專利名稱：：去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物在治療抗藥性癌癥、病毒和微生物感染中的用途的制作方法去曱二氫愈創(chuàng)木酸衍生物在治療抗藥性癌癥、病毒和微生物感染中的用途
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及防止或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞中多藥抗藥性的化合物和方法。發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)生的植物木酚素的合成衍生物，四-O-甲基去甲二氫愈創(chuàng)木酸(四-o-甲基NDGA或M4N)具有抗病毒和抗癌活性，不是通過結(jié)合必需的病毒或細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)，而是通過以突變不敏感的方式阻斷這些生長(zhǎng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，給予了M4N長(zhǎng)期使用的有效性(1-3，15)。M4N在細(xì)胞培養(yǎng)物和Thy7Thy-小鼠中五種人癌癥異種移植物(乳腺癌、MCF-7、肝癌Hep3B、結(jié)直腸癌HT-29、前列腺癌LNCaP和慢性骨髓性白血病K562)中都能夠抑制SP^調(diào)節(jié)的Cdc2和存活蛋白基因表達(dá)，其隨后誘導(dǎo)細(xì)胞停止在細(xì)胞周期的G2/M期并以及時(shí)的方式凋亡(4，5)。在這個(gè)過程的最初階段中，如果在M4N存在下用這對(duì)基因的SPr無關(guān)的、CMV啟動(dòng)子-驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體來轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，M4N處理的癌細(xì)胞可以恢復(fù)它們的復(fù)制和抗凋亡能力。這種發(fā)現(xiàn)與如下模型一致M4N對(duì)這兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄效果的模型是啟動(dòng)子SPr依賴性的(4)。在通過IP和IV途徑注射和通過口喂M4N時(shí)，發(fā)現(xiàn)小鼠組織中M4N的分布和累積是選擇性的且血液中的藥物水平非常低和只是暫時(shí)存在(5)。在使用皮下、陰道內(nèi)和IV制劑的所有毒性研究中，狗和兔中的含量也只是勉強(qiáng)可檢測(cè)的。在迄今為止進(jìn)行的所有毒理學(xué)研究中，沒有觀察到例如使用順鉑或其他非選擇性細(xì)胞毒性劑看到的先祖細(xì)胞類型消除的證據(jù)。在迄今為止的臨床試驗(yàn)中，M4N沒有引起全身副作用，如胃腸道問題、貧血和脫發(fā)(6)。多藥抗藥性基因1(MDR1)編碼170kda膜蛋白腺苷三磷酸酶P-糖蛋白(Pgp)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(7)。MDR1是ATP-結(jié)合盒(ABC)家族(8)的一個(gè)成員，對(duì)于該家族在化療處理后排出細(xì)胞毒性化合物10的能力是通常已知的(9)。Pgp蛋白質(zhì)的底物包括藥物，如多柔比星(Dox)(也稱為阿霉素)、長(zhǎng)春堿、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿的和許多其他的藥物(10)。最近已經(jīng)廣泛研究了基于MDR-1基因表達(dá)的機(jī)理。在應(yīng)答環(huán)境信號(hào)中，發(fā)現(xiàn)高水平的MDR-1表達(dá)取決于一組在MDR1啟動(dòng)子位點(diǎn)以增強(qiáng)體形式與獨(dú)特的DNA序列相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。在Dox誘導(dǎo)時(shí)，MDR-1的轉(zhuǎn)錄快速進(jìn)行。在該過程中，已經(jīng)表明了轉(zhuǎn)錄因子NF-Y1結(jié)合SPl/Sp3來募集P/CAF組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶至MDR啟動(dòng)子位點(diǎn)。組蛋白乙酰化進(jìn)一步促進(jìn)了與活性MDR1轉(zhuǎn)錄相容的局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成(10)。許多研究實(shí)驗(yàn)室積極地進(jìn)行著對(duì)于可以抑制MDR1和Pgp合成的化合物的尋找。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)化合物ET-743，其靶向NF-Y1/PCAF復(fù)合物，能夠抑制MDR-1基因激活(11)。與Sp!/EGRJWT,竟?fàn)幍挠糜诮Y(jié)合MDR-1啟動(dòng)子GC元件的阻遏物K2-5F顯著降低了MDR-1表達(dá)(12)?？顾幮允桥c使用細(xì)胞毒性藥物如Dox、長(zhǎng)春堿、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿和其它藥物的癌癥治療相關(guān)的主要問題之一。Dox的長(zhǎng)期使用，例如，導(dǎo)致在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中產(chǎn)生由高M(jìn)DR-1基因表達(dá)和細(xì)胞腺苷三磷酸酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pgp累積引起的抗藥性。Pgp起作用以從胂瘤細(xì)胞中排出藥物，導(dǎo)致更少的藥物處于能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)的部位。概述本發(fā)明包括，特別是，用于治療細(xì)胞和生物中抗藥性(例如，多藥抗藥性)，和用于治療癌癥和其他疾病的組合物、用途和方法，在所述疾病中細(xì)胞或微生物已經(jīng)產(chǎn)生或可能產(chǎn)生一種或多種化療劑或藥物的抗藥性。因此，本發(fā)明包括NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽用于防止細(xì)胞中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pgp的合成和功能中的至少一種的用途；該NDGA衍生物具有下式其中R"R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-、CH3(C=0)0-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接，條件是i)RrR4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)R^R4中的一個(gè)包括糖殘基。本發(fā)明還包括NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽聯(lián)合至少一種第二化療劑來治療癌癥的用途，該NDGA具有下式其中i)Ri-R4中的至少一個(gè)包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CH^基團(tuán)的氨基酸殘基，或包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-12-基團(tuán)的取代氨基酸殘基，并且剩余的R基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-;或ii)R「R4中的一個(gè)包括糖殘基且剩余的R基團(tuán)選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0;所述氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接。本發(fā)明進(jìn)一步包括NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽防止或克服癌細(xì)胞中多藥抗藥性的用途；該NDGA衍生物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中R"R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-、CH3(C=0)0-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)結(jié)合，條件是i)RrR4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)R「R4中的一個(gè)包括糖殘基。還包括克服微生物中抗藥性的方法，它包括將有效量的NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽給予所述微生物或含有該微生物的宿主，其中該NDGA衍生物具有下式其中R。R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-、CH3(C=0)0-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接；條件是i)RrR4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)Ri-R4中的一個(gè)包括糖殘基。此外，本發(fā)明包括治療動(dòng)物中抗藥性感染的方法，它包括將有效量的化合物或該化合物生理學(xué)上可接受的鹽和至少一種感染抵抗的治療劑一起給藥于該動(dòng)物，該化合物具有下式其中RpR2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-、CH3(00)0-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接，條件是i)R,-R4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)R,-R4中的一個(gè)包括糖殘基。本發(fā)明包括組合物，該組合物含有化合物或該化合物生理學(xué)上可接受的鹽，該化合物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中i)RrR4中的至少一個(gè)是通過氧原子與苯環(huán)連接的p-氨基酸殘基；或ii)R!-R4中的一個(gè)是糖殘基，其任選地通過氧原子和1-10個(gè)-CHr基團(tuán)與苯環(huán)連接。此外，本發(fā)明包括組合物，該組合物含有NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑，該NDGA衍生物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中i)R,-R4中的至少一個(gè)包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CH2-基團(tuán)的氨基酸殘基，或包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CH2-基團(tuán)的取代氨基酸殘基，并且剩余的R基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-;或ii)R,-R4中的一個(gè)包括糖殘基且剩余的R基團(tuán)選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0;所述氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接。本發(fā)明還包括測(cè)定NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和用于治療癌癥的第二化療劑的最佳劑量組合的方法，其中該NDGA衍生物具有下式其中R"R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-;CH30;CH3(C=0)0-;氨基酸殘基；取代的氨基酸殘基；糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過1-10個(gè)碳原子和氧原子的連接體與苯環(huán)連接；該方法包括(a)將一系列不同劑量的NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑的組合物施用到癌細(xì)胞的培養(yǎng)物中；(b)測(cè)量細(xì)胞的生長(zhǎng)速率；(c)使用等效應(yīng)圖(isobologram)方法或組合指數(shù)法來測(cè)定使用次最佳濃度的NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑獲得可比較功效的最佳組合劑量。附圖簡(jiǎn)要說明圖1.M4N處理對(duì)MCF細(xì)胞和NCI/ADR-RES細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)。A.培養(yǎng)物中。B.Thy7Thy-小鼠的異種移植物中。圖2.M4N處理對(duì)MCF-7和NCI/ADR細(xì)胞中Cdc2和存活蛋白產(chǎn)生的作用-蛋白質(zhì)印跡分析。圖3.M4N、Dox、紫杉醇及其組合在NCI/ADR-RES細(xì)胞中的劑量-效應(yīng)曲線。A.M4N和多柔比星(Dx)，單獨(dú)和組合。B.M4N和紫杉醇(Px)，單獨(dú)和組合。x-軸表示以nmol/l計(jì)的藥物劑量，y-軸表示Fa,受影響(生長(zhǎng)抑制)細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。圖4.M4N與Dox或紫杉醇組合在NCI/ADR-RES細(xì)胞中的分析。A.不同效果水平(Fa)的M4N和多柔比星(Dx)組合的等效應(yīng)圖。B.不同效果水平(Fa)的MaN和紫杉醇(Px)組合的等效應(yīng)圖。圖5.M4N與Dox或紫杉醇組合在NCI/ADR-RES細(xì)胞中的分析。A.M4N和多柔比星(Dx)組合的CI曲線。B.M4N和紫杉醇(Px)組合的CI曲線。圖6.M4N對(duì)NCI/ADR-RES人乳腺癌細(xì)胞中MDR1基因表達(dá)和Pgp水平的作用。A.通過總RNA的RT-PCR產(chǎn)生的MDRl和GAPDH(歸一化對(duì)照)cDNA的瓊脂糖凝膠分析，該總RNA來自用0、5、10和20fiMM4N處理三天的細(xì)胞。柱狀圖中的結(jié)果歸一化為GAPDH。B.用0、5、10和20nMM4N處理三天的細(xì)胞中Pgp和細(xì)胞周期蛋白Bl(歸一化對(duì)照)的蛋白質(zhì)印跡分析。柱狀圖中的結(jié)果歸一化為細(xì)胞周期蛋白Bl的標(biāo)準(zhǔn)化。圖7.M4N對(duì)MCF-7細(xì)胞中通過多柔比星誘導(dǎo)的MDRl基因表達(dá)的作用。在5pMM4N存在或不存在下，使MCF-7細(xì)胞保持未處理或用0.05jiM多柔比星處理兩天，然后分析總RNA和蛋白質(zhì)的MDRl基因表達(dá)和Pgp蛋白水平。A.通過RT-PCR產(chǎn)生的MDRl和GAPDH(歸一化對(duì)照)cDNA的瓊脂糖凝膠分析。STD，來自NCI/ADR-RES細(xì)胞的cDNA。B.Pgp和細(xì)胞周期蛋白Bl(歸一化對(duì)照)蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析。STD，來自NCI/ADR-RES細(xì)胞的蛋白質(zhì)的分析。圖8.Pgp-介導(dǎo)的羅丹明123排出的抑制。測(cè)試在0、1.25、2.5、3.75和5.0nMM4N存在下孵育三天的NCI/ADR-RES細(xì)胞保持羅丹明123的能力。將細(xì)胞中剩余羅丹明123的百分比對(duì)時(shí)間作圖。圖9.(A)麥芽糖-M3N對(duì)人肺瘤細(xì)胞系增殖的效應(yīng)。用不同濃度的麥芽糖-M3N處理HT29、LNCaP、Hep3B、K562和MCF772小時(shí)。通過MTT測(cè)定法來測(cè)量細(xì)胞存活力百分比并將其表示為一式三份數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值土SD。(B)用DAPI將未處理的或用60pM麥芽糖-1^13]\處理72小時(shí)的Hep3B細(xì)胞染色。箭頭表示凋亡體。圖10.麥芽糖-M3N對(duì)人腫瘤細(xì)胞系中Cdc2和存活蛋白表達(dá)的作用。從對(duì)照細(xì)胞C或暴露于麥芽糖-M3N24和72小時(shí)的細(xì)胞[M制得總蛋白提取物并通過蛋白質(zhì)印跡分析來分析CDC2和存活蛋白水平。將P-肌動(dòng)蛋白用作負(fù)荷對(duì)照。圖11.腫瘤內(nèi)麥芽糖-]\13]\處理對(duì)C3腫瘤的凋亡，以及CDC2和存活蛋白水平的效應(yīng)。從每日腫瘤內(nèi)注射所示濃度的麥芽糖-M3N或安慰劑(0.15MNaCl)處理4天的小鼠切除肺瘤。將固定的腫瘤切片并使用對(duì)CDC2和存活蛋白特異性抗體通過H&E染色和免疫化學(xué)分析來分析。圖12.M4N和麥芽糖M3N(Mal-M3N)單獨(dú)以及結(jié)合紫杉醇(Px)對(duì)棵鼠中NCI/ADR-RES乳腺癌異種移植物腫瘤的Pgp蛋白水平的效應(yīng)。用i.p.注射M4N(320阿ol/m2)、Mal-M3N(320拜ol/m2)或Px(16nmol/m2),單獨(dú)或組合，每日處理小鼠，處理兩周，將來自該小鼠的曱酪固定的腫瘤切片并使用人對(duì)Pgp特異性抗體通過H&E和免疫化學(xué)染色來分析。發(fā)明描述本發(fā)明使用去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物，如四-o-甲基NDGA，(M4N)來停止Pgp蛋白的形成和/或功能。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)M4N抑制Dox-誘導(dǎo)的MDR基因表達(dá)、Pgp蛋白的合成并防止Dox從藥物處理過的細(xì)胞中"泵出"。M4N處理使Dox更可利用于靶向細(xì)胞周期S期的TopII/DNA復(fù)合物。因此，可以協(xié)同使用低濃度的M4N和Dox來控制癌生長(zhǎng)。此外，發(fā)現(xiàn)M4N及其衍生物在NCI/ADR-RES細(xì)胞的人乳腺癌異種移植物的消除中非常有效，NCI/ADR-RES細(xì)胞是已經(jīng)獲得對(duì)Dox強(qiáng)烈抗藥性的一種細(xì)胞系。M4N阻斷了NCI/ADR-RES細(xì)胞中的Cdc2和存活蛋白基因表達(dá)，并且顯著地，M4N也能夠防止MDR1基因的表達(dá)。其他NDGA4汙生物，如下所述，應(yīng)當(dāng)也呈現(xiàn)這些特性。如在此所用的"去曱二氫愈創(chuàng)木酸衍生物"的意思是指以下結(jié)構(gòu)的化合物及其生理學(xué)上可接受的鹽(i)其中R，、R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-，條件是R,、R2、R3和R4各自不同時(shí)是HO-;氨基酸殘基；取代的氨基酸殘基。還包括該式的化合物及其生理學(xué)上可接受的鹽，其中RpR2、&和R4中的一個(gè)是糖殘基且剩余的R基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CH30-和CH3(00)0-。該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基可以任選地通過1-10個(gè)，更常見1-6個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接，最常見具有連接該碳連接體至苯環(huán)的氧原子。通常連接體包括2-4個(gè)-CHr基團(tuán)，例如，(糖殘基)-CH2-CH2-0-(苯基)。1^-114可以相同或不同，除了在特定的應(yīng)用(例如，癌癥的治療)中，其中Rj、R2、R3和R(各自不能同時(shí)是HO-。優(yōu)選R!-R4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基；取代的氨基酸殘基；糖殘基。用作取代基的氨基酸包括天然產(chǎn)生和合成的氨基酸。這些包括，特別是，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、曱硫氨酸、18苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、5-羥基賴氨酸、4-羥基脯氨酸、曱狀腺素、3-甲基組氨酸、s-N-甲基賴氨酸、s-N，N，N-三曱基賴氨酸、氨基己二酸、"羧基谷氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、N-曱基精氨酸和N-乙酰賴氨酸。包括R和L型以及混合的R和L型的a氨基酸。其它可能的取代基包括在氨基和羧基之間存在2個(gè)或更多個(gè)(通常2-4個(gè))-CHr基團(tuán)的氨基酸，如以下更詳細(xì)描述的，及其衍生物。因此，氨基酸殘基可以是a、p、Y或更高階氨基酸的殘基，優(yōu)選在其他方面對(duì)應(yīng)天然產(chǎn)生的氨基酸的氨基酸殘基。氨基酸殘基優(yōu)選通過連接殘基中羰基的氧原子連接苯環(huán)。打算將取代的氨基酸殘基和氨基酸的衍生物包括那些殘基其中一個(gè)或多個(gè)氫原子已經(jīng)被曱基或其他直鏈或支鏈低級(jí)烷基(1-6個(gè)碳原子)、硫酸根或磷酸根基團(tuán)等替代，例如，其中在氨基上進(jìn)行了二曱基取代。由于M4N在水溶液中有限的溶解度，為了更易于配制和施用藥物組合物，存在對(duì)具有相似特性的水溶性化合物的需要。例如，通過M3N的糖基化來獲得其中R^R4中的一個(gè)是糖例如單糖或二糖的化合物，可以實(shí)現(xiàn)溶解度的提高。出于空間原因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)優(yōu)選包括在糖和連接苯基的氧原子之間含有1-10個(gè)，更常見1-6個(gè)碳原子，通常2-4個(gè)-CHr基團(tuán)的連接基團(tuán)。有用的糖的實(shí)例是麥芽糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、葡糖胺以及其中糖的OH基團(tuán)被其他基團(tuán)如O-甲基、O-乙?；?、氨基、羧基、低級(jí)烷基、低級(jí)?；?1至6個(gè)碳原子)、磷?；?或磺基置換的它們的衍生物，或相同或不同種類的2個(gè)或更多個(gè)糖的寡糖。這樣化合物的實(shí)例是其中R,或R2是麥芽糖或半乳糖且剩余的R基團(tuán)是-OCH3的那些，如以下的化合物(分別被稱為半乳糖-M3N和麥芽糖-M3N):668.74待治療的腫瘤包括呈現(xiàn)抗藥性，特別是由細(xì)胞中MDR1基因的存在/超表達(dá)引起的抗藥性的任何癌性或非癌性胂瘤(Ling，V.Multidrugresistance:MolecularMechanismsandClinicalRelevance(多藥抗藥性分子機(jī)理和臨床關(guān)聯(lián))，C"wcwC/^附W/^r.P/m/wao/.40:53-58，1997)。這樣的腫瘤包括，特別是，乳腺癌、轉(zhuǎn)移性肺癌、原發(fā)性黑素瘤、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。打算將術(shù)語"癌性腫瘤"包括可能已經(jīng)經(jīng)受或可能沒有經(jīng)受轉(zhuǎn)移的任何惡性腫瘤。打算將術(shù)語"非癌性腫瘤"包括任何良性腫瘤。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的來使用這些術(shù)語?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的組合物和方法治療的良性和惡性腫瘤的其他實(shí)例可以在CancerBiology(癌生物學(xué))的表l-l中找到(RaymondW.Ruddon，CancerBiology(癌生物學(xué))，第3版,OxfordUniv.Press,1995，在此引入作為參考)。待治療的胂瘤包括已知具有病毒起因的那些，以及不具有病毒起因的那些。預(yù)期本發(fā)明的組合物和方法在實(shí)體腫瘤的治療中特別有用。"多藥抗藥性"或"MDR"意思是指對(duì)一種或多種治療化合物抗藥性的細(xì)胞、微生物等，該化合物打算用來滅活或殺滅那些細(xì)胞或微生物包括，例如呈現(xiàn)高M(jìn)DR-1基因表達(dá)的那些。術(shù)語"抗藥性"還用來指已知對(duì)特定治療化合物抗藥性的細(xì)胞、微生物等?？紤]到局部(例如，局部或通過局部注射至腫瘤中)或通過全身傳送(例如，口服、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi))來給藥NDGA衍生物或含有該衍生物的藥物組合物，通常和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑和栽體一起。可以將非水溶性衍生物在合適的溶劑中配制成藥物組合物，用于注射至腫瘤中，例如，以DMSO溶液的形式。也可以使用局部給藥的其他方式，如局部應(yīng)用或靶向傳送至胂瘤部位。水溶性的化合物和組合物可以在任何藥學(xué)上可接受的水溶液如磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中配制。也可以將NDGA衍生物用于基于脂質(zhì)或基于水的制劑中，用于全身傳送，如本領(lǐng)域已知并使用的。NDGA衍生物可以非極性化合物的形式或以游離酸/堿的形式、或四氫氯化物的形式或其他生理學(xué)上可接受的鹽來使用。本發(fā)明的化合物可以結(jié)合其他診斷或治療化合物并和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑和載體一起使用，這是指本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的。根據(jù)本發(fā)明，"藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑和載體"意思是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與NDGA衍生物相配伍并適用于局部或全身給藥于動(dòng)物這樣的化合物，動(dòng)物特別是人或其他哺乳動(dòng)物?？梢酝ㄟ^制藥領(lǐng)域公知的任一種方法制得用于口服或腸胃外給藥的有用溶液，例如,這些方法描述于Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明頓藥物科學(xué))中，(Gennaro，A.編輯)，MackPub.(1990)。獲得所需治療效果而給藥的化合物的量可以改變，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易決定。劑量、給藥頻率和治療長(zhǎng)度取決于各種情況，主要是取決于腫瘤的大小和類型。預(yù)期常規(guī)劑量為約10-10Vmol/m2患者或受治療者的體表面積，更常見10、10Vmol/ii^患者或受治療者的體表面積。除了憑借自身是有效的抗癌劑外(美國專利No.6，214，874，6,417,234，6,608,108)，NDGA衍生物顯示出能夠解決許多與臨床中常用的細(xì)胞毒性藥物相關(guān)的藥物藥物抗藥性問題。通過使用這些相對(duì)非毒性的衍生物并結(jié)合低濃度的其他細(xì)胞毒性藥物可以獲得高效的癌癥控制。因此，NDGA衍生物可以用作第一化療劑，與用作癌性或良性腫瘤化療劑的各種細(xì)胞毒性劑，例如，Dox、長(zhǎng)春堿、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿一起使用。如在此所用的，這樣的其他化療劑將稱為"第二，，化療劑。當(dāng)結(jié)合NDGA衍生物時(shí)，降低濃度的這些第二化療劑足以獲得高功效。包括于在此所用的"第二化療劑，，意思內(nèi)的其他常用化療劑的歹寸表可以在Blagosklonny，Ce〃C>c/e3:e52-e59(2004)中找到；其他細(xì)胞毒性化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在此所述的NDGA衍生物還可以用于治療抗藥性病毒、細(xì)菌和其他相似的感染，通過給藥這些衍生物結(jié)合由于抗藥性基因的存在或超表達(dá)而微生物已經(jīng)對(duì)其變得抗藥性的藥物化合物。因此，本發(fā)明提供了使用NDGA衍生物防止細(xì)胞中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pgp的合成和功能中至少一種的用途，該NDGA衍生物具有下式其中K、R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-，條件是R。R2、R3和R4各自不同時(shí)是HO-;氨基酸殘基；取代的氨基酸殘基；和該衍生物的生理學(xué)上可接受的鹽。用于該用途的還包括該式的化合物，其中RnR2、R3和R4中的一個(gè)是糖基且剩余的R基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CH3(3-和CH3(C=0)0-，以及該化合物的生理學(xué)上可接受的鹽。氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過1-10個(gè)，更常見1-6個(gè)碳原子和氧原子的連接體與苯環(huán)連接，如上所述。優(yōu)選RrR4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基；取代的氨基酸殘基；和糖殘基。氨基酸殘基可以是，例如，天然產(chǎn)生的氨基酸或其衍生物的殘基，或在氨基和羧基之間存在至少兩個(gè)-CHr基團(tuán)的氨基酸或其衍生物的22殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用四+曱基去甲二氫愈創(chuàng)木酸(M4N)。例如，可通過化療劑，如Dox、長(zhǎng)春堿、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿來引起化學(xué)誘導(dǎo)。細(xì)胞可以是，例如，腫瘤細(xì)胞，或感染性微生物，如病毒、細(xì)菌、寄生物或真菌。例如，可以通過抑制細(xì)胞中的化學(xué)誘導(dǎo)、防止MDR1的轉(zhuǎn)錄和/或防止Pgp的合成來防止Pgp的合成或功能。細(xì)胞可以是，例如，肺瘤細(xì)胞，或感染性微生物，如細(xì)菌、病毒、寄生物或真菌。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了防止細(xì)胞中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pgp的合成和功能中至少一種的方法，該方法包括將有效量的上述NDGA衍生物中的一種給予細(xì)l包。上述衍生物還可以結(jié)合一種或多種化療劑使用來治療癌癥。這些第二化療劑可以是，例如，Dox、長(zhǎng)春堿、紫杉醇或長(zhǎng)春新堿。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約2:1至約100:1,更常見約10:1至約50:1(例如，約20:1)的特定比例的NDGA衍生物與第二化療劑特別有利，因?yàn)樗鼈兲峁┝嗣糠N藥劑最小劑量的最佳結(jié)果。在本上下文中，"約，，意思是指±25%，即，例如，對(duì)于約20:1的比例來說為15:1至24:1的比例。因此，將清楚的是，上述的NDGA衍生物可用于防止或克服癌細(xì)胞中的多藥抗藥性，并且本發(fā)明提供了克服癌細(xì)胞中抗藥性的方法和用途，包括將有效量的上述NDGA衍生物給予癌細(xì)胞，用于防止或克月良MDR?？顾幮钥梢允牵?，對(duì)Dox、長(zhǎng)春堿、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿以及用于治療癌癥的其他藥物的抗藥性。因此，本發(fā)明還提供了治療癌癥的方法，它包括給予NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽結(jié)合第二化療劑來治療癌癥，其中該NDGA衍生物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>其中i)RrR4中的至少一個(gè)包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CHr基團(tuán)的氨基酸殘基，或包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CHr基團(tuán)的取代氨基酸殘基，并且剩余的R基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-;或ii)Rr"R4中的一個(gè)包括糖殘基且剩余的R基團(tuán)選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-;氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過1-10個(gè)碳原子和氧原子的連接體與苯環(huán)連接。這類第二化療劑可以是，例如，Dox、長(zhǎng)春堿、紫杉醇和/或長(zhǎng)春新堿。癌癥可以是人癌癥，例如，乳腺癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤，或可以是非人動(dòng)物尤其是哺乳動(dòng)物中的癌癥。本發(fā)明還提供了克服微生物中抗藥性的方法，它包括將有效量的NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽給予所述微生物或含有該微生物的宿主，其中該NDGA衍生物具有下式R2'其中、R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-、CH3(C=0)0-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接；條件是i)RrR4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)RrR4中的一個(gè)包括糖殘基。微生物可以是，例如，病毒、細(xì)菌、寄生物或真菌。因此，本發(fā)明還提供了治療動(dòng)物中抗藥性感染的方法，它包括將有效量的如上所述的NDGA衍生物和至少一種感染抗藥性的藥物(例如，抗生素)給藥于動(dòng)物。感染可以是，例如，病毒、細(xì)菌、寄生物或真菌感染。本發(fā)明還提供了用于上述目的的化合物和組合物。特別地，本發(fā)明提供了化合物或該化合物生理學(xué)上可接受的鹽，該化合物具有下式其中i)RrR4中的至少一個(gè)包括通過氧原子與苯環(huán)連接的p-、y-或更高階氨基酸殘基；或ii)R，-R4中的一個(gè)是糖殘基，任選地通過氧原子和1-10個(gè)-CHr基團(tuán)與苯環(huán)連接；和剩余的R基團(tuán)是-OCH3。本發(fā)明這方面的一個(gè)實(shí)施方案中，Ri-R4中的至少一個(gè)是p-、"或更高階氨基酸殘基，任選地通過氧原子和1-10個(gè)-CHr基團(tuán)與苯環(huán)連接。剩余的R基團(tuán)可以是，例如，HO-、CH30-或CH3(C=0)0-。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RrR4中的一個(gè)是糖部分，并且剩余的基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CH:jO-或CH3(C=0)0-。在一個(gè)實(shí)施方案中，R,-R4中的至少一個(gè)是p-氨基酸，并且剩余的R基團(tuán)是CH30-。p-和Y-氨基酸指的是在氨基和羧基之間各自具有2個(gè)或3個(gè)-CHr基團(tuán)的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，P-和y-氨基酸殘基分別對(duì)應(yīng)于在氨基和羧基之間存在一個(gè)或兩個(gè)另外的-CHr基團(tuán)的天然產(chǎn)生氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，R廠R4中的一個(gè)是單糖或二糖，例如，半乳糖或麥芽糖。這些類型的衍生物的實(shí)例是麥芽糖-M3N和半乳糖-M3N，如上所述，麥芽糖-CH2-CH2-0-m3n,和半乳糖-CHrCH2-0-M3N。本發(fā)明化合物的其他實(shí)例是5-((2S，3R)4-(3,4-雙4-(二甲氨基)丁酰氧基苯基}-2，3-二甲基丁基)-2-[4-(二甲氨基)丁酰氧基苯基4-(二甲氨基)丁酸酯和5-((28，3議)-4-{3，4-雙[4-(二甲氨基)丙酰氧基1苯基}-2，3-二甲基丁基)-2-[4-(二甲氨基)丙酰氧基苯基-4-(二曱氨基)丙酸酯。本發(fā)明的這些和其他化合物可以任選地與第二化療劑、抗生素和/或藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體配制成組合物。在這點(diǎn)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NDGA衍生物和其他化療劑的特定組合可以以特定的摩爾比最佳地傳送，例如約2:1至約100:1，例如約20:1，具有該兩種化合物次最佳濃度的預(yù)定協(xié)同作用。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，以這些優(yōu)選的比例，例如，2.4:1、20:1、50:1，來配制本發(fā)明的藥物組合物。因此，本發(fā)明還包括組合物，該組合物含有NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑，該NDGA衍生物具有下式其中i)R,-R4中的至少一個(gè)包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CHr基團(tuán)的氨基酸殘基，或包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CH2-基團(tuán)的取代氨基酸殘基，并且剩余的R基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CH3(3-和CH3(C=0)0-;或ii)R廣R4中的一個(gè)包括糖殘基且剩余的R基團(tuán)選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-;該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接。本發(fā)明的另一方面提供了測(cè)定NDGA衍生物和其他化療劑這樣的有利比例的方法，和含有這些比例的NDGA纟汙生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑的組合物。該方法包括以下步驟(a)將一系列不同劑量的NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑的組合物施用到癌細(xì)胞的培養(yǎng)物中；(b)測(cè)量所述細(xì)胞的生長(zhǎng)速率；26(C)使用等效應(yīng)圖法或組合指數(shù)方法來測(cè)定使用次最佳濃度的NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑獲得可比較功效的最佳組合劑量；和(d)配制含有最佳劑量的組合物。優(yōu)選，將最佳配制的組合物給藥于需要治療的患者。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)麥芽糖-M3N或M4N和紫杉醇的最佳組合為320jimol/m2:16拜ol/m2。本申請(qǐng)要求享有美國臨時(shí)申請(qǐng)no.60/616，114的優(yōu)先權(quán)，在此將其引入作為參考。實(shí)施例現(xiàn)在參照以下特定的、非限制性的實(shí)施例來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。以下的實(shí)施例證明了M4N和其他NDGA衍生物能夠通過阻斷Spi調(diào)節(jié)的MDR-1基因表達(dá)來控制Pgp的合成。結(jié)果顯示了M4N在防止MDR-1基因的Dox誘導(dǎo)和維持MCF-7細(xì)胞的藥物敏感性中是有效的。M4N和Dox顯示出抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同效果。此外，在M4N處理后，NCI/ADR-RES細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)、MDR基因表達(dá)和Pgp蛋白的合成全部得到很大程度的降低。此外，實(shí)施例顯示了NDGA衍生物和笫二化療劑的組合是協(xié)同作用的且在降低體內(nèi)肺瘤生長(zhǎng)中是高度有效的。實(shí)施例1M4N處理阻斷了培養(yǎng)物和Thy7Thy-小鼠的異種移植物中MCF-7和NCI/ADR細(xì)月包的細(xì)胞增殖。方法將MCF-7細(xì)胞(人乳房癌細(xì)胞系，可從ATCCP.O.Box1549,Manassas,VA20108獲得)以1.5xl04細(xì)胞/孔接種于24-孔平板中的500^1含有10%胎牛血清(FBS)以及抗生素青霉素和鏈霉素的Dulbecco，s改良Eagle，s培養(yǎng)基(DMEM)中。第二天加入不同濃度的M4N。孵育另外的3天后，通過MTT測(cè)定法來測(cè)定細(xì)胞增殖。對(duì)于異種移植物研究，將5-6周齡的雌性無胸腺棵鼠(nu/nu)在它們的脅腹皮下(s.c.)植入懸浮于Hank，s平衡鹽溶液(HBSS)中的2xl06個(gè)MCF-7細(xì)胞或2xl06個(gè)NCI/ADR細(xì)胞(從TumorRepositoryDevelopmentalTherapeuticProgram,NCI-Frederick,MD荻得)。當(dāng)腫瘤呈現(xiàn)出7-8mm平均直徑時(shí)，給小鼠喂養(yǎng)無菌食物球中的M4N(每個(gè)球含2.5ml加熱的玉米油中約300mgM4N，混合了9克基礎(chǔ)混合粉，HarlarTekladCo.，2.0ml的H20)。將小鼠分配到接受溶解于6%CremaphorEL、6%乙醇和88%鹽水中的M4N的處理組，和只接受栽體的對(duì)照組。進(jìn)行分配使得對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都含有帶有相當(dāng)大小腫瘤的小鼠。小鼠每日接受IOOjiL含有2mgM4N的單次腹膜內(nèi)(i.p.)注射，持續(xù)3周。對(duì)照小鼠接受等體積載體。每七天測(cè)量一次腫瘤的兩個(gè)垂直尺寸(L和W)，根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤體積V=(LxW/2)3x;r/6。將來自各只小鼠的結(jié)果合并并測(cè)定平均腫瘤體積。通過Student'st-檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)胂瘤體積平均差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)果如圖1中所示的，M4N能夠抑制培養(yǎng)物(圖1A)和腫瘤異種移植物(圖IB)中MCF-7和NCI/ADR-RES細(xì)胞生長(zhǎng)。M4N在抑制MCF-7的生長(zhǎng)中比抑制NCI/ADR-RES的生長(zhǎng)更有效。為了在72小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)全部的細(xì)胞停止，對(duì)于NCI/ADR-RES需要40nM的M4N，而對(duì)MCF-7細(xì)胞僅20fiM的M4N就足夠了。通過每日IP注射M4N或通過在食物球中加入M4N口喂而進(jìn)行的21天系統(tǒng)處理后，M4N還極大地降低了該兩種類型的異種移植物的腫瘤大小(圖IB)。實(shí)施例2M4N處理后極大地降低了MCF-7和NCI/ADR細(xì)胞中的Cdc2和存活蛋白表達(dá)。方法用所示的M4N濃度處理后，用PBS洗滌MCF-7和NCI/ADR細(xì)胞單層并用PBS中的lOmMEDTA和lOmMEGTA收集。將洗滌過的細(xì)胞沉淀并在含有蛋白酶抑制劑混合物(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO.)的RIPA緩沖劑(50mMtris國HCl，pH7.4，150mMNaCl，1。/o曲通x-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1。/。SDS和ImMEDTA)中裂解。用Bio-Rad蛋白濃度測(cè)定溶液來測(cè)定蛋白濃度。將二十五微克蛋白在14%SDSPAGE凝膠上分離并使用半干電印跡裝置電印跡在Hybond增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)硝基纖維素膜(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上。以0.2ng/mL的終濃度4吏用抗Cdc2(OncogeneResearchProducts，cat.#D04431-l)、存活蛋白(SantaCruzBiotechnology,cat.#SCBT10811)和細(xì)胞周期蛋白B(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA，cat.#SCBTH-433)的兔多克隆一抗和小鼠多克隆一抗肌動(dòng)蛋白(SantaCruzBiotechnology,cat.#SC-8432)。二抗是綴合辣根過氧化物酶的抗兔子或抗小鼠IgG。用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑盒(Amersham)產(chǎn)生濾光片。將化學(xué)發(fā)光濾光片對(duì)著X-射線膜放置，用于蛋白質(zhì)條帶的檢測(cè)。結(jié)果除了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的效果(圖1)，M4N處理大大地抑制了MCF-7(圖2A)和NCI/ADR-RES細(xì)胞(圖2B)中的Cdc2和存活蛋白基因表達(dá)。在M4N(15nM)處理3天時(shí)，MCF-7細(xì)胞中存在>95%的Cdc2抑制和>60%的存活蛋白抑制。M4N(40pM)處理2天后，NCT/ADR-RES細(xì)胞中的Cde2和存活蛋白也得到了極大的降低(圖2B)。實(shí)施例3M4N對(duì)MDR的i秀導(dǎo)和表達(dá)方法*^培##秀樹添*從ATCC獲得人乳腺癌細(xì)胞系，MCF-7。從DTP人腫瘤細(xì)胞系篩選(HumanTumorCellLineScreen)(DevelopmentalTherapeuticsProgram,NCI)獲得多藥抗藥性細(xì)胞系，NCI/ADR-RES。將兩種細(xì)胞系維持于補(bǔ)充了10。/。胎牛血清以及抗生素青霉素和鏈霉素的Dulbecco，s改良Eagle，s培養(yǎng)基中。如先前所述的(1，13)合成NDGA衍生物，M4N。在二曱亞砜(DMSO)中制備M4N和紫杉醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的儲(chǔ)液并加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，使得DMSO的終濃度為百分之一。制得Dox(Sigma-Aldrich)的含水儲(chǔ)液并在稀釋至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中之前過濾滅菌。細(xì)應(yīng)#'/須試將NCI/ADR-RES以每孔2xl04細(xì)胞的密度接種于24孔平板中并在24h后給培養(yǎng)基補(bǔ)充M4N、Dox、紫杉醇或M4N和Dox或M4N和紫杉醇的組合物。以1.5至48nM之間的濃度來^f吏用M4N。對(duì)于M4N和Dox的組合，使用2.4:1(M4N:Dox)的固定比例，對(duì)于M4N和紫杉醇，比例為20:1(M4N:紫杉醇)。藥物添加后三天，用SRB測(cè)定法(14)，4吏用PowerWave200農(nóng)1量平板閱讀器(Bio-TekInstruments,Winooski，VT)觀寸量540和690腿(參照)吸收度，來測(cè)定細(xì)胞毒性。秀游;/^5^"^的譯價(jià)將基于半數(shù)效應(yīng)原理的Chou和Talalay的組合指數(shù)(CI)等效應(yīng)圖方法用于計(jì)算組合藥物效果的協(xié)同作用或拮抗作用。使用半數(shù)效應(yīng)等式和曲線(18,20)以及CT等式和曲線(19)來作出單獨(dú)或組合的每種藥物連續(xù)稀釋濃度的劑量-效應(yīng)曲線。使用計(jì)算機(jī)軟件CompuSyn(20)自動(dòng)產(chǎn)生不同效果和劑量水平的CI值和等效應(yīng)圖。使用這種方法，通過l、<1和>1分別表示加和、協(xié)同或拮抗效應(yīng)。將對(duì)于每種單一藥物和組合的藥物達(dá)到給定效果水平需要的劑量比例的比較用于測(cè)定劑量-減少指數(shù)(DRI)。使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)來分離總RNA。根據(jù)制造商的方案使用含有Platinum7Vz《DNA聚合酶的SuperscriptII一步式RT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen)來進(jìn)行RT-PCR，使用MDR1特異性的寡核苷酸引物5，-ACATGACCAGGTATGCCTAT-3，(SEQIDNO:1)5,-GAAGATAGTATCTTTGCCCA-3，(SEQI關(guān)O;2)和GAPDH特異性的寡核苷酸引物5，CCATCACCATCTTCCAGGAG-3,(SEQIDNO;3)5，國CCTGCTTCACCACCTTCTTG畫3，(SEQIDNO:4)通過瓊脂糖凝膠電泳來分離RT-PCR產(chǎn)物并用溴化乙錠染色。通過ImageJ軟件(NIH，Bethesda,MD)來定量相對(duì)條帶強(qiáng)度。蛋白質(zhì)印跡將培養(yǎng)的細(xì)胞在PBS中的10mMEDTA和10mMEGTA溶液中孵育，然后用Tefloi^細(xì)胞刮器刮擦來收集。將細(xì)胞沉淀并在含有蛋白酶抑制劑混合物(SigmaChemicalCo.)的改良PIRA緩沖液[50mMTris-HCl(pH7.4),l%NP-40，0.25%脫氧膽酸鈉，150mMNaCl,lmMEDTA(pH8.0)I中裂解。通過離心來澄清裂解物并用Bio-Rad蛋白測(cè)定法(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)來測(cè)定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白樣品并使用半干印跡裝置電印跡于Hybond增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)硝基纖維素膜(Amersham)上，并按照ECL蛋白質(zhì)印跡系統(tǒng)(Amersham)的操作說明書進(jìn)行檢測(cè)。使用的抗體是抗Pgp和細(xì)胞周期蛋白B的兔多克隆一抗和綴合辣根過氧化物酶的二抗(SantaCruzBiotechnology)。使用Image，J軟件來測(cè)量相對(duì)條帶強(qiáng)度。在0、1.25、2.5、3.75和5.0jiMM4N的存在下培養(yǎng)NCI/ADR-RES細(xì)胞。三天后，通過胰蛋白酶處理收集細(xì)胞并以5.0xl(^細(xì)胞/ml的密31度重懸浮于含有1.0ng/ml羅丹明123(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的相同培養(yǎng)基中。在37。C孵育一小時(shí)后，用冰冷PBS將裝載羅丹明的細(xì)胞洗滌兩次并重懸浮于含有起始濃度M4N的培養(yǎng)基中。在排出階段的過程中，每15分鐘收集5,0xl()S個(gè)細(xì)胞，在冰冷PBS中洗滌，重懸浮于100fil水冷PBS中并通過485nm激發(fā)波長(zhǎng)和535nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光測(cè)定法來分析。結(jié)果M/V和#杉寧的逸合放^M4N、Dox和紫杉醇作為單獨(dú)的藥劑或組合以劑量依賴性的方式抑制了多藥抗藥性人乳腺癌細(xì)胞系NCI/ADR-RES的生長(zhǎng)。對(duì)于M4N的平均ICs。值為8.67jiM,而對(duì)于Dox和紫杉醇的IC5D值分別是3.22nM和3.26fiM(表1)。對(duì)于Dox和紫杉醇的IC5。值是通過NCI/ADR-RES細(xì)胞呈現(xiàn)的MDR表型的表示，如對(duì)于這兩種藥劑對(duì)MCF-7所報(bào)道的ICso值是130nM和6.4nM，MCF-7是一種藥物敏感性人乳腺癌細(xì)胞系(10)。相反，來自我們先前的研究(5)，對(duì)于對(duì)抗MCF-7的M4N的ICs。值大約為7pM，幾乎和對(duì)于抗藥性細(xì)^^系的相同。當(dāng)在NCI/ADR-RES細(xì)胞中結(jié)合使用時(shí)，M4N和Dox具有5.63+2.34pM的IC5。值。對(duì)于M4N和紫杉醇組合，IC5。值為3.31+0.17,(表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>將兩種方法，等效應(yīng)圖法和組合指數(shù)(CI)法，用于測(cè)定M4N和Dox或紫杉醇之間是否存在協(xié)同作用。構(gòu)建抑制生長(zhǎng)卯％(Fa=0.9)、75%(Fa=0.75)和50%(Fa=0.5)必需的M4N和Dox與M4N和紫杉醇劑量的等效應(yīng)圖。對(duì)于兩種藥物聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)為低于這些值中每一個(gè)的預(yù)期加和效應(yīng)線的藥物濃度，表明在M4N和兩種第二化療劑之間存在強(qiáng)烈的協(xié)同作用(即，CK0.3)(圖3)。此外，將Chou和Talalay(19)的半數(shù)效應(yīng)分析用來計(jì)算兩種藥物組合的組合指數(shù)(CI)。M4N和Dox組合在高劑量水平(ED帥和ED95)具有非常強(qiáng)烈的協(xié)同作用(CK0.1),而M4N和紫杉醇在全部劑量范圍內(nèi)具有強(qiáng)烈的協(xié)同作用(CI=0.41-0.14)(圖3-5，表l)。劑量降低指數(shù)(DRI)測(cè)定了允許協(xié)同組合中每種藥物的倍數(shù)劑量-降低。這是重要的，因?yàn)閯┝拷档蛯?dǎo)致降低的毒性，同時(shí)維持了所需的功效。作為它們協(xié)同作用的結(jié)果，DRI對(duì)于每種藥物呈現(xiàn)出相當(dāng)大的劑量降低(表l)。DRI顯示出通過同時(shí)給藥11.3nMM4N，將抑制75%NCI/ADR-RES細(xì)胞生長(zhǎng)(ED75)必需的Dox濃度降低了6.47倍，即，從30.5nM降低至4.7pM，而ED95降低了87.6倍。相似地，紫杉醇的EDso降4氐了19.63倍，ED95降低了300.3倍。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實(shí)施例4MDR1基因表達(dá)和P-糖蛋白水平的M4N抑制我們接下來檢測(cè)了M4N對(duì)MDRl基因表達(dá)的作用，以測(cè)定觀察到的多藥抗藥性細(xì)胞中M4N與Dox和紫杉醇之間的協(xié)同作用是否是MDR表型逆轉(zhuǎn)的結(jié)果。我們假定M4N通過其抑制Spl結(jié)合的能力可能下調(diào)MDR1基因表達(dá)。為了檢測(cè)這種可能性，將NCI/ADR-RES細(xì)胞暴露于0、5、10和20nlM4N三天，此后檢測(cè)總RNA和蛋白的MDR1mRNA和Pgp的水平。用20nMM4N處理后，細(xì)胞中的MDRlmRNA水平在歸一化至管家基因GAPDH后降低至未處理值的36.3%(圖6A)。在暴露于20nMM4N三天后，還降低了Pgp的含量，其豐度降低至對(duì)照含量的17.8%(圖6B)。甚至三天暴露于5pMM4N導(dǎo)致Pgp降低21.8%。將Pgp的水平歸一化至細(xì)胞周期蛋白Bl，根據(jù)我們以前的結(jié)果，細(xì)胞周期蛋白Bl的表達(dá)不受M4N影響(4,5)。該結(jié)果表明了M4N通過抑制多藥抗藥性細(xì)胞中MDR1mRNA和夠逆轉(zhuǎn)MDR表型。實(shí)施例5M4N對(duì)化療后細(xì)胞荻得抗藥性能力的作用接下來我們研究了M4N是否可以用于在暴露于化療后防止細(xì)胞獲得抗藥性。當(dāng)將藥物敏感性人乳腺癌細(xì)胞系暴露于低劑量Dox時(shí)，誘導(dǎo)了MDR1基因表達(dá)。我們?cè)?.0jiMM4N的存在或不存在下用0.05nMDox處理MCF-7細(xì)胞兩天并測(cè)量MDR1mRNA和Pgp蛋白的相對(duì)含量。在不存在M4N下Dox處理誘導(dǎo)了MDRlmRNA和Pgp兩者的可測(cè)量表達(dá)(圖7)。沒有暴露于Dox的MCF-7細(xì)胞中的MDRl表達(dá)是不可檢測(cè)的。然而，通過與M4N的聯(lián)合治療消除了MDRl表達(dá)的誘導(dǎo)(圖7)。實(shí)施例6M4N對(duì)多藥抗藥性細(xì)胞中羅丹明123排出的作用36Pgp介導(dǎo)了Dox和紫杉醇從多藥抗藥性細(xì)胞中的排出。使用Pgp底物Rh-123來檢測(cè)M4N下調(diào)Pgp對(duì)藥物排出的作用。在0、1.25、2.5、3.75和5.0nMM4N存在下，將NCI/ADR-RES細(xì)胞孵育三天。然后將細(xì)胞裝載Rh-123、洗滌并使其排出，使用或不用M4N。在排出期間的過程中，以15分鐘的間隔測(cè)定細(xì)胞的結(jié)合細(xì)胞的Rh-123含量歷時(shí)1小時(shí)。未處理的抗藥性細(xì)胞具有約12分鐘的E5。(細(xì)胞保持50%Rh-123的時(shí)間)(圖8)。用1.25、2.5、3.75和5.0nMM4N處理細(xì)胞分別將Eso提高至12.5、12.5、15和20分鐘。這些減緩藥物排出的結(jié)果與M4N降低細(xì)胞中的Pgp水平相一致。實(shí)施例7糖取4戈的JMtN衍生物我們合成了新的水溶性M4N類似物，麥芽糖-M3N，通過用麥芽糖分子置換M4N上3，或4，位置的甲基。評(píng)價(jià)了麥芽糖-M3N對(duì)抗五種人癌細(xì)胞系的體外和體內(nèi)抗癌活性。還檢測(cè)了它對(duì)Cdc2和存活蛋白的抑制效果。方法麥芽糖-M3N的合成以M4N合成中的副產(chǎn)物形式獲得M3N，并用硅膠色謙法純化(1)。將M3N(0.47g)和卩-麥芽糖八-醋酸鹽(1.85g)(21,23)溶解于二氯曱烷(5ml)中，并用三氟化硼醚合物(2.0ml)處理3-4小時(shí)。在過量三氟化硼分解后，用碳酸氫鈉和氯化鈉的冷溶液洗滌有機(jī)溶液，蒸發(fā)成糖漿，并溶解于95%EtOH中，用于在SephadexLHJO柱(5x200cm)中色譜分離。通過色語法從過量麥芽糖醋酸鹽以及未反應(yīng)的M3N中分離產(chǎn)物(未反應(yīng)的M3N可以重新用于另一輪的麥芽糖化)。用催化量的甲醇鈉將麥芽糖化的M3N(固體)在無水甲醇中脫乙酰，并用Dowex50x8(氫形式)除去甲醇鈉。曱醇溶液的蒸發(fā)產(chǎn)生了固體產(chǎn)物。最終分離的產(chǎn)量為起始M3N的35-40%，但是通過未反應(yīng)M3N的再次糖基化可以將產(chǎn)量提高至60%或更高。如本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，對(duì)起始化合物合適改變，使用這種方法可以制得半乳糖M3N和其他糖衍生物?？墒褂蒙舷挛闹兴龅姆椒▉頊y(cè)試這類化合物的功效。細(xì)胞培養(yǎng)和麥芽糖-M3N處理從ATCC(Mannassas，VA)獲得人胂瘤細(xì)胞系。將人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，Hep3B,維持于補(bǔ)充了10。/。FBS的Eagle'sMEM中；將人乳腺癌細(xì)胞系，MCF7，生長(zhǎng)于含有10%FBS的DMEM中；將人結(jié)直腸癌細(xì)胞系，HT29，培養(yǎng)于含有10%FBS的McCoy，s5a培養(yǎng)基中；將人前列腺癌細(xì)胞系，LNCaP，維持于含有10%FBS的RPMI1640中，將人紅白血病細(xì)胞系，K562，在含有10%FBS的Iscove，s改良Dulbecoo，s培養(yǎng)基(IMDM)中增殖。所有培養(yǎng)物含有抗生素青霉素和鏈霉素。通過用全長(zhǎng)HPV16轉(zhuǎn)染EJras轉(zhuǎn)化的C57B16(B6)小鼠胚胎細(xì)胞來產(chǎn)生C3細(xì)胞系。將C3細(xì)胞生長(zhǎng)并維持于補(bǔ)充了5%FBS加青霉素和鏈霉素的IMDM中。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將麥芽糖-M3N溶解于水中至10mM的濃度，然后過濾滅菌。將細(xì)胞以每平方厘米大約2xl(^個(gè)細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基中。接種后二十四小時(shí)，除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基并替換為含有所需濃度麥芽糖-M3N的培養(yǎng)基。細(xì)胞存活力將兩萬個(gè)細(xì)胞接種于24-孔平板的每個(gè)孔中。二十四小時(shí)后，用含有各種濃度麥芽糖-M3N的新培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。孵育3天后，將培養(yǎng)基改成含有溶解于PBS中的500figMTT、5%FBS和100單位/ml青霉素和鏈霉素的MTT溶液。孵育后兩小時(shí)，除去MTT溶液并用500^1DMSO/孔替代。將溶解的染料轉(zhuǎn)移至96-孔平板中并使用ELISA閱讀器在540nm的波長(zhǎng)處閱讀。蛋白質(zhì)印跡在所需的藥物孵育時(shí)間后，收集培養(yǎng)基并在PBS中10mMEDTA和10mMEGTA的溶液中用Tefloi^刮棒刮擦單層細(xì)胞培養(yǎng)物。將細(xì)胞沉淀并在改良的RIPA緩沖劑[50mMTris-HCl(pH7.4),1%NP-40,0.25%脫氧膽酸鈉，150mMNaCl，lmMEDTA(pH8.0)和lx蛋白酶抑制劑混合物(SigmaChemicalCo.)I中裂解。然后用Bio-Rad蛋白濃度測(cè)定溶液定量蛋白提取物并儲(chǔ)存于-80aC。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并使用半干印跡裝置電印跡在Hybond增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光硝基纖維素膜(Amersham)上，并按照增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(AmershamPharmacia)的操作說明書中所述的進(jìn)行檢測(cè)。所用的抗體是抗Cdc2、存活蛋白和p-肌動(dòng)蛋白的兔多克隆一抗和辣根過氧化物國二抗(SantaCruzBiotechnology)。小鼠中C3細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤的麥芽糖-M3N處理將四只C57bl/6小鼠在肩之間皮下接種5xl()S個(gè)C3細(xì)胞。使腫瘤發(fā)展大約20天。然后小鼠每日接受腫瘤內(nèi)注射0.1ml的0.15MNaCl，溶解于0.15MNaCI中的10mg、20mg或40mg的麥芽糖-M3N。處理4天后，使小鼠安樂死并切除腫瘤，立即固定，然后儲(chǔ)存于PBS中的4。/。甲醛中。然后將組織樣品送至ParagonBioservices(Baltimore,MD)，用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)，使用抗Cdc2和存活蛋白的抗體。結(jié)果麥芽糖-M3N對(duì)抗人腫瘤的體外和體內(nèi)抗癌活性在五種人癌細(xì)胞系中評(píng)價(jià)了麥芽糖-M3N的生長(zhǎng)抑制效果，這五種細(xì)胞系包括Hep3B、HT29、K562、LNCaP和MCF7。將細(xì)胞暴露于麥芽糖-M3N3天，導(dǎo)致所測(cè)試的每個(gè)細(xì)胞系中細(xì)胞存活力的劑量依賴性降低，具有20nM至40pM的ICs。值，與對(duì)于M4N觀察到模式的非常相似(圖9A)。進(jìn)行麥芽糖-M3N處理的Hep3B的核的DAPI染色，以鑒定凋亡體的濃縮核(圖9B)，并證實(shí)了麥芽糖-M3N相關(guān)的細(xì)胞死亡是通過凋亡發(fā)生的。麥芽糖-M3N抑制Cdc2和存活蛋白基因表達(dá)為了檢測(cè)麥芽糖-M3N是否抑制Cdc2和存活蛋白生產(chǎn)力，將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于生長(zhǎng)抑制劑量的麥芽糖-M3N，并在處理24和72小時(shí)后提取蛋白。蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)印跡分析表明處理過細(xì)胞中降低的Cdc2和存活蛋白表達(dá)。與M4N相比較，麥芽糖-M3N呈現(xiàn)出相似的Cdc2和存活蛋白表達(dá)的抑制(圖10)。體內(nèi)抗腫瘤活性在麥芽糖-M3N的體內(nèi)抗腫瘤功效的初步測(cè)試中，C3腫瘤每曰接受含有各種濃度麥芽糖-M3N的單次腫瘤內(nèi)注射，持續(xù)4天。處理后，將小鼠安樂死，拍照，并通過H&E、Cdc2和存活蛋白染色來分析組織樣品。與對(duì)照的比較，處理過的胂瘤的顏色顯得更暗。顏色改變與升高水平的凋亡和壞死相關(guān)，如通過H&E染色所證明的。此外，處理過的腫瘤清楚地顯示出與對(duì)照腫瘤相比較，Cdc2和存活蛋白蛋白表達(dá)水平降低(圖11)。實(shí)施例8M4N或麥芽糖-M3N和紫杉醇對(duì)抗棵鼠中NCI/ADR-RES抗藥性乳腺癌異種移植物的聯(lián)合治療方法將帶有NCI/ADR-RES多藥抗藥性乳腺癌異種移植物的棵鼠用作聯(lián)合治療的模型來進(jìn)一步檢測(cè)M4N和紫杉醇之間的協(xié)同作用。從CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)購買5國6周齡的T-細(xì)胞缺陷雄性棵(nu/nu)鼠，并圈養(yǎng)在無病原體的房間中。按照J(rèn)ohnsHopkinsUniversityAnimalCareandUseCommittee的指南進(jìn)行所有涉及小鼠的實(shí)驗(yàn)。將小鼠在兩脅腹皮下植入懸浮于Hank，s平衡鹽溶液(HBSS)中的lxl()6個(gè)NCI/ADR-RES細(xì)胞。當(dāng)腫瘤呈現(xiàn)2-4mm平均直徑時(shí)，將小鼠隨機(jī)分配到處理組(每組7只小鼠)、只有溶劑的組、只接受M4N或麥芽糖-M3N的組或和紫杉醇組合的組。對(duì)于腹膜內(nèi)(i.p.)給藥，將IVl4N、麥芽糖-M3N和紫杉醇溶解于新制得的降低cremophor的溶液中，該溶液含有20。X)(v)脫水乙醇、20%(v)CremophorEL,PEG300，<11%(v)吐溫80(22)。對(duì)于每種藥物和藥物組合，進(jìn)行每日0.05ml的注射。每七天測(cè)量一次腫瘤的兩個(gè)垂直尺寸，并根據(jù)以下公式來計(jì)算肺40瘤體積腫瘤體積=(a2xb)/2其中a是腫瘤的寬度(較小的直徑)和b是長(zhǎng)度(較大的直徑)(23)。計(jì)算每個(gè)處理組的平均腫瘤體積和標(biāo)準(zhǔn)誤差。測(cè)定相對(duì)平均腫瘤體積，(V/V。)，其中V是特定時(shí)間的平均腫瘤體積并且Vo是第0天的平均胂瘤體積(23),并將該相對(duì)平均腫瘤體積用于評(píng)價(jià)腫瘤生長(zhǎng)抑制(T/C值)，使用以下的等式T/C(%)=處理過的相對(duì)平均腫瘤體積/對(duì)照的相對(duì)平均體積x100采用抗腫瘤活性最小水平(T/C542%)的NCI標(biāo)準(zhǔn)(25)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，切除腫瘤并固定于曱醛中。然后將組織樣品送至ParagonBioservices,用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)，使用抗人P-糖蛋白(Pgp)的抗體。使用M4N和紫杉醇的兩個(gè)劑量方案，二者都使用20:1的固定摩爾比(M4N:紫杉醇)，如表l中所示的通過體外測(cè)試為協(xié)同作用所測(cè)定的。基于來自其他研究(22)的值，8和16nmol/i^劑量的紫杉醇是次最佳的，并且通過降低我們以前使用MCF-7乳腺癌異種移植物的研究中所用的最大耐受劑量來達(dá)到160和320pmol/m2的M4N劑量(5)。還測(cè)試了其他的NDGA衍生物。產(chǎn)生了麥芽糖-M3N,作為M4N的水溶性替代物，然而為了一致性，將其溶解于與該研究的M4N和紫杉醇相同的還原cremophor溶劑系統(tǒng)中。對(duì)于只接受溶劑的對(duì)照小鼠，在兩周的處理中，外植的腫瘤得到了可觀地增大，平均腫瘤體積接近三倍大小(表2)。還注意到用次最佳劑量的M4N(320nmol/m2)、紫杉醇(16nmol/m2)或麥芽糖-M3N(320nmol/m2)處理的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)在兩周后分別具有1.33、1.59和1.25的相對(duì)平均腫瘤體積。然而，對(duì)于用M4N和紫杉醇或麥芽糖-M3N和紫杉醇組合處理的小鼠，最終相對(duì)平均腫瘤體積小于1，表明腫瘤大小的總體下降(表2)。此外，對(duì)于每種藥物組合給藥方案的腫瘤生長(zhǎng)抑制(T/C)值全部低于$42%(根據(jù)國立癌癥研究標(biāo)準(zhǔn)的最小抗胂瘤活性水平)(24)。通過在處理階段的開始和結(jié)束時(shí)記錄它們的體重來評(píng)價(jià)小鼠的健康和良好狀況。對(duì)于每種劑量方案，平均體重改變是小的(-0.9至+1.3)，并且與對(duì)照組相比，沒有顯著不同(表2)。僅有的兩個(gè)呈現(xiàn)平均體重降低的處理組是M4N和紫杉醇的高劑量單種藥物方案(分別為-0.2和-0.9)。任何組中不存在小鼠死亡記錄。使用協(xié)同藥物聯(lián)合治療的優(yōu)勢(shì)是使用次最大劑量化療劑的能力。這反映在治療方案降低的毒性，如通過體重的穩(wěn)定性和零死亡率所說明的。實(shí)施例9M4N和麥芽糖-M3N抑制了NCI/ADR-RES乳腺癌異種移植物腫瘤中的P-糖蛋白水平為了檢測(cè)解釋M4N和紫杉醇之間在抑制抗藥性乳腺癌異種移植物生長(zhǎng)中的明顯協(xié)同作用的機(jī)理，分析腫瘤的Pgp存在。用蘇木精和曙紅(H&E)或使用Pgp特異性抗體的免疫化學(xué)將來自實(shí)施例8每個(gè)處理組的異種移植物腫瘤活體檢查的組織切片染色。來自對(duì)照組的肺瘤切片在大部分腫瘤細(xì)胞表面呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的對(duì)Pgp的抗體棕色染色(圖12)。在紫杉醇處理的腫瘤中看到相似的模式。相反，M4N和麥芽糖-M3N處理的腫瘤顯示出抗體染色的劇烈下降，與Pgp蛋白含量的降低相一致。用M4N和紫杉醇組合處理的肺瘤應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致肺瘤退化，通過H&E染色具有一些中心壞死并且不存在Pgp抗體染色(圖12)。在麥芽糖-M3N/紫杉醇處理的腫瘤中，Pgp水平被相似地降低。實(shí)施例10含有較長(zhǎng)鏈氨基酸的NDGA衍生物預(yù)期其中R廠R4包括至少一個(gè)"長(zhǎng)鏈"氨基酸取代基的NDGA衍生物及其衍生物(如上文所定義的)也是有用的。這樣的取代基在氨基和羧基之間存在至少兩個(gè)-CHr基團(tuán)(通常2-4個(gè))。這些化合物的衍生物包括，特別是，其中胺基團(tuán)具有二曱基取代的化合物，例如5-((2S，3R)-4-(3，4-雙[4-(二甲氨基)丁酰氧基j苯基)-2，3-二曱基丁基)-2-[4-(二甲氨基)丁酰氧基苯基-4-(二曱氨基)丁酸酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>5-((2S,3R)-4-(3,4-雙[4-(二甲氨基)丙酰氧基苯基)-2，3-二甲基丁基》2-[4-(二甲氨基)丙酰氧基]苯基_4-(二甲氨基)丙酸酯方案1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>方案2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過常規(guī)方法來制得這樣的衍生物。例如，可以使用以下的方法，對(duì)原料進(jìn)行合適的取代，以獲得其他相似的衍生物。5-((2S，3R)-4-(3，4-雙[4-(二甲氨基)丁酰氧基l苯基)-2，3-二曱基丁基)-2-[4-(二甲氨基)丁酰氧基j苯基4-(二甲氨基)丁酸酯(中-2，3-二甲基-1，4_二{3，4-雙}[4-(二曱氨基)丁酰氧基苯基}丁烷)(參見方案1)將DCC(4.28g，20.76mmo1，6.0當(dāng)量)和DMAP(422.7mg，3.46mmo1，1.0當(dāng)量)加入NDGA(1.05g，3.46mmo1，1.0當(dāng)量)和4-(二甲氨基)丁酸鹽酸鹽(3.48g，20.76mmo1，6.0當(dāng)量)的二氯曱烷(lOOmL)溶液中。將反應(yīng)混合物在氮?dú)庀率覝財(cái)嚢?4小時(shí)。在濾掉反應(yīng)混合物中的二環(huán)己脲后，將所得到的溶液在減壓下濃縮。然后將丙酮(250mL)加入殘余物中并用過量HC1(g)將所得到的溶液起泡。將沉淀物溶解于水中并使用丙酮在室溫再沉淀兩次，來獲得白色固體產(chǎn)物。許多關(guān)注和資源已經(jīng)指向逆轉(zhuǎn)在輔助化療過程后可能產(chǎn)生的多種抗癌藥物的抗藥性。第一代MDR逆轉(zhuǎn)劑是也發(fā)生結(jié)合Pgp的藥理學(xué)活性化合物。因?yàn)樗鼈兤渌乃幚硖匦允沟盟鼈儗?duì)于臨床使用的毒性太大，這些藥物最終沒有成功。本發(fā)明人已經(jīng)顯示了M4N和其他NDGA衍生物能夠逆轉(zhuǎn)多藥抗藥性癌細(xì)胞中的MDR表型。M4N和其他NDGA衍生物獨(dú)特地適于執(zhí)行使細(xì)胞對(duì)化療藥物如Dox和紫杉醇再次敏感的任務(wù)。此外，本發(fā)明的化合物還能夠抑制Dox介導(dǎo)的MDR1基因表達(dá)誘導(dǎo)，并因此如果在化療的最初階段過程中給藥，在防止MDR的發(fā)展中應(yīng)該是有用的。這些發(fā)現(xiàn)形成了幾個(gè)對(duì)癌癥治療有用的策略。例如，可以用本發(fā)明的化合物治療其癌癥對(duì)多種抗癌劑已經(jīng)變得抗藥性的患者，來逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的MDR表型，接著用最初的化療劑或其他藥物(例如，Dox或紫杉醇)來治療。此外，本發(fā)明的化合物可以以低劑量加入最初的輔助化療方案中，來防止MDR的發(fā)展。Dox是靶向新合成的DNA拓樸異構(gòu)酶II復(fù)合物形式的DNA的有44效細(xì)胞毒性藥物(25，26)。當(dāng)單獨(dú)給藥時(shí)，Dox在最初抑制MCF-7生長(zhǎng)中非常有效，然而Dox抗藥性是不可避免的。發(fā)明人已經(jīng)顯示了低濃度的M4N可以用來抑制Dox敏感性MCF-7細(xì)l包和Dox抗藥性NCI/ADR-RES細(xì)胞中的MDR-1基因表達(dá)。MDR-1的基因產(chǎn)物，Pgp蛋白，通常已知其排出細(xì)胞毒性藥物如Dox的能力。在以上詳細(xì)描述的結(jié)果中顯示了在M4N處理后可以消除Pgp(圖6)。在Pgp不存在下，在其細(xì)胞毒活性必需的部位應(yīng)當(dāng)可以利用更多的Dox。除了抑制MDR基因表達(dá)，M4N獨(dú)立地發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞周期G2/M期細(xì)胞生長(zhǎng)的控制。NDGA衍生物和其他抗癌藥物一起協(xié)調(diào)地工作，應(yīng)當(dāng)在制止轉(zhuǎn)移性腫瘤生長(zhǎng)而不引起抗藥性和隨后的宿主毒性中提供明顯的優(yōu)勢(shì)。在此引用的所有專利和出版物在此引入作為參考。參考文獻(xiàn)1.Hwu，J,R.，Tseng^W.N,'Gnabre，J.，Giza，P.andHuang，R.C.Antiviralactivitiesofmethylatednordihydroguaiareticacids.1.Synthesis,structuralidentificationandinhibitionofTat-regulatedHIVtransactivation./Afe^O^加，41,2994-3000，1998.2.Chen，H,S.，Teng，Li，Li，J.N.，Park,R.，Mold,D.，Gnabre,J.，Hwu，J,R.，Tseng,W.N.andHuang，R.C.Antiviralactivitiesofmethylatednordihydroguaiareticacids.2.TargetingherpessimplexvirusreplicationbymutationinsensitivetranscriptioninhibiterTetra-o-methyl-NDGA.丄Merf.C/zem.41，3001-3007，1998.3.Heller，J.D.，Kuo，J,，Wu，T.C,，Kast，M.andHuang,R.C.Tetra-o-methyl-nordihydroguaiareticaddinducesG2arrestinmammaliancellsandexhibitstumoricidalactivityinvivo.C匿er61，5499-5504，2001.4.Chang，CC.,Heller，J,D,，Kuo,J'andHuang，R,C.Tetra-o-methylnoridhydroguaiareticacidinducesgrowtharrestandcellularapoptosisbyinhibitingCdc2andSurvivinexpression.戶戰(zhàn)Ato"a2^d,101，13239-13244>2004.5.Park,R.,Chang，C.C，Liang，Y.C.，Chung，Y.，Henry,R.A.，Lin,E.，Mold，D.andHuang，R.C.Systemictreatmentwithtetra-o-methylnordihydroguaiareticacidsuppressesthegrowthofhumanxenografttumors.CZz".Cawcer11(12)4601-4609，2005,6.Hu肌g，R.C.，Park,R"Chang，C.C.,Liang,Y.C.,Mold,D.,Lin，E.，Heller,J.andFrazer，N.U,s.PatentapplicationfileMay20，2004,Ref.No.1150-0002.407.Juliano，RX.andLing，V.AsurfaceglycoproteinmodulatingdrugpermeabilityinChinesehamsterovarycellmutants.丑/oc力e7w.萬^p力;Ay^4cto455,152-162，1976.8.Gottesman，M.M.andAmbudkar，S.V,ABCtransportersandhumandisease.，。e臘'g.腸",Zr'33,453-458，2001.9.Scotto，K.andEgan,D.A.TranscriptionalregulationofMDRgenes.Cyo/ec/mo/ogy27，257-269，1998.10.Scotto，K.W,TranscriptionalregulationofABCdrugtransporter.Owco，e22，7496-7511,2003.11.Shengkan，J,，Gorfajn，B.,Faircoth，G.andScotto，K,W.Ecteinascidin743，atranscription-targetedchemotherapeuticthatinhibitsMDR1activation.尸roc.Mz//jo^.&z'.97，6775-6779，2000.12.Xu，D.，Ye，D.，F(xiàn)isher,M.andJuli咖，R丄.SelectiveinhibitionofP-glycoproteinexpressioninmultidrug-resistanttumorcellsbyadesignedtranscriptionalregulator,乂尸^m.在五xpen'me"fa/7T^7'印fl/7ew"c5302，963-971,2002.13.Dewick，P.M.andJackson，D.G.Cytotoxiclignansfrompodophyllumandthenomenclatureofaryltetralinlignans.Cj^ocAe/m^^v20，2277，1981.14.Gnabre，J.N.，Brady，J,N.,Clauton，D.J,，Ito，Y,，Dittmer，J.，Bates,R.B.andHuang,R.C.Inhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1transcriptionandreplicationbyDNAsequence-selectiveplantlignans./Voc.A^rfJc^f.&f.92,11239-11243，1995.15.Craigo，J,，Callahan，M.，Huang，R.C.andDelucia，A.Inhibitionofhumanpapillomavirustype16geneexpressionbynordihydroguaiareticacidplantlignanderivatives.^(""Vz.ra/M47，19-28,2000.16.ChouTC，TalalayP(1984)Quantitativeanalysisofdose-effectrelationships:thecombinedeffectsofmultipledrugsorenzymeinhibitors.AdvEnzymeRegul22:27-55.17.ChangTT，ChouTC(2000)Rationalapproachtotheclinicalprotocoldesignfordrugcombinations:areview.ActaPaediatrTaiwan41:294-30218.ChouTC(1991)In:ChouTC，RideoutDC(eds)Synergismandantagonisminchemotherapy.Academic,SanDiego，pp61-10219.ChouTC，MotzerRJ，TongY,BoslGJ(1994)Computerizedquantitationofsynergismandantagonismoftaxol，topotecan，andcisplatinagainsthumanteratocarci加macellgrowth:arationalapproachtoclinicalprotocoldesign.JNatlCancerInst86:1517-2420.ChouTC,MartinN(2005)CompuSynforDrugCombinations.ComboSyn,Inc.Paxamus，NJ21.Wolfson，MLandAThompson(1962)，MethodsinCarbohydrateChem.，VolI,p.334.22.ChaoTC，ChuZ，TsengLM,ChiouTJ，HsiehRK，WangWS,YenCC，YangMH,HsiaoLT，LiuJH，ChenPM(2005)PaclitaxelinanovelformulationcontaininglessCremophorELasfirst-linetherapyforadvancedbreastcancer:aphasentrial.Invest.NewDrugs23:171-177.23.ChangC-C:PhDThesis,JohnsHopkinsUniversity,2005.24.BisseryMQnGuenardD，Gueritte-VoegeleinF，LavelleF(1991)Experimentalantitumoractivityoftaxotere(RP56976，NSC628503)，ataxolanalog.CancerResearch51:4845-4852.25.Tewey，K,M.，Rowe，T.C.,Yang,L.，Halligan，B'D.andLiu，LF.Adriamycin-inducedDNAdamagemediatedbymammalianDNAtopoisomeraseII.itoewce226，466-468，1984.26.Nelson,W.G.，Liu，L.F,andCoffey,D.S.NewlyreplicatedDNAisassociatedwithDNAtopoisomeraseIIinculturedratprostaticadenocarcinomacells,TVa/wre322，187-189，1986.權(quán)利要求1.NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽用于防止細(xì)胞中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pgp的合成和功能中至少一種的用途；該NDGA衍生物具有下式其中R1、R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH3O-、CH3(C＝O)O-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接，條件是i)R1-R4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)R1-R4中的一個(gè)包括糖殘基。2.根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中RrR4中的至少一個(gè)是在氨基和羧基之間存在至少兩個(gè)-CH2-基團(tuán)的氨基酸殘基。3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中RrR4各自是-CO(CH2)3-N-(CH3)2。4.根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中R!-R4中的一個(gè)包括單糖或二糖殘基。5.根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中R^R4中的至少一個(gè)是通過1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接的氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基。6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中Ri是-0-CH2-CHr麥芽糖或OCH2-CH;r半乳糖，并且R廠R4各自是-OCH3。7.根據(jù)權(quán)利要求l-6之一的用途，其中Pgp的合成是由化療劑引起的。8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述化療劑選自多柔比星、長(zhǎng)春堿、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿。9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。10.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的用途，其中所述細(xì)胞是感染性微生物。11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述細(xì)胞是病毒、細(xì)菌、寄生物或真菌。12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中所述NDGA衍生物防止細(xì)胞中多藥抗藥性基因1(MDR1)表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)。13.根據(jù)權(quán)利要求1-11之一的用途，其中所述NDGA衍生物防止細(xì)胞中MDR1的表達(dá)。14.NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽聯(lián)合至少一種第二化療劑治療癌癥的用途，該NDGA4汙生物具有下式R2'其中i)R!-R4中的至少一個(gè)包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CHr基團(tuán)的氨基酸殘基，或包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CHr基團(tuán)的取代氨基酸殘基，并且剩余的R基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CEbO-和CH3(C=0)0-;或ii)R廠R4中的一個(gè)包括糖殘基且剩余的R基團(tuán)選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-;該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接。15.根據(jù)權(quán)利要求U的用途，其中R!-R4中的至少一個(gè)是在氨基和羧基之間存在至少兩個(gè)-CH2-基團(tuán)的氨基酸殘基。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中RrR4各自是-CO-(CH2)3N-(CH3)2。17.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中RrR4中的一個(gè)是單糖或二糖。18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所迷單糖或二糖殘基通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接。19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中RrR4中的一個(gè)是-0-CH2-CHr麥芽糖或-O-CHrCHr半乳糖，并且剩余的R基團(tuán)是-OCH3。20.根據(jù)權(quán)利要求14-19之一的用途，其中所述第二化療劑選自多柔比星、長(zhǎng)春堿、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿。21.根據(jù)權(quán)利要求14-20之一的用途，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。22.根據(jù)權(quán)利要求14-20之一的用途，其中所述細(xì)胞是感染性微生物。23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中所述細(xì)胞是病毒、細(xì)菌、寄生物或真菌。24.根據(jù)權(quán)利要求14-23任一項(xiàng)的用途，其中所述NDGA衍生物與第二化療劑的摩爾比為約20:1。25.根據(jù)權(quán)利要求14-23任一項(xiàng)的用途，其中所述NDGA衍生物與第二化療劑的摩爾比為約2.4:1。26.NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽用于防止或克服癌細(xì)胞中多藥抗藥性的用途；該NDGA衍生物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R!、R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-、CH3(C=0)0-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接，條件是i)R^R4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)RrR4中的一個(gè)包括糖殘基。27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中RrR4中的至少一個(gè)是在氨基和羧基之間存在至少兩個(gè)-CHr基團(tuán)的氨基酸殘基。28.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中RrR4各自是CO(CH2)3-N-(CH3)2。29.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中RrR4中的一個(gè)包括單糖或二糖殘基。30.根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中R,-R4中的至少一個(gè)是-0-CH2-CH2-麥芽糖或-0-CH2-CH2-半乳糖，并且剩余的R基團(tuán)是-OCH3。31.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中所述化療劑選自多柔比星、長(zhǎng)春堿、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿。32.根據(jù)權(quán)利要求26-31之一的用途，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。33.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述癌癥或細(xì)胞分別是人癌癥或人癌細(xì)胞。34.根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中所述癌癥選自乳腺癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。35.根據(jù)權(quán)利要求l-34任一項(xiàng)的用途，其中所述細(xì)胞是非人的動(dòng)物細(xì)月包。36.根據(jù)權(quán)利要求35的用途，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。37.克服微生物中抗藥性的方法，它包括將有效量的NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽給予所述微生物或含有所述微生物的宿主，其中該NDGA衍生物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中RpR2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO-、CH30-、CH3(C=0)0-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接，條件是i)RrR4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)RrRt中的一個(gè)包括糖殘基。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述微生物選自病毒、細(xì)菌、寄生物和真菌。39.治療動(dòng)物中抗藥性感染的方法，它包括與至少一種該感染抵抗的治療劑一起，將有效量的化合物或該化合物的生理學(xué)上可接受的鹽給予所述動(dòng)物，該化合物具有下式其中R！、R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自HO誦、CH30-、CH3(C=0)0-、氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基和糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1-10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接，條件是i)RrR4中的至少一個(gè)包括氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，或ii)RrR4中的一個(gè)包括糖殘基。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述感染是病毒、細(xì)菌、寄生物或真菌感染。41.含有化合物或該化合物的生理學(xué)上可接受的鹽的組合物，該化合物具有下式其中i)R,-R4中的至少一個(gè)是通過氧原子與苯環(huán)連接的p-氨基酸殘基；或ii)R廠R4中的一個(gè)是糖殘基，任選地通過氧原子和l-10個(gè)-CHr基團(tuán)與苯環(huán)連接；并且剩余的R基團(tuán)是-OCHb。42.權(quán)利要求41的組合物，其中RrR4中的一個(gè)是單糖或二糖。43.權(quán)利要求42的組合物，其中所述糖選自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、葡糖胺、半乳糖胺及其衍生物，其上-OH基團(tuán)或氨基基團(tuán)通過連接選自O(shè)-曱基、O-乙?；?、氨基、羧基、低級(jí)烷基、低級(jí)?；?、磷酸和磺酸基團(tuán)的取代基或用該取代基置換進(jìn)行修飾。44.權(quán)利要求41的組合物，其中RrR4中的一個(gè)是由至少兩個(gè)相同或不同種類的糖構(gòu)成的寡糖。45.權(quán)利要求42的組合物，其中所述化合物是麥芽糖-M3N或半乳糖-M3N。46.權(quán)利要求41的組合物，其中！^-R4是P-氨基酸。47.權(quán)利要求41的組合物，它包含5-((2S，3R)-4-(3，4-雙[4-(二甲氨基)丁酰氧基1苯基}-2，3-二甲基丁基)-2-[4-(二甲氨基)丁酰氧基苯基4誦(二甲氨基)丁酸酯或5-((2S，3R)-4-(3，4-雙[4-(二甲氨基)丙酰氧基苯基}-2，3-二甲基丁基)-2-[4-(二甲氨基)丙酰氧基苯基4-(二甲氨基)丙酸酯。48.權(quán)利要求41-47之一的組合物，它另外包含笫二化療劑。49.權(quán)利要求48的組合物，其中所述第二化療劑選自多柔比星、長(zhǎng)春堿、紫杉醇和長(zhǎng)春新堿。50.權(quán)利要求48的組合物，其中所述NDGA衍生物和第二化療劑具有約2:1至約100:1的摩爾比。51.含有NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和笫二化療劑的組合物，該NDGA衍生物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中i)R，-R4中的至少一個(gè)包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CHr基團(tuán)的氨基酸殘基，或包括在氨基和羧基之間存在至少2個(gè)-CH^基團(tuán)的取代氨基酸殘基，并且剩佘的R基團(tuán)獨(dú)立地選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-;或ii)R,-R4中的一個(gè)包括糖殘基且剩余的R基團(tuán)選自HO-、CH30-和CH3(C=0)0-;該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過氧原子和1=10個(gè)碳原子的連接體與苯環(huán)連接。52.權(quán)利要求51的組合物，其中所述NDGA衍生物和第二化療劑具有約2:1至約100:1的摩爾比。53.含有M4N或麥芽糖-M3N和紫杉醇的組合物，M4N或麥芽糖-M3N與紫杉醇的摩爾比為約20:1。54.含有M4N或麥芽糖-M3N和多柔比星的組合物，M4N或麥芽糖-M3N與多柔比星的摩爾比為約2.4:1。55.測(cè)定NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑用于治療癌癥的最佳劑量組合的方法，其中該NDGA衍生物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中RpR"R3和R4各自獨(dú)立地選自HO;CH30;CH3(C=0)0-;氨基酸殘基；取代的氨基酸殘基；糖殘基；該氨基酸殘基、取代的氨基酸殘基或糖殘基任選地通過1-10個(gè)碳原子和氧原子的連接體與苯環(huán)連接；該方法包括(a)將一系列不同劑量的NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑的組合物施用到癌細(xì)胞的培養(yǎng)物中；(b)測(cè)量該細(xì)胞的生長(zhǎng)速率；(c)使用等效應(yīng)圖法或組合指數(shù)法測(cè)定獲得與次最佳濃度的該NDGA衍生物或其生理學(xué)上可接受的鹽和第二化療劑相當(dāng)功效的最佳組合劑量。56.含有權(quán)利要求55最佳劑量組合的組合物。57.權(quán)利要求56的組合物用于治療癌癥的用途。全文摘要使用去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物用于防止細(xì)胞中MDR1基因表達(dá)和PgP蛋白合成或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞中多藥抗藥性的組合物和方法，以及使用NDGA衍生物聯(lián)合另外的化療劑治療抗藥性癌癥和傳染的組合物和方法。文檔編號(hào)A61K31/192GK101437505SQ200580040063公開日2009年5月20日申請(qǐng)日期2005年10月6日優(yōu)先權(quán)日2004年10月6日發(fā)明者D·E·莫爾德,R·C·C·黃,Y·C·李,張智全,胡紀(jì)如,許銘華申請(qǐng)人:約翰斯霍普金斯大學(xué)