專利名稱：：APOB的RNAi調(diào)節(jié)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)載脂蛋白B表達的組合物和方法，尤其是涉及到寡核苷酸例如化學(xué)修飾的寡核苷酸對載脂蛋白B的負調(diào)解作用。
背景技術(shù)：
：RNA干擾或"RNAi"—詞最初是由Fire及其合作者在描述雙鏈RNA(dsRNA)在被引入到線蟲里時發(fā)現(xiàn)其能夠阻遏基因表達而提出的(FireW"LM^/m391:806-811，1998)。短雙鏈RNA在許多有機體包括脊椎動物體內(nèi)引導(dǎo)基因特異性的轉(zhuǎn)錄后沉默，并為研究基因功能提供了一個新的工具。脂蛋白由甘油酯和膽固醇酯構(gòu)成，周圍具有蛋白質(zhì)、磷脂和膽固醇的雙親包被。脂蛋白的蛋白質(zhì)成分眾所周知為調(diào)節(jié)載脂蛋白，并且人類至少有九種調(diào)節(jié)載脂蛋白。調(diào)節(jié)載脂蛋白B(ApoB)發(fā)現(xiàn)于各類脂蛋白中乳糜微粒、密度極低的脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)和低密度脂蛋白(LDL)。ApoB的功能為通過ApoB/E受體作為細胞結(jié)合和LDL顆粒的內(nèi)陷的識別信號。含有載脂蛋白B的脂蛋白積聚和過多，會導(dǎo)致脂相關(guān)疾病的生成，如動脈粥樣硬化。研究降低ApoB的療法對治療脂相關(guān)疾病很有意義。一種以反義治療的形式、以寡核苷酸為基礎(chǔ)的治療，己經(jīng)顯示能夠降低小鼠體內(nèi)ApoB水平，并且該治療還能夠減少血清膽固醇和甘油三酸酯的水平(U.S.公告號2003/0215943)。這些結(jié)果表明了一個適度的ApoB的負調(diào)解作用，以及作為治療脂相關(guān)疾病的一個靶。本發(fā)明對現(xiàn)有技術(shù)的改進表現(xiàn)在提供了能夠減少體內(nèi)血清ApoB水平的IRNA試劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了能夠減少受試者如哺乳動物(例如人)中載脂蛋白B(APoB)水平的組合物及其方法。所述方法包括對受試者施用能夠使ApoB基因沉默的一種iRNA試劑。該iRNA試劑可以是在本文所描述的這樣，或者是一種基于具有活性的序列之一的dsRNA，并且對哺乳動物ApoB基因如來自人或小鼠ApoB基因的相同區(qū)域定位。iRNA試劑包含每條鏈少于30個的寡核苷酸，例如21-23個核苷酸，構(gòu)成、包括在此提供的試劑標號為1-74的試劑之一，或是來自在此提供的標號為1-74的試劑之一衍生物。這些優(yōu)選的iRNA試劑含有對受試者所有非ApoB基因序列的四個或更多個的核苷酸錯配。本發(fā)明尤其是提供一種iRNA試劑，其包含一種有義鏈，該有義鏈具有至少15個有義鏈序列的連續(xù)的核苷酸，以及具有一種反義鏈，該反義鏈具有至少15個反義鏈序列的連續(xù)的核苷酸，這些序列為在此提供的試劑標號為1-74的iRNA試劑的序列，例如，1號試劑，有義鏈序列5'-cuuuacaagccuugguucagu畫3，(SEQ.IDNO.153),反義鏈序歹!j5,-acugaaccaaggcuuguaaagug-3，(SEQ.IDNO.154)。需要理解的是，在此提供的某些iRNA試劑包含特定的修飾核苷酸優(yōu)選類型如54-74號試劑，同時試劑號為1-53的iRNA試劑則作為藍圖。它們是指包含這樣的修飾，該修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，且與試劑標號為1-53的iRNA試劑相當(dāng)，如下面還要提到的，例如，2'-0-甲基修飾、堿基替代等，對于上述修飾，本領(lǐng)域技術(shù)人員不會認為這些試劑的特性會改變，尤其是不會改變兩條鏈與它們的互補鏈在嚴格的條件下雜交的能力。表I:耙向ApoB的示例性iRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>參見圖I知表示核苷酸的解,—(例如，小寫字母、黑體和斜體字母)。如下面的實例3所示，表1中試劑號為1-53的iRNA試劑具有良好的和令人驚訝的減少存在于培養(yǎng)的人HepG2細胞中的ApoBmRNA量的能力，在HepG2細胞與這些iRNA試劑共同孵育后，與沒有同iRNA試劑一起孵育的那些細胞相比，減少50%以上，并且/或減少分泌到細胞培養(yǎng)上清的ApoB蛋白質(zhì)的量超過500/。(參見表8)。本發(fā)明還提供了一種iRNA試劑，其包含一個至少具有iRNA試劑有義序列的15個連續(xù)核苷酸的有義鏈，該試劑的試劑號為1-19，24-26，29，30和32-42，以及一個至少具有iRNA試劑反義序列15個連續(xù)核苷酸的反義鏈，該試劑的試劑號為1-19，24-26,29，30和32-42。如下面的實例3所示，表1中試劑號為1-19，24-26，29，30和32-42的iRNA試劑具有良好的和令人驚訝的減少存在于培養(yǎng)的人HepG2細胞中的ApoBmRNA量的能力，在HepG2細胞與這些iRNA試劑共同孵育后，與沒有同iRNA試劑一起孵育的那些細胞相比，減少60%以上，并且/或減少分泌到細胞培養(yǎng)上清的ApoB蛋白質(zhì)的量超過60%(參見表8)。本發(fā)明還提供了一種iRNA試劑，其包含一個具有表1所提供的iRNA試劑有義序列中的至少15個連續(xù)核苷酸的有義鏈，該試劑的試劑號為1-12，15，17，24，29，30和32-35，以及一個具有表1所提供的iRNA試劑反義序列中的至少15個連續(xù)核苷酸的反義鏈，該試劑的試劑號為1-12，15，17，24，29，30和32-35。如下面的實例3所示，這些試劑具有良好的和令人驚訝的減少存在于培養(yǎng)的人HepG2細胞中的ApoBmRNA量的能力，在HepG2細胞與這些iRNA試劑共同孵育后，與沒有同iRNA試劑一起孵育的那些細胞相比，減少70%以上，并且/或減少分泌到細胞培養(yǎng)上清的ApoB蛋白質(zhì)的量超過70%(參見表8)。本發(fā)明還提供了一種iRNA試劑，其包含一個具有iRNA試劑有義序列中的至少15個連續(xù)核苷酸的有義鏈，該試劑的試劑號為1-5，7和11，以及一個具有iRNA試劑反義序列中的至少15個連續(xù)核苷酸的反義鏈，該試劑的試劑號l-5，7和11。如下面的實例3所示，這些試劑具有良好的和令人驚訝的減少存在于培養(yǎng)的人HepG2細胞中ApoBmRNA的量的能力，在HepG2細胞與這些iRNA試劑共同孵育后，與沒有同iRNA試劑一起孵育的那些細胞相比，減少80%以上，并且/或減少分泌到細胞培養(yǎng)上清的ApoB蛋白質(zhì)的量超過80Q/。(參見表8)。在一個尤其優(yōu)選的實例中，iRNA試劑選自下面的iRNA試劑組:試劑號為54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64,65，66，67，68，69，70，71，72，73或74。在另一項是實施例中，與那些沒有同試劑共同孵育的人HepG2細胞相比，iRNA試劑減少存在于培養(yǎng)的人HepG2細胞中的ApoBmRNA的量超過50%，并且/或減少孵育的人HepG2分泌到細胞孵育上清的ApoB蛋白質(zhì)的量超過50%，并且/或在50mg每kg體重或100mg每kg體重的施用后，減少存在于小鼠體內(nèi)C57B1/6的小鼠肝細胞的apo-BmRNA的量至少達到20%。本發(fā)明還提供iRNA試劑，其包含一條有義鏈和一條反義鏈，每一條鏈包括至少16，17或18個，如以下所限定的，與iRNA試劑序列之一基本相同的核苷酸，這些試劑的試劑號為1-74，除了那些每條鏈不超過l，2或3個核苷酸分別被其它的核苷酸(例如，腺苷被尿嘧啶替代)替代的鏈，其基本保留抑制ApoB在培養(yǎng)的人HepG2細胞中的表達的能力，如下面所限定。在一項實施例中，iRNA試劑為至少15個核苷酸的長度，包括一條有義RNA鏈和一條反義RNA鏈，其中，反義RNA鏈為30個核苷酸或更短一些，iRNA試劑的雙鏈區(qū)為15-30個核苷酸，優(yōu)選為18-25個核苷酸對的長度。iRNA試劑還可以包括一個具有1-4，優(yōu)選為2-3的未配對核苷酸的核苷酸單鏈突出端，并且未配對的核苷酸具有至少一個硫代磷酸酯二核苷酸的連接。核苷酸單鏈突出端可以為例如在iRNA試劑反義鏈的3'端。在一項實施例中，iRNA試劑抑制人和小鼠ApoB在如人HepG2細胞和鼠NmuLi細胞中的表達。在一項實施例中，如所描述，IRNA試劑可優(yōu)選通過連接一個疏水結(jié)構(gòu)例如含有膽固醇的結(jié)構(gòu)而得到修飾，該連接優(yōu)選為連接至iRNA試劑的有義鏈，更優(yōu)選為連接至iRNA試劑有義鏈的3'端。在另一項實施例中，如本文所描述，iRNA試劑優(yōu)選被修飾來促進穩(wěn)定性。優(yōu)選的修飾包括引入硫代磷酸酯的連接和在2'位核糖單元的替代，例如，2，-脫氧，2，-脫氧-2，-氟，2，-氧-甲基，2，-氧-甲氧乙基(2，-0-MOE)，2，-氧-氨丙基(2，-0-AP)，2，-氧-二甲氨基乙基(2，曙0誦DMAOE),2'-氧-二甲基氨丙基(2,-O-DMAP)，2'-氧-二甲基氧氨基乙基氧乙基(2'-0-DMAEOE)或2，-氧-氮-甲基乙酰氨基(2'-0-NMA)替代。優(yōu)選地，這些2，-替代是針對iRNA試劑有義鏈上以及任選的反義鏈上的5'-UA-3，二核苷酸、5'-UG-3，二核苷酸，5'-CA-3，二核苷酸,5'-UU-3，二核苷酸或者5，-CC-3'二核苷酸的5'核苷酸，或者針對所有含嘧啶堿基的核苷酸。更優(yōu)選的是出現(xiàn)于所有序列基序(s叫uencemotif)5，-UA-3，、5'曙CA-3,、5'-UU-3'和5'-UG-3'的5'端的大部分嘧啶是2'修飾的核苷酸。更優(yōu)選地，所有出現(xiàn)于有義鏈的嘧啶為2'-修飾的核苷酸，并且出現(xiàn)于所有序列基序5'-UA-3'和5'-CA-3'中的5'端的大部分嘧啶。最優(yōu)選地，所有位于有義鏈的嘧啶為2，-修飾的核苷酸，并且在反義鏈中，出現(xiàn)于所有序列基序5'-UA-3'、5，-CA-3，、5,-UU-3，和5，-UG國3，的5'端的大部分嘧啶是2'-修飾的核苷酸。在另一項實施例中，如本文所描述，膽固醇結(jié)構(gòu)(例如，位于有義鏈的3'端)、2，-修飾(例如，2'-氧-甲基或2'-脫氧-2'-氟修飾)和硫代磷酸酯(例如，位于有義鏈和反義鏈靠近3'端的一或兩個核苷酸)存在于同一個iRNA試劑中。在一項優(yōu)選實施例中，施用一種iRNA試劑，例如一種在本文描述的試劑，用來治療由于ApoB的表達而引起的受試者的疾患和病癥。在另一項實施例中，施用iRNA試劑作為由ApoB介導(dǎo)的病癥的預(yù)防性治療。一方面，本發(fā)明公開了制劑，包括基本上是純的或藥物上可接受的iRNA試劑的制劑，其調(diào)節(jié)例如抑制ApoB。該制劑可以包含靶向編碼ApoB核苷酸的iRNA試劑和一種藥物可接受的載體。在一項實施例中，iRNA試劑包含一條有義鏈，該有義鏈具有iRNA試劑有義鏈的至少15個連續(xù)的核苷酸，該試劑的試劑號為1-74，并且包含一條反義鏈，該反義鏈具有iRNA試劑反義鏈的至少15個連續(xù)的核苷酸，該試劑的試劑號為1-74。另一方面，本發(fā)明提供了一種制備一種藥物組合物的方法，包括配制iRNA試劑的一條有義鏈，其具有至少15個iRNA試劑有義鏈的連續(xù)的核苷酸，該試劑的試劑號為1-74;配制一條反義鏈，其具有至少15個iRNA試劑反義鏈的連續(xù)的核苷酸，該試劑的試劑號為1-74;以及一種藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以一個足以減少ApoB信使RNA(mRNA)表達的量被施用。在一項實施例中，施用了足夠量的iRNA試劑以減少ApoB蛋白質(zhì)的表達(例如，減少了至少2%、4%、6%、10%、15%、20%或更多)。本發(fā)明的藥物組合物可以施用于受試者，其中，該受試者有患有如下疾病的風(fēng)險或正在患有如下疾病，這些疾病的特征在于ApoB增加或不必要的ApoB的表達、膽固醇的增加或不需要的膽固醇的水平、脂介導(dǎo)的脈管病癥和/或脂代謝紊亂。iRNA試劑可用于被診斷為患有疾病或有患該疾病風(fēng)險的個體，以拖延疾病的發(fā)作或癥狀的出現(xiàn)。這些疾病包括HDL/LDL膽固醇失衡；異常脂血癥，如家族性混合型高脂血癥、獲得性高脂血癥；高膽固醇血癥；抗斯達汀高膽固醇血癥；冠狀動脈疾病(CAD);冠心病(CHD);血栓癥和動脈粥樣硬化。在一項實施例中，耙向ApoB的iRNA被施用于患有抗斯達汀高膽固醇血癥的受試者。本發(fā)明的藥物組合物還能夠以足以減少血清LDL膽固醇和/或HDL膽固醇和/或總膽固醇水平的量施用于受試者。例如，iRNA以能夠足以減少總膽固醇的量施用到受試者，使總膽固醇的水平減少了至少0.5%、1°/。、2.5%、5%、10%或更多。在一項實施例中，本發(fā)明的藥物組合物以足以減少心肌梗塞發(fā)作的量施用于受試者。在一項優(yōu)選實施例中，藥物組合物被重復(fù)施用。在一項實施例中，iRNA試劑可以被耙向到肝臟，在使用了ApoBiRNA試劑之后，肝臟中的ApoB的表達水平被降低。例如，iRNA試劑可以與能夠靶向到肝臟的結(jié)構(gòu)進行復(fù)合，例如一種抗體或配體，如與肝細胞上的受體結(jié)合的膽固醇。如以下的實例7G)所示，含有膽固醇結(jié)構(gòu)的這種結(jié)合導(dǎo)致了siRNAs被肝組織有效的吸收，并且降低了ApoBmRNA在肝樣品中的水平。這個結(jié)果表明這種與含有膽固醇結(jié)構(gòu)的結(jié)合使iRNA試劑在體內(nèi)靶向肝中的基因成為可能。在一項實施例中，iRNA試劑能夠被耙向到消化道，例如，靶向到腸如空腸，并且ApoB在消化道中的表達水平在施用ApoBiRNA試劑之后降低。意想不到的是，還發(fā)現(xiàn)結(jié)合到一個膽固醇結(jié)構(gòu)上的iRNA試劑可以將IRNA試劑耙向到消化道。如下面的實例7G)所示，與含有膽固醇結(jié)構(gòu)的結(jié)合導(dǎo)致腸組織對siRNA有效的吸收和將ApoBmRNA在腸組織樣品里的水平降低。表明該修飾，例如與含有膽固醇結(jié)構(gòu)的結(jié)合，使iRNA試劑在體內(nèi)靶向到消化道組織的基因的使用成為可能。在一項實施例中，iRNA試劑被修飾或是與一種運送試劑結(jié)合，如在本文所描述的運送試劑脂質(zhì)體。在一項實施例中，該修飾介導(dǎo)與血清白蛋白(SA)的結(jié)合，例如，一種人血清白蛋白(HAS)，或是它的片段。一種評估抑制ApoB-基因表達的iRNA試劑的方法，該方法包括a.提供一種iRNA試劑，其中，第一條鏈充分地與ApoBmRNA核苷酸序列互補，第二條鏈充分地與第一條鏈互補從而雜交到第一條鏈；b.將iRNA試劑與含有ApoB基因的細胞接觸；c.將同iRNA試劑接觸之前的細胞或未接觸的對照細胞的ApoB基因表達與同iRNA試劑接觸之后的細胞的APoB基因表達作一個對比；和d.確定iRNA試劑是否對抑制ApoB基因表達起作用，其中，如果ApoBRNA在細胞中存在的量或細胞分泌的蛋白質(zhì)的量少于細胞接觸iRNA試劑之前的量，那么該iRNA是起作用的。在一項實施例中，b.-d.步驟是在體外和非人類實驗用動物體內(nèi)進行。在另一項實施例中，該方法還包括確定iRNA試劑在激活外周血單核細胞剌激干擾素-a生成的活性。本發(fā)明的方法和組合物，例如在本文所描述的治療肝臟疾病和病癥的方法和組合物，可以使用所描述的任一iRNA試劑。同時，本發(fā)明的方法和組合物可以治療在本文所描述的任何一種疾病或病癥，以及治療任一受試者，如任何一種動物、任何一種哺乳類如任何一個人。本發(fā)明的方法和組合物，例如治療在本文所描述的脂代謝紊亂的方法和iRNA組合物，可以利用任何一種在本文所描述的劑量和/或配方，以及任何一種在本文所描述的施藥途徑。本發(fā)明的一個或多個實施例的詳情可用下面提供的附圖來說明。本發(fā)明的其它特征、目的以及優(yōu)勢將通過本說明書、附圖和權(quán)利要求書而得以充分的理解。該申請引入了所有具有相關(guān)目的的參考資料、專利和專利申請。圖1為示意圖，說明結(jié)合了膽固醇的RNA鏈的合成和結(jié)構(gòu)。圓圈表示固相(可控孔徑玻璃，CPG)。圖2表示細胞在經(jīng)過增加siRNA和AL-DUP5024水平而治療后的比例[ApoBmRNA]/[GAPDH對照mRNA]。在50%最大抑制作用(IC50)處的抑制劑濃度的確定，通過曲線擬合來確定，同時利用計算機軟件Xlfit的參數(shù)如下單側(cè)量效(DoseResponseOneSite)、4參數(shù)邏輯模型(4ParameterLogisticModel)、fit=(A+((B-A)/(1+(((10AC)/x)AD))))，inv=((10AC)/((((B-A)/(y-A))-1)A(1/D)))，res=(y-fit)。圖3為聚丙烯酰胺凝膠板，表明小鼠血清核酸酶對下列siRNA復(fù)合物的降解AL-DUP5024、AL-DUP5163、AL-DUP5164、AL-DUP5165、AL-DUP5166、AL-DUP5180和AL-DUP5181。siRNA復(fù)合物在小鼠血清中孵育0、1、3、6或24小時。標有"imb"的行代表未處理的對照。圖4為聚丙烯酰胺凝膠板，為聚丙烯酰胺凝膠板，表明小鼠血清核酸酶對siRNA復(fù)合物的降解AL-DUP5167、AL-DUP5168、AL-DUP5048、AL-DUP5169、AL隱DUP5170、AL-DUP5182和AL-DUP5183。siRNA復(fù)合物在小鼠血清中孵育0、1、3、6或24小時。標有"imb"的行代表未處理的對照。圖5A為培養(yǎng)的人HepG2細胞分泌到上清的ApoB蛋白質(zhì)的量效圖，培養(yǎng)的人H印G2細胞與含有100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14或0.05nMApoB特異性的siRNA復(fù)合物AL-DUP5163介質(zhì)一同孵育。該效應(yīng)以經(jīng)過ApoB特異性的siRNA復(fù)合物處理的細胞上清中ApoB蛋白質(zhì)的濃度，與經(jīng)過非特異性對照siRNA復(fù)合物(AL-DUP5129，菱形)處理或經(jīng)過不含(AL-DUPHCV，方形)膽固醇結(jié)合物處理的細胞上清中ApoB濃度的比例來表示。圖5B為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5164—同孵育。圖5C為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5165—同孵育。圖5D為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5166—同孵育。圖5E為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5180—同孵育。圖5F為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5181—同孵育。圖5G為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5167—同孵育。圖5H為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5168—同孵育。圖5I為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5169—同孵育。圖5J為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5170—同孵育。圖5K為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5182—同孵育。圖5L為按照圖5A描述的方法，ApoB蛋白質(zhì)分泌的量效圖。HepG2細胞與在圖5A中描述的濃度范圍內(nèi)的siRNA復(fù)合物5183—同孵育。圖6A-D舉例表示如下實例7，(H),的實驗結(jié)果。圖6A為用放射標記的且與siRNAs反義鏈互補的探針的Sl-核酸酶保護測試。該測試用于檢測收集的肝臟和空腸組織裂解物中的siRNA，這些裂解物來自注射了生理鹽水("-")、AL-DUP5386("A")、AL-DUP5311(，，B，，)、AL-DUP5385("C2")和AL-DUP5167("C1")的動物。三種與膽固醇結(jié)合的siRNAs在肝臟和空腸中的比較水平上被檢測到，但是未與膽固醇結(jié)合的siRNAAL-DUP5383在兩種組織中仍然低于檢測水平。用于內(nèi)源miRNAs的Sl-核酸酶保護測試作為空腸(miRNA143，序列5'國UGAGAUGAAGCACUGUAGCUCA畫3',SEQIDNO.270)和肝臟(miRNA122,序列5,陽UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3',SEQIDNO.269)的負載對昭。八、、o圖6B顯示分支DNA測定法測試檢測經(jīng)過siRNA處理之后，小鼠肝臟和空腸組織中的ApoBmRNA水平。組織裂解物用于定量檢測ApoB和GAPDHmRNA以及計算ApoB和GAPDHmRNA的比例，并且用相對于生理鹽水對照組的一組平均值來表達。棒代表組平均值，誤差棒代表平均值的標準偏差。棒棒上方的*號表示與生理鹽水對照組動物具有顯著差異的組，p<0.01。圖6C表示在經(jīng)過siRNA處理之后所測定的血漿ApoB蛋白質(zhì)水平的ELISA測試結(jié)果。利用抗小鼠ApoB-100的初級抗體LF3，測試來自每個動物體血漿樣品的ApoB-100。ApoB蛋白質(zhì)水平的組平均值用相對于生理鹽水對照平均值來表示。棒代表組平均值，誤差棒代表平均值的標準偏差。棒上方的*號表示與生理鹽水對照組動物具有顯著差異的組，p<0.01。圖6D表示在經(jīng)過siRNA處理之后總血漿ApoB蛋白質(zhì)水平。用膽固醇測試試劑盒(Diasys)測定的總血漿膽固醇水平。棒代表組平均值，誤差棒代表平均值的標準偏差。棒上方的*號表示與生理鹽水對照組動物的具有顯著差異的組，p<0.01。圖7A為示意圖，表示ApoBmRNA和連接到用于5'-RACEPCR的ApoBcDNA的連接物。該示意圖顯示對應(yīng)的AL-DUP5167siRNA和PCR引物的耙位，以及PCR反應(yīng)產(chǎn)物的大小。圖7B為RACE-PCR擴增3的瓊脂糖凝膠。該電泳分析顯示了僅用ApoB特異性的AL-DUP5167處理的小鼠的肝臟和空腸的特定的剪切產(chǎn)物。凝膠上大寫字母標記的泳道表示經(jīng)過處理的組和對照組。該泳道的標記如下A:PBS;B:AL-DUP5386;C:AL-DUP5167;D:AL曙DUP5163;E:AL-DUP5385;F:AL-DUP5311;Fc:對照，僅使用來自C組cDNA的正向引物；RC:對照，僅使用來自C組cDNA的反向引物。具體實施方式為便于理解，術(shù)語"核苷酸"或"核糖核苷酸"在此有時是指RNA試劑的一或多個單體亞基。應(yīng)該理解，如果是被修飾的RNA或核苷酸替代物，術(shù)語"核糖核苷酸"或"核苷酸"也指被修飾的核苷酸或者替代物置牛奐結(jié)構(gòu)(surrogatereplacementmoiety),如同下面所述。在此所使用的"RNA試劑"是未修飾的RNA、修飾的RNA或核苷替代物，它們在本文中均被描述。雖然描述了大量的修飾的RNAs和核苷替代物，但是優(yōu)選實例是指那些與未修飾RNAs相比對核酸酶降解具有更大抵抗性的。優(yōu)選的實例包括具有2'糖修飾、對單鏈突出端的修飾，優(yōu)選的是3'單鏈突出端，或者尤其是如果為單鏈，則為包括一個或多個磷酸酸鹽基團或一個或多個磷酸基團的類似物的5'修飾。在此所使用的"iRNA試劑"("干擾RNA試劑"的縮寫)是指一種RNA試劑，其能夠負調(diào)解作用靶基因的表達，如ApoB。不受理論的約束，iRNA試劑可以通過一個或多個機制而起作用，包括靶mRNA轉(zhuǎn)錄后剪切，有時在本領(lǐng)域指RNAi，或轉(zhuǎn)錄前或翻譯前機制。iRNA試劑可以包括一個單鏈或多于一個鏈，例如雙鏈(ds)RNA試劑。如果iRNA試劑為一個單鏈，那么尤其優(yōu)選的是包括5'修飾，該修飾包括一個或多個磷酸酯基團或一個或多個磷酸酯基團的類似物。在此所使用的"單鏈iRNA試劑"是指iRNA試劑由一個單個分子所組成。它可以包含雙鏈區(qū)，由鏈內(nèi)配對形成，如可以是或包括發(fā)夾或柄狀結(jié)構(gòu)。針對耙分子，單鏈iRNA試劑優(yōu)選為反義。在此所使用的"dsiRNA試劑"("雙鏈iRNA試劑"的縮寫)是指iRNA試劑，其包括多于一條優(yōu)選為兩條鏈，其中鏈間雜交能夠形成雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域。在哺乳類動物細胞中，雖然dsiRNA試劑能夠誘導(dǎo)經(jīng)常是有害的干擾反應(yīng)，但是短的dsiRNA試劑不會啟動這種干擾反應(yīng)，至少不會使其達到對細胞和宿主有害的程度。本發(fā)明的iRNA試劑包括短到不會誘發(fā)哺乳動物細胞內(nèi)干擾反應(yīng)的分子。所以，將iRNA試劑(如在本文所描述的配方)組合物施用到哺乳類的鄰胞，可以用于沉默ApoB基因的表達從而避免干擾反應(yīng)。那些短得不足以激動感染反應(yīng)的分子在此被稱為siRNA試劑或siRNAs。在此所使用的"siRNA試劑"或"siRNA"是指iRNA試劑，例如一種dsiRNA試劑或單鏈RNA試劑，其短到不足以誘導(dǎo)人細胞中有害的干擾反應(yīng)，例如它有少于60但優(yōu)選是少于50、40或30個核苷酸對的雙鏈區(qū)。另外，在一項實施例中，哺乳動物細胞經(jīng)過一種破壞干擾反應(yīng)成份的iRNA試劑的處理，例如dsRNA激活的蛋白質(zhì)激酶PKR。本文所描述的分離的iRNA試劑，其包括dsiRNA試劑和siRNA試劑，并能夠介導(dǎo)ApoB基因的沉默，例如通過RNA降解。為方便起見，這種RNA在此也指被沉默的RNA。那么這種基因就是靶基因。優(yōu)選是，被沉默的RNA為一種內(nèi)源ApoB基因的基因產(chǎn)物。如在此所使用，短句"介導(dǎo)RNAi"是指一種試劑以序列特異性方式，將靶基因沉默的能力。"使靶基因沉默"意為一種過程，由此細胞在沒有接觸試劑的時候，含有和/或分泌靶基因特定產(chǎn)物，而當(dāng)與試劑接觸后，與一種相似的未與試劑接觸的細胞相比較，含有和/或分泌至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或少于90%這種基因產(chǎn)物。這種靶基因產(chǎn)物可以是例如信使RNA(mRNA)、一種蛋白質(zhì)或一種調(diào)節(jié)元素。不受理論的束縛，可以認為由在本文所描述的試劑造成的沉默使用了RNAi機制或過程以及一種向?qū)NA，如具有15到30個核苷酸對的siRNA試劑。如在此所使用的，術(shù)語"互補"是用于說明互補充分的程度，以便在本發(fā)明化合物和靶RNA分子如ApoBmRNA分子之間，形成穩(wěn)定的和特性的結(jié)合。在特異性結(jié)合是必要的情況下，也就是說，在體內(nèi)測試或治療處理的生理條件下，或是在體外測試，測試被實施的條件下，特異性結(jié)合需要充分的互補以避免寡聚體化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合。非靶序列一般至少有4個核苷酸是不相同的。如在此所使用的，iRNA試劑是"充分地"與靶RNA"互補"，例如，耙mRNA(如耙ApoBmRNA)，如果iRNA試劑減少細胞中靶RNA編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的話。該iRNA試劑還可以"準確地"與靶RNA"互補"(不包括含有亞基(一個或多個)的SRMS)，如耙RNA和iRNA試劑退火，優(yōu)選是在確切互補區(qū)用獨有的Watson-Crick堿基配對，形成一個雜交體。"充分互補"iRNA試劑可以包含一個內(nèi)在區(qū)域(如至少10個核苷酸)，該內(nèi)在區(qū)域準確地與靶ApoBRNA互補。更進一步說，在一些實施例中，iRNA試劑特異性地辨別一個單個核苷酸的區(qū)別。在這種情形下，如果發(fā)現(xiàn)準確的互補在該區(qū)域(例如在7個核苷酸之內(nèi))有一個核苷酸的不同的話，iRNA試劑僅僅介導(dǎo)RNAi。優(yōu)選的iRNA試劑基于或包含表1中所提供的有義和反義序列，或由表1中所提供的有義和反義序列組成。如在本文所使用的，當(dāng)指第一條核苷酸序列與第二條核苷酸序列相比較時，"基本相同"是除了最多一個、二個或三個核苷酸替代(例如，腺苷被尿嘧啶替代)之外，第一條核苷酸序列與第二條核苷酸序列相同。當(dāng)指不同于表1所列的iRNA試劑之一，但通過核苷酸的缺失、添加或替代從表1所列的iRNA試劑之一而衍生的iRNA試劑時，"基本保留抑制ApoB在培養(yǎng)的人HepG2細胞中的表達的能力"，如在本文所使用，是指所述衍生的iRNA試劑具有比較低的抑制活性，與作為衍生物來源的表1中的iRNA試劑相比，低于不超過20%的抑制作用。例如，衍生于表1中iRNA試劑的一種iRNA試劑，該表中的iRNA試劑降低在培養(yǎng)的人HepG2細胞中ApoBmRNA的量到70%，而衍生的iRNA試劑降低在培養(yǎng)的人HepG2細胞中ApoBmRNA的量到50%，可以看作基本保留了抑制ApoB在培養(yǎng)的人HepG2細胞中表達的能力?？蛇x的，本發(fā)明的iRNA試劑降低了ApoBmRNA在培養(yǎng)的人HepG2細胞中的量，或者是將分泌到細胞培養(yǎng)上清中的ApoB蛋白質(zhì)量減少到至少50%。在一項典型的實施例中，受試者為牛、馬、小鼠、兔子、狗、豬、山羊或靈長類。在更優(yōu)選的實施例中，受試者是人，例如，一名正常的個體或者是被診斷患有或預(yù)測患有疾病或有病癥的個體。因為在施用了iRNA試劑組合物之后，iRNA試劑介導(dǎo)沉默可以持續(xù)好幾天，因而在多數(shù)情況下，可以將一天一次的施用組合物的頻率降低，或在某些情況下，整個療程僅一次給藥。與ApoB錯誤表達相關(guān)的病癥靶向ApoB的iRNA試劑，例如在本文所描述的iRNA試劑，可被用于治療受試者，如患有或具有發(fā)展的疾病或病癥風(fēng)險的人，其中該疾病與病癥與異常或不需要的ApoB基因表達相關(guān)，如ApoB的過表達。例如，耙向ApoBmRNA的iRNA試劑可用于治療一種脂相關(guān)疾病，例如高膽固醇血癥，如伴有外周血病變的原發(fā)性高膽固醇血癥。其它脂相關(guān)病癥包括冠狀動脈疾病(CAD)、心肌梗塞；HDL/LDL膽固醇失衡；異常脂血癥(例如家族性混合型高脂血癥(FCHL)和獲得性高脂血癥)；高膽固醇血癥；抗斯達汀高膽固醇血癥；冠心病(CHD);血栓癥和動脈粥樣硬化。在一項實施例中，耙向ApoBmRNA的iRNA被施用于患有抗斯達汀病癥，如抗斯達汀高膽固醇血癥的受試者。該受試者當(dāng)時正在接受斯達汀的治療，或過去接受過斯達汀的治療，或不適于接受斯達汀的治療。耙向ApoBmRNA的iRNA試劑可用于治療攜帶ApoB基因或LDL受體的基因突變或多態(tài)性的人。例如，iRNA試劑可用來治療被診斷為患有家族性載脂蛋白B-100缺陷癥(FDB)的人，這是一種脂蛋白代謝顯性遺傳疾病，會導(dǎo)致高膽固醇血癥和增加患CAD的傾向。由于缺陷性ApoB/E受體而削弱了的LDL顆粒的清除，血漿膽固醇水平在這類受試者中會顯著提高。iRNA試劑的設(shè)計和選擇以下的實例2解釋了基于序列預(yù)測的基因步查用于評估81種潛在靶向人和小鼠ApoBmRNA的iRNA試劑。根據(jù)所提供的結(jié)果，表1列出了具有活性的iRNA試劑靶向ApoB。人們可以很方便地設(shè)計和產(chǎn)生出其它基于此的其它iRNA試劑，這些試劑包含在此所提供的具有活性的序列之一，或由在此所提供的具有活性的序列之一組成，以使活性序列的至少一部分被包含在iRNA試劑中。以下實例2中所示的iRNA試劑由一條21個核苷酸長度的有義鏈和一條23個核苷酸長度的反義鏈構(gòu)成。雖然，這些長度可能是潛在的比較理想的，并不是說iRNA試劑僅限于這些長度。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員很清楚，較短或較長的iRNA試劑的效能是相似的，因為在某一個特定長度范圍內(nèi)，功效是指核苷酸序列的功能而不是指鏈的長度。例如，Yang，D.等在PNAS2002，99:9942-9947中闡明了長度在21禾口30堿基對之間的iRNA試劑具有相似的功效。其它資料顯示了堿基對長度減少到15個的iRNA試劑的有效的基因沉默(Byrom，W.M.等，InducingRNAiwithsiRNACocktailsGeneratedbyRNaseIII;TechNotes10(1)，Ambion,Inc.,Austin,TX,USA)。所以，根據(jù)本發(fā)明從表1中提供的序列，選擇長度在15到22的一部分核苷酸生成衍生自表l所列序列之一的iRNA試劑是可行和可以考慮的?；蛘哒f，可以向表1中所提供的序列之一添加一個或幾個核苷酸，優(yōu)選但不是必要的，以這樣的方式加入的核苷酸分別與靶基因如ApoB的序列是互補的。所有這樣衍生成的iRNA試劑都包括在本發(fā)明iRNA試劑的范圍內(nèi)，假設(shè)它們基本保留了抑制ApoB在培養(yǎng)的人HepG2細胞中表達的能力。一般來說，本發(fā)明的iRNA試劑包括了一個與ApoB基因充分互補的區(qū)域，并且核苷酸的長度足夠長，從而iRNA試劑或其一個片段可以介導(dǎo)ApoB基因的負調(diào)解作用。表1中iRNA試劑的反義鏈與小鼠(GenBankAccessionnumber:XM—137955)的mRNA序列和人(GenBankAccessionnumber:NM—000384)ApoB完全互補的，它們的有義鏈與反義鏈除了反義鏈上的兩個3'端核苷酸外，完全互補。然而獲得iRNA試劑與靶之間完全的互補不是必需的，但是該一致性必需充分得足以使iRNA試劑或其剪切產(chǎn)物進行序列特異性沉默，例如通過ApoBmRNA的RNAi剪切。因此，如以下所述，本發(fā)明的iRNA試劑包括這樣的試劑，其包括一條有義鏈和一條反義鏈，每一條鏈包括至少16、17或18個核苷酸序列，這些核苷酸基本與如下限定的表1中的序列之一基本相同，除了每條鏈上分別不超過1、2或3個核苷酸被其它核苷酸替代(如，腺苷被尿嘧啶置換)外，并且基本保留了抑制ApoB在培養(yǎng)的人HepG2細胞中的表達的能力。這些試劑因而具有至少15個核苷酸與表1中的序列之一相同，但是針對ApoBmRNA序列或在有義鏈和反義鏈之間有1、2或3個堿基錯配被引入。對靶ApoBmRNA序列的錯配，尤其是在反義鏈，終端是最耐受區(qū)域，并且如果出現(xiàn)錯配，優(yōu)選是在一個或多個終端區(qū)，如出現(xiàn)在5'和/或3'端的6、5、4或3個核苷酸之內(nèi)，最優(yōu)選是出現(xiàn)在有義鏈5'端或反義鏈3'端的6、5、4或3個核苷酸之內(nèi)。有義鏈僅需要充分地與反義鏈互補以保持分子整體的雙鏈特征。iRNA試劑的反義鏈在長度上應(yīng)該與14、15、16、17、18、19、25、29、40或50個核苷酸相同，或至少為14、15、16、17、18、19、25、29、40或50個核苷酸。其在長度上應(yīng)該等于或小于60、50、40或30個長度的核苷酸。優(yōu)選的范圍是15-30、17-25、19-23和19-21個核苷酸的長度。iRNA試劑的有義鏈在長度上應(yīng)該等于或至少為14、15、16、17、18、19、25、29、40或50個核苷酸。其在長度上應(yīng)該等于或小于60、50、40或30個核苷酸。優(yōu)選的范圍是15-30、17-25、19-23和19-21個核苷酸的長度。iRNA試劑的雙鏈部分在長度上應(yīng)該等于或至少為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40或50個核苷酸對。其在長度上應(yīng)該等于或小于60、50、40或30個長度的核苷酸對。優(yōu)選的范圍是15-30、17-25、19-23和19-21個核苷酸對的長度。優(yōu)選是對有義鏈和反義鏈進行選擇，使iRNA試劑在分子的一端或兩端包含一個單鏈或未配對的區(qū)。如此，iRNA試劑就含有有義鏈和反義鏈，優(yōu)選是配對地含有突出端，例如，在5'和3'兩端或一端的突出端，但優(yōu)選是3'端的2-3個核苷酸的突出端。大多數(shù)實施例具有3'端的突出端。優(yōu)選的siRNA試劑具有l(wèi)-4個單鏈突出端，優(yōu)選為3'端的突出端，或每一端為優(yōu)選為2或3個核苷酸的長度。突出端可以由于一條鏈長于另一條而形成，或者是由兩條相同長度的鏈交錯形成。5'端優(yōu)選為被磷酸化。雙鏈區(qū)的優(yōu)選的長度在15和30之間，最優(yōu)選的為18、19、20、21、22和23個核苷酸的長度，例如以上所述的siRNA試劑的范圍。siRNA試劑可以在長度和結(jié)構(gòu)上與天然的Dicer處理的來自長的dsRNAs的產(chǎn)物相同。在實施例中，siRNA試劑的兩條鏈相連，例如包括共價連接。能產(chǎn)生所需雙鏈區(qū)和優(yōu)選為3'端突出端的發(fā)夾或其它單鏈結(jié)構(gòu)，都在本發(fā)明范圍內(nèi)。以下的討論多數(shù)是針對單鏈分子。在本發(fā)明的很多實施例中，需要或優(yōu)選dsiRNA試劑，例如一種部分地dsiRNA試劑。所以，應(yīng)該理解的是，由以下所描述的單鏈結(jié)構(gòu)組成的雙鏈結(jié)構(gòu)(例如兩條分開的分子相接觸形成雙鏈區(qū)或雙鏈區(qū)是通過鏈內(nèi)分子配對(例如發(fā)夾結(jié)構(gòu))形成的)屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。優(yōu)選的長度在其它各處都有描述。候選iRNA試劑的評估候選iRNA試劑負調(diào)解靶基因表達的能力可以被評估。例如，提供一種候選iRNA試劑，使其與一種表達耙基因如ApoB基因的細胞如HepG2細胞相接觸，該基因或者是內(nèi)源性的或者是用一種能夠表達ApoB表達的構(gòu)造而被轉(zhuǎn)染。靶基因在接觸候選iRNA試劑之前和之后的表達水平可以進行比較，例如，在mRNA或蛋白質(zhì)水平上的比較。如果確定靶基因的RNA或蛋白質(zhì)表達的量在接觸了iRNA試劑之后變低，則說明iRNA試劑負調(diào)解了靶基因的表達。靶ApoBRNA或ApoB蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的水平可以用任何所需方法來確定。例如，靶RNA的水平可以用RNA印跡法、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)或核糖核酸酶保護分析進行測定。蛋白質(zhì)水平可以通過例如蛋白質(zhì)印跡法來測定。穩(wěn)定性測試、修飾和iRNA試劑的重測試可以評估候選iRNA試劑的穩(wěn)定性，例如，當(dāng)例如把iRNA試劑引入進受試者身體時，它對核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶剪切的易感性。多種方法可以用來確定對修飾尤其是對剪切的易感性的位點，例如用受試者體內(nèi)一種成分的剪切。如果對剪切易感的位點被確定，還可對iRNA試劑進行設(shè)計和/或合成，其中，潛在的剪切位點被制成對剪切有耐性，例如引入在剪切位點2'的修飾，如2'-氧-甲基基團。該被修飾了的iRNA試劑可被重新測試其穩(wěn)定性，并且這個過程可以反復(fù)進行，直到iRNA試劑表現(xiàn)出所需的穩(wěn)定性。體內(nèi)測試iRNA試劑被確認具有抑制ApoB基因表達的能力，可以利用動物模型(例如，哺乳類如小鼠或兔子)進行體內(nèi)的功能性測試。例如，iRNA試劑施用到某個動物，然后根據(jù)它的生物分布、穩(wěn)定性和它的抑制ApoB基因表達的能力進行評估。iRNA試劑可以直接施用到靶組織，例如通過注射的方式，或者iRNA試劑以與施用到人同樣的方式施用到動物模型。還可以評估iRNA試劑的細胞內(nèi)分布。該評估可以包括確定iRNA試劑是否被細胞所利用。該評估還可以包括確定iRNA試劑的穩(wěn)定性(例如半衰期)。iRNA試劑的體內(nèi)評估還可以通過將iRNA試劑連接到一種示蹤性的標記物(例如一種熒光標記，如熒光素；同位素放射性標記，如"S、32P、33或3^金顆粒；或者用于免疫組織化學(xué)的抗原顆粒)?？捎糜诒O(jiān)測生物分布的iRNA試劑，能夠在體內(nèi)缺少使基因沉默的活性。例如，iRNA試劑能耙向不存在于動物體內(nèi)的基因(例如注射進小鼠體內(nèi)的iRNA試劑可以靶向熒光素酶)，或者是iRNA試劑具有不能靶向任何基因(例如內(nèi)源性基因)的無義序列。該iRNA的定位/生物分布能夠被檢測到，例如通過連接到iRNA試劑的示蹤性標記，如以上所述的那些示蹤劑。還可以對iRNA試劑負調(diào)解ApoB基因表達的能力進行評估。可以測定到體內(nèi)ApoB基因表達的水平，例如通過原位雜交，或者是通過暴露于iRNA試劑之前和之后RNA與組織的分離作用。當(dāng)為獲得該組織而需要處死動物時，另外未經(jīng)過處理的對照動物用于比較。耙ApoBmRNA可以通過任何所需方法被檢測到，包括但不局限于RT-PCR、RNA印跡法、分支DNA測定法測試或核糖核酸酶保護分析?；蛘?，ApoB基因表達還可以通過實施蛋白質(zhì)印跡分析對經(jīng)過iRNA試劑處理的組織提取物進行檢測。iRNA化學(xué)在本文所描述的為分離的iRNA試劑，例如RNA分子(雙鏈；單鏈)，其能夠介導(dǎo)RNAi抑制ApoB的表達。在此所討論的RNA試劑包括未修飾的RNA以及為提高功效而修飾的RNA，和核苷替代物的多聚體。未修飾RNA是指一種分子，其中核酸、所說的糖、堿基和磷酸酯結(jié)構(gòu)成份與天然的成份一樣或基本相同，優(yōu)選為人體內(nèi)的天然成份。現(xiàn)有技術(shù)將稀有的或不尋常但是天然發(fā)生的RNAs看作是修飾的RNAs，參見Limbach等，(1994)7Vwc/e/cJc/A22:2183-2196。這樣的稀有或不尋常的修飾的RNAs通常被稱為修飾的RNAs(很顯然是因為它們是轉(zhuǎn)錄后修飾的結(jié)果)，并在本文屬于未修飾的RNA。在本文所使用的修飾的RNA是指一種分子，其中核酸的組分，即糖、堿基和磷酸酯結(jié)構(gòu)的一或多個成份，與天然的成份不一樣，優(yōu)選為不同于產(chǎn)生自人體的天然成份。雖然它們被稱為修飾的"RNAs"，但由于修飾作用，它們當(dāng)然包含不是RNAs的分子。核苷替代物是這樣一些分子，其中核糖磷酸酯主鏈被非核糖磷酸酯構(gòu)造所替代，該構(gòu)造使堿基處于正確的空間關(guān)系，以便雜交與所見到的與核糖磷酸酯主鏈的雜交基本相似，例如，非帶電的核糖磷酸酯主鏈的類似物。以上所述的實例都在此討論。在本文所述的修飾可以并入到任何雙鏈RNA和在本文所描述的RNA樣分子如iRNA試劑中。可能需要對iRNA試劑的反義鏈和有義鏈的一條鏈或兩條鏈進行修飾。由于核酸是亞基或單體的多聚體，許多如下所述的修飾發(fā)生于可以在核酸內(nèi)重復(fù)的部位，例如堿基或磷酸酯結(jié)構(gòu)，或磷酸酯結(jié)構(gòu)的非連接氧的修飾。在某些情況下，該修飾會在核酸的所有涉及部位發(fā)生，但事實上在大多數(shù)情況下，并不是這樣。作為實例，修飾可以僅發(fā)生于3，或5'末端，也可以僅發(fā)生于末端區(qū)域，例如在鏈的末端核苷酸或最后2、3、4、5或10個核苷酸的部位。修飾可發(fā)生于雙鏈區(qū)、單鏈區(qū)或二者都有。例如，在非結(jié)合氧部位的硫代磷酸酯修飾僅在一個末端或兩個末端發(fā)生，也可以在末端區(qū)域發(fā)生，例如在鏈的末端核苷酸或最后2、3、4、5或10個核苷酸的部位，或是發(fā)生于雙鏈和單鏈區(qū)，尤其是在兩個末端。類似地，修飾可以發(fā)生在有義鏈、反義鏈或兩者都有。在某些情況下，有義鏈和反義鏈具有相同修飾或者同類修飾，但是在其它情形下，有義鏈和反義鏈具有不同的修飾，例如，在某些情況下，僅對一條鏈進行修飾，例如有義鏈。對iRNA試劑進行修飾的兩個主要目的是獲得它們對生物環(huán)境降解的穩(wěn)定性以及改進藥理學(xué)性質(zhì)，例如藥效性質(zhì)，這一點下面還將進行闡述。其它的對iRNA試劑的糖、堿基或骨架的適當(dāng)?shù)男揎椩诠灿蠵CT申請No.PCT/US2004/01193中有所描述，該申請于2004年1月16日遞交。iRNA試劑可以包含非天然存在的堿基，如在2004年4月16日提交的共有PCT申請No.PCT/US2004/011822中所描述的。iRNA試劑可以包含非天然存在的糖，如非碳水化合物環(huán)形載體分子。用于iRNA試劑的非天然存在的糖的典型特性，在共有PCT申請No.PCT/US2004/011829中有所描述，該申請于2003年4月16日遞交。iRNA試劑可以包括核苷酸之間的鍵(例如手性硫代磷酸酯鍵)，用于增加核酸酶抗性。iRNA試劑此外還可包含，或者可選擇地包含，核糖類似物以增加核酸酶抗性。典型的用于增加核酸酶抗性的核苷酸間的鍵和核糖類似物在共有PCT申請No.PCT/US2004/07070中有所描述，該申請于2004年3月8日遞交。iRNA試劑可以包括用于寡核苷酸合成的與配體結(jié)合的單體亞基和單體。典型的單體在共有美國申請No.10/916,185中有所描述，該申請于2004年8月10日遞交。iRNA試劑可以具有ZXY結(jié)構(gòu)，如在共有PCT申請No.PCT/US2004/07070中有所描述，該申請于2004年3月8日遞交。iRNA試劑可以與雙親結(jié)構(gòu)結(jié)合。用于iRNA試劑典型的雙親結(jié)構(gòu)在共有PCT申請No.PCT/US2004/07070中有所描述，該申請于2004年3月8日遞交。iRNA試劑的有義和反義序列可以是回文序列?；匚膇RNA試劑的典型特征在共有PCT申請No.PCT/US2004/07070中有所描述，該申請于2004年3月8日遞交。在另一項實施例中，iRNA試劑可以與輸送試劑復(fù)合，使其特征為模塊復(fù)合物(modularcomplex)。所述復(fù)合物可以包含載體試劑，該載體試劑連接到下述(a)、(b)和(c)中的一個或多個(優(yōu)選是兩個或多個，更優(yōu)選是三個)(a).凝聚劑(例如一種試劑，其可以通過離子或靜電相互作用，具有吸引諸如結(jié)合核酸的能力)；(b).融合劑(例如一種能夠融合和/或通過細胞膜被輸送的試劑)；和(c).耙向基團，例如細胞或組織靶向試劑，諸如凝集素、糖蛋白、脂或蛋白質(zhì)，例如一種能夠結(jié)合到某一特定細胞類型的抗體。iRNA試劑與輸送試劑的復(fù)合在共有PCT申請No.PCT/US2004/07070中有所描述，該申請于2004年3月8日遞交。iRNA試劑可以具有非規(guī)范的配對，比如在iRNA雙鏈分子的有義序列和反義序列之間。非規(guī)范配對的iRNA試劑的典型特征在共有PCT申請No.PCT/US2004/07070中有所描述，該申請于2004年3月8日遞交增強的核酸酶抗性iRNA試劑，如靶向ApoB的iRNA試劑，對核酸酶具有增強的抗性。增加抗性的一個途徑是確定剪切位點和將這些位點進行修飾以抑制剪切。例如，二核苷酸5，-UA-3，、5，-UG-3，、5,國CA-3'、5'-UU畫3，或5，-CC-3，作為剪切點已經(jīng)在審理中的共有申請U.S.60/574,744和共有PCT申請PCT/US2005/018931中有所描述。為增加核酸酶抗性和/或增加與靶結(jié)合的親和性，iRNA試劑，如具有有義鏈和/或反義鏈的iRNA試劑，可以包括諸如2'修飾的核糖單元和/或硫代磷酸酯鍵。例如，2'羥基基團(OH)可以被許多不同的"含氧"或"脫氧"取代基修飾或取代。2'羥基基團的"含氧"修飾的實例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R=H，垸基、環(huán)垸基、芳基、芳垸基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、0(CH2CH20)nCH2CH2OR;"鎖"核酸(LNA)，其中2'羥基通過諸如亞甲基橋連接到相同核糖的4'碳；O-AMINE(AMINE=NH2;烷基胺、二垸基胺、雜環(huán)基胺、芳基胺、二芳基胺、雜芳基胺或二雜芳基胺、乙二胺、多胺)和氨基垸氧基，0(CH2)nAMINE,(例如，AMINE=NH2;烷基胺、二垸基胺、雜環(huán)基胺、芳基胺、二芳基胺、雜芳基胺或二雜芳基胺、乙二胺、多胺)。值得注意的是，僅含有甲氧基乙基(MOE)(OCH2CH2OCH3,PEG的衍生物)的寡核苷酸，與那些用強硫代磷酸酯修飾修飾的寡核苷酸相比，表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)暮怂崦阜€(wěn)定性。"脫氧"修飾包括氫(即尤其針對部分dsRNA突出端部分的脫氧核糖)；鹵素(例如氟)；氨基(如NH2;垸基胺、二垸基胺、雜環(huán)基胺、芳基胺、二芳基胺、雜芳基胺、二雜芳基胺或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE=NH2;烷基胺、二烷基胺、雜環(huán)基胺、芳基胺、二芳基胺、雜芳基胺，或二雜芳基胺)，-NHC(O)R(尺=烷基、環(huán)垸基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)，氰基；巰基；烷基-硫代-垸基；硫代烷氧基；和烷基、環(huán)垸基、芳基、烯基、炔基，它們可以被諸如氨基官能團所取代。優(yōu)選的取代基是2，-甲氧基乙基、2，-OCH3、2'-0-烯丙基、2'-C-烯丙基和2，-氟。為最大化核酸酶抗性，2'-修飾可以與一個或多個磷酸鍵修飾(例如硫代磷酸酯)聯(lián)合使用。"嵌合"寡核苷酸是指含有兩個或多個不同修飾的寡核苷酸。在某些實施例中，iRNA試劑的所有嘧啶都進行2'修飾，因而iRNA試劑促進了對核酸內(nèi)切酶的抗性。核酸抗性也可通過5'修飾而得到促進，導(dǎo)致諸如至少一個5'-尿苷-腺嘌呤-3'(5，-UA-3，)二核苷酸，其中尿苷是2'-修飾的核苷酸；至少一個5'-尿苷-鳥嘌呤-3'(5'-UG-3')二核苷酸，其中5'-尿苷是2'-修飾的核苷酸;至少一個5'-胞苷-腺嘌呤-3，(5'-CA-3，)二核苷酸，其中5'-胞苷是2'-修飾的核苷酸；至少一個5'-尿苷-尿苷-3'(5'-UU-3，)二核苷酸，其中5'-尿苷是2，-修飾的核苷酸；或者至少一個5'-胞苷-胞苷-3'(5，-CC-3，)二核苷酸，其中5'-胞苷是2'-修飾的核苷酸。iRNA試劑可以包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個這種二核苷酸。優(yōu)選的是，出現(xiàn)于所有序列基序5'-UA-3'、5'-CA-3'、5'-UU-3'和5'-UG-3'的最5'端的嘧啶是2'修飾的核苷酸。更優(yōu)選的是，所有出現(xiàn)于有義鏈的嘧啶為2'-修飾的核苷酸，并且是出現(xiàn)于所有基序列5'-UA-3'和5'-CA-3'的最5'端的嘧啶。最優(yōu)選的是，所有位于有義鏈的嘧啶為2'-修飾的核苷酸，并且在反義鏈中出現(xiàn)于所有序列基序5,-UA畫3,、5，-CA-3，、5'-UU-3'和5'-UG-3，的最5'端的嘧啶是2，-修飾的核苷酸。本發(fā)明人指出當(dāng)使獲得的理想穩(wěn)定性所需的修飾總數(shù)最小化時，后一種修飾顯示出核苷修飾在整個分子的抗核酸酶降解的穩(wěn)定性中的貢獻最大化，參見審理中的共同申請的PCT申請PCT/US2005/018931中，在此作為參考。寡核苷酸主鏈中包含的呋喃糖也可以降低核酸內(nèi)切。iRNA試劑可以通過含有3'陽離子的基團進行進一步修飾，或是通過3，-3'鍵在3，末端將核苷反轉(zhuǎn)(inverting)進行修飾。在另一種選擇中，3'末端可以被氨基垸基封閉，例如3'C5-氨基垸基dT。其它的3'結(jié)合物能夠抑制3'-5'核酸外切。不受理論的約束，3'結(jié)合物如甲氧萘丙酸和異丁苯丙酸，能夠通過空間位阻阻止核酸外切酶結(jié)合到寡核苷酸的3'端而抑制核酸外切。甚至小的烷基鏈、芳香基團或者雜環(huán)結(jié)合物或修飾的糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)也能夠阻滯3'-5'核酸外切酶。相似地，5'結(jié)合物能夠抑制5'-3'核酸外切。不受理論的約束，5'結(jié)合物諸如甲氧萘丙酸或異丁苯丙酸，可以通過空間位阻阻止核酸外切酶結(jié)合到寡核苷酸的5'端而抑制核酸外切。甚至小的垸基鏈、芳香基團或者雜環(huán)結(jié)合物或修飾的糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)能夠阻滯3'-5'核酸外切酶。當(dāng)雙鏈iRNA試劑包括位于至少一端的單鏈核苷酸突出端時，該iRNA試劑具有增加的核酸酶抗性。在優(yōu)選實施例中，核酸突出端包含l到4個，優(yōu)選是2到3個的未配對核苷酸。在一項優(yōu)選實施例中，直接與端部核苷酸對相鄰的單鏈突出端未配對的核苷酸，包含有一個嘌呤堿基，而且端部核苷酸對是G-C對，或者最后四個互補核苷酸對中的至少兩個為G-C對。進一步地，在有些實施例中，核苷酸突出端可以含有1個或2個未配對的核苷酸，并且在典型實施例中，核苷酸突出端為5'-GC-3'。在一項優(yōu)選實施例中，iRNA試劑包括位于反義鏈3'端的基序5'-CGC-3',從而形成2-nt突出端5'-GC-3'。所以，iRNA試劑可以包含單體，該單體己經(jīng)被修飾以抑制降解，例如抑制來自受試者體內(nèi)的核酸酶如核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶的降解。這些單體在本文是指NRMs，即核酸酶抗性促進單體(NucleaseResistancepromotingMonomers)或修飾物。在很多情形下，這些修飾也會調(diào)節(jié)iRNA試劑的其它特性，例如，與蛋白質(zhì)相互作用的能力，如轉(zhuǎn)移蛋白諸如血清白蛋白，或者RISC的成員，或者第一和第二序列互相形成雙鏈或與其它序列如靶分子形成雙鏈的能力。不受理論的約束，認為iRNA試劑中的糖、堿基和/或磷酸酯主鏈的修飾能夠提高核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的抗性，并且能夠促進與轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)和一個或多個RISC復(fù)合物的功能性成分的相互作用。優(yōu)選的修飾是指增進了對核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶的抗性，從而在與RISC復(fù)合物相互作用之前延長iRNA試劑的半衰期，但同時不降低iRNA試劑作為靶向mRNA酶切導(dǎo)向試劑的活性。并且，不受理論的約束，相信將修飾定位于在或靠近反義鏈的3'和/或5，端，使iRNA試劑滿足以上所述的優(yōu)選的核酸酶抗性的標準。并且，仍舊不受理論的約束，相信將修飾定位在例如有義鏈的中部會使iRNA試劑顯示出脫靶效應(yīng)的可能性相對小。用于產(chǎn)生滿足于如上所述的優(yōu)選核酸酶抗性標準的iRNA試劑的修飾，可以包含一個或多個的如下糖、堿基和/或磷酸酯主鏈的化學(xué)的和/或立體化學(xué)修飾。(0手性(Sp)硫代物。所以，優(yōu)選的NRMs包括核苷酸二聚體，該核苷酸二聚體富含或全部都是特定手性形式的修飾的磷酸酯基，該修飾的磷酸酯基含有在非橋部位的雜原子，如在X位點的Sp或Rp，該位點一般被氧所占據(jù)。在X處的原子也可以是S、Se、Nr2或B。。當(dāng)X為S時，優(yōu)選富含或全部都是手性(手性純)Sp鍵。富含意為至少70%、80°/。、90%、95%或99%的優(yōu)選形式。這種NRMs在下面將有更詳細的描述；(ii)一個或多個陽離子基團與糖、堿基和/或磷酸酯或修飾的磷酸酯主鏈結(jié)構(gòu)的磷原子的結(jié)合。因此，優(yōu)選的NRMs包括在末端衍生陽離子基團的單體。由于反義序列5'端應(yīng)該具有端基-OH或磷酸酯基，該NRM優(yōu)選不在反義序列的5'端使用。該基團應(yīng)該在堿基上對H鍵形成和雜交的干擾最小的位點結(jié)合，例如，遠離與另一條鏈的互補堿基相互作用的面，如5'位的嘧啶或7位的嘌呤。這些內(nèi)容將在下面要詳細討論；(iii)末端的非磷酸鍵。所以，優(yōu)選的NRMs包括非磷酸鍵，如4個碳原子的鍵，其比磷酸鍵對酶切具有更大的抗性。實例包括3，CH2-NCH3-0-CH2-5，和3，CH2-NH-(0=)-CH2-5，；(iv)3'-橋連硫代磷酸酯和5'-橋連硫代磷酸酯。所以，優(yōu)選的NRMs包括這些結(jié)構(gòu)；(v)L-RNA、2'-5'鍵、反向鍵、a-核苷。所以，其它優(yōu)選的NRMs包括L核苷和來自L-核苷的二聚核苷酸；2'-5'磷酸酯鍵、非磷酸酯鍵和修飾的磷酸酯鍵(例如，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和硼磷酸酯(boronophosphate));具有反向鍵的二聚體，例如3，-3，或5，-5，鍵；具有在糖l'位的a鍵的單體，例如在本文所描述的具有a鍵的結(jié)構(gòu)；(vi)結(jié)合基團。所以，優(yōu)選的NRMs可以包含例如在本文所描述的例如通過糖、堿基或主鏈與單體結(jié)合的耙向結(jié)構(gòu)或結(jié)合配體。(vii)脫堿基鍵。所以，優(yōu)選的NRMsk可以包含脫堿基單體，如在本文所描述的脫堿基單體(例如，無堿基單體)；如在本文所描述的芳香族單體或雜環(huán)單體或多雜環(huán)芳香族單體；和(viii)5'-膦酸酯和5'-磷酸酯前藥。所以NRMs包括單體，優(yōu)選在末端位點，例如5'位，其中一個或多個磷酸酯基團原子用保護基團進行衍生，該一個或多個保護基團由于受試者體內(nèi)的某種成分的作用而被去除，例如受試者體內(nèi)的羧酸酯酶或某種酶。例如，一種磷酸酯前藥，其中羧酸酯酶裂解受保護的分子，導(dǎo)致硫代陰離子的產(chǎn)生，該硫代陰離子攻擊與磷酸酯的氧相鄰的碳并導(dǎo)致脫保護的磷酸酯的產(chǎn)生。一個或更多個不同的NRM修飾可以引入到iRNA試劑或iRNA試劑的序列中。可在一條序列或iRNA試劑中使用一次以上的NRM修飾。由于某些NRMs干擾雜交，所以其使用總數(shù)量應(yīng)能保持可接受水平的iRNA試劑雙鏈體的形成。在某些實施例中，NRM修飾被引入到一條序列的端部酶切位點或酶切區(qū)域(有義鏈或序列)，其不會耙向受試者體內(nèi)所需的序列或基因。如此，可以減少脫靶沉默(off-targetsilencing)。核酸酶抗性修飾包括一些可以只在末端或其它任何可行的部位的修飾。一般來說，修飾能夠抑制雜交，所以優(yōu)選是僅在末端區(qū)域利用它們，并且優(yōu)選是不在序列的酶切位點或酶切區(qū)域使用它們，所述序列靶向受試者的序列或基因。如果在iRNA試劑兩條序列之間保持有充分的雜交，則它們可以用于有義序列的任何一個部位。在某些實施例中，需要將NRM置于序列的酶切位點或酶切區(qū)域，該序列不靶向受試者的序列或基因，因為它能夠最小化脫靶沉默。另外，在本文所描述的iRNA試劑可以具有一個突出端，該突出端不會與iRNA試劑的其它序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)一一它是一個突出端，但除了iRNA試劑的其它序列之外，其既與自身也與另一條核苷酸雜交。在大多數(shù)情形下，核酸酶抗性促進修飾會隨著序列是否靶向受試者的序列(通常是指反義序列)或不靶向受試者的序列(通常是指有義序列)而有所不同。如果序列靶向受試者序列，那么干擾或抑制核酸內(nèi)切酶酶切的修飾就不插入受RISC介導(dǎo)的酶切區(qū)域，例如，酶切位點或酶切區(qū)域(參見Elbashir等，2001年,GenesandDev.15:188)。該靶點的酶切大約位于20或21nt的向?qū)NA的中部，或者是第一條核苷酸上游的10或11個核苷酸的中間，該第一條核苷酸與向?qū)Ш塑账峄パa。如在此所述，酶切位點是指位于剪切位點任意一側(cè)的核苷酸，在靶點上或在與之雜交的iRNA試劑鏈上。酶切區(qū)域是指任一方向上具有酶切位點的l、2或3個核苷酸的核苷酸。這種修飾可以被引入到末端區(qū)域，例如，一條序列末端或距末端2、3、4或5個核苷酸的位置，該序列耙向或不耙向受試者的序列。栓系配體iRNA試劑的特性包括它的藥理學(xué)特性，可以受到配體如栓系配體引入的影響和調(diào)整。很多種實體物質(zhì)如配體，能夠被束縛到iRNA試劑上，例如，到結(jié)合配體的單體亞基的載體上。實例在下面有關(guān)結(jié)合配體的單體亞基的內(nèi)容中有所描述，但只是優(yōu)選部分，實體物質(zhì)可在其它位點處與iRNA試劑結(jié)合。優(yōu)選結(jié)構(gòu)是配體，它們能夠通過介入束縛而直接或間接地連接到載體，優(yōu)選是共價地連接。在優(yōu)選實施例中，所述配體是通過介入束縛而結(jié)合到載體上的。當(dāng)結(jié)合配體的單體被并入正在生長的鏈時，所述配體或束縛的配體可以出現(xiàn)在結(jié)合配體的單體上。在某些實施例中，在結(jié)合"前體"配體的單體亞基已經(jīng)被并入生長中的鏈之后，該配體能夠并入到結(jié)合"前體"配體的單體亞基中。例如，一個單體具有諸如氨基末端的束縛，如TAP(CH2)nNH2,可以被并入進一個生長中的有義鏈或反義鏈。在之后的步驟中，即在前體單體亞基被并入鏈之后，具有親電基團如五氟苯酯或醛基的配體，可通過將配體的親電基團連接到結(jié)合前體配體的單體亞基束縛的末端親核基團，從而連接到結(jié)合前體配體的單體上。在優(yōu)選實施例中，配體改變了與其結(jié)合的iRNA試劑的分布、靶向或壽命。在優(yōu)選實施例中，與缺乏配體的種類相比較，配體增強了所選擇的靶的親和力，所選擇的耙例如為分子、細胞或細胞類別和諸如細胞或器官腔隙的腔隙、組織、器官或身體的某個區(qū)域。優(yōu)選的配體能夠促進運輸、雜交和特異性的特性，并能夠促進所獲天然的或修飾的寡核糖核苷酸的核酸酶抗性，或者促進含有任一在本文所描述的單體和/或天然或修飾的核糖核苷酸的結(jié)合體的多聚體分子的核酸酶抗性。一般來說，配體包括治療性修飾物，如利于增進吸收；例如用于監(jiān)測分布的診斷化合物或報告基團(reportergroup);交聯(lián)劑；賦予核酸酶抗性的結(jié)構(gòu)；和天然或不尋常的核苷堿基(nudeobase)。普通的實例包括親脂類、脂類、類固醇(如，uvaol，hecigenin,diosgenin)、萜類(例如三萜，諸如薩灑皂草配基、Frieddin、衍生自表木栓醇的石膽酸)、維生素(例如葉酸、維生素A、生物素、維生素B6)、碳水化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合試劑、整合蛋白靶向分子、聚陽離子、肽、多胺和擬肽。配體可包括自然生成的物質(zhì)，(如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)，或球蛋白)；碳水化合物(如右旋糖苷、普魯蘭多糖、幾丁質(zhì)、殼聚糖、菊粉、環(huán)糊精或透明質(zhì)酸)；氨基酸，或脂類。配體還可以是重組體或合成分子，如合成聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的實例包括氨基酸為聚賴氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、poly(L-lactide-co-glycolied)copolymer、聯(lián)乙烯醚-馬來酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺類的實例包括聚氮丙啶(polyethylenimine)、聚賴氨酸、亞精胺、精胺、多胺、偽肽-多胺、擬肽多胺、樹狀聚合物多胺、精氨酸、脒、精蛋白、陽離子結(jié)構(gòu)，例如，陽離子脂質(zhì)、陽離子卟啉、多胺季銨鹽或Ct螺旋肽。配體還可以包括靶向基團，例如，細胞或組織靶向試劑，如凝集素、糖蛋白、脂或蛋白質(zhì)，例如結(jié)合到某一個特定的細胞如肝細胞或空腸細胞的抗體。靶向基團可以為促甲狀腺素、促黑細胞激素、凝集素、糖蛋白、表面活性劑蛋白A、粘液素碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、多價甘露糖、多價海藻糖、糖基化聚氨基酸、多價半乳糖、鐵傳遞蛋白、二膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂、膽固醇、類固醇、膽酸、葉酸、維生素B12、生物素、或RGD肽或RGD擬肽。其它配體的實例包括染料、嵌入劑(如吖啶)、交聯(lián)劑(如補骨脂靈、絲裂霉素C)、H卜啉(TPPC4、德葉啉、Sapphyrin)、多環(huán)芳香烴(如吩嗪、二氫吩嗪)、人工核酸內(nèi)切酶(如EDTA)、親脂性分子，如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪丸激素(dihydrotestosterone)、甘油(如其酯及其醚，例如C10、Cu、C12、C13、d4、d5、d6、Cn、d8、d9或C2Q烷基；例如，1，3-二-0(十六垸基)甘油、1，3-二-0(十八烷基)甘油)、geranyloxyhexyl、十六垸基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七垸基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、03-(油?；?石膽酸、03-(油酰基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)，以及肽結(jié)合物(如antennapedia肽、Tat肽)、烷基化試劑、磷酸酯、氨基、巰基、PEG(如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、多胺、烷基、取代的烷基、放射性同位素標記物、酶、半抗原(例如生物素)、運輸/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成的核糖核酸酶(例如咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑結(jié)合物、四氮雜大環(huán)的Eu3+復(fù)合物)、二硝基苯基、HRP或AP。配體可以是蛋白質(zhì)，如糖蛋白或肽，如針對共配體(co-ligand)具有特定親和力的分子；或抗體，其能結(jié)合到特定細胞如癌細胞、內(nèi)皮細胞或骨細胞上。配體還可以包括激素或激素受體。它們還包括非肽類，如脂、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、多價甘露糖、或多價海藻糖。配體可以為例如脂多糖，一種p38MAP激活劑或是NF-kB激活劑。配體可以是一種物質(zhì)，例如一種藥，它能夠通過破壞細胞的細胞骨架，如破壞細胞的微管、微絲和/或中間纖維來增強iRNA試劑被吸收進入細胞。所述藥可以為例如taxon、長春新堿、長春堿、細胞松弛素、噻氨酉旨魅唑、japlakinolide、latmnculinA、夢5基毒月太、swinholideA、indanocine或myoservin。所述配體能夠通過激活諸如炎性反應(yīng)來增強細胞對iRNA試劑的吸收。示例性配體應(yīng)具有這樣的功效，包括腫瘤壞死因子a(TNFalpha)、白細胞介素-ip或Y干擾素。一方面，所述配體為脂或脂類分子。這種脂或脂類分子優(yōu)選為能夠結(jié)合一種血清蛋白，例如，人血清白蛋白(HSA)。一種HSA結(jié)合配體可以使這種結(jié)合物分布到靶組織上，如肝組織，包括肝的實質(zhì)細胞。其它能夠結(jié)合HAS的分子也可用作配體，例如neproxin或阿司匹林。脂或脂類配體能夠(a)增強對這種結(jié)合物降解的抗性，(b)促進靶向或運輸?shù)桨壹毎蚣毎ぃ?或(c)能夠用于調(diào)節(jié)與血清蛋白的結(jié)合，例如HSA。脂類配體可用于調(diào)節(jié)，如控制所述結(jié)合物與靶組織的結(jié)合。例如，與HSA結(jié)合的脂或脂類配體更加不太可能靶向到腎臟，因而被排出體外的可能性很小。與HSA結(jié)合的脂或脂類配體很少被用于將結(jié)合物靶向到腎臟。在一項優(yōu)選實施例中，脂類配體結(jié)合HSA。優(yōu)選地，它有足夠的親和力與HSA結(jié)合，從而該結(jié)合物將優(yōu)選地分配到非腎臟組織。但優(yōu)選地，該親和力并不會太強以致這種HSA-配體的結(jié)合不能逆轉(zhuǎn)。另一方面，所述配體是一種結(jié)構(gòu)，如一種維生素，它被靶細胞如增生性細胞吸收。這些特性尤其對治療不需要的細胞增生性病癥有益，例如，惡性或非惡性類型細胞如癌細胞。示例的維生素包括維生素A、E和K。其它的實例維生素包括維生素B，例如葉酸、B12、核黃素、生物素、維生素B6或其它被癌細胞吸收的維生素或營養(yǎng)。還包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。另一方面，所述配體為細胞滲透試劑，優(yōu)選為螺旋狀細胞滲透試劑。優(yōu)選地，該試劑為兩性分子。示例的試劑是一種肽，諸如tat或antermopedia。如果所述試劑是一種肽，它可以是被修飾的肽，其包括擬肽、逆轉(zhuǎn)體(invertomers)、非肽或偽肽的鍵，以及D-氨基酸的應(yīng)用。螺旋狀試劑優(yōu)選為(x-螺旋試劑，其具有親脂和疏脂相?？梢允褂冒邢蛟錾毎麅?nèi)富含的標記物的肽。例如，含有RGD的肽和擬肽能夠靶向癌細胞，尤其是表達avP3整合蛋白的細胞。所以可以使用RGD肽、含有RGD的環(huán)肽、包括D-氨基酸的RGD肽，以及合成的RGD模擬物。除了RGD之外，還可以使用其它靶向(Xv(33整合蛋白配體的結(jié)構(gòu)。一般來說，這樣的配體能夠用來控制增殖細胞和血管生成。這種類型的優(yōu)選結(jié)合物包括能耙向PECAM-1、VEGF或其它癌基因，如在本文所描述的癌基因的iRNA試劑。與糖如半乳糖和/或其類似物結(jié)合的靶向試劑尤其有用。這些試劑尤其是靶向肝臟的實質(zhì)細胞。例如靶向結(jié)構(gòu)可以包含超過一個優(yōu)選為2個或3個的半乳糖結(jié)構(gòu)，相互之間的間隔大約為15埃左右。耙向結(jié)構(gòu)也可以是乳糖(例如三個乳糖結(jié)構(gòu))，其由葡萄糖與半乳糖結(jié)合而成。靶向結(jié)構(gòu)還可以為N-乙?；?半乳糖胺和N-乙酰-葡糖胺。甘露糖或甘露糖-6-磷酸酯靶向結(jié)構(gòu)可用于靶向巨噬細胞。所述配體可以為肽或擬肽。擬肽(在此也指寡擬肽)是一種能夠折疊成與天然肽類似的所限定的三維結(jié)構(gòu)的分子。肽和擬肽與iRNA試劑的結(jié)合通過如增強細胞識別和吸收，而影響iRNA藥代動力學(xué)的分布。肽或擬肽結(jié)構(gòu)大約為5-50個氨基酸的長度，例如大約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸的長度。iRNA結(jié)合物iRNA試劑可以通過諸如共價結(jié)合而與第二種試劑結(jié)合。例如，用于治療一種特定疾病如脂類紊亂的iRNA試劑，能夠與除了iRNA試劑的第二種治療試劑結(jié)合。所述第二種治療試劑可為治療同一種病癥的試劑。5'-磷酸酯修飾在優(yōu)選實施例中，iRNA試劑為5'磷?；虬?'起始端磷酰基類似物。反義鏈5'-磷酸酯修飾包括那些與RISC介導(dǎo)的基因沉默相容的修飾。適合的修飾包括5，-單磷酸酯((HO)2(O)P-0-5，)；5，-二磷酸酯((HO)2(O)P隱0國P(HO)(0)-0國5，)；5，-三磷酸酯((HO)2(O)P畫O-(HO)(O)P畫O-P(HO)(O)-0-5，);5，-鳥苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-0-5，-(HO)(0)P-0(HO)(0)P-0-P(HO)(0)-0-5，;5，-腺苷帽(Appp)，和任一修飾的或未修飾的核苷酸帽結(jié)構(gòu)(N-0畫5，國(HO)(0)P-0-(HO)(0)P國0國P(HO)(0)-0-5，)；5'畫單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-0-5，)；5'-單二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-0-5，),5'-硫代磷酸酯(HO)2(O)P-S-5，);如下任一其它的組合，氧/硫取代的單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯(如5'-a-硫代三磷酸酯、5'卞硫代三磷酸酯，等)、5'-氨基磷酸酯((HO)2(0)P-NH-5，，(HO)(NH2)(0)P-0-5，)，5，-烷基磷酸酯(11=烷基=甲基、乙基、異丙基、丙基等，例如RP(OH)(0)誦0-5，-,(OH)2(0)P-5，-CH2-),5，-烷基醚膦酸酯(R二烷基醚-甲氧基甲基(MeOCH2-)，乙氧基甲基等，例如RP(OH)(0)-0-5，-)。有義鏈被修飾以使有義鏈失活和防止活性RISC的形成，從而減少可能的脫靶效應(yīng)?？梢酝ㄟ^用于阻止有義鏈5'-磷?；男揎梺硗瓿?，例如通過5，-0-甲基核糖核苷酸修飾(參見Nykanen等,(2001)ATPrequirementsandsmallinterferingRNAstructureintheRNAinterferencepathway.Cell107,309-321)。其它阻止磷?；饔玫男揎椂伎梢允褂茫?，用H而不是0-Me來替代5'-OH?；蛘撸瑢⒋篌w積的基團加到5'-磷酸酯，使其成為磷酸二酯鍵。iRNA試劑到組織和細胞的運輸靶向肝臟耙向ApoB的iRNA試劑可以通過例如將iRNA試劑與親脂性結(jié)構(gòu)如脂、油酰基、視黃基或膽固醇基結(jié)合等的結(jié)合作用使iRNA試劑被靶向到肝臟。優(yōu)選為與膽固醇結(jié)合。其它能夠與諸如iRNA試劑結(jié)合的親脂性結(jié)構(gòu)，包括膽酸、金剛垸乙酸、1-芘丁酸、雙氫睪酮、1，3-雙-0(十六垸基)甘油、geranyloxyhexyl基團、十六垸基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七垸基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、03-(油?；?石膽酸、03-(油?；?膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪?；蛘?，iRNA試劑可以通過例如將iRNA試劑結(jié)合到低密度脂蛋白(LDL)，例如乳糖化的LDL等的結(jié)合被耙向到肝臟，或iRNA試劑可以通過例如將iRNA試劑結(jié)合到具有糖殘基的多聚體載體復(fù)合物上等的結(jié)合被靶向到肝臟。iRNA試劑可以通過如結(jié)合作用被靶向到肝臟，如將iRNA試劑與脂質(zhì)體結(jié)合，該脂質(zhì)體與糖殘基復(fù)合。與例如半乳糖和/或其類似物的糖結(jié)合的靶向試劑是尤其有用的。這些試劑尤其靶向肝臟的實質(zhì)細胞。優(yōu)選地，靶向結(jié)構(gòu)包括多于一個半乳糖結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選為兩個或三個。再優(yōu)選地，靶向結(jié)構(gòu)包括三個半乳糖結(jié)構(gòu)，例如相互之間相隔大約15埃。靶向結(jié)構(gòu)可以是乳糖，乳糖為葡萄糖與半乳糖的結(jié)合。優(yōu)選地，靶向結(jié)構(gòu)包括三個乳糖。耙向結(jié)構(gòu)還可以為N-乙?；?半乳糖胺和N-乙?；?葡萄糖胺。甘露糖或甘露糖-6-磷酸酯靶向結(jié)構(gòu)可用于靶向巨噬細胞。iRNA試劑還可以通過與低密度脂蛋白(LDL)例如乳糖化的LDL結(jié)合而被靶向到肝臟。與糖殘基復(fù)合的聚合載體也具有將iRNA試劑耙向到肝臟的功能。靶向試劑可以經(jīng)共價或非共價直接連接到iRNA試劑，或連接到另一種運送或配方形式，如脂質(zhì)體。例如，'具有或不具有靶向結(jié)構(gòu)的iRNA試劑能夠與一種具有或不具有靶向結(jié)構(gòu)的運送形式相結(jié)合，例如脂質(zhì)體。靶向ApoB的iRNA試劑能夠被耙向到肝臟，例如通過結(jié)合的方式，如將iRNA試劑結(jié)合到血清白蛋白(SA)分子，例如，人血清白蛋白(HSA)分子或其片段。iRNA試劑或其組合物對SA例如HSA具有親和力，在SA如HSA存在的情況下，該親和力水平在肝臟中足夠高，達到至少為10%、20°/。、30%、50°/?；?00°/。，或者外源性SA的加入將增加對肝臟的輸送。通過例如測試在加入或缺乏外援小鼠或人SA情況下的分布，可以對這些指標進行測定。SA，如HSA，和靶向試劑可以通過諸如共價或非共價直接連接到iRNS試劑或到另一種運送或配方形式，例如脂質(zhì)體。例如，具有或不具有靶向結(jié)構(gòu)的iRNA試劑能夠與一種具有或不具有耙向結(jié)構(gòu)的運送形式相結(jié)合，例如脂質(zhì)體。iRNA試劑運送進細胞不受任何理論的約束，結(jié)合膽固醇的iRNA試劑和某些脂蛋白成分(如膽固醇、膽固醇酯、磷脂)之間的化學(xué)相似性會導(dǎo)致血液中iRNA試劑與脂蛋白(如LDL、HDL)的結(jié)合，和/或者導(dǎo)致iRNA試劑與對膽固醇，如膽固醇運輸途徑中的成分具有親和力的細胞成分的相互作用。脂蛋白以及它們的組成成分通過各種主動或被動運輸機制被細胞吸收或加工，不受限制地，例如LDL-受體結(jié)合的LDL的內(nèi)吞作用、氧化的或其它修飾的LDL的內(nèi)吞作用，該LDL的修飾通過與Scavenger受體A的相互作用、Scavenger受體Bl-介導(dǎo)的HDL膽固醇在肝臟的吸收，和胞飲作用或經(jīng)過諸如ABC-A1、ABC-G1或ABC-G4的ABC(ATP結(jié)合性盒型)轉(zhuǎn)運蛋白的膽固醇跨膜運輸。所以，結(jié)合膽固醇的iRNA有利于具有這些運輸機制的細胞如肝細胞對對它的吸收。如此，本發(fā)明提供了證據(jù)和通用的方法將iRNA試劑靶向到表達特定細胞表面成分如受體的細胞，其是通過將所述成分(如膽固醇)的天然配體結(jié)合到iRNA試劑，或通過將一種化學(xué)結(jié)構(gòu)(如膽固醇)結(jié)合到結(jié)合有所述成分(例如LDL、HDL)的天然配體的iRNA試劑。其它實施例一種RNA，如iRNA試劑，能夠在體內(nèi)細胞產(chǎn)生，例如通過將外源DNA模板運送入細胞。例如，DNA模板能被插入到載體作為基因治療載體?；蛑委熭d體可以通過靜脈注射、局部給藥(U.S.專利No.5，328，470)或立體定向注射(參見Chen等，/Voc.A^/.^c"df/SJ91:3054-3057,1994)被輸送到某個受試者。基因治療載體的藥物制備包括可以接受的稀釋劑中的基因治療載體或包含一種緩釋基質(zhì)，基因輸送載體被被埋入該緩釋基質(zhì)中。例如，DNA模板包含兩個轉(zhuǎn)錄單位，一個產(chǎn)生包括iRNA試劑上鏈(topstrand)的轉(zhuǎn)錄物，另一個產(chǎn)生包括iRNA試劑下鏈(bottomstrand)的轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)模板被轉(zhuǎn)錄時，iRNA試劑生成并且被加工進siRNA試劑片段中，該片段介導(dǎo)基因沉默。生理效應(yīng)通過iRNA試劑與人和非人類的動物序列的互補性，將在本文所描述的iRNA試劑設(shè)計成使測定治療毒性更容易完成。用這些方法，iRNA試劑可以由一條與人的核酸序列完全互補的序列祖來自至少一種非人類動物如非人類哺乳類諸如嚙齒動物、反芻動物或靈長類的核酸序列組成。例如，非人類哺乳動物可以是小鼠、大鼠、狗、豬、山羊、綿羊、牛、猴子、倭黑猩猩、黑猩猩、獼猴或食蟹猴。iRNA試劑序列能夠與同源基因范圍內(nèi)的序列互補，例如，非人類哺乳動物和人的致癌基因或腫瘤抑制基因。通過測定iRNA試劑在非人類哺乳動物的毒性，可以推斷出iRNA試劑在人體內(nèi)的毒性。對更嚴格的毒性測試，iRNA試劑能夠與人和多于一種如二、三種或更多種非人類動物互補。在本文所描述的方法能夠被用來與iRNA試劑作用于人的任何一種生理效應(yīng)相關(guān)聯(lián)，例如任何不需要的功效，如毒性作用，或任何有益的或需要的效果。iRNA的生產(chǎn)iRNA試劑可以用各種方法進行批量生產(chǎn)。典型的方法包括有機合成和RNA酶切，例如進行體外酶切。有機合成iRNA試劑可以通過分別合成雙鏈RNA分子的每一條鏈制備而成。然后使構(gòu)成鏈(componentstrands)退火。大的生物反應(yīng)器如OligoPilotIIfromPharmaciaBiotecAB(UppsalaSweden)可用于生產(chǎn)大量的用于既定iRNA的特定RNA鏈。OligoPilotII反應(yīng)器僅用過量1.5摩爾的亞磷酰胺核苷酸就能有效地結(jié)合核苷酸。要制備RNA鏈，可以使用核糖核苷酸酰胺(amidites)。單體加成的標準循環(huán)可用于合成iRNA寡聚核苷酸鏈。一般來說，兩條互補鏈分別合成然后退火，例如，從固體支撐物釋放和脫保護之后。有機合成可用于生產(chǎn)不連續(xù)的iRNA種類。對ApoB基因的互補的類型可以被精確地規(guī)定。例如，該種類與某個區(qū)域互補，該區(qū)域包含多態(tài)性，例如單核苷酸多態(tài)性。同時，多態(tài)性的部位可以被準確地確定。在某些實施例中，該多態(tài)性位于內(nèi)部區(qū)域，例如單個或兩個末端的至少4、5、7或9核苷酸。dsRNA酶切iRNA可以通過酶切一個比較大的dsiRNA來制備。該酶切可以體外或體內(nèi)被介導(dǎo)。例如，體外酶切生產(chǎn)iRNA可以通過以下的方法進行體外轉(zhuǎn)錄dsRNA通過從兩個方向轉(zhuǎn)錄核酸(DNA)片段而生成。例如，HiScribeRNAi轉(zhuǎn)錄試劑盒(NewEnglandBiolabs)提供從核酸片段生產(chǎn)dsRNA的載體和方法，，該片段通過T7啟動子在任意一側(cè)的某一部位被克隆進載體。產(chǎn)生了用于T7轉(zhuǎn)錄dsRNA兩條互補鏈的單獨模板。通過加入T7RNA聚合酶，模板進行體外轉(zhuǎn)錄，從而生成dsRNA。使用PCR和/或其它的RNA聚合酶(例如，T3或SP6聚合酶)的類似的方法也都可以使用。在一項實施例中，用該方法產(chǎn)生的RNA經(jīng)過仔細的純化去除會污染重組酶制品的內(nèi)毒素。體外酶切dsRNA經(jīng)體外切割成iRNAs，例如使用Dicer或相容的RNAseIll-based活性。例如，將dsRNA在果蠅的體外提取物中孵育，或者利用純化的組分如純化的RNAse或RISC復(fù)合物。參見Ketting等，Dev2001Oct15;15(20):2654-9以及Hammond的2001Aug10;293(5532):1146-50。dsRNA切割通常產(chǎn)生多個iRNA種類，每一種為源dsRNA分子(sourcedsRNAmolecule)的某個特定的21到23nt片段。例如，可能存在包含與源dsRNA分子的重疊區(qū)域和相鄰區(qū)域互補的序列的固As。不管合成方法如何，iRNA制備可在適于形成配方的溶液(例如，水溶液和/或有機溶液)中進行。例如，iRNA制備物被沉淀并重新溶解于純雙重蒸餾水中，然后被凍干。然后經(jīng)干燥的iRNA重懸于適于進行配方加工的溶液中。修飾的和核苷酸替代品iRNA試劑的合成在下面進行探討。配制在本文所描述的iRNA試劑可以配制成可用于受試者。為了便于理解，這一章節(jié)的配方、組合物和方法主要針對未修飾的iRNA試劑進行討論。但需要明白的是，這些配方、組合物和方法也可以與其它iRNA試劑一同作用，如修飾的iRNA試劑，并且這種使用屬于本發(fā)明的范圍。所配制的iRNA組合物可以設(shè)定為多種狀態(tài)。在一些實例中，所述組合物至少為部分晶體、全部晶體，和/或無水(例如，少于80%、50%、30%、20%，或10%的水)。在其它實例中，iRNA為含水狀態(tài)，例如在含水的溶液中。水相或晶體組合物能夠與諸如運輸載體如脂質(zhì)體(尤其針對水相)或顆粒(如適于晶體組合物的微粒)結(jié)合。一般情況下，iRNA組合物以這樣的方式配制成，即與所施用的方法相容的方式。在特定的實施例中，所述組合物用以下至少一個方法制備噴霧干燥、凍干法、真空干燥、蒸發(fā)、流化床干燥，或這些技術(shù)的組合；或者使用脂的超聲處理、冷凍干燥、冷凝和其它的組合方式。iRNA可以與其它的試劑結(jié)合配制而成，例如，另一種治療性試劑或穩(wěn)定iRNA的試劑，如與iRNA復(fù)合形成iRNP的蛋白質(zhì)。其它的試劑還包括螯合劑如EDTA(例如為了去除二價陽離子如Mg2+)、鹽、RANse抑制劑(例如廣譜RNAse抑制劑諸如RNAsin)，等等。在一項實施例中，iRNA制劑包括另一種iRNA試劑，例如能夠介導(dǎo)針對第二基因或者同一基因RNAi的第二iRNA試劑。其它制劑還包括至少三個、五個、十個、二十、五十或一百或更多個不同的iRNA種類。這樣的iRNAs能夠針對相似數(shù)量的不同基因介導(dǎo)RNAi。在一項實施例中，iRNA制劑包含至少一種第二種治療性試劑(如一種試劑，其不是RNA或DNA)。在某些實施例中，iRNA試劑，如雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑(例如，一種前體，如一種較大的能被加工成siRNA試劑的iRNA試劑，或者是一種編碼iRNA試劑如雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑或其前體的DNA)，被配制成靶向特定的細胞。例如，包含iRNA的脂質(zhì)體或顆粒或其它結(jié)構(gòu)也可以包含一種靶向結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠識別靶細胞上的特異性分子。靶向結(jié)構(gòu)可以包括抗靶細胞表面蛋白質(zhì)的抗體，或者是針對耙細胞表面某個分子的配體或配體的受體結(jié)合部分。在一項實施例中，所述靶向結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)體結(jié)合。例如，美國專利6,245,427公開了一種利用蛋白質(zhì)或肽靶向脂質(zhì)體的方法。在另一項實施例中，脂質(zhì)體中陽離子的脂組分衍生為具有靶向作用的結(jié)構(gòu)。例如，W096/37194描述了轉(zhuǎn)換戊二?；王；字；掖及?N-glutaryldioleoylphosphatidylethanolamine)成為N國蘿5基丁二酉先亞胺激活的酯。該產(chǎn)物然后連接到RGD肽。其它的靶向方法在本發(fā)明仍有描述。治療方法和輸送途徑包含iRNA試劑如靶向ApoB的iRNA試劑的組合物，可以通過很多途徑輸送到受試者。典型的途徑包括鞘內(nèi)、薄壁組織、靜脈、鼻部、口腔和眼部的輸送。iRNA試劑可以結(jié)合進適于施藥的藥物組合物。例如，組合物可以包含一種或多種iRNA試劑和藥物可接受的載體。在此所述的"藥物可接受的載體"包括與藥物施用相容的任何一種或所有的溶劑、擴散媒介、涂覆物、抗細菌和抗真菌試劑、等滲和吸收延遲試劑等。這種針對具有藥物活性物質(zhì)的載體和試劑的用途在本領(lǐng)域是已知的。除非任何現(xiàn)有技術(shù)的載體或試劑與活性化合物不相容，其在組合物中的使用是可以預(yù)期的。添加的活性化合物也可以結(jié)合進組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)是否為局部治療或系統(tǒng)治療以及根據(jù)所需治療的區(qū)域，以各種方式來給藥。給藥可以是局部的(包括眼部、鼻內(nèi)部、皮膚)、口腔或腸外給藥。腸外給藥包括靜脈內(nèi)滴注、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射，或鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥。輸送途徑依據(jù)病人的癥狀而定。一般來說，iRNA試劑可以以任何一種適合的方法給藥。如在此所述，局部輸送是指直接將iRNA試劑施用到身體的任何一個表面，包括眼、粘液膜、體腔表面，或任何的內(nèi)表面。局部施藥制品包括皮膚貼劑、藥膏、洗液、乳液、膠、滴劑、噴霧以及液體。傳統(tǒng)的藥學(xué)載體、水溶液、粉劑或油劑、增稠劑等也都是必需或所需的。局部用藥還可以作為一種途徑，選擇性地將iRNA試劑輸送到病人的表皮、真皮，或它們的特異性的層，或基底組織。用于鞘內(nèi)或心室給藥的組合物包括無菌水溶液，其含有緩沖液、稀釋劑和其它適合的添加劑。用于腸外給藥的配制品包括無菌水溶液，其含有緩沖液、稀釋劑和其它適合的添加劑。心室內(nèi)注射可以通過例如連接到一種儲器的心室導(dǎo)管來進行。對心室內(nèi)注射，需要控制溶質(zhì)的濃度以保證制劑的等滲。iRNA試劑還可以經(jīng)肺部輸送被施用到病人身上。肺部輸送組合物可以被病人吸入并被擴散，使該組合物，優(yōu)選為iRNA，在擴散過程中能夠到達肺，在此，組合物通過肺泡吸收直接進入血液循環(huán)。肺部輸送能夠有效地通過系統(tǒng)輸送和局部輸送來治療肺部疾病。肺部輸送可以通過不同的途徑來獲得，包括使用噴霧、煙霧、毛細管和干粉劑型。輸送可以通過使用液體噴霧器、煙霧吸入器和干粉擴散器來完成。優(yōu)選為定量吸入器。使用噴霧器或吸入器的優(yōu)點之一是可以將潛在的污染降到最低，因為這些設(shè)備是自含式的。以干粉擴散器來說，輸送藥物己經(jīng)被配制成干粉。iRNA組合物自身可以穩(wěn)定地貯存為凍干或噴霧干燥粉或者與適合的粉載體組合。在用煙霧給藥治療時，用于吸入的組合物的輸送可以通過劑量定時設(shè)備來完成，該設(shè)備包括定時器、劑量器、時間測量器或時間顯示器，當(dāng)該顯示器與所述設(shè)備結(jié)合在一起時，可以測量劑量、療程監(jiān)測，和/或誘導(dǎo)至病人的iRNA試劑被修飾使其能夠通過血腦屏障。例如，將iRNA試劑與一種可以使該試劑穿過屏障的分子結(jié)合。這種修飾的iRNA試劑可以通過任何一種所需的方法進行給藥，如通過心室注射或肌內(nèi)注射或通過肺部輸送。iRNA試劑可以經(jīng)眼部給藥，來治療視網(wǎng)膜疾病如視網(wǎng)膜病變。例如，該藥物組合物可以被施用到眼表面或附近的組織，例如眼瞼的內(nèi)面。它們還可以局部施用，如通過噴霧、滴注象眼藥水一樣，或者眼藥膏。藥膏或滴液可以通過本領(lǐng)域所熟知的眼部輸送系統(tǒng)被輸送，如敷藥器或眼滴管。這種組合物包括mucomimetics如透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、羥丙基甲基纖維素或聚(乙烯醇)、防腐劑如山梨酸、EDTA或benzylchroniumchloride,以及普通量的稀釋劑和/或載體。藥物組合物還可以被施用到眼內(nèi)部，并且用針或其它能夠?qū)⒃撍幬锝M合物引入到所選擇部位或結(jié)構(gòu)的輸送裝置進行輸送。含有iRNA試劑的組合物還可以通過眼貼劑被施用。iRNA試劑經(jīng)口腔或鼻輸送被施用。例如，經(jīng)過這些膜施用的藥物的藥力可以很快地發(fā)作，從而提供了治療血漿水平，避免肝代謝的首過效應(yīng)，以及避免將藥物暴露于不利的胃腸(GI)環(huán)境中。其余的優(yōu)點還包括容易接近膜部位，使藥物能被施用、局域化并且易清除。藥物施用可以由受試者或其它人提供，如護理人員。護理人員指參與提高人類健康的單位，如醫(yī)院、收容所、醫(yī)生辦公室、門診；保健工作者如醫(yī)生、護士或其它從醫(yī)人員；或是配偶或監(jiān)護人如父母。以一定劑量或輸送定量藥劑的分配器的形式提供藥物治療。還可以監(jiān)測受試者以觀察疾病癥狀的改進或穩(wěn)定。術(shù)語"治療有效量"是指存在于組合物中用于提供接受治療的受試者體內(nèi)所需藥物水平的量，以期產(chǎn)生所希望的生理反應(yīng)。術(shù)語"生理有效量"是指輸送到受試者以產(chǎn)生所期望的緩和效果或醫(yī)療效果的量。術(shù)語"藥物可接受載體"是指能夠進入肺而對肺沒有明顯的不利的毒物學(xué)效果的載體。適于作載體的藥物賦形劑的類別包括穩(wěn)定劑如人血清白蛋白(HSA)、填充劑如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液；鹽如氯化鈉；等等。這些載體是晶體形式或無定形的形式或是二者的混合。尤其有價值的填充劑包括相容碳水化合物、多肽、氨基酸或其組合物。適合的碳水化合物包括單糖如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、海藻糖等；環(huán)糊精如2-羥基丙基-p-環(huán)糊精；和多糖如棉子糖、麥芽糊精、右旋糖苷等；醛醇如甘露醇、木糖醇等。碳水化合物的優(yōu)選基團包括乳糖、海藻糖、棉子糖麥芽糊精和甘露醇。適合的多肽包括天冬酰苯丙氨酸甲酯。氮基酸包括丙氨酸和甘氨酸，優(yōu)選為甘氨酸。適合的pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液包括從有機酸和堿如檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉等制備的有機鹽；優(yōu)選為檸檬酸鈉。在一項實施例中，包含iRNA組合物的單位劑量或測定的劑量由輸入的裝置來分配。該裝置包括一個監(jiān)測受試者體內(nèi)參數(shù)的感應(yīng)器。例如，該裝置可以包括一個泵如滲透泵和，可選擇地，連接電極。iRNA試劑可以包裹在病毒天然的外殼中或包裹在用化學(xué)或酶解方法產(chǎn)生的人工外殼中或衍生自它們的結(jié)構(gòu)中。劑量iRNA試劑以每kg體重少于大約75mg的單位劑量給藥，或少于大約70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg,以及少于200nmole的RNA試劑(例如，大約4.4x1016copies)按每kg體重，或少于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0,0015、0.00075、0.00015nmole的RNA試劑每kg體重。單位劑量可以通過諸如注射(例如靜脈或肌肉、鞘內(nèi)或直接注射進器官)、吸入或局部施用來給藥。iRNA試劑直接輸送到器官(例如直接到肝臟)以每個器官從大約O.OOOOlmg到3mg的順序輸送藥劑，或者優(yōu)選為每個器官大約O.OOOl-O.OOlmg，大約每個器官0.03-3.0mg,大約每個眼睛0.1-3.0mg或者大約每個器官0.3-3.0mg。藥劑的施用劑量以能有效地治療或防止疾病或病癥的發(fā)展和發(fā)生為準。在一項實施例中，單位劑量的施用頻率少于一天一次，例如少于每2、4、8或30天一次。在另一項實施例中，單位劑量不是以一定的頻率(例如不規(guī)則的頻率)進行給藥。例如單位劑量只給藥一次。在一項實施例中，有效劑量是與其它傳統(tǒng)的治療方式一同給藥。在一項實施例中，受試者先以起始劑量給藥，然后是iRNA試劑的維持劑量或更多劑量，如雙鏈iRNA試劑、siRNA試劑，(例如前體，如一種大的能夠被加工成siRNA試劑的iRNA試劑，或者是編碼iRNA試劑諸如雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑的DNA或其前體)。該維持劑量一般來說低于起始劑量，例如少于起始劑量的一半。維持劑量方案包括用一個或多個劑量治療受試者，所述劑量的范圍為從根據(jù)體重的O.Oliag至U75mg/kg例如70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg每kg體重每天。維持劑量給藥優(yōu)選為不超過每5、10或是30天一次。更進一步說，該治療方案可以維持一段時間，這要根據(jù)特定的疾病的性質(zhì)、嚴重程度和病人的整體健康情況而定。在優(yōu)選實施例中，給藥劑量不超過一天一次，例如不超過每24、36、48或更多個小時一次，例如不超過每5或8天一次。隨著治療，監(jiān)測病人的身體狀況的改變和疾病癥狀的減緩。如果病人對當(dāng)前使用的劑量水平反應(yīng)不明顯的話，化合物的劑量可以增加，如果疾病的癥狀減緩或消失或者如有非預(yù)想的副作用出現(xiàn)，則要減少化合物的劑量。根據(jù)特定情形按照需要來給與有效的劑量，以單劑量或二個或更多的劑量給藥。如果需要方便地重復(fù)或頻繁的給藥，建議使用輸送工具，如泵、半永久支架(如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦池、囊內(nèi))或儲庫。在一項實施例中，iRNA試劑藥物組合物包括多種iRNA試劑。針對天然形成的靶序列如ApoB基因的靶序列，iRNA試劑具有非重疊和非相鄰的序列。在另一項實施例中，多種iRNA試劑對不同天然形成的靶基因是特異性的。例如，靶向ApoB的iRNA試劑可以出現(xiàn)在相同的藥物組合物中作為耙向不同基因的iRNA試劑。在另一項實施例中，iRNA試劑對不同的等位基因是特異性的。隨著成功的治療，接下來需要考慮的是對病人進行維持治療以防止病患復(fù)發(fā)，其中本發(fā)明的化合物將以維持劑量給藥，給藥范圍從O.OlPg到100g每kg體重(參見美國6,107,094)。iRNA試劑化合物的濃度以能足以有效地治療或防止人類的病患或調(diào)節(jié)生理機能為準。iRNA試劑的給藥濃度或用藥量根據(jù)測定試劑的參數(shù)和給藥方法而定，例如鼻內(nèi)、口腔或肺部給藥。例如，鼻部的配方需要成分的濃度更低一些，以避免對鼻道的剌激和燒傷感。有時需要將口部服用的配方的濃度稀釋到10-100倍，然后用于鼻部的配方。某些因素會影響有效治療受試者所需的劑量，這些因素包括但不限于疾病或病癥的的嚴重程度、以前的治療、整體健康狀態(tài)和/或受試者的年齡，以及存在其它的疾病。同時，以iRNA試劑如雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑(如前體，如一種大的能夠被加工成siRNA試劑的iRNA試劑，或者是編碼iRNA試劑諸如雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑的DNA或其前體)的有效治療劑量對受試者的治療，可以包括單一治療或優(yōu)選為可以包括一系列的治療。同樣重要的是，用于治療的iRNA試劑如siRNA試劑的有效劑量在一個特定的治療過程中可以增減。從在本文所描述的診斷方法的結(jié)果來看，劑量的改變會引起明顯的變化。例如，在iRNA試劑組合物給藥后，受試者可以被監(jiān)控。根據(jù)監(jiān)測的信息，可以施用額外劑量的iRNA試劑組合物。服藥劑量是依據(jù)被治療的疾病的嚴重性和反應(yīng)來確定的，療程可以從幾天延續(xù)到幾個月，或直到治療有效果或者疾病癥狀減輕。理想的服用劑量方案可以從測量藥物在病人體內(nèi)積累的時候計算。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以很容易地測定最理想的劑量和服用方法以及重復(fù)頻率。最佳劑量可以隨著每一種化合物的相對藥力而改變，并且一般基于在體內(nèi)和體外動物模型中有效的EC50來確定的。在某些實施例中，動物模型包括表達人類基因的轉(zhuǎn)基因動物，例如產(chǎn)生靶ApoBRNA的基因。轉(zhuǎn)基因動物可以缺乏相應(yīng)的內(nèi)源RNA。在另一項實施例中，測試組合物包括iRNA試劑，該iRNA試劑至少在內(nèi)部區(qū)域與在動物模型的耙ApoBRNA和人的耙ApoBRNA之間的保守序列互補。本發(fā)明利用下面的實例來做進一步的說明，但不能解釋為是作進一步的限制。實施例實施例l.經(jīng)過固相合成制備siRNAs試劑的來源在此試劑的來源沒有專門給出，這種試劑可以獲自任何一個在質(zhì)量/純度上達到分子生物學(xué)應(yīng)用標準的分子生物學(xué)試劑供應(yīng)商。siRNA合成單鏈RNAs使用Expedite8909合成器(AppliedBiosystems,AppleraDeutschlandGmbH,Darmstadt,Germany)在lMmole的規(guī)模上固相合成，可控孔徑玻璃(CPG,500A，GlenResearch,SterlingVA)作為固體支持物。RNA和含有2'-0-甲基核苷酸的RNA分別使用相應(yīng)的亞磷酰胺和2'-0-甲基亞磷酰胺通過固相合成產(chǎn)生(ProligoBiochemieGmbH，Hamburg,Germany)。這些buildingblocks在寡核苷酸鏈序歹!j范圍內(nèi)所選擇的位點上引入，其利用標準核苷亞磷酰胺化學(xué)，如在書《Currentprotocolsinnucleicacidchemistry》，Beaucage，S丄.等(Edrs.)，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA中所描述。硫代磷酸鍵通過將碘氧化劑溶液替代為在乙腈(1%)的Beaucage試劑(ChruachemLtd,Glasgow,UK)溶液而引入。輔助試劑獲自MallinckrodtBaker(Griesheim，Germany)。通過對寡核苷酸粗品進行陰離子交換HPLC,根據(jù)現(xiàn)有的方法進行脫保護和純化作用。利用分光光度計(DU640B,BeckmanCoulterGmbH，Unterschlei他eim，Germany)，產(chǎn)率和濃度通過各自RNA溶液在260nm波長處的UV吸收值來確定。雙鏈RNA經(jīng)過與一種等摩爾的退火緩沖液(20mM磷酸鈉，pH6.8;100mM氯化鈉)中的互補鏈溶液相混合而形成，并在85-9(TC水浴中加熱3分鐘，然后經(jīng)過3-4個小時冷卻到室溫。純化的RNA溶液在-2(TC貯存?zhèn)溆?。膽固醇如圖1所示與siRNA結(jié)合。為合成這些3'-結(jié)合膽固醇的siRNAs，一種適當(dāng)修飾的固體支持物用于RNA合成。該修飾的固體支持物按照下列方法制備-二乙基-2-氮雜丁烷-l，4-二羧酸酯AA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>將4.7M的氫氧化鈉(50mL)水溶液加入攪拌和冰冷卻的甘氨酸步驟60。C下在30分鐘內(nèi)向5,6-二氫-4//-吡咯并[3，2，1;]喹啉-1-基)乙醛酸甲酯(l.O克，4.12毫摩爾)和吲哚-3-乙酰胺(0.8克，4.5毫摩爾)在無水四氫呋喃的溶液中逐滴加入叔丁醇鉀溶液(在四氫呋喃中1M)(12.4毫升，12.4毫摩爾)。將該混合物在(TC下攪拌2小時。然后加入濃鹽酸(10毫升)，并將該混合物在室溫下攪拌l小時。隨后用乙酸乙酯(200毫升)稀釋該混合物，用水(50毫升)和飽和氯化鈉水溶液(50毫升)洗滌2次，然后用無水硫酸鈉干燥有機層。將殘渣用硅膠色譜法提純，用乙酸乙酉旨/己烷(l:4)洗脫以生成亮紅色固體狀的3-5,6-二氫-4//-吡咯并[3,2,1-!;/]喹啉-1-基)-4(l/Z-li引哚-3-基)P比咯-2,5-二酮(1.2克，80%)。'HNMR(CDC13)400MHzS:8.5(brs,1H),7.78(s,1H),7.63(d，1H，J=2.8Hz)，7.44(s,1H),7.35(d,1H,J=8Hz)，7.16(d,1H，J=8.4Hz),7.11(t,1H,J=7.6Hz),6.86(t,1H,J=7.6Hz)，6.80(d,1H，J=7.2Hz),6.64(t,1H，J=8Hz),6.57(d，1H,J=8Hz),4.2(t,2H，J=6Hz),2.96(t，2H,J=6Hz),2.24(m,2H).實施例2.(士)-順式-3-f5,6-二氫-4好-吡咯并f3,2，l-川喹啉-l-基)-4(l好-吲哚-3-基)吡咯烷-2，5-二酮和(±)-反式-3-(5，6-二氫-4好-吡咯并3,2,1-川喹啉-1-基)-4(1好-吲哚-3-基)卩比咯烷-2,5-二酮的制備(士)-順式化合物、(±)-反式化合物，或其混合物的制備是采用如步驟A至C中分別所述的還原條件獲得。步驟A:用鋅/汞還原3-(5,6-二氫-4//-吡咯并[3，2，1^]喹啉-1-基)-4(1//-吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮Zn/HgEtOH>HC1氨基卜丙酸乙酯AB(U.5g，21.3mml)在0。C下溶解于20%的二甲基甲酰胺中的哌啶溶液。將該溶液連續(xù)攪拌1個小時。反應(yīng)混合物在真空下濃縮并向殘留物加入水，產(chǎn)物用乙酸乙酯提取。粗產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)變成鹽酸鹽被純化。3-({6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10，11，12,13，14,15，16,17-十四氫-111-環(huán)戊并[3]-菲-3-基-氧羰基氨基]-己?；鶀乙氧基羰基甲基-氨基)-丙酸乙酯AD將3-[(6-氨基-己?；?-乙氧基羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的鹽酸鹽(4.7g,14.8mmo1)加入二氯甲烷中。并將該懸浮液在冰上冷卻到0。C。在懸浮液中加入二異丙基乙胺(3.87g,5.2mL，30mmo1)。在所得溶液中加入膽甾醇氯甲酸酯(6.675g,14.8mmo1)。將反應(yīng)混合物攪拌過夜。該反應(yīng)混合物用二氯甲烷稀釋并用10%的鹽酸洗滌。產(chǎn)物經(jīng)過快速分離色譜(閃柱)純化(10.3g，92%)。1-{6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3，4，7，8，9，10，11，12,13,14,15,16,17-十四氫-111-環(huán)戊并[3]-菲-3-基-氧羰基氨基]-己?；鶀-4-氧代-吡咯烷-3-羧酸乙酯AE<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>叔丁醇鉀(l.lg，9.8mmol)在30mL的干甲苯中攪拌。將該混合物在冰上冷卻到0°C，并在20分鐘內(nèi)邊攪拌慢慢加入5g(6.6mmol)的二酯AD。在加入過程中，溫度保持在低于5X:。在0-C下持續(xù)攪拌30分鐘，并加入lmL的冰乙酸，之后立即加入下述溶液，即40mL水中溶解4gNaH2P04*H20。將所獲得的混合物用lOOmL的二氯甲垸提取兩次，然后用10mL的磷酸緩沖液洗滌合并的有機提取液兩次，干燥、蒸發(fā)至干。殘留物溶解于60mL的甲苯中，冷卻至0"C，用50mL、pH9.5的冷碳酸鹽緩沖液洗滌三次。用磷酸將水提物調(diào)節(jié)到pH3，并用40mL氯仿提取5次，合并氯仿液、干燥、蒸發(fā)得到殘留物。用25%乙酸乙酯/己焼進行柱層析，將該殘留物純化而獲得1.9g的1>-酮酯(39%)。[6-(3-羥基-4-羥甲基-吡咯垸-1-基)-6-氧代-己基]-氨甲酸17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2，3,4,7,8,9,10,ll，12，13，14,15，16，17-十四氫-111-環(huán)戊并[3]菲-3-基酯AF<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>將甲醇(2mL)在1小時期間逐滴加入四氫呋喃(10mL)中的b-酮酯AE(1.5g,2.2mmol)與氫硼化鈉(0.226g,6mmol)的回流混合物中。在回流溫度下持續(xù)攪拌1小時。在冷卻到室溫后，加入1NHC1(12.5mL),用乙酸乙酯(3x40mL)提取混合物。合并的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥并真空濃縮生成產(chǎn)物，該產(chǎn)物再經(jīng)過柱層析(10%MeOH/CHCl3)純化(89%)。(6國{3-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-羥基-吡咯烷-1-基}-6-氧代-己基)-氨基甲酸17-(1,5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3,4,7，8，9,10，ll,12,13,14,15,16,17-十四氫-lH-環(huán)戊并[a]菲-3-基酯AGAG將二醇AF(1.25gm,1.994mmol)在真空下與吡啶(2x5mL)蒸發(fā)進行干燥。攪拌中加入無水吡啶(10mL)和4,4，-二甲氧基三苯基氯甲烷(0.724g，2.13mmo1)。在室溫下反應(yīng)過夜。加入甲醇使反應(yīng)中止。在真空下濃縮反應(yīng)混合物，并向殘留物加入二氯甲烷(50mL)。用1M碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層，并用無水硫酸鈉干燥、過濾并濃縮。殘留吡啶通過與甲苯蒸發(fā)而被去除。粗產(chǎn)物經(jīng)過柱層析(2%MeOH/CHCl3，在5。/。MeOH/氯仿中的，Rf-0.5)純化(1.75g，95%)。琥珀酸單-(4-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基2,3，4,7,8,9，10，11，12,13,14,15,16，17-十四氫-lH-環(huán)戊并[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己酰}-吡咯垸-3-基)酯AHAH將化合物AG(l.Og,1.05mmol)與琥珀酸酐(0.150g,1.5mmol)和DMAP(0.073g，0.6mmo1)混合，然后在真空下4(TC干燥過夜。將該混合物溶解在無水二氯乙垸(3mL)中，然后加入三乙胺(0.318g，0.440mL,3.15mm0l)，在氬氣環(huán)境中、室溫下攪拌該溶液16個小時。然后用二氯甲烷(40mL)稀釋該溶液，用冰冷卻的檸檬酸水溶液(5wt%,30mL)和水(2x20mL)洗滌。用無水硫酸鈉干燥有機相并濃縮至干。殘留物留作下一個步驟使用。膽固醇衍生的CPGAIAI將琥珀酸酯AH(0.254g,0.242mmol)溶解于二氯甲垸/乙腈(3:2，3mL)的混合物中。然后在該溶液中先后加入乙腈(1.25mL)中的DMAP(0.0296g,0,242mmol)、乙腈/二氯乙烷(3:1,1.25mL)中的2,2，-二硫-二(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmo1)。在所得溶液中加入乙腈(0.6mL)中的三苯基膦(0.064g，0.242mmo1)。反應(yīng)混合物顏色轉(zhuǎn)變成亮橙色。用手動搖動器簡單攪拌該溶液(5分鐘)。加入長鏈烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g,61mm/g)。攪拌該懸浮液2個小時。用燒結(jié)的漏斗過濾CPG，并用乙腈、二氯甲垸和醚先后洗滌。未參加反應(yīng)的氨基用乙酸酐/嘧啶掩蓋。用UV測量來測定CPG的負載容量(37mM/g)。結(jié)合膽固醇的RNA鏈的合成與結(jié)構(gòu)示于圖1中。實例2:設(shè)計siRNA以靶向人與小鼠ApoB基因中的區(qū)域核酸序列如以下所示，采用標準命名法命名，具體為表2中的縮寫。fc^用于所列核苷酸序列的核苷酸單體縮寫。要明白的是，當(dāng)這些單體出現(xiàn)在寡核苷酸的時候，相互由5'-3'磷酸二酯鍵相連接。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>a大寫字母代表2'-脫氧核糖核酸(DNA)，小寫字母代表核糖核酸(RNA)在此描述的某些寡核苷酸被修飾為包含連接于它們的3'末端的膽固醇結(jié)構(gòu)(參見圖l)。這些被表示為5，-(n)n(Chol)-3，。當(dāng)在本文中涉及在所給定核苷酸序列內(nèi)的"位置n"(n為整數(shù))時，其意為在核苷酸序列的第n個核苷酸，其中最5'的核苷酸計數(shù)為第一個核苷酸，然后朝向3'方向向后數(shù)。由于用于人的治療一般先用動物來做試驗，所以我們設(shè)計的siRNAs能夠?qū)游锬Ｐ拖到y(tǒng)和人都具有潛在的功效。所選擇的動物模型系統(tǒng)為小家鼠，mww船cw/M。所以，選擇siRNA靶向作用的序列的第一個標準就是小鼠和人ApoB之間的交叉反應(yīng)。為了選擇能夠潛在抑制ApoB基因在小鼠和人表達的siRNA,編碼小鼠(GenBankAccessionNo.:XM—137955)和人(GenBankAccessionNo.:NM—000384)ApoB閱讀框的序列，用序列對比(pairwiseBLASTalgorithm)進行排列比較。有關(guān)BLAST程序運用的數(shù)學(xué)運算在Altschul等(NucleicAcidsRes.25:3389-3402，1997)中有說明。具有23或更多的連續(xù)的核苷酸(小鼠閱讀框的核苷酸463-494，622-647，658-680，701-725，1216-1240，1282-1320，1299-1328，1339-1362，2124-2155，2807-2830，2809-2837，2860-2901，3035-3057，3103-3125，3444-3467，3608-3635,4130-4167，4374-4402，4503-4525，5962-5985，6696-6724，9232-9257，9349-9372，10177-10213，10477-10505，10791-10814，11020-11045，12227-12251，13539-13572)相同的區(qū)域被識別。所有可能的23個核苷酸長度的序列都被確定。這一組代表了170個潛在的siRNA耙向區(qū)域。根據(jù)BLAST檢索(wordsize7，mismatchpenalty-1,expectvalue1000)將這些序列與人和小鼠的基因組和mRNA數(shù)據(jù)庫進行比較。所有具有3個或少于3個的與任何小鼠mRNA和小鼠基因組數(shù)據(jù)庫錯配的序列的潛在的23個核苷酸靶區(qū)域，從最初的組中排除。剩下的84個潛在的靶區(qū)域作為模板衍生出siRNA的有義鏈和反義鏈。每個siRNA的有義鏈與來自潛在靶區(qū)域的3到23(從5'到3')個核苷酸相同。反義鏈被限定為對整個23個核苷酸耙區(qū)域的反向互補。所獲得的siRNAs在反義鏈的3'端有2個核苷酸突出端以及一個21個核苷酸的堿基對區(qū)域。84個潛在的siRNAs中有81個被合成并且確定具有抑制ApoB在孵育的人HepG2細胞中表達的功效。與那些未處理的對照細胞相比較，抑制ApoBmRNA表達少于50%的siRNAs在人和/或小鼠血清中的穩(wěn)定性也被確定。84個合成的siRNA雙鏈分子的有義和反義鏈序列如表3所示。有義鏈代表所有23個核苷酸區(qū)域的3-23位核苷酸，所述23個核苷酸區(qū)域是(a)在小鼠(GenBankAccessionNo.:XM—137955)和人(GenBankAccessionNo.:NM—000384)ApoB的閱讀框(ORF)之間是同源的；和(b)當(dāng)與所有其它的人和小鼠基因組和mRNA數(shù)據(jù)庫的序列比較時發(fā)現(xiàn)具有4個或更多個錯配。表3所列的反義鏈與23個有義鏈核苷酸區(qū)域的1-23位核苷酸互補。并給出相應(yīng)的小鼠ApoB的ORF中對應(yīng)的23核苷酸區(qū)域的最5'端的核苷酸位置。表3:未修飾的siRNA雙鏈分子核酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>IDKo.序列有義鏈恥.序列反義鏈雙鏈體描述符起始位點b92X354S933ucaaguguc抑cacacugaatiucagugugaugacacnmgauuu1018095站幼-XfOP5047$7SBAll—00P39auguccauucsaaacuaccac100135S0101102ugguaguuu購aauggacaggucAI)-XkUPSOSO103104AL-DDP505110190:tosaccugruccauucaaaacuacc106AL-POP5052108AL-DUP5053109craucacacugaauaccaaiigc110AXi-DUP5054:m股c3a9ccuu99uuca9ugug112cacacii訴acca的gcuu0uaaa129311411SAI^OOP5057U8處-S0S8ii沒120tigaugCccauauuugucacaaac;121122123124AIi-DnP50SI12512€uuuaaua說cugaucaa欲uu0uaAll-0UP50S26698127128gau3ccccucuug魏uguuca9ga129130131sruccagccccaucacuuuaca132JW^DUP5086133d的cccc3uc3cuuuacaagc:134AL-DUP50B7128513Si365088137138AL-DOT50892B07133agg諷aucuuauainmgaucc抑aucaaauaua的axiucccuucA!>napS0901411421在31441222814S146AI-IHJP5093147grccccaucacuuuaca的ccu148aggcuuguaaagugauggg9cugAL-DUP50941287143ISOAL-DUPS09S151152AL-TOPSO訴2130i53cuuuac;2Lagccuugguuc瑰gu處-0UP129€1SSQt^gatic祖auauaag3uxicccuAB-DOTS的S21331S715BAL-DTJPSO的21123153auauaagauucccumcuatmuugAL-DUP51002124161162caaauauafLgaiiuc！ccuucusuuAL—DUP510116393S0165guuguuucuGCagsuccuiigcac167caaggaucuggagaaac戰(zhàn)ca168uguuguuucuccagaucwugc;欲437Sa解說符指退火的雙鏈siRNAb在小鼠ApoB的ORF中的相應(yīng)的23核苷酸區(qū)域的最5'端核苷酸位置或者，對于84個潛在耙區(qū)域的同一個組，siRNA可以產(chǎn)生19個堿基對和2個核苷酸dTdT突出端。有義鏈于是與靶區(qū)域的1到19、2到20、3到21、4到22，或5到23的核苷酸相同，并且兩個dT核苷酸被加到寡核苷酸的3'末端。如此選擇的有義鏈的反向互補作為反義鏈的模板，并且兩個dT核苷酸被加到3'末端。實例3.在細胞培養(yǎng)時，siRNA在mRNA以及蛋白質(zhì)水平上抑制ApoB表達以上所述的siRNA的活性是在HepG2細胞中測試的。用分支DNA測定法測定培養(yǎng)的HepG2細胞中總mRNA的ApoBmRNA，所述總mRNA分離自與ApoB特異性的siRNA—同孵育的細胞，以及用酶連免疫吸附測定法(ELISA)測定與ApoB特異性的siRNA一同孵育的細胞上清中的ApoBIOO蛋白質(zhì)。HepG2細胞獲自AmericanTypeCultureCollection(Rockville,MD，cat.No.HB-8065)并培養(yǎng)在MEM(GibcoInvitrogen,InvitrogenGmbH，Karlsruhe,Germany,cat.No.21090-022)，并補充有10%小牛血清(FCS)(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.S0115),2mML-Glutamin(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.K0238)，青霉素100U/ml，鏈霉素100pg/ml(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.A2213),1x非必需氨基酸(NEA)(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.K0293)以及ImM丙酮酸鈉(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.L0473),且培養(yǎng)是在37'C下5%C02氛圍內(nèi)的增濕孵育箱中(HeraeusHERAcell,KendroLaboratoryProducts,Langenselbold,Germany)進行。為轉(zhuǎn)染siRNA，HepG2細胞以1.5x104每孔細胞的密度置于96微孔板上，孵育24小時。用說明書所描述的oligofectamine(InvitrogenGmbH,Karlsruhe,Germany,cat.No.12252-011)進行siRNA轉(zhuǎn)染。siRNA以100nM的濃度轉(zhuǎn)染，以用于篩選siRNA雙鏈分子，以100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14和0.05nM的濃度用于測定劑量反應(yīng)/在50%最大抑制作用(IC5Q)時的抑制濃度。轉(zhuǎn)染24小時之后，更換培養(yǎng)基再將細胞孵育24小時。用酶連免疫吸附測定法測定ApoB100蛋白質(zhì)濃度，如以下所述，收集上清后貯存在-80'C下直至分析之用。用分支DNA測定法測定ApoBmRNA，如下所述，，除了將2^1的50嗎1ProteinaseK(Epicentre,Madison,WI,USA,cat.No.MPRK092)貯備液添加到600(^1的TissueandCellLysisSolution(Epicentre,Madison,WI，USA,cat.No.MTC096H)之外，按照QuantigeneExplore試劑盒(Genospectra，F(xiàn)remont,CA,USA,cat.No.QG-000-02)說明書的說明收集細胞然后將細胞裂解，用于bDNA的mRNA測定。在-8(TC貯存裂解物直至用于分支DNA測定法分析。利用培養(yǎng)的NmuLi細胞，根據(jù)分支DNA測定法(bDNA測定法)定量測定鼠科動物ApoBmRNA。NmuLi細胞(普通肝臟，ATCCNo.:CRL-1638)在DMEM(BiochromAG，Berlin,Germany,cat.No.F0435)中孵育，添加10%小牛血清(FCS)(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.S0115)禾口2mML-Glutamin(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.K0238)，在37°C、5%C02大氣氛圍下的增濕孵育箱中(HeraeusHERAcell，KendroLaboratoryProducts,Langenselbold,Germany)。在轉(zhuǎn)染的前一天，將細胞以4x103細胞每孔的密度置于在96微孔板上。按照明書的方法(InvitrogenGmbH，Karlsruhe,Germany,cat.No.12252-011)，用oligofectamine進行三遍siRNA細胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染過程中siRNA在培養(yǎng)基中的濃度為200nM，用于篩選15個未修飾或修飾的siRNA雙鏈分子。在轉(zhuǎn)染之后，將細胞孵育24個小時，之后生長培養(yǎng)基用不含siRNA的新鮮培養(yǎng)基更換。收集細胞裂解物并用以上所描述的貯存HipG2細胞的方法貯存。以下所示為未結(jié)合膽固醇的對照siRNA雙鏈分子的序列AL-DUPHCVSense:5:acggcuagcugugaaaggucc-3一SEQ.工DNo.169Antisense:S""-ggaccuuucacagcuagccguga-3一SEQ.IDNo.170AL-DUPHCV的有義鏈相應(yīng)于肝炎C病毒(AccessionNo.:D89815)3'-未翻譯區(qū)域的9472-9493位置。以下所示為結(jié)合膽固醇的對照siRNA雙鏈分子的序列AL-DUP5129Senses5、cacaugaagcsgcaegacuu(Choi卜3一SEQ.IDNo.171Mtisensei5一-aagucgugcugcuuc闊ug-3一SEQ,ID恥.172有義鏈的1-21核苷酸相應(yīng)于具有增強的綠色熒光蛋白(GenBankAccessionNo.:U57607)的克隆載體pEGFP-C3的843-864位置。細胞上清中的ApoB100蛋白質(zhì)水平用ELISA法進行測定。用ClearFlatBottomPolystyreneHighBindMicroplates(CorningB.V.LifeSciences,Schiphol國Rijk,TheNetherlands,cat.No.9018)進行測定。多克隆抗體山羊抗人載脂蛋白B(ChemiconInternationalGmbH,Hofheim,Germany,cat.No.AB742)以1:1000在磷酸緩沖生理鹽水(PBS)(PBSDulbeccow/oCa2++，Mg2++,BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.L182-05)中被稀釋，將lOOpl這種稀釋液覆蓋在96微孔板上，4。C下過夜。用30(Hil在PBS中的1%牛血清白蛋白(BSA)(CarlRothGmbH&CoKG,Karlsruhe,Germany,cat.No.8076.2)封閉后，微孔板用PBS洗三遍。解凍細胞培養(yǎng)上清并且以1:1用含有0.1%Tween20(CarlRothGmbH&CoKG，Karlsruhe,Germany,cat.No.9127.1)和0.1%BSA的PBS稀釋。取IO(HU這種稀釋液加到每一個孔。在室溫下經(jīng)過2小時的孵育后，用含有0.1%Tween20的PBS將微孔板洗滌五遍，之后用PBS洗三遍。取100|ul以1:1000經(jīng)過含有0.1%Tween20和3%BSA的PBS稀釋的結(jié)合辣根過氧化物酶的山羊抗人載脂蛋白B多克隆抗體(AcademyBio-MedicalCompany,Houston,TX,USA,cat.No.20H-Gl-b)加入到每一個孔。將微孔板在室溫下孵育2個小時。經(jīng)過用含有0.1%Tween20的PBS將微孔板洗滌五遍并用PBS洗滌三遍后，孑L在0.9mg/mlOPD(ophenylendiaminedihydrochloride，MerckBiosciencesGmbH,BadSoden,Germanycat.No.523121)中孵育，該OPD在24mmol/L檸檬酸緩沖液中(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany:cat.No.C1909-1KG)，pH5.0,含有0.03%過氧化氫(MerckBiosciencesGmbH,BadSoden，Germanycat.No.386790)。力口入0,5mol/LH2S04(MerckKgaA,Darmstadt,Germany,cat.No.100731)中斷酶反應(yīng)，并用分光光度計(PerkinElmerWallacVictor31420multilabelreader,PerkinElmerLASGmbH,Rodgau,Germany)測定490nm處的吸收。與任何小鼠基因無關(guān)聯(lián)的siRNA雙鏈分子用做對照，并且給定的ApoB特異性的siRNA雙鏈分子的活性以經(jīng)過處理的細胞上清中的ApoB蛋白質(zhì)濃度相對于經(jīng)過對照siRNA雙鏈分子處理的細胞上清中的ApoB蛋白質(zhì)濃度的百分比表示。膽固醇結(jié)構(gòu)與siRNA雙鏈分子有義鏈的結(jié)合增進了培養(yǎng)的HepG2細胞中ApoB分泌誘導(dǎo)效果。所以，一個siRNA雙鏈分子對照包含了結(jié)合的膽固醇結(jié)構(gòu)(AL-DUP5129)。利用分支DNA測定法(bDNA)測定ApoBmRNA的水平。該測試禾ll用QuantigeneExplore試齊!j盒(Genospectra，F(xiàn)remont,CA,USA,cat.No.QG-000-02)進行。冷凍裂解物在室溫下溶化，然后按照QuantigeneExplore試劑盒說明書的說明定量測定ApoB和GAPDHmRNA。用于捕獲延伸物(CaptureExtender,CE)，標記延伸物(LabelExtender，LE)的核酸序列以及封閉(BL)探針，在借助QuantiGeneProbeDesignerSoftware2.0(Genospectra,Fremont,CA,USA,cat.No.QG-002-02)下，選自ApoB和GAPDH的核酸序列。用于定量測定鼠類和人ApoB的探針核苷酸序列分別在表4和表5列出。用于定量測定鼠類和人GAPDH的探針核苷酸序列分別在表6和表7列出。表4:用于分支DNA測定法的鼠ApoB的DNA探針Nucleotidesequence血CECTeATOTCCmGCAGCaaGGTTTTTCTCrTGGAMGMAGT173CESMGCGGCCGmGTTGaTMTTTTCTCTTGGMAGAMGT174CESTTTTTGCTGTCTOCACCCATTTTTCTCTTGGAMGMAGT175CE176CECATTCAGCTTCA咖GCTCOOTTTTCTCTTCGMASAMGT177CEMTGTCTGCMTTAGCCTATOGCTTTTTTCTCTTGGaMGMAGT178LEAGCCCAAGCTCTGCATTCAAnTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTU$LE認TCMGGATGCCCCA鵬TTTTTAGGCMAGGACCCGTGTCTISOLE在CTGMTTTTGCA鵬TGTTCTrTTmTAGGCAT鵬ACCCGTCTCT181LE鵬CAGeTCTCCCMCMGTTTTT鵬激A(mcCa3TGTer182LEGMTCATGGCCTGGTAMTGCTTTTTAGGCmGGACCCGTGTCTLECAGCATAGGAGCCCATCAAATCATmTTAGGCATAGGACCCGTGTCTLEGACTGTGTGTGTGGTCMGrrTCMOTTTmGGCmGGACCCGTGTCTLE馬鵬CTCTAGCTG憶G!myyyOTTTTTAGGCmGGACCCGTGTCT18618LE188LEACaTATGTTTCAGCTCATTATTTTGMAGTITrmGGC^TAGGACCCGTGTCT189L￡LEGMTTCGACACCCTGMCCTTAGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTBLrcCCCAGTGACACCTCTQTQA192BLTCGGCTGaGTTTGMGTTGMGAT193BL3J4BLTCCAGTGAfi^QACCTGCAATGTTCA3JSBLrCTOTTATMWlOTGTCTCCACTGl兆BL197BL198BL199CE:捕獲延伸物探針；LE-標記延伸物探針；BI^封閉探針表5<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>ProbetvpeaNucleotidesequenceCECMATGGCaGCCCTOGTGATTTTTCTOTGGAMGMAGT217CECOTGACTGTGCCGTTGMTTTTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGT218CEGTCTCGCTeCTGGMGATGGTTTTTCTCTTGGMAGAMGT219CEC!CCGGCCTTCTCCATGGTTTTTTCTCTTGGAAAGAMGT220LEMCMTCTCCACTTOCCACTGT雷TAGGCATAGGACCC鵬TCT221LE■■GAraTGTAGTTGAGGTCftATTTTTAGGCATAfiGACCCOTGTCT222LEGACMGCTTCCCATTC:rCGGTTTTmGGCMM3GACCC咖TCT223LETGAT鵬CTTCCCGTT風(fēng)TmTT鵬CATAGGACCCGTGTCT224LEGACMACTCAGCACCGGCOTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCT22SBLTGAAGGGGTCGTTQATGQC22SBLCCGTGAGTGGMTCATACTGGM227BLCACCCCATTTGATGTTAGT鵬228BLSGTGAAGACACCAGTAGACTCCAC229CE:捕獲延伸物探針；LE—示記延伸物探針；BI^封閉探針表7:用于分支DNA測定法的人GAPDH的DNA探針NucleotidesequenceSEOH230CEmCECfCCCAGCCTTCTCCATGGTTTTTTCTCTTGGaaA(aMGT232CEeCTeCCeCCTGC織TG脇TTTTTCTCTTGGMAGMASE233L￡AGCCTTGACG6TGCCATGTTTTOGGCATAGGACCCGTGTCT234XjESJVTOACMGCTTCCCGTTCTCTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCT235ii超AGATGGTQMGGGATTTCCATTTTTTTAGGCaTAGGACCCGTGTCT236L搭GCMCGCCCCACTTGATTTTTTTTTAGGCATAGGACCCG窗CT2371^CMBACQTACTCAGCGCCMnnA(3GCATAGGaCCC啦G戮238L狂GGCA說GATGATGACCCmTGTTTTTAGGCATAGGRCCCGTGTCT239SGTGaAGACGCOVGTG說CTC240'CE:捕獲延伸物探針；LE-標記延伸物探針；BI^封閉探針通過比較樣品中ApoBmRNA與GAPDHmRNA的比例，將不同樣品的ApoBmRNA水平標準化。不耙向任何鼠基因的AL-DUPHCV以及結(jié)合膽固醇的AL-DUP5129用作對照。所給定的ApoB特異性siRNA雙鏈分子的活性以經(jīng)過處理的細胞中的ApoBmRNA(ApoBmRNA/GAPDHmRNA)相對于經(jīng)過對照siRNA處理的細胞的百分比表表8顯示篩選81個siRNA雙鏈分子在減少HepG2細胞培養(yǎng)中的ApoBmRNA水平和NmuLi細胞培養(yǎng)的上清液中ApoB蛋白質(zhì)水平的活性的結(jié)果。表8:經(jīng)過siRNA處理之后ApoBmRNA和蛋白質(zhì)的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>雙鏈體描述符相對對照，HEPG2培辨的細胞中的(ApoBmRNA/GAPDHmli^A)相對對照，HEPG2細胞培養(yǎng)物上清中的ApoB蛋白AL-DUP50328247AL-DUP503311587AI^DUP50345838AL-DUP50354626AL-DUP50364724AL-DUP503712053AL-DUP50386233AL-DUP50395645AL-DUP50407870ALJXJP504138745AlyJDUP504223252AL"DUP50436554AL-DUP5044,9555AL-DUP50456557AUDUP50462837AL-DUP50472956AI^DUP50482816AL-DUP50493136AL-DUP50505554AL-DUP50516555AL"DUP50524949AJL-DUP50533746AL"0UP50545443AL-DUP5055205101AL"DUP50566772AL"DUP50577766AL-DUP50588537AL-DUP505911661AL-DUP50604535AL~DXJP50614043AL-DUP50626347AL-DUP50842652AL-DUP50853557雙鏈體描述符號相對對照，HEPG2培養(yǎng)的細胞中的(ApoBmKNAA3APDHmRNA)相對對艱，HEPG2細胞培,上清中的ApoB蛋白AU)UP508636697127AU)UP50肪352826336451AL-DUP50外76卯AL-DUP50923781AL-DUP50932164AL孺50941529ALOTP50955457AL-DUP50965562AU)UP5097829AL"DUP5鵬1124AL-爾509943站AL-DUP51001757AL-DUP51011539表8中最具活性的27個siRNA雙鏈分子被確定為具有<對照的31%的殘余ApoBmRNA/GAPDHmRNA，或者是ApoB蛋白質(zhì)殘基水平<對照的35%。這些siRNA雙鏈分子被選擇作進一步的分析和建立IC50值。這27個siRNA雙鏈分子為AL-DUP5000，AL-DUP5002，AL-DUP5013，AL-DUP5022,AL-DUP5024，AL-DUP5028，AL-DUP5029,AL-DUP5030，AL-DUP5035，AL-DUP5036，AL-DUP5038，AL-DUP5046，AL-DUP5047，AL-DUP5048，AL-DUP5049，AL-DUP5060，AL-DUP5083，AL-DUP5084，AL-DUP5087，AL-DUP5088,AL-DUP5089，AL-DUP5093，AL-DUP5094，AL-DUP5097，AL-DUP5098，AL-DUP5100，AL-DUP5101。用以上所述的27個siRNA雙鏈分子研究增加劑量，其中，在經(jīng)過分別與100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14或0.05nM的siRNA雙鏈分子溶液一同孵育之后，利用NmuLi細胞作ApoBmRNA的定量分析，而利用HepG2細胞的細胞培養(yǎng)上清作ApoB蛋白質(zhì)的定量分析。最低ApoBmRNA和ApoB蛋白質(zhì)殘留水平被測定。對27個siRNA當(dāng)中15個顯示出均最少量的ApoBmRNA和最低的蛋白質(zhì)殘留水平，重復(fù)三次增加劑量，所得數(shù)據(jù)用來計算50%最大抑制作用(IC50)時的抑制濃度，然后計算出三次測定的平均值。通過應(yīng)用劑量增加試驗的數(shù)據(jù)對計算機軟件Xlfit4(IDBusinessSolutionsLtd.,Guildford,UK)上實施的程序做曲線擬合取得IC50值。運用以下參數(shù)從曲線擬合所得的參數(shù)化公式，計算IC50值，所述參數(shù)為單側(cè)量效(DoseResponseOneSite)、4參數(shù)邏輯模型、fit=(A+((B-A)/(l+(((10AC)/x)AD))))，inv=((10AC)/((((B-A)/(y-A))-l)A(l/D)))，reS=(y-fit)(以實例的方式，參見圖2)。—表9表示五個減少NmuLi細胞中mRNA和蛋白質(zhì)水平>70%的ApoBsiRNAs的IC50的平均值。對照實驗測定了培養(yǎng)的NmuLi細胞中最少的ApoBmRNA/GAPDH殘留，以未處理對照的百分比表示；以及測定了H印G2細胞上清中最少的ApoB蛋白質(zhì)殘留，也以未測試對照的百分比表示。表9:選擇的siRNA的IC50<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>選擇AL-DUP5024和AL-DUP5048用于進一步的實驗。實例6.siRNA雙鏈體被修飾并表現(xiàn)出對核酸酶提高的抗性siRNA雙鏈體AL-DUP5024和AL-DUP5048被各種化學(xué)修飾所改變，以試圖增強寡聚核苷酸鏈對在諸如如血清和胞內(nèi)介質(zhì)的生物液中存在的核酸酶引起的降解的抗性。具體的，在反義鏈的位點21和22之間，以及位點22和23之間，或者在有義鏈的位點20和21之間引入硫代磷酸酯鍵(參見表IO)，這樣提高了siRNA對核酸外切降解的穩(wěn)定性。表10用于穩(wěn)定性檢驗的siRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表示通過包含硫代磷酸酯的吡咯烷連接物偶聯(lián)到3'-末端的膽固醇。之前，該實驗室鑒定了siRNA雙鏈體中的某些序列基序，其特別易于于被內(nèi)切核酸酶進行降解性攻擊(參見共有和同時處于申請中的申i青US60/574,744)。具體的，這些基序是5'誦UA-3'、5'-UG-3'、5，-CA-3，、5'-UU-3，和5，-CC-3，。含有這些序列基序的siRNA具有針對內(nèi)切核酸酶的降解性攻擊的穩(wěn)定性，其通過將這些雙核苷酸基序中最5'端核苷酸的核糖亞基的2'-OH替代為2，-0-CH3(這里也被稱作2，-0-甲基或者2，-0-Me)。因此，這些siRNA被合成，其中，在有義鏈上、反義鏈上或者上述兩鏈上，除了5'-CC-3，外，所有這些雙核苷酸基序都具有2'-0-Me基。所測試的進一步修飾是將膽固醇部分結(jié)合到這些siRNA的有義鏈的3'-末端(參見圖1)。這種修飾被認為促進RNA被吸收入細胞內(nèi)(Manoharan,M.等人，^4油iewse"wd地c/e/cJczWZ>wgZ)eve/op膨wf2002,12:103~128)。合成在表10中所列的siRNA雙鏈體，并檢測它們在血清孵育檢驗中對核裂解性降解的穩(wěn)定性，以及它們在降低由培養(yǎng)的NmuLi細胞分泌到上清的ApoB蛋白量中的活性。除了下面列出的外，siRNAAL-DUP5024、AL-DUP5163、AL-DUP5164、AL-DUP5165、AL-DUP5166、AL-DUP5180和AL-DUP5181的核苷酸序列是完全相同的AL-DUP5024完全由未修飾的核苷酸構(gòu)成；AL-DUP5163在反義鏈的位點21和22具有2'-0-Me基，在反義鏈的位點21和22之間以及位點22和23之間具有硫代磷酸酯鍵，并且AL-DUP5163具有偶聯(lián)到其有義鏈的3'-末端的膽固醇部分；AL-DUP5164在其有義鏈的位點4、6、8、12、14和20以及其反義鏈的位點l、6、7、13、15和17具有2'-0-Me基，并在其反義鏈的位點21和22之間以及位點22和23之間具有硫代磷酸酯鍵，并且AL-DUP5164具有偶聯(lián)到其有義鏈的3'-末端的膽固醇部分；AL-DUP5165在其反義鏈的位點1、6、7、13、15和17具有2'-OMe基，在其反義鏈的位點21和22之間以及22和23之間具有硫代磷酸酯鍵，并且AL-DUP5165具有偶聯(lián)到其有義鏈的3'-末端的膽固醇部分；AL-DUP5166在其有義鏈的位點4、6、8、12、14和20具有2'-0-Me修飾，在其反義鏈的位點21和22之間以及22和23之間具有硫代磷酸酯鍵，并且AL-DUP5166具有偶聯(lián)到其有義鏈的3，-末端的膽固醇部分；AL-DUP5180在其有義鏈的位點4、6、8、12、14和20以及其反義鏈的位點21和22具有2'-0-Me修飾，在其反義鏈的位點21和22之間以及22和23之間，以及在其有義鏈的位點20和21之間具有硫代磷酸酯鍵；以及AL-DUP5181在其有義鏈的位點4、6、8、12、14和20以及其反義鏈的位點l、6、7、13、15和17具有2，-0-Me修飾，在其反義鏈的位點21和22之間以及22和23之間，以及在其有義鏈的位點20和21之間具有硫代磷酸酯鍵。siRNAAL-DUP5048、AL-DUP5167、AL-DUP5168、AL國DUP5169、AL-DUP5170、AL-DUP5182和AL-DUP5183的核苷酸序列是完全相同的，除了AL-DUP5048完全由未修飾的核苷酸構(gòu)成；AL-DUP5167在反義鏈的位點21和22具有2'-0-Me基，在反義鏈的位點21和22之間以及位點22和23之間具有硫代磷酸酯鍵，并且AL-DUP5167具有偶聯(lián)到其有義鏈的3，-末端的膽固醇部分；AL-DUP5168在其有義鏈的位點3、6、8、11、15和18以及其反義鏈的位點2、3、6、8、10、13、15、18和21具有2，-0-Me基，并在其反義鏈的位點21和22之間以及位點22和23之間具有硫代磷酸酯鍵，并且AL-DUP5168具有偶聯(lián)到其有義鏈的3'-末端的膽固醇部分；AL-DUP5169在其反義鏈的位點2、3、6、8、10、13、15、18和21具有2'-0-Me基，在其反義鏈的位點21和22之間以及22和23之間具有硫代磷酸酯鍵，并且AL-DUP5169具有偶聯(lián)到其有義鏈的3'-末端的膽固醇部分；AL-DUP5170在其有義鏈的位點3、6、8、11、15和18以及其反義鏈的位點21和22具有2'-0-Me修飾，在其反義鏈的位點21和22之間以及22和23之間具有硫代磷酸酯鍵，并且AL-DUP5170具有偶聯(lián)到其有義鏈的3'-末端的膽固醇部分；AL-DUP5182在其有義鏈的位點3、6、8、11、15和18以及其反義鏈的位點21和22具有2'-0-Me修飾，在其反義鏈的位點21和22之間以及22和23之間，以及在其有義鏈的位點20和21之間具有硫代磷酸酯鍵；以及AL-DUP5183在其有義鏈的位點3、6、8、11、15和18以及其反義鏈的位點2、3、6、8、10、13、15、18和21具有2'-0-Me修飾，在其反義鏈的位點21和22之間以及22和23之間，以及在其有義鏈的位點20和21之間具有硫代磷酸酯鍵。在小鼠和95%人血清中檢測表10中所列舉的siRNA的穩(wěn)定性。小鼠血清是從Sigma(Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen,Germany,cat.No.M5905)或者CharlesRiver(CharlesRiverLaboratories,Sulzfeld,Germany,cat.No.MASER)得到的。這里所報道的檢驗結(jié)果在所檢測的不同血清來源中是一致的。為了檢測所述被修飾的siRNA在人血清中的穩(wěn)定性，收集了來自8位人類志愿者的血(270mL)，并將其在室溫下保持3小時。將血池在20。C和3000rcf下"f吏用Megafuge1.0(HeraeusInstruments,KendroLaboratoryProductsGmbH,Langenselbold)離心以從細胞部分(cellularfraction)分離血清。將上清等份保存在-20。C，并在需要時使用。從Sigma(Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen，Germany,cat.No.HI513)獲得的人血清被用于對照檢驗中。向溶解在6plPBS中的雙鏈RNAGOOpmol,大約4.2|ig)中加入60W人血清，并將該混合物在37。C孵育不同的時間例如0、15或者30分鐘，或者l、2、4、8、16或者24小時。接著，將含有RNA/血清溶液的整個管在液氮中進行冷凍，并保存在-80。C。為了分析未偶聯(lián)膽固醇的siRNA，將冷凍的樣品置于冰上，冰加入450pl0.5M的NaCl。完全熔化后，將該溶液轉(zhuǎn)入Phase-LockGel管(Eppendorf,Hamburg,Germany;cat.No.0032005.152)中，與500pi50%苯酚、48%氯仿、2%異戊醇(CarlRothGmbH&CoKG,Karlsruhe,Germany,cat.No.Al56.2)進行混合，并加入額外的300|il氯仿。將這些管劇烈漩渦30秒，接著在4。C以16,200rcf離心15分鐘。將含水的上清轉(zhuǎn)入到新管中，并與40)il3M乙酸鈉pH5.2、lplGlycoBlue(Ambion,TX,USA;cat.No.9516)和1ml95%乙醇進行混合。在-20。C使RNA沉淀過夜。在存在SDS(十二烷基硫酸鈉)的情況下通過熱苯酚提取對偶聯(lián)膽固醇的siRNA進行分離。將血清樣品(66^1)與20(HilRNA緩沖液(0.5%SDS、10mMEDTA、10mMTrispH7.5)和200^1水飽和的苯酚(CarlRothGmbH&CoKGKarlsruhe,Germany;cat.No.A980.1)進行混合。將反應(yīng)管在65。C孵育20分鐘。為了達到相分離，將這些管置于冰上5分鐘，并接著在4'C以16,200rcf離心10分鐘。將水相轉(zhuǎn)入到新管中。利用150plRNApotion和劇烈漩渦10秒鐘對剩余的苯酚相進行又一次提取。將這些管置于冰上2分鐘，并接著在4'C以16,200rcf離心10分鐘。將第二次提取的水相轉(zhuǎn)移并與第一次提取的上清結(jié)合。通過力口入2|ilGlycoBlue(Ambion，Austin,TX,USA;Cat.No.9516)禾口1ml95%乙醇將RNA進行沉淀。在-20。C過夜將RNA的沉淀進行完全。通過變性凝膠電泳對所分離的RNA進行分析。將含有沉淀的RNA的管在4。C以16,200rcf離心10分鐘。將上清移棄。使用400^170%乙醇將RNA沉淀進行清洗，并通過在4°C以16,200rcf離心5分鐘進行再沉淀。去除所有的液體，并將沉淀溶解在STOP緩沖液(95%甲酰胺、5%EDTA0.5M、0.02%二甲苯藍)中。將這些樣品在92。C煮沸3分鐘，并在冰上快速冷卻。將10^1上樣到14%聚丙烯酰胺變性膠(6M尿素、20%甲酰胺，CarlRothGmbH&CoKGKarlsruhe,Germany)上。在45mA下對RNA進行分離大約2小時。通過使用"全染色(stains-all)"試齊lj(Sigma畫AldrichChemieGmbH,Steinheim,Germany,cat.no.E9379)根據(jù)用戶說明書進行的染色將RNA帶進行顯示。在與小鼠和人血清孵育1小時后未修飾的AL-DUP5024幾乎完全被降解，而被修飾的siRNA對降解則更有抗性(參見圖3)。在電泳分離后，使用全染色試劑對全長RNA進行染色達到3小時以顯示AL-DUP5163，孵育達到6小時以顯示AL-DUP5164、AL-DUP5165、AL-DUP5166、AL-DUP5180和AL-DUP5181。AL-DUP5164、AL-DUP5166和AL-DUP5181中觀察到了最強的穩(wěn)定作用，這說明易于降解的有義鏈中這些位點的修飾是非常有效的。反義鏈的額外的修飾僅僅提供了較少的額外穩(wěn)定作用。(參見圖3)類似的，在與小鼠血清孵育1小時后，未修飾的AL-DUP5048幾乎完全被降解，而被修飾的dsRNA則對于降解有較少的敏感。在電泳分離之后，使用全染色試劑對全長RNA進行染色達到3小時以顯示AL-DUP5167、AL-DUP5170和AL-DUP5182，孵育達到6小時以顯示AL-DUP5169，達到24小時以顯示AL-DUP5168和AL-DUP5183。(參見圖3)對表10中所列的siRNA雙鏈進行檢測它們在降低培養(yǎng)的HepG2細胞分泌ApoB蛋白到上清中的效率，以選擇最有活性的雙鏈以進行體內(nèi)的進一步測試。ApoB特異性的膽固醇修飾的siRNA在HepG2細胞的體外檢驗中的沉默活性與未修飾的ApoB-特異性siRNA的沉默活性相當(dāng)。兩種未偶聯(lián)的siRNAAL-DUP5024和AL-DUP5048以200nM的濃度分別降低了鼠ApoBmRNA水平的84±9%和72±9%，而相應(yīng)的偶聯(lián)的和被修飾的siRNAAL-DUP5167和AL-DUP5163分別具有61±8%和68±9%的抑制活性。圖5A圖5L表示ApoB蛋白分泌到培養(yǎng)的人HepG2細胞的上清中的劑量應(yīng)答曲線，其中人HepG2細胞被與含有100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14或者0.05nM的ApoB特異性siRNA雙鏈體進行孵育。所述應(yīng)答被表達為在使用ApoB特異性siRNA雙鏈體處理的細胞上清中ApoB蛋白濃度與在使用非特異性對照siRNA雙鏈體處理的細胞上清中ApoB濃度的比例。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇AL-DUP5163、AL-DUP5165、AL-DUP5166和AL-DUP5167進行在小鼠中的檢測(參見下面的結(jié)果)。實例7被修飾的siRNA雙鏈體降低肝臟和空腸的組織切片中ApoBmRNA的量，并降低C57B1/6雄性小鼠血清中ApoB蛋白的膽固醇水平使用27G注射針通過尾部靜脈注射進行在小鼠中的推注給藥(bolusdosing)siRNA。以能夠釋放8|il/g體重的計劃劑量的濃度，將siRNA溶解在PBS中。在給藥之前，將小鼠置于紅外線燈下大約3分鐘以便于注射。在給藥之前幾天，通過收集來自尾部靜脈的4~7滴血收集預(yù)處理血樣。在通過C02窒息進行處死后，通過心臟穿剌收集大約0.7ml血液，并將2040mg的組織等份在液氮中進行冷凍并保存在-8(TC直到進行分析。通過上述的分支DNA測定法對ApoB100mRNA水平進行檢測。將每份大約10~30mg的三份冷凍組織切片樣品(肝臟或者空腸)通過在含有84嗎/ml蛋白酶K(Epicentre,Madison,WI，USA,cat.No.MPRK092)的lml組織和細胞裂解溶液(Epicentre,Madison,WI,USA,cat.No.MTC096H)的超聲降解進行勻漿，其使用每次為0.9秒的39次脈沖，其振幅為大約150pm。在分析之前，將裂解物保存在-80。C至少12小時(過夜)。將冷凍的裂解物在室溫下融化，并根據(jù)用戶說明書使用QuantigeneExplore試劑盒對ApoB和GAPDHmRNA進行定量。借助QuantiGeneProbeDesigner軟〈牛2.0(Genospectra，F(xiàn)remont,CA,USA,cat.No.QG-002-02)從ApoB和GAPDH的核酸序列選擇捕獲延伸物(CE)、標記延伸物(LE)以及封閉(BL)探針的核酸序列。表4中示出了在ApoB定量中所使用的探針核苷酸序列。表6中示出了在GAPDH定量中所使用的探針核苷酸序列。對每個處理組的組織樣品中ApoBmRNA和GAPDHmRNA的比例進行平均，并與未處理的對照組或者使用不相關(guān)siRNA雙鏈體處理的對照組進行比較。進行ELISA檢驗以對小鼠血清中的ApoB100蛋白的量進行定量。為了進行該檢驗，將96孔板覆蓋lOOpl小鼠ApoB-100-特異性單克隆抗體LF3(25|ig/ml;Zlot,CH.等人，J.LipidRes.1999，40:76-84)，并將該板在37"C孵育2小時。使用磷酸酯緩沖生理鹽水(PBS)(PSDulbecco不含Ca2+、Mg2+，BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.LI82-05)將該板清洗3次，接著通過向每個孔中加入含有3%牛血清白蛋白(BSA)(CarlRothGmbH&CoKG,Karlsruhe,Germany,cat.no.8076.2)的300)!lPBS將剩余的結(jié)合位點封閉。在室溫下將這些板孵育1小時。接著使用PBS將板清洗5次。將溶解在lOOpl含有0.1%Tween(CarlRothGmbH&CoKG,Karlsruhe,Germany,cat.No.9127.1)和3%BSA的PBS中的0.2^1小鼠血清加入到每個孔中。在37。C孵育2小時后，使用PBS將板清洗5次。將lOOpl1:500稀釋的多克隆兔抗小鼠載脂蛋白B48/100抗體(AcrisAntibodiesGmbH,Hiddenheim，Ge兀nany,cat.no.BP2050)加入到這些孔中，并在37。C孵育2小時。使用PBS將板清洗5次后，加入lOOpl偶聯(lián)辣根過氧化物酶的驢抗兔IgG(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,USA,cat.no.sc2004)，并在37°C孵育1小時。使用PBS將板清洗5次，并將這些孔與在24mmol/LpH5.0含有0.03%過氧化氫(MerckBiosciencesGmbH,BadSoden，Germany,cat.No.386790)擰檬酸緩沖液中的0.9mg/mlOPD(鄰苯二胺鹽酸鹽，MerckBiosciencesGmbH,BadSoden,Germanycat.No.523121)孵育。通過力口入0.5mol/LH2S04(MerckKgaA,Darmstadt,Germany,cat.No.100731)終止該酶反應(yīng)，并在分光光度計(PerkinElmerWallacVictor31420多標記閱讀儀器，PerkinElmerLASGmbH,Rodgau,Germany)上檢測490nm處的吸光度。使用CholesterolFS試劑盒(DiaSysDiagnosticSystemsGmbH,Holzheim,Germany)根據(jù)用戶說明書檢測小鼠血清中的總血清膽固醇。在分光光度計(DU640B,BeckmanCoulterGmbH,Unterschlei卩heim,Germany)上進行這些檢測。在注射之后，Sl-核酸酶保護檢驗被用于檢測肝臟和空腸組織中的siRNA。按照上面為進行分支DNA測定法所描述的，對一些小塊動物組織(1030mg)進行勻漿。立即對這些裂解物進行處理，或者將其保存在-8(TC，并在進行檢驗操作之前在室溫下將其融化。將10(Hil裂解物轉(zhuǎn)到新管，并與200|ilSTE(氯化鈉-TPJS-EDTA緩沖液；500mMNaCl9mMTrispH7.5，0.9mMEDTA)以及200W苯酚(TRIS-EDTA飽和的苯酚，Roti-phenol，Carl5RothGmbH&CoKG,Karlsruhe,Germany,cat.no.0038.1)進行混合。將這些管在VortexGenie2(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY,USA,cat.no.SI-0256)上以最大速度劇烈混合30秒，接著在4。C以16,200rcf離心10分鐘。將大約310pl含水的上清小心地抽吸并轉(zhuǎn)到新的反應(yīng)管，與50(ig大腸桿菌(E.coli)tRNA(RocheDiagnostics,Penzberg，Germany;cat.No.109541)禾口900^195%乙醇進行混合。在-2(TC將RNA的乙醇沉淀持續(xù)過夜。將用于Sl-核酸酶保護檢驗的DNA探針進行放射性標記。長度為25~27個核苷酸的探針對應(yīng)于siRNA分子的21個核苷酸有義鏈序列，但在其3，-末端包含額外的46個核苷酸作為非互補延伸(extension)。使用YJ2PATP將這些DNA寡聚核苷酸探針進行磷酸化，以在其5'-末端引入有放射性的磷酸基團。將15皮摩爾的每種探針與50pCi的y-32PATP(AmershamGE-Healthcare,Freiburg,Germany,cat.no.AAOOl8)以及10U多聚核苷酸激酶(NewEnglandBiolabs,Frankfurt,Germany:M0201S)在總體積的多聚核苷酸激酶緩沖液(NewEnglandBiolabs,Frankfurt,Germany,cat.no.M0201S)中進行混合。將該溶液在37°。孵育1小時。根據(jù)用戶說明書通過將該反應(yīng)混合物流經(jīng)MicrospinG-25脫鹽柱(AmershamGE國Healthcare,Freiburg,Germany,cat.no.27-5325-01)使該標記反應(yīng)終止。在13天內(nèi)使用所得到的探針溶液。為了檢測來自小鼠組織裂解物的siRNA，將從裂解物沉淀的總RNA在4。C以16,200rcf離心10分鐘。小心地將上清移棄，而保留核酸沉淀。首先將該沉淀重懸浮在5(V1S1-雜交緩沖液(300mMNaCl，1mMEDTA,38mMHEPESpH7.0,0.1%TritonX-100)中，接著加入1f^l有放射性的DNA探針溶液。將該雜交反應(yīng)混合物加熱到92。C保持2分鐘。立即將這些反應(yīng)管轉(zhuǎn)到保持在37。C的加熱塊上，并進一步孵育30分鐘。在室溫下繼續(xù)雜交額外的2小時。為了確定血清中siRNA的濃度，將lpl血清與50lalSl-雜交緩沖液以及l(fā)pl有放射性的DNA探針進行混合，并如上繼續(xù)該雜交。使用了下面的探針為檢測AL-DUP3001和AL-DUP5386:5,國GAACTGTGTGTGAGAGGTCCTTCTT曙3，SEQ.IDNO.265;為檢測AL-DUP53115'曙GTGATCAGACTCAATACGAATTCTTCTT-3，SEQ.IDNO.266;為檢測衍生自AL-DUP5048的siRNA(AL-DUP5048、AL-DUP5167、AL-DUP5168、AL-DUP5169、AL-DUP5170、AL-DUP5182、AL-DUP5183、AL-DUP5385和AL-DUP5546)5，-GTCATCACACTGAATACCAATTCTTCT-3，SEQ.IDNO.267;為檢測衍生自AL-DUP5024的siRNA(AL-DUP5024、AL-DUP5163、AL-DUP5164、AL-DUP5165、AL-DUP5166、AL-DUP5180和AL-DUP5181)5,-JGGTGTATGGCTTCAACCCTGTCTTCT_3,SEQ.IDNO.268;為檢測衍生自AL-DUP5002的siRNA(AL-DUP5536和AL-DUP5537)5，-GATTGATTGACCTGTCCATTCTCTTCTT-3'SEQ.IDNO.307;為檢測衍生自AL-DUP5035的siRNA(AL-DUP5538和AL-DUP5539)5'國CACCAACTTCTTCCACGAGTCTCTTCTT-3'SEQ.IDNO.308;為檢測衍生自AL-DUP5089的siRNA(AL-DUP5540和AL-DUP5541)5'-GAGTTTGTGACAAATATGGGCTCTTCTT陽3'SEQ.IDNO.309;為檢測衍生自AL-DUP5097的siRNA(AL-DUP5542和AL-DUP5543)5'國CTTTACAAGCCTTGGTTCAGTTCTTCTT-3，SEQ.IDNO.310;為檢測衍生自AL-DUP5098的siRNA(AL-DUP5544和AL-DUP5545)5,畫GGAATCTTATATTTGATCCAATCTTCTT-3，SEQ.IDNO.311。另外，與肝臟(miRNA122)和空腸(miRNA143)中內(nèi)源表達的微RNA雜交的兩個探針被用作上樣參照。為檢測miRNA122:5'畫JAACACCATTGTCACACTCCATCTTCTT-3'SEQ.IDNO.269;為檢測miRNA143:5,陽GAGCTACAGTGCTTCATCTCATCTTCTT-3'SEQ.IDNO.270。雜交之后，將45(HdSl-核酸酶消化混合物加入到每個管中(450^ilSl-反應(yīng)混合物:333mMNaCl，2.2mM醋酸鋅。66.7mM醋酸鈉pH4.5，0.02%TritonX-100和100USl-核酸酶；AmershamGE-Healthcare,Freiburg,Germany;cat.no.E2410Y)以降解全部未雜交的探針。將該消化反映混合物在37。C下孵育30分鐘。通過加入在7^1500mMEDTApH8.0禾口900jil95%乙醇中的30嗎t(yī)RNA(RocheDiagnostics,Penzberg,Germany;109541)終止該反應(yīng)消化。在-20。C將得到保護的探針沉淀過夜，或者在-80。C沉淀90分鐘。沉淀后，通過變性凝膠電泳對得到保護的探針進行分析。將所沉淀的雙鏈體RNA在4。C以16,200rcf離心10分鐘。小心地將上清移棄。將沉淀溶解在12plSTOP緩沖液(95%甲酰胺、5%EDTA0.5M和0.02%二甲苯藍中。將管加熱到92°C2分鐘，接著立即在冰上冷卻。在變性測序凝膠(12.5%丙烯酰氨、lx標準TBE緩沖液、19cmx20cmx0.4mm長x寬x深；RotiphoreseDNA測序系統(tǒng)，CarlRothGmbH&CoKG,Karlsruhe,5Germany,cat.no.A431.1)上樣4pl/泳道的該溶液。對該凝膠進行電泳45分鐘，其在對應(yīng)于大約30V/cm的電壓梯度的600V下(EPS3501XL,AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden;cat.no.18-1130-05)。在紙上將該凝膠干燥，并曝光到通用磷光板顯像儀過夜(AmershamGE曙Healthcare,Freiburg,Germany;cat,no,63-0034-88)。第二天，在Typhoon9200高性能顯像儀使有放射性的帶顯現(xiàn)。使用配有Typhoon9200顯像儀的2003.01版ImageQuantTL軟件通過比較上樣到凝膠上的每種有放射性探針的60、20、6.6和2.2fmol的梯度稀釋進行比較進行對有放射性帶的定量。除了下面描述的涉及轉(zhuǎn)基因動物以表達人ApoB的動物實驗外，所有的動物實驗都是遵守保護用于實驗和其他科學(xué)用途的脊椎動物歐洲公約進行的。C57B1/6雄性小鼠是從CharlesRiverLaboratories,Sulzfeld，Germany獲得的，并在使用前適應(yīng)至少5天。將這些動物飼養(yǎng)在22±2°C和55土10%rel.濕度下。晝/夜節(jié)奏為12小時，在上午6:00(亮)和下午6:00(黑)變化。除非下面有特別的說明，這些動物都被隨意喂養(yǎng)SsniffR/M國H食物(SsniffSpezialdiatenGmbH,Soest,Germany,cat.No.VI531)。進行下面的實驗方案。A.)3組，每組中7只年齡3.5個月的動物在連續(xù)的三天接受每日50mg/kg劑量的AL-DUP5163、AL-DUP5166(序列參見表10)或者等量的載體，并在第四天將其處死。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度和肝臟和空腸ApoBmRNA水平。與其它方面完全相同的AL-DUP5163相比，AL-DUP5166有義鏈上位點4、6、8、12、14和20核苷酸的2，-0-甲基修飾為AL-DUP5166提供了針對在血清中的降解的更高的穩(wěn)定性(參見圖3)。該實驗被設(shè)計為測試小鼠ApoB特異siRNA下調(diào)ApoB基因在小鼠的肝臟和空腸中表達的能力，以及降低血清中ApoB蛋白水平和膽固醇水平的能力。該實驗還測試了是否具有提高其在生物血清中穩(wěn)定性的2'-0-Me修飾的siRNA在下調(diào)ApoB表達中比缺少2'OMe有義鏈修飾的siRNA更有效。通過分支DNA測定法對肝臟和空腸組織中ApoBmRNA的水平進行檢驗。發(fā)現(xiàn)AL-DUP5163將肝臟組織樣品中ApoBmRNA的水平降低到對照動物的肝臟組織中存在的水平的50±13%?？漳c中ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的40±6%。發(fā)現(xiàn)AL-DUP5166將肝臟組織中ApoBmRNA的水平降低到降低到對照動物的組織中的mRNA水平的59±9%?？漳c中ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的14±3%。B.)2組，每組中7只年齡3.5個月的動物連續(xù)三天接受每日50mg/kg劑量的AL-DUP5167(序列參見表10)或者等量的載體的處理。在第四天將小鼠處死。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度和肝臟和空腸ApoBmRNA水平。通過分支DNA測定法對ApoBmRNA水平進行檢驗。發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167將來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織樣品中存在的ApoBmRNA水平降低到對照動物的肝臟組織中存在的mRNA水平的41±6%?？漳c中ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的29±9%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為對照水平的101±9%，基本上沒有變化。血清膽固醇被降低到載體對照的60±22%。C.)3組，每組中7只年齡2.5個月的動物連續(xù)三天接受每日50mg/kg劑量的AL-DUP5165或者等量的載體，并在第四天被處死。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度和肝臟ApoBmRNA水平。與其它方面完全相同的AL-DUP5163(序列參見表10)相比，AL-DUP5165反義鏈上位點1、6、7、13、15禾n17核苷酸的2'-0-甲基修飾為AL-DUP5165提供了針對在血清中的降解的更高的穩(wěn)定性(參見圖3)，但這種穩(wěn)定作用不如在AL-DUP5166中所觀察到的強。該實驗被比較了具有提高其在生物血清中穩(wěn)定性的反義鏈上2，-0-Me修飾的小鼠ApoB特異siRNA下調(diào)ApoB基因在小鼠的肝臟和空腸中表達的能力，以及降低血清ApoB蛋白水平和膽固醇水平的能力。該實驗還測試了是否被修飾為具有在血清中提高的穩(wěn)定性的siRNA在下調(diào)ApoB表達方面更有效。分支DNA被用于檢測ApoBmRNA的水平。發(fā)現(xiàn)AL-DUP5165將來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織樣品中ApoBmRNA的水平降低到僅僅接受載體的對照動物的肝臟組織中存在的mRNA水平的68±12%。血清ApoB蛋白的濃度被降低到對照水平的63±6%。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的99±26%，基本上沒有變化。D.)4組，每組6只年齡2.5個月的動物連續(xù)三天接受每日50mg/kg劑量的AL-DUP5167、AL-DUP3001、AL-DUP5311或者等量的載體，并在第四天被處死。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度，和肝臟與空腸ApoBmRNA水平。AL-DUP5167的核苷酸序列被表示在表10中。AL-DUP5311和AL-DUP3001的序列如下有義鏈；5""-grugaucagacugaauacgaau(Choi)-3'SEQ.IDNo.271反義鏈:5—-auucguauugagucugaucacm^g-3'SEQ.IDNo..272AL-DUP3001有義鏈:5，-sraacugugugugagagguccu(Choi〗-3'(SEQ.IDNo.273).反義鏈:5'-ggsccucucacac3csguuc2225-3'(SEQ.IDNO.274}AL-DUP5311表示AL-DUP5167的小鼠ApoBmRNA錯配siRNA，其中在位點4、10、14和19制造了四個G/C轉(zhuǎn)化。這種siRNA被用作與AL-DUP5167進行比較的陰性對照。AL-DUP3001表示無關(guān)的對照siRNA。AL-DUP3001有義鏈的位點1~20的序列相應(yīng)于克隆載體pGL3-Basic(PromegaGmbH，Mannheim,Germany,cat.no.El751)(登記號U47295)的1252~1272位核苷酸，并且其是編碼螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶的序列的一部分。AL-DUP3001用于作為AL-DUP5167的另一個陰性對照。本實驗是為了確認使用AL-DUP5167所得到的前面的發(fā)現(xiàn)，以進一步表示使用AL-DUP5167所觀察到的作用是序列特異性的。通過分支DNA測定法確定ApoBmRNA水平。發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167將來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織中ApoBmRNA的水平降低到對照動物的肝臟組織中存在的水平的36±11%?？漳c中ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的27±8%。小鼠血清中血清ApoB蛋白被降低到大約載體對照水平的29±16%。血清膽固醇水平為73±35%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)AL-DUP5311使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織中ApoBmRNA的水平為注射載體的對照動物的肝臟組織中存在的水平的95±16%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)空腸中ApoBmRNA的水平基本在對照動物中水平的120±19%不變。血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的109±76%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇水平為載體對照的77±43%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)AL-DUP3001使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織中ApoBmRNA的水平為注射載體的對照動物的肝臟組織中存在的水平的79±22%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)空腸中ApoBmRNA的水平為對照動物中水平的130±33%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的104±55%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇水平為載體對照的108±46%，基本上沒有變化。E.)4組6只年齡2.5個月的動物連續(xù)三天接受每日50mg/kg劑量的AL-DUP5167、AL-DUP3001、AL-DUP5311或者等量的載體，或者連續(xù)三天接受每日10mg/kg劑量的AL-DUP5167，或者連續(xù)三天接受每日2mg/kg劑量的AL-DUP5167，或者僅僅在第一天接受一次劑量的50mg/kg。在第4天將小鼠處死。另外一組的6只動物在第一天，在它們背部肩胛骨稍后處接受了皮下滲透壓泵移植(Alzet1007D,ALZETOsmoticPumpsDURECTCorporation,Cupertino,CA，USA)。該泵l皮設(shè)置為釋放0.5pl/hr的0.33mglAL-DUP5167溶液持續(xù)7天，其量達到每天的劑量為每只動物每天大約4mg/kg體重。在第8天將該組動物處死。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度，和肝臟與空腸ApoBmRNA水平。前面給出了AL-DUP5167、AL-DUP5311和AL-DUP3001的核苷酸序列。該實驗是為了確認前面利用AL-DUP5167，且以載體、錯配的siRNA(AL-DUP5311)以及無關(guān)的siRNA(AL-DUP3001)作為對照所得到的發(fā)現(xiàn)，以進一步確定是否推注靜脈內(nèi)連續(xù)3天2或10mg/kg體重的劑量，或者在第1天一次50mg/kg體重的劑量能夠足以得到在上面(C)和(D)中連續(xù)3天靜脈內(nèi)50mg/kg體重的劑量時所觀察到的作用。而且，該實驗設(shè)計將這些給藥方案與通過滲透壓泵持續(xù)釋放每天低劑量的4mg/kg體重持續(xù)7天進行比較。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以50mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)給藥連續(xù)3天，接著在第4天處死時，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167將來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平降低到僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的69±17%，空腸中ApoBmRNA水平被降低到對照動物中水平的24±8%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的69±9%。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的95±29%，基本上沒有變化。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以10mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)給藥連續(xù)3天，接著在第4天處死時，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的81±32%，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA水平變?yōu)閷φ談游镏兴降?2±13%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的101±19%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的101±29%，基本上沒有變化。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以2mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)給藥連續(xù)3天，接著在第4天處死時，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的109±38%，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA水平變?yōu)閷φ談游镏兴降?7±21%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的115±13%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的114±26%，基本上沒有變化。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，在第一天以50mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)給藥一次，接著在第4天處死時，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167將來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平降低到僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的41±20%，空腸中ApoBmRNA水平被降低到對照動物中水平的62±23%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的52±11%。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的95±25%，基本上沒有變化。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以50mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)給藥連續(xù)3天，接著在第4天處死時，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5311使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的100±16%，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA水平變?yōu)閷φ談游镏兴降?00±20%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的97±11%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的129±37%，基本上沒有變化。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以50mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)給藥連續(xù)3天，接著在第4天處死時，發(fā)現(xiàn)AL-DUP3001使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的97±28%，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA水平變?yōu)閷φ談游镏兴降?01±16%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的106±6%。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的129±43%，基本上沒有變化。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以從滲透壓泵釋放每天4mg/kg體重的劑量持續(xù)7天，接著在第8天處死時，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的79±24%，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA水平變?yōu)閷φ談游镏兴降?0土19%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的106±6%。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的129±43%，基本上沒有變化。F.)七組，每組中6只年齡為2.5個月的動物在第一天接受了一次推注給藥50mg/kg的AL-DUP5167。6只動物的一個對照組接受了等量的載體。在給藥后12、24、36、60、84和108小時，將接受siRNA的多組動物處死。在給藥后84小時，將接受載體的對照組處死。確定肝臟和空腸ApoBmRNA的水平。上面提供了AL-DUP5167的核苷酸序列。設(shè)計本實驗是為了獲得AL-DUP5167對肝臟和空腸中ApoBmRNA水平影響，以及對血清ApoB和膽固醇濃度影響的時間進程。在靜脈內(nèi)給藥50mg/kgAL-DUP5167后12小時處死的動物中，在肝臟中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的100±32%的ApoBmRNA水平，以及在空腸中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物的空腸組織中存在的ApoBmRNA水平的145±78%的ApoBmRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白濃度被確定為載體對照水平的124±14%。在靜脈內(nèi)給藥50mg/kgAL-DUP5167后24小時處死的動物中，在肝臟中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的85±21%的ApoBmRNA水平，以及在空腸中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物的空腸組織中存在的ApoBmRNA水平的84±32%的ApoBmRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白濃度被確定為載體對照水平的92±52%。在靜脈內(nèi)給藥50mg/kgAL-DUP5167后36小時處死的動物中，在肝臟中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的64±20%的ApoBmRNA水平，以及在空腸中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物的空腸組織中存在的ApoBmRNA水平的88±19%的ApoBmRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白濃度被確定為載體對照水平的55±12%。在靜脈內(nèi)給藥50mg/kgAL-DUP5167后60小時處死的動物中，在肝臟中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的73±10%的ApoBmRNA水平，以及在空腸中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物的空腸組織中存在的ApoBmRNA水平的41±13%的ApoBmRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白濃度被確定為載體對照水平的43±16%。在靜脈內(nèi)給藥50mg/kgAL-DUP5167后84小時處死的動物中，在肝臟中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的73±13%的ApoBmRNA水平，以及在空腸中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物的空腸組織中存在的ApoBmRNA水平的68±22%的ApoBmRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白濃度被確定為載體對照水平的54±15%。在靜脈內(nèi)給藥50mg/kgAL-DUP5167后108小時處死的動物中，在肝臟中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的68±15%的ApoBmRNA水平，以及在空腸中發(fā)現(xiàn)了僅接受載體的動物的空腸組織中存在的ApoBmRNA水平的85±15%的ApoBmRNA水平。在小鼠血清中，血清ApoB蛋白濃度被確定為載體對照水平的51±8%。G.)五組，每組中IO只年齡為2.5個月的動物，連續(xù)三天每日靜脈內(nèi)接受50mg/kg體重劑量的AL-DUP5167、AL-DUP5385、AL-DUP5311、AL-DUP5386或者等量的載體，一組7只動物根據(jù)相同的給藥方案接受AL-DUP5163，在第4天處死所有的動物。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度以及肝臟和空腸ApoBmRNA水平。另外，根據(jù)Sl-核酸酶保護檢驗估計肝臟樣品中存在的siRNA的量(參見圖6)。上面提供了AL-DUP5167、AL-DUP5163和AL-DUP5311的核苷酸序列。AL-DUP5385和AL-DUP5386的核苷酸序列為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage95</formula>AL-DUP5385與AL-DUP5167完全相同，除了AL-DUP5385在其有義鏈的3，-末端不具有膽固醇部分，并且在其有義鏈的位點20和21之間具有硫代磷酸酯鍵。后面的硫代磷酸酯鍵是為了提供與具有硫代磷酸酯鍵的膽固醇修飾相似的對核酸外切降解的保護。(參見圖1)AL-DUP5386與AL-DUP3001完全相同，除了反義鏈的位點23的2'-0-甲基修飾被去除，并在位點21加入了2'-0-甲基修飾。這被認為AL-DUP5386提供了比AL-DUP3001優(yōu)越的對降解的穩(wěn)定作用。設(shè)計本實驗是為了確認在上面(E)中所得到的結(jié)果，以進一步將偶聯(lián)膽固醇的AL-DUP5167的活性與在其他方面完全相同只是缺少膽固醇的AL-DUP5385的活性進行比較，以確認利用AL-DUP觀察到的抑制ApoBmRNA表達活性的缺失不是由于經(jīng)過處理的小鼠的血液中AL-DUP3001的快速降解。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167將在來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平降低到在僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的mRNA水平的43±6%，空腸中ApoBmRNA的水平被降低到對照動物水平的27士10。/。。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的32±14%。小鼠血清中血清膽固醇濃度被降低到載體對照水平的63±11%。通過Sl-核酸酶保護檢驗，在肝臟和空腸組織樣品中檢測到大約100-200ng/g組織的AL-DUP5167(圖6A)。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5163將在來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平降低到在僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的mRNA水平的64±8%，空腸中ApoBmRNA的水平被降低到對照動物水平的49士13。/。。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的66±20%。小鼠血清中血清膽固醇濃度為載體對照水平的94±10%，基本上沒有變化。通過Sl-核酸酶保護檢驗，在肝臟和空腸組織樣品中檢測到大約50-150ng/g組織的AL-DUP5163。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5385使在來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的mRNA水平的84士12。/。，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA的水平變?yōu)閷φ談游锼降?15±25%。發(fā)現(xiàn)小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的101±24%，沒有變化。小鼠血清中血清膽固醇濃度為載體對照水平的97土10%，基本上沒有變化。在Sl-核酸酶保護檢驗中，在肝臟和空腸組織樣品中沒有能夠檢測到的殘余AL-DUP5385(圖6A)。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5311使在來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的mRNA水平的96士16。/。，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA的水平變?yōu)閷φ談游锼降?6±28%。發(fā)現(xiàn)小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的102±32%，沒有變化。小鼠血清中血清膽固醇濃度為載體對照水平的104±10%，基本上沒有變化。通過Sl-核酸酶保護檢驗，在肝臟和空腸組織樣品中檢測到大約50-200ng/g組織的AL-DUP5311(圖6A)。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5386使在來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的mRNA水平的89士11。/。，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA的水平變?yōu)閷φ談游锼降?5±14%。發(fā)現(xiàn)小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的94士31。/。，沒有變化。小鼠血清中血清膽固醇濃度為載體對照水平的104±10%，基本上沒有變化。通過Sl-核酸酶保護檢驗，在肝臟和空腸組織樣品中檢測到大約50-200ng/g組織的AL-DUP5386(圖6A)。H.):六組，每組中年齡為2.5個月的6只動物接受了單次靜脈內(nèi)推注給藥100、50、25或者12.5mg/kg體重的AL-DUP5167，或者等量的載體。在給藥72小時候?qū)⑦@些動物處死。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度以及肝臟和空腸ApoBmRNA水平。前面在表10中提供了AL-DUP5167的核苷酸序列。進行本實驗是為了評估AL-DUP5167的劑量響應(yīng)。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以100mg/kg體重的劑量，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167將來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平降低到僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的48±13%，空腸中ApoBmRNA水平被降低到對照動物中水平的37±3%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的57±14%。血清膽固醇被降低為載體對照水平的71±14%。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以50mg/kg體重的劑量，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167將來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平降低到僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的79±13%，空腸中ApoBmRNA水平被降低到對照動物中水平的67±15%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的69±17%。血清膽固醇被降低為載體對照水平的90±28%，基本上沒有變化。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以25mg/kg體重的劑量，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的96±7%，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA水平被降低到對照動物中水平的56±11%。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被確定為載體對照水平的68±26%。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的93士8%，基本上沒有變化。根據(jù)分支DNA測定法所確定的，以12.5mg/kg體重的劑量，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167使來自經(jīng)過處理的小鼠的肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA水平為僅接受載體的動物的肝臟組織中存在的ApoBmRNA水平的90±14%，基本上沒有變化，空腸中ApoBmRNA水平為對照動物中水平的77±22%，沒有變化。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被確定為載體對照水平的95±5%。發(fā)現(xiàn)血清膽固醇為載體對照水平的91±14%，基本上沒有變化。I):八組，每組中6只年齡為2.5個月的動物接受了一次靜脈內(nèi)推注100mg/kg體重的AL-DUP5167(序列，參見表10)劑量，或者等量的載體。在給藥后18小時、66小時、96小時、168小時和336小時將使用AL-DUP5167處理的這些組動物處死，在給藥后18小時、66小時和240小時，將使用載體處理的這些組動物處死。將240小時后處死的組用作對照，所有的數(shù)值都表達為這組中所得到的平均值的百分數(shù)。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度以及肝臟和空腸ApoBmRNA水平。Sl-核酸酶保護檢驗被用于確定肝臟組織中存在的AL-DUP-5167的量。設(shè)計該實驗是為了確認AL-DUP5167對肝臟和空腸中ApoBmRNA水平影響，以及對血清ApoB以及膽固醇濃度的時間進程，以延長觀察的時間。給藥18小時后，在肝臟樣品中回收了3.3嗎/g組織的AL-DUP5167，其在66小時后下降到22ng/g組織，在其之后低于能夠檢測的極限。在靜脈內(nèi)注射100mg/kgAL-DUP5167之后18個小時被處死的動物中，在其肝臟中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的肝臟組織中所存在的ApoBmRNA的37±16%的ApoBmRNA，在空腸中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的空腸組織中所存在的ApoBmRNA的87±29%的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的XX±X%。在靜脈內(nèi)注射100mg/kgAL-DUP5167之后66個小時被處死的動物中，在其肝臟中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的肝臟組織中所存在的ApoBmRNA的47±7%的ApoBmRNA，在空腸中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的空腸組織中所存在的ApoBmRNA的43±8%的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的XX±X%在靜脈內(nèi)注射100mg/kgAL-DUP5167之后96個小時被處死的動物中，在其肝臟中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的肝臟組織中所存在的ApoBmRNA的38±9%的ApoBmRNA，在空腸中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的空腸組織中所存在的ApoBmRNA的78±14%的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的XX±X%。在靜脈內(nèi)注射100mg/kgAL-DUP5167之后168個小時被處死的動物中，在其肝臟中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的肝臟組織中所存在的ApoBmRNA的57±5%的ApoBmRNA，在空腸中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的空腸組織中所存在的ApoBmRNA的87±27%的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的XX±X%。在靜脈內(nèi)注射100mg/kgAL-DUP5167之后336個小時被處死的動物中，在其肝臟中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的肝臟組織中所存在的ApoBmRNA的94±100/0的ApoBmRNA，在空腸中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的空腸組織中所存在的ApoBmRNA的109±12%的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的XX±X%。在靜脈內(nèi)注射100mg/kg鹽水對照AL-DUP5167之后18個小時被處死的動物中，在其肝臟中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的肝臟組織中所存在的ApoBmRNA的83±21%的ApoBmRNA,在空腸中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的空腸組織中所存在的ApoBmRNA的109士26%的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的51±8%。在靜脈內(nèi)注射100mg/kgAL-DUP5167之后18個小時被處死的動物中，在其肝臟中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的肝臟組織中所存在的ApoBmRNA的104±19%的ApoBmRNA，在空腸中發(fā)現(xiàn)240小時載體對照組的空腸組織中所存在的ApoBmRNA的97±21%的ApoBmRNA。小鼠血清中的血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的51±8%。本實驗表明偶聯(lián)膽固醇的siRNA的功能可以在肝臟中持續(xù)7天或者更長，在腸中持續(xù)3天或者更長。后者與腸內(nèi)的腸細胞的平均壽命一致。從實驗A)1)得出的結(jié)論基于siRNA的抑制基因表達的重要考慮是是否所觀察到的影響是特異的，而且不是由于"脫靶"效應(yīng)以及已經(jīng)在體外和其他基于寡聚核苷酸的方法利用siRNA所報道的可能干擾反應(yīng)。在我們的實驗中利用多種獨立的針對ApoBmRNA不同序列區(qū)域的siRNA觀察到了偶聯(lián)膽固醇的siRNA的ApoB特異性效應(yīng)。而且，ApoB的體內(nèi)沉默是特異性的，因為非特異的siRNA和錯配對照siRNA都不能介導(dǎo)ApoBmRNA、血漿ApoB蛋白水平或者總膽固醇水平的顯著降低。偶聯(lián)膽固醇的ApoB特異性siRNA而不是未偶聯(lián)的ApoB特異性siRNA表現(xiàn)出了生物活性，這說明膽固醇偶聯(lián)在達到系統(tǒng)性體內(nèi)活性的重要作用，并暗示通過化學(xué)偶聯(lián)策略進一步優(yōu)化基于系統(tǒng)給藥的活性的可能。實例8.膽固醇穩(wěn)定siRNA活性在體內(nèi)探索合成的siRNA沉默內(nèi)源靶基因的能力中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)化學(xué)穩(wěn)定的和偶聯(lián)膽固醇的siRNA在體外和體內(nèi)具有顯著提高的藥理學(xué)性能。在有義鏈和反義鏈上具有部分硫代磷酸酯骨架和2，-0-甲基修飾的化學(xué)穩(wěn)定的siRNA表現(xiàn)出對血清和組織勻漿中的核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶的顯著提高的抗性。在siRNA有義鏈的3'-末端通過吡咯垸連接物偶聯(lián)膽固醇(進而產(chǎn)生膽固醇偶聯(lián)的siRNA)不會導(dǎo)致細胞培養(yǎng)中基因沉默活性的顯著喪失。在瞬時從轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒表達熒光酶的HeLa細胞中，在不存在轉(zhuǎn)染試劑或者電轉(zhuǎn)的情況下，只有偶聯(lián)膽固醇的siRNA會抑制熒光酶的表達(IC5。200nM)，而不偶聯(lián)的siRNA則沒有活性。通過表面電漿共振測定確定偶聯(lián)膽固醇的siRNA與人血清白蛋白(HSA)的結(jié)合；未偶聯(lián)的siRNA沒有表現(xiàn)出與HAS的任何結(jié)合，而發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)膽固醇的siRNA結(jié)合到HAS,其估計的KD-lpM。由于增強的與血清蛋白的結(jié)合，通過靜脈注射為大鼠注射的偶聯(lián)膽固醇的siRNA與未偶聯(lián)的siRNA相比表現(xiàn)出改進的藥物動力學(xué)性能。在以50mg/kg在大鼠中靜脈注射后，放射標記偶聯(lián)膽固醇的siRNA在血漿中具有11/2=95+/-13分鐘，這是通過曲線擬合確定的，其假設(shè)了二室模型(twocompartmentmodel)，一級消除率，并利用WinNonLin4.1(PharsightCorporation,MountainView,CA,USA)。在小鼠中靜脈推注注射一次50mg/kg后24小時，根據(jù)RNA酶保護檢驗，偶聯(lián)膽固醇的siRNA表現(xiàn)出廣泛的組織生物分布。然而，在組織樣品中沒有觀察到可以檢測量的偶聯(lián)siRNA，在肝臟、心臟、腎和肺樣品中檢測到了大約200ng/g的顯著水平的偶聯(lián)膽固醇的siRNA。共同的，這些研究說明膽固醇偶聯(lián)顯著改進siRNA的體內(nèi)藥物動力學(xué)性能。實例9.人ApoB-100轉(zhuǎn)基因小鼠中ApoB的表達被人和小鼠ApoB特異性的siRNA降低試驗程序是由Alnylam機構(gòu)動物管理與使用委員會許可的，并且根據(jù)Massachusetts州Cambridge城關(guān)于動物福利的規(guī)章進行。從Taconic(Taconic,Germantown，NY,USA,cat.no.1004-T)獲得半合子雄性人ApoB-100轉(zhuǎn)基因小鼠(動物株名稱B6.SSJL-Tg(APOB100)N20)，并將其在恒定的溫度和濕度下在12小時光亮/黑暗循環(huán)(上午6:30/下午6:30)的條件下進行飼養(yǎng)，并喂養(yǎng)經(jīng)過照射的標準嚙齒動物食物(PicoLabRodentDiet20,PurinaMills,LLC,St.Louis,MO,USA,cat.no.5053)。將年齡為3032的動物分成3組，每組8只進行處理。一組接收三天的每日尾部靜脈注射(給藥間隔24小時)磷酸緩沖液(10pl/g體重)。另一組，接受三天的每日尾部靜脈注射(給藥間隔24小時)50mgsiRNAAL-DUP5167/kg體重，其給藥體積為1(Hd/g體重。第三組接受三天的每日尾部靜脈注射(給藥間隔24小時)50mgsiRNAAL-DUP5311/kg體重，其給藥體積為10pl/g體重。將siRNA雙鏈體配制在磷酸酯緩沖液中。在最后的注射24小時后，將這些動物通過C02窒息處死。從每只動物收獲整個肝臟以及對應(yīng)空腸的小腸片段，并在液氮中進行快速冷凍。使用研缽和碾槌將冷凍的組織研磨成細粉。將大約10mg的每種組織粉末加入到冰冷的1.5mlEppendorf管中，并加入含有3.3|il(10|_il/3ml)50嗎1蛋白酶K(Epicentre，Madison，WI,USA,cat.No.MPRK092)貯液的細胞裂解溶液(Epicentre,Madison,WI,USA,cat.No.MTC096H)。將這些管旋渦并在65。C下孵育15分鐘；每5分鐘漩渦一次。在室溫下以5000rcfl0分鐘將細胞碎片沉淀，并將800|il上清轉(zhuǎn)到新管中。立即將裂解物用于分支DNA測定法(上面所描述的)，以確定ApoB和GAPDHmRNA的相對水平，或保存在-8(TC以后使用。發(fā)現(xiàn)ApoB特異性的siRNAAL-DUP5167降低了小鼠ApoBmRNA的水平(顯著差異為pO.Ol);在被AL-DUP5167處理的動物中發(fā)現(xiàn)了載體處理小鼠中小鼠ApoBmRNA水平43±10%的肝臟中ApoBmRNA水平，以及58±12%的空腸中ApoBmRNA水平。人的肝臟中ApoBmRNA被降低到對照動物的肝臟中水平的40土10。/。。發(fā)現(xiàn)錯配對照siRNAAL-DUP5311使ApoBmRNA水平基本上沒有變化；在被AL-DUP5167處理的動物中發(fā)現(xiàn)了載體處理小鼠中小鼠ApoBmRNA水平93±20%的肝臟中ApoBmRNA水平，以及104±13%的空腸中ApoBmRNA水平。肝臟中的人ApoBmRNA被確定為對照動物肝臟中水平的92±24%。實例10:特異性的ApoB切割位點可以被5'-RACEPCR所鑒定引物是從OperonBiotechnologies,Inc.(Alameda,CA,USA)購買的。通過5'-RACE(如在Llave等人，Science2002,297:2053-6;和Yekta等人，Science2004,304:594-6中所描述的)，使用下面的修飾和下面提供的引物，對來自上面實驗(實例7)處理組(G.)每一只動物的匯集的肝臟和空腸的ApoBmRNA的特異性誘導(dǎo)切割產(chǎn)物進行鑒定。在這種實驗中，接頭與RNA樣品中存在的具有5，-磷酸的RNA發(fā)生反應(yīng)，例如聯(lián)合siRNA的RISC對mRNA的3'切割產(chǎn)物。大部分(如果不是全部的話)由核酸酶催化的核酸水解反應(yīng)的產(chǎn)物不含有5，-磷酸，因此不會與該接頭反應(yīng)。在后續(xù)的PCR反應(yīng)中，只有含有這些接頭序列以及目標基因序列的分子類型被通過選擇適當(dāng)?shù)囊飻U增。在連接RACE接頭("GeneRacer"接頭，Invitrogen)之后，使用基因特異型引物5167GSP對cDNA合成進行引導(dǎo)，以產(chǎn)生"5167"cDNA。使用下面的引物對，在連續(xù)PCR反應(yīng)中進行對相應(yīng)于ApoB的序列進行擴增PCR反應(yīng)1:GR5'-Xbal(正向)+5167ApoBRev2-Sa11(反向)PCR反應(yīng)2:GS5'NestF-Xbal(正向)+5167ApoBRev3-Sall(反向)將50倍稀釋的PCR反應(yīng)1用于PCR反應(yīng)2中。通過瓊脂糖凝膠電泳對每次PCR反映的產(chǎn)物進行分析，并通過溴化乙啶染色進行顯現(xiàn)。在接受AL-DUP5167動物的肝臟和接受AL-DUP5167動物的空腸中發(fā)現(xiàn)了對應(yīng)于的siRNA引導(dǎo)切割的預(yù)計特異性條帶，并且達到比AL-DUP5385低的程度(參見圖7)。從PCR反應(yīng)1切出特異性條帶，并進行測序(測序引物5167ApoBRev3-Sall)以確認在RACE接頭和小鼠ApoB的核苷酸1026(登記號XM137955)之間存在的連接。為了特異性地擴增對應(yīng)預(yù)計的siRNA切割位點的片段，將PCR反應(yīng)1稀釋50倍，并使用下面的引物對進行擴增PCR反應(yīng)3:iApoB5167-XbaI(正向)+5167ApoBRev3-Sa11(反向)如果并且只有如果在PCR反應(yīng)1中出現(xiàn)結(jié)合RACE接頭和ApoBmRNA的RISC切割產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)物的話，其中所述ApoBmRNA的切割是通過AL-DUP5167所介導(dǎo)的RNA干擾而預(yù)計的，在PCR反應(yīng)3中才形成PCR產(chǎn)物。如上所述，使該PCR反應(yīng)的產(chǎn)物顯現(xiàn)(圖7)。如上對所擴增的條帶進行確認性測序。引物序列5'-CTCTAGAGCGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'SBQ,IDNO.2"GS5，歸F-Xbal5'-CTCraSAGGGMrACTGACATGGACTGAAGeAGTA-3'卿.IDNO-2805167GSP5,-CTCGTCTTCralOTAGAGTGCAGCT-3,SEQ,ID恥，281SW7ApoBRev2~SalI5'-ACGC0TCGAO3T鵬JW3CATGGAGGTTGGCAGTmTTC-3'S蹈.IDNO.旭5'-ACGCGTCGACOTAATGGTCCTGTCATGACTQCCCTT-3'SBQ,IDNO.283實例ll:對修飾的siRNA進一步的測試設(shè)計進一步修飾的siRNA測試AL-DUP5002、AL-DUP5035、AL-DUP5048、AL國DUP5089、AL-DUP5097和AL-DUP5098的進一步的siRNA修飾版本的穩(wěn)定性，以及抑制ApoB表達的活性。合成AL-DUP5048的修飾版本，其具有通過吡咯烷連接物偶聯(lián)到有義鏈3'-末端的膽固醇。對于未修飾iRNA試劑AL-DUP5002、AL-DUP5035、AL-DUP5089、AL-DUP5097和AL-DUP5098的每一種，iRNA試劑是使用21個核苷酸的有義鏈、形成2個核苷酸的3'突出端的23個核苷酸的反義鏈進行合成的，在其有義鏈3'-末端具有通過含有硫代磷酸酯的連接物連接的膽固醇部分，在其反義鏈的位點21和22具有2'-0-甲基核苷酸，在其反義鏈的位點21和22之間以及位點22和23之間具有硫代磷酸酯鍵。這種結(jié)構(gòu)對應(yīng)于在AL-DUP5167中已經(jīng)使用的修飾模式，并且用于保護iRNA試劑免于核酸外切酶的降解活性。另外，合成了另一種iRNA試劑，其代表了AL-DUP5002、AL-DUP5035、AL國DUP5089、AL-DUP5097和AL畫DUP5098的修飾版本，在其有義鏈3'-末端具有通過含有硫代磷酸酯的連接物連接的膽固醇部分，在其反義鏈所有序列基序5'-UA-3'、5，-CA-3'、5'-UU-3'和5'-UG-3'的位點具有2'-0-甲基核苷酸，以及在其反義鏈的位點21和22之間以及位點22和23之間具有硫代磷酸酯鍵。制造這些額外的修飾以保護這些siRNA免于核酸內(nèi)切酶的降解活性。表11中列出了相應(yīng)的序列。表11:用于穩(wěn)定性和活性檢驗的被修飾的iRNA試劑雙鏈體描述符SEQ.IDMo.(H義鏈序列SEQ.IDNO.反義鏈序列AL省55"285gucaucacacugaauaccaau(chol)286csgggu卿的cc3uacaccumcmuAL-DUP5536287gra訓(xùn)mgaum咖gaccumguccnia,c(chol)288gaaumggacmaggucaauonaaucnymuAL-DUP5537289grauugauugaccuguccauuc(chol)2卯AL掘5538291cmaccmaacuimicumuccmacgaguc(chol)232gacucg咖ggaagaag醫(yī)mggumg,uAL-DUP5539293caccaacuucuuccacgaguc(chol)294gacucguggaagaaguuggugm賺AL-DUP5540295gagu麵umgumgaonaaa咖aumgggc(chol)296gccc(na畫腳mimigucmacmaaacucmgmaAL-DUP5541297gaguuugugacaaauau卿c(chol)298gcc咖3uuuguc3c站3cuc,aAL-DUP5542299cu誰uma國agccum咖ggu脆cmagu(chol)300acumgaaccmaaggcu,gumaaagmumgAL-DUP5543301c飄ac3agccuugguucagu(chol)302ac卿accaaggcuugua站gtn咖gAL-DUP5544303ggsaucumumaumaumu,gauccmaa(chol)304u瞧ggaucmaaauma麗agaumuccuAL-DUP5545305ggaaucuuauauuugauccaa(chol)3QSuuggaucaaa咖a的auuccmcmum^2'0-甲基修飾；"(^M)"表示通過包含硫代磷酸酯的吡咯烷連接物偶聯(lián)到3'-末端的膽固醇；"(chol)"表示通過缺少硫代磷酸酯的吡咯垸連接物偶聯(lián)到3'-末端的膽固醇。siRNA穩(wěn)定性測試測試了siRNA(表11中表示了它們的序列)的穩(wěn)定性，其通過在人血清中進行孵育(Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen,Germanycat.No.HI513)接著通過HPLC'進行片斷的分離。將50)iM的每種siRNA的磷酸酯緩沖液(PBS，Sigma-AldrichChemieGmbH,TaufkirchenGermany)溶液與血清以10:1(血清siRNA)的比例孵育30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、16小時和24小時，并按照下面所描述的對樣品進行分析。通過HPLC在對血清樣品進行蛋白酶K處理后確定siRNA降解的時間進程。蛋白酶K(20mg/ml)是從peQLab(Erlangen，Germany;Cat-No.04-1075)獲得的，并將其與去離子水1:1稀釋到終濃度10mg./ml的蛋白酶K。新制備蛋白酶K緩沖液(4.0mlTRIS-HCl、1MpH7.5、1.0mlEDTA0.5M、1.2mlNaCl5M和4.0mlSDS10%)，并將其保存在50°C直到使用以避免沉淀。40個核苷酸的多聚(L-dT)((L-dT)4。)是從NoxxonPharmaAG(Berlin,Germany)獲得的，并被用作內(nèi)部標準。與由R-對映異構(gòu)體構(gòu)成的天然核酸相比，L-對映異構(gòu)體的聚合物表現(xiàn)出了對核酸水解降解的特別的穩(wěn)定性，而在其它方面也具有非常相似的性能。在完成每一個孵育時期后，為了終止siRNA降解，立刻將25pl蛋白質(zhì)酶K緩沖液加入到血清孵育樣品中，以最高速度將該混合物漩渦5禾少(VortexGenie2,ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY,USA,cat.no.SI0256)，在漩渦5秒之后，加入8pl蛋白酶KOOmg/ml)，最后將該混合物在恒溫混合儀在42"C和1050rpm下孵育20分鐘。向每個孔中，加入5pl50)iM(L-dT)4o溶液(250pmo1)作為內(nèi)部標準，將該溶液漩渦5秒，在桌面離心機上將該管離心1分鐘以在底部收集所有附著到孔壁上的液滴。將該溶液轉(zhuǎn)到96孔Captiva0.2pm過濾板(Varian,Germany,Cat.No.A5960002)，并通過21900rcf離心45分鐘進行過濾。使用47.5^去離子水(18，2mQ)對孵育孔進行清洗，將該清洗液利用21900rcf15分鐘過濾通過CaptivaFilterUnit,接著重復(fù)該清洗步驟。在第二次清洗步驟之后，回收平均大約180pl的總體積(理論總體積為200|il)。從降解產(chǎn)物中利用離子交換色譜對siRNA單連進行互相分離在變形條件下使用DionexBioLCHPLC系統(tǒng)，其配有內(nèi)部脫氣裝置、自動取樣器、柱式加熱爐以及固定波長UV-檢測器(DicmexGmbH,Idstein,Germany)。標準的運行參數(shù)如下柱DionexDNA-PaclOO;4x250mm溫度75°C洗脫液A:10mMNaC104,20mMTRIS畫HCl,1mMEDTA;10%乙腈，pH二8.0洗脫液B:800mMNaC104,20mMTRIS-HC1,1mMEDTA;10%乙腈，pH=8.0檢測在260nm處梯度0~1分鐘10%BI-11分鐘10%->35%BII-12分鐘35%B-〉100%B12-14分鐘100%B->10%B14-16分鐘10%B達到柱的重新平衡注射體積20^如果siRNA的兩條鏈之間的分離不滿意，或者降解片斷與一條鏈共同洗脫，則通過改變溫度、pH、用NaBr替代NaC104、乙腈的濃度以及/或者調(diào)解洗脫梯度的斜率，直到對來自有義鏈與反義鏈的波峰進行單獨定量。通過使用由工具廠商所提供的軟件(Chromeleon6.6;DionexGmbH:Idstein,Germany)對UV檢測器信號的整合，得到了全長鏈的波峰。數(shù)據(jù)分析從所有的樣品和標準化的對照獲得了積分的有義鏈、反義鏈以及內(nèi)部標準的峰面積。通過計算實驗峰面積與理論內(nèi)部標準峰面積的比例來確定每種樣品的校正因子CF，其代表在過濾步驟和清洗步驟中的液體損失。理論內(nèi)部標準峰面積是從例如內(nèi)部標準的校準曲線和使用關(guān)系式相應(yīng)于計算25pmol(L-dT)4o的理論峰面積得到的，其中所述內(nèi)部標準的校準曲線是通過將50^1的50nM(L-dT)4。的每種系列稀釋注射到HPLC柱上得到的，所述的理論峰面積是從稀釋系列通過峰面積的線性最小二乘擬合得到的。用于有義鏈和反義鏈的峰面積的校正因子CF是從如下得到的CF二峰面積內(nèi)部標準(理論)/峰面積*部標準(樣品)這種處理假設(shè)，通過兩次清洗過濾器，在組合的過濾物中大打了實際上完全的回收，并校正殘余在過濾器上的不同體積的清洗水，這樣可以對來自不同樣品的峰面積進行比較。接著將在每個時間點得到的有義鏈和反義鏈的峰面積與校正因子CF相乘以得到標準化的峰面積(NPA有義鏈,t，NPAs義鏈,t):NPA有義鏈或反義鏈,t—(峰面積有義鏈或fi錢,t)XCF為了獲得在時間t，有義鏈和反義鏈的殘余全長產(chǎn)物的相對量(%FLP)，將每種鏈在t=0分鐘經(jīng)過標準化的峰面積(NPA鼓鏈,—0，NPA反義鏈,一)設(shè)定為100%，將在其他時間點的NPA除以這些數(shù)值。從對照樣品(將siRNA僅與退火緩沖液孵育時)獲得的數(shù)值，可以作為該方法精確度的對照。兩種鏈的。/。FLP都應(yīng)該在100%附近，包括了誤差富余，而不論孵育的時間。接著可以計算每種鏈的降解半衰期t^，假設(shè)來自對ln(n/。FLP)圖的線性最小二乘擬合的斜率的一級動力學(xué)為11/2=111(0,5)/斜率表11的序列所描述的siRNA的血清半衰期表12種提供了表11的序列所描述的siRNA全長產(chǎn)物的降解半衰期。從AL-DUP5546反義鏈的半衰期與其有義鏈或者AL-DUP5547的反義鏈的半衰期的差別明顯的是，通過2，-0-甲基和3，-倒數(shù)第二個核苷酸的硫代磷酸酯對3'-末端的保護提供了在降解半衰期方面大約67倍的提高。在其傾向于核酸內(nèi)切降解的位點進行取代2'-0-甲基修飾的核苷酸，會進一步提高半衰期大約34倍，除了平均提高倍數(shù)為20倍的AL-DUP5543。表12:具有不同穩(wěn)定修飾的siRNA的血清半衰期<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>被修飾的siRNA抵抗核酸內(nèi)切降解的體外活性表11的體內(nèi)活性按照上面的實例3被進行檢測。結(jié)果表示在表13中表13被修飾的siRNA抵抗核酸內(nèi)切降解的體外活性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>從表13中AL-DUP5167和AL-DUP5546的ICso之間的比較看，明顯的是在AL-DUP5167的反義鏈位點21和22之間，位點22和23之間引入硫代磷酸酯鍵，在反義鏈的位點21和22引入2'-0-甲基不會負面影響該siRNA的活性。而且，從ALDUP5536與AL-DUP5537、ALDUP5538與ALDUP5539、ALDUP5540與AL-DUP5541、ALDUP5542與AL-DUP5543，以及ALDUP5544與ALDUP5545的1<:50之間的比較能夠看出，在大部分情況下在所有出現(xiàn)序列基序5，-UA-3，、5，-CA-3，、5'-UU-3，和5'-UG-3，的最5'端嘧啶的位置引入2'-0-甲基修飾的核苷酸對于這些分子也不會有不利的影響。被修飾的siRNA抵抗核酸內(nèi)切降解的體內(nèi)活性使用上面實例7中所描述的路線和程序進行下面的實驗13組5只年齡為2.5個月的動物接受了一次靜脈內(nèi)推注給藥劑量為100mg/kg體重的AL-DUP5167、ALDUP5536、AL-DUP5537、ALDUP5538、ALDUP5539、ALDUP5540、AL-DUP5541、ALDUP5542、AL-DUP5543、ALDUP5544、ALDUP5545，或者等量的載體。在給藥72小時后將這些動物處死。確定總血清膽固醇、血清ApoB100濃度，和肝臟與空腸ApoBmRNA水平。另外，通過實例7中所描述的Sl-核酸酶保護檢驗對每組中的3只動物的肝臟、空腸以及血清樣品中的siRNA濃度進行確定；然而，通過視覺比較條帶與系列稀釋進行對放射性條帶強度的定量，而且沒有計算標準偏差。AL-DUP5167的核苷酸序列在表10中被提供。ALDUP5536、AL-DUP5537、ALDUP5538、ALDUP5539、ALDUP5540、AL-DUP5541、ALDUP5542、AL-DUP5543、ALDUP5544和ALDUP5545的核苷酸序列在上面表11中被提供。進行本實驗以評定引入到siRNA的修飾對提高它們在生物介質(zhì)中的穩(wěn)定性，以及對體內(nèi)它們的基因表達抑制活性的影響。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5167以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的42±12%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的45±8%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度被降低為載體對照水平的44±23%。血清膽固醇為載體對照水平的75±20%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟70ng/g，空腸14ng/g，血清14ng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5546以100mg/kg體重的劑量，使在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平為在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的95±9%，基本上沒有變化；空腸中的ApoBmRNA的水平為對照動物中水平的102±16%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的113±39%，基本上沒有變化。血清膽固醇被提高到為載體對照水平的132±10%。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟lng/g，空腸無法檢測到，血清無法檢測到。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5536以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的56±8%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的28±8%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度被降低為載體對照水平的46±6%。血清膽固醇被降低到載體對照水平的74士33%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟2ng/g，空腸6ng/g，血清6ng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5537以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的72±11%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的94±9%，基本上沒有變化。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的75±25%，基本上沒有變化。血清膽固醇為載體對照水平的118±9%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟無法檢測到，空腸無法檢測到，血清lng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5538以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的56±16%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的75±1%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的102±27%，基本上沒有變化。血清膽固醇為載體對照水平的117±18%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟35ng/g，空腸7ng/g，血清lng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5539以100mg/kg體重的劑量，在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平為在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的76±18%，基本上沒有變化；空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的62±12%，基本上沒有變化。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的108±23%，基本上沒有變化。血清膽固醇為載體對照水平的102±18%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟7ng/g，空腸4ng/g，血清2ng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5540以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的54±12%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的54±12%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的72±30%，基本上沒有變化。血清膽固醇為載體對照水平的117±18%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟35ng/g，空腸7ng/g，血清lng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5541以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的73±10%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的68±5%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的90±8%，基本上沒有變化。血清膽固醇為載體對照水平的99±8%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟72ng/g，空腸10ng/g，血清7ng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5542以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的58±9%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的28±4%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的55±9%。血清膽固醇為載體對照水平的61±27%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟8ng/g，空腸17ng/g，血清22ng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5543以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的77±5%，空腸中的ApoBmRNA的水平為低對照動物中水平的91±14%，基本上沒有變化。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度為載體對照水平的97±16%，基本上沒有變化。血清膽固醇為載體對照水平的128±24%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟無法檢測到，空腸無法檢測到，血清無法檢測到。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5544以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的63±6%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的20±3%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的46±5%。血清膽固醇被降低到載體對照水平的55±5%。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟〉900ng/g，空腸60ng/g，血清40ng/g。根據(jù)通過分支DNA測定法所確定的，發(fā)現(xiàn)AL-DUP5545以100mg/kg體重的劑量，將來在來自經(jīng)過處理的小鼠肝臟組織的樣品中存在的ApoBmRNA的水平降低到在僅接受載體的動物肝臟組織中存在的mRNA水平的58±11%，空腸中的ApoBmRNA的水平被降低到對照動物中水平的37±11%。小鼠血清中血清ApoB蛋白濃度被降低到載體對照水平的50±6%。血清膽固醇為載體對照水平的75±28%，基本上沒有變化。發(fā)現(xiàn)3種動物的平均iRNA濃度為大約肝臟70ng/g，空腸7ng/g，血清無法檢測到。實例12:測試siRNA產(chǎn)生免疫的能力最近，一些已經(jīng)公開的報道主張了siRNA試劑有具有可能不利的產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力(參見例如Hornung等人，NatureMed2005,11:263-270)。關(guān)于例如潛在地由siRNA引起的人中暫時干擾素-a(IFN-a)提高的某些生物結(jié)果幾乎沒有了解。為了避免不必要的危險副作用，期望得到有效的抗病毒siRNA，其幾乎沒有或者沒有刻意檢測到的刺激免疫的活性。雖然，在人中刺激的具體過程是不能的，但我們認為所描述的試驗作為預(yù)測寡聚核苷酸和siRNA刺激免疫能力的方法是適當(dāng)?shù)?。我們通過檢測外周血單核細胞(PMBC)中siRNAAL-DUP5167、AL-DUP5536、AL-DUP5537、ALDUP5538、ALDUP5539、ALDUP5542、AL-DUP5543、ALDUP5544和ALDUP5545誘導(dǎo)的IFN-a，檢測了表11中所列出的siRNA的產(chǎn)生免疫的能力。包括AL-DUP5311作為無關(guān)的序列對照。ODN2216(—種IFN-a的強誘導(dǎo)劑)(Homung等人，NatureMed2005,11:263-270)被用作陽性對照，PBS作為陰性對照。ODN2216的核苷酸序列為5，-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3，SEQ.IDNO.306通過在Chang,H.S.,和Sack,D.A.,Clin.Diag.Lab.Immunology2001,8:482-488中所描述的Ficoll梯度離心分離PBMC，除了采用來自從InstituteforTransfusionMedicinegGmbH,Suhl,Germany獲得的單個供體的未過濾的耗盡紅細胞的白細胞濃縮物(使用PBShl稀釋)(BuffyCoat)作為起始材料，將在RPMI完全培養(yǎng)基(RPMI1640完全；10%FCS;1%L-Glu)中的最終懸浮液調(diào)整到lxl(^個細胞/ml。將細胞與在Opti-MEM或者Opti-MEM+轉(zhuǎn)染試劑GenPorter2(GP2;PeqlabBiotechnologieGmbH,Erlangen,Germany)中的ODN2216或者siRNA進行孵育。將每孑L100pl細胞懸浮液(100.000個細胞)的96孔板結(jié)合50^1的1.5pMOpti-MEM中的寡聚核苷酸(寡聚核苷酸的最終濃度為500nM)，或者5(Hi1a)6^1GP2試劑與119^1Opti-MEM的混合物與b)l^il100nMPBS中的寡聚核苷酸溶液以及來自GP2試劑盒的124^1洗脫液B的1:1混合物(寡聚核苷酸的最終濃度為133nM)。在37"C下進行孵育24小時，從孔的頂部小心去除5(^1的上清。將這些用于使用huIFN-a快速ELISA(BenderMedSystems,Vienna,Austria,catalogueno.BMS216INST)的確定IFN國a。表14總結(jié)了這些結(jié)果。表14:與siRNA或者ODN2216孵育的外周血單核細胞所產(chǎn)生的IFN畫a<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>得自實例11和12的結(jié)論a)在某些位點(特別是傾向降解的位點)具有被修飾的核苷酸的寡聚核苷酸在它們在生物介質(zhì)中的體外半衰期方面受益，而它們體外或者體內(nèi)的抑制基因表達的能力則大部分沒有受到影響b)根據(jù)它們的序列，siRNA能夠但不是普遍地是刺激免疫的試劑。c)AL-DUP5536、AL-DUP5540和AL-DUP5542是作為抑制apoB表達的特別有希望的候選，因此可以用于治療包括apoB異常表達的紊亂。表15列舉了這里可以使用的試劑數(shù)目以指定上面所描述的iRNA試劑表15:與siRNA或者ODN2216孵育的外周血單核細胞所產(chǎn)生的顧-a<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>其他實施方式已經(jīng)描述了一些本發(fā)明的實施方式。然而，需要理解的是，可以進行多種修飾，而不離開本發(fā)明的主旨和范圍。權(quán)利要求1.一種iRNA試劑，其包括有義鏈和反義鏈，其中所述的有義鏈具有試劑序號1～74的iRNA試劑的有義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸，所述的反義鏈具有試劑序號1～74的iRNA試劑的反義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸。2.—種iRNA試劑，其包括有義鏈和反義鏈，其中所述的有義鏈具有試劑序號119、24~26、29、30和32~42的iRNA試劑的有義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸，其中所述的反義鏈具有試劑序號1~19、24~26、29、30和32~42的iRNA試劑的反義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸，其中所述iRNA試劑使與這些試劑孵育后培養(yǎng)的人HepG2細胞中存在的ApoBmRNA的量與沒有與該試劑孵育的細胞相比降低了60%以上，和/或使分泌到細胞培養(yǎng)上清中的Apo蛋白的量降低了60°/。以上。3.—種iRNA試劑，其包括有義鏈和反義鏈，其中所述的有義鏈具有試劑序號1~12、15、17、24、29、30和3235的iRNA試劑的有義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸，其中所述的反義鏈具有試劑序號1~12、15、17、24、29、30和32~35的iRNA試劑的反義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸，其中所述iRNA試劑使與這些試劑孵育后培養(yǎng)的人HepG2細胞中存在的ApoBmRNA的量與沒有與該試劑孵育的細胞相比降低了70%以上，和/或使分泌到細胞培養(yǎng)上清中的Apo蛋白的量降低了70%以上。4.一種iRNA試劑，其包括有義鏈和反義鏈，其中所述的有義鏈具有試劑序號15、7和11的iRNA試劑的有義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸，其中所述的反義鏈具有試劑序號1~5、7和11的iRNA試劑的反義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸，其中iRNA試劑使與這些試劑孵育后培養(yǎng)的人HepG2細胞中存在的ApoBmRNA的量與沒有與該試劑孵育的細胞相比降低了80%以上，和/或使分泌到細胞培養(yǎng)上清中的Apo蛋白的量降低了80%以上。5.—種iRNA試劑，其包括有義鏈和反義鏈，其中每條鏈都包括至少有16、17或18個核苷酸的序列，該序列與試劑序號1~74的iRN試劑的序列之一基本上完全相同，除了每條鏈上分別有不超過l、2或3個核苷酸被其它核苷酸替代(例如腺苷被尿嘧啶替代)夕卜，同時基本保持了抑制培養(yǎng)的人HepG2細胞中ApoB表達的能力，或者保持了在將該iRNA試劑以50mg/kg體重或者100mg/kg體重為動物給藥后，將C57B1/6小鼠的鼠肝臟細胞中所存在的apo-BmRNA的量在體內(nèi)降低至少20%的能力。6.—種iRNA試劑，其選自試劑序號54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的iRNA試劑組。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的iRNA試劑，其中，所述iRNA試劑使與這些試劑孵育后培養(yǎng)的人HepG2細胞中存在的ApoBmRNA的量與沒有與該試劑孵育的細胞相比降低了50%以上，和/或使分泌到人HepG2細胞培養(yǎng)上清中的Apo蛋白的量降低了50%以上，和/或使該iRNA試劑以50mg/kg體重或者100mg/kg體重給藥后，將C57B1/6小鼠的鼠肝臟細胞中所存在的apo-BmRNA的量在體內(nèi)降低至少20%。8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項所述的iRNA試劑，其中所述的反義RNA鏈長度為30個或者更少的核苷酸，所述iRNA試劑的雙鏈體區(qū)長度為1530個核苷酸對。9.根據(jù)權(quán)利要求1~8中任一項所述的iRNA試劑，其中所述的iRNA試劑還額外降低了培養(yǎng)的肝源鼠細胞中所存在的ApoBmRNA的10.根據(jù)權(quán)利要求l9中任一項所述的iRNA試劑，其包括使所述iRNA試劑在生物樣品中穩(wěn)定性得到提高的修飾。11.根據(jù)權(quán)利要求110中任一項所述的iRNA試劑，其包括硫代磷酸酯或者2'-修飾的核苷酸。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的iRNA試劑，其包括至少一個5'-尿苷-腺嘌呤-3，(5，-UA-3，)二核苷酸，其中所述的尿苷是2'-修飾的核苷酸；至少一個5'-尿苷-鳥嘌呤-3，(5，-UG-3，)二核苷酸，其中所述的5，-尿苷是2'-修飾的核苷酸；至少一個5'-胞苷-腺嘌呤-3，(5，-CA-3，)二核苷酸，其中所述的5，-胞苷是2'-修飾的核苷酸；或者至少一個5，-尿苷-尿苷-3，(5'-UU-3，)二核苷酸，其中所述的5'-尿苷是2'-修飾的核苷酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的iRNA試劑，其中在所有出現(xiàn)的序列基序5,-UA曙3'、5，-CA-3，、5'-UU-3'和5'-UG-3'二核苷酸中的最5'端嘧啶都是2'-修飾的核苷酸，或者在有義鏈中的所有嘧啶以及在所有出現(xiàn)的5'-UA-3'和5'-CA-3'的最5'端嘧啶都是2'-修飾的核苷酸，或者其中在有義鏈中的所有嘧啶都是2'-修飾的核苷酸，以及在反義鏈中所有出現(xiàn)的序列基序5，-UA-3'、5，-CA-3，、5'-UU-3，和5，-UG-3，中的最5'端嘧啶都是2'-修飾的核苷酸。14.根據(jù)權(quán)利要求1113中任一項所述的iRNA試劑，其中所述的2'-修飾選自2，-脫氧、2，-脫氧-2，-氟、2'-0-甲基、2'-0-甲氧乙基(2'-0-MOE)、2，-0-氨基丙基(2，-0-AP)、2，-0-二甲基氨基乙基(2，-0-DMAOE)、2'-0-二甲基氨基丙基(2，-0-DMAP)、2'-0-二甲基氨基乙氧基乙基(2，-0-DMAEOE)和2'-0-N-甲基乙酰氨基(2，-0-NMA)的組。15.根據(jù)權(quán)利要求114中任一項所述的iRNA試劑，其包含具有1~4個不配對核苷酸的核苷酸突出。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的iRNA試劑，其中所述的核苷酸突出具有2或3個不配對核苷酸。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的iRNA試劑，其中所述的核苷酸突出是在所述iRNA試劑反義鏈的3'-末端。18.根據(jù)前面任一項權(quán)利要求所述的iRNA試劑，其含有膽固醇部分。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的iRNA試劑，其中所述的膽固醇部分連接到所述iRNA試劑有義鏈的3'-末端。20.根據(jù)前面任一項權(quán)利要求所述的iRNA試劑，其中所述的iRNA試劑靶向為被肝細胞吸收。21.根據(jù)前面任一項權(quán)利要求所述的iRNA試劑，其中所述的iRNA試劑靶向為被腸細胞吸收。22.—種用于治療人受試者的方法，其中所述受試者具有脂類紊亂或者有產(chǎn)生脂類紊亂的風(fēng)險，所述方法包括給藥iRNA試劑，其中所述的iRNA試劑包括有義鏈和反義鏈，其中所述的有義鏈具有試劑序號174的iRNA試劑的有義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸，所述的反義鏈具有試劑序號174的iRNA試劑的反義鏈序列中的至少15個連續(xù)核苷酸。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的脂類紊亂是高膽固醇血癥、高脂血癥、冠狀動脈病、冠心病、血栓或動脈粥樣硬化。24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中以足以降低受試者細胞或者組織中ApoB表達的量進行iRNA給藥。25.—種藥物組合物，其包含a.權(quán)利要求1~21任一項所述的iRNA試劑，和b.藥物上可以接受的載體。26.—種制備藥物組合物的方法，其包括使用藥物上可以接受的載體配制權(quán)利要求1~21任一項所述的iRNA試劑。27.—種降低細胞中ApoBRNA量的方法，其包括將細胞與權(quán)利要求1~21任一項所述的iRNA試劑接觸。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中將所述細胞在體外與所述的iRNA試劑接觸。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中在受試者體內(nèi)將所述細胞與iRNA試劑接觸。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述受試者被診斷為患有高膽固醇血癥、高脂血癥、冠狀動脈病(CAD)、冠心病、血栓或動脈粥樣硬化。31.—種制備權(quán)利要求1~21任一項所述的iRNA試劑的方法，其中所述方法包括合成所述iRNA試劑，其中所述的有義鏈和反義鏈包括至少一種能夠使iRNA試劑對核苷酸水解降解穩(wěn)定的修飾。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述受試者被診斷為患有脂類紊亂。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述受試者被診斷為患有高膽固醇血癥、高脂血癥、冠狀動脈病、冠心病、血栓或動脈粥樣硬化。34.根據(jù)權(quán)利要求3133中任一項所述的方法，其中所述受試者為人。35.—種評估被認為抑制ApoB基因表達的iRNA試劑的方法，其中所述方法包括a.提供iRNA試劑，其中第一鏈與ApoBmRNA的核苷酸序列充分互補，另一條鏈與所述第一鏈充分互補以與第一鏈雜交；b.將所述iRNA試劑與含有ApoB基因的細胞接觸；c.在所述iRNA試劑與細胞接觸之前，將ApoB基因表達或者未接觸的對照細胞的ApoB基因表達與所述iRNA試劑接觸細胞之后的ApoB基因表達進行比較；以及d.確定是否所述iRNA試劑能夠用于抑制ApoB基因的表達，其中如果細胞中存在的ApoBRNA的量或者細胞所分泌的蛋白質(zhì)的量比iRNA試劑接觸細胞之前的量小，則所述iRNA能夠用于抑制ApoB基因的表達。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中在體外和非人的實驗室動物體內(nèi)進行步驟b,d.。37.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其還包括確定iRNA試劑在激活外周血單核細胞產(chǎn)生干擾素-ct中的活性。全文摘要本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)載脂蛋白B表達的組合物和方法，尤其是涉及到利用化學(xué)修飾寡核苷酸而對載脂蛋白B的負調(diào)解作用。文檔編號A61K31/70GK101133074SQ200580040296公開日2008年2月27日申請日期2005年9月26日優(yōu)先權(quán)日2004年9月24日發(fā)明者于爾根·蘇賽克,漢斯-彼得·沃爾洛赫爾,菲利普·哈德維格,薩伊達·埃爾巴希申請人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司