專利名稱：：用于進(jìn)行抗葡萄球菌接種的免疫原性組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及葡萄球菌免疫原性組合物和疫苗，它們的制備以及這些組合物在醫(yī)學(xué)中的用途。更特別地，它涉及疫苗組合物，包含用于治療或預(yù)防葡萄球菌感染的抗原的組合。也提供了所述疫苗在醫(yī)學(xué)中的使用和它們的制備方法。背景近年來(lái)，隨著血管內(nèi)設(shè)備的使用增加，在社區(qū)獲得的和在醫(yī)院獲得的感染數(shù)量都已經(jīng)增加了。在醫(yī)院獲得的(醫(yī)源性)感染是發(fā)病和死亡的主要原因，更特別是在美國(guó)，它每年影響了超過(guò)200萬(wàn)患者。根據(jù)各種研究，美國(guó)患者的大約6%在他們呆在醫(yī)院期間將獲得感染。估計(jì)1992年在美國(guó)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)超過(guò)45億美元(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev.6;428)。大多數(shù)頻發(fā)感染是尿道感染(UTI-感染的33%),接下來(lái)是肺炎(15.5%)，外科手術(shù)部位感染(14.8%)以及原發(fā)血流感染(13%)(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev,6;428)。金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性的葡萄球菌(大多數(shù)是表皮葡萄球菌)、腸球菌種、大腸桿菌以及綠膿桿菌是主要的醫(yī)源性病原體。盡管那些病原體差不多引起同樣數(shù)量的感染，但是它們可引起的失調(diào)的嚴(yán)重性再加上抗生素抗性的分離菌的頻率，對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的這個(gè)排位進(jìn)行平衡，它們成為了最重要的醫(yī)源性病原體。金黃色葡萄球菌是有著顯著發(fā)病率和死亡率的醫(yī)源性感染的最通常原因(Romero-Vivasetal1995，Infect.Dis.21;1417)。它是骨髓炎、心內(nèi)膜炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、肺炎、膿腫以及中毒性休克綜合征的一些病例的原因。表皮葡萄球菌是正常的皮膚共生生物，也是引起植入的醫(yī)療設(shè)備的感染以及在外科手術(shù)部位的感染的重要機(jī)會(huì)致病菌。被金黃色葡萄球菌感染的醫(yī)療設(shè)備包括心臟起搏器、腦脊液分流器、連續(xù)流動(dòng)的腹膜透析導(dǎo)管、整形外科設(shè)備以及人工心臟瓣膜。用抗生素治療金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，青霉素是首選藥物，而萬(wàn)古霉素用于曱氧苯青霉素抗性的分離菌。自1980年代以來(lái)，對(duì)抗生素呈現(xiàn)廣鐠抗性的葡萄球菌菌抹的百分比已經(jīng)變得曰益普遍(Panliloetal1992，Infect.Control.Hosp.Epidemiol.13;582)，造成了對(duì)有效的抗菌治療的威脅。此外，近來(lái)出現(xiàn)的萬(wàn)古霉素抗性的金黃色葡萄球菌已經(jīng)引起了恐懼，害怕曱氧苯青霉素抗性的金黃色葡萄球菌菌林將會(huì)產(chǎn)生并擴(kuò)散，對(duì)此還沒(méi)有可用的有效治療。已經(jīng)研究了在被動(dòng)免疫療法中使用抗葡萄球菌抗原的抗體這一備選方法。包括給予多克隆抗血清的療法正在研發(fā)之中(WO00/15238，WO00/12132)，以及用抗脂磷壁酸的單克隆抗體進(jìn)行治療(WO98/57994)。備選方法將是使用主動(dòng)疫苗接種來(lái)產(chǎn)生對(duì)葡萄球菌的免疫應(yīng)答。已經(jīng)確定了用作疫苗組分而包含的幾種候選物。這些候選物包括纖連蛋白結(jié)合蛋白(US5840846)、MHCII類似物(US5648240)、纖維蛋白原結(jié)合蛋白(US6008341)、GehD(US2002/0169288)、膠原蛋白結(jié)合蛋白(US6288214)、SdrF、SdrG和SdrH(WO00/12689)、突變體SEA和SEB外毒素(WO00/02523)以及52kDa玻連蛋白結(jié)合蛋白(WO01/60852)。金黃色葡萄球菌基因組已經(jīng)被測(cè)序，并已經(jīng)確定了許多編碼序列(EP786519，WO02/094868)。對(duì)于表皮葡萄球菌同樣如此(WO01A34809)。作為該方法的改進(jìn)，其他人已經(jīng)確定了被來(lái)自患有葡萄球菌感染的患者的超免疫血清所識(shí)別的蛋白質(zhì)(WO01/98499，WO02/059148)。靶向金黃色葡萄球菌或靶向它所產(chǎn)生的外蛋白的疫苗的首次產(chǎn)生已經(jīng)獲得了有限成功(Lee1996TrendsMicrobiol.4;162)。仍然存在研發(fā)針對(duì)葡萄球菌感染的有效疫苗的需求。因此，本發(fā)明提供了包含至少兩種不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物，所述蛋白或其免疫原性片段選自以下至少兩組蛋白或免疫原性片段組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結(jié)合蛋白或其免疫原性片段，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自、溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig和MAP;組b)至少一種葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC和NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；組c)至少一種葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNAIII活化蛋白(RAP)。圖1-優(yōu)選蛋白質(zhì)的多肽序列。表1提供了有關(guān)每個(gè)SEQID代表哪個(gè)蛋白質(zhì)的信息。圖2-編碼優(yōu)選蛋白質(zhì)的核苦酸序列。表1提供了有關(guān)每個(gè)SEQID編碼哪個(gè)蛋白質(zhì)的信息。圖3-天然條件下a毒素的純化。圖A顯示了a毒素純化期間所制備樣品的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE。第1道-分子量標(biāo)志，笫2道-含有過(guò)量表達(dá)a毒素的可溶性級(jí)分，第3道-從Ni-NTA柱流過(guò)，第4道-用10%緩沖液B洗脫的級(jí)分，第5道-用20%緩沖液B洗脫的級(jí)分，第6道-用30。/。緩沖液B洗脫的級(jí)分，第7道-用50%緩沖液B洗脫的級(jí)分，第8道-用75。/。緩沖液B洗脫的級(jí)分，第9道和笫10道-用100%緩沖液B洗脫的級(jí)分，第11道"秀導(dǎo)前在T=0時(shí)的細(xì)菌，第12道-誘導(dǎo)后在T=4時(shí)的細(xì)菌，第13道-細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，第14道國(guó)可溶性級(jí)分，第15道-不溶性級(jí)分。圖B顯示了10、5、2和1pi純化a毒素的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE。圖4-變性條件下的SdrC的純化。圖A顯示了a毒素純化期間所制備樣品的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE。泳道M-分子量標(biāo)志，泳道Start-由含有過(guò)量表達(dá)SdrC的不溶性級(jí)分所形成的上清液，泳道FTl-從M-NTA柱流過(guò)，泳道C-用漂洗緩沖液C洗脫的級(jí)分，泳道D-用緩沖液D洗脫的級(jí)分，道E-用緩沖液E洗脫的級(jí)分。圖B顯示了1、2、5和10pl純化SdrC的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE。圖5-在包被了純化蛋白質(zhì)的平板中抗葡萄球菌蛋白質(zhì)抗血清的ELISA結(jié)果。合并小鼠pre-使用提取自接種前小鼠的合并的血清的結(jié)果。合并小鼠PostIII-使用免疫后提取的合并的小鼠血清的結(jié)果。合并兔pre-使用提取自接種前兔的合并的血清的結(jié)果。合并兔PostIII-使用免疫后提取的合并的兔血清的結(jié)果。Blc-陰性對(duì)照。圖6-在包被了殺死的葡萄球菌的平板上產(chǎn)生的抗葡萄球菌蛋白質(zhì)的小鼠抗血清的ELISA結(jié)果。圖A使用由金黃色葡萄球菌血清型5殺死的完整細(xì)胞所包被的平板。圖B使用由金黃色葡萄球菌血清型8殺死的完整細(xì)胞所包被的平板。圖C使用由表皮葡萄球菌殺死的完整細(xì)胞所包被的平板。用方塊符號(hào)標(biāo)記的線顯示使用來(lái)自小鼠的抗血清的ELISA結(jié)果，該小鼠用所標(biāo)明的葡萄球菌蛋白質(zhì)免疫三次。用菱形符號(hào)標(biāo)記的線顯示免疫前小鼠血清的ELISA結(jié)果。圖7-在包被了殺死的葡萄球菌的平板上產(chǎn)生的抗葡萄球菌蛋白質(zhì)的兔抗血清的ELISA結(jié)果。圖A使用由金黃色葡萄球菌血清型5殺死的完整細(xì)胞所包被的平板。圖B使用由金黃色葡萄球菌血清型8殺死的完整細(xì)胞所包被的平板。圖C使用由表皮葡萄球菌殺死的完整細(xì)胞所包被的平板。用方塊符號(hào)標(biāo)記的線顯示使用來(lái)自兔的抗血清的ELISA結(jié)果，該小鼠用所標(biāo)明的葡萄球菌蛋白質(zhì)免疫三次。用菱形符號(hào)標(biāo)記的線顯示免疫前兔血清的ELISA結(jié)果。詳細(xì)描述本發(fā)明公開(kāi)了葡萄球菌抗原的特定組合，當(dāng)其組合時(shí)，引起有效治療或預(yù)防葡萄球菌感染的免疫原性組合物的產(chǎn)生。本發(fā)明的免疫原性組合物合適地?fù)饺肓藚⑴c不同葡萄球菌感染的抗原。所述免疫原性組合物以針對(duì)葡萄球菌功能的不同方面的免疫應(yīng)答為目標(biāo)，因此能夠誘導(dǎo)特別優(yōu)選的免疫應(yīng)答。葡萄球菌感染的發(fā)展經(jīng)過(guò)幾個(gè)不同階段。例如，葡萄球菌的生存周期包括共棲增殖、通過(guò)接觸相鄰組織或血流而開(kāi)始感染、在血液中的厭氧增殖、金黃色葡萄球菌毒力決定子與宿主防御機(jī)制之間的相互作用以及誘導(dǎo)并發(fā)癥包括心內(nèi)膜炎、轉(zhuǎn)移性膿腫形成和敗血病綜合征。細(xì)菌表面上的不同分子將參與感染周期的不同步驟。通過(guò)以針對(duì)參與葡萄球菌感染不同步驟的有效量的特定抗原的組合的免疫應(yīng)答為目標(biāo)，能夠產(chǎn)生功效增強(qiáng)的葡萄球菌免疫原性組合物或疫苗。特別地，來(lái)自不同類型的某些抗原的組合，其中一些參與對(duì)宿主細(xì)胞的粘附，其中一些參與鐵捕獲或其它轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能，其中一些是毒素或毒力調(diào)節(jié)劑和免疫優(yōu)勢(shì)抗原，能夠引起防止多階段感染的免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^(guò)如實(shí)施例中描述的動(dòng)物模型分析法測(cè)定和/或j吏用如實(shí)施例中描述的調(diào)理吞噬作用分析法測(cè)定免疫應(yīng)答的有效性。本發(fā)明的一個(gè)額外優(yōu)點(diǎn)是免疫原性組合物中來(lái)自不同蛋白家族的本發(fā)明的抗原組合將能夠產(chǎn)生抗更廣泛菌林的保護(hù)作用。本發(fā)明涉及包含多種蛋白的免疫原性組合物，所述蛋白選自至少兩類不同的蛋白，具有具有葡萄球菌的不同功能。這樣的蛋白質(zhì)種類的例子是胞外結(jié)合蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白諸如Fe捕獲蛋白，毒素或毒力調(diào)節(jié)劑以及其它免疫優(yōu)勢(shì)蛋白質(zhì)。本發(fā)明的疫苗組合能夠有效抗同源葡萄球菌菌抹(得到抗原的菌林)，并且優(yōu)選也抗異源葡萄球菌菌林。本發(fā)明的免疫原性組合物包含等于或多于2、3、4、5或6種的選自2或3個(gè)以下組的多種蛋白質(zhì)組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結(jié)合蛋白或其免疫原性片段，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP畫(huà)2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig和MAP;組b)至少一種葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC和NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；組c)至少一種葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNAIII活化蛋白(RAP)。例如，第一種蛋白質(zhì)選自組a)、b)或c)，第二種蛋白質(zhì)選自一個(gè)組，該組選自組a)、b)和c)，其不包括第二種蛋白質(zhì)。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組a)的蛋白質(zhì)以及選自組b)和/或組c)的額外蛋白質(zhì)。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組b)的抗原以及選自組c)和/或組a)的額外蛋白質(zhì)。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組c)的抗原以及選自組a)和/或組b)的額外蛋白質(zhì)。本發(fā)明的免疫原性組合物合適地含有來(lái)自金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的蛋白。蛋白質(zhì)本發(fā)明的免疫原性組合物包含分離的蛋白質(zhì)，其包含與圖1的任意序列具有至少85%同一性、優(yōu)選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少97-99%或完全同一性的氨基酸序列。本文在明確提及蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選指天然或重組的、全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或者任選地已經(jīng)去除了任何信號(hào)序列的成熟蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可直接從葡萄球菌菌林中分離或者通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)?？蓪⒌鞍踪|(zhì)的免疫原性片段加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中。這些片段是包含從蛋白質(zhì)的氨基酸序列連續(xù)選取的至少10個(gè)氨基酸、優(yōu)選20個(gè)氨基酸、更優(yōu)選30個(gè)氨基酸、更優(yōu)選40個(gè)氨基酸或50個(gè)氨基酸、最優(yōu)選100個(gè)氨基酸的片段。此外，這樣的免疫原性片段是與針對(duì)葡萄球菌蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的抗體有免疫反應(yīng)的，或者是與通過(guò)用葡萄球菌感染而產(chǎn)生的抗體有免疫反應(yīng)的。免疫原性片段也包括以有效劑量給予時(shí)，(單獨(dú)或者作為結(jié)合到載體上的半抗原)，引起針對(duì)葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的片段，更優(yōu)選地是對(duì)金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染有保護(hù)性的。這樣的免疫原性片段可包括例如缺少N末端前導(dǎo)序列、和/或跨膜結(jié)構(gòu)域和/或C末端錨定結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性片段包含蛋白質(zhì)基本上所有的胞外結(jié)構(gòu)域，所述蛋白質(zhì)在片段序列的整個(gè)長(zhǎng)度上具有與選自圖1的序列至少85%同一性、優(yōu)選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少97-99%同一性。本發(fā)明的免疫原性組合物還可以含有葡萄球菌蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)或者葡萄球菌蛋白質(zhì)的免疫原性片段。這樣的融合蛋白質(zhì)可以重組制備，可包含至少2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白質(zhì)的一個(gè)部分。作為選擇，融合蛋白質(zhì)可包含至少2、3、4或5種葡萄球菌蛋白質(zhì)的多個(gè)部分。這些融合蛋白質(zhì)可以將不同的葡萄球菌蛋白質(zhì)或其片段組合到同一蛋白質(zhì)中。作為選擇，本發(fā)明也包括葡萄球菌蛋白質(zhì)或其片段的單獨(dú)的融合蛋白質(zhì)，作為與異源序列諸如T細(xì)胞表位或純化標(biāo)志的提供者的融合蛋白質(zhì)，例如P-半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶，綠色熒光蛋白(GFP)，表位標(biāo)志諸如FLAG、myc標(biāo)志、聚組氨酸，或者病毒表面蛋白質(zhì)諸如流感病毒血凝素，或者細(xì)菌蛋白質(zhì)諸如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>胞外成分結(jié)合蛋白胞外成分結(jié)合蛋白是結(jié)合宿主胞外成分的蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于粘附素。胞外成分結(jié)合蛋白的例子包括層粘連蛋白受體(NaiduetalJ.Med.Microbiol.1992，36;177),SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白(US5801234，Wiltshire和FosterInfec.Immun.2001，69;5198),EbhA(WilliamsetalInfect.Immim.2002，70;6805)，EbhB，彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)(Parketal1999,J.Biol.Chem.274;2845)，EFB(FIB)(Wastfelt和Flock1995，J.Clin.Microbiol.33;2347)，SBI(ZhangetalFEMSImmun.Med.Microbiol.2000，28;211)，自溶素(Ruppeta12001，J.Infect.Dis.183;1038)，ClfA(US6008341,McDevittetalMol.Microbiol.1994，11;237)，SdrC，SdrG(McCreaetalMicrobiology2000,146;1535)，SdrH(McCreaetalMicrobiology2000，146;1535)，脂肪酶GehD(US2002/0169288)，SasA，F(xiàn)nbA(FlocketalMolMicrobiol.1994，12;599，US6054572)，F(xiàn)nbB(WO97/14799，Boothetal2001Infec.Immun.69;345)，膠原蛋白結(jié)合蛋白Cna(Visaietal2000，J.Biol.Chem.275;39837)，ClfB(WO99/27109)，F(xiàn)bpA(Phonimdaengetal1988J.GenMicrobiol.134;75)，Npase(Flock2001J.Bacteriol.183;3999)，IsaA/PisA(LonenzetalFEMSImmuno.Med.Microbiol.2000，29;145)，SsaA(LangetalFEMSImmunol.Med.Microbiol.2000，29;213)，EPB(Hussain和Hermann,丹麥14-17th關(guān)于葡萄球菌的研討會(huì)，2000)，SSP-1(Veenstraetal1996，J.Bacteriol.178;537)，SSP國(guó)2(Veenstraetal1996，J.Bacteriol.178;537)，17kDa肝素結(jié)合蛋白HBP(Fallgrenetal2001，J.Med.Microbiol.50;547)，玻連蛋白結(jié)合蛋白(Lietal2001，Curr.Microbiol.42;361)，纖維蛋白原結(jié)合蛋白，凝固酶，F(xiàn)ig(WO97/48727)以及MAP(US5648240)。SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白這是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它是肺炎葡萄球菌粘附素PsaA的同源物。它是高度免疫原性的32kDa脂蛋白，分布在整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁(CockayneetalInfect.Immun.199866;3767)。它在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中表達(dá)為32kDa脂蛋白，40kDa同源物存在于人葡萄球菌中。在表皮葡萄球菌中，它是鐵調(diào)節(jié)操縱子的成分。它顯示了與包括副血鏈球菌的FimA在內(nèi)的粘附素有相當(dāng)高的同源性，以及與具有證實(shí)的或推定的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的脂蛋白具有相當(dāng)高的同源性。因此SitC被包括為胞外結(jié)合蛋白和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。披露于US5，801，234的唾液結(jié)合蛋白也是SitC的形式，可被包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中。ClfA和ClfB這兩種蛋白質(zhì)都具有纖維蛋白原結(jié)合活性，在存在血漿時(shí)引起金黃色葡萄球菌形成聚集。它們含有細(xì)胞壁相關(guān)蛋白質(zhì)所共有的LPXTG基序。ClfA描述于US6008341,ClfB描述于WO99/27109。凝固酶(FbpA)這是一種纖維蛋白原結(jié)合蛋白質(zhì)，在存在血漿時(shí)引起金黃色葡萄球菌形成聚集。它描述于涉及到凝固酶的參考文獻(xiàn)中Phonimdaengetal(J.Gen.Microbio.1988，134:75-83)，Phonimdaengetal.(MolMicrobiol1990;4:393-404)，Cheungetal.(InfectImmun1995j63:1914-1920)以及Shopsinetal.(J.CLin.Microbiol.2000;38:3453-3456)。肽(C末端27個(gè)氨基酸)的成熟蛋白質(zhì)。、4凝固酶具有三個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域。氨基酸59-297是巻曲螺旋區(qū)，氨基酸326-505是富含脯氨酸和甘氨酸的區(qū)域，從氨基酸506到645的C末端結(jié)構(gòu)域具有P折疊構(gòu)象。這些結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)都是本發(fā)明的優(yōu)選片段。SdrG-Fbe—EfB/FIGFbe是在表皮葡萄球菌的許多分離林中發(fā)現(xiàn)的纖維蛋白原結(jié)合蛋白，具有119kDa的推斷分子量(Nilssonetal1998.Infect.Immun.66;2666)。它的序列與金黃色葡萄球菌的聚集因子(ClfA)的序列相關(guān)。抗Fbe的抗體可阻斷表皮葡萄球菌結(jié)合到纖維蛋白原包被的平板和導(dǎo)管上(Pei和Flock2001,J.Infect.Dis.184;52)。該蛋白在WO00/12689中也描述為SdrG。SdrG在凝固酶陰性的葡萄球菌中被發(fā)現(xiàn)，是含有LPXTG序列的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白質(zhì)。SdrG含有信號(hào)肽(氨基酸1-51)，含有纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)和膠原蛋白結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域(氨基酸51-825)，兩個(gè)CnaB結(jié)構(gòu)域(氨基酸627-698和738-809)，SD重復(fù)區(qū)(氨基酸825-1000)以及錨定結(jié)構(gòu)域(氨基酸1009-1056)。Fbe具有推定的信號(hào)序列，在氨基酸51和52之間帶有裂解位點(diǎn)。因此Fbe的優(yōu)選片段含有Fbe的成熟形式，從氨基酸52延續(xù)到C末端(氨基酸1092)。Fbe從氨基酸52到氨基酸825的結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)纖維蛋白原結(jié)合。因此Fbe的優(yōu)選片段包含或由氨酸52-825組成。Fbe的氨基酸373和516之間的區(qū)域顯示了Fbe和ClfA之間的最大保守性。因此優(yōu)選片段將含有Fbe的氨基酸373-516。Fbe的氨基酸825-1041含有高度重復(fù)區(qū)，由串聯(lián)重復(fù)的天冬氨酸和絲氨酸殘基組成。SdrG的優(yōu)選片段包括已經(jīng)去除了信號(hào)肽和/或SD重復(fù)序列以及錨定結(jié)構(gòu)域的多肽。這些多肽包括或者由SEQIDNO:70的氨基酸50-825、氨基酸50-633、氨基酸50-597(WO03/76470的SEQIDNO2)、氨基酸273-597(WO03/76470的SEQIDNO4)、氨基酸273-577(WO03/76470的SEQIDNO6)、氨基酸1-549、氨基酸219-549、氨基酸225-549、氨基酸219-528、氨基酸225-528所組成的多肽。優(yōu)選地，將與SEQIDNO:70、20或21的序列具有至少80%、85%、卯％、92%、95%、97%、98%、99%或100%同源性的SdrG多肽加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中。本發(fā)明的組合物任選包含上述SdrG多肽的片段。優(yōu)選片段已經(jīng)去除了信號(hào)肽和/或SD重復(fù)序列和/或錨定結(jié)構(gòu)域。例如對(duì)應(yīng)于SEQID76的氨基酸1-713、1-549、225-549、225-529、24-717、1-707、1-690、1-680、1-670、1-660、1-650、1-640、1-630、1-620、1-610、1-600、34-707、44-697、36-689的序列或者與SEQID70或20或21具有85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。去除了信號(hào)肽的優(yōu)選片段在片段的N末端具有曱硫氨酸殘基以確保正確翻譯。更優(yōu)選的片段具有下面的序列MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVIN麗QSINTDDNNQIIKKEET麗YDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEK廳(JDEKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVP麗NTKLDVEYKTALSSVNKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLG麗GEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNYVWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDEEbhA和EbhBEbhA和EbhB是在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者中都表達(dá)的蛋白質(zhì)(ClarkeandFosterInfect.Immun.2002，70;6680，WilliamsetalInfect.Immun.2002，20;6805)，它Cl結(jié)合至'J纖連蛋白。由于纖連蛋白是胞外基質(zhì)的重要成分，EbhA和EbhB在將葡萄球菌粘附到胞外基質(zhì)方面具有重要功能。Ebh蛋白質(zhì)較大，具有1.1兆道爾頓的分子量。由于生產(chǎn)和配制的容易性，使用Ebh蛋白質(zhì)的片段而不是完整序列是有利的。蛋白質(zhì)的中部區(qū)域含有不完全重復(fù)序列，其含有纖連蛋白結(jié)合位點(diǎn)。下述含有一個(gè)或多個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域的片段是用來(lái)加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段。Ebh蛋白質(zhì)含有127個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的不完全重復(fù)單元，其特征在于含有共有序列L.G.{10}A.{13}Q.{26}L..M..L.{33}A優(yōu)選地.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M"L.{33}A.{12}更優(yōu)選地.....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}LLN.AQKL..QI/V..A..V..V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/RN/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N/D.......其中"."代表任意氨基酸，".{10}"代表任意10個(gè)氨基酸，I/V表示氨基酸的備選。參考Kurodaetal(2001)Lancet357;1225-1240中披露的序列以及表2，很容易推知Ebh蛋白質(zhì)中的重復(fù)序列。包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段包括含有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、/\個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或超過(guò)10個(gè)的127個(gè)氨基酸的重復(fù)單元的蛋白質(zhì)。這樣的片段可以由l、2、3、4、5、6、7、8、9、IO個(gè)或更多的127個(gè)氨基酸的重復(fù)區(qū)的重復(fù)序列所組成，或者可以由在片段的任一末端或兩個(gè)末端帶有額外氨基酸殘基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多的重復(fù)序列所組成。另一種優(yōu)選的片段是跨越三個(gè)重復(fù)序列(氨基酸3202-3595)的大約44kDa的H2多肽，如ClarkeetalInfectionandImmunity70，6680-6687，2002中所描述的。這樣的片段將優(yōu)選能夠結(jié)合纖連蛋白和/或引起針對(duì)整個(gè)Ebh蛋白質(zhì)有活性的抗體。Ebh蛋白質(zhì)能夠結(jié)合纖連蛋白。這些多肽序列的優(yōu)選片段保持了結(jié)合到纖連蛋白的能力?？赏ㄟ^(guò)由Clarkeetal(InfectionandImmunity70;6680-66872002)所描述的ELISA來(lái)評(píng)估對(duì)纖連蛋白的結(jié)合。還有另一種優(yōu)選的片段是那些包含B細(xì)胞或T輔助細(xì)胞表位的片段，例如表3和4中描述的那些片段/肽。表2.Ebh全長(zhǎng)序列中的重復(fù)序列。Ebh全長(zhǎng)序列披露于Kurodaetal(2001)Lancet357;1225-1240。下表顯示了127個(gè)氨基酸的重復(fù)序列在全長(zhǎng)序列中開(kāi)始和結(jié)束位置的氨基酸殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表3.對(duì)127個(gè)氨基酸的重復(fù)序列所預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位全長(zhǎng)序列披露于Kurodaetal(2001)Lancet357;1225-1240。選擇這些重復(fù)序列中序列的一個(gè)由全長(zhǎng)序列的氨基酸3204-3331所編碼的重復(fù)序列來(lái)進(jìn)行表位預(yù)測(cè)NQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGV<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>"開(kāi)始"和"結(jié)束"欄代表所預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位在127個(gè)氨基酸的重復(fù)序列中的位置"起始，，和"終止，，欄代表所預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位在Ebh全長(zhǎng)序列中的位置表4預(yù)測(cè)的Ebh中的T輔助細(xì)胞表位全長(zhǎng)序列披露于TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)，序列索引Q8NWQ6。選擇這些重復(fù)序列中的一個(gè)由全長(zhǎng)序列的氨基酸3204-3331所編碼的重復(fù)序列來(lái)進(jìn)行表位預(yù)測(cè)NQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGV<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>-"重復(fù)序列中的位置"欄表示所預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位在重復(fù)序列中的位置-"序列中的位置"欄表示所預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位在Ebh全長(zhǎng)序列中的位置肽；;此，這些片段可被用作生產(chǎn)本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽的中i;體。特別優(yōu)選的是其中幾個(gè)、5-10、1-5、1-3、1-2或1個(gè)氨基酸以任意組合被取代、缺失或添加的變體。彈性蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(EbpS)EbpS是含有486個(gè)氨基酸的分子量83kDa的蛋白質(zhì)。它與金黃色葡萄球菌的細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)聯(lián)，具有三個(gè)將蛋白質(zhì)保持在膜中的疏水區(qū)(Downeretal2002，J.Biol.Chem.277;243;Parketal1996，J.Biol.Chem.27"15803)。氨基酸1-205和343-486之間的兩個(gè)區(qū)域是在細(xì)胞質(zhì)膜外表面上表面暴露的。EbpS的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于N末端的殘基14-34之間(Parketal1999，丄Biol.Chem.274;2845)。加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段是含有彈性蛋白結(jié)合區(qū)域的表面暴露片段(氨基酸1-205)。一些優(yōu)選片段不含完整的暴露環(huán)，但是應(yīng)當(dāng)含有彈性蛋白結(jié)合區(qū)域(氨基酸14-34)。能夠使用的作為選擇的片段由形成第二表面暴露環(huán)的氨基酸組成(氨基酸343-486)。在一端或兩端含有少至1、2、5、10、20、50個(gè)氨基酸的作為選擇的片段也是可能的。層粘連蛋白受體金黃色葡萄球菌的層粘連蛋白受體在致病性方面起著重要作用。感染的典型特征就是允許廣泛的轉(zhuǎn)移性膿肺形成的血流侵襲。血流侵襲需要流過(guò)血管基底膜的能力。這是通過(guò)層粘連蛋白受體結(jié)合到層粘連蛋白而實(shí)現(xiàn)的(LopesetalScience1985，229;275)。層粘連蛋白是表面暴露的，存在于葡萄球菌的許多菌林包括金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中。SBISbi是除了蛋白A之外的第二IgG結(jié)合蛋白，它在大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌林中表達(dá)(Zhangetal1998，Microbiology144;985)。Sbi序列的N末端具有典型的信號(hào)序列，在氨基酸29之后帶有裂解位點(diǎn)。因此加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的Sbi的優(yōu)選片段在氨基酸殘基30、31、32或33處開(kāi)始，延續(xù)到Sbi的C末端，例如SEQIDNO:26。已經(jīng)將Sbi的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域確定為從氨基酸41-92向蛋白質(zhì)N末端的區(qū)域。這個(gè)結(jié)構(gòu)域與蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源。Sbi的最小IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有下面的序列QTTQ麗YVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK*國(guó)表示在IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間相似的氨基酸包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中的Sbi優(yōu)選片段含有IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該片段含有IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的共有序列，如上面序列中所示的由*標(biāo)明的。優(yōu)選地，片段含有或者由上面所示的全部序列組成。更優(yōu)選地，片段含有或者由Sbi的氨基酸30-92、33-92、30-94、33_94、30-146、33-146、30-150、33-150、30-160、33-160、33-170、33-180、33-190、33-200、33-205或33-210組成，例如SEQIDNO:26。優(yōu)選的片段可含有來(lái)自所指序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO個(gè)氨基酸的取代。優(yōu)選的片段可含有IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多個(gè)重復(fù)序列(2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))。EFB-FIBFib是19kDa纖維蛋白原結(jié)合蛋白，它由金黃色葡萄球菌分泌到胞外基質(zhì)中。所有測(cè)試的金黃色葡萄球菌分離林都產(chǎn)生它(WastfeltandFlock1995，J.Clin.Microbiol.33;2347)。金黃色葡萄球菌在存在纖維蛋白原時(shí)聚集并結(jié)合到纖維蛋白原包被的表面。該能力有助于導(dǎo)管和內(nèi)皮細(xì)胞的葡萄球菌菌落增殖。Fib在蛋白質(zhì)的N末端含有信號(hào)序列，在大約氨基酸30處帶有推定的裂解位點(diǎn)。因此引入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段將含有成熟蛋白質(zhì)的序列(從大約氨基酸30到蛋白質(zhì)的C末端)。IsaA/PisAIsaA是29kDa蛋白質(zhì)，也稱為PisA，已經(jīng)顯示出它是醫(yī)院患者敗血癥期間的免疫優(yōu)勢(shì)的葡萄球菌蛋白質(zhì)(Lorenzetal2000,FEMSImmunol.Med.Microb.29;145)。IsaA序列的開(kāi)頭29個(gè)氨基酸被認(rèn)為是信號(hào)序列。因此包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中的IsaA優(yōu)選序列將含有從氨基酸殘基30起到編碼序列的末端。纖連蛋白結(jié)合蛋白纖連蛋白結(jié)合蛋白A(FnbA)描述于US5320951和Schenningsetal(1993，Mircob.Pathog.15;207)。纖連蛋白結(jié)合蛋白A含有參與結(jié)合纖連蛋白的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域(WO94/18327)。這些結(jié)構(gòu)域被稱為Dl、D2、D3和D4。纖連蛋白結(jié)合蛋白A或B的優(yōu)選片段包含或由Dl、D2、D3、D4、Dl-D2、D2國(guó)D3、D3-D4、Dl-D3、D2-D4或Dl醒D4組成(如WO94/18327中的描述)。纖連蛋白結(jié)合蛋白含有36個(gè)氨基酸的信號(hào)序列。例如VK麗LRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA任選地，缺失該信號(hào)序列的成熟蛋白質(zhì)包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁作為屏障來(lái)防止代謝物自由擴(kuò)散到細(xì)菌中。一系列蛋白質(zhì)協(xié)同形成了必需養(yǎng)分進(jìn)入細(xì)菌的通道，因此對(duì)于細(xì)菌生存是必需的。術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括參與結(jié)合到代謝物諸如鐵的初始步驟的蛋白質(zhì)以及參與將代謝物事實(shí)上轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌中的那些蛋白質(zhì)。分子鐵對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)是必需的輔助因子。分泌結(jié)合游離鐵的鐵載體，然后被遞送鐵的細(xì)菌表面受體捕獲來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜。鐵的探測(cè)對(duì)于確定人感染來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的，以便針對(duì)該類蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生能夠?qū)е缕咸亚蚓媪Φ膯适А＾D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的例子包括免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Burnieetal2000Infect.Imun.68;3200)，IsdA(Mazmanianetal2002PNAS99;2293)，IsdB(Mazmanianetal2002PNAS99;2293)，Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，SitC(Wiltshire和Foster2001Infect.Immun.69;5198)以及NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是有良好保守性的蛋白質(zhì)，它可能能夠產(chǎn)生針對(duì)不同葡萄球菌菌林的交叉保護(hù)性的免疫應(yīng)答(Meietall"7，Mol.Microbiol.26;399)?？惯@種蛋白質(zhì)的抗體已經(jīng)在患有敗血癥的患者中發(fā)現(xiàn)了(Burnieetal2000，Infect.Immun.68;3200)。免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的優(yōu)選片段將包括肽DRHFLN、GNYD、RRYPF、KTTLLK、GVTTSLS、VDWLR、RGFL，更優(yōu)選KIKVYVGNYDFWYQS、TVIVVSHDRHFLYNNV和/或TETFLRGFLGRMLFS，因?yàn)檫@些序列含有被人免疫系統(tǒng)識(shí)別的表位。IsdA-IsdB金黃色葡萄球菌的isd基因(鐵調(diào)節(jié)的表面決定子)編碼負(fù)責(zé)血紅蛋白結(jié)合以及傳遞血紅素鐵到細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)，它在這里作為必需養(yǎng)分。IsdA和IsdB位于葡萄球菌的細(xì)胞壁中。IsdA似乎被暴露在細(xì)菌表面上，因?yàn)樗鼘?duì)蛋白酶K消化是敏感的。IsdB被部分消化，表明它部分暴露在細(xì)菌表面上(Mazmanianetal2003Science299;906)。IsdA和IsdB都是結(jié)合血紅素的29kDa蛋白質(zhì)。它們的表達(dá)通過(guò)Fur阻抑物而被鐵的可獲得性所調(diào)節(jié)。它們的表達(dá)在鐵濃度將變低的宿主感染期間將變高。它們也4皮稱為FrpA和FrpB(Morrisseyetal2002，Infect.Immun.70;2399)。FrpA和FrpB是帶有高電荷的主要表面蛋白。已經(jīng)顯示它們提供了粘附到塑料的主要作用。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含IsdA和/或IsaB片段，其描述在WO01/98499或WO03/11899中。毒素和毒力調(diào)節(jié)劑這個(gè)蛋白質(zhì)家族的成員包括毒素諸如a毒素、溶血素、腸毒素B和TSST-1以及調(diào)節(jié)毒素產(chǎn)生的蛋白質(zhì)諸如RAP。oc毒素(Hla)ot毒素是由大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌林產(chǎn)生的重要毒力決定子。它是具有溶血活性的孔形成毒素。已經(jīng)顯示抗oc毒素的抗體中和動(dòng)物模型中ot毒素的有害和致命效應(yīng)(Adlametal1977Infect.Immun.17;250)。人血小板、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞對(duì)a毒素的效應(yīng)是敏感的。a毒素的高毒性要求其在作為免疫原使用之前應(yīng)當(dāng)脫毒。這可以通過(guò)化學(xué)處理實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)用曱醛、戊二醛或其它交聯(lián)試劑處理或者通過(guò)將它化學(xué)綴合到如下所述的細(xì)菌多糖上。除去毒性的進(jìn)一步的方式是引入除去毒性同時(shí)保持毒素的抗原性的點(diǎn)突變。在a毒素的氨基酸35處的點(diǎn)突變的引入導(dǎo)致毒性的去除同時(shí)保持免疫原性，所述突變是用亮氨酸殘基取代組氨酸殘基(Menzies和Kernodle1996;Infect.Immun.64;1839)。組氨酸35似乎對(duì)于孔形成所需的正確寡聚化來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵性的，這個(gè)殘基的突變導(dǎo)致毒性喪失。當(dāng)加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中時(shí)，a毒素優(yōu)選通過(guò)His35突變而凈皮脫毒，最優(yōu)選通過(guò)用Leu或Arg取代His35。在作為選擇的實(shí)施方案中，a毒素通過(guò)綴合到免疫原性組合物的其它組分上而被脫毒，優(yōu)選莢膜多糖，最優(yōu)選綴合到金黃色葡萄球菌V型多糖和/或金黃色葡萄球菌VIII型多糖和/或PNAG上。RNAIII活化蛋白(RAP)RAP本身不是毒素。但是它是毒力因子表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。RAP由葡萄球菌產(chǎn)生并分泌。它激活其它葡萄球菌的agr調(diào)節(jié)系統(tǒng)并激活毒力因子諸如溶血素、腸毒素B和TSST-1的表達(dá)和隨后的釋放。針對(duì)RAP產(chǎn)生的免疫應(yīng)答將不會(huì)殺死細(xì)菌，但是將干擾它們的致病性。這具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即對(duì)于新的抗性菌林的形成提供更小的選擇壓力。它將具有第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即產(chǎn)生的免疫應(yīng)答在減少感染的發(fā)病方面將是有幫助的。將RAP與疫苗中的其它抗原結(jié)合是特別有利的，特別是在額外的抗原將提供能夠殺死細(xì)菌的免疫應(yīng)答的情況。其它蛋白質(zhì)累積-結(jié)合蛋白質(zhì)(Aap)Aap是表皮葡萄球菌菌林累積在表面上所必需的140kDa蛋白質(zhì)(HussainetalInfect.Immun.1997，65;519)。表達(dá)該蛋白質(zhì)的菌林產(chǎn)生顯著更大量的生物膜，Aap似乎參與了生物膜的形成?？笰ap的抗體能夠抑制生物膜形成并抑制表皮葡萄球菌的累積。Aap的優(yōu)選片段是包含氨基酸550-1069或由氨基酸550-1069組成的保守結(jié)構(gòu)域。葡萄球菌分泌的抗原SsaASsaA是在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都發(fā)現(xiàn)的30kDa強(qiáng)免疫原性蛋白質(zhì)(Langetal2000FEMSImmunol.Med.Microbiol.29;213)。它在心內(nèi)膜炎期間的表達(dá)表明了特異性針對(duì)感染疾病發(fā)病的毒力作用。SsaA含有N末端前導(dǎo)序列和信號(hào)肽酶裂解位點(diǎn)。前導(dǎo)肽之后是從殘基30到殘基130的大約100個(gè)氨基酸的親水區(qū)。加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選SsaA片段由成熟蛋白(氨基酸27到C末端或者氨基酸30到C末端)組成。另一種優(yōu)選的片段含有SsaA從氨基酸30到氨基酸130的疏水區(qū)。優(yōu)選組合本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選蛋白質(zhì)組合包含層粘連蛋白受體和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SitC和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含EbhA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含EbhB和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含EbpS和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含EFB(FIB)和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SBI和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含自溶素和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含ClfA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、MABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SdrC和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SdrG和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體和RAP。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SdrH和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含酯酶GehD和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SasA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、MABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含F(xiàn)nbA和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含F(xiàn)nbB和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含Cna和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含ClfB和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含F(xiàn)bpA和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含Npase和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含IsaA/PisA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、MABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SsaA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含EPB和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SSP-l和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SSP-2和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含HPB和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含玻連蛋白結(jié)合蛋白和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含纖維蛋白原結(jié)合蛋白和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含凝固酶和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含F(xiàn)ig和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含MAP和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、CIfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含IsdA和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含IsdB和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、西旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SitC和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含ct毒素和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含a毒素H35L或H35R突變體和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、MABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含RAP和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含Aap和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、RAP、a毒素和H35LORH35Rct毒素。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)組合包含SsaA和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、CIfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP畫(huà)1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、RAP、ct毒素和H35LORH35Rcc毒素。發(fā)明人證明了某些抗原產(chǎn)生了抗原混合物范疇內(nèi)的特別有效的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包含IsaA和葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或IsaA和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素，或包含Sbi和葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或Sbi和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素，或包含SdrC和葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或SdrC和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素，或IsaA和Sbi，或IsaA和SdrC，或IsaA和自溶素，或IsaA和Ebh，或Sbi和SdrC，或Sbi和自溶素，或Sbi和Ebh，或SdrC和自溶素，或SdrC和Ebh，或自溶素-葡糖酰胺酶和Ebh的免疫原性組合物。對(duì)于這些組合中的每一種，蛋白可以是全長(zhǎng)或片段，其具有與圖1的序列具有至少85%、90%、95%、98%或100%同一性的序列。在上面的以及下面的組合中，特定蛋白質(zhì)可以任選作為如上所述的片段或融合蛋白而存在于本發(fā)明的免疫原性組合物中。本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性組合物不包括WO02/094868中公開(kāi)的蛋白序列。三種蛋白質(zhì)的組合本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性組合物包含oc-毒素、胞外成分結(jié)合蛋白(優(yōu)選粘附素)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(優(yōu)選鐵結(jié)合蛋白)相組合的三種蛋白質(zhì)成分。在這樣的組合中，oc毒素可以^:化學(xué)脫毒或通過(guò)引入點(diǎn)突變而遺傳學(xué)脫毒，優(yōu)選His35Leu點(diǎn)突變。A毒素作為游離蛋白質(zhì)存在或者作為選擇而被綴合到免疫原性組合物的多糖或LTA成分上。優(yōu)選的組合包括免疫原性組合物，包含ct毒素、IsdA和胞外成分結(jié)合蛋白，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。免疫原性組合物，包含ot毒素、IsdB和胞外成分結(jié)合蛋白，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、歸A、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。免疫原性組合物，包含oc毒素、IsdA和粘附素，其選自層粘連蛋白受體、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、自溶素、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。免疫原性組合物，包含oc毒素、IsdB和粘附素，其選自層粘連蛋白受體、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。包含a毒素、IsdA和層粘連蛋白受體的免疫原性組合物。包含oc毒素、IsdA和EbhA的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和EbhB的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和EbpS的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和EFB(FIB)的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和SdrG的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和ClfA的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和ClfB的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和FnbA的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和凝固酶的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和Fig的免疫原性組合物。包含ot毒素、IsdA和SdrH的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和SdrC的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和MAP的免疫原性組合物。包含IsaA和Sbi的免疫原性組合物。包含IsaA和IsdB的免疫原性組合物。包含IsaA和IsdA的免疫原性組合物。包含IsaA和SdrC的免疫原性組合物。包含IsaA和Ebh或其如上所述的片段的免疫原性組合物。包含Sbi和SdrC的免疫原性組合物。包含Sbi和Ebh或其如上所述的片段的免疫原性組合物。包含IsaA、Sbi或SdrC的免疫原性組合物。在不同克隆系中表達(dá)的抗原的選擇對(duì)與金黃色葡萄球菌種群結(jié)構(gòu)相關(guān)的毒力因子的出現(xiàn)進(jìn)行的分析表明，金黃色葡萄球菌的天然種群中存在可變的毒力基因。在金黃色葡萄球菌的臨床分離林中，至少五種克隆系顯示出是非常普遍的(Booth"a/.，2001InfectImimm.69(1):345-52)。A-溶血素(A/fl)、纖連蛋白結(jié)合蛋白A(/m/l4)和聚集因子A顯示出存在于大多數(shù)分離林中，無(wú)論品系身份如何，表明了些蛋白質(zhì)在金黃色葡萄球菌的生存中的重要作用(Booth""/.，2001InfectImmun.69(1):345-52)。而且，才艮據(jù)Peacocketal.2002，/"6J、c//4、凝固酵、5/fl、附/7、/v/(Panton畫(huà)Valentine殺白細(xì)胞素)、/r/g(gamma-毒素)、a-毒素和/cfl似乎與潛在的克隆結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，表明了這些基因相當(dāng)多的水平轉(zhuǎn)移。相反，其它毒力基因諸如纖連蛋白結(jié)合蛋白B(/h6B)、p-溶血素(Mft)、膠原蛋白結(jié)合蛋白(can)、TSST-1(加)和曱氧苯青霉素抗性基因(附ecj)與特定品系有力地相關(guān)聯(lián)(BoothC"/.，2001InfectImmun.69(1):345-52)。同樣地，PeacockWfl/.2002(InfectImmun.70(9):4987-96)顯示出腸毒素、"〃exfolatin(和)，(3-和S畫(huà)毒素、Mr基因U&D、s&E和66/7)、cwa、W/;S和^/fe在種群中的分布是與MLST-衍生的克隆復(fù)合物相當(dāng)明顯地相關(guān)的。MLST數(shù)據(jù)沒(méi)有提供證據(jù)證明引起醫(yī)源性疾病的菌林代表了與引起社區(qū)獲得疾病的菌林或者從健康帶菌者回收的菌林所截然不同的亞群(FeilWfl/.，2003JBacteriol.185(11):3307-16)。本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性組合物對(duì)于來(lái)自不同克隆系的葡萄球菌是有效的。在一種實(shí)施方案中，這是通過(guò)包含1、2、3、4種的優(yōu)選至少1種在大多數(shù)葡萄球菌分離林中表達(dá)的蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)的。這樣的蛋白質(zhì)的例子包括a-溶血素(/t/fl)、纖連蛋白結(jié)合蛋白A(/wM)和聚集因子A(c(/^)、凝固酶、5/m、附op、/7v/(Panton-Valentine殺白細(xì)胞素)、A/g(gamma-毒素)和/cfl。我們也鑒定了免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、RAP、自溶素(Ruppetal2001，J.Infect.Dis.183;1038)、層粘連蛋白受體、SitC、IsaA/PisA、SPOIIIE()、SsaA、EbpS、SasF(Rocheetal2003，Microbiology149;643)、EFB(FIB)、SBI、Clffi、IsdA、IsdB、FnbB、Npase、EBP、骨唾液酸結(jié)合蛋白II、IsaB/PisB(LorenzetalFEMSImmuno.Med.Microb.2000，29;145)、SasH(Rocheetal2003，Microbiology149;643)、MRPI、SasD(Rocheetal2003，Microbiology149;643)、SasH(Rocheetal2003，Microbiology149;643)、自溶素前體(AUR)/Seppl以及新的自溶素。在作為選擇的實(shí)施方案中，在不同的克隆菌林組中表達(dá)的2或多種蛋白質(zhì)被包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中。優(yōu)選地，抗原組合將使得能夠產(chǎn)生針對(duì)多種克隆菌林有效的免疫應(yīng)答，最優(yōu)選針對(duì)所有克隆菌林。優(yōu)選組合包括FnbB和p-溶血素、FnbB和Cna、FnbB和TSST畫(huà)l、FnbB和mecA、FnbB和SdrD、FnbB和SdrF、FnbB和EbpS、FnbB和Efb、(3-溶血素和Cna、(5-溶血素和TSST-1、(3-溶血素和mecA、(3-溶血素和SdrD、(3-溶血素和SdrF、P-溶血素和EbpS、p-溶血素和Efb、Cna和TSST畫(huà)1、Cna和mecA、Cna和SdrD，Cna和SdrF、Cna和EbpS、Cna和Efb、TSST-1和mecA、TSST-1和SdrD、TSST誦1和SdrF、TSST-1和EbpS、TssT畫(huà)l和Efb、MecA和SdrD、MecA和SdrF、MecA和EbpS、MecA和Efb、SdrD和SdrF、SdrD和EbpS、SdeD和Efb、SdrF和EbpS、SdrF和Efb以及EbpS和Efb。上述優(yōu)選組合可以與上述額外成分相結(jié)合。選擇在不同生長(zhǎng)階段表達(dá)的抗原葡萄球菌經(jīng)歷指數(shù)生長(zhǎng)階段，在該階段表達(dá)特定組的蛋白。這包括很多胞外成分結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在指數(shù)生長(zhǎng)階段后，葡萄球菌回到指數(shù)后階段，在該階段中其生長(zhǎng)較慢，并且調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。在指數(shù)生長(zhǎng)階段表達(dá)的很多蛋白都受到下調(diào)，而其它蛋白，如酶和大多數(shù)毒素，包括OC毒素，都以更高水平表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性組合物包含在指數(shù)生長(zhǎng)階段以更高水平表達(dá)的蛋白和在指數(shù)后階段以更高水平表達(dá)的蛋白。"更高水平"是指一個(gè)階段的表達(dá)水平相對(duì)于其它階段更高。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含ot毒素和胞外成分結(jié)合蛋白(優(yōu)選FnbA、FnbB、ClfA和ClfB)或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。更優(yōu)選地，其包含ot毒素或Cna或酯酶GehD和選自下組的蛋白層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、SasA、FnbA、FnbB、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC、NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Aap和SsaA。在上文描述的組合中，a毒素可以按照上文的描述遺傳學(xué)或化學(xué)脫毒，并且可能綴合或不綴合到下文描述的多糖上。多糖本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選進(jìn)一步包含莢膜多糖，包括一種或多種PIA(也被稱為PNAG)和/或金黃色葡萄球菌的V型和/或VIII型莢膜多糖和/或表皮葡萄球菌I型和/或11型和/或III型莢膜多糖。PIA(PNAG)現(xiàn)在清楚的是，被確定為PS/A、PIA和SAA的各種形式的葡萄球菌表面多糖是同樣的化學(xué)實(shí)體-PNAG(Maira-LitranetalVaccine22;872-879(2004))。因此術(shù)語(yǔ)PIA或PNAG包括所有這些多糖或者衍生自它們的寡糖。PIA是多糖胞間粘附素，由被N-乙酰和O-琥珀酰成分取代的口-U口6)連接的葡糖胺的聚合物所組成。該多糖存在于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者中，能夠從任一來(lái)源分離(Joyceetal2003,CarbohydrateResearch338;903;Maira-Litranetal2002，Infect.Imun.70;4433)。例如，PNAG可從金黃色葡萄球菌菌林MN8m分離(WO04/43407)。分離自表皮葡萄球菌的PIA是生物膜的組成成分。它負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞粘連，或許也起作用來(lái)防止生長(zhǎng)的菌落免受宿主的免疫應(yīng)答。該多糖在以前被稱為聚-N-琥珀酰-P-(.l口6)-葡糖胺(PNSG)，最近顯示它不具有預(yù)期結(jié)構(gòu)，因?yàn)榇_定了N-琥珀?；遣徽_的(Maira畫(huà)Litranetal2002，Infect.Imun.70;4433)。因此，形式上稱為PNSG而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)是PNAG的多糖也被術(shù)語(yǔ)PIA所包括。PIA(或PNAG)可以是不同大小的由多達(dá)30個(gè)重復(fù)單元(被N-乙酰和0-琥珀酰成分取代的口-(l口6)連接的葡糖胺聚合物)所組成的寡糖，從超過(guò)400kDa、至ij75和400kDa之間、至！』10和75kDa之l、司變化。任何大小的PIA多糖或寡糖都可用于本發(fā)明的免疫原性組合物中，然而超過(guò)40kDa的大小是優(yōu)選的。大小分級(jí)可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法來(lái)獲得，例如通過(guò)微流化、超聲照射或者通過(guò)化學(xué)裂解(WO03/53462，EP497524,EP497525)。PIA(PNAG)的優(yōu)選大小是40-400kDa、50-350kDa、40-300kDa、60-300kDa、50-250kDa和60-200kDa。PIA(PNAG)PIA可由于氨基被乙酸酯取代而具有不同程度的乙?；ｓw外產(chǎn)生的PIA幾乎在氨基上被全部取代(95-100%)。作為選擇，可以使用脫乙?；腜IA(PNAG)，具有少于60%、優(yōu)選少于50%、40%、30%、20%、10%的乙?；?。4吏用脫乙酰化PIA(PNAG)是優(yōu)選的，因?yàn)镻NAG的非乙酰化表位在介導(dǎo)調(diào)理素殺死革蘭氏陽(yáng)性菌時(shí)是有效的，優(yōu)選金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。更優(yōu)選地，PIA(PNAG)具有40kDa和300kDa之間的大小并且是脫乙?；?，以使得少于60%、50%、40%、30%或20%的氨基祐:乙酰化。術(shù)語(yǔ)使PNAG脫乙酰化(dPNAG)是指少于60%、50%、40%、30%、20%或10%的氨基被乙?；腜NAG多糖或寡糖。在一種實(shí)施方案中，通過(guò)化學(xué)處理天然多糖來(lái)使PNAG脫乙?；孕纬蒬PNAG。例如，用堿性溶液處理天然PNAG，以4吏得pH上升到超過(guò)IO。例如用0.1-5M、0.2國(guó)4M、0.3-3M、0.5-2M、0.75-1.5M或lMNaOH、KOH或NH40H處理PNAG。處理進(jìn)^f亍至少10或30分鐘，或者1、2、3、4、5、10、15或20小時(shí)，溫度在20-100、25-80、30-60或30國(guó)50或35-45。C?？砂凑誛O04/43405的描述來(lái)制備dPNAG。包括在本發(fā)明免疫原性組合物中的多糖優(yōu)選被如下所述綴合到載體蛋白質(zhì)上，或者作為選擇不被綴合。來(lái)自金黃色葡萄球菌的5型和8型多糖在人體中引起感染的大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌林含有5型或8型多糖。大約60%的人體菌林是8型的，大約30%是5型的。5型和8型莢膜多糖抗原的結(jié)構(gòu)描述于MoreauetalCarbohydrateRes.201;285(1990)以及FournieretalInfect.Immun.45;87(1984)中。兩者都在它們的重復(fù)單元中具有FucNAcp以及具有ManNAcA,可用于引入巰基。所報(bào)道的結(jié)構(gòu)為5型—4)-口隱D畫(huà)ManNAcA(30Ac)國(guó)(1—4)誦口畫(huà)L-FucNAc(1—3)國(guó)口-D-FucNAc-(1—8型—3)畫(huà)口-D陽(yáng)ManNAcA(40Ac)一(1—3)-口-L畫(huà)FucNAc(1—3)畫(huà)口陽(yáng)D—FucNAc隱(1—最近(JonesCarbohydrateResearch340，1097畫(huà)1106(2005))匪R譜將結(jié)構(gòu)修正為5型—4)-□-D-ManNAcA國(guó)(l—4)-□-L-FucNAc(30Ac)-(l—3)-□-D-FucNAc-(1—8型—3)-□-D-ManNAcA(40Ac)-(l—3)-□一L-FucNAc(1—3)-□-D-FucNAc(1—可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法從合適的金黃色葡萄球菌菌祙中提取多糖，例如按照US6294177中的描述。例如，ATCC12902是5型金黃色葡萄球菌菌林，ATCC12605是8型金黃色葡萄球菌菌林。多糖是天然大小，或者作為選擇可以通過(guò)例如微流化、超聲照射或者通過(guò)化學(xué)處理進(jìn)行大小分級(jí)。本發(fā)明也包括衍生自金黃色葡萄球菌5型和8型多糖的寡糖。包括在本發(fā)明免疫原性組合物中的5型和8型多糖優(yōu)選被如下所述綴合到載體蛋白質(zhì)上，或者作為選擇不被綴合。作為選擇，本發(fā)明的免疫原性組合物含有5型或8型多糖。金黃色葡萄球菌336抗原在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含US6294177中描述的金黃色葡萄球菌336抗原。336抗原包含P-連接的己糖胺，不含O-乙酰基，特異性結(jié)合到針對(duì)保藏為ATCC55804的金黃色葡萄球菌336型的抗體上。在一種實(shí)施方案中，336抗原是天然大小，或者作為選擇可以通過(guò)例如微流化、超聲照射或者通過(guò)化學(xué)處理進(jìn)行大小分級(jí)。本發(fā)明也包括衍生自336抗原的寡糖。包括在本發(fā)明免疫原性組合物中的336抗原優(yōu)選被如下所述綴合到載體蛋白質(zhì)上，或者作為選擇不被綴合。來(lái)自表皮葡萄球菌的I、II和III型多糖表皮葡萄球菌菌抹ATCC-31432、SE-360和SE-10的特征分別在于三種不同的莢膜I、II和III型(IchimanandYoshida1981，J.Appl.Bacteriol.51;229)。提取自每種表皮葡萄球菌血清型的莢膜多糖構(gòu)成I、II和III型多糖。可以通過(guò)幾種方法提取多糖，包括描述于US4197290中的方法或者按照Ichimanetal1991，J.Appl.Bacteriol.71;176中所描述的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含來(lái)自表皮葡萄球菌的i和/或ii和/或ni型多糖或寡糖。多糖是天然大小，或者作為選擇可以通過(guò)例如微流化、超聲照射或者通過(guò)化學(xué)裂解進(jìn)行大小分級(jí)。本發(fā)明也包括提取自表皮葡萄球菌菌林的寡糖。這些多糖不纟皮綴合，或者優(yōu)選地被如下所述進(jìn)行綴合。多糖的綴合在與疫苗接種中使用多糖相關(guān)的問(wèn)題中，其中之一是多糖本身為弱免疫原的這一事實(shí)。已經(jīng)設(shè)計(jì)來(lái)克服這一免疫原性缺乏的策略包括將多糖連接到較大的蛋白質(zhì)載體上，其提供了旁觀者t細(xì)胞輔助。優(yōu)選的是，將本發(fā)明所利用的多糖連接到提供旁觀者T細(xì)胞輔助的蛋白質(zhì)載體上?？梢耘c多糖免疫原綴合的這些載體的例子包括白喉和破傷風(fēng)類毒素(分別是DT、DTCrml97和TT)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、和結(jié)核菌素的純化蛋白質(zhì)衍生物(PPD)、綠膿桿菌外蛋白A(rEPA)、來(lái)自流感嗜血桿菌的蛋白D、肺炎球菌溶血素或者上述任何之一的片段。適合使用的片段包括含有T輔助表位的片段。特別地，蛋白D片段將優(yōu)選包含蛋白質(zhì)的N末端1/3。蛋白D是來(lái)自流感嗜血桿菌的IgD結(jié)合蛋白質(zhì)(EP0594610B1)，并且是潛在的免疫原。此外，葡萄球菌蛋白可以用作本發(fā)明的多糖綴合物中的載體蛋白。下文描述的葡萄球菌蛋白可以用作載體蛋白；例如層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC和MABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNAIII活化蛋白(RAP)或其片段。特別有利于使用在葡萄球菌疫苗中的新載體蛋白質(zhì)是葡萄球菌a類毒素。可將天然形式綴合到多糖上，因?yàn)榫Y合步驟降低了毒性。優(yōu)選地將遺傳去毒的a毒素諸如His35Leu或His35Arg變體用作載體，因?yàn)闅埩舳拘愿?。作為選擇，通過(guò)用交聯(lián)試劑、曱醛或戊二醛處理將oc毒素化學(xué)去毒。遺傳去毒的a毒素被任選化學(xué)去毒，優(yōu)選通過(guò)用交聯(lián)試劑、曱醛或戊二醛處理以進(jìn)一步降低毒性?？赏ㄟ^(guò)任何已知方法將多糖連接到載體蛋白質(zhì)上(例如通過(guò)Likhite的美國(guó)專利4，372，945，Armor的美國(guó)專利4，474，757以及Jenningsetal.的美國(guó)專利4,356,170)。優(yōu)選地，實(shí)施CDAP綴合化學(xué)(參見(jiàn)WO95/08348)。在CDAP中，氰化試劑l-氰基-二甲氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)被優(yōu)選用于多糖-蛋白質(zhì)綴合物的合成。氰化反應(yīng)可以在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行，這避免了堿性敏感的多糖的水解。這種合成法使得能夠直接偶聯(lián)到載體蛋白質(zhì)上?？蓪⒍嗵侨苡谒谢螓}溶液中?？蓪DAP溶解在乙腈中，立即加入到多糖溶液中。CDAP與多糖的羥基反應(yīng)形成氰酸酯。反應(yīng)步驟之后，加入載體蛋白質(zhì)。賴氨酸的氨基與活化的多糖反應(yīng)形成異脲共價(jià)連接。偶聯(lián)反應(yīng)之后，然后加入大大過(guò)量的甘氨酸以淬滅殘留的活化官能團(tuán)。然后將產(chǎn)物通過(guò)凝膠滲透柱以去除未反應(yīng)的載體蛋白質(zhì)和殘留試劑。綴合優(yōu)選包括在載體蛋白和多糖之間產(chǎn)生直接的鍵。任選地，可以將間隔基(如己二酸酐(ADH))導(dǎo)入載體和多糖之間?？菇瘘S色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的保護(hù)作用在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性組合物提供針對(duì)多于一種葡萄球菌菌林的有效免疫應(yīng)答，優(yōu)選針對(duì)來(lái)自金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者的菌株。更優(yōu)選地，產(chǎn)生針對(duì)金黃色葡萄球菌5型和8型血清型的保護(hù)性免疫應(yīng)答。更優(yōu)選地，產(chǎn)生針對(duì)表皮葡萄球菌的多種菌林，例如血清型I、II和III中至少兩種血清型的菌林的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明免疫原性組合物的一種用途是通過(guò)在醫(yī)院治療之前接種疫苗來(lái)預(yù)防醫(yī)源性感染。在這個(gè)階段，很難精確預(yù)測(cè)患者將暴露于哪些葡萄球菌菌林。因此用能夠產(chǎn)生針對(duì)各種葡萄球菌菌林的有效免疫應(yīng)答的疫苗進(jìn)行接種是有利的。有效免疫應(yīng)答被定義為在如實(shí)施例中描述的小鼠攻擊模型或調(diào)理呑噬作用分析中產(chǎn)生明顯保護(hù)。在例如實(shí)施例5的小鼠攻擊模型中的明顯保護(hù)被定義為與接種了載體的小鼠相比LD50至50%、100%或200%的增加。在例如實(shí)施例8的棉鼠攻擊模型中的明顯保護(hù)被定義為所觀察到的平均對(duì)數(shù)CFU/鼻至少10。/。、20%、50%、70%或卯％的降低。已知調(diào)理性抗體的存在是與保護(hù)性相關(guān)聯(lián)的，因此在例如實(shí)施例7的調(diào)理吞噬作用分析中細(xì)菌計(jì)數(shù)至少10%、20%、50%、70%或90%的減少表明了明顯的保護(hù)。包括免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、RNAIII活化蛋白、層粘連蛋白受體、SitC、IsaA/PisA、SsaA、EbhA/EbhB、EbpS和Aap在內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌之間是相當(dāng)保守的，實(shí)施例8顯示IsaA、ClfA、IsdB、SdrG、HarA、FnbpA和Sbi能夠產(chǎn)生交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答(例如在至少一種金黃色葡萄球菌和至少一種表皮葡萄球菌菌林之間的交叉反應(yīng)性)。PIA在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌之間也是相當(dāng)保守的，并且能夠誘導(dǎo)交叉免疫應(yīng)答。因此在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物將包含兩種、三種或四種上述蛋白質(zhì)，優(yōu)選進(jìn)一步包含PIA(PNAG)。多核苷酸疫苗另一方面，本發(fā)明涉及圖2的多核苷酸在治療、預(yù)防或診斷葡萄球菌感染中的用途。所述多核苷酸包括分離的多核苷酸，其包含編碼在序列的全長(zhǎng)上與圖1的氨基酸序列具有至少70%同一性，優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性，更優(yōu)選至少95%同一性的多肽。在此方面，高度優(yōu)選的是具有至少97%同一性的多肽，而具有至少98-99%同一性的多肽是更高度優(yōu)選的，具有至少99%同一性的多肽是最高度優(yōu)選的。在本發(fā)明中有用的其它多核苷酸包括分離的多核苷酸，其包含在整個(gè)編碼區(qū)與編碼本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列具有至少70%同一性，優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性，更優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列。在此方面，高度優(yōu)選的是具有至少97%同一性的多核苷酸，而具有至少98-99%同一性的多核苷酸是更高度優(yōu)選的，具有至少99%同一性的多核苷酸是最高度優(yōu)選的。其它多核苷酸包括分離的多核苷酸，其包含與圖1的序列具有至少70%同一性，優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性，更優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列。在此方面，高度優(yōu)選的是具有至少97%同一性的多核苦酸，而具有至少98-99°/。同一性的多核苷酸是更高度優(yōu)選的，具有至少99%同一性的多核苷酸是最高度優(yōu)選的。所述多核苷酸可以插入合適的質(zhì)?；蛑亟M微生物載體，并且用于免疫(參見(jiàn)例如Wolffet.al"Science247:1465-1468(1990);Corret.al.，J.Exp.Med.184:1555-1560(1996);Doeet.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.93:8578-8583(1996))。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的前述蛋白的核酸和它們?cè)卺t(yī)學(xué)中的用途。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈的，并且可以是DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。其它的編碼或非編碼序列可能但不是必須存在于本發(fā)明的多核苷酸中。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與圖2中公開(kāi)的序列具有顯著同一性的多核苷酸變體；采用此處描述的方法(如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)與本發(fā)明的多核苷酸序列相比具有至少75%序列同一性，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高序列同一性的多核苷酸。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸將包含編碼在圖1的序列的全長(zhǎng)上與圖1的氨基酸序列具有至少90%，優(yōu)選95%和更高同一性的多肽的核苷酸序列；或與所述分離的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及與上述所有多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸的用途。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的多核苷酸的片段的用途，當(dāng)給予受試者時(shí)，所述片段與圖1的多核苷酸具有相同的免疫原性特征。本發(fā)明也提供了編碼此處定義的圖1的蛋白的免疫原性片段的多核苷酸的用途。也考慮具有圖2所示多核苷酸編碼的多肽序列的免疫原性活性水平的至少約50%,優(yōu)選至少約70%，更優(yōu)選至少約90%的免疫原性活性水平的片段的用途。用于本發(fā)明的多肽片段優(yōu)選包含至少約5、10、15、20、25、50或100或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，包括此處所述多肽組分的所有中間長(zhǎng)度，如上文列出的那些。可以用標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選技術(shù)，從來(lái)源于人腫瘤前或腫瘤組織(如肺)的細(xì)胞中的mRNA的cDNA文庫(kù)獲得用于本發(fā)明的多核苷酸(例如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringharborLaboratoryPress,ColdSpringharbor,N.Y.(1989))。本發(fā)明的多核苦酸也可以從天然來(lái)源如基因組DNA文庫(kù)獲得，或可以用公知和可商購(gòu)的技術(shù)合成。存在一些本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得并且公知的方法來(lái)獲得全長(zhǎng)cDNAs或延伸短cDNAs，例如基于cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)的那些方法(參見(jiàn)例如Frohmanetal.，PNASUSA85，8998-9002，1988)。最近對(duì)該:纟支術(shù)的改進(jìn)，例如MarathonTM^支術(shù)(ClontechLaboratoriesInc.)，顯著簡(jiǎn)化了對(duì)更長(zhǎng)cDNAs的檢索。在Marathon技術(shù)中，從提取自選擇的組織的mRNA制備cDNAs,并且在每個(gè)末端連接上"銜接子"序列。然后，進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)，以便用基因特異性和銜接子特異性寡核苷酸引物的組合擴(kuò)增cDNA的"丟失的"5，末端。然后，用"嵌套的"引物，即設(shè)計(jì)用于在擴(kuò)增的產(chǎn)物內(nèi)退火的引物(典型是在銜接子序列中的更3，處退火的銜接子特異性引物和在已知基因序列的更5，處退火的基因特異性引物)重復(fù)PCR反應(yīng)。然后可以通過(guò)DNA測(cè)序分析該反應(yīng)的產(chǎn)物，通過(guò)將產(chǎn)物直接連接于存在的cDNA而構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA，以得到完整序列，或用關(guān)于設(shè)計(jì)5，引物的新序列信息進(jìn)行獨(dú)立的全長(zhǎng)PCR。包含所述DNA的載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主和按照下文表達(dá)的它們的截短或雜合蛋白都形成本發(fā)明的部分。表達(dá)載體也可以是重組活微生物，如病毒或細(xì)菌。可以將感興趣的基因插入活重組病毒或細(xì)菌的基因組。用該活載體進(jìn)行接種和體內(nèi)感染，將導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達(dá)和免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。因此，在某些實(shí)施方案中，使用多種已知的基于病毒的系統(tǒng)的任何一種將編碼用于本發(fā)明的免疫原性多肽的多核苷酸導(dǎo)入到適合的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中用于表達(dá)。在一個(gè)說(shuō)明性的實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了基因遞送系統(tǒng)的方便和有效的平臺(tái)。編碼用于本發(fā)明的多肽的選定核苷酸序列可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)插入到載體中，并包裝到逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。然后能分離重組病毒并遞送給受試者。已經(jīng)描述了許多說(shuō)明性的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(例如，美國(guó)專利No.5，219，740;MillerandRosman(1989)BioTechniques7:980-990;Miller,A.D.(1990)HumanGeneTherapy1:5-14;Scarpaetal.(1991)Virology180:849-852;Burnsetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037和Boris-LawrieandTemin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。此外，還已經(jīng)描述了許多說(shuō)明性的基于腺病毒的系統(tǒng)。與整合到宿主基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，腺病毒存留在染色體外，因而使與插入資變有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)最小化(Haj-AhmadandGraham(1986)J.Virol.57:267-274;Bettetal.(1993)J.Virol.67:5911-5921;Mitterederetal.(1994)H腿anGeneTherapy5:717-729;Sethetal.(1994)J.Virol.68:933-940;Barretal.(1994)GeneTherapy1:51-58;Berkner，K.L.(1988)BioTechniques6:616-629;andRichetal.(1993)HumanGeneTherapy4:461-476)。也已經(jīng)開(kāi)發(fā)出各種腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體系統(tǒng)用于多核苷酸遞送。使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以容易地構(gòu)建AAV載體。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,173,414和5,139,941;國(guó)際公開(kāi)No.WO92/01070和WO93/03769;Lebkowskietal.(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996;Vincentetal.(1990)Vaccines90(ColdSpringHarborLaboratoryPress);Carter,B.J.(1992)CurrentOpinioninBiotechnology3:533-539;Muzyczka,N.(1992)CurrentTopicsinMicrobiol,andImmunol.158:97-129;Kotin，R.M.(1994)HumanGeneTherapy5:793-801;ShellingandSmith(1994)GeneTherapy1:165-169;andZhouetal.(1994)J.Exp.Med.179:1867-1875。對(duì)于通過(guò)基因轉(zhuǎn)移遞送編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子有用的其他病毒載體包括那些來(lái)源于痘病毒家族的那些，例如牛痘病毒和禽痘病毒。舉例來(lái)說(shuō)，表達(dá)感興趣的分子的牛痘病毒重組體可以如下構(gòu)建。首先將編碼多肽的DNA插入到合適的載體中，使得它接近牛痘啟動(dòng)子和側(cè)翼的牛痘DNA序列，例如編碼胸苦激酶(TK)的序列。然后這個(gè)載體被用于轉(zhuǎn)染同時(shí)感染了牛痘的細(xì)胞。同源重組用于將牛痘啟動(dòng)子加編碼所述目標(biāo)多肽的基因插入到病毒基因組中。可以通過(guò)在存在5-溴脫氧尿核苷的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞，并選取對(duì)其有抗性的病毒斑塊，來(lái)選擇產(chǎn)生的TK.sup.(-)重組體。基于牛痘的感染/轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可以被方便地用于提供在生物體的宿主細(xì)胞中在此描述的一種或多種多肽的可誘導(dǎo)的、瞬時(shí)的表達(dá)或共表達(dá)。在這個(gè)特定的系統(tǒng)中，細(xì)胞首先在體外用編碼噬菌體T7RNA聚合酶的牛痘病毒重組體感染。該聚合酶顯示了精確的特異性，僅轉(zhuǎn)錄帶有T7啟動(dòng)子的模板。在感染之后，將細(xì)胞用由T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的多核苷酸或目標(biāo)多核苷酸轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的、來(lái)自牛痘病毒重組體的聚合酶將轉(zhuǎn)染的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，然后RNA通過(guò)宿主的翻譯機(jī)制被翻譯成多肽。該方法提供了高水平的、瞬時(shí)的、細(xì)胞質(zhì)的大量RNA和它的翻譯產(chǎn)物的產(chǎn)生。參見(jiàn)，例如ElroySteinandMoss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(19卯)87:6743-6747;Fuerstetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:8122-8126。做為選擇，也可以l吏用鳥(niǎo)類痘病毒例如禽痘(fowlpox)和雀痘(canarypox)病毒來(lái)遞送目才示編碼序列。已知表達(dá)來(lái)自哺享t動(dòng)物病原體的免疫原的重組禽痘病毒，當(dāng)給非禽類物種施用時(shí)，給予了保護(hù)性免疫。在人類和和其他哺乳動(dòng)物物種中施用Avipox載體是特別希望的，因?yàn)锳vipox屬的成員僅在易感的禽類物種中生產(chǎn)性復(fù)制，因而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒(méi)有傳染性。生產(chǎn)重組禽痘病毒的方法是本領(lǐng)域已知的，并應(yīng)用了遺傳重組，在以上關(guān)于牛痘病毒的生產(chǎn)中描述了。參見(jiàn)，例如WO91/12882;WO89/03429;和WO92/03545。許多甲病毒屬載體的任何一種也可以被用于遞送本發(fā)明的多核苷酸組合物，例如那些在美國(guó)專利No.5，843,723;6，015，686;6,008,035和6,015,694中描述的。也可以使用某些基于委內(nèi)端拉馬腦炎(VEE)的載體，這些的il明性實(shí)例可以在美國(guó)專利No.5，505，947和5,643,576中找到。jt匕夕卜，也可以將分子綴合載體，如Michaeletal.J.Biol.Chem.(1993)268:6866-6869andWagneretal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:6099-6103中描述的腺病毒嵌合載體用于本發(fā)明的基因遞送。關(guān)于這些和其它公知的基于病毒的送遞系統(tǒng)的其它說(shuō)明性的信息可以參見(jiàn)例如Fisher國(guó)Hochetal"P麼，胸/.JcflA5W.317-321，1989;Flexneretal"K5W.569:86-103，1989;Flexneretal"r"c">i":17-21，1990;U.S.PatentNos.4,603,112，4，769,330，and5,017,487;WO89/01973;U.S.PatentNo.4,777,127;GB2,200,651;EP0,345,242;WO91/02805;Berkner，所^:/m/《證6:616-627，1988;Rosenfeldetal"Sc&臟252:431-434，1991;Kollsetal.，/Vfl".5W.fAV/T97:215-219，1994;Kass-Eisleretal.，jP艦淑/.爿cflrf.CASL4卯11498-11502，1993;Guzmanetal.，C/，/函wM:2838-2848，1993;和Guzmanetal.，C/r.及w73:1202-1207，1993。上文描述的重組活微生物可以是有毒的或以各種方式減毒的，以獲得活疫苗。所述活疫苗也形成本發(fā)明的部分。在某些實(shí)施方案中，可以將多核苷酸整合到靶細(xì)胞的基因組中。該整合可以是通過(guò)同源重組發(fā)生在特異性的位置和方向(基因替代)和可以在隨機(jī)、非特異性的位置整合(基因增強(qiáng))。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多核苷酸可以穩(wěn)定維持在細(xì)胞中，作為DNA的獨(dú)立的附加片段。所述多核苷酸片段或"附加體，，編碼足夠獨(dú)立于宿主細(xì)胞周期而維持和復(fù)制，或與宿主細(xì)胞周期同步維持和復(fù)制的序列。將表達(dá)構(gòu)建體遞送到細(xì)胞和多核苷酸在細(xì)胞中維持的方式不依賴于采用的構(gòu)建體的表達(dá)。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，作為"棵"DNA施用/遞送本發(fā)明的多核苦酸，例如在Ulmeretal"5We"ce259:1745-1749，1993中描述的和Cohen，Sc&wce259:1691-1692，1993綜述的。通過(guò)將DNA包被在生物可降解的珠中可以增加棵DNA的攝取，所述生物可降解的珠被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。在另一種實(shí)施方案中，可以用粒子轟擊方法遞送本發(fā)明的組合物，很多這樣的方法已經(jīng)描述過(guò)。在一個(gè)說(shuō)明性的實(shí)例中，用例如PowderjectPharmaceuticalsPLC(Oxford，UK)和PowderjectVaccinesInc.(Madison,WI)制造的那些裝置可以實(shí)現(xiàn)氣體馬區(qū)動(dòng)的粒子加速，這一點(diǎn)的一些實(shí)例在美國(guó)專利No.5，846，796;6,010,478;5,865,796;5,584,807;和EPPatentNo.0500799中描述了。這種方法提供了一種無(wú)針的遞送方法，其中微觀粒子，例如多核苷酸或多肽粒子的干粉制劑在手持裝置產(chǎn)生的氦氣噴射內(nèi)被加速到高速，推動(dòng)所述粒子進(jìn)入目標(biāo)耙組織。在相關(guān)的實(shí)施方案中，對(duì)于氣體驅(qū)動(dòng)的無(wú)針注射本發(fā)明的組合物有用的其他裝置和方法包括Bioject，Inc.(Portland,OR)提供的那些，其某些實(shí)例在美國(guó)專利No.4,790,824;5,064,413;5,312,335;5,383,851;5,399,163;5,520,639和5,993,412中描述。疫苗在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物與藥學(xué)可接受的賦形劑相混合，更優(yōu)選與佐劑混合以形成疫苗。本發(fā)明的疫苗優(yōu)選被佐劑化。合適的佐劑包括鋁鹽諸如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，但是也可以是鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或者可以是?；野彼峄蝓；?、陽(yáng)離子或陰離子衍生多糖或聚磷腈的不溶懸浮液。優(yōu)選所選擇的佐劑是TH1或TH2型應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物。高水平的Thl型細(xì)胞因子傾向于幫助對(duì)特定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，而高水平的Th2型細(xì)胞因子傾向于幫助對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。重要的是要記住，Thl和Th2型免疫應(yīng)答的區(qū)別不是絕對(duì)的。實(shí)際上每個(gè)人都將維持被描述為T(mén)hl優(yōu)勢(shì)或Th2優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。然而，4艮據(jù)Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT細(xì)胞克隆中所描述的(Mosmann，T.R.和Coffman，R丄.(1989)TH1和TH2細(xì)胞淋巴因子分泌的不同模式導(dǎo)致不同的功能性質(zhì)(TH1andTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties).AnnualReviewofImmunology,7，pl45-173)來(lái)考慮細(xì)胞因子家族經(jīng)常是方便的。傳統(tǒng)上，Thl型應(yīng)答是與T-淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的INF-y和IL-2細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)的。經(jīng)常與Thl型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)直接關(guān)聯(lián)的其它細(xì)胞因子不是T細(xì)胞產(chǎn)生的，諸如IL-12。相反，Th2型應(yīng)答是與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌相關(guān)聯(lián)的。促進(jìn)Thl優(yōu)勢(shì)應(yīng)答的合適佐劑體系包括單磷酰脂A或其衍生物，特別是3-脫氧-酰化單磷酰脂A(3D-MPL)(它的制備參見(jiàn)GB2220211A);單磷酰脂A的組合，優(yōu)選3-脫氧-酰化單磷酰脂A加上鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳劑。在這樣的組合中，抗原和3D-MPL被包含在同一微粒結(jié)構(gòu)中，以便能夠用于抗原性和免疫刺激性信號(hào)的更有效遞送。研究已經(jīng)表明3D-MPL能夠進(jìn)一步增強(qiáng)明礬吸附抗原的免疫原性[ThoelenW"/.Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-Bl]。增強(qiáng)體系涉及單磷酰脂A與皂苷衍生物的組合，特別是如WO94/00153中披露的QS21和3D-MPL的組合，或者更低反應(yīng)原性的組合物，其中用膽固醇淬滅了QS21，如WO96/33739中所披露的。WO95/17210中描述了涉及水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚的特別有效的佐劑制劑，這是優(yōu)選的制劑。優(yōu)選地，疫苗額外包含皂苷，更優(yōu)選QS21。制劑也可包含水包油乳劑和生育酚(WO95/17210)。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)疫苗制劑的方法，包括將本發(fā)明的蛋白質(zhì)與藥學(xué)可接受的賦形劑諸如3D-MPL混合在一起。含有未曱基化CpG的寡核*酸(WO96/02555)也是TH1應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物，適合用于本發(fā)明中。本發(fā)明的優(yōu)選組合物是形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的那些。其中的固醇/免疫學(xué)活性的皂苷組分形成ISCOM結(jié)構(gòu)的組合物也構(gòu)成本發(fā)明的方面。QS21:固醇的比將典型地大約在1:100到1:1的重量比。優(yōu)選存在過(guò)量的固醇，QS21:固醇的比至少1:2w/w。對(duì)于人體給藥來(lái)說(shuō)，典型地，QS21和固醇將以大約1fig到大約100iag的范圍存在于疫苗中，優(yōu)選每劑量大約10pg到大約50fig。脂質(zhì)體優(yōu)選含有天然脂，例如卵磷脂，優(yōu)選在室溫不結(jié)晶的，例如卵黃卵磷脂、二油酰卵磷脂或二月桂基團(tuán)卵磷脂。脂質(zhì)體也可含有增加脂質(zhì)體-QS21結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的帶電荷的脂，因?yàn)橹|(zhì)體是由飽和脂組成的。在這些情況下，帶電荷的脂的量?jī)?yōu)選1-20%w/w，最優(yōu)選5-10%。固醇與磷脂的比為1-50%(mol/mo1),最優(yōu)選20-25%。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物含有MPL(3-脫?；鶈瘟柞Ｖ珹，也稱為3D-MPL)。由GB2220211(Ribi)可知，3D-MPL是3型脫氧?；瘑瘟柞Ｖ珹與4、5或6個(gè)酰化鏈的混合物，由RibiImmunochem，Montana生產(chǎn)。優(yōu)選形式披露在國(guó)際專利申請(qǐng)92/116556中。本發(fā)明合適的組合物是最初制備脂質(zhì)體時(shí)沒(méi)有MPL、然后加入MPL的那些組合物，優(yōu)選100nm微粒。因此MPL不包含在嚢泡膜內(nèi)部(稱為MPL在外部)。MPL包含在嚢泡膜內(nèi)部的組合物(稱為MPL在內(nèi)部)也構(gòu)成本發(fā)明的方面?？乖砂趪芭菽?nèi)部或者包含在嚢泡膜外部。優(yōu)選地，可溶性抗原在外部，疏水性或脂化抗原包含在膜的內(nèi)部或外部。本發(fā)明的疫苗制劑可用于防護(hù)或治療哺乳動(dòng)物對(duì)感染的敏感性，其通過(guò)經(jīng)全身性或粘膜途徑給予所述疫苗。這些給藥可包括經(jīng)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑的注射；或者經(jīng)粘膜給予口腔/食道、呼吸道、泌尿生殖道。用于肺炎或中耳炎治療的疫苗鼻內(nèi)給藥是優(yōu)選的(因?yàn)槟軌蚋行У仡A(yù)防肺炎雙球菌的鼻咽遞送，從而減弱了在它的最早階段的感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可作為單劑量給藥，但是其組分也可同時(shí)或不同時(shí)間一起共同給藥(例如肺炎球菌多糖可分開(kāi)給藥，在疫苗的任何細(xì)菌蛋白質(zhì)組分給藥的同時(shí)或1-2周后給藥，以便免疫應(yīng)答的最佳彼此協(xié)調(diào))。對(duì)于共同給藥來(lái)說(shuō)，可任選Thl佐劑存在于任意或所有的不同給藥中，然而優(yōu)選的是它與疫苗的細(xì)菌蛋白質(zhì)組分結(jié)合存在。除了單一途徑給藥之外，也可使用2種不同的給藥途徑。例如，多糖可IM(或ID)給藥，細(xì)菌蛋白質(zhì)可IN(或ID)給藥。此外，本發(fā)明的疫苗可以IM給藥用于致敏劑，IN給藥用于加強(qiáng)劑。每劑疫苗中的綴合抗原的量選擇為在典型疫苗中誘導(dǎo)免疫保護(hù)性應(yīng)答而沒(méi)有明顯的不利副作用的量。這樣的量將根據(jù)采用的是哪種特定免疫原以及如何呈遞它而變化。通常，期望的是每劑將包含0.1-100pg多糖，優(yōu)選0.1-50fig的多糖綴合物，優(yōu)選0.1-10fig，更優(yōu)選1-10fig，其中1到5pg是更優(yōu)選的范圍。疫苗中的蛋白質(zhì)抗原含量將典型地在1-100Mg的范圍，優(yōu)選5-50/ig的范圍，最典型地在5-25jig的范圍。在初次疫苗接種之后，受試者可接受一次或幾次適當(dāng)間隔的加強(qiáng)免疫。疫苗制備一般地描述于VaccineDesign("亞基和佐劑方法，，("Thesubunitandadjuvantapproach")(edsPowellM.F.&NewmanM.J.)(1995)PlenumPressNewYork)中。在脂質(zhì)體中的膠嚢化描述于Fullerton的美國(guó)專利4,235,877中。本發(fā)明的疫苗可保存在溶液中或者凍干。優(yōu)選地，在存在糖諸如蔗糖、海藻糖或乳糖的情況下凍干溶液。還進(jìn)一步優(yōu)選的是，將它們凍干，在使用之前當(dāng)場(chǎng)再生。凍干可形成更穩(wěn)定的組合物(疫苗)，可能在存在3D-MPL且缺少鋁基佐劑的情況下產(chǎn)生更高的抗體滴度?？贵w和纟皮動(dòng)免疫本發(fā)明的另一方面是制備用于預(yù)防或治療葡萄球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用本發(fā)明的疫苗免疫受體并從受體分離免疫球蛋白的步驟。由該方法制備的免疫球蛋白是本發(fā)明進(jìn)一步的方面。包含本發(fā)明的免疫球蛋白和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物是本發(fā)明進(jìn)一步的方面，其可用在治療或預(yù)防葡萄球菌疾病的藥物的生產(chǎn)中。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是用于治療或預(yù)防葡萄球菌感染的方法，包括給予患者有效量的本發(fā)明的藥物制劑的步驟。成水溶性組合物而制備的。將免疫刺激量的接種物給予哺乳動(dòng)物，然后將接種過(guò)的哺乳動(dòng)物維持足夠時(shí)間以便抗原性組合物誘導(dǎo)保護(hù)性抗體?？赏ㄟ^(guò)公知技術(shù)諸如親合層析在期望的程度上分離抗體(Harlow和LaneAntibodies;alaboratorymanual1988)?？贵w可包括來(lái)自各種常用動(dòng)物的抗血清，例如山羊、靈長(zhǎng)類、驢、豬、馬、豚鼠、大鼠或人。從動(dòng)物取血，回收血清。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的免疫球蛋白可包括完整抗體、抗體片段或亞片段?？贵w可以是任何類型的完整免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、具有針對(duì)本發(fā)明的兩種或多種抗原的雙特異性的嵌合抗體或雜交抗體。它們也可以是片段，例如F(ab，)2、Fab，、Fab、Fv等等，包括雜交片段。免疫球蛋白也包括天然的、合成的或遺傳工程化的蛋白質(zhì)，它們象抗體一樣通過(guò)結(jié)合到特定抗原上形成復(fù)合物而起作用。本發(fā)明的疫苗可被給予受體，然后該受體作為免疫球蛋白源，是對(duì)來(lái)自特定疫苗的攻擊的應(yīng)答而產(chǎn)生的。這樣，治療過(guò)的受試者將提供血漿，從該血漿中經(jīng)常規(guī)的血漿分級(jí)方法將獲得超免疫球蛋白。超免疫球蛋白將被給予另一受試者以便給予抗葡萄球菌感染的抗性或者治療葡萄球菌感染。本發(fā)明的超免疫球蛋白特別適用于治療或預(yù)防嬰兒、免疫受損個(gè)體中的葡萄球菌疾病，或者在需要治療時(shí)而沒(méi)有時(shí)間給該個(gè)體針對(duì)疫苗接種的應(yīng)答產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的另外方面是藥物組合物，其包含兩種或多種針對(duì)本發(fā)明免疫原性組合物的至少兩種成分有反應(yīng)的單克隆抗體(或其片段；優(yōu)選人抗體或人源化抗體)，可用于治療或預(yù)防革蘭氏陽(yáng)性菌引起的感染，優(yōu)選葡萄球菌，更優(yōu)選金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。這樣的藥物組合物包含可以是任何類型的完整免疫球蛋白的單克隆抗體，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、具有針對(duì)本發(fā)明的兩種或多種抗原的特異性的嵌合抗體或雜交抗體。它們也可以是片段，例如F(ab，)2、Fab，、Fab、Fv等等，包括雜交片段。制備單克隆抗體的方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，可包括脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合(Kohler和Milstein1975Nature256;495;Antibodies—alaboratorymanualHarlow和Lane1988)。作為選擇，單克隆Fv片段可通過(guò)篩選合適的噬菌體展示文庫(kù)而獲得(VaughanTJetal1998NatureBiotechnology16;535)。單克隆抗體可以通過(guò)已知方法人源4匕或部分人源化。方法本發(fā)明也包括制備本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗的方法。本發(fā)明的優(yōu)選方法是制備疫苗的方法，包括混合抗原以制備本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟以及加入藥學(xué)可接受賦形劑的步驟。治療方法本發(fā)明也包括治療或預(yù)防葡萄球菌感染的方法，特別是在醫(yī)院獲得的醫(yī)源性感染。的。這樣的患者將;先知道手i日期并能夠預(yù)先接種疫苗。由于不知道患者是否將暴露于金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌感染，因此優(yōu)選用如上所述的防護(hù)兩者的本發(fā)明的疫苗進(jìn)行接種。優(yōu)選地，等待擇期手術(shù)的16歲以上成人用本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗進(jìn)行治療。用本發(fā)明的疫苗接種醫(yī)護(hù)人員也是有利的。本發(fā)明的疫苗制劑可用于防護(hù)或治療哺乳動(dòng)物對(duì)感染的敏感性，其通過(guò)經(jīng)全身性或粘膜途徑給予所述疫苗。這些給藥可包括經(jīng)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑的注射；或者經(jīng)粘膜給予口腔/食道、呼吸道、泌尿生殖道。每劑疫苗中的綴合抗原的量選擇為在典型疫苗中誘導(dǎo)免疫保護(hù)性應(yīng)答而沒(méi)有明顯的不利副作用的量。這樣的量將根據(jù)采用的是哪種特定免疫原以及如何呈遞它而變化。疫苗的蛋白質(zhì)含量將典型地在1-lOO^ig的范圍，優(yōu)選5-50^g，最典型地在10-2^ig的范圍。通常，期望的是每劑將包含0.1-100jig所呈遞的多糖，優(yōu)選0.1-50^g，優(yōu)選0.1-10pg，更優(yōu)選1-10)ig，其中l(wèi)到5pg是最優(yōu)選的范圍。對(duì)于特定疫苗來(lái)說(shuō)最佳的量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究確定，包括在受試者中的合適免疫應(yīng)答的觀察。在初次疫苗接種之后，受試者可接受一次或幾次適當(dāng)間隔的加強(qiáng)免疫。盡管本發(fā)明的疫苗可通過(guò)任何途徑給藥，但是將所述疫苗給藥到皮膚中(ID)構(gòu)成本發(fā)明的一種實(shí)施方案。人體皮膚包含外部"角質(zhì)狀的，，角質(zhì)層，稱為角質(zhì)層，它覆蓋表皮。在該表皮之下是稱為真皮的層，它又覆蓋皮下組織。研究人員已經(jīng)證明，疫苗注射進(jìn)皮膚中，特別是真皮中，刺激了免疫應(yīng)答，這也可能與許多另外的優(yōu)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。用這里描述的疫苗進(jìn)行的皮內(nèi)接種構(gòu)成本發(fā)明的優(yōu)選特征。皮內(nèi)注射的常規(guī)技術(shù)"mantoux方法"包括如下步驟，清潔皮膚，然后用一只手伸展，用窄規(guī)針(26-31規(guī)格)朝向針上部的斜面以10-15。的角度插入。一旦針的斜面插入，就降低針管，進(jìn)一步推進(jìn)，同時(shí)提供低壓以在皮膚下抬高它。然后極慢地注射液體從而形成皮膚表面上的泡或隆起，接著慢慢抽出針。更為近來(lái)，已經(jīng)描述了特別地設(shè)計(jì)來(lái)將液體試劑給藥到皮膚中或穿過(guò)皮膚的設(shè)備，例如描述于WO99/34850和EP1092444中的設(shè)備，以及描述于例如WO01/13977中的快速注射設(shè)備；US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5，704，911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4，790，824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。皮內(nèi)給予疫苗制劑的作為選擇的方法可包括常規(guī)注射器和針，或者設(shè)計(jì)來(lái)沖擊遞送固體疫苗的設(shè)備(WO99/27961)，或者皮膚貼(WO97/48440;WO98/28037);或者施加到皮膚表面上(通過(guò)皮膚或經(jīng)皮的遞送WO98/20734;WO98/28037)。當(dāng)將本發(fā)明的疫苗給藥到皮膚時(shí)，或者更特別地給藥到真皮中時(shí)，疫苗是較低的液體體積，特別是在大約0.05ml和0.2ml之間的體積。本發(fā)明的皮膚或經(jīng)皮疫苗中抗原的含量可以類似于肌肉內(nèi)疫苗中存在的常規(guī)劑量(見(jiàn)上文)。然而，皮膚或經(jīng)皮疫苗的特征是制劑可以是"低劑量"。因此"低劑量"疫苗中的蛋白質(zhì)抗原優(yōu)選存在為僅僅0.1到10pg每劑，優(yōu)選0.1到5pg每劑；多糖(優(yōu)選綴合的)抗原可以在O.Ol-l)ig每劑的范圍內(nèi)存在，優(yōu)選0.01到0.5^g之間的多糖每劑。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)"經(jīng)皮遞送"意指將疫苗遞送到皮膚中的真皮區(qū)域。然而，疫苗將不必全部位于真皮中。真皮是位于距離人體皮膚表面大約1.0和大約2.0mm之間的皮膚層，但是在個(gè)體之間以及身體不同部分中存在一定量的變化。通常，可預(yù)期的是通過(guò)到皮膚表面下1.5mm來(lái)到達(dá)真皮。真皮的表面是角質(zhì)層和表皮，下面是皮下層。根據(jù)遞送模式，疫苗可能最終完全或主要位于真皮中，或者它可能最終分布在表皮和真皮中。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是預(yù)防或治療葡萄球菌感染或疾病的方法，包括將本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗給予有此需要的患者的步服在優(yōu)選實(shí)施方案中，患者是等待擇期手術(shù)的。本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方案是本發(fā)明的免疫原性組合物在制備用于治療或預(yù)防葡萄球菌感染或疾病的疫苗中的用途，優(yōu)選手術(shù)后葡萄球菌感染。術(shù)語(yǔ)"葡萄球菌感染"包括由金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌以及能夠引起哺乳動(dòng)物中優(yōu)選人宿主中感染的其它葡萄球菌菌林所引起的感染。在每種情況下，發(fā)明人都認(rèn)為這里的術(shù)語(yǔ)"包含，，、"包括可以任選用"由…組成"替換。入這里。為使本發(fā)明可被更好地理解，提供下面的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅用于說(shuō)明目的，不要以任何方式理解為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1表達(dá)重組蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的構(gòu)建A:克隆。設(shè)計(jì)在特異于葡萄球菌基因的寡核苷酸中的合適限制性位點(diǎn)允許將PCR產(chǎn)物定向克隆到E"http://表達(dá)質(zhì)粒pET24d或pQE-30中，這樣蛋白質(zhì)就能夠表達(dá)為在N-或C-末端含有(His)6親合層析標(biāo)志的融合蛋白質(zhì)。所使用的引物是oc毒素-5，-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3，和5，CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3"EbpS-5-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG畫(huà)3'和5,CCCAAGCTTTTATGGAATAACGATTTGTTG-3"ClfA—5,國(guó)CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3"和5，CCCAAGCTTTTACTCTGGAATTGGTTCAATTTC畫(huà)3"FnbpA—5，-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3"和5'CCCAAGCTTTTATGCTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3"Sbi—5,-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3"和5GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3"SdrC—5國(guó)CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3"和5CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC醒3"SdrG—5，畫(huà)CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3"和5，CCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG國(guó)3"Ebh-5,-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3"和5AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG畫(huà)3,Aaa-5，-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC畫(huà)3'和5，GCGCGCTCGAGATGGATGAATGCATAGCTAGA-3"IsaA—5，-CAAGC畫(huà)3，和5國(guó)AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3"HarA—5畫(huà)GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3'和5TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG國(guó)3"自溶素葡糖酰胺酶-5-CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3，和5，-CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3，自溶素酰胺酶-5，-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3，和5，GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3"IsdA—5，-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3"和5ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAGCTTTAGAGCTTG-3"IsdB—5，畫(huà)TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG陽(yáng)3'和5，GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3"MRPII-5，-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3"和5，AGGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3'首先按照廠商說(shuō)明使用ToplO細(xì)菌細(xì)胞將PCR產(chǎn)物引入到pGEM-T克隆載體(Novagen)中。制備該中間構(gòu)建體是為了幫助進(jìn)一步克隆到表達(dá)載體中。通過(guò)限制酶分析選擇含有DNA插入片段的轉(zhuǎn)化體。消化之后，通過(guò)凝膠電泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液中的0.8%瓊脂糖)分析約20^1反應(yīng)試樣。在凝膠電泳和溴化乙啶染色之后通過(guò)UV照射觀察DNA片段。將DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)(1Kb梯度，LifeTechnologies)與測(cè)試樣品平行電泳，用于估計(jì)DNA片段的大小。然后用如廠商(LifeTechnologies)所建議的合適限制酶將從每種克隆的選定轉(zhuǎn)化體純化的質(zhì)粒順序消化完全。然后使用硅膠基自旋柱純化已消化的DNA片段，接著用pET24d或pQE-30質(zhì)粒連接。使用pET24d質(zhì)粒進(jìn)行Ebh(H2片段)、AaA、IsdA、IsdB、HarA、Atl-酰胺酶、Atl-葡糖胺、MRP、IsaA的克隆，使用pQE-30質(zhì)粒進(jìn)行ClfA、SdrC、SdrE、FnbpA、SdrG/Fbe、a毒素和Sbi的克隆。B:表達(dá)載體的生產(chǎn)。為制備用于連接的表達(dá)質(zhì)粒pET24d或pQE-30，用合適的限制酶同樣消化完全。使用大約為所制備載體5倍摩爾過(guò)量的消化片段來(lái)進(jìn)行連接反應(yīng)。使用本領(lǐng)域公知的方法，用T4DNA連接酶(約2.0單位/反應(yīng)，LifeTechnologies)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的約20pl的連接反應(yīng)(約16。C，約16小時(shí))。根據(jù)本領(lǐng)域公知方法使用連接試樣(約5pi)轉(zhuǎn)化M15(pREP4)或BT21::DE3電感受態(tài)細(xì)胞。在約1.0ml的LB肉湯培養(yǎng)基中于371C經(jīng)約2-3小時(shí)生長(zhǎng)期后，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于含有氨千青霉素(100pg/ml)和/或卡那霉素U0pg/ml)的LB瓊脂平板上。在選擇中包括抗生素。將平板在371C下培養(yǎng)約16小時(shí)。用無(wú)菌牙簽挑取單獨(dú)的ApR/KanR克隆，用于"補(bǔ)充"接種新鮮的LBApR/KanR平板以及約1.0mlLBAp/Kan肉湯培養(yǎng)基。補(bǔ)充平板和肉湯培養(yǎng)基兩者都在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)器(平板)或振蕩水浴中于371C下培養(yǎng)過(guò)夜。采用基于全細(xì)胞的PCR分析來(lái)證明轉(zhuǎn)化體含有DNA插入片段。這里，將約1.0ml過(guò)夜LBAp/Kan肉湯培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到1.5ml聚丙烯管中，在Beckmann微型離心機(jī)(約3分鐘，室溫，約12,000Xg)中經(jīng)離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀懸浮在約200jU無(wú)菌水中，使用約10pl試樣進(jìn)行約50^1終體積的含有正向和反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)。將最初的951C變性步驟增加到3分鐘以確保細(xì)菌細(xì)胞的熱破壞和質(zhì)粒DNA的釋放。使用ABIModel9700熱循環(huán)儀和32循環(huán)的三步熱擴(kuò)增程序即95。C、45秒；55-58°C、45秒，72°C、1分鐘來(lái)從裂解的轉(zhuǎn)化體樣品中擴(kuò)增BASB203片段。在熱擴(kuò)增之后，通過(guò)凝膠電泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液中的0.8%瓊脂糖)分析約反應(yīng)試樣。在凝膠電泳和溴化乙啶染色之后通過(guò)UV照射觀察DNA片段。將DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)(1Kb梯度，LifeTechnologies)與測(cè)試樣品平4亍電泳，用于估計(jì)PCR產(chǎn)物的大小。將產(chǎn)生預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體確定為含有蛋白質(zhì)表達(dá)構(gòu)建體的菌林。然后對(duì)含有表達(dá)質(zhì)粒的菌林進(jìn)行重組蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)表達(dá)的分析。C:PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體的表達(dá)分析。將過(guò)夜的種子培養(yǎng)物試樣(約1.0ml)接種到含有約25mlLBAp/Kan肉湯的125ml錐形瓶中，在37"C振蕩(約250rpm)培養(yǎng)直到培養(yǎng)物濁度達(dá)到約0.5的O.D.600,即對(duì)數(shù)中期(通常大約1.5-2.0小時(shí))。這時(shí)，將大約一半培養(yǎng)物(約12.5ml)轉(zhuǎn)移到第二個(gè)125ml瓶中，通過(guò)加入IPTG(制備在無(wú)菌水中的l.OM原液，Sigma)到1.0mM的終濃度來(lái)誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)的和沒(méi)有誘導(dǎo)的培養(yǎng)物在37。C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)另外的約4小時(shí)。在誘導(dǎo)期之后移出誘導(dǎo)的和沒(méi)有誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的樣品(約1.0ml)，在微型離心機(jī)中于室溫離心約3分鐘來(lái)收集細(xì)胞。將單獨(dú)的細(xì)胞沉淀懸浮在約50pl無(wú)菌水中，然后與等體積的含有2-巰基乙醇的2XLaemelliSDS-PAGE樣品緩沖液混合，置于沸水浴中約3分鐘變性蛋白質(zhì)。將等體積(約15^1)的未加工的IPTG誘導(dǎo)和沒(méi)有誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解物加樣到雙份12%Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚的Mini膠，Novex)上。將誘導(dǎo)的和沒(méi)有誘導(dǎo)的裂解物樣品與預(yù)先染色過(guò)的分子量標(biāo)志(SeeBlue，Novex)—起在常規(guī)條件下使用標(biāo)準(zhǔn)SDS/Tris/甘氨酸跑膠緩沖液(BioRad)進(jìn)行電泳。電泳之后，將一份膠用考馬斯亮藍(lán)R250(BioRad)染色，然后脫色以觀察新的IPTG可誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)。使用BioRadMini-ProteanII印跡設(shè)備和Towbin氏甲醇(20%)轉(zhuǎn)移緩沖液將第二份膠在PVDF膜(0.45微米孔徑，Novex)上于4TC電印跡約2小時(shí)。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法封閉膜并進(jìn)行抗體溫育。首選使用單克隆抗-RGS(His)3抗體，然后使用綴合到HRP(QiaGen)的兔抗小鼠第二抗體來(lái)確證重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和識(shí)別。使用ABT不溶性底物或者使用帶有AmershamECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的Hyperfilm來(lái)實(shí)現(xiàn)抗-His抗體反應(yīng)模式的觀察。實(shí)施例2:重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)使用含有質(zhì)粒(pQE30)的大腸桿菌M15(pREP4)或者含有質(zhì)粒pET24d的BL21::DE3的編碼葡萄球菌蛋白質(zhì)的重組表達(dá)菌林來(lái)生產(chǎn)用于重組蛋白質(zhì)純化的細(xì)胞團(tuán)。培養(yǎng)基用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基由含有100網(wǎng)/mlAp和/或30pg/mlKm的2XYT肉湯(Difco)組成。以0.25ml/L(消泡劑204，Sigma)加入消泡劑到發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中。為誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，加入IPTG(異丙基P-D-硫代半乳糖苷)到發(fā)酵罐中(1mM終濃度)。重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)在天然條件下以1mM的終濃度加入IPTG，將培養(yǎng)物生長(zhǎng)另外的4小時(shí)。然后將培養(yǎng)物在6,000rpm離心10分鐘，將沉淀重懸浮在包括蛋白酶抑制劑混合物的磷酸鹽緩沖液(50mMK2HP04，KH2P04pH7)中。使用1500巴的壓力將該樣品進(jìn)行French壓力裂解(2次)。在15,000rpm離心30分鐘后，保留上清液用于進(jìn)一步純化，加入NaCl到0.5M。然后將樣品加樣到50mMK2HP04，KH2P04pH7環(huán)境的Ni-NTA樹(shù)脂(XK16柱Pharmacia,Ni國(guó)NTA樹(shù)月旨Qiagen)。加樣之后，用緩沖液A(0.2MNaH2P04pH7，0.3MNaCl,10%甘油)漂洗柱。為洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，使用分步梯度，其中在緩沖液A中加入了不同比例的緩沖液B(0.2MNaH2P04pH7，0.3MNaCl，10。/"甘油和200mM味唑)。緩沖液B的比例由10%逐漸增加到100%。純化后，匯集含有蛋白質(zhì)的洗脫組分，濃縮，對(duì)0.002MKH2P04/K2HP04pH7，0.15MNaCl透析。寸吏用該方法純化ClfA、SdrG、IsdA、IsaB、HarA、Atl-葡糖胺和a毒素。在變性條件下以1mM的終濃度加入IPTG，將培養(yǎng)物生長(zhǎng)另外的4小時(shí)。然后將培養(yǎng)物在6,000rpm離心10分鐘，將沉淀重懸浮在包括蛋白酶抑制劑混合物的磷酸鹽緩沖液(50mMK2HPO4，KH2P04pH7)中。使用1500巴的壓力將該樣品進(jìn)行French壓力裂解(2次)。在15,000rpm離心樣品30分鐘后，用包括1M尿素的磷酸鹽緩沖液漂洗沉淀。在15,000rpm離心30分鐘后，在8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris-HClpH8中重懸浮沉淀，在室溫保持過(guò)夜。將樣品在15000rpm離心20分鐘，收集上清液用于進(jìn)一步純化。然后將樣品加樣到8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris-HClpH8環(huán)境的Ni-NTA樹(shù)脂(XK16柱Pharmacia,Ni-NTA樹(shù)月旨Qiagen)。在流過(guò)通道后，用緩沖液A(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0,5MNaCl、O.OIMTris、pH8.0)、緩沖液C(8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris、pH6.3)、緩沖液D(8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris、pH5.9)和緩沖液E(8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris、pH4.5)連續(xù)漂洗柱。在漂洗期間用緩沖液D和E從柱上洗脫重組蛋白質(zhì)。變性的重組蛋白質(zhì)可被溶于缺少尿素的溶液中。為此目的，將8M尿素中所含有的變性蛋白質(zhì)對(duì)4M尿素、0.1MNa2P04、O.OIMTris-HCl、pH7.1，2M尿素、0.1MNaH2P04、O.OIMTris國(guó)HCl、pH7.1，0.5M精氨酸和0.002MKH2P04/K2HP04pH7.1，0.15MNaCl，0.5M精氨酸連續(xù)透4斤。該方法用于純化Ebh(H2片段)、AaA、SdrC、FnbpA、Sbi、Atl-酰胺酶和IsaA。通過(guò)SDS-PAGE分析純化的蛋白質(zhì)。在天然條件(a毒素)下純化的一種蛋白質(zhì)和在變性條件(SdrC)下純化的一種蛋白質(zhì)的結(jié)果示于圖3和4中。實(shí)施例3多糖的制備如Joyceetal2003，CarbohydrateResearch338;903-922中所描述的制備PIA(PNAG)。如InfectionandImmunity(1990)58(7);2367中所描述的從金黃色葡萄球菌提取5型和8型多糖?；罨团悸?lián)化學(xué)將天然多糖溶于NaC12M中或水中。估計(jì)所有血清型的最佳多糖濃度，在2mg/ml和5mg/ml之間。從存在于乙腈中的100mg/ml原液中，將CDAP(CDAP/PS比0.75mg/mgPS)加入到多糖溶液中。1.5分鐘后，加入0.2M三乙胺以獲得特定的活化pH(pH8.5-10.0)。在該pH下的2分鐘期間于25匸進(jìn)行多糖活化。將載體蛋白質(zhì)加入到活化的多糖中，其量足以產(chǎn)生1/l的摩爾比，在特定pH下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)1小時(shí)。然后，用甘氨酸在25"C淬滅反應(yīng)30分鐘，在41C過(guò)夜。使用以0.2MNaCl平衡過(guò)的Sephacryl500HR凝膠過(guò)濾柱經(jīng)凝膠過(guò)濾純化綴合物。確定洗脫組分的糖和蛋白質(zhì)含量。匯集綴合物，在0.22pm滅菌膜上無(wú)菌過(guò)濾。確定綴合物制劑中的PS/蛋白質(zhì)比。表征表征每種綴合物的蛋白質(zhì)和多糖含量。經(jīng)間苯二酚測(cè)試測(cè)定多糖含量，經(jīng)Lowry測(cè)試測(cè)定蛋白質(zhì)含量。通過(guò)濃度比確定最終PS/PD比(w/w)。殘留的DNAP含量(ng/pgPS):用CDAP活化多糖就在多糖中引入了氰酸酯基團(tuán)并釋放DMAP(4-二曱氨基-嘧啶)。通過(guò)在GSK發(fā)展和驗(yàn)證的特定分析法確定殘留的DMAP含量。游離多糖含量(％):置于4TC下或儲(chǔ)存于371C7天的綴合物的游離多糖含量是根據(jù)上清液確定的，所述上清液是與a-載體抗體和飽和硫酸氨溫育之后接著離心而獲得的。使用a-PS/oc-PSELISA來(lái)定量上清液中的游離多糖。綴合物的缺少也可通過(guò)a-載體/a-PSELISA來(lái)控制。實(shí)施例4制劑佐劑組合物來(lái)自上面實(shí)施例的蛋白質(zhì)可以與葡萄球菌多糖組合單獨(dú)或一起配制，作為佐劑，制劑可包含3-脫氧-?；?單磷?；(3D-MPL)和氫氧化鋁的混合物，或者3-脫氧-酰化-單褲酰基酯A(3D-MPL)和磷酸鋁的混合物，或者3D-MPL和/或QS21的混合物，任選在油/水乳劑中，任選與膽固醇或鋁鹽單獨(dú)配制，優(yōu)選磷酸鋁。3D-MPL:是革蘭氏陰性菌明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌的脂多糖(LPS)的化學(xué)脫毒形式。在GSKBiologicals進(jìn)4亍的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示3D-MPL與各種載體的組合有力地增強(qiáng)了體液型和TH1型細(xì)胞免疫。QS21:是純化自QuillajaSaponariaMolina樹(shù)的樹(shù)皮粗提取物的一種皂苷，它具有強(qiáng)的佐劑活性它活化抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖以及對(duì)幾種抗原的CTL。含有3D-MPL和明鞏的有本發(fā)明抗原的疫苗可按照WO93/19780或92/16231中所描述的類似方式制備。在GSKBiologicals進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了3D-MPL和QS21的組合在誘導(dǎo)體液型和TH1型細(xì)胞免疫應(yīng)答方面的明顯協(xié)同效應(yīng)。含有這樣抗原的疫苗描述于US5750110中。油/水乳劑由2種油(生育酚和角篁烯)和含有吐溫80作為乳化劑的PBS所組成。乳劑包含5。/。角鯊烯、5%生育酚、0.4%吐溫80，具有180nm的平均粒徑，被稱為SB62(見(jiàn)WO95/17210)。在GSKBiologicals進(jìn)4亍的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了該O/W乳劑添加MPL/QS21就進(jìn)一步增加了它們的免疫刺激性。乳劑SB62(2倍濃度)的制備將吐溫80溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中產(chǎn)生2。/。PBS溶液。為提供IOOml兩倍濃度乳劑，將5g的DLa生育酚和5ml的角鯊烯進(jìn)行渦旋以徹底混合。加入90ml的PBS/吐溫溶液，徹底混合。然后將所得溶液通過(guò)注射器，最后通過(guò)使用微流控機(jī)微流化。所得油滴具有大約180nm的大小。實(shí)施例5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。8到10周齡的雌性CD國(guó)1小鼠由CharlesRiverLaboratories,Kingston,Mass獲得。對(duì)于致死率研究來(lái)i兌，用CSA平板上培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的連續(xù)稀釋物腹膜內(nèi)(i.P.)攻擊五組9到11個(gè)CD-l小鼠。接種物數(shù)量在約101()到108CFU/小鼠的范圍。按天評(píng)估死亡率3天。通過(guò)使用劑量-應(yīng)答關(guān)系的概率單位模型估計(jì)50%致死劑量(LD5Q)。通過(guò)似然比檢驗(yàn)測(cè)試普通LDs。的虛假設(shè)。通過(guò)用約2x106CFU/小鼠經(jīng)靜脈(i.v.)途徑或者用約2x107CFU/小鼠經(jīng)i.p.途徑攻擊8到20個(gè)小鼠的組來(lái)引起亞致死的菌血癥。接種后，在特定時(shí)間從尾部將分開(kāi)的動(dòng)物組放血，通過(guò)在帶有5%綿羊血(BectonDickinsonMicrobiologySystems)的胰蛋白酶水解的大豆瓊脂平板上重復(fù)進(jìn)行定量平板計(jì)數(shù)兩次來(lái)評(píng)估菌血癥水平。用不配對(duì)的Stutent氏,發(fā)驗(yàn)的Welch4務(wù)正來(lái)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。實(shí)施例6確定不同哺乳動(dòng)物中的抗體應(yīng)答的一般方法通過(guò)ELISA測(cè)試血清的針對(duì)葡萄球菌多糖的IgG抗體。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將來(lái)自ATCC(Rockville，Md，20852)的純化莢膜多糖以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的25^g/ml濃度包被在高結(jié)合性的微量滴定板(NuncMaxisorp)上于4"C過(guò)夜。用10%胎牛血清(FCS)于371C封閉平板1小時(shí)。用20pg/ml細(xì)胞壁多糖(StatensSerumInstitute,Copenhagen)和10%FCS在室溫預(yù)孵育血清樣品30分鐘以中和針對(duì)該抗原的抗體。然后將樣品在微量平板上稀釋兩倍于PBS中的10%FCS中，在室溫?cái)嚢杵胶?小時(shí)。漂洗之后，用1:4000稀釋于PBS中的10%FCS中的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgGFc單克隆抗體(HP6043-HRP，StratechScientificLtd)在室溫?cái)嚢杵胶馕⒘科桨?小時(shí)。使用1:5000的JacksonImmunoLaboratoriesInc.過(guò)氧化物酶-綴合的AffiniPure山羊抗-大鼠IgG(H+L)(代碼112-035-003)進(jìn)行ELISA來(lái)測(cè)定大鼠IgG。使用SoftMaxPro的邏輯對(duì)數(shù)比較對(duì)每種血清型的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行滴定曲線鑒定。用于包被ELISA平板的多糖濃度是10-20fig/ml。在每10ml的pH4.5的0.1M檸檬酸鹽緩沖液中使用4mgOPD(Sigma)加上14fil11202在室溫于暗處顯影顏色15分鐘。用50piHC1終止反應(yīng)，在490nm相對(duì)于650nm讀取光密度。使用由SoftMaxPro軟件計(jì)算的4-參數(shù)的邏輯對(duì)數(shù)方程通過(guò)參照校準(zhǔn)曲線模型的滴定點(diǎn)來(lái)確定IgG濃度。測(cè)定針對(duì)葡萄球菌多糖的鼠和大鼠IgG的ELISA是類似的，除了下面的例外。采用JacksonImmunoLaboratoriesInc.過(guò)氧4匕物酶綴合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)和AffiniPure山羊抗大鼠IgG(H+L)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的IgG。HP6043-HRP與人和恒河猴純化IgG同樣地反應(yīng)，所以將該試劑用于恒河猴抗血清。蛋白質(zhì)ELISA是類似于多糖ELISA進(jìn)行的，有下面的修改。將蛋白質(zhì)以2.0pg/ml在PBS中包被過(guò)夜。將血清樣品稀釋在含有10%胎牛血清和O.l%聚乙烯醇的PBS中。使用針對(duì)人IgGFc的Sigma過(guò)氧化物酶綴合的山羊親合純化抗體(索引A-2290)檢測(cè)結(jié)合的人抗體。實(shí)施例7調(diào)理吞噬作用分析。按照Xuetal1992Infect.Immun.60;1358所述進(jìn)行人多形核白細(xì)胞(PMN)對(duì)金黃色葡萄球菌的體外調(diào)理吞噬作用殺死。人PMN是通過(guò)在3%葡聚糖T-250中沉淀而從肝素化血液制備的。調(diào)理素反應(yīng)混合物(lml)含有存在于補(bǔ)充了10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中的約106PMN，約108CFU的金黃色葡萄球菌，以及O.lml的測(cè)試血清或IgG制劑。將超免疫的兔血清用作陽(yáng)性對(duì)照，將O.lml的未免疫的兔血清用作IgG樣品的完全來(lái)源。將反應(yīng)混合物在37匸溫育，將細(xì)菌樣品在0、60和120分鐘時(shí)轉(zhuǎn)移到水中，隨后稀釋，涂布在胰蛋白酶水解的大豆瓊脂平板上，在37"€溫育，過(guò)夜溫育后用于細(xì)菌計(jì)數(shù)。實(shí)施例8葡萄球菌蛋白質(zhì)在小鼠和兔中的免疫原性用純化的葡萄球菌蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物以便產(chǎn)生超免疫血清。用Specol為佐劑的每種蛋白質(zhì)10pg免疫小鼠三次(第0、14和28天)。用Specol為佐劑的每種蛋白質(zhì)20pg免疫兔三次(第0、21和42天)。收集免疫血清，在抗-蛋白質(zhì)和抗-已殺死的完整細(xì)胞的ELISA中進(jìn)行評(píng)估。戎-f將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的1pg/ml的純化蛋白質(zhì)包被在高結(jié)合性微量滴定板(NuncMaxisorp)上于4TC過(guò)夜。用PBS-BSA1%在室溫?cái)嚢璺忾]平板30分鐘。然后將測(cè)試樣品1/1000稀釋，在室溫?cái)嚢铚赜?小時(shí)。漂洗之后，使用在PBS-吐溫0.05%中1:5000稀釋的JacksonImmunoLaboratoriesInc.過(guò)氧化物酶綴合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(索引115-035-003)或AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)(索引11-035_003)檢測(cè)結(jié)合的鼠或兔抗體。將檢測(cè)抗體在室溫?cái)嚢铚赜?0分鐘。使用在每10ml的pH4.5的0.1M檸檬酸鹽緩沖液中的4mgOPD(Sigma)+5pi11202在室溫于暗處顯影顏色15分鐘。用50piHC1終止反應(yīng)，在4卯nm相對(duì)于650nm讀取光密度。將PostIII的1/1000稀釋液的O.D.與用預(yù)先免疫的血清所獲得的O.D.相比較。用小鼠和兔血清產(chǎn)生的結(jié)果在圖5A中。觀察到了針對(duì)每種抗原的良好血清轉(zhuǎn)化。直接針對(duì)SBI的血清的評(píng)估減少了，這是由于該蛋白質(zhì)的Ig結(jié)合活性。戎-已殺/ZW^T整糴。腔#￡X/5L4:將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的20pg/ml的來(lái)自金黃色葡萄球菌5型和8型或者表皮葡萄球菌菌林Hay的已殺死的完整細(xì)胞(熱滅活或甲醛滅活)包被在高結(jié)合性微量滴定板(NuncMaxisorp)上于4°C蒸發(fā)過(guò)夜。用PBS-BSA1%在室溫?cái)嚢璺忾]平板30分鐘。通過(guò)加入在PBS-吐溫0.05%中稀釋的10|Lig/ml的親合純化雞抗-蛋白質(zhì)A(ICL索引CPA-MA-2)接著在室溫溫育1小時(shí)而中和蛋白質(zhì)A。然后將測(cè)試樣品在微量平板上由1/10的起始稀釋成為稀釋兩倍于PBS-0.05%中，在室溫?cái)嚢铚赜?小時(shí)。漂洗之后，使用在PBS-吐溫O力5%中1:5000稀釋的JacksonImmunoLaboratoriesInc.過(guò)氧化物酶綴合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(索引115-035-003)或AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)(索引11-035-003)檢測(cè)結(jié)合的鼠或兔抗體。將檢測(cè)抗體溫育30分鐘。使用在每10ml的pH4.5的0.1M檸檬酸鹽緩沖液中的4mgOPD(Sigma)+5piH202在室溫于暗處顯影顏色15分鐘。用50filHC1終止反應(yīng)，在490nm相對(duì)于650nm讀取光密度。應(yīng)當(dāng)注意的是，蛋白質(zhì)在葡萄球菌中的表達(dá)水平將根據(jù)培養(yǎng)條件而變化。因此陰性結(jié)果可能反映了不正確的培養(yǎng)條件選擇而不是缺少免疫原性。使用小鼠血清的結(jié)果示于表5中，一些圖示于圖6中。用針對(duì)SdrC、FnbpA、Ebh、Sbi和IsaA的血清觀察到了金黃色葡萄球菌菌林5的微弱識(shí)別。只有用針對(duì)Sbi的血清才觀察到金黃色葡萄球菌菌林8的識(shí)別。用針對(duì)Atl酰胺酶、MRP、IsdA、IsaA、Ebh、Aaa和Sbi的血清7見(jiàn)察到了表皮葡萄球菌Hay的孩i弱識(shí)別。使用兔血清產(chǎn)生的結(jié)果選擇性示于圖7中，并總結(jié)在表6中。用IsaA和IsdB觀察到了三種菌林的非常良好的識(shí)別。用HarA觀察到了三種菌林的微弱識(shí)別，即使動(dòng)物只接受一次注射而不是用于其它蛋白質(zhì)的三次注射。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表6蛋白質(zhì)名稱對(duì)SA5的反應(yīng)對(duì)SA8的反應(yīng)對(duì)SEHay的反應(yīng)IsaA+++++++++ClfA+++++Atl酰胺酶-+++IsdB+++++++++SdrG+++葡糖酰胺酶一--HarA(1次注射)+++IsdA一一-oc毒素——+SrdC——-Ebh-+一AaA一-—MRP一-++Sbi一+++一FnbpA++++實(shí)施例8葡萄球菌蛋白組合在鼻菌落增殖模型中的功效。用八種葡萄球菌抗原的組合接種十五組的三只棉鼠，作為對(duì)照的五只棉鼠不用抗原處理。這十六組如下組l-Atl-葡糖胺、AAA、a毒素、SdrC、SdrG、Ebh、Sbi組2-Atl-葡糖胺、Atl-酰胺酶、IsdA、IsdB、ClfA、SdrC、Ebh、FnbpA組3-Atl-葡糖胺、Atl-酰胺酶、HarA、IsdA、MRP、IsdB、AAA、"毒素組4-Atl-葡糖胺、HarA、IsdA、AAA、ClfA、IsaA、Ebh、Sbi組5-HarA、MRP、AAA、a毒素、ClfA、SdrC、Ebh、FnbpA組6-IsdA、IsdB、AAA、a毒素、ClfA、SdrG、Sbi、FnbpA組7-Atl畫(huà)酰胺酶、IsdA、MRP、AAA、IsaA、SdrG、Ebh、FnbpA組8-對(duì)照組9-Atl-葡糖胺、IsdA、MRP、a毒素、IsaA、SdrC、Sbi、FnbpA組10-Atl岡葡糖胺、MRP、IsdB、AAA、ClfA、IsaA、SdrC、SdrG組ll-Atl-酰胺酶、MRP、IsdB、a毒素、ClfA、IsaA、Ebh、Sbi組12國(guó)Atl-葡糖胺、HarA、IsdB、a毒素、IsaA、SdrG、Ebh、FnbpA組13-Atl國(guó)酰胺酶、HarA、IsdB、AAA、IsaA、SdrC、Sbi、FnbpA組14-Atl-葡糖胺、Atl-跣胺酶、HarA、MRP、ClfA、SdrG、Sbi、FnbpA組15誦Atl-酰胺酶、HarA、IsdA、a毒素、ClfA、IsaA、SdfC、SdrG組16—HarA、IsdA、MRP、IsdB、SdrC、SdrG、Ebh、Sbi每種抗原混合物含有與佐劑相混合的3pg的每種抗原，所述佐劑由含有MPL和QS21的脂質(zhì)體所制備。在實(shí)驗(yàn)的第1、14和28天接種棉鼠三次。接種后兩周，使用如Kokai-Kunetal(2003)Antimicrob.Agents.Chemother.47;1589-1597中所描述的鼻菌落增殖分析法評(píng)估免疫功效。使用"DesignExpert6"軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行經(jīng)典的多重線性回歸分析。將抗原存在編碼為1,抗原不存在為-1。使用模型的公式，確定哪些抗原是產(chǎn)生每個(gè)鼻菌落數(shù)量大量減少的關(guān)鍵抗原是可能的。結(jié)果鼻菌落增殖分析的結(jié)果示于表7中。對(duì)照組具有3.51335的平均對(duì)數(shù)CFU/鼻，在用葡萄球菌蛋白接種的所有棉鼠組中都能看到鼻菌落增殖的減少。組4、9和13顯示出鼻菌落增殖的最大減少，有超過(guò)2個(gè)對(duì)數(shù)CFU/鼻的減少。組12和16也得到了良好結(jié)果，顯示出大約2個(gè)對(duì)數(shù)CFU/鼻的減少。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>使用鼻菌落增殖數(shù)據(jù)的多重線性回歸分析來(lái)計(jì)算抗原混合物中特定抗原的貢獻(xiàn)。最終的模型含有七種最好的抗原。這些抗原的結(jié)果示于表8中。在蛋白質(zhì)混合物中，HarA的包含就產(chǎn)生了鼻菌落增殖的最大減少，接著是IsaA、Sbi、SdrC、自溶素-葡糖胺、MRP和Ebh。表8模型中七種最好抗原的對(duì)數(shù)CFU/鼻和CFU/鼻比值的差異的影響以及相應(yīng)的p-值。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>權(quán)利要求1.包含至少兩種不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物，所述蛋白或其免疫原性片段選自以下至少兩組蛋白或免疫原性片段組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結(jié)合蛋白或其免疫原性片段，其選自SdrG、層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結(jié)合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結(jié)合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Nbase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、凝固酶、Fig和MAP；組b)至少一種葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢(shì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SitC和NiABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；組c)至少一種葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自α毒素(Hla)、α毒素H35R突變體、RNAIII活化蛋白(RAP)。2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中至少一種蛋白或免疫原性片段選自組a)。3.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其中至少一種蛋n或免疫原性片段選自組b).4.權(quán)利要求1-3的免疫原性組合物，其中至少一種蛋白:、免疫原性片段選自組c)。5.權(quán)利要求1-4的免疫原性組合物，，其中至少一種蛋白.i免疫原性片段選自組a)、組b)和組c),6.權(quán)利要求1-5的免疫原性組合物，包含至少一種來(lái)自會(huì)黃色葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段.7.權(quán)利要求1-6的免疫原性組合物，包含至少一種來(lái)自l皮葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段。8.權(quán)利要求1-"的免疫原性組合物，進(jìn)一步包含P1A多糖或寡糖"9.權(quán)利要求1-8的免疫原性組合物，進(jìn)一步包含來(lái)自金裔色葡萄球菌的V型和/或VHI型莢膜多糖或寡糖.10.權(quán)利要求1-9的免疫原性組合物，進(jìn)一步包含來(lái)自表史葡萄球菌的l型和/或II型和Z或lll型笑腹多糖或寡糖，11.權(quán)利要求的免疫原姓組合物，進(jìn)一步包含來(lái)自專蘭氏陽(yáng)性菌的脂礴壁酸，12.權(quán)利要求11的免疫原性組合物，其中脂辯壁酸提取自著萄球菌。13.權(quán)利要求8-12的免疫原性組合物，其中葡萄球菌莢脬多糖綴合到蛋白質(zhì)栽體上。14.權(quán)利要求11-13的免疫原性組合物，其中脂褲壁酸綴合到蛋白質(zhì)栽體上15.權(quán)利要求13-14的免疫原性組合物，其中蛋白栽體選纟破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、流感嗜血桿菌蛋白D、肺jf球菌溶血素和a類毒素。16.權(quán)利要求1-15的免疫原性組合物，，其中產(chǎn)生了針對(duì)企黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者的有效免疫應(yīng)答.17.包含權(quán)利要求1-16的免疫原性組合物和藥學(xué)可接受賊形劑的疫苗》18.制備疫苗的方法，包括混合抗原以制備權(quán)利要求1-16O免疫原性組合物的步驟以及加入藥學(xué)可接受賦形刑的步驟，19.預(yù)防或治療葡萄球菌感染的方法，包括給予有此需要的患者權(quán)利要求n的疫苗的步驟.20.權(quán)利要求1-16的免疫原性組合物在制備用于治療或預(yù)防葡萄球菌感染的疫苗中的用途.21.制備用于預(yù)防或治療葡萄球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用權(quán)利要求17的疫苗免疫受體，并且從受體分離免疫球蛋巧的步驟。22.由權(quán)利要求21的方法制備的免疫球蛋白.23.包含權(quán)利要求22的免疫球蛋白和藥學(xué)可接受賦形劑的藥物組合物，24.治療或預(yù)防葡萄球菌感染的方法，包括給予患者有效l:的權(quán)利要求23的藥物制劑的步驟，25.權(quán)利要求23的藥物制刑在制備用于治療或預(yù)防葡萄球菌感染的藥物中的用途.全文摘要本發(fā)明涉及包含葡萄球菌抗原的混合物的免疫原性組合物，該混合物組合了具有不同功能的抗原，例如，包括葡萄球菌胞外成分結(jié)合蛋白和葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或葡萄球菌胞外成分結(jié)合蛋白和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素或葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素的組合。也描述了疫苗、治療方法、用途和制備葡萄球菌疫苗的方法。文檔編號(hào)A61K39/116GK101128215SQ200580039690公開(kāi)日2008年2月20日申請(qǐng)日期2005年9月20日優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日發(fā)明者C·A·尼特,C·卡斯塔多,J·普爾曼,N·P·F·勒克雷尼耶申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司