診斷組合物的方法，包括使用如權利要求16所述的顯像探針。
20.包括一級尋靶部分和二級靶標的尋靶探針作為靶向醫(yī)學顯像中的工具的用途，其特征在于，所述尋靶探針包括作為所述二級靶標的至少一個疊氮基或至少一個膦基團，所述膦或所述疊氮基是適于施陶丁格連接用的反應配偶子。
21.包括一級尋靶部分和二級靶標的尋靶探針在制造醫(yī)學顯像用的工具中的用途，其特征在于，所述尋靶探針包括作為所述二級靶標的至少一個疊氮基或至少一個膦基團，所述膦或所述疊氮基是適于施陶丁格連接用的反應配偶子。
22.一種包括MRI顯像劑以及在施陶丁格連接中可以與疊氮基反應的膦基團的顯像探針，其特征在于，所述顯像劑的金屬原子通過含有膦基團的連接基團與一個或者多個羧酸配位。
23.一種顯像探針，其包括PET或SPECT標記和三苯基膦作為二級尋靶部分。
24.如權利要求22所述的顯像探針，其具有通式結構(6) 其中M是順磁性金屬離子，選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II)、Yt(III)、Cr(III)、Eu(III)、Yb(III)和Dy(III)；A、B、C和D是單鍵或雙鍵；X1、X2、和X3是-OH、-COO-、-CH2OH-、CH2COO-；R1-R10是氫、烷基、芳基、磷部分，以及Y是取代的三苯基膦如(CH2)2-COO-C6H4N(CH2COOH)2-P-(C6H5)2或允許在取代的膦和順磁性金屬之間有一個或多個配位的另一種取代的三苯基膦。
25.如權利要求24所述的顯像探針，其中所述順磁性金屬是Gd。
26.如權利要求24或25所述的化合物，其由式(1)所代表
27.一種醫(yī)學顯像用的組合探針，其包括一級尋靶部分和可檢測標記，其特征在于，所述尋靶部分通過酰胺鍵或三苯基膦氧化物部分與所述可檢測標記連接。
28.如權利要求27所述的組合探針，其中所述可檢測標記是選自如下的顯像劑金屬顆粒，有機PET或SPECT標記的輔基，光學標記，PET、SPECT或MRI用的金屬配位化合物，微泡，以及含有碘或鋇的分子或泡囊。
29.一種體外制備包括一級尋靶部分和可檢測標記或藥物活性劑的組合的尋靶和顯像或治療探針的方法，所述方法包括如下步驟使包括膦的可檢測標記與包括疊氮基的一級尋靶部分反應或使包括疊氮基的可檢測標記與包括膦的一級尋靶部分反應。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述顯像劑選自有機PET或SPECT標記的輔基，光學標記，PET、SPECT或MRI用的金屬配位化合物，微泡，和含有碘或鋇的分子或泡囊。
31.一種開發(fā)對靶標具有優(yōu)化的結合親和性以及對顯像或治療探針具有優(yōu)化的反應的尋靶探針的方法，所述方法包括a)制備所述尋靶探針的尋靶部分的化合物庫，其中在所述尋靶部分上的不同部位引入二級靶標，和b)篩選這樣得到的化合物庫，以與靶標結合并與顯像探針和/或治療探針結合。
32.一種特異肽的衍生物的庫，其特征在于，所述衍生物在所述肽的肽鏈中的不同氨基酸位置處被疊氮基修飾。
33.如權利要求32的庫用于測定含有疊氮基的肽和/或包括疊氮基的肽和包括膦的顯像或治療探針的反應產(chǎn)物對一級靶標的結合性能的用途。
34.一種靶向醫(yī)學顯像或治療用的試劑盒，其包括至少一個靶標代謝前體，其包括二級靶標；和至少一個另外的探針，其選自包括二級尋靶部分和標記的顯像探針；或包括二級尋靶部分和藥物活性化合物的治療探針，其特征在于，所述靶標代謝底物或所述顯像或治療探針中的任一個包括至少一個疊氮基，分別作為二級靶標和二級尋靶部分，而另一個探針包括至少一個膦基團，所述膦和所述疊氮基是施陶丁格連接用的反應配偶子。
35.如權利要求34所述的試劑盒，其中所述靶標代謝前體包括至少一個疊氮基，而所述顯像或治療探針包括至少一個膦基團。
36.如權利要求34或35所述的試劑盒，其中所述代謝前體選自糖、氨基酸、核堿、和膽堿。
37.一種靶向醫(yī)學顯像或治療用的試劑盒，其包括至少一個報道探針，其包括二級靶標；和至少一個另外的探針，其選自包括二級尋靶部分和標記的顯像探針；或包括二級尋靶部分和藥物活性化合物的治療探針，其特征在于，所述報道探針或所述顯像探針或治療探針中的任一個包括至少一個疊氮基，分別作為二級靶標和二級尋靶部分，而另一個探針包括至少一個膦基團，所述膦和所述疊氮基是施陶丁格連接用的反應配偶子。
38.如權利要求34～37中任一項所述的試劑盒，其包括顯像探針。
39.如權利要求38所述的試劑盒，其中所述顯像探針包括可檢測標記，其是傳統(tǒng)顯像系統(tǒng)中所用的造影劑，選自MRI可顯像劑、自旋標記、光學標記、超聲反應性試劑、X射線反應性試劑、放射性核素、和FRET型染料。
全文摘要
提供共價連接如施陶丁格連接的選擇性化學和生物正交反應在靶向分子顯像和治療中的用途，更具體而言，其有益的應用是預靶向顯像或治療。現(xiàn)有預靶向顯像的問題在于其僅依賴于天然/生物尋靶構造(即生物素/鏈親和素)。與其內(nèi)源性性質相關的對尺寸的考慮因素和限制因素嚴重限制了其應用數(shù)量。本發(fā)明公開了如何使用非生物的、在生理條件下通過小或不可檢測到的結合來形成穩(wěn)定的加成物的生物正交反應能夠克服這些局限。
文檔編號A61K51/02GK101068577SQ200580034471
公開日2007年11月7日 申請日期2005年10月4日 優(yōu)先權日2004年10月7日
發(fā)明者馬克·S·羅比亞爾, 霍爾格·克呂埃 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司