專利名稱：作為靶向試劑用于內(nèi)皮－特異性體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的熱激蛋白的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的實(shí)施方案涉及使用來源于熱激蛋白(HSP)的肽和多肽對(duì)信號(hào)試劑(例如，造影劑或成像劑)進(jìn)行送遞并使之與治療劑內(nèi)化的化合物、組合物和方法。例如，熱激蛋白70與氧化的低密度脂蛋白受體(LOX-1或OLR-1)相結(jié)合，并向LOX-1受體發(fā)出信號(hào)，以便對(duì)HSP以及內(nèi)皮上附著的任何部分進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。HSP肽類可以直接與成像劑或治療劑相連接，也可以通過一種連接體進(jìn)行連接。該組合物還可用于將生物學(xué)分子送遞到體內(nèi)具有高濃度LOX-1的位點(diǎn)，包括巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞。造影劑/成像劑可以根據(jù)不同的成像模式進(jìn)行選擇，特別是所述部分可以對(duì)容易受到炎癥相關(guān)斑塊如動(dòng)脈粥樣硬化斑影響的位點(diǎn)進(jìn)行成像。組合物可用于診斷和監(jiān)測(cè)炎癥以及炎癥起主要作用的疾病，諸如各種心血管疾病，包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、易損斑塊、冠狀動(dòng)脈疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
2.相關(guān)領(lǐng)域說明HSPs(熱激蛋白)是存在于從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的生物體的細(xì)胞中的高度保守蛋白家族。HSPs是細(xì)胞代謝所必須的，即便是在未應(yīng)激的細(xì)胞中也是如此。它們促進(jìn)蛋白組裝的合成、結(jié)構(gòu)、運(yùn)輸和其他方面，諸如幫助新合成的多肽折疊，以防止與其他的蛋白發(fā)生過早的相互作用(即作為伴侶蛋白)。HSP的表達(dá)反應(yīng)于生理應(yīng)激諸如體溫升高、pH改變和氧耗竭而增加。這些應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞蛋白三維結(jié)構(gòu)的破裂或打開。如果對(duì)這種應(yīng)激不做檢查，折疊錯(cuò)誤的或者被打開的蛋白會(huì)形成聚集物，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。HSPs和受破壞的蛋白相結(jié)合，幫助其重新折疊至它們適宜的形狀，以及/或者預(yù)防破壞的發(fā)生。
EP 1046652 A1公開了一種包含哺乳動(dòng)物氧化的-LDL受體(LOX-1)和一部份IgG的融合多肽，其中融合多肽可以用標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記。由此，融合多肽可用于檢測(cè)、量化、分離和純化氧化的LDL。但是EP1046652 A1中的融合多肽不能用于檢測(cè)或量化LOX-1。
TAT肽序列(YGRKKRRQRRR)和最近報(bào)道的Antp內(nèi)化序列(RQIAWFQNRRNKWKK)證明了體內(nèi)和體外各種底物的內(nèi)化活性。但是都沒有證明可以靶向特定的受體，用于向內(nèi)皮上的病變區(qū)域送遞診斷性造影劑，盡管TAT肽被用于將氧化鐵納米顆粒非特異性送遞到細(xì)胞中(Wunderbalinger，P，et al.，Bioconjugate Chemistry，2002，13，264-8)。這些方法的一個(gè)缺點(diǎn)是肽將造影劑靶向到目標(biāo)細(xì)胞的非特異性。這種造影劑的非特異性送遞將阻止目的診斷區(qū)域(即粥樣硬化病變)與其他的脈管系統(tǒng)的功能區(qū)域相區(qū)別。
心血管疾病是美國(guó)主要的死亡原因，每年導(dǎo)致超過100萬的死亡人數(shù)。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的主要原因，并且是西方國(guó)家非意外死亡的主要原因。文獻(xiàn)記載導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化有很多危險(xiǎn)因素，諸如高血壓、總血清膽固醇升高、高水平的低密度脂蛋白(LDL)膽固醇、低水平的高密度(HDL)膽固醇、糖尿病、重度肥胖癥和吸煙。人們做了很多努力來確定該疾病的病原學(xué)，以及動(dòng)脈粥樣硬化的方法和后果，包括心肌梗塞、心絞痛、器官衰竭和中風(fēng)的可能的治療。迄今為止，動(dòng)脈粥樣硬化的治療主要著眼于降低膽固醇水平和調(diào)節(jié)脂質(zhì)。然而，最近的研究顯示，40％的由冠狀疾病引起的死亡發(fā)生在膽固醇水平低于220mg/dl的人身上。現(xiàn)在還有很多問題無法解決，包括粥樣硬化病變是如何并在何時(shí)變成易損且具生命威脅性的？最佳介入點(diǎn)？如何檢測(cè)和監(jiān)測(cè)損傷的進(jìn)展？一些介入性的和非介入性的技術(shù)已經(jīng)被用于對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行成像，和評(píng)估疾病的進(jìn)展和穩(wěn)定化情況。這些包括冠狀動(dòng)脈造影術(shù)、血管內(nèi)超聲血管鏡檢查、血管內(nèi)核磁共振成像和使用紅外導(dǎo)管的斑熱成像法。這些技術(shù)已經(jīng)成功的用于鑒定易損的斑，但通常都是介入性的(例如，需要手術(shù)或插入探針或照相機(jī))。在患有不穩(wěn)定性心絞痛的患者中發(fā)現(xiàn)了可溶性標(biāo)記物，諸如P-選擇蛋白、von Willebrand因子、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(C146)、C-反應(yīng)性蛋白，D-二聚體(Ikeda et al.，Am.J.Cardiol.，1990，65，1693-1696)和活化的循環(huán)炎癥細(xì)胞，但是這些物質(zhì)的存在不能找出所涉及的病變的所在。導(dǎo)管中所含的溫度敏感性元素用于對(duì)斑定位，理論依據(jù)是炎癥過程和細(xì)胞增殖過程是放熱的過程，并且描述在例如美國(guó)專利No.4,986,671和美國(guó)專利No.4,752,141之中。血管造影照片反映了腔直徑，并且提供了具有極好分辨率的狹窄的測(cè)量方法，但是，它并不能對(duì)血管壁或者各種不同的組織病理學(xué)成分進(jìn)行成像。
現(xiàn)行的技術(shù)可典型地鑒定出動(dòng)脈粥樣硬化的某些形態(tài)學(xué)和/或功能參數(shù)，并且可提供與疾病相關(guān)的危險(xiǎn)的定性或半定量評(píng)估。然而，這些診斷方法是介入性的，并且只能產(chǎn)生很少的關(guān)于基礎(chǔ)病理生理，如斑的細(xì)胞組成，和斑中的每種成分在分子學(xué)水平上的生物學(xué)特征的信息。
氧化的LDL(oxLDL)與動(dòng)脈粥樣硬化的病理生物學(xué)關(guān)系密切。人們懷疑動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)集合是由于攝取了oxLDL而不是天然的LDL而造成的。OxLDL可以被巨噬細(xì)胞上的清除劑受體所識(shí)別；巨噬細(xì)胞攝取大量的oxLDL可導(dǎo)致泡沫細(xì)胞增加，泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的重要成分。LOX-1或凝集素樣氧化LDL受體最近被鑒別為內(nèi)皮細(xì)胞上的oxLDL受體。它介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞引起的oxLDL內(nèi)化，并且與巨噬細(xì)胞清除劑受體，諸如那些描述于WO 02/06771，(Sawamura，T.Nature 1997 38673-77)中的受體不同。LOX-1的氨基酸序列示于圖3中。LOX-1同樣在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并且在oxLDL識(shí)別/內(nèi)化在這些細(xì)胞中的過程中起主要作用(Yoshida，H.et al.，Biochem.J.19983349-13)。LOX-1在健康人類主動(dòng)脈樣品中幾乎不可測(cè)得，但是在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中可以測(cè)到，特別是用其他方法不能測(cè)到的早期病變中(Kataoka，H.et al.，Circulation 1999 993110-3117)可以測(cè)到。最近的工作顯示，oxLDL被LOX-1的識(shí)別是內(nèi)皮細(xì)胞粘附受體表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵的早期步驟。這些受體被認(rèn)為對(duì)吸引單核細(xì)胞到早期動(dòng)脈粥樣硬化斑中起重要的作用。LOX-1抗體被描述為可通過防止oxLDL結(jié)合于LOX-1而治療動(dòng)脈粥樣硬化(WO 01/64862)。
目前的成像劑和模型主要用于提供解剖學(xué)信息。這些信息典型的通過某種形式的可以提供高分辨率的造影劑而獲得。然而，基礎(chǔ)疾病狀況涉及生物化學(xué)過程，其使得疾病的進(jìn)程遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過表現(xiàn)出的物理癥狀。具有了對(duì)生化途徑或者途徑中的特異性標(biāo)記(生物標(biāo)記)成像的能力，在疾病早期過程中可提供有效的信息。因此我們需要一種非介入性的診斷或監(jiān)測(cè)各種心血管疾病(例如，動(dòng)脈粥樣硬化、易損斑塊、冠狀動(dòng)脈疾病、腎病、血栓形成、由凝血、中風(fēng)、心肌梗塞、器官移植、器官衰竭和高膽固醇血癥)的方法。非介入性的方法可獲得斑塊的基礎(chǔ)病理學(xué)信息，諸如斑塊的細(xì)胞組成和斑塊內(nèi)每種成分在分子學(xué)水平上的生物學(xué)特征。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了HSP或其與LOX-1結(jié)合的片段的用途，它們用于將試劑包括但不限于治療劑和產(chǎn)生信號(hào)的試劑內(nèi)化到細(xì)胞中。在另一實(shí)施方案中，HSP的LOX-1結(jié)合部分提供了有效的鑒定體內(nèi)炎癥并且對(duì)其進(jìn)行定位的方法，所述炎癥包括動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了使用HSP(LOX-1肽結(jié)合序列)以輔助診斷程序的方法。更具體地，化合物和組合物可用于檢測(cè)斑塊形成的方法中。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供使用LOX-1肽結(jié)合序列監(jiān)測(cè)人類和/或其他動(dòng)物疾病的治療方法，所述疾病由LOX-1的超量表達(dá)或提高的表達(dá)而導(dǎo)致。
本發(fā)明還提供了能夠體內(nèi)結(jié)合LOX-1的成像劑/分子，以使得能夠檢測(cè)LOX-1蛋白的表達(dá)，并因此能夠?qū)OX-1蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量。
除了成像的目的，化合物和組合物也可用作送遞生物學(xué)分子的機(jī)制，這對(duì)于具有高濃度LOX-1的區(qū)域諸如巨噬細(xì)胞或其他炎癥細(xì)胞是很有意義的。
本發(fā)明還提供了監(jiān)測(cè)治療炎性疾病諸如動(dòng)脈粥樣硬化的效力的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種確定LOX-1在疑似患有由LOX-1表達(dá)導(dǎo)致的疾病或病癥的哺乳動(dòng)物中的表達(dá)水平的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是HSP-70的N-末端同系物的氨基酸序列。
圖2是HSP-70的C-末端同系物的氨基酸序列。
圖3是人LOX-1的氨基酸序列。
圖4是式(I)化合物的L和SIG變異的圖示。
圖5是HSP-70的N-末端同系物的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
圖6是HSP-70的C-末端同系物的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I化合物(I)Y-(L)n-E，
其中Y是SIG或TA，其中SIG是信號(hào)部分，其提供可在體內(nèi)或體外被檢測(cè)到的信號(hào)，TA是治療劑；L是連接Y和E的連接基團(tuán)；E是結(jié)合部分，包括熱激蛋白或其與LOX-1結(jié)合的片段或變體；且n是0或1。
定義結(jié)合部分(E).
“結(jié)合部分”(E)是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人熱激蛋白，或其能夠與LOX-1結(jié)合的片段或變體。與已知的結(jié)合LOX-1的部分不同，本發(fā)明的結(jié)合部分設(shè)計(jì)為可以在人類體液(體內(nèi)或體外)存在下以足夠的特異性與LOX-1結(jié)合，使得可以區(qū)分健康組織與超量表達(dá)LOX-1的組織(例如，動(dòng)脈粥樣組織)。如此文所使用的，本發(fā)明的術(shù)語“結(jié)合LOX-1的熱激蛋白或其片段或變體”也可在整個(gè)申請(qǐng)中表示肽、肽序列、HSP肽、LOX-1結(jié)合肽或者結(jié)合肽。每一術(shù)語都可包括它的片段、融合肽、衍生物、變體和同系物。進(jìn)而，特定的參考諸如HSP-70或序列號(hào)1-5可作為示例性的天然物質(zhì)，同樣包括其片段、融合肽、衍生物、變體和同系物，用于特殊的參考。
在每一項(xiàng)實(shí)施方案中，熱激蛋白(配體)可以是全序列、或全序列的片段或同系物、或它的片段或變體。蛋白和肽的差別在于它們的大小。術(shù)語“肽”通常指的是含有少于100個(gè)氨基酸，分子量為約10,000Da的物質(zhì)。優(yōu)選的HSP肽含有少于30個(gè)氨基酸或分子量小于3500Da。與抗體或蛋白相比，此類小肽具有一些優(yōu)點(diǎn)。例如，它們可承受修飾或連接納米顆粒時(shí)的嚴(yán)酷化學(xué)條件；此外，這些顆粒的整體合成可簡(jiǎn)化，并易于控制。并且小肽也不容易是免疫原性的。此外，小肽通常在基礎(chǔ)的生物學(xué)過程中比其他類的分子普遍更為重要，并且在很多情況下，小肽與它們的受體的親和力要顯著高于抗體或其片段的親和力。優(yōu)選的，熱激蛋白是熱激蛋白70、或其全序列、片段或變體的片段、同系物。更為優(yōu)選的，HSP肽結(jié)合序列是HSP-70片段。更為優(yōu)選的，熱激蛋白70片段是30聚體或更短。所述片段含有30個(gè)或更少的氨基酸以提供更好的特異性、運(yùn)輸和/或清除性質(zhì)，優(yōu)選的，含有如下HSP-70的親水性部分。更優(yōu)選的，30聚體選自熱激蛋白70的第383-640號(hào)氨基酸。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，HSP-70可整體性使用，HSP-70的某些部分更易于與細(xì)胞表面受體相結(jié)合。在不變的狀態(tài)下，HSP-70將具有穩(wěn)定的三級(jí)構(gòu)象。然而，短鏈的寡聚物也許無法獲得穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，或者無法代表HSP的結(jié)合部分。因此，根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案，HSP的親水性部分可用于制備用于與LOX-1形成復(fù)合物的片段。親水性區(qū)域具有兩個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)(1)短鏈寡聚物的親水性性質(zhì)可以使其更為穩(wěn)定；(2)親水性結(jié)構(gòu)域最有可能負(fù)責(zé)細(xì)胞結(jié)合。結(jié)合部分可包括，例如·DAAKNQVALN PQNTVFDAKR LIGRKFGDPVVQSDMKHWPF(序列號(hào)1)。
·QVINDGDKPK VQVSYKGETK AFY(序列號(hào)2)。
·PEEISSM VLTKMKEIAE AYLGYPVT(序列號(hào)3)。
·D SQRQATKDAG VIAGLNVLRI INEPTAAAIA YGLDR(序列號(hào)4)。
·MGDKSENVQD LLLLDVAPLS LGLETAGGVM(序列號(hào)5)。
·KDNNLLGRFE LSGIPPAPGV PQIEVTFDID(序列號(hào)6)。
根據(jù)另一項(xiàng)實(shí)施方案，優(yōu)選使用序列號(hào)1-6的同源片段或序列號(hào)1-6的較大片段。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，由于HSPs，例如HSP-70的高度保守性質(zhì)，人們可以使用其他的HSPs。更具體地，優(yōu)選使用來自與HSP-70的結(jié)合區(qū)域具有高同源性的其他HSPs的序列。進(jìn)而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)N-末端同源片段優(yōu)于C-末端同源片段，因?yàn)橥唇Y(jié)構(gòu)顯示，與C-末端部分相比，N-末端部分具有更多親水性的結(jié)構(gòu)域。
二級(jí)結(jié)構(gòu)分析法顯示，N-末端同源片段主要是由α-螺旋組成的，而C-末端同源片段主要是由β-折疊組成的。其他優(yōu)選的片段可通過3-D建模和表面性質(zhì)諸如靜電學(xué)和疏水性確定。
例如，具有實(shí)驗(yàn)性確定的結(jié)構(gòu)的同源蛋白從公共結(jié)構(gòu)域中鑒定出來，特別是蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中鑒定出來，它的序列顯示出與LOX-1具有最高的同源性。PBD結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的phi-psi BLAST檢索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)可用于鑒定同源模板。然后，從蛋白數(shù)據(jù)庫中還可以獲得晶體結(jié)構(gòu)。
此外，以下結(jié)構(gòu)信息有助于確定有用的序列和其中的氨基酸取代。以下信息是基于1HJO(人類)的HSP片段的信息，這些在www.pdb.org中由有進(jìn)一步的描述。
1.β-折疊A氨基酸7-ILE至氨基酸28-ILE氨基酸141-ASN至氨基酸146-VAL氨基酸168-ASN至氨基酸174-ASN2.β-折疊B氨基酸42-VAL至氨基酸51-ILE3.螺旋1氨基酸53-ASP至氨基酸61-LEU4.螺旋2氨基酸63-PRO至氨基酸65-ASN5.螺旋3氨基酸70-ALA至氨基酸73-LEU6.螺旋4氨基酸81-PRO至氨基酸89-HIS7.β-折疊C氨基酸93-GLN至氨基酸115-TYR8.螺旋5氨基酸116-PRO至氨基酸135-LEU
9.螺旋6氨基酸152-ASP至氨基酸164-ILE10.螺旋7氨基酸175-GLU至氨基酸182-ALA11.螺旋8氨基酸230-GLY至氨基酸248-LYS12.β-折疊D氨基酸192-GLU至氨基酸337-VAL13.螺旋9氨基酸257-LYS至氨基酸275-SER14.β-折疊E氨基酸279-GLN至氨基酸298-THR15.螺旋10氨基酸299-ARG至氨基酸323-ASP16.螺旋11氨基酸328-LYS至氨基酸330-GLN17.螺旋12氨基酸339-GLY至氨基酸342-ARG18.螺旋13氨基酸344-PRO至氨基酸353-PHE19.螺旋14氨基酸368-ALA至氨基酸380-LEU。
使用此文中描述的這些參數(shù)和方法，可以合成某些HSP片段。其他的變體包括設(shè)計(jì)成可產(chǎn)生新的糖基化和/或磷酸化位點(diǎn)的那些、或者設(shè)計(jì)成除去已有糖基化和/或磷酸化位點(diǎn)的那些。變體中在糖基化位點(diǎn)、蛋白水解裂解位點(diǎn)和/或半胱氨酸殘基上包括至少一個(gè)氨基酸取代。變體同樣還包括在連接肽的目標(biāo)氨基酸序列前后位置的其他氨基酸殘基的肽。例如，半胱氨酸殘基可加在目標(biāo)氨基酸序列的氨基或羧基末端上，用于通過形成二硫鍵而使目標(biāo)氨基酸序列環(huán)化。術(shù)語“變體”還包括具有目標(biāo)氨基酸的那些，其具有至少一個(gè)，最多25個(gè)側(cè)翼于目標(biāo)氨基酸的3’或5’末端的額外的氨基酸。
本發(fā)明的HSP蛋白和肽可以是天然或合成來源的。天然蛋白和肽可以從動(dòng)物來源中分離。如此文所用的，“分離”的HSP可指的是從原始環(huán)境(例如，材料存在的天然環(huán)境)中取出的材料，由此是從天然環(huán)境中“經(jīng)人工改造”。分離的材料可進(jìn)一步包含分離的HSP肽結(jié)合序列，或者特別是HSP70片段結(jié)合序列。
術(shù)語“片段”指的是由目標(biāo)氨基酸的連續(xù)亞序列組成的肽或多肽，包括諸如剪接變體和由體內(nèi)蛋白酶活性導(dǎo)致的天然存在產(chǎn)生的片段。所述片段可在氨基末端、羧基末端和/或內(nèi)部截短(諸如天然剪接)。所述片段可以通過氨基酸末端甲硫氨酸制備也可不通過其制備。適宜的本發(fā)明HSP片段含有3-100個(gè)氨基酸，優(yōu)選4-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選的是5-30個(gè)氨基酸。
術(shù)語“變體”指的是這樣的蛋白或多肽其中與目標(biāo)氨基酸序列相比，存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入，并且包括天然存在的等位基因變體或可變剪接變體。術(shù)語“變體”包括將肽序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸用相同或同源氨基酸或不相似氨基酸置換。存在很多可以將氨基酸劃分為相似或同源的標(biāo)準(zhǔn)(Gunnar von Heijne，SequenceAnalysis in Molecular Biology，p.123-39(Academic Press，New York，NY 1987.)。優(yōu)選的變體包括在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上的丙氨酸取代。其他優(yōu)選的取代基包括對(duì)蛋白的總體凈電荷、極性或疏水性幾乎沒有作用或者作用很小的保守性取代。保守取代如下表1中所示。
表1保守氨基酸取代基
表2列出了其他的氨基酸取代方案表2原始?xì)埢? 取代AlaGly；SerArgLysAsnGln；His
AspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyAla；ProHisAsn；GlnIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；Gln；GluMetLeu；Tyr；IlePheMet；Leu；TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp；PheValIle；Leu其他的變體可由不十分保守的氨基酸取代組成，諸如選擇在維持以下方面的作用更顯著不同的殘基(a)取代區(qū)域中的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，作為折疊或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)的分子的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈體積。通常預(yù)期對(duì)功能具有更為顯著的影響的取代基是以下這些，其中(a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一取代基取代或缺失或插入；(b)親水性殘基，例如，絲氨?；蛱K氨酰基取代了疏水性殘基，或被取代為疏水性殘基，疏水性取代基例如是，亮氨?；?、異亮氨?；?、苯丙氨酰基、纈氨?；?、或丙氨?；?；(c)半胱氨酸殘基取代了其他殘基或被其他殘基取代；(d)具有正電性側(cè)鏈的殘基，例如，賴氨?；⒕滨；⒒蚪M氨?；〈素?fù)電性的殘基，例如，谷氨?；蛱於；?，或被負(fù)電性殘基取代；或(e)具有大側(cè)鏈的殘基，例如苯丙氨酸，取代了不具有所述側(cè)鏈的殘基如甘氨酸，或被甘氨酸取代。
多肽及其變體術(shù)語“多肽”包括蛋白、肽及其片段(功能性的或非功能性的)，其由HSP核苷酸編碼。術(shù)語“衍生物”指的是被化學(xué)修飾或者天然過程修飾的蛋白或多肽，所述修飾通過天然過程如加工以及其它翻譯后修飾，也可以通過化學(xué)修飾技術(shù)，諸如加入一種或多種聚乙二醇分子、糖、磷酸鹽或者其它這類分子，所述分子天然不與如此衍生的野生型氨基酸連接。衍生物包括鹽類。所述化學(xué)修飾物在教科書、論文、以及大量研究論著中有詳細(xì)記載，都是本領(lǐng)域公知的技術(shù)。可以理解，在蛋白或多肽上可在一些位點(diǎn)上進(jìn)行相同或不同程度的同樣類型的修飾。
此外，給定蛋白或多肽可含有多種類型的修飾。修飾可以替代蛋白和多肽中的任何位置，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈、以及氨基或羧基末端。修飾包括，例如乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)連接、亞鐵血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸鹽、甲?；?、γ-羧化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、消旋、糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP-核糖基化、硒基化、硫酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白的添加，諸如精氨?；捅樵诘鞍谆?。PROTEINS--STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York(1993)and Wold，F(xiàn).，Posttranslational ProteinModificationsPerspectives and Prospects，pgs.1-12 in PosttranslationalCovalent Modification Of Proteins，H.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)；Seifter et al.，Meth.Enzymol.182626-646(1990)andRattan et al.，Protein SynthesisPosttranslational Modifications andAging，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62(1992)。術(shù)語“衍生物”還包括導(dǎo)致蛋白或多肽成為支鏈或含支鏈或不含支鏈的環(huán)狀化合物的化學(xué)修飾型。環(huán)狀、支鏈的和支鏈環(huán)狀的蛋白或者多肽可從天然的翻譯后加工步驟中得到，也可以通過完全合成的方法獲得。
術(shù)語“同系物”指的是和目標(biāo)氨基酸序列相比，至少60％的氨基酸序列是相同的蛋白，可以通過通常用于比較兩種多肽的氨基酸位置的相似性的常用標(biāo)準(zhǔn)方法來確定。兩種蛋白之間的相似性或同一性程度可以通過已知方法方便地計(jì)算出來，包括但不限于以下文獻(xiàn)所描述的那些COMPUTATIONALMOLECULARBIOLOGY，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；BiocomputingInformatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo H.and Lipman，D.，SIAM，J.Applied Math.，481073(1988)。優(yōu)選的確定同一性的方法設(shè)計(jì)為提供測(cè)試序列之間的最大匹配。確定同一性和相似性的方法編制在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中。
優(yōu)選的確定兩種序列之間的同一性和相似度的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN，and FASTA，Atschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)。BLAST X程序可以從NCBI和其它來源獲得(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。例如，通過使用一種計(jì)算機(jī)算法諸如GAP(Genetic ComputerGroup，University of Wisconsin，Madison，Wis.)，對(duì)要確定序列同一性百分比的兩種蛋白或多肽進(jìn)行比對(duì)，以得到它們各自氨基酸的最優(yōu)匹配(“匹配跨度”，通過算法確定)。
與算法結(jié)合使用空位開放罰分(計(jì)算方式是3×(乘)平均對(duì)角線；″平均對(duì)角線″是使用的比較矩陣的對(duì)角線平均值；″對(duì)角線″指的是通過特定比較矩陣給每個(gè)完美氨基酸匹配賦予的評(píng)分或數(shù)目)和空位延伸罰分(通常是空位開放罰分的1/10倍)，以及比較矩陣諸如PAM 250或BLOSUM 62。算法也可以使用標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(對(duì)于PAM250比較矩陣，參見Dayhoff et al.Atlas of Protein Sequence and Structure，vol.5，supp.3；對(duì)于BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，8910915-10919)。然后可通過算法計(jì)算出同一性百分比。與比較目標(biāo)氨基酸相比，同系物典型具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代基、缺失和/或插入。
術(shù)語“肽模擬物”或“模擬物”指的是模擬肽或蛋白的生物活性的生物活性化合物，但在化學(xué)性質(zhì)上并非是肽，也就是說，它們不含有任何肽鍵(即氨基酸之間的酰胺鍵)。此處的術(shù)語肽模擬物是廣義的含意，包括在性質(zhì)上不完全是肽的分子，諸如擬肽、半肽和類肽。廣義肽模擬物(肽的一部份被缺乏肽鍵的結(jié)構(gòu)所替代)的例子如下所述。本發(fā)明的完全或部分非肽的肽模擬物提供了反應(yīng)性化學(xué)部分的空間排列，這些部分非常類似于目標(biāo)肽中活性基團(tuán)的三維排列，所述肽模擬物基于所述目標(biāo)肽。作為該相似活性位點(diǎn)幾何學(xué)的結(jié)果，肽模擬物對(duì)生物系統(tǒng)具有作用，該作用與目標(biāo)肽的生物活性相似。
本發(fā)明肽模擬物優(yōu)選基本上在三維形狀和生物學(xué)活性上都與此處描述的目標(biāo)肽相似。本領(lǐng)域公知的結(jié)構(gòu)上修飾肽以制造肽模擬物的方法的例子包括逆轉(zhuǎn)主鏈上的手性中心以生成D-氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，其(特別是在N-末端上)可促進(jìn)對(duì)抗蛋白水性降解的穩(wěn)定性，而不會(huì)不利地影響活性。提供的一個(gè)例子描述于“Tritriated D-ala1-Peptide TBinding”，Smith C.S.et al.，Drug Development Res.，15，pp.371-379(1988)。第二個(gè)方法是改變環(huán)狀結(jié)構(gòu)以獲得穩(wěn)定態(tài)，諸如N至C鏈之間的亞酰胺和內(nèi)酰胺(Ede et al.in Smith and Rivier(Eds.)“PeptidesChemistry and Biology”，Escom，Leiden(1991)，pp.268-270)。另一個(gè)例子是關(guān)于構(gòu)象受到限定的胸腺五肽樣化合物，諸如記載于美國(guó)專利號(hào)4,457,489(1985)之中的那些。第三個(gè)方法是通過使用賦予對(duì)蛋白水解的抗性的擬肽鍵取代目標(biāo)肽中的肽鍵。
許多擬肽鍵是被這樣描述的，其通常不會(huì)影響肽結(jié)構(gòu)和生物活性。該方法的一個(gè)例子是取代逆向-反向擬肽鍵(“Biologically activeretroinverso analogues of thymopentin”，Sisto A.et al in Rivier，J.E.and Marshall，G.R.(eds)“Peptides，Chemistry，Structure and Biology”，Escom，Leiden(1990)，pp.722-773)和Dalpozzo，et al.(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41561-566，在此引入作為參考)。根據(jù)此修飾，肽的氨基酸序列可以與目標(biāo)氨基酸序列的序列一致，除了有一個(gè)或多個(gè)肽鍵被逆向-反向擬肽鍵取代。優(yōu)選的，大部分的N-末端肽鍵被取代，因?yàn)檫@種取代可賦予對(duì)在N-末端起作用的外肽酶的蛋白水解的抗性。進(jìn)一步的修飾也可通過用其他具有相似結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團(tuán)置換氨基酸的化學(xué)基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)。其他適宜的已知的可促進(jìn)對(duì)酶裂解的穩(wěn)定性而不喪失或基本不喪失生物學(xué)活性的合適擬肽是減少的等構(gòu)物擬肽鍵(Couder，et al.(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41181-184，此處以其整體引入作為參考)。
由此，這些肽的氨基酸序列可以與目標(biāo)氨基酸的序列相一致，除了一個(gè)或多個(gè)肽鍵被等構(gòu)物擬肽鍵取代。優(yōu)選的，大部分N-末端肽鍵被取代，因?yàn)檫@種取代可以賦予對(duì)在N-末端起作用的外肽酶的蛋白水解的抗性。合成具有一個(gè)或多個(gè)減少的等構(gòu)物肽鍵的肽的方法是本領(lǐng)域已知的[Couder，et al.(1993)，如上文的引用]。其他的例子包括導(dǎo)入酮亞甲基或甲基硫化物鍵以替換肽鍵。
類肽衍生物代表另一類的肽模擬物，其保留了生物活性的結(jié)構(gòu)簇，但是除去了肽鍵，因此具有蛋白水解抗性(Simon，et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，899367-9371在此處以全文引入)。類肽是N-取代的甘氨酸的寡聚物。已經(jīng)描述了一系列的N-烷基，每一個(gè)都相應(yīng)于對(duì)應(yīng)天然氨基酸的側(cè)鏈(Simon，et al.(1992)，如上文的引用)。目標(biāo)分子的一些或全部氨基酸都可用相應(yīng)于取代的氨基酸的N-取代的甘氨酸來取代。
術(shù)語“肽模擬物”或“模擬物”也包括反向-D肽和對(duì)映異構(gòu)體。術(shù)語“反向-D肽”指的是與目標(biāo)肽的L-氨基酸序列相比，由反向順序排列的D-氨基酸組成的生物活性蛋白或肽。術(shù)語“對(duì)映異構(gòu)體”指的是目標(biāo)肽的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)L-氨基酸殘基被相應(yīng)的D-氨基酸殘基取代的、具有生物活性的蛋白或肽。
已經(jīng)分離了各種LOX-1，并且對(duì)它們進(jìn)行了測(cè)序，顯示出它們?cè)谖锓N之間有顯著的不同[Chen，M.，et al.，J.Biochem.，355289-95(2001)]。美國(guó)專利號(hào)5,962,260和6,197,937公開了人和牛LOX-1的氨基酸序列。使用在這些文獻(xiàn)中公開的技術(shù)從任何物種分離出LOX-1，可以很容易建立起HSP肽(E)與LOX-1的結(jié)合。
由此，結(jié)合部分(E)可以通過已知技術(shù)(典型的為分離或合成)獲得，條件是已知LOX-1多肽的氨基酸序列。只與LOX-1的特定部位相結(jié)合的部分(E)同樣只能在得到已知和/或預(yù)期的抗原決定簇或表位結(jié)合位點(diǎn)的條件下合成。
可以有很多方法來篩選或評(píng)估不同E基團(tuán)的親和力。例如，一個(gè)方法包括基于熒光的體外試驗(yàn)。基于細(xì)胞的測(cè)定可同時(shí)提供關(guān)于檢測(cè)所需的產(chǎn)生信號(hào)的實(shí)體的量，因此需要與結(jié)合部分(E)綴合。在所述試驗(yàn)中，熒光染料優(yōu)選通過柔性連接體與HSP肽的N-末端連接，所述連接體諸如氨基酸序列KKGG(K＝賴氨酸，G＝甘氨酸)。在N-末端與沒有其他用于連接染料的功能末端的信號(hào)部分連接的情況下，染料也可以通過摻入序列中的K殘基(如連接體)的側(cè)鏈酰胺進(jìn)行連接。
無論使用的篩選測(cè)定(例如，遺傳性體外模型)的種類如何，首先需假定LOX-1在基質(zhì)表面上的量是已知的，無論其為細(xì)胞或其他基質(zhì)。在一個(gè)多孔透明平板上，LOX-1(可作為純的LOX-1蛋白或在細(xì)胞上表達(dá))可均勻分布于孔中。然后加入被標(biāo)記的HSP肽，并以最優(yōu)的時(shí)間量在不同的孔中進(jìn)行溫育。這些孔之后用緩沖液進(jìn)行充分洗滌，緩沖液可諸如磷酸緩沖鹽水(PBS)，然后對(duì)平板進(jìn)行成像，用激光照射以激發(fā)和產(chǎn)生所連接的染料的熒光。每一孔中產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，以及不同肽的結(jié)合程度都可以定量化。為了獲得絕對(duì)結(jié)合數(shù)，通過在結(jié)合測(cè)定的相似條件下獲得已知量的染料綴合的HSP肽的熒光強(qiáng)度而進(jìn)一步校準(zhǔn)信號(hào)。如果LOX-1分子的數(shù)量是已知的，并且確定了結(jié)合的肽的量，用以評(píng)價(jià)結(jié)合親和力的解離常數(shù)也可以計(jì)算出來。因此，可以定量篩選不同的HSP肽，得到其結(jié)合親和力。每個(gè)細(xì)胞中結(jié)合的肽的數(shù)量也可提供關(guān)于參數(shù)的信息，所述參數(shù)是從綴合于肽的產(chǎn)生信號(hào)的實(shí)體獲得可檢測(cè)信號(hào)所必須的。
可以通過使用激光共焦顯微鏡或成像儀來獲得測(cè)定中的圖像。例如，可以按照以下步驟，用激光共焦顯微鏡獲得與細(xì)胞結(jié)合的肽的圖像HCAE細(xì)胞可以在高質(zhì)量硅酸硼8-隔室載玻片(ElectronMicroscopy Sciences，F(xiàn)ort Washington，PA)上生長(zhǎng)。然后，向細(xì)胞中加入約為10μL的1mg/ml的標(biāo)記肽的水溶液，溫育1小時(shí)。然后，優(yōu)選用HBSS緩沖液洗滌細(xì)胞3次。然后細(xì)胞用4％甲醛溶液固定10分鐘。在最后一次用緩沖液洗滌后，對(duì)載玻片進(jìn)行成像。優(yōu)選使用OLYMPUS激光掃描共焦顯微鏡、型號(hào)Fluoview 300，使用氬-離子激光(選擇488nm光線)和510-nm長(zhǎng)徑濾光器獲得圖像?？赏ㄟ^兩種通道獲得圖像反射光和熒光模式通道，或者兩種都采用。進(jìn)一步，可以使用，例如共焦顯微鏡來研究?jī)?nèi)化水平。共焦顯微鏡具有三維掃描能力，由此可探測(cè)到細(xì)胞內(nèi)部以及跨細(xì)胞-表面的平面。由此，可以檢測(cè)到熒光劑是否被內(nèi)化到細(xì)胞中。
為了進(jìn)行更高流通量的篩選，可以擴(kuò)展上述方法用96-孔板替代8-孔載玻片，并且用Biorad成像儀，型號(hào)FX Proplus替換共焦顯微鏡。例如，熒光素標(biāo)記的與細(xì)胞結(jié)合的HSP的圖像可以使用成像儀獲得，其中的HCAE細(xì)胞可以在標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)96-孔板(Becton-Dickenson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)上鋪板并生長(zhǎng)。然后，向細(xì)胞中加入約10μL的1mg/ml的標(biāo)記的HSP水溶液，并溫育1小時(shí)。然后，優(yōu)選用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次。在最后一次使用緩沖液洗滌之后，載玻片使用Biorad成像儀進(jìn)行成像，其選擇“熒光素”作為熒光團(tuán)。
信號(hào)部分(SIG)“信號(hào)部分”SIG提供可在體內(nèi)或體外被檢測(cè)到的信號(hào)。SIG可以通過自身或者通過與另一種物質(zhì)反應(yīng)而成像，并且可以通過檢測(cè)裝置在體內(nèi)或體外被檢測(cè)到。適宜的信號(hào)部分(SIG)包括發(fā)光染料、放射性核素、近紅外染料、磁活性同位素、超順磁顆粒、Z值大于50的金屬離子、包封的物質(zhì)諸如膠束、脂質(zhì)體、聚核糖體、氣體填充的微泡以及它們的組合。任何信號(hào)部分/來源都可使用，只要其能與結(jié)合部分(E)相結(jié)合并不會(huì)破壞E和LOX-1的結(jié)合，同時(shí)能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
適宜體內(nèi)成像的SIG部分包括·作為用于單光子發(fā)射計(jì)算體層攝影(SPECT)成像的γ發(fā)射體的放射性核素；·作為用于正電子發(fā)射體層攝影(PET)的正電子發(fā)射體的放射性核素；·染料，其可以是用于光學(xué)成像的熒光或化學(xué)發(fā)光染料；·含高-Z元素，優(yōu)選碘或鉍的分子，用于X-射線成像、計(jì)算機(jī)體層攝影(CT)；·用于超聲檢查法的氣體填充的微泡、氟碳化合物填充的膠束；·用于核磁共振成像(MRI)的順磁離子，諸如螯合的Gd+++，或超順磁顆粒，諸如超順磁氧化鐵納米顆粒(SPIO)；或者·納米顆粒級(jí)超順磁顆粒，優(yōu)選含有氧化鐵和鐵元素中至少一種的納米顆粒。
優(yōu)選的SIG基團(tuán)適宜體內(nèi)成像。所述SIG基團(tuán)可以在哺乳動(dòng)物體外檢測(cè)，或者通過使用專為體內(nèi)使用設(shè)計(jì)的檢測(cè)器，例如血管內(nèi)輻射或光學(xué)檢測(cè)器諸如內(nèi)窺鏡檢測(cè)，或者使用設(shè)計(jì)用于手術(shù)中使用的輻射探測(cè)器而進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)選的體內(nèi)SIG基團(tuán)是那些可以在體內(nèi)給予之后以非介入性方式進(jìn)行外部檢測(cè)的基團(tuán)。最優(yōu)選的適于體內(nèi)成像的SIG基團(tuán)是放射性的、特別是放射性金屬離子、發(fā)射γ射線的放射性鹵素和發(fā)射正電子的放射性非金屬，特別是那些適于使用SPECT或PET成像的基團(tuán)。
適于體內(nèi)成像的SIG最優(yōu)選地選自(i)放射性金屬離子；(ii)順磁金屬離子；(iii)發(fā)射γ射線的放射性鹵素；(iv)發(fā)射正電子的放射性非金屬；(v)超極化的NMR-活性原子核；(vi)適于體內(nèi)光學(xué)成像的報(bào)道物；(vii)適于血管內(nèi)檢測(cè)的β-發(fā)射體。
當(dāng)SIG是放射性金屬離子，也即射電金屬時(shí)，適宜的射電金屬可以是正電子發(fā)射體諸如64Cu、48V、52Fe、55Co、94mTc或68Ga；或者是γ-發(fā)射體諸如99mTc、111In、113mIn或67Ga。優(yōu)選的射電金屬是99mTc、64Cu、68Ga和111In。最優(yōu)選的射電金屬是γ-發(fā)射體，特別是99mTc。
當(dāng)SIG是順磁金屬離子時(shí)，適宜的所述金屬離子包括Gd(III)、Mn(II)、Cu(II)、Cr(III)、Fe(III)、Co(II)、Er(II)、Ni(II)、Eu(III)或Dy(III)。優(yōu)選的順磁金屬離子是Gd(III)、Mn(II)和Fe(III)，特別優(yōu)選的是Gd(III)。
當(dāng)SIG是發(fā)射γ射線的放射性鹵素時(shí)，放射性鹵素適宜選自123I、131I或77Br。優(yōu)選的發(fā)射γ射線的放射性鹵素是123I。
當(dāng)SIG是發(fā)射正電子的放射性非金屬時(shí)，所述適宜的正電子發(fā)射體包括11C、13N、15O、17F、18F、75Br、76Br或124I。優(yōu)選的發(fā)射正電子的放射性非金屬是11C、13N、18F和124I，特別優(yōu)選的是11C和18F，最優(yōu)選的是18F。
當(dāng)SIG是超極化NMR-活性原子核時(shí)，所述NMR-活性原子核具有非-零核自旋，且包括13C、15N、19F、29Si和31P。其中優(yōu)選的是13C。術(shù)語“超極化”指的增強(qiáng)NMR-活性原子核的極化程度，超過其平衡極化。在超極化之前，13C(相對(duì)于12C)的天然豐度約為1％，適宜的13C-標(biāo)記化合物適宜地富集至豐度至少為5％，優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少90％。式(I)化合物的至少一個(gè)碳原子適宜地富含13C，其隨后進(jìn)行超極化。
當(dāng)SIG是適于體內(nèi)光學(xué)成像的報(bào)道物時(shí)，此報(bào)道物可以是任何可直接或間接在光學(xué)成像過程中被檢測(cè)到的部分。報(bào)道物可以是光散射體(例如，有色或無色顆粒)、光吸收劑或光發(fā)射體。更為優(yōu)選地，報(bào)道物是一種諸如發(fā)色團(tuán)或熒光化合物的染料。該染料可以是任何的可干擾波長(zhǎng)從紫外線到近紅外線的電磁譜中的光的染料。最優(yōu)選地，報(bào)道物具有熒光性質(zhì)。
優(yōu)選的有機(jī)發(fā)色報(bào)道物和熒光報(bào)道物包括具有廣泛非定域電子系統(tǒng)，如花青、部花青、靛青、酞青、naphthalocyanines、三苯基次甲基染料、卟啉、pyrilium染料、thiapyriliup染料、squarylium染料、croconium染料、azulenium染料、indoanilines、benzophenoxazinium染料、benzothiaphenothiazinium染料、蒽醌、萘醌、陰丹士林、phthaloylacridones、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子內(nèi)和分子間電荷轉(zhuǎn)移染料和染料復(fù)合物、芳庚酮、四嗪、二(dithiolene)復(fù)合物、二(苯-二硫醇鹽)復(fù)合物、iodoaniline染料、二(S，O-dithiolene)復(fù)合物。也可以使用熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白(GFP)和GFP的修飾形式具有不同的吸收/發(fā)射性質(zhì)。在某些上下文中，某些稀土金屬(例如，銪、釤、鋱或鏑)的復(fù)合物可作為熒光納米晶體使用(量子點(diǎn))。
所使用的發(fā)色團(tuán)的特定的例子包括熒光素、磺基若丹明101(Texas Red)、若丹明B、若丹明6G、若丹明19、靛氰綠、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Marina Blue、Pacific Blue、Oregon Green88、Oregon Green 514、tetramethylrhodamine、和Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750。
特別優(yōu)選的是在400nm和3μm之間，特別是600和1300nm之間的可見光和近紅外區(qū)域具有最大吸收值的染料。
光學(xué)成像模式和測(cè)定技術(shù)包括但不限于發(fā)光成像；內(nèi)窺鏡檢查；熒光內(nèi)窺鏡檢查；光學(xué)相干體層攝影；透射成像；時(shí)間分辨透射成像；共焦成像；非線性顯微鏡檢查法；光聲成像；聲光成像；光譜法；反射光譜法；干涉測(cè)量法；相干干涉測(cè)量法；漫射光學(xué)體層攝影術(shù)和熒光介導(dǎo)的漫射光學(xué)體層攝影術(shù)(連續(xù)波長(zhǎng)、時(shí)間域和頻率域系統(tǒng))以及光散射、吸收、極化、發(fā)光、熒光時(shí)間、量子產(chǎn)量和猝滅的測(cè)量。
當(dāng)成像部分是適于血管內(nèi)檢測(cè)的β-發(fā)射體時(shí)，適宜的所述β-發(fā)射體包括射電金屬67Cu、89Sr、90Y、153Sm、186Re、188Re或192Ir和非金屬32P、33P、38S、38Cl、39Cl、82Br和83Br。
特別優(yōu)選的信號(hào)部分包括熒光素、11C、18F、52Fe，62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、131I、154-158Gd和175Lu、超順磁氧化鐵納米顆粒、重金屬離子、氣體填充的微泡、光學(xué)染料、卟啉、texaphyrins、它們的高度碘化的有機(jī)化合物螯合物、含有前述至少一種成分的聚合物、含有至少一種前述成分的endoedral fullerenes，以及它們的混合物。甚至更優(yōu)選的，信號(hào)部分對(duì)于PET是18F；對(duì)于MRI是超順磁氧化鐵納米顆粒(SPIO)或螯合的Gd、對(duì)于X-射線CT是碘，對(duì)于SPECT是99mTc。在體內(nèi)成像的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，SIG是選自18F、11C、68Ga和64Cu(用于PET)的發(fā)射正電子的放射性同位素，或者是選自123I和99mTc(用于SPECT)的γ發(fā)射放射性同位素。最優(yōu)選的，信號(hào)部分對(duì)于PET是18F。
可通過本領(lǐng)域公知的方法導(dǎo)入SIG。放射性SIG基團(tuán)可通過對(duì)適宜前體進(jìn)行放射性標(biāo)記而很容易地導(dǎo)入?！扒绑w”適宜地含有結(jié)合部分E的非放射性衍生物，其設(shè)計(jì)使得與所需的非金屬放射性同位素的方便的化學(xué)形式的化學(xué)反應(yīng)可以通過寥寥幾步便可實(shí)施(理想狀態(tài)只需一步)，而不需要顯著的純化(理想狀態(tài)不需要進(jìn)一步的純化)以獲得所需的放射性產(chǎn)物。所述前體是合成的并且可以便利地以良好的化學(xué)純度獲得?！扒绑w”可任選含有用于HSP肽的某些官能團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)(PGP)。適宜的前體描述于Bolton，J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)。
術(shù)語“保護(hù)基團(tuán)”(PGP)指的是一種抑制或阻抑不希望的化學(xué)反應(yīng)的基團(tuán)，但是又設(shè)計(jì)為在不會(huì)引起分子其他部分發(fā)生改變的溫和條件下能從目的官能團(tuán)脫去的基團(tuán)。在脫保護(hù)基后可獲得所需的產(chǎn)物。保護(hù)基團(tuán)是本領(lǐng)域中公知的，并且對(duì)于胺基團(tuán)，可以適宜地選自Boc(Boc是叔-丁氧羰基)、Fmoc(Fmoc是芴基甲氧羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde[即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧環(huán)亞己基)乙基]或Npys(即3-硝基-2-吡啶亞磺酰)；對(duì)于羰基，保護(hù)基團(tuán)適宜地選自甲基酯、叔-丁基酯或芐基酯。對(duì)于羥基而言，適宜的保護(hù)基團(tuán)是甲基、乙基或叔-丁基；烷氧基甲基或烷氧基乙基；芐基；乙?；槐郊柞；蝗郊谆?Trt)或三烷基甲硅烷基諸如四丁基二甲基甲硅烷基。對(duì)于巰基而言，適宜的保護(hù)基團(tuán)是三苯甲基和4-甲氧芐基。其他保護(hù)基團(tuán)的使用描述于‘Protective Groups in Organic Synthesis’，Theorodora W.Greene and Peter G.M.Wuts，(Third Edition，John Wiley & Sons，1999)。
用非金屬放射性同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記的優(yōu)選前體是包括衍生物的那些，所述衍生物進(jìn)行親電或親核鹵化反應(yīng)；用選自鹵代烷基或鹵代氟化烷基、甲苯磺酸鹽/酯、triflate(如三氟甲磺酸鹽/酯)或甲磺酸鹽/酯進(jìn)行溫和烷基化；使硫醇部分烷基化，以形成硫醚鍵；或者與標(biāo)記的醛或酮進(jìn)行縮合。第一類所述物質(zhì)的例子是(a)有機(jī)金屬衍生物諸如三烷基錫烷(例如，三甲基錫烷基或三丁基錫烷基)、或者三烷基硅烷(例如，三甲基甲硅烷基)；(b)用于鹵素交換的非放射性碘代烷基或溴代烷基和用于親核鹵化反應(yīng)的甲苯磺酸烷酯、甲磺酸烷酯或三氟甲磺酸烷酯；(c)向親電鹵化反應(yīng)活化的芳環(huán)(例如，酚類)和向親核鹵化反應(yīng)活化的芳環(huán)(例如，芳基碘，芳基重氮、芳基三烷基銨鹽或硝基芳基衍生物)。
溫和烷基化的優(yōu)選的衍生物是醇、酚或胺基團(tuán)，特別是酚和空間無位阻的伯胺或仲胺。
使含有硫醇的放射性同位素反應(yīng)試劑烷基化的優(yōu)選衍生物是N-鹵代乙?；鶊F(tuán)，尤其是N-氯乙?；蚇-溴乙?；苌铩?br> “前體”可任選共價(jià)結(jié)合于固體支持基質(zhì)。通過這種方式，所需成像劑產(chǎn)品在溶液中形成，其中起始原料和雜質(zhì)仍結(jié)合在固體相中。用18F-氟化物進(jìn)行固相親電氟化作用的前體描述于WO 03/002489中。用18F-氟化物進(jìn)行固相親核氟化作用的前體描述于WO 03/002157。
當(dāng)SIG是放射性鹵素諸如碘時(shí)，前體適宜地包括非放射性鹵素原子諸如碘代芳基或溴代芳基(以進(jìn)行放射性碘交換)；活化的前體芳環(huán)(如酚基團(tuán))；有機(jī)金屬化合物(例如，三烷基錫或三烷基甲硅烷基)；或有機(jī)前體諸如三氮烯或親核取代的良好離去基團(tuán)，諸如碘鹽。導(dǎo)入放射性鹵素(包括123I和18F)的方法記載于Bolton[J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)]。適宜的與放射性鹵素，特別是碘連接的前體芳基的例子如下所示 它們都含有可允許放射性碘溫和取代到芳環(huán)上的取代基。另外可選的含有放射性碘的取代基可以通過放射性鹵素交換而直接碘化合成，例如 當(dāng)SIG是碘的放射性同位素時(shí)，放射性碘原子優(yōu)選通過直接共價(jià)鍵連接到芳環(huán)諸如苯環(huán)或乙烯基上，因?yàn)槿藗児庠右子谠隗w內(nèi)代謝中連接到飽和脂族系統(tǒng)上，由此喪失了放射性碘。
當(dāng)SIG是氟的放射性同位素時(shí)，放射性氟原子可以形成氟代烷基或氟代烷氧基的一部份，因?yàn)榉榛傻挚贵w內(nèi)代謝。另外，放射性氟原子可通過直接共價(jià)鍵連接到芳環(huán)諸如苯環(huán)上。放射性氟化作用可通過直接標(biāo)記法進(jìn)行，其中采用了18F-氟化物與適宜的具有良好離去基團(tuán)諸如溴代烷基、甲磺酸烷酯或甲苯磺酸烷酯的前體的反應(yīng)。18F也可通過用烷化劑諸如18F(CH2)3OMs(其中Ms是甲磺酸鹽/酯)對(duì)胺前體進(jìn)行N-烷基化得到N-(CH2)318F，或用18F(CH2)3Oms或18F(CH2)3Br對(duì)羥基進(jìn)行O-烷基化而導(dǎo)入的。18F還可通過用18F(CH2)3OH試劑對(duì)N-鹵乙?；鶊F(tuán)進(jìn)行烷基化以獲得-NH(CO)CH2O(CH2)318F衍生物而導(dǎo)入。對(duì)于芳基體系，從芳基重氮鹽、芳基硝基化合物或芳基季銨鹽進(jìn)行18F-氟化物親核置換是芳基-18F衍生物的適宜途徑。
含有伯胺基團(tuán)的前體也可用18F標(biāo)記，所述標(biāo)記是通過使用18F-C6H4-CHO而進(jìn)行還原胺化而實(shí)施，如Kahn et al[J.Lab.Comp.Radiopharm.45，1045-1053(2002)]and Borch et al[J.Am.Chem.Soc.93，2897(1971)]所記載的。該方法同樣對(duì)于芳基伯胺也適用，諸如含有苯基-NH2或苯基-CH2NH2基團(tuán)的化合物。
18F-標(biāo)記的優(yōu)選的方法是使用肽的氨氧基衍生物作為前體，如Poethko et al[J.Nuc.Med.，45，892-902(2004)]所教導(dǎo)的。所述前體之后與18F-C6H4-CHO在酸性條件下(例如，pH2-4)進(jìn)行縮合，通過肟醚鍵得到所需的18F-標(biāo)記的成像劑。肟醚相對(duì)于亞胺具有的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)水解的抵抗力更強(qiáng)。
含胺的前體也可通過與18F-標(biāo)記的活性酯的反應(yīng)用18F標(biāo)記，以獲得酰胺鍵產(chǎn)物，所述酯諸如 所示的N-羥基琥珀酰亞胺酯以及其用于標(biāo)記肽的用途記載于Vaidyanathan et al[Nucl.Med.Biol.，19(3)，275-281(1992)]andJohnstrom et al[Clin.Sci.，103(Suppl.48)，45-85(2002)]。18F-標(biāo)記的衍生物的合成途徑的進(jìn)一步的詳細(xì)說明描述于Bolton，J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)。
當(dāng)SIG包含金屬離子時(shí)，金屬離子以金屬復(fù)合物的形式存在。術(shù)語“金屬復(fù)合物”指的是具有一個(gè)或多個(gè)配體的金屬離子的配位復(fù)合物。特別優(yōu)選的，金屬復(fù)合物是“抗反式螯合”的，也即不容易與金屬配位位點(diǎn)的其他潛在競(jìng)爭(zhēng)性配體進(jìn)行配體交換。潛在競(jìng)爭(zhēng)性的配體包括HSP肽本身加上體外制備的賦形劑(例如，制備時(shí)所使用的輻射防護(hù)劑或抗菌防腐劑)，或者體內(nèi)的內(nèi)源性化合物(例如，谷胱甘肽、運(yùn)鐵蛋白或血漿蛋白)。
從前體衍生的金屬復(fù)合物是綴合物(也即，綴合的金屬配體)，其中的配體與E或其他的連接基團(tuán)L(如果存在)共價(jià)鍵合。
本發(fā)明中用于形成對(duì)反式螯合具有抵抗作用的金屬復(fù)合物的適宜的配體包括螯合劑，其中的2-6個(gè)優(yōu)選2-4個(gè)金屬供體原子的排列使得能獲得5-或6-元螯合環(huán)(通過具有任一碳原子的非配位主鏈或連接金屬供體原子的非配位雜原子)；或者含有與金屬離子強(qiáng)結(jié)合的供體原子的單齒配體，諸如異腈、膦或diazenides。與金屬結(jié)合良好、作為螯合劑的一部分的供體原子類型的例子是胺、硫醇、酰胺、肟和膦。膦形成所述強(qiáng)金屬復(fù)合物，使得甚至單齒或二齒膦形成適宜的金屬復(fù)合物。異腈和diazenides的線性幾何學(xué)使得它們不會(huì)被輕易摻入螯合劑中，由此典型地可作為單齒配體使用。適宜的異腈的例子包括簡(jiǎn)單烷基異腈諸如叔-丁基異腈和醚取代的異腈諸如mibi(也即，1-異氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)。適宜的膦的例子包括Tetrofosmin、和單齒膦，諸如三(3-甲氧丙基)膦。適宜的diazenides的例子包括HYNIC系列的配體，也即肼-取代的吡啶或煙酰胺。
形成抗反式螯合的金屬復(fù)合物的、用于锝的適宜螯合劑的例子包括但不限于(i)下式的二胺二肟 其中的E1-E6各自獨(dú)立地表示R′基團(tuán)；每一R′是H或C1-10烷基、C3-10烷基芳基、C2-10烷氧基烷基、C1-10羥基烷基、C1-10氟代烷基、C2-10羧基烷基或C1-10氨基烷基，或者兩個(gè)或多個(gè)R′基團(tuán)與它們連接的原子一同形成碳環(huán)、雜環(huán)、飽和的或不飽和的環(huán)，其中一個(gè)或多個(gè)R′基團(tuán)與式(I)中的-(L)nE綴合；Q是式-(J)f-的橋連基；其中的f是3、4或5，且每個(gè)J獨(dú)立為-O-、-NR′-或-C(R′)2-，條件是-(J)f-包含的J基團(tuán)中最多只有一個(gè)是-O-或-NR′-。
優(yōu)選的Q基團(tuán)如下所示Q＝-(CH2)(CHR′)(CH2)-也即丙二胺肟或PnAO衍生物；Q＝-(CH2)2(CHR′)(CH2)2-也即戊二胺肟或PentAO衍生物；Q＝-(CH2)2NR′(CH2)2-。
E1至E6優(yōu)選地選自C1-3烷基、烷基芳基、烷氧基烷基、羥基烷基、氟代烷基、羧基烷基或氨基烷基。最優(yōu)選地，每一E1至E6基團(tuán)是CH3。
綴合優(yōu)選在E1或E6R′基團(tuán)中存在，或者在Q部分的R′基團(tuán)中存在。更優(yōu)選地，HSP肽與Q部分的R′基團(tuán)綴合。當(dāng)HSP肽與Q部分的R′基團(tuán)綴合時(shí)，R′基團(tuán)優(yōu)選位于橋頭的位置。在此情況下，Q優(yōu)選是-(CH2)(CHR′)(CH2)-、-(CH2)2(CHR′)(CH2)2-或-(CH2)2NR′(CH2)2-，最優(yōu)選是-(CH2)2(CHR′)(CH2)2-。特別優(yōu)選的雙功能二胺二肟螯合劑具有下式 (螯合劑1)以使HSP肽可通過橋頭的-CH2CH2NH2基團(tuán)綴合。
(ii)具有諸如MAG3(巰基乙?；拾彼?的硫醇三酰胺供體組的N3S配體和相關(guān)配體；或者具有諸如Pica的二酰胺吡啶硫醇供體組的N3S配體；
(iii)具有諸如BAT或ECD(也即，雙半胱乙酯)的二胺二硫醇供體組、或諸如MAMA的酰胺胺二硫醇供體的N2S2配體；(iv)N4配體，其是具有四胺、酰胺三胺或二酰胺二胺供體組，諸如cyclam、monoxocyclam或dioxocyclam的開鏈或大環(huán)配體。
(v)具有二胺二苯酚供體組的N2O2配體。
上述配體特別適于復(fù)合锝，例如，94mTc或99mTc，這些配體更為詳細(xì)地描述記載于Jurisson et al[Chem.Rev.，99，2205-2218(1999)]。所述配體也適于其他的金屬，諸如銅(64Cu或67Cu)、釩(例如，48V)、鐵(例如，52Fe)或鈷(例如，55Co)。其他適宜的配體記載于Sandoz的WO91/01144，其中包括特別適于銦、釔和釓的配體，特別是大環(huán)氨基羧酸鹽和氨基磷酸配體。形成非離子的(即中性的)釓金屬復(fù)合物的配體是已知的并且記載于US 4885363。放射性金屬離子是锝時(shí)，配體優(yōu)選的時(shí)一種四齒螯合劑。優(yōu)選的用于锝的螯合劑是二胺二肟，或上述具有N2S2或N3S的供體組的那些。
連接劑L包括任何能夠?qū)，也即信號(hào)部分SIG或治療劑TA連接于結(jié)合部分(E)的部分。在每一所述實(shí)施方案中，L可以進(jìn)行獨(dú)立的選擇。例如，連接劑可以是至少為2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)、結(jié)合至少一個(gè)金屬陽離子的金屬螯合劑，或它們的組合。在很多情況下，優(yōu)選包括L，以連接SIG至E，或者連接TA至E。也即，在式(I)中的n是1。如上文所述，當(dāng)SIG是金屬時(shí)，L可任選含有金屬-配位配體或螯合劑。
至少為2價(jià)的有機(jī)部分可用作L，包括小分子有機(jī)部分諸如苯甲酸酯或丙酸酯(圖4)。有機(jī)基團(tuán)可以通過共價(jià)或離子結(jié)合到E和Y上。作為連接劑使用的適宜的有機(jī)部分典型的具有約1-10000個(gè)碳原子，并可以包括選自下組的有機(jī)基團(tuán)亞烷基、亞芳基、環(huán)亞烷基、氨基亞烷基、氨基亞芳基、氨基環(huán)亞烷基、硫代亞烷基、硫代亞芳基、硫代環(huán)亞烷基、氧化亞烷基、氧化亞芳基、氧化環(huán)亞烷基、酰基亞烷基、酰基亞芳基、?；h(huán)亞烷基單元，及它們的組合。特別優(yōu)選的酰基亞芳基單元是具有如下結(jié)構(gòu)的4-?；鶃啽交?br> 其他適宜的連接劑包括金屬螯合劑，諸如以下一個(gè)或多個(gè)DTPA、1，4，7-三氮雜-環(huán)壬烷-N，N’，N”-三乙酸(NOTA)、對(duì)-溴乙酰胺基-芐基-四乙胺四乙酸(TETA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)癸烷四乙酸(DOTA)、EDTA和CHXa。優(yōu)選的金屬螯合劑可與至少一種選自52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、154- 158Gd、和175Lu的陽離子的金屬相結(jié)合。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，各種連接劑都與某些信號(hào)部分一同使用。例如，金屬信號(hào)發(fā)生部分，諸如64Cu，典型地需要一個(gè)連接配體，而18F不需要。此外，標(biāo)記的輔基諸如18F-氟代丙酸酯或18F-氟代苯甲酸酯(圖4)可以使用，一旦制備后，它們可以通過活性酯綴合而與肽綴合。
L優(yōu)選為式-(A)z-基團(tuán)，其中每一A獨(dú)立地為-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-，-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8環(huán)雜亞烷基、C4-8環(huán)亞烷基、C5-12亞芳基、或C3-12雜亞芳基、氨基酸、糖或者單分散聚乙二醇(PEG)單元；R則獨(dú)立地選自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羥基烷基；Z是0-10的整數(shù)；且式(I)的連接基團(tuán)(L)的功能是將信號(hào)部分與HSP肽的活性位點(diǎn)相分割。當(dāng)SIG相對(duì)較大(例如，金屬復(fù)合物)時(shí)，這是特別重要的，這樣抑制劑到LOX-1的結(jié)合就不會(huì)收到損害。這可以通過組合柔性(例如，簡(jiǎn)單的烷基鏈)來獲得，這樣大的基團(tuán)可以具有使其離開活性位點(diǎn)的自由度，和/或可以通過組合剛性來獲得，如使金屬復(fù)合物離開活性位點(diǎn)的環(huán)烷基或芳基間隔基。
連接基團(tuán)的性質(zhì)也可用于調(diào)節(jié)成像劑的生物分布。由此，例如，在連接體中導(dǎo)入醚基團(tuán)可有助于減少血漿蛋白結(jié)合。當(dāng)L包括有聚乙二醇(PEG)單元或肽鏈(適宜地含有1-10個(gè)氨基酸殘基)時(shí)，連接基團(tuán)可用于調(diào)節(jié)成像劑的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)和血漿清除率。所述“生物調(diào)節(jié)劑”連接基團(tuán)可加速成像劑從背景組織，諸如肌肉或肝臟和/或血液中的清除率，由此因?yàn)楸尘案蓴_減少，可獲得更好的診斷圖像。生物調(diào)節(jié)連接基團(tuán)也可有助于特定的排泄途徑，例如，通過腎臟排泄，而不是通過肝臟。
當(dāng)L含有1-10個(gè)氨基酸殘基的肽鏈時(shí)，氨基酸殘基優(yōu)選地選自甘氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或絲氨酸。當(dāng)L-含有PEG部分時(shí)，其優(yōu)選含有從式IIA或IIB的單分散PEG樣結(jié)構(gòu)的低聚衍生的單元 (17-氨基-5-氧代-6-氮雜-3，9，12，15-四氧雜十七烷酸)其中的p是1-10的整數(shù)，其中的C-末端單元(*)與信號(hào)部分相連接?；蛘撸梢允褂靡允絀IB的丙酸衍生物為基礎(chǔ)的PEG樣結(jié)構(gòu) 其中的p如式IIA所定義，q是3-15的整數(shù)。
在式IIB中，p優(yōu)選的是1或2，q優(yōu)選的是5-12。
當(dāng)連接基團(tuán)不包括PEG或肽鏈時(shí)，優(yōu)選的-(A)n-基團(tuán)具有連接的原子組成的主鏈，所述原子構(gòu)成了2-10個(gè)原子，優(yōu)選2-5個(gè)原子，特別優(yōu)選2或3個(gè)原子組成的-(A)n-部分。2個(gè)原子組成的最小連接基團(tuán)主鏈具有的優(yōu)點(diǎn)是，成像部分可以很好地與HSP肽分開，這樣可以將任何的相互作用最小化。
非肽連接基團(tuán)，諸如亞烷基或亞芳基的優(yōu)點(diǎn)是，不會(huì)與綴合的HSP肽發(fā)生顯著的氫鍵相互作用，這樣連接體就不會(huì)纏繞在一起。優(yōu)選的亞烷基間隔基是-(CH2)d-，其中的d是2至5。優(yōu)選的亞芳基間隔基具有如下的通式 其中a和b獨(dú)立地是0、1或2。
連接基團(tuán)-(A)n-優(yōu)選含有二甘醇酸部分、馬來酰亞胺部分、戊二酸、琥珀酸、賴氨酸-甘氨酸衍生物諸如KKGG、基于聚乙二醇的單元或者式IIA或IIB的PEG樣單元。
在某些情況下，諸如產(chǎn)生信號(hào)的試劑，如18F或11C的情況下，連接體可能不需要連接產(chǎn)生信號(hào)的試劑或治療劑。相似地，放射性同位素可直接通過共價(jià)鍵連接在E上。在這種情況下，HSP肽可簡(jiǎn)單地使用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記。術(shù)語“標(biāo)記”指的是官能團(tuán)含有SIG，或SIG作為附加物進(jìn)行連接。當(dāng)官能團(tuán)中含有SIG時(shí)，表示‘信號(hào)部分’形成化學(xué)結(jié)構(gòu)的一部份，放射性同位素以顯著高于所述同位素的天然豐度的水平存在。所述提高了的或者富集了的同位素水平可適宜地是考慮的同位素的天然豐度水平的至少5倍，優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少20倍；理想地是至少50倍，或者以使考慮的同位素的富集水平是90％至100％的水平存在。所述官能團(tuán)的例子包括具有水平升高的11C的CH3基團(tuán)和具有水平升高的18F的氟代烷基基團(tuán)，這樣SIG就是化學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)同位素標(biāo)記的11C或18F原子。放射性同位素3H和14C并不是適宜的體內(nèi)成像部分。
在此文中描述了合成用于標(biāo)記部分(E)的、識(shí)別LOX-1的肽配體連接體(L)的方法，以及直接標(biāo)記結(jié)合LOX-1的結(jié)合試劑的方法。
肽合成HSP肽可使用N□-Fmoc-保護(hù)的氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)合成，其中在25微摩爾的規(guī)模(Fmoc＝芴基甲氧羰基)上使用2，4-二甲氧基二苯甲基胺樹脂(Rink Amide AM)。肽可使用Rainin/Protein TechnologySymphony固相肽合成儀(Woburn，MA)合成。在任何化學(xué)過程之前，樹脂在二氯甲烷中溶脹1小時(shí)，然后與DMF(二甲基甲酰胺)進(jìn)行交換半小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間。每個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)都在室溫下，在含有5當(dāng)量的氨基酸的DMF中進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間典型的為45分鐘，對(duì)于預(yù)期難以偶聯(lián)的殘基是1小時(shí)(例如，將異亮氨酸I以IPP序列偶聯(lián)到脯氨酸P上)。所使用的偶聯(lián)試劑是HBTU(O-苯并三唑基-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)，堿為NMM(N-甲基嗎啉)。在每一步驟中，偶聯(lián)試劑以相對(duì)于所估計(jì)的樹脂容量的5倍當(dāng)量的規(guī)模提供，反應(yīng)在2.5ml 0.4MNMM的DMF溶液中進(jìn)行。反應(yīng)不會(huì)干擾氨基酸的側(cè)鏈，如果存在反應(yīng)性基團(tuán)，氨基酸側(cè)鏈已經(jīng)典型地被對(duì)酸敏感的基團(tuán)保護(hù)起來。通常，酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸側(cè)鏈可以相應(yīng)的叔-丁醚形式保護(hù)。谷氨酸側(cè)鏈可以相應(yīng)的叔-丁醚形式進(jìn)行保護(hù)。賴氨酸和鳥氨酸側(cè)鏈用Boc進(jìn)行保護(hù)。谷氨酰胺側(cè)鏈以γ-三苯甲基衍生物形式進(jìn)行保護(hù)，精氨酸側(cè)鏈則以2，2，5，7，8-五甲基-色滿-6-磺酰衍生物形式進(jìn)行保護(hù)。
在每個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)之后，N-末端Fmoc-保護(hù)的胺使用20％哌啶的DMF溶液在室溫下脫保護(hù)兩次，約15分鐘。在加入最后的殘基后，用DMF和二氯甲烷徹底沖洗仍然留在肽合成儀上的樹脂。
本發(fā)明使用了一種由1mL的TFA、2.5％TSP(三異丙基硅烷)和2.5％的水組成的混合物以使肽從樹脂中分離。樹脂和混合物在室溫下攪拌約3至4小時(shí)。使用玻璃纖維使樹脂珠濾出，然后用2-3ml的TFA沖洗。肽用40ml冰冷的醚沉淀，并在3000-4000rpm轉(zhuǎn)速下離心直至在離心管底部形成沉淀物。傾倒出醚，沉淀物重新在冷醚(40mL)中混懸，并再次離心；重復(fù)該操作2至3次。在最后一次沖洗時(shí)，向30ml的冷醚中加入10ml的Millipore水，再次離心混合物。傾倒出醚。含有粗肽的水層轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中進(jìn)行冷凍干燥。
肽的合成可通過質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證，使用的是飛行時(shí)間基質(zhì)輔助的激光解吸光譜法(MALDI-TOF)。也可使用初步的LC/MS技術(shù)在粗合成混合物中表征純產(chǎn)品。
連接體的合成在熒光素染料、5(6)-羧基熒光素與合成肽的N-末端的偶聯(lián)過程中，優(yōu)選包括以與上述氨基酸相同的方式向樹脂中加入染料、HBTU和NMM。在反應(yīng)后，優(yōu)選用DMF和二氯甲烷徹底洗滌樹脂，并在氮?dú)饬鞲稍?。含?mL TFA、2.5％TSP(三異丙基硅烷)和2.5％水的混合物可用于使肽從樹脂中分離。樹脂和混合物優(yōu)選在室溫下攪拌約3至4小時(shí)。然后使用玻璃纖維將樹脂珠濾出，隨后使用2-3ml的TFA沖洗。然后優(yōu)選用冰冷的醚(40mL)對(duì)肽進(jìn)行沉淀并離心(例如，在3000-4000rpm轉(zhuǎn)速下)，直至在離心管底部形成沉淀。可以傾倒出醚，然后將沉淀重新混懸在冷醚(40mL)中，并再次離心—該操作可重復(fù)2至3次。在最后的洗滌中，優(yōu)選向30ml的冷醚中加入10ml的Millipore水，然后再次離心混合物。然后傾倒出醚，含有粗肽的水層可以轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中用于冷凍干燥。肽合成的粗產(chǎn)率通常為90％。典型地沒有觀察到未標(biāo)記的肽。
優(yōu)選地，肽可使用反相半制備或制備HPLC進(jìn)行純化，使用的柱子是C4-二氧化硅柱(Vydac，Hesperia，CA)。肽的色譜圖可以在220nm下監(jiān)測(cè)，該波長(zhǎng)與酰胺發(fā)色團(tuán)的吸收值相對(duì)應(yīng)。在495nm下監(jiān)測(cè)同樣可以觀察，并保證肽上熒光素染料的存在。優(yōu)選使用包括CH3CN/TFA(乙腈/三氟乙酸；100∶0.01)和H2O/TFA(水/三氟乙酸；100∶0.01)洗脫液的溶劑體系，半制備和制備色譜的洗脫液的流速分別為3ml/min和10ml/min。對(duì)于半制備和制備色譜，溶解在Millipore水中的粗肽可以1.5mg和5-10mg肽的規(guī)模注入。分析色譜圖表以確保良好的分辨率和峰形。所有肽的梯度條件典型為30分鐘內(nèi)5至50％的CH3CN/TFA(100∶0.01)。純化的肽可以通過基質(zhì)輔助的激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行確認(rèn)。
治療劑本發(fā)明的治療劑(TA)包括但不限于藥物化合物或組合物和生物活性組合物，諸如例如，抗生素，鎮(zhèn)痛藥、疫苗、抗炎藥、抗抑郁藥、抗病毒劑、抗腫瘤劑、酶抑制劑、含齊多夫定的制劑、大分子多肽、作為抗病毒和抗腫瘤劑的芳族硝基和亞硝基化合物和它們的代謝物、HIV蛋白酶抑制劑、病毒和甾體、促進(jìn)生長(zhǎng)的組合物諸如激素、或者其他刺激生長(zhǎng)的試劑、它們的混合物，等等。
生物活性成分可選自任何已知的活性材料，這些材料在內(nèi)化到細(xì)胞中之后，可提供增強(qiáng)了的效力，諸如抗癌劑?；钚猿煞挚砂?，例如，抗代謝物諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(ARAc)、6-巰嘌呤、甲氨喋呤；烷化劑諸如氮芥、環(huán)磷酰胺、亞硝基脲、順鉑；植物生物堿諸如長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷(VP16)；抗生素諸如絲裂霉素C、博來霉素、多柔比星；或激素諸如他莫昔芬或氟他胺。
在第二種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種以適于哺乳動(dòng)物給藥的形式存在的含有式I化合物和的生物相容性載體的組合物。對(duì)于藥物組合物而言，式I的必須特點(diǎn)以及其優(yōu)選的實(shí)施方案如上文第一個(gè)實(shí)施方案中所述。
“生物相容性載體”是流體，特別是液體，試劑可以混懸或溶解在其中，這樣化合物可以是生理可耐受的，也即，可以給予哺乳動(dòng)物身體而不會(huì)導(dǎo)致毒性或過度的不適。生物相容性載體適宜的是可注射的載體液體，諸如無菌的、無熱源的注射用水；水溶液，諸如乙醇水溶液或鹽水(可有利地進(jìn)行平衡，以使最終注射產(chǎn)物達(dá)到等滲)；一種或多種滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)的水溶液(例如，具有生物相容性抗衡離子的血漿陽離子的鹽)、糖(例如，葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如，山梨糖醇或甘露醇)、甘醇(例如，甘油)或其他的非離子多元醇(例如，聚乙二醇、丙二醇等等)。優(yōu)選地，生物相容性載體是不含熱源的注射用水或等滲鹽水。
所述藥物組合物適于在容器中提供，該容器中含有密封裝置，適于用皮下針頭單次或多次穿刺(例如，皺起的隔膜密封)，同時(shí)能保證無菌的完整性。所述容器中可含有單個(gè)或多個(gè)患者劑量。優(yōu)選的多劑容器中可含有單個(gè)大瓶(例如，10-30cm3體積)，其中含有多個(gè)患者劑量，從而單個(gè)患者劑量可以在制劑的保質(zhì)期的不同時(shí)間中以各種時(shí)間間隔從臨床級(jí)注射器抽出，以適于臨床狀況。預(yù)填充的注射器設(shè)計(jì)成含有單個(gè)患者劑量，或者“單位劑量”的形式，由此可優(yōu)選的是一次性的或其他適合臨床使用的注射器。當(dāng)SIG具有放射性時(shí)，預(yù)填充的注射器可任選具有注射器屏蔽板以保護(hù)操作者免受輻射劑量。適宜的所述放射性藥物注射屏蔽板是本領(lǐng)域公知的并且優(yōu)選的含有鉛或鎢。
當(dāng)SIG是用于體內(nèi)成像的放射性核素(也即，放射性藥物)時(shí)，放射性藥物需從試劑盒中制備，如以下第三個(gè)實(shí)施方案中所述。另外的，放射性藥物可以在無菌的制備條件下制備以獲得所需的無菌產(chǎn)品。放射性藥物也可在無菌條件下制備后，使用例如，γ-輻射、高壓滅菌、干熱或化學(xué)處理(例如，環(huán)氧乙烷處理)進(jìn)行最后的滅菌。優(yōu)選地，本發(fā)明放射性藥物從試劑盒中制備。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備第二個(gè)實(shí)施方案中的藥物組合物的試劑盒，其中的SIG包括了放射性同位素或放射性核素。所述試劑盒包括上文所述的“前體”，優(yōu)選是無菌、無熱原形式的，由此與無菌放射性同位素源的反應(yīng)獲得了所需的具有最少操作步驟的放射性藥物。所述考慮對(duì)于放射性藥物而言是非常重要的，因?yàn)榉派湫酝凰氐陌胨テ谙鄬?duì)較短，并且也是為了便于操作以及減少放射性藥物工作者的輻射劑量。由此，所述試劑盒重建所需的反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選的是上文定義的“生物相容性載體”，并最優(yōu)選是水性的。
適宜的試劑盒容器含有可保持無菌完整性和/或放射性安全的密封容器，并且任選還含有惰性頂部空間氣體(例如，氮或氬)，由此可允許溶液通過注射器加入或抽出。優(yōu)選的所述容器是隔膜密封的管形瓶，其中的氣體密閉裝置用整體密封裝置包被(典型的是鋁)。所述容器具有的其他優(yōu)點(diǎn)是如有需要，可以抵抗真空，例如改變頂部空間氣體或脫氣體溶液。
非放射性試劑盒可任選進(jìn)一步含有其他成分，諸如輻射防護(hù)劑、抗菌性防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑或填充劑。
術(shù)語“輻射防護(hù)劑”指的是通過捕獲高反應(yīng)性的自由基諸如從水的射解中得到的含氧自由基來抑制降解反應(yīng)諸如氧化還原過程的化合物。本發(fā)明的輻射防護(hù)劑適宜地選自抗壞血酸、對(duì)-氨基苯甲酸(也即，4-氨基苯甲酸)、龍膽酸(也即，2，5-二羥基苯甲酸)及其具有生物相容性陽離子的鹽。術(shù)語“生物相容性陽離子”指的是可與離子化的、負(fù)電荷基團(tuán)形成鹽的正電荷抗衡離子，所述正電荷抗衡離子同樣是無毒的并且適于動(dòng)物體給藥，特別是人類給藥。適宜的生物相容性陽離子包括堿金屬鈉或鉀、堿土金屬鈣和鎂；以及銨離子。優(yōu)選的生物相容陽離子是鈉和鉀，優(yōu)選的是鈉。
術(shù)語“抗菌防腐劑”指的是可抑制潛在有害的微生物諸如細(xì)菌、酵母和霉菌生長(zhǎng)的試劑。抗菌防腐劑也可根據(jù)劑量具有某些殺菌性質(zhì)。本發(fā)明的抗菌防腐劑的主要作用是抑制重配后放射性藥物組合物中，也即在放射性診斷產(chǎn)品中的任何所述微生物的生長(zhǎng)。但是，抗菌性防腐劑可以任選用于在重配前抑制本發(fā)明的非放射性試劑盒的一種或多種成分中潛在有害的微生物的生長(zhǎng)。適宜的抗菌性防腐劑包括對(duì)氨基苯甲酸酯類，即，對(duì)氨基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯，或者它們的混合物；苯甲醇；苯酚；甲酚；溴化十六烷基三甲銨和柳硫汞。優(yōu)選的抗菌性防腐劑是對(duì)氨基苯甲酸酯類。
術(shù)語“pH調(diào)節(jié)劑”指的是可保證重配后的試劑盒中的pH值在人或哺乳動(dòng)物給藥可接受的范圍(約pH4.0至10.5)之內(nèi)的化合物或化合物的混合物。適宜的pH調(diào)節(jié)劑包括藥學(xué)可接受的緩沖劑，諸如tricine、磷酸鹽或TRIS[也即，三(羥甲基)氨基甲烷]和藥學(xué)可接受的堿，諸如碳酸鈉、碳酸氫鈉或它們的混合物。當(dāng)以酸式鹽形式使用綴合物時(shí)，pH調(diào)節(jié)劑可任選以獨(dú)立管形瓶或容器的形式提供，這樣試劑盒的使用者可以多步驟程序的一部分來調(diào)節(jié)pH。
術(shù)語“填充劑”指的是藥學(xué)可接受的用于在生產(chǎn)和冷凍干燥過程中便于材料操作的膨脹劑。適宜的填充劑包括無機(jī)鹽諸如氯化鈉和水溶性糖或糖醇，諸如蔗糖、麥芽糖、甘露醇或海藻糖。
上文描述了試劑盒中使用的“前體”的優(yōu)選方面。在試劑盒中使用的前體可在無菌操作條件下使用，以獲得所需的無菌、無熱原的材料。前體也可以在無菌條件下使用，然后用例如γ-輻射、高壓滅菌、干熱或化學(xué)處理(例如，用環(huán)氧乙烷)進(jìn)行最后的滅菌。優(yōu)選地，前體以無菌、無熱原形式使用。更優(yōu)選地，無菌、無熱原的前體在前述密封容器中使用。
試劑盒中的“前體”可任選與上文所述的固體支持物基質(zhì)共價(jià)連接。對(duì)于PET放射性藥物的制備，試劑盒中可含有一個(gè)藥筒，其可插在適宜的自動(dòng)化合成儀上。除了固體支持物結(jié)合的前體，藥筒中可含有除去不需要的氟離子的柱子，以及連接的適當(dāng)容器，這樣可使得反應(yīng)混合物蒸發(fā)，并且可以根據(jù)需要配制產(chǎn)品。合成所需的試劑、溶劑和其他的消耗品都可記載在帶軟件的光盤中，從而可使得合成者以滿足放射性濃度、容積、送遞時(shí)間等的用戶要求的方式操作。方便地，所有的試劑盒中的成分都是一次性的以減少操作之間污染可能性，從而保證無菌和質(zhì)量。
在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種對(duì)組織成像以檢測(cè)LOX-1的存在和/或量的方法，包括給予哺乳動(dòng)物式(I)的化合物，其中Y是SIG；任選給予清除劑以除去任何沒有與LOX-1結(jié)合的式(I)的化合物；并且對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行有效檢測(cè)SIG產(chǎn)生的信號(hào)的成像，以檢測(cè)LOX-1的存在和/或量。
對(duì)于該成像方法，Y是SIG，其他的式(I)的基本特點(diǎn)和優(yōu)選實(shí)施方案在第一個(gè)實(shí)施方案中有所記載。
術(shù)語“清除劑”指的是生物相容的、無毒化合物，其與任何在血流中循環(huán)的式(I)化合物相結(jié)合以形成易于被肝臟或腎臟排泄的物質(zhì)，從而從哺乳動(dòng)物體內(nèi)除去。
根據(jù)特定的與結(jié)合部分E相連接的SIG，可使用適宜的成像技術(shù)來對(duì)靶組織成像。例如，當(dāng)使用18F作為標(biāo)記試劑時(shí)，進(jìn)行PET成像。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，式(I)化合物作為第二個(gè)實(shí)施方案中的藥物組合物給藥。
標(biāo)記的配體可用作診斷劑以輔助疑似過度表達(dá)LOX-1的靶組織的成像。該成像方法也可用作診斷性的用途以體內(nèi)或體外檢測(cè)人類組織中LOX-1的存在與否，優(yōu)選體內(nèi)檢測(cè)。此外，成像方法可重復(fù)數(shù)天以獲得LOX-1生長(zhǎng)或表達(dá)程度的定量評(píng)估結(jié)果。由此，體外成像可以涉及組織或細(xì)胞培養(yǎng)物成像，以檢測(cè)LOX-1的存在和/或量。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，哺乳動(dòng)物以前診斷為患有動(dòng)脈粥樣硬化，并且已經(jīng)用治療動(dòng)脈粥樣硬化的治療劑進(jìn)行了治療，所述方法進(jìn)一步包括在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)給藥和成像操作至少一次，并檢測(cè)LOX-1的量的差異。這提供了監(jiān)測(cè)由LOX-1表達(dá)導(dǎo)致的疾病或病癥的療效的方法。
由LOX-1的表達(dá)導(dǎo)致的疾病或病癥包括炎癥位點(diǎn)和存在高濃度的LOX-1的區(qū)域，諸如巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞聚集的部位。更優(yōu)選地，組織是動(dòng)脈粥樣硬化組織，包括動(dòng)脈粥樣硬化斑。
在第五個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式(I)的化合物在診斷疑似患有LOX-1表達(dá)導(dǎo)致的疾病或病癥的哺乳動(dòng)物的方法中的應(yīng)用，其中式(I)中Y是SIG。所述疾病在前述第四個(gè)實(shí)施方案中已經(jīng)描述過。在此應(yīng)用中，Y是SIG，SIG優(yōu)選適于體內(nèi)成像。其他的式(I)化合物的必要特征和優(yōu)選的實(shí)施方案記載在前述第一個(gè)實(shí)施方案中。
在此應(yīng)用中，哺乳動(dòng)物預(yù)先給予了第三個(gè)實(shí)施方案中的放射性藥物組合物。術(shù)語“預(yù)先給予”指的是臨床醫(yī)生參與的步驟，其中已經(jīng)將試劑給予患者，例如通過靜脈注射。當(dāng)SIG適于體內(nèi)成像時(shí)，該實(shí)施方案中包括本發(fā)明第一方面所述的成像劑的優(yōu)選的實(shí)施方案。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這還包括了式(I)化合物在制備用于診斷涉及LOX-1的哺乳動(dòng)物體疾病狀況的體內(nèi)診斷成像的診斷劑中的用途，其中式(I)中Y是SIG。
本發(fā)明通過如下非限制性的實(shí)施例進(jìn)行說明。
實(shí)施例所有的實(shí)施例都是預(yù)示性的實(shí)施例。
實(shí)施例1.
使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使熱激蛋白基團(tuán)E通過4-?；鶃啽交?L)與熒光素(SIG)共價(jià)結(jié)合。用細(xì)胞系測(cè)試復(fù)合物與細(xì)胞結(jié)合的能力。復(fù)合物與細(xì)胞一同溫育并洗滌。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。此外，通過將染料內(nèi)化到細(xì)胞中而不是位于細(xì)胞表面上的操作(已經(jīng)被熒光成像術(shù)證明)，證明HSP片段將信號(hào)內(nèi)化的能力。在內(nèi)化到細(xì)胞中后，立即用pH敏感性染料諸如CypHer(Amersham Biosciences，Pscataway，NJ)對(duì)片段進(jìn)行標(biāo)記。
實(shí)施例2.
通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使E通過Lys-Lys-Gly-Gly(L)與18F(SIG)共價(jià)結(jié)合。然后將復(fù)合物通過注射體內(nèi)送遞到5只對(duì)照和5只患病的ApoE-/-小鼠中(可獲自Jackson Laboratories)。在送遞后，使用標(biāo)準(zhǔn)PET技術(shù)掃描小鼠?；疾⌒∈髸?huì)顯示沿著受影響的動(dòng)脈壁的特異性結(jié)合。
在第二階段，使用復(fù)合物進(jìn)行治療的過程被重復(fù)，以顯示成像劑的積累，以得到患病區(qū)域的更高分辨率。
實(shí)施例3.
通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使E通過DTPA(L)與紫杉醇(T)共價(jià)結(jié)合。使用細(xì)胞系來檢測(cè)復(fù)合物結(jié)合細(xì)胞的能力。復(fù)合物與細(xì)胞一起溫育，然后洗滌。通過將染料內(nèi)化到細(xì)胞中而不是位于細(xì)胞表面上的操作(已經(jīng)被熒光成像術(shù)證明)，證明HSP片段將信號(hào)內(nèi)化的能力。
實(shí)施例4.
通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，E通過68Ga(L)共價(jià)結(jié)合。然后將復(fù)合物通過注射體內(nèi)送遞到5只對(duì)照和5只患病的ApoE-/-小鼠中。在送遞后，使用標(biāo)準(zhǔn)PET技術(shù)掃描小鼠。患病小鼠會(huì)顯示沿著受影響的動(dòng)脈壁的特異性結(jié)合。
在第二階段，使用復(fù)合物進(jìn)行治療的過程被重復(fù)，以顯示成像劑的積累，以得到患病區(qū)域的更高分辨率。
實(shí)施例5.
通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使E通過Lys-Lys-Gly-Gly(L)與18F(SIG)共價(jià)連接，并進(jìn)一步與紫杉醇(TA)共價(jià)結(jié)合。復(fù)合物與細(xì)胞結(jié)合的能力可通過熱激的HeLa細(xì)胞系和未應(yīng)激的正常HeLa細(xì)胞來檢測(cè)。進(jìn)而復(fù)合物與細(xì)胞一同溫育并洗滌。表達(dá)了LOX-1的細(xì)胞會(huì)顯示具有更大的選擇性細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡的選擇性將進(jìn)一步通過細(xì)胞成像和信號(hào)內(nèi)化來說明。
實(shí)施例6.
作為沒有連接體的復(fù)合物的實(shí)施例，通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，使E通過68Ga(SIG)共價(jià)結(jié)合。然后將復(fù)合物通過注射體內(nèi)送遞到5只對(duì)照和5只患病的ApoE-/-小鼠中。在送遞后，使用標(biāo)準(zhǔn)PET技術(shù)掃描小鼠。患病小鼠會(huì)顯示沿著受影響的動(dòng)脈壁的特異性結(jié)合。
在第二階段，使用復(fù)合物進(jìn)行治療的過程被重復(fù)，以顯示成像劑的積累，以得到患病區(qū)域的更高分辨率。
序列表<110>SYUD，F(xiàn)aisalZHAO，MingTORRES，Andrew<120>作為靶向試劑用于內(nèi)皮-特異性體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的熱激蛋白<130>61765.002015<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>40<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成載體<400>1Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Leu Asn Pro Gln Asn Thr Val Phe1 5 10 15Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Gly Asp Pro Val Val Gln20 25 30Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe35 40<210>2<211>23<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成載體<400>2Gln Val Ile Asn Asp Gly Asp Lys Pro Lys Val Gln Val Ser Tyr Lys1 5 10 15
Gly Glu Thr Lys Ala Phe Tyr20<210>3<211>25<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成載體<400>3Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Ile Ala1 5 10 15Glu Ala Tyr Leu Gly Tyr Pro Val Thr20 25<210>4<211>36<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成載體<400>4Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu1 5 10 15Ash Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr20 25 30Gly Leu Asp Arg35<210>5<211>30
<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成載體<400>5Met Gly Asp Lys Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val1 5 10 15Ala Pro Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val Met20 25 30<210>6<211>29<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成載體<400>6Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu Leu Ser Gly Ile Pro Pro1 5 10 15Ala Pro Gly Val Pro Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp20 2權(quán)利要求
1.具有式(I)的化合物；(I) Y-(L)n-E，其中Y是SIG或TA，其中SIG是信號(hào)部分，其提供可在體內(nèi)或體外被檢測(cè)到的信號(hào)，TA是治療劑；L是連接Y和E的連接基團(tuán)；E是結(jié)合部分，包括熱激蛋白或其與LOX-1結(jié)合的片段或變體；且n是0或1。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中Y是SIG。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中SIG選自發(fā)光染料；放射性核素；近紅外染料；磁活性同位素；超順磁顆粒；碘化的不透輻射的有機(jī)化合物；Z值大于50的不透輻射的金屬離子；氣體填充的微泡，或它們的組合。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中SIG是放射性核素。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中放射性核素選自11C、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、131I、154-158Gd和175Lu。
6.權(quán)利要求4或5的化合物，其中放射性核素是正電子發(fā)射體。
7.權(quán)利要求6的化合物，其中正電子發(fā)射體選自18F和11C。
8.權(quán)利要求4或5的化合物，其中放射性核素是γ發(fā)射體。
9.權(quán)利要求3的化合物，其中SIG是近紅外染料。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的化合物，其中L是至少2價(jià)的有機(jī)基團(tuán)。
11.權(quán)利要求10的化合物，其中有機(jī)基團(tuán)與基團(tuán)Y和基團(tuán)E都是共價(jià)結(jié)合的。
12.權(quán)利要求10的化合物，其中有機(jī)基團(tuán)與基團(tuán)Y和基團(tuán)E都是離子結(jié)合的。
13.權(quán)利要求10的化合物，其中有機(jī)基團(tuán)選自亞烷基、亞芳基、環(huán)亞烷基、氨基亞烷基、氨基亞芳基、氨基環(huán)亞烷基、硫代亞烷基、硫代亞芳基、硫代環(huán)亞烷基、氧化亞烷基、氧化亞芳基、氧化環(huán)亞烷基、?；鶃喭榛?、?；鶃喎蓟?、酰基環(huán)亞烷基單元，及它們的組合。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中?；鶃喎蓟鶈卧蔷哂腥缦陆Y(jié)構(gòu)的4-?；鶃啽交?br> 15.權(quán)利要求1-10的化合物，其中L包括聚乙二醇(PEG)單元或肽鏈，從而L可調(diào)節(jié)式I化合物的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)和血液清除率。
16.權(quán)利要求14的化合物，其中肽鏈含有1至10個(gè)氨基酸殘基。
17.權(quán)利要求1-16的化合物，其中SIG包括金屬離子，并且SIG或有機(jī)基團(tuán)包括金屬螯合劑。
18.權(quán)利要求16化合物，其中的金屬螯合劑結(jié)合至少一種選自52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、154-158Gd和175Lu的陽離子的金屬陽離子。
19.權(quán)利要求17或18的化合物，其中金屬螯合劑選自DTPA、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N’，N”-三乙酸(NOTA)、對(duì)-溴乙酰胺基-芐基-四乙胺四乙酸(TETA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)癸烷四乙酸(DOTA)、EDTA、CHXa。
20.權(quán)利要求1-19的化合物，其中E是熱激蛋白70或其與LOX-1結(jié)合的片段。
21.權(quán)利要求20的化合物，其中的片段是熱激蛋白70的N-末端片段。
22.權(quán)利要求20或21的化合物，其中的片段含有至多30個(gè)氨基酸。
23.一種以適合哺乳動(dòng)物給藥的形式存在的，含有權(quán)利要求1-22的式(I)化合物和生物相容性載體的藥物組合物。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中Y是如權(quán)利要求2-9所定義的SIG。
25.權(quán)利要求24的藥物組合物，其中SIG是放射性核素。
26.一種用于制備權(quán)利要求25的組合物的試劑盒。
27.一種對(duì)哺乳動(dòng)物中的組織成像以檢測(cè)LOX-1的存在和/或量的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物權(quán)利要求1-22的式(I)化合物，其中Y是SIG；任選給予清除劑以除去任何沒有與LOX-1結(jié)合的式(I)化合物；并且對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行有效檢測(cè)SIG產(chǎn)生的信號(hào)的成像，以檢測(cè)LOX-1的存在和/或量。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以前診斷為患有動(dòng)脈粥樣硬化，并且已經(jīng)用治療動(dòng)脈粥樣硬化的治療劑進(jìn)行了治療，所述方法進(jìn)一步包括在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)給藥和成像操作至少一次，以檢測(cè)LOX-1的量的差異。
29.權(quán)利要求27或28的方法，其中式(I)的化合物是權(quán)利要求23-25的藥物組合物的一部份。
30.權(quán)利要求27-29的方法，其中有效檢測(cè)SIG的成像是正電子發(fā)射體層攝影術(shù)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中SIG選自18F和11C。
32.權(quán)利要求1-22的式(I)化合物在診斷疑似患有由LOX-1表達(dá)導(dǎo)致的疾病或病癥的哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用，其中Y如權(quán)利要求3-10所定義。
33.權(quán)利要求32的用途，其中的診斷方法包括權(quán)利要求27至31的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及熱激蛋白及其片段作為靶向配體的用途。熱激蛋白可與凝集素樣氧化低密度脂蛋白(LOX－1)相結(jié)合，并且可以用成像劑標(biāo)記，或者與治療劑相連接。還涉及可用于診斷或監(jiān)測(cè)疾病的肽和用于使信號(hào)部分內(nèi)化的方法和治療劑。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101039702SQ200580035134
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月13日
發(fā)明者F·休德, M·趙, A·托雷斯 申請(qǐng)人:通用電氣公司