專利名稱：包含唯bh3域蛋白中bh3結構域的融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及融合蛋白，更具體地說，涉及一種包含唯BH3域蛋白中BH3結構域的融合蛋白。
背景技術：
多細胞機體的細胞是具有高度組織性群體的組成部分。該群體的細胞數(shù)量受細胞區(qū)分率和細胞死亡率的嚴格控制。當不再需要細胞，他們就通過激活細胞內(nèi)的死亡程序來進行自毀。這個重要的過程叫做凋亡。凋亡也被當作程序化死亡，由蛋白級聯(lián)來告知凋亡。相關蛋白的突變隱藏了正常的程序化細胞死亡，這種變在很多疾病，尤其在癌癥方面起著很重要的作用。因此，癌細胞的增長率通常取決于細胞死亡的有缺陷控制。另外，凋亡的存在是能使惡性細胞增加數(shù)量和存活的主要特征。
凋亡的線粒體依賴性通路是由Bcl-2家族蛋白所支配。Bcl-2家族的Bcl-2、Bcl-xL、Bak和很多其他的部分都有一個靠近羧基端的氨基酸疏水端，能在外部線粒體膜內(nèi)錨定Bcl-2家族蛋白。相反地，其他Bcl-2家族部分，如Bid，Bim，Bad，都缺乏這些錨定膜的領域，而對蛋白本身卻是關閉的，直到受到刺激才能暴露出來(如Bax)。
Bcl-2家族蛋白通過多細胞動物的進化與在脊椎動物及無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的同源染色體一起保存。一些動物病毒在基因組中也留有Bcl-2家族基因，包括癌癥中的單純皰疹病毒，如Epstein-Barr病毒(EBV)和Kaposi sarcomaherpes病毒(KSHV)。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白都已有過描述?？沟蛲龅鞍缀痛俚蛲龅鞍椎腂cl-2家族蛋白的相對比率指示了對多種多樣的刺激細胞凋亡的敏感性或存在，包括增長因素缺失，組織缺氧，輻射，抗癌藥，氧化劑和鈣超載。
在凋亡過程中，Bcl-2家族蛋白特定調(diào)節(jié)(促進或抑制)線粒體中蛋白質(zhì)的釋放，如細胞色素C，Smac/DIABLO，凋亡誘導因子，HtrA2和核酸內(nèi)切酶。某些Bcl-2家族蛋白(促凋亡部分)是承擔在線粒體中已經(jīng)經(jīng)過程序化細胞死亡和死亡信號執(zhí)行者的主要調(diào)整者?？傊珺cl-2家族包含引發(fā)線粒體膜釋放的促凋亡部分和抑制線粒體膜釋放的抗凋亡部分。進一步地，該家族可劃分為3個子類[(a)，(b)和(c)]。子類(a)和(b)在結構上與細菌酶素的孔道形成域極其相似，如大腸桿菌系和白喉毒素。這些螺旋狀的象毛孔的蛋白包括抗凋亡蛋白(子類(a)和多域的促凋亡蛋白(子類(b)?？沟蛲霾糠?a)，如Bcl-2和Bcl-xL，顯示了通過全部4個Bcl-2同源的BH結構域蛋白(BH1-4也被稱為多域的抗凋亡蛋白)。有些促凋亡部分(b)，如Bax和Bak，支配著BH1-3域中(BH1-3也被稱為多域促凋亡蛋白)的序列同族。與之對照的，子類(c)中有一些促凋亡部分，如Bid，Noxa，Bik，Bim，Bad，Bmf，DP5/HrK和Bok，支配著唯一一個被稱為α螺旋BH3域(為唯BH3域蛋白)中的序列同族。BH3域代表性地包含一個有15至20個氨基酸長度的兩系α螺旋和16個氨基酸。
唯BH3蛋白(子類(c)作為多種促凋亡和抗凋亡信號的傳入效應物發(fā)揮作用(Hunt A.et al(2001)Science 293，1784-1785)。所有的唯BH3蛋白都能凝固并在功能上對抗抗凋亡的Bcl-2家族蛋白(Hunt A，et al，supra).它們的BH3領域進入了抗凋亡蛋白表面的不易被水沾濕的裂縫里，如Bcl-XL。它們通過抗凋亡的Bcl-2家族蛋白之間的相互轉換來刺激一個要求有至少含有一個多域的促凋亡Bcl-2家族蛋白的Bax或Bak，進行促凋亡的機制來成倍轉換死亡信號。進一步地，有一些但不是所有的唯BH3蛋白有能力凝固成多域的促凋亡部分Bax或Bak。
比如，唯BH3蛋白Bid能促進促凋亡蛋白的集合和Bax及Bak自身的功能，反之，其他的唯BH3蛋白不能發(fā)揮這樣的功能。通過使用短的縮氨酸來表現(xiàn)唯BH3蛋白Bid的α螺旋BH3域，所呈現(xiàn)出的Bid縮氨酸能夠?qū)е翨ax和Bak的低聚反應(oligomerization)釋放細胞色素c.這個特性歸因于唯BH3蛋白Bim(Korsmeyer S.J.et al(2000)細胞死亡不同7，1166-1173)。概括地說，Bid捆綁了(多域的)促凋亡的Bax和Bak，也捆綁了抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xL，并能直接激活Bax和Bak。
相對應的，顯示唯BH3蛋白Bad Bik的BH3域的縮氨酸缺乏直接激活Bax和Bak的能力，但能捆綁抗凋亡的Bcl-2家族蛋白(Letai A et al(2002)癌細胞2，183-192)。使用來自唯BH3蛋白Bad的BH3域的縮氨酸只能在Bcl-xL存在的條件下刺激Bax的活性，這在另一篇論文上也有過描述(Moreau P F.et al(2003)The Journal of Biological Chemistry，vol.278，no.21，19426-19435)。因而，唯BH3蛋白的BH3域支配著獨特的功能。“Bad-like”的BH3域激活了促凋亡的Bax和Bak，其特征在于，“Bad-like”的BH3域通過占有抗凋亡的Bcl-2家族部分的口袋“敏化”了促凋亡的Bax和Bak。概括地說，唯BH3蛋白的BH3域表現(xiàn)為兩種通過使用遺傳決定的通路來開始細胞死亡的工具化合物。
如上所述，各種研究論文都有描述過唯BH3蛋白，分析它們的功能和機制。結果表明它們的BH3域能有效地通過控制來自所述的抗凋亡蛋白中的活性多域促凋亡蛋白，引起細胞凋亡從而表現(xiàn)為抗凋亡的Bcl-2家族部分。
另外，唯BH3蛋白的BH3域是一個值得注意的研究課題，能形成有效的工具針對由于各種各樣的程序化細胞死亡而導致的有缺陷控制疾病的治療。然而，之前的技術沒有提供直接運輸所述的蛋白或他們的BH3域的方法，也沒有對期望的有機體或細胞定位。主要的問題之一是細胞內(nèi)膜的滲透性。有研究論文包含了最初的多精氨酸轉換的方法。(Wang et al，(2000)，Cancer Res.60，1498-1502)；Holinger et al.(1999)，J.Biol.Chem，274，13298-13304)。然而，各種各樣的兩性分子α螺旋縮氨酸，特別是陽離子縮氨酸，可以被吸引到陰性負荷膜上，包括線粒體膜，在這里它們能非特定地打斷油脂矩陣和膜障礙物功能(Matsuzaki(2001)Biochem.Soc.Trans.29，598-601；Ellerby etal(1999)，Nat.Med.5，1032-1038)。另外一種方法是使用ANT-BH3BAD結構結合antennepedia(ANT)作為內(nèi)在化半族，由此得來的BAD的BH3域是有毒的。然而，毒性與Bcl-2通路無關(Vieira et al.(2002)，Oncogene 21，1963-1977；Schimmer et al.(2001)，細胞死亡差異8，725-733)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目標就是提供一個能直接運輸唯BH3蛋白的BH3域到期望生物體部位的系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明，所提供的融合蛋白包含至少一個第一部分(I)和至少一個第二部分(II)，所述的第一部分(I)包含一個載體序列，所述的第二部分(II)包含唯BH3域蛋白中BH3結構域序列的部分或者全長，所述融合蛋白在其第一部分(I)和其第二部分(II)中包含一個逆序的右旋氨基酸。
本發(fā)明的融合蛋白包含(至少在部分(I))逆序的右旋肽(也稱逆序蛋白或逆序融合蛋白)。逆序蛋白與線性肽的異構體有關，在該異構體中常規(guī)或天然的左旋肽序列方向是是顛倒的，每個氨基酸殘基的手性(與自然發(fā)生的左旋肽相對照，因歸于右旋肽的手性特征)是顛倒的。根據(jù)本發(fā)明，術語“融合蛋白”和“蛋白”是指同一意思。根據(jù)本發(fā)明，逆序融合蛋白可被構造，如通過合成與相應的天然左旋肽序列相反的肽序列來構成。與常規(guī)的左旋肽序列相比，右旋異構體(融合)蛋白中每個單氨基化合物中的酰胺基無活性，因此確保了位于α碳中側鏈群的位置被保留。本發(fā)明的逆序融合蛋白擁有很多有用的特性。比如，他們更有效地進入細胞，更穩(wěn)定(尤其在體內(nèi))，比相應的左旋肽顯示更低的免疫原性。天然肽包含L氨基酸，幾乎所有的分解酶如蛋白酶或肽酶都粘附在相鄰的左旋氨基酸的肽鏈上。因此，由逆序形式右旋肽組成的蛋白在很大程度上能抵抗蛋白水解的破壞。與常規(guī)的非顛倒的左旋肽相似物比較，融合蛋白細胞的保持時間明顯增加了。
本發(fā)明的融合蛋白部分(I)作為載體或載體序列?！拜d體或載體”序列(作為本發(fā)明的融合蛋白的一部分)是能夠引導融合蛋白或融合蛋白部分(II)分別進入細胞質(zhì)或者進一步進入到特殊的細胞內(nèi)靶點的氨基酸序列。這個載體序列能引導融合蛋白進入細胞內(nèi)期望的位置，如細胞核、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體或過氧物酶體。因此，在首選的實施例中，本發(fā)明的融合蛋白的載體序列引導融合蛋白到細胞內(nèi)一個預定的位置?？傊?，載體序列能引導本發(fā)明的融合蛋白通過胞漿膜，如從細胞外的細胞環(huán)境通過胞漿膜進入細胞質(zhì)，從而提高融合蛋白的細胞舉起能力或藥物部分(II)(被載物部分)，各自單獨地提高細胞滲透性或提高細胞內(nèi)的保持時間。
總之，本發(fā)明的包含所述的載體序列的融合蛋白的功能有效部分(I)限定了包含至少4個(連續(xù)的)右旋氨基酸作為氨基酸序列。由部分(I)組成的功能有效氨基酸序列應顯示強烈的基本特性。所述的功能有效氨基酸序列優(yōu)選包含至少60％的堿性氨基酸，至少65％的更好，甚至至少80％的，甚至至少85％的，甚至至少90％的，至少96％的最好，甚至是精氨酸和/或賴氨酸。本發(fā)明的融合蛋白的功能有效部分(I)優(yōu)選由長4-50個右旋氨基酸的氨基酸序列構成，優(yōu)選4-40個，4-30個更好，4-20個還要好一些，4-約10個最好。


圖1A顯示對應于Tat蛋白堿性區(qū)域的氨基酸序列是逆序的D形式。因而，所有顯示的氨基酸是D對映異構體的氨基酸。圖1A的序列就是一個D-TAT的實例(SEQ ID NO1)。
圖1B顯示了基因的D-TAT(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列。在圖1A中有提到。
圖2A顯示了人類異構重組產(chǎn)物Bid(轉錄變量1，SEQ ID NO.3)的母體L氨基酸序列。
圖2B顯示了人類異構重組產(chǎn)物Bad(SEQ ID NO.4)的母體L氨基酸序列；強調(diào)了BH3域；BH3域不僅包含已強調(diào)的部分，還包含在任何兩端的兩個額外的氨基酸。這四個額外的氨基酸是以粗體字顯示的。
圖2C顯示了人類異構重組產(chǎn)物Noxa(SEQ ID NO.5)的氨基酸序列。
圖2D顯示了人類異構重組產(chǎn)物Puma(SEQ ID NO，6)的氨基酸序列。
圖2E顯示了人類異構重組產(chǎn)物Bim(轉錄變量1，SEQ ID NO，7)的氨基酸序列。
圖2F顯示了人類異構重組產(chǎn)物Bik(SEQ ID NO.8)的母體L氨基酸序列；強調(diào)了BH3域；BH3域不僅包含已強調(diào)的部分，還包含在任何兩端的兩個額外的氨基酸。這四個額外的氨基酸是以粗體字顯示的。
圖3A顯示了D-TAT-Bid(轉錄變量1，SEQ ID NO.9)的氨基酸序列——本發(fā)明融和蛋白的一個實例，其特征在于，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的融和蛋白的部分(II)的Bid全長序列在隨后的圖3B-3F&由D氨基酸(D-Tat)組成的部分(I)中的母體L形式序列中有描述。為了描述作為逆序的所有右旋氨基酸序列的本發(fā)明的融和蛋白，必須轉化部分(II)。
圖3B顯示了D-TAT-Bad(SEQ ID NO.10)的氨基酸序列；強調(diào)了BH3域；BH3域不僅包含已強調(diào)的部分，還包含在任何兩端的兩個額外的氨基酸。這四個額外的氨基酸是以粗體字顯示的。
圖3C顯示了D-TAT-Noxa(SEQ ID NO.11)的氨基酸序列。
圖3D顯示了D-TAT-Puma(SEQ ID NO.12)的氨基酸序列。
圖3E顯示了D-TAT-Bim(轉錄變量1，SEQ ID NO.13)的氨基酸序列。
圖3F顯示了D-TAT-Bik(SEQ ID NO.14)的氨基酸序列；強調(diào)了BH3域；BH3域不僅包含已強調(diào)的部分，還包含在任何兩端的兩個額外的氨基酸。這四個額外的氨基酸是以粗體字顯示的。
圖4A顯示了Bik的BH3域(Bik BH3)的母體L氨基酸序列；圖4B顯示了Bad的BH3域(Bad BH3)的母體L氨基酸序列；圖4C顯示了Bid的BH3域(Bid BH3)的母體L氨基酸序列；
圖4D顯示了Bmf的BH3域(Bmf BH3)的母體L氨基酸序列；圖4E顯示了DP5/Hrk的BH3域(DP5/Hrk BH3)的母體L氨基酸序列；圖4F顯示了Bim的BH3域(Bim BH3)的母體L氨基酸序列；圖4G顯示了Noxa的BH3域(Noxa BH3)的母體L氨基酸序列；圖4H顯示了PUMA的BH3域(PUMA BH3)的母體L氨基酸序列；圖4I顯示了Bax的BH3域(Bax BH3)的母體L氨基酸序列；圖4J顯示了Bak的BH3域(Bak BH3)的母體L氨基酸序列；圖4K顯示了Bok的BH3域(Bok BH3)的母體L氨基酸序列；圖5 顯示了由BH3導致的HeLa細胞死亡結果的曲線圖。所使用的本發(fā)明的融和縮氨酸包含了作為第一個部分(I)的載體序列D-TAT&作為第二個部分(II)的唯BH3蛋白的BH3域序列的Bim，Bok，Bax，DP5[Hrk]，Bid，Noxa，PUMA&Bak(在圖5中都分別有描述)。融合縮氨酸分別通過在培養(yǎng)基中與Hela細胞一起在為1μm，10μm，50μm，100μm的濃度中經(jīng)過24小時的培養(yǎng)。這種控制包括不含治療作用的Hela細胞，即不包含于本發(fā)明的融合縮氨酸的培養(yǎng)。該控制也在培養(yǎng)基中與Btc-3細胞一起經(jīng)過24小時的培養(yǎng)。在Hoechst/PI著色(Bonny et al，J Biol，Chem.(2000)27516466-16472)，之后再計算凋亡細胞。凋亡細胞的百分比在圖5中作為“細胞死亡％”的橫軸上有顯示。如在圖5中所顯示的，包含Bim，Bok或Bax的融合縮氨基顯示了最好的結果，也就是在包含PUMA(大約23％的細胞死亡率)的融合縮氨酸之后，大約98％&68％的最高細胞死亡率。必須注明的是，包含Bim的融合縮氨酸導致了最好的結果，也就是在50μm濃度的縮氨酸中大約98％的細胞死亡率，其特征在于包含Bok或Bax的融合縮氨酸導致了所顯示的在100μm縮氨酸濃度中大約98％&大約68％的細胞死亡率。
圖6顯示了由BH3導致的βTC-3細胞死亡結果的曲線圖。所使用的本發(fā)明的融和縮氨酸包含了作為第一個部分(I)的載體序列D-TAT&作為第二個部分(II)的唯BH3蛋白的BH3域序列的Puma，Noxa，Bak Bim，Bok，Bax&DP-5(在圖6中都分別有描述)。融合縮氨酸分別通過在培養(yǎng)基中與βTC-3細胞一起在濃度為1μm&10μm中經(jīng)過24小時的培養(yǎng)(濃度為1μm的表示為”Puma 1”，濃度為10μm的表示為”Puma 10”).一個樣本包含10μm濃度的載體序列L-Tat。另一個樣本包含了作為有毒控制的物質(zhì)毒胡蘿卜素(thapsigargin)。這種控制包括不含治療作用的βTC-3細胞，即不包含于本發(fā)明的融合縮氨酸的培養(yǎng)。該L-Tat樣本&該控制也在培養(yǎng)基中與βTC-3細胞一起經(jīng)過24小時的培養(yǎng)。在Hoechst/PI著色(如上)之后再計算凋亡細胞。凋亡細胞的百分比在圖6中作為“細胞死亡％”的橫軸上有顯示由于在圖5中有顯示。如在圖5中所顯示的，在10μm濃度中Noxa&Bax顯示之后，在10μm濃度中包含Bim，Bok的融合蛋白顯示了最好的結果，(各自顯示細胞死亡率為大約99％&大約86％)。
如圖5&圖6中顯示的，如在Bonny C.et al.中所描述的，完成了Hoechst/PI著色。IB1減少了能分泌胰島素的細胞的引起細胞漿移動的凋亡，J.Biol.Chem.(2000)27516466-16472.HeLa細胞線(人類子宮頸癌)(圖5)&胰島素分泌細胞線βTC-3(Efrat S.et al.，衍生于能顯示轉基因的胰島素基因--致癌基因相混血的老鼠的Beta細胞線，Proc Natl Acad SciUSA(1998)859037-9041)(圖6)，以上這兩條細胞線在RPMI-1640媒介中進行培養(yǎng)，該媒介中補充有10％的胎兒小腿血清，100μg/ml的鏈霉素，100U/ml的青霉素，1mmol/l的鈉丙酮酸鹽&2mmol/l的谷氨酸鹽。
圖7顯示了為本發(fā)明而得到的所有D融合縮氨酸(來自Bid，Bax和Bad的D-BH3-D-Tat)結果。由D氨基酸組成的BH3域序列域與圖4所給的序列相符合，但與氨基酸序列相反。包括Cis-Pl的所有使用的濃度，都是培養(yǎng)細胞的10μM(Hela(上一排)和C33A(下一))，持續(xù)時間為48小時。還要應用以下條件RPMI-1640媒介，補充有10％的胎兒小腿血清，100μg/ml的鏈霉素，100U/ml的青霉素，1mmol/l的鈉丙酮酸鹽&2mmol/l的谷氨酸鹽。與Hoechst和Propidium Iodide(PI)(參看上述)(每5分鐘1μg/ml，然后在熒光顯微鏡下人工計數(shù)或拍照)一起進行著色。在該化驗中，能養(yǎng)活的細胞沾染了藍色，死細胞沾染了黑紅色(黑色)。很清楚地看到所有本發(fā)明的所有D融合縮氨酸都導致了細胞死亡。
具體實施例方式
根據(jù)本發(fā)明，載體序列起源于眾所周知的膜置換序列。在本發(fā)明特別首選的實施例中，本發(fā)明的融合蛋白的載體序列是人類免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白的逆序的右旋氨基酸序列。TAT是HIV感染循環(huán)不可缺少的濾過性毒菌蛋白。該蛋白在WO94/04686，US.Pat.Nos.5,674,980等中有描述，每個都可合并作為參考。然而，本發(fā)明的融合蛋白的部分(I)與部分(II)相連接，其特征在于，在逆序的D構型中，部分(I)包含部分或所有的86個Tat全長序列的氨基酸。特別是擁有少于86個氨基酸的本發(fā)明的融合蛋白的功能有效部分(I)可被使用，其特征在于仍然展示了很好的細胞舉起活性，隨意進入細胞核額外的定位信號。作為進入細胞的媒介和負責舉起的Tat序列段可被限定，使用眾所周知的技術(參看Franked et al，Proc.Natl Acad.Sci.USA 867397-7401(1989).本發(fā)明的融合蛋白的部分(I)優(yōu)選包含TAT的堿性區(qū)域(關于氨基酸aa 57-48或57-49)，不包含TAT的富含半胱氨酸區(qū)域(氨基酸22-36)和天然TAT縮氨酸的exon 2編碼的羧基終端域(氨基酸73-86)。TAT的堿性區(qū)域的反面(關于氨基酸aa 57-48或57-49)可作為本發(fā)明的融合蛋白的部分(I)或部分(I)的一部分來使用。包含Tat的堿性區(qū)域或其反面的序列是關于D-Tat序列的。
因此，根據(jù)基因的D-TAT規(guī)則NH2-XXXAXXXXX-COOH，本發(fā)明的融合蛋白的功能有效部分(I)優(yōu)選包含一個D-TAT序列，如NH2-RRRQRRKKRG-COOH或NH2-RRRQRRKKR-COOH(其特征在于，兩個都有以上所述的天然Tat基礎域的逆序)，或包含序列變量NH2-XXXAXXXXX-COOH，其特征在于，X與氨基酸精氨酸或賴氨酸有關，A與任何非基礎氨基酸有關。A優(yōu)選放在以上所給出的基因規(guī)則的第四個位置上。然而，A可二者選一地放在任何其他序列的位置上，如第2，3，5，6，7或8的位置上，而不是第4。進一步地，以上所給出的基因規(guī)則可被修飾，通過替換一個或更多來傳入額外的非基礎殘基，部分(I)序列只由右旋氨基酸組成，其目的在于作為由左旋氨基酸組成的相應的非反向序列展示同樣的結構側鏈的專利。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體實施例中，部分(I)包含帶有圖1A或圖1B的氨基酸的載體序列。
在另一個實施例中，本發(fā)明融合蛋白的功能有效部分(I)包含以下基因規(guī)則的基因氨基酸序列NH2-AmXAoXAn-COOH，NH2-AmXXXAn-COOH，NH2-AmXXAXAn-COOH，NH2-AmXAXXAn-COOH或NH2-XAAX-COOH，X與氨基酸基因或賴氨酸有關，A與任何非基礎的氨基酸有關，m是一個從0到14的整數(shù)，n是一個不受m約束的0-14的整數(shù)，o是一個不受m和n約束的0-14的整數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，必須要注明的是，以上的載體序列等基因規(guī)則是只由右旋氨基酸組成的。
本發(fā)明融和蛋白功能有效部分(I)的特定例子包含或可能包含以下強烈堿性序列NH2-KTRR-COOH，NH2-RLKR-COOH，NH2-KPRR-COOH，NH2-KRFQR-COOH，NH2-GRIRR-COOH，NH2-NIGRRRN-COOH，NH2-RAGRNGR-COOH，NH2-RPRR-COOH，NH2-GKRRG-COOH，NH2-KRRE-COOH，NH2-RQKRGGS-COOH，NH2-RKSR-COOH，NH2-RGSRR-COOH，NH2-RRQK-COOH，NH2-RARKG-COOH，NH2-RGRK-COOH，NH2-RRRLS-COOH，NH2-RPRRLSP-COOH，NH2-RGRKY-COOH，NH2-RPKRGMG-COOH，NH2-GVRRR-COOH，NH2-GYKKVGFSR-COOH，NH2-KFSRLSK-COOH，NH2-RRVR-COOH，NH2-RRSRP-COOH，NH2-RRRM-COOH，NH2-KSMALTRKGGY-COOH，NH2-RSRRG-COOH，NH2-KMNPLPY-COOH。根據(jù)本發(fā)明，必須要注明的是，以上載體序列只由右旋氨基酸組成。
部分(I)可能只包含一個(即連續(xù)性的)基礎細胞膜置換序列(D逆序形式)，類似于相應的(天然的)置換序列，也就是以上所述的D-Tat序列。另外，部分(I)在逆序中可能包含兩個或更多的氨基酸序列，該序列帶有強烈的堿性特征，對應于相同的或不同的置換序列相。這些逆向的D形式置換圖形是通過使用D氨基酸和回復氨基酸序列在天然蛋白的基礎上進行合成的。換而言之，本發(fā)明的融合蛋白可能包含如在部分(I)中的兩個或更多的置換序列的化合物，這些序列都是作為逆序的D形式序列進行合成的。很明顯地，置換圖形的化合物沒有在任何母體蛋白序列中發(fā)生(如L形式)。這些兩個或更多的部分(I)置換序列是與連接序列或沒有與之連接的。連接序列要求優(yōu)選的長度是2-20個氨基酸。
正如上面所透露的，部分(I)可能包含一個或更多右旋氨基酸置換圖形(與母體序列相比為逆序)，這些氨基酸置換圖形在相應的天然L形式同系物的基礎上合成而來。另外，部分(I)可能包含L形式序列的D氨基酸串，這些D氨基酸串與天然蛋白序列相比是被作了有序的修飾。這些部分(I)的衍生物(由逆序D形式提供，也就是說D形式的衍生物是L形式衍生物的同系物)明顯地支配進入細胞中(甚至優(yōu)選進入細胞核)發(fā)揮舉起作用的載體特性，這與對應的天然蛋白極其相似，盡管它們的序列與天然蛋白序列不一樣。
此外，糖基部分和/或脂部分，如膽固醇或其它油脂，可以加到本發(fā)明的融合蛋白上，特別是本發(fā)明融合蛋白的部分(I)，或甚至是其它部分，目的在于進一步提高融合蛋白的膜溶性，如加到部分(I)一端或兩端提供局部親脂性。另外糖基部分或脂部分還可能被連接到氨基酸側鏈上，尤其是羥基和氨基的側鏈。
本發(fā)明的融合蛋白的部分(I)必須保持它的細胞滲透性和/或細胞內(nèi)駐留功能。然而，通過對到部分(I)進行修飾可增加許多其它的功能。因此，可以修飾部分(I)來引導本發(fā)明的融合蛋白進入細胞內(nèi)特定靶點。相應地，修飾部分(I)使其到達指定的細胞內(nèi)位置而不損失增強的細胞滲透性。通常，將本發(fā)明的融合蛋白靶向?qū)胩囟ǖ募毎麉^(qū)(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體，gloom器官，溶酶體囊泡)，常規(guī)序列可導入到部分(I)。另外，可以添加確保本發(fā)明的融合蛋白細胞質(zhì)定位的特異序列，如部分(I)可包含至少一個深層次序列，該序列綁定到一個或多個的細胞質(zhì)結構，使本發(fā)明的融合蛋白保持在細胞質(zhì)中。，堿性區(qū)域的修飾對于核定位很重要(參考Dang and Lee(1989)，J.Virol.Chem.26418019-18023；Hauber et al.(1989)，J.Virol.631181-1187；Rubenet al.(1989)，J.Virol.631-8)，可能導致本發(fā)明的融合蛋白部分(I)的細胞質(zhì)定位或部分細胞質(zhì)定位。因此，部分(I)可能包含可替換的核定位信號，該信號導致了本發(fā)明的融合蛋白的細胞質(zhì)定位。
如上所述的，唯BH3蛋白通過使Bcl-2家族成員與其它Bcl-2家族成員的相互作用揭示了凋亡的調(diào)整。本發(fā)明的融合蛋白的部分(II)是一個氨基酸序列，包含一個或多個唯BH3蛋白的BH3域序列的部分或全長(作為Bcl-2家族蛋白的子類進行限定)。部分(II)也可能包含天然BH3域序列(全長或部分的)的D逆序形式，從而確保了D氨基酸側鏈在全部母體L氨基酸序列中的定位，或者包含全部母體L氨基酸序列，這兩者能通過與至少1個Bcl-2家族蛋白相互作用或激活或敏化至少一個Bcl-2家族的促凋亡成員來引起凋亡。
如果本發(fā)明的融合蛋白的部分(II)包含部分的BH3域序列，它就應該在母體序列方向或逆序方向擁有(目的是功能有效)至少4個右旋或左旋氨基酸(反映了至少4個唯BH3蛋白的BH3域的L氨基酸的片斷)。在優(yōu)選的具體實施例中，部分(II)只包含右旋氨基酸。本發(fā)明的融合蛋白的功能部分(II)包含逆序氨基酸的部分或全長，該逆序氨基酸的范圍首選4-20，4-18亦為優(yōu)選，4-15甚至更加優(yōu)選，4-13還要好一些，4-10甚至更好，最為優(yōu)選的是4-8。用作部分(II)的全部或部分的BH3域序列必須保持其功能，即保持其促凋亡的活性。通過適當?shù)幕灧椒?，如凝固化?將本發(fā)明的融合蛋白的部分(II)或本發(fā)明的融合蛋白本身凝固到母體凝固伙伴中)或通過凋亡化驗來化驗促凋亡活動，以此來測試它們的功能活性。
更適宜地說，部分(II)包含唯BH3蛋白的BH3域的部分或全長，該蛋白選自于母體L形式或逆序的D形式中由Bid，Noxa，Puma，Bim，Bik，Bmf，DP5/Hrk和Bok組成的群。BH3群(全長或部分)可選自于任何哺乳動物的唯BH3蛋白，特別是來自人類的異形體(isoform)。相應地，本發(fā)明的融合蛋白的部分(II)包含附圖2A，2B，2C，2D，2E或2F的氨基酸序列(或者是在圖2A-2F中展示組成的母體L氨基酸形式或逆序D形式(由右旋氨基酸組成))，即圖2A-2F的序列必須通過回復端來轉化母體C端轉化為形式的N端，母體N端轉化為形式的C端。本發(fā)明的融合蛋白的部分(II)包含母體唯BH3蛋白序列全長的片斷(以L或D形式)，該片斷優(yōu)選少于50個的氨基酸，更優(yōu)選少于40個的氨基酸，最優(yōu)選的是少于30個的氨基酸。這些母體序列的片斷明顯或部分地(至少7個BH3域的序列氨基酸)包含BH3域的序列。
本發(fā)明的融合蛋白的部分(II)包含一個或多個唯BH3蛋白的BH3域的序列的部分或全長，或者是以母體氨基酸的形式，或者是由右旋氨基酸組成的轉化形式。由左旋氨基酸組成的部分(II)可通過熟練掌握重組細胞方法或縮氨酸合成方法的人進行人工合成，如固態(tài)合成。而部分(II)的左旋氨基酸序列是后來與部分(II)的右旋氨基酸序列相連接的(通過第二步)。另外，化學合成允許直接合成(沒有導入第二連接步驟)部分(I)中的右旋氨基酸和部分(II)中由左旋氨基酸組成的本發(fā)明的融合蛋白。而部分(II)也是由右旋氨基酸組成，融合蛋白通過運用逆序的右旋氨基酸進行化學合成并轉化成母體BH3域序列的部分或全部(使用與合成左旋氨基酸序列的同樣方法)，如天然的載體序列，天然的基礎Tat序列。
天然的唯BH3蛋白或片斷的氨基酸序列包含BH3域，相應地，作為部分(II)的一部分，由右旋氨基酸組成的逆序同系物可被修飾，如通過對母體蛋白至少一個氨基酸的增加、刪除或置換來提供非天然序列。修飾尤其是保守修飾，能改變部分(II)的凝固性或穩(wěn)定性，如增加或減少穩(wěn)定性。帶有修飾的初級序列的部分(II)(與天然BH3域或唯BH3蛋白序列相比)可通過同樣的技術來對未修飾的左旋氨基酸或右旋氨基酸序列進行修飾而達到合成的目的。
本發(fā)明的融合蛋白至少由部分(I)和部分(II)組成。而且根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白進一步地可能由部分(III)，(IV)，(V)組成。這些額外的部分是可選擇的，并可能為本發(fā)明的融合蛋白帶來額外的功能。。至少有一個部分可能是氨基酸、寡肽或多肽、或小的有機化合物，而且能夠與本發(fā)明的融合蛋白結合在合適的位置上，如N-末端或C-末端或中心。這些額外的部分(如HA，HSV-Tag，His6)可能使本發(fā)明的融合蛋白服得到純化和/或分離。如有要求的話，融合體在生產(chǎn)過程即將結束時即能夠從本發(fā)明的融合蛋白中被去除(如通過溶蛋白性裂解或已知的其他方法)。另外，特定細胞間隔的載體序列或其他功能序列可以通過一個額外的部分被融合到發(fā)明的分子中或者摻合到部分(I)或部分(II)中。額外的部分(如部分(III)允許本發(fā)明的融合蛋白與一定的細胞型特異結合，如免疫細胞，肝細胞，特別是器官的瘤細胞，如淋巴細胞，神經(jīng)細胞等。這個目的可以通過將有特定細胞標志的天然配體(如膜蛋白細胞外部分配體，像受體，或?qū)蚰さ鞍准毎獠糠肿髁肆黾毎麡擞浀目贵w)融合到本發(fā)明的融合蛋白來達成。因此，本明的共軛分子可能被。因此，本發(fā)明的融合蛋白可被選擇性地導入待治療動物一定的細胞或組織中。
在另一個優(yōu)選的實施例中，不只一個，最好由兩個或三個同樣的或不一樣的BH3域序列的部分或全部，被合并到本發(fā)明的融合蛋白或部分(II)的部分或作為額外的部分(如部分(III)中。尤其是不同的唯BH3蛋白的BH3域序列的部分或全長可與本發(fā)明的融合蛋白進行結合，如Bid和Bad，Bim和Bad，Bik和Bad，Puma和Bad，Noxa和Bad，Bmf和Bad，DP5/Hrk和Bad，Bok和Bad，Bik和Bim Bik和Bid，Bik和Puma，Bik和Noxa Bik和Bmf，Bik和DP5/Hrk，Bik和Bok，Bid和Puma，Bid和Noxa，Bid和Bim Bid和Bmf，Bid和DP5/Hrk，Bid和Bok，Bim和Noxa，Bim和Puma，Bim和Bmf，Bim和DP5/Hrk，Bim和Bok，Puma和Noxa，Puma和Bmf，Puma和DP5/Hrk，Puma和Bok，Noxa和Bmf，Noxa和DP5/Hrk，Noxa和Bok.如果本發(fā)明的融合蛋白擁有不止一個BH3域的話，本發(fā)明的融合蛋白將優(yōu)選包含(部分或全長)像唯BH3蛋白的BH3域。顯然，如果在本發(fā)明的融合蛋白中不止一個BH3域，他們中的兩個或更多將呈現(xiàn)逆序D形式或常規(guī)的母體L形式。所以本發(fā)明的融合蛋白結合了D形式和L形式的BH3域。
根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白通常有一個至少12-200個甚至更多(額外的部分或部分(III)的全長)氨基酸的范圍，優(yōu)選的范圍是12-150個氨基酸，20-100個氨基酸還要好一些，20-75個氨基酸還要更好，20-50個氨基酸為最好。根據(jù)本發(fā)明，如果部分(II)是由L氨基酸組成的話，根據(jù)附圖3A，3B，3C，3D，3E或3F融合蛋白有一個序列(在部分(I)中有顯示這些數(shù)據(jù))和片斷(在部分(I)中有包含)，顯然，在所顯示的數(shù)據(jù)中唯BH3蛋白序列的全長少于50個氨基酸，片斷至少包含在唯BH3蛋白的BH3域序列中。在本發(fā)明的另一實施例中，在這些數(shù)據(jù)中所顯示的每一個部分(II)序列均由D氨基酸組成，并通過顛倒逆序端點從而導致部分(II)中所有的D氨基酸發(fā)生逆序。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的至少一個第一部分(I)和至少一個第二部分(II)通過共價鍵結合?！肮矁r鍵”是兩個原子通過共享一對或多對共用電子而形成的穩(wěn)定的化學鍵。正如前面所述，部分(III)、(IV)、(V)亦可通過共價鍵與部分(I)或部分(II)連結。
一般來說，部分(I)和部分(II)可通過連接器或N終端和C終端之間形成氨基化合物進行結合。部分(I)的C端氨基化合物可被連接到部分(II)的N端氨基化合物，或者部分(I)的N端氨基化合物可被連接到部分(II)的C端氨基化合物。例如，本發(fā)明的融合蛋白有獨立的C端或N端運輸序列，部分(I)被共價連接到部分(II)中的，具體表現(xiàn)是，在包含D-TAT序列的部分(I)和作為包含蛋白的BH3域序列的部分或全長之間被加入。
如果存在的話，如上面提到的，更多的部分(III)，(IV)，(V)等以類似的方式或隨意地與部分(I)或部分(II)相連接，連接序列在有至少一個其它下面所提到的半分子的前提下同樣也能用于融合本發(fā)明的融合蛋白。隨意部分(III)，(IV)等通過D氨基酸的側鏈連接到本發(fā)明的融合蛋白，或被附著在部分(I)或(II)的終端上。側鏈的連接優(yōu)選的是側鏈的氨基或羥基群，例如通過酯或醚連接。根據(jù)本發(fā)明必須要強調(diào)的是，所有的氨基酸(任何部分(I)，(II)，(III)，(IV)，(V)中的)都由右旋氨基酸組成，通過連接該氨基酸的逆序最終摹擬了天然同系物。
如果連接序列用于融合的部分(I)和(II)或其它的融合部分，如部分(III)到部分(I)和/或部分(II)，這些連接序列可以優(yōu)先形成一條含有5-50個殘基的可變形的序列，有5-15個殘基的更好。在優(yōu)選的實施例中，連接序列(一個全是D或全是L氨基酸的序列)包含至少20％，甚至至少40％，至少50％的Gly殘基。通過本技術的方法可以較容易地選擇和制備適當?shù)倪B接序列。
部分(I)和部分(II)也能通過本技術中眾所周知的適當方式來進行化學連接。然而必須要注意的是，許多眾人皆知的化學連接是非特異性，也就是說他們并非是與傳輸?shù)鞍?或多縮氨酸)或被栽物半分子的特異點連接的。因此，非特異性連接的物質(zhì)可以進攻功能位點或者一些空間阻礙的活動位點，致使融合蛋白在生物學上變得非活性。正如前面所描述的，更多的部分(III)、(IV)(V)等可以以類似的方式彼此或與部分(I)和/或(II)進行連接。
與部分(I)的功能基團一次或幾次的化學直接連接能提高連接特異性，這些功能基團交叉連接的蛋白/縮氨酸/多縮氨酸中的一個或兩個中只發(fā)現(xiàn)過一次或兩次。其中一個例子就是半胱氨酸，它是唯一的包含巰基且在很多蛋白中只發(fā)生過幾次的氨基酸。還舉例說明一下，如果蛋白/縮氨酸/多縮氨酸沒包含賴氨酸，而是專指最初的胺交聯(lián)試劑，將為那個蛋白/縮氨酸/多縮氨酸提供氨基端的選擇性。然而，要成功地使用這個方法增加連接特異性，要求蛋白/縮氨酸/多縮氨酸在分子區(qū)域中擁有合適的稀少的起反作用的殘基，且該分子在改變過程中沒有丟失分子的生物活性。
當?shù)鞍?縮氨酸/多縮氨酸序列發(fā)生過程中交叉連接反應時，半胱氨酸可被替換，否則將很可能妨礙生物活性。半胱氨酸殘基被置換顯然是蛋白(或多縮氨酸)最小化折疊反應的結果。當置換化學結構和空間結構類似于半胱氨酸的蛋白/縮氨酸/多縮氨酸時，折疊反應變化也會變小。因此，比較于置換半胱氨酸，絲氨酸是是取代反應的優(yōu)選殘基。然而，對于生成的半胱氨酸殘基，優(yōu)選的置換位點是N端或者C端或靠近的地方。不管受影響的蛋白/縮氨酸/多縮氨酸是被化學生成的還是DNA重組的，常規(guī)的方法對每一個氨基酸序列修飾都是可取的。
兩個要素的連接，如部分(I)中的D形式與部分(II)中的L形式的連接，都能通過連接或共軛來完成。有幾種分子間交聯(lián)試劑可以用，可參考Meansand Feeney，Chemical Modification of Proteins，Holden-Day，1974，pp 39-43.中的舉例。在這些舉例的試劑中，如N-琥珀酰-3-2-聯(lián)硫基吡啶-丙酸鹽(SPDP)、N，N′-(1，3-苯烯)二馬來酰亞胺、N，N-乙烯-二碘乙酰胺或或其他含有6～11個亞甲基的有機物和和1，5-二氟-2，4-二硝基苯。其他有這種交聯(lián)作用的試劑還包括p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯砜、乙二酸二甲酯、1，4-二磺酰氯苯酚、己二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、偶氮苯-p二異氰酸鹽、二馬來酰亞胺己烷和disdiazobenzidine。交聯(lián)試劑可以提供同性雙功能，也就是可以進行同樣反應的兩個功能基。優(yōu)選的一種具有同性雙功能的交聯(lián)試劑是二馬來酰亞胺己烷(BMH)，BMH含有兩個馬來酰亞胺功能基團，馬來酰亞胺在中性條件下(pH 6.5-7.7)與巰基內(nèi)含(sulfhydryl-containing)發(fā)生特異性反應，這兩個馬來酰亞胺通過一個碳鏈連接，因此，BMH可用于含有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)或多肽的不可逆的交聯(lián)反應。交聯(lián)試劑可以提供異性雙功能，異性雙功能交聯(lián)試劑有兩個不同功能的基團，如一個活性氨基和一個活性巰基可以交聯(lián)分別含有自由胺和自由硫醇的兩個蛋白質(zhì)分子，異性雙功能的交聯(lián)試劑有琥珀酰亞胺基-4-(N-甲基馬來酰亞胺)-環(huán)己烷-1-羧酸鹽(SMCC)、m-馬來亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、和琥珀酰亞胺-4-(p-苯基馬來亞胺)丁酸鹽(SMPB)及MBS的同系物。交聯(lián)試劑的丁二酰亞胺基(succinimidyl)基能與胺發(fā)生反應，馬來酰亞胺的活性巰基能與半胱氨酸的巰基以共價鍵結合于一起。因為交聯(lián)試劑通常在水中都有低的水溶性，將一個親水基團譬如磺酸基連接到交聯(lián)試劑上就可以增加它的水溶性，Sulfo-MBS和sulfo-SMCC交聯(lián)試劑水溶性改變的實例。很多交聯(lián)試劑能使本來處于細胞環(huán)境下不分裂的情況發(fā)生了變化。于是，一些交聯(lián)試劑就捆綁有一個共價鍵，如在細胞環(huán)境下發(fā)生分裂的二硫化物。比如Traut′s reagent，、dithiobis(succinimidylpropionate)(簡稱DSP)、和N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate(簡稱SPDP)都是已經(jīng)知道的可分裂的交聯(lián)試劑?？煞至训慕宦?lián)試劑允許被載物半分子被運送到目標細胞后單獨地從運輸多肽中分離出來?；谶@個目的，直接的二硫化物也可以運用?；瘜W交聯(lián)也包括了定距離裝置的用途，這種定距離裝置提供分子的柔韌性或調(diào)節(jié)共軛分子之間的距離，這樣有助于生物活性的保護。定距離裝置可以是由包含有定距離的氨基酸(如脯氨酸)的蛋白質(zhì)或多肽組成，另外，定距離裝置也可以是交聯(lián)試劑的一部分，如long-chain SPDP″(見Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.，cat.No.21651 H)。許多包括前面提到過的交聯(lián)試劑都已經(jīng)上市使用，有關它們詳細的介紹都能從它們的供應商那兒獲得。一本涉及到蛋白質(zhì)交聯(lián)和共軛制備的書是Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRCPress(1991)。
本發(fā)明同樣也包含了那些模擬天然功能序列的或它們的D形式同系物序列的已經(jīng)被修飾過的的融合蛋白。這些修飾后的變量定義為衍生物，也是本發(fā)明的融合蛋白。衍生物包含部分(I)和/或部分(II)的派生物，也可以是部分(III)，部分(IV)，部分(V)等的衍生物，(如果存在的話)也可以是天然L序列或相應的逆序D形式的衍生物。本文有意指出的是，融合蛋白是通過取代L或D形式氨基酸序列一個或多個位點的一個或多個氨基酸而來，或是通過使自然母體的任何位點的一個或多個氨基酸缺失而來，和/或是在自然肽序列的一個或多個位點插入一個或多個氨基酸而來，以此來達到保持其特有活性的目的。氨基酸的取代反應優(yōu)選與傳統(tǒng)的取代反應。傳統(tǒng)的取代反應有以下代表甘氨酸和丙胺酸；纈氨酸，異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺酸和谷酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；苯基丙氨酸和酪氨酸。此外，可優(yōu)選傳統(tǒng)的取代反應基團有門冬氨酸-谷氨酸；天門冬酰胺-谷酰胺；纈氨酸--亮氨酸--異亮氨酸；丙胺酸--纈氨酸；苯基丙氨酸-酪氨酸和賴氨酸-精氨酸。通過部分(I)和/或部分(II)的這些序列變更(如果存在的話，也可以是部分(III)，部分(IV)，部分(V))，使本發(fā)明的融合蛋白的穩(wěn)定性和/或有效性可被改變，如加強。與它們的母體L形式(或D形式類似物，表現(xiàn)母體序列的D形式和L形式也都被稱成“雙親序列”)相比，被修飾的本發(fā)明的融合蛋白必須與擁有相應雙親序列的蛋白保持同源性，如在序列，功能，抗原特性或其它特征方面。特別優(yōu)選的是包含于部分(I)中的母體運輸序列的衍生物保持其相應的功能(主要是細胞半分子可滲透方面的特性)，然而包含在部分(II)的母體BH3域蛋白序列的衍生物保持了它們細胞凋亡前的特性。衍生于母體雙親序列的本發(fā)明的融合蛋白所改變的特性，比雙親序列的特性更有優(yōu)勢(比如增加pH的適宜性，提高溫度的穩(wěn)定性等)。本發(fā)明的融合蛋白的部分(I)要么是母體L形式同系物的逆序D形式，要么是通過對序列修飾的所導入的逆序D形式(母體L形式同系物)的衍生物。
母體的D形式或L形式序列的衍生物(構成本發(fā)明的融合蛋白)與母體氨基酸有明顯堅固的序列屬性，如部分(II)中圖2A——2F中所揭露的。特別優(yōu)選的是保持有至少60％的氨基酸序列屬性，甚至是保持有至少75％的序列屬性，甚至是保持有至少80％的，甚至保持有至少90％的，甚至是保持有至少95％的。序列屬性是能被測定，如通過使用合適的默認值參數(shù)和序列分析軟件(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705)。
合成衍生物已經(jīng)知道并且可以根據(jù)下面的標準方法來實行，這個標準方法是在本技術中描述過的一種熟練的技術(參考SambrookJ，Maniatis T(1989)supra).根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，運用重新結合技術可將包含有母體的或衍生的L形式的序列用于制備本發(fā)明的融合蛋白的某些蛋白，如部分(II)。如上面所描述的，這些L形式的部分(II)通過單獨的步驟被連接到D形式的部分(I)上。一般來說，要做好本發(fā)明的融合蛋白的蛋白重新結合準備，可通過選擇預定的母體DNA序列或修飾母體DNA序列，或?qū)NA序列轉化到適當?shù)乃拗魃?，表達(修飾后的)的DNA序列要形成所要求的蛋白序列。通過標準方法可以實現(xiàn)對蛋白序列的分離，這些方法包括將溶媒中細胞進行離心或過濾分離出來，必要時還要破壞細胞，通過鹽(硫酸銨)來使蛋白質(zhì)沉淀，取上清液或濾過液，進一步通過色譜方法來提純，比如離子交換柱色譜、親和性色譜或者其他經(jīng)過驗證的相似的方法(參看SambrookJ，Maniatis T(1989)supra)。
更詳細地，重新結合技術包括借助于核酸或編碼融合蛋白的部分(II)的左旋肽并培育成重組微生物的載體使宿主細胞轉化，優(yōu)選大腸埃希菌為例，大腸埃希菌在適于宿主細胞生長和核酸表達的環(huán)境下，如誘導劑、鹽適當補充的媒介、生長因素、抗體、營養(yǎng)補充等。因此核酸實現(xiàn)了表達，并生成了編碼后的融合蛋白。
包含本發(fā)明的融合蛋白部分(II)中母體L形式的核酸的載體，詳細闡明了如部分(II)中的L形式序列的一個或更多核酸序列的核酸序列。因為能變成適宜的宿主細胞，載體能用于促使核酸的表達。載體可以是質(zhì)粒，噬菌體微?；蚧蛘咧皇侨旧w的植入。一旦變形成為適宜的宿主細胞，載體就可以開始復制或者獨立運行染色體，或者在適宜條件下，結合到自身的染色體上，根據(jù)本發(fā)明可優(yōu)選的載體是大腸埃希菌E.coli XL-Blue MRF`和pBK-CMV質(zhì)體。
之前所提到的載體的“其他序列”涉及如下通常，合適的載體包括如Ori p，colEl Ori復制的起點和允許核酸插入序列，這些插入的核酸有表達作用(錄制和/或翻譯)和有可選擇的遺傳標志，如編碼了熒光蛋白的GFP遺傳因子，賦予了抗體的遺傳因子，這些抗體來源于Tn3的P-內(nèi)酰胺酶遺傳因子，來源于Tn903的抵抗卡那徽素的或來源于Tn9的抵抗氯霉素。
術語“質(zhì)?！币馑际窃谌旧w外通常能自我復制的遺傳單元。質(zhì)粒一般都用較低的p放在字母和/或數(shù)字之前或之后。然而此處所說的最開始的質(zhì)粒在一個無限制的基礎上是很容易得到利用的，或根據(jù)從已公布的程序，從可得到的質(zhì)粒中進行構造。另外，該領域內(nèi)熟練的人員都知道那些已描述的相等質(zhì)粒。用來制備現(xiàn)在發(fā)明的載體的質(zhì)體是可以分離的，如來源于含有質(zhì)體的適宜的大腸埃希菌可用如氯化銫DNA分離的標準程序來分離。
適宜的載體涉及到編碼型載體也等同于表達型載體的DNA的重組。編碼型載體涉及到自主復制因子，包括但不受限制的質(zhì)粒和噬菌體，包含融合蛋白部分(II)的一個或多個左旋肽段的一個或多個附加核酸的DNA分子已經(jīng)被補充。表達型載體涉及到編碼型載體重組構造的所有DNA，這些DNA包含了共軛分子的一個或多個左旋肽段的核酸序列，共軛分子連接于適宜的支配序列能夠?qū)崿F(xiàn)表達和控制插入進適宜主體的核酸的轉錄。如此一來質(zhì)粒就可以輕松改變構造表達型載體以致于制備了許多生物體的共軛分子的左旋肽段，這些生物體包括了大腸桿菌Sf9(一種桿狀病毒)、酵母菌。U.S.Pat.No.4,992,373文獻中也包括了構造AV12表達媒介和變換AV12宿主細胞的技術，這里的介紹僅是文獻里所描述的眾多技術中的一種，僅供參考。
“可操作連接”意思就是核酸序列以一種允許核酸序列表現(xiàn)(如翻譯和/或轉錄)的方式被連接到一個控制序列?！胺g”意思就是包含在DNA核酸序列中的信息被轉化成補充的RNA序列的過程。
“控制序列”于本技術中已經(jīng)獲悉并且可以選擇來表達左旋肽段的核酸和控制轉錄。這樣的控制序列包括了，但不僅僅限定于此的多腺苷酸化信號、啟動子(天然或合成的啟動子)、或可實現(xiàn)準錄的加強因子、控制轉錄的可選的操作序列、組織特異性的基因位點、編碼了合適的捆綁核糖體的mRNA序列、能使控制轉錄和翻譯末端的mRNA和和核酸序列穩(wěn)定的序列等，這些控制序列是可以改變的，如通過染色體的缺失或增加，插入或取代一個或多個核酸，于是保存他們的控制功能。本技術的其它適宜的控制序列也已獲悉并且有作描述，可參考Goeddel(1990)，Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。
尤其是已經(jīng)知道了很多用作不同生物體的不同的啟動子，如用于枯草芽孢桿菌的優(yōu)先啟動子是AprE，用于E.coli中優(yōu)先的啟動子是T7/Lac啟動子，用于釀酒酵母中啟動子則是PGK1(磷酸甘油酸酯激酶1)，glaA則是用于黑曲霉素的優(yōu)先啟動子并且cbhI是木霉素的優(yōu)先啟動子。適合用于原核宿主細胞的啟動子還包括β-內(nèi)酰胺酶(含有復制子和B-內(nèi)酰胺酶基因的載Pgx2907(ATCC39344))和乳糖啟動子系統(tǒng)，堿性的磷酸酯酶，色氨酸啟動子系統(tǒng)(在trp啟動子的控制下作為trpE融合蛋白并設計用于促進開放式閱讀框表達的pATH1(ATCC 37695)的載體)以及雜和啟動子比如tac啟動子(從pDR540ATCC-37282質(zhì)粒中分離)。但是，已知核苷酸序列的其他功能性的細菌啟動子，通過使用連接子或者適配器來補給任何必需的限制性酶切位點使人們能夠熟練地連接它們到現(xiàn)已編碼出來的左旋的DNA肽段。細菌系統(tǒng)的啟動子將同樣會包含連接到現(xiàn)已編碼出來的左旋的DNA肽段上的S-D序列。
有用的表達型載體，比如可能會包括染色體的片段、非染色體的片段和合成的DNA序列的片段，合成的DNA序列的片段則例如各種已知的SV40的引物或者片段和已知的細菌質(zhì)粒，例如大腸桿菌中的質(zhì)粒，包括col E1，pBK，pCR1，pBR322，pMb9，pUC 19以及其變種，廣闊的數(shù)組范圍的質(zhì)粒，例如RP4，噬菌體DNAs，各種衍生出來的噬菌體λ例如NM989，和其它DNA噬菌體，例如M13和菌絲狀的單鏈的DNA噬菌體，酵母質(zhì)粒，真核細胞中有用的載體，例如動物照射室中的載體和從質(zhì)粒制品和噬菌體DNAs中得到的載體，這樣的載體例如使其可以利用噬菌體DNA或者其它表達控制序列的改良的質(zhì)粒。用于上述表達載體的表達技術在生物技術中是有名的和普遍的，例如Sambrook J，Maniatis T(1989)supra。
包括前面提到的載體或者已發(fā)明的融合蛋白部分(II)的左旋肽段的核苷酸的相配細胞或者宿主細胞有能力為上述的核苷酸或者載體去充當宿主和表達型載體。宿主細胞可以是原核的，真核的或古核生物(archaeon)細胞。宿主細胞包括(例如，由于轉化，轉染或轉導)質(zhì)?；蛘吆塑账幔遣皇莾H限于此處，細菌細胞(如R.marinus，E.coli，Streptomyces，Pseudomonas，Bacillus，Serratia marcescens，Salmonella typhimurium)，真菌包括酵母(例如酵母菌屬，畢赤酵母屬)和霉(例如曲霉)，昆蟲細胞(例如Sf9)或者哺乳動物細胞(例如COS，CHO)。完美的宿主細胞表示大腸桿菌。一般而言，在能夠想得到的特殊方法中，一個宿主細胞可能被篩選出來去調(diào)整有關插入序列或者修飾或者處理用序列已編碼的表達蛋白。選擇合適的細胞或者細胞系或者宿主系統(tǒng)來確保得到期望的變體和異種蛋白的處理算是完成了。例如，在細菌系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)表達可以用于產(chǎn)生非糖基化的核心蛋白，然而哺乳動物細胞中的蛋白質(zhì)表達則產(chǎn)生異性蛋白的糖基化。
真核宿主細胞不是限用于特殊的真核宿主細胞。真核細胞的多樣性是可用的，例如從美國標準菌庫中的和上述的載體都是可以用的。一個特殊宿主細胞的選擇在一定程度上依賴那些促進已發(fā)現(xiàn)的左旋肽段的核苷酸表達的特殊表達載體。真核宿主細胞包括哺乳動物細胞和酵母細胞。盡管許多其它菌種是常用的，但半知菌類的釀酒酵母是最常用的真核微生物。為了酵母菌的表達，例如酵母復制型質(zhì)粒(ATCC-40053)，是常用的。(見Stinchcomb L.et al.(1979)Nature，28239；Kingsman J.al.(1979)，Gene，7141；S.Tschemper etal.(1980)，Gene，10157)。這種質(zhì)粒已包含可以為那些不能在色氨酸中生長的酵母突變株提供可選標記的色氨酸基因。
用于酵母宿主的合適的啟動序列包括3-磷酸甘油酸酯激酶(在pAP12BD質(zhì)粒(ATCC 53231)可以找到和在文獻U.S.Pat.No.4,935,350，issued Jun.19，1990，中描述的)或者例如烯醇酶(pAC1質(zhì)粒(ATCC 39532)可以找到)，甘油酸酯-3-磷酸脫氫酶(pHcGAPC1質(zhì)粒(ATCC 57090，57091)中分離得到)，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄糖異構酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡糖異構酶和葡萄糖激酶，同樣還有酵單菌目屬的乙醛脫氫酶和丙酮酸脫羧酶(見文獻U.S.Pat.No.5,000,000 issued Mar.19，1991)等其它的糖酵解酶。具有在各種生長條件下可控的誘導型啟動子轉錄附加優(yōu)點的其它的酵母啟動子是乙醛脫氫酶2，異細胞色素C，酸性磷酸酯酶，與氮代謝有關的降解酶，金屬硫蛋白(在pCL28XhoLHBPV質(zhì)粒載體上含有(ATCC 39475)和在文獻U.S.Pat.No.4,840,896有所描述)，3-磷酸甘油醛脫氫酶和用于麥芽糖和半乳糖發(fā)酵的酵素(例如pRY121質(zhì)粒(ATCC 37658)上發(fā)現(xiàn)的GAL1)的啟動子區(qū)。酵母增強子例如來源于釀酒酵母的UAS Ga1(在YEpsec--hI1beta質(zhì)粒(ATCC 67024)上發(fā)現(xiàn)的與CYC1啟動子相結合)也是有效的利用酵母啟動子。
前面提到的載體可以用適當?shù)姆椒?例如轉化，電穿孔，用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、二乙氨基乙基葡聚糖或者其他物質(zhì)轉染，微粒轟擊，脂質(zhì)轉染，感染或轉導)引入宿主細胞的。轉化歸因于DNA進入一個有機體以致于DNA是可復制的，或者是染色體外的遺傳因子或者染色體整合。在生物技術中轉化入細菌和真核宿主的方法也是已知的。很多方法，例如核注射，原生質(zhì)體融合或者利用在Sambrook J，Maniatis T(1989)supra中總結了的鈣試劑盒，僅由是否任何編碼序列的與質(zhì)粒接納有關的轉染，實際上都是可以表達的。當任何指征或者操作或者載體出現(xiàn)在宿主細胞中時成功的轉染是公認的。
在本發(fā)明的另外一個具體實施例中，本發(fā)明的融合蛋白的部分(II)與母體L形式或其衍生物不相應，但與由D氨基酸組成并是反方向的逆序D形式序列相對應。這些部分(II)的D形式序列(與部分(I)的D形式序列一起)在重組技術方面不是很明顯，通過縮氨酸合成技術進行合成，如固態(tài)階段合成，使用D氨基酸而非L氨基酸來得到D氨基酸序列。然而，必須注明的是，氨基酸順序必須在合成上是顛倒的(與L形式的同系物相比較)。
眾所周知，所有發(fā)明的氨基酸序列都可以通過化學方法合成，包括固相蛋白質(zhì)的合成，包括固態(tài)階段蛋白合成或重新結合方法。這兩種方法在U.S Pat.No.4617149中有描述，其整體性則要結合參考文獻，固相化學合成多肽的原理在生物技術中是很有名的并且Dugas H和PenneyC在1981年生物有機化學雜志的54-92頁有描述，例如蛋白質(zhì)和氨基酸可以通過利用適用的生物系統(tǒng)430A肽合成器和適用的生物系統(tǒng)提供的合成循環(huán)來合成。被保護的氨基酸，如t-乙醇醚化碳酰基保護的氨基酸和其它反應試劑都可從化學供應機構中取得。為了產(chǎn)生羧基末端的羧酰胺，用雙偶連記錄的的連續(xù)的p-甲基二本甲基胺樹脂化學合成是被應用到4-metylbenzhydrylamine樹脂化的起始。為了產(chǎn)生成C端酸，要使用相應的嘧啶-2-醛肟甲碘化物樹脂。通過使用預成型的氫氧根的苯并三唑脂來結合天門冬酰胺，谷氨酸和精氨酸。以下的要用側鏈保護精氨酸，甲苯磺?；惶於彼?，環(huán)己基；葡萄糖，環(huán)己基；絲氨酸，苯甲基；芐基；蘇氨酸；芐基；酪氨酸，4-溴芐酯基。在丁氧基肼基甲酸酯策略中，一部分丁氧基肼基甲酸酯的保護在二氯甲烷溶劑中伴隨著三氟醋酸來完成。接下來蛋白質(zhì)或者多肽合成的完成就是脫保護和用包含10％甲酚的無水氟化氫的樹脂中分離出來。從樹脂中分離支鏈的保護基團和融合蛋白的側鏈是在不高于0℃，最好是-20℃的條件下保持30min，然后再在0℃的條件下30min進行的。在去掉氟化氫后，融合蛋白和側鏈都要用乙醚洗滌，然后融合蛋白用冰乙酸提取，接著低壓凍干。通過交聯(lián)葡聚糖-10為固定相的色譜柱，用10％乙酸洗脫完成凈化。
本發(fā)明的另一個表現(xiàn)提供了一種藥劑學上的合成物，該合成物包含本發(fā)明的融合蛋白和藥物合適的基質(zhì)，佐劑或者賦型劑。這個藥劑學上的合成物是為了治療那些至少有部分是由正常的程序化細胞死亡(凋亡)的變化而引起的疾病。優(yōu)選可治療的疾病包括癌癥，如霍奇金淋巴癌，非霍奇金淋巴癌，組織淋巴癌，腦癌，卵巢癌，泌尿生殖器管道癌，大腸癌，肝癌，結腸直腸管道癌，胰腺癌，乳癌，前列腺癌，淋巴系統(tǒng)癌，胃癌，喉癌和肺癌，包括肺腺癌，細小細胞肺癌和/皮膚癌，如黑素瘤或非黑素瘤的皮膚癌，包括基部細胞和鱗片狀細胞的癌和牛皮癬，白塞(Behcet)綜合病癥和尋常性天皰瘡。
依照發(fā)明提及，一種藥物合適的基質(zhì)，佐劑或者賦型劑是無毒的并且不能破壞按配方制造的作為治療的本發(fā)明的融合蛋白的藥理學活性。用于藥物合劑中的合適賦型劑包括，但也不僅僅限于這些，比如離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白(例如人血清蛋白)，緩沖物質(zhì)(例如磷酸鹽)，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，部分飽和脂肪酸的甘油酯混合物，水，鹽或者電解質(zhì)(例如硫酸魚精蛋白，磷酸二氫鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠質(zhì)硅酸酐，三硅酸鎂)，聚乙烯吡咯烷酮，基本纖維素，聚乙烯乙二醇，羧甲基纖維素(鈉)，聚丙烯酸鹽，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯-封閉聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
現(xiàn)已發(fā)明的藥物制劑可以注射的或者非注射的給藥(例如口服)。
術語注射用于此處包括皮下的，靜脈的，肌內(nèi)的，關節(jié)內(nèi)的，滑膜腔內(nèi)的，向腹膜的，胸骨內(nèi)的，鞘膜內(nèi)的，肝內(nèi)的，內(nèi)傷的和顱內(nèi)的注射或者輸注技術。如果注射給藥，藥物制劑選擇皮下或者靜脈給藥更好。發(fā)明的藥物制劑的無菌的注射形式可以是水或者油狀的混懸液。這些混懸液可以用合適的分散或者濕潤劑和懸浮劑依照制藥技術來按配方制造。無菌的注射劑在無毒的合適的注射稀釋劑或者溶媒中也可能是無菌的注射溶液或者混懸液，例如在1，3-二丁醇中的注射溶液。在這些可以使用的賦型劑和溶劑中有水，林格溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)的油按照慣例都可以作為溶媒或者混懸介質(zhì)。
為了這個目的，任何溫和的油都可以使用，包括合成的單雙甘油酯。脂肪酸，例如油酸和其甘油酯衍生物在注射劑的制備中都是有用的，像一些天然的藥用的油，例如橄欖油或者蓖麻油，特別是在聚氧乙醇環(huán)境中都是有用的。這些油劑或者混懸劑也可能包含長鏈的乙醇稀釋劑或者分散劑，例如羧甲基纖維素或者那些通常用于合適的藥物制劑(乳劑和混懸劑)中的相似的分散劑。其它常用的表面活性劑，例如吐溫，司盤類和其它的乳化劑或者經(jīng)常用于藥物制劑中合適的固體，液體，或者其它的劑型的生物利用度增強劑。
不僅限于這些，膠囊劑，片劑，水制混懸液或者溶液。至于用于口服的片劑，輔料一般包括乳糖和玉米淀粉。潤滑劑像硬脂酸鎂都是有代表性的加入。用于口服的膠囊，常用的稀釋劑包括乳糖和干燥的淀粉。當口服水制的混懸液時，有效成分常常與乳化劑和混懸劑結合在一起。如果要的得到的話，一定的甜味劑，調(diào)料或者著色劑都是要加的。另外，標準的藥物制劑方法都可以用于控制作用持續(xù)時間。這在制藥技術中都是很有名的，包括控制藥物釋放和合適的大分子，例如聚合物，多元酯，聚合的氨基酸，聚乙烯吡咯烷酮，乙烯-醋酸乙烯酯，甲基纖維素，羧甲基纖維素或者硫酸魚精蛋白。大分子的濃度同樣可以作為控制藥物釋放的整合方法。另外，媒介物可以與大分子片段融合在一起，例如多元酯，聚合的氨基酸，水凝膠，多聚的乳酸或者乙烯基乙腈共聚物的共聚物。除了融合以外，這些媒介物在微粒體中用于飽和化合物。
此外的一些給藥形式，例如噴霧吸入，局部地，經(jīng)直腸地，經(jīng)鼻地，向頰地，陰道地或者經(jīng)由一個植入型藥盒，這其中的一些形式將在下面仔細的介紹。
相應地，已發(fā)明地藥物制劑可以以栓劑的形式用于直腸給藥。這些栓劑通過混合一些沒有刺激性的輔料制成的，輔料要求在室溫下是固體而在直腸的溫度下是液態(tài)的，為此其可以在直腸中溶解來釋放藥物。這些輔料包括可可脂，蜂蠟和聚乙二醇。
已發(fā)明的藥物制劑也可以局部的給藥，特別是當治療目標包括容易接近的區(qū)域或者器官時包括眼部，皮膚或者下部的腸道疾病。相應的局部制劑為這些區(qū)域或者器官制備。用于下部的腸道的局部制劑可以以栓劑的形式起作用(見上)或者用合適的灌腸劑。經(jīng)皮的局部制劑也是可用的。為了局部應用，藥用的化合物可以配成包含有效成分混懸或者溶解在輔料中的軟膏劑。用于這個發(fā)明的共軛分子的局部給藥的輔料包括但不僅限于此，例如礦物油，液狀石蠟，白蠟，丙烯乙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蠟和水。有時，藥用的化合物可以配成包含有效成分混懸或者溶解在輔料中的洗劑或者乳膏劑。合適的輔料包括礦物油，司盤-60，吐溫-60，十六烷基酯蠟，2-辛基月桂醇，芐醇和水，但是不僅限于此。
為了眼部藥用，藥用的化合物可以按配方在等滲，合適的PH的無菌鹽溶液中制成微粒化的混懸液，或者更好的是溶液，可以添加防腐劑或者不添加例如氯化苯甲基酮。有時，眼部用藥也可以按配方制成軟膏劑例如凡士林。
本發(fā)明地藥物制劑可以以鼻腔氣溶劑或者吸入劑的形式給藥。這種藥用化合物可以依照藥物制劑配方中的技術制備和，在鹽，苯甲醇或者其它合適的防腐劑，為了增加生物利用度的吸收促進劑，碳氟化合物和其它的增溶或者分散劑中制成溶液。
更好的話，這個發(fā)明的藥物制劑可以口服給藥。
在單劑量的形式下結合用于藥物合劑的基質(zhì)，佐劑和賦型劑已發(fā)明的共軛分子的量會是不同的，其取決于宿主，特殊的給藥模式。更好地，為了給一個病人每天0.01--100mg/kg(體重)的藥量的抑制劑，藥用的合劑應該按配方制成。首選的藥物劑量范圍是每天0.1-5mg/kg(體重)甚至于每天1-5mg/kg(體重)。
膠囊劑其是將100mg的活性成分，175mg的乳糖，24mg的滑石粉和6mg的硬脂酸鎂灌裝于由動物明膠做成的膠囊中制成的。軟膠囊在大豆油中制成藥物活性成分的混合物并且通過正電壓排出泵將其注入到明膠中形成含100mg活性成分的軟膠囊。接著在洗滌和干燥即得軟膠囊劑。片劑通過傳統(tǒng)的程序來制備片劑，以至其劑量單位為100mg的活性成分，0.2mg的二氧化硅，5mg的硬脂酸鎂，275mg的微晶纖維素，11mg的玉米淀粉和98.8mg的乳糖。合適的包衣可以用于增加可口性或者用于延緩吸收。注射劑適合給藥的注射用合劑是通過將1.5％活性成分(按重量計)攪拌入10％丙二醇(按體積計)和水中。溶液是由無菌的等滲的氯化鈉制成?；鞈覄┯糜诳诜o藥的水制混懸液的制備，每5mm含有100mg完全分散好的活性成分，200mg羧基纖維素鈉，5mg苯甲酸鈉，1.0g山梨醇溶液和0.025mm的香草醛。
值得注意的是用于任何病人的特定劑量和治療服法將依賴很多因素，包括特定融合蛋白的活性，年齡，體重，一般健康狀態(tài)，性別，飲食，給藥次數(shù)，排泄頻率，藥物并用和治療醫(yī)生的決定和正在治療的特殊疾病的嚴重性。在藥物制劑中已發(fā)明的融合蛋白的量也將依賴于制劑中的特殊融合蛋白。
本發(fā)明的進一步實施例與本發(fā)明的融合蛋白的使用有關。本發(fā)明的融合蛋白可用于治療疾病或預防疾病或控制有缺陷的凋亡，如霍奇金淋巴癌，非霍奇金淋巴癌，腦癌，卵巢癌，泌尿生殖器管道癌，大腸癌，肝癌，結腸直腸管道癌，胰腺癌，乳癌，前列腺癌，淋巴系統(tǒng)癌，胃癌，喉癌和肺癌，包括肺腺癌，細小細胞肺癌和/皮膚癌，如黑素瘤或非黑素瘤的皮膚癌，包括基部細胞和鱗片狀細胞的癌和牛皮癬，Behcet的綜合病癥和尋常性天皰瘡。
下面的材料和例子用于解釋發(fā)明，但不應該限于上面的構建的發(fā)明范圍?，F(xiàn)在申請公開引用的所有文獻也是通過文獻整合完整的。
序列表<110>Xigen S.A.
<120>包含Bcl-2家族蛋白中唯BH3域蛋白中BH3結構域的融合蛋白<130>CX01P002WO<140>
<141>
<150>EP 04028278.245<151>2004-11-29<160>25<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat的氨基酸序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或刪除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>1Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa1 5 10<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)..(9)<223>Xaa＝處于1-3位以及5-9位的精氨酸或賴氨酸，以及Xaa＝處于4位的非基本氨基酸<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(9)<223>氨基酸1至9是右旋氨基酸<400>2Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210>3<211>241<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述Bid的氨基酸序列(人類)(轉錄變量1)<400>3Met Cys Ser Gly Ala Gly Val Met Met Ala Arg Trp Ala Ala Arg Gly1 5 10 15Arg Ala Gly Trp Arg Ser Thr Val Arg Ile Leu Ser Pro Leu Gly His20 25 30Cys Glu Pro Gly Val Ser Arg Ser Cys Arg Ala Ala Gln Ala Met Asp35 40 45Cys Glu Val Asn Asn Gly Ser Ser Leu Arg Asp Glu Cys Ile Thr Asn50 55 60Leu Leu Val Phe Gly Phe Leu Gln Ser Cys Ser Asp Asn Ser Phe Arg65 70 75 80Arg Glu Leu Asp Ala Leu Gly His Glu Leu Pro Val Leu Ala Pro Gln85 90 95Trp Glu Gly Tyr Asp Glu Leu Gln Thr Asp Gly Asn Arg Ser Ser His100 105 110Ser Arg Leu Gly Arg Ile Glu Ala Asp Ser Glu Ser Gln Glu Asp Ile115 120 125Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp130 135 140Arg Ser Ile Pro Pro Gly Leu Val Asn Gly Leu Ala Leu Gln Leu Arg145 150 155 160Asn Thr Ser Arg Ser Glu Glu Asp Arg Asn Arg Asp Leu Ala Thr Ala165 170 175Leu Glu Gln Leu Leu Gln Ala Tyr Pro Arg Asp Met Glu Lys Glu Lys180 185 190Thr Met Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His195 200 205Thr Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile210 215 220Asn Gln Asn Leu Arg Thr Tyr Val Arg Ser Leu Ala Arg Asn Gly Met225 230 235 240Asp<210>4<211>168<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述Bad的氨基酸序列(人工序列)<400>
Met Phe Gln Ile Pro Glu Phe Glu Pro Ser Glu Gln Glu Asp Ser Ser1 5 10 15Ser Ala Glu Arg Gly Leu Gly Pro Ser Pro Ala Gly Asp Gly Pro Ser20 25 30Gly Ser Gly Lys His His Arg Gln Ala Pro Gly Leu Leu Trp Asp Ala35 40 45Ser His Gln Gln Glu Gln Pro Thr Ser Ser Ser His His Gly Gly Ala50 55 60Gly Ala Val Glu Ile Arg Ser Arg His Ser Ser Tyr Pro Ala Gly Thr65 70 75 80Glu Asp Asp Glu Gly Met Gly Glu Glu Pro Ser Pro Phe Arg Gly Arg85 90 95Ser Arg Ser Ala Pro Pro Asn Leu Trp Ala Ala Gln Arg Tyr Gly Arg00 105 110Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Val Asp Ser Phe Lys Lys Gly115 120 125Leu Pro Arg Pro Lys Ser Ala Gly Thr Ala Thr Gln Met Arg Gln Ser130 135 140Ser Ser Trp Thr Arg Val Phe Gln Ser Trp Trp Asp Arg Asn Leu Gly145 150 155 160Arg Gly Ser Ser Ala Pro Ser Gln165<210>5<211>483<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Noxal的氨基酸序列(人工序列)<400>
Met Ala Ser Leu Gly Asp Leu Val Arg Ala Trp His Leu Gly Ala Gln1 5 10 15Ala Val Asp Arg Gly Asp Trp Ala Arg Ala Leu His Leu Phe Ser Gly20 25 30Val Pro Ala Pro Pro Ala Arg Leu Cys Phe Asn Ala Gly Cys Val His35 40 45Leu Leu Ala Gly Asp Pro Glu Ala Ala Leu Arg Ala Phe Asp Gln Ala50 55 60Val Thr Lys Asp Thr Cys Met Ala Val Gly Phe Phe Gln Arg Gly Val65 70 75 80Ala Asn Phe Gln Leu Ala Arg Phe Gln Glu Ala Leu Ser Asp Phe Trp85 90 95
Leu Ala Leu Glu Gln Leu Arg Gly His Ala Ala Ile Asp Tyr Thr Gln100 105 110Leu Gly Leu Arg Phe Lys Leu Gln Ala Trp Glu Val Leu His Asn Val115 120 125Ala Ser Ala Gln Cys Gln Leu Gly Leu Trp Thr Glu Ala Ala Ser Ser130 135 140Leu Arg Glu Ala Met Ser Lys Trp Pro Glu Gly Ser Leu Asn Gly Leu145 150 155 160Asp Ser Ala Leu Asp Gln Val Gln Ar9 Arg Gly Ser Leu Pro Pro Arg165 170 175Gln Val Pro Arg Gly Glu Val Phe Arg Pro His Arg Trp His Leu Lys180 185 190His Leu Glu Pro Val Asp Phe Leu Gly Lys Ala Lys Val Val Ala Ser195 200 205Ala Ile Pro Asp Asp Gln Gly Trp Gly Val Arg Pro Gln Gln Pro Gln210 215 220Gly Pro Gly Ala Asn His Asp Ala Arg Ser Leu Ile Met Asp Ser Pro225 230 235 240Arg Ala Gly Thr His Gln Gly Pro Leu Asp Ala Glu Thr Glu Val Gly245 250 255Ala Asp Arg Cys Thr Ser Thr Ala Tyr Gln Glu Gln Arg Pro Gln Val260 265 270Glu Gln Val Gly Lys Gln Ala Pro Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Met275 280 285Gly Gly Pro Gly Pro Gly Pro Cys Glu Asp Pro Ala Gly Ala Gly Gly290 295 300Ala Gly Ala Gly Gly Ser Glu Pro Leu Val Thr Val Thr Val Gln Cys305 310 315 320Ala Phe Thr Val Ala Leu Arg Ala Arg Arg Gly Ala Asp Leu Ser Ser325 330 335Leu Arg Ala Leu Leu Gly Gln Ala Leu Pro His Gln Ala Gln Leu Gly340 345 350Gln Leu Ser Tyr Leu Ala Pro Gly Glu Asp Gly His Trp Val Pro Ile355 360 365Pro Glu Glu Glu Ser Leu Gln Arg Ala Trp Gln Asp Ala Ala Ala Cys370 375 380Pro Arg Gly Leu Gln Leu Gln Cys Arg Gly Ala Gly Gly Arg Pro Val385 390 395 400Leu Tyr Gln Val Val Ala Gln His Ser Tyr Ser Ala Gln Gly Pro Glu405 410 415Asp Leu Gly Phe Arg Gln Gly Asp Thr Val Asp Val Leu Cys Glu Glu420 425 430Pro Asp Val Pro Leu Ala Val Asp Gln Ala Trp Leu Glu Gly His Cys435 440 445Asp Gly Arg Ile Gly Ile Phe Pro Lys Cys Phe Val Val Pro Ala Gly
450 455 460Pro Arg Met Ser Gly Ala Pro Gly Arg Leu Pro Arg Ser Gln Gln Gly465 470 475 480Asp Gln Pro<210>6<211>193<212>PRT<213>人類<220>
<221>MISC_FFATURF<223>序列描述美洲獅的氨基酸序列(人工序列)<400>
Met Ala Arg Ala Arg Gln Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly1 5 10 15Leu Ala Arg Asp Gly Pro Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Val Pro20 25 30Ser Ala Val Ser Cys Gly Leu Cys Glu Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro35 40 45Ala Ala Pro Thr Leu Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Pro Thr Ala50 55 60Pro Pro Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ser Arg Trp Pro Gly Gly65 70 75 80Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gly Pro Arg Pro Asp Gly Pro Gln Pro Ser85 90 95Leu Ser Leu Ala Glu Gln His Leu Glu Ser Pro Val Pro Ser Ala Pro100 105 110Gly Ala Leu Ala Gly Gly Pro Thr Gln Ala Ala Pro Gly Val Arg Gly115 120 125Glu Glu Glu Gln Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met130 135 140Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gln Tyr Glu Arg Arg Arg Gln Glu Glu Gln145 150 155 160Gln Arg His Arg Pro Ser Pro Trp Arg Val Leu Tyr Asn Leu Ile Met165 170 175Gly Leu Leu Pro Leu Pro Arg Gly His Arg Ala Pro Glu Met Glu Pro180 185190Asn<210>7<211>198<212>PRT<213>人類<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述Bim的氨基酸序列(人類)
(轉錄變量1)<400>7Met Ala Lys Gln Pro Ser Asp Val Ser Ser Glu Cys Asp Arg Glu Gly1 5 10 15Arg Gln Leu Gln Pro Ala Glu Arg Pro Pro Gln Leu Arg Pro Gly Ala20 25 30Pro Thr Ser Leu Gln Thr Glu Pro Gln Gly Asn Pro Glu Gly Asn His35 40 45Gly Gly Glu Gly Asp Ser Cys Pro His Gly Ser Pro Gln Gly Pro Leu50 55 60Ala Pro Pro Ala Ser Pro Gly Pro Phe Ala Thr Arg Ser Pro Leu Phe65 70 75 80Ile Phe Met Arg Arg Ser Ser Leu Leu Ser Arg Ser Ser Ser Gly Tyr85 90 95Phe Ser Phe Asp Thr Asp Arg Ser Pro Ala Pro Met Ser Cys Asp Lys100105 110Ser Thr Gln Thr Pro Ser Pro Pro Cys Gln Ala Phe Asn His Tyr Leu115 120 125Ser Ala Met Ala Ser Met Arg Gln Ala Glu Pro Ala Asp Met Arg Pro130 135 140Glu Ile Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn145 150 155 160Ala Tyr Tyr Ala Arg Arg Val Phe Leu Asn Asn Tyr Gln Ala Ala Glu165 170 175Asp His Pro Arg Met Val Ile Leu Arg Leu Leu Arg Tyr Ile Val Arg180 185 190Leu Val Trp Arg Met His195<210>8<211>160<212>PRT<213>人類<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述Bik的氨基酸序列(人工序列)<400>8Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1 5 10 15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20 25 30Thr Asp Ser Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35 40 45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50 55 60
Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65 70 75 80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85 90 95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>9<211>251<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Bid的氨基酸序列(人工序列)(轉錄變量1)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或刪除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Met Cys Ser Gly Ala Gly1 5 10 15Val Met Met Ala Arg Trp Ala Ala Arg Gly Arg Ala Gly Trp Arg Ser20 25 30Thr Val Arg Ile Leu Ser Pro Leu Gly His Cys Glu Pro Gly Val Ser35 40 45Arg Ser Cys Arg Ala Ala Gln Ala Met Asp Cys Glu Val Asn Asn Gly50 55 60Ser Ser Leu Arg Asp Glu Cys Ile Thr Asn Leu Leu Val Phe Gly Phe65 70 75 80Leu Gln Ser Cys Ser Asp Asn Ser Phe Arg Arg Glu Leu Asp Ala Leu85 90 95Gly His Glu Leu Pro Val Leu Ala Pro Gln Trp Glu Gly Tyr Asp Glu100 105 110Leu Gln Thr Asp Gly Asn Arg Ser Ser His Ser Arg Leu Gly Arg Ile115 120 125Glu Ala Asp Ser Glu Ser Gln Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg
130 135 140His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser Ile Pro Pro Gly145 150 155 160Leu Val Asn Gly Leu Ala Leu Gln Leu Arg Asn Thr Ser Arg Ser Glu165 170 175Glu Asp Arg Asn Arg Asp Leu Ala Thr Ala Leu Glu Gln Leu Leu Gln180 185 190Ala Tyr Pro Arg Asp Met Glu Lys Glu Lys Thr Met Leu Val Leu Ala195 200 205Leu Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His Thr Pro Ser Leu Leu Arg210 215 220Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile Asn Gln Asn Leu Arg Thr225 230 235 240Tyr Val Arg Ser Leu Ala Arg Asn Gly Met Asp245 250<210>10<211>178<212>PRT<213>人類<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Bad的氨基酸序列(人工序列)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或刪除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>10Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Phe Gln Ile Pro Glu1 5 10 15Phe Glu Pro Ser Glu Gln Glu Asp Ser Ser Ser Ala Glu Arg Gly Leu20 25 30Gly Pro Ser Pro Ala Gly Asp Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys His His35 40 45Arg Gln Ala Pro Gly Leu Leu Trp Asp Ala Ser His Gln Gln Glu Gln50 55 60Pro Thr Ser Ser Ser His His Gly Gly Ala Gly Ala Val Glu Tle Arg65 70 75 80Ser Arg His Ser Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Glu Asp Asp Glu Gly Met85 90 95Gly Glu Glu Pro Ser Pro Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala Pro Pro100 105 110
Asn Leu Trp Ala Ala Gln Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser115 120 125Asp Glu Phe Val Asp Ser Phe Lys Lys Gly Leu Pro Arg Pro Lys Ser130 135 140Ala Gly Thr Ala Thr Gln Met Arg Gln Ser Ser Ser Trp Thr Arg Val145 150 155 160Phe Gln Ser Trp Trp Asp Arg Asn Leu Gly Arg Gly Ser Ser Ala Pro165 170 175Ser Gln<210>11<211>493<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述D-Tat-Noxal的氨基酸序列(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或刪除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>11Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ala Ser Leu Gly Asp1 5 10 15Leu Val Arg Ala Trp His Leu Gly Ala Gln Ala Val Asp Arg Gly Asp20 25 30Trp Ala Arg Ala Leu His Leu Phe Ser Gly Val Pro Ala Pro Pro Ala35 40 45Arg Leu Cys Phe Asn Ala Gly Cys Val His Leu Leu Ala Gly Asp Pro50 55 60Glu Ala Ala Leu Arg Ala Phe Asp Gln Ala Val Thr Lys Asp Thr Cys65 70 75 80Met Ala Val Gly Phe Phe Gln Arg Gly Val Ala Asn Phe Gln Leu Ala85 90 95Arg Phe Gln Glu Ala Leu Ser Asp Phe Trp Leu Ala Leu Glu Gln Leu100 105 110Arg Gly His Ala Ala Ile Asp Tyr Thr Gln Leu Gly Leu Arg Phe Lys115 120 125Leu Gln Ala Trp Glu Val Leu His Asn Val Ala Ser Ala Gln Cys Gln130 135 140Leu Gly Leu Trp Thr Glu Ala Ala Ser Ser Leu Arg Glu Ala Met Ser145 150 155 160
Lys Trp Pro Glu Gly Ser Leu Asn Gly Leu Asp Ser Ala Leu Asp Gln165 170 175Val Gln Arg Arg Gly Ser Leu Pro Pro Arg Gln Val Pro Arg Gly Glu180 185 190Val Phe Arg Pro His Arg Trp His Leu Lys His Leu Glu Pro Val Asp195 200 205Phe Leu Gly Lys Ala Lys Val Val Ala Ser Ala Ile Pro Asp Asp Gln210 215 220Gly Trp Gly Val Arg Pro Gln Gln Pro Gln Gly Pro Gly Ala Asn His225 230 235 240Asp Ala Arg Ser Leu Tle Met Asp Ser Pro Arg Ala Gly Thr His Gln245 250 255Gly Pro Leu Asp Ala Glu Thr Glu Val Gly Ala Asp Arg Cys Thr Ser260 265 270Thr Ala Tyr Gln Glu Gln Arg Pro Gln Val Glu Gln Val Gly Lys Gln275 280 285Ala Pro Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Met Gly Gly Pro Gly Pro Gly290 295 300Pro Cys Glu Asp Pro Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ser305 310 315 320Glu Pro Leu Val Thr Val Thr Val Gln Cys Ala Phe Thr Val Ala Leu325 330 335Arg Ala Arg Arg Gly Ala Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ala Leu Leu Gly340 345 350Gln Ala Leu Pro His Gln Ala Gln Leu Gly Gln Leu Ser Tyr Leu Ala355 360 365Pro Gly Glu Asp Gly His Trp Val Pro Ile Pro Glu Glu Glu Ser Leu370 375 380Gln Arg Ala Trp Gln Asp Ala Ala Ala Cys Pro Arg Gly Leu Gln Leu385 390 395 400Gln Cys Arg Gly Ala Gly Gly Arg Pro Val Leu Tyr Gln Val Val Ala405 410 415Gln His Ser Tyr Ser Ala Gln Gly Pro Glu Asp Leu Gly Phe Arg Gln420 425 430Gly Asp Thr Val Asp Val Leu Cys Glu Glu Pro Asp Val Pro Leu Ala435 440 445Val Asp Gln Ala Trp Leu Glu Gly His Cys Asp Gly Arg Tle Gly Ile450 455 460Phe Pro Lys Cys Phe Val Val Pro Ala Gly Pro Arg Met Ser Gly Ala465 470 475 480Pro Gly Arg Leu Pro Arg Ser Gln Gln Gly Asp Gln Pro485 490<210>12<211>203<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Puma的氨基酸序列(人工序列)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或刪除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ala Arg Ala Arg Gln1 5 10 15Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly Leu Ala Arg Asp Gly Pro20 25 30Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Val Pro Ser Ala Val Ser Cys Gly35 40 45Leu Cys Glu Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Thr Leu Leu50 55 60Pro Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Pro Thr Ala Pro Pro Ala Val Thr Ala65 70 75 80Ala Leu Gly Gly Ser Arg Trp Pro Gly Gly Pro Arg Ser Arg Pro Arg85 90 95Gly Pro Arg Pro Asp Gly Pro Gln Pro Ser Leu Ser Leu Ala Glu Gln100 105 110His Leu Glu Ser Pro Val Pro Ser Ala Pro Gly Ala Leu Ala Gly Gly115 120 125Pro Thr Gln Ala Ala Pro Gly Val Arg Gly Glu Glu Glu Gln Trp Ala130 135 140Arg Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met Ala Asp Asp Leu Asn Ala145 150 155 160Gln Tyr Glu Arg Arg Arg Gln Glu Glu Gln Gln Arg His Arg Pro Ser165 170 175Pro Trp Arg Val Leu Tyr Asn Leu Ile Met Gly Leu Leu Pro Leu Pro180 185 190Arg Gly His Arg Ala Pro Glu Met Glu Pro Asn195 200<210>13<211>208<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Bim的氨基酸序列(人工序列)
轉錄變量1<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或刪除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ala Lys Gln Pro Ser1 5 10 15Asp Val Ser Ser Glu Cys Asp Arg Glu Gly Arg Gln Leu Gln Pro Ala20 25 30Glu Arg Pro Pro Gln Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Ser Leu Gln Thr35 40 45Glu Pro Gln Gly Asn Pro Glu Gly Asn His Gly Gly Glu Gly Asp Ser50 55 60Cys Pro His Gly Ser Pro Gln Gly Pro Leu Ala Pro Pro Ala Ser Pro65 70 75 80Gly Pro Phe Ala Thr Arg Ser Pro Leu Phe Ile Phe Met Arg Arg Ser85 90 95Ser Leu Leu Ser Arg Ser Ser Ser Gly Tyr Phe Ser Phe Asp Thr Asp100 105 110Arg Ser Pro Ala Pro Met Ser Cys Asp Lys Ser Thr Gln Thr Pro Ser115 120 125Pro Pro Cys Gln Ala Phe Asn His Tyr Leu Ser Ala Met Ala Ser Met130 135 140Arg Gln Ala Glu Pro Ala Asp Met Arg Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gln145 150 155 160Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn Ala Tyr Tyr Ala Arg Arg165 170 175Val Phe Leu Asn Asn Tyr Gln Ala Ala Glu Asp His Pro Arg Met Val180 185 190Ile Leu Arg Leu Leu Arg Tyr Ile Val Arg Leu Val Trp Arg Met His195 200 205<210>14<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Noxal的氨基酸序列(人工序列)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或刪除
<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ser Glu Val Arg Pro1 5 10 15Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Gln Leu Leu20 25 30Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met Thr Asp Ser Glu Glu Asp35 40 45Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu Glu Cys Met Glu Gly Ser50 55 60Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val65 70 75 80Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu Ser Glu Val Ala Met His85 90 95Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln Thr Glu Asp Ile Arg Asp100 105 110Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr Thr Leu Lys Glu Asn Ile115 120 125Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly Ser Trp Val Ser Cys Glu130 135 140Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Leu145 150 155 160Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys165 170<210>15<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bik的BH3域的原始L型氨基酸序列<400>15Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser1 5 10 15Leu Arg<210>16<211>18<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bak的BH3域的原始L型氨基酸序列<400>16Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Val Asp Ser1 5 10 15Phe Lys<210>17<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bid的BH3域的原始L型氨基酸序列<400>17Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser1 5 10 15Ile Pro<210>18<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bmf的BH3域的原始左旋氨基酸序列<400>18Gln Ile Ala Arg Lys Leu Gln Cys Ile Ala Asp Gln Phe His Arg Leu1 5 10 15His Val<210>19<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述DP5Hrk的BH3域的原始L型氨基酸序列
<400>19Leu Thr Ala Ala Arg Leu Lys Ala Ile Gly Asp Glu Leu His Gln Arg1 5 10 15Thr Met<210>20<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bim的BH3域的原始左旋氨基酸序列<400>20Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn Ala Tyr1 5 10 15Tyr Ala<210>21<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>Description of sequencenative L-amino acid sequence of theBH3-domain of Noxa(Noxa BH3)<400>序列描述Noxal的BH3域的原始左旋氨基酸序列Glu Cys Ala Thr Gln Leu Arg Arg Phe Gly Asp Lys Leu Asn Phe Arg1 5 10 15Gln Lys<210>22<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Puma的BH3域的原始左旋氨基酸序列<400>22
Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gln1 5 10 15Tyr Glu<210>23<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bax的BH3域的原始左旋氨基酸序列<400>23Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn1 5 10 15Met Glu<210>24<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bak的BH3域的原始L型氨基酸序列<400>24Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg1 5 10 15Tyr Asp<210>25<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bok的BH3域的原始左旋氨基酸序列Glu Val Cys Thr Val Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu Gln Ile1 5 10 15Arg Pro
權利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，其包含至少一個第一部分(I)和至少一個第二部分(II)，所述第一部分(I)包含一個載體序列，所述第二部分(II)包含唯BH3域蛋白中BH3結構域序列的部分或者全長，所述融合蛋白在其第一部分(I)中包含一個逆序的右旋氨基酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述至少一個第一部分(I)和至少一個第二部分(II)通過共價鍵相連。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一部分(I)包含一個載體序列，所述載體序列能夠?qū)⑺鋈诤系鞍滓龑е链_定的細胞位置。
4.根據(jù)權利要求1至3中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一部分(I)包含一個載體序列，所述載體序列能夠增強細胞滲透性從而增強融合蛋白的細胞攝取性能。
5.根據(jù)權利要求1至4中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一部分(I)包含一個載體序列，所述載體序列是人類免疫缺陷病毒TAT蛋白中的一個D-TAT序列。
6.根據(jù)權利要求1至5中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一部分(I)包含一個氨基酸序列，所述氨基酸序列為圖1A所示的氨基酸序列(D-TAT的氨基酸序列RRRQRRKKRG)，或者為圖1B所示的氨基酸序列(D-TAT的同屬氨基酸序列Xn-RRRQRRKKR-Xn)。
7.根據(jù)權利要求1至6中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全長的BH3結構域序列，能夠誘導細胞凋亡。
8.根據(jù)權利要求1至7中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全長的BH3結構域序列，其與至少一個Bc1-2家族蛋白相結合。
9.根據(jù)權利要求1至8中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全長的BH3結構域序列，其用于激活或者敏化所述Bcl-2家族蛋白的至少一個促凋亡蛋白。
10.根據(jù)權利要求1至9中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全長的BH3結構域序列，其來自于一個唯BH3域蛋白，所述唯BH3域蛋白選自包含Bid、Bad、Noxa、Puma、Bim、Bik、Bmf、DP5/Hrk和Bok的族群。
11.根據(jù)權利要求1至10中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全長的BH3結構域序列，其以由左旋氨基酸所組成的形式存在，或者以由右旋氨基酸所組成的形式存在。
12.根據(jù)權利要求1至11中任一權利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含如圖2A、2B、2C、2D、2E、2F所示的氨基酸序列(Bid、Bad、Noxa、Puma、Bim和Bik的氨基酸序列)，或其一個包含部分或者全長的BH3結構域序列的片段。
13.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含如權利要求1至12中任一權利要求所述的融合蛋白，以及可選地包括可生理接收的載體、佐劑和/或賦形劑。
14.利用如權利要求1至12中任一權利要求所述的融合蛋白治療和/或預防由缺陷性細胞凋亡導致的疾病，如癌癥，所述癌癥包括霍杰金淋巴瘤、非霍杰金淋巴瘤、組織細胞淋巴瘤、腦瘤(成膠質(zhì)細胞瘤)、卵巢癌、泌尿生殖器癌癥、結腸癌、肝癌、直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、胃癌、喉癌和肺癌，所述肺癌包括肺腺癌和小型細胞肺癌，和/或皮膚癌，例如黑素瘤或者非黑素瘤的皮膚癌癥，包括基底細胞瘤和扁平細胞癌，以及牛皮癬、白塞氏病、尋常性天皰瘡。
15.利用如權利要求1至12中任一權利要求所述的融合蛋白，制備用于治療和/或預防由缺陷性細胞凋亡導致的疾病如癌癥的藥物組合物，所述癌癥包括霍杰金淋巴瘤、非霍杰金淋巴瘤、組織細胞淋巴瘤、腦瘤(成膠質(zhì)細胞瘤)、卵巢癌、泌尿生殖器癌癥、結腸癌、肝癌、直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、胃癌、喉癌和肺癌，所述肺癌包括肺腺癌和小型細胞肺癌，和/或皮膚癌，例如黑素瘤或者非黑素瘤的皮膚癌癥，包括基底細胞瘤和扁平細胞癌，以及牛皮癬、白塞氏病、尋常性天皰瘡。
全文摘要
本發(fā)明涉及融合蛋白，其包括至少一個第一部分(I)和至少一個第二部分(II)，所述第一部分(I)包含一個載體序列，所述第二部分(II)包含唯BH3域蛋白中BH3結構域序列的部分或全長，所述融合蛋白在其第一部分(I)中包含一個逆序的右旋氨基酸。此外，本發(fā)明還涉及包含所述融合蛋白的藥物組合物及其用途。
文檔編號A61K38/17GK101068832SQ200580040812
公開日2007年11月7日 申請日期2005年11月18日 優(yōu)先權日2004年11月29日
發(fā)明者克里斯托夫·邦尼, 迪迪爾·科夸茲 申請人:希根有限責任公司