專利名稱：：基于植物甾醇和甘油酯的反膠束及其治療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及一種包含水溶性治療活性劑的反膠束體系。特別地，本發(fā)明的反膠束可用于遞送藥物。本發(fā)明還涉及包含所述反膠束的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：在過去幾年，各種各樣的方法被提出來用于改進(jìn)耙部位的藥物遞送。第一，藥物必須以合適并且簡便的方式給藥，例如通過口服或直腸途徑，第二，活性成分必須以活性形式遞送到靶細(xì)胞。一些藥物在經(jīng)過胃腸道(GIT)的過程中難以吸收并且不穩(wěn)定，尤其是蛋白質(zhì)和肽類。到目前為止已做出多種嘗試以改進(jìn)多肽類和肽類的遞送，尤其是通過口服途徑的遞送，例如胰島素(用于治療糖尿病)、干擾素(用于治療肝炎)、細(xì)胞因子(用于治療癌癥)等。然而，目前這些藥物的給藥是通過非胃腸道注射?，F(xiàn)今，40%的新藥只能通過非胃腸道注射給藥。盡管口服給予蛋白質(zhì)和肽類面臨固有的難題，但是多種方法已被提出用以改善口服吸收?？此瓶尚诺牟呗园ɑ瘜W(xué)修飾以穩(wěn)定藥物和/或使其更具脂溶性并從而提高其擴(kuò)散穿越脂質(zhì)膜或胃腸道的機(jī)會。其他研究者加入穩(wěn)定劑例如肽酶抑制劑(例如，抑肽酶)以減少代謝損失，還有一些研究者采用非離子表面活性劑、膽鹽及其類似物、磷脂、螯合劑或酰基肉毒堿形式的各種吸收促進(jìn)劑。許多專利和公開出版物也描述了將活性成分包囊入納米顆?；蛭⒚最w粒的方法。但是，到目前為止，沒有一種己開發(fā)的遞送系統(tǒng)是完全令人滿意的，尤其是對于胰島素而言。例如，至今已公開的遞送系統(tǒng)只能使胰島素的吸收率在2-5%?；加?型或2型糖尿病的人常常用胰島素治療。盡管注射設(shè)備在改進(jìn)并且入侵性減少(例如，筆狀設(shè)備)，但是注射劑仍然存在缺點并且非常不受歡迎。非注射式制劑具有更多優(yōu)點。除了更具有患者親和性，這些制劑可以提高依從性，使得療效更好并減少與糖尿病有關(guān)的并發(fā)癥。發(fā)明人之前己披露了將兩種脂質(zhì)與一些金屬鹽攪拌會增加金屬生物利用度并因此用1000至5000倍更低的劑量即可獲得相同的治療活性；所述金屬鹽的可能的毒性從而可以被減少[例如，見US6,129,924、WO02/36134和WO2004/075990]。本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。更具體地，本發(fā)明的目的是提供包含活性成分的藥物遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)可口服給藥并且具有令人滿意的生物利用度。本發(fā)明涉及用于釋放所需的治療劑的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)遞送系統(tǒng)，以及相關(guān)組合物和制備該遞送系統(tǒng)的方法。更具體地，本發(fā)明提供一種用于配藥的反膠束轉(zhuǎn)運(yùn)體系。更具體地，本發(fā)明的反膠束促進(jìn)生物活性分子跨粘膜上皮屏障吸收并使得活性成分被靶細(xì)胞內(nèi)化。本發(fā)明的反膠束更具體地包含至少一種水溶性治療活性成分、植物甾醇、甘油酯和水。更具體地，本發(fā)明涉及具有小于或等于100nm的水性核心的反膠束。所述反膠束可以用植物甾醇和甘油酯通過特定的方法制備。所述膠束更具體地是通過下列方法獲得(a)將(i)植物甾醇，(ii)甘油酯，優(yōu)選脂肪酸甘油二酯，(iii)水，尤其是純凈水，和(iv)至少一種水溶性治療活性成分接觸，(b)在4(TC或40'C以下，攪拌步驟(a)中得到的混合物，并持續(xù)足夠長的時間以形成反膠束，所述攪拌是以約1000至約5000轉(zhuǎn)/分鐘的速度機(jī)械性地進(jìn)行或通過超聲處理進(jìn)行。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明反膠束和藥學(xué)可接受載體、賦形劑或輔劑的組合物。具體實施例方式下列文字僅僅用于舉例說明優(yōu)選的實施方案，并不限制并入一些使本發(fā)明產(chǎn)生效果所必需的特征。反膠束本發(fā)明的反膠束體系的特征在于是包含存在于油中的水微滴分散體的微乳。所述分散體在水/油表面用表面活性劑(甘油酯，更優(yōu)選脂肪酸甘油二酯)來穩(wěn)定。反膠束相可定義為其中由水形成內(nèi)相而脂質(zhì)的疏水尾部形成連續(xù)相的一種體系。包含油(類)、表面活性劑(類)和水相的反膠束還表征為油包水微乳。膠束的尺寸似乎隨著(水)/(表面活性劑)的重量比w(混合物中被增溶的水/混合物中的表面活性劑)而線性變化。如前文所述，混合物中水的相對重量(W)優(yōu)選低于或等于甘油酯優(yōu)選脂肪酸甘油二酯的量的2.5倍，并且優(yōu)選低于或等于1倍。更具體地，W是0.01至0.2。按照具體的實施方案，所述比例W優(yōu)選自0，05至0.18。反膠束，例如其核心的尺寸，可用不同的方法表征-X-射線散射-中子散射-透射電子顯微鏡(TEM)-動態(tài)光散射(DLS)本發(fā)明的反膠束體系中脂質(zhì)組分(植物甾醇和甘油酯)的比例可以在大范圍內(nèi)變化，例如植物甾醇/甘油酯的重量比可以在0.01至l(包含端點)的范圍內(nèi)。根據(jù)一個具體實施方案，相對于植物甾醇(優(yōu)選谷甾醇)可以采用過量的甘油酯(優(yōu)選脂肪酸甘油二酯)。更具體地，植物甾醇/甘油酯的重量比大于或等于O.l，更優(yōu)選自0.1至0.2。反膠束體系的化合物可以通過適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治觥８唧w地，植物甾醇可以用氣相色譜分析法鑒定，而甘油酯可用高效液相色譜法(HPLC)鑒定，尤其是用光散射檢測器，于硅膠柱(KromasilC18)上，在洗脫液的存在下進(jìn)行，例如恒組成(isocmtic)乙腈。氣相色譜法也可用于分析甘油二酯。反膠束是動態(tài)系統(tǒng)。布朗運(yùn)動導(dǎo)致膠束不斷地碰撞，這引起膠束的聚結(jié)以及水性核心的交換。膠束發(fā)生分離和再生，并允許不同溶液之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。膠束之間的交換速率尤其隨著溫度、表面活性劑烴鏈的長度、以及W比(游離水使所述交換增加)而增加。在本發(fā)明的范疇之內(nèi)，與納米技術(shù)中所期望的相反，膠束的水性核心必須具有特定的尺寸以允許在制備膠束時引入的一個或多個治療活性成分的分子被穩(wěn)定在其中。水性核心的尺寸優(yōu)選小于或等于約100nm并且優(yōu)選大于或等于5nm。上述定義的比例W優(yōu)選小于或等于約2.5。如實施例1所述產(chǎn)品的X-射線散射分析展示了微乳中的反膠束。本發(fā)明較現(xiàn)有技術(shù)而言的主要優(yōu)勢在于植物甾醇在制備反膠束中的使用，更優(yōu)選使用谷甾醇。因此，本發(fā)明提供了需要跨粘膜遞送的化合物的吸收，優(yōu)選跨口腔粘膜和直腸粘膜，更優(yōu)選跨口腔粘膜。并且，本發(fā)明反膠束提供了具有低吸收變化性的重要的生物利用度。本發(fā)明反膠束的另一個有利方面在于它們能被制成不同的尺寸以使其與將要包含的活性成分相適應(yīng)。制備反膠束的方法在一個具體的實施方案中，本發(fā)明涉及制備具有小于或等于100nm水性核心并且包含至少一種水溶性治療活性成分、植物甾醇、甘油酯和水的反膠束的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)將(i)植物甾醇，(ii)甘油酯，優(yōu)選脂肪酸甘油二酯，(iii)水，尤其是純凈水，和(iv)至少一種水溶性治療活性成分接觸，其中比例W呵水]/[甘油酯]優(yōu)選小于或等于約2.5，(b)在40。C或4(TC以下，攪拌步驟(a)中得到的混合物，并持續(xù)足夠長的時間以形成反膠束，所述攪拌是以從約1000至約5000轉(zhuǎn)/分鐘的速度通過機(jī)械方式進(jìn)行或通過超聲處理進(jìn)行。得到并回收的反膠束特別可用作藥物遞送系統(tǒng)。該方法步驟(b)尤其重要，因為它允許獲得反膠束，而該膠束可用作遞送藥物至耙部位的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。步驟(a)采用的化合物將在下文具體描述。步驟(a)所得混合物的攪拌特別是在低于或等于40'C的溫度下進(jìn)行，更優(yōu)選從3(TC至38'C，更優(yōu)選從3(TC至35'C，持續(xù)能形成反膠束的充足時間。該充足時間可以特別地根據(jù)采用的攪拌技術(shù)變化，例如機(jī)械攪拌或超聲處理。機(jī)械攪拌或超聲處理的時間是無論采用何種方式將初始混合物轉(zhuǎn)變成單相反膠束溶液所需的時間。在具體的實施方案中，治療活性成分首先溶于水(優(yōu)選純凈水)中，然后將其與其它組分接觸(步驟(a))。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇與本發(fā)明組合物一起使用的賦形劑或組分，以保持它們的有益特性。具體地，當(dāng)大量加入時，甘油的存在可以阻止反膠束的形成或破壞反膠束體系。更具體地，不高于1%的甘油(百分比表示組合物中甘油重量/水的總重量)用于本發(fā)明反膠束的制備中，并優(yōu)選沒有甘油。超聲處理超聲處理時的超聲波引起液體內(nèi)部的聲音氣穴現(xiàn)象，即在液體內(nèi)部形成氣泡。超聲波在反應(yīng)室的每個部位產(chǎn)生均勻的攪拌并且在液體內(nèi)部很少產(chǎn)生湍流。它是制備納米顆粒的最可靠和有用的方法。所得的微乳的穩(wěn)定性具體由用作表面活性劑的甘油酯(優(yōu)選脂肪酸甘油二酯)決定。不同類型的超聲處理材料可用于實驗室或工業(yè)規(guī)模。高強(qiáng)度超聲波方法是最合適的方法。為少量制備，具有20kHz超聲波的400W或600W的材料可提供滿意的效果并因此是優(yōu)選的。該過程中溫度和發(fā)射期的電子控制在這類設(shè)備中也是可能的。存在可用于工業(yè)應(yīng)用的同一類型的材料。在具體時間內(nèi)(3-5分鐘，一次或多次)，物理參數(shù)取決于采用的材料、混合物的體積及其粘度。本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易地確定這樣的參數(shù)。更特定地，混合物的溫度不得超過4(TC以避免反應(yīng)物的降解。溫度優(yōu)選低于約38。C，更優(yōu)選低于約35'C。機(jī)械攪拌常用物質(zhì)采用螺旋漿式攪拌器，其快速運(yùn)動產(chǎn)生湍流和漩渦使得顆?；ハ嘭炌?，并在混合物內(nèi)部形成納米顆粒。攪拌速度優(yōu)選自1000至5000轉(zhuǎn)/分鐘。采用的體積、設(shè)備、攪拌速度和W比例由治療活性成分決定并必須與之相適應(yīng)。如上所述，混合物的溫度不得超過4(TC以避免反應(yīng)物的降解。溫度優(yōu)選低于約38t)，更優(yōu)選低于約35-C。反膠束化合物甘油酯可用于制備本發(fā)明反膠束體系的甘油酯，尤其是脂肪酸甘油酯，可以從大多數(shù)動物并更優(yōu)選從植物中分離。甘油酯包括甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯。在具體實施方案中，本發(fā)明優(yōu)選使用的甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯具有下列結(jié)構(gòu)式(I):CHORgCH2OR3(|)其中Rj是具有14至24個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的?；鶜埢瑲湓?，或單-，二-或三-半乳糖或葡萄糖；R2是具有2至18個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的酰基殘基；R3是具有14至24個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的?；鶜埢驓湓?。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，R,和R3中至少一個，優(yōu)選僅一個，表示油酸酰基殘基(C18:1[順]-9)。根據(jù)一個特定的方案，R2具有一個不飽和鍵(例如烯鍵)且有利地具有18個碳原子，優(yōu)選地R2是油酸殘基(油?；鶊F(tuán))、其雙鍵(順-6、7、9、11和13)的位置異構(gòu)體之一或其異支鏈化(iso-branched)異構(gòu)體之一。根據(jù)另一個具體方案，^代表油?；８鶕?jù)另一個具體方案，R2代表乙?；８鶕?jù)一個優(yōu)選實施方案，R3代表氫原子。不飽和植物油特別優(yōu)選用作甘油酯的來源，特別是經(jīng)過首次冷榨的橄欖油。作為普遍規(guī)則，含有高濃度油酸的油將被選作本發(fā)明的甘油酯的有用來源。這種油通常包含高比例的對本發(fā)明有用的甘油酯。根據(jù)本發(fā)明的具體方案，優(yōu)選的脂肪酸甘油二酯選自1，2-二油酸甘油酯和l-油?；?2-乙酰甘油酯。它們中的一部分還是市售可得的，并且尤其是那些被發(fā)現(xiàn)在所要求保護(hù)的本申請中最為活躍的。這種情況具體的是l-油?；?2-乙酰甘油酯和1，2-二油酰基甘油酯，它們是具有高純度含量的市售產(chǎn)品。具體地，包含約44%二油酸甘油酯的甘油單油酸酯，其中約14%是1，2-二油酸甘油酯。這樣的化合物是藥學(xué)上可接受的(歐洲藥典(第4版)，USP25/NF20，以及日本食品添加劑標(biāo)準(zhǔn))。這樣的產(chǎn)品可例如以PECEOL⑧的名字通過Gattefoss6公司市售獲得。植物甾醇可用于制備本發(fā)明反膠束體系的甾醇是植物甾醇。谷甾醇是優(yōu)選的可用于本發(fā)明反膠束體系的植物甾醇。植物甾醇與膽固醇相比具有很多優(yōu)點，植物甾醇能穿越粘膜，尤其是口腔和直腸粘膜。因此，本發(fā)明的反膠束提供了一種手段以繞開不方便的或不舒適的非腸道途徑并同時使物質(zhì)無需通過胃給藥，胃是對包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的許多物質(zhì)不利的環(huán)境。因此，作為一種遞送手段，本發(fā)明的反膠束是非常有利的，因為它們使得要給予的活性成分能夠被大量并均勻地吸收?；旌显诒景l(fā)明反膠束體系中的谷甾醇可以是[p]-或M-谷甾醇，優(yōu)選[卩]-谷甾醇，或者可以含有至少這兩種谷甾醇之一的植物提取物的形式混入。尤其可能使用的是各種各樣的市售產(chǎn)品。更具體地，可以使用從大豆中提取的市售的谷甾醇。在這種產(chǎn)品中，谷甾醇通常占產(chǎn)品重量的50%至70%并且通常與分別約15X的菜油甾醇和谷甾垸醇(sitostanol)以混合物的形式存在。從各種松樹中提取的被稱作妥爾油(talloil)的市售谷甾醇也可以被采用。通常，可能采用與谷甾垸醇混合的谷甾醇。優(yōu)選地，所述混合物包含按混合物重量計至少50%的谷甾醇。通過按照下列方法進(jìn)行，能夠獲得具有高于95%、或者甚至99%純度的(3-谷甾醇用丙酮對市售混合物進(jìn)行連續(xù)重結(jié)晶化，使得p-谷甾醇通過去除混合物中存在的菜油甾醇和谷甾垸醇被預(yù)純化。然后，用洗脫液混合物，例如甲醇，尤其是100%甲醇或甲醇和乙腈的混合物，尤其是80-20的混合物或其它可能獲得純度高于95%或甚至高于99%的谷甾醇的中間比例的混合物，由此在制備C18柱上通過高壓液相色譜法，將如此預(yù)純化的產(chǎn)品進(jìn)行1至3個步驟的純化。該純度通過氣相色譜法測定。谷甾醇以及因此谷甾烷醇還可以按照文獻(xiàn)中的技術(shù)從植物中提取而制備，例如ClaudeCerdon在Montpellier發(fā)表的標(biāo)題為--ModulationdelaproductiondesapogeninessteroidiquesenreponseaI'inhibitiondelasynthesede3161"013的論文第95頁。該提取優(yōu)選通過根據(jù)具體而言法國專利FR2316247中描述的方法與金屬絡(luò)合來進(jìn)行，其中描述了將3-羥基-甾體和3-氧代-甾體從含有這些化合物的混合物中分離出來的方法。為實施該提取，己知具有相對高含量的谷甾醇的任何植物或源于植物的產(chǎn)品均可使用。舉例而言，具有相對高的游離谷甾醇含量的植物或源于植物的產(chǎn)品的實例具體可提及橄欖油、大豆油、棉花葉、咖啡葉、小麥胚芽，它們的游離植物甾醇含量以及谷甾醇在游離植物甾醇部分的百分比在下表中給出<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>%是按重量計。谷甾烷醇的相對含量還未被研究。還必須指出的是游離植物甾醇部分含有一定比例的24R和24S異構(gòu)體，它們可根據(jù)植物的不同而變化。對該比例所知甚少，因為它很少被研究。該比例以及在純化過程中不能與谷甾醇分離的谷甾烷醇的相對數(shù)量可以解釋一些植物中植物甾醇部分的較好的相對活性，并且尤其是本發(fā)明所述反膠束體系的制備中必需的過量的植物甾醇。如上所述，植物甾醇和甘油酯的比例可以在大范圍內(nèi)變化，例如植物甾醇/甘油酯的重量比可以在0.01至l(包含端點)的范圍內(nèi)變化。根據(jù)一個具體實施方案，可以使用較植物甾醇(優(yōu)選谷甾醇)而言過量的甘油酯(優(yōu)選脂肪酸甘油二酯)。更具體地，植物甾醇/甘油酯的重量比大于或等于O.l，更優(yōu)選從O.l至0.2。治療活性化合物任何水溶性治療劑均可以用于本發(fā)明，其包括但不限于多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核酸[DNA或RNA(尤其是RNAi)或其片段]和水性藥物組合物。具有特定治療意義的蛋白質(zhì)更優(yōu)選被用于本發(fā)明。由于這些活性成分在生物介質(zhì)中不穩(wěn)定，具體而言它們能被GIT中存在的內(nèi)源性酶降解，因此它們通常通過注射途徑給藥。本發(fā)明感興趣的治療劑是任何治療性的蛋白質(zhì)或糖蛋白類，例如胰島素、促紅細(xì)胞生成素、瘦素(leptin)、生長因子、生長激素釋放激素、集落刺激因子、水溶性激素(甲狀旁腺激素或其片段或類似物，促黃體激素釋放激素(LHRH)或其類似物(例如，那法瑞林，布舍瑞林，戈舍瑞林)，多糖(例如，肝素)、干擾素、肝素樣化合物、以及細(xì)胞因子。其還包括DNA、RNA片段或質(zhì)粒、RNA干擾劑、免疫劑和/或疫苗劑等。這些混入本發(fā)明反膠束體系的治療劑可以穿越粘膜上皮屏障并因此在耙部位顯示治療效果。水溶性活性成分更優(yōu)選存在于反膠束的水性核心中。治療劑的穩(wěn)定性和活性可以主要通過混合物中的水濃度來控制。用溶于水相的酶進(jìn)行了研究，研究顯示酶活性可以被優(yōu)化并且動力學(xué)反應(yīng)取決于水的相對濃度。混入反膠束體系的活性成分的量由它們在親水相(水性核心)中的溶解度決定。優(yōu)選地，混入在反膠束體系的治療劑的量與活性成分有關(guān)。反膠束體系的用途本發(fā)明的反膠束改善了混入其中的活性成分的生物利用度，使得它在靶部位的治療用途具有減少的毒性。由于它的微乳性質(zhì)，反膠束體系提供了不同類型的制劑，該制劑包含賦形劑、載體或不同的輔劑，它們可以通過不同途徑給藥，包括經(jīng)粘膜給藥，例如通過口腔或直腸給藥。目前已知反膠束體系作為微反應(yīng)裝置，可用于納米材料的制備。它們可以載有蛋白質(zhì)類酶。與水溶性底物的催化反應(yīng)可以在微乳內(nèi)部的巨大水-油內(nèi)表面上進(jìn)行。生物分子的活性和穩(wěn)定性可以被控制，主要是通過介質(zhì)中水的濃度。在反膠束體系中混入治療劑提供了下列優(yōu)點所述治療劑更加穩(wěn)定，它們能通過粘膜被吸收，膠束在血液中的運(yùn)輸不會被改變并且活性成分在靶部位獲得了理想的生物學(xué)效果。本發(fā)明的目的涉及一種包含如上定義的反膠束以及藥學(xué)可接受載體、賦形劑或輔劑的藥物組合物。本發(fā)明的另一個目的涉及如上定義的反膠束在制備要遞送一種或多種水溶性治療活性劑的藥物組合物中的用途，尤其是經(jīng)粘膜遞送。該藥物組合物具體而言是用于阻止或治療與疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀。本發(fā)明的另一個目的涉及向哺乳動物(尤其是人)遞送一種或多種水溶性治療活性劑的方法，該方法包括給予如上定義的反膠束組合物。在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)粘膜遞送一種或多種水溶性治療活性劑的方法，該方法包括向所述哺乳動物(尤其是人)經(jīng)粘膜給予如上定義的反膠束組合物。本發(fā)明提供了預(yù)防、治療、或改善與人類疾病或病癥有關(guān)的一種或多種癥狀的方法，該方法包括給予有此需要的所述人群有效量的如上定義的反膠束組合物，該組合物包含一種或多種水溶性的對與所述疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的預(yù)防、治療或改善有用的治療劑。在具體實施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或改善與疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，該方法包括向有需要的對象經(jīng)粘膜給予有效量的如上定義的反膠束組合物，該組合物包含一種或多種水溶性的對與所述疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的預(yù)防、治療或改善有用的治療劑。具體而言，如上文定義的水溶性治療活性劑包括蛋白質(zhì)、多肽、肽類、糖蛋白、多糖、如上文定義的核酸、或它們的混合物。其中多肽和肽類的例子是胰島素、干擾素、和細(xì)胞因子，待治療的疾病更具體而言分別是糖尿病、肝炎、和癌癥。其中免疫劑和/或疫苗劑被使用，由此獲得的本發(fā)明的反膠束體系可用作疫苗。關(guān)于藥學(xué)可接受的賦形劑、介質(zhì)或載體，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何賦形劑、介質(zhì)或載體均可使用。引用了下列例子但并不受其限制乳糖，玉米淀粉，葡萄糖，蔗糖，甜味劑例如麥芽糖醇糖漿，阿拉伯膠，明膠，角叉菜聚糖，硬脂酸，硬脂酸鎂，糊精，麥芽糊精，甘露醇，滑石粉，天然來源的脂肪，尤其是富含不飽和脂肪酸和植物甾醇的植物來源的油。具體而言，如果最后需要，可使用對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言公知的其他添加劑，如穩(wěn)定劑、干燥劑、粘合劑或pH緩沖劑。本發(fā)明優(yōu)選的賦形劑促進(jìn)了最終產(chǎn)品與粘膜的粘著。本發(fā)明組合物可以通過不同方式給藥，尤其是，經(jīng)過口服途徑，采用口腔或消化吸收，或更主要的是經(jīng)過口腔中的粘膜組織。本文使用的術(shù)語"粘膜"和"粘膜的"是指粘膜組織例如上皮，固有層，和消化道的平滑肌層。本文使用的"經(jīng)粘膜遞送"、"經(jīng)粘膜給藥"以及類似的術(shù)語是指組合物向粘膜組織給藥。"經(jīng)粘膜遞送"、"經(jīng)粘膜給藥"以及類似的術(shù)語包括但不限于通過支氣管、牙齦、舌、鼻、口、陰道、直腸、以及腸粘膜組織遞送組合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明反膠束組合物以膠囊、囊片、氣霧劑、噴霧劑、溶液、混懸劑、乳劑、扁囊劑、片劑、軟彈性明膠膠囊、氣霧劑、散劑或顆粒劑的形式經(jīng)粘膜給藥。本發(fā)明組合物可以以液體的形式裝入膠囊，該膠囊在嘴中釋放其內(nèi)含物。優(yōu)選地，本發(fā)明的反膠束組合物被施予哺乳動物，更優(yōu)選人，以預(yù)防或治療疾病或病癥。下列實施例旨在示例本發(fā)明的實施而對其范圍不造成限制。實施例實施例1:經(jīng)直腸途徑向動物給予胰島素的運(yùn)輸遞送系統(tǒng)的制備向溶有1g谷甾醇的2ml乙醇中添加含有100UI胰島素(UmulineZn長效)的1ml純凈水，然后再加入40mlPeceol(從Gattefoss6市售獲得的甘油單油酸酯)。對混合物進(jìn)行兩次(每次3分鐘)超聲波處理，將溫度控制在低于35°C。所得產(chǎn)品由含有胰島素的穩(wěn)定反相納米膠束的均質(zhì)混合物組成。它可以經(jīng)直腸途徑以2ml/kg的劑量給予動物(5UI胰島素鋅/24h/kg)。實施例2:經(jīng)口服給藥向?qū)ο蠼o予胰島素的運(yùn)輸遞送系統(tǒng)的制備向溶有10g谷甾醇的10ml乙醇中添加含有200UI胰島素(Umuline長效)的2ml純凈水，然后再加入28mlPeceol。對混合物進(jìn)行兩次(每次3分鐘)超聲波處理，將溫度控制在低于35°C。所得產(chǎn)品由含有胰島素的穩(wěn)定反相納米膠束的均質(zhì)混合物組成。將其裝入膠囊，每個膠囊含有l(wèi)g所得產(chǎn)品(5UI速效胰島素每個膠囊)。然后它可以被施予需要胰島素的患者。該患者在嘴中破開膠囊并在嘴中保持從膠囊中得到的液體約一分鐘(使混合物中的谷甾醇與嘴粘膜粘著并獲得快速吸收)。實施例3:向?qū)ο罂谇唤o予促紅細(xì)胞生成素的運(yùn)輸遞送系統(tǒng)的制備溶有10g谷甾醇的10ml乙醇與含有80000UI促紅細(xì)胞生成素(EPREX40000Ul/ml)的2ml水溶液混合，然后再混入28mlPeceol。用扁平烤盤攪拌器以1200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌混合物，將溫度控制在低于35°C。所得產(chǎn)品由含有促紅細(xì)胞生成素的穩(wěn)定反相納米膠束的均質(zhì)混合物組成。將其裝入膠囊，每個膠囊含有1g所得產(chǎn)品(1000UI促紅細(xì)胞生成素每個膠囊)。然后它可以被施予需要促紅細(xì)胞生成素的患者。該患者在嘴中破開膠囊并在嘴中保持從膠囊中得到的液體約一分鐘(使混合物中的谷甾醇與嘴粘膜粘著并獲得快速吸收)。實施例4:含有促紅細(xì)胞生成素的反膠束的制備向溶有3g谷甾醇的4.5ml乙醇中添加含有2000UIEPO的1mlEPREX,然后再加入72mlPeceo胸。用加熱至35。C的磁力攪拌器攪拌混合物15分鐘。W比例是0.04。然后以2ml/kg的劑量經(jīng)直腸途徑向大鼠給藥(50Ul/kg)。實施例5:含有促紅細(xì)胞生成素的反膠束的制備向溶有3g谷甾醇的4.5ml乙醇中添加含有4000UIEPO的2mlEPREX,然后再加入72mlPeceo跑。用加熱至35。C的磁力攪拌器攪拌混合物15分鐘。W比例是0.08。然后以2ml/kg的劑量經(jīng)直腸途徑向大鼠給藥(100UI/kg)。實施例6:用于直腸內(nèi)給予含質(zhì)粒的反膠束的運(yùn)輸遞送系統(tǒng)的制備和給藥溶有125pg谷甾醇的200乙醇與含有3mg質(zhì)粒pEGFP-Nl的250Hl水溶液混合，然后再混入4.75mlPeceo贈。用扁平烤盤攪拌器以1200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌混合物，將溫度控制在低于35'C。所得產(chǎn)品是含有質(zhì)粒的穩(wěn)定反相納米膠束的均質(zhì)混合物。被施予的產(chǎn)品含有pEGFP-Nl的反膠束如上所述制備。pEGFP-Nl(購自Clontech)，用于增強(qiáng)的綠熒光蛋白(eGFP)的哺乳動物表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)化到有活性的大腸埃希氏菌ToplO細(xì)胞(Invitrogen)中并用來自Qiagen公司的EndoFreePlasmidMegaKit按照制造商的指導(dǎo)純化后使用。方法八只大鼠(Wistar,250-300g)經(jīng)直腸途徑注射500|il該產(chǎn)品。采集注射后第1、2、4和8分鐘時的血樣(每次兩只大鼠)至含有抗凝劑的試管內(nèi)。以1500rpm離心25分鐘后，血漿被用于轉(zhuǎn)染研究。HepG2(人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系)和CV1(猴腎成纖維細(xì)胞細(xì)胞系)被存放在補(bǔ)充有10%胎牛血清的Dulbecco改性Eagle's培養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,CA，)中，并在轉(zhuǎn)染研究之前24小時以5><104個細(xì)胞/孔的密度接種在24-孔平板中。針對轉(zhuǎn)染，去除培養(yǎng)基并在室溫下將含有質(zhì)粒pEGFP-Nl的反膠束的大鼠血漿200W加入不同的盤中20分鐘。在加入500pl新鮮培養(yǎng)基后，在熒光顯微鏡下通過測定熒光細(xì)胞的百分比而測量基因表達(dá)之前，培養(yǎng)細(xì)胞48小時。陰性對照血漿對應(yīng)于未注射含有質(zhì)粒pEGFP-Nl的反膠束的大鼠樣品。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，F(xiàn)uGENETM6(Roche)被用作轉(zhuǎn)染的陽性對照。結(jié)果得到的轉(zhuǎn)染％(熒光細(xì)胞％)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例7:藥理學(xué)實驗促紅細(xì)胞生成素的生物活性促紅細(xì)胞生成素(EPO)是主要的人體紅血球生成調(diào)節(jié)劑。EPO的分子量是30-34kDa。重組EPO在商業(yè)上是通過在中國倉鼠卵巢的真核細(xì)胞系中的EPOcDNA克隆的表達(dá)而獲得的。rhEPO效力的早期測定是通過一些參數(shù)例如紅細(xì)胞壓積、紅血球體積和網(wǎng)狀細(xì)胞數(shù)增加之后在普通大鼠和小鼠中進(jìn)行的。最近的研究評價了循環(huán)中的網(wǎng)狀細(xì)胞的數(shù)量是紅血球生成的功能狀態(tài)的早期指標(biāo)，并且外周血中網(wǎng)狀細(xì)胞的百分比評估己被用于考察EPO的生物活性。EPREX:由JANSSEN-CILAG實驗室制造，2000Ul/ml批次A:EPO50Ul/kg:單劑量皮下給藥批次B:EPO100UI/kg:單劑量皮下給藥批次C:EPO50UI/kg:單劑量直腸給藥(實施例4)批次D:EPO100Ul/kg:單劑量直腸給藥(實施例5)實驗方法在取血樣96h之后，八周齡的正常紅血球的小鼠接受一次產(chǎn)品給藥。每一批產(chǎn)品用3只大鼠進(jìn)行實驗。網(wǎng)狀細(xì)胞計數(shù)采用自動流式細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>產(chǎn)品C和D(含有促紅細(xì)胞生成素的反膠束)對紅血球生成具有顯著的影響，與經(jīng)皮下給藥的EPO相等。實施例8:體內(nèi)試驗糖尿病鏈脲霉素大鼠模型一長效胰島素使用的產(chǎn)品是按照實施例1制備的產(chǎn)品。研究目的比較長效胰島素經(jīng)皮下給藥和將相同劑量的胰島素混入本發(fā)明反膠束經(jīng)直腸途徑給藥的降低血糖的活性。給藥途徑的評價含有脂質(zhì)納米顆粒的產(chǎn)品在胃和十二指腸中被降解，尤其是被脂酶降解。對患者給藥優(yōu)選經(jīng)由粘膜吸收在嘴部位進(jìn)行。由于這種給藥方式不適用于大鼠，選擇了使得與口服給藥具有同樣效果的經(jīng)粘膜吸收的直腸途徑。經(jīng)過直腸途徑被吸收的物質(zhì)不像口服施予的物質(zhì)那樣會經(jīng)過肝臟，而是通過粘膜組織遞送至血流中。給藥途徑批次2:皮下批次3:直腸施用產(chǎn)品批次2:Umulinzinc5Ul/kg批次3:NPX:在膠束載體中的Umulinzinc5UI/kg(實施例1)給藥量用直腸探針2ml/kg/天方法以50mg/kg劑量靜脈給予雄性Wistar大鼠(體重250-300g)鏈脲霉素(STZ)，提供處于胰島素依賴型和非胰島素依賴型糖尿病(l型和2型)中間的糖尿病。給藥三天后，血糖在20和30mmol/l之間并幾乎穩(wěn)定地持續(xù)隨后7天。給予藥物7天，對距離治療開始0天、72h和7天收集的血樣進(jìn)行血糖生物學(xué)化驗。結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結(jié)論-以每日5UI/Kg劑量皮下給予的胰島素鋅(批次2)使血糖恢復(fù)至正常值。-產(chǎn)品NPX(胰島素鋅納米顆粒，批次3)對血糖具有顯著影響治療開始后72h，6只動物中的4只重新獲得了與皮下給予胰島素后同樣的正常血糖水平。該動物的胰島素的生物利用度與注射給予胰島素時的生物利用度相似。兩只動物對于注射的胰島素的輕微不同的結(jié)果是由于向動物進(jìn)行直腸給藥時通常會遇到的困難。向人類口服給藥時會避免這類困難。實施例9:體內(nèi)試驗糖尿病鏈脲霉素大鼠模型一速效胰島素研究目的比較速效胰島素經(jīng)皮下給藥和將相同劑量胰島素混入本發(fā)明反膠束經(jīng)直腸途徑給藥的降低血糖的活性及生物利用度。實驗方法通過靜脈注射鏈脲霉素(60mg/kg)使雄性Wistar大鼠(體重150-200g)患糖尿病。四天后，經(jīng)過處理的大鼠呈現(xiàn)胰島素依賴型糖尿病，若干天后，伴隨有胰島素依賴。對每批3只大鼠進(jìn)行實驗。只進(jìn)行一次給藥，對照產(chǎn)品通過皮下給藥，而受試膠束(Mc)產(chǎn)品通過直腸給藥。對照產(chǎn)品和受試Mc產(chǎn)品的胰島素劑量相同5Ul/kg。治療組-對照組不經(jīng)過STZ處理-速效胰島素組(速效UMULINE)經(jīng)皮下途徑給藥-速效胰島素組(速效UMULINE)經(jīng)直腸途徑給藥-速效胰島素組McUMULINE經(jīng)直腸給藥-無胰島素的Mc制劑組經(jīng)直腸給藥在7個時間點進(jìn)行血糖和胰島素化驗15分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘，180分鐘，360分鐘以及24小時。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)論經(jīng)直腸途徑的Mc吸收動力學(xué)與經(jīng)皮下途徑的Mc吸收動力學(xué)相當(dāng)Tmax=2-3小時。消除動力學(xué)是相當(dāng)?shù)?。較皮下途徑而言，Mc制劑的相對生物利用度是55X，以AUC為基實施例10:水加入量的優(yōu)化上文實施例中給出的含有適量peceol、谷甾醇和乙醇的樣品，通過改變?nèi)苡械鞍踪|(zhì)的水的量而制備。稀釋規(guī)模以0.3%的水增加量進(jìn)行。樣品于35'C下攪拌均勻，如上文所述。通過目測(混濁度)和小角度X-射線散射測定水含量對于反膠束體系穩(wěn)定性的影響。結(jié)果組合物中含有6.9%(即，W約是0.175)和更多的水時，微乳變得越來越混濁并且隨著水量的增加開始出現(xiàn)兩相。水的百分比是以水總重組合物總重表示的。權(quán)利要求1.反膠束體系，其包含至少一種水溶性的治療活性成分、植物甾醇、甘油酯和水。2.根據(jù)權(quán)利要求1的反膠束體系，其中膠束具有小于或等于100nm的水性核心。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的反膠束體系，通過下述方法獲得-(a)使(i)植物甾醇，(ii)甘油酯，(iii)水，和(iv)至少一種水溶性治療活性成分相接觸，(b)在4(TC或4(TC以下，攪拌步驟(a)中得到的混合物，并持續(xù)足夠長的時間以形成反膠束，所述攪拌是以約1000至約5000轉(zhuǎn)/分鐘的速度機(jī)械性地進(jìn)行或通過超聲處理進(jìn)行。4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的反膠束體系，其中比率W二(水)/(甘油酯)優(yōu)選小于或等于約2.5。5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的反膠束體系，其中植物甾醇/甘油酯的重量比在0.01至l的范圍內(nèi)。6.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的反膠束體系，其中植物甾醇/甘油酯的重量比大于或等于O.l，更優(yōu)選為0.1至0.2。7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一項的反膠束體系，其中攪拌步驟(b)是在3(TC至38'C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的反膠束體系，其中比例W二(水)/(甘油酯)小于或等于約1。9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的反膠束體系，其中甘油酯具有下列結(jié)構(gòu)式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(I)其中Rt是具有14至24個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的?；鶜埢?，氫原子，或單-、二-或三-半乳糖或葡萄糖；R2是具有2至18個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的酰R3是具有14至24個碳原子的直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸的?；鶜埢?，或氫原子。10.根據(jù)前述權(quán)利要求的反膠束體系，其中R,和R3中至少一個，優(yōu)選僅一個，代表油酸(C18:1[順]-9)的?；鶜埢?1.根據(jù)前述權(quán)利要求9和10中任一項的反膠束體系，其中R2是油酸殘基(油?；鶊F(tuán))、其雙鍵(順-6、7、9、11和13)的位置異構(gòu)體之一或其異支鏈化異構(gòu)體之一。12.根據(jù)前述權(quán)利要求9和10中任一項的反膠束體系，其中R2代表乙酰基。13.根據(jù)前述權(quán)利要求9-12中任一項的反膠束體系，其中R3代表氫原子。14.根據(jù)前述權(quán)利要求9-13中任一項的反膠束體系，其中甘油酯選自1，2-二油酸甘油酯和l-油?；?2-乙酰甘油酯。15.根據(jù)前述權(quán)利要求1-14中任一項的反膠束體系，其中植物甾醇是谷留醇。16.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一項的反膠束體系，其中所述水溶性治療劑是肽、多肽、蛋白質(zhì)、核酸[DNA或RNA(更優(yōu)選RNAi)或其片段]或水性藥物組合物。17.根據(jù)權(quán)利要求16的反膠束體系，其中所述水溶性治療劑選自由胰島素、促紅細(xì)胞生成素、瘦素、生長因子、生長激素釋放激素、集落刺激因子、水溶性激素(甲狀旁腺激素或其片段或類似物，促黃體激素釋放激素(LHRH)或其類似物(例如，那法瑞林，布舍瑞林，戈舍瑞林)，干擾素、細(xì)胞因子、多糖(例如，肝素)、肝素樣化合物、DNA、RNA片段或質(zhì)粒、RNA干擾劑、以及免疫劑和域疫苗劑)組成的組。18.藥物組合物，其包含前述任一項權(quán)利要求定義的反膠束和藥學(xué)可接受的載體。全文摘要本發(fā)明主要涉及包含水溶性治療活性劑的反膠束體系。本發(fā)明的反膠束具體用于遞送藥物。本發(fā)明還涉及包含所述反膠束的藥物組合物及其制備方法。文檔編號A61K9/48GK101102747SQ200580037669公開日2008年1月9日申請日期2005年11月2日優(yōu)先權(quán)日2004年11月2日發(fā)明者J-C·莫雷爾申請人:丹德拉醫(yī)藥股份公司