專利名稱：基于組合方式產(chǎn)生多價重組抗原的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域和生產(chǎn)抗病原生物體的多價疫苗領域。本發(fā)明的一個實施方式具體地提供了一些方法和組合物，所述方法和組合物提供了能用于生產(chǎn)一群多價疫苗的異形核絲狀真菌內的一群編碼抗原的核苷酸序列。
背景技術：
目前可以用多種方法生產(chǎn)疫苗。通常用受精的雞卵生產(chǎn)流感疫苗。在美國，疾病控制中心會選擇出三種被認為能代表最可能在特定流感季節(jié)內流行的病毒的病毒株。將所選病毒的樣品提供給生產(chǎn)商，作為種病毒母液(seed virus stock)，其具有所需的抗原特征。將種病毒注射到受精的雞卵內。孵育雞卵，同時復制流感病毒。在一段合適的時間之后，打開雞卵并收集蛋白。蛋白樣品內含有病毒。從雞卵中純化出病毒并滅活。然后組合各個病毒母液產(chǎn)生常用的流感病毒疫苗，所述疫苗通常是三價疫苗。
其中可能發(fā)生各種能影響整個批次疫苗的問題。例如，無菌問題使得Chiron疫苗生產(chǎn)設備在2004年被吊銷執(zhí)照。這種情況表明傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方法是如何不可靠。此外，目前的流感疫苗生產(chǎn)方法每年都使用了數(shù)億個雞卵。儲存、處理和加工步驟都是費時的和勞動密集的。另外，因為其較長的生產(chǎn)周期，如果一種新的流感病毒株在流感季節(jié)成為了主要的病毒株，那么目前基于雞卵的生產(chǎn)方法將花費數(shù)個月來產(chǎn)生新的疫苗。
因為這些局限性，非常需要一種更為可變通的和有效的生產(chǎn)抗原物質例如流感疫苗的方法。
重組真菌表達蛋白質已經(jīng)利用異源基因在真菌中的克隆和表達產(chǎn)生了各種有用的蛋白。例如Lambowitz的美國專利No.4,486,533描述了經(jīng)線粒體質粒DNA自主復制絲狀真菌的DNA載體以及往鏈孢霉菌內引入并表達異源基因。Yelton等的美國專利No.4,816,405描述了能夠修飾絲狀子囊菌的重要菌株使得其產(chǎn)生并分泌大量所需的異源蛋白的工具和系統(tǒng)。Buxton等美國專利No.4,885,249描述了含有能被整合到宿主黑曲霉細胞內的選擇標記物的DNA載體對黑曲霉的轉化。McKnight等的美國專利NO.4,935,349描述了一種用于在曲霉中表達更高等的真核基因的方法，其涉及能指導在曲霉和其它絲狀真菌中表達異源基因的啟動子。相似的技術已經(jīng)被用于克隆出粗糙鏈孢霉(“Neurospora crassa”)的與氨基酸轉運有關的mtr基因，以及被用于驗證所克隆的DNA在體內與位于該基因側面的基因組標記物的緊密連接。Stuart，W.D.et al.，Genome(1988.)30198-203；Koo，K.and Stuart，W.D.Genome(1991)34644-651。
絲狀真菌具有多個使得它們成為用于產(chǎn)生真核蛋白的優(yōu)秀候選者的特點。絲狀真菌能分泌復雜的蛋白；正確折疊三維蛋白，包括形成二硫鍵；在翻譯之后蛋白水解地剪切蛋白；以及用N連接的和O連接的糖基化反應使蛋白糖基化。這些能力使得該組微生物成為生產(chǎn)分泌型重組蛋白的吸引人的宿主(MacKenzie，D.A.et al.，J Gen Microbial(1993)1392295-2307；Peberdy，J.F.，Trends in BioTechnology(1994)1250-57)。
粗糙鏈孢霉已經(jīng)被用作產(chǎn)生重組的同源和異源蛋白的宿主細胞(Carattoli，A.，et al.，Proc Nat Acad Sci USA5(199S)926612-6616；Yamashita，R.A.et al.，F(xiàn)ungal Genetics Newsletter(1995 Suppl.)42A；Kato.E.et al.，F(xiàn)ungal Genetics Newsletter(1995 Suppl.)42A；Buczynski，S.et al.Fungal Genetics Newsletter(1995 Suppl.)42A；Nakano，E.T.et al.FungalGenetics Newsletter(1995 Suppl.)40540)。另外，粗糙鏈孢霉已經(jīng)被用作通過異核體方式表達重組的異二聚體和多聚體蛋白的宿主細胞，美國專利5,643,745，1997年7月，Stuart435/69.1。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了生產(chǎn)多價疫苗的異核體絲狀真菌。
通過融合第一種和第二種親代真菌菌株，且對于三價疫苗而言，還融合了第三種親代菌株，以及對于更高價的疫苗，還為每一附加的抗原都添加了一種親代菌株，由此產(chǎn)生了本發(fā)明的各個異核體，其中各親代菌株含有保持異核體狀態(tài)所必需的標記物以及一表達單元，所述表達單元編碼多價疫苗的抗原的天然存在的變體、多價疫苗的抗原的經(jīng)合理設計的變體、或多價疫苗的抗原的隨機產(chǎn)生的變體。因此，除了天然變體以外，可以通過化學的、物理的或定點誘變技術或其它技術產(chǎn)生變體。
本發(fā)明的異核體能用于選擇性地生產(chǎn)所需的給定抗原的多價疫苗。
綜上所述，本發(fā)明提供了生產(chǎn)多價疫苗的變體的異核體。


圖1顯示了合成血凝素0(HA0)基因(A/NewCaledonial/20/1999/H1N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及用于真菌表達的概念性翻譯(conceptual translation)。下劃線顯示出起始密碼子。
圖2顯示了合成血凝素0(HA0)基因編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。粗體字顯示了真菌的信號序列。
圖3顯示了合成血凝素(HA)基因(A/Vietnam/1194/2004/H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。下劃線顯示出起始密碼子。
圖4顯示了合成血凝素(HA)基因編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO4)。粗體字顯示真菌的信號序列。
圖5顯示了合成M1基質蛋白(A/Vietnam/I 194/2004/H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。下劃線顯示出起始密碼子。
圖6顯示了M1基因編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
圖7顯示了對粗糙鏈孢霉表達的HAO的western印跡檢測。用SDS分離來自菌株HAO5和HAO8的經(jīng)2天搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基以及未轉化的對照(C)、50ng及200ng對照HA(A/New Caldonia 20/99，ProteinSciences)，并將其印跡到硝基纖維素膜上。利用山羊多克隆的抗HA(H1N1)抗體(BioDesign)以及隨后的抗山羊Ig-堿性磷酸酶綴合物和比色法檢測血凝素。
圖8顯示了經(jīng)考馬斯亮藍染色的來自HAO5和HAO8的經(jīng)2天搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基的凝膠。在這些條件下，2天搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)生了相當少量的分泌蛋白。
圖9顯示了HAO5的靜止培養(yǎng)表達。對來自HAO5的經(jīng)6天靜止培養(yǎng)的培養(yǎng)基的western印跡。如圖7所示的檢測HA蛋白。在整個試驗中，可檢測到的主要條帶位于約57kDa(根據(jù)氨基酸組成預計的大小)，對照HA蛋白(C)為72kDa。
發(fā)明詳述“異核體”(或異形核細胞)是通過兩種(或更多種)絲狀真菌親代菌株的融合所形成的細胞，每個異核體細胞因此都含有兩個(或更多個)遺傳上有所不同的細胞核。異核體含有親代菌株的細胞核，所述親代菌株通常都是所有異核體相容性等位基因的純合子(除了當存在tol基因時的交配型等位基因(mating type allele))。已經(jīng)鑒定出至少十個異核體不相容性的染色體位點het-c、het-d、het-e、het-i、het-5、het-6、het-7、het-8、het-9和het-10，推測還存在著更多的位點。見Peris et al.，″Chromosomal Loci of Neurospora crassa″，Microbiological Reviews(1982)46426-570中的第478頁。
本發(fā)明通過提供用于利用異形核絲狀真菌生產(chǎn)一群多價疫苗的方法和組合物拓展了美國專利5,643,745、5,683,899和6,268,140所述的工作。能用這些方法和組合物發(fā)現(xiàn)并生產(chǎn)多價疫苗，例如抗病毒疫苗、抗細菌疫苗和抗真菌疫苗。
優(yōu)選實施方式本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生一群多價疫苗的新方法和組合物。通過給定抗原的有序或隨機組合產(chǎn)生多價疫苗。為了得到多價疫苗，在本方法中得到了異核體，其包括步驟將編碼多價疫苗的給定抗原的第一群DNA分子、第二群DNA分子、以及有時還將第三群或更多群DNA分子引入到第一種、第二種、以及有時是第三種或更多種真菌親代宿主內，利用第一種、第二種、以及有時還利用第三種或更多種親代真菌宿主產(chǎn)生了異核體真菌株；然后如果合適，在能表達編碼亞基的DNA的條件下培養(yǎng)所形成的異核體，并且進一步地篩選出所形成的能生產(chǎn)具有所需性能的多價疫苗的異核體。下面詳細地描述了每個部分，即真菌親代菌株、DNA分子和融合方法。
絲狀真菌的性質以及異核體形成的背景要求真菌可以以單個的單個核細胞的形式存在，所述單個核細胞生長成絲狀的多個核的菌絲、酵母細胞、具有多個孢子的子實體、和/或有性分化的細胞。它們也可以以多個核的形式存在。真菌如霉菌的生長形式的基本元件是菌絲，其為一種分支的管狀結構，直徑約為2μm到10μm。菌絲是通過其頂端的延長(頂端生長)和通過側支的形成進行生長。因此，當菌落生長時，其菌絲會形成纏繞著的絲的塊。
一些菌絲滲透到培養(yǎng)基內，真菌從中吸收營養(yǎng)物并生長于其中，同時這些菌絲會突出到培養(yǎng)基的表面，形成了“氣生菌絲體”。大多數(shù)菌落都生長于液體的或固體的培養(yǎng)基內，形成不規(guī)則的、干燥的、絲狀的團(mats)。在大多數(shù)物種中，菌絲被稱作“隔(septa)”的橫壁分割開來。但是，這些隔都有著細微的、中央的細孔。因此，甚至有隔菌絲都具有包埋于連續(xù)的細胞質中的細胞核，實際上在其可轉運的細胞質內含有多個細胞核。
術語“絲狀真菌”表示那些能通過分支的、纏繞的菌絲形成菌絲體的真菌，盡管菌絲受到了橫壁的隔斷，但是橫壁上的細孔容許細胞質在隔室之間流動。當進行有性繁殖時，許多這樣的真菌在囊內形成了減數(shù)分裂的孢子。在適當?shù)拇碳は?，可以發(fā)生無性生殖，不過機理還不是很清楚。對于這種形式的生殖而言，在沿著菌絲的多個部位上所形成的發(fā)芽突起的頂部外生了稱作“分生孢子”的孢子。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的異核體組的絲狀真菌通常是藻菌綱(Phycornycetes)、子囊菌綱(Ascomycetes)、擔子菌綱(Basidiomycetes)、和半知菌綱(Deuteromycetes)。藻菌綱包括所有的無隔的和一些有隔的絲狀真菌。它們的無性孢子是不同類型的，包括在專門化的莖末端上形成的囊內所含有的孢囊孢子。不同的物種有著不同的性周期。
子囊菌與其它真菌有所不同的結構是子囊，一種含有稱作子囊孢子的有性孢子的囊樣結構。子囊孢子是交配、雄性和雌性核的融合、兩次減數(shù)分裂、以及通常1次終末有絲分裂的終產(chǎn)物。通過在專門化結構的表面上形成的有性孢子可以區(qū)分出擔子菌。半知菌常被稱作“不完全菌(imperfect fungi)”，因為還沒有觀察到有性階段。它們的菌絲都是有隔的，并且分生孢子形式與子囊菌的那些分生孢子形式相似。
優(yōu)選的絲狀真菌是子囊菌綱，更優(yōu)選地是鏈孢霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、木霉屬(Tricoderma)、金孢子菌屬、和青霉屬。特別優(yōu)選的種來自鏈孢霉屬包括中間型鏈孢霉(N.intermedia)、粗糙鏈孢霉、N.sitopula、和N.tetraspora，其中最優(yōu)選的種是粗糙鏈孢霉。有用的曲霉菌種包括構巢曲霉、黑曲霉、土曲霉、和煙曲霉。
絲狀真菌的贅生物生長包括核分裂和細胞分裂(有絲分裂)。這種類型的細胞分裂包括無性生殖，即新菌落的形成是通過分生孢子的途徑，這不涉及配子，也不涉及核融合。例如，鏈孢霉屬的物種的細胞核內都含有7個不同的染色體，每個染色體都只有單一拷貝，即贅生物生物體是單倍體。在菌絲體生長期間以及通過形成分生孢子的無性繁殖期間通常都保持這種單倍體狀態(tài)。
也可以發(fā)生有性生殖，不同配子類型的兩個單倍體細胞(菌絲或分生孢子)融合形成了含有兩個不同核的雙核細胞。因此兩個單倍體核共存于相同的細胞質內，同時在合胞體內或多或少地進行分裂。但是如果細胞啟動了子囊孢子形成，兩個不同的單倍體核可以融合形成二倍體核，其含有成對的同源染色體。然后這種二倍體細胞開始減數(shù)分裂。
“異核體”(或異形核細胞)是具有兩個(或多個)遺傳學上不同的細胞核的細胞。本發(fā)明的異核體必須含有來自其中所有異核體相容性等位基因(除了當存在tol基因時的交配型等位基因)都為純合子的細胞的細胞核。例如在鏈孢霉菌中，已經(jīng)鑒定出了至少10個異核體不相容性的染色體位點het-c、het-d、het-e、het-i、het-5、het-6、het-7、het-8、het-9和het-10，推測還存在著更多的位點。見Perkins et al.，″ChromosomalLoci of Neurospora crassa″，Microbiological Reviews(1982)46426-570中的第478頁。
如果兩個菌株都攜帶有一個或多個het位點的不同的等位基因，它們就不能形成穩(wěn)定的異核體。在不同的異核體融合之后或者在往不同的菌株內微注射了細胞質或提取物之后都會發(fā)生原生質體殺滅。當重復體(部分二倍體)是het的一種或多種等位基因的雜合體時，其生長受到抑制并且是十分異常的。通過異核體檢查首次鑒定出了大量的異核體不相容性位點(具體地是het-c、-d、-e和-i)。用重復體檢測出了het-5到-10，因為天然群體中的het位點的差異是普遍的。參考文獻同上。
交配型等位基因“A”和“a”在粗糙鏈孢霉中也可作用為het基因，盡管可以出現(xiàn)一些緩慢的異核型生長。微注射試驗已經(jīng)涉及到殺滅反應中的蛋白。因此，相反的交配型對于與異核型aseogenous菌絲的增生相關的復雜事件通常也是重要的。參考文獻同上的第436和478頁。但是，如果存在tol基因時，抑制了與相反的交配型等位基因A和a相關的贅生物(異核體)不相容性，且不影響性相容性。因此，(tol；A+a；a)異核體可以是完全相容的和穩(wěn)定的，只要其它的het位點是相同的等位基因(或共等位基因的(conallelic))，并且存在tol基因，A/a重復體就可正常生長。
如果提供了來自對于相容性位點是共等位基因的(conallelic)兩種不同的菌絲，當它們生長于相同的培養(yǎng)基時，它們可以融合，特別是如下所述的融合是強制性的。然后所形成的培養(yǎng)物含有來自兩個菌株的細胞核，所述細胞核循環(huán)于共同菌絲體團的共有細胞質內。
構建編碼給定抗原的混合群的表達單元在描述本發(fā)明時，根據(jù)如下設定的定義使用下面的術語本發(fā)明涉及在絲狀真菌異核體內生產(chǎn)“異源的多價疫苗”。在上下文中，“異源的”表示蛋白通常不是真菌產(chǎn)生的?！岸鄡r”表示最終的疫苗產(chǎn)物是由至少兩種抗原或抗原變體構成的。產(chǎn)物可以是異多價疫苗，包括完全不同的疫苗，或者可以是同多價疫苗，是由單個亞基的變體組成。多價疫苗的實例包括但不限于，來自細胞表面的重組抗原的混合物、病毒被膜蛋白、特殊致病性蛋白抗原等。
“編碼抗原的核苷酸序列”是序列的一部分，其中當所述序列與合適的控制序列可操縱地連接時，其轉錄物被翻譯成了多肽。用5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的終止密碼子確定出編碼序列的界限。該編碼序列可以來源于例如原核基因、真核mRNA的cDNA、真核DNA(例如真菌)的基因組DNA序列，或者可以包括合成DNA。多腺苷酸信號和轉錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。
當控制序列影響到合適宿主細胞內的編碼序列的表達時，編碼序列與控制序列是“可操縱地連接的”。
“表達單元”是含有與“控制序列或區(qū)域”可操縱地連接的編碼序列的DNA分子，所述控制序列或區(qū)域在合適的條件下指導可操縱連接的序列在合適宿主生物體內的轉錄和翻譯。
當這些外源DNA已經(jīng)被引入到宿主細胞膜內時，說明細胞已經(jīng)被外源DNA所“轉化”。對于原核生物例如細菌而言，外源DNA可以保持于游離基因元件例如質粒內。因為絲狀真菌確實具有核(是真核生物)，被最穩(wěn)定轉化的真菌宿主細胞含有整合到染色體內的外源DNA，使得其可以通過染色體復制被子代細胞所繼承。
“重組宿主”表示已經(jīng)被或者即將被經(jīng)重組技術制備的DNA序列轉化的細胞，其包括原代轉化的細胞及其培養(yǎng)物和后代。
可以采用多種方法產(chǎn)生一群DNA分子，其編碼1)多價疫苗的抗原亞基的天然存在的變體；2)多價疫苗的抗原的隨機產(chǎn)生的或選定的變體；或者3)多價疫苗的抗原的合理設計的或選定的變體。下面用流感疫苗作為舉例說明的實例。本領域技術人員可以容易地用下面羅列的方法或本領域已知的等價方法產(chǎn)生編碼亞基的DNA分子群。
用標準的cDNA產(chǎn)生/克隆技術可以產(chǎn)生編碼具有天然異質性的抗原的抗原的天然存在的變體的DNA分子群。首先從病原體中分離出mRNA或病毒基因組RNA群，例如對于流感疫苗而言，直接從病毒本身的基因組RNA中分離出RNA群。在本領域已知的克隆方法例如RTPCR中，所分離的RNA分子群被用作產(chǎn)生cDNA分子的模板。因此可以將所產(chǎn)生的cDNA分子群插入到如下所述的合適的表達單元內。
或者，對于已知其蛋白序列的抗原而言，用本領域已知的方法可以產(chǎn)生人工cDNA序列，所述序列整合有絲狀真菌宿主菌株高頻率地用其產(chǎn)生它自己的內源性蛋白的密碼子。
另外，可以對編碼多價疫苗的抗原的分離的或人工的cDNA分子實施定點或隨機誘變，以產(chǎn)生特殊亞基的非天然存在的變體。可以容易地用例如隨機的或定點錯配PCR引發(fā)(priming)、接頭分區(qū)誘變、或化學和物理誘變的方法產(chǎn)生編碼抗原的合理設計的或隨機產(chǎn)生的變體的DNA分子群。例如，可以用隨機產(chǎn)生的或合理設計的PCR引物產(chǎn)生抗原編碼序列內的隨機的或靶向的異質性。
當選擇標準例如蛋白折疊或選擇特殊的靶殘基或區(qū)域被用于產(chǎn)生變體或選擇編碼變體的DNA分子時，變體在此被認為是合理設計的。當產(chǎn)生或選擇變體編碼DNA分子時沒有使用選擇標準時，變體被認為是隨機產(chǎn)生的。
用于產(chǎn)生多價疫苗亞基中的異質性的優(yōu)選的靶位點是免疫原性表位及其周圍的氨基酸序列。對于流感病毒抗原基因而言，這種類型的變異形成位于每個抗原的已知的天然可變區(qū)的中心。例如，可以一個接一個地改變可變區(qū)內的每個氨基酸，以產(chǎn)生已知變異的文庫。
構建編碼多價疫苗的抗原的表達單元利用公知的技術構建出含有編碼多價疫苗的抗原的核苷酸分子的表達單元。通過將亞基編碼序列放置于與最終的絲狀真菌宿主內指導表達亞基編碼序列的控制序列可操縱地連接，產(chǎn)生表達單元。
本領域目前已知有多種用于以組成或誘導的方式指導可操縱地連接的蛋白編碼序列的表達的控制元件。根據(jù)所用的真菌菌株、培養(yǎng)真菌所采用的條件、所需的蛋白表達水平、和所需的表達性能(例如誘導型對組成型)選擇控制序列。本領域技術人員可以容易地用本領域已知的控制序列產(chǎn)生在本異核體組中所用的表達單元。
除了指導蛋白編碼序列的轉錄和翻譯的序列之外，本發(fā)明的表達單元還可以控制信號序列、指導抗原輸出到細胞外的表達控制元件。Dalbey R.E.，et al.，TIBS 17474-478(1992)提供了對絲狀真菌的已知的分泌信號的綜述。本領域技術人員可以容易地產(chǎn)生含有分泌信號的表達單元。
本發(fā)明的另一種形式的表達單元可以含有融合蛋白，其通過與宿主細胞或異源的膜錨定序列融合指導抗原位于細胞膜，或者通過與宿主細胞或異源的細胞表面分子融合指導抗原位于細胞表面。
在一個應用中，產(chǎn)生了重組單元，而不是表達單元。在這種情況中，位于亞基編碼序列或抗原編碼序列的片段側面的是含有與宿主真菌菌株的整合位點同源的序列的DNA區(qū)域。然后用同源序列刺激并指導重組單元和宿主染色體之間的同源重組。當使用重組單元時，優(yōu)選地首先用含有表達控制元件的表達單元轉化宿主菌株，隨后用靶向重組所用的序列進行轉化。例如，可以將流感抗原引入到宿主真菌內，然后可以用同源重組單元引入宿主染色體的靶區(qū)域內的異質性。
有時用中間宿主產(chǎn)生能夠轉化最終真菌細胞的中間載體。然后可以生長中間細菌轉化體，得到所需量的DNA，其被用于轉化所需的絲狀真菌宿主?？梢杂米髦虚g載體的常用的細菌載體的實例包括例如pBR322、pUC8和pUC9。其它有用的中間載體包括pHY201、pKBY2、pTZ18R、pX182和pCVTN2.9、pN807、pN846。
在另一個實施方式中，抗原或相關的物質被表達為與真菌疏水蛋白例如EAS的融合蛋白。通常大量地表達并分泌真菌疏水蛋白。然后用疏水蛋白涂層真菌的表面。已知這些蛋白在溶液中會發(fā)生聚集。這種聚集性能容許制備出聚集的重組蛋白，其形成了抗原顆粒?？梢约兓鲞@些蛋白并用作抗原。當在相同的培養(yǎng)物中表達出多個抗原時，就產(chǎn)生了多價抗原顆粒。
要明白本發(fā)明的這種描述和闡述覆蓋了在本發(fā)明的精神和范圍之內的所有實施方式。例如，本領域人員知道插入、缺失或取代開放閱讀框的氨基酸序列內的氨基酸基本上不會影響分子的抗原性，因此本發(fā)明包括通過對天然存在亞基的缺失、添加或取代所產(chǎn)生的這種多價抗原。
親代菌株的性質因為用于制備本發(fā)明的異核體的每種親代真菌菌株都含有編碼多價疫苗的抗原的DNA分子群的成分，所以一種真菌親代將具有被修飾成含有編碼所需多價疫苗的第一個抗原或抗原組的第一個DNA分子群的成分的細胞核，以及每個連續(xù)的真菌親代都將具有被修飾成含有所需多價疫苗的不同的抗原或抗原組的不同DNA分子群的成分的細胞核。例如，為了產(chǎn)生產(chǎn)二價流感疫苗的異核體，一種真菌親代將由A H1N1型流感病毒的cDNA產(chǎn)生抗原組，而另一種真菌親代將由A H3N2型流感病毒的cDNA產(chǎn)生抗原組。為了產(chǎn)生三價流感疫苗，一種真菌親代將由A H1N1型流感病毒的cDNA產(chǎn)生抗原組，第二種真菌親代將由AH3N2型流感病毒的cDNA產(chǎn)生抗原組，以及第三種真菌親代將由B HN型流感病毒的cDNA產(chǎn)生抗原組。核苷酸和蛋白序列都是公開的。例如，HA基因的示例序列包括H3N2(AY738729)、流感A病毒(A/Leningrad/54/1(H1N1))神經(jīng)氨酸酶基因(M38309)、流感A病毒(A/Swine/Ontario/42729A/01(H3N3))神經(jīng)氨酸酶(NA)基因(AY619975)、流感A病毒(A/Swine/Ontario/KO 1477/01(H3N3))神經(jīng)氨酸酶(NA)基因(AY619966)、流感A病毒(A/Swine/Saskatchewan/18789/02(H1N1))神經(jīng)氨酸酶(NTA)基因(AY619960)、流感A病毒(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1))片段6(NC 004523)、流感A病毒(A/mallard/Alberta/211/98(H1N1))神經(jīng)氨酸酶(NA)基因(AY633214)、流感A病毒(A/mallard/Alberta/99/91(H1N1))神經(jīng)氨酸酶(NA)基因(AY207541)、和流感A病毒(A/duck/Miyagil/9/77(H1N1))神經(jīng)氨酸酶(NA)基因(AY207534)。
除了如上述的每個親代菌株的細胞核都已經(jīng)被修飾成含有編碼抗原或抗原組的DNA分子外，每個親代菌株的細胞核還必須含有造成使得真菌依賴于第二個核、和/或第三個核和/或其它核的存在才能在形成異核體的條件下生存的特征的基因組。因此，每個親代的細胞核都賦予了將造成含有核的真菌不能在培養(yǎng)條件下生存的特征，除非同時也存在第二個細胞核、和/或第三個細胞核和/或更多的細胞核。例如，需要特殊營養(yǎng)物的親代必須與沒有這種需要的親代一起才能被培養(yǎng)于缺少這種營養(yǎng)物的培養(yǎng)基上。如果發(fā)生了菌絲融合，第二種親代就賦予了在缺乏這種營養(yǎng)物的條件下生存的能力。反過來，第二種親代可能需要第一種親代所不需要的不同的營養(yǎng)物。當兩種營養(yǎng)物都缺乏時，僅僅含有兩種核的真菌才能生存。
所需的營養(yǎng)物可以是真菌菌株細胞的生長所需的、或者當缺少時會嚴重地損害真菌菌株生長或生存的能力的任一物質。有用的營養(yǎng)物需求以及相關突變體的實例包括(1)氨基酸例如組氨酸(his-1到-7突變體)、脯氨酸(aga突變體)、精氨酸(arg-11突變體)、瓜氨酸(arg-11突變體)、門冬酰胺(asn突變體)、膽堿(chol-1和chol-2突變體)、半胱氨酸(cys-1突變體)、谷氨酰胺(gln-1突變體)、亮氨酸(leu-1到4突變體)、賴氨酸(lys-2、-4和-5突變體)、甲硫氨酸(mac突變體和met-6、-9和-10突變體)、和蘇氨酸(thr-2和-3突變體)。
(2)芳香族氨基酸混合物，例如對氨基苯甲酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的混合物(所有aro菌株都需要，除了aro-6、aro-7和aro-8)、色氨酸和苯丙氨酸的混合物(aro-6突變體需要)、異亮氨酸和頡氨酸的混合物(ilv-1、-2和-3需要)、以及苯丙氨酸和酪氨酸的混合物(pt突變體需要)。
(3)維生素例如泛酸(pan-1突變體)和硫胺素(thi-2和thi-4突變體)。
(4)嘌呤堿基例如腺嘌呤(ad-2到ad-4和ad-8突變體)、次黃嘌呤(ad-2和ad-3突變體)、肌苷、和鳥嘌呤或鳥嘌呤核苷(gua-1或-2突變體)。
(5)嘧啶堿基例如尿嘧啶(pyr-1到pyr-6)。
(6)飽和脂肪酸(cel突變體)或在9或11位點上具有順式構象的雙鍵的不飽和脂肪酸例如C16或C18脂肪酸、在9位點上具有反式構象的雙鍵的脂肪酸、以及具有經(jīng)甲撐橋中斷的多個順式雙鍵的脂肪酸(ufa-1和-2)。
(7)生理上重要的離子例如鉀離子(trk)。
(8)糖醇例如肌醇(acu和inl突變體)和甘油。以及(9)其它的有機物例如乙酸(ace突變體)、I-酮戊二酸、琥珀酸、蘋果酸、甲酸或甲醛(for突變體)、對氨基苯甲酸(pab-1、-2和-3突變體)、和磺胺(35℃下的sfo突變體)。
基于營養(yǎng)物需求的一個特殊實例是編碼酶鳥氨酸轉氨甲酰酶的ArgB+基因。野生型黑曲霉含有這種酶。用常規(guī)的一般技術例如用紫外線照射處理以及之后通過依據(jù)不能在基本培養(yǎng)基中生長的能力以及在含有精氨酸的培養(yǎng)基中生長的能力進行篩選，可以制備出缺少這種酶的突變體(ArgB-株)。如果它們也含有ArgB+核，含有這種基因組的真菌可以在基本培養(yǎng)基中生長。
也能用于強迫異核體形成的基因是賦予對多種細胞毒藥物中的任何一種藥物的耐藥性的基因。例如，在可選擇的實施方式中，其中一種親代可以具有一種營養(yǎng)物需求以及對經(jīng)有害化學試劑、抗生素或病毒、或惡劣環(huán)境條件例如其它親代對此敏感的預定的溫度范圍所誘導的毒性作用的抗性。
可以施加毒性作用的有害化學試劑的特殊實例包括吖啶黃(通常由acr賦予抗性，acr-4和acr-6賦予抗性需要shg基因的存在)、3-氨基-1，2，4-三唑(由acr-2、atr-1、cpc、leu-1或leu-2賦予抗性)、染料例如孔雀綠(由acr-3賦予抗性)、咖啡因(由caf-1賦予抗性)、嘌呤類似物(由aza-1賦予對8-氮雜腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤的抗性；由aza-2賦予對8-氮雜鳥嘌呤和6-巰基嘌呤的抗性；由mep(3)和mep(10)賦予對6-甲基嘌呤的抗性)、氰化物(由cni-1賦予在生長的頭24個小時內的不敏感性)、四唑鹽(由cya-6和cya-7賦予抗性)、亞胺環(huán)己酮(由cyh-1、-2和-3賦予抗性)、鉻酸鹽(由cys-13賦予抗性)、2-脫氧-D-葡萄糖(由dgr賦予抗性)、伊短菌素(由edr-1和-2賦予抗性)、乙硫氨酸(由eth-1賦予抗性，在存在對氟苯丙氨酸時由nap賦予抗性；如果乙硫氨酸是D形式，則由oxD賦予抗性)、氟化合物例如5-氟脫氧尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、和5-氟尿甙(由fdu-2賦予對所有三種化合物的抗性；在無氨的基本培養(yǎng)基中，由uc-5賦予對5-氟尿嘧啶的抗性；由ud-1賦予對5-氟脫氧尿嘧啶和5-氟尿甙的抗性)、和氟苯丙氨酸(在某些條件下由fpr-1到-6賦予抗性)、8-氮雜腺苷(由mts賦予抗性)、甲基甲烷磺酸(upr-1賦予不敏感性或輕微敏感性)、表面活性物質例如地喹氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、和氯化苯甲烴銨(由sur-1賦予抗性)、以及金屬離子例如釩酸鹽(由van賦予抗性)。
施加毒性作用的抗生素的實例通常包括苯菌靈(甲基-1-(丁基氨甲酰苯并咪唑-2-基-氨基甲酸酯)(由Bncil賦予抗性)、抗菌素A(由cni-1賦予在生長的頭24個小時內的不敏感性)、聚烯抗生素例如制霉菌素(由erg-1和3賦予抗性)、以及寡霉素(由oli賦予抗性)。
能賦予對各種極端的環(huán)境條件的抗性的基因也是有用的，所述環(huán)境條件是例如高溫或低溫、缺氧(由an賦予抗性)、恒光照(由Hs-1、-2和-3賦予抗性)或缺乏光照、紫外線、離子射線、以及高滲透壓或低滲透壓。在特別優(yōu)選的實施方式中，對毒性作用的抗性就是對抗生素例如潮霉素的抗性。
本發(fā)明所普遍使用的菌株可以生長于蓋棉花塞的試管中的IX Vogel基本培養(yǎng)基(N培養(yǎng)基)內，根據(jù)菌株的表型往培養(yǎng)基中加入添加物，例如組氨酸、精氨酸和/或肌醇。例如可以從Fungal Genetics Stock Center(“FGSC”)以及從斯坦福大學D.D.Perkins得到常用的菌株。被認為有用的另一種粗糙鏈孢霉菌株是M246-89601-2A(來自Dr.Mary Case，University of Georgia，Athens)。該菌株是野生型74A的衍生物，其含有穩(wěn)定的qa-2突變(M246)、arom-9突變(M6-11)和inos(io601)突變。雙重突變體qa-2、arom-9缺少生物合成的和代謝的脫氫奎尼酸酶活性，并且不能在沒有芳香族氨基酸添加物的基本培養(yǎng)基中生長，例如所述芳香族氨基酸是濃度為約80μg/mL的苯丙氨酸。
也從Fungal Genetics Stock Center得到有用的黑曲霉株(ATCC46951)以及鐮刀菌、麻孢殼屬(Gelasinospora)和糞生殼糞殼菌(Sordaria fimicola)的菌株，或者用紫外線誘變也能制備形成其在給定基本培養(yǎng)基中的生長需要鳥嘌呤和精氨酸的分離株。這種缺乏氨甲酰轉移酶的菌株叫作argB(350(-)52)。Cove，Biochim Biophys Acta(1966)11351-56描述了用于生長黑曲霉或構巢曲霉的培養(yǎng)基。
通常用標準方法保持菌株和制備分生孢子(Davis and de Serres，Methods Enzymol(1971)17A79-141)。菌絲體通常在液體培養(yǎng)物中生長約14個小時(25℃)，如在Lambowitz et al.J Cell Biol(1979)8217-31中所述的那樣。宿主菌株通常生長于添加有適當營養(yǎng)物的Vogel或Fries基本培養(yǎng)基中，所述營養(yǎng)物是例如組氨酸、精氨酸、phe、tyr、和/或trp(每種都為約80μg/mL)、對氨基苯甲酸(約2μg/mL)、和肌醇(約0.2mg/mL)。
許多具有所需特征的真菌菌株都是公眾可得到的。但是，如果菌株不容易得到，本領域一般人員可以利用本領域公知的選擇技術分離出提供有所需特征的所需突變體或遺傳加工過的細胞核。下面的表顯示了舉例說明的親代組合。
表1Diakaryon組合 親本1 親本2表型需要組氨酸 色氨酸或者需要精氨酸 賴氨酸或者需要尿嘧啶 胸腺嘧啶Trikaryon組合 親本1 親本2 親本3表型 需要 組氨酸 色氨酸 精氨酸和 色氨酸精氨酸 組氨酸(給融合配偶體提供)(精氨酸) (組氨酸)(色氨酸)Tetrakaryon 親本1 親本2 親本3 親本4表型 需要 組氨酸色氨酸 精氨酸 亮氨酸和 色氨酸精氨酸 亮氨酸 組氨酸和 精氨酸亮氨酸 組氨酸 色氨酸(給融合配偶體提供)(亮氨酸) (組氨酸)(色氨酸) (精氨酸)如表中所示的那樣，可以選出各種互補特征/性能組合以滿足不同的融合條件。突變體菌株一般都具有營養(yǎng)物需求，而通過用抗性基因的表達載體修飾核可以更便利地賦予抗某些物質的能力?；蛘撸弥亟M技術例如與轉化載體的同源重組可以實現(xiàn)營養(yǎng)物需求，以及通過在存在毒性條件的條件下通過突變可以賦予抗性。
在本發(fā)明的一個實施方式中，宿主細胞被轉換成了用于轉化的原生質體。當使用原生質體時，它們的優(yōu)選的制備方法是例如用甲殼酶/glutamase混合物對細胞壁的酶消化。對用于酶消化的合適的酶的選擇是在本領域技術人員的知識范圍之內。有用的酶是那些能夠消化復合多糖的酶，在已知能有效地制備多種真菌物種的真菌原生質體的酶中可以發(fā)現(xiàn)這些有用的酶。合適的酶的特殊實例包括Novozyme 234(一種酶的粗制混合物)和β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucurouidase)?？梢杂闷渌线m的方法產(chǎn)生原生質體。但是，如果鑒定出能讓載體滲入到細胞壁的合適方法，可以與原生質體一起使用真菌宿主的整個細胞壁或者用整個細胞壁取代原生質體。
為了修飾真菌宿主菌株，使之含有編碼多價疫苗的特殊亞基的DNA的表達單元，除非特殊標注，本發(fā)明的實施都采用本領域人員的能力范圍之內的分子生物學、微生物學、和重組DNA技術。在文獻中充分地解釋了這些技術。見，例如Maniatis et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(1982)；D.N.Gover et al.DlSTA CloningA PracticalApproach(1985)Volumes I and II；寡核苷酸合成(M.J.Gait ed.1984)；核酸雜交(Hames et al.eds.1985)；轉錄和翻譯(Hames et al.eds.1984)；動物細胞培養(yǎng)(R.I.Freshhey ed.1986)；固定化細胞和酶(IRL Press1986)；B.Perbat，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)。
用于轉化粗糙鏈孢霉的常用方法一旦將編碼多價抗原的DNA分子群放入到了表達單元內，用DNA分子轉化絲狀真菌的親代宿主菌株，例如Smart“Heterologous dimericproteins produced in heterokaryons”所述的那樣。粗糙鏈孢霉是從FungalGenetics Stock Center公開得到的，但是也可以使用獨立制備的菌株。如Stadler et al.Genetics(1966)54677-685和Haas et al.Genetics(1952)37217-26所述的，可以從頭分離出突變體。也可以從斯坦福大學D.D.Perkins得到有用的菌株。菌株通常生長于蓋棉花塞的試管中的IX Vogel基本培養(yǎng)基(“N培養(yǎng)基”)內，根據(jù)菌株的表型添加合適的添加物。
原生質體作為轉化的對象。為了形成分生孢子的原生質體，將真菌接種到4到5個125ml錐形瓶(用棉花塞蓋住)中的添加有合適添加劑的25ml固體N培養(yǎng)基上。培養(yǎng)物在室溫下生長5-7天。
通過往每個瓶內加入10ml N培養(yǎng)基、更換棉花塞，和搖晃培養(yǎng)瓶收集到分生孢子。晾置固體數(shù)分鐘。將分生孢子混合物傾倒到懸掛在錐形瓶口上的經(jīng)高壓滅菌的粗棉布包內，并用一根或多根橡膠帶將其扎緊?；厥者^濾液，用血細胞計數(shù)儀測定出分生孢子的濃度，將鏈(chains)計為一個。
往150ml含有1.5％蔗糖和合適添加物的液體N培養(yǎng)基中加入2×109個分生孢子。分生孢子在蓋有棉花塞的燒瓶內發(fā)芽，同時在室溫下?lián)u晃5-6個小時(150-200rpm)，直到超過75％的分生孢子已經(jīng)發(fā)芽以及發(fā)芽管的長度為1-4個分生孢子直徑。通過在約1500-2000rpm下離心10分鐘收集細胞。用水沖洗細胞沉淀3次。
然后將沉淀重懸于10ml 1.0M山梨糖醇內，通過在等滲條件下用酶清除堅硬的分生孢子的細胞壁以阻止在形成原生質體時發(fā)生原生質體“爆炸”，可以制備出原生質體。方案采自Vollmer和Yanofsky的方法Proc Natl Acad Sci USA(1986)834869-73。
具體地，在無菌的250ml錐形瓶內，往50mg Interspex出售的固體酶(商品名為Novozyme234)中逐漸加入分生孢子懸浮液。在30℃下?lián)u晃(100rpm)混合物約1個小時(4±10分鐘)，以消化細胞壁。通過顯微鏡下檢查蓋玻片下的混合物小液滴監(jiān)測原生質體的形成過程?？梢詸z測出原生質體，因為當往蓋玻片的一端加入水時，它們可以發(fā)生滲透裂解。在分生孢子形成的晚期應當更頻繁地監(jiān)測這個過程。
將原生質體混合物傾倒到無菌的15ml尖底離心管內，通過在swinging bucket臺式離心機中500rpm下離心10分鐘可以回收原生質體。用10ml 1.0M山梨糖醇洗滌所得到的沉淀物2次，然后用下面的STC溶液洗滌1次91g山梨糖醇、50mM Tris.Cl、50mM CaCl2、用足量的NaOH將pH值調整到8.0，并加量到500ml。
將最終的原生質體沉淀懸浮于16.0ml STC、200μl DMSO和4ml下面的PTC溶液的混合物中200g Sigma出售的商品名為“4000”的聚乙二醇、50mM Tris.Cl、50mM CaCl2、用足量的NaOH將pH值調整到8.0，并加量到50ml。
可以直接使用所形成的原生質體懸浮液，或者可以按1.0ml凍存于-80℃。
在無菌的、15ml螺旋帽的試管內，通過輕搖試管混合2.0μl 50mM亞精胺溶液、5.0μl轉染的質粒DNA以及5.0μl 5mg/ml肝素溶液，所述質粒DNA含有所需多價疫苗的抗原的表達載體以及選擇標記物例如苯菌靈耐藥基因(濃度通常為1.0mg/ml)。通過將12.83mg亞精胺溶解于1.0ml TE內并調整pH值為8.0可以制備出亞精胺溶液，并且可以儲存于-20℃。通過將50mg肝素鈉鹽溶解于10mlSTC內可以制備出感染溶液，并儲存其凍干部分。
在臺式離心機上短暫地旋轉(脈沖式的)試管內容物，然將其放置于冰浴箱內。往試管內加入約50-100μl凍融的原生質體。然后在冰上賦予混合物約30分鐘，但是冰上孵育時間為20分鐘也取得了成功。加入約1ml PTC，輕搖試管混合。然后將混合物在室溫下再孵育約20分鐘。
通過混合20ml 50x Vogel基本培養(yǎng)基、825ml水、182g山梨糖醇、和28g瓊脂可以制備出再生“頂層”瓊脂。高壓滅菌頂層瓊脂，并加入100ml 10x FIGS溶液(含有5g/l果糖、2g/l肌醇、2g/l葡萄糖、和200山梨糖)。在50℃-55℃下孵育15ml頂層瓊脂，并將其傾倒到含有原生質體和質粒DNA的試管內。通過輕搖并倒轉試管2到3次快速地混合內容物，然后均勻地傾倒到鋪板的“底層”瓊脂層上。
通過混合任一所需的添加物、1xN培養(yǎng)基；高壓滅菌，并加入10xFIGS和苯菌靈(如果用苯菌靈耐藥性作為標記物)制備出“底層”瓊脂，F(xiàn)IGS和苯菌靈的終濃度分別是1x和0.5μg/ml。將體積為25ml“底層”瓊脂傾倒到Petri培養(yǎng)板上，并使得其變硬。
在將頂層瓊脂傾倒到底層瓊脂上之后，通過加熱去除氣泡。直立放置培養(yǎng)板，知道頂層瓊脂已經(jīng)固化(約5分鐘)。如果頂層瓊脂過早地變硬，可以預加溫底層瓊脂培養(yǎng)板。一旦頂層瓊脂已經(jīng)固化，將培養(yǎng)板在30℃下倒置孵育。
為了選擇出粗糙鏈孢霉轉化體，將宿主培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基(具有只有轉化細胞才能利用的組合物或者含有只有轉化細胞才具有耐藥性的抗生素)內，并在34℃下孵育。在鋪板后約24-36小時可以發(fā)現(xiàn)成功轉化的指示。在生長3天后，穩(wěn)定轉化體被總體評分。檢測出轉化體所需的孵育時間根據(jù)宿主菌株和表型標記物的不同會有所不同。
用標準方法例如合適的ELISA、菌落印跡免疫檢測法、限制性內切酶分析、濾膜雜交、嵌套缺失亞克隆等可以篩選出所選的轉化體是否表達所需的抗原亞基。
在本發(fā)明中，用上述的重組技術生產(chǎn)表達所需重組抗原或抗原組的真菌宿主菌株，每個宿主菌株都具有一種或多種在特定條件下負面地影響生長的特性，但是所述特性是可以被一種或多種其它的細胞核所賦予的性能糾正的。
所形成的宿主菌株是用于形成本發(fā)明的異核體的親代菌株。
或者，可以用電穿孔方法轉化新采集的絲狀真菌例如鏈孢霉菌的分生孢子(Van，D.C.Fungal Genetics Newsletter No.42A(Supplement)(1995))。通常從7-28天的培養(yǎng)物中采集到分生孢子。用1M山梨醇溶液洗滌細胞，并將其配成終濃度為2.5×109個細胞/ml的懸浮液。往分生孢子懸浮液部分加入近5μg線性DNA，然后將其一部分放置于電穿孔杯例如具有0.2cm缺口的電穿孔杯的底部。電穿孔機例如In Vitrogen電穿孔機II被設定為電壓梯度約為7.25kb/cm、以及約71μF和約200歐姆。在電穿孔之后，將細胞鋪板于具有或不具有基本上如上所述的頂層瓊脂的合適培養(yǎng)基上。
在轉化之后，通過在用于特殊宿主細胞和每種個別情況中所用的表達單元的選擇培養(yǎng)基上擴增培養(yǎng)物可以建立源自每個分子變體的穩(wěn)定的生產(chǎn)菌株。
異核體的產(chǎn)生因為就所有的異核體相容性等位基因(如上面所解釋的，除了當存在tol基因時的交配型等位基因)而言，所選出的所有真菌宿主菌株都是共等位基因(conallelic)，因此當在沒有一種宿主菌株能單獨存活的條件下一起培養(yǎng)宿主菌株時，真菌能融合，使得形成本發(fā)明的異核體真菌。通過菌絲融合，宿主真菌的不同的單倍體核可以共存于共同的細胞質內。雖然不希望受任何理論的約束，本發(fā)明人相信每個細胞內的膜內顆粒的聚集造成了膜融合，使得在無蛋白區(qū)域之間的細胞接觸成為可能。然后接觸區(qū)內的脂質重排導致了細胞的完全融合。
因為每個親代都含有能產(chǎn)生多價疫苗的不同抗原的細胞核，所形成的異核體能夠產(chǎn)生完整的包括多個抗原的多價疫苗。
據(jù)此所形成的異核體是穩(wěn)定的，其中核以相同的速度分裂。
生產(chǎn)給定多價疫苗的異核體的產(chǎn)生本發(fā)明的組合物和方法采用了表達源自病原生物體的免疫原性抗原的異核體。如上所述，兩種或多種宿主菌株形成了所述異核體，每個異核體都生產(chǎn)不同的多價疫苗。
一個實例是產(chǎn)流感抗原變體的異核體。為了產(chǎn)生這樣一種菌株，在沒有任何營養(yǎng)添加物的固體培養(yǎng)基底物上混合每種單個親代菌株的分生孢子懸浮液，或者對于具有耐藥性基因的宿主細胞而言，是在含有細胞毒藥物的培養(yǎng)基上進行混合。可以形成由親代菌株的預定組合所構成的異核體，或者可以形成利用微滴定板的矩陣格式或其它常用格式的異核體文庫。下面的表(表2)中舉例說明了一些可得到的組合，其僅僅是舉例說明的形式，并不表示任何形式的限定。
表2用于產(chǎn)生多價疫苗的異核體的產(chǎn)生親代宿主細胞含有來自流感病毒株的基因AH1N1或AH3N2或BHN具有抗原變體a、b、c... d、e、f... g、h、j...
根據(jù)用戶的選擇可以產(chǎn)生單個疫苗生產(chǎn)菌株異核體的組成菌株c加上 菌株f加上 菌株h或者可以產(chǎn)生一組疫苗生產(chǎn)菌株例如異核體1的組成 菌株a加上 菌株d加上 菌株g異核體2的組成 菌株a加上 菌株e加上 菌株h異核體3的組成 菌株b加上 菌株f加上 菌株i以及如果需要，可以包括所有可能的組合，其中“A”＝A型流感病毒；“B”＝B型流感病毒；“H”＝血凝素；“N”＝神經(jīng)氨酸酶；“變體”＝流感病毒類型的H和N抗原的抗原類型與菌株的不同組合。
常用的基本培養(yǎng)基含有按每升計，5.0g葡萄糖、50.0ml鹽溶液(見下)、1.0ml微量元素(見下)、和12.5g瓊脂(pH值調整為6.5)(如果所需的培養(yǎng)基為固體形式)。鹽溶液含有120.0g NaNO3、10.4g KCl、10.4gMgSO4、和30.4g KH2PO4。
微量元素溶液包括1.1g(NH4)6Mo7O24.4H2O、11.0g H3BO3、1.6gCoCl2.6H2O、1.6g CuSO4、50.0g Na2EDTA、5.0g FeSO4.7H2O、5.0gMnCl2.4H2O、和22.0g ZnSO4.7H2O(pH值為6.5)。
因此，為了使得異核體絲狀真菌保持住其異形核狀態(tài)，需要保持外界的強迫力。異核體真菌細胞在基本培養(yǎng)基中的生長“強迫”菌株仍保持在一起。如果交配型是相反的，可以用tol基因保持穩(wěn)定的(A+a)異核體。
通過在有利于產(chǎn)生抗原的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的異核體可以產(chǎn)生多價疫苗?？梢詮呐囵B(yǎng)物中回收多價疫苗抗原，并用適合的標準技術進行純化，所述技術必須要保留住抗原的結構。
優(yōu)選地，異核體絲狀真菌攜帶有表達單元，其容許所培養(yǎng)的宿主將所需的多價疫苗直接地分泌到基本生長培養(yǎng)基內，使得可以從無細胞的培養(yǎng)基中直接純化出多價疫苗。或者，異核體絲狀真菌攜帶有表達單元，其指導抗原表達于細胞表面?？梢詮募毎呀馕镏蟹蛛x出細胞內產(chǎn)生的多價疫苗。有用的純化方法是本領域人員的能力范圍之內，例如分子尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法、HPLC、親和色譜法、疏水作用色譜法等等。
抗原所闡述的發(fā)明涉及制備抗病原體(特別是證實有改變其抗原特征的的能力的病原體)的抗原組合物例如疫苗。真核的、病毒的、細菌的和真菌的抗原都包括在本發(fā)明的用途之內。本發(fā)明的另一個用途是制備同時抗多種不同抗原的抗原組合物。本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式涉及制備多價流感疫苗。流感病毒一直都在發(fā)生突變并產(chǎn)生新的病毒株。因此，沒有必要限制在本發(fā)明中所列的個別基因，因為本發(fā)明適用于任何流感病毒株或者任何病原體株。
存在三種類型的流感病毒A、B和C型流感病毒。A和B型流感病毒幾乎每年都會引起疾病流行，而C型病毒僅僅引起輕微的呼吸道不適，并被認為是臨床上不重要的一種病毒類型。根據(jù)病毒表面上的兩種蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)可以將A型流感病毒分成亞型。目前感染人類的A型流感病毒的亞型是A(H1N1)和A(H3N2)。目前禽流感病毒(H5N1)受到了極大的關注，已知其也能感染人類。
流感病毒極好地進行著巨大的抗原漂移。全世界都投入了極大的努力來監(jiān)測病毒的抗原漂移，使得可以鑒定出任何新出現(xiàn)的變異病毒株，然后將其用于產(chǎn)生更新的疫苗，所述疫苗是與在給定流感季節(jié)中可能感染人類的病毒株最為匹配的疫苗。在鑒定出相關的流感病毒株之后，可以用本發(fā)明的方法產(chǎn)生多價抗原材料，可以用其制備出疫苗。
另一個實施方式涉及制備抗瘧原蟲的多價疫苗，瘧原蟲是一種原蟲，其包括四種引起人類瘧疾的種類。四種瘧原蟲的實例包括間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲。多價疫苗所針對的病原體的總列表打算包括人乳頭瘤病毒16、18、和31、人免疫缺陷病毒(HIV)、帶狀皰疹-水痘病毒、麻疹病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、1型單純皰疹病毒、和2型單純皰疹病毒。適合用作本發(fā)明的靶點的抗原包括這些生物體的能夠引發(fā)宿主體內的免疫反應的任何蛋白。
分泌抗原的檢測異核體宿主可以儲存于固體基本培養(yǎng)基上，也可以在有利于表達多價抗原的條件下培養(yǎng)于液體基本培養(yǎng)基內。在生長2-7天后，可以在無菌條件下收集液體培養(yǎng)基，并用標準的分析方法檢測是否存在每種特異的所需抗原，所述方法包括但不限于ELISA、PAGE5毛細管電泳、和光譜測定法。
在鑒定出產(chǎn)所需的多價疫苗的變體的培養(yǎng)物之后，用標準方法可以將儲存于固體培養(yǎng)物中的細胞擴增為更大的發(fā)酵培養(yǎng)物，當在所用的特殊真菌宿主的最佳生長條件下生長時，這種擴增的宿主培養(yǎng)物將產(chǎn)生所需的產(chǎn)物，其量足夠用于研究評估以及最終用作重組疫苗。
細胞表面定向抗原的檢測可以構建出異核體，其表達在真菌孢子的表面上展示病毒抗原的融合蛋白。天然的蛋白一般都定向于真菌的細胞表面，例如疏水蛋白例如鏈孢霉菌的EAS蛋白，以及透酶蛋白例如鏈孢霉菌的MTR蛋白。這些蛋白可以用作病毒抗原的細胞表面定向的融合配偶體。用本領域人員公知的方法構建并表達融合蛋白。用標準的分析方法可以檢測在細胞表面上表達抗原的單個菌株。這些方法包括但不限于用特異于病毒抗原的抗體直接或間接地標記細胞，之后用各種方法檢測特異性結合。這些方法包括但不限于ELISA、肉眼或熒光光譜法、和流式細胞術。然后可以融合表達抗原的單個菌株，并重新測定是否同時表達單個表達的表面抗原，并因此直接地或在純化之后形成了免疫系統(tǒng)的多價靶點、用于重組疫苗的多價抗原。
非分泌抗原的檢測如果抗原是非分泌的，可以用標準方法裂解并去除每個液體培養(yǎng)物中的細胞組分，然后檢測細胞懸浮液和碎片中的具有所需特征的多價疫苗。一旦用標準方法已經(jīng)鑒定出產(chǎn)所需抗原的菌株時，可以用儲存于固體培養(yǎng)基中的菌株接種并進行擴增培養(yǎng)。當在特殊異核體的最佳生長條件下生長時，這種擴增的宿主培養(yǎng)物將再次產(chǎn)生足以進行進一步評價和應用的量的所需產(chǎn)物。
下面的實施例只用于舉例說明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1合成的HA基因構建體用下面的方法設計出合成基因(A/New Caledonial/20/1999/H1N1的HA0、A/Vietnam/1194/2004/H5N1的HA、和A/Vietnam/1194/2004/H5N1的M1)。
從公共NCBI數(shù)據(jù)庫中得到每個基因的氨基酸序列。在HA和HA0基因中，用真菌的信號序列取代天然的前導序列。利用此序列，用于真菌表達的基因被反向翻譯，并利用粗糙鏈孢霉密碼子偏向性對其進行密碼子優(yōu)化。序列被變更成低自由能形式，其被計算成復原了新生mRNA的二級結構。逐串地搜索所形成基因中的內含子剪接供體和受體位點。在變更序列以去除這些位點之后，也檢查了序列的轉錄終止位點，并去除了任何的意外位點。
然后測序優(yōu)化的序列。將所形成的DNA亞克隆到大腸桿菌內，然后測序以檢查合成過程中的錯誤。在驗證序列之后，將DNA亞克隆到表達載體(對HA和HA0基因是pHDKXL1，而對M1基因是pALGAM)內，并轉化到鏈孢霉菌內。HA和HA0基因靶向于鏈孢霉菌的His-3位點處的整合，以及M1基因靶向于鏈孢霉菌的Am基因處的整合。
實施例2在粗糙鏈孢霉中表達HA0如實施例1所述的，產(chǎn)生了編碼合成的血凝素0(HA0)以及所連接的促進蛋白產(chǎn)生的真菌的信號序列的表達載體。
利用在組氨酸-3處具有突變的宿主菌株選擇出組氨酸原養(yǎng)型的轉化體(pHDKXL1/HA或HA0轉化體)或潮霉素B耐藥的轉化體(pALGAM/M1轉化體)。通過在選擇培養(yǎng)基上反復涂劃接種純化出所轉化的菌株之后，用ELISA檢測轉化體是否表達所述基因。檢測搖瓶內的培養(yǎng)基中的分泌的流感抗原。將約100萬個分生孢子/ml接種于含有25ml基本Volet鹽加上0.5％的125ml Ehrlenmeyers中的酵母提取液的燒瓶內。樣品在26℃、200rpm搖晃下生長，或者可以在相同的溫度下靜置生長。在生長2、3、4、5、和6天之后取出樣品。用購自BIODESIGN的抗流感病毒的抗體開發(fā)出ELISA。用作標準物的對照抗原購自蛋白科技公司。用利用標準方法和試劑的Western印跡法重新篩選ELISA陽性的樣品。
測試了不同的生長條件。具體地，分別特異地測試了搖晃和靜置培養(yǎng)。通常培養(yǎng)酵母2到6天后，收集樣品進行分析。
用SDS-PGAE分離樣品，并將其印跡到硝基纖維素膜上進行顯像。用山羊多克隆的抗HA(H1N1)抗體以及隨后的抗山羊Ig堿性磷酸酶綴合物檢測出血凝素。用比色法測定結合力。
圖7顯示了用于檢測粗糙鏈孢霉內表達合成HA0的western印跡法檢測。圖8顯示了對來自不同HA0克隆的SDS-PAGE凝膠的考馬斯蘭染色。圖9顯示了對靜置培養(yǎng)表達的HA05的western印跡。這個數(shù)據(jù)證實了本系統(tǒng)在真菌內重組表達流感病毒蛋白的能力。
實施例3在真菌異核體內多價表達流感病毒抗原根據(jù)實施例1所述的方法制備出表達載體。通過電穿孔將DNA引入到鏈孢霉菌內，并用實施例2的方法選擇出轉化體。因為表達載體編碼HA0、HA、和M1基質蛋白，所以培養(yǎng)物產(chǎn)生了流感病毒蛋白的多價混合物。
序列表<110>紐詹尼西斯有限公司<120>基于組合方式產(chǎn)生多價重組抗原的方法和組合物<130>239182001440<140>To Be Assigned<141>Concurrently Herewith<150>US 60/619,364<151>2004-10-15<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1718<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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權利要求
1.絲狀真菌異核體，其中所述異核體產(chǎn)生抗原的多價重組變體，且其中所述異核體是通過融合兩種或多種真菌親代菌株形成的，其中所述異核體的生存需要存在所有真菌親代菌株的細胞核，所述親代真菌菌株各自含有外源提供的編碼源自病原生物體的抗原變體的核酸分子，且其中所述真菌親代菌株是所有異核體相容性等位基因的純合子。
2.權利要求1的異核體，其中多價抗原以可溶性蛋白的形式被分泌至培養(yǎng)基內。
3.權利要求2的異核體，其中多價抗原聚集成顆粒。
4.權利要求1的異核體，其中多價抗原展示于真菌異核體的表面。
5.權利要求1的異核體，其中多價抗原保留在真菌異核體的細胞質內。
6.權利要求1的異核體，其中病原生物體是病毒。
7.權利要求1的異核體，其中病毒是由流感病毒、人乳頭瘤病毒16、人乳頭瘤病毒18、人乳頭瘤病毒31、水痘-帶狀皰疹病毒、麻疹病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、1型單純皰疹病毒、和2型單純皰疹病毒組成的組中的一種。
8.權利要求1的異核體，其中病毒抗原源自A型流感病毒和B型流感病毒。
9.權利要求4的異核體，其中抗原是由A型和B型流感病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶的變體組成。
10.權利要求1的異核體，其中每種所述的A型和B型流感病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶的變體都是天然存在的變體。
11.權利要求1的異核體，其中每種所述的A型和B型流感病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶的變體都不是天然存在的亞基變體。
12.權利要求1的異核體，其中病原生物體是細菌。
13.權利要求1的異核體，其中病原生物體是真菌。
14.權利要求1的異核體，其中病原生物體是由病毒、細菌和真菌生物體的任何及所有組合的混合物組成。
15.一種生產(chǎn)多價疫苗的方法，所述方法包括在能夠表達外源提供的核酸分子以形成多價疫苗的條件下培養(yǎng)權利要求1的異核體的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了用絲狀真菌異核體快速地生產(chǎn)多價重組疫苗的方法和組合物。本發(fā)明涉及通過組合其中已經(jīng)被引入編碼源自病原生物體的抗原變體的重組DNA分子的兩種或多種親代菌株形成的絲狀真菌異核體的用途。所形成的疫苗是多價疫苗。
文檔編號A61K39/116GK101043903SQ200580035156
公開日2007年9月26日 申請日期2005年10月17日 優(yōu)先權日2004年10月15日
發(fā)明者多爾西·W.·斯圖爾特, 愛德華·B.·凱姆巴拉瑞 申請人:紐詹尼西斯有限公司