專(zhuān)利名稱(chēng)：促進(jìn)血管新生的甲狀腺激素類(lèi)似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到甲狀腺激素，甲狀腺激素類(lèi)似物和它的衍生物，和它的聚合物形態(tài)。使用這些化合物的方法和包含它們的藥物組合物也被公開(kāi)。本發(fā)明也涉及到制備這些化合物的方法。

背景技術(shù)：
甲狀腺激素，L-甲狀腺素(T4)和L-三碘甲狀腺氨酸(T3)，在脊椎動(dòng)物不同組織中調(diào)節(jié)許多不同的生理學(xué)的過(guò)程。甲狀腺激素的大部分作用是通過(guò)甲狀腺激素受體(“TR”)作媒介的，TR是活性配基轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的核受體總科的一員。這個(gè)總科也包括類(lèi)固醇激素，類(lèi)維生素A，和1，25-二羥基維生素D3的受體。這些受體是能調(diào)節(jié)各種各樣的組織中特殊基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子并且能夠作為普遍使用的藥物的目標(biāo)，所述的普遍使用的藥物例如它莫西芬，一個(gè)雌激素受體部分拮抗物。有兩個(gè)不同的基因，他們編碼兩個(gè)不同的TR，即TRα和TRβ。這兩個(gè)TR經(jīng)常在不同的組織里在不同的水平上共表達(dá)。大部分的甲狀腺激素不會(huì)區(qū)別這兩個(gè)TR并都以相似的親和力結(jié)合。
在老鼠身上的基因敲除研究表明TRβ在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育和通過(guò)垂體內(nèi)的T3的甲狀腺有刺激性的激素的負(fù)反饋中發(fā)揮作用，而TRα調(diào)節(jié)熱量產(chǎn)生和心血管系統(tǒng)的甲狀腺激素的效果。TR拮抗物的鑒定在將來(lái)甲狀腺功能減退癥的治療過(guò)程中起到很重要的作用。通過(guò)直接拮抗在受體水平上甲狀腺激素的效果，這些分子可以迅速地見(jiàn)效，這對(duì)于需要外科手術(shù)、有心臟病，或處在威脅生命地甲狀腺毒性風(fēng)暴的危險(xiǎn)中的患者是一個(gè)顯著地進(jìn)步。因此，保留了化合物的發(fā)展的需要，這些化合物通過(guò)甲狀腺激素受體(TRs)的相同形態(tài)選擇性的激動(dòng)藥劑或拮抗物起作用來(lái)有選擇性的調(diào)節(jié)甲狀腺激素行為，將證明對(duì)醫(yī)學(xué)治療是有用的。近來(lái)的成就集中在作為潛在的治療藥劑和化學(xué)探針的甲狀腺激素(T3/T4)拮抗物設(shè)計(jì)和合成上。這也需要擬甲狀腺素藥的化合物的發(fā)展，這比天然的激素和潛在的有用的受體結(jié)合與激活性質(zhì)更容易達(dá)到。
甲狀腺激素受體優(yōu)選地結(jié)合3，5，3’-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)，一種來(lái)自組織循環(huán)的L-甲狀腺素(T4)的脫碘作用的激素類(lèi)似物。可是，作為獨(dú)立的TR，T4和T3激活胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的能力，最近已被幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室所描述。作為獨(dú)立的TR起作用，甲狀腺激素也調(diào)節(jié)突觸體的質(zhì)膜Na+/H+交換器，Ca2+-刺激的ATP酶，集合其他的離子泵或渠道，和GTP酶的活動(dòng)。從這幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究證明了甲狀腺激素激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的能力。這些途徑有代表性地被通過(guò)細(xì)胞表面的物理和化學(xué)信號(hào)激活。盡管甲狀腺激素同質(zhì)膜結(jié)合的動(dòng)力學(xué)和類(lèi)似物專(zhuān)一性已經(jīng)被重復(fù)地報(bào)道，但是造成這些對(duì)于甲狀腺激素TR獨(dú)立的活動(dòng)的細(xì)胞表面受體在以前還沒(méi)有確定過(guò)。
我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)指出，在缺少功能性的TR的CV-I猴子成纖維細(xì)胞圖線和其他的細(xì)胞里，T4激活促細(xì)胞分裂劑激活的蛋白激酶(MAPK；ERK112)信號(hào)的級(jí)聯(lián)和促進(jìn)MAPK的磷酸化作用和核易位，它比接下來(lái)的T4的生理學(xué)濃度的應(yīng)用早10min。在甲狀腺激素處理的細(xì)胞的核片斷里，我們描述了有活性的MAPK和反式激活的核蛋白，它們是MAPK的絲氨酸激酶活性的底物。這些蛋白包括轉(zhuǎn)錄(STAT)-1α、STAT3、p53、雌激素受體(ER)-α和在包括TR細(xì)胞里，T3(TRβ1)的核甲狀腺激素受體的信號(hào)的變換器和激活劑。這些蛋白的甲狀腺激素控制的MAPK依賴(lài)的磷酸化作用增強(qiáng)了他們轉(zhuǎn)錄的能力。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑和四碘化甲狀腺乙酸(tetrac)能夠阻止T4誘導(dǎo)的MAPK活化作用效果，其中四碘化甲狀腺乙酸(tetrac)是一種抑制Tq結(jié)合到細(xì)胞表面的甲狀腺激素類(lèi)似物。甲狀腺激素活化的MAPK也可能作用在質(zhì)膜上，例如，在N+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)，勝于轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的時(shí)候。目前還沒(méi)有被確定與MAPK級(jí)聯(lián)的活化作用相連接的T4的細(xì)胞表面受體。
整合素是一類(lèi)橫跨膜的糖蛋白，這種糖蛋白能夠形成沒(méi)有共價(jià)鍵的異二聚體。整合素的胞外區(qū)域與各種配體相互作用，這些配體包括胞外基質(zhì)糖蛋白和細(xì)胞骨架連接到細(xì)胞內(nèi)的區(qū)域。十年前甲狀腺激素就被指出其影響整合素和胞外基質(zhì)蛋白、層粘連蛋白的相互作用，但是機(jī)制還不清楚。整合素αVβ3有大量的胞外蛋白配體，包括生長(zhǎng)因子，并且與配體結(jié)合能激活MAPK級(jí)聯(lián)。一些整合素包含一種Arg-Gly-Asp(″RGD″)識(shí)別位點(diǎn)，它對(duì)基質(zhì)和其他包含Arg-Gly-Asp序列的胞外蛋白的配合是非常重要的。
因此，非常希望鑒別和提供一個(gè)被甲狀腺激素，或其類(lèi)似物和聚合物處理過(guò)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)的初始位點(diǎn)，從而為調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子和其他的多肽(它們的細(xì)胞表面受體聚在初始位點(diǎn)周?chē)?提供方法。
據(jù)估計(jì)在美國(guó)有五百萬(wàn)人經(jīng)受著慢性的穩(wěn)定的咽炎的折磨。每年有200,000位65歲以下的人死于術(shù)語(yǔ)上所謂的“過(guò)早的缺血性心臟病”。盡管有醫(yī)學(xué)治療，許多人繼續(xù)遭受著心肌梗塞和衰弱綜合癥，促進(jìn)了采用經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)或冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)來(lái)重建血管的需要。假定救助心肌缺血的一條途徑就是增強(qiáng)冠狀側(cè)枝循環(huán)。
在心肌梗塞的急性過(guò)程中體內(nèi)冠狀溶栓治療的時(shí)可見(jiàn)的冠狀側(cè)副管(″collaterals″)在解剖學(xué)上的出現(xiàn)和肌酸激酶時(shí)間-活性曲線、梗塞尺寸和動(dòng)脈瘤形態(tài)間的相互關(guān)系現(xiàn)在已被建立。這些研究證實(shí)了有冠狀阻礙疾病的心臟中的冠狀側(cè)副管的保護(hù)性作用，與冠狀側(cè)副管不可見(jiàn)的患者相比較，顯示較小的梗塞，較小的動(dòng)脈瘤形狀和改善的心室功能。當(dāng)心臟的肌細(xì)胞呈現(xiàn)缺血性，冠狀側(cè)副管通過(guò)伴隨著DNA的復(fù)制與內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞的有絲分裂的生長(zhǎng)發(fā)展很活躍。一旦缺血發(fā)展，這些因子被激活并為受體占據(jù)變得可利用，在暴露到外源肝素后它可能引起血管新生。不幸的是，通過(guò)血管新生的發(fā)生，這個(gè)“自然”的過(guò)程不足以在幾乎所有的有冠狀動(dòng)脈疾病的患者體內(nèi)治愈缺血。
在缺血的過(guò)程中，通過(guò)ATP的分解腺苷被釋放。腺苷參與許多保護(hù)心臟的生理學(xué)活動(dòng)。腺苷在血液動(dòng)力學(xué)的變化中起作用，例如心動(dòng)過(guò)緩和血管舒張，并且已被證明腺苷在例如預(yù)處理和再灌注損傷中的可能性還原這樣的不相關(guān)的現(xiàn)象中起作用(Ely andBerne，Circulation，85893(1992)。
血管新生是在已存在的血管上發(fā)展新的血管(Mousa，S.A.，Inangiogenesis Inhibitors and StimulatorsPotential TJierapeuticImplications，Landes Bioscience，Georgetown，Texas；Chapter1，(2000))。生理學(xué)上地，血管新生保證成熟生物體適當(dāng)?shù)匕l(fā)展，為卵植入子宮做好準(zhǔn)備，并在傷口愈合起關(guān)鍵的作用。胚胎發(fā)生或正常情況和血管新生過(guò)程中血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展依靠生長(zhǎng)因子和有胞外基質(zhì)的細(xì)胞間的相互作用(Breier et al.，Trends in CellBiology 6454-456(1996)；Folkman，Nature Medicine 127-31(1995)；Risau，Nature 386671-674(1997)。在胚胎發(fā)生過(guò)程中血管通過(guò)兩個(gè)途徑產(chǎn)生血管發(fā)生和血管新生(Blood et al.，Bioch.Biophys.Acta 103289-118(1990)。血管新生是通過(guò)平衡前血管新生因子和抗血管新生因子進(jìn)行控制的多步驟過(guò)程。這個(gè)過(guò)程的最后階段包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和機(jī)體化形成管狀結(jié)構(gòu)。生長(zhǎng)因子，比如FGF2和VEGF，被認(rèn)為是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的關(guān)鍵參與者。
血管新生是一種復(fù)雜的過(guò)程，包括血管生長(zhǎng)因子(PCarmeliet，Ann NY Acad Sci 902249-260，2000)，胞外基質(zhì)，粘附分子和代謝因素(RJ Tomanek，GC Schatteman，Anat Rec 261126-135，2000)的本地釋放。血管內(nèi)部的機(jī)械力也可能起作用(OHudlicka，Molec Cell Biochem 14757-68，1995)。在新血管生長(zhǎng)中涉及的內(nèi)生生長(zhǎng)因子的主要種類(lèi)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族和血管內(nèi)生生長(zhǎng)因子(VEGF)(G Pages，Ann NY Acad Sci902187-200，2000)。促細(xì)胞分裂劑激活的蛋白激酶(MAPK；ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)涉及到VEGF基因表達(dá)和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的控制。
固有的腺苷可以促進(jìn)冠狀流動(dòng)響應(yīng)而增加心肌氧的需要，從而調(diào)節(jié)心肌流動(dòng)儲(chǔ)備(Ethier et al.，Am.J.Physiol.，H131(1993)，這證實(shí)了生理學(xué)濃度的腺苷加入到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中，可能通過(guò)一種表面受體刺激增殖。腺苷可能是人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和可能的血管新生因子。血管新生出現(xiàn)是為了保護(hù)患有例如冠狀動(dòng)脈疾病(“CAD”)的阻礙血液流動(dòng)疾病的患者，但是血管生長(zhǎng)的自然速率不足以治愈疾病。因此，增強(qiáng)和加速體內(nèi)的自然的血管新生潛能的策略對(duì)患有CAD的病人是有好處的。
同樣地，傷口愈合在許多發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)是一個(gè)主要問(wèn)題，且隨著不斷增加的各種各樣的環(huán)氧合酶-2(CoX2)的使用糖尿病患者的傷口愈合能力被削弱且患有慢性炎癥。血管新生對(duì)傷口修復(fù)是必要的，因?yàn)樾卵芴峁I(yíng)養(yǎng)支持活動(dòng)的細(xì)胞，促進(jìn)肉芽組織形成和促進(jìn)殘余物的清除。大約有60％的肉芽組織物由血管組成，它也提供了必要的氧來(lái)促進(jìn)修復(fù)和血管的生長(zhǎng)。它很好的證明了血管新生因子存在于傷口流體中且當(dāng)血管新生抑制修復(fù)時(shí)促進(jìn)修復(fù)。傷口血管新生是一種復(fù)雜的多步驟的過(guò)程。盡管對(duì)許多血管新生因子有詳細(xì)的了解，但是在定義這些因子的來(lái)源，及包括在傷口血管新生中的調(diào)節(jié)活動(dòng)方面，以及在促進(jìn)修復(fù)的血管新生刺激物的臨床使用方面進(jìn)展很小。依賴(lài)于傷口的深度，傷口的類(lèi)型(燒傷，創(chuàng)傷，等等)和位置(肌肉，皮膚，骨頭，等等)的不同，修復(fù)機(jī)制和介質(zhì)很可能是不同的，這一事實(shí)使對(duì)傷口血管新生的理解進(jìn)一步復(fù)雜化。患者的情況和年齡(糖尿病患者，截癱患者，類(lèi)固醇治療患者，年齡較大的嬰幼兒，等等)也能決定血管新生因子修復(fù)和應(yīng)答的速率。病人的性別和激素狀態(tài)(絕經(jīng)期前，絕經(jīng)期后，等等)也會(huì)影響修復(fù)的機(jī)制和應(yīng)答。削弱傷口愈合尤其會(huì)影響美國(guó)年齡較大的和1400萬(wàn)糖尿病患者中的許多人。因?yàn)闇p少血管新生經(jīng)常是導(dǎo)致這些患者中傷口愈合難題的因素，定義傷口愈合中的重要的血管新生因子和發(fā)展阻止和/或糾正削弱的傷口愈合是很重要的。
因此，對(duì)通過(guò)血管新生試劑進(jìn)行有效的治療存在需要，在這里，血管新生試劑可以作為主要的或附加的治療，以最小的副作用來(lái)促進(jìn)傷口愈合，冠狀血管新生或其它與血管新生相關(guān)的疾病。這種治療對(duì)患有血管異常例如心肌梗死，撞擊或外圍的動(dòng)脈疾病的患者特別有用，并且可以用來(lái)預(yù)防患有不良冠狀循環(huán)的患者，其中，不良冠狀循環(huán)使患者患有缺血和心肌梗死的高的危險(xiǎn)。
甲狀腺激素、類(lèi)似物和聚合結(jié)合物在大腦的發(fā)育中有重要的作用。不斷增加的證據(jù)表明在早期發(fā)育階段聚合的甲狀腺激素的缺失導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)和功能的不足，但是這個(gè)潛在的精確的機(jī)制仍然難以明白。
哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)包括一種外圍的神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS，包括大腦和脊髓)，且包括兩種主要種類(lèi)的細(xì)胞神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞填滿了神經(jīng)元間的空間，滋養(yǎng)著他們并調(diào)節(jié)他們的功能。特定的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，例如PNS中的Schwann細(xì)胞和CNS中的少突膠質(zhì)細(xì)胞，也提供了一個(gè)髓鞘環(huán)繞在神經(jīng)系統(tǒng)周?chē)Ｋ枨誓苎刂窠?jīng)元迅速傳導(dǎo)。在外圍神經(jīng)系統(tǒng)中，多重神經(jīng)元的軸突可以捆在一起從而形成神經(jīng)纖維。這些，依次相繼地，可能結(jié)合到肌束或纖維束中。
在發(fā)育過(guò)程中，從中樞和外圍的神經(jīng)系統(tǒng)分化的神經(jīng)元送出軸突，它生長(zhǎng)并與特定目標(biāo)細(xì)胞相聯(lián)系。在一些情況下，軸突必須覆蓋很大的距離；一些生長(zhǎng)到外圍，而其它的被限制在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在哺乳動(dòng)物中，在生命的胚胎期神經(jīng)形成的這個(gè)階段是完全的，一旦它們完全分化神經(jīng)元細(xì)胞不繁殖。
已經(jīng)確認(rèn)，一種神經(jīng)病宿主能夠影響神經(jīng)系統(tǒng)。神經(jīng)病可以影響神經(jīng)元本身或相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可以導(dǎo)致細(xì)胞代謝功能障礙，感染，暴露給毒物，自身免疫，營(yíng)養(yǎng)不良，或缺血。在一些情況下，細(xì)胞的神經(jīng)病被認(rèn)為直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在其它的情況下，神經(jīng)病可以導(dǎo)致足夠的組織壞死來(lái)刺激身體的免疫/炎癥系統(tǒng)和對(duì)初始損傷的免疫應(yīng)答然后摧毀神經(jīng)通路。
由CNS軸突的損壞導(dǎo)致的神經(jīng)通路損壞的地方，自體固有的外圍神經(jīng)移植被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而連接損害并允許軸突使它回到它們正常的目標(biāo)區(qū)域。與CNS神經(jīng)元相比較，外圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元在對(duì)軸突損壞的應(yīng)答時(shí)能延伸新的外圍過(guò)程。外圍神經(jīng)系統(tǒng)軸突的這個(gè)再生的特性足夠允許這些片段移植給軸突。但是成功的移植被許多的因素限制，這些因素包括關(guān)于發(fā)生在細(xì)胞體附近的成功的移植的旁路的CNS軸突損壞的長(zhǎng)度，和從CNS神經(jīng)細(xì)胞體到移植點(diǎn)的距離。
在外圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，神經(jīng)元的這種細(xì)胞可再生性對(duì)一種受損的神經(jīng)路徑的修復(fù)功能有限制能力。特別地，新的軸突隨機(jī)地延伸，且經(jīng)常誤導(dǎo)與不合適的目標(biāo)聯(lián)系，而導(dǎo)致反常的功能。例如，如果一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)被損壞，再生的軸突可能聯(lián)系錯(cuò)誤的肌肉，導(dǎo)致癱瘓。另外，嚴(yán)重的神經(jīng)過(guò)程導(dǎo)致一個(gè)比幾毫米還長(zhǎng)的間隙，例如大于10毫米(mm)，或者是由于神經(jīng)再生無(wú)法生長(zhǎng)必要的距離，或者是由于軸突生長(zhǎng)錯(cuò)誤的方向，不會(huì)發(fā)生適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)再生。通過(guò)外科手術(shù)的方法來(lái)修補(bǔ)外圍神經(jīng)損傷的努力會(huì)遇到多種結(jié)果，尤其是在損傷延伸超過(guò)很大距離的地方。在一些情況下，用來(lái)得到嚴(yán)重的神經(jīng)末端正確的排列的縫合步驟刺激創(chuàng)傷組織的表達(dá)，所述創(chuàng)傷組織的表達(dá)被認(rèn)為抑制了軸突的再生。即使創(chuàng)傷組織形成的地方已被減少，隨著神經(jīng)指導(dǎo)通道或其它管狀修復(fù)的使用，成功的再生通常仍限制在距離小于10毫米的神經(jīng)損傷上。另外，外圍神經(jīng)元很明顯地抑制某一位置，在此位置損傷或神經(jīng)病影響細(xì)胞體自身或?qū)е履┒溯S突的廣泛的退化。
哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的途徑也會(huì)遇到由于新生性病變導(dǎo)致的損傷帶來(lái)的危險(xiǎn)。神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤形成已經(jīng)被鑒定。神經(jīng)源變形細(xì)胞一般失去了它們作為普通分化細(xì)胞擁有的能力，并由于功能損失能摧毀神經(jīng)系統(tǒng)途徑。另外，增生擴(kuò)散的腫瘤可以通過(guò)扭曲正常神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)，通過(guò)壓縮神經(jīng)系統(tǒng)抑制途徑，抑制腦脊液或血液補(bǔ)給流動(dòng)，和/或通過(guò)刺激身體的免疫應(yīng)答來(lái)誘發(fā)傷害。腎上腺轉(zhuǎn)移瘤是大腦和脊髓新生性病變的很重要的原因，類(lèi)似地也可以損壞神經(jīng)系統(tǒng)途徑和誘使神經(jīng)細(xì)胞死亡。
與神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞生長(zhǎng)，分化和發(fā)育相關(guān)聯(lián)的一類(lèi)形態(tài)可調(diào)節(jié)的分子是細(xì)胞粘附分子(“CAM”)，最特別的是神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(N-CAM)。這些CAM是免疫球蛋白超級(jí)家族的成員。它們通過(guò)同種結(jié)合，即在并列的細(xì)胞上的CAM-CAM結(jié)合調(diào)節(jié)發(fā)育或成熟的組織中的細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用。已經(jīng)確定出大量不同的CAM。其中，被研究的最徹底的是N-CAM和L-CAM(肝細(xì)胞粘附分子)，這兩種在早期發(fā)育階段的所有細(xì)胞上都已被鑒定，在不同的成年組織中也一樣被鑒定。在神經(jīng)組織發(fā)育中，N-CAM表達(dá)被認(rèn)為在組織機(jī)體，神經(jīng)元的遷移，神經(jīng)系統(tǒng)-肌肉組織的粘附，視網(wǎng)膜的形成，突觸發(fā)生和神經(jīng)變性中是很重要的。減少的N-CAM的表達(dá)也被認(rèn)為是與神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙相關(guān)聯(lián)。例如，在一種脫髓鞘突變的鼠體內(nèi)，N-CAM，N-CAM-180的至少一種形式的表達(dá)有所減少。Bhat，Brain Res.452373-377(1988)。N-CAM水平的減少也也與腦積水的正常壓力和II型精神分裂癥有關(guān)，分別參見(jiàn)文獻(xiàn)Werdelin，Acta Neurol.Scand.79177-181(1989)和Lyons，et al.，Biol.Psychiatry 23769-775(1988)。另外，N-CAM的抗體已表明可中斷受損的神經(jīng)系統(tǒng)中的功能性恢復(fù)。Remsen，Exp.Neurobiol.110268-273(1990)。
目前不存在修復(fù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元外在的損傷和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的疾病導(dǎo)致的損害的令人滿意的方法。在美國(guó)每年有15,000到18,000新的脊髓損傷的新病例。另外，大約有200,000脊髓損傷患者。每年照顧這些病人的花費(fèi)超過(guò)了7億美元。伴隨急性脊髓創(chuàng)傷的病理生理學(xué)是一個(gè)復(fù)雜的和沒(méi)有完全弄清楚的機(jī)制。機(jī)械創(chuàng)傷導(dǎo)致的主要的組織損傷立刻發(fā)生且不可逆。Allen，J.Am.Med.Assoc.57878-880(1911)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明許多創(chuàng)傷后的組織損傷是作用過(guò)程的結(jié)果，這一作用過(guò)程在損傷后數(shù)分鐘開(kāi)始并延續(xù)數(shù)天或數(shù)星期。Janssen，et al.，Spine 1423-32(1989)and Panter，etal.，(1992)。這個(gè)嚴(yán)重的，自破壞性的過(guò)程包括病理生理學(xué)的機(jī)制，例如出血，創(chuàng)傷后缺血，水腫，突觸和神經(jīng)元壞死，和伴隨胞囊形成和梗死形成的髓鞘化。參見(jiàn)Tator，et al.，J.Neurosurg，7515-26(1991)和Faden，Crit.Rev.Neurobiol.7175-186(1993)。被提議的有害的因子包括電解質(zhì)變化由此增加的胞內(nèi)鈣引起活動(dòng)的級(jí)聯(lián)(Young，J.Neurotrauma 9，Suppl.1S9-S25(1992)andYoung，J.Emerg.Med 1113-22(1993))，伴有未受控制的傳導(dǎo)物釋放的生物化學(xué)變化(Liu，et al.，Cell 66807-815(1991)和Yanase，et al.，J.Neurosurg 83884-8 88(1995)，花生四烯酸的釋放，自由基的生產(chǎn)，脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)(Braughler，et al.，J.Neurotrauma 9，Suppl.1S1-S7(1992)，類(lèi)花生酸生產(chǎn)(Demediuk，et al.，J.Neurosci.Res.20115-121(1988)，內(nèi)源阿片樣物質(zhì)(Faden，et al.，Ann Neurol.17386-390(1985)，代謝變化包括氧和葡萄糖的改變(Faden，Crit.Rev.Neurobiol.7175-186(1993))，炎癥變化(Blight，J.Neurotrauma 9，Suppl.1S83-S91(1992)，和星形水腫(Kimelberg，J.Neurotrauma 9，Suppl.1S71-S81(1992)。在過(guò)去的400年里外科手術(shù)的方法包括伴隨著融合的椎板切除術(shù)和減壓，其已成為最普通的熟練的處理策略。Hansebout，″EarlyManagement of Acute spinal cord Injury″，pp.181-196(1982)andJanssen，et al.，Spine 1423-32(1989)。但是，這些過(guò)程不包括關(guān)于增加脊髓組織再生特性的技術(shù)的應(yīng)用。
一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的宿主已經(jīng)被確定，包括髓鞘化疾病，脊髓病，和如肌肉萎縮神經(jīng)側(cè)索硬化癥(“ALS”)這樣的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的疾病。INTERNAL MEDICINE，ch.121-123(4th ed.，J.H.Stein，ed.，Mosby，1994)。多發(fā)性硬化(“MS”)是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘化混亂，引起大腦和脊髓內(nèi)硬化的斑點(diǎn)(例如，斑塊)。依賴(lài)于斑塊的位置和尺寸，多發(fā)性硬化有多種臨床表現(xiàn)。典型的綜合癥包括視力的降低，復(fù)視，眼震，發(fā)音困難，虛弱，感覺(jué)異常，膀胱畸形，和情緒的改變。已經(jīng)提出無(wú)數(shù)的治療方法來(lái)治療這種長(zhǎng)期變化的疾病。被提議的方法包括從飲食到電擊到針灸，情感支持，和免疫抑制療法的各種形式。沒(méi)有一個(gè)證明是滿意的。
在一些疾病(例如，初期的側(cè)面硬化，脊髓肌肉萎縮，良性的局灶性肌萎縮)中發(fā)生低級(jí)和高級(jí)神經(jīng)元的嚴(yán)重?fù)p失。但是，ALS是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病最常見(jiàn)的的形式。低級(jí)和高級(jí)神經(jīng)元損失在ALS中都發(fā)生。癥狀包括更嚴(yán)重的骨骼肌肉消瘦，虛弱，gasciculations，和cramping。一些病例主要牽連腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(進(jìn)行性延髓麻痹)。不幸的是，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和相關(guān)疾病的治療主要依賴(lài)于這點(diǎn)。INTERNAL MEDICINE，ch.123 (4th ed.，J.H.Stein，ed.，Mosby，1994)。
因而，本領(lǐng)域很需要能夠治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元混亂和損傷，和神經(jīng)功能的相關(guān)的缺陷的辦法。因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于，為刺激血管新生，誘使神經(jīng)元分化，和阻止神經(jīng)元細(xì)胞的死亡或退化提供組成物和方法。
酪氨酸在一個(gè)(單碘化酪氨酸)或兩個(gè)(二碘化酪氨酸)位點(diǎn)被碘化，并且然后結(jié)合形成有活性的激素(二碘化酪氨酸+二碘化酪氨酸→四碘甲腺原氨酸，[甲狀腺素，T4]；二碘化酪氨酸+單碘化酪氨酸→三碘甲腺原氨酸[T3])。包括甲狀腺體在內(nèi)的T3的另一來(lái)源是通過(guò)含硒酶I型5’-脫碘酶(5’D-I)的T4的外環(huán)脫碘作用的結(jié)果。甲狀腺球蛋白，一種包含T3和T4及其基質(zhì)在內(nèi)的糖蛋白，被甲狀腺細(xì)胞作為膠體微滴從小囊中吸收。
溶酶體包含蛋白酶從甲狀腺球蛋白中切開(kāi)T3和T4，導(dǎo)致游離的T3和T4的釋放。碘化酪氨酸(單碘化酪氨酸和二碘化酪氨酸)也從甲狀腺球蛋白中釋放，但是僅有非常小量到達(dá)血流。通過(guò)胞內(nèi)脫碘作用從它們中移去碘，這些碘通過(guò)甲狀腺體被使用。
通過(guò)蛋白水解從甲狀腺釋放的T4和T3到達(dá)血流，為了運(yùn)輸在這它們與結(jié)合了甲狀腺激素的血清蛋白相結(jié)合。主要的甲狀腺激素結(jié)合蛋白是甲狀腺素結(jié)合球蛋白(“TBG”)，它有高的親和力但低的T4和T3的容量。TBG通常約占結(jié)合激素的75％。其它的甲狀腺激素-結(jié)合蛋白——主要的甲狀腺素-結(jié)合前清蛋白也叫轉(zhuǎn)甲腺素蛋白(“TTR”)，它有很高的親和性但是低的T4的容量，而清蛋白則由于結(jié)合血清甲狀腺激素的殘留而具有有低的親和力但高的T4和T3的容量。大約占總血清0.03％的T4和占總血清0.3％的T3是游離的并與結(jié)合的激素相平衡。只能利用游離的T4和T3對(duì)外圍組織起到甲狀腺激素作用。
甲狀腺激素有兩個(gè)主要的生理影響(1)它們實(shí)質(zhì)上增加了每個(gè)體組織的蛋白合成。(T3和T4進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞中來(lái)源于循環(huán)的T3和細(xì)胞里由T4轉(zhuǎn)換而來(lái)的T3，能夠與不連續(xù)的核受體相結(jié)合并影響mRNA的形成。)(2)通過(guò)不斷增加Na+，K+-ATP酶(Na泵)活性，T3增加了O2的消耗，這是造成主要在組織中基本的O2消耗的原因(例如，肝，腎，心臟核骨骼肌)。增加的Na+，K+-ATP酶的活力對(duì)這個(gè)酶的不斷合成是次要的；因此，不斷增加的O2的消耗也可能與甲狀腺激素的核結(jié)合有關(guān)。但是，線粒體上T3的直接的作用還沒(méi)有排除。盡管T4本身也可能具有生物學(xué)活性，但是T3被認(rèn)為是有活性的甲狀腺激素。
對(duì)激素的生物學(xué)作用起重要作用的甲狀腺素庫(kù)是游離的甲狀腺激素庫(kù)。通過(guò)攝取/釋放甲狀腺激素進(jìn)/出細(xì)胞和通過(guò)甲狀腺激素結(jié)合蛋白結(jié)合/釋放甲狀腺激素，在短的時(shí)間周期內(nèi)可以確定這個(gè)庫(kù)的大小。這些蛋白的比例和絕對(duì)濃度在血漿和腦脊髓的流體(“CSF”)中是不同的。最明確的區(qū)別發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)甲腺素蛋白(“TTR”)，它是僅有的在大腦中合成的結(jié)合甲狀腺激素的血漿蛋白(Schreiber G，Southwell BR，Richardson SJ.Hormone deliverysystems to the brain-transthyretin.Exp Clin Endocrinol Diabetes.1995；103(2)75-80)。TTR與沒(méi)有遺傳缺陷的人體中其它的兩種甲狀腺激素-結(jié)合血漿蛋白是截然不同的。TTR基因的表達(dá)開(kāi)始于大腦的進(jìn)化過(guò)程中，更早于在肝中的進(jìn)化過(guò)程。與甲狀腺素(TR)T4結(jié)合相關(guān)的TTR的域的結(jié)構(gòu)已經(jīng)完整地保存了3億5千萬(wàn)年。這些觀察結(jié)果表明大腦TTR的特殊功能意義。根據(jù)推斷這決定了在腦的細(xì)胞外的空間游離的T4水平。由特殊的脫碘酶在腦中T4能轉(zhuǎn)換成三碘甲腺原氨酸T3。這種T3在細(xì)胞核中可以與受體相互作用，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。
阿爾茨海默氏病是一種嚴(yán)重的神經(jīng)變性的病癥，并且當(dāng)前大約有4百萬(wàn)美國(guó)人遭受這個(gè)疾病的困擾。隨著老年人口增大，除非找到治療或阻止的辦法到下一個(gè)世紀(jì)的中期這個(gè)數(shù)目可以達(dá)到14百萬(wàn)。目前，還沒(méi)有對(duì)這個(gè)疾病的早期診斷的靈敏的和特殊的premortem測(cè)試。當(dāng)前阿爾茨海默氏病是根據(jù)認(rèn)知的降低、伴隨著那些癥狀的其他的可能的原因的系統(tǒng)消除來(lái)診斷的?？赡艿陌柎暮Ｄ喜〉呐R床診斷的確認(rèn)只能通過(guò)死后的腦的檢驗(yàn)來(lái)得到。阿爾茨海默氏病的腦特征在于在擔(dān)負(fù)學(xué)習(xí)和記憶的地區(qū)(例如，大腦皮層和海馬)出現(xiàn)的兩個(gè)不同的異常的蛋白質(zhì)的沉淀物。這些沉淀物是細(xì)胞外的類(lèi)淀粉斑塊和細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(“NFTs”)，其中細(xì)胞外的類(lèi)淀粉斑塊是阿爾茨海默氏病的特征，細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)在其他的神經(jīng)變性的病癥中也可以發(fā)現(xiàn)。淀粉狀的肽一般是40或42長(zhǎng)度的氨基酸(分別是“A1-40”或“A1-42”，)，由一種較大的與膜相關(guān)的未知功能的、淀粉狀蛋白(“APP”)的蛋白異常的過(guò)程形成。普遍認(rèn)為這些肽的寡聚聚集體能夠毒害神經(jīng)，最終導(dǎo)致突觸的退化和神經(jīng)元的損失。淀粉狀的沉淀的數(shù)值大致與在死亡時(shí)癥狀的厲害程度相關(guān)聯(lián)。
在過(guò)去，進(jìn)行了一些嘗試來(lái)設(shè)計(jì)能被用來(lái)作為阿爾茨海默氏病的premortem診斷劑的放射性藥物。Bornebroek等表明采用123I標(biāo)記的淀粉狀的關(guān)聯(lián)蛋白血清淀粉狀的P組分(SAP)，在帶有腦的淀粉狀蛋白病的病人的大腦皮層、可能在管壁中以低的水平積累(Bornebroek，M.，et al.，Nucl.Med.Commun.(1996)，Vol.17，pp.929-933)。
Saito等建議通過(guò)血-腦屏障輸送123I標(biāo)記的A1-40。據(jù)報(bào)導(dǎo)碘化了的A1-40在組織切片中結(jié)合一種淀粉狀的斑塊(Saito，Y.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995，Vol.92，pp.10227-10231)。美國(guó)專(zhuān)利第5,231,000號(hào)公開(kāi)了帶有在阿爾茨海默氏病病人腦中發(fā)現(xiàn)的A4淀粉狀多肽的專(zhuān)一性的抗體。然而，穿過(guò)血腦屏障傳遞這些抗體的方法還沒(méi)有被公開(kāi)。Zhen等描述了結(jié)合淀粉狀的被稱(chēng)為“剛果紅.TM.”的染料改良法，和這些帶有锝和錸的改進(jìn)的分子復(fù)合物。傳聞聲稱(chēng)帶有放射性的離子的復(fù)合物是阿爾茨海默氏病的可能的成像試劑(Zhen et al.，J.Med.Chem.(1999)，Vol.42，pp.2805-2815)。然而，復(fù)合物通過(guò)血-腦屏障的潛力是有限的。
美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的一個(gè)小組(Skovronsky，M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.2000，Vol.97，pp.7609-7614)開(kāi)發(fā)了剛果紅的熒光標(biāo)記的衍生物，具有腦可透性，而且可以非特異的結(jié)合到淀粉狀的物質(zhì)上(也就是說(shuō)，折疊片構(gòu)造的肽)。在臨床試驗(yàn)前，這種化合物需要被放射性標(biāo)記然后進(jìn)行臨床前的藥物動(dòng)力學(xué)和毒性掃描。相反，我們的發(fā)明利用僅自然發(fā)生的物質(zhì)的衍生物或其組合來(lái)診斷防止、和治療阿爾茨海默氏病。Klunk等報(bào)道了采用剛果紅.TM.、柯胺G(“CG”)的衍生物的試驗(yàn)。據(jù)報(bào)導(dǎo)CG在活體外較好地結(jié)合人造的淀粉狀體，并通過(guò)正常的老鼠的血-腦屏障(Klunk et al.，Neurobiol.Aging(1994)，Vol.15，No.6，pp.691-698)。Bergstrom等給出了一個(gè)帶有123I標(biāo)記的化合物作為阿爾茨海默氏病中的M1和M2型毒蕈堿型乙酰膽堿受體可能的可顯影放射性配體(Bergstrom et al.，Eur.J.Nucl.Med.(1999)，Vol.26，pp.1482-1485)。
最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)帶有阿爾茨海默氏病的病人的腦中某些特殊的趨化因子受體上調(diào)(Horuk，R. et al.，J.Immunol.(1997)，Vol.158，pp.2882-2890)；Xia et al.，J.NeuroVirol(1999)，Vol.5，pp.32-41)。另外，最近已經(jīng)表明趨化因子受體CCR1在帶有晚期的阿爾茨海默氏病和正常的年齡的腦的病人中均被上調(diào)。(Halks-Miller et al，CCR1 Immunoreactivity in Alzheimer′s DiseaseBrains，Society for Neuroscience Meeting Abstract，#787.6，Volume24，1998)。在PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/56771中已描述了CCR1受體拮抗物和它們作為消炎劑的作用。
上面描述的所有提議都沒(méi)有成為阿爾茨海默氏病的早期診斷的顯影劑的臨床的進(jìn)展。因此，仍需要一種臨床的診斷劑，它能被使用作阿爾茨海默氏病的可靠的和早期的診斷。另外，建議的策略對(duì)帶有阿爾茨海默氏病的病人中淀粉狀的斑塊形成或積累的抑制也很有用。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供為早期診斷、防止、和治療神經(jīng)變性的疾病的化合物和方法，例如，阿爾茨海默氏病。
有趣的是，已經(jīng)注意到血管新生也存在于其他的不受歡迎的情況，包括固體瘤的生長(zhǎng)和新陳代謝；變形性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；硬皮??；和造成盲的-糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維增生癥和新生血管性青光眼的共同原因(事實(shí)上，眼睛的疾病大致總是伴隨著血管新生)。事實(shí)上創(chuàng)傷處血管新生過(guò)程與腫瘤血管新生有許多共同的特征。因而，有某些病況不歡迎血管新生，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病或其主要的癥狀或腎上腺轉(zhuǎn)移瘤。因此，仍需要某些方法，這些方法可被用來(lái)抑制血管新生制劑的作用從而治療癌癥。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在某種程度上基于某種發(fā)現(xiàn)，這種發(fā)現(xiàn)是甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物和它們的多聚體形式，在細(xì)胞膜水平上起作用并具有與甲狀腺激素作用相獨(dú)立的前血管新生性質(zhì)。因此，這些甲狀腺激素類(lèi)似物和多聚體形式(也就是，血管新生劑)可用于治療各式各樣的病癥。同樣地，該發(fā)明也基于甲狀腺激素類(lèi)似物的拮抗物抑制這些類(lèi)似物的前血管新生作用的發(fā)現(xiàn)，該發(fā)明還可以用于治療各種各樣的病癥。
因此，一方面本發(fā)明以治療服從促進(jìn)血管增生治療的疾病的方法為特點(diǎn)，通過(guò)向需要的患者給藥適量的多聚體形式的甲狀腺激素、或甲狀腺激素類(lèi)似物，有效促進(jìn)血管新生。這里提供了服從促進(jìn)血管新生治療的例子，包括閉塞的血管病、冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、勃起的機(jī)能障礙、心肌梗死、缺血、撞擊、外周動(dòng)脈血管的病癥和傷口。
甲狀腺激素類(lèi)似物的例子在這里也被提供可以包括三碘甲腺原氨酸(T3)、左旋甲狀腺素(T4)、3，5-二甲基-4-(4′-羥基-3′-異丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或3，5-二碘甲狀腺丙酸(DITPA)四碘甲腺乙酸四碘甲狀腺乙酸(TETRAC)、和三碘甲狀腺乙酸(TRIAC)。
在一種實(shí)施方案中，甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物、或其多聚體形式由腸胃外、口直腸、或局部的方法、或其組合方式來(lái)給藥。腸胃外的給藥方式包括，例如，皮下的、腹膜內(nèi)的、肌肉的、或靜脈內(nèi)的給藥方式，例如用導(dǎo)管。局部的給藥方式可以包括繃帶幫助。
在另一種實(shí)施方案中，甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物、或其多聚體形式可以被裝入膠囊或整合入微粒、脂質(zhì)體、或聚合體中。聚合體可以包括，例如，多聚糖脂類(lèi)、聚丙交酯、或它們的共聚體。脂質(zhì)體或微粒的大小大約小于200納米、并可以通過(guò)一個(gè)或一個(gè)以上腸胃外的途徑、或別的給藥方式來(lái)給藥。在另一種實(shí)施方案中，脂質(zhì)體或微粒可以存放在缺血性組織周?chē)拿?xì)血管層、或通過(guò)一種導(dǎo)管把其應(yīng)用到血管內(nèi)部。
根據(jù)本發(fā)明甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物、或其多聚體形式還可以隨著一個(gè)或一個(gè)以上生理活性物質(zhì)共同給藥，這些生理活性物質(zhì)可以包括，例如生長(zhǎng)因子、血管擴(kuò)張劑、抗凝血?jiǎng)⒖共《緞?、抗?xì)菌劑、抗發(fā)炎劑、免疫的抑制劑、止痛劑、血管化試劑、或細(xì)胞粘著分子、或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，甲狀腺激素類(lèi)似物或多聚體形式先于或后于給一個(gè)或一個(gè)以上生理活性物質(zhì)作注射給藥。
生長(zhǎng)因子可以包括，例如，轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子α(“TGFα”)、轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子β(″TGFβ″)、基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子上皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、和血管通透因子。血管擴(kuò)張劑可以包括，例如腺苷、腺苷衍生物、或其組合?？鼓?jiǎng)┌ǎ遣槐幌拗圃?，肝素、肝素衍生物、抗因子分解Xa、抗凝血酶、乙酰水楊酸、氯吡格雷、或其組合。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了促進(jìn)血管沿著或圍繞醫(yī)療器材生成的方法，根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括在將裝置插入病人體內(nèi)之前，用甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式包覆裝置。包覆步驟可以進(jìn)一步地包括用一個(gè)或一個(gè)以上生理活性物質(zhì)包覆醫(yī)療器材，所述生物活性物質(zhì)例如，而不限于，生長(zhǎng)因子、血管擴(kuò)張劑、抗凝血?jiǎng)?、或其結(jié)合物。根據(jù)本發(fā)明，可以被甲狀腺激素類(lèi)似物或其多聚體形式包覆的醫(yī)療器材包括血管擴(kuò)張器、導(dǎo)管、套管或電極。
在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于治療服從抑制血管生成療法的病況的方法，所述方法包括對(duì)所需患者給藥一定量的抗血管生成劑，在所述患者體內(nèi)有效的抑制血管生成。服從抑制血管生成治療的病況的例子包括，但是不限制于，主要的或腎上腺轉(zhuǎn)移瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、和相關(guān)的狀況。本發(fā)明也提供了用來(lái)抑制血管新生的的抗血管生成劑的例子并包括、但是不限制于，四碘甲狀腺乙酸(TETRAC)、三碘甲狀腺乙酸(TRIAC)、單克隆抗體LM609、XT199或其結(jié)合物。這種抗血管生成劑可以在細(xì)胞表面起到抑制前血管新生劑的作用。
在一種實(shí)施方案中，抗血管生成劑由腸胃外的、口的、直腸的、或局部的方式、或其組合的方式給藥。在另一種實(shí)施方案中，抗血管生成劑可以與一種或一種以上其他抗血管生成治療劑或化療劑一起共同給藥。
在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包括甲狀腺激素、和其與聚合物結(jié)合的類(lèi)似物的組合物(即血管新生劑)?？梢酝ㄟ^(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合。例如，共價(jià)鍵可以發(fā)生在一個(gè)酯或酐鍵間。本發(fā)明還提供了甲狀腺激素類(lèi)似物的例子，包括左旋甲狀腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、3，5-二甲基-4-(4′-羥基-3′-異丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或3，5-二碘甲狀腺丙酸。在一種實(shí)施方案中，聚合體可以包括，但是不限制于聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚體、聚乳酸、或瓊脂糖。
另一方面，本發(fā)明提供了藥物制劑，該藥物制劑包括在藥學(xué)上可接受載體中的根據(jù)本發(fā)明的血管新生劑。在一種實(shí)施方案中，藥物制劑還可以包括一個(gè)或一個(gè)以上藥學(xué)上可接受的賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明，藥物制劑可以裝入膠囊或結(jié)合進(jìn)一個(gè)脂質(zhì)體、微粒、或聚合體中。脂質(zhì)體或微粒的大小小于大約200納米。根據(jù)本發(fā)明，任何藥物制劑可以通過(guò)腸胃外的、口頭的、直腸的、或局部的給藥方法、或其組合的方式給藥。在另一種實(shí)施方案中，藥物制劑可以與一個(gè)或一個(gè)以上生理活性物質(zhì)共同給藥需要的病人。這些生理活性物質(zhì)包括但不限于生長(zhǎng)因子、血管擴(kuò)張劑、抗凝血?jiǎng)?、或其結(jié)合物。
在其它方面，本發(fā)明關(guān)于聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物和包含所述激素的藥物制劑的應(yīng)用，來(lái)恢復(fù)神經(jīng)元的功能和提高神經(jīng)細(xì)胞的存活。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，神經(jīng)元的功能被采用平均集體的生理學(xué)的、生物化學(xué)的和解剖的機(jī)制，這個(gè)機(jī)制允許在胚胎和產(chǎn)后期間神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，而且在成年的動(dòng)物中，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)一些部分退化和不能革新的時(shí)候，這個(gè)機(jī)制是中樞神經(jīng)系統(tǒng)適應(yīng)的能力和損害神經(jīng)元的再生機(jī)制的基礎(chǔ)。
所以，下列過(guò)程發(fā)生是是為了獲得神經(jīng)元的功能神經(jīng)切除術(shù)、神經(jīng)移植術(shù)、突觸發(fā)生、突觸的抑制、突觸的擴(kuò)充、軸突的萌芽、神經(jīng)中樞的再生、神經(jīng)中樞路徑的發(fā)育和組織和回路去替換損壞的部分。所以根據(jù)本發(fā)明，適于用聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物或其組合處理的病人是患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(像阿爾茨海默氏病的老年性癡呆、帕金森神經(jīng)機(jī)能障礙、亨廷頓氏舞蹈病、小腦的-脊骨的腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良)、外傷和腦缺血的退化的病人。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是為了治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺陷，包括肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、和脊髓傷害，該方法包括給藥與生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的前血管新生或神經(jīng)發(fā)生因子相結(jié)合的聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物、或其結(jié)合體。脊髓傷害包括由腫瘤、機(jī)械性創(chuàng)傷、和化學(xué)的外傷引起的傷害。相同的或類(lèi)似的方法被用來(lái)修復(fù)在有肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、或脊髓傷害的哺乳動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)機(jī)能。單獨(dú)給藥的上述的聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物或與神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合給藥，也能夠提供預(yù)防的功能。這樣的給藥在患有或有患有肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、或脊髓傷害的危險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物中有保護(hù)運(yùn)動(dòng)機(jī)能的作用。也根據(jù)本發(fā)明，單獨(dú)給藥聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物或與神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合給藥，保護(hù)的黑質(zhì)-紋狀體通路完整性。
特別地，本發(fā)明治療(前或后征兆地)肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、或脊髓傷害的方法包括，單獨(dú)給藥的聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物或與神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子聯(lián)合給藥。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或與神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物是一種可溶性復(fù)合物、包含至少一種單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物。
在一方面，本發(fā)明以組合物和治療方法為特征，其中治療方法包括對(duì)傷害到神經(jīng)中樞途徑、或可以預(yù)見(jiàn)這種傷害的哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的促骨生成蛋白(“單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物”)，如這里所定義的，在足夠維持神經(jīng)途徑，包括修復(fù)受損途徑或抑制附加損傷的濃度下保持一定時(shí)間。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明以維持神經(jīng)中樞途徑的組合物和治療方法為特征。這樣的治療方法包括對(duì)傷害到神經(jīng)中樞的途徑或預(yù)期的這樣的傷害的哺乳動(dòng)物給藥一種化合物，這種化合物能夠刺激治療有效濃度的內(nèi)生的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物。這些化合物在這里做為單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子-刺激劑結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物有關(guān)，并且可以理解的是，這種化合物包括一種物質(zhì)，這種物質(zhì)在對(duì)哺乳動(dòng)物給藥時(shí)，能夠作用于組織或器官正常地負(fù)責(zé)、或產(chǎn)生單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物和/或分泌單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物，這種物質(zhì)還能致使單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物內(nèi)呼吸水平改變。
特別是，本發(fā)明提供了保護(hù)神經(jīng)元免受與身體對(duì)神經(jīng)傷害的免疫和發(fā)炎反應(yīng)相關(guān)的組織損傷作用的方法。本發(fā)明也提供了刺激神經(jīng)元維持它們的不同的表現(xiàn)型的方法，不同的表現(xiàn)型包括誘導(dǎo)神經(jīng)元的起源的轉(zhuǎn)換的細(xì)胞再分化到未轉(zhuǎn)換的神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法來(lái)刺激細(xì)胞粘著分子，特別是神經(jīng)細(xì)胞粘著分子(“N-CAM”) 的產(chǎn)生。本發(fā)明也提供了方法、組合物與設(shè)備來(lái)刺激損壞的神經(jīng)元和神經(jīng)中樞的途徑的細(xì)胞修復(fù)作用，這里的損壞的神經(jīng)元和神經(jīng)中樞的途徑，包括再生的損壞樹(shù)枝狀大分子或軸突。另外，本發(fā)明也提供了方法來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)組織的狀況，并且通過(guò)監(jiān)視單獨(dú)聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物或和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子水平的波動(dòng)來(lái)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)神經(jīng)病。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，這里描述的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可以用來(lái)修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)途徑損傷。尤其是單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物能夠有效地修復(fù)包括神經(jīng)纖維切斷或損傷的神經(jīng)途徑損傷。特別的，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物能夠刺激完整地突軸神經(jīng)再生，包括冠狀動(dòng)脈血流和髓鞘再生。優(yōu)選的，將在生物相容的、生物再吸收的載體中的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物提供到受傷的位置，在該位置能維持單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物，并且，在必要處，嚴(yán)重的神經(jīng)元從近端的到遠(yuǎn)端的結(jié)束直接的軸突的生長(zhǎng)方法。例如，在神經(jīng)再生的地方可能需要直接的軸突的生長(zhǎng)方法將被誘導(dǎo)超過(guò)一擴(kuò)大的距離，例如大于10毫米。預(yù)計(jì)了多種能夠提供這種功能的載體。例如，有效的載體包括在這里公開(kāi)的制備物質(zhì)或粘稠溶液，包括層粘連蛋白、透明質(zhì)酸或膠原、或其他的適合的人造的、生物相容的聚合的物質(zhì)例如聚乳酸、聚羥基乙酸或聚丁酸和/或其共聚物。一種優(yōu)選的載體包括衍生的細(xì)胞外基質(zhì)組合物，例如，得自老鼠肉瘤細(xì)胞。
在一種特別地優(yōu)選的實(shí)施方案中，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物放置在一種神經(jīng)引導(dǎo)渠道中，這個(gè)神經(jīng)引導(dǎo)渠道橫跨損壞的途徑。這個(gè)渠道既作為一種防護(hù)罩又作為一種指導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的一種自然的方法。有用的渠道包括一種生物相容的膜，它的結(jié)構(gòu)可能是管狀的，其尺寸足夠跨過(guò)所需修復(fù)的神經(jīng)的缺口，并且有空缺去適合接收嚴(yán)重的神經(jīng)末端。這種膜可能是由任何生物相容的、無(wú)刺激性的物質(zhì)制成的，例如硅樹(shù)脂或一種生物相容的聚合體，例如聚乙烯或聚乙烯醋酸乙烯酯。腸衣也可能是由生物相容的生物可再吸收的聚合物組成的，例如，膠原、透明質(zhì)酸、聚乳酸、聚丁酸和聚羥基乙酸。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案，該渠道的外表面實(shí)質(zhì)上是不通透的。
單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可能是放置在與一種生物相容的運(yùn)載物質(zhì)相聯(lián)系的渠道中，或可能被吸附到或關(guān)聯(lián)到腸衣的內(nèi)表面，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,011,486所描述的，該專(zhuān)利指出單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物易到達(dá)嚴(yán)重的神經(jīng)末端。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，這里所描述的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物具有有效的保護(hù)作用，從而免受與身體對(duì)神經(jīng)組織最初傷害的免疫/發(fā)炎應(yīng)答有關(guān)的損害。這樣的應(yīng)答可能沿著創(chuàng)傷到神經(jīng)組織，致使，通過(guò)自身免疫的功能障礙、新生性病變、傳染、化學(xué)的或機(jī)械性創(chuàng)傷、病原，通過(guò)神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的血流間斷，或通過(guò)神經(jīng)或圍繞物質(zhì)的其他創(chuàng)傷。例如，由氧不足或隨著神經(jīng)中樞的血液供給的閉塞處的缺血-再灌注引起的主要的損傷，例如腦栓塞被認(rèn)為是與免疫地關(guān)聯(lián)的。另外，與許多主要的腦腫瘤有關(guān)的至少部分的損傷也好象是與免疫相關(guān)聯(lián)的。單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物的應(yīng)用，直接地或系統(tǒng)地減輕和/或抑制免疫有關(guān)的應(yīng)答神經(jīng)中樞的傷害。作為選擇，也可以使用給藥優(yōu)選地在損傷的位置，給藥能刺激活體內(nèi)單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物表達(dá)和/或分泌的藥劑。當(dāng)在外科手術(shù)或其他的主動(dòng)的臨床治療期間，在發(fā)生損傷的位置，在創(chuàng)傷發(fā)生之前給藥單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或藥劑，能夠?yàn)橛形ｋU(xiǎn)的神經(jīng)組織提供一種神經(jīng)保護(hù)作用。
通常，在本發(fā)明的方法和組合物中有用的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物是蛋白二聚體，這些蛋白二聚體誘導(dǎo)一個(gè)或一個(gè)以上的真核(例如，哺乳動(dòng)物)細(xì)胞、組織或器官的形態(tài)發(fā)生。組織形態(tài)發(fā)生包括從頭或再生的組織形成，例如在發(fā)育期間發(fā)生在一種脊椎動(dòng)物的胚胎。特別重要的是單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物，它們誘導(dǎo)組織-特異性至少是骨或神經(jīng)中樞組織的形態(tài)發(fā)生。在這里做為規(guī)定，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物包含一對(duì)多肽，當(dāng)它們折疊時(shí)，形成蛋白二聚體從而在顯有甲狀腺受體的細(xì)胞和組織中引起形態(tài)發(fā)生的應(yīng)答。也就是說(shuō)，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物一般地誘導(dǎo)一種事件的級(jí)聯(lián)，該事件包括在一種形態(tài)發(fā)生地許可的環(huán)境中所有下列情況刺激起源細(xì)胞的增殖；刺激起源細(xì)胞的分化；刺激分化的細(xì)胞的增殖；和，支持分化的細(xì)胞的生長(zhǎng)與維持?！捌鹪础奔?xì)胞是未定型的細(xì)胞，依靠它們的基因組全部功能和在形態(tài)發(fā)生被誘導(dǎo)的許可的環(huán)境的組織專(zhuān)一性，這些細(xì)胞有能力分化成一個(gè)或一個(gè)以上特殊類(lèi)型地的分化的細(xì)胞。一種典型的起源細(xì)胞是一種造血干細(xì)胞、一種間充質(zhì)干細(xì)胞、一種基底上皮細(xì)胞、一種神經(jīng)脊細(xì)胞、等等。更進(jìn)一步，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可以延遲或緩和衰老的開(kāi)始-或靜止-與表現(xiàn)型和/或組織功能有關(guān)地?fù)p失。更進(jìn)一步，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可以刺激一種分化的細(xì)胞類(lèi)型的表型表達(dá)，包括新陳代謝的和/或功能的的表達(dá)，例如，分泌，和其性狀。另外，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可以誘導(dǎo)在適當(dāng)?shù)臓顩r下的定型細(xì)胞的分化(例如，成骨細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、等等)。在這里特別重要的是，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物誘導(dǎo)至少骨或神經(jīng)中樞的組織的分化、和/或支持生長(zhǎng)、維持和/或神經(jīng)中樞的組織的功能性。
特別重要的是，當(dāng)單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物提供到哺乳動(dòng)物的一種特異的組織時(shí)，它們誘導(dǎo)組織-特異的形態(tài)發(fā)生或維持分化的正常狀態(tài)和組織的生長(zhǎng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物(例如，鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳動(dòng)物)身體組織的形成，例如但不限于神經(jīng)、眼睛、骨、軟骨、骨髓、韌帶、牙齒、牙周組織、肝、腎、肺、心臟、或胃腸的內(nèi)層。優(yōu)選的方法在正在發(fā)育的胚胎組織地環(huán)境中、或在防腐劑、在后-胚胎組織無(wú)瘡疤的傷口位置可能進(jìn)行。
本發(fā)明的其他方面包括組合物和使用地甲狀腺激素類(lèi)似物和其聚合體對(duì)神經(jīng)變性的病癥的成像和診斷的用法，例如，阿爾茨海默氏病。例如，在一方面，本發(fā)明以在體內(nèi)對(duì)患者給藥時(shí)對(duì)靶點(diǎn)具有高特異性的T4類(lèi)似物為特征。優(yōu)選的T4類(lèi)似物表現(xiàn)的靶點(diǎn)和非靶點(diǎn)的比率至少為4∶1，在給藥后1小時(shí)內(nèi)活體內(nèi)穩(wěn)定和實(shí)質(zhì)上定位到目標(biāo)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征藥物組合物由附著于锝、銦地的甲狀腺素類(lèi)似物一種連接體組成，锝、銦用于單光子發(fā)射(“SPECT”)做γ成像和用造影劑來(lái)核磁共振成像。另外，結(jié)合TTR的鹵代類(lèi)似物可以抑制淀粉狀原纖維的形成，因此可以被利用的來(lái)防止和治療阿爾茨海默氏病。這樣的化合物還可以被用于電子發(fā)射斷層掃描(“PET”)成像方法。
在其它方面，本發(fā)明也包括用于調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子及其他多肽的組合物和方法，這些多肽的細(xì)胞表面受體聚集著整合素αVβ3、或包含氨基酸順序?yàn)榫彼?甘氨酸-天冬氨酸(“RGD”)的其他的細(xì)胞表面受體?？梢员徽{(diào)整的多肽包括，例如，胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子和干擾素-γ。
本發(fā)明的一個(gè)或一個(gè)以上的具體的實(shí)施方案在下面的補(bǔ)充描述中已經(jīng)闡明。盡管任何與下面描述相似或相等的方法和材料都可以用于實(shí)現(xiàn)或檢測(cè)本發(fā)明，但這里描述的是優(yōu)選的方法和材料。本發(fā)明的其他的特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)經(jīng)過(guò)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)的描述而變得顯而易見(jiàn)。除非上下文明確指出，在說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)的意思。除非另有規(guī)定，在這里使用的所有的科技術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常的理解有相同的意思。本說(shuō)明書(shū)中引用的所有專(zhuān)利和出版物通過(guò)在此引證全部并入本文。



圖1.在雞CAM試驗(yàn)中測(cè)定的L-T4和L-T3對(duì)血管新生的影響。A，對(duì)照樣品暴露于PBS中，附加樣品暴露于1nM T3或0.1μmol/L T4中三天。從2個(gè)實(shí)驗(yàn)典型的圖像中可見(jiàn)，兩種激素都導(dǎo)致血管支流增加。B，由在實(shí)驗(yàn)期間從3個(gè)實(shí)驗(yàn)中取出已存在的血管形成的新支流±SEM的平均數(shù)列表，每個(gè)實(shí)驗(yàn)包括9個(gè)CAM分析。在顯示的濃度處，T3和T4產(chǎn)生類(lèi)似的效果(支流形成分別增加了1.9倍和2.5倍)。**比較處理過(guò)的激素和處理CAM樣品的PBS，通過(guò)單因子變異數(shù)分析P＜0.001。
圖2.通過(guò)T4和瓊脂糖連接的T4(T4-ag)Tetrac抑制血管新生的增加。A，在暴露于0.1μmol/L T4 3天在典型的CAM標(biāo)本中支流血管形成增加2.5倍。在3個(gè)相似的實(shí)驗(yàn)中，也存在2.3倍的增加。激素的這個(gè)效果是由tetrac(0.1μmol/L)抑制的，tetrac是一種在前面已說(shuō)過(guò)的抑制T4的質(zhì)膜活動(dòng)的T4類(lèi)似物。先前已說(shuō)過(guò)T4類(lèi)似物抑制T4的質(zhì)膜活動(dòng)。單獨(dú)的13 Tetrac沒(méi)有刺激血管新生(C)。B，T4-ag(0.1μmol/L)，刺激血管新生增長(zhǎng)2.3倍(在3個(gè)實(shí)驗(yàn)中為2.9倍)，通過(guò)tetrac其效果也被阻止。檢測(cè)tetrac、T4-ag、和T4在CAM測(cè)定中的作用的3個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的摘要信息。數(shù)據(jù)(平均±SEM)可從3個(gè)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件的10個(gè)圖像中獲得。**處理過(guò)的T4和T4-瓊脂糖處理過(guò)的樣品與PBS處理過(guò)的對(duì)照樣品相比較，通過(guò)變量分析P＜0.001。
圖3.FGF2和T4前血管生成效果的比較。在次最大濃度中T4(0.05μmol/L)和FGF2(μg/mL)的串聯(lián)效果在CAM測(cè)定中和如用FGF2(1μg/mL，在T4不存在的情況下)的血管新生相等水平是加成的。B，作為在A中CAM測(cè)定中檢驗(yàn)FGF2和T4的活動(dòng)的3個(gè)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的摘要信息。處理過(guò)的樣品結(jié)果與3個(gè)實(shí)驗(yàn)中那些采用PBS處理過(guò)的對(duì)照樣品相比較，*P＜0.05；**P＜0.001。
圖4.由T4或外源的FGF2所引起的關(guān)于血管新生的抗FGF2的效果。FGF2在3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的CAM模型中的血管新生2倍增加，抑制的效果通過(guò)對(duì)FGF2(8μg)的抗體進(jìn)行。T4也刺激血管新生1.5倍增加，這個(gè)效果也被FGF2抗體抑制，表明CAM模型中的甲狀腺激素的活動(dòng)由FGF2的自分泌/旁分泌作用來(lái)調(diào)節(jié)，因?yàn)門(mén)4和T3促使FGF2 CAM模型中的細(xì)胞釋放FGF2(表1)。我們?cè)谇懊嬉阎赋?，非特異性的IgG抗體在CAM測(cè)定中對(duì)血管新生沒(méi)有影響。B，研究當(dāng)FGF2或T4存在時(shí)FGF2-ab的活動(dòng)的3個(gè)CAM實(shí)驗(yàn)結(jié)果的摘要信息。P＜0.01；**P＜0.001，研究甲狀腺激素和FGF2關(guān)于血管新生的作用和在FGF2的抗體存在時(shí)這些作用的損失表明3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的顯著的效果。
圖5.PD98059，一種由T4、T3和FGF2誘導(dǎo)的關(guān)于血管新生的MAPK(ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)抑制劑的作用。由T4(0.1μmol/L)和T3(1nmol/L)共同刺激的血管新生完全被PD98059(3μmol/L)抑制。B，由FGF2(1μg mL)誘導(dǎo)的血管新生也被PD98059抑制，表明生長(zhǎng)因子的活動(dòng)也取決于ERK1/2途徑的活化。包括T4-瓊脂糖(T4-ag)和tetrac(圖2)的實(shí)驗(yàn)的上下文中表明T4在細(xì)胞膜引發(fā)前血管生成作用，A和B中所示的結(jié)果與甲狀腺激素的前血管生成活動(dòng)中由MAPK參加的2因子是一致的ERK1/2轉(zhuǎn)換激素的早期信號(hào)，這個(gè)信號(hào)導(dǎo)致FGF2的加工作用和轉(zhuǎn)換FGF2的關(guān)于血管新生的后來(lái)的活動(dòng)。C，3個(gè)實(shí)驗(yàn)的摘要信息，通過(guò)A和B描述，顯示了PD98059關(guān)于T4和FGF2在CAM模型中的活動(dòng)的作用。*P＜0.01；**P＜0.001，顯示了關(guān)于3個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的變量分析結(jié)果。
圖6.T4和FGF2在ECV304內(nèi)皮細(xì)胞中活化MAPK。帶有0.25％激素-消耗的血清的M1 99培養(yǎng)基中制備細(xì)胞，并用T4(0.1umol/L)處理15分鐘到6小時(shí)。細(xì)胞的收獲和核碎片的制備如前所述。經(jīng)凝膠電泳分離的核蛋白，用抗體免疫印跡到磷酸化MAPK(pERK1和pERK2，分別為44和42kDa)，接著通過(guò)第二個(gè)抗體連接到熒光-檢測(cè)系統(tǒng)。核碎片免疫印跡的一種β-肌動(dòng)蛋白用作對(duì)裝填到該圖每一部分中的凝膠的控制。每個(gè)免疫印跡對(duì)3實(shí)驗(yàn)是有代表性的。A，T4引起ECV304細(xì)胞中ERK1/2磷酸化作用的增加和核易位。盡管該作用能保持＞6小時(shí)，該作用在30分鐘時(shí)最大。B，ECV304細(xì)胞在所述的細(xì)胞樣品中添加10-7MT415分鐘后，用ERK1/2活化抑制劑PD98059或PKC抑制劑CGP41251(CGP；100nmol/L)30分鐘。收獲細(xì)胞核，這個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)表明了通過(guò)T4(條帶4)，ERK1/2磷酸化作用(活化)的增加，該磷酸化作用可被兩種抑制劑(條帶5和6)阻斷，表明PKC活動(dòng)對(duì)在內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)T4的MAPK活化是必需的。C，ECV304細(xì)胞或者用T4(10-7mol/L)、FGF2(10ng/mL)、或兩種都采用，處理15分鐘，本圖顯示了pERK1/2在用激素或生長(zhǎng)因子治療的核中的積累或用同時(shí)用激素和生長(zhǎng)因子治療提高核中pERK1/2的積累。
圖7.T4增加ECV304內(nèi)皮細(xì)胞中FGF2 cDNA的積累。用T4(10-7mol/L)和FGF2和從各細(xì)胞試樣中分離到的GAPDHcDNA處理細(xì)胞6到48小時(shí)。FGF2cDNA的水平，如頂端的印跡所示，對(duì)GAPDH cDNA成分中的變化是正確的，如底部印跡所示，F(xiàn)GF2校正水平在下面的圖表中闡明(平均數(shù)的±SE平均數(shù)；n＝2個(gè)實(shí)驗(yàn))。從在所有的時(shí)間點(diǎn)用T4處理的細(xì)胞中提取的RNA中FGF2轉(zhuǎn)錄增加了許多。*P＜0.05；**P＜0.01，指出了，在每個(gè)檢驗(yàn)值的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)變量分析的比較。
圖8.雞胚瘤日生長(zhǎng)模型。瘤植入的雞絨毛尿囊膜(CAM)模型的圖解。
圖9.T4刺激3D傷口愈合。暴露與T4和根據(jù)這里所描述的3D傷口愈合測(cè)定控制的人皮膚成纖維細(xì)胞的照像。
圖10.T4的劑量-依賴(lài)增加了傷口愈合，第3天。根據(jù)圖表可知，T4以濃度在0.1μM到1.0uM間的劑量-依賴(lài)方式增加傷口愈合(由遷移細(xì)胞調(diào)節(jié))。同樣的增加在T4的濃度在1.0μM到3.0μM間是看不到的。
圖11.結(jié)合到純化的整合蛋白的I-125-T4的未標(biāo)記的T4和T3的效果。將未標(biāo)記的T4(10-4M到10-11M)或T3(10-4M到10-8M)加入到純凈的αVβ3整合蛋白(2μg/樣品)并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。在每個(gè)樣品中加入兩微居里的I-125標(biāo)記的T4。樣品培養(yǎng)20分鐘。在室溫下，與上樣染料混合，然后在5％自然的凝膠上在4℃、45mA條件下跑24小時(shí)。電泳后，把凝膠包在塑料中暴露顯影。結(jié)合到純凈的αVβ3的I-125-T4不受10-11M到10-7M范圍的未標(biāo)記的T4的影響。但是被濃度為10-6M的未標(biāo)記的T4以劑量-依賴(lài)的方式競(jìng)爭(zhēng)出。結(jié)合到整合蛋白的高放射性的T4幾乎完全被10-4M未標(biāo)記的T4所取代。與競(jìng)爭(zhēng)出結(jié)合到整合素的T4相比，T3沒(méi)有那么有效，在10-6M，10-5M，和10-4MT3時(shí)，信號(hào)分別減弱11％，16％，和28％。
圖12.Tetrac和包含RGD的肽，而不是包含RGE的肽競(jìng)爭(zhēng)出結(jié)合到純凈的αVβ3的T4。A)Tetrac加入到純凈的αVβ3以劑量依賴(lài)方式減少了結(jié)合到整合蛋白的高放射性的T4。在10-7M和10-5M tetrac存在下T4和αVβ3的結(jié)合分別減少了38％和90％。10-5M的RGD肽的加入競(jìng)爭(zhēng)出結(jié)合到αVβ3上的T4。10-5M和10-4M RGE肽的應(yīng)用，作為對(duì)RGD肽的控制，不能減少結(jié)合純凈的αVβ3上的高放射性的T4。B)由圖片A的tetrac和RGD數(shù)據(jù)的圖形表示。數(shù)據(jù)點(diǎn)見(jiàn)通過(guò)3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖13.單克隆抗體LM609關(guān)于T4結(jié)合到αVβ3的效果。A)在指明濃度下將LM609加入到αVβ3。每樣品1μgLM609使結(jié)合到整合蛋白的T4減少了52％。當(dāng)LM609的濃度為2μg/樣品并用高達(dá)8μg抗體濃度維持時(shí)結(jié)合到整合蛋白的T4達(dá)到最大抑制。作為對(duì)抗體專(zhuān)一性的控制，10μg/樣品的Cox-2mAB和10μg/樣品的鼠免疫免疫球蛋白G在用T4培養(yǎng)之前加到αVβ3中。B)由圖片A的數(shù)據(jù)圖形表示。數(shù)據(jù)點(diǎn)見(jiàn)通過(guò)3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖14.RGD、RGE、tetrac、和mAB LM609關(guān)于T4-誘導(dǎo)的MAPK活化的效果。A)CV-1細(xì)胞(50-70％覆蓋)用10-7M T4(10-7M總濃度，10-7M游離濃度)處理30分鐘。選擇的樣品在加入T4之前用指明濃度的包含RGD的肽、包含的肽、tetrac、或LM609處理16小時(shí)。核蛋白用SDS-PAGE分離并用抗磷酸MAPK(pERK1/2)抗體免疫印跡。pERK1/2的核積累在用10-6M或更高濃度的RGD肽處理的樣品中減少了，而在用10-4M RGE處理的樣品中不是顯著的改變。pERK1/2積累在用10-6M tetrac處理的CV1細(xì)胞中減少了76％，當(dāng)tetrac的濃度在10-5M和更高時(shí)降低pERK1/2的積累到類(lèi)似未處理的對(duì)照樣品水平。當(dāng)αVβ3LM609的單克隆抗體用于CV1細(xì)胞培養(yǎng)濃度為1μg/ml時(shí)降低核中活化的MAPK的積累。B)RGD、RGE、和tetrac的資料的圖形表示見(jiàn)圖片A。數(shù)據(jù)點(diǎn)用通過(guò)3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。
圖15.對(duì)關(guān)于T4誘導(dǎo)MAPK活化的αV和β3基因沉默的效果。用CVI細(xì)胞采用基因沉默技術(shù)轉(zhuǎn)染αV、β3、或αV和β3一起。轉(zhuǎn)染兩天后，細(xì)胞用10-7MT4處理。A)從每個(gè)轉(zhuǎn)染組分離到的RNA進(jìn)行RT-PCR來(lái)檢驗(yàn)每個(gè)基因沉默的專(zhuān)一性和功能性。B)從每個(gè)轉(zhuǎn)染中分離核內(nèi)蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
圖16.CAM模型中關(guān)于T4-刺激的血管新生的αVβ3 mAB(LM609)的抑制效果。A)樣品暴露于PBS，T4(0.1μM)，or T4加10mg/ml LM609中3天。通過(guò)T4刺激的血管新生通過(guò)αVβ3單克隆抗體LM609的加入被充分的抑制。B)在實(shí)驗(yàn)期間從存在的血管形成新分支的平均數(shù)±SEM的列表。數(shù)據(jù)從3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到，其中每個(gè)實(shí)驗(yàn)包含每個(gè)處理組中的9個(gè)樣品。C、D)通過(guò)T4或FGF2刺激的血管新生也由于αVβ3單克隆抗體LM609或XT 199的加入而被抑制。
圖17.甲狀腺激素類(lèi)似物-利用聚乙烯醇通過(guò)酯鍵聚合結(jié)合的聚合物組成。在這個(gè)制備中市場(chǎng)上可買(mǎi)到的聚乙烯醇(或相關(guān)共聚合體)可以通過(guò)用甲狀腺激素類(lèi)似物的酰基氯，也就是酰基氯形式來(lái)處理進(jìn)行酯化。加入三乙胺形成鹽酸三乙胺中和氫氯化物鹽，鹽酸三乙胺在不同的類(lèi)似物的甲狀腺激素酯聚合體形式的沉淀上可以用水沖走。聚合體的酯鍵可以在體內(nèi)進(jìn)行水解來(lái)釋放活性的前血管新生甲狀腺激素類(lèi)似物。
圖18.甲狀腺激素類(lèi)似物-利用丙烯酸乙烯共聚體通過(guò)酐鍵聚合結(jié)合的聚合物組成。這與前面的聚合體共價(jià)結(jié)合相似然而這時(shí)候是通過(guò)一酐鍵也就是說(shuō)來(lái)源于丙烯酸共聚體的反應(yīng)。這個(gè)酐鍵也對(duì)體內(nèi)水解敏感而釋放甲狀腺激素類(lèi)似物。伴隨著用三乙胺的處理鹽酸被中和，隨后的用水洗滌沉淀的聚酐除去副產(chǎn)品鹽酸三乙胺。這個(gè)反應(yīng)將導(dǎo)致甲狀腺激素類(lèi)似物丙烯酸共聚體+三乙胺的形成。在體內(nèi)水解作用下，甲狀腺激素類(lèi)似物將隨時(shí)間的過(guò)去而釋放，這可以加丙烯酸乙烯共聚體來(lái)控制。
圖19.甲狀腺激素類(lèi)似物-在聚乳酸中的包埋的聚合物組成。聚乳酸聚酯高聚物(PLA)在體內(nèi)進(jìn)行水解得到乳酸單體，這已經(jīng)開(kāi)發(fā)作為人體藥物輸送系統(tǒng)的載體。不同于前面的兩種共價(jià)方法，這是一個(gè)將甲狀腺激素類(lèi)似物裝入PLA聚合體珠膠囊的非共價(jià)方法，其中這兩種共價(jià)方法種甲狀腺激素類(lèi)似物通過(guò)一化學(xué)鍵連接到聚合體。這種反應(yīng)將導(dǎo)致在水中包含PLA珠的甲狀腺激素類(lèi)似物的形成。過(guò)濾和洗滌將引起包含PLA珠的甲狀腺激素類(lèi)似物形成，它在體內(nèi)水解將導(dǎo)致甲狀腺激素加乳酸的對(duì)照水平的產(chǎn)生。
圖20.甲狀腺激素類(lèi)似物能與各式各樣的聚合體結(jié)合。A-D表明取代要求得到各式各樣的甲狀腺激素類(lèi)似物，這些甲狀腺激素類(lèi)似物可以共軛來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的甲狀腺激素類(lèi)似物的多聚體形式。
圖21.體外三維血管新生測(cè)定。圖21是對(duì)覆有纖維蛋白的珠子上人微血管的內(nèi)皮體外三維發(fā)芽測(cè)定的方法和說(shuō)明。
圖22.三維纖維蛋白中HOMEC的體外發(fā)芽血管新生。圖22是在不同的放大條件下人微血管的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)芽的說(shuō)明。
圖23A-E.在低水平膠原條件下血小板-引起的傷口愈合因子的釋放。
圖24A-B.未標(biāo)記T4和T3從純凈的整合蛋白取代[125I]-T4。在加入[125I]-T4之前將未標(biāo)記的T4(10-11M到10-4M)或T3(10-8M到10-4M)加入到純凈的αVβ3整合蛋白(2μg/樣品)。(a)[125I]-T4鍵合到純凈的αVβ3不受10-11M到10-7M范圍內(nèi)未標(biāo)記的T4的影響，但是被＞10-6M濃度未標(biāo)記T4以濃度-依賴(lài)的方式取代。T3在取代T4鍵合αVβ3的效果差一些。(b)T4和T3數(shù)據(jù)的圖解說(shuō)明見(jiàn)3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖25A-B.Tetrac和包含RGD的肽、而不是包含RGE的肽取代T4鍵合純凈的αVβ3。(a)用tetrac或包含RGD的肽預(yù)培養(yǎng)純凈的αVβ3以劑量-依賴(lài)的方式降低整聯(lián)蛋白和[125I]-T4之間的相互作用。應(yīng)用10-5M到10-4M RGE肽，作為RGD肽的對(duì)照，沒(méi)有減少標(biāo)記的T4鍵合到純凈的αVβ3。(b)tetrac和RGD數(shù)據(jù)的圖解說(shuō)明顯示了由3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)引起的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖26 A-B.整聯(lián)蛋白抗體抑制T4鍵合到αVβ3。在加入[125I]-T4之前將抗體LM609和SC7312在指出的濃度(μg/ml)加入到αVβ330分鐘。當(dāng)LM609濃度為2μg/ml并維持抗體濃度高達(dá)8μg/ml時(shí)達(dá)到對(duì)T4鍵合整聯(lián)蛋白的最大抑制。當(dāng)2μg/mlL抗體/樣品和8μg/ml抗體存在時(shí)SC73 12對(duì)T4鍵合到αVβ3分別減少了58％和46％。作為抗體專(zhuān)一性的對(duì)照，10μg/ml抗αVβ3mAb(P1F6)和10μg/ml鼠免疫球蛋白G在用T4培養(yǎng)之前加入到αVβ3。圖表顯示了從3個(gè)獨(dú)立的SC7312實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖27A-B.RGD和RGE肽、tetrac、和mAb LM609關(guān)于T4-誘導(dǎo)MAPK活化的效果。(a)用10-6M或更高的RGD肽處理的樣品中pERK1/2的核的積累減少，但直到10-4M RGE處理的樣品中沒(méi)有顯著的改變。用10-5M tetrac和T4處理的CV-1細(xì)胞中pERK1/2的積累與未處理的對(duì)照樣品中觀察到的水平相似。LM609，αVβ3的單克隆抗體，當(dāng)它以1μg/ml濃度應(yīng)用于CV-1培養(yǎng)時(shí)降低核內(nèi)活化的MAPK的積累。(b)圖表顯示了從3個(gè)獨(dú)立的SC7312實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。用α-微管蛋白抗體免疫印跡分析包括上樣凝膠的控制。
圖28A-B.基因沉默對(duì)αV和β3關(guān)于T4-誘導(dǎo)MAPK活化的效果。用CV1細(xì)胞采用小干擾RNA(終濃度為100nM)轉(zhuǎn)染αV、β3、或αV和β3一起。轉(zhuǎn)染兩天后，細(xì)胞用10-7MT4或?qū)φ蛰d體處理30分鐘。(a)從每個(gè)轉(zhuǎn)染組分離到的RNA進(jìn)行RT-PCR來(lái)檢驗(yàn)每個(gè)小干擾RNA的專(zhuān)一性和功能性。B)從每批轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離到核蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在有或沒(méi)有用T4處理的條件下作為pERK1/2的探針。在母系細(xì)胞和那些用小干擾RNA干擾處理的細(xì)胞內(nèi)，帶有T4的pERK1/2的核內(nèi)積累很明顯。用小干擾RNA對(duì)αV或β3處理的細(xì)胞表明沒(méi)有T4存在時(shí)pERK1/2增加，在有T4處理時(shí)pERK1/2降低。包含αV和β3的小干擾RNA對(duì)T4的處理不響應(yīng)。
圖29A-B.CAM模型終αVβ3 mAb(LM609)關(guān)于T4-刺激的血管新生的抑制效果。CAM暴露于濾光盤(pán)用PBS、T4(10-7M)、或T4加10μg/ml LM609處理3天。(a)由T4刺激的血管新生實(shí)質(zhì)上用加入αVβ3單克隆抗體LM609抑制。(b)在實(shí)驗(yàn)周期期間從存在的血管形成新分支的平均值±SEM如表所示。***P＜0.001，比較3個(gè)分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中用T4-處理的樣品和T4/LM609-處理的樣品的結(jié)果，每處理組包含9個(gè)圖像。統(tǒng)計(jì)分析采用單因子變異數(shù)分析。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的特征及其他細(xì)節(jié)將更多特別地被補(bǔ)充圖形的參考所描述，和通過(guò)權(quán)利要求指出。為方便起見(jiàn)，這里收集了在說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)中使用的特定術(shù)語(yǔ)。除非規(guī)定否則，在這里使用的所有的學(xué)術(shù)上的和科學(xué)的術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常的理解有相同的意思。
如在這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“血管新生劑”包括那些促進(jìn)或促使血管新生的任何化合物或物質(zhì)，不管是單獨(dú)的或和聯(lián)合在一起的另一個(gè)物質(zhì)。實(shí)例包括，但是不局限于T3、T4、T3或T4-瓊脂糖、T3的聚合的類(lèi)似物、T4、3，5-二甲基-4-(4′-羥基-3′-異丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或DITPA。相反，提到的抑制或阻止血管新生的任何化合物或物質(zhì)的術(shù)語(yǔ)“抗血管新生劑”或“抗血管生成劑”，不管是單獨(dú)的或和聯(lián)合在一起的另一個(gè)物質(zhì)。實(shí)例包括，但是不局限于，TETRAC，TRIAC，XT 199，和mAb LM609。
如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“心肌缺血”定義為一種由減少的心血管的容量所引起到心肌的血液供給不足。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病”被稱(chēng)為由于心肌的功能和為正常功能供給充分的血流的冠狀血管的容量之間不平衡導(dǎo)致的心臟功能的疾病/病癥。可以用在這里描述的組合物和方法處理的與冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病有關(guān)的特殊的冠狀的疾病/病癥包括心肌缺血、心絞痛、冠狀動(dòng)脈瘤、冠狀動(dòng)脈血栓癥、冠狀動(dòng)脈痙攣、冠心病、心肌梗塞和冠狀狹窄癥。
如這里所使用的術(shù)語(yǔ)“閉塞的周?chē)匝芗膊　?又名外周的動(dòng)脈的閉塞的病癥)是一種血管的病癥-包括在頸動(dòng)脈或股骨的動(dòng)脈的堵塞，包括回腸的動(dòng)脈。股骨的動(dòng)脈堵塞導(dǎo)致疼痛和限制的運(yùn)動(dòng)。與閉塞的周?chē)匝芗膊∮嘘P(guān)的一種特殊的病癥是糖尿病足，它影響糖尿病患者，經(jīng)常導(dǎo)致足的切除。
如這里所使用的術(shù)語(yǔ)“血管的再生”、“血管新生”、“血管的再形成”和“增大側(cè)支循環(huán)”(或大意是這些詞匯)被認(rèn)為是同義的。術(shù)語(yǔ)“藥物地可接受的”當(dāng)涉及一種自然的或合成代用品意味著鑒于它的更多地有益的作用該物質(zhì)有一可接受的毒性效應(yīng)，同時(shí)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)，“生理地可接受的”意味著該物質(zhì)有相對(duì)低地毒性。術(shù)語(yǔ)，“共同給藥”意思指大約同時(shí)或接近地時(shí)序給病人兩個(gè)或兩個(gè)以上藥物以便它們的作用大致同時(shí)或?qū)嵸|(zhì)上重疊地進(jìn)行。這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括連續(xù)的以及同時(shí)的藥物給藥。
“藥物地可接受的鹽類(lèi)”涉及甲狀腺激素類(lèi)似物、多聚體形式和衍生物的藥物地可接受的鹽類(lèi)，它的鹽類(lèi)源自于本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的各種各樣的有機(jī)的和無(wú)機(jī)的反離子，包括，單獨(dú)地舉例來(lái)說(shuō)，鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨、等等；當(dāng)該分子包含一種基本官團(tuán)、有機(jī)的或無(wú)機(jī)酸的鹽類(lèi)，例如氫氯化物、氫溴化物、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、醋酸鹽、順丁烯二酸鹽、草酸酯等等能被用作藥物地可接受的鹽類(lèi)。該術(shù)語(yǔ)也既包括酸有包括堿結(jié)合的鹽類(lèi)。
“藥物地可接受的酸結(jié)合鹽類(lèi)”涉及那些保持生物有效性和游離堿的性狀的鹽類(lèi)，它們不是生物學(xué)上或相反不受歡迎的，它們是由無(wú)機(jī)酸例如例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等，和有機(jī)酸例如乙酸、丙酸、丙酮酸、馬來(lái)酸、丙二酸、丁二酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、安息香酸、扁桃酸、甲磺酸、乙基磺酸、p-甲苯磺酸、水楊酸等等形成的。本發(fā)明特別地優(yōu)選的化合物的鹽類(lèi)是一氯化物鹽類(lèi)和二氯化合物鹽類(lèi)。
“藥物地可接受的堿結(jié)合鹽類(lèi)”涉及那些保持生物有效性和游離酸的性狀的鹽類(lèi)，它們不是生物學(xué)上或相反不受歡迎的。這些鹽類(lèi)從無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿與游離酸結(jié)合來(lái)制備。這些鹽類(lèi)來(lái)源于無(wú)機(jī)堿包括，但是不局限于鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鋅、鋁的鹽類(lèi)等等。優(yōu)選的無(wú)機(jī)鹽是銨、鈉、鉀、鈣、和鎂鹽。這些鹽類(lèi)來(lái)源于有機(jī)堿包括，但是不局限于，伯胺、仲胺和叔胺的鹽類(lèi)，胺類(lèi)的代替物包括自然地產(chǎn)生的胺類(lèi)代替物、環(huán)胺類(lèi)和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，例如異丙胺三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2二乙氨基乙醇、三乙醇胺、二環(huán)己胺、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海蔥次苷、膽堿、甜菜堿、2-乙二胺葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺樹(shù)脂等等。特別地優(yōu)選的有機(jī)堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環(huán)己胺、膽堿和咖啡因。
“脲基”涉及基本的結(jié)構(gòu)式-N(H)-C(O)-NH2 從上面的定義和實(shí)例可以知道那些用于包含一種替代的烷基的基團(tuán)的在其上的任何置換在烷基的任何碳上發(fā)生。本發(fā)明的化合物、或它們的藥物地可接受的鹽類(lèi)，在它們的結(jié)構(gòu)上也許有不對(duì)稱(chēng)碳原子。本發(fā)明的化合物和它們的藥物地可接受的鹽類(lèi)可以以單一的對(duì)映體、非對(duì)映異構(gòu)物、外消旋酒石酸鹽、對(duì)映體和非對(duì)映異構(gòu)體的混合物形態(tài)存在。所有這些單一的對(duì)映體、非對(duì)映異構(gòu)物外消旋酒石酸鹽和其混合物確定為在本發(fā)明范疇內(nèi)?；衔飪?nèi)部的某些碳原子的絕對(duì)構(gòu)型、如果已知，通過(guò)適當(dāng)?shù)慕^對(duì)的描述符R或S來(lái)指出。
分離對(duì)映異構(gòu)體可以通過(guò)使用旋光活性的開(kāi)始和/或中間的物質(zhì)或通過(guò)使用慣用的拆分技術(shù)例如，酶催化的拆分或手性的HPLC。
如這里所使用的，慣用語(yǔ)“生長(zhǎng)因子”或“神經(jīng)發(fā)生因子”涉及對(duì)CNS或PNS的細(xì)胞有生長(zhǎng)、增殖、分化、營(yíng)養(yǎng)的作用的蛋白、肽或其他的分子。這樣的因子可能被用來(lái)誘導(dǎo)增殖或分化，可以包括，例如，允許CNS或PNS的細(xì)胞增殖的任何營(yíng)養(yǎng)因子，包括綁定細(xì)胞表面的受體上對(duì)細(xì)胞發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)的或生長(zhǎng)-誘導(dǎo)作用的任何分子。優(yōu)選的因子包括但是不局限于，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(“NGF”)、表皮生長(zhǎng)因子(“EGF”)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(“PDGF”)、類(lèi)似胰島素的生長(zhǎng)因子(“IGF”)、酸性的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(“aFGF”或“FGF-I”)、基本的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(“bFGF”或“FGF-2”)和轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-α和轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β(“TGF-α”或“TGF-β”)。
“患者”包括活生物例如人、猴子、奶牛、羊、馬類(lèi)、豬、家牛、山羊、狗、貓、耗子、鼠、從此的培養(yǎng)細(xì)胞和其轉(zhuǎn)基因的物種。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案，患者是人。采用本發(fā)明的組合物給藥給要治療的患者可以使用已知的程序、劑量和時(shí)段來(lái)有效的治療患者的疾病。為獲得治療的作用所必需的治療的化合物的有效量可以根據(jù)因素而變化，例如年齡、性別、和患者的體重、和患者體內(nèi)處理外來(lái)的治療的化合物藥劑的能力?？梢哉{(diào)節(jié)給藥方案來(lái)提供最佳的治療的響應(yīng)。例如，可能每日給藥幾個(gè)分開(kāi)的劑量或可能由據(jù)顯示的治療的位置的緊急相應(yīng)地減少劑量。
“給藥”包括允許本發(fā)明的組合物施行它們的預(yù)期功能的給藥途徑、例如，促進(jìn)血管新生。各種各樣的給藥途徑可能包括，而沒(méi)有必要限于腸胃外的(例如，靜脈內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、肌肉的、皮下注射)、口的(例如，飲食的)、局部的、鼻的、直腸的、或通過(guò)依賴(lài)疾病或待治療的健康情況的緩釋微載體。口的、腸胃外的和靜脈內(nèi)的給藥是優(yōu)選的給藥方式。用于給藥的化合物的制劑根據(jù)被選擇的給藥途徑(例如，溶液、乳劑、凝膠劑、氣霧劑、膠囊劑)變化。包含用于給藥的化合物的適當(dāng)?shù)慕M合物可以制成生理地可接受的運(yùn)載體或載體和可選擇的佐藥和防腐劑。對(duì)于溶液或乳劑、合適的載體包括，例如，水的或乙醇的/水溶液、乳劑或懸濁液，包括鹽的和緩沖液媒介、無(wú)菌水、奶油、軟膏、洗液、油劑、糊劑和固體載體。腸胃外的運(yùn)載體可以包括氯化鈉溶液、R型葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、R型乳酸鹽或不揮發(fā)性油類(lèi)。靜脈內(nèi)的運(yùn)載體可以包括許多的添加劑防腐劑、或流體、營(yíng)養(yǎng)品或電解質(zhì)補(bǔ)充物(一般地參見(jiàn)，Remington′s Pharmaceutical Science，16thEdition，Mack，Ed.(1980))。
“有效量”包括允許施行它的預(yù)期功能的前血管生成或抗血管生成化合物的總量，例如，這里所描述的促進(jìn)或抑制血管新生相關(guān)的病癥。該有效量取決于許多因素，包括生物活性、年齡、體重、性別、總的健康情況、待治療疾病的嚴(yán)重程度，和合適的藥物動(dòng)力學(xué)的性質(zhì)。例如，該活性物質(zhì)的劑量可能從大約0.01mg/kg/日到大約500mg/kg/日、有利地從大約0.1mg/kg/日到大約100mg/kg/日。該活性物質(zhì)的治療地有效量可以通過(guò)適當(dāng)途徑單一劑量或多倍的劑量給藥。更進(jìn)一步，該活性物質(zhì)的劑量可以據(jù)顯示的治療的或預(yù)防的位置的緊急性相應(yīng)地增加或減少。
“藥物地可接受的載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌的和抗真菌劑、等滲的和吸收延遲劑等等，它們與該化合物的活動(dòng)是協(xié)調(diào)的，對(duì)患者是生理地可接受的。藥物地可接受的載體的一個(gè)實(shí)例是緩沖的生理鹽水(0.15M NaCl)。對(duì)于藥物地活性物質(zhì)的這些媒介和藥劑的使用在本領(lǐng)域是大家熟知的。除了到任何慣用的媒介或藥劑與該治療的化合物不相容的程度，適合于藥物給藥的組合物中它們的使用是預(yù)期的。補(bǔ)充的活性化合物也可以合并入組合物。
“輔助的配料”包括，但是不局限于，下列的一個(gè)或一個(gè)以上賦形劑；表面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；?；头至褎徽澈蟿?；潤(rùn)滑劑；甜味劑；調(diào)味劑；著色劑；防腐劑；生理地可降解的組合物例如白明膠；水的運(yùn)載體和溶劑；油的運(yùn)載體和溶劑；懸浮劑；分散或潤(rùn)濕劑；乳化劑、鎮(zhèn)痛劑；緩沖液；鹽類(lèi)；稠化劑；填料；乳化劑；抗氧化劑；抗生素；抗真菌劑；穩(wěn)定劑；和藥物地可接受的聚合的或疏水性的物質(zhì)。包括本發(fā)明的藥物組合物在內(nèi)的其他的“輔助的配料”在本技術(shù)領(lǐng)域和已描述的是已知的，例如，雷氏藥學(xué)大全。
組合物 血管生成劑包含甲狀腺激素、其類(lèi)似物、和激素和它們的類(lèi)似物的聚合體結(jié)合物在這里被公開(kāi)。公開(kāi)的組合物能被用來(lái)促進(jìn)血管新生從而治療病癥，在病癥的位置血管新生是有益的。另外，這些甲狀腺激素、類(lèi)似物和聚合體結(jié)合物的抑制可用于抑制與不希望有的血管新生有關(guān)的治療病癥的血管新生。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“血管生成劑”包括那些促進(jìn)或促使血管新生的任何化合物或物質(zhì)，不管是單獨(dú)的還是和聯(lián)合在一起的另外的物質(zhì)。實(shí)例包括，但是不局限于，T3 T4、T3或T4-瓊脂糖、T3的聚合的類(lèi)似物、T4、3，5-二甲基-4-(4′-羥基-3′-異丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或DITPA。
聚合體結(jié)合物用于改善藥物存活期。同時(shí)許多老和新的療法有好的耐藥力，許多化合物必須提高藥物顯示技術(shù)來(lái)減少毒性、增大循環(huán)時(shí)間、或改進(jìn)生物分布。改善藥物存活期的一種策略是對(duì)水溶性聚合物的利用。許多的水溶性聚合物已經(jīng)表明可以改進(jìn)生物分布、改善細(xì)胞攝取方式、改變穿過(guò)生理障礙的滲透性、和改進(jìn)穿過(guò)身體的間隙的比率。為獲得或者一個(gè)目標(biāo)或支撐-釋放作用，包含藥物部分的水溶性聚合物已經(jīng)合成，藥物部分作為末端基團(tuán)、做為脊椎的一部分、或者做為聚合體鏈上的側(cè)基。
本發(fā)明的典型的組合物包括甲狀腺激素或類(lèi)似物由此的聚合體結(jié)合物。聚合體結(jié)合物可以是或者通過(guò)共價(jià)的或非共價(jià)的連接鍵。在優(yōu)選的實(shí)施方案，該聚合體結(jié)合物可以通過(guò)一酯鍵或一酸酐鍵而存在。使用聚乙烯醇通過(guò)一酯鍵聚合體結(jié)合物的一個(gè)實(shí)例如圖17所示。在這些預(yù)備市場(chǎng)上可買(mǎi)到的聚乙烯醇(或相關(guān)的共聚體)可以通過(guò)用甲狀腺激素的?；忍幚韥?lái)酯化，包括?；鹊男问健Ｍㄟ^(guò)加入三乙胺給予鹽酸三乙胺氫氯化物鹽類(lèi)被中和，它們可以在對(duì)于不同的類(lèi)似物的甲狀腺激素酯聚合體形式的沉淀上用水沖走。該聚合體的酯鍵可以生體內(nèi)進(jìn)行水解來(lái)釋放活性的前血管新生甲狀腺激素類(lèi)似物。
通過(guò)一酸酐鍵使用丙烯酸乙烯共聚體的聚合體結(jié)合物的實(shí)例如圖18所示。這與上述的聚合體共價(jià)的結(jié)合物相似，然而，這時(shí)候它通過(guò)一酸酐鍵連接也就是說(shuō)來(lái)源于丙烯酸共聚體的反應(yīng)。這個(gè)酸酐鍵也對(duì)在體內(nèi)水解敏感而釋放甲狀腺激素類(lèi)似物。通過(guò)用三乙胺的處理和后來(lái)的用水除去鹽酸三乙胺副產(chǎn)品的沉淀的聚酐聚合體的洗滌完成了鹽酸的中和。這些反應(yīng)將導(dǎo)致甲狀腺激素類(lèi)似物丙烯酸共聚體+三乙胺的形成。在體內(nèi)水解下，隨著時(shí)間的過(guò)去甲狀腺激素類(lèi)似物將釋放，它可以加丙烯酸乙烯共聚體來(lái)控制。
別的典型的聚合體結(jié)合物包括甲狀腺激素或它的與聚乙二醇(PEG)結(jié)合的類(lèi)似物。許多藥物、蛋白和脂質(zhì)體的PEG的附著已經(jīng)表明改善停留時(shí)間和減少毒性。PEG可以與活化劑通過(guò)鏈末端的羥基和其他的化學(xué)的方法系在一起。PEG本身，然而，限于兩個(gè)活化劑每分子。在一個(gè)不同的方法，PEG和氨基酸的共聚物做為新的生物材料被研究，它們將保持PEG的生物適合性性質(zhì)，但是它們有許多固定點(diǎn)每分子的附加的優(yōu)點(diǎn)和它們可以設(shè)計(jì)合成來(lái)適合各種各樣的應(yīng)用。
別的典型的聚合體結(jié)合物包括甲狀腺激素或它的聚合體的非共價(jià)的結(jié)合物的類(lèi)似物。這個(gè)詳述見(jiàn)圖19所示。一個(gè)優(yōu)選的非共價(jià)的結(jié)合物是在聚乳酸聚合體內(nèi)的甲狀腺激素或其類(lèi)似物的包埋。聚乳酸聚酯聚合物(PLA)在體內(nèi)進(jìn)行水解成乳酸單體并使用作人體內(nèi)藥物傳送系統(tǒng)運(yùn)載體。不同于先前的兩個(gè)共價(jià)的方法，這個(gè)是那些將甲狀腺激素類(lèi)似物裝入PLA聚合體顆粒膠囊的非共價(jià)的方法，在這兩個(gè)共價(jià)的方法甲狀腺激素類(lèi)似物通過(guò)一個(gè)化學(xué)鍵與聚合體相連接。過(guò)濾和洗滌將導(dǎo)致包含PLA顆粒的甲狀腺激素類(lèi)似物的形成，它們?cè)隗w內(nèi)水解將引起甲狀腺激素多余的乳酸的控制的的水平的發(fā)生。
更進(jìn)一步，本發(fā)明的組合物包括與視黃醇結(jié)合的甲狀腺激素類(lèi)似物(例如，視黃酸(即，維生素A))，它們結(jié)合到甲狀腺激素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)甲腺素蛋白(“TTR”)和維生素A結(jié)合蛋白(“RBP”)。甲狀腺激素類(lèi)似物還可以用鹵代己烯雌酚、單獨(dú)的或和聯(lián)合在一起的視黃酸結(jié)合，供來(lái)檢測(cè)和抑制淀粉狀的斑塊。這些類(lèi)似物兼?zhèn)銽4-TTR的有益的性質(zhì)，也就是，它們的快速的攝取和延長(zhǎng)在腦和淀粉狀體的滯留，帶有鹵素取代基的性質(zhì)，包括對(duì)PET成像有用的某些鹵素同位素，這些鹵素同位素包括氟-18、碘-123、碘-124、碘-131、溴-75、溴-76、溴-77和溴-82。
此外，納米技術(shù)能被使用創(chuàng)造納米尺度大小的有用物質(zhì)和結(jié)構(gòu)。具有生理活性物質(zhì)的主要的缺陷是易碎性。納米刻度的物質(zhì)可以與這樣的生理活性物質(zhì)結(jié)合來(lái)顯著地改善該物質(zhì)的持久性，產(chǎn)生該物質(zhì)局部的高濃度和通過(guò)最小化損失降低成本。所以，輔助的聚合的結(jié)合物包括甲狀腺激素和其類(lèi)似物的納米顆粒制劑。在這個(gè)實(shí)施方案，納米聚合體和納米粒子能被用作甲狀腺激素和它的類(lèi)似物的本地傳送的基質(zhì)。這將在控制傳送進(jìn)細(xì)胞的和組織目標(biāo)的時(shí)間給予幫助。
本發(fā)明的組合物既包括甲狀腺激素、類(lèi)似物又包括衍生物或者單獨(dú)的或帶有聚合體的共價(jià)的或非共價(jià)的結(jié)合物。典型的類(lèi)似物和衍生物的實(shí)例如圖20、表A-D所示。表A顯示了T2、T3、T4、和溴代衍生物。表B顯示了丙氨酰側(cè)鏈修飾。表C顯示了羥基、二苯酯鍵、和D-結(jié)合物。表D顯示了酪氨酸類(lèi)似物。
術(shù)語(yǔ)“抗血管新生劑”或“抗血管生成劑”涉及抑制或阻止血管新生的任何化合物或物質(zhì)，不管是單獨(dú)的還是和聯(lián)合在一起的別的物質(zhì)。實(shí)例包括，但是不局限于，TETRAC TRIAC、XT 199、和mAb LM609。
甲狀腺激素、類(lèi)似物和聚合的結(jié)合物在促進(jìn)血管新生的作用 甲狀腺激素類(lèi)似物或多聚體形式的前血管生成作用取決于一個(gè)非基因組的啟動(dòng)，通過(guò)對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥理學(xué)的抑制劑的減少的激素作用的敏感性來(lái)檢測(cè)。這樣的結(jié)果表明通過(guò)甲狀腺激素的MAPK的活化的別的結(jié)果是新血管的生長(zhǎng)。后者是非基因組地開(kāi)始的，但是當(dāng)然，需要一個(gè)跟著發(fā)生的復(fù)合物基因轉(zhuǎn)錄程序。甲狀腺激素的環(huán)境濃度是相對(duì)穩(wěn)定的。CAM模型、當(dāng)我們檢測(cè)它的時(shí)候，是甲狀腺缺乏的和因此可能被認(rèn)為是一個(gè)體系，它們不會(huì)再生出完整的有機(jī)體。
對(duì)血管新生的雞胚絨毛尿囊膜(CAM)試驗(yàn)的有效性已經(jīng)提供一個(gè)模型，在這個(gè)模型中測(cè)定血管新生和研究可能機(jī)制涉及通過(guò)新血管生長(zhǎng)的甲狀腺激素的誘導(dǎo)。目前的申請(qǐng)公開(kāi)了在FGF2的CAM模型中那些近似的和可以提高接近最佳的劑量的作用的T4的前血管生成作用。更進(jìn)一步公開(kāi)了激素的前血管生成作用是在質(zhì)膜上開(kāi)始的，取決于通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑T4的活化作用。像上面提出的，治療閉塞的周?chē)匝芗膊『凸跔畹募膊〉姆椒?，特別是，冠狀血管的閉塞、和與外周的脈管系統(tǒng)和/或冠狀血管的閉塞有關(guān)的病癥也被公開(kāi)。病人體內(nèi)需要的促進(jìn)血管新生和/或補(bǔ)充并行的血管的組合物和其方法也被公開(kāi)。該組合物包括一有效量的甲狀腺激素類(lèi)似物、多聚體形式和衍生物。該方法包括一有效量的甲狀腺激素類(lèi)似物、多聚體形式、和低的衍生物的共同給藥、帶有其他的標(biāo)準(zhǔn)前血管新生生長(zhǎng)因子、血管擴(kuò)張劑、抗凝血?jiǎng)?、溶解血栓的或其他的血管?相關(guān)的療法的持續(xù)一星期或以上的每日的劑量。
CAM試驗(yàn)已經(jīng)被用于確認(rèn)被認(rèn)為促進(jìn)血管新生的各種各樣的生長(zhǎng)因子和化合物的血管生成活動(dòng)。例如，生理學(xué)的濃度的T4被證明在體外模型里有前血管生成和在一個(gè)摩爾的堿上有FGF2的活動(dòng)。丙硫尿嘧啶的存在沒(méi)有減少甲狀腺素的作用，表明那些為產(chǎn)生T3的T4的去-碘化作用在這個(gè)模型不是先決條件。各式各樣的甲狀腺激素類(lèi)似物的前血管新生作用的摘要信息已列入表1。
表1CAM模型中的各式各樣的甲狀腺激素類(lèi)似物前血管新生作用 n＝8/組 這個(gè)模型中新血管的生長(zhǎng)的出現(xiàn)需要幾日，表明那些甲狀腺激素的作用是完全取決于對(duì)帶有激素的甲狀腺激素(TR)核的受體的交互作用。那些需要帶有自然的配體的TR核內(nèi)的絡(luò)合、T3的碘化甲狀腺氨酸的活動(dòng)，通過(guò)定義是基因組的，在基因表達(dá)中達(dá)到頂點(diǎn)。另一方面，這個(gè)模型系統(tǒng)對(duì)T4而不是T3的優(yōu)先的應(yīng)答，TR的自然的配體一升高的可能性和在那些需要基因轉(zhuǎn)錄的作用下達(dá)到頂點(diǎn)，這個(gè)可能性指那些血管新生可能通過(guò)T4在質(zhì)膜非基因組地開(kāi)始的。T4的非基因組的活動(dòng)已經(jīng)廣泛地描述了，通常在質(zhì)膜上開(kāi)始和可能通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞。它們不需要碘化甲狀腺氨酸和TR的核內(nèi)的配體，但是可能協(xié)調(diào)或調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄。類(lèi)固醇的非基因組的活動(dòng)也已經(jīng)很好的描述了，并已知道類(lèi)固醇或其他的化合物協(xié)調(diào)基因組的活動(dòng)。帶有T4和tetrac或帶有瓊脂糖-T4進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明T4的前血管生成作用實(shí)際上很可能是在質(zhì)膜上開(kāi)始的。Tetrac阻斷T4的膜-開(kāi)始的作用，但是本身不活化激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，它是一個(gè)對(duì)甲狀腺激素的非基因組活動(dòng)的探針。瓊脂糖-T4被認(rèn)為不是細(xì)胞內(nèi)部的獲得入口并已經(jīng)用于檢查對(duì)該激素的可能細(xì)胞表面-開(kāi)始的活動(dòng)的模型。在雞絨毛尿囊膜(“CAM”)模型中甲狀腺激素的前血管生成作用的研究證明從存在的血管的新血管的生成通過(guò)1O″7-10″9M的或者左旋甲狀腺素(T4)或3，5，3′-三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)被促進(jìn)兩到三倍。更多有趣地是，T4-瓊脂糖、一個(gè)不通過(guò)細(xì)胞膜的甲狀腺激素類(lèi)似物，產(chǎn)生一個(gè)比得上那些由T3或T4得到的有效的前血管新生作用。
部分地，本發(fā)明提供了對(duì)患者體內(nèi)需要的促進(jìn)血管新生的組合物和其方法。服從通過(guò)促進(jìn)血管新生治療的疾病包括，例如，閉塞的周?chē)匝芗膊『凸跔畹募膊。貏e是，閉塞的冠狀血管、和與外周的脈管系統(tǒng)和/或冠狀血管的閉塞有關(guān)的病癥、勃起的功能障礙、中風(fēng)、和創(chuàng)傷。對(duì)在病人體內(nèi)需要的促進(jìn)血管新生和/或補(bǔ)充并行的血管的組合物和其方法也已公開(kāi)。該組合物包括一有效量的甲狀腺激素類(lèi)似物和衍生物的多聚體形式和一有效量的腺苷和/或氧化氮供體。該組合物可以是一種無(wú)菌的、可注射的、藥物制劑的形式，其中藥物制劑包括一血管生成地有效量的在生理地和藥物地可接受的載體里似甲狀腺激素的物質(zhì)和腺苷衍生物，選擇性地帶有一個(gè)或一個(gè)以上賦形劑。
心肌梗死 伴隨著急性的心肌梗死的心力衰竭的一種主要的原因是新血管形成的不充分的應(yīng)答，那就是說(shuō)，血管新生。甲狀腺激素和它的類(lèi)似物在心臟衰竭和刺激冠狀的血管新生里是有益的。本發(fā)明的方法包括，部分地，在梗死形成的時(shí)候或者通過(guò)直接注入進(jìn)心肌、或者通過(guò)通過(guò)間歇的主動(dòng)脈的結(jié)扎的冠狀動(dòng)脈的注射的模擬來(lái)產(chǎn)生暫時(shí)的等容收縮提供甲狀腺激素類(lèi)似物的單一療法來(lái)獲得血管新生和/或心室的改型。
因此，本發(fā)明的特征方法的一方面，這個(gè)特征方法通過(guò)給需要的患者適量的多聚體形式的甲狀腺激素、或其類(lèi)似物、有效的促進(jìn)血管新生來(lái)促進(jìn)血管新生來(lái)治療閉塞的血管病、冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、心肌梗死、缺血、中風(fēng)、和/或外周的動(dòng)脈血管的病癥。
甲狀腺激素類(lèi)似物的多聚體形式的實(shí)例在這里也被提供并且可以包括結(jié)合到聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚體、聚乳酸、或瓊脂糖的三碘甲腺原氨酸(T3)、左旋甲狀腺素(T4)、(GC-I)、或3，5-二碘甲狀腺丙酸(DITPA)。
該方法也包括一有效量的似甲狀腺激素的物質(zhì)和一有效量的腺苷和/或低的NO供體，持續(xù)一星期或以上的每日的劑量的共同給藥。一種或兩種組分都可以通過(guò)導(dǎo)管局部地輸送。在體內(nèi)的甲狀腺激素類(lèi)似物和衍生物通過(guò)在適當(dāng)?shù)卮笮〉闹|(zhì)體或微粒中的化合物的結(jié)合可以輸送到圍繞缺血性的組織的毛細(xì)血管床。甲狀腺激素類(lèi)似物、多聚體形式和衍生物通過(guò)帶有一種合適的抗體的共價(jià)鍵可以靶向到缺血性的組織。
該方法可能用作心肌梗死后修復(fù)心臟功能的一種療法。該方法也可能用作改善帶有冠狀動(dòng)脈疾病的病人，這些病人遭受著從心肌缺血或局部缺血到除了心的區(qū)域包括，例如，閉塞的周?chē)匝芗膊?又名外周的動(dòng)脈阻塞性疾病)、勃起的功能障礙。
傷口愈合 傷口的血管新生是愈合的增生期的重要的的一部分。除了特大的表面所有皮膚傷口的愈合在沒(méi)有血管新生時(shí)不可能發(fā)生。不僅任何損傷的脈管系統(tǒng)需要被修復(fù)，而且為治愈所必需的增殖的局部細(xì)胞的活動(dòng)需要從血流中得到增多的營(yíng)養(yǎng)的供給。此外，形成血管的內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)組織自身和愈合的調(diào)節(jié)者是很重要的。
因此，血管新生提供了一種新的微循環(huán)支持創(chuàng)傷的愈合。損傷后四日新血管在傷口空間內(nèi)部就變成臨床上明顯的。血管的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、和平滑肌細(xì)胞所有的增殖與支持傷口肉芽發(fā)生相協(xié)調(diào)。同時(shí)，上皮再形成發(fā)生來(lái)重建上皮的覆蓋層。從創(chuàng)傷邊緣或從深的毛囊的上皮細(xì)胞遷移橫穿傷口并且在肉芽組織和臨時(shí)基質(zhì)上形成他們自身。生長(zhǎng)因子例如角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)調(diào)節(jié)這個(gè)過(guò)程。上皮形成的幾模型(滑動(dòng)對(duì)比滾動(dòng)細(xì)胞)存在。
像甲狀腺激素調(diào)節(jié)代謝率，當(dāng)由于甲狀腺機(jī)能減退新陳代謝減慢時(shí)，傷口愈合也減慢。所以在傷口愈合中局部地應(yīng)用甲狀腺激素類(lèi)似物或多聚體形式的作用提出了一種加速新的策略，這個(gè)策略加速了糖尿病患者和帶有損傷了的傷口愈合能力的非糖尿病患者的傷口愈合。局部的給藥可以采用繃帶幫助的附著形式。另外，納米聚合體和納米顆粒能被用作甲狀腺激素和它的類(lèi)似物的本地輸送的基質(zhì)。這將幫助定時(shí)控制的輸送進(jìn)細(xì)胞的和組織目標(biāo)。
因此，通過(guò)給藥給需要的患者以適量的多聚體形式的甲狀腺激素、或其類(lèi)似物、有效的促進(jìn)血管新生的通過(guò)促進(jìn)血管新生來(lái)治療創(chuàng)傷的本發(fā)明的特征方法的別的實(shí)施方案。對(duì)于其詳述，參見(jiàn)實(shí)例9A和9B。
誘導(dǎo)和維持神經(jīng)元的細(xì)胞的甲狀腺激素、類(lèi)似物、和和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的聚合的結(jié)合物的作用 與傳統(tǒng)的神經(jīng)中樞的誘導(dǎo)的認(rèn)識(shí)相反，本發(fā)明部分地以意外的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)是，開(kāi)始和維持血管新生的機(jī)制是神經(jīng)發(fā)生的有效的促進(jìn)者和支持者。這些方法和組合物是有用的，例如、對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷和創(chuàng)傷中的神經(jīng)病、損傷和神經(jīng)元的混亂的療法。這個(gè)發(fā)明公開(kāi)了各種各樣的單獨(dú)的前血管新生策略或和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子的使用。前血管新生因子包括像在這里闡述的聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物。在本技術(shù)領(lǐng)域已知的和帶有神經(jīng)生長(zhǎng)觸器或其他的神經(jīng)發(fā)生因子的聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物和它的單獨(dú)的聚合的結(jié)合物或和聯(lián)合在一起的其他的前血管新生生長(zhǎng)因子可以結(jié)合用于最佳的神經(jīng)發(fā)生。
在哺乳動(dòng)物中用于維持神經(jīng)中樞途徑的治療方法、組合物和設(shè)備，包括提高擔(dān)快死的風(fēng)險(xiǎn)的神經(jīng)元的存活、誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元和神經(jīng)中樞的途徑的細(xì)胞的修復(fù)、和刺激神經(jīng)元維持它們的分化表型。另外，包含聚合的甲狀腺激素類(lèi)似物、和其組合的組合物，在抗氧化劑和/或消炎劑存在的情況下證實(shí)了神經(jīng)元的再生和保護(hù)。
本發(fā)明也提供了甲狀腺激素、類(lèi)似物、和聚合的結(jié)合物、單獨(dú)的或和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子來(lái)提高神經(jīng)元的存活和維持神經(jīng)中樞途徑。如同這里所描述的，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物能夠提高神經(jīng)元的存活、刺激神經(jīng)元的CAM表達(dá)、維持分化的神經(jīng)元的表型表達(dá)、誘導(dǎo)神經(jīng)中樞的起源的轉(zhuǎn)換細(xì)胞的再分化、和刺激在神經(jīng)中樞的過(guò)程的斷處上軸突的生長(zhǎng)，特別是在軸突里的大的缺口。成形基因也防止與免疫地相關(guān)的神經(jīng)組織損傷有關(guān)的組織破壞。最終，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可能用作用來(lái)監(jiān)視哺乳動(dòng)物中神經(jīng)組織的存活期的方法的一部分。
本發(fā)明也提供了關(guān)于在培養(yǎng)鼠表層神經(jīng)元之間的神經(jīng)突觸形成的聚合的甲狀腺激素的作用，使用一種體系評(píng)價(jià)體外功能的神經(jīng)突觸形成。暴露在10-9M聚合的甲狀腺激素、3，5，3′-三碘甲腺原氨酸或甲狀腺素，引起細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度的自發(fā)的同步的振蕩的變化的頻率增加，這與神經(jīng)突觸形成的數(shù)目有關(guān)系。通過(guò)免疫的細(xì)胞化學(xué)的和免疫印跡分析對(duì)與突觸囊泡關(guān)聯(lián)的蛋白的檢測(cè)也證實(shí)暴露在甲狀腺素促進(jìn)了神經(jīng)突觸的形成。乙胺碘呋酮，5′-脫碘酶的抑制劑、或氨三唑，一種除草劑的存在，在甲狀腺素存在的情況下抑制了神經(jīng)突觸的形成。因此，本發(fā)明也提供一種有用的體外試驗(yàn)體系來(lái)篩選那些通過(guò)分裂聚合的甲狀腺系統(tǒng)來(lái)干擾發(fā)育的CNS中的神經(jīng)突觸的形成。
通常，本發(fā)明的方法可能用于治療在危險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物的患者或被神經(jīng)中樞組織的損傷或神經(jīng)病所煩擾的患者。本發(fā)明適合于治療所有的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，優(yōu)選地較高等的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物例如人。另外，然而、本發(fā)明可能應(yīng)用于對(duì)那些作為人的同伴來(lái)供養(yǎng)的家養(yǎng)哺乳動(dòng)物的治療(例如，狗、貓、馬)，它們有重要的商業(yè)價(jià)值(例如，山羊、豬、羊、家牛、運(yùn)動(dòng)的或耕畜)，它們有重要的科學(xué)價(jià)值(例如，瀕危物種的捕獲的或自由的標(biāo)本、或近親交配或基因工程的動(dòng)物種類(lèi))，或不然它們有價(jià)值。
這里描述的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物提高了細(xì)胞的存活，特別是處于將死的危險(xiǎn)中的神經(jīng)元的細(xì)胞。例如，完全分化的神經(jīng)元是非有絲分裂的，并且，當(dāng)使用本技術(shù)領(lǐng)域所知的化學(xué)合成培養(yǎng)基或低的血清培養(yǎng)基在低于標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件體外培養(yǎng)時(shí)會(huì)死去。參見(jiàn)，例如，Charness，J.Biol.Chem.263164-3169(1986)and Freese，et al.，Brain Res.521254-264(1990)。然而，如果非有絲分裂的神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)用單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子處理，對(duì)這些細(xì)胞的存活有較大地提高。例如，從成年鼠腦的黑質(zhì)中分離的紋狀體的基底神經(jīng)節(jié)的原代培養(yǎng)使用標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)制備，例如，通過(guò)由帶有黑質(zhì)組織的巴斯德吸管研碎來(lái)離解，使用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方案，和在低的血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，例如，包含50％DMEM(Dulbecco改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基)、50％F-12培養(yǎng)基、補(bǔ)充有青霉素/鏈霉素和4g/L葡萄糖的加熱滅活的馬血清。在低于標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下，當(dāng)培養(yǎng)在游離血清培養(yǎng)基中這些細(xì)胞到三星期會(huì)進(jìn)行顯著的細(xì)胞死亡。通過(guò)細(xì)胞無(wú)能力保持附著和通過(guò)它們的超級(jí)結(jié)構(gòu)特征的變化細(xì)胞死亡在形式上很明顯。，例如，通過(guò)染色質(zhì)凝塊和細(xì)胞器解體。特別地，細(xì)胞保持附著和延伸至維持活的分化的神經(jīng)元的形態(tài)。在沒(méi)有單獨(dú)的甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子治療的情況下，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞分解并進(jìn)行細(xì)胞壞死。
黑質(zhì)的基底神經(jīng)節(jié)中的功能障礙與體內(nèi)的亨廷頓氏舞蹈病和帕金森病有關(guān)。這里定義的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物提高神經(jīng)元存活的能力表明這些單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物作為提高在體內(nèi)處于死亡危險(xiǎn)中的神經(jīng)元的細(xì)胞存活的療法的一部分將很有用，例如，對(duì)神經(jīng)病或，化學(xué)的或機(jī)械性創(chuàng)傷。本發(fā)明進(jìn)一步提出這些單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物提供了一種治療神經(jīng)病有用的治療劑，這種神經(jīng)病影響紋狀體的基底神經(jīng)節(jié)，包括亨廷頓氏舞蹈病和帕金森病。對(duì)于臨床應(yīng)用，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可能被用來(lái)給藥或，換句話說(shuō)，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子-刺激劑可能被用來(lái)給藥。
這里描述的甲狀腺激素化合物還可以用于保護(hù)受過(guò)化學(xué)的創(chuàng)傷的神經(jīng)組織。這里描述的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物提高誘導(dǎo)神經(jīng)元的細(xì)胞存活和再分化細(xì)胞中的細(xì)胞聚集和細(xì)胞-細(xì)胞粘著的能力，表明單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物作為通過(guò)保護(hù)細(xì)胞限定的途徑防止由化學(xué)創(chuàng)傷所引起的損傷來(lái)維持神經(jīng)中樞途徑的治療劑將很有用處。特別地，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可以保護(hù)神經(jīng)元，包括發(fā)育中的神經(jīng)元，防止眾所周知的抑制神經(jīng)元的增殖和遷移和干涉細(xì)胞-細(xì)胞粘著的毒素的影響。這樣的毒素的實(shí)例包括乙醇，一個(gè)或一個(gè)以上的毒素存在于香煙煙霧和各種各樣的鎮(zhèn)靜劑中。關(guān)于發(fā)育中的神經(jīng)元的乙醇的有毒影響在胎兒乙醇綜合癥中誘導(dǎo)神經(jīng)學(xué)上的顯然的損傷。單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物還保護(hù)神經(jīng)元防止與興奮性氨基酸例如谷氨酸有關(guān)的細(xì)胞毒素的影響。
例如，當(dāng)提供25-50mM的單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子給NG108-15細(xì)胞來(lái)治療這些細(xì)胞，乙醇抑制單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞粘著作用。按照單一酒精飲料的攝取在一個(gè)成年人體內(nèi)的血酒精濃度，帶有5-10mM乙醇就可獲得半最大抑制。乙醇可能干涉細(xì)胞間CAM的同種結(jié)合，而不是它們的誘導(dǎo)，如同單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子——誘導(dǎo)N-CAM水平不受乙醇的影響。此外，抑制效果與單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子的濃度成反比。因此，可以預(yù)見(jiàn)，單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子或單獨(dú)的聚合的甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子的給藥——對(duì)神經(jīng)元、特別是發(fā)育中的神經(jīng)元、暴露在毒素例如乙醇中的損傷危險(xiǎn)的刺激劑，通過(guò)克服毒素抑制的影響保護(hù)這些細(xì)胞免于神經(jīng)組織損傷。這里描述的單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子對(duì)由于暴露在毒素中誘導(dǎo)的神經(jīng)病引起的治療損傷的神經(jīng)中樞途徑的療法也很有用。
這里描述的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物在體內(nèi)的活動(dòng)在如同這里所描述的動(dòng)物模型里也很容易評(píng)價(jià)。一種合適的動(dòng)物，優(yōu)選地顯示出神經(jīng)組織損傷，例如，遺傳地或環(huán)境上地誘導(dǎo)，向腦內(nèi)注射帶有有效量的以一種合適的治療制劑的形式的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子，例如磷酸鹽緩沖鹽水、pH7。單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物優(yōu)選地注射到受影響的神經(jīng)元的區(qū)域內(nèi)部。在隨后的時(shí)間點(diǎn)和由形態(tài)上和/或由合適的生物化學(xué)標(biāo)記物(例如，由單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或N-CAM局部化；或通過(guò)測(cè)量劑量-依賴(lài)的關(guān)于生物化學(xué)的標(biāo)記物對(duì)CNS神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的活動(dòng)或?qū)τ贑NS組織損傷的影響)的作用的組織的評(píng)價(jià)，受影響的組織被切除，使用的實(shí)例如，神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白做為標(biāo)記物。其劑量和保溫時(shí)間隨待檢測(cè)的動(dòng)物而變化。對(duì)于不同物種的合適的劑量范圍可能通過(guò)和建立的動(dòng)物模型比較來(lái)確定。下面提出的是對(duì)于鼠腦刺傷模型的一個(gè)典型的方案。
簡(jiǎn)言之，從標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)的來(lái)源獲得的雄性Long Evans大鼠，使其麻醉并對(duì)頭部區(qū)域準(zhǔn)備外科手術(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)方法和使用0.035K電線僅僅刺穿頭骨對(duì)每葉的中心鉆一個(gè)洞使頭骨暴露。包含或者單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子(例如，OP-I，25毫克)或PBS的25毫升溶液通過(guò)漢密爾頓注射器注射到每個(gè)洞中。溶液被輸送到表面以下大約深3毫米處，進(jìn)入下層皮層、胼胝體和海馬。然后縫合皮膚使動(dòng)物復(fù)原。
手術(shù)后三日，犧牲大鼠切下頭部并對(duì)它們的腦部進(jìn)行切片。通過(guò)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白免疫熒光著色的辦法來(lái)評(píng)價(jià)瘢痕組織的形成，神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白是一種為神經(jīng)膠質(zhì)傷痕定性地確定瘢痕程度的蛋白標(biāo)記物。神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白抗體商業(yè)上可得到，例如，從美國(guó)密蘇里州圣路易的Sigma化學(xué)公司。切片也可以用帶有抗OP-1抗體確定OP-1的存在來(lái)探測(cè)。神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白的降低的水平在用單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子處理的動(dòng)物的組織切片中是預(yù)期的，證明了單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕和刺激神經(jīng)再生的能力。
用于神經(jīng)變性疾病的腦顯象、診斷和治療的甲狀腺激素、類(lèi)似物、和聚合結(jié)合物的作用 本發(fā)明涉及對(duì)神經(jīng)變性疾病的早期診斷、防止和治療有用的新的藥物和放射性藥物，比如，例如，阿爾茨海默氏病。本發(fā)明也包括新的結(jié)合在生物系統(tǒng)中和能用于電子發(fā)射斷層掃描(PET)、單光子發(fā)射(SPECT)成象方法、和磁共振(MRI)成像方法的化合物。T4及其他甲狀腺激素類(lèi)似物在體內(nèi)結(jié)合到局部化配體的能力使利用這樣的化合物經(jīng)PET、SPECT、MRI和類(lèi)似的成像方法原位成像成為可能?；旧?，關(guān)于配體的自然狀態(tài)沒(méi)有必要知道，只要結(jié)合發(fā)生，并且這樣的結(jié)合對(duì)所關(guān)心的這些細(xì)胞、器官、組織或受體是特殊的。
借助帶有正電子-發(fā)射同位素標(biāo)記的含示蹤原子的化合物PET成像得以完成(Goodman，M.M.臨床的電子發(fā)射斷層掃描，莫斯比年鑒，1992，K.F.Hubner et al.，Chapter 14)。對(duì)于大多數(shù)生物材料，合適的同位素很少。碳同位素11C，已經(jīng)被用于PET，但是它的20.5分鐘的短暫半衰期限制了它對(duì)那些可以很快地合成和純化的化合物的用處，并限制了設(shè)備也就是說(shuō)產(chǎn)生C11前體原材料的地方貼緊著回旋加速器。其他的同位素半衰期更短。N13的半衰期只有10分鐘，O15的半衰期更短，只有2分鐘。兩者的發(fā)射比C11要更多的能量。然而，已經(jīng)可以用這些同位素進(jìn)行PET研究(Hubner，K.F.，i臨床的電子發(fā)射斷層掃描，莫斯比年鑒，1992，K.F.Hubner，et al.，Chapter 2)。一種更有用的同位素，18F，半衰期有110分鐘。這允許有充分的時(shí)間來(lái)并入放射性標(biāo)記的示蹤物、純化和給人或動(dòng)物患者給藥。另外，設(shè)備更遠(yuǎn)離回旋加速器，直到大約200英里周?chē)梢允褂肍標(biāo)記的化合物。18F的缺點(diǎn)是與自然地-存在生物材料功能上等價(jià)的氟化類(lèi)似物相對(duì)來(lái)說(shuō)比較稀少，而且用回旋加速器有效地利用原材料產(chǎn)生的合成方法設(shè)計(jì)很困難。這樣的原材料可以是或者氟化物離子或者氟氣體。在后者中雙分子的氣體實(shí)際上僅一個(gè)氟原子是放射性核素，所以氣體指定為F-F18。使用F-F18反應(yīng)做為原材料從而利用K.F18做為原材料的充裕的反應(yīng)使產(chǎn)生的產(chǎn)品僅有一半放射性核素。另一方面，F(xiàn)18可以按居里量制備做為氟化物離子用于并入使用游離載體親核取代反應(yīng)時(shí)理論上為1.7Ci/nmol的高比放射性的放射性藥物化合物。F18的能量輻射為0.635兆電子伏，在組織中產(chǎn)生一相對(duì)短的，平均2.4毫米正電子范圍，允許高分辨率PET成像。
SPECT成像使用那些發(fā)射高能光子的同位素示蹤物(γ-發(fā)射極)。有用同位素的范圍比用于PET的大，但是SPECT提供較低的三維分辨力。雖然如此，SPECT廣泛用于獲得臨床上顯著的關(guān)于結(jié)合的類(lèi)似物、局部化和間隙比率的信息。一個(gè)對(duì)SPECT成像有用的同位素是I123α-γ-發(fā)射極，它有13.3小時(shí)的半衰期。帶有I123標(biāo)記的化合物可以從制造的位置運(yùn)到大約1000英里遠(yuǎn)的地方，或同位素本身可以運(yùn)送到該地點(diǎn)合成。百分之八十五的同位素發(fā)射有159千電子伏光子，通過(guò)SPECT裝置很容易調(diào)節(jié)它。目前已使用。本發(fā)明的化合物可以是帶有锝的標(biāo)記。锝-99m是大家都知道的對(duì)于SPECT成像有用的放射性核素。本發(fā)明的T4類(lèi)似物通過(guò)4-6個(gè)碳鏈加入到锝-99m金屬簇，該碳鏈可以是飽和的或擁有雙鍵或三鍵。
PET中使用的F18標(biāo)記化合物限于幾個(gè)類(lèi)似的化合物。最顯著地，18F-氟去氧葡萄糖已經(jīng)廣泛用于葡萄糖代謝和與大腦活動(dòng)有關(guān)的局部葡萄糖攝取的研究。18F-L-氟多巴及其他多巴胺受體類(lèi)似物也已用于多巴胺受體分布作圖。
其他的鹵素同位素可用于PET或SPECT成像，或常用的示蹤物標(biāo)記。這些鹵素同位素包括有可用的半衰期和發(fā)射特性的75Br、76Br、77Br和82Br。通常，存在化學(xué)方法為所描述的同位素替代任何鹵素部分。所以，所描述的化合物的任何鹵代同族體生物化學(xué)的生理學(xué)的活動(dòng)現(xiàn)在可被本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員使用，包括穩(wěn)定的同位素鹵素同族體。砹可以用于替代其他的鹵素同種型。210At，例如，發(fā)射α-粒子，半衰期為8.3小時(shí)。其他的同位素也發(fā)射α-粒子并有有用的半衰期。所以，砹-取代化合物可用于腦部治療，在那結(jié)合是充足地腦-特異的。
大量的研究證明碳水化合物和氨基酸結(jié)合進(jìn)惡性腦細(xì)胞中增多。這些累積與促進(jìn)這些細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)合成有關(guān)。葡萄糖類(lèi)似物18F-2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖(2-FDG)已經(jīng)被用來(lái)很好地從正常的腦組織或良性生長(zhǎng)中辨別惡性腦的腦髓。(DiChiro，G.et al.(1982)Neurology(NY)321323-1329)。然而，氟-18標(biāo)記的2-FDG不是對(duì)檢測(cè)低級(jí)腦的腦髓的好的選擇試劑，因?yàn)檎＝M織中高的攝取可以掩蓋腦的存在。另外，因?yàn)樵趥魅拘缘慕M織和在膀胱中各自的2-FDG放射性高的攝取量，氟-18標(biāo)記的2-FDG不是對(duì)從傳染性的組織或檢測(cè)卵巢的癌中辨別肺腦髓的理想放射性藥物。天然存在的氨基酸甲硫氨酸、帶有碳-11標(biāo)記，也已用于從正常的組織中辨別惡性的組織。但是它在正常的組織中也有比較高的攝取量。此外，碳-11的半衰期僅20分鐘；所以C-11甲硫氨酸不能長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。
腦脊液(“CSF”)轉(zhuǎn)甲腺素蛋白(“TTR”)，鼠和人中主要的CSF甲狀腺素(T4)載體蛋白在脈絡(luò)叢(“CP”)中合成。在鼠中延遲注射125I-T4，放射性的T4先在CP中積累，然后在腦脊液中隨后在腦中積累(Chanoine JP，Braverman LE.轉(zhuǎn)甲腺素蛋白在甲狀腺激素運(yùn)送到腦脊液和腦髓中的作用.Acta Med Austriaca.1992；19 Suppl 125-8)。
本發(fā)明的化合物實(shí)質(zhì)上提供了改善對(duì)有淀粉狀蛋白質(zhì)尤其腦的淀粉狀蛋白質(zhì)的體內(nèi)區(qū)域的PET成像?？梢圆⑷肷飳W(xué)上的活性化合物的所有的可利用的發(fā)射正電子的同位素有短暫的半衰期。因此這些標(biāo)記化合物實(shí)際應(yīng)用取決于標(biāo)記化合物能多快合成、合成的產(chǎn)率和最終產(chǎn)品的放射化學(xué)純度。甚至從同位素源、回旋加速器設(shè)備、到可以進(jìn)行PET成像的醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室的裝運(yùn)時(shí)間，是有限的。有效的距離的概算是半衰期內(nèi)每分鐘大約兩英里。因此，C11，半衰期為20.5分鐘，被限制在其來(lái)源大約方圓40英里范圍內(nèi)而帶有F18標(biāo)記的化合物能在大約方圓200英里范圍內(nèi)使用。18F標(biāo)記化合物的進(jìn)一步的要求是它對(duì)受體或目標(biāo)分子有結(jié)合專(zhuān)一性，這些受體或目標(biāo)分子是用來(lái)結(jié)合，那些充分低來(lái)區(qū)分靶向和非靶向結(jié)合的與其他的目標(biāo)的非特異的結(jié)合，和那些在測(cè)試環(huán)境中避免和其他的物質(zhì)交換的測(cè)試的條件下是穩(wěn)定的標(biāo)記。更特別地，本發(fā)明的化合物必須展示充分的結(jié)合到所要求的目標(biāo)同時(shí)與其他的組織或細(xì)胞不能結(jié)合到任何可比較的程度。
本發(fā)明的化合物實(shí)質(zhì)上提供了改善對(duì)有淀粉狀蛋白質(zhì)尤其腦部的淀粉狀蛋白質(zhì)的區(qū)域的PET成像辦法。對(duì)PET成像精確的要求的一個(gè)局部解決辦法是在SPECT成像中使用發(fā)射γ射線的同位素。I123是一個(gè)對(duì)SPECT通常使用的同位素標(biāo)記物，它有13小時(shí)的半衰期和由此而來(lái)的從合成位置超過(guò)1000英里的有效范圍。本發(fā)明的化合物可以迅速地和有效地用I標(biāo)記供做為可以代替PET成像的SPECT分析來(lái)使用。此外，因?yàn)橄嗤幕衔锟梢杂妹恳粋€(gè)同位素標(biāo)記，使通過(guò)使用相同的示蹤物的PET和SPECT獲得的結(jié)果進(jìn)行比較第一次變得有可能。
腦結(jié)合的專(zhuān)一性也提供了本發(fā)明的I-取代化合物的應(yīng)用。這樣的化合物可以用短壽命的123I標(biāo)記來(lái)進(jìn)行SPECT成像或用壽命較長(zhǎng)的125I來(lái)進(jìn)行長(zhǎng)期的研究比如監(jiān)視一系列療法。其他碘和溴的同位素可以被替代那些例證中的同位素。
因此，本發(fā)明的化合物提供改善使用PET和SPECT對(duì)腦顯象的方法。該方法必然伴有給患者(它們可以是人或動(dòng)物，用于實(shí)驗(yàn)的和/或診斷的目的)給藥，本發(fā)明的化合物的成像生成數(shù)量和帶有合適的同位素標(biāo)記然后通過(guò)PET或SPECT測(cè)量混合物的分布，其中如果使用F18或其他的陽(yáng)電子輻射體就采用PET，如果使用I123或γ輻射源，則采用SPECT?？紤]到掃描器的檢測(cè)靈敏度和噪音水平、同位素的壽命、患者的身體大小和給藥途徑，所有這些對(duì)于已知的和經(jīng)過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域熟練人員不用過(guò)多的試驗(yàn)即可知道的計(jì)算和測(cè)量可解釋的典型的可變量，成像生成數(shù)量是PET或SPECT掃描器中能提供的最小的數(shù)量。
很清楚，本發(fā)明的化合物可以帶有任何原子或在結(jié)構(gòu)中結(jié)合有這些原子的同位素標(biāo)記。同時(shí)F18、I123和I125由于特別地可用于PET、SPECT和示蹤分析在這里已經(jīng)被強(qiáng)調(diào)，其他的使用預(yù)計(jì)包括那些來(lái)自穩(wěn)定同位素同族體的生理學(xué)或藥理學(xué)性質(zhì)，這對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明也提供了通過(guò)锝絡(luò)合物的锝標(biāo)記。锝的同位素，特別地Tc99m，已經(jīng)被用于腦顯象。本發(fā)明提供本發(fā)明的化合物的锝-配合的絡(luò)合物，它們對(duì)腦顯象很有用。該絡(luò)合物是通過(guò)4-6個(gè)碳鏈加到環(huán)狀氨基酸中的锝-配位絡(luò)合物，這里的碳鏈可以是飽和的或擁有一個(gè)雙鍵或三鍵。在雙鍵存在的地方，E(反式)或Z(順式)異構(gòu)體可以被合成，每一個(gè)異構(gòu)體可以被使用。合成中描述了最后一步加入99mTc同位素以達(dá)到該同位素的最大使用年限。
下列方法已在這里報(bào)道方法過(guò)程中應(yīng)用。利用在95％富集18O的水中和11MeV質(zhì)子的18O(p，n)18F反應(yīng)從西門(mén)子回旋加速器中產(chǎn)生18F-氟化物。所有的溶劑和化學(xué)藥品是分析純并且在使用時(shí)沒(méi)有進(jìn)一步的純化。化合物的熔點(diǎn)由使用Buchi公司SP系列裝置在毛細(xì)管中測(cè)定。采用250毫米厚的硅膠G PF-254涂層于鋁(從Analtech公司處獲得)上進(jìn)行薄層色譜分析(TLC)。采用60-200目硅膠(aldrich公司)進(jìn)行柱色譜。紅外光譜(IR)記錄在帶有NaCl鍍層的Beckman 18A分光光度計(jì)上。質(zhì)子核磁共振波譜(IH NMR)用帶有尼高力的高分辨率儀器在300兆赫處獲得。
在別的方面，本發(fā)明指導(dǎo)使用本發(fā)明的化合物的方法來(lái)生產(chǎn)診斷人的阿爾茨海默氏病的放射性藥物。在別的方面，本發(fā)明指導(dǎo)本發(fā)明的化合物制備的方法。
這里所描述的本發(fā)明的化合物是甲狀腺激素類(lèi)似物或其他的TTR結(jié)合配體，它們結(jié)合到TTR并且有能力通過(guò)血-腦屏障。因此，該化合物適合做為阿爾茨海默氏病的成像的體內(nèi)診斷劑。根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法過(guò)程進(jìn)行放射性的檢測(cè)，或者通過(guò)γ照相，或者通過(guò)電子發(fā)射斷層掃描(PET)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物的游離堿或藥物地可接受的鹽類(lèi)形式，例如，一氯化物或二氯化合物鹽類(lèi)，用于草藥制劑做為診斷劑。該草藥制劑包含本發(fā)明的化合物，選擇性地包含本技術(shù)領(lǐng)域已知的佐劑，例如緩沖液、氯化鈉、乳酸、表面活性劑等等。在使用之前可能要在無(wú)菌的條件下對(duì)該草藥進(jìn)行過(guò)濾滅菌。
每次操作放射劑量在1到100mCi范圍內(nèi)，優(yōu)選地5到30mCi，最優(yōu)選地5到20mCi。
本發(fā)明的各種各樣的方面中，某些特定的化合物(例如，實(shí)例16-20中公開(kāi)的化合物)是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是在電子發(fā)射斷層掃描(PET)中用作診斷劑的化合物。
本發(fā)明的化合物可能由任何合適的途徑給藥，優(yōu)選地采用適合這一途徑的藥物組合物形式，和在腦中以一結(jié)合到TTR的有效劑量從而通過(guò)γ照相或PET來(lái)檢測(cè)。典型地，給藥是腸胃外的，例如，靜脈內(nèi)、進(jìn)入腹膜腔內(nèi)地、皮下地、皮內(nèi)地、或肌內(nèi)注射。靜脈給藥是優(yōu)選的。因此，例如，本發(fā)明提供了對(duì)腸胃外給藥地組合物，它們包含溶解了造影劑的溶液或可接受的載體中的懸浮液，例如，血清或生理的氯化鈉溶液。
水相載體包括水、乙醇的/水溶液、鹽水溶液，腸胃外的運(yùn)載體比如氯化鈉、R型葡萄糖等等。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有機(jī)酯比如油酸乙酯。其他的藥物地可接受的載體、無(wú)毒的賦形劑，包括鹽類(lèi)、防腐劑、緩沖劑等等，已被描述，例如，在雷氏藥物大全，15.sup.th Ed.EastonMackPublishing Co.，pp.1405-1412 and 1461-1487(1975)和國(guó)家藥典XIV.，14.sup.th Ed.華盛頓美國(guó)藥物聯(lián)合會(huì)(1975)中。水相載體是優(yōu)選的。
本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)懸浮或溶解本發(fā)明的化合物——選擇性地與在草本制劑藥學(xué)——在水相介質(zhì)中常用地的添加劑結(jié)合，然后選擇性地對(duì)懸濁液或溶液滅菌來(lái)生產(chǎn)，某種意義上本質(zhì)上是已知的。合適的添加劑是，例如，生理地可接受的緩沖液(比如，例如，氨基丁三醇)、絡(luò)合劑的添加(例如，二乙基三胺五乙酸)或～如果需要-電解質(zhì)，例如，氯化鈉或～必要時(shí)-抗氧化劑，比如抗壞血酸。
如果水中或生理鹽溶液中地本發(fā)明的化合物的懸濁液或溶液對(duì)腸衣給藥或其他的目的是值得要的，按照草本制劑藥學(xué)中的慣例，它們與一個(gè)或幾個(gè)助劑(例如，甲基纖維素、乳糖、甘露醇)和/或表面活性劑(例如，卵磷脂、“吐溫”、“Myri”)和/或調(diào)味劑相混合來(lái)改善味道(例如，有高度揮發(fā)性的油類(lèi))。
該組合物可能通過(guò)傳統(tǒng)的、眾所周知的滅菌方法來(lái)滅菌、可能采用過(guò)濾除菌。得到的水溶液可能采用凍干、在給藥之前與無(wú)菌溶液結(jié)合凍干制備包裝起來(lái)使用。本組合物可以包含根據(jù)需要的近似的生理情況藥物地可接受的輔助的物質(zhì)，比如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張性調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑等等，例如，醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨醇酐酯、油酸三乙醇胺酯等等。
對(duì)于根據(jù)本發(fā)明有放射性鹵素的化合物，這些化合物可以作為“熱的”化合物來(lái)運(yùn)輸，也就是說(shuō)，在該化合物中帶有放射性的鹵素和在例如，生理地可接受的鹽水溶液中給藥。就金屬配合物來(lái)說(shuō)，這些化合物作為“冷的”化合物來(lái)運(yùn)輸，也就是說(shuō)，不帶放射性的離子，然后和Tc-信號(hào)的洗出液或錸-信號(hào)的洗出液相混合。
甲狀腺激素、類(lèi)似物、和聚合結(jié)合物在調(diào)節(jié)多肽活動(dòng)的作用，其中多肽的細(xì)胞表面受體聚集在整合素αβ3、或其他的包含RGD的化合物周?chē)纤卅罺β3是一種帶有幾個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)配位體的異二聚體質(zhì)膜蛋白質(zhì)，包含一氨基酸順序?yàn)榫彼?甘氨酸-天冬氨酸(“RGD”)。使用純化的整合素，我們發(fā)現(xiàn)整合素αVβ3結(jié)合T4而且這個(gè)交互作用被αVβ3拮抗物擾亂。放射性配體-結(jié)合得到研究表明純化的αVβ3用高的親合力結(jié)合T4(EC50，371pM)、并且似乎在T3上選擇性地結(jié)合T4。這與前面地報(bào)道是一致的，這些報(bào)道表明通過(guò)T4的MAPK活化和核易位，還有激素-誘導(dǎo)血管生成可與T3相比擬。整合素αVβ3拮抗物抑制T4結(jié)合到整合素上，重要地，防止經(jīng)MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)的T4的活化。這個(gè)功能的結(jié)果-MAPK活化-激素結(jié)合到整合素上，通過(guò)整合素αVβ3拮抗物與甲狀腺激素MAPK-依賴(lài)的前血管生成活動(dòng)的抑制一起，允許我們描述關(guān)于作為受體的整合素的碘化甲狀腺氨酸-結(jié)合部位。注意到，3-iodothyronamine，一種甲狀腺激素衍生物，最近已經(jīng)被Scanlan等弄清楚，它結(jié)合酪胺受體(TARI)，但是，有趣地是，這個(gè)類(lèi)似物的作用，與T4和T3的作用正相反。
整合素傳統(tǒng)的配位體是蛋白。小分子甲狀腺激素，也是整合素的一種配位體，這是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明也公開(kāi)了，白藜蘆醇、一種有雌激素的活動(dòng)的多酚，結(jié)合到整合素αVβ3上具有一種功能的細(xì)胞后果，即凋亡，不同于那些由甲狀腺激素的結(jié)合引起的。T4結(jié)合處得到整合素的位置位于或者接近異二聚體整合素的RGD結(jié)合溝。有可能，然而，αVβ3在蛋白質(zhì)上的其他地方結(jié)合T4，并且被tetrac或RGD占據(jù)的RGD識(shí)別位點(diǎn)-包含肽別構(gòu)阻斷T4結(jié)合位點(diǎn)或在致使T4位點(diǎn)不能利用的整合素內(nèi)部引起構(gòu)象變化。因此，由層粘連蛋白的T4的調(diào)節(jié)——星形膠質(zhì)細(xì)胞的整合素交互作用可能是激素結(jié)合到整合素的結(jié)果。因此，細(xì)胞外部甲狀腺激素通過(guò)除層粘連蛋白之外的胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的整合素αVβ3可能影響配位體，這種可能性是存在的。
機(jī)制中是非基因組的T4的活動(dòng)今年來(lái)在很多文獻(xiàn)中發(fā)表。許多這些活動(dòng)是MAPK-調(diào)節(jié)的。我們已經(jīng)指出，通過(guò)甲狀腺激素的MAPK級(jí)聯(lián)的活化中的起始步驟，包括蛋白激酶C的活化，對(duì)GTPγS和百日咳毒素是很靈敏的，表明，對(duì)于甲狀腺激素的質(zhì)膜受體是蛋白G-敏感的。注意到，通過(guò)整合素αVβ3調(diào)節(jié)的某些細(xì)胞功能已經(jīng)有人指出是蛋白質(zhì)G-調(diào)節(jié)的。例如，RGD結(jié)合區(qū)域的定點(diǎn)誘變消除了核苷酸受體P2Y2活化Go的能力，當(dāng)Gq活化時(shí)，核苷酸受體P2Y2活化Go的能力不受影響。王等人證實(shí)了整合素-關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，IAP/CD47，通過(guò)Gi-調(diào)節(jié)的MAPK活化的抑制誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移。
除由整合素αVβ3對(duì)特定的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化連接T4及其他類(lèi)似物的結(jié)合外，本發(fā)明也公開(kāi)了，經(jīng)過(guò)整合素的激素配位體對(duì)通過(guò)MAPK-依賴(lài)的血管新生的T4誘導(dǎo)來(lái)說(shuō)是必需的。在CAM模型中，T4治療后48-72小時(shí)血管顯著的生長(zhǎng)，表明T4的質(zhì)膜作用可以導(dǎo)致復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄變化。因此，細(xì)胞表面T4的激素-轉(zhuǎn)導(dǎo)的非基因組的活動(dòng)的引發(fā)——與使新血管形成達(dá)到頂點(diǎn)中激素的的基因組作用連接。甲狀腺激素的非基因組的和基因組的活動(dòng)的相互關(guān)系在前面已有描述，例如，在TRβ1的絲氨酸-142位點(diǎn)的MAPK-依賴(lài)的磷酸化作用，也就是說(shuō)，通過(guò)T4在細(xì)胞表面上引發(fā)而且通過(guò)共阻遏物蛋白和共激活劑的補(bǔ)充的TR引起脫落。直接的發(fā)明了也公開(kāi)了，通過(guò)MAPK-依賴(lài)的機(jī)制T4刺激C-6膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，也就是說(shuō)，通過(guò)RGD肽抑制，而且通過(guò)我們現(xiàn)在已知的由RGD肽抑制的方法過(guò)程，甲狀腺激素引起MCF-7細(xì)胞中核的雌激素受體(ERa)的MAPK-調(diào)節(jié)的絲氨酸-磷酸化作用。在幾個(gè)細(xì)胞系中的這些發(fā)現(xiàn)都支持整合素在細(xì)胞對(duì)甲狀腺激素的功能的應(yīng)答的參與。
作為對(duì)于整合素的交互作用的甲狀腺激素指示物的臨床意義和血管新生下游的的結(jié)果的膜受體的αVβ3的識(shí)別。例如，αVβ3在許多腫瘤中過(guò)表達(dá)并且這些過(guò)表達(dá)看起來(lái)似乎在腫瘤侵入和生長(zhǎng)中起作用。甲狀腺激素相對(duì)固定循環(huán)水平可以促進(jìn)腫瘤-關(guān)聯(lián)的血管新生。除證明這里和其它地方的CAM模型中T4的前血管生成活動(dòng)外，本發(fā)明也公開(kāi)了，人表皮微脈管內(nèi)皮細(xì)胞當(dāng)暴露于甲狀腺激素時(shí)也形成新血管。腫瘤細(xì)胞周?chē)摩罺β3拮抗物或tetrac的本地輸送可能抑制甲狀腺激素-刺激的血管新生。盡管tetrac缺乏許多甲狀腺激素的生物活動(dòng)，它可以進(jìn)入某些細(xì)胞的內(nèi)部。對(duì)非免疫原性底物(瓊脂糖或聚合體)的tetrac的錨定、或特定的RGD拮抗物排除了化合物可以穿過(guò)質(zhì)膜而仍保持這里所示的阻止T4-誘導(dǎo)的血管新生的能力的可能性。因此，用于現(xiàn)在的研究中的瓊脂糖-T4是對(duì)有特定的細(xì)胞的作用但是不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的甲狀腺激素類(lèi)似物的新家族的原型。
因此，這里的實(shí)例如作為對(duì)甲狀腺激素(左旋甲狀腺素、T4)的細(xì)胞表面受體和作為對(duì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)的T4-誘導(dǎo)的活化的起始位點(diǎn)的整合素αVβ3。αVβ3可分離地帶有高親合力的結(jié)合放射性標(biāo)記的T4；放射性配體-結(jié)合通過(guò)四碘甲腺乙酸(tetrac)、αVβ3抗體和通過(guò)整合素RGD識(shí)別位點(diǎn)肽來(lái)替換。CV-I細(xì)胞缺乏核的甲狀腺激素受體但是產(chǎn)生質(zhì)膜αVβ3；用生理學(xué)的濃度的T4活化MAPK途徑來(lái)治療這些細(xì)胞，其效果被tetrac、RGD肽和αVβ3抗體抑制。T4-結(jié)合到整合素的抑制劑也阻斷MAPK-調(diào)節(jié)的T4的前血管生成活動(dòng)。T4-誘導(dǎo)的MAPK磷酸化作用被αV和β3的siRNA基因沉默阻斷。這些發(fā)現(xiàn)表明T4結(jié)合到αVβ3附近的RGD識(shí)別位點(diǎn)，并顯示激素結(jié)合到αVβ3上有生理的結(jié)果。
甲狀腺激素、類(lèi)似物和聚合結(jié)合物在抑制血管新生中的作用 在另一部分，本發(fā)明也提供了對(duì)需要它的患者體內(nèi)抑制血管新生的組合物和方法。通過(guò)抑制血管新生來(lái)治療的疾病包括，例如，初期的或腎上腺轉(zhuǎn)移瘤和糖尿病性視網(wǎng)膜病。該組合物可以包括一有效量的TETRAC、TRIAC或mAb LM609。該組合物可以是無(wú)菌的、可注射的的形式，藥物劑型包括一抗血管生成有效量的抗血管生成物質(zhì)，該物質(zhì)在生理地和藥物地可接受的載體并選擇性地帶有一或一個(gè)以上的賦形劑中。
在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供通過(guò)給需要它的患者適量的對(duì)抑制血管新生有效的抗血管生成劑給藥來(lái)抑制血管新生從而治療疾病。
用來(lái)抑制血管新生的抗血管生成劑的實(shí)例通過(guò)本發(fā)明也已提供，包括但是不局限于，四碘甲腺乙酸(TETRAC)、三碘甲腺乙酸(TRIAC)、單克隆抗體LM609，或其結(jié)合物。這樣的抗血管生成劑可以在細(xì)胞表面起作用來(lái)抑制原血管新生劑。
腫瘤-有關(guān)的新血管生長(zhǎng) 通過(guò)抑制血管新生來(lái)治療的疾病的實(shí)例包括，但是不局限于，初期的或腎上腺轉(zhuǎn)移瘤、包括但不限于神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳癌。在這種方法中，抑制甲狀腺激素-誘導(dǎo)的血管生成作用的化合物用于抑制血管新生。這種方法的細(xì)節(jié)在實(shí)施例12中闡明。
糖尿病性視網(wǎng)膜病 通過(guò)抑制血管新生來(lái)治療的疾病包括，但是不局限于糖尿病性視網(wǎng)膜病和相關(guān)的疾病。在這種方法中，抑制甲狀腺激素-誘導(dǎo)的血管生成作用的化合物用于抑制血管新生。這種方法的細(xì)節(jié)在實(shí)施例8A和B中闡明。
大家都知道通過(guò)氧不足(勝于糖尿病)依賴(lài)alphaV(αV)整合素表達(dá)誘導(dǎo)的增殖期視網(wǎng)膜病變(E Chavakis et al.，Diabetologia 45262-267，2002)。在這當(dāng)中建議，特定的整合素阿爾法V貝塔-3(αVβ3)上甲狀腺激素的活動(dòng)在糖尿病性視網(wǎng)膜病發(fā)展的過(guò)程中是允許的。整合素αVβ3在這里作為對(duì)甲狀腺激素的細(xì)胞表面受體是確定的。甲狀腺激素、它的類(lèi)似物和聚合體結(jié)合物通過(guò)這些受體來(lái)誘導(dǎo)血管新生起作用。
療法和劑型 甲狀腺激素類(lèi)似物、多聚體形式，和衍生物可用于一種在需要的它的病人體內(nèi)促進(jìn)血管新生的方法。本方法包括一有效量的甲狀腺激素類(lèi)似物、多聚體形式和衍生物以低的每日的劑量持續(xù)一星期或一星期以上的共同給藥。本方法可能用作心肌梗死后修復(fù)心臟功能的一種治療方法。本方法可能也用于改善有冠狀動(dòng)脈疾病遭受心肌缺血或除了心臟區(qū)域的局部缺血的病人的血流，這種局部缺血的例子如，周?chē)匝芗膊。?，外周的?dòng)脈阻塞性疾病，在這個(gè)地方血流的減少是一個(gè)難題。
本化合物可以通過(guò)任何醫(yī)療地有效方法來(lái)給藥，這個(gè)有效的方法適合于給藥的本化合物，包括口的、直腸的、局部的或腸胃外的包括皮下的、肌肉的和靜脈內(nèi)的)給藥。例如，腺苷有一個(gè)很短的半衰期。為此，它是靜脈內(nèi)給藥優(yōu)選的。然而，腺苷A.sub.2拮抗劑已經(jīng)發(fā)展了，有更長(zhǎng)的半衰期并且可以通過(guò)其他的方法給藥。甲狀腺激素類(lèi)似物、多聚體形式和衍生物可以采用，例如，靜脈內(nèi)、口的、局部的、鼻內(nèi)的給藥方式來(lái)給藥。
在一些實(shí)施方案，甲狀腺激素類(lèi)似物、多聚體形式和衍生物通過(guò)不同的方法來(lái)給藥。
在刺激血管新生中所要求的有效的甲狀腺激素、它的類(lèi)似物、多聚體形式、和衍生物的用量，當(dāng)然，隨待治療的個(gè)體而變化并且最終依照醫(yī)師的指導(dǎo)。所需考慮的因素包括待治療病人的健康情況、所使用的特別的腺苷A2受體拮抗劑的功效、劑型的性質(zhì)和病人的體重。甲狀腺激素類(lèi)似物或它的多聚體形式和衍生物治療閉塞的劑量是可以提供所希望的效果的任何劑量。
如上所述的化合物是包括和對(duì)給藥的方式可接受的載體一起的甲狀腺激素類(lèi)似物或它的多聚體形式和衍生物的劑型來(lái)給藥優(yōu)選的。如為本技術(shù)領(lǐng)域那些熟練人員所知道的，可以使用包含適合于使用目的的活性成分的任何劑型或藥物輸送系統(tǒng)。為口的、直腸的、局部的或腸胃外的包括皮下的、腹膜內(nèi)的、肌肉的和靜脈內(nèi)的)給藥所適當(dāng)?shù)乃幬锏乜山邮艿妮d體是本領(lǐng)域那些熟練人員所知道的。在適合其它劑型的組分或?qū)ζ淙萜鳠o(wú)害的意義上該載體必須是藥物地可接受的。
適合于方便地腸胃外給藥的劑型包括滅菌水制備的活性化合物，它和該容器的血是優(yōu)選地等滲的。因此，這樣方便的劑型可能包含蒸餾水、5％葡萄糖蒸餾水溶液或鹽溶液。有用的劑型也包括包含配方(I)的化合物地濃溶液或固體，它用以適當(dāng)?shù)娜軇┫♂屘峁┮粋€(gè)適合上面的母本給藥的溶液。
對(duì)于腸衣給藥，化合物可以以分散的單元并入惰性載體中，例如蒴果、扁囊劑、藥片或糖錠，每個(gè)包含一種預(yù)先確定用量的活性化合物；作成粉末或顆粒；或懸浮液或溶于水溶液或非水溶液中，例如，一種糖漿、一種甘香制劑、一種乳劑或一種氣霧劑。適當(dāng)?shù)妮d體可能是淀粉或糖和包括潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑、粘合劑及其他相同性質(zhì)的物質(zhì)。
可以通過(guò)壓縮或模具，選擇性地帶有一或一個(gè)以上的附加的組分來(lái)制作藥片。壓片可以通過(guò)在一種合適的機(jī)器中以自由流動(dòng)的形式擠壓活性化合物來(lái)制備，例如，一種粉末或顆粒，選擇性地與助劑混合，例如，粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、表面活性的或分散劑。模片可以通過(guò)在一種合適的機(jī)器中將帶有任何適當(dāng)?shù)妮d體的粉末的混合物模具造型來(lái)制得。
糖漿或懸浮液可以通過(guò)添加活性化合物到濃縮的糖的水溶液中制得，例如，蔗糖，對(duì)此也可以添加任何助劑。這樣的助劑可以包括調(diào)味劑，一種延遲糖的結(jié)晶得試劑或增加任何其它組分可溶性的試劑，例如，如多元醇，例如，甘油或山梨糖醇。
對(duì)于直腸給藥的劑型可以作為帶有傳統(tǒng)的載體的栓劑來(lái)提供，例如，可可脂或Witepsol S55(德國(guó)炸藥諾貝爾化學(xué)的商標(biāo))，作為一種栓劑基質(zhì)。
做為選擇，該化合物可以以脂質(zhì)體或微球體(或微粒)方式給藥。用于制備脂質(zhì)體和微球體為病人給藥的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。U.S.Pat.No.4,789,734，通過(guò)引用由此并入本文，描述了將生物物質(zhì)裝入脂質(zhì)體膠囊的方法。本質(zhì)上，該物質(zhì)溶于水溶液，添加適當(dāng)?shù)牧字皖?lèi)脂物，如果需要再一起加入表面活性劑，根據(jù)需要對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行透析或超聲波處理。已知方法的評(píng)論參見(jiàn)G.Gregoriadis，Chapter 14，″Liposomes，″Drug Carriers inBiology and Medicine，pp.287-34 1(Academic Press，1979)。
由聚合體或蛋白形成微球體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可以對(duì)通過(guò)胃腸道直接進(jìn)入血流的路徑來(lái)修整。做為選擇，該化合物可以合并和該微球體、或微球體的合成物，植入在數(shù)天到數(shù)月時(shí)間內(nèi)來(lái)緩釋。參見(jiàn)，例如，U.S.Pat.Nos.4,906,474，4,925,673 and 3,625,214，and Jein，TIPS 19155-157(1998)，通過(guò)引證在此并入本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，甲狀腺激素類(lèi)似物或它的多聚體形式和腺苷衍生物可以配制成一種脂質(zhì)體或微粒，脂質(zhì)體或微粒大小合適能隨靜脈內(nèi)給藥進(jìn)入并固定在毛細(xì)管床。當(dāng)脂質(zhì)體或微粒進(jìn)入并固定在圍繞缺血性組織的毛細(xì)管床、該藥劑可以局部地給藥到最有效的位點(diǎn)。對(duì)目標(biāo)的缺血性組織的合適的脂質(zhì)體通常小于大約200納米，代表性地如公開(kāi)的單層微脂體，參見(jiàn)Baldeschweiler的U.S.Pat.No.5,593,688，題名為“缺血性組織的脂質(zhì)體靶向”，其內(nèi)容通過(guò)引證在此并入本文。
優(yōu)選的微粒由可生物降解的聚合物來(lái)制備，例如聚糖酯、聚交酯和其共聚物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易確定一依賴(lài)于多種因素適當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)，這些因素包括藥物釋放和要求的劑量所要求的比率。
在一個(gè)實(shí)施方案，該劑型通過(guò)導(dǎo)管直接到血管內(nèi)部給藥。例如，給藥可以通過(guò)導(dǎo)管中的洞進(jìn)行。在那些實(shí)施方案中，該劑型可以被歸入生物可降解的聚合水凝膠，例如在Hubbell等申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利No.5,410,016中所公開(kāi)的，這些實(shí)施方案中活性化合物有一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間的半衰期(大約1日到一周或以上)。這些聚合水凝膠可以輸送到組織管腔內(nèi)部并且隨著時(shí)間活性化合物釋放作為該聚合體降解物。如果需要，該聚合水凝膠可以是微?；蛑|(zhì)體，這些微?；蛑|(zhì)體中包括分散的活性化合物，以提供對(duì)活性化合物的控釋的其它機(jī)制。
該劑型可以很方便地以單位劑量形式存在并可能通過(guò)任何藥劑學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來(lái)制備。所有的方法包括促使活性化合物變成和載體聯(lián)合的步驟，它們構(gòu)成了一或一個(gè)以上的附加的組分通常，該劑型通過(guò)均一地和緊密地促使活性化合物變成和液體載體或磨碎的固體載體聯(lián)合然后，如果必要，將產(chǎn)品成型為所要求單位劑量的形式來(lái)制備。
該劑型可以選擇性地包括附加的組分，例如各式各樣的生理活性物質(zhì)例如生長(zhǎng)因子(包括TGF-β，基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF2)、上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子α和β(TGFα和β)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子/血管通透因子(VEGF/VPF))、抗病毒的、抗菌的、抗炎的、免疫抑制劑、止痛的、血管化劑、和細(xì)胞粘著分子。
除前面提到過(guò)的組分之外，該劑型可以更進(jìn)一步的包括一或一個(gè)以上的可選的藥物劑型領(lǐng)域技術(shù)人員所利用的佐劑，例如，稀釋劑、緩沖劑、調(diào)味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等等。
治療的劑型和方法 單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物的誘導(dǎo)物、或本發(fā)明的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物受體的拮抗劑可以通過(guò)適合使用特別的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物、或拮抗劑的任何路徑來(lái)給藥。因此，視情況而定，給藥可以是口的或腸胃外的，包括靜脈內(nèi)的和腹腔進(jìn)入的給藥路線。另外、給藥可以通過(guò)該單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或拮抗劑的丸藥定期的注射來(lái)進(jìn)行，或可以通過(guò)由儲(chǔ)液器的儲(chǔ)液器靜脈內(nèi)的或腹膜內(nèi)的更多的連續(xù)給藥，這個(gè)儲(chǔ)液器是外部的(例如，i.v.袋)或內(nèi)部的(例如，生物可降解植入物、或植入產(chǎn)生單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子的細(xì)胞群落)。
本發(fā)明的治療劑(即，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物受體的誘導(dǎo)物或拮抗劑)可以通過(guò)任何合適的方法提供給個(gè)體，直接地(例如，局部地，如通過(guò)注射、植入或局部的給藥到組織位點(diǎn))或系統(tǒng)地(例如，腸胃外地或口地)。在試劑可以通過(guò)腸胃外提供，例如通過(guò)靜脈內(nèi)的、皮下的、分子內(nèi)的、眼科的、腹膜內(nèi)的、肌肉的、面頰的、直腸的、陰道的、眶內(nèi)的、腦內(nèi)、顱內(nèi)的、脊柱內(nèi)的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的、腦池內(nèi)的、囊內(nèi)的、鼻內(nèi)的或通過(guò)煙霧劑給藥，優(yōu)選的試劑包含水溶液或生理地適合的懸浮液或溶液。因此，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物載體或運(yùn)輸是生理地可接受的以便除給病人輸送所要求地試劑之外，還不用考慮對(duì)病人的電解質(zhì)和/或平衡體積的不利影響。該試劑地液體培養(yǎng)基因此可以包含正常的生理鹽水(例如，9.85％NaCl水溶液，0.15M，pH7-7.4)。
帶有聚合甲狀腺激素類(lèi)似物替代區(qū)域的二聚物的聯(lián)合產(chǎn)生聚合甲狀腺激素類(lèi)似物的替代形式，它典型地比相應(yīng)成熟形式更多的可溶于生理溶液。
對(duì)腸胃外給藥有用的溶液可以通過(guò)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何方法來(lái)制備，例如，參見(jiàn)雷氏藥物大全(Gennaro，A.，ed.)，Mack Pub.，1990中的描述。本發(fā)明的治療劑的劑型可以包括，例如，聚二醇如聚乙二醇、植物油、氫化萘等等。直接給藥的劑型，特別是，可以包括甘油及其他高粘度的組合物來(lái)幫助維持試劑在要求的位點(diǎn)。生物相容的，優(yōu)選的生物可降解的聚合體包括，例如透明質(zhì)酸、膠原、磷酸三鈣、聚丁酸、丙交酯、和乙交酯聚合體和丙交酯/乙交酯共聚物、控制試劑體內(nèi)釋放可能有用的賦形劑。對(duì)這些試劑其他的可能地有用的腸胃外的輸送系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸液系統(tǒng)、和脂質(zhì)體。吸入劑給藥的劑型包含如賦形劑，例如，乳糖，或可能的水溶液包含，例如，聚氧化乙烯-9-月桂基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽、或油溶液以滴鼻劑、或作為凝膠應(yīng)用于鼻內(nèi)的形式來(lái)給藥。腸胃外給藥的劑型也可以包括對(duì)面頰給藥的甘膽酸鹽、對(duì)直腸給藥的甲氧基水楊酸甲酯、或?qū)﹃幍澜o藥的檸檬酸。對(duì)直腸給藥的栓劑也可以通過(guò)混合單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或拮抗劑來(lái)制備，這些單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或拮抗劑帶有一種無(wú)刺激性的賦形劑例如可可脂或其他的組合物，它們?cè)谑覝叵率枪腆w并且在體溫下是液體。
局部給藥到皮膚表面的劑型可以通過(guò)將單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或拮抗劑分散在皮膚病學(xué)上可接受的載體如飲料、奶油、軟膏或皂中。特別有用的是能在皮膚上形成膜或?qū)佣ㄎ粦?yīng)用并且抑制脫離的載體。對(duì)內(nèi)部組織表面局部給藥，本試劑可能分散在一種液體組織粘合劑或其他的已知的提高組織表面吸附的物質(zhì)。例如，使用羥丙基纖維素或纖維蛋白原/凝血酶溶液可能更有好處。做為選擇，可使用組織-涂層溶液，如果包含果膠的劑型。
做為選擇，這里所描述的試劑可以口服給藥。作為治療劑的蛋白口服給藥通常沒(méi)有實(shí)踐，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白容易被消化酶降解并且在它們可以吸收到血液中以前哺乳動(dòng)物消化系統(tǒng)中是酸性的。然而，典型地這里所描述的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物是酸穩(wěn)定的并且抗蛋白酶的(參見(jiàn)，例如，U.S.Pat.No.4,968,590)。另外，OP-I、已經(jīng)在乳腺提出物、初乳和57天的牛奶中識(shí)別。從乳腺提出物中純化的OP-I是形態(tài)發(fā)生活性的并且也在血液中檢測(cè)到。通過(guò)攝取奶的母性給藥，是TGF-β超家族蛋白的一種自然輸送路徑。Letterio，et al.，Science 2641936-1938(1994)報(bào)道，TGF-β存在于鼠奶中，而且放射性同位素標(biāo)記的TGF-β通過(guò)幼年哺乳動(dòng)物胃腸的粘膜來(lái)吸收。標(biāo)簽的、攝取的TGF-β迅速地在幼體身體組織中以完整的形式出現(xiàn)，這些組織包括肺、心臟和肝。最終，可溶解的形式的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物，例如，成熟期有或者沒(méi)有抗氧化劑或抗炎劑的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物。這些發(fā)現(xiàn)，和在下面實(shí)例中那些公開(kāi)的，表明口服和腸胃外給藥是對(duì)包括單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子的TGF-β超家族蛋白給藥到個(gè)體的辦法可行的。另外，典型地這里所描述的某些單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子的成熟形式是微溶的，奶(并且乳腺提出物和初乳)中發(fā)現(xiàn)的單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子形式是易溶的，可能通過(guò)帶有部分或所有的表達(dá)的全長(zhǎng)的多肽序列的替代域的成熟的、形態(tài)發(fā)生的-活性形式的聯(lián)合和/或通過(guò)帶有一或一個(gè)以上的奶組分的聯(lián)合。因此，在這里提供的化合物也與能提高它們?cè)隗w外或體內(nèi)的溶解度的分子有關(guān)。
單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物打算用于對(duì)CNS異常的治療劑時(shí)，一增加的問(wèn)題必須解決克服血腦屏障，腦毛細(xì)血管壁結(jié)構(gòu)有效地篩除所有除了存在于血中所選擇的種類(lèi)物質(zhì)，阻止他們進(jìn)入腦中的途徑。血腦屏障可以通過(guò)向腦中直接輸注聚合甲狀腺激素、或通過(guò)鼻內(nèi)給藥或適合于吸收劑型的吸入劑和通過(guò)嗅覺(jué)神經(jīng)元的逆行運(yùn)輸來(lái)有效地繞過(guò)。做為選擇，聚合甲狀腺激素類(lèi)似物可以修飾來(lái)提高它穿過(guò)血腦屏障的運(yùn)輸。例如，單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物的平頭形式或單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物——刺激劑可以非常成功的。做為選擇，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)方法，這里所提供的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或拮抗劑可以衍生或共軛到親脂性的部分或積極運(yùn)輸穿過(guò)血腦屏障的物質(zhì)上。例如，參見(jiàn)，Pardridge，Endocrine Reviews 7314-330(1986)and U.S.Pat.No.4,801,575。
這里提供的化合物也可能與能靶向結(jié)合單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或拮抗劑到要求的組織有關(guān)。例如，可以使用那些與特定的帶有所要求組織的細(xì)胞表面分子互相作用的抗體、抗體碎片、其他的結(jié)合蛋白?？梢栽O(shè)計(jì)有用的靶向分子，例如，使用U.S.Pat.No.5,091,513中公開(kāi)的單鏈結(jié)合位點(diǎn)技術(shù)。靶向分子可以是共價(jià)的或非共價(jià)的與單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或拮抗劑相關(guān)聯(lián)。
作為一個(gè)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，配制的組合物包含治療-有效的量的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或它的拮抗劑。也就是說(shuō)，它們包含一數(shù)量，這個(gè)數(shù)量提供該試劑的適當(dāng)?shù)臐舛葋?lái)暫時(shí)死亡影響神經(jīng)系統(tǒng)組織使其足夠刺激削弱的中央的或外周神經(jīng)系統(tǒng)功能的可檢測(cè)的恢復(fù)，直到和包括它的完全的恢復(fù)。作為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員高興的是，這些濃度的變化依賴(lài)許多因子，包括選擇的試劑的生物學(xué)的功效、該特定的試劑的化學(xué)特性(例如，疏水性)、它的劑型，包括一種帶有一或一個(gè)以上的賦形劑的混合物、給藥途經(jīng)、和治療前景，包括不管活性成分直接給藥到組織位點(diǎn)、或系統(tǒng)地給藥。給藥優(yōu)選的劑量也可能依靠可變量如疾病或損傷組織的健康狀況、和特定的哺乳動(dòng)物的全面健康狀態(tài)。作為一般的物質(zhì)，0.00001-1000mg的單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子的單一的、每日的、每?jī)芍芑蛎恐艿膭┝吭诳寡趸瘎┖?或消炎劑存在的情況下是充足的，優(yōu)選0.0001-100毫克，并且更優(yōu)選0.001到10毫克。做為選擇，0.01-1000.mu.g/公斤體重的單一的、每日的、每?jī)芍艿幕蛎恐艿膭┝?，更?yōu)選的0.01-10mg/公斤體重，可以有利地使用。如特定的環(huán)境下所要求的或考慮適當(dāng)?shù)模峁┑挠行┝靠梢砸詥我粍┝炕蚨啻?兩個(gè)或更多)分期的劑量。一種快速濃注或擴(kuò)散輸注劑型能被使用。如果希望促進(jìn)重復(fù)或頻繁的輸注，半永久性的擴(kuò)張(例如靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、腦池內(nèi)的或囊內(nèi)的)的的植入可能是可行的。
本發(fā)明的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物、誘導(dǎo)物或拮抗劑可以、當(dāng)然，單獨(dú)的給藥或和聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的已知的治療這里所描述的的疾病中有益的其他分子一起給藥。例如，各式各樣的眾所周知的生長(zhǎng)因子、激素、酶、治療劑組合物、抗生素、或其他的生理活性試劑也可以和單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物一起給藥。因此，各式各樣的已知的生長(zhǎng)因子如NGF、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF-α、和TGF-β，又如酶、酶抑制劑、抗氧化劑、消炎劑、自由基清除劑、抗生素和/或趨化/趨化因子，可以歸入提供的單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子結(jié)合在一起的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物劑型。
材料和方法 試劑所有的試劑是化學(xué)純級(jí)別，購(gòu)自Sigma化學(xué)試劑公司(St.Louis，MO)或通過(guò)VWR科學(xué)(Bridgeport，NJ)。醋酸可的松、牛血清白蛋白BSA)和明膠溶液(來(lái)自牛皮的2％類(lèi)型B)購(gòu)自Sigma化學(xué)試劑公司。授精雞蛋購(gòu)自Charles River實(shí)驗(yàn)室、SPAFAS鳥(niǎo)類(lèi)的產(chǎn)品和維護(hù)North Franklin，CT)。T4、3，5，3′-三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)、四碘甲腺乙酸t(yī)etrac)、T4-瓊脂糖、6-N-丙基-2-硫尿嘧啶(PTU)、包含RGD的肽包含RGE的肽從Sigma獲得；PD 98059購(gòu)自Calbiochem；CGP41251是NovartisPharma(巴塞爾、瑞士)饋贈(zèng)的。多克隆的抗FGF2和單克隆抗β-肌動(dòng)蛋白是從圣克魯斯廠生物技術(shù)公司獲得和人重組體FGF2和VEGF來(lái)自Invitrogen公司。磷酸化ERK1/2的多克隆抗體來(lái)自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，山羊抗兔IgG來(lái)自DAKO。對(duì)αVβ3(SC73 12)和α-微管蛋白(E9)的單克隆抗體購(gòu)自圣克魯斯廠生物技術(shù)公司(圣克魯斯廠，CA)。正常的老鼠IgG和HRP-共軛的山羊抗兔Ig購(gòu)自Dako Cytomation(Carpinteria，CA)。對(duì)αVβ3(LM609)和αVβ5(P1F6)的單克隆抗體，又和純化αVβ3，購(gòu)買(mǎi)chemicon(Temecula、CA)。L-[125I]-T4(比放射性，1250μCi/μg)從Perkin Elmer生命科學(xué)(波士頓、MA)處獲得。
血管新生的絨毛尿囊膜(CAM)模型體內(nèi)新血管形成通過(guò)以前所描述的方法來(lái)檢測(cè)。9-12十日齡的雞胚購(gòu)自SPAFAS(Preston、CT)，37℃、相對(duì)濕度55％條件下孵化。用皮下注射器針頭在殼上隱藏氣囊上制造一個(gè)小孔，第二個(gè)孔直接在通過(guò)蠟燭鑒別得胚胎的薄膜得無(wú)血管部分的蛋的寬邊制得。一個(gè)漏氣囊在第一個(gè)洞處通過(guò)使用負(fù)壓在第二個(gè)洞下面創(chuàng)造，引起CAM從殼中分離。用一種小的手工制作的砂輪在掉下的CAM切出大約1.0平方厘米的口(Dremel，Emerson Electric Co分離)、允許在下面的CAM直接存取。FGF2(1μg/毫升)用作標(biāo)準(zhǔn)前血管生成試劑來(lái)誘導(dǎo)十日齡胚胎的CAM上的新血管支流。1號(hào)濾紙的無(wú)菌圓片用3毫克/毫升醋酸可的松和1mmol/L PTU并在無(wú)菌條件下風(fēng)干進(jìn)行預(yù)處理。然后將甲狀腺激素、激素類(lèi)似物、FGF2或?qū)φ杖軇?、和抑制劑?yīng)用于圓片和允許干燥的圓片。然后將圓片懸浮在PBS中并放置在生長(zhǎng)的CAM上。用T4或FGF2處理的過(guò)濾器放在3天孵化的第一天上，用對(duì)FGF2的抗體加入30分鐘后選擇樣品作為指示。24小時(shí)時(shí)，、MAPK級(jí)聯(lián)抑制劑PD 98059通過(guò)過(guò)濾圓片也全加到CAM上。
CAM部分的顯微分析37℃相對(duì)濕度55％條件下孵化3日，直接從控制和處理的CAM樣品中切除在每個(gè)過(guò)濾圓片下面的CAM組織。用PBS洗滌組織3次，放入35毫米皮氏培養(yǎng)皿(NalgeNunc)，在SV6立體顯微鏡(Zeiss)下放大50倍檢驗(yàn)。暴露于過(guò)濾器的CAM部分的數(shù)字成像使用一個(gè)3電荷耦合器彩色攝像機(jī)系統(tǒng)(東芝)來(lái)收集并用圖像前處理軟件(媒體控制學(xué))來(lái)分析。計(jì)數(shù)包含等于每個(gè)過(guò)濾圓片面積的圓形區(qū)域的血管分支點(diǎn)數(shù)目。在每個(gè)CAM制備中計(jì)入圖像，從8到10個(gè)CAM制備中發(fā)現(xiàn)來(lái)分析每種治療的疾病(甲狀腺激素或類(lèi)似物、FGF2、FGF2抗體、PD 98059)。另外，每個(gè)實(shí)驗(yàn)執(zhí)行3次。產(chǎn)生的血管新生指數(shù)是每套樣品種新分支點(diǎn)的平均±SEM。
FGF2測(cè)定ECV304內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充10％胎兒牛血清的M1 99培養(yǎng)基中。ECV304細(xì)胞(106細(xì)胞)鋪于0.2％凝膠-涂層的24孔板在完全培養(yǎng)基中過(guò)夜，然后將細(xì)胞用游離血清培養(yǎng)基洗滌并用T4和T3處理作為指示。72小時(shí)后，收獲上層清液使用商業(yè)ELISA體系(R&D系統(tǒng))對(duì)沒(méi)有稀釋的FGF進(jìn)行測(cè)定。
MAPK活化ECV304內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于0.25％激素的血清13的M199培養(yǎng)基2日耗盡激素。然后用T4(10-7mol/L)處理細(xì)胞15分鐘到6小時(shí)。在另外的實(shí)驗(yàn)中，用T4或者FGF2或用PD98059或CGP41251存在時(shí)用T4處理細(xì)胞。核的碎片通過(guò)前面我們報(bào)道的方法從所有樣品中預(yù)先清除，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并且轉(zhuǎn)入薄膜用對(duì)磷酸化ERK1/2的抗體來(lái)免疫印跡。核磷酸化的ERK1/2的出現(xiàn)表明通過(guò)T4這些MAPK同種型的活化。
反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)10cm平皿中匯合的ECV304細(xì)胞用T4(10-7mol/L)6到48小時(shí)并且使用胍鹽異硫氰酸鹽提取總RNA(Biotecx實(shí)驗(yàn)室)。使用Access RT-PCR系統(tǒng)(Promega)取RNA(1μg)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。在48℃45分鐘然后94℃變性2分鐘，總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。第二條鏈合成和PCR擴(kuò)增執(zhí)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為94℃變性30秒、60℃退火60秒、并且68℃延伸120秒，在所有循環(huán)完成后再在68℃下延伸7分鐘。對(duì)FGF2的PCR引物如下FGF2正義鏈5′-TGGTATGTGGCACTGAAACG-3′(SEQ ID NO2)；FGF2反義鏈5′-CTCAATGACCTGGCGAAGAC-3′(SEQ IDNO2)；PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是734bp。對(duì)GAPDH引物包括正義鏈5′-AAGGTCATCCCTGAGCTGAACG 3′(SEQIDNO3)、和反義鏈5′-GGGTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3′(SEQ IDNO4)；PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是218bp。RT-PCR的產(chǎn)物通過(guò)1.5％瓊脂糖凝膠電泳并加入溴化乙錠使其可見(jiàn)來(lái)分離。凝膠的目標(biāo)條帶使用Lablmage軟件(Kapelan)來(lái)定量，并且FGF2/GAPDH X10的值適合于每次時(shí)間點(diǎn)。
統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)單因子變異數(shù)分析(變量分析)比較實(shí)驗(yàn)組和各個(gè)控制組來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基于此計(jì)算得到的統(tǒng)計(jì)顯著性P＜0.05。
Matrigel FGF2或者老鼠中癌細(xì)胞系植入物中的體內(nèi)血管新生體內(nèi)鼠的血管新生模型鼠的matrigel模型按照以前所描述的方法實(shí)施(Grant等，1991；Okada等，1995)并且在我們的實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施(Powel等，2000)。簡(jiǎn)短地，生長(zhǎng)因子游離matrigel(Becton Dickinson，Bedford MA)在4℃置于冰上解凍過(guò)夜。分裝的matrigel放在冷的聚丙烯管中并且將FGF2、甲狀腺激素類(lèi)似物或者癌細(xì)胞(1×106細(xì)胞)加入matrigel。將帶有鹽水、FGF2、甲狀腺激素類(lèi)似物或者癌細(xì)胞的matrigel以不同的劑量皮下注射。對(duì)照的和實(shí)驗(yàn)的凝膠植入物放入一個(gè)含有0.5毫升的細(xì)胞裂解液(Sigma，St.Louis，MO)的微型離心管中并且用杵壓碎，將該管在4℃孵化過(guò)夜并且在第二天1500g離心15分鐘。對(duì)每個(gè)樣品將200μl分裝的細(xì)胞裂解液加入到1.3毫升的Drabkin試劑溶液(Sigma，St.Louis，MO)。此溶液在540納米下用分光光度計(jì)分析。光的吸收與包含于樣品中的血紅蛋白的數(shù)量成比例。
腫瘤植入物的腫瘤生長(zhǎng)和代謝-雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型本方案在前面已描述(Kim等，2001)。簡(jiǎn)短地、1×107腫瘤細(xì)胞放在每個(gè)CAM表面(7日齡胚胎)孵化一個(gè)星期。切除產(chǎn)生的腫瘤并切成50毫克的碎片。這些碎片放在增加的10CAM/群上并在隨后的幾天全部用25μl溶于PBS的化合物(A-D)來(lái)處理。七天后，將腫瘤從蛋中切除，腫瘤重量將確定每個(gè)CAM。圖8是一個(gè)簡(jiǎn)圖，它表明CAM中涉及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)模型的步驟。
關(guān)于腫瘤生長(zhǎng)率、腫瘤血管新生、和癌細(xì)胞系的腫瘤代謝的TETRAC、TRIAC、和甲狀腺激素拮抗物的作用可以確定。
老鼠的腫瘤生長(zhǎng)和代謝-腫瘤異種移植模型該模型的描述參見(jiàn)我們的出版物，Kerr et al.，2000；Van Waes et al.，2000；AIi et al.，2001；and AIi et al.，2001，這些出版物中的每一個(gè)通過(guò)引用在這里全面地并入全文?？梢源_定和比較對(duì)TETRAC、TRIAC、及其他甲狀腺激素拮抗物在不同的劑量和抗不同腫瘤類(lèi)型的抗腫瘤效果。
腫瘤生長(zhǎng)和代謝-代謝的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮撃Ｐ偷拿枋鰠⒁?jiàn)我們近期的出版物(Mousa，2002；Amirkhosravi et al.，2003a and 2003b，這些出版物中的每一個(gè)通過(guò)引用在這里全面地并入全文)。簡(jiǎn)短地，B16鼠的惡性黑色素瘤細(xì)胞(ATCC，Rockville，MD)及其他腫瘤系在補(bǔ)充有10％胎牛血清、青霉素和鏈霉素(Sigma，St.Louis，MO)的RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)到70％克隆率并用胰蛋白酶-EDTA(Sigma)收獲，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次。細(xì)胞在PBS中重懸浮，為了代謝實(shí)驗(yàn)使其濃度在2.0×105細(xì)胞/毫升。動(dòng)物稱(chēng)重為18-21克的C57/BL6鼠(Harlan，印第安納波利斯，印地安那州)將用于這些研究。所有程序與IACUC和實(shí)驗(yàn)指南一致?？梢源_定和比較對(duì)TETRAC、TRIAC、及其他甲狀腺激素拮抗物在不同的劑量和抗不同的腫瘤類(lèi)型的抗腫瘤效果。
關(guān)于血管新生的甲狀腺激素類(lèi)似物的作用。
T4誘導(dǎo)CAM模型中血管新生指數(shù)(基礎(chǔ)上的成倍增加)顯著的增加。同通過(guò)1μg的FGF2的血管新生指數(shù)中2-3倍增加來(lái)說(shuō)，0.001-1.0μM的T3或者0.1-1.0μM的T4在獲得最大效果在血管新生指數(shù)產(chǎn)生2-2.5倍的增加。(表格1和圖1a和1b)。T4促進(jìn)血管新生的效果(血管新生指數(shù)的2-2.5倍增加)是在有或沒(méi)有PTU存在的情況下達(dá)到的，其中PTU抑制T4到T3的轉(zhuǎn)化。在CAM模型中T3本身(91-100nM)誘導(dǎo)的有效的前血管生成作用。T4瓊脂糖產(chǎn)生同通過(guò)T4獲得的類(lèi)似的前血管新生作用。T4或T4-瓊脂糖的前血管生成作用通過(guò)TETRAC或TRIAC可以100％阻斷。
通過(guò)次最大濃度的T4的FGF2的前血管生成活動(dòng)的增強(qiáng)。
次最大濃度處T4和FGF2的結(jié)合引起血管新生指數(shù)中一附加的增長(zhǎng)直到像FGF2或T4的最大前血管新生效果相同的水平(圖2)。
關(guān)于CAM模型中T4和FGf2的前血管生成活動(dòng)的MAPK級(jí)聯(lián)抑制劑的效果。T4或FGF2的前血管新生效果通過(guò)0.8-8μg的PD98059完全阻斷(圖3)。
關(guān)于CAM模型中T4和FGf2的前血管生成活動(dòng)的特定的整合素αVβ3拮抗物的效果。T4或FGF2的前血管新生效果通過(guò)10μg的特定的單克隆抗體LM609完全被阻斷(圖4a和4b)。
CAM測(cè)定已經(jīng)用于證實(shí)各種各樣的生長(zhǎng)因子及其他血管新生的助催化劑或抑制劑的血管生成活動(dòng)。在目前的研究中，生理學(xué)的濃度的T4被證明有前血管生成，與FGF2類(lèi)似的活動(dòng)。PTU的存在減低了T4的效果，表明T4的去碘化作用產(chǎn)生T3在這個(gè)模型中不是先決條件。因?yàn)樵谶@個(gè)模型中新血管的出現(xiàn)需要幾日，我們假定甲狀腺激素的效果完全取決于該核的受體對(duì)甲狀腺激素(TR)的交互作用。那些需要核內(nèi)的TR與自然的配位體、T3的絡(luò)合的碘化甲狀腺氨酸的活動(dòng)，通過(guò)定義是基因組的，并在基因表達(dá)中達(dá)到頂點(diǎn)。另一方面，這個(gè)模型系統(tǒng)對(duì)T4而不是T3的優(yōu)選的應(yīng)答，TR的自然的配位體增加了血管新生可能通過(guò)T4在質(zhì)膜上非基因組的引發(fā)并達(dá)到那些需要基因轉(zhuǎn)錄的效果頂點(diǎn)的可能性。已經(jīng)廣泛描述的T4的非基因組活動(dòng)，通常在質(zhì)膜上引發(fā)，并可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)。它們不需要碘化甲狀腺氨酸和TR的核內(nèi)的配體結(jié)合，但是可以協(xié)調(diào)或調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄。也已被很好的描述的類(lèi)固醇的非基因組活動(dòng)并已知道協(xié)調(diào)類(lèi)固醇或其他的化合物的基因組活動(dòng)。用T4和tetrac或用瓊脂糖-T4進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明實(shí)際上T4的前血管生成效果很可能是在質(zhì)膜上引發(fā)的。我們?cè)趧e處已指出tetrac阻斷T4的膜-引發(fā)的效果，但是它本身不活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，它是對(duì)甲狀腺激素的非基因組活動(dòng)的一個(gè)探針。瓊脂糖-T4被認(rèn)為不能到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部入口并被我們和他人用來(lái)檢驗(yàn)對(duì)激素可能的細(xì)胞表面-引發(fā)的活動(dòng)模型。
這些結(jié)果表明通過(guò)甲狀腺激素MAPK活化的另一結(jié)果是新血管的生長(zhǎng)。后者被非基因組的引發(fā)，但是理所當(dāng)然需要一個(gè)必然的復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄程序。
甲狀腺激素的環(huán)境濃度相對(duì)是穩(wěn)定的。CAM模型，當(dāng)我們檢驗(yàn)它的時(shí)候，是thyroprival和因此可以被認(rèn)為是一個(gè)體系，這個(gè)體系不能復(fù)制完整的有機(jī)體。我們認(rèn)為T(mén)4的循環(huán)水平和各種各樣的其他的調(diào)節(jié)器來(lái)用于調(diào)整血管對(duì)內(nèi)生的血管生成因子，如VEGF和FGF2的敏感性。
三維血管新生測(cè)定 培養(yǎng)于涂有纖維蛋白的微載體珠上的人表皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外三維發(fā)芽的血管新生用白明膠-涂層的Cytodex-3珠以每珠40個(gè)細(xì)胞(24孔板，150-200珠每孔)的比率和HDMEC(路徑5-10)混合在一塊，用5毫升EBM+15％正常人血清懸浮，，前4小時(shí)每小時(shí)輕輕的混合，然后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。次日，加入10毫升新鮮的EBM+5％HS，將此混合物繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，檢查EC-珠的培養(yǎng)；然后加入500ulPBS到24孔板中的每個(gè)孔，再將100ul的EC-珠培養(yǎng)液加到PBS中。計(jì)數(shù)珠的數(shù)目，并計(jì)算EC/珠的濃度。
準(zhǔn)備有或者沒(méi)有血管新生因子或試驗(yàn)因子的EBM培養(yǎng)基中的纖維蛋白原溶液(1毫克/毫升)。陽(yáng)性對(duì)照，使用50ng/mlVEGF+25ng/ml FGF2。EC-珠用EBM培養(yǎng)基洗滌兩次，并將EC-珠加到纖維蛋白原溶液中。對(duì)每種疾病實(shí)驗(yàn)分三組進(jìn)行。EC-珠輕輕地混入纖維蛋白原溶液中，并將2.5ul人凝血酶(0.05U/ul)加入到1毫升纖維蛋白原溶液中；立即向24孔板每個(gè)孔中加入300ul混合溶液。纖維蛋白原溶液在5-10分鐘內(nèi)聚合；20分鐘后，我們添加EBM+20％正常人血清+10ug/ml抑蛋白酶肽。平皿置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)HDMEC大約需要花費(fèi)24-48小時(shí)來(lái)侵入纖維蛋白凝膠和形成的管。
對(duì)以前設(shè)計(jì)用來(lái)研究在牛纖維蛋白凝膠中牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成行為的體外血管新生測(cè)定的微載體(Nehls andDrenckhahn，1995a，b)進(jìn)行修飾用來(lái)研究三維ECM環(huán)境中人微脈管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生。(圖1和2)。簡(jiǎn)短地，如前面所描述的(Feng等，1999)分離到的人纖維蛋白酶原，溶于M199培養(yǎng)基中，濃度為1mg/ml(pH7.4)并用0.22微孔過(guò)濾器過(guò)濾滅菌。1.5等滲透壓的1.5mg/ml膠原溶液通過(guò)無(wú)菌的Vitrogen 100混入5×M199培養(yǎng)基和蒸餾水中制得。在某些實(shí)驗(yàn)中，生長(zhǎng)因子和ECM蛋白(如VEGF、bFGF、PDGF-BB、血清、白明膠和粘連蛋白)加入到纖維蛋白原或膠原溶液中。隨后，EC-珠-膠原或EC-珠-纖維蛋白原懸浮液(500EC-珠/毫升)加到24孔板上，每孔300ul。EC-珠-膠原在37℃培養(yǎng)形成凝膠。加入凝血酶至終濃度為0.5U/毫升后，EC-珠-纖維蛋白培養(yǎng)物在室溫下不到5分鐘產(chǎn)生凝膠。凝膠化后，往每個(gè)孔中加入1毫升新鮮的測(cè)定培養(yǎng)基(對(duì)HDMEC補(bǔ)充有20％正常人血清的EBM或補(bǔ)充有10％胎牛血清的EBM)。血管生成應(yīng)答通過(guò)視頻圖像俘獲可以可見(jiàn)的監(jiān)視并記錄。特別地，用配備有Nikon NP-2恒溫器和Sheldon#2004二氧化碳流體混合器的怛溫培養(yǎng)室的Nikon Diaphot-TMD倒置顯微鏡(Nikon公司；Melville，NY)，可以觀察和記錄毛細(xì)血管發(fā)芽形成。該顯微鏡直接連接到由Dage-MTI CCD-72S攝像機(jī)和連接到Macintosh G3電腦的索尼12″PVM-122屏幕顯示器組成的視頻系統(tǒng)。使用Adobe Photoshop以各種放大倍數(shù)捕獲圖像。關(guān)于發(fā)芽的血管新生的血管生成因子的效果通過(guò)測(cè)定帶有毛細(xì)管發(fā)芽的EC-珠的數(shù)目和百分比來(lái)可見(jiàn)地定量。計(jì)數(shù)每個(gè)試驗(yàn)條件下三組孔中每個(gè)孔中地100個(gè)珠(五到六個(gè)隨機(jī)的低倍視野)。所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。
細(xì)胞培養(yǎng)。
非洲綠猴成纖維細(xì)胞系，CV-I(ATCC、Manassas，VA)，它缺乏對(duì)甲狀腺激素的核受體，以5000細(xì)胞/平方厘米平鋪并維持在補(bǔ)充有10％(v/v)加熱鈍化的FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中。所有的培養(yǎng)試劑購(gòu)自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)。在5％CO2、37℃加濕室中培養(yǎng)。每三天更換一次培養(yǎng)基并在80％克隆率時(shí)傳代。對(duì)實(shí)驗(yàn)的處理，將細(xì)胞鋪在10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿(康寧公司，康寧，NY)并允許在包含10％FBS的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24小時(shí)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞兩次并補(bǔ)充補(bǔ)充有青霉素、鏈霉素和HEPES的游離血清的DMEM。在游離血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后，細(xì)胞用載體控制(帶有0.4％聚乙二醇(v/v)的終濃度為0.004 N KOH)或T4(終濃度為10-7M)處理30分鐘；然后收集培養(yǎng)基并通過(guò)酶免疫測(cè)定來(lái)確定游離T4水平。有10-7M總T4的培養(yǎng)物中有10-9到10-10游離的T4。隨后的處理，如以前所描述的方法來(lái)收獲細(xì)胞和制備核內(nèi)蛋白。
用siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
將CV-I細(xì)胞鋪于10厘米平板上(150,000細(xì)胞/平板)并在補(bǔ)充有10％FBS的DMEM中培養(yǎng)24小時(shí)。在OPTI MEM(Ambion，Austin，TX)中漂洗細(xì)胞并根據(jù)廠商的指導(dǎo)使用siPORT用siRNA(100nM最終濃度)轉(zhuǎn)染到αV、β3、或一塊的αV和β3。CV-I細(xì)胞用擾亂siRNA轉(zhuǎn)染，作為一個(gè)陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后四小時(shí)，加入7毫升包含10％FBS的培養(yǎng)基到平板中并允許培養(yǎng)過(guò)夜。然后用PBS漂洗細(xì)胞并在用T4處理前放入釋放血清DMEM中48小時(shí)。
RT-PCR的RNA分離 根據(jù)廠商的指導(dǎo)使用購(gòu)自Qiagen(巴倫西亞，美國(guó))的RKeasy試劑盒從轉(zhuǎn)染后的72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物中提取總RNA。根據(jù)廠商的指導(dǎo)使用Access RT-PCR系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)對(duì)二百納克總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。基于發(fā)表的種特異性的序列的引物αV(登記號(hào)NM-002210)F-5′-TGGGATTGTGGAAGGAG和R-51-AAATCCCTGTCCATCAGCAT(319bp產(chǎn)物)，β3(NM000212)F-5′-GTGTGAGTGCTCAGAGGAG和R-5′-CTGACTCAATCTCGTCACGG(515bp產(chǎn)物)，和GAPDH(AF261085)F-5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT和R-51-TGAGCTTGACMGTGGTCG(212bp產(chǎn)物)。在TECHNE公司(Burlington，NJ)的Flexigene熱循環(huán)儀中進(jìn)行RT-PCR。95℃培育2分鐘后，對(duì)下面的步驟進(jìn)行25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘、57℃退火1分鐘、68℃延伸1分鐘，并進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用溴化乙錠著色在1.8％(w/v)瓊脂糖凝膠上可見(jiàn)。
Western印跡。
分裝的核內(nèi)蛋白(10μg/條帶)混有Laemmli樣品緩沖液并通過(guò)SDS-PAGE(10％分離膠)分離然后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。用5％脫脂奶在包含1％Tween-20(TBST)的Tris緩沖液30分鐘阻斷后，用1∶1000稀釋的對(duì)磷酸化p44/42 MAP激酶(細(xì)胞信號(hào)技術(shù)，Beverly，MA)的單克隆抗體和膜在有5％牛奶的TBST中4℃培養(yǎng)過(guò)夜。該膜在TBST中洗滌3×5分鐘，并采用化學(xué)發(fā)光(ECL，Amersham)來(lái)檢測(cè)免疫活性蛋白。譜帶強(qiáng)度由使用VersaDoc 5000成像系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules CA)來(lái)確定。
放射性配體結(jié)合的檢測(cè)。
2μg純化的αVβ3與標(biāo)明濃度的試驗(yàn)化合物混合并允許在室溫下培養(yǎng)30分鐘。然后加入[125I]-T4(2μCi)，該混合物允許在20℃下再培養(yǎng)30分鐘。將樣品樣品緩沖液(50％甘油、0.1MTris-HCl、pH6.8、和溴酚藍(lán))混合，于冷的環(huán)境中在5％基礎(chǔ)-自然的凝膠上45mA跑膠24小時(shí)。拆開(kāi)儀器并把凝膠放在濾紙上，包入塑料包中，暴露顯影。條帶強(qiáng)度使用VersaDoc 5000成像系統(tǒng)來(lái)確定。
雞胚絨毛尿囊膜(CAM)測(cè)定(αVβ3的研究)。
十日齡雞胚購(gòu)自￡tom SPAFAS(Preston，CT)并在37℃、相對(duì)濕度55％條件下培養(yǎng)。用皮下注射器針頭在蛋的平頭做一個(gè)小孔，第二個(gè)孔在該蛋的寬邊，直接在胚胎膜無(wú)血管部分獲得。從第一個(gè)孔輕微的吸取替換氣囊并使CAM脫離蛋殼。使用一個(gè)Dremel模型手工制作的鉆，在漏氣的囊上的蛋殼中切開(kāi)一個(gè)大約1.0平方厘米的口，從而可以得到CAM。1號(hào)濾紙的無(wú)菌圓片(Whatman、Clifton，NJ)用3mg/ml醋酸可的松和1mM PTU預(yù)處理并在無(wú)菌情況下風(fēng)干。甲狀腺激素、對(duì)照溶劑和mAb LM609被用于該圓片上，隨后進(jìn)行干燥。然后將該圓片懸浮在PBS中，并放置在生長(zhǎng)的CAM上。培養(yǎng)3天后，切除過(guò)濾圓片下面的CAM并用PBS漂洗。每個(gè)膜置于35毫米皮氏培養(yǎng)皿中并在SV6立體顯微鏡下以50×放大倍數(shù)檢查。采用圖像前處理軟件(Mediacybemetics)捕獲和分析數(shù)字圖像。計(jì)數(shù)包含等同于過(guò)濾圓片面積的圓形區(qū)域的血管分支點(diǎn)的數(shù)目。對(duì)為了每個(gè)治療情況的8-10CAM標(biāo)本的每一個(gè)圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)，另外，每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。
本發(fā)明將在下面的非限制的實(shí)例中進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例 實(shí)施例1 甲狀腺激素在血管生成中的作用如圖IA所示和圖IB的概括，L-T4和L-T3都能在CAM試驗(yàn)中提高血管生成。T4在介質(zhì)中的生理總濃度為0.1μmol/L時(shí)，能夠?qū)⒀苤Я餍纬商岣?.5倍(PO.001)。T3(1nmol/L)也能刺激血管生成提高2倍。通過(guò)發(fā)現(xiàn)脫碘酶抑制劑PTU對(duì)T4造成的血管生成沒(méi)有抑制效果，可以排除由于5′-單脫碘酶將T4轉(zhuǎn)化為T(mén)3造成的T4是唯一有效的可能性。將PTU應(yīng)用于CAM模型中使用的所有過(guò)濾片。因此，在早已被標(biāo)準(zhǔn)化用于生長(zhǎng)因子試驗(yàn)的CAM模型中，T4和T3促進(jìn)新血管支流的形成。
實(shí)施例2. T4-瓊脂糖和Tetrac先前已經(jīng)顯示出T4-瓊脂糖能夠用和T4一樣的方法刺激起始于原生質(zhì)膜上的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而且T4和T4-瓊脂糖的作用被脫氨基碘化甲狀腺氨酸同系物阻斷，其中，已知脫氨基碘化甲狀腺氨酸同系物tetrac能夠抑制T4與原生質(zhì)膜的結(jié)合。在CAM模型中，tetrac的加入(0.1μmol/L)能夠抑制T4的作用(圖2A)，但單獨(dú)使用tetrac對(duì)血管生成沒(méi)有影響(圖2C)。當(dāng)以0.1μmol/L的激素濃度添加時(shí)，T4-瓊脂糖的作用比得上T4在CAM模型中的作用(圖2B)，且T4-瓊脂糖的作用也被tetrac的作用抑制(圖2B；概括在2C中)。
實(shí)施例3.次最大濃度的T4增強(qiáng)FGF2的前血管生成活性 血管生成是一種復(fù)雜的過(guò)程，通常需要多肽生長(zhǎng)因子的參與，CAM試驗(yàn)需要至少48小時(shí)才能表現(xiàn)出血管生長(zhǎng)；因此，在此模型中的甲狀腺激素的表觀原生質(zhì)膜作用很可能導(dǎo)致一種對(duì)于激素復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，已經(jīng)確定無(wú)論FGF2是否包含于激素反應(yīng)中且無(wú)論激素是否可能加強(qiáng)次生理水平的生長(zhǎng)因子的作用。T4(0.05μmol/L)和FGF2(0.5μg/mL)分別刺激血管生成到適當(dāng)?shù)某潭?圖3)。通過(guò)次生理濃度的T4，能夠?qū)⒋巫畲鬂舛鹊腇GF2的血管生成作用提高到單獨(dú)使用1.0μgFGF2才能達(dá)到的水平。因此，次最大激素和生長(zhǎng)因子濃度的作用好象是一種添加劑。為了更準(zhǔn)確的定義FGF2在甲狀腺激素刺激中的作用，向用FGF2或者T4處理過(guò)的過(guò)濾器中加入一種FGF2的多克隆抗體，72小時(shí)之后測(cè)量血管生成。圖4顯示，在沒(méi)有外生FGF2的情況下，F(xiàn)GF2抗體抑制FGF2或T4刺激的血管生成，暗示FGF2表達(dá)能夠調(diào)節(jié)T4在CAM試驗(yàn)中的作用。對(duì)照物IgG抗體在CAM試驗(yàn)中沒(méi)有刺激作用或者抑制作用。
實(shí)施例4.通過(guò)甲狀腺激素刺激FGF2從內(nèi)皮細(xì)胞中釋放 用T4(0.1μmol/L)或者T3(0.01μmol/L)處理ECV304內(nèi)皮細(xì)胞3天，并以此ECV304內(nèi)皮細(xì)胞為介質(zhì)測(cè)定FGF2的水平。如表2所示，在介質(zhì)中T3刺激的FGF2濃度增長(zhǎng)3.6倍，而T4能夠?qū)е?.4倍的增長(zhǎng)。這一發(fā)現(xiàn)表明，通過(guò)提高可以作用于內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子濃度，甲狀腺激素可能提高，至少部分地提高FGF2的血管生成作用。
表2.T4和T3對(duì)FGF2從ECV304內(nèi)皮細(xì)胞中釋放的作用 *P＜0.001，將T3-處理的樣本與ANOVA對(duì)照樣品比較； F＜0.05，將T4-處理的樣本與ANOVA對(duì)照樣品比較。
實(shí)施例5.ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在通過(guò)甲狀腺激素和FGF2刺激血管生成中的作用 T4對(duì)細(xì)胞發(fā)揮非免疫性作用的途徑是MAPK信號(hào)傳遞鏈，具體地，是ERK1/2活化的信號(hào)傳遞鏈.已知T4能夠通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子提高ERK1/2活化作用.通過(guò)利用PD 98059(2到20μmol/L)來(lái)檢驗(yàn)MAPK途徑在甲狀腺激素刺激的FGF2表達(dá)中的作用，其中，PD 98059是一種通過(guò)酪氨酸-蘇氨酸激酶MAPK激酶-1(MEK1)和MEK2來(lái)抑制ERK1/2活化作用的抑制劑.表中的數(shù)據(jù)表明，PD 98059有效地阻斷FGF2從用T4或者T3處理的ECV304內(nèi)皮細(xì)胞中移出.在CAM試驗(yàn)中進(jìn)行ERK1/2的平行研究，圖5表示了有代表性的結(jié)果.生理濃度的T3和T4的結(jié)合物致使血管分支增加2.4倍，通過(guò)3μmol/L PD98059(圖5A)能夠完全阻斷此作用(圖5A)。ERK1/2活化作用的抑制劑(圖5B)能夠有效地阻斷FGF2刺激的分支形成(2.2-倍)。因此，甲狀腺激素的前血管生成作用開(kāi)始于原生質(zhì)膜且包括ERK1/2途徑的活化作用，從而促進(jìn)FGF2從內(nèi)皮細(xì)胞中釋放。ERK1/2活化作用是傳導(dǎo)FGF2信號(hào)和促成新血管形成的再次要求。
實(shí)施例6.在用T4(10″7mol/L)處理15分鐘到6小時(shí)的ECV304細(xì)胞中研究甲狀腺激素和FGF2對(duì)MAPK活化作用刺激的磷酸化作用和ERK1/2 MAPKs的核移位作用的影響 在用T4處理的15分鐘內(nèi)細(xì)胞核中出現(xiàn)磷酸化的ERK1/2，當(dāng)處理30分鐘時(shí)，磷酸化ERK1/2達(dá)到最大濃度，且持續(xù)存在6小時(shí)(圖6A)。由于化合物通過(guò)MAPK激酶阻斷ERK1/2的磷酸化作用，可以預(yù)見(jiàn)到的結(jié)果是通過(guò)PD 98059能夠抑制激素的這種作用(圖6B)。同我們所看到的T4在其他細(xì)胞系中的作用一樣，傳統(tǒng)的蛋白激酶C(PKC)-O、PKC-β、和PKC-γ抑制劑CGP41251也能阻斷細(xì)胞中激素對(duì)MAPK活化作用的影響。甲狀腺激素提高了幾個(gè)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的作用，例如干擾素-γ13和表皮生長(zhǎng)因子。在ECV304細(xì)胞中，T4能夠提高FGF2在15分鐘共同培養(yǎng)過(guò)程中引起的MAPK活化作用(圖6C)。通過(guò)在CAM模型中觀測(cè)ECV304細(xì)胞，我們建議，激素導(dǎo)致血管生成的復(fù)雜的機(jī)理包括FGF2內(nèi)皮細(xì)胞的釋放和釋放的FGF2自分泌作用對(duì)血管生成的增強(qiáng)。
實(shí)施例7.在用甲狀腺激素處理的ECV304細(xì)胞中的RT-PCR 在研究T4對(duì)前血管生成影響的機(jī)理時(shí)提出的最終問(wèn)題是激素是否可能導(dǎo)致FGF2基因表達(dá)。用T4(10″7mol/L)處理內(nèi)皮細(xì)胞6到48小時(shí)，進(jìn)行基于RT-PCR的FGF2和GAPDH RNA的估計(jì)(從cDNA測(cè)得的量推斷；圖7)。通過(guò)6小時(shí)的激素處理，F(xiàn)GF2 cDNA的量有明顯增加且修正了GAPDH的內(nèi)容，用激素處理48小時(shí)這一現(xiàn)象進(jìn)一步提高。
實(shí)施例8A.小鼠(糖尿病的和非糖尿病的)體內(nèi)視網(wǎng)膜新血管生成模型 為了評(píng)估試驗(yàn)物品對(duì)視網(wǎng)膜新血管生成的藥理活性，將幼齡小鼠暴露于高氧環(huán)境下7天并且允許恢復(fù)，從而刺激視網(wǎng)膜上新血管的形成。對(duì)試驗(yàn)物品進(jìn)行評(píng)價(jià)來(lái)確定視網(wǎng)膜新血管生成是否被抑制。用蘇木精-伊紅染液檢查視網(wǎng)膜，有至少一個(gè)著色時(shí)，說(shuō)明有新血管生成(通常是選擇素染色)。也可以使用其他著色劑(例如PCNA、PAS、GFAP、血管生成的標(biāo)記物，等等)。下面對(duì)此模型進(jìn)行了概括 動(dòng)物模型 將幼齡小鼠(p7)和它們的母畜放置于高氧環(huán)境(70-80％)下7天。
在P12，將小鼠從充氧環(huán)境下移走并且放入正常環(huán)境。
讓小鼠恢復(fù)5-7天。
然后處死小鼠并采集眼睛。
視情況而定，將小鼠的眼睛或者冷凍或者固定。
用適當(dāng)?shù)慕M織化學(xué)染色劑對(duì)眼睛染色。
用適當(dāng)?shù)拿庖呓M織化學(xué)染色劑對(duì)眼睛染色。
采集血、血漿、或者其他組織。
檢查特別提到的具有微血管變更的眼睛，觀察任何和所有發(fā)現(xiàn)。半定量的記錄新血管生長(zhǎng)，也可以使用圖像分析。
實(shí)施例8B甲狀腺激素和糖尿病性視網(wǎng)膜病 使用J de Ia Cruz et al.，J Pharmacol Exp Ther 280454-459，1997中公開(kāi)的草案，對(duì)患有鏈脲佐菌素(STZ)導(dǎo)致的試驗(yàn)性糖尿病和糖尿病性視網(wǎng)膜病的小鼠給藥Tetrac。給藥終點(diǎn)是增生性視網(wǎng)膜病(血管生成)出現(xiàn)的Tetrac的抑制作用。
實(shí)施例9A.使用新型的甲狀腺激素和類(lèi)似物的藥物聚合制劑使傷口愈合并進(jìn)行止血治療。
本發(fā)明還包括一種新穎的傷口愈合和止血療法，包括一種固定的甲狀腺激素類(lèi)似物，優(yōu)選T4類(lèi)似物、氯化鈣和膠原蛋白。在低水平膠原蛋白存在的情況下，這種新穎的制劑能夠有效的控制靜脈和動(dòng)脈出血，降低出血時(shí)間，產(chǎn)生纖維蛋白/血小板栓，釋放血小板衍生的傷口愈合因子，并且十分安全。這種傷口愈合和止血包扎的發(fā)展是很有價(jià)值的，能夠短期或長(zhǎng)期應(yīng)用于戰(zhàn)斗傷亡護(hù)理方面?？梢?xún)?yōu)化固定的左旋甲狀腺素(T4)和球狀多聚己糖的藥物制劑，該藥物制劑以一種水凝膠或者覆蓋物的方式存在，包含膠原蛋白和氯化鈣。這種以水凝膠或者覆蓋物的方式存在的新穎的傷口愈合和止血(WH制劑)療法還可以包括殺菌劑的加入。
通過(guò)附著在細(xì)胞表面受體(整合素αvβ3)的活化作用導(dǎo)致胞內(nèi)信號(hào)活化作用，結(jié)合到聚合物或者固定在瓊脂糖上的左旋甲狀腺素顯示有效的血管生成刺激性，隨后導(dǎo)致不同的生長(zhǎng)因子產(chǎn)量的上調(diào)。另外，固定化T4導(dǎo)致上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞的細(xì)胞遷移。固定化T4、而不是T3或其他類(lèi)似物，能夠提高膠原蛋白導(dǎo)致的血小板凝聚和分泌，這將促進(jìn)主體本身的血小板栓形成。此外，固定化T4還能夠促進(jìn)白細(xì)胞遷徙，這是對(duì)抗傳染病的關(guān)鍵。因此，固定化T4可以幫助身體產(chǎn)生更多用于再生血管的化合物，并且，固定化T4還能夠提高白血球的數(shù)值，白血球在受傷位點(diǎn)產(chǎn)生豐富的自由基。自由基能夠從創(chuàng)傷處清除潛伏地病原菌。
因此T4或者T4-瓊脂糖(10-100nM)，而不是T3、DIPTA、或者GC-I，在提高血小板凝聚和分泌(去?；饔?方面有效。因此，T4(或者類(lèi)似物和其聚合結(jié)合物，例如，T4-瓊脂糖)和10mM氯化鈣相結(jié)合，在有或者沒(méi)有膠原蛋白的情況下優(yōu)選地用于傷口愈合。參見(jiàn)圖23A-E。
凝血彈性描記法 自從1948年Hartert開(kāi)發(fā)以來(lái)，凝血彈性描記法(TEG)已經(jīng)被用于不同的醫(yī)院裝置中。TEG的原理以表示血塊特征的物理粘彈性為基準(zhǔn)。使用計(jì)算機(jī)化血栓彈性?xún)x(TEG 3000型，Haemoscope，Skokie，IL)，在37℃下在振動(dòng)的塑料圓柱電池(″杯″)和與平面有1mm間隙的同軸懸掛固定的活賽(″銷(xiāo)″)中檢測(cè)血塊形成。杯每4.5秒向兩側(cè)振動(dòng)一次，中間有一秒循環(huán)停留時(shí)間；產(chǎn)生0.1Hz的頻率和最大0.1每秒的剪切速率。銷(xiāo)被起到轉(zhuǎn)矩傳感器作用的扭絲懸吊起來(lái)。隨著血塊形成，纖維蛋白小纖維將杯和銷(xiāo)物理地連接起來(lái)，并且，使用IBM兼容機(jī)家用計(jì)算機(jī)和定制軟件(Haemoscope公司，Skokie，IL)可以在線顯示杯受血塊粘彈性影響的旋轉(zhuǎn)。作為時(shí)間函數(shù)對(duì)銷(xiāo)受到的扭矩(相對(duì)于杯的振蕩)作圖。
TEG通過(guò)測(cè)量不同的參數(shù)，例如凝結(jié)開(kāi)始的等待時(shí)間(R)、固定的血塊(k)的振幅開(kāi)始為大約20mm的時(shí)間、通過(guò)斜率測(cè)定(α)的血塊形成動(dòng)力學(xué)、和血塊的最大振幅(MA)評(píng)估凝聚作用。參數(shù)A測(cè)量任一點(diǎn)MA痕跡的寬度。以毫米為單位的振幅A是血塊強(qiáng)度或彈性的函數(shù)。TEG痕跡中的振幅是血塊剛性的測(cè)量值；通過(guò)凝結(jié)、G獲得的強(qiáng)度或者剪切力彈性模數(shù)的峰值是血塊剛性的函數(shù)，且可以由TEG痕跡的最大振幅(MA)計(jì)算出。
從TEG痕跡中計(jì)算下列參數(shù) R，反應(yīng)時(shí)間(凝膠時(shí)間)表示了形成3維纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)(具有大約2mm振幅的可測(cè)量的剛性)之前的潛伏期。
最大振幅(MA，以毫米為單位)是血塊表現(xiàn)的剛性的峰值。
剪切力彈性模數(shù)或血塊強(qiáng)度(G，dynes/cm)定義為G＝(5000A)/(100-A). 由于血塊必須能夠經(jīng)受血管創(chuàng)傷位點(diǎn)的切應(yīng)力，血塊凝聚是在體內(nèi)血栓形成和止血的重要參數(shù)。TEG可以用來(lái)評(píng)估不同的藥理干涉療法對(duì)血塊形成和消除涉及到的不同因素(凝血活化作用、凝血酶生成、纖維蛋白形成、血小板活化作用、血小板-纖維蛋白相互作用、和纖維蛋白聚合)的效果。表3顯示了在人全血中內(nèi)毒素(0.63ug)、Xa(0.25nM)、凝血酶(0.3mU)和TF(25ng)對(duì)計(jì)算機(jī)化TEG調(diào)節(jié)的不同凝結(jié)參數(shù)的影響。
采血經(jīng)William Beaumont醫(yī)院人類(lèi)調(diào)查委員會(huì)的批準(zhǔn)，血也得自同意捐獻(xiàn)的志愿者。使用二種注射方法，用21規(guī)格的蝴蝶針取樣，并丟棄最初的3ml血。將全血(WB)裝入包含3.8％檸檬酸鈉的硅化真空管中(Becton Dickinson，Rutherford，NJ)，維持檸檬酸鹽全血的比率為1∶9(v/v)。在收集血液的3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行TEG。添加1-2.5mM的鈣，隨后加入不同的激發(fā)劑。氯化鈣本身在使用濃度下對(duì)血塊形成和凝結(jié)強(qiáng)度只顯示最小的作用。
血塊形成源于凝血酶-誘發(fā)纖維蛋白肽A從纖維蛋白原中斷裂。產(chǎn)物纖維蛋白單體自然地聚合形成小纖維束，進(jìn)行線性延伸、分支、和橫向結(jié)合導(dǎo)致形成一種纖維蛋白纖維的三維網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的性質(zhì)是它們能夠起到剛性彈性固體的作用，能夠抵抗變形切應(yīng)力。這種變形抗力可以被彈性模數(shù)-一種凝結(jié)強(qiáng)度指數(shù)調(diào)節(jié)。與只以時(shí)間為基礎(chǔ)開(kāi)始血塊形成的TEG傳統(tǒng)的凝固試驗(yàn)(如前凝血酶時(shí)間和部分促凝血酶原激酶時(shí)間)不同，TEG能夠獲得通過(guò)血塊得到的最大強(qiáng)度測(cè)定值的定量信息。通過(guò)GPIIb/IIIa受體，血小板結(jié)合纖維蛋白(ogen)并且調(diào)節(jié)血塊的粘彈性質(zhì)。我們的結(jié)果說(shuō)明，在TF-TEG中，凝結(jié)強(qiáng)度無(wú)疑是血小板濃度的函數(shù)，且在剪切力下，血小板凝結(jié)強(qiáng)度增加～8倍。在使用TF-TEG在剪切力下抑制血小板-纖維蛋白調(diào)節(jié)的凝結(jié)強(qiáng)度時(shí)，不同的血小板GPIIb/IIIa拮抗物(I級(jí)對(duì)照II級(jí))表現(xiàn)不同的效果。
統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用平均±SEM來(lái)表示。使用合適的t檢驗(yàn)法或者ANOVA，通過(guò)成對(duì)分析法或組分析法分析數(shù)據(jù)；當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異是顯著的。
表3使用TEG，對(duì)照組織因子，在含枸櫞酸鹽的人類(lèi)全血中氯化鈣對(duì)凝結(jié)動(dòng)力學(xué)的影響 數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM，n＝4，*P＜0.01。
在全血中使用全電阻技術(shù)進(jìn)行血小板凝聚和去?；饔迷诒緦?shí)驗(yàn)中，使用得自Chrono-Log公司的560型全血凝聚分析儀和Aggro-連接軟件。在稀釋的血液中放置兩個(gè)電極，并且從其中一個(gè)向另一個(gè)發(fā)射電脈沖。由于血小板聚集在電極周?chē)?，Chrono-Log測(cè)量以ohms為單位的電信號(hào)的電阻。
采血每天，從健康的年齡在17到21歲之間的供血者體內(nèi)取血，放入裝有3.8％檸檬酸鈉(Becton Dickinson，Rutherford，NewJersey)緩沖液的4.5毫升真空瓶中。將血液保存在搖床中，來(lái)延長(zhǎng)血小板的壽命，且實(shí)驗(yàn)在取血后的5小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。
過(guò)程作為對(duì)照，500微升全血、500微升0.9％的生理鹽水和有磁性的攪拌棒放入電池中混合，并預(yù)熱5分鐘使溫度到達(dá)37攝氏度。用5微升1-2μg/ml的膠原蛋白誘發(fā)次閾值凝聚作用，用凝聚分析儀測(cè)量6-7分鐘。對(duì)照T3，檢驗(yàn)T4、T4-瓊脂糖及其他甲狀腺激素類(lèi)似物對(duì)膠原蛋白導(dǎo)致的凝聚作用和分泌的影響。ngerman-Wojenski C，Smith JB，Silver MJ.Evaluation ofelectrical aggregometrycomparison with optical aggregometry，secretion of ATP，and accumulation of radiolabeled platelets.J LabClin Med.1983 Jan；101(1)44-52. 細(xì)胞遷移試驗(yàn)。使用Mousa等人描述的方法和前面描述得細(xì)胞遷移試驗(yàn)(Methods In Cell Science，19(3)179-187，1997，和Methods In CeIl Science 19(3)189-195，1997)，從血液中分離出人類(lèi)粒性白細(xì)胞。簡(jiǎn)要地，使用具有8μm孔徑趨藥性孔室的96孔微室。這種孔室允許細(xì)胞向著化學(xué)激素、細(xì)胞因子或胞外基質(zhì)蛋白濃度梯度遷徙。向含有5μL實(shí)驗(yàn)試劑，例如fiavanoids或甲狀腺激素衍生物的聚丙烯平皿中加入細(xì)胞懸浮液(45μl，2×106)，在22℃下培養(yǎng)10分鐘。向可使用的趨藥性孔室的下面的小孔中加入帶有或不帶有濃度為0.001-0.1μM的T3/T4(33μl)的IL8(0.1-100ng)，然后使用預(yù)加框過(guò)濾器集合孔室。向上面的小孔中加入25μl細(xì)胞/實(shí)驗(yàn)試劑懸浮液，然后在潮濕的細(xì)胞培養(yǎng)器中過(guò)夜培養(yǎng)(37℃下22小時(shí)，5％CO2)。過(guò)夜培養(yǎng)之后，使用12管吸液管和細(xì)胞刮刀輕輕的除去未遷徙細(xì)胞和過(guò)量介質(zhì)。然后，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中將過(guò)濾器洗滌兩次，并且固定在1％甲醛PBS緩沖液中。遷移細(xì)胞的細(xì)胞膜充滿Triton X-100(0.2％)，然后用PBS洗滌2-3次。用玫瑰精毒傘素(12.8IU/ml)染色遷移細(xì)胞的絲狀肌動(dòng)蛋白30分鐘(22℃)。玫瑰精毒傘素每周制備一次，在4℃避光保存時(shí)可重復(fù)使用3天。使用Cytofluor II微過(guò)濾器熒光計(jì)(530干擾/590發(fā)射)，通過(guò)熒光檢測(cè)定量確定化學(xué)活性物質(zhì)運(yùn)載劑。使用特別設(shè)計(jì)的處理/洗滌設(shè)備進(jìn)行所有的細(xì)胞處理和隨后的洗滌(Methods In Cell Science，19(3)179-187，1997)。這一技術(shù)能夠精確的定量細(xì)胞遷徙，并提供具有最小介入或內(nèi)部試驗(yàn)變化性的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
細(xì)胞遷徙試驗(yàn)使用具有8μm孔徑趨藥性孔室的96孔微室進(jìn)行這種試驗(yàn).這種孔室允許細(xì)胞向著體外粘連蛋白、骨橋蛋白濃度梯度遷徙。使用EDTA/胰蛋白酶(0.01％/0.025％)用標(biāo)準(zhǔn)的方法去掉培養(yǎng)的細(xì)胞。去掉之后，洗滌細(xì)胞兩次并重新懸浮(2×106/ml)在EBM(內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Clonetics Inc.)中。向可使用的趨藥性孔室的下面的小孔中添加0.0125-100μg/ml的體外粘連蛋白或骨橋蛋白(33μl)，然后使用預(yù)加框過(guò)濾器集合。向包含5μl不同濃度試驗(yàn)試劑的聚丙烯平皿中加入細(xì)胞懸液(45μl)，在22℃下培養(yǎng)10分鐘。向可使用的趨藥性孔室的上面的小孔中添加25μl的細(xì)胞/試驗(yàn)試劑懸浮液，然后在濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)器中過(guò)夜培養(yǎng)(37℃下22小時(shí))。過(guò)夜培養(yǎng)之后，使用12管吸液管和細(xì)胞刮刀輕輕的除去未遷徙細(xì)胞和過(guò)量介質(zhì)。然后，在磷酸鹽緩沖鹽水(沒(méi)有Ca++或Mg++)中將過(guò)濾器洗滌兩次，并且固定在1％甲醛PBS緩沖液中。遷移細(xì)胞的細(xì)胞膜充滿TritonX-100(0.2％)，然后用PBS洗滌2-3次。用玫瑰精毒傘素(12.8IU/ml)染色遷移細(xì)胞的絲狀肌動(dòng)蛋白30分鐘(22℃)。玫瑰精毒傘素每周制備一次，在4℃避光保存時(shí)可重復(fù)使用3天。使用Cytofluor II微過(guò)濾器熒光計(jì)(530干擾/590發(fā)射)，通過(guò)熒光檢測(cè)定量確定化學(xué)活性物質(zhì)運(yùn)載劑。使用特別設(shè)計(jì)的處理/洗滌設(shè)備進(jìn)行所有的細(xì)胞處理和隨后的洗滌。這種設(shè)備包括六個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)劑單位，每個(gè)單位具有30ml的容量。單個(gè)單位充滿下列試劑的一種PBS、甲醛、TritonX-100、或者玫瑰精-毒傘素。使用這種技術(shù)時(shí)，過(guò)濾器被輕輕地浸入適當(dāng)?shù)娜芤褐校虼藢⑦w移細(xì)胞的損失減到最少。這一技術(shù)能夠精確的定量細(xì)胞遷徙，并提供具有最小介入或內(nèi)部試驗(yàn)變化性(1，2)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
向細(xì)胞外基質(zhì)蛋白體外粘連蛋白的遷徙 LC＝下部孔室，UC＝上部孔室 使用其它潛在的和特異性的avb3血管生成劑例如LM609和SM256可以得到相似的數(shù)據(jù)。
實(shí)施例9B.體外人上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的傷口愈合文獻(xiàn)Mohamed S，Nadijcka D，Hanson，V.Wound healing properties ofcimetidine in vitro.Drug Intell Clin Pharm 20973-975；1986描述了體外2維傷口愈合方法，該文獻(xiàn)通過(guò)引證在此全部并入本文。
另外，我們的實(shí)驗(yàn)室已建立了一種3維傷口愈合方法，本研究(見(jiàn)下文)中將會(huì)使用該方法。數(shù)據(jù)顯示甲狀腺激素能夠有效的刺激傷口愈合。
人類(lèi)皮膚成纖維細(xì)胞的體外三維傷口愈合試驗(yàn) 步驟1制備收縮的膠原蛋白凝膠劑 1)用350ul 2％的BSA包覆24孔板2hr， 2)80％融合性NHDF(正常人皮膚成纖維細(xì)胞，通道5-9)被胰蛋白酶化，并且用生長(zhǎng)培養(yǎng)基中和，離心并用PBS洗滌一次， 3)制備膠原蛋白-細(xì)胞混合物，輕輕地混合并一直置于冰中 4)從24孔板中取出2％BSA，添加膠原蛋白-細(xì)胞混合物350ul/孔，并在37℃下，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孔板。5)1小時(shí)之后，添加0.5ml/孔的介質(zhì)DMEM+5％FBS，使用10ul尖端將膠原蛋白凝膠從每個(gè)孔邊緣分離下來(lái)，然后培養(yǎng)2天。成纖維細(xì)胞可能收縮膠原蛋白凝膠。
步驟2制備三維纖維蛋白傷口凝塊并嵌入創(chuàng)傷的膠原蛋白培養(yǎng)基 1)制備含有或不含有試驗(yàn)試劑的纖維蛋白原溶液(1mg/ml)。在eppendorf試管中加入350ul纖維蛋白原溶液。
2)用剪刀從中間切割收縮的膠原蛋白。用PBS洗滌凝膠并將凝膠放入24孔板每個(gè)小孔的中心。
3)向每個(gè)試管中添加1.5ul人凝血酶(0.25UM)，混合小孔然后在膠原蛋白凝膠周?chē)砑尤芤海撊芤嚎赡茉?0分鐘內(nèi)聚合。20分鐘后，添加含有或不含有實(shí)驗(yàn)試劑的DMEM+1％(或5％)FBS，450ul/小孔，并在37℃下，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)平板5天。每天都照相。
在患有糖尿病的鼠體內(nèi)的傷口愈合 在患有糖尿病的鼠體內(nèi)使用一種急性的切割傷口模型，試驗(yàn)甲狀腺激素類(lèi)似物和它的結(jié)合形成的影響。每3-21天為周期進(jìn)行傷口閉合比率、斷裂強(qiáng)度分析和組織學(xué)檢測(cè)。
方法在實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物(小鼠和老鼠)帶有二個(gè)小穿刺傷口-對(duì)一個(gè)創(chuàng)口使用WH，另一個(gè)作為對(duì)照覆著鹽溶液。要不，不理創(chuàng)傷直到自然痊愈。
受傷之后動(dòng)物被euthanised五天。從治療的和未經(jīng)治療的的創(chuàng)口邊緣切去1到1.5毫米面積的皮膚。
傷口閉合和傷口閉合的時(shí)間是確定的。另外，在創(chuàng)傷的肉芽組織中，幫助構(gòu)造結(jié)締組織的蛋白tenascin水平是確定的。肉芽組織的性質(zhì)(即通常形成傷口痊愈、新毛細(xì)管和結(jié)締組織的粗糙的、帶粉紅色的組織)也是確定的。
材料和方法 使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備慢性顆粒狀創(chuàng)口。在使用之前，將重量在300到350克的雄性Sprague Dawley鼠馴化一周。在腹腔內(nèi)戊巴比妥麻醉(35mg/kg)的條件下，刮削小鼠背部并去毛。將動(dòng)物分別關(guān)進(jìn)籠內(nèi)并不限量給與食品和水。依照紐約奧爾巴尼退役老兵體檢中心動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)準(zhǔn)則進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)。
之前已經(jīng)將這種傷口的組織學(xué)特征與人類(lèi)慢性顆粒狀傷口進(jìn)行了比較。然后將六十四只鼠分成八個(gè)試驗(yàn)組(n＝8/組)。在第5、9、12、15、和18天，局部施用介質(zhì)(參照介質(zhì))處理動(dòng)物。參照介質(zhì)可以是瓊脂糖(組1)或與左旋甲狀腺素結(jié)合使用的多聚體形式(組2)。用T4-瓊脂糖(組3-5)或者T4-聚合物(組6-8)以1，10，100μg/cm2的濃度在10μg球狀多聚己糖、10μg膠原蛋白和10mM氯化鈣的存在下，在第5、9、12、15、和18天局部使用處理創(chuàng)口。不處理傷口使其暴露在空氣中。每48小時(shí)在醋酸鹽紙上描繪創(chuàng)口的輪廓，并使用計(jì)算機(jī)化數(shù)字求積法計(jì)算面積。
在第19天，從創(chuàng)口的頭部、中間和尾部可以獲得三個(gè)肉芽組織充分厚的橫向條帶，并將其固定在10％的福爾馬林緩沖液中。從每個(gè)樣品中取橫切面(5μm)并用蘇木精和四溴熒光素染色。肉芽組織的厚度可以使用低功率測(cè)微目鏡估計(jì)。立即檢驗(yàn)肉芽組織表面發(fā)炎層以下的高性能領(lǐng)域。從每個(gè)切下的肉芽組織中可以攝影和編碼五個(gè)相鄰的高性能領(lǐng)域。放大相片，然后用于盲目的組織分析。計(jì)算成纖維細(xì)胞，″圓″細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、和嗜中性白細(xì)胞)和毛細(xì)管。此外，各個(gè)切面的多孔性漸次變化的，多孔性比例從1(還原細(xì)胞計(jì)數(shù))變化到5(高度細(xì)胞)。
統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)時(shí)間繪制連續(xù)的面積測(cè)量值。每只動(dòng)物的數(shù)據(jù)符合Gompertz等式(一般r2＝0.85)。使用這種曲線可以估計(jì)傷口半衰期。使用壽命統(tǒng)計(jì)表分析和Wilcoxon等級(jí)檢驗(yàn)法進(jìn)行組間比較。使用家用計(jì)算機(jī)帶有的SAS(SAS/STAT家用計(jì)算機(jī)指南，第6版，Cary，North Carolina，1987，p 1028)和BMDP(BMDP統(tǒng)計(jì)軟件手冊(cè)，Los Angeles，BMDP Statistical Software，Inc.1988)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
使用一維方差分析將不同試驗(yàn)組算得的細(xì)胞入庫(kù)分析。組間差異的后hoc分析可以使用Tukey′s試驗(yàn)(所有對(duì)多次比較法)進(jìn)行，當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為差距顯著。使用Sigma Stat統(tǒng)計(jì)軟件(Jandel Scientific，Corte Madera，California)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
實(shí)施例10.心肌梗死的鼠類(lèi)模型 心肌梗死的冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模型常用于研究鼠類(lèi)心臟功能。首先用甲苯噻嗪和克他命使鼠麻醉，得到適當(dāng)?shù)穆樽砗?，向氣管插入管子并開(kāi)始正壓通氣。用非常松弛地膠布使鼠仰臥，并進(jìn)行中央胸骨切開(kāi)術(shù)。從腹部輕輕取出心臟并6-O縫合將在左側(cè)腹面的下降冠狀動(dòng)脈牢牢綁住。心臟在胸中被飛快的替換，并在胸廓切開(kāi)術(shù)切口進(jìn)行3-0荷包線縫合隨后用間斷縫合術(shù)或外科夾使皮膚閉合。將動(dòng)物放置在溫度調(diào)節(jié)加熱板上在恢復(fù)期間仔細(xì)觀察。如果必要給予呼吸用氧氣和心肺復(fù)蘇?；謴?fù)后，該鼠回到動(dòng)物照管裝置。鼠內(nèi)的這樣的冠狀動(dòng)脈結(jié)扎產(chǎn)生大前壁心肌梗死。這種方法48小時(shí)死亡率可以高達(dá)50％，這種方法產(chǎn)生的梗塞尺寸存在著可變性。根據(jù)這些考慮和先前的經(jīng)驗(yàn)，獲得16-20只帶有大的梗塞的鼠以便下面討論的甲狀腺激素輸送的兩個(gè)模型可以進(jìn)行比較，大約需要400只鼠。
這些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用來(lái)表明冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前或后甲狀腺激素的全身給藥在完整的動(dòng)物中產(chǎn)生有益的效果，包括通過(guò)超聲波心動(dòng)描記法和血液動(dòng)力學(xué)的測(cè)量、和梗塞面積的減少評(píng)價(jià)的血液動(dòng)力學(xué)的反常的程度。結(jié)果測(cè)量建議在梗死形成三星期后進(jìn)行。盡管一些鼠可能沒(méi)有梗死形成、或僅有一小梗死形成產(chǎn)生，這些鼠可以通過(guò)正常的超聲心動(dòng)圖和正常的血液動(dòng)力學(xué)(低壓末端-舒張壓＜8mm Hg)來(lái)鑒別。
甲狀腺激素輸送 有兩種輸送途徑。第一，把直接甲狀腺激素注入到梗塞心肌周?chē)Ｗ鳛檎５暮腿毖缘男募〉慕缇€在急性開(kāi)放胸閉塞期間很容易識(shí)別，這種途徑提供了激素的充分輸送來(lái)檢測(cè)血管新生的效果。
盡管第一個(gè)模型在病人中進(jìn)行冠狀動(dòng)脈旁路外科手術(shù)有用，并構(gòu)成原則性的證據(jù)，即局部注射誘導(dǎo)血管新生，使用第二個(gè)模型的更廣泛的途徑也可以使用。在第二個(gè)模型中，在誘導(dǎo)心肌梗死之前在麻醉的鼠中將導(dǎo)管逆行經(jīng)過(guò)頸動(dòng)脈放在左側(cè)心室。換句話說(shuō)，用直針擊穿主動(dòng)脈，剛好到主動(dòng)脈瓣上方。然后通過(guò)在冠狀血管的起源上突然的閉合主動(dòng)脈幾秒鐘模擬甲狀腺激素的冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，從而產(chǎn)生等容收縮。主動(dòng)脈的收縮后立即把甲狀腺激素注射到左側(cè)心室或主動(dòng)脈。產(chǎn)生的等容收縮推動(dòng)帶有甲狀腺激素的血液沿著冠狀血管灌注整個(gè)心肌。這種方法根據(jù)需要可以進(jìn)行許多次來(lái)得到有效作用。注射量取決于使用的劑量和新血管的形成。
超聲波心動(dòng)描記法 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出在未麻痹的鼠中得到二維和M-方式超聲心動(dòng)圖的方法。左心室的尺寸、功能、膜壁厚度和壁的活動(dòng)可以再生并可靠地測(cè)量。測(cè)量以極微小的方式排除關(guān)于甲狀腺激素給藥的偏移。
血液動(dòng)力學(xué) 血液動(dòng)力學(xué)的測(cè)量用來(lái)決定左心室的損傷程度。用異氟烷使鼠麻醉。通過(guò)沿著右前頸部的一個(gè)切口，分離開(kāi)右側(cè)的頸動(dòng)脈和右側(cè)的頸靜脈并用帶有壓力傳感導(dǎo)管插入(Millar，SPR-612，1.2Fr)。然后獲得下列測(cè)量心率、心臟收縮的和心臟舒張的血壓、平均動(dòng)脈壓、左心室的心臟收縮和末端-舒張壓、和+和-dP/dt。特別實(shí)用的是左心室的末端-舒張壓的測(cè)量，其累進(jìn)的高度與心肌損傷的程度相互關(guān)聯(lián)。
梗死尺寸 犧牲鼠用TTC方法來(lái)測(cè)量梗死尺寸。
形態(tài)測(cè)量學(xué) 在梗塞區(qū)域、周?chē)Ｈ麉^(qū)域、和抵抗梗塞的備用心肌，通常是后壁內(nèi)測(cè)量微脈管密度[微脈管/平方毫米]。從每個(gè)鼠，7-10高倍放大的帶有橫切斷的肌細(xì)胞的高倍視野[×400]使用圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)字記錄。通過(guò)一個(gè)微小的探測(cè)器對(duì)微脈管進(jìn)行計(jì)數(shù)。微循環(huán)定義為帶有150微米或較少的直徑的超過(guò)第三級(jí)小動(dòng)脈的血管，在小動(dòng)脈和小靜脈之間提供組織。為校正左心室肥厚內(nèi)的差異，通過(guò)為體重修正的LV重量微脈管密度得以分開(kāi)。從仿造操作的鼠得來(lái)得心肌將作為對(duì)照。
實(shí)施例11關(guān)于T4或FGF2的前血管新生的αVβ3拮抗物的效果 αVβ3抑制劑LM609在10微克時(shí)完全抑制CAM模型中FGF2或T4-誘導(dǎo)的前血管新生效果(圖16)。
實(shí)施例12癌-相關(guān)的新血管生長(zhǎng)的抑制。
在J.Bennett，Proc Natl Acad Sci USA 992211-2215，2002里公開(kāi)得方案，用于甲腺乙酸(Tetrac)給藥給錫特鼠，這種鼠獲得了人乳癌細(xì)胞的植入物(MCF-7)。在飲用水中提供Tetrac來(lái)提升鼠模型中激素類(lèi)似物的循環(huán)水平到10-6M。終點(diǎn)是關(guān)于植入得瘤周?chē)难苄律膖etrac的抑制作用。
實(shí)施例13甲狀腺激素和它的類(lèi)似物在體外三維微血管的內(nèi)皮發(fā)芽模型中VEGF和FGF2的次閾值水平下的前血管新生促進(jìn)效果。
或T3、T4、T4-瓊脂糖、或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)加血管的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在體外三維微血管的內(nèi)皮發(fā)芽模型中產(chǎn)生的可比較的前血管新生效果。甲狀腺激素類(lèi)似物的前血管新生效果由PD98059阻斷，PD98059是一種促細(xì)胞分裂劑-活化的蛋白激酶MAPK；ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。另外，特殊的αVβ3完整拮抗物(XT199)抑制甲狀腺激素類(lèi)似物或者T4-瓊脂糖的前血管新生效果。數(shù)據(jù)也證明甲狀腺激素拮抗物Tetrac抑制甲狀腺類(lèi)似物的前血管新生的應(yīng)答。因此，那些經(jīng)過(guò)試驗(yàn)的甲狀腺激素類(lèi)似物是前血管新生的，其作用開(kāi)始于質(zhì)膜并且包括αVβ3整聯(lián)蛋白受體，且是MAPK-依賴(lài)的。
本發(fā)明描述了在體外三維微血管的內(nèi)皮發(fā)芽模型中VEGF和FGF2的次閾值水平下T3、T4、或T4-瓊脂糖的前血管新生促進(jìn)效果。本發(fā)明也提供證據(jù)，這些證據(jù)是，激素的效果在內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜上開(kāi)始并且由αVβ3整聯(lián)蛋白和ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化來(lái)調(diào)節(jié)。
通過(guò)三維發(fā)芽測(cè)定中低濃度的VEGF和FGF2的血管新生活動(dòng)的T3、T4、或T4-瓊脂糖來(lái)增強(qiáng)已被證實(shí)。10-7M-10-8M總激素濃度的T3或T4，或10-7M總激素濃度的T4-瓊脂糖在這種體外模型中對(duì)VEGF和FGF2的最大濃度的前血管新生活動(dòng)中是可以比較的。盡管鼠心臟中的新血管生長(zhǎng)已經(jīng)報(bào)道有發(fā)生，附隨著通過(guò)大劑量的T4的心肌肥大的誘導(dǎo)，甲狀腺激素認(rèn)為不是因子。本實(shí)施例確定了生理學(xué)濃度的激素在除了心臟的環(huán)境中是前血管新生的。
T4-瓊脂糖再現(xiàn)T4的效果，并且這種甲狀腺激素的衍生物認(rèn)為不是獲得進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的入口；它已經(jīng)被用于我們實(shí)驗(yàn)室來(lái)檢查對(duì)于可能的細(xì)胞表面-開(kāi)始的碘化甲狀腺氨酸的作用的激素作用模型。更進(jìn)一步，用T4和tetrac進(jìn)行實(shí)驗(yàn)也支持結(jié)論，該結(jié)論是這種模型中T4的作用開(kāi)始于質(zhì)膜。Tetrac阻斷T4的膜-開(kāi)始的效果。
因?yàn)榧谞钕偌に胤腔蚪M的活化MAPK(ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激素關(guān)于血管新生的作用可以被MAPK調(diào)節(jié)。MAPK級(jí)聯(lián)的抑制劑PD98059，當(dāng)被加入到CAM模型，，抑制T4的前血管新生作用。這結(jié)果與T4關(guān)于FGF2加工作用的效果的甲狀腺激素信號(hào)上游的轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用是一致的，大家都知道FGF2也經(jīng)過(guò)MAPK-依賴(lài)的機(jī)制起作用。T4和FGF2各自產(chǎn)生磷酸化作用和內(nèi)皮細(xì)胞中ERK1/2的核易位，并且當(dāng)使用次最大劑量，結(jié)合來(lái)進(jìn)一步提高ERK1/2活化。為檢查專(zhuān)門(mén)與血管新生相關(guān)對(duì)關(guān)于血管生長(zhǎng)的FGF2的作用的激素刺激的僅有的MAPK-非獨(dú)立組分的可能性，測(cè)量PD98059存在時(shí)為響應(yīng)T4細(xì)胞釋放的FGF2。后者阻斷在生長(zhǎng)因子濃度下激素-引起的增加并且表明MAPK活化包含關(guān)于從內(nèi)皮細(xì)胞釋放的FGF2的T4的作用，而且包含關(guān)于血管新生的FGF2隨之產(chǎn)生的效果。
甲狀腺激素關(guān)于血管新生的效果 T4、T3、或者T4-瓊脂糖在0.01-0.1μM引起顯著的(P＜0.01)刺激血管新生(表4)。這表示可以比得上FGF2(50ng/ml)加VEGF(25ng/ml)的前血管新生效果。
表4.三維人微血管的內(nèi)皮發(fā)芽測(cè)定中生長(zhǎng)因子、甲狀腺激素、和類(lèi)似物的體外前血管新生效果 數(shù)據(jù)(平均值±SD)從3個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得。細(xì)胞用次閾值水平的FGF2預(yù)處理(1.25ng/ml)+VEGF(2.5ng/ml)。數(shù)據(jù)表示平均值±SD，n＝3，*通過(guò)方差分析P＜0.01，比較處理的對(duì)照。
Tetrac關(guān)于甲狀腺前血管新生作用的效果 T3刺激細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在質(zhì)膜上開(kāi)始。通過(guò)脫氨基碘化甲狀腺氨酸類(lèi)似物，tetrac，這些前血管新生作用被阻斷，tetrac是大家所知道的抑制T4鍵合到血漿隔膜。tetrac(0.1μM)的加入抑制T3、T4、或T4-瓊脂糖的前血管新生作用(表5-7)。這通過(guò)微-血管的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的數(shù)目和血管長(zhǎng)度的抑制來(lái)表示(表5-7)。
通過(guò)甲狀腺激素的血管新生的刺激中ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的角色 ERK1/2抑制的平行的研究在三維微血管的發(fā)芽測(cè)定中進(jìn)行。甲狀腺激素和類(lèi)似物在0.01-0.1μM時(shí)血管長(zhǎng)度和遷移細(xì)胞的數(shù)目產(chǎn)生顯著的增大，該效果被PD 98059有效地(P＜0.01)阻斷(表5-7)。這通過(guò)微-血管的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的數(shù)目和血管長(zhǎng)度的抑制來(lái)表示(表5-7)。
通過(guò)甲狀腺激素刺激血管新生中整聯(lián)蛋白αVβ3的角色 在次閾值的VEGF和FGF2存在時(shí)T3、T4、或T4-瓊脂糖在0.01-0.1μM-調(diào)節(jié)的前血管新生通過(guò)αVβ3整聯(lián)蛋白拮抗物XT199被有效地(P＜0.01)阻斷(表5-7)。這通過(guò)微-血管的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的數(shù)目和血管長(zhǎng)度的抑制來(lái)表示(表5-7)。因此，甲狀腺激素和它的類(lèi)似物的前血管新生效果開(kāi)始于質(zhì)膜αVβ3整聯(lián)蛋白并包括ERK1/2的活化。
表5三維人微血管的內(nèi)皮發(fā)芽測(cè)定中甲狀腺激素T3的前血管新生機(jī)制 人表皮的微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMVC)被使用。細(xì)胞用FGF2(1.25ng/ml)+VEGF(2.5ng/ml)預(yù)處理。第3天4×和10×獲取圖像。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*P＜0.01。
表6三維人微血管的內(nèi)皮發(fā)芽測(cè)定中甲狀腺激素T4的前血管新生機(jī)制 人表皮的微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMVC)被使用。細(xì)胞用FGF2(1.25ng/ml)+VEGF(2.5ng/ml)預(yù)處理。第3天4×和10×獲取圖像。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*P＜0.01。
表7三維人微血管的內(nèi)皮發(fā)芽測(cè)定中甲狀腺激素T4-瓊脂糖的前血管新生機(jī)制 人表皮的微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMVC)被使用。細(xì)胞用FGF2(1.25ng/ml)+VEGF(2.5ng/ml)預(yù)處理。第3天4×和10×獲取圖像。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*P＜0.01。
實(shí)施例14為評(píng)價(jià)聚合甲狀腺類(lèi)似物運(yùn)輸穿過(guò)血腦屏障的體外模型 下面所描述的是為評(píng)價(jià)帶有選擇單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物或和單獨(dú)的聚合甲狀腺類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子可能橫穿血腦屏障的裝置的體外方法。本模型和方案的詳細(xì)說(shuō)明通過(guò)Audus，et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci 5079-18(1987)提供，該文公開(kāi)的在這里通過(guò)引用并入全文。
簡(jiǎn)言之，從新鮮牛腦的大腦灰質(zhì)中分離到微脈管內(nèi)皮細(xì)胞。牛腦可從地方的屠宰場(chǎng)獲得并用冰冷的最小的帶有抗生素的基本裝置運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室(“MEM”)。在無(wú)菌的情況下使用標(biāo)準(zhǔn)解剖方法除去大的表面血管和腦膜。通過(guò)吸取除去皮層的灰質(zhì)，然后切碎成大約1毫米的立方塊。然后將切碎的灰質(zhì)用0.5％酵素(BMB，印第安納波利斯，Ind.)37℃在振蕩水浴培養(yǎng)3小時(shí)。隨后消化3小時(shí)，通過(guò)離心濃縮混合物(1000×g10分鐘)，然后用13％右旋糖酐再懸浮，5800×g離心10分鐘。棄去浮在表面的脂肪、細(xì)胞碎片和髓磷脂，在1mg/ml膠原酶/酵素中再懸浮粗的微脈管并在37℃振蕩水浴培養(yǎng)5小時(shí)。消化5小時(shí)后，微脈管懸浮液用來(lái)在預(yù)建立的50％Percoll梯度1000×g離心10分鐘。除去包含純凈內(nèi)皮細(xì)胞的區(qū)域(從梯度頂端的第二條帶)并用培養(yǎng)基洗滌兩次(例如，50％MEM/50％F-12營(yíng)養(yǎng)混合物)。在包含20％二甲亞砜和10％馬血清的培養(yǎng)基中冷凍細(xì)胞(-80℃)以便以后的使用。
分離后，大約5×105細(xì)胞cm2覆蓋在培養(yǎng)皿上或5-12毫米孔徑大小聚碳酸酯濾紙上也就是說(shuō)涂有鼠膠原和粘連蛋白。接種細(xì)胞10-12天后，通過(guò)顯微鏡檢查細(xì)胞單層覆蓋情況。
這些細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的、組織化學(xué)的和生物化學(xué)的性質(zhì)的表征表明這些細(xì)胞具有血腦屏障的許多顯著的特征。這些特征包括緊的細(xì)胞間的接合、膜穿孔的缺少、胞飲的活動(dòng)的低水平、和γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、和凝血因子抗原活動(dòng)的存在。
培養(yǎng)的細(xì)胞可被用于各式各樣的實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)中需要為極化的鍵合或運(yùn)輸?shù)哪Ｐ?。通過(guò)在多孔平板中鋪細(xì)胞，大的和小的分子的鍵合受體和非受體可以實(shí)施。為了實(shí)施穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞通量測(cè)量，讓細(xì)胞在多孔聚碳酸酯膜濾器(例如，從Nucleopore、Pleasanton，Calif.)上生長(zhǎng)。大孔徑濾紙(5-12毫米)用來(lái)避免濾紙變成分子通量的比率-限制阻礙的過(guò)濾器的可能性。這些大孔徑濾紙的使用不允許細(xì)胞在濾紙下面生長(zhǎng)，允許細(xì)胞單層的目測(cè)檢查。
一旦細(xì)胞擴(kuò)展覆蓋，將他們并排放在擴(kuò)散池儀器(例如，從Crown Glass，Sommerville，NJ.)中為了通量測(cè)量用試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)，擴(kuò)散池的供體室調(diào)幅脈沖，然后隨著脈沖在各個(gè)時(shí)間，從接收器室除去一部分來(lái)做分析。放射性或熒光標(biāo)記的物質(zhì)允許可靠的分子通量定量。通過(guò)加入非可運(yùn)輸?shù)脑囼?yàn)物質(zhì)例如蔗糖或菊粉同時(shí)調(diào)整單層完整性并為了保證統(tǒng)計(jì)顯著性重復(fù)測(cè)定至少4次。
實(shí)施例15創(chuàng)傷損傷模型 流體撞擊腦損傷模型用于評(píng)價(jià)單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物或和單獨(dú)的聚合甲狀腺激素類(lèi)似物結(jié)合在一起的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其他的神經(jīng)發(fā)生因子在顯著的外傷性腦損傷后修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的能力。
I.流體撞擊腦損傷方法 用于這個(gè)研究的動(dòng)物是過(guò)秤250-300克的雄性Sprague-Dawley鼠(Charles River)。為了流體撞擊腦損傷的基本的外科預(yù)備在前面已描述。Dietrich，et al.，Acta Neuropathol.87250-258(1994)在這里通過(guò)引用并入全文。簡(jiǎn)短地，用3％氟烷、30％氧、和一氧化二氮的均衡使鼠麻醉。進(jìn)行氣管插管術(shù)并把鼠放在一立體定位的框架中。然后在右側(cè)的頂骨皮層上施行4.8毫米顱骨切開(kāi)術(shù)，前囟后3.8毫米和中線側(cè)面的2.5毫米。損傷管放在暴露的硬腦膜上并且通過(guò)粘合劑粘著。然后倒入齒的丙烯酸在損傷管的周?chē)?，然后將損傷管用明膠海綿塞住。將頭皮縫合閉合并將動(dòng)物放回它的盒子，允許恢復(fù)過(guò)夜。
第二天，流體撞擊腦損傷本質(zhì)上產(chǎn)生了，如Dixon，et al.，J.Neurosurg.67110-119(1987)和Clifton，et al.，J.Cereb.BloodFlow Metab.11114-121(1991)描述的。流體撞擊裝置由加滿的鹽的有機(jī)玻璃缸組成也就是說(shuō)備有傳感器室并且適合于鼠顱骨的損傷螺釘。金屬螺釘牢牢連接到插管的麻醉的鼠的塑料損傷管(70％一氧化二氮、1.5％氟烷、和30％氧，并且損傷通過(guò)撞擊活塞的擺錘下降引起損傷。鼠進(jìn)行輕的調(diào)節(jié)的頭部損傷，范圍從1.6到1.9大氣壓。大腦溫度用熱敏探示器插入右側(cè)臨時(shí)的肌肉中間接的監(jiān)測(cè)并維持37-37.5℃。也測(cè)量直腸溫度并且在監(jiān)控周期之前和整個(gè)監(jiān)控周期內(nèi)維持在37℃。
行為試驗(yàn) 三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的功能/行為試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)腦損傷后的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和反射功能。該試驗(yàn)已經(jīng)在文獻(xiàn)中完全地描述了，這些文獻(xiàn)包括Bederson，et al.，(1986)Stroke 17472-476；DeRyck，et al.，(1992)Brain Res.57344-60；Markgraf，et al.，(1992)Brain Res.575238-246；and Alexis，et al.，(1995)Stroke 262338-2346。
A.前肢放置試驗(yàn) 測(cè)量前肢放置對(duì)三個(gè)單獨(dú)的刺激(視覺(jué)的、觸覺(jué)的、和固有感受的)來(lái)評(píng)價(jià)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)的結(jié)合。DeRyck，et al.，Brain Res.57344-60(1992)。對(duì)于視覺(jué)放置微粒，研究人員把動(dòng)物垂直握住并且拿近到一個(gè)桌子上。放在桌上的四肢的標(biāo)準(zhǔn)位置記為“0”、延遲放置(＜2秒)記為“1”、沒(méi)有或延遲很長(zhǎng)的放置(＞2秒)記為“2”。當(dāng)動(dòng)物直著拿來(lái)首先記下各自的分，然后在動(dòng)物橫著拿來(lái)到桌上再記一次分(滿分每肢＝4)；在每一種情況下更高的分?jǐn)?shù)表示更多的不足)。對(duì)于觸覺(jué)放置微粒，握住動(dòng)物以便它看不見(jiàn)或用它的胡須接觸不到桌面當(dāng)動(dòng)物首先直著拿來(lái)到桌上然后橫著拿來(lái)到桌上。背前爪輕輕地接觸桌面。每次放置都按上面的辦法記分(滿分每肢＝4)。對(duì)于固有感受放置微粒，動(dòng)物僅直著拿來(lái)并對(duì)背的前抓給較大的壓力(滿分每肢＝2)。最后，測(cè)試動(dòng)物對(duì)放置前肢響應(yīng)通過(guò)桌面的胡須刺激的能力(滿分每肢＝2)。然后把第二高分加到一塊給出總的前肢放置分?jǐn)?shù)每肢(范圍＝0-12)。
B.橫梁平衡試驗(yàn) 橫梁平衡對(duì)運(yùn)動(dòng)原皮層的損害敏感。這些工作通過(guò)要求鼠在一窄橫梁上穩(wěn)定的平衡來(lái)評(píng)價(jià)平衡運(yùn)動(dòng)功能。Feeney，et al.，Science，217855-857(1982)；Goldstein，et al.，Behav.Neurosci.104318-325(1990)。這個(gè)測(cè)試包括手術(shù)前24小時(shí)的三個(gè)60-秒訓(xùn)練試驗(yàn)來(lái)獲得基本資料。該儀器由一個(gè)3/4英寸寬、10英寸長(zhǎng)、懸在桌上1英寸高的橫梁組成。鼠放在橫梁上并且必須用四肢在橫梁上維持穩(wěn)定的姿勢(shì)60秒。動(dòng)物的特性用Clifton，et al.，J.Cereb Blood Flow Metab.11I1 14-121(1991)的等級(jí)來(lái)計(jì)算，這個(gè)比例范圍從1到6，1分是正常的，6分表明動(dòng)物不能在橫梁上支撐自己。
C.橫梁走動(dòng)試驗(yàn) 這是感覺(jué)運(yùn)動(dòng)結(jié)合特別是檢查后肢功能的試驗(yàn)。這個(gè)試驗(yàn)儀器和計(jì)算方法由Feeney，et al.，Science，217855-857(1982)改編而來(lái)。1英寸寬、4英寸長(zhǎng)、懸于地面3英寸高的橫梁燈光暗的房間。在橫梁的遠(yuǎn)端是一個(gè)帶有狹窄入口的黑暗的目標(biāo)箱。沿著橫梁在相等的距離，放置四個(gè)3英寸金屬螺釘，傾斜遠(yuǎn)離橫梁中心。在橫梁的出發(fā)點(diǎn)一個(gè)白色噪聲發(fā)生器和強(qiáng)光源刺激動(dòng)物橫過(guò)橫梁并且進(jìn)入目標(biāo)箱。一旦進(jìn)入目標(biāo)箱，刺激終止。鼠到達(dá)目標(biāo)箱(數(shù)秒內(nèi))潛伏并且記錄作為橫過(guò)橫梁的后肢特性(根據(jù)1到7計(jì)算等級(jí))。7分表明正常走過(guò)橫梁小于2英尺滑動(dòng)，并且1分表明該鼠不能小于80秒內(nèi)橫過(guò)橫梁。手術(shù)以前三天訓(xùn)練每個(gè)老鼠來(lái)取得任務(wù)并且在三個(gè)連續(xù)的試驗(yàn)上達(dá)到正常表現(xiàn)(7分)。三個(gè)基本的試驗(yàn)在手術(shù)24小時(shí)收集，并且其后每日記錄檢查三個(gè)試驗(yàn)。計(jì)算潛伏的平均值和每天的分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例16甲狀腺激素類(lèi)似物
實(shí)施例17維A酸類(lèi)似物
實(shí)施例18結(jié)合維A酸的甲狀腺激素類(lèi)似物
T4-類(lèi)維生素A酸
T3-類(lèi)維生素A酸
DITPA-類(lèi)維生素A酸
GC1-類(lèi)維生素A酸
TRIAC-類(lèi)維生素A酸
TETRAC-類(lèi)維生素A酸 實(shí)施例19鹵化己烯雌酚類(lèi)似物
己烯雌酚 實(shí)施例20T4類(lèi)似物、鹵化己烯雌酚和維A酸的組合物
維A酸-己烯雌酚-維A酸 實(shí)施例21PET成像化合物的制備 一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的放射性顯影劑(實(shí)施例16-20)通過(guò)放射性的4-鹵化芐基衍生物和哌嗪衍生物反應(yīng)來(lái)制備。對(duì)PET成像優(yōu)選的是F-18標(biāo)記的4-氟芐基衍生物。制備4-氟-.sup.18F-鹵芐的一般方法的描述參見(jiàn)Iwata et al.，Applied Radiation andIsotopes(2000)，Vol.52，pp.87-92 實(shí)施例22SPECT成像化合物的制備 對(duì)于單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層照相(“SPECT”)，99mTc-標(biāo)記化合物是優(yōu)選的。對(duì)于這些化合物一般的合成途徑根據(jù)實(shí)施例16-20從化合物的非放射性類(lèi)似物開(kāi)始也就是說(shuō)與99mTc-鍵合螯合劑反應(yīng)，例如N2S2-螯合劑。該螯合劑的合成遵循標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，A.Mahmood et al.，A N2 S2-Tetradentate Chelate for Solid-PhaseSynthesisTechnetium，Rhenium in Chemistry and NuclearMedicine (1999)，Vol.5，p.71，or in Z.P.Zhuang et al.，Bioconjugate Chemistry(1999)，Vol.10，p.159中描述方法。
根據(jù)實(shí)施例16-20，螯合劑中的一個(gè)是或者直接鍵合到非放射性化合物的-N(R4)R5基團(tuán)的氮上或經(jīng)過(guò)包含有一到十個(gè)碳原子的烷基的連接部分，這里的烷基選擇性的包含一到十個(gè)-C(O)-基團(tuán)，一到十個(gè)-C(O)N(R)-基團(tuán)，一到十個(gè)-N(R)C(O)-基團(tuán)，，一到十個(gè)-N(R)-基團(tuán)，一到十個(gè)-N(R)2-基團(tuán)，一到十個(gè)羥基基團(tuán)，一到十個(gè)-C(O)O(R)-基團(tuán)，一到十個(gè)氧原子，一到十個(gè)硫原子，一到十個(gè)氮原子，一到十個(gè)鹵素原子，一到十個(gè)芳基基團(tuán)，和一到十個(gè)飽和的或不飽和的雜環(huán)，這里的R是氫或烷基。優(yōu)選的連接部分是-C(O)-CH2-N(H)-。
實(shí)施例23T4是αVβ3整聯(lián)蛋白的配體 為了確定T4是否是αVβ3整聯(lián)蛋白的配體、用[125I]T4培養(yǎng)2μg市場(chǎng)上可買(mǎi)到的純凈蛋白質(zhì)，將該混合物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上跑電泳。αVβ3鍵合放射性標(biāo)記的T4并且這個(gè)交互作用被未標(biāo)記T4競(jìng)爭(zhēng)性地中斷，這里[125I]T4培養(yǎng)之前將T4以濃度-依賴(lài)的方式加入αVβ3(圖24)。未標(biāo)記T4的加入在T4總濃度為10-7M(3×10-10M游離T4)使整聯(lián)蛋白鍵合到放射性標(biāo)記的配位體減少了13％，在T4總濃度為10-6M(1.6×10-9M游離T4)使整聯(lián)蛋白鍵合到放射性標(biāo)記的配位體減少了13％，10-5M未標(biāo)記的T4時(shí)抑制最大。使用非線性回歸，αVβ3和游離T4的相互作用確定有333pM的Kd值和371pM的EC50值。未標(biāo)記的T3在替代[125I]T4-鍵合到αVβ3不是很有效，總T3濃度10-4M時(shí)信號(hào)減少了28％。
實(shí)施例24T4鍵合到αVβ3由tetrac、RGD肽和整聯(lián)蛋白抗體阻斷 我們?cè)谇懊姹砻髁?，T4-刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞表面激活可以被碘化甲狀腺氨酸類(lèi)似物tetrac抑制，它阻止T4同質(zhì)膜的鍵合。在我們的放射性配體-鍵合測(cè)定中，tetrac對(duì)[125I]T4鍵合到純凈的αVβ3沒(méi)有影響，T4和αVβ3的結(jié)合在10-7M和10-5Mtetrac存在時(shí)分別減少了38％和90％(圖25)。為確定相互作用的專(zhuān)一性，RGD肽，它鍵合到αVβ3上細(xì)胞外基質(zhì)-鍵合位點(diǎn)，和RGE肽，它有一個(gè)谷氨酸殘基代替天冬氨酸殘基并且因此不鍵合αVβ3，想辦法加入它們來(lái)取代T4和整聯(lián)蛋白鍵合。RGD肽，而不是RGE肽的應(yīng)用，以劑量-依賴(lài)的方式降低了[125I]T4和αVβ3的相互作用(圖25)。
為了進(jìn)一步表征T4和αVβ3的相互作用，在加入[125I]T4之前向純凈的αVβ3中加入對(duì)αVβ3或αVβ5的抗體。加入1μg/mlαVβ3單克隆抗體LM609與未處理對(duì)照樣品相比較，減少整聯(lián)蛋白和T4間的復(fù)雜組成52％。增加LM609的量到2μg、4μg、和8μg/ml條帶密度分別減少64％、63％和81％(圖26)。當(dāng)一個(gè)不同的αVβ3單克隆抗體，SC7312，和整聯(lián)蛋白培養(yǎng)時(shí)可觀察到相類(lèi)似的結(jié)果。當(dāng)有1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml抗體存在時(shí)SC7312降低T4鍵合到αVβ3的能力分別為20％、46％、47％、59％。對(duì)αV和β3的單克隆抗體分別培養(yǎng)，不影響[125I]T4鍵合到αVβ3，表明結(jié)合需要從αVβ3的異二聚物復(fù)合體產(chǎn)生鍵合的口袋，沒(méi)必要在每一個(gè)單體上有一個(gè)特別的區(qū)域。為檢驗(yàn)條帶密度的減少是因?yàn)橥ㄟ^(guò)抗體的αVβ3的特異識(shí)別，在加入[125I]T4之前，用對(duì)αVβ5(P1F6)的單克隆抗體或鼠免疫球蛋白G培養(yǎng)αVβ3，這兩者都不影響整聯(lián)蛋白和放射性配體之間的復(fù)合體組成(圖26)。
實(shí)施例25T4-刺激的MAPK活化被激素鍵合的抑制劑和整聯(lián)蛋白αVβ3的抑制劑阻斷 研究了用生理水平的T4(總激素濃度10-7M，10-10M游離激素)處理30min的MCV-I細(xì)胞中磷酸化MAPK(pERK1/2)的核移位作用。結(jié)果與我們先前報(bào)導(dǎo)的一致，在30min之內(nèi)，T4導(dǎo)致磷酸化MAPK在CV-I細(xì)胞中核內(nèi)累積(圖27)。用指定濃度的αVβ3拮抗物預(yù)培養(yǎng)CV-I細(xì)胞16h，降低T4導(dǎo)致MAPK活化作用和移位作用的能力。RGD肽在10-8和10-7M濃度下的應(yīng)用對(duì)MAPK活化的作用很小。然而與對(duì)照培養(yǎng)基相比，10-6MRGD肽能夠抑制62％的MAPK磷酸化作用，當(dāng)培養(yǎng)基中RGD濃度為10-5M(85％降低)和10-4M(87％降低)時(shí)活化作用被最大限度地降低。在CV-I細(xì)胞中，用T4處理后，向培養(yǎng)基中加入非特異性RGE肽沒(méi)有影響MAPK磷酸化作用和核移位作用。
阻止T4結(jié)合到原生質(zhì)膜上的Tetrac是一種有效的T4-導(dǎo)致的MAPK活化作用抑制劑。當(dāng)T4濃度為10-6M時(shí)，與只用T4處理的對(duì)照培養(yǎng)基相比，tetrac降低86％的MAPK磷酸化作用和移位作用(圖27)。當(dāng)在使用T4之前向培養(yǎng)基中加入10-4M tetrac處理16小時(shí)時(shí)，抑制作用增加到97％。在用T4刺激之間16小時(shí)加入向培養(yǎng)基中加入單克隆抗體LM609也能降低T4-誘導(dǎo)的MAPK活化。T4處理之后，LM609在培養(yǎng)基中的濃度為0.01和0.001μg/ml時(shí)不影響MAPK活化作用。與單獨(dú)使用T4處理的細(xì)胞相比，在培養(yǎng)基中抗體的濃度提高到0.1、1、和10μg/ml時(shí)，能夠使細(xì)胞核部分的磷酸化MAPK水平降低29％、80％、和88％。
CV-I細(xì)胞用siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染為αV、β3或αV和β3，并在置于無(wú)血漿培養(yǎng)基之前恢復(fù)16小時(shí)。T4處理30min之后，采集細(xì)胞提取核內(nèi)蛋白或者RNA。Figure 28A說(shuō)明各個(gè)siRNA對(duì)靶分子整合素亞基的特異性。用αVsiRNA或αV和β3siRNAs轉(zhuǎn)染的CV-I細(xì)胞顯示減少的αV亞基RT-PCR產(chǎn)物，但當(dāng)細(xì)胞用對(duì)β3有特異性的siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，或者在不存在外源siRNA的情況下暴露于轉(zhuǎn)染反應(yīng)劑時(shí)，αVmRNA的表達(dá)不存在差異。相似地，用β3siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞已經(jīng)降低了β3mRNA的水平，但相對(duì)而言未改變的αVsiRNA的水平。無(wú)論siRNA是否進(jìn)入到細(xì)胞之內(nèi)，加入T430分鐘不改變對(duì)于αV或者β3的mRNA水平。
用western印記調(diào)節(jié)用分別對(duì)于αV和β3或二者結(jié)合物的siRNAs轉(zhuǎn)染的CV-I細(xì)胞中活化的MAPK水平(圖28B)。與母細(xì)胞系相比，用siRNA攪亂負(fù)控制處理的CV-I細(xì)胞具有稍微提高的T4-誘導(dǎo)活化的MAPK水平。單獨(dú)暴露于轉(zhuǎn)染反應(yīng)劑的細(xì)胞顯示與未轉(zhuǎn)染的CV-I細(xì)胞相似的MAPK磷酸化水平和模式。當(dāng)單一的αVsiRNA或β3siRNA或者其結(jié)合物被轉(zhuǎn)染入CV-I細(xì)胞中時(shí)，介質(zhì)處理的培養(yǎng)基中的磷酸化MAPK水平有所提高，但T4導(dǎo)致活化MAPK水平進(jìn)一步提高的能力受到抑制。
實(shí)施例26αVβ3抗體阻斷激素導(dǎo)致的血管新生 在CAM試驗(yàn)中，通過(guò)應(yīng)用生理濃度的T4能夠刺激血管新生(圖29A和圖29B的概括)。與PBS處理的細(xì)胞膜相比，置于CAM過(guò)濾片上的10-7M的T4使血管分支形成提高2.3倍(P＜0.001)。丙基硫氧嘧啶能夠阻止T4到T3的轉(zhuǎn)變，對(duì)T4引起的血管新生沒(méi)有影響。直接抗αVβ3的單克隆抗體LM609(10μg/過(guò)濾片)的加入能夠抑制對(duì)于T4的前血管生成反應(yīng)。
實(shí)施例27用于短期和長(zhǎng)期運(yùn)輸?shù)募谞钕偌に仡?lèi)似物生物相容性聚合結(jié)合物 草圖1甲狀腺激素類(lèi)似物

草圖2顯示棍、球和棍、盤(pán)形和空間填充物模型的分子模型3D視圖，用于相對(duì)評(píng)價(jià)。
棍模型兩套分子-下面一套顯示分子密度 1套Triac和Tetrac(黃色表示碘，紅色表示)
2套
球和棍模型Triac和Tetrac-下面一套顯示分子密度和第1套的地形陣列分布。
1套
2套
盤(pán)狀模型Triac和Tetrac
空間填充物模型Triac和Tetrac
甲狀腺激素類(lèi)似物和抗癌活性 甲狀腺激素代謝產(chǎn)物Triac和tetrac可用于處理的甲狀腺癌從而富集并作為需要的治療劑替代品。
商業(yè)購(gòu)得的甲狀腺激素及其類(lèi)似物 市場(chǎng)上可購(gòu)得的合成甲狀腺激素的商標(biāo)名稱(chēng)包括Unithroid、Levothroid、Synthroid和Levoxyl。常用的制劑包括Levo-T、Levothyroxine Sodium和Novothyrox。
天然的甲狀腺激素得自屠宰牲畜的甲狀腺，以干燥粉末形式作為食品增補(bǔ)劑出售。這種干燥的產(chǎn)品可能包含不需要的動(dòng)物蛋白質(zhì)、T3和T4化合物不適當(dāng)?shù)谋壤妥畈煌扑]使用的合成粘合劑。由于動(dòng)物的腺體不同，每批產(chǎn)品T3與T4的比例可能是變化的，且對(duì)于人類(lèi)患者沒(méi)有適當(dāng)?shù)暮愣ü┙o方式。由于系統(tǒng)在劑量、傳遞和有效性方面的復(fù)雜性，十分需要標(biāo)準(zhǔn)的、恒定的、限定的劑量和瞬時(shí)釋放方式，使其能夠被人類(lèi)或其他應(yīng)用安全的使用。
甲狀腺激素調(diào)節(jié)的釋放系統(tǒng) 直至今日，在美國(guó)，可以使用甲狀腺激素代替治療的非特異性和標(biāo)準(zhǔn)化治療方式治療病人。根據(jù)個(gè)性化需要，我們提議了一種長(zhǎng)期永久的個(gè)體甲狀腺成分緩釋系統(tǒng)，在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中預(yù)先排列了劑量、所需活性和反應(yīng)曲線。我們通過(guò)將結(jié)合甲狀腺成分的聚合物傳遞到產(chǎn)物位點(diǎn)來(lái)確定劑量并以限定的方式分布。通過(guò)可水解性和不可水解性特征，提議的結(jié)合物(圖3-草圖a)能夠?qū)崿F(xiàn)具有短期和長(zhǎng)期的釋放容量。從而實(shí)現(xiàn)用于特異性心血管和傷口愈合性質(zhì)的最小劑量水平傳遞。
草圖3有序和隨機(jī)的聚合結(jié)合物
O＝藥物/有機(jī)化合物/整體結(jié)合 藥物/API結(jié)合物的局部聚合模型 結(jié)合的給藥系統(tǒng)在給藥系統(tǒng)發(fā)展過(guò)程之中，合成聚合物結(jié)合的化學(xué)體已經(jīng)普及。在應(yīng)用和交易中，可以使用各種合成的、天然的和生物聚合而得的側(cè)基基團(tuán)與有效的生物可降解的骨架聚合物。為了達(dá)到目的，可以根據(jù)結(jié)合產(chǎn)品最終的特性，按照它們的親水性、疏水性、和被酶、輔因子和生物常用酸水解的性質(zhì)，使用聚烷基乙二醇、聚酯、聚酸酐、聚糖和聚氨基酸進(jìn)行結(jié)合。
聚合物結(jié)合-合成及純化 我們建議建立一個(gè)對(duì)于對(duì)照的結(jié)合產(chǎn)物的庫(kù)，包括生物高聚物的可水解的和不可水解的聚合結(jié)合產(chǎn)物。一個(gè)試驗(yàn)的例子從每類(lèi)聚合產(chǎn)物按照它的涉及輸送、運(yùn)輸、半衰期和退化和或糜爛資料的藥物動(dòng)力學(xué)對(duì)它們的詳細(xì)研究進(jìn)化而來(lái)。該系列也試著去制備并存的或組合合成的庫(kù)設(shè)計(jì)，這些組合合成適于對(duì)底物的類(lèi)似的化學(xué)種類(lèi)的反應(yīng)，并利用DCC、DCC/基于HOBt、和其它水溶性的試劑包括連接鍵的放置和為了將來(lái)的發(fā)展在聚合結(jié)合組合的或并行的合成中基于合成的策略通常使用的NHS酯。利用在PRI的合成器的現(xiàn)有設(shè)備可得到這個(gè)效果，并且每個(gè)產(chǎn)物對(duì)于生物檢驗(yàn)體系的適應(yīng)性分別來(lái)純化。
草圖4從自然的、合成的和聚肽高聚鏈的典型的聚合結(jié)合結(jié)構(gòu)
n＝鏈的長(zhǎng)度 R＝H，具有兩種不同功能的PEG-連接-T3 R＝I，具有兩種不同功能的PEG-連接-T4
甲氧基-PEG-連接-T4甲狀腺產(chǎn)物的聚合結(jié)合物
R＝HEMA鏈的重復(fù)單元 聚-(HEMA)-連接-T4-結(jié)合物
聚-(乙烯基-合-馬來(lái)酐)固定結(jié)合物 A＝甲狀腺部分(通過(guò)氨基酸結(jié)合)
R＝重復(fù)的鏈單元 A＝甲狀腺部分(通過(guò)碳末端結(jié)合) 聚-(丙交酯-合-賴(lài)氨酸)固定結(jié)合物
R1＝糖鏈的單體 R2＝甲狀腺部分 透明質(zhì)酸綁定結(jié)合物
R＝甲狀腺部分T3/T4/DITPA/GC-1 多重功能聚氨胺上固定的甲狀腺部分
A＝結(jié)合的選擇的甲狀腺部分 可動(dòng)的甲狀腺聚肽結(jié)合物 聚合結(jié)合物-物理和化學(xué)的表征 使用核磁共振(高和低場(chǎng)-質(zhì)子和碳，任何可使用的地方使用DEPT，HOMOCOSY和HETEROCOSY/HETCOR)、紅外，質(zhì)譜儀、高效液相色譜、對(duì)穩(wěn)定適應(yīng)性和降解速率分布的熱和環(huán)境退化分析對(duì)聚合綁定化合物進(jìn)行徹底的光譜分析和色譜分析。
釋放和穩(wěn)定性研究 對(duì)定量釋放分析的詳細(xì)的高效液體色譜分析在我們對(duì)每個(gè)甲狀腺產(chǎn)物建立的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行，也就是GC-1、T3、T4和DITPA以及Triac和Tetrac與個(gè)別聚合物和聚合物共軛產(chǎn)物的色譜和光譜分析的分布圖。
對(duì)結(jié)合的聚合物相容性標(biāo)準(zhǔn) 生物可降解的和生物相容的聚合物已經(jīng)指定為有希望的載體作為長(zhǎng)期和短時(shí)間運(yùn)載工具包括不可水解的聚合結(jié)合物(表1)。PEG和PEO是最普通的分子量范圍很寬的羥基端聚合物對(duì)可溶性(簡(jiǎn)易的載體模式)、降解時(shí)間和結(jié)合的解除來(lái)挑選。一端保護(hù)的甲氧基-PEG也被用作直鏈能膨脹的載體從而降低在亞細(xì)胞運(yùn)輸期間蛋白質(zhì)附著或粘著的概率。乙烯和乙酸乙烯酯的某一共聚物，也就是說(shuō)，本質(zhì)上有特別好的生物適應(yīng)性低結(jié)晶度和疏水性的EVAc是對(duì)包囊調(diào)節(jié)的藥物輸送載體的理想候選。
證明有高半衰期和體系內(nèi)保留的性質(zhì)的聚合物將保證結(jié)合的目的。從乳酸和羥基乙酸中大多數(shù)普通的和推薦的可生物降解的聚合物間可以使用。L-丙交酯的共聚物、和L-賴(lài)氨酸是有用的，因?yàn)樗陌饭倌軋F(tuán)對(duì)酰胺鍵形成的有效性，并且這充當(dāng)載體和可運(yùn)輸?shù)募谞钕倩衔锿ㄟ^(guò)所有的甲狀腺組分的羧基部分連接在一起的比較長(zhǎng)久維持的共價(jià)鍵。
從纖維素、幾丁質(zhì)、右旋糖酐、聚蔗糖、果膠、角叉菜膠(所有的亞類(lèi))、和海藻酸鹽和一些它們的半合成衍生物中的自然產(chǎn)生的多糖是理想載體，因?yàn)樗母呱镞m應(yīng)性、生物體系熟悉的降解產(chǎn)物(從葡萄糖和果糖的單糖)、親水性、可溶性、對(duì)聚合基質(zhì)的較長(zhǎng)久穩(wěn)定的蛋白質(zhì)固定化/相互作用。這提供一個(gè)殼來(lái)額外的保護(hù)聚合基質(zhì)避免將來(lái)降解并增加結(jié)合的有效半衰期。
從血清白蛋白、膠原、白明膠和聚L-賴(lài)氨酸、聚L-丙氨酸、聚L-絲氨酸的蛋白質(zhì)和多肽是基于有有利的載體分子生物降解、生物適應(yīng)性和適度的釋放時(shí)間的自然的氨基酸。聚L-絲氨酸更有興趣，是由于它的不同鏈衍生物，例如，聚絲氨酸酯、聚絲氨酸亞胺和普通的對(duì)特殊的共價(jià)結(jié)合有空余位點(diǎn)的聚絲氨酸聚合主鏈。
從異丁烯酸衍生聚合物的合成的水凝膠已經(jīng)經(jīng)常用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用因?yàn)樗鼈兣c活組織的相似性。最廣泛使用的合成水凝膠是丙烯酸、丙烯酰胺和2-甲基丙烯酸羥(HEMA)的聚合物。聚HEMA是便宜的、生物相容的、可利用的伯醇側(cè)鏈延長(zhǎng)功能用來(lái)結(jié)合和適于眼睛、眼內(nèi)及其他眼科的應(yīng)用，這使得他們成為理想的藥物輸送物。pHEMA對(duì)細(xì)胞附著是免疫的并提供零細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這使得他們成為體內(nèi)輸送系統(tǒng)的理想候選。
隨著粗DITPA結(jié)合產(chǎn)物的發(fā)展已經(jīng)獲得合成甲狀腺類(lèi)似物DITPA結(jié)合物庫(kù)設(shè)計(jì)程序。通過(guò)Dicycolhexyl碳二亞胺和通過(guò)其他的親水的和疏水性的耦合試劑PVA和PEG親水性聚合物連接在一起，也在不斷發(fā)展。
在固相合成器上的文庫(kù)合成進(jìn)化設(shè)計(jì)處于最后階段，根據(jù)試驗(yàn)系統(tǒng)和參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的共性，將會(huì)啟用它的高流通量篩選(HTS)模型。以結(jié)構(gòu)傳輸分析(SDA合成)為目的，累計(jì)結(jié)合物傳送時(shí)間、半衰期和構(gòu)思穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)分析。下表是用于制備的聚合結(jié)合物(表8)。
表8根據(jù)化學(xué)種類(lèi)反應(yīng)性和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，用于制備的指定聚合結(jié)合物文庫(kù) 其他實(shí)施方式 雖然本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)結(jié)合詳細(xì)的說(shuō)明進(jìn)行了描述，但是前面的說(shuō)明只起到指示性作用，并不能限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)來(lái)定義。本發(fā)明的其他方面、優(yōu)勢(shì)和修飾包括在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.治療服從促進(jìn)血管新生治療的病況的方法，所述方法包括向需要治療的患者給藥一定量的甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式，能夠在所述患者體內(nèi)有效的促進(jìn)血管新生。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述服從促進(jìn)血管新生治療的病況選自閉塞的血管病、冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、勃起的機(jī)能障礙、心肌梗死、缺血、撞擊、外周動(dòng)脈血管的病癥和傷口。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀腺激素或類(lèi)似物與下列成員結(jié)合，這些成員包括聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚物、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、和瓊脂糖。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀腺激素類(lèi)似物是左旋甲狀腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、3，5-二甲基-4-(4′-hydroy-3′-異丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或3，5-二碘甲狀腺丙酸(DITPA)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式的給藥方式是腸胃外給藥、口服給藥、直腸給藥、局部給藥、或其結(jié)合。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述腸胃外給藥是皮下注射、腹腔內(nèi)給藥、肌肉注射、靜脈注射或其結(jié)合。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式被裝入膠囊或整合入微粒、脂質(zhì)體、或聚合物中。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中聚合物是多聚糖脂類(lèi)、聚交酯或其共聚物。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中脂質(zhì)體或微粒的尺寸小于大約200nm。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中對(duì)脂質(zhì)體或微粒進(jìn)行靜脈給藥。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中脂質(zhì)體或微粒可以存放在缺血性組織周?chē)拿?xì)血管層。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式通過(guò)導(dǎo)管給藥。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式存在于一種聚合體系中，這種聚合體系通過(guò)所述導(dǎo)管應(yīng)用于血管內(nèi)部。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式與一種或一種以上化合物共同給藥，所述化合物包括生長(zhǎng)因子、血管擴(kuò)張劑、阻凝劑、和其結(jié)合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述生長(zhǎng)因子選自轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子α(“TGFα”)、轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子β(″TGFβ″)、基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、和血管通透因子。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述血管擴(kuò)張劑是腺苷、腺苷衍生物或其結(jié)合物。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述抗凝劑是肝素、肝素衍生物、抗-因子X(jué)a、抗凝血酶、乙酰水楊酸、氯吡格雷或其結(jié)合物。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式先于或后于所述生長(zhǎng)因子、血管擴(kuò)張劑、阻凝劑或其結(jié)合物注射給藥。
19.促進(jìn)血管沿著或圍繞醫(yī)療器材生成的方法，所述方法包括在將裝置插入病人體內(nèi)之前，用甲狀腺激素、甲狀腺激素類(lèi)似物或其聚合體形式包覆裝置。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述包覆步驟進(jìn)一步包括用生長(zhǎng)因子、血管擴(kuò)張劑、阻凝劑、或其結(jié)合物包覆裝置。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述醫(yī)療器材是擴(kuò)張器、導(dǎo)管、套管、或電極。
22.用于治療服從抑制血管生成療法的病況的方法，所述方法包括對(duì)所需患者給藥一定量的抗血管生成劑，在所述患者體內(nèi)有效的抑制血管生成。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述服從抑制血管生成療法的病況選自原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和糖尿病性視網(wǎng)膜病。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抗血管生成劑是四碘甲腺乙酸(TETRAC)、三碘甲腺乙酸(TRIAC)、單克隆抗體LM609、XT 199或其結(jié)合物。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中抗血管生成劑的給藥方式是腸胃外給藥、口服給藥、直腸給藥、局部給藥或其結(jié)合。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中抗血管生成劑與一種或一種以上其他抗血管生成治療劑或化療劑一起共同給藥。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中抗血管生成劑在細(xì)胞表面起作用。
28.一種血管生成劑，包括甲狀腺激素或其類(lèi)似物。
29.一種血管生成劑，包括甲狀腺激素或其與聚合物結(jié)合的類(lèi)似物。
30.如權(quán)利要求29所述的血管生成劑，其中所述類(lèi)似物選自圖20、表格A-D列舉的化合物。
31.如權(quán)利要求29所述的血管生成劑，其中所述甲狀腺激素類(lèi)似物是左旋甲狀腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、3，5-二甲基-4-(4′-hydroy-3′-異丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或3，5-二碘甲狀腺丙酸酸(DITPA)。
32.如權(quán)利要求29所述的血管生成劑，其中所述聚合物是聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚物、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸或瓊脂糖。
33.如權(quán)利要求29所述的血管生成劑，其中所述結(jié)合是通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合。
34.如權(quán)利要求33所述的血管生成劑，其中所述共價(jià)鍵是酯鍵或酸酐連接鍵。
35.一種藥物制劑，包括在藥學(xué)可接受的載體中的權(quán)利要求29的血管生成劑。
36.如權(quán)利要求35所述的藥物制劑，進(jìn)一步包括一種或一種以上藥學(xué)可接受的賦形劑。
37.如權(quán)利要求35所述的藥物制劑，其中所述血管生成劑被裝入膠囊或并入微粒、脂質(zhì)體、或聚合物中。
38.如權(quán)利要求37所述的藥物制劑，其中脂質(zhì)體或微粒的尺寸小于200nm。
39.如權(quán)利要求35所述的藥物制劑，其中所述制劑以腸胃外給藥、口服給藥、直腸給藥或局部給藥方式或其結(jié)合給藥。
40.如權(quán)利要求35所述的藥物制劑，其中所述制劑與一種或一種以上化合物共同對(duì)所需患者給藥，一種或一種以上化合物選自生長(zhǎng)因子、血管擴(kuò)張劑、阻凝劑、和其結(jié)合物。
41.用于治療神經(jīng)變性的疾病或不適的藥物組合物，包括治療有效量的一種或一種以上甲狀腺激素類(lèi)似物。
42.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述甲狀腺激素類(lèi)似物是T3、DITPA、或GC-I。
43.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述甲狀腺激素類(lèi)似物與聚合物相結(jié)合。
44.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述聚合物選自聚乙烯醇、聚乳酸、丙烯酸酐、聚乙二醇、纖維素、和樹(shù)枝狀大分子。
45.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述甲狀腺激素類(lèi)似物與納米粒子結(jié)合。
46.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包括前血管新生因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)發(fā)生因子、消炎劑、抗氧化劑或其結(jié)合物。
47.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其中所述前血管新生因子是FGF或VEGF。
48.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其中所述抗氧化劑是維生素C、維生素E、似白藜蘆醇化合物或其結(jié)合物。
49.如權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其中所述消炎劑是選自非甾醇類(lèi)化合物、胰島素感光劑、和蛋白體酶抑制劑的化合物。
50.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中該組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)可接受的賦形劑。
51.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述治療有效量的劑量在1到100mg之間。
52.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病或不適選自運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺陷、肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、脊髓損傷、脫髓鞘疾病、脊髓病。
53.治療神經(jīng)變性疾病或不適的方法，所述方法包括向有需要的患者給藥藥學(xué)有效量的藥物組合物，該藥物組合物包括一種或一種以上甲狀腺激素類(lèi)似物。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中藥物組合物與神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)發(fā)生因子、抗氧化劑、消炎劑或其結(jié)合物共同給藥。
55.修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)途徑損傷的方法，所述方法包括向有需要的患者給藥藥學(xué)有效量的藥物組合物，該藥物組合物包括一種或一種以上甲狀腺激素類(lèi)似物。
56.用于診斷神經(jīng)變性疾病的顯象劑，包括與轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白結(jié)合的標(biāo)記的甲狀腺激素類(lèi)似物。
57.如權(quán)利要求56所述的顯象劑，其中所述顯象劑經(jīng)過(guò)血腦屏障。
58.如權(quán)利要求56所述的顯象劑，其中所述甲狀腺激素類(lèi)似物選自T3、T4、DITPA、GC-I。
59.如權(quán)利要求56所述的顯象劑，其中所述甲狀腺激素類(lèi)似物與聚合物相結(jié)合。
60.如權(quán)利要求56所述的顯象劑，其中所述甲狀腺激素類(lèi)似物與樹(shù)枝狀高分子相結(jié)合。
61.如權(quán)利要求56所述的顯象劑，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。
62.如權(quán)利要求61所述的顯象劑，其中所述顯象劑抑制淀粉狀蛋白纖維的形成。
63.如權(quán)利要求56所述的顯象劑，其中所述顯象劑通過(guò)電子發(fā)射斷層掃描、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層照相、或磁共振成象儀成象。
64.如權(quán)利要求56所述的顯象劑，其中所述甲狀腺激素類(lèi)似物與視黃酸、鹵化己烯雌酚、或其類(lèi)似物相結(jié)合。
65.用于診斷阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括對(duì)懷疑已經(jīng)患有或可能患有阿爾茨海默氏病的患者給藥顯象劑，所述顯象劑包括與轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白結(jié)合的標(biāo)記的甲狀腺激素類(lèi)似物，并使用腦顯象技術(shù)，形成至少一個(gè)顯示顯象劑在患者大腦中分布的圖像，所述腦顯象技術(shù)選自電子發(fā)射斷層掃描、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層照相、或磁共振成象儀。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了治療患有涉及到血管新生疾病的主體的方法，包括給藥有效用量的聚合形態(tài)的甲狀腺激素，或它的拮抗物，來(lái)促進(jìn)或抑制患者體內(nèi)的血管新生。聚合形式的甲狀腺激素組合物，或甲狀腺激素類(lèi)似物，在這里也被公開(kāi)。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101102758SQ200580038970
公開(kāi)日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2005年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者莎克爾·A·莫薩, 費(fèi)思·B·戴維斯, 保羅·J·戴維斯 申請(qǐng)人:奧德威研究院, 阿爾伯尼藥學(xué)院