專利名稱：新的抗微生物劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景 本發(fā)明涉及新的抗微生物劑和，更特別地涉及新種類的聚合物，其被設(shè)計為發(fā)揮抗微生物活性，同時具有穩(wěn)定、無毒和避免對其發(fā)生抗藥性。本發(fā)明更進(jìn)一步地涉及包含該聚合物的藥物組合物、醫(yī)療裝置和食品防腐劑和涉及利用其治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病的方法。
抗生素，其在本文和本領(lǐng)域中也是指抗菌劑或抗微生物劑，根據(jù)分子式其為相對小容量的天然物質(zhì)，一般由細(xì)菌或真菌釋出。多年來使用這些天然物質(zhì)以及其衍生物和/或其變體作為藥物，用于治療細(xì)菌引起的感染。
早在1928年，Alexander Fleming閣下觀察到金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細(xì)菌集落能被點青霉菌(Penicillium notatum)霉菌所破壞。他的觀察導(dǎo)致Fleming假定抗生物質(zhì)的存在和其作用法則。在微觀水平的化學(xué)戰(zhàn)中已經(jīng)建立了將真菌釋放物質(zhì)作為抑制其他生物體的手段。該法則后來被用于開發(fā)殺滅體內(nèi)引起疾病的某些類細(xì)菌的藥物。在二十世紀(jì)四十年代Howard Florey和Ernst Chain分離出活性成分青霉素并開發(fā)了這種藥物的粉末形式。
將這些進(jìn)步轉(zhuǎn)化為醫(yī)療保健，引人注目地減少了感染性疾病的生病和死亡。然而，經(jīng)過數(shù)十年，幾乎所有引起顯性感染的菌株對抗生素發(fā)生了抗藥性。
抗生素抗藥性可導(dǎo)致嚴(yán)重的不利后果，例如增加患者患普通感染的死亡率、發(fā)病率和醫(yī)療費(fèi)用，而從前用抗生素可容易治療(Am.J.Infect.Control 24(1996)，380-388；Am.J.Infect.Control 27(1999)，520-532；Acar，J.F.(1997)，Clin.Infect.Dis.24，Suppl 1，S17-S18；Cohen，M.L.(1992)，Science 257，1050-1055；Cosgrove，S.E.和Carmeli，Y.(2003)，Clin.Infect.Dis.36，1433-1437；Holmberg，S.D.等(1987)，Rev.Infect.Dis.9，1065-1078)，并因此成為當(dāng)今政府、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究最公認(rèn)的臨床問題之一(美國國會，技術(shù)評定部，Impacts ofAntibiotic-Resistant Bacteria，OTA-H-629，美國華盛頓特區(qū)，政府印刷部(1995)；英國國會上議院，Science and Technology 7th ReportResistance to Antibiotics and Other Antimicrobial Agents，HL Paper 81-II，session(1997-98)；和Interagency Task Force on AntimicrobialResistance，A Public Health Action Plan to Combat AntimicrobialResistance.Part 1Domestic issues)。
由于經(jīng)典抗生素使用相關(guān)的限制，廣泛的研究已集中在發(fā)現(xiàn)新的、有效的和不誘發(fā)抗藥性的抗微生物劑/抗菌劑上。
在這些研究內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了新類型的短天然存在肽，其產(chǎn)生顯著的抗微生物/抗細(xì)菌活性。
稱作抗微生物肽(AMPs)的這些肽，來自動物源，組成大量不同的肽家族，可用作有效的抗微生物劑對抗耐抗生素的微生物(參見新近的綜述，例如，Levy，O.(2000)Blood 96，2564-2572；Mor，A.(2000)DrugDevelopment Research 50，440-447；Zasloff，M.(2002)New EnglandJournal of Medicine 347，1199-1200；Zasloff，M.(2002)Nature 415，389-395；Zasloff，M.(2002)Lancet 360，1116-1117)。在過去20年中，已經(jīng)從單細(xì)胞生物至哺乳動物包括人類的多種來源中鑒定出700多種AMPs(參見新近的綜述，例如，Andreu，D.和Rivas，L.(1998)Bioploymers 47，415-433；Boman，H.G.(2003)J.Intern.Med.25 4，197-215；Devine，D.A.和Hancock，R.E.(2002)Curr.Pharm.Des.8，703-714；Hancock，R.E.和Lehrer，R.(1998)Trends Biotechnol.16，82-88；Hancock，R.E.(2001)Lancet Infect.Dis.1，156-164；Hancock，R.E.和Rozek，A.(2002)FEMS Microbiol.Lett.206，143-149；Hoffmann，J.A.和Reichhart，J.M.(2002)Nat.Immunol.3，121-126；Lehrer，R.I.和Ganz，T.(1999)Curr.Opin.Immunol.11，23-27；Nicolas，P.和Mor，A.(1995)Annu.Rev.Microbiol.49，277-304；Nizet，V.和Gallo，R.L.(2002)Trends Microbiol.10，358-359；Shai，Y.(2002)Curr.Pharm.Des.8，715-725；Simmaco，M.等.(1998)Bioploymers 47，435-450；Tossi，A.等.(2000)Bioploymers 55，4-30；Tossi，A.和Sandri，L.(2002)Curr.Pharm.Des.8，743-761；Vizioli，J.和Salzet，M.(2002)Trends Pharmacol.Sci.23，494-496；Brogden，K.等.(2003)Int.J.Antimicrob.Agents 22，465-478和Papagianni，M.(2003)Biotechnol.Adv.21，465-499)。
現(xiàn)在公認(rèn)AMPs在宿主先天的防御中發(fā)揮重要作用。它們在一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)中顯示出大量的異質(zhì)性，但共有公共的特性例如兩親性特性和凈正電荷。這些特征的出現(xiàn)形成它們?nèi)芗?xì)胞功能的基礎(chǔ)。足夠的資料表明AMPs通過動搖細(xì)胞膜的有序結(jié)構(gòu)引起細(xì)胞死亡，盡管還不完全了解其詳細(xì)的機(jī)理(參見新近的綜述，例如，Epand，R.M.等.(1995)，Biopolymers 37，319-338；Epand，R.M.和Vogel，H.J.(1999)，Biochim.Biophys.Acta 1462，11-28；Gallo，R.L.和Huttner，K.M.(1998)，J.Invest Dermatol 111，739-743；Gennaro，R.等.(2002)，Curr.Pharm.Des.8，763-778；Hansen，J.N.(1994)，Crit Rev.Food Sci Nutr.34，69-93；Huang，H.W.(1999)，Novartis.Found.Symp.225，188-200；Hwang，P.M.和Vogel，H.J.(1998)，Biochem.Cell Biol.76，235-246；Lehrer，R.I.等.(1993)，Annu.Rev.Immunol.11，105-128；Matsuzaki，K.(1999)，Biochim.Biophys.Aeta 1462，1-10；Muller，F(xiàn).M.等.(1999)，Mycoses 42 Suppl 2，77-82；Nissen-Meyer，J.和Nes，I.F.(1997)，Arch.Microbiol.167，67-77；Peschel，A.(2002)，Trends Microbiol.10，179-186；Sahl，H.G.和Bierbaum，G.(1998)，Annu.Rev.Microbiol.52，41-79；Shai，Y.(1995)，Trends Biochem.Sci.20，460-464；和Yeaman，M.R.和Yount，N.Y.(2003)，Pharmacol Rev.55，27-55)。據(jù)假定，膜結(jié)構(gòu)紊亂導(dǎo)致小溶質(zhì)(例如K+、氨基酸和ATP)滲漏，迅速地耗盡質(zhì)子動力勢，使細(xì)胞缺乏能量并引起某些生物合成過程的休止(Sahl，H.G.和Bierbaum，G.(1998)，Annu.Rev.Microbiol.52，41-79)。這種機(jī)理符合抗微生物活性不受手性中心相互作用介導(dǎo)的假說和，可因此通過防止發(fā)生多種已知誘導(dǎo)抗藥性的機(jī)制顯著地預(yù)防抗生素抗性。
除它們直接被充分證明的溶細(xì)胞(膜破裂)活性之外，AMPs在多種抗微生物領(lǐng)域也顯示出多種有趣的生物活性。一些AMPs顯示出激活天然免疫性細(xì)胞包括白細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的殺微生物活性(Ammar，B.等.(1998)，Biochem.Biophys.Res.Commun.247，870-875；Salzet，M.(2002)Trends Immunol.23，283-284；Scott，M.G.等.(2000)，J.Immunol.165，3358-3365；和Scott，M.G.等.(2002)，J.Immunol.169，3883-3891)。多數(shù)陽離子肽賦予與脂多糖結(jié)合的活性，因此抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和防御導(dǎo)致內(nèi)毒素性休克的級聯(lián)事件(Chappie，D.S.等.(1998)，Infect.Immun.66，2434-2440；Elsbach，P.和Weiss，J.(1998)，Curr.Opin.Immunol.10，45-49；Lee，W.J.等.(1998)，Infect.Immun.66，1421-1426；Giacometti，A.等.(2003)，J Chemother.15，129-133；Gough，M.等.(1996)，Infect.Immun.64，4922-4927；和Hancock，R.E.和Chapple，D.S.(1999)，Antimicrob.Agents Chemother.43，1317-1323)。將抗微生物基因引入植物染色體，通過表達(dá)肽使植物能抵抗病原體(Alan，A.R.等.(2004)，Plant Cell Rep.22，388-396；DeGray，G.等.(2001)，Plant Physiol 127，852-862；Fritig，B.，Heitz，T.和Legrand，M.(1998)，Curr.Opin.Immunol.10，16-22；Osusky，M.等.(2000)，Nat.Biotechnol.18，1162-1166；Osusky，M.等.(2004)，Transgenic Res.13，181-190；和Powell，W.A.等.(2000)，Lett.Appl.Microbiol.31，163-168)。
在最近20年內(nèi)鑒定和研究的核糖體合成的抗微生物肽的基礎(chǔ)上，開發(fā)了數(shù)千個重新設(shè)計的AMPs(Tossi，A.等.(2000)，Bioploymers 55，4-30)。這些重新設(shè)計的肽包含人工設(shè)計的序列，通過遺傳工程或化學(xué)上的肽合成生產(chǎn)。發(fā)現(xiàn)不同的抗微生物肽(具有可變長度和序列)均以相似的濃度產(chǎn)生活性，這暗示其抗菌活性是一般機(jī)理而不是要求優(yōu)選活性結(jié)構(gòu)的特定機(jī)理(Shai，Y.(2002)，Bioploymers 66，236-248)。天然存在的肽和具有人工設(shè)計序列的新形成肽(或者通過人合成或者通過遺傳工程在生物體表達(dá))顯示多種水平的抗菌和抗真菌活性以及溶解哺乳動物細(xì)胞的活性。作為結(jié)果，AMPs為引人注目地對準(zhǔn)仿生學(xué)和擬肽(peptidomimetic)開發(fā)的靶子，因為在非自然特異序列的低聚物中將生物物理學(xué)特性的關(guān)鍵肽再生，在設(shè)法避開肽藥物相關(guān)的限制時，推測上應(yīng)該充分賦予其抗菌功效(Latham，P.W.(1999)，Nat.Biotechnol.17，755-757)。
設(shè)計新抗微生物肽的挑戰(zhàn)之一取決于開發(fā)擬肽，其對細(xì)菌或真菌細(xì)胞將具有高度特異性，因而，將允許更好地理解肽溶解特異性(即細(xì)胞膜之間的差別)的機(jī)理。對AMPs的構(gòu)效關(guān)系(SAR)研究一般涉及天然存在分子的系統(tǒng)修飾或重新設(shè)計的模型擬肽，可預(yù)期形成兩親性α-螺旋或β-折疊，并由多種方法測定結(jié)構(gòu)和活性(Tossi，A.等.(2000)，Bioploymers 55，4-30)，如下 設(shè)計新肽最低限度(Minimalist)的方法是基于兩親性、α-螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)的要求。使用的殘基類型通常限于堿性、正電荷的氨基酸賴氨酸或精氨酸，和一種至三種疏水殘基的丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸或色氨酸(Blazyk，J.等.(2001)，J.Biol.Chem.276，27899-27906；Epand，R.F.等.(2003)，Bioploymers 71，2-16；Hong，J.等.(1999)，Biochemistry 38，16963-16973；Jing，W.等.(2003)，J.Pept.Res.61，219-229；Ono，S.等.(1990)，Biochim.Biophys.Acta 1022，237-244；和Stark，M.等.(2002)，Antimicrob.AgentsChemother.46，3585-3590)。當(dāng)這些方法可通向設(shè)計有效的抗微生物劑時，沒有考慮可由進(jìn)化選擇AMPs序列的微妙，缺失它們可導(dǎo)致喪失特異性。
設(shè)計和合成兩親性AMPs序列模板方法一般包括在對照大量系列的天然相似物后提取序列模式。與常規(guī)的序列修飾方法相比，這種方法的優(yōu)點是減少了為了獲得有用的結(jié)果所需要合成肽的總數(shù)，而維持至少一些基于信息的序列。如同上文所述，在最低限度的方法中會遺失序列(Tiozzo，E.等.(1998)，Biochem.Biophys.Res.Commun.249，202-206)。
序列修飾的方法包括所有已知的和可接受的修飾天然肽的方法，例如通過除去、增加、或替換一個或多個殘基、在N-或C-末端切去肽、或從不同的天然肽片段組合嵌合體的肽。這些修飾已被廣泛地用于尤其在樹蛙抗菌肽(dermaseptins)、蛾血素、爪蟾抗菌肽和蜂毒素的研究中(Scott，M.G.等.(2000)，J.Immunol.165，3358-3365；Balaban，N.等.(2004)，Antimicrob.Agents Chemother.48，2544-2550；Coote，P.J.等.(1998)，Antimicrob.Agents Chemother.42，2160-2170；Feder，R.等.(2000)，J.Biol.Chem.275，4230-4238；Gaidukov，L.等.(2003)，Biochemistry 42，12866-12874；Kustanovich，I.等.(2002)，J.Biol.Chem.277，16941-16951；Mor，A.和Nicolas，P.(1994)J.Biol.Chem.269，1934-1939；Mor，A.等.(1994)，J.Biol.Chem.269，31635-31641；Oh，D.等.(2000)，Biochemistry 39，11855-11864；Patrzykat，A.等.(2002)，Antimicrob.Agents Chemother.46，605-614；Piers，K.L.和Hancock，R.E.(1994)Mol.Microbiol.12，951-958；和Shepherd，C.M.等.(2003)，Biochemistry 370，233-243)。
上面所述的方法已經(jīng)用于許多針對新AMPs的設(shè)計研究中。在這些研究中，使用α螺旋和/或β折疊誘導(dǎo)構(gòu)造決(building blocks)、使用更柔韌的β氨基酸構(gòu)造塊、使用混合的D-和L-氨基酸序列和使用表面兩性分子的芳香胺聚合物，均證明了誘導(dǎo)兩親性構(gòu)象對AMPs生物活性的重要性。
抗微生物肽能與經(jīng)典的抗生素產(chǎn)生協(xié)同作用，或許是通過使抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞(Darveau，R.P.等.(1991)，Antimicrob.AgentsChemother.35，1153-1159；和Giacometti，A.等.(2000)，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.38，115-118)。其它潛在的用途包括食物防腐(Brul，S.和Coote，P.(1999)，Int.J.Food Microbiol.50，1-17；Yaron，S.，Rydlo，T.等.(2003)，Peptides 24，1815-1821；Appending P.和Hotchkiss，J.H.(2000)，J.Food Prot.63，889-893；和Johnsen，L.等.(2000)，Appl.Environ.Microbiol.66，4798-4802)、用于探測細(xì)菌或真菌感染位置的成像探針(Welling，M.M.等.(2000)，Eur.J.Nucl.Med.27，292-301；Knight，L.C.(2003)，Q.J.Nucl.Med.47，279-291；和Lupetti，A.等.(2003)，Lancet Infect.Dis.3，223-229)、抗腫瘤活性(Baker，M.A.等.(1993)，Cancer Res.53，3052-3057；Jacob，L.和Zasloff，M.(1994)，Ciba Found.Symp.186，197-216；Johnstone，S.A.等.(2000)，Anticancer Drug Des 15，151-160；Moore，A.J.等.(1994)，Pept.Res.7，265-269；和Papo，N.和Shai，Y.(2003)，Biochemistry 42，9346-9354)、促有絲分裂活性(Aarbiou，J.等.(2002)，J.Leukoc.Biol.72，167-174；Murphy，C.J.等.(1993)，J.Cell Physiol 155，408-413；和Gudmundsson，G.H.和Agerberth，B.(1999)，J.Immunol.Methods232，45-54)和醫(yī)學(xué)/外科裝置的襯料(Haynie，S.L.等.(1995)，Antimicrob.Agents Chemother.39，301-307)。
然而，當(dāng)潛在的AMPs作為新的治療劑被眾所公認(rèn)時，目前已知的AMPs的使用受到缺乏足夠的特異性和任意的系統(tǒng)毒性的限制(英國國會上議院，Science and Technology 7th ReportResistance toAntibiotics and Other Antimicrobial Agents，HL Paper 81-II，session(1997-98)；和Alan，A.R.等.(2004)，Plant Cell Rep.22，388-396)。因此，明確地存在開發(fā)新的具有改良的特異性和毒性性質(zhì)的抗微生物肽的需要。此外，雖然肽被公認(rèn)是有希望的治療和抗微生物劑，它們的使用受到它們在體內(nèi)和體外不穩(wěn)定性和不好的藥代動力學(xué)性質(zhì)的嚴(yán)格限制。肽和多肽在氧化的和酸性的環(huán)境中容易被降解，因此，一般要求靜脈注射給藥(為了避免例如胃腸道中降解)。肽在血液系統(tǒng)中被蛋白水解酶進(jìn)一步降解并迅速地被循環(huán)清除。而且，特別地由于肽相對的高分子量和/或缺乏特異轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，肽口服后通常具有吸收差的特征。此外，肽具有高度可溶性的特征并因此不能越過生物學(xué)屏障例如細(xì)胞膜和血腦屏障，但卻顯示出經(jīng)肝和腎的快速排泄。肽的療效進(jìn)一步地受到其高度柔性的限制，這是由于結(jié)合引起熵大量減少和相當(dāng)?shù)臒崃W(xué)能量消耗抵消它們的受體親和力。此外，肽為熱和濕度敏感的物質(zhì)，因此它們的維持要求昂貴的管理、給藥復(fù)合物和不便的模式、和高成本的生產(chǎn)和維護(hù)。上述缺點妨礙肽和多肽作為有效藥物的使用，并激勵尋找時常涉及擬肽化合物的替代物。
擬肽化合物為改良的多肽，當(dāng)與母體肽相比時，其被設(shè)計為在體內(nèi)和體外均具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，和仍有至少同樣的受體親和力。為了設(shè)計有效的擬肽，因此要求最大詳細(xì)限度三維地了解與預(yù)期靶點的相互作用。
試圖實現(xiàn)上述目標(biāo)的一個方法為利用合成組合文庫(SCLs)，其是一種已知快速獲得最佳類型活性化合物的強(qiáng)大工具。因此，許多從短肽至小雜環(huán)分子的新抗微生物化合物已經(jīng)由SCLs鑒定出(Blondelle，S.E.和Lohner，K.(2000)，Biopolymers 55，74-87)。
在許多生物體中發(fā)現(xiàn)了一些天然存在的改良肽家族，其顯示出抗微生物強(qiáng)大的活性。已經(jīng)提議這些化合物和其有效的化學(xué)變體，作為領(lǐng)向普遍地解決創(chuàng)立沒有天然AMPs相關(guān)缺點的抗微生物化合物的挑戰(zhàn)。
因此，例如，在多種微生物中發(fā)現(xiàn)了在N端具有親脂?；溙卣鞯奶烊淮嬖诘亩炭刮⑸镫?Bassarello，C.等.(2004)，J.Nat.Prod.61，811-816；Peggion，C，等(2003)，J.Pept.Sci.9，679-689；和Toniolo，C.等.(2001)，Cell Mol.Life Sci.58，1179-1188)。因此，大量應(yīng)用AMPs?；夹g(shù)以賦予AMPs具有改良的抗微生物特性(Avrahami，D.等.(2001)，Biochemistry 40，12591-12603；Avrahami，D.和Shai，Y.(2002)，Biochemistry 41，2254-2263；Chicharro，C.等.(2001)，Antimicrob.Agents Chemother.45，2441-2449；Chu-Kung，A.F.等.(2004)，Bioconjug.Chem.15，530-535；Efron，L.等.(2002)，J.Biol.Chem.277，24067-24072；Lockwood，N.A.等.(2004)，Biochem.J.378，93-103；Mak，P.等.(2003)，Int.J.Antimicrob.Agents 21，13-19；和Wakabayashi，H.等.(1999)，Antimicrob.Agents Chemother.43，1267-1269)。然而，一些研究指出將烴鏈連至肽上僅導(dǎo)致末端增加該脂肽對膜的親和力(Epand，R.M.(1997)，Biopolymers 43，15-24)。
一個能暗指主要目標(biāo)的AMPs家族為dermaseptins家族。Dermaseptins是從葉水蛙(Phyllomedusa)種類的多種樹蛙皮膚中分離出的肽(Brand，G.D.等.(2002)，J.Biol.Chem.277，49332-49340；Charpentier，S.等.(1998)，J.Biol.Chem.273，14690-14697；Mor，A.等.(1991)，Biochemistry 30，8824-8830；Mor，A.等.(1994)，Biochemistry 33，6642-6650；Mor，A.和Nicolas，P.(1994)，Eur.J.Biochem.219，145-154；和 Wechselberger，C.(1998)，Biochim.Biophys.Aeta 1388，279-283)。這些在結(jié)構(gòu)上和機(jī)能上地相關(guān)的陽離子肽，一般具有24-34氨基酸殘基。據(jù)發(fā)現(xiàn)，Dermaseptins在體外從數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)產(chǎn)生快速溶細(xì)胞的活性，對抗多種微生物包括病毒、細(xì)菌、原生動物、酵母和絲狀真菌(Coote，P.J.等.(1998)，Antimicrob.Agents Chemother.42，2160-2170；Mor，A.和Nicolas，P.(1994)，J.Biol.Chem.269，1934-1939；Mor，A.等.(1994J，J.Biol.Chem.269，31635-31641；Mor，A.和Nicolas，P.(1994)，Eur.J.Biochem.219，145-154；Belaid，A.等.(2002)，J.Med.Virol.66，229-234；De Lucca，A.J.等.(1998)，Med.Mycol.36，291-298；Hernandez，C.等.(1992)，Eur.J.Cell Biol.59，414-424；和Mor，A.等.(1991)，J.Mycol.Med 1，5-10)以及相對難接近的病原體例如細(xì)胞內(nèi)寄生物(Efron，L.等.(2002)，J.Biol.Chem.277，24067-24072；Dagan，A.等.(2002)，Antimicrob.Agents Chemother.46，1059-1066；Ghosh，J.K.等.(1997)，J.Biol.Chem.272，31609-31616；和Krugliak，M.等.(2000)，Antimicrob.Agents Chemother.44，2442-2451)。
因為以結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)的觀點，蛙皮抗菌肽顯示的生物多樣性存在于非常大組的抗微生物肽中，它們用作一般的模型系統(tǒng)，用于了解陽離子抗微生物肽的功能。
已知28-殘基肽dermaseptin S4熱切地結(jié)合生物膜，發(fā)揮快速溶細(xì)胞活性，對抗多種病原體以及對抗紅細(xì)胞(Mor，A.等.(1994)，J.Biol.Chem.269(50)31635-41)。
在尋找S4的活性衍生物(擬肽)中，制備了其中第四和第二十位置的氨基酸殘基被賴氨酸殘基取代的28個-殘基衍生物(稱作K4K20-S4)、和其中第四位置的氨基酸殘基被賴氨酸殘基取代的16和13個-殘基的兩種短衍生物(分別稱作K4-S4(1-16)和K4-S4(1-13))，并測試了它們的抑制效果(Feder，R.等(2000)，J.Biol.Chem.275，4230-4238)。對于66個臨床分離試驗中90％的這些衍生物的最小抑菌濃度(MICs)(即金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和大腸桿菌的MIC90)，隨著種類不同在2至8μg/ml之間變化，憑此發(fā)現(xiàn)了13部分的衍生物K4-S4(1-13)與相似活性衍生物的兩種被證實為抗微生物肽家族的爪蟾抗菌肽和內(nèi)源性抗微生物多肽(protegrin)相比，在與人紅細(xì)胞一起孵化時具有顯著更少的溶血作用(Fahrner，R.L.等.(1996)，Chem.Biol.3(7)543-50；Zasloff，M.等.(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(3)910-3；Yang L.等.(2000)，Biophys.J.，79 2002-2009)。另外的研究進(jìn)一步證實短的賴氨酸富集的S4衍生物為有希望的抗微生物劑，具有減少毒性的特征并在其預(yù)先接觸受試者后也顯示有效。
將切去C末端的13部分的衍S4生物K4-S4(1-13)的N末端酰化也導(dǎo)致減少的溶血活性，憑此有幾個衍生物，例如它的氨基庚酰衍生物，對細(xì)胞內(nèi)寄生物顯示出有效的和選擇性的活性，即增加抗寄生物的效力和減少溶血性。這些研究表明增加抗微生物肽的疏水性能提高其特異性，假定是通過允許這樣的AMPs特別地作用于細(xì)胞內(nèi)寄生物的膜并因此支持根據(jù)脂肽越過宿主細(xì)胞膜和選擇性地破壞寄生物膜所提出的機(jī)理。
全部地，從體外和體內(nèi)試驗收集的資料表明一些蛙皮抗菌肽衍生物能用于治療多種微生物相關(guān)的疾病包括多重耐藥的病原體所引起的感染。據(jù)發(fā)現(xiàn)這些藥劑高度有效，并在其給藥中不發(fā)展抗藥性。然而，這些藥劑的治療用途仍然受到如上文中所討論的其體內(nèi)和體外不穩(wěn)定性、不好的藥代動力學(xué)性質(zhì)、和肽的其它不利特性的限制。
總之，大多數(shù)目前已知的抗微生物肽和擬肽作為治療藥劑受到實用性限制，盡管其具有有希望的抗微生物活性。依然存在對具有AMP特性但沒有AMPs相關(guān)局限性的化合物的需要，為了實現(xiàn)增強(qiáng)特異性并因此增強(qiáng)臨床選擇性而提供化學(xué)和代謝穩(wěn)定的活性化合物的概念已得到廣泛的公認(rèn)。
因此廣泛公認(rèn)地需要(將具有非常有益的優(yōu)點)新的、代謝穩(wěn)定的、無毒的和低本高效的、沒有上述局限性的抗微生物劑。
發(fā)明概述 本發(fā)明現(xiàn)已設(shè)計并成功地制備了新種類的聚合化合物，其以正電荷氨基酸殘基和疏水部分為基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)了這些新的聚合物作為選擇性的抗微生物劑高度有效，而沒有毒性和誘導(dǎo)的抗藥性。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面提供聚合物，其包括兩個或更多個氨基酸殘基和一個或多個疏水部分殘基，其中一個或多個疏水部分殘基與至少兩個氨基酸殘基經(jīng)由一個氨基酸殘基的N-α和另一個氨基酸殘基的C-α以共價鍵連接。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案中的進(jìn)一步特征，該聚合物具有抗微生物活性。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物能夠有選擇地破壞至少一部分致病微生物。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該病原微生物選自原核生物、真細(xì)菌(eubacterium)、古細(xì)菌(archaebacterium)、真核生物、醇母、真菌、藻類、原生生物(protozon)和寄生蟲。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物包括至少兩個疏水部分殘基，其中一個或多個疏水部分殘基在一個氨基酸殘基的N端與氨基酸殘基的N-α和/或在C端與另一個氨基酸殘基的C-α連接。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物包括兩個或更多個疏水部分殘基，其中一個或多個疏水部分殘基與該聚合物氨基酸殘基的側(cè)鏈相連接。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，一個或多個氨基酸殘基為正電荷氨基酸殘基。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，正電荷氨基酸殘基選自組氨酸殘基、賴氨酸殘基、鳥氨酸殘基和精氨酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明還進(jìn)一步的特征，一個或多個疏水部分殘基與一個或多個氨基酸殘基經(jīng)由肽鍵連接。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，一個或多個疏水部分殘基與兩個氨基酸殘基經(jīng)由肽鍵連接。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，一個或多個疏水部分殘基與各自的氨基酸殘基經(jīng)由肽鍵連接。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，一個或多個疏水部分殘基與氨基酸殘基的N-α經(jīng)由肽鍵連接。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，一個或多個疏水部分殘基與氨基酸殘基的C-α經(jīng)由肽鍵連接。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，一個或多個疏水部分在其一個末端具有羧基基團(tuán)和在其另一個末端具有胺基團(tuán)(aminegroup)。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物包括2至50個氨基酸殘基，優(yōu)選地2至12個氨基酸殘基和更優(yōu)選地2至8個氨基酸殘基。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物包括1至50個疏水部分殘基，優(yōu)選地1至12個疏水部分殘基和更優(yōu)選1至8個疏水部分殘基。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該疏水部分殘基包括一個或多個具有4至30個碳原子的烴鏈。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該疏水部分殘基包括一個或多個脂肪酸殘基，其選自未分支的飽和脂肪酸殘基、分支的飽和脂肪酸殘基、未分支的不飽和脂肪酸殘基、分支的不飽和脂肪酸殘基和它們的任何組合，脂肪酸殘基具有4至30個碳原子。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該脂肪酸殘基選自丁酸殘基、辛酸殘基和月桂酸殘基。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，一個或多個疏水部分是ω氨基脂肪酸殘基。該ω氨基脂肪酸殘基選自4-氨基丁酸、6-氨基已酸、8-氨基辛酸、10-氨基癸酸、12-氨基月桂酸、14-氨基肉豆蔻酸、16-氨基棕櫚酸、18-氨基硬脂酸、18-氨基油酸、16-氨基棕櫚油酸、18-氨基亞油酸、18-氨基亞麻酸和20-氨基花生四烯酸。優(yōu)選地，ω氨基脂肪酸殘基選自4-氨基丁酸、8-氨基辛酸和12-氨基月桂酸。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物所有的氨基酸殘基為正電荷氨基酸殘基，例如賴氨酸殘基、組氨酸殘基、鳥氨酸殘基、精氨酸殘基和它們的任何組合。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物進(jìn)一步包括一種或多種與其連接的活性劑。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該活性劑或者在N端經(jīng)由氨基酸殘基的N-α和/或在C端經(jīng)由氨基酸殘基的C-α與氨基酸殘基的側(cè)鏈相連，和/或與一個或多個該聚合物疏水部分的殘基相連。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該活性劑為標(biāo)記試劑，其選自熒光試劑、放射性試劑、磁性試劑、發(fā)色團(tuán)、磷光性試劑和重金屬簇。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該活性劑包括至少一種治療活性劑，其選自激動劑殘基(agonist residue)、氨基酸殘基、止痛劑殘基、拮抗劑殘基、抗生素殘基、抗體殘基、抗抑郁劑、抗原殘基、抗組胺殘基、抗高血壓劑、抗炎藥物殘基、抗代謝劑殘基、抗微生物劑殘基、抗氧化劑殘基、抗增殖藥物殘基、反義(antisense)殘基、化療藥物殘基、輔助因子殘基、細(xì)胞因子殘基、藥物殘基、酶殘基、生長因子殘基、肝素殘基、激素殘基、免疫球蛋白殘基、抑制劑殘基、配體殘基、核苷酸殘基、寡聚核苷酸殘基、肽殘基、磷脂殘基、前列腺素殘基、蛋白質(zhì)殘基、毒素殘基、維生素殘基和它們的任何組合。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物能夠?qū)⒁环N或多種活性劑(例如標(biāo)記試劑或治療活性劑)遞送給至少一部分如本文所述的致病微生物細(xì)胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，本文所述的聚合物能夠由通式I表示 X-W0-[A1-Z1-D1]-W1-[A2-Z2-D2]-W2-...[An-Zn-Dn]-Wn-Y 式I 其中 n為2至50、優(yōu)選為2至12和更優(yōu)選為2至8的整數(shù)； A1，A2，...，An各自獨(dú)立地為氨基酸殘基，優(yōu)選為正電荷氨基酸殘基，和更優(yōu)選所有的A1，A2，...，An為如上文所述的正電荷氨基酸殘基，例如組氨酸殘基、賴氨酸殘基、鳥氨酸殘基和精氨酸殘基； D1，D2，...，Dn各自獨(dú)立地為疏水部分殘基(如本文所述)或缺失，提供至少一個這樣的疏水部分殘基存在于該聚合物中，和優(yōu)選至少一個該疏水部分殘基為ω氨基脂肪酸殘基； Z1，Z2，...，Zn和W0，W1，W2，...，Wn各自獨(dú)立地為連接氨基酸殘基與疏水部分殘基的連接部分或缺失，優(yōu)選至少一個連接部分為肽鍵和最優(yōu)選所有的連接部分為肽鍵； X和Y可以各自獨(dú)立地為氫、氨基酸殘基、疏水部分殘基或具有通式I結(jié)構(gòu)的其它聚合物。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物進(jìn)一步包括如本文所述的一種或多種活性劑，其與一個或多個X、Y、W0、A1、An和/或者Wn連接。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面提供結(jié)合物，其包括氨基酸殘基和與氨基酸殘基的N-α或C-α連接的疏水部分殘基，所設(shè)計的疏水部分殘基能夠與另外氨基酸殘基的N-α或C-α形成鍵。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案中的進(jìn)一步特征，該疏水部分殘基經(jīng)肽鍵與氨基酸殘基的N-α或C-α連接。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該疏水部分在其一個末端具有羧基基團(tuán)和在其另一個末端具有胺基團(tuán)和還包括如本文所述的烴鏈。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該疏水部分包括如本文所述的脂肪酸殘基。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該疏水部分為如本文所述的ω-氨基脂肪酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面提供制備上文所述的結(jié)合物的方法，該方法包含提供氨基酸；提供疏水部分，其具有能夠與氨基酸殘基的N-α起反應(yīng)的第一功能團(tuán)和/或能夠與氨基酸殘基的C-α起反應(yīng)的第二功能團(tuán)；將該疏水部分的第一功能團(tuán)經(jīng)由所述氨基酸殘基的N-α與該氨基酸連接；或?qū)⒃撌杷糠值牡诙δ軋F(tuán)經(jīng)由氨基酸殘基的C-α與該氨基酸連接。優(yōu)選地該疏水部分經(jīng)由肽鍵與該氨基酸連接。
根據(jù)如下所述的發(fā)明優(yōu)選實施方案中的進(jìn)一步的特征，氨基酸為正電荷氨基的例如組氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該疏水部分在其一個末端具有羧基基團(tuán)，在其另一個末端具有胺基團(tuán)和烴鏈，如同本文所述。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該疏水部分包括如本文所述的脂肪酸殘基。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該疏水部分為如本文所述的ω-氨基脂肪酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的還一個方面提供藥物組合物，其包括作為活性成分的本文所述的本發(fā)明聚合物和藥學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案中的進(jìn)一步特征，藥物組合物包裝在包裝材料中并經(jīng)印刷標(biāo)識(在所述包裝材料中或上)，用于治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病，致病微生物例如原核生物、真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物、醇母、真菌、藻類、原生生物和寄生蟲。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，藥物組合物進(jìn)一步包括一種或多種另外的如本文所述的治療活性劑，由此優(yōu)選地，治療活性劑包括抗生素。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供治療如本文所述致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病的方法，該方法包括給需要它的受治療者施用治療有效量的本文所述的聚合物。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案中的進(jìn)一步特征，施用是經(jīng)口服、直腸、靜脈內(nèi)、局部、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮膚、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)(intrperitoneally)或鞘內(nèi)導(dǎo)管(intrathecal catheter)實現(xiàn)。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該方法進(jìn)一步包括給該受治療者使用一種或多種如本文所述的治療活性劑，優(yōu)選抗生素。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，本發(fā)明聚合物以本身或作為藥物組合物的一部分施用；藥物組合物進(jìn)一步包括如本文所述的藥學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供本文所述的聚合物在治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病的用途。該聚合物可任選地與另外的治療活性劑組合使用。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供本文所述的聚合物用于制備治療致病微生物相關(guān)醫(yī)學(xué)疾病的藥物的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個方面，提供醫(yī)學(xué)裝置，其包括本發(fā)明的聚合物和配置用于遞送聚合物至受治療者身體部位的遞送系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，該聚合物組成藥物組合物的一部分，和藥物組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，遞送是經(jīng)吸入實現(xiàn)的，和遞送系統(tǒng)選自定量吸入器、呼吸器、噴霧吸入器、干粉吸入裝置、電加熱器、蒸發(fā)器、噴霧器和煙霧發(fā)生器。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，遞送是經(jīng)皮膚實現(xiàn)的，和遞送系統(tǒng)選自橡皮膏和皮膚貼劑。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，遞送是經(jīng)局部實現(xiàn)的，和遞送系統(tǒng)選自橡皮膏條、繃帶、橡皮膏、傷口敷料和皮膚貼劑。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中再進(jìn)一步的特征，遞送是經(jīng)身體器官內(nèi)植入醫(yī)學(xué)裝置實現(xiàn)的。優(yōu)選地，遞送系統(tǒng)進(jìn)一步包括生物相容的基質(zhì)，其又包括生物可降解的聚合物和進(jìn)一步包括緩釋載體。
根據(jù)本發(fā)明的又另外一個方面，提供食品防腐劑，其包括有效量的本發(fā)明聚合物，和優(yōu)選地進(jìn)一步包括可食用的載體。
根據(jù)本發(fā)明的還一個方面，提供用于探測如本文所述致病微生物的成像探針(imaging probe)，其包括如本文所述的聚合物，和與其連接的一種或多種如本文所述的標(biāo)記試劑。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案中進(jìn)一步的特征，該標(biāo)記試劑與氨基酸殘基側(cè)鏈、該聚合物的C端和/或N端和/或本發(fā)明聚合物的一個疏水殘基連接。
本發(fā)明通過新種類的抗微生物聚合物成功地解決了目前已知結(jié)構(gòu)的缺陷，其組合了治療活性抗微生物肽的優(yōu)點，例如高效和特異性，而不具有肽的缺點。
除非另外規(guī)定，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常了解的同樣意義。雖然與本文所述的相似或相同方法和材料能用于實踐或試驗本發(fā)明，以下描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。萬一沖突，將參照專利說明書包括定義。另外，材料、方法、和實例只用作說明，而不打算受其限制。
附圖簡述 此處僅以實施例的方式，參照附圖來描述本發(fā)明。對于具體參照詳細(xì)附圖，應(yīng)強(qiáng)調(diào)所顯示的細(xì)節(jié)是以實施例的方式和僅用于說明性討論本發(fā)明優(yōu)選實施方案的目的，并假定相信這是描述本發(fā)明原理和概念方面最有益和容易了解的原因來展示細(xì)節(jié)。在這點上，不打算安排比必需基本了解本發(fā)明更詳細(xì)的方式，來顯示本發(fā)明結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)，采用附圖描述使本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見本發(fā)明的數(shù)個形式可以具體實施。
本附圖中

圖1展示累積的條線圖，通過在反相HPLC柱上聚合物被洗脫時流動相乙腈百分?jǐn)?shù)的標(biāo)度上，標(biāo)記對抗大腸桿菌(紅色條)、綠膿假單胞菌(黃色條)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(藍(lán)色條)和蠟樣芽胞桿菌(綠色條)顯示顯著的微生物活性(MIC值小于50μM)的聚合物，證明了根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物的抗微生物活性和疏水性之間高度相關(guān)； 圖2展示累積的條線圖，通過在代表從+9至+1凈正電荷的列(bin)上，標(biāo)記對抗大腸桿菌(紅色條)、綠膿假單胞菌(黃色條)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(藍(lán)色條)和蠟樣芽胞桿菌(綠色條)顯示出顯著的微生物活性(MIC值小于50μM)的聚合物，證明了根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物的抗微生物活性和凈正電荷之間缺乏相關(guān)性； 圖3展示比較的曲線圖，通過在37℃下LB介質(zhì)中指定的孵化期后，進(jìn)行菌落形成單位(CFU)計數(shù)并比較零(對照)、3和6倍的最小抑菌濃度(MIC)值(3.1μM)的劑量依賴性，證明了根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物C12K(NC8K)5NH2對聚合物存在下孵化的大腸桿菌的動力學(xué)殺菌效果； 圖4采用指定介質(zhì)中的100μM的聚合物濃度(2mM的脂質(zhì)體濃度)所表達(dá)的平均殘基摩爾橢圓率，展示根據(jù)本發(fā)明的兩個示例性抗微生物聚合物C12K(NC8K)5NH2和C12K(NC8K)7NH2，的圓二色光譜，并比較15-殘基對照肽，?；痙ermaseptin S4衍生物(數(shù)據(jù)代表三次單獨(dú)記錄值的平均值)； 圖5(a-b)展示條線圖，與暴露給經(jīng)典抗生素四環(huán)素、慶大霉素和環(huán)丙沙星比較時，通過將連續(xù)10代細(xì)菌暴露給溶胞以下(sub-lytic)濃度的K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2，在大腸桿菌上測量MIC水平演變(圖5a)，和在與暴露給兩類抗生素利福平和四環(huán)素比較時，將連續(xù)15代暴露細(xì)菌給溶胞以下(sub-lytic)濃度的C12KKNC12KNH2，在耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌測量MIC水平演變(圖5b)，證明了根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物不引起抗藥性的結(jié)果(MIC的相對值為由指定次代培養(yǎng)物獲得的MIC與同時從前代對照孔(沒有抗微生物劑培養(yǎng)的孔)中采集細(xì)菌所得到測定的MIC的標(biāo)準(zhǔn)化比值； 圖6展示通過表面等離子共振(SPR)測量得到的聯(lián)合和解離曲線(結(jié)合率)，證明根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物C12K(NC8K)5NH2的多種劑量(0.21、0.42、0.84、1.67、3.35μg)對模型膜的膜結(jié)合性質(zhì)(Kapp是假定為2步驟模型計算產(chǎn)生的結(jié)合常數(shù))； 圖7展示UV照亮的1％瓊脂糖凝膠電泳的照片，將聚合物在室溫下使用200納克質(zhì)粒以指定的DNA/聚合物比值(w∶w)孵化30分鐘后，通過DNA遲緩測定法測量，證明根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物C12KKNC12KNH2、K(NC4K)7NH2和C12K(NC8K)5NH2的DNA結(jié)合性質(zhì)(在聚合物缺失下的質(zhì)粒pUC19的正常遷移顯示在最左邊的泳道)； 圖8展示條線圖，證明通過SPR測量的根據(jù)本發(fā)明的表示為KNC8KNH2、K(NC8K)2NH2、K(NC8K)3NH2、K(NC8K)6NH2、KNC12KNH2、K(NC12K)2NH2、和K(NC12K)3NH2的示例性聚合物對脂多糖的結(jié)合，其中在用LPS孵化后聚合物對脂質(zhì)體的較弱結(jié)合證實了聚合物與LPS的結(jié)合； 圖9展示比較的曲線圖，當(dāng)與已知抗微生物活性的肽IB-367(白色圓圈)和作為對照的載體緩沖液(白色三角形)比較時，以每ml的CFU的對數(shù)單位對孵化時間證明根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物C8K(NC8K)7NH2抗人唾液中的微生物群的抗微生物活性(黑色圓圈)； 圖10展示比較的曲線圖，通過在階期依賴性效果上顯示將引起瘧疾的寄生蟲暴露給聚合物的時間對鐮狀瘧原蟲寄生蟲成活力(耐氯喹FCR3菌株對氯喹敏感NF54菌株)的效果，證明根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物C12K(NC12K)3NH2的抗瘧活性；和 圖11展示比較的曲線圖，通過顯示在寄生蟲發(fā)育不同階段用聚合物治療時間對寄生蟲成活的效果，證明根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物C12KNC8KNH2的抗瘧活性。
優(yōu)選實施方案的描述 本發(fā)明是新種類的聚合物抗微生物劑，其被設(shè)計為發(fā)揮抗微生物活性，同時具有穩(wěn)定、無毒和避免對其發(fā)生抗藥性，和因此能有益地用于治療致病微生物相關(guān)的多種醫(yī)學(xué)疾病。本發(fā)明還是包含它的藥物組合物、醫(yī)學(xué)裝置和食品防腐劑。本發(fā)明的抗微生物聚合物優(yōu)選地包括一個或多個正電荷氨基酸殘基和一個或疏水部分殘基，以一個對另一個的連接。
參照圖形和附隨的描述可以更好地了解本發(fā)明的原理和操作。
在詳細(xì)地解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明的應(yīng)用不限于下述描述所提出的或?qū)嵤├e例說明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明可以是其它的實施方案，或以多種途徑實踐或執(zhí)行。也應(yīng)當(dāng)了解，本文應(yīng)用的語詞和術(shù)語是用于描述的目的，不應(yīng)該被視為限制。
正如上述討論，現(xiàn)代經(jīng)典的抗生素例如四環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星和甲氧西林的使用，數(shù)年來受到對其發(fā)生抗藥性的嚴(yán)格限制。因此，已引導(dǎo)廣泛的研究于尋找防止發(fā)生誘導(dǎo)抗藥性的新抗微生物劑中。
正如上述進(jìn)一步的討論，天然存在的抗微生物肽(AMPs)是格外有效的抗微生物劑，但是作為藥物用于治療用途，卻受到肽制品、維護(hù)和臨床施用方式相關(guān)的限制。
基于數(shù)年對抗微生物肽性質(zhì)累積的知識和其使用相關(guān)的限制，本發(fā)明者假定，為了實現(xiàn)新種類的抗微生物劑，沒有經(jīng)典抗生素誘導(dǎo)抗藥性的缺點和那些AMPs的缺點，AMPs的三個關(guān)鍵屬性必須維持柔韌的結(jié)構(gòu)、兩親性特性和凈正電荷。
構(gòu)思本發(fā)明時，想像柔韌聚合的結(jié)構(gòu)將用于避免在靶微生物中發(fā)生抗藥性目的。進(jìn)一步想像如下文所定義的氨基酸的使用，能用作聚合物以及凈正電荷來源的主要成分。
進(jìn)一步構(gòu)思本發(fā)明時，猜測回避純氨基酸多肽結(jié)構(gòu)將不僅解決多肽作為藥物用途的生產(chǎn)和維持的限制問題，而且減輕多肽作為藥物施用隔開的限制缺陷。因此，想像該想像聚合物的預(yù)期兩親性特性可起于非氨基酸的疏水部分等，例如但不限于脂肪酸。
當(dāng)將本發(fā)明回到實踐時，如同隨后實施例部分中所證明的，本發(fā)明者開發(fā)并成功生產(chǎn)了新種類的聚合物，其顯示出呈現(xiàn)高度的抗微生物活性、低誘導(dǎo)抗藥性、非溶血性、對血漿蛋白酶的抵抗性和對微生物膜的高度親和力。
進(jìn)一步構(gòu)思本發(fā)明時，想像活性劑結(jié)合至聚合物結(jié)構(gòu)，例如標(biāo)記試劑和/或治療活性劑，將組合本發(fā)明聚合物對微生物細(xì)胞的親和力和另外活性劑的效用。在活性劑為標(biāo)記試劑的情形中，該組合將協(xié)助定位和診斷宿主中微生物生長的濃度；在活性劑為治療活性劑的情形中，起因于治療活性劑和抗微生物聚合物結(jié)構(gòu)的雙重療效，可以實現(xiàn)協(xié)同作用的療效。此外，可以實現(xiàn)治療試劑的定向遞送。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面提供具有抗微生物活性聚合物，其包含多個(例如兩個或更多個)氨基酸殘基和一個或多個疏水部分殘基，其中至少一個疏水部分殘基以共價鍵經(jīng)由一個氨基酸殘基的N-α和/或另一個氨基酸殘基的C-α與至少兩個氨基酸殘基連接。所以，該聚合物為被一個或多個疏水部分殘基間斷的氨基酸殘基序列所形成的鏈。
可以理解本文自始至終使用的術(shù)語“氨基酸”或“氨基酸”包括20個遺傳密碼氨基酸；體內(nèi)翻譯后常修改的那些氨基酸包括例如羥基脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；和其它罕見的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正白氨酸和鳥氨酸。此外，術(shù)語“氨基酸”包括D-和L-氨基酸和其它非天然存在的氨基酸。
下表1和2列出可用于本發(fā)明的遺傳編碼氨基酸(表1)和非常規(guī)的/修改的氨基酸的非限制性實例(表2)。
表1 表2 當(dāng)本文使用時，短語“疏水部分”是描述對水具有較小的或沒有親和力的化學(xué)部分，說得更精確些，其在水中具有低的或沒有溶解性和在其它的極性溶劑中通常具有低的或沒有溶解性。用于本發(fā)明上下文中適當(dāng)?shù)氖纠允杷糠?，包括但沒有限于為主要由一個或多個烴鏈和/或芳環(huán)和一個或多個官能團(tuán)組成的疏水部分，該官能團(tuán)可以是非疏水性的，但不改變該疏水部分的整體疏水性。代表性的實例包括但沒有限于為脂肪酸、疏水性氨基酸(具有疏水側(cè)鏈的氨基酸)、烷烴、烯烴和芳基等(這些術(shù)語如同本文所定義)，和它們的任何組合。
當(dāng)本文使用時，短語“化學(xué)部分”是描述化合物的殘基，其通常具有某些官能度。如本領(lǐng)域眾所公認(rèn)，術(shù)語“殘基”本文是指分子的主要部分，其與別的分子共價鍵連接。
當(dāng)本文使用時，短語“官能團(tuán)”是描述化學(xué)基團(tuán)，其能夠經(jīng)歷通常導(dǎo)致鍵形成的化學(xué)反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明該鍵優(yōu)選為共價鍵。導(dǎo)致鍵形成的化學(xué)反應(yīng)包括，例如親核和親電子取代反應(yīng)、親核和親電子加成反應(yīng)、加成消除反應(yīng)、環(huán)化加成反應(yīng)、重排反應(yīng)和任何其它已知的涉及官能團(tuán)的有機(jī)反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的聚合物可具有一個或多個疏水部分殘基，憑此至少一個疏水部分殘基在其一端與一個氨基酸和在其另一端與另一個氨基酸殘基連接，和另一個疏水部分殘基通過與任一個末端即末端氨基酸殘基的N-α和/或末端氨基酸殘基的C-α連接可以延長聚合物鏈。任選地，第二個疏水部分可以與該聚合物氨基酸殘基的側(cè)鏈連接。
根據(jù)本發(fā)明的聚合物，優(yōu)選地包括2至50個氨基酸殘基，更優(yōu)選地該聚合物包括2至12個氨基酸殘基和更優(yōu)選地2至8個氨基酸殘基。
通過聚合物中具有的一個或多個正電荷氨基酸殘基提供聚合物的凈正電荷，任選地除以自由形態(tài)存在時的正電荷N端胺以外。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，聚合物的所有氨基酸殘基為正電荷氨基酸殘基。根據(jù)該實施方案的示例性聚合物包括多個賴氨酸殘基。
當(dāng)本文使用時，短語“正電荷氨基酸”是描述具有側(cè)鏈pKa值大于7的親水性氨基酸，即堿性氨基酸。堿性氨基酸在生理pH時由于水合氫離子的關(guān)系，通常具有正電荷的側(cè)鏈。天然存在的(遺傳學(xué)上編碼的)堿性氨基酸包括賴氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)和組氨酸(His，H)，而非天然(非遺傳學(xué)上編碼的，或非標(biāo)準(zhǔn)的)堿性氨基酸包括，例如鳥氨酸、2，3，-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、2，5，6-三氨基己酸、2-氨基-4-胍基丁酸、和高精氨酸。
本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)該實施方案聚合物中的每個成分與其他成分優(yōu)選通過肽鍵連接。
當(dāng)本文使用時，術(shù)語“肽鍵”是指酰胺基，即-(C＝O)NH-基團(tuán)，其通常是通過羧基和胺基(這些術(shù)語如同本文所定義)之間的縮合反應(yīng)形成。
然而，該實施方案的聚合物可以有其它的鍵，連接聚合物結(jié)構(gòu)中的多種成分。當(dāng)在體內(nèi)時，此非肽鍵可以使聚合物更穩(wěn)定，或更能滲入細(xì)胞中。因此，聚合物內(nèi)的肽鍵(-(C＝O)NH-)可以被替換，例如被N-甲基酰胺鍵(-(C＝O)NCH3-)、酯鍵(-C(R)H-C(＝O)-O-C(R)-N-)、酮亞甲基鍵(ketomethylen bonds)(-(C＝O)CH2-)、氮雜鍵(azabonds)(-NH-N(R)-C(＝O)-)，(其中R為任何烷基，例如甲基)，甲氨鍵(carba bonds)(-CH2-NH-)、羥基亞乙基鍵(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺鍵(-CS-NH-)、烯雙鍵(-CH＝CH-)、逆酰胺鍵(-NH-(C＝O)-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-C(＝O)-)，其中R為天然存在碳原子上的“正常的”側(cè)鏈。這些修飾沿著聚合物鏈以任何鍵發(fā)生，甚至同時發(fā)生若干(2-3)次。
在優(yōu)選的實施方案中，聚合物中氨基酸殘基和疏水部分殘基相互連接的所有的鍵為肽鍵。例如在一個實施方案中，氨基酸殘基通過肽鍵連接疏水部分殘基，該疏水部分殘基依次又與第二個氨基酸殘基通過另一個肽鍵連接，從而形成聚合物。在另一個實例中，以前實例的聚合物通過第二個疏水部分殘基延長，該殘基經(jīng)由肽鍵等與任何一個N-或C-端連接。
根據(jù)本發(fā)明的聚合物，優(yōu)選地包括1至50個疏水部分殘基。更優(yōu)選地，該聚合物包括1至12個疏水部分殘基和更優(yōu)選1至8個疏水部分殘基。
本發(fā)明上下文中此和其它方面使用的疏水部分優(yōu)選具有一個或多個烴鏈，并能夠與聚合物的一個或兩個其它成分(例如，一個或兩個氨基酸殘基和另一個疏水部分)經(jīng)由兩個肽鍵連接。因此，這些部分優(yōu)選在烴鏈末端具有羧基基團(tuán)(用于連接自由胺基團(tuán))和在其另一端具有胺基(用于連接羧酸基團(tuán))。
在這樣的疏水部分中連接羧基和胺基的烴鏈優(yōu)選具有4至30個碳原子。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，疏水部分殘基為脂肪酸殘基，其中烴鏈可以是未分支和飽和的、分支和飽和的、未分支和未飽和的、或分支和未飽和的。更優(yōu)選地，脂肪酸殘基的烴鏈?zhǔn)蔷哂?至30個碳原子的未分支和飽和的鏈。此脂肪酸殘基的非限制性實例為丁酸殘基、辛酸殘基和月桂酸殘基。
更優(yōu)選實施方案中，脂肪酸殘基在烴鏈的末尾碳(就羧酸基團(tuán)而論)上有胺。本文中此脂肪酸殘基是指ω氨基脂肪酸殘基。再之，ω氨基脂肪酸殘基的烴鏈可以具有4至30個碳原子。
該ω氨基脂肪酸非限制的實例為4-氨基丁酸、6-氨基已酸、8-氨基辛酸、10-氨基癸酸、12-氨基月桂酸、14-氨基肉豆蔻酸、16-氨基棕櫚酸、18-氨基硬脂酸、18-氨基油酸、16-氨基棕櫚油酸、18-氨基亞油酸、18-氨基亞麻酸和20-氨基花生四烯酸。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，疏水部分選自4-氨基丁酸、8-氨基辛酸和12-氨基月桂酸。
本文所述的聚合物能夠共同地由以下的通式I表示 X-W0-[A1-Z1-D1]-W1-[A2-Z2-D2]-W2-...[An-Zn-Dn]-Wn-Y 式I 其中 n為2至50、優(yōu)選為2至12和更優(yōu)選為2至8的整數(shù)； A1，A2，...，An各自獨(dú)立地為氨基酸殘基，優(yōu)選為正電荷氨基酸殘基，和更優(yōu)選所有的A1，A2，...，An為如上文所述的正電荷氨基酸殘基，例如組氨酸殘基、賴氨酸殘基、鳥氨酸殘基和精氨酸殘基，和最優(yōu)選所有的正電荷氨基酸殘基為賴氨酸殘基； D1，D2，...，Dn各自獨(dú)立地為疏水部分殘基(如本文所定義和所述)或缺失，提供至少一個這樣的疏水部分殘基存在于該聚合物中，和優(yōu)選至少一個該疏水部分殘基為ω氨基脂肪酸殘基； 連接各個單體的殘基為連接部分，表示為Z1，Z2，...，Zn和W0，W1，W2，...，Wn，各自獨(dú)立地連接氨基酸殘基與疏水部分殘基或缺失，優(yōu)選至少一個連接部分為肽鍵和最優(yōu)選所有的連接部分為肽鍵； 聚合物的端，表示為X和Y，可以各自獨(dú)立地為氫、氨基酸殘基、疏水部分殘基或是通式I的其它聚合物。
如上述討論，一個或多個疏水部分殘基可以連接至聚合物的一個或多個氨基酸殘基的側(cè)鏈，即充當(dāng)主聚合物的分支。
可以容易地合成根據(jù)本實施方案的聚合物。例如其中連接部分為肽鍵并因此在此方面類似于天然和合成肽的聚合物，能通過肽合成領(lǐng)域已知的經(jīng)典方法制備。這樣的方法包括，例如標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)。該標(biāo)準(zhǔn)方法包括專用固相合成、部分固相合成方法、片段縮合、經(jīng)典溶解合成、和甚至用重組DNA技術(shù)。參見，例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc，852149(1963)，在此引入作為參考。固相肽合成程序是本領(lǐng)域眾所周知的，并由John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young進(jìn)一步描述Solid Phase Peptide Syntheses(2nd Ed.，Pierce ChemicalCompany，1984)。
本發(fā)明聚合物可以被純化，例如通過制備高效液相色譜儀[Creighton T.(1983)Proteins，structures and molecular principles.WHFreeman和Co.N.Y.]。
除具有有益的抗微生物活性的本身之外，如本文詳述，本發(fā)明聚合物可以包括與其連接的另外的活性劑例如標(biāo)記試劑和/或治療活性劑。
活性劑與本發(fā)明聚合物的結(jié)合能提供雙重效用的聚合物。當(dāng)另外的活性劑為標(biāo)記試劑時，其結(jié)合本發(fā)明抗微生物的聚合物(對微生物具有高親和力)，可有助于定位、診斷和靶向作用宿主內(nèi)微生物生長位置。當(dāng)另外的活性劑為治療活性劑時，其與本發(fā)明抗微生物的聚合物結(jié)合將發(fā)揮雙重的和可能協(xié)同的抗微生物活性。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，一種或多種活性劑可以在任何可取代的位置與聚合物連接。該可取代位置的實例包括但沒有限于聚合物的一個或多個氨基酸殘基的側(cè)鏈、聚合物的任何一個連接部分、聚合物的任何一個N-和C-端、和聚合物的任何一個或多個疏水部分殘基。
因此，當(dāng)本文使用時，短語“治療活性劑”是描述化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)給受治療者施用時，其呈現(xiàn)治療活性。
當(dāng)本文使用時，短語“標(biāo)記試劑”是指可探測的部分或探針，包括，例如發(fā)色團(tuán)、熒光化合物、磷光化合物、重金屬簇、和放射性標(biāo)記化合物、以及任何其它已知的可探測的部分。
宿主內(nèi)微生物生長位置的標(biāo)記對于診斷和有效地靶向作用及治療發(fā)光的(photogenic)微生物至關(guān)重要。
向聚合物添加治療活性劑可提供解決方案，解決目前已知的治療活性劑對抗發(fā)光的微生物的許多不足，例如發(fā)光的微生物對治療活性劑的抗藥性、治療活性劑對發(fā)光的微生物的特異性和普遍效力的薄弱。本發(fā)明聚合物由于本身的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)不僅顯示抗微生物活性，而且作為遞送目前已知治療活性劑的載體可提供尋靶能力和，進(jìn)一步為目前已知治療活性劑提供膜滲透性，這是由于聚合物發(fā)揮擾亂發(fā)光的微生物的膜結(jié)構(gòu)的能力。
治療活性劑(可有益地用于本發(fā)明的此和其它上下文中)的非限制性實例包括但沒有限于一種或多種激動劑殘基、氨基酸殘基、止痛劑殘基、拮抗劑殘基、抗生素殘基、抗體殘基、抗抑郁劑、抗原殘基、抗組胺殘基、抗高血壓劑、抗炎藥物殘基、抗代謝劑殘基、抗微生物劑殘基、抗氧化劑殘基、抗增殖藥物殘基、反義(antisense)殘基、化療藥物殘基、輔助因子殘基、細(xì)胞因子殘基、藥物殘基、酶殘基、生長因子殘基、肝素殘基、激素殘基、免疫球蛋白殘基、抑制劑殘基、配體殘基、核苷酸殘基、寡聚核苷酸殘基、肽殘基、磷脂殘基、前列腺素殘基、蛋白質(zhì)殘基、毒素殘基、維生素殘基和它們的任何組合。
當(dāng)治療活性劑為抗微生物劑或抗生素時，組合的治療效果是特別有利的。本發(fā)明聚合物和另外的抗微生物劑/抗生素的組合活性可提供該抗微生物劑/抗生素克服這些藥物已知缺陷(例如靶向作用、特異性、效力、耐藥性等)的能力。協(xié)同作用也得以實現(xiàn)。
適合用于本發(fā)明上下文中的抗微生物劑和抗生素非限制的實例包括但沒有限于為扁桃酸、2，4-二氯苯甲醇、4-[二(乙基硫)甲基]-2-甲氧基苯酚、4-差向四環(huán)素、4-己基雷瑣辛、5，12-二氫-5，7，12，14-四氮雜并五苯(tetrazapentacen)、5-氯香芹酚、8-羥基喹啉、乙酰胂胺、乙酰吉他霉素、吖啶黃素、阿拉曲沙星、安巴腙、安福霉素、阿米卡星、硫酸阿米卡星、氨吖啶、氨基水楊酸鈣、氨基水楊酸鈉、氨基水楊酸、魚石脂、阿莫羅芬、阿莫西林、阿莫西林鈉、三水阿莫西林、阿莫西林-克拉維酸鉀聯(lián)合物、兩性霉素B、氨芐西林、氨芐青霉素鈉、三水氨芐青霉素、氨芐西林·舒巴坦、阿帕西林、阿貝卡星、阿撲西林、阿司米星、硫酸阿司米星、阿扎硝唑、疊氮氯霉素、阿度西林、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、巴氨西林、桿菌肽、桿菌肽鋅、卡那霉素B、潔爾滅、芐索氯銨、苯佐氯銨、鹽酸小檗堿、比阿培南、鉍溴酚、雙氯麝酚、聯(lián)苯芐唑、堿式水楊酸鉍、博來霉素抗生素復(fù)合物、鹽酸博來霉素、硫酸博來霉素、溴莫普林、溴氯柳苯胺、溴硝丙二醇、溴羥喹啉、布替萘芬、鹽酸布替萘芬、布康唑、十一碳烯酸鈣、克念菌素抗生素復(fù)合物、卷曲霉素、羧芐青霉素、羧芐基青霉素雙鈉鹽、卡非西林、卡茚西林、卡蘆莫南、嗜癌霉素、醋酸卡泊芬凈、頭孢拉定、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、鹽酸頭孢氨芐、頭孢氨芐鈉、頭孢來星、頭孢噻啶、頭孢噻吩、頭孢噻吩鈉、頭孢孟多、頭孢孟多酯鈉、頭孢孟多鈉、頭孢匹林、頭孢匹林鈉、頭孢曲嗪、頭孢曲嗪丙二醇、頭孢吡酮、頭孢吡酮鈉鹽、頭孢唑林、頭孢唑啉鈉、頭孢拉宗、頭孢拉宗鈉、頭孢卡品、鹽酸頭孢卡品匹伏酯、頭孢地尼、新戊酰氧基甲基頭孢地托侖(cefditoren pivoxil)、頭孢吡肟、鹽酸頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢他美新戊酰氧甲酯(cefetamet pivoxil)、頭孢克肟、頭孢甲肟、頭孢美唑、頭孢美唑鈉、頭孢米諾、頭孢米諾鈉、cefmolexin、頭孢地嗪、頭孢地嗪鈉、頭孢尼西、頭孢尼西鈉、頭孢哌酮、頭孢哌酮鈉、頭孢雷特、硫酸頭孢噻利、頭孢噻肟、頭孢噻肟鈉、頭孢替坦、頭孢替坦二鈉、頭孢替安、鹽酸?？宋魈骖^孢替安、鹽酸頭孢替安、頭孢西丁、頭孢西丁鈉、鹽酸頭孢唑蘭、頭孢匹胺、頭孢匹胺鈉、頭孢匹羅、硫酸頭孢匹羅、頭孢泊肟、頭孢泊肟酯、頭孢丙烯、頭孢喹肟、頭孢拉定、頭孢沙定、頭孢磺啶、頭孢他啶、頭孢特侖、頭孢特侖新戊酰氧甲酯、頭孢替唑、頭孢布坦、頭孢唑肟、頭孢唑肟鈉、頭孢曲松、頭孢曲松鈉、頭孢呋新、頭孢呋新乙酰氧乙酯、頭孢呋新鈉、西他氯銨、溴化十六烷基三甲銨、十六烷基三甲銨(cetrimonium)、十六烷基吡啶、氯胺-T、氯霉素、棕櫚酸氯霉素、琥珀酸鈉氯霉素、氯己定、氯芐甲咪唑、鹽酸氯芐甲咪唑、氯二甲酚、氯苯甘醚、氯喹那多、金霉素、鹽酸金霉素、環(huán)己西林、環(huán)吡酮、西諾沙星、環(huán)丙沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、枸櫞酸、克拉霉素、克拉維酸鉀、克拉維酸鈉、克拉維酸、克林霉素、鹽酸克林霉素、鹽酸克林霉素棕櫚酸酯、克林霉素磷酸酯、氯碘羥喹、氯康唑、單鹽酸氯康唑、氯法齊明、氯福克酚、氯甲西林、氯莫環(huán)素、克霉唑、氯唑西林、氯唑西林鈉、多粘菌素E、多粘菌素E甲磺酸鈉、硫酸多粘菌素E、環(huán)絲氨酸、更生霉素、達(dá)氟沙星、氨苯砜、達(dá)托霉素、柔紅霉素、DDT、地美環(huán)素、地美環(huán)素鹽酸鹽、地喹胺(dequalinium)、地貝卡星、硫酸地貝卡星、雙溴丙脒、雙氯酚、雙氯西林、雙氯西林鈉、二癸基二甲基氯化銨、雙氫鏈霉素、硫酸雙氫鏈霉素、雙碘喹啉、地美硝唑、雙吡硫翁、地紅霉素、DL-薄荷腦、D-薄荷腦、溴化十二烷基三苯基磷、阿霉素、鹽酸阿霉素、多西環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、益康唑、硝酸益康唑、恩康唑、依諾沙星、恩氟沙星、曙紅、依匹西林、爾他培南鈉鹽(ertapenem sodium)、紅霉素、依托紅霉素、紅霉素琥珀酸乙酯、乳糖紅霉素、紅霉素硬脂酸脂、依沙吖啶、依沙吖啶乳酸鹽、乙胺丁醇、冰醋酸、乙硫異煙胺、乙醇、丁香酚、依沙酰胺、法羅培南、芬替康唑、硝酸芬替康唑、非扎硫酮、氟羅沙星、氟氧頭孢、氟氧頭孢鈉、氟氯青霉素、氟氯青霉素鎂、氟氯青霉素鈉、氟康唑、氟胞嘧啶、氟甲喹、氟紅霉素、氟三唑、磷霉素、磷霉素鈣、磷霉素鈉、新霉素B、硫酸新霉素B、呋喃烯啶(furagin)、呋喃唑酮、夫沙芬凈(fusafungin)、夫西地酸、夫西地酸鈉鹽、加替沙星、吉米沙星、慶大霉素抗生素復(fù)合物(gentamicinantibiotic complex)、慶大霉素、硫酸慶大霉素、戊二醛、短桿菌肽、格帕沙星、灰黃霉素、哈拉宗、鹵丙炔氧苯(haloprogine)、海他西林、海他西林鉀、六氯酚、己脒定、?？颂驵?、汞喹米特(hydrargaphene)、氫醌、均霉素、亞胺培南、異帕米星、硫酸異帕米星、異康唑、硝酸異康唑、異煙肼、異丙醇、伊曲康唑、交沙霉素、交沙霉素丙酯、卡那霉素、硫酸卡那霉素、酮康唑、吉他霉素、乳酸、拉諾康唑、侖氨西林、白霉素A1、白霉素A13、白霉素A4、白霉素A5、白霉素A6、白霉素A7、白霉素A8、白霉素A9、左氧氟沙星、林可霉素、鹽酸林可霉素、利奈唑胺、利拉萘酯、1-薄荷腦、洛美沙星、鹽酸洛美沙星、氯碳頭孢(loracarbef)、賴甲環(huán)素、溶菌酶、醋酸甲磺滅膿、單過氧化酞酸鎂六水合物(magnesium monoperoxophthalate hexahydrate)、乙硫酸美西銨、美西林、甲氯環(huán)素、磺基水楊酸甲氯環(huán)素、美帕曲星、汞溴紅、美羅培南、美他氯銨、美坦西林、美他環(huán)素、烏洛托品、水楊酸甲酯、甲芐索氯銨、甲紫、甲氧苯青霉素、甲氧苯青霉素鈉、甲硝唑、甲硝唑苯甲酸酯、美洛西林、美洛西林鈉、咪康唑、硝酸咪康唑、小諾霉素、硫酸小諾霉素、麥迪霉素、米諾環(huán)素、鹽酸米諾環(huán)素、美歐卡霉素、米他氯銨、絲裂霉素C、莫能星、莫能星鈉、嗎啉米特、羥羧氧酰胺菌素、羥羧氧酰胺菌素二鈉、莫西沙星、莫匹羅星、莫匹羅星鈣、那氟沙星、萘夫西林、萘夫西林鈉、萘替芬、萘啶酸、那他霉素、新霉素A、新霉素抗生素復(fù)合物、新霉素C、硫酸新霉素、奈康唑、奈替米星、硫酸萘替米星、硝呋太爾、硝呋齊特、硝呋妥因醇、硝呋肼、尼莫唑、尼立達(dá)唑、呋喃妥因、呋喃西林、硝羥喹啉、諾氟沙星、新生霉素、制霉菌素抗生素復(fù)合物、奧替尼啶、氧氟沙星、竹桃霉素、奧莫康唑(omoconazol)、奧比沙星、奧硝唑、鄰苯基苯酚、苯唑西林、苯唑西林鈉、奧昔康唑、硝酸奧昔康唑、oxoferin、奧索利酸、奧昔氯生、土霉素、土霉素鈣、鹽酸土霉素、帕尼培南、巴龍霉素、硫酸巴龍霉素、帕珠沙星(pazufloxacine)、培氟沙星、甲磺酸培氟沙星、培那西林、青霉素G、青霉素G鉀、青霉素G鈉、青霉素V、青霉素V鈣、青霉素V鉀、噴他脒、噴他脒二羥乙磺酸鹽、噴他脒甲磺酸鹽、噴他霉素、非奈西林、苯酚、苯氧乙醇、苯汞基硼酸鹽(phenylmercuriborat)、PHMB、酞磺胺噻唑、哌氯定(picloxydin)、吡哌酸、哌拉西林、哌拉西林鈉-三唑巴坦鈉、吡咯米酸、匹氨西林、pivcefalexin、匹美西林、鹽酸匹美西林、聚甲酚磺醛、多粘菌素抗生素復(fù)合物、多粘菌素B、硫酸多粘菌素B、多粘菌素Bl、聚諾昔林、聚維酮碘、普羅帕脒(propamidin)、普羅硝唑、丙匹西林、丙匹西林鉀、丙酸、丙硫異煙胺、丙噻酯、吡嗪酰胺、乙胺嘧啶、巰氧吡啶、吡咯尼群、喹啉、奎奴普丁-達(dá)福普汀、間苯二酚、核糖霉素、硫酸核糖霉素、利福布汀、利福平、利福霉素、利福噴汀、利福昔明、利硫美坦、羅他霉素、羅利環(huán)素、羅索沙星、羅紅霉素、蘆氟沙星、水楊酸、塞克硝唑、二硫化硒、舍他康唑、硝酸舍他康唑、西卡寧、西索米星、硫酸西索米星、硫代硫酸鈉、司帕沙星、壯觀霉素、鹽酸壯觀霉素、螺旋霉素抗生素復(fù)合物、螺旋霉素b、鏈霉素、硫酸鏈霉素、琥珀磺胺噻唑、舒巴克坦、舒巴克坦鈉、磺芐西林鈉、舒苯汀(sulbentin)、硫康唑、硝酸硫康唑、磺胺苯酰、磺胺脲、磺胺醋酰、磺胺醋酰鈉、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶銀、磺胺嘧啶鈉、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺多辛、磺胺脒、磺胺林、磺胺馬宗、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶鈉、磺胺甲二唑、磺胺甲基異唑、磺胺甲基異唑-甲氧芐啶、磺胺甲氧嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺唑、磺胺、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹沙啉、磺胺琥珀酸、磺胺噻唑、磺胺硫脲、磺胺托拉米、sulfatriazin、磺胺索嘧啶、磺胺異唑、磺胺乙酰異唑、磺胺類藥物(sulfonamides)、舒他西林、舒他西林甲苯磺酸鹽、他克莫司、酞氨西林鹽酸鹽、替考拉寧A2復(fù)合物、替考拉寧A2-1、替考拉寧A2-2、替考拉寧A2-3、替考拉寧A2-4、替考拉寧A2-5、替考拉寧A3、替考拉寧抗生素復(fù)合物、泰利霉素、替馬沙星、替莫西林、tenoic acid、特比萘芬、特康唑、特立齊酮、四環(huán)素、鹽酸四環(huán)素、四環(huán)素偏磷酸鹽、四甲基秋藍(lán)姆化一硫、四氧普林、噻苯達(dá)唑、甲砜霉素、鹽酸硫代苯丙醇甘氨酸鹽(thiaphenicolglycinatehydrochloride)、硫柳汞、塞侖、鹿香草酚、替貝碘銨、替卡西林、替卡西林-克拉維酸混合物、替卡西林二鈉、替卡西林一鈉、甲溴羥喹、替米考星、替硝唑、噻康唑、妥布霉素、硫酸妥布霉素、托西拉酯、托林達(dá)酯、托萘酯、甲硫托洛銨(toloconium metilsulfat)、托曲珠利、托氟沙星、三氯卡班、三氯生、甲氧芐啶、硫酸甲氧芐啶、三苯基銻硫化物(triphenylstibinsulfide)、醋竹桃霉素、曲伐沙星、泰洛星、tyrotliricin、氯烷吡啶、十一烯酸、萬古霉素、鹽酸萬古霉素、紫霉素、維吉霉素抗生素復(fù)合物、伏立康唑、占托西林、希波酚和十一烯酸鋅。
本實施方案的聚合物的主要部分是基于氨基酸和雙官能的疏水部分之間的結(jié)合物組成的重復(fù)單元。該結(jié)合物在聚合物的序列中可重復(fù)數(shù)次和/或，被不同類型的結(jié)合物或被單個或重復(fù)的氨基酸殘基和單個或重復(fù)的疏水部分殘基所間斷和/或側(cè)面作用。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面提供結(jié)合物，其包括氨基酸殘基和疏水部分殘基，如上文定義和描述，連接至該氨基酸殘基的N-α或C-α。設(shè)計本發(fā)明結(jié)合物中的疏水部分殘基，以便它能夠與另外的氨基酸殘基的N-α或C-α形成鍵。優(yōu)選地，疏水部分殘基與氨基酸殘基經(jīng)由肽鍵結(jié)合。
本發(fā)明結(jié)合物中的疏水部分具有雙官能的設(shè)計，允許該結(jié)合物用作可聚合的結(jié)合物，形成本文所述和提出的聚合物的一部分。優(yōu)選地，形成結(jié)合物部分的疏水部分具有雙官能度，在其一個末端形式為羧基基團(tuán)和在其另一個末端形式為胺基團(tuán)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面提供制備上文所述的結(jié)合物的方法，其一般方法是基于提供氨基酸，優(yōu)選地氨基酸為正電荷氨基酸，例如組氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸；提供如上文定義和描述的疏水部分，具有能夠與氨基酸殘基的N-α起反應(yīng)的第一官能團(tuán)和能夠與氨基酸殘基的C-α起反應(yīng)的第二官能團(tuán)；將疏水部分的第一官能團(tuán)與氨基酸經(jīng)由該氨基酸的N-α連接；或?qū)⑹杷糠值牡诙倌軋F(tuán)與氨基酸經(jīng)由該氨基酸的C-α連接。
優(yōu)選地，氨基酸的N-α或C-α和疏水部分之間是經(jīng)由肽鍵連接。
為了形成連接氨基酸和疏水部分肽鍵，優(yōu)選該疏水部分在其一個末端具有羧基基團(tuán)和在其另一個末端具有為胺基團(tuán)。
本文所述的抗微生物聚合物可有益地用于治療致病微生物感染，這些如下文所定義。如同隨后實施例部分所證明，此聚合物自身能夠發(fā)揮抗微生物活性。因此，包括另外治療活性劑的選擇可協(xié)同地用作抗多種細(xì)菌、真菌和其它微生物的毒性藥劑。
本文各處的短語“致病微生物”用于描述能夠引起高等生物體(通常例如哺乳動物和尤其是人)疾病或病癥的任何微生物。該致病微生物可屬于生物體的任何家族，例如但不限于為原核生物、真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物、醇母、真菌、藻類、原生生物和其它的寄生蟲。致病微生物非限制性的實例為鐮狀瘧原蟲(Plasmodium falciparum)和相關(guān)的引起的瘧疾原生動物寄生蟲、棘阿米巴屬(Acanthamoeba)和其它自由生活阿米巴、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、異尖屬(Anisakis)和相關(guān)的蠕蟲、蛔蟲(Ascaris lumbricoides)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridium botulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridiumperfringens)、小球隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、圓孢子蟲(Cyclospora cayetanensis)、裂頭屬絳蟲(Diphyllobothrium)、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、真圓線蟲屬(Eustrongylides)、蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌(Listeriamonocytogenes)、侏形吸蟲屬(Nanophyetus)、類志賀毗鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀菌(Shigella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鏈球菌(Streptococcus)、鞭蟲(Trichuris trichiura)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)和其它弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)和假結(jié)核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病的方法，該方法包括給需要它的受治療者施用治療有效量的一種或多種聚合物，如上文所述。
當(dāng)本文使用時，術(shù)語“治療”和“治療”包括去除、基本上抑制、減慢或反轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展、基本上改善疾病的臨床或美學(xué)癥狀或基本上預(yù)防出現(xiàn)疾病的臨床或美學(xué)癥狀。
當(dāng)本文使用時，短語“治療有效量”是描述所施用的組合物的量，其將在某種程度上緩解所治療的疾病的一種或多種癥狀。
根據(jù)本發(fā)明實施方案的治療方法可包括施用如上文所定義和討論的另外的治療活性劑。
如同以上敘述和隨后的實施例部分所證明，可以設(shè)計和利用本發(fā)明的抗微生物聚合物(單用或與其它任何治療活性劑連用)，消滅病態(tài)的微生物。通過有選擇地破壞致病微生物細(xì)胞的一部分引起致病微生物的毀滅。雖然最有名的抗生素通過有選擇地干擾細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)或核苷酸的一種或多種分子組分的生物合成起作用，本發(fā)明聚合物也通過與致病微生物的細(xì)胞外膜結(jié)合和破裂起作用。細(xì)胞外膜的破裂由于膜的去極化、代謝產(chǎn)物的泄漏和/或細(xì)胞完整性的總損失引起細(xì)胞死亡；因此本發(fā)明聚合物也通過破壞新陳代謝和/或致病微生物的增殖進(jìn)程，直接用作有效的抗微生物劑。
如同隨后的實施例部分所證明，本發(fā)明聚合物可與另外的抗生素或其它治療活性劑通過透化致病微生物細(xì)胞起協(xié)同作用；由此又顯示間接的抗微生物活性。下文給出的結(jié)果允許這樣的結(jié)論本發(fā)明聚合物是有效的外膜分裂劑。聚合物的透化作用能增加其它治療活性劑的攝取，因此能夠增強(qiáng)其它藥物和抗生素的顯而易見的抗微生物活性。
治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病包括通過致病微生物或致病微生物的感染、侵襲、污染和傳播。一般而言感染引起的疾病是指致病微生物侵入植物或動物組織。寄生的蠕蟲和其它更高的致病生物體侵入身體組織通常地是指侵襲。
侵入生物體例如細(xì)菌生產(chǎn)損害宿主組織和干擾正常代謝的毒素；一些毒素實際上是破壞宿主組織的酶。其它的細(xì)菌物質(zhì)可通過對宿主吞噬細(xì)胞的破壞加予損害，致使身體對其它的致病微生物感染更為敏感。由許多侵入生物體生產(chǎn)的物質(zhì)引起宿主內(nèi)變應(yīng)性致敏。感染可經(jīng)由呼吸飛沫、直接接觸、污染的食物或帶菌者例如昆蟲傳播。也可以兩性之間傳播和母胎傳播。
細(xì)菌感染引起的疾病通常包括，例如放線菌病、炭疽、曲菌病、菌血癥、細(xì)菌性皮膚病、巴爾通體感染、肉毒桿菌中毒、普魯斯病、伯克霍爾德氏菌(burkholderia)感染、彎曲桿菌感染、念珠菌病、貓抓病、衣原體屬感染、霍亂、梭狀芽孢桿菌感染、球孢子菌病、隱球菌病、皮膚真菌病、白喉、埃里希體病、流行虱傳播斑疹傷寒、大腸桿菌感染、梭狀桿菌感染、壞疽、全身感染、全身性霉菌病(generalmycoses)、淋病、革蘭陰性細(xì)菌感染、革蘭陽性細(xì)菌感染、組織胞漿菌病、膿皰病、克雷伯氏菌屬感染、軍團(tuán)桿菌病、麻風(fēng)病、鉤端螺旋體病、李斯特菌感染、萊姆病、瘧疾、足分支菌病、類鼻疽(melioidosis)、分枝桿菌感染、支原體感染、壞死性筋膜炎、諾卡氏菌感染、甲癬、鳥病、肺炎球菌感染、肺炎、假單胞菌屬感染、Q熱、鼠咬熱、回歸熱、風(fēng)濕熱、立克次體感染、落磯山斑疹熱、沙門菌感染、猩紅熱、叢林斑疹傷寒、膿毒病、性傳播的細(xì)菌性病、葡萄球菌感染、鏈球菌感染、外科位置感染、破傷風(fēng)、蜱傳播疾病、結(jié)核病、兔熱病(tularemia)、傷寒、泌尿道感染、弧菌感染、雅司病、耶爾森菌病、耶爾森菌蟲害瘟疫、動物傳染病和接合菌病。
因為本實施方案的聚合物通過主要是由特異性和選擇性地針對致病微生物膜的親和力所產(chǎn)生上述的一個機(jī)理，對致病微生物施加抗微生物效果和對哺乳動物細(xì)胞具有相對完整無損的效果(如同紅細(xì)胞所證明和隨后實施例部分所介紹)，因此它們可用于治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病。這種親和力可用于減弱、破裂、穿刺、熔化、融合和/或標(biāo)記致病微生物膜。
如同隨后實施例部分中系列細(xì)菌菌株證明和介紹，通過膜破裂，可直接破壞致病微生物；或減弱致病微生物，以讓先天的免疫系統(tǒng)消滅它或減慢其新陳代謝和因此減慢其生殖以讓先天的免疫系統(tǒng)戰(zhàn)勝感染。
通過膜破裂可直接破壞致病微生物，以讓治療活性劑，例如抗生素更容易穿透微生物的細(xì)胞并在此發(fā)揮(afflict)活性。
本發(fā)明的抗微生物聚合物協(xié)助另外的治療活性劑滲入致病微生物細(xì)胞的在后能力，可用于治療許多感染性疾病例如，舉例，瘧疾。
瘧疾，又稱為叢林熱、沼澤地?zé)岷蜐竦責(zé)?，為傳染性疾病，特征為循環(huán)性寒戰(zhàn)、發(fā)熱、和出汗，它是由原生動物寄生蟲，瘧原蟲(一種Apicomplexa)，通過感染人瘧原蟲的帶菌者，雌性瘧蚊屬(Anopheles)蚊子，的叮咬傳染，使紅細(xì)胞感染寄生蟲引起的。四種類型的瘧疾中，最威脅生命的類型為惡性(falciparum)瘧。其它三種類型的瘧疾間日瘧、三日瘧和卵型瘧通常較少為嚴(yán)重的和不威脅生命。瘧疾，仍然是致命的擊敗人類的傳染性疾病，主要在熱帶和撒哈拉以南的非洲引起每年大約5億感染和一至兩百萬死亡。寄生蟲的鐮狀瘧原蟲品種計算占80％病例和90％死亡。鐮狀瘧原蟲瘧疾中紅細(xì)胞的粘性特別顯著，這是發(fā)生瘧疾出血性的并發(fā)癥主要因素。
迄今為止對瘧疾沒有絕對治愈法。如果早期診斷則可以減輕瘧疾，但預(yù)防仍然比治療更有效，因此抑制寄生蟲的物質(zhì)廣泛用于到熱帶的游客。自十七世紀(jì)以來，奎寧為瘧疾的選擇性預(yù)防劑。二十世紀(jì)中，奎納克林、氯喹、和伯氨喹的開發(fā)減少了對奎寧依靠。這些抗瘧藥物可用于預(yù)防，并推薦給到侵襲區(qū)域的旅行者。
不幸地，早在二十世紀(jì)六十年代瘧原蟲的幾種菌株對氯喹發(fā)生抗藥性。抗藥性的發(fā)生，加上蚊子對殺蟲劑正生長的免疫，已經(jīng)使瘧疾成為一個世界性領(lǐng)引的再度出現(xiàn)的感染性疾病。甲氟喹可用于該疾病已變得高度耐氯喹的區(qū)域，但是一些菌株現(xiàn)在對其和其它的藥物有抵抗力?，F(xiàn)在，青蒿素(得自青蒿)與其它藥物的聯(lián)合在許多病例中是治療抗性株的首選。馬拉隆(Malarone)(阿托伐醌和氯胍)也用于抗性株?？汞懠惨呙缛匀粚嶒炐缘摹?br> 當(dāng)本發(fā)明回到實踐時，本發(fā)明者已經(jīng)制備和成功使用這些抗微生物聚合物作為抗瘧劑，具有如隨后實施例部分所證明的減少的溶血效果。本發(fā)明聚合物顯示能夠清楚地與溶解宿主細(xì)胞分開的方式殺死寄生蟲。這些聚合物能夠進(jìn)入受感染細(xì)胞，僅有選擇地透化寄生蟲細(xì)胞膜。當(dāng)與宿主和正常血細(xì)胞比較時，通過具有不同性質(zhì)結(jié)構(gòu)的肽樣聚合物與紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲鐮狀瘧原蟲膜的組分之間不同的相互作用，最好地解釋了這些結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)也確定本發(fā)明的膜活性聚合物可設(shè)計為特別地作用于胞內(nèi)寄生物的膜以擾亂其功能。本發(fā)明聚合物通過例如弱化寄生蟲膜和使抗瘧劑能更快地穿透寄生蟲膜，因此能克服對多種抗瘧劑的寄生蟲抗藥性問題。
因此，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是抗微生物聚合物以本身或與目前使用的抗瘧藥或任何其它的抗寄生物藥聯(lián)合作為抗瘧藥的用途，如同隨后實施例部分中所舉例說明。
本發(fā)明抗微生物聚合物能以本身或作為藥物組合物的活性成分應(yīng)用，可具有或沒有另外的治療活性劑和藥學(xué)上可接受的載體。
因此，根據(jù)本發(fā)明再一個方面，提供藥物組合物，其包括一種和多種如上所述具有抗微生物活性的本發(fā)明聚合物和藥學(xué)上可接受的載體。
本文使用的“藥物組合物”是指本文所述的抗微生物聚合物的制劑，具有其它的化學(xué)成分例如藥學(xué)上可接受的和適當(dāng)?shù)妮d體和輔料。藥物組合物的目的是為了使生物體容易施用化合物。
在下文中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指對生物體不會引起顯著的刺激和不會取消所施用化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。載體的實例為但沒有限于丙二醇、鹽水、有機(jī)溶劑與水的乳劑和混合物、以及固體(例如粉末)和氣體載體。
本文的術(shù)語“輔料”是指加至藥物組合物的以便更容易施用化合物的惰性物質(zhì)。輔料的實例包括但沒有限于碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖和多類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。
制劑的技術(shù)和藥物的施用可參見“ Remington′s PharmaceuticalSciences”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，在此將其引入作為參考。
因此可以制造根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物，以常規(guī)方式使用一種和多種藥學(xué)上可接受的載體包括輔料和輔件(auxiliaries)，其促進(jìn)銀覆蓋的(silver-coated)酶進(jìn)入藥學(xué)上可使用的制劑中。適當(dāng)?shù)闹苿┮蕾囉谒x擇的給藥途徑。本文描述的銀覆蓋的(silver-coated)酶的毒性和治療效果可通過標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序在實驗動物中確定，例如通過測定受治療者銀覆蓋的(silver-coated)酶的EC50、IC50和LD50(引起測試動物50％死亡的致死劑量)。由這些活性測定和動物實驗獲得的資料可用于確定人類所使用的劑量范圍。
劑量可依賴所應(yīng)用的劑型和所使用的給藥途徑改變?？捎蓚€人醫(yī)師考慮患者的病情選擇準(zhǔn)確的制劑、給藥途徑和劑量。(參見，例如，F(xiàn)ingl等，1975，in“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1p.l)。
施用組合物的量將，當(dāng)然，取決于正治療的受治療者、難受的嚴(yán)重度、給藥的方式、處方醫(yī)師的判斷等。
本發(fā)明的組合物，如果想要，可在包裝或調(diào)劑裝置中供應(yīng)，例如FDA(美國食品與藥品管理局)批準(zhǔn)的可包含一或多個含活性成分的單元劑型藥盒。包裝可，例如，包括金屬或塑料箔，例如但不限于起泡包裝或加壓容器(用于吸入)。包裝或調(diào)劑裝置可伴有施用的技術(shù)說明書。包裝或調(diào)劑裝置也可伴有容器相關(guān)的通知，該通知以政府機(jī)構(gòu)調(diào)節(jié)制造商、使用者或藥物制劑零售商的規(guī)定形式，反映了該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)此組合物形式可給人或獸醫(yī)施用。這樣的通知，例如，可以是美國食品與藥品管理局批準(zhǔn)的用于處方藥物或批準(zhǔn)產(chǎn)品插入物的標(biāo)簽。本發(fā)明包含銀覆蓋的(silver-coated)酶在可配伍的藥學(xué)載體中制造的組合物，也可以制備、放置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，并?biāo)記治療適應(yīng)的疾病或診斷，如同上文詳細(xì)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，依賴于所選擇的聚合物和所存在的另外活性成分，本發(fā)明的藥物組合物包裝在包裝材料中并在所述包裝材料中或上印刷標(biāo)識，用于治療如上文所定義的致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病和寄生蟲。
包含本發(fā)明聚合物的藥物組合物可進(jìn)一步包含至少一種如上文定義和提出的另外的治療活性劑。
本發(fā)明的聚合物還可在多種醫(yī)療裝置中有益地用作活性物質(zhì)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的還一個方面提供醫(yī)學(xué)裝置，其包括一種或多種上文所述的本發(fā)明聚合物，和配置用于遞送該聚合物至受治療者身體部位的遞送系統(tǒng)。
因此應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的醫(yī)學(xué)裝置，將本發(fā)明聚合物遞送至或用于預(yù)期的身體部位。聚合物以本身或作為藥物組合物的一部分摻入醫(yī)學(xué)裝置，如同上文所述。
當(dāng)本文使用時，短語“身體部位”包括任何器官、組織、膜、腔、血管、道、生物學(xué)表面或肌肉，本發(fā)明聚合物遞送至或用于這些身體部位是有益的。
示例性身體部位包括但不限于皮膚、真皮層、頭皮、眼睛、耳朵、口、咽喉、胃、小腸組織、大腸組織、腎、胰臟、肝、消化系統(tǒng)、呼吸道、骨髓組織、粘膜、鼻膜、血液系統(tǒng)、血管、肌肉、肺空洞、動脈、靜脈、毛細(xì)管、心臟、心腔、雄性或雌性生殖器官和任何內(nèi)臟的器官或腔。
根據(jù)本發(fā)明該方面的醫(yī)學(xué)裝置可以是本領(lǐng)域已知的任何醫(yī)學(xué)裝置，包括依賴于例如所治療的疾病和身體部位，例如由FDA所定義和分類的那些，和http://www.fda.gov/cdrh/devadvice/313.html(例如，I，II和III類)中指定的那些。
因此，例如在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，醫(yī)學(xué)裝置包含為了以吸入遞送該聚合物而配置的遞送系統(tǒng)。這樣的吸入裝置有用于遞送本發(fā)明聚合物至例如呼吸道。
此醫(yī)學(xué)裝置中的遞送系統(tǒng)可以基于多種適合類型中的任意呼吸遞送系統(tǒng)，其適合給受治療者施用治療有效量的本發(fā)明聚合物。可以配置吸入裝置，優(yōu)選地經(jīng)由口腔和/或鼻途徑，以遞送在煙霧劑/噴霧劑、蒸汽和/或干燥粉末合劑的形式中的化合物至該受治療者的呼吸道。普通技術(shù)人員廣泛應(yīng)用的和本領(lǐng)域文獻(xiàn)中廣泛描述的眾多呼吸系統(tǒng)和方法，適合裝配適當(dāng)?shù)奈胙b置，摻入治療劑例如本發(fā)明的聚合物(參見，例如美國專利編號6,566,324、6,571,790、6,637,430、和6,652,323；美國食品與藥品管理局(USFDA)藥品評價與研究中心(CDER)；http://www.mece.ualberta.ca/arla/tutorial.htm)。
因此呼吸遞藥系統(tǒng)可以是例如，噴霧器或煙霧發(fā)生器例如噴霧吸入器、干粉吸入器(DPI)和計量吸入器(MDI)、蒸發(fā)器例如電加熱器和汽化器、和呼吸器例如呼吸機(jī)、人體呼吸器(例如胸甲)、肺通氣器和復(fù)蘇器。
本發(fā)明該方面的又一個實施方案中，醫(yī)學(xué)裝置是經(jīng)皮膚實現(xiàn)遞送聚合物的醫(yī)學(xué)裝置。在此實施方案中，在受治療者的皮膚上應(yīng)用該醫(yī)學(xué)裝置，以經(jīng)皮遞送該聚合物至血液系統(tǒng)中。
經(jīng)皮遞送根據(jù)本發(fā)明的聚合物的示例性醫(yī)學(xué)裝置包括但沒有限于橡皮膏和皮膚貼劑。經(jīng)皮或經(jīng)表皮遞送該聚合物的醫(yī)學(xué)裝置一般還包括一種或多種滲透促進(jìn)劑，用于促進(jìn)它們滲透通過表皮并進(jìn)入系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明該方面的再一個實施方案，醫(yī)學(xué)裝置是在受治療者的生物學(xué)表面局部地應(yīng)用該醫(yī)學(xué)裝置實現(xiàn)遞送聚合物的醫(yī)學(xué)裝置。生物學(xué)表面可以是例如，皮膚、頭皮、眼睛、耳朵和指甲。這樣的醫(yī)學(xué)裝置可用于治療多種皮膚疾病和損傷、眼睛和耳朵感染等。
局部應(yīng)用的示例性醫(yī)學(xué)裝置包括但沒有限于橡皮膏條、繃帶、橡皮膏、傷口敷料和皮膚貼劑。
本發(fā)明該方面的還一個實施方案中，醫(yī)學(xué)裝置是經(jīng)身體器官內(nèi)植入醫(yī)學(xué)裝置實現(xiàn)遞送聚合物的醫(yī)學(xué)裝置。當(dāng)本文使用時，術(shù)語“器官”還包括體腔。
器官可以是例如，肺空洞、心臟或心腔、體腔、器官腔、細(xì)管、動脈、靜脈、肌肉、骨、腎、毛細(xì)管、真皮層之間的空間、雌性或雄性生殖系統(tǒng)的器官、消化道的器官和任何其它內(nèi)臟器官。
根據(jù)本發(fā)明實施方案的醫(yī)學(xué)裝置一般包括其中摻入根據(jù)本發(fā)明聚合物的裝置結(jié)構(gòu)。因此可將聚合物例如應(yīng)用在、陷入于或連接至(化學(xué)地，靜電學(xué)地或別的方式地)該裝置結(jié)構(gòu)。
裝置結(jié)構(gòu)可為例如金屬的結(jié)構(gòu)，因此可包含生物相容的金屬或金屬混合物(例如金、鉑)。
替代選擇地，裝置結(jié)構(gòu)可以包含其它生物相容的基質(zhì)。這些可包括，例如塑料、硅、聚合物、樹脂，和可以包含至少一種成分例如，舉例，聚氨基甲酸乙酯、纖維素酯、聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯、右旋糖酐、明膠、膠原、彈性蛋白(elastin)、層粘連蛋白、纖維結(jié)合蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白、肝素、分段的聚氨基甲酸乙酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維蛋白、纖維素和例如富勒烯(fullerenes)中的無定形碳或有結(jié)構(gòu)的碳、和它們的任何組合。
在預(yù)期為生物可降解的植入裝置的案例中，裝置結(jié)構(gòu)包括生物可降解的生物相容的基質(zhì)。生物可降解的基質(zhì)可包括例如，生物可降解的聚合物例如聚-L-乳酸。
任選地，裝置結(jié)構(gòu)可包括生物相容的金屬，涂有其它生物相容的基質(zhì)。
還任選地，在預(yù)期以控制方式釋放本發(fā)明聚合物的裝置的案例中，裝置結(jié)構(gòu)可包括或涂有生物相容的基質(zhì)，該基質(zhì)作為功能性緩釋載體或包含緩釋載體。生物相容的基質(zhì)因此可以為預(yù)期位置或器官內(nèi)植入物上溶解的、熔化的或液化的緩釋載體。替代選擇地，生物相容的基質(zhì)可以為孔中陷入聚合物的預(yù)定多孔材料。當(dāng)在預(yù)期位置植入時，聚合物從孔中擴(kuò)散出來，因此擴(kuò)散速率由孔徑和化學(xué)性能確定。還替代選擇地，生物相容基質(zhì)包含生物可降解的基質(zhì)，憑借其降解釋放本發(fā)明的聚合物。
通過本領(lǐng)域已知的任何方法，基于裝置結(jié)構(gòu)所選擇的性能，可將本發(fā)明的聚合物摻入裝置結(jié)構(gòu)中。例如，聚合物可陷入多孔的基質(zhì)中、膨脹或浸泡在基質(zhì)中、或與基質(zhì)粘附。
非常類似于體內(nèi)的抗微生物活性，本發(fā)明聚合物的抗微生物活性還可用于食品成分和制品的防腐。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供食品防腐劑，其包括有效量的如本文所述的本發(fā)明聚合物。
可以將聚合物摻入食物制品中，以本身或與可食用的載體一起作為其成分的一部分。
本發(fā)明聚合物對微生物膜已經(jīng)顯示具有高度的選擇性親和力，這如同隨后實施例部分所證明。這種屬性是促成聚合物(當(dāng)用作抗微生物劑時)有效和靈驗活性的主要要素之一。當(dāng)聚合物與標(biāo)記試劑偶聯(lián)時，這種膜結(jié)合屬性可進(jìn)一步用于標(biāo)記微生物的菌叢和增殖位置，尤其是在宿主體內(nèi)的微生物生長場所。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供探測致病微生物的成像探針，該成像探針包括如上文定義和描述的聚合物，而聚合物又包括與其連接的至少一種如上文所定義的標(biāo)記試劑。當(dāng)向周圍釋放時，這些具有標(biāo)記試劑與其連接的聚合物，將與微生物細(xì)胞膜結(jié)合并因此使標(biāo)記試劑與微生物細(xì)胞連接。
當(dāng)本文使用時，術(shù)語“發(fā)色團(tuán)”是指化學(xué)部分，當(dāng)其與另外的分子連接時，致使后者染色并因此在應(yīng)用多種分光光度計測量中可見。
短語“熒光化合物”是指在暴露給外源射線期間在特定波長下發(fā)光的化合物。
短語“磷光化合物”是指在沒有可感知的熱或外部刺激如通過磷的慢氧化下發(fā)光的化合物。
重金屬簇例如可為例如電子顯微鏡技術(shù)中用于標(biāo)記的金原子簇。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，一種或多種標(biāo)記試劑可以在任何可取代的位置與聚合物連接，如同上述討論的活性劑的情形。該取代位置的實例為，但沒有限于為，聚合物中任何一個或多個氨基酸殘基的側(cè)鏈、聚合物的任何一個結(jié)合部分、聚合物的任何一個N和C端、和聚合物中任何一個或多個疏水部分殘基。
本發(fā)明的另外目的、優(yōu)點、和新特征，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，在下述實施例的試驗上將成為顯而易見的，但不打算受下述實施例的限制。此外，如上文所描繪和權(quán)利要求部分所要求的本發(fā)明的每個不同的實施方案和方面均可在下述實施例中尋到實驗的支持。
實施例 現(xiàn)按下述實施例與上述說明一起制成參照；以非限制方式舉例說明本發(fā)明。
材料和實驗方法 材料 在其主鏈胺基團(tuán)上具有Fmoc((9H-芴-9-基)甲基碳酸酯)保護(hù)和在其側(cè)鏈胺基團(tuán)上具有Boc(碳酸叔丁酯)保護(hù)的賴氨酸購自AppliedBiosystems和NovaBiochem。
具有Fmoc保護(hù)胺基的ω-氨基脂肪酸例如4-氨基丁酸、8-氨基辛酸和12-氨基月桂酸購自Sigma-Aldrich/NovaBiochem。
所有其它使用的溶劑和試劑購自Sigma-Aldrich/NovaBiochem/Applied Biosystems/J.T.Baker，使用時沒有進(jìn)一步純化。
制備抗微生物聚合物文庫-一般程序 根據(jù)本發(fā)明的聚合物可通過固相法制備，并根據(jù)本領(lǐng)域描述的方法將其純化成色譜均勻性(Feder，R.等.(2000)J.Biol.Chem.275，4230-4238)。簡言之，在全自動的、程序控制的肽合成儀上通過應(yīng)用Fmoc活性酯化學(xué)合成該聚合物(Applied Biosystems 433A)。從該樹脂上分裂后，用30％乙腈水溶液提取該粗制聚合物并純化，以獲得HPLC測定(Alliance Waters)色譜均勻性大于95％的聚合物。
在Cl8柱(Vydak，250mm×4.6或10mm)上使用乙腈比水的線性梯度(每分鐘1％)進(jìn)行HPLC色譜，此兩種溶劑均包含0.1％三氟醋酸。測定純化后的聚合物質(zhì)譜(ZQ Waters)以證實它們的組成，并在-20℃下以凍干粉貯存。進(jìn)行試驗前，用水制備新鮮的溶液，經(jīng)渦旋混合，超聲溶解，離心，然后稀釋在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中。
為了評價每個聚合物的疏水性，在HPLC反相C18柱上用乙腈的線性梯度(每分鐘1％)洗脫聚合物，該聚合物洗脫時乙腈的百分?jǐn)?shù)用來評價疏水性(參見，下表3的“ACN(％)”)。
用于上述合成中的示例性構(gòu)造單位在以下方案1中提出，其包括賴氨酸和具有m個碳原子的ω-氨基脂肪酸(化合物I)。
向根據(jù)常規(guī)肽固相合成實驗方案的樹脂中，分別連續(xù)地加入Fmoc/Boc-保護(hù)的賴氨酸和Fmoc-保護(hù)的化合物I，進(jìn)行了根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物(其包含賴氨酸和化合物I)的合成。 方案1
賴氨酸 化合物I 菌株和樣品制備 使用培養(yǎng)于LB介質(zhì)(10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取液，5克/升NaCl，pH 7.4)中的以下菌株測定抗菌活性大腸桿菌(ATCC 35218)；耐甲氧西林(methicilin)的金黃色葡萄球菌(CI15903)；蠟樣芽胞桿菌(ATCC 11778)；和綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC9027)。
最小抑菌濃度(MIC)的測量 在96-孔板中使用每毫升106的細(xì)菌接種物，通過微稀釋敏感試驗法測定最小抑菌濃度(MICs)。通過在600nm測量光密度并用一套標(biāo)準(zhǔn)值標(biāo)定其細(xì)胞數(shù)。以2倍的系列稀釋法，將一百(100)μl的細(xì)菌混懸液加到100μl的培養(yǎng)基(對照)或100μl包含多種聚合物濃度的培養(yǎng)基中。在37℃孵育期24小時后，通過光密度測量確定增殖抑制。
物理參數(shù)(電荷和疏水性)對抗微生物活性的影響 制備聚合物文庫以嘗試增加電荷和疏水性對抗微生物活性的影響。通過將ω-氨基脂肪酸-賴氨酸結(jié)合物數(shù)目從1至7個遞增，連續(xù)地嘗試電荷。通過增加ω-氨基脂肪酸的碳原子數(shù)目(4、8和12)連續(xù)地嘗試疏水性。如上文所述，測試每個系列的聚合物的抗微生物活性。
細(xì)菌中抗微生物劑的抗藥性發(fā)生 當(dāng)與已知引起抗藥性的經(jīng)典抗生素慶大霉素，四環(huán)素和環(huán)丙沙星(用作耐抗生素菌株的發(fā)生對照)相比時，研究了細(xì)菌對本發(fā)明聚合物抗微生物活性發(fā)生抗藥性的可能性。將指數(shù)生長期的細(xì)菌樣品暴露給抗微生物劑，用于上述的MIC測定。接著孵化過夜，從顯示出近50％生長抑制的孔中采集細(xì)菌，洗滌并稀釋在新鮮的介質(zhì)中，生長過夜，使之接受MIC測定，直到高達(dá)10次反復(fù)。類似地，使用從前代對照孔(培養(yǎng)孔沒有聚合物)中采集的細(xì)菌，將這些次培養(yǎng)物的MIC演化同時與各自的新生代比較。由指定次培養(yǎng)物所獲得的MIC與第一次暴露所獲得的MIC的比率計算每個實驗的MIC相對值。
動力學(xué)研究 在試管中完成動力學(xué)研究，最終體積為1ml，如下將100μl包含在培養(yǎng)基中的細(xì)菌2-4×107菌落形成單位(CFUs)/ml的混懸液加入到0.9ml培養(yǎng)基或包含聚合物多種濃度(0、3和6倍的MIC值)的培養(yǎng)基中。在37℃搖動時暴露給聚合物0、30、60、90、120和360分鐘后，通過將50μl的樣品加入至450μl的鹽水(0.9％NaCl)中，培養(yǎng)物受到系列的10倍稀釋(直到10-6)。使用量滴平板法(3滴，每滴20μl，到LB-瓊脂平板上，如Yaron，S.等.(2003)，Peptides 24，1815-1821所述)測定菌落形成單位(CFUs)。在37℃將平板孵化16-24小時后，計算CFUs。從至少兩次重復(fù)進(jìn)行的獨(dú)立測定中獲得這些實驗的各自統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)。
提高外膜滲透性情況下的抗微生物活性 根據(jù)以下程序，通過用EDTA(乙二胺四醋酸)處理細(xì)菌培養(yǎng)物，提高革蘭陰性菌(即大腸桿菌或綠膿假單胞菌)的外膜滲透性將1MEDTA水溶液(pH＝8.3)稀釋在LB介質(zhì)中，得到4mM濃度，該稀溶液用于溶解聚合物。細(xì)菌在LB介質(zhì)中生長過夜，在96-孔板中將每毫升包含106細(xì)菌的100μl部分加到100μl EDTA培養(yǎng)基或加到包含多種聚合物濃度的EDTA培養(yǎng)基(2倍的系列稀釋法)中。如上所述測定抗革蘭陰性菌的生長抑制。
對血漿蛋白酶的敏感性 通過測定暴露給人血漿后的抗菌活性，評價本發(fā)明聚合物對蛋白水解消化的敏感性，如下37℃下，將250μl的聚合物鹽水溶液(0.9％NaCl)以MIC值16倍的濃度在培養(yǎng)基用50％(v/v)人血漿預(yù)孵化。孵化期3、6、和18小時后，在96-孔板的LB介質(zhì)中，聚合物溶液受到2倍的連續(xù)稀釋。將根據(jù)本發(fā)明的四個示例性聚合物(C12K(NC8K)5NH2、K(NC12K)3NH2、C12KNC12KNH2、和C12KKNC12KNH2)和16-殘基dermaseptin S4衍生物(S416，用作對照的示例性AMP)，在人血漿(50％)中預(yù)孵育不同的時間期限，評價本發(fā)明聚合物對酶裂解的敏感性。此后，如上所述測定抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。類似地，在缺失血漿的培養(yǎng)基條件下(以下實驗結(jié)果部分指的是0小時的預(yù)孵化)也測定了抗菌活性。從至少兩次重復(fù)進(jìn)行的獨(dú)立測定中獲得這些實驗的各自統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)。
溶血測定 憑借磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的人紅細(xì)胞(RBC)，確定聚合物的溶膜(membranolytic)潛在性。將人全血樣品在PBS中以200xg2分鐘離心清洗三次，再以5％血細(xì)胞比容混懸于PBS。將包含2.5×108RBC 50μl部分的混懸液加到包含200μl聚合物溶液(PBS中的2倍系列稀釋液)、單獨(dú)的PBS(用于基線值)、或蒸餾水(用于100％溶血)的試管中。在37℃攪動下孵化3小時后，將樣品離心，通過在405nm測量上清液200μl部分的吸收度作為血色素泄漏的機(jī)能，確定溶血活性。
圓二色性(CD) 用Aviv型號202CD光譜儀(Aviv Associates，Lakewood，NJ)，使用0.01cm直角QS Hellma試管，在25℃(通過熱電Peltier元件控制0.1℃的精確度)下以毫度(millidegrees)測量CD光譜。將聚合物樣品溶解在PBS、20％(v/v)三氟代乙醇/水、或逐步滴加在包含3∶1比例和濃度最高達(dá)2mM的POPC(2-油酰基-1-棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿)和POPG(1-棕櫚酰-2-油?；?sn-甘油-3-磷-rac-(1-甘油))的PBS中，以便獲得脂質(zhì)體。使用每個聚合物已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在100μM的濃度下掃描聚合物的CD光譜作為UV測定。在同樣的條件下測量一種示例性AMP即N端酰化的S4 dermaseptin衍生物N C12K4 S 4(1-14)(Mor，A.等.(1994)，J.Biol.Chem.269(50)31635-41)的CD，并作為參考化合物用于CD研究中。本文表示的CD數(shù)據(jù)代表三次單獨(dú)記錄值的平均數(shù)。
表面等離子共振測定 使用BIAcore 2000生物傳感器系統(tǒng)，通過表面等離子共振(SPR)研究與模型雙分子層膜的結(jié)合。將模仿細(xì)菌質(zhì)膜的包含磷脂的脂質(zhì)體(3∶1比例的POPC∶POPG)固定在傳感器表面，然后將聚合物溶液連續(xù)流動地經(jīng)過該膜。以共振信號作為時間函數(shù)的曲線展示所分析的聚合物與固定磷脂膜之間相互作用的發(fā)展。從分析所形成的曲線計算相互作用的親和力，詳細(xì)如同Gaidukov，L.等.(2003)，Biochemistry 42，12866-12874。簡言之，在5個劑量(0.21、0.42、0.84、1.67、3.35μg)聯(lián)合和解離曲線(結(jié)合率)，計算Kapp(作為結(jié)果的結(jié)合常數(shù))(假定為2步驟模型)。
脂多糖結(jié)合測定 為了探討本發(fā)明聚合物發(fā)揮抗菌活性的機(jī)理，測試了該聚合物對細(xì)菌膜的靶向作用。更具體地，測試了正電荷聚合物對革蘭陰性菌膜上存在的負(fù)電荷脂多糖(LPS)的親合力。
因此，使用光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)BIAcore 2000(BIAcore)，通過SPR技術(shù)進(jìn)行本發(fā)明聚合物對LPS的結(jié)合測定。將于PBS中的50μM聚合物樣品和100μg/ml LPS的混合物在室溫下孵化30分鐘。25℃下，以每分鐘10μl的流速將10μl該混合物注射地通過涂布在Ll傳感器片上的POPC∶POPG(3∶1)雙分子層，進(jìn)行結(jié)合測定。注射不含聚合物樣品的100μg/ml LPS作為LPS與膜結(jié)合的空白實驗，注射50μM的聚合物樣品，以確定沒有LPS時聚合物與膜的結(jié)合。
DNA結(jié)合測定 在1％瓊脂糖膠中的凝膠電泳期間，通過評價其延緩DNA質(zhì)粒遷移的能力，研究了本發(fā)明聚合物與核苷酸的結(jié)合。將200納克DNA質(zhì)粒(pUC19，2683堿基對)與最終體積20μl雙蒸餾水(DDW)中的漸增量的不同聚合物混合，進(jìn)行DNA遲緩實驗。將反應(yīng)混合物在室溫下孵化30分鐘。接著，加入2μl負(fù)載染料(20％Ficoll 400，0.1M EDTA，0.25％溴酚藍(lán)和1％十二烷基硫酸鈉)，將可分量20μl用于1％瓊脂糖凝膠電泳，該1％瓊脂糖凝膠電泳于包含溴乙錠(0.25μg/ml)的TAE緩沖液(0.02M Tris堿，0.01M冰醋酸，0.5mM EDTA，pH＝8.5)中。本實驗中使用的質(zhì)粒通過WizardPlus SV Minipreps DNA PurificationSystem(Promega)分離。
唾液殺微生物測定 通過將新鮮的人唾液與聚合物或IB-367(兩者都溶于pH 5的10mM醋酸鈉緩沖液中，最終濃度100μM)以1∶1的比例混合，研究了本發(fā)明聚合物對抗健康人志愿者唾液中微生物混合物的抗微生物活性。沒有用抗細(xì)菌劑的唾液溶液用作對照。IB-367為正電荷內(nèi)源性抗微生物多肽，已知其具有在體外和體內(nèi)抗人口腔粘膜炎相關(guān)的微生物群活性(Loury，D.等.，1999，Oral Surg Oral Med Oral Pathol OralRadiol Endod 87(5)544-51.)。將各種溶液涂布在LA板上，將涂板的唾液樣品在37℃沒有通氣下孵化過夜。計數(shù)并計算菌落，以確定該藥物的殺微生物的效果。如上所述確定能養(yǎng)活的菌落形成單位(CFU)值。
抗瘧疾測定 通過篩選下文表3中所提出的聚合物部分文庫對培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞的抗瘧疾和溶血活性及其毒性，進(jìn)行了本發(fā)明聚合物的抗瘧疾活性研究。
寄生蟲培養(yǎng)按照Kutner和同事所述[Kutner，S.，Breuer，W.V.，Ginsburg，H.，Aley，S.B.，和Cabantchik，Z.I.(1985)J Cell.Physiol.125，521-527]，使用人紅細(xì)胞(RBC)培養(yǎng)不同菌株的鐮狀瘧原蟲。用山梨醇方法[Lambros，C.J.，和Vanderberg，J.P.(1979)J.Parasitol.65，418-420]同步培養(yǎng)，然后通過Percoll-丙氨酸梯度離心法[Kutner，S.，Breuer，W.V.，Ginsburg，H.，Aley，S.B.，和Cabantchik，Z.I.(1985)J.Cell.Physiol.125，521-527]從培養(yǎng)基中富集受感染的細(xì)胞。
IC50的測定在1％血細(xì)胞比容和2％寄生蟲血癥時，存在漸增濃度的測試聚合物下，培養(yǎng)了環(huán)形階期(ring stage)的同步培養(yǎng)物。孵育18小時后，通過[3H]次黃嘌呤(Hx)攝取(終濃度為2μ Ci/ml)，6小時期間測定寄生蟲成活力并與對照(不含聚合物)比較。使用商品化軟件套Sigmaplot對數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸擬合，確定50％抑制濃度(IC50)。
聚合物的時間和階期依賴性作用已知抗瘧藥在寄生蟲發(fā)育不同的階期產(chǎn)生不同的作用。它們也需要與寄生蟲相互作用的最小時間，以抑制其生長。因此，在24孔板中，1％血細(xì)胞比容，2％寄生蟲血癥板培養(yǎng)基(沒有次黃嘌呤的生長培養(yǎng)基，10mM NaHCO3和7％熱滅活的人血漿)中接種環(huán)形階期培養(yǎng)物。以不同的濃度立刻加入測試聚合物，在6、24和48小時后移開。讓沒有聚合物的培養(yǎng)物發(fā)育成熟至滋養(yǎng)體階期(trophozoite stage)，配用化合物作用6和24小時。從實驗開始的30小時后向所有細(xì)胞每孔加入2μCi Hx，24小時后采集細(xì)胞。
聚合物對培養(yǎng)中的哺乳動物細(xì)胞的影響將MDCK(狗腎細(xì)胞系)上皮細(xì)胞生長融合(約培養(yǎng)3天)。類似的培養(yǎng)物在測試聚合物的不同濃度下生長。此后，加入10μl Alamar藍(lán)，3.5小時后測量熒光。至于陽性對照，在培養(yǎng)開始時向?qū)φ諛悠分屑尤?0μM環(huán)己酰亞胺。
實驗結(jié)果 聚合物文庫的制備 按照上述的一般程序，制備了根據(jù)本發(fā)明聚合物的數(shù)個代表性系列(其大體上包含多個賴氨酸殘基和作為疏水部分的ω氨基脂肪酸殘基和脂肪酸殘基)，并在下表3中提出。
這些示例性的聚合物在本節(jié)中是指根據(jù)下式 T[NCiK]jG 該式中，NCi表示ω氨基脂肪酸殘基(根據(jù)本發(fā)明的示例性疏水部分，在本文所述的通式I中由D1...Dn表示)，由此i表示脂肪酸殘基中的碳原子數(shù)目；K表示賴氨酸殘基(根據(jù)本發(fā)明的示例性氨基酸殘基，在本文所述的通式I中由A1...An表示，所以[NCiK]表示ω氨基脂肪酸-賴氨酸結(jié)合物殘基(在本文所述的通式I中表示為[A1-Z1-D1]...[An-Zn-Dn])；j表示聚合物中特定結(jié)合物的重復(fù)單位的數(shù)目(相應(yīng)于本文所述的通式I中的n)；T和G各自獨(dú)立地表示氫(沒有符號)、賴氨酸殘基(表示為K)、ω氨基脂肪酸殘基(表示為NCi)、脂肪酸殘基(表示為Ci)、ω氨基脂肪酸-賴氨酸結(jié)合物殘基(表示為[NCiK])、芴甲氧羰基殘基(表示為Fmoc)、芐基殘基(表示為Bz)、膽鹽殘基(表示為Ch1)、胺基(通常在C端形成酰胺和表示為NH2)、和游離酸殘基(C端，沒有符號)、醇?xì)埢退鼈兊娜魏谓M合(全部相應(yīng)于本文所述的通式I中的X和Y)。
因此，例如根據(jù)本發(fā)明的一個聚合物，此處是指NC12K(NC8K)7NH2，相應(yīng)于上文所述的通式I的聚合物，其中X為具有12個碳原子的ω氨基脂肪酸(12-氨基月桂酸)與賴氨酸結(jié)合的殘基；n為6；A1...A6各自為賴氨酸殘基；D1...D7全部為具有8個碳原子的ω氨基脂肪酸(8-氨基辛酸)殘基；Z1...Z7和W0-W7全部為肽鍵；和Y為胺。為了清楚，NC12K(NC8K)7NH2的化學(xué)結(jié)構(gòu)在以下方案2中提出方案2
最小抑菌濃度的測量 按照上文所述，測試了各個系列聚合物多種抗微生物活性。所得結(jié)果在下表3中提出，其中 “Q”代表在生理pH時全部分子的電荷(表3中第3欄)； “ACN(％)”代表聚合物被洗脫時HPLC-RP梯度流動相中的乙腈百分?jǐn)?shù)，其相應(yīng)于所評價聚合物的疏水性(表3中第4欄)； “LC50”代表通過人紅細(xì)胞溶血的溶膜潛在性測定實驗，按照上文所述測量，得到的以μM為單位的各個測試聚合物溶膜的濃度(表3中第5欄)； “MIC E.c.”代表按照上文抗菌活性測定中所述一樣測量，以μM為單位的各個測試聚合物對大腸桿菌的最小抑菌濃度(表3中第6欄)； “MIC EDTA E.c.”代表按照上文提高外膜滲透性測定中所述一樣測量，以μM為單位的各個測試聚合物對2mM EDTA存在下大腸桿菌培養(yǎng)的最小抑菌濃度(表3中第7欄)； “MIC P.a.”代表按照上文抗菌活性測定中所述一樣測量，以μM為單位的各個測試聚合物對綠膿假單胞菌的最小抑菌濃度(表3中第8欄)； “MIC MR S.a.”代表按照上文耐抗生素細(xì)菌的抗菌活性測定中所述一樣測量，以μM為單位的各個測試聚合物對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(表3中第9欄)； “MIC B.c.”代表按照上文抗菌活性測定中所述一樣測量，以μM為單位的各個測試聚合物對蠟樣芽胞桿菌的最小抑菌濃度(表3中第10欄)；和 ND表示“沒有測定”。
一些值用±標(biāo)準(zhǔn)離均差表示。
在第84和85個中的“Orn”和“Arg”分別表示鳥氨酸和精氨酸氨基酸殘基。
表3 物理參數(shù)(電荷和疏水性)對抗微生物活性的影響 電荷和疏水性可以看作是分子的不一致的兩個物理特性電荷通過與極性水分子相互作用使化合物在水性介質(zhì)中容易溶解，而疏水性(一般相應(yīng)于非極性的碳?xì)浠衔锊糠值臄?shù)目和長度)妨礙溶解。這些物理特性的最佳化在開發(fā)一般藥物和具體抗微生物劑中至關(guān)重要，因為這些特性影響藥物重要的特點例如在生物系統(tǒng)中和在跨生物系統(tǒng)的膜滲透性和轉(zhuǎn)運(yùn)。
因此，為研究系列增加電荷和疏水性性質(zhì)的影響，制備了聚合物文庫，測量了如下抗微生物活性抗兩種革蘭陰性菌大腸桿菌(結(jié)果表示在上文表3中第6欄)和綠膿假單胞菌(結(jié)果表示在上文表3中第8欄)；和抗兩種革蘭陽性菌耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(結(jié)果表示在上文表3中第9欄)和蠟樣芽胞桿菌(結(jié)果表示在上文表3中第10欄)。
通過制備就賴氨酸殘基數(shù)目而論具有系列延長鏈的聚合物，實現(xiàn)系列增加正電荷。通過制備具有系列增加脂肪酸殘基(作為代表性疏水部分)的數(shù)目和/或具有系列增加各個脂肪酸殘基中的碳原子數(shù)目的聚合物，實現(xiàn)系列增加疏水性。通過制備具有系列增加賴氨酸-氨基脂肪酸結(jié)合物數(shù)目的聚合物，實現(xiàn)系列增加正電荷和疏水性。
如表3中所示，發(fā)現(xiàn)了通過從4至12個，經(jīng)由8個碳原子地增加脂肪酸殘基中的碳原子數(shù)增加聚合物疏水性，會影響聚合物的抗微生物活性。將其中重復(fù)疏水部分為4-氨基丁酸的聚合物系列(參見，表3中第1-24條)與其中重復(fù)疏水部分為8-氨基辛酸的系列(參見，表3中第25-53條)和與其中重復(fù)疏水部分為12-氨基月桂酸的系列(參見，表3中第54-95條)比較。結(jié)果(表3中給出的)表明其中重復(fù)疏水部分為4-氨基丁酸(參見，表3中第1-14條)和8-氨基辛酸(參見，表3中第25-53條)的聚合物在一直到最高試驗濃度50μM時一般沒有出現(xiàn)顯著的抗微生物活性。序列中沒有12-氨基月桂酸殘基但在較低濃度出現(xiàn)顯著的抗微生物活性的聚合物僅有C8K(NC8K)5NH2、C8K(NC8K)6和C8K(NC8K)7NH2(參見，表3中第6欄的第29-31條)，然而，包含一個或多個更多疏水性的12-氨基月桂酸殘基聚合物，(參見，表3中第54-95條)，在像1.6μM一樣低的濃度下出現(xiàn)了顯著的活性。
以聚合物被洗脫時HPLC流動相的乙腈百分?jǐn)?shù)的方式評價的聚合物疏水性的影響，進(jìn)一步證明聚合物的這種性質(zhì)和抗微生物活性之間的相互關(guān)系。如表3第4欄中所給出的數(shù)據(jù)所示，對任何一種試驗細(xì)菌均顯示顯著水平的抗微生物活性的所有聚合物都在乙腈濃度高于36％時被洗脫，憑此，在乙腈濃度低于36％時被洗脫的聚合物沒有一個顯示這樣的活性。
圖1表示在所進(jìn)行的四種測定的任何一種中顯示出顯著的微生物活性(MIC值小于50μM)的聚合物分布。如圖1中清楚看到的，對一種或多種試驗細(xì)菌的具有抗微生物活性的聚合物只顯示于在36％和以上的乙腈洗脫濃度中，此外，發(fā)現(xiàn)對抗所有試驗細(xì)菌有活性的聚合物在51％和以上乙腈濃度時洗脫。
如表3中進(jìn)一步所示，發(fā)現(xiàn)了通過增加聚合物中賴氨酸殘基的數(shù)目增加聚合物的正電荷，只邊緣地影響聚合物的抗微生物活性。因此，測試了每個系列中具有凈電荷+1至+9的聚合物的抗微生物活性。結(jié)果(表3中給出的)表明，例如具有最高凈正電荷+9的大多數(shù)聚合物，即K(NC4K)7NH2、NC12K(NC4K)7NH2、K(NC8K)7NH2、NC12K(NC8K)7NH2、K(NC12K)7NH2、(NC12K)8NH2，(分別參見，表3中第14，24，38，52，64和71條)，沒有顯示顯著的活性，唯有一NC12K(NC8K)7NH2(參見，表3中第52條)顯示顯著的活性。
下表4以聚合物凈正電荷和其抗微生物活性的作用方式，提出這些實驗中所獲得結(jié)果的概要。表4的第2排表示9列(bins)中的聚合物數(shù)，其中每列代表從+9開始至+1的凈正電荷。表4的第3排表示在電荷列中所測量的活性測定總數(shù)，就是，該列中聚合物數(shù)乘以上述的四個細(xì)菌測定。表4的第4排表示各自列中發(fā)現(xiàn)有抗四種細(xì)菌的任何一種的活性聚合物數(shù)。表4的第5排表示根據(jù)電荷列中測量的測定總數(shù)的活性聚合物百分?jǐn)?shù)。如表4中所見，(例如第4排)，倘若發(fā)現(xiàn)了聚合物的凈正電荷和其抗微生物活性之間的任何相互關(guān)系，那也只有一點點相關(guān)。這些結(jié)果顯示似乎影響測試聚合物的抗微生物活性的唯一特征為大于+1的凈正電荷。 表4 圖2表示在上述提及的四種測定的任何一種中顯示出顯著的微生物活性(MIC值小于50μM)的根據(jù)本發(fā)明的聚合物分布。如圖2中清楚看到的，對四種細(xì)菌的任何一種顯示抗微生物活性聚合物分散在除+1電荷以外的整個電荷值范圍內(nèi)，因此證明聚合物的凈正電荷和其抗微生物活性之間缺乏相關(guān)性。
細(xì)菌中抗微生物劑的抗藥性發(fā)生 如上文實驗方法部分所述，按照細(xì)菌對根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物的多樣暴露，經(jīng)測量MIC水平，測試了對本發(fā)明聚合物發(fā)生抗藥性的可能性。在這些實驗中，測試的聚合物為K(NC12K)3NH2、C12K(NC8K)5NH2和C12KKNC12KNH2，由此比較了大腸桿菌對K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2的抗藥性發(fā)生與對三類經(jīng)典抗生素慶大霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星的抗藥性發(fā)生，和比較了耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌對C12KKNC12KNH2的抗藥性發(fā)生與對兩類經(jīng)典抗生素利福平和四環(huán)素的抗藥性發(fā)生。
這些實驗中獲得的數(shù)據(jù)展示在圖5a和5b中。圖5a提出從K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2獲得的數(shù)據(jù)。圖5b提出從C12KKNC12KNH2獲得的數(shù)據(jù)。
如圖5a中清楚看到的，K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2抗大腸桿菌的MIC相對值在隨著初始暴露后的10個連續(xù)次培養(yǎng)代中維持穩(wěn)定。鮮明的對比，在同樣時間期間，對照抗生素所測試的MIC值基本上增加，反映耐抗生素細(xì)菌出現(xiàn)。因此，在第十代，四環(huán)素和慶大霉素的MIC值增加至4倍，而環(huán)丙沙星增加至16倍以上。這些結(jié)果證明將細(xì)菌暴露給抗微生物的本發(fā)明聚合物不會導(dǎo)致抗藥性發(fā)生。
如圖5b中清楚看到的，C12KKNC12KNH2抗耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的MIC相對值在隨著初始暴露后的15個連續(xù)次培養(yǎng)代中維持穩(wěn)定。鮮明的對比，在同樣時間期間，對照抗生素所測試的MIC值基本上增加，反映耐抗生素細(xì)菌出現(xiàn)。因此，在第十代，利福平的MIC值增加230倍以上而環(huán)丙沙星以大，和四環(huán)素增加至4倍。這些結(jié)果證明將細(xì)菌暴露給抗微生物的本發(fā)明聚合物不會導(dǎo)致抗藥性發(fā)生。
在交叉抗藥性實驗中進(jìn)一步評價了隨著暴露給本發(fā)明聚合物后的抗微生物劑的抗藥性發(fā)生，其中耐甲氧西林菌株的金黃色葡萄球菌暴露給本發(fā)明的示例性聚合物。該實驗所獲得的結(jié)果存在于上文表3中“MIC MR S.a.”欄下，清楚地證明了本發(fā)明聚合物對耐抗生素細(xì)菌持續(xù)的抗微生物活性，尤其為實例C12(KNC12K)2NH2、C12KKNC12KNH2、FmocK(NC12K)2、C12K(KNC12K)2NH2、C12OrnNC12OrnNH2、C12ArgNC12ArgNH2、C12KNC12KNH2、C12K(NC12K)2、C12K(NC8K)4NH2和C12KK(NC8K)4NH2(分別參見，表3中第79，78，95，80，84，85，54，87，42和53條)。
時間間隔的抗微生物活性的動力學(xué)研究 如同上述方法部分，以相應(yīng)3和6倍的MIC值的濃度，測試了本發(fā)明代表性聚合物C12K(NC8K)5NH2殺菌活性的動力學(xué)速度。這些結(jié)果存在于圖3中，清楚地反映聚合物的抗菌活性。如圖3中所示，在6小時內(nèi)暴露給3倍MIC的濃度聚合物和在2小時內(nèi)暴露給6倍MIC的濃度聚合物，存活的細(xì)菌數(shù)減少幾乎七個對數(shù)單位。
這些驚人的結(jié)果以有效的藥代動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)一步證明本發(fā)明聚合物的抗微生物效力。
提高外膜滲透性情況下的抗微生物活性 按照向測定緩沖液中添加陽離子螯合劑EDTA(其針對提高革蘭陰性菌例如大腸桿菌外膜滲透性)所獲得的結(jié)果列于上表3中標(biāo)題“MICEDTA E.c”欄下。這些結(jié)果清楚地顯示在EDTA存在下聚合物的活性譜不同于沒有EDTA時所獲得的結(jié)果(上表3中標(biāo)題“MIC E.c”欄下)。因此，聚合物如K(NC8K)7NH2、NC12K(NC8K)4NH2、NC12K(NC8K)5NH2、C12K(NC12K)2NH2、K(NC12K)5NH2、K(NC12K)6NH2、K(NC12K)7NH2、(NC12K)4NH2、(NC12K)5NH2、(NC12K)6NH2、(NC12K)7NH2和(NC12K)8NH2，這些在沒有E DTA存在下顯示較小的或沒有抗微生物活性，在E DTA存在下變得高達(dá)50倍以上的更多活性(分別參見，表3中第38，49，50，55，62，63，64，67，68，69，70和71條)。其它的聚合物，例如K(NC12K)4NH2、C8K(NC8K)5NH2、C12K(NC8K)4NH2、NC12K(NC8K)6NH2和(NC12K)3NH2，這些在沒有EDTA存在下顯示僅有邊緣的抗微生物活性，在E DTA存在下各自變?yōu)?1倍至4倍之間的更多活性(分別參見，表3中第61，29，42，51和66條)。
這些結(jié)果說明抗微生物劑的膜滲透性和其功效之間的緊密相關(guān)性，和進(jìn)一步說明本發(fā)明聚合物在抗微生物活性上，其正電荷和疏水性質(zhì)之間的合成關(guān)系和微妙的平衡。
對血漿蛋白酶的敏感性的測定結(jié)果 通過在人血漿(50％)中多種時間期內(nèi)，預(yù)孵化根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物C12K(NC8K)5NH2、K(NC12K)3NH2、C12KNC12KNH2、和C12KKNC12KNH2、和示例性對照AMP 16殘基dermaseptin S4衍生物(S416)，此后測定它們對抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性，評價本發(fā)明聚合物對酶裂解的敏感性。從至少兩次重復(fù)進(jìn)行的獨(dú)立實驗中獲得統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)。
這些結(jié)果列于下文表5中，其中“MIC(E.c.)C12K(NC8K)5NH2(μM)”為測量大腸桿菌時C12K(NC8K)5NH2以μM為單位的最小抑菌濃度；“MIC(E.c.)K(NC12K)3NH2(μM)”為測量大腸桿菌時K(NC12K)3NH2以μM為單位的最小抑菌濃度；“MIC(E.c.)S416(μM)”為測量大腸桿菌時S416(用作對照AMP的示例性dermaseptin)以μM為單位的最小抑菌濃度；“MIC S.a.C12KNC12KNH2(μM)”為測量金黃色葡萄球菌時C12KNC12KNH2以μM為單位的最小抑菌濃度；和“MIC(S.a.)C12KKNC12KNH2(μM)”為測量金黃色葡萄球菌時C12KKNC12KNH2以μM為單位的最小抑菌濃度。
表5 如表5中所示，當(dāng)對照AMP S416暴露給人血漿完全地失去活性時，本發(fā)明的聚合物維持它們的活性，因此，當(dāng)與高活性但不穩(wěn)定的AMPs相比時，清楚地證明了根據(jù)本發(fā)明聚合物具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性。更特別地，如表5中所示，dermaseptin S416在暴露給血清酶3小時后沒有顯示可測量的MIC，甚至在比MIC值多于16倍高的濃度(大于50μM)時，這表明該肽可能由于酶蛋白水解作用滅活。
以鮮明的對比，本發(fā)明聚合物對酶降解顯示出延長抵抗力。如表5中進(jìn)一步所示，短聚合物例如C12KNC12KNH2和C12KKNC12KNH2的活性在暴露給血漿酶6小時后只減少只2倍，而更長的聚合物例如K(NC12K)3NH2和C12K(NC8K)5NH2甚至孵化18小時后也沒有顯示任何程度的失活。
溶血測定 如上文所述，測定本發(fā)明聚合物對人紅細(xì)胞(紅血球，RBC)毒性作用。這些結(jié)果列于表3中標(biāo)題“LC50”欄下，以引起紅血球在磷酸鹽緩沖液(PBS)中50％(LC50)溶解的溶解濃度的表示。
如表3中所示，顯示高抗微生物活性的聚合物例如C12K(NC8K)7NH2、C8(KNC12K)2NH2、C8K(KNC12K)2NH2、NC12K(KNC12K)2NH2、C12K(NC8K)5NH2、C12K(NC8K)6NH2、NC12(KNC12K)2NH2、C12KK(NC8K)4NH2、和K(NC12K)3NH2(分別參見表3中第45，76，77，83，43，44，82，53和60條)，顯示低的溶血活性。如表3中進(jìn)一步所示，特別地發(fā)現(xiàn)了包括與其N端結(jié)合的多種脂肪酸部分和/或相對大量數(shù)目的賴氨酸的聚合物，隨同低的溶血活性一起顯示有效的抗菌活性。這些結(jié)果清楚地證明本發(fā)明聚合物對人血細(xì)胞的低毒性。
圓二色性(CD) 如上文實驗方法部分所述，通過在多種介質(zhì)中的圓二色性(CD)測量，研究了根據(jù)本發(fā)明所選的聚合物的二級結(jié)構(gòu)。圖4中給出根據(jù)本發(fā)明的示例性抗微生物聚合物C12K(NC8K)5NH2和C12K(NC8K)7NH2，和示例性dermaseptin衍生物NC12K4S4(1-14)的CD圖形。所給出的數(shù)據(jù)代表三次單獨(dú)記錄值的平均數(shù)。
如圖4中所示，本發(fā)明聚合物的CD光譜顯示最小近200nm，指示為隨機(jī)結(jié)構(gòu)(random structure)。在存在和缺失脂質(zhì)體下所進(jìn)行的測定中，觀察同樣的CD光譜。對照dermaseptin NC12K4S4(1-14)的CD光譜顯示α-螺旋二級結(jié)構(gòu)的一般光譜特征。在20％三氟代乙醇/水中觀察相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)沒有展示)。
表面等離子共振測定 如上文方法部分所述，使用表面等離子共振(SPR)測量，研究了根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物與膜結(jié)合的性質(zhì)。
所得到的數(shù)據(jù)表明根據(jù)本發(fā)明的聚合物顯示對模擬細(xì)菌質(zhì)膜的模型膜的高親和結(jié)合力，其Kapp值為104至107/M-1)。圖6，例如表示由C12K(NC8K)5NH2所得到的數(shù)據(jù)，證明根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物對模型膜的高親和結(jié)合力(Kapp值為9.96×104M-1。
根據(jù)本發(fā)明另外的示例性抗微生物聚合物，K(NC12K)3NH2顯示甚至更高親和結(jié)合力(Kapp值為6.3×105M-1，數(shù)據(jù)沒有顯示)。
這些結(jié)果證實本發(fā)明聚合物對致病微生物膜的親和力。
脂多糖結(jié)合測定 如上文方法部分所述，測量了根據(jù)本發(fā)明的正電荷聚合物對革蘭陰性菌膜上存在的負(fù)電荷脂多糖(LPS)的親合力。圖8中，如同這些測定中的測量，表示根據(jù)本發(fā)明的七個示例性聚合物KNC8KNH2、K(NC8K)2NH2、K(NC8K)3NH2、K(NC8K)6NH2、KNC12KNH2、K(NC12K)2NH2、和K(NC12K)3NH2對用LPS孵化前和后的脂質(zhì)體膜的最大結(jié)合水平。
如圖8中所示，聚合物對膜的親合力受到聚合物長度的影響。因此，例如K(NC8K)6NH2的親合力高于KNC8KNH2的親合力，和發(fā)現(xiàn)了K(NC12K)3NH2的親合力高于KNC12KNH2的親合力。
如圖8中進(jìn)一步所示，觀察到聚合物的長度和其對LPS親合力之間的同樣的關(guān)系。因此，例如聚合物K(NC8K)6NH2和K(NC12K)3NH2各自對用LPS孵化后的脂質(zhì)體膜顯示出接近于2倍減少的親和力，表明孵化時期內(nèi)聚合物與LPS的結(jié)合，干擾了其與膜性脂質(zhì)體的結(jié)合。
這些結(jié)果提供進(jìn)一步支持了涉及與LPS強(qiáng)相互作用的聚合物的作用機(jī)理，其促進(jìn)對抗細(xì)菌膜的破壞作用并因此減少內(nèi)毒素血癥的發(fā)生風(fēng)險。
DNA結(jié)合測定 在1％瓊脂糖膠中的凝膠電泳期間通過測定其延緩DNA質(zhì)粒遷移的能力，研究了根據(jù)本發(fā)明的示例性聚合物對核苷酸的結(jié)合性質(zhì)。
所得到的結(jié)果顯示根據(jù)本發(fā)明的聚合物以劑量依賴性方式延緩多種質(zhì)粒(例如，pUC19，pGL3 Luciferase Reporter Vector(Promega))的遷移。圖7中表示在本發(fā)明的三個示例性聚合物C12KKNC12KNH2、K(NC4K)7NH2和C12K(NC8K)5NH2缺失和存在下用質(zhì)粒pUC19獲得的代表性結(jié)果(注解質(zhì)粒從細(xì)菌培養(yǎng)物中分離導(dǎo)致三個主光帶和數(shù)個次光帶，如在最左邊的凝膠紫外像的槽中所見)。在最短的測試聚合物C12KKNC12KNH2存在下明顯的劑量依賴性行為是顯而易見的。更長的測試聚合物K(NC4K)7NH2和C12K(NC8K)5NH2進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了劑量依賴性行為。因此，在C12KKNC12KNH2的最低劑量(聚合物與DNA比例為1∶1)下，超螺旋的質(zhì)粒DNA光帶消失，而其它光帶顯示輪廓不清的圖像。這些結(jié)果提示本發(fā)明聚合物對超螺旋DNA較高的抑制效果。增加聚合物的劑量導(dǎo)致增強(qiáng)的效果，以致遲緩效果擴(kuò)展到所有DNA種類。
此外，發(fā)現(xiàn)了多種聚合物-DNA復(fù)合物在暴露給DNA酶消化酶或肽酶消化酶后保持完整。這些發(fā)現(xiàn)揭示本發(fā)明聚合物和DNA分子之間的緊密結(jié)合，顯示聚合物對DNA分子施加的和反之亦然的相互屏蔽。
唾液殺微生物測定 如上所述，研究了本發(fā)明的示例性聚合物C8K8對抗人唾液中的微生物的抗微生物活性。圖9表示本研究得到的結(jié)果，其根據(jù)每ml的CFU對數(shù)單位作為樣品孵化時間的函數(shù)，該樣品用載體緩沖液(對照)、IB-367(已知活性的抗微生物劑對照)和C8K8。這些結(jié)果表示在對照的未治療組中，唾液微生物沒有任何治療，持續(xù)存在并增生，對照的處理過的唾液微生物的生長受到抑制但在30分鐘后重新開始增生；由此用根據(jù)本發(fā)明的聚合物治療過的唾液微生物的生長受到不能恢復(fù)的抑制。
抗瘧疾測定 測試了根據(jù)本發(fā)明的一組聚合物對寄生蟲生長和哺乳動物細(xì)胞的抗瘧的效果。獲得的結(jié)果表示在下表6中，其中 “寄生蟲的IC50(μM)”代表按照上文所述一樣的測量，以μM為單位的測試聚合物濃度，該濃度要求50％的抑制引起瘧疾的寄生蟲的生長(表6中第3欄)； “MDCK的IC50(μM)”代表按照上文所述一樣的測量，以μM為單位的測試聚合物濃度，該濃度要求50％的抑制MDCK細(xì)胞的生長(表6中第3欄)；和 “IC50比率”代表MDCK的IC50對寄生蟲的IC50比率，指示聚合物對寄生蟲膜的特異性超過對哺乳動物細(xì)胞的特異性。 表6 如表6所示，一些聚合物顯示出非常高的抗瘧原蟲活性，具有微克分子以下(sub-micromolar)范圍的IC50，如表示寄生蟲的IC50的欄中所示(μM)(參見上表6中D和E條)。此系列顯現(xiàn)出來的構(gòu)效關(guān)系結(jié)論為鏈的延長增加抗瘧活性(減少IC50)。在賴氨酸的N端存在烷基部分，常常增加抗瘧活性(參見上表6中G和A條、H和C條、和I和E條)。至于一些聚合物，氨基基團(tuán)進(jìn)一步增加活性(參見上表6中C和D條)，但這種表現(xiàn)不一定一致(參見上表6中A和B條、和E和條F)。
本發(fā)明聚合物對MDCK細(xì)胞的效果有類似的一致性。在賴氨酸的N端添加烷基導(dǎo)致減少活性(參見上表6中G和A條、H和C條、和I和E條)。氨基基團(tuán)部分通常導(dǎo)致減少活性(參見上表6中A和B條、和C和D條)，但最長的聚合物觀察到相反的效果(參見上表6中E和條F)。
IC50的比率基本上等同治療比率。因此上表6中D和E條顯示根據(jù)本發(fā)明的治療最有效的聚合物。
用初級培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞(CF)和HepG2變異細(xì)胞獲得相似的結(jié)果(結(jié)果沒有展示)。
為了進(jìn)一步研究關(guān)于聚合物的長度和疏水部分殘基長度的構(gòu)效關(guān)系，測試另一個系列的聚合物的抗瘧活性。
如下表7中所示，其中“IC50(μM)”代表以μM為單位的測試聚合物濃度，該濃度要求50％的抑制引起瘧疾的寄生蟲的生長，如上文所述一樣測量(表7中第3欄)，該結(jié)果指示添加辛酸(C8)至賴氨酸殘基N端相當(dāng)大地增加抗瘧效能(最高達(dá)67倍)，但是當(dāng)鏈長增長時，這種增幅減少。用月桂酸(C12)取代C8導(dǎo)致進(jìn)一步增加抗瘧效能(最高達(dá)20倍)，而在該端用ω氨基月桂酸(NC12)取代大量地恢復(fù)該效能。
在C12K(NC8K)nNH2組中最活性的聚合物之間，抗瘧效能隨著聚合物長度長度而減少(參見，下表7中第15-21條)。至于非?；?在N端)基團(tuán)K(NC8K)nNH2(參見，下表7中第1-7條)，盡管它們顯示整體較低的活性，觀察到相反的趨勢。至于其它的組觀察不到這樣一致趨勢。
該系列的聚合物在至少比各自IC50值2倍高的濃度下，沒有一個使受染的RBC溶解(數(shù)據(jù)沒有展示)。
表7 通過在環(huán)和滋養(yǎng)體階期暴露寄生蟲培養(yǎng)物給多種時間長度和不同的聚合物濃度，測試了聚合物C12K(NC12K)3NH2的抗瘧效果(參見上表6中的E條)，除去該聚合物并在48小時后使用次黃嘌呤摻入試驗，測試了受到不同處置的所有培養(yǎng)物的寄生蟲成活力。
計算每個處置的IC50的耐氯喹FCR3菌株對氯喹敏感NF54菌株，該結(jié)果展示在圖10中。如10中所見，環(huán)形階期比滋養(yǎng)體階期對聚合物更敏感，滋養(yǎng)體階期中發(fā)揮抑制作用也需要化更長的時間。似乎在其IC50值48小時的累積效果也比暴露更短時間所觀察的那些更低。
在不同階期將寄生蟲培養(yǎng)物暴露給C12KNC8KNH2(參見上表7中第15條)的時間對寄生蟲成活的效果展示在圖11中。如圖11中所見，結(jié)果表明環(huán)和滋養(yǎng)體階期對C12KNC8KNH2幾乎是相同的敏感，然而，在環(huán)形階期為了發(fā)揮完全的抑制活性，要求24小時周期，至于滋養(yǎng)體階期要求更多的時間周期。
可以理解本發(fā)明的某些特征(為了清楚，在單獨(dú)實施方案的上下文中描述它們)，也可以在單一實施方案中將它們組合提供。相反地，本發(fā)明的多種特征(為了簡潔，在單一實施方案的上下文中描述它們)，也可以分別地或?qū)⑺鼈円匀魏芜m當(dāng)?shù)淖咏M合體(subcombination)提供。
盡管本發(fā)明結(jié)合其具體的實施方案描述，顯然地，許多替代物、變體和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。因此，打算包括所有這樣的替代物、變體和變化，這些落在所附的權(quán)利要求書的精神和概況的范圍內(nèi)。
本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請書，在此將其全部內(nèi)容作為參考并入本說明書，達(dá)到如每個個體出版物、專利或?qū)＠暾垥貏e地和個別地指出在此引入作為參考的相同程度。此外，本說明書中任何參考的引文或證明不應(yīng)該解釋為承認(rèn)這樣的參考對本發(fā)明是可獲得的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1.包含多個氨基酸殘基和至少一個疏水部分殘基的聚合物，其中所述至少一個疏水部分殘基中的至少一個與所述多個氨基酸殘基中的至少兩個氨基酸殘基，經(jīng)由所述至少兩個氨基酸殘基中的一個氨基酸殘基的N-α和經(jīng)由另一個氨基酸殘基的C-α，以共價鍵連接。
2.權(quán)利要求1的聚合物，具有抗微生物活性。
3.權(quán)利要求2的聚合物，能夠有選擇地破壞致病微生物的至少一部分細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的聚合物，其中所述的致病微生物選自原核生物、真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物、醇母、真菌、藻類、原生生物和寄生蟲。
5.權(quán)利要求1的聚合物，包含至少兩個疏水部分殘基，其中所述至少兩個疏水部分殘基中的至少一個在所述多個氨基酸殘基的N端與氨基酸殘基的N-α和/或在所述多個氨基酸殘基的C端與氨基酸殘基的C-α連接。
6.權(quán)利要求1的聚合物，包含至少兩個疏水部分殘基，其中所述至少兩個疏水部分殘基中的至少一個與所述多個氨基酸殘基的氨基酸殘基的側(cè)鏈連接。
7.權(quán)利要求1的聚合物，其中所述的多個氨基酸殘基包括至少一個正電荷氨基酸殘基。
8.權(quán)利要求1的聚合物，其中所述的至少一個疏水部分殘基與所述至少兩個氨基酸殘基中的至少一個經(jīng)由肽鍵連接。
9.權(quán)利要求1的聚合物，其中所述的至少一個疏水部分殘基與所述至少兩個氨基酸殘基中的每個經(jīng)由肽鍵連接。
10.權(quán)利要求5的聚合物，其中所述的至少一個疏水部分殘基與所述氨基酸殘基的所述N-α經(jīng)由肽鍵連接。
11.權(quán)利要求5的聚合物，其中所述的至少一個疏水部分殘基與所述氨基酸殘基的所述C-α經(jīng)由肽鍵連接。
12.權(quán)利要求9的聚合物，其中所述的至少一個疏水部分在其一個末端具有羧基基團(tuán)和在其另一個末端具有胺基團(tuán)。
13.權(quán)利要求1的聚合物，其中所述的多個氨基酸殘基包括2至50個氨基酸殘基。
14.權(quán)利要求7的聚合物，其中所述至少一個正電荷氨基酸殘基選自組氨酸殘基、賴氨酸殘基、鳥氨酸殘基和精氨酸殘基。
15.權(quán)利要求1的聚合物，包括1至50個疏水部分殘基。
16.權(quán)利要求1的聚合物，其中所述的疏水部分殘基包括至少一個烴鏈。
17.權(quán)利要求1的聚合物，其中所述的疏水部分殘基包括至少一個脂肪酸殘基。
18.權(quán)利要求17的聚合物，其中所述的至少一個脂肪酸殘基選自未分支的飽和脂肪酸殘基、分支的飽和脂肪酸殘基、未分支的不飽和脂肪酸殘基、分支的不飽和脂肪酸殘基和它們的任何組合。
19.權(quán)利要求17的聚合物，其中所述的脂肪酸殘基選自丁酸殘基、辛酸殘基和月桂酸殘基。
20.權(quán)利要求12的聚合物，其中所述的至少一個疏水部分是ω氨基脂肪酸殘基。
21.權(quán)利要求20的聚合物，其中所述的疏水部分選自4-氨基丁酸、6-氨基已酸、8-氨基辛酸、10-氨基癸酸、12-氨基月桂酸、14-氨基肉豆蔻酸、16-氨基棕櫚酸、18-氨基硬脂酸、18-氨基油酸、16-氨基棕櫚油酸、18-氨基亞油酸、18-氨基亞麻酸和20-氨基花生四烯酸。
22.權(quán)利要求20的聚合物，其中所述的疏水部分選自4-氨基丁酸、8-氨基辛酸和12-氨基月桂酸。
23.權(quán)利要求7的聚合物，其中所述的多個氨基酸殘基基本上由正電荷氨基酸殘基組成。
24.權(quán)利要求23的聚合物，其中所述正電荷氨基酸殘基選自賴氨酸殘基、組氨酸殘基、鳥氨酸殘基、精氨酸殘基和它們的組合。
25.權(quán)利要求1的聚合物，進(jìn)一步包括至少一種與其連接的活性劑。
26.權(quán)利要求25的聚合物，其中所述的至少一種活性劑為標(biāo)記試劑。
27.權(quán)利要求26的聚合物，其中所述的標(biāo)記試劑選自熒光試劑、放射性試劑、磁性試劑、發(fā)色團(tuán)、磷光性試劑和重金屬簇。
28.權(quán)利要求25的聚合物，其中所述的至少一種活性劑包括至少一種治療活性劑。
29.權(quán)利要求28的聚合物，其中所述的至少一種治療活性劑選自激動劑殘基、氨基酸殘基、止痛劑殘基、拮抗劑殘基、抗生素殘基、抗體殘基、抗抑郁劑、抗原殘基、抗組胺殘基、抗高血壓劑、抗炎藥物殘基、抗代謝劑殘基、抗微生物劑殘基、抗氧化劑殘基、抗增殖藥物殘基、反義殘基、化療藥物殘基、輔助因子殘基、細(xì)胞因子殘基、藥物殘基、酶殘基、生長因子殘基、肝素殘基、激素殘基、免疫球蛋白殘基、抑制劑殘基、配體殘基、核苷酸殘基、寡聚核苷酸殘基、肽殘基、磷脂殘基、前列腺素殘基、蛋白質(zhì)殘基、毒素殘基、維生素殘基和它們的任何組合。
30.權(quán)利要求25的聚合物，能夠?qū)⒅辽僖环N活性劑釋放給至少一部分的致病微生物細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的聚合物，其中所述的致病微生物選自原核生物、真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物、醇母、真菌、藻類、原生生物和寄生蟲。
32.權(quán)利要求30的聚合物，其中所述的至少一種活性劑為標(biāo)記試劑。
33.權(quán)利要求30的聚合物，其中所述的至少一種活性劑包括至少一種治療活性劑。
34.具有通式I的聚合物
X-W0-[A1-Z1-D1]-W1-[A2-Z2-D2]-W2-...[An-Zn-Dn]-Wn-Y
式I
其中
n為2至50的整數(shù)；
A1，A2，...，An各自獨(dú)立地為氨基酸殘基；
D1，D2，...，Dn各自獨(dú)立地為疏水部分殘基或缺失，條件是所述的D1，D2，...，Dn中至少一個為所述的疏水部分殘基；
Z1，Z2，...，Zn和W0，W1，W2，...，Wn各自獨(dú)立地為連接氨基酸殘基與疏水部分殘基的連接部分，或缺失；
X和Y各自獨(dú)立地為氫、氨基酸殘基、疏水部分殘基或具有所述的通式I。
35.權(quán)利要求34的聚合物，具有抗微生物活性。
36.權(quán)利要求35的聚合物，能夠有選擇地破壞致病微生物的至少一部分細(xì)胞。
37.權(quán)利要求36的聚合物，其中所述的致病微生物選自原核生物、真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物、醇母、真菌、藻類、原生生物和寄生蟲。
38.權(quán)利要求34的聚合物，其中至少一個所述的氨基酸殘基為正電荷氨基酸殘基。
39.權(quán)利要求38的聚合物，其中所述的正電荷氨基酸殘基選自組氨酸殘基、賴氨酸殘基、鳥氨酸殘基和精氨酸殘基。
40.權(quán)利要求38的聚合物，其中每個所述的氨基酸殘基為正電荷氨基酸殘基。
41.權(quán)利要求40的聚合物，其中所述的正電荷氨基酸殘基選自組氨酸殘基、賴氨酸殘基、鳥氨酸殘基和精氨酸殘基。
42.權(quán)利要求34的聚合物，其中X為疏水部分殘基。
43.權(quán)利要求34的聚合物，其中Y為疏水部分殘基。
44.權(quán)利要求34的聚合物，其中每個X和Y為疏水部分殘基。
45.權(quán)利要求34的聚合物，其中至少一個所述的氨基酸殘基具有與其側(cè)鏈連接的疏水部分殘基。
46.權(quán)利要求34的聚合物，其中所述的W0，W1，W2，...，Wn和所述的Z1，Z2，...，Zn中至少一個為肽鍵。
47.權(quán)利要求34的聚合物，其中每個所述的W0，W1，W2，...，Wn和所述的Z1，Z2，...，Zn均為肽鍵。
48.權(quán)利要求34的聚合物，其中所述的D1，D2，...，Dn中至少一個為ω氨基脂肪酸殘基。
49.權(quán)利要求34的聚合物，其中至少一個所述的疏水部分殘基包括至少一個烴鏈。
50.權(quán)利要求34的聚合物，其中至少一個所述的疏水部分殘基包括至少一個脂肪酸殘基。
51.權(quán)利要求50的聚合物，其中所述的至少一個脂肪酸殘基選自丁酸殘基、辛酸殘基和月桂酸殘基。
52.權(quán)利要求48的聚合物，其中所述的至少一個ω氨基脂肪酸殘基選自4-氨基丁酸、6-氨基已酸、8-氨基辛酸、10-氨基癸酸、12-氨基月桂酸、14-氨基肉豆蔻酸、16-氨基棕櫚酸、18-氨基硬脂酸、18-氨基油酸、16-氨基棕櫚油酸、18-氨基亞油酸、18-氨基亞麻酸和20-氨基花生四烯酸。
53.權(quán)利要求34的聚合物，進(jìn)一步包括至少一種與其連接的活性劑。
54.權(quán)利要求53的聚合物，其中所述的至少一種活性劑為標(biāo)記試劑。
55.權(quán)利要求53的聚合物，其中所述的至少一種活性劑包括至少一種治療活性劑。
56.藥物組合物，包括作為活性成分的權(quán)利要求1的聚合物和藥學(xué)上可接受的載體。
57權(quán)利要求56的藥物組合物，包裝在包裝材料中并在所述包裝材料中或上印刷標(biāo)識，用于治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病。
58.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述的致病微生物選自原核生物、真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物、醇母、真菌、藻類、原生生物和寄生蟲。
59.權(quán)利要求56的藥物組合物，進(jìn)一步包括至少一種另外的治療活性劑。
60.權(quán)利要求59的藥物組合物，其中所述的至少一種治療活性劑選自激動劑、止痛劑、拮抗劑、抗生素、抗體、抗抑郁劑、抗原、抗組胺、抗高血壓藥、抗炎藥物、抗代謝劑、抗微生物劑、抗氧化劑、抗增殖劑、反義藥(antisense)、化療藥物、輔助因子、細(xì)胞因子、酶、生長因子、激素、免疫球蛋白、抑制劑、配體、核苷酸、寡聚核苷酸、前列腺素、毒素、維生素和它們的任何組合。
61.權(quán)利要求59的藥物組合物，其中所述的至少一種另外的治療活性劑包括抗生素。
62.治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病的方法，該方法包括給需要它的受治療者施用治療有效量的權(quán)利要求1的聚合物。
63.權(quán)利要求1的聚合物的用途，用于治療致病微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病。
64.權(quán)利要求1的聚合物用于制備治療致病微生物相關(guān)醫(yī)學(xué)疾病的藥物的用途。
65.權(quán)利要求62-64的任何一項的方法或用途，其中所述的致病微生物選自原核生物、真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物、醇母、真菌、藻類、原生生物和寄生蟲。
66.權(quán)利要求62的方法，其中所述的施用是經(jīng)口服、直腸、靜脈內(nèi)、局部、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮膚、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或鞘內(nèi)導(dǎo)管實現(xiàn)。
67.權(quán)利要求62的方法，進(jìn)一步包括給所述的受治療者施用至少一種治療活性劑。
68.權(quán)利要求63的用途，其中所述的聚合物與至少一種治療活性劑組合使用。
69.權(quán)利要求67和68的任何一項的方法或用途，其中所述的至少一種治療活性劑選自激動劑、止痛劑、拮抗劑、抗生素、抗體、抗抑郁劑、抗原、抗組胺、抗高血壓藥、抗炎藥物、抗代謝劑、抗微生物劑、抗氧化劑、抗增殖劑、反義藥、化療藥物、輔助因子、細(xì)胞因子、酶、生長因子、激素、免疫球蛋白、抑制劑、配體、核苷酸、寡聚核苷酸、前列腺素、毒素、維生素和它們的任何組合。
70.權(quán)利要求67和68的任何一項的方法或用途，其中所述的至少一種治療活性劑包括抗生素。
71.權(quán)利要求62的方法，其中所述的聚合物以本身或作為藥物組合物的一部分施用，所述的藥物組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。
72.醫(yī)學(xué)裝置，其包括權(quán)利要求1的聚合物和配置用于遞送該聚合物至受治療者身體部位的遞送系統(tǒng)。
73.權(quán)利要求72的醫(yī)學(xué)裝置，其中所述的聚合物組成藥物組合物的一部分，所述的藥物組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。
74.權(quán)利要求72的醫(yī)學(xué)裝置，其中所述的遞送是經(jīng)吸入實現(xiàn)。
75.權(quán)利要求72的醫(yī)學(xué)裝置，其中所述的遞送是經(jīng)皮膚實現(xiàn)。
76.權(quán)利要求72的醫(yī)學(xué)裝置，其中所述的遞送是經(jīng)局部實現(xiàn)。
77.權(quán)利要求72的醫(yī)學(xué)裝置，其中所述的遞送是經(jīng)身體器官內(nèi)植入醫(yī)學(xué)裝置實現(xiàn)。
78.食品防腐劑，包括有效量的權(quán)利要求1的聚合物。
79.權(quán)利要求78的食品防腐劑，進(jìn)一步包括可食用的載體。
80.用于探測致病微生物的成像探針，該成像探針包括聚合物，該聚合物包括多個氨基酸殘基和至少一個疏水部分殘基，其中所述至少一個疏水部分殘基中的至少一個與所述多個氨基酸殘基中的至少兩個氨基酸殘基，經(jīng)由所述至少兩個氨基酸殘基中的一個氨基酸殘基的N-α和經(jīng)由另一個氨基酸殘基的C-α，以共價鍵連接，同時該聚合物進(jìn)一步包括至少一種與其連接的標(biāo)記試劑。
81.權(quán)利要求80的成像探針，其中所述的至少一種標(biāo)記試劑與所述聚合物的所述多個氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基的側(cè)鏈連接。
82.權(quán)利要求80的成像探針，其中所述的至少一種標(biāo)記試劑與所述聚合物的所述多個氨基酸殘基的C端和/或N端連接。
83.權(quán)利要求80的成像探針，其中所述的至少一種標(biāo)記試劑與所述聚合物的所述至少一個疏水部分殘基中的至少一個連接。
84.權(quán)利要求80的成像探針，其中所述的至少一種標(biāo)記試劑選自發(fā)色團(tuán)、熒光試劑、磷光性試劑、重金屬簇和放射性試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類新的抗微生物聚合物和其制備方法，該聚合物被設(shè)計為發(fā)揮抗微生物活性，同時具有穩(wěn)定、無毒和避免對其發(fā)生抗藥性。進(jìn)一步公開了包含該聚合物的藥物組合物和利用該聚合物治療病態(tài)微生物相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病的方法、醫(yī)學(xué)裝置、成像探針和食品防腐劑。進(jìn)一步公開了氨基酸殘基和疏水部分殘基的結(jié)合物和其制備方法。
文檔編號A61P31/04GK101065131SQ20058004018
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者A·莫爾, I·拉德茲舍夫斯基 申請人:技術(shù)研究及發(fā)展基金有限公司