專利名稱：：包含抗原和佐劑的納米顆粒，和免疫原性結(jié)構(gòu)的制作方法包含抗原和佐劑的納米顆粒，和免疫原性結(jié)構(gòu)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及納米顆粒，更特別地涉及包含佐劑和抗原的納米顆粒，抗原如肺瘤和病原體抗原，以及它們在一系列應(yīng)用中的用途。本發(fā)明進一步涉及帶有糖類配體的免疫原性結(jié)構(gòu)，以及它們用于治療和預(yù)防目的的用途，和用于分離和檢測對抗該糖類結(jié)構(gòu)的抗體的用途。發(fā)明背景糖類和肽抗原直接注射給患者時缺乏免疫原性大大妨礙了它們在疫苗中的應(yīng)用。這種抗原單獨注射時常常被抗原呈遞細胞(APCs)忽略，被迅速清除并且不誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在大多數(shù)情況下，將該抗原與佐劑結(jié)合給予仍是必需的。佐劑可以是單純的遞送系統(tǒng)如脂質(zhì)體，其緩慢清除抗原并使其更可能到達并被APCs接受。然而，這實質(zhì)上不是很有效并且通常需要與刺激免疫系統(tǒng)的試劑結(jié)合，如刺激細胞因子形成的細菌產(chǎn)物。細胞因子本身也可以共同給予。這些產(chǎn)品中的許多毒性太大或太具實驗性而不能應(yīng)用于人類，而且最有效的佐劑還未被批準(zhǔn)用于人類?？梢杂糜谌祟惖拇蠖鄶?shù)佐劑的有效性是有限的。尋找適于人類使用的有效佐劑是一項持久挑戰(zhàn)。糖類抗原免疫原性特別弱，因為它們僅可以刺激B細胞反應(yīng)，不能刺激T細胞反應(yīng)。這通常通過將糖類與蛋白載體結(jié)合來達到。然而，為了增強免疫反應(yīng)，使用佐劑仍是必需的。糖類抗原是用于抗癌免疫療法的潛在目標(biāo)，因為它們暴露于腫瘤細胞表面但是隱藏在正常細胞上。許多細菌及其他病原體也因糖類抗原而區(qū)別，如果糖類免疫原性不是如此弱的話，其是用于疫苗的好目標(biāo)。因此改善糖類抗原的免疫原性將應(yīng)用于多種治療領(lǐng)域。癌細胞通常以異常方式被糖基化，是將它們與正常細胞區(qū)分開來的特征。(GlycoconjugateJ.(1997)，14:569;Adv.CancerRes.(1989)，52:257;CancerRes.(1996)，56:5309)。在大多數(shù)情況下，異常糖基化以糖蛋白和糖脂形式存在于細胞表面。因此這些改變的糖類結(jié)構(gòu)可以被稱作腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，其常常不存在于正常細胞上。在很多情況下，細胞不顯示出同種糖基化，即，細胞表面上存在復(fù)合聚糖鏈的不同糖形式(Annu.Rev.Biochem.(1988)，57:785)。在大多數(shù)改變的胂瘤相關(guān)抗原的發(fā)現(xiàn)和隨后表征的過程中，研究表明它們對于癌細胞具有重要作用。例如，腫瘤相關(guān)抗原能夠使退化細胞顯示出惡性表型的特征性性質(zhì)，如粘附能力增加，所述粘附在建立轉(zhuǎn)移中起重要作用。然而，這種抗原在某些階段也可以在正常細胞中表達，在那里它們負(fù)責(zé)這些細胞的正常功能。因此，腫瘤相關(guān)抗原是主要由腫瘤細胞呈遞的結(jié)構(gòu)，通常在細胞膜上或膜中，這允許它們與非惡性組織區(qū)分開。胂瘤相關(guān)抗原可以是例如多肽，特別是糖基化蛋白，或糖基化形式的多肽?？梢源砟[瘤相關(guān)抗原的其他結(jié)構(gòu)包括糖脂，例如神經(jīng)節(jié)苷脂如GM2。這種腫瘤相關(guān)抗原可以表現(xiàn)為細胞膜脂類成分的改變，其可能是癌細胞的特征。腫瘤相關(guān)抗原包括下列實例。N-CAM(神經(jīng)細胞粘附分子)，其常常在神經(jīng)起源的腫瘤上表達并且引起同嗜性粘著(J.CellBiol.118(1992),937)。LewisY糖類抗原，其存在于大多數(shù)上皮起源的腫瘤上，但是其在上皮組織的胎兒發(fā)育中也起重要作用。已經(jīng)表明這個抗原在肺癌中的表達與預(yù)后不良有緊密關(guān)聯(lián)，因為LewisY陽性癌細胞顯然具有較高的轉(zhuǎn)移潛力(N.Engl.J.Med.327(1992)，14)。CEA(癌胚抗原)，其常常存在于胃腸道的上皮腫瘤中，并且已被鑒定為自粘分子(Cell57(1989),327)。Ep-CAM(上皮細胞粘附分子)，其在幾乎所有上皮起源的腫瘤上表達，但是其還存在于許多正常上皮上。它已被表征為自粘分子(self-adhesionmolecule)并且因此可以被分類為全上皮(pan-epithelial)粘附抗原(J.CellBiol.125(1994)，437)。腫瘤相關(guān)抗原的更多實例是SialylTn糖類，Lewis抗原(Lewis-x、Lewis-b、Lewisy-結(jié)構(gòu))、GloboH糖類、神經(jīng)節(jié)苷脂如GD2/GD3/GM2、前列腺特異性抗原(PSA)、CA125、CA19-9、CA15-3、TAG-72、EGF受體、Her2/Neu受體、p97、CD20和CD21。對抗所有這些抗原的單克隆抗體是可以獲得的。腫瘤相關(guān)抗原的實例在DeVUaetal.(Eds.，"BiologicalTherapyofCancer",2.Edition,Chapter3:BiologyofTumorAntigens,LippincottCompany,ISBN0-397-51416-6(1995)，(Elektrophoresis(1999)，20:362;Curr.PharmaceuticalDesign(2000)，6:485，Neoplasma(1996)，43:285))中描述。癌癥的治療方法有多種，然而目前治療方案的成功率仍待提高。除手術(shù)和化療之外，還已知免疫療法。在被動免疫療法中，單克隆抗體(MAbs)以適當(dāng)?shù)牧咳斫o予患者，直接與靶結(jié)合。治療的目的是形成免疫復(fù)合物，通過一系列免疫反應(yīng)，具有該靶的細胞或生物被消滅。治療作用依賴于循環(huán)中MAbs的濃度和它們的生物半衰期，其生物半衰期通常相當(dāng)短。因此在適當(dāng)?shù)囊欢螘r間內(nèi)重復(fù)給藥是必需的。如果使用異種MAbs，如鼠科動物抗體，可能發(fā)生不良反應(yīng)，可能導(dǎo)致過敏性休克。由于這個缺點，這種免疫療法僅被采用了有限的一段時間。主動免疫方式以不同方法激活患者的免疫系統(tǒng)。給予類似于具體靶的抗原后，患者的體液和T細胞特異性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)防御機制，與體內(nèi)該靶作斗爭。各種類型的和抗各種不同疾病的疫苗抗原是本領(lǐng)域熟知的。例如，使用含有乙型肝炎表面抗原的疫苗接種抗乙型肝炎是大家熟知的。已經(jīng)表明用于接種的高劑量范圍抗原以及小劑量接種可以提供充分的血清轉(zhuǎn)化率(ParishD.C.etal.，1991，SouthernMedicalJournal,84，426-430;GoudeauA.etal.，1984，TheLancet,10，1091-1092)。也已知甘露聚糖-粘蛋白融合蛋白質(zhì)并且可以用于產(chǎn)生細胞毒性T細胞。已經(jīng)表明依靠給予小鼠的融合蛋白劑量，幾乎可以僅誘導(dǎo)細胞免疫(低劑量)，僅誘導(dǎo)體液免疫(高劑量)(PieterszG.A.etal.，1998，CancerImmunol.Immunother.，45，321-326).對于主動免疫，抗原通常存在于免疫原性制劑中以提供疫苗。模擬該靼的抗原與該靼或其片段的一級或二級序列具有相似性。然而模擬表位(mimotope)或模擬表位抗原與該靶的三級結(jié)構(gòu)具有相似性。盡管已經(jīng)開發(fā)了許多用于治療癌癥的產(chǎn)品，但是仍非常需要提供與已知物質(zhì)相比特性改善的物質(zhì)。特別是，在接種疫苗方面，需要高免疫原性、易于重復(fù)和卓有成效，但是不引起嚴(yán)重副作用的產(chǎn)品。W002/32404(ConsejoSuperiordeInvestigacionesScientificas)公開了由金屬或半導(dǎo)體原子形成的納米顆粒，其中包含糖類的配體與納米顆粒核心共價連接。這些納米顆粒用于調(diào)節(jié)糖類介導(dǎo)的相互作用并且是可溶和無毒的。要求GB-A-0313259.4(ConsejoSuperiordeInvestigacionesScientificasandMidatechLimited)的優(yōu)先權(quán)的PCT申請公開了磁性納米顆粒，其具有包含惰性和磁性金屬原子的核心，該核心與配體共價連接。GB申請0411537.4(ConsejoSuperiordeInvestigacionesScientificasandMidatechLimited)公開了納米顆粒，其包括與RNA配體結(jié)合的磁性納米顆粒，特別是siRNA酉己^。發(fā)明概述本發(fā)明寬泛涉及包含佐劑和抗原的納米顆粒，和帶有糖類配體的免疫原性結(jié)構(gòu)。在一個方面，本發(fā)明提供了可以用于治療各種疾病的改善的免疫原性結(jié)構(gòu)，特別是在癌癥預(yù)防和治療中用于接種目的。因此，本發(fā)明提供了免疫原性結(jié)構(gòu)，其由與糖類配體共價連接的核心分子和至少一個T細胞輔助肽配體組成。在另一方面，本發(fā)明提供了免疫原性結(jié)構(gòu)，其由與多個糖類配體共價連接的核心分子組成，其中糖類配體包含至少一個新表位(neoepitope)結(jié)構(gòu)。核心分子可以是抗體或其衍生物或片段?？晒┻x擇地，核心分子也可以是由金屬或半導(dǎo)體原子核心組成的納米顆粒，如本文進一步描述。例如，金屬核心可以包括Au、Ag、Cu、Pd或Al。W002/32404和Crespoetal，PhysicalReviewLetters,93(8):87204-14，2004中詳細描述了納米顆粒及其制備。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性結(jié)構(gòu)可以是任何糖類配體。例如，在優(yōu)選實施方案中，它可以與基于糖類的肺瘤相關(guān)抗原顯示出結(jié)構(gòu)或功能相似性，如Lewis抗原，唾液酸或非唾液酸化，或SialylTn或非唾液酸化的Tn或甚至上述背景部分論述的任何腫瘤相關(guān)抗原。單個糖類配體可能也包含新表位結(jié)構(gòu)。新表位可以由細胞表面蛋白的抗原的糖基化形成。糖類結(jié)構(gòu)很少作為單個分子位于腫瘤細胞上，而是主要以由多個糖類結(jié)構(gòu)組成的簇存在。這些簇可以形成新表位，其中單個配體不介導(dǎo)抗體結(jié)合和腫瘤細胞的破壞，但是糖類簇識別的結(jié)果是有效的免疫反應(yīng)?？梢酝ㄟ^使用多個糖類配體以致呈現(xiàn)高密度的大量配體來設(shè)計和模擬腫瘤細胞上存在的糖類簇。這些配體可以與核心分子緊密連接并模仿簇，即腫瘤細胞上呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。例如，抗體可以與肺瘤細胞上異常糖基化結(jié)構(gòu)結(jié)合，但是不能與表面結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)的單個糖類配體結(jié)合。因此來源于這些糖蛋白的糖類配體任選與異常糖基化的其它抗原的創(chuàng)造性組合成為可能并可以產(chǎn)生新表位結(jié)構(gòu)。通過以異常糖基化靶進行免疫治療，以這個異常糖基化為特征的幾乎全部肺瘤特異性受體可被阻斷。它們當(dāng)中是，例如EGF-受體家族的全部受體、CD55(791Tgp72/DAF-衰變加速因子)受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和P-糖蛋白。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對抗異常糖基化的免疫原性結(jié)構(gòu)以功能性方式與EGF受體家族的幾個受體結(jié)合，因此誘導(dǎo)細胞生長的信號級聯(lián)可以有效地被阻斷。因此分別阻止或降低了生長因子與受體的結(jié)合。這種治療與使用抗EGF受體細胞外蛋白部分的抗體的免疫療法相比更特異，因為正常細胞EGF受體上未找到罕有的肺瘤相關(guān)糖類結(jié)構(gòu)。另一方面，這種治療更通用，因為具有相同異常糖基化的不同受體可被同時阻斷。通過使用對抗異常糖基化的免疫療法，也可能阻止或降低EGF或調(diào)蛋白對癌細胞的促有絲分裂刺激。抗體與腫瘤相關(guān)糖基化的癌細胞的特異性結(jié)合阻斷了生長因子受體與其生理配體的相互作用并抑制經(jīng)由這些受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和因此抑制細胞發(fā)育。同時，這種抗體可以通過其體液和細胞免疫系統(tǒng)內(nèi)的作用特異性攻擊腫瘤細胞。根據(jù)本發(fā)明，分別表達EGF受體或EGF受體家族的受體的腫瘤細胞被特異性結(jié)合并可以被裂解或生長被阻斷。已經(jīng)將以新表位的靶進行的免疫療法改善，其不影響正常組織的上皮細胞，而僅影響腫瘤細胞。這種新表位的實例是由EpCAM蛋白或Her-2/neu受體與LewisY糖類或適當(dāng)唾液酸化的糖蛋白糖基化形成的表位。當(dāng)生產(chǎn)和制備對這些新表位特異性的抗體時，優(yōu)選它們不與去糖基化的蛋白結(jié)合，也不與結(jié)構(gòu)不同的蛋白上的糖基序結(jié)合。優(yōu)選建議這些抗體作為被動免疫療法的單克隆抗體，以便避免非特異性相互作用和副作用。新表位的鑒定也可以成為接種抗原的開發(fā)基礎(chǔ)，即只呈遞具有該表位的免疫原。這個表位或表位模擬物可以從適當(dāng)?shù)碾奈膸旎蛲ㄟ^抗獨特型抗體技術(shù)容易地產(chǎn)生，或可以作為天然存在抗原的衍生物，例如片段。根據(jù)選擇的新表位，可以獲得恰具有這個新表位或其模擬物的抗原制劑，模擬物例如抗獨特型抗體、模擬表位。這種抗原制劑是用于癌癥患者主動免疫的有價值的活性物質(zhì)，或它們也可以用作診斷制劑。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性結(jié)構(gòu)可以是來源于類毒素例如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素或匙孔血藍蛋白的T細胞輔助肽配體。該配體可以是不同長度，例如長度5至50個氨基酸，或者5至30個氨基酸或5至20個氨基酸。使用與免疫原性結(jié)構(gòu)連接的免疫原性肽，當(dāng)注射給個體時，可以增長免疫原性。例如，氨基酸序列可以是FKLQTMVKLFNRIKNNVA(SEQIDNo.1)。本發(fā)明還包括包含一種或多種免疫原性結(jié)構(gòu)的組合物，用于制備預(yù)防或治療癌癥的藥物。該治療可以是如下進一步討論的主動或^皮動免疫療法。此外，本發(fā)明公開的免疫原性結(jié)構(gòu)用于分離適于檢測和分離肺瘤細月包的抗體的應(yīng)用也可以實施。對于術(shù)語抗體、其衍生物或片段，應(yīng)理解為所有類型的抗體，尤其是單特異性和多特異性單克隆抗體，或還有化學(xué)、生物化學(xué)或分子生物學(xué)上制備的抗體，或具有一定特異性的多克隆抗體，例如免疫血清或免疫血清的級分。根據(jù)發(fā)明使用的抗體優(yōu)選是天然的，即具有功能活性的抗體。優(yōu)選這個抗體不具有連接的標(biāo)記或其他檢測試劑，以便不損害它的功能。天然抗體具有患者中自然存在的抗體的性質(zhì)。天然抗體是異四聚體糖蛋白，其由兩個相同輕鏈和兩個相同重鏈組成。然而也可以使用抗體衍生物，優(yōu)選其選自抗體片段、綴合物、同源物或衍生物，或具有另外的效應(yīng)器作用的復(fù)合物。無論如何，優(yōu)選抗體衍生物含有Fab片段的至少一部分，優(yōu)選連同F(xiàn)(ab02片段的至少一部分和/或絞鏈區(qū)的一部分和/或入或k抗體的Fc部分。此外，根據(jù)本發(fā)明還可以使用單鏈抗體衍生物，如所謂的單鏈抗體。根據(jù)本發(fā)明使用的抗體優(yōu)選是免疫球蛋白類型，如IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。術(shù)語金屬或半導(dǎo)體原子的納米顆粒簇包括適于作為固定配體或多個配體的基底，該配體包含糖類基團。合適的納米顆粒在例如WO02/32404和CrespoR.etal.(PhysicalReviewUtters,2004，93,8pp87204-1-4)中描述，并在下面進一步討論。在使用金簇的情況下，通?？梢允褂?0至500個金原子提供納米范圍內(nèi)的核心直徑。例如，核心直徑可以在50至500nm、50至250nm、50至150nffl之間。配體與顆粒核心共價連接。實施這個步驟的方案是本領(lǐng)域熟知的，共價結(jié)合可以例如通過巰基進行。糖類配體也可以與抗體連接在一起。為了得到具有多個結(jié)合的配體的抗體，可以使用含有高密度活性基團的分支接頭。這些接頭可以結(jié)合多個糖類配體，該配體然后可以作為簇結(jié)構(gòu)定位于抗體上。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性結(jié)構(gòu)可以用于制備預(yù)防和治療疾病象癌癥的藥物。這個藥物制劑可以用于免疫療法。在另一方面，本發(fā)明涉及納米顆粒，其具有包括金屬和/或半導(dǎo)體原子的核心，該核心與抗原配體連接。該配體典型地是糖類或肽抗原。該納米顆?？捎糜谶f送抗原并應(yīng)用于各種應(yīng)用，特別是作為疫苗用在治療應(yīng)用中。在優(yōu)選實施方案中，納米顆粒還可以與佐劑連接，例如刺激先天免疫系統(tǒng)的T輔助刺激肽或糖類。這個遞送系統(tǒng)有幾個優(yōu)于現(xiàn)有方法的優(yōu)點。該納米顆粒本身可以通過阻止抗原的破壞或清除以及通過提供顆粒形式的抗原來提高對抗原的免疫反應(yīng)。在使用另外佐劑的情況下，本發(fā)明允許使用單一遞送載體以遞送抗原和佐劑二者，或多種抗原或佐劑。該納米顆粒尺寸小，小至足以被細胞吸收并允許抗原被呈遞到細胞表面上。在T輔助肽也與納米顆粒綴合的情況下，T輔助肽也可能被呈遞。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了納米顆粒，其包含包括金屬和/或半導(dǎo)體原子的核心，其中核心與多個配體共價連接，配體包括抗原配體。在優(yōu)選實施方案中，配體還包括佐劑。該抗原可以是例如肽或糖類。在優(yōu)選實施方案中，抗原是腫瘤特異性抗原。優(yōu)選的糖類腫瘤抗原包括SialylTn(STn)、SialylLewisa(Lea)、SialylLewisx(Lex)或SialylLewisy(Ley)及其非唾液酸化形式。在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗原是病原體特異性抗原，如細菌、病毒或寄生蟲抗原。例如，可以4吏用HIV抗原Manalphal-2Man或寄生蟲抗原Galalpha1-3Gal。胞，如T細胞，尤其是T輔助細胞。該佐劑可以是糖類部分或肽部分。優(yōu)選的糖類部分包括葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和/或N-乙酰葡糖胺。優(yōu)選的肽部分包括活化T輔助細胞的肽，如來自細菌毒素的免疫原性肽。特別優(yōu)選的肽部分包含氨基酸序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA(SEQIDNo.1)。優(yōu)選，本發(fā)明的納米顆粒是水溶性的。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒具有平均直徑在0.5至lOnm的核心，更優(yōu)選1至2.5nm。優(yōu)選，包括它們的配體的納米顆粒具有10至30nm的平均直徑。除抗原和佐劑之外，納米顆?？梢园ㄒ环N或更多類型的配體。例如，另外的配體或配體基團或結(jié)構(gòu)域可以包括一個或多個肽、蛋白結(jié)構(gòu)域、核酸分子、脂類基團、糖類基團、任何有機或陰離子或陽離子基團。糖類基團可以是多糖、寡糖或單糖基團。優(yōu)選的配體包括糖綴合物，因此形成糖納米顆粒。在存在核酸分子的情況下，核酸分子可以包括單或雙鏈DNA或RNA。在特別優(yōu)選的實施方案中，該納米顆粒包括膜轉(zhuǎn)位信號，輔助它們滲透通過細胞膜。該顆粒可以具有固定于其上的一個以上種類的配體，例如2、3、4、5、10、20或IOO種不同的配體?？晒┻x擇地或另外地，多個不同類型的納米顆?？梢砸黄鹗褂谩Ｔ趦?yōu)選實施方案中，與顆粒的單個金屬核心相連的總配體的平均數(shù)量是至少一個配體，更優(yōu)選50個配體，和最優(yōu)選60個配體。該納米顆粒還可以包含標(biāo)記，如熒光基團、放射性核素、磁性標(biāo)記、染料、NMR活性原子或使用表面等離子體共振能夠檢測的原子。優(yōu)選的磁性標(biāo)記包括順磁基團，包括Mif2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3或鑭系元素+3。優(yōu)選的NMR活性原子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe"或鑭系元素+3。納米顆粒的核心可以是金屬核心。優(yōu)選，該金屬核心包括Au、Ag或Cu，例如選自Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd的合金。在一些實施方案中，納米顆粒的核心是磁性的。優(yōu)選的磁性納米顆粒核心可以包括惰性(passive)金屬原子和磁性金屬原子，其在核心中的比率是大約5:0.1至大約2:5。該惰性金屬可以是例如金、鉑、銀或銅，和磁性金屬是鐵或鈷。在另一個方面，本發(fā)明提供了包括如本文所述的一種或多種納米顆粒的群體的組合物。在一些實施方案中，納米顆粒的群體可以具有與核心連接的不同密度的相同或不同配體。有些情況下，可能需要包封納米顆粒，使多個納米顆粒能夠遞送至目標(biāo)部位。合適的包封技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。納米顆粒的包封群體可以是一個、兩個、三個或許多不同類型。在優(yōu)選實施方案中，該組合物包括納米顆粒和藥物可接受載體。在更多方面，本發(fā)明提供了制備如本文所述的納米顆粒的方法。方<更地，該方法包括將配體與納米顆粒核心綴合，通過將配體4汴生接頭和將衍生的配體包括在合成納米顆粒核心的反應(yīng)混合物中。在自我裝配納米顆粒過程中，納米顆粒核心通過接頭與配體連接。該接頭可以包括巰基、烷基、二醇基或肽基團。示例的接頭基團由通式H0-(CH2)n-S-S-(CH2)fOH表示，其中n和m獨立地是l至5。當(dāng)合成了納米顆粒時，分裂-S-S-接頭以形成兩個含硫的接頭，其每一個允許通過-S-基與納米顆粒核心共價連接。在優(yōu)選實施方案中，接頭基團包括C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、CIO、Cll、C12、C13或C15烷基和/或C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、CIO、Cll、C12、C13或C15二醇基。該接頭可以是混合接頭，例如六甘醇-Cll烷基。不同的接頭可以控制肽是被釋放還是保持與納米顆粒連接。例如，在本文描述的BMIX和BC11肽的情況下，該肽的前兩個殘基是FK，其是組織蛋白酶的切割位點。如果這距離納米顆粒足夠遠(使用間隔物)，可以釋》丈T輔助肽LQTMVKLFNRIKNNVA(SEQIDNO:2)用于細胞內(nèi)力口工。在一個實施方案中，可以使用W002/32404中首先描述的方案合成具有包括金原子的核心的納米顆粒，其中使用二硫化物接頭將配體衍生，所衍生配體與HAuCL(四氯金酸)在還原劑存在下反應(yīng)來制備納米顆粒。在這個方法中，處于甲醇或水中的二硫化物保護的配體可以添加到四氯金酸水溶液中。優(yōu)選的還原劑是硼氫化鈉。該方法的這個及其他特征在W002/32404中描述。在另一個方面，本發(fā)明還提供了本文描述的納米顆粒用于預(yù)防或治標(biāo)治療。尤其是，該納米顆?？梢杂米饕呙?。在一個方面，本發(fā)明提供了上面限定的納米顆粒用于制備治療由給予該納米顆粒所改善的病癥的藥物的用途。例如，本文描述的納米顆粒或它們的衍生物可以配制為藥物組合物，并以各種形式給予患者，尤其是治療由給予抗原所改善的病癥。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的納米顆粒在制備治療癌癥的藥物中的用途。癌癥可以是例如結(jié)腸、胰腺、腸、肺、襯里、卵巢或膀胱癌。還提供了本發(fā)明的納米顆粒在制備治療傳染病的藥物中的用途。引起該疾病的病原體可以是病毒、細菌或寄生蟲。以下描述了根據(jù)本發(fā)明可以治療的具體用途的實例，以及納米顆粒在體外和體內(nèi)的其他應(yīng)用?，F(xiàn)在將參考附圖舉例描述本發(fā)明的實施方案，該實施方案是非限制性的。附圖簡述圖l顯示了配體Glc(A)、Stn(B)和Le7(0。圖2顯示了T輔助肽配體BCll的結(jié)構(gòu)。圖3顯示了T輔助肽配體BMIX的結(jié)構(gòu)。圖4A顯示了對于BC11I納米顆粒的起始混合物(上面)和所產(chǎn)生納米顆粒(下面)的NMRi普。圖4B顯示了對于BC11II納米顆粒的起始混合物(上面)和所產(chǎn)生納米顆粒(下面)的NMR語。圖5A顯示了對于BC11I納米顆粒的透射式電子顯微鏡照片(左)和粒徑分布直方圖(右)。圖5B顯示了對于BC11II納米顆粒的透射式電子顯微鏡照片(左)和粒徑分布直方圖(右)。圖6顯示了推定的BC11I納米顆粒的略圖。圖7顯示了來自接種BC11I(圓形和正方形)或BC11II(三角形)的小鼠的抗HSA-1^的IgG的血清滴定度。來自未接種小鼠的對照血清顯示為單個的實心正方形。箭頭表示接種時間。圖8顯示了來自接種BC11III(三角形)或BCllIV(正方形和圓形)的小鼠的抗HSA-Ley的IgG的血清滴定度。來自未接種小鼠的對照血清顯示為空心正方形。箭頭表示接種時間。圖9顯示來自接種BC11II伴破傷風(fēng)毒素致敏的小鼠的抗HSA-Ley的IgG的血清滴定度。箭頭表示接種時間。發(fā)明詳述納米顆粒納米顆粒是小顆粒，例如金屬或半導(dǎo)體原子的簇，可以用作固定配體的基底。本發(fā)明的納米顆?？扇苡诖蠖鄶?shù)有機溶劑，尤其是水。這可以用在它們的提純中并且重要地意味著它們可以在溶液中使用以呈遞固定于顆粒表面的配體。納米顆?？扇艿氖聦嵕哂谐蔬f自然構(gòu)象配體的優(yōu)點。對于治療應(yīng)用，該納米顆粒無毒、可溶和在生理條件下是穩(wěn)定的。優(yōu)選，納米顆粒具有平均直徑0.5至50nm的核心，更優(yōu)選0.5至10nm，更優(yōu)選0.5至5nm，更優(yōu)選0.5至3nm和還更優(yōu)選0.5至2.5nm。除核心之外，當(dāng)還考慮配體時，優(yōu)選顆粒的總平均直徑是5.0至100nm，更優(yōu)選5至50nm和最優(yōu)選10至30nm。可以使用本領(lǐng)域熟知4支術(shù)測量平均直徑，如透射電子顯微術(shù)。核心材料可以是金屬或半導(dǎo)體和可以由一個以上類型的原子組成。優(yōu)選，核心材料是選自Au、Fe或Cu的金屬。納米顆粒核心還可以由合金形成，包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd,并可以用于本發(fā)明。優(yōu)選的核心材料是Au和Fe，最優(yōu)選的材料是Au。納米顆粒核心優(yōu)選包括大約100至500個原子(例如金原子)以提供納米范圍的核心直徑。其他特別有用的核心材料與具有NMR活性的一種或多種原子摻雜，這允許使用NMR在體外和體內(nèi)檢測納米顆粒。NMR活性原子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3或鑭系元素+3或本申請其它地方描述的量子點。包括半導(dǎo)體原子的納米顆粒核心可以被檢測，因為納米尺度的半導(dǎo)體晶體能夠擔(dān)當(dāng)量子點，也就是說它們可以吸收光，由此將材料中的電子激發(fā)到更高能量水平，隨后以材料的特征頻率釋放光子。半導(dǎo)體核心材料的實例是硒化鎘、硫化鎘、碲化鎘。還包括鋅化合物如碗*化鋅。在一些實施方案中，納米顆粒的核心可以是磁性的并包括磁性金屬原子，任選與惰性金屬原子組合。例如惰性金屬可以是金、鉑、銀或銅，和磁性金屬可以是鐵或釓。在優(yōu)選實施方案中，惰性金屬是金，磁性金屬是鐵。在這種情況下，方便地，核心中惰性金屬原子與磁性金屬原子的比例是大約5:0.l至大約2:5。更優(yōu)選，該比例是大約5:0.1至大約5:1。如本文使用的，術(shù)語"惰性金屬"是指不顯示磁性并且化學(xué)性質(zhì)上對氧化穩(wěn)定的金屬。惰性金屬可以是抗磁性的或超順磁性的。優(yōu)選，這種納米顆粒是超順磁性的。具有包括順磁性金屬的核心的納米顆粒的實例為包括Mn+2、G(T3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe"或鑭系元素+3的那些。其他磁性納米顆?？梢允怯刹牧先鏜nFe(尖晶石磚)或CoFe(鈷纟失氧體)組成，可以形成納米顆粒U茲性流體，添加或不添加如上限定的另外的核心材料)。Biotechnol.Prog.，19:1095-100(2003)，J.Am.Chem.Soc.125:9828-33(2003)，J.ColloidInterfaceSci.255:293-S(2002)中給出了用于制備這種納米顆粒的自我裝配連接化學(xué)的實例。在一些實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒或其配體包括可檢測標(biāo)記。該標(biāo)記可以是納米顆粒核心的元素或配體。該標(biāo)記可以是可檢測的，因為納米顆粒的那個元素的固有特性，或與可檢測的其它部分連接、綴合或聯(lián)合。標(biāo)記的優(yōu)選實例包括熒光基團、放射性核素、磁性標(biāo)記或染料。熒光基團包括熒光素、羅丹明或四甲基羅丹明、Texas-Red、Cy3、Cy5等等，并可以通過熒光標(biāo)記的激發(fā)和使用拉曼散射光譜的發(fā)射光檢測來檢測(Y.C.Cao，R.Jin，C.A.Mirkin，Science2002，297:1536-1539)。在一些實施方案中，該納米顆粒包含用于檢測納米顆粒的放射性核素，其使用放射性核素放射的放射性，例如通過使用PET、SPECT，或用于治療，即殺死靶細胞。本領(lǐng)域通常使用的可以輕易被改變而在本發(fā)明中使用的放射性核素的實例包括99mTc,其以各種氧化狀態(tài)存在，盡管最穩(wěn)定的是TcO";"P或"P;"Co;59Fe;67Cu，其常常用作(V+鹽；"Ga,其通常使用Ga-"鹽，例如枸櫞酸鎵；68Ge;82Sr;"Mo;1Q3Pd;mIn，其通常用作1113+鹽；1251或1311，其通常用作碘化鈉；137Cs;153Gd;153Sm;158Au;186Re;通常用作Tl+鹽如氯化鉈的旭Tl;39Y3+;"Li^+和24Cr2+。放射性核素作為標(biāo)記和示蹤劑的普遍用途是本領(lǐng)域熟知的并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地改變而用于本發(fā)明的方面?？梢詷O其容易地使用力文射性核素，通過摻入納米顆粒核心或?qū)⑺鼈儼ㄗ鳛橐怨潭ㄔ诩{米顆津立上的配體部分存在的標(biāo)記。另外或可供選擇地，本發(fā)明的納米顆粒，或它們與其他種類相互作用的結(jié)果，可以用本領(lǐng)域熟知的很多技術(shù)使用如上指出的與納米顆粒結(jié)合的標(biāo)記或通過利用它們的性質(zhì)而被檢測到。這些檢測納米顆粒的方法可以從檢測當(dāng)納米顆粒與另一個種類結(jié)合時產(chǎn)生的聚集體，例如通過簡單肉眼觀察或通過使用光散射(含有納米顆粒的溶液的透射)，到使用復(fù)雜的技術(shù)如透射電子顯微術(shù)(TEM)或原子力顯微術(shù)(AFM)以顯象納米顆粒。檢測金屬顆粒的其它方法是使用等離子體共振，它是金屬表面電子激發(fā)的，通常由光輻射所引起。表面等離子體共振(SPR)現(xiàn)象存在于金屬(如Ag或Au)和介電材料如空氣或水的分界面。當(dāng)分析物與固定于納米顆粒表面的配體結(jié)合改變了分界面的折射率，SPR就發(fā)生改變。SPR的更多優(yōu)點是它可用于監(jiān)測實時相互作用。如上所述，如果納米顆粒包括或與具有NMR活性的原子摻雜，那么這個技術(shù)可用于在體外或體內(nèi)檢測該顆粒，使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)。使用基于使用納米顆粒促進銀還原(I)的定量信號放大的系統(tǒng)可以檢測納米顆粒。如果納米顆粒包括配體作為熒光探針，可以使用焚光光謙。并且，糖類的同位素標(biāo)記可用于促進它們的探測。該配體可以包括允許隨意控制最終的構(gòu)建體中抗原和載體密度的惰性糖類成分(例如葡萄糖)。抗原抗原是一種分子，它被適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細胞，即T細胞或B細胞或二者同時特異性識別?？乖ǖ鞍住⑻穷?、核酸乃至小分子如毒素。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗原是腫瘤特異性抗原，尤其是肽或糖類腫瘤特異性抗原。在其他優(yōu)選實施方案中，抗原是病原體上發(fā)現(xiàn)的抗原，如病毒、細菌或寄生蟲。糖類腫瘤特異性抗原的實例包括由腫瘤細胞表面上糖蛋白和糖脂的糖鏈攜帶的唾液酸化和非唾液酸化的Lewis結(jié)構(gòu)。這些抗原常常在胂瘤中過表達并且好象參與腫瘤細胞與內(nèi)皮的粘附。例如，SialylLewisa負(fù)責(zé)粘附人結(jié)腸、胰腺和胃癌細胞，而SialylLewisX負(fù)責(zé)肺、肝和卵巢癌細胞的結(jié)合。SialylLea在結(jié)腸直腸、肝和胃癌中過表達(對于綜述，參見UgorskiandLaskowska(2002)，ActaBiochiraicanPolonica，49，303-311)。佐劑佐劑是提高對抗原的免疫反應(yīng)的試劑。佐劑可以通過刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)的細胞來提高抗體反應(yīng)，和/或可以通過非特異性增加先天免疫系統(tǒng)活性而作用。通常，提高抗體反應(yīng)的抗原通過在抗原更多暴露于淋巴細胞的適當(dāng)部位濃縮抗原或通過刺激細胞因子的產(chǎn)生來做到這點。當(dāng)用作疫苗遞送平臺時，納米顆粒自己可以充當(dāng)佐劑，通過提供顆粒形式的抗原，使得它們更容易被抗原呈遞細胞攝取，如巨噬細胞。然而，使用與納米顆粒綴合的提高免疫系統(tǒng)其他方面的其他試劑，這個作用可以大大增強。增加先天免疫系統(tǒng)活性的佐劑包括糖類部分，如木糖、巖藻糖、甘露糖和N-乙?；被咸烟?。這些以幾個方式起作用。它們可以結(jié)合在血液和淋巴中循環(huán)的分泌分子，其觸發(fā)補體成分分裂導(dǎo)致補體固定。它們也可以結(jié)合吞噬細胞上的表面受體，象巨噬細胞，如CD2-6(腿R)，其刺激吞噬作用和細胞內(nèi)吞。這種佐劑也可以在刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起作用。它們可以結(jié)合啟動導(dǎo)致效應(yīng)分子(細胞因子)釋放的信號的細胞表面受體。例如，糖類與樹突細胞表面上Toll樣受體的結(jié)合引起它們分泌細胞因子，包括白介素6(IL-6)，其妨礙調(diào)節(jié)性T細胞抑制效應(yīng)T細胞對抗原的應(yīng)答的能力。B細胞也具有Toll樣受體。當(dāng)結(jié)合受體時，它提高B細胞對抗原的反應(yīng)。其他佐劑直接刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)的細胞。例如，可以使用刺激輔助T細胞(HTL)反應(yīng)的肽，以增強對抗原肽的CTL反應(yīng)。這種肽可以是例如來自破傷風(fēng)類毒素的高免疫原性抗原，其產(chǎn)生非特異性HTL反應(yīng)?；罨腍TL增強CTL的增殖、存活和效應(yīng)功能。這種肽在提高對糖類抗原的免疫反應(yīng)中特別有用。盡管糖類抗原可以被糖類特異性B細胞結(jié)合和內(nèi)化，但是它們不能活化僅由肽活化的HTL。然而本發(fā)明的納米顆粒可以激起B(yǎng)細胞和HTL反應(yīng)，因為它們與糖類抗原和HTL活化肽都結(jié)合。這提供了大大提高的免疫反應(yīng)。給藥和治療本發(fā)明的納米顆粒組合物可以通過很多不同的途徑給予患者，包括腸或腸胃外途徑。腸胃外給藥包括通過下列途徑給藥靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、鼻、肌內(nèi)、眼內(nèi)、透上皮、腹膜內(nèi)和局部(包括真皮、眼睛、直腸、鼻內(nèi)、吸入和氣霧)和直腸全身途徑。例如通過注射或使用遞送槍彈道式實施給藥，遞送槍加速它們經(jīng)由表皮外層的透皮途徑。然后納米顆粒可以被例如樹突細胞吸收，樹突細胞通過淋巴系統(tǒng)遷移而成熟，引起調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和抗該抗原的接種。納米顆粒還可以以氣霧劑遞送。小型納米顆?？赡苓@樣做。本發(fā)明的特別小型納米顆粒是遞送至細胞和組織的巨大優(yōu)點，因為它們可以被細胞吸收，即使當(dāng)其與尋靶或治療分子連接時。本發(fā)明的納米顆?？梢员慌渲茷樗幬锝M合物，可以是固體或液體組合物形式。這種組合物通常將包含一些類型的載體，例如固體載體如明膠或佐劑或惰性稀釋劑，或液體載體如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}溶液，或二元醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。這種組合物和制劑通常含有至少0.lw"/。的該化合物。對于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射，或在病變部位注射，活性成分將是腸胃外可接受水溶液形式，該溶液是無熱原的并且具有適當(dāng)?shù)膒H、等滲性和穩(wěn)定性。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員肯定能夠制備合適的溶液，使用例如該化合物或其衍生物的溶液，例如在生理鹽水中、用甘油、液體聚乙二醇或油類制備的分散液。除一種或多種化合物之外，任選與其他活性成分組合，該組合物可以包含一種或多種藥物可接受賦形劑、栽體、緩沖劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑或抗氧化劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他物質(zhì)。這種物質(zhì)應(yīng)該無毒并且不會妨礙活性成分的功效。載體或其他物質(zhì)的確切性質(zhì)可以依賴于給藥途徑，例如口服或腸胃外。液體藥物組合物典型地配制為具有大約3.0至9.0的pH，更優(yōu)選大約4.5至8.5,和還更優(yōu)選大約5.0至8.0。組合物的pH可以使用緩沖液來維持，如醋酸鹽、枸櫞酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、Tris或組氨酸，緩沖液典型地以大約lmM至50mM的范圍使用。或者組合物的pH可以通過使用生理可接受酸或堿來調(diào)節(jié)。藥物組合物中通常包括防腐劑以妨礙微生物生長，延長組合物的儲藏期限和允許多用途包裝。防腐劑的實例包括石炭酸、間曱酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸和它的酯、羥苯甲酸曱酯、羥苯甲酸丙酯、苯扎氯銨和芐索氯銨。典型地防腐劑以大約0.1至1.0%(w/v)的范圍使用。優(yōu)選，藥物組合物以預(yù)防有效量或治療有效量(視情況而定，盡管預(yù)防可能被認(rèn)為是治療)給予個體，這足以顯示有利于個體。典型地，這將產(chǎn)生提供有益于個體的治療有效的活性。給予化合物的實際量，和給藥速度和時間過程，將依賴于所治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療的要求，如確定劑量等是普通醫(yī)生和其他醫(yī)生職責(zé)范圍內(nèi)的事情，典型地考慮待治療的紊亂、患者的情況、遞送部位、給藥方法和專業(yè)人員已知的其他因素。HandbookofPharmaceuticalAdditives,2ndEdition(eds.M.AshandI.Ash)，2001(SynapseInformationResources,Inc.,Endicott，NewYork,USA);Remington'sPharmaceuticalSciences,20thEdition,2000，pub.Lippincott，Williams&Wilkins;andHandbookofPharmaceuticalExcipients，2ndedition,1994中可以找到上述4支術(shù)和方案的實例。例如，優(yōu)選組合物以每公斤體重大約0.01至lOOmg活性化合物，和更優(yōu)選大約0.5至10mg/kg體重的劑量給予患者。很清楚涉及腫瘤治療的情況下，治療包括由醫(yī)師實施來減輕胂瘤對患者作用的任何手段。因此，盡管腫瘤的完全緩解是期望目標(biāo)，但是有效的治療還包括能夠達到胂瘤部分緩解以及減慢肺瘤生長速度包括轉(zhuǎn)移的任何手段。這種手段可以有效延長和/或提高生活質(zhì)量和減輕疾病癥狀。免疫療法本發(fā)明的組合物，如免疫原性結(jié)構(gòu)，可以用于預(yù)防和治療疾病，象癌癥，和更特別地用于免疫療法。在本發(fā)明中，術(shù)語"接種"意思是主動免疫，就是由于給予少量抗原誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，例如經(jīng)由皮下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、口服或鼻內(nèi)途徑，該抗原被接種的個體識別為外來的并因此在合適的制劑中具有免疫原性。因此為了建立抗該抗原的特異性免疫應(yīng)答，該抗原被用作免疫系統(tǒng)的"觸發(fā)子"。根據(jù)本發(fā)明，接種可以是治療或預(yù)防性的，如同所有抗微生物疫苗一樣。例如，通過給沒有罹患癌癥的個體接種，也許可能達到抗癌癥爆發(fā)的預(yù)防性保護?？赡苁┘舆@種預(yù)防接種的個體的實例是發(fā)展為癌癥的風(fēng)險增加的個體，盡管這個應(yīng)用不限于這種個體。處于癌癥風(fēng)險的患者可能已經(jīng)具有發(fā)展的腫瘤(原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移)，或顯示出癌癥易感性。對于根據(jù)本發(fā)明的癌癥患者的主動免疫，免疫原性結(jié)構(gòu)典型地被配制為疫苗。優(yōu)選，這種藥物制劑含有藥物可接受載體，所述載體例如可以進一步包括輔助物質(zhì)、緩沖劑、鹽和/或防腐劑。藥物制劑可以例如用于預(yù)防和治療癌癥患者中的癌癥相關(guān)病癥，如轉(zhuǎn)移形成。這樣做時，抗原呈遞細胞在體內(nèi)或離體特異性調(diào)節(jié)以使產(chǎn)生抗TAA的免疫反應(yīng)。對于用特異性抗原或抗原組合的主動免疫，通常使用疫苗制劑，其含有免疫原-它是天然TAA或它的表位，模擬物或新表位模擬物，或免疫原性抗體-主要以低濃度，例如從O.Oljjg至10mg范圍的免疫原性量，然而劑量范圍可以增至100至500mg的范圍。根據(jù)接種抗原的免疫原性，該免疫原性例如通過外來種類的序列或通過衍生作用確定，或還分別根據(jù)使用的輔助物質(zhì)或佐劑，可以選擇例如0.Oljjg至lmg范圍內(nèi)，優(yōu)選lOOjjg至500yg的合適免疫原性劑量。然而，將在延長期限遞送給生物的儲庫疫苗還可以含有高得多的量的接種抗原，例如至少lmg至100mg以上。濃度將取決于給予的液體或懸浮疫苗的量。疫苗通常以即用型注射器或安瓿形式提供，具有0.01至lml范圍的體積，優(yōu)選0.1至0.75ml。本發(fā)明試劑盒成分的接種抗原優(yōu)選存在于適于皮下、肌內(nèi)以及真皮內(nèi)或透皮給藥的藥物可接受載體中。也可由粘液途徑給藥，例如通過鼻內(nèi)或經(jīng)口接種。如果使用固態(tài)物質(zhì)作為疫苗制劑的助劑，例如將分別給予含助劑的疫苗抗原的吸附物或懸浮混合物。在特殊實施方案中，疫苗以溶液或水溶劑中的液體疫苗存在。優(yōu)選，腫瘤疫苗的接種單位已經(jīng)在即用型注射器或安瓿中提供。疫苗的穩(wěn)定制劑可以以即用型形式有利地出售。盡管不必要求防腐劑，如硫柳汞或可容忍性改善的其他防腐劑的含量，但是它可以以使制劑在制冷溫度至室溫的儲存溫度下穩(wěn)定性更久的形式提供。然而根據(jù)本，重構(gòu)。已經(jīng)證明通過使用佐劑適于增加根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的免疫原性。為了這個目的，使用固體物質(zhì)或液體疫苗佐劑，例如氫氧化鋁(Alu-Gel)或磷酸鋁、生長因子、淋巴因子、細胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、y干擾素、或補體因子如C3d、其它的脂質(zhì)體制劑、或具有另外抗原的制劑，免疫系統(tǒng)已經(jīng)對該抗原產(chǎn)生了強烈的免疫反應(yīng)，如破傷風(fēng)類毒素、細菌毒素，如假單胞菌外毒素和脂質(zhì)A和脂多糖的衍生物。在類毒素肽與核心結(jié)構(gòu)共價連接的情況下，佐劑的需要可以降低或取消。實施例實施例1負(fù)栽糖類抗原、T輔助載體和連接于金表面的葡萄糖的納米顆粒的制備和表征描述如下。使用配體Glc、STn和Ley(圖1)。選擇C2脂肪族間隔物將葡萄糖殘基與金表面連接，而C5脂肪族接頭用于兩個抗原的連接。通過氨基末端基團將來自破傷風(fēng)類毒素的混雜T細胞肽表位(FKLQTMVKLFNRIKNNVA)與C脂肪族間隔物連接而制備T輔助肽配體BC11(圖2)。通過氨基末端基團將相同破傷風(fēng)類毒素T細胞肽表位與由六甘醇和dJ旨肪族間隔物組成的混合接頭連接而制備T輔助肽配體BMIX(圖3)。對于糖納米顆粒的制備，Glc、STn、Ley和BC11或BMIX以期望比例溶于氘化甲醇中并在50謹(jǐn)Hz記錄這些溶液的^NMR譜。這些混合物的譜允許清楚地鑒定屬于單獨成分的信號和證實這些信號的強度相當(dāng)于根據(jù)原始溶液中不同配體的比例所預(yù)期的強度(圖4)。用甲醇稀釋后，如下所述處理該混合物以得到相應(yīng)的糖納米顆粒，通過離心過濾重復(fù)純化該顆粒。這些構(gòu)建體在氘化重水中的屮NMR譜(圖4)表明在所用以前建立的實驗條件下獲得的GNPs中維持了原始配體比例。上清液的^NMR譜也證實所述的配體比例。按照上述程序，制備下列糖納米顆粒BC11I(Glc:STn:BCll28:1:1)、BC11II(Glc:STn:BC1120:9:1)、BC11III(Glc:STn:Ley:BC1118:10:1:1)、BC11IV(Glc:STn:Ley:BC1118:1:10:1)、BMIXI(Glc:STn:BMIX28:1:1)、BMIXII(Glc:STn:BMIX20:9:1)、BMIXIII(Glc:STn:Ley:BMIX18:10:1:1)、BMIXIV(Glc:STn:Ley:BMIX18:1:10:1)BMIXV(Glc:Ley:BMIX28:1:1)和BMIXVI(Glc:Ley:BMIX20:9:1)。使用透射電子顯微術(shù)(TEM)測定這些構(gòu)建體的平均直徑，對于BC11I、BC11II、BC11III和BC11IV分別是2.25nm、1,45nm、2.05nm和1.81nm,和對于BMIXI、BMIXII、BMIXIII、BMIXIV、BMIXV和BMIXVI分別是1.80nm、1.55nm、2.19認(rèn)、1.77nm、1.64nm和1.79nm。從這些平均直徑，估計蔟中金原子的數(shù)量，與金連接的鏈和GNPs的近似分子量。13]以下給出了這些值。已經(jīng)制備和表征了幾個另外的糖納米顆粒(1-4)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些構(gòu)建體的組分如下1(STn，100%)、2(Ley100%)、3(Glc:STn:HS(CH丄。C00H接頭20:1:1)、4(Glc:STn:HS(CH2)uO(CH2CH20)6CH，H接頭28:1:1)。實驗部分HAuCh和NaBH4購自AldrichChemicalCompany。對于所有實驗和溶液，使用納米純凈水(Nanopurewater)(18.1mO)。肽BC11-Au-抗原糖類納米顆粒的制備a)BC11I(Glc:STn:BCll28:1:1).肽BCll(3.1mg，1.31jjmol)溶于CF3C00D(lOOpL),在氬流下濃縮該溶液直至觀察到油的形成。然后添加Glc(8.8mg，36.7ymo1)和STn(0.8mg，1.31ymol)，并將混合物溶于CD30D(500pL)中。力-NMRi普顯示Glc、STn和BCll的信號之間比例為28:1:1。用Me0H(2.8mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至1。添加HAuCl4的水溶液(286jjL，0.025M)。然后，以幾份添加1NNaBH,水溶液(157jjL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h并通過傾析分離甲醇層w。將黑色固體溶于水(700yL)并用離心過濾(AMICONMW10000，30min，1400Grpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。AMIC0N過濾器中的殘渣溶于500yL水中并凍干以提供1.2ragBC11I納米顆粒。TEM:平均直徑2.25nm、309個金原子、92條鏈、MW=90586。b)BC11II(Glc:STn:BC1120:9:1).肽BC11(4.0mg，1.7jjmol)溶于CF3C00D(100pL)，在氬流下濃縮該溶液直至，見察到油的形成。然后添加Glc(8.1mg，33.9|jmol)和STn(9.3mg,15.2pmo1)，并將混合物溶于CD30D(500pL)中。!H-腿譜顯示Glc、STn和BCll的信號之間比例為20:9:1。用MeOH(3.7mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至1。添加HAuCl4的水溶液(368yL，0.025M)。然后，以幾份添加1NNaBH4水溶液(202yL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h并通過傾析分離甲醇層14]。將黑色固體溶于水(500ijL)并用離心過濾(AMICONMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMICON過濾器中的殘渣溶于500jjL水中并凍干以提供1.8mgBCllII納米顆粒。TEM:平均直徑1.45nm、116個金原子、53條鏈、匿-45358。c)BCllIII(Glc:STn:Ley:BCll18:10:1:1).肽BCll(2.8mg，1.2jjmol)溶于CF3C00D(100jjL)，在氬流下濃縮該溶液直至觀察到油的形成。然后添加Glc(5.1mg，21.3ymol)、Ley(0.9mg，1.2pmol)和STn(7.3mg，11.8|jmol)，并將混合物溶于CD30D(500jjL)中。力-NMR譜顯示Glc、STn、Ley和BC11的信號之間比例為18:10:1:1。用MeOH(2.4mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至1。添加HAuCl4的水溶液(256yL，0.025M)。然后，以幾份添加1NNaB仏水溶液(142yL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h并通過傾析分離曱醇層[4]。將黑色固體溶于水(500jjL)并用離心過濾(AMIC0NMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMIC0N過濾器中的殘渣溶于500yL水中并凍干以提供O.5mgBC11III納米顆粒。TEM:平均直徑2.05nm、225個金原子、71條鏈、MW=76661。d)BCllIV(Glc:STn:Ley:BCll18:1:10:1).肽BCll(2.7mg,1.1pmol)溶于CF3C00D(lOOpL),在氬流下濃縮該溶液直至觀察到油的形成。然后添加Glc(4.9mg，20.6jjmo1)、Ley(8.8mg，11.4jjmo1)和STn(0.7mg，1.1,1)，并將混合物溶于CD30D(500jjL)中。'H-NMR譜顯示G1c、STn、Le'和BC11的信號之間比例為18:1:10:1。用MeOH(2.3mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至1。添加HAuCl4的水溶液(248yL，0.025M)。然后，以幾份添加1NNaBH4水溶液(137jjL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h并通過傾析分離甲醇層"]。將黑色固體溶于水(500jjL)并用離心過濾(AMICONMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMICON過濾器中的殘渣溶于500jjL水中并凍干以提供1.2mgBC11IV納米顆粒。TEM:平均直徑1.81nm、201個金原子、71條鏈、MW=75409。肽BMIX-Au-抗原糖類納米顆粒的制備a)BMIXI(Glc:STn:BMIX28:1:1).肽BMIX(3.5mg，1.31jjmol)溶于CF3C00D(IOOjjL)，在氬流下濃縮該溶液直至觀察到油的形成。然后添加Glc(8.8mg，36.6ymo1)和STn(0.8mg，1.31jjmo1)，并將混合物溶于CD30D(500jjL)中。力-NMR謙顯示Glc、STn和BMIX的信號之間比例為28:1:1。用MeOH(2.7mL,總體積3.2mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至l。添加HAuCl4的水溶液(314jjL，0.025M)。然后，以幾份添加1NNaBH4水溶液(157iiL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h并通過傾析分離曱醇層[2]。將黑色固體溶于水(700yL)并用離心過濾(AMICONMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMIC0N過濾器中的殘渣溶于500jjL水中并凍干以提供1.0mgBMIXI納米顆粒。TEM:平均直徑1.80nm、201個金原子、71條鏈、MW=63300。b)BMIXII(Glc:STn:BMIX20:9:1).肽BMIX(3.5mg，1.31ymol)溶于CF3C00D(100jjL),在氬流下濃縮該溶液直至，見察到油的形成。然后添加Glc(6.3mg，26.2jjmo1)和STn(7.2mg，11.7,1)，并將混合物溶于CD30D(500yL)中。力-醒Ri普顯示Glc、STn和BMIX的信號之間比例為20:9:1。用MeOH(2.7mL，總體積3.2mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至l。添加HAuCl4的水溶液(314jjL，0.025M)。然后，以幾份添加1NNaBH4水溶液(157jjL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h。在這里不可能通過傾析分離甲醇層。然后將體積減至lmL，添加水(700jjL)并用離心濾器(AMICONMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMICON過濾器中的殘渣溶于500pL水中并凍干以提供2.5mgBMIXII納米顆粒。TEM:平均直徑1.55nm、140個金原子、53條鏈、MW-50567。c)BMIXIII(Glc:STn:Ley:BMIX18:10:1:1).肽BMIX(3.9mg，1.46ymol)溶于CF3COOD(lOOyL),在氬流下濃縮該溶液直至觀察到油的形成。然后添加Glc(6.3mg，26.2pmol)、Ley(1.1mg,1.46nmol)和STn(9.Omg，14.6pmo1)，并將混合物溶于CD30D(500ijL)中。^-NMR譜顯示G1c、STn、1^和BMIX的信號之間比例為18:10:1:1。用MeOH(3.2mL，總體積3.7mL)稀釋該溶液。添加HAuCl4的水溶液(350pL,0.025M)。然后，以幾份添加INNaBH4水溶液(193pL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h并通過傾析分離曱醇層121。將黑色固體溶于水(50(HjL)并用離心濾器(AMICONMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMICON過濾器中的殘渣溶于500jjL水中并凍干以提供2.8mgBMIXIII納米顆粒。TEM:平均直徑2.19nm、309個金原子、92條鏈、MW=103569。d)BMIXIV(Glc:STn:Ley:BMIX18:1:10:1).肽BMIX(3.7mg，1.38ymol)溶于CF3COOD(100|jL),在氬流下濃縮該溶液直至觀察到油的形成。然后添加Glc(6.0mg，24.8|jmol)、Ley(10.7mg，13.8jjmol)和STn(0.85mg，1.38jjmo1)，并將混合物溶于CD30D(500jjL)中。^-NMR譜顯示Glc、STn、1^和BMIX的信號之間比例為18:1:10:1。用Me0H(3.0mL，總體積3.5mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至l。添加HAuCl4的水溶液(330jjL,0.025M)。然后，以幾份添加1NNaBH4水溶液(182yL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h并通過傾析分離甲醇層[2]。將黑色固體溶于水(500yL)并用離心濾器(AMICONMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMICON過濾器中的殘渣溶于500|jL水中并凍干以提供1.8mgBMIXIV納米顆粒。TEM:平均直徑1.77nm、201個金原子、71條鏈、MW=75934。e)BMIXV{Glc:Ley:BMIX28:1:1).肽BMIX(3.7mg，1.4pmol)溶于CF3C00D(100jiL)，在氬流下濃縮該溶液直至觀察到油的形成。然后添加Glc(9.4mg，39.1ymol)和Le7(l.lmg，1.4jjmo1)，并將混合物溶于CD30D(500jjL)中。屮-NMR謙顯示Glc、1^和BMIX的信號之間比例為28:1:1。用Me0H(3.0mL,總體積3.5mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至l。添加HAuCl4的水溶液(331yL，0.025M)。然后，以幾份添加1NNaBH,水溶液(182yL),伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h并通過傾析分離甲醇層[2]。將黑色固體溶于水(700yL)并用離心濾器(AMICONMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMICON過濾器中的殘渣溶于500jjL水中并凍干以提供0.7mgBMIXV納米顆粒。TEM:平均直徑1.64nm、140個金原子、53條鏈、MW=45568。f)BMIXVI(Glc:Ley:BMIX20:9:1).肽BMIX(3.5mg，1.31jjmol)溶于CF3C00D(100|jL)，在氬流下濃縮該溶液直至觀察到油的形成。然后添加Glc(6.3mg，26.2jjmol)hLey(9.2mg，11.8ymo1)，并將混合物溶于CD30D(500pL)中。^-NMRi瞽顯示Glc、Le'和BMIX的信號之間比例為20:9:1。用MeOH(2.7mL，總體積3.2mL)稀釋該溶液并添加三氟乙酸將pH值調(diào)至l。添加HAuCl4的水溶液(314pL，0.025M)。然后，以幾份添加INNaBH4水溶液(157ijL)，伴快速搖動。形成的黑色懸液搖動另外2h。在這里不可能通過傾析分離甲醇層。然后將體積減至lmL，添加水(700ijL)并用離心濾器(AMICONMW10000，30min，14000rpm)純化。該過程重復(fù)兩次，直至納米顆粒不含鹽和起始原料。將AMIC0N過濾器中的殘渣溶于500jjL水中并凍干以提供1.8mgBMIXVI納米顆粒。TEM:平均直徑1.79nm、201個金原子、71條鏈、MW=73864。綴合抗原的納米顆粒誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的用途用納米顆粒BCllI、II、III和IV接種小鼠并監(jiān)測對綴合抗原的免疫反應(yīng)。30yg納米顆粒在200jjl佐劑(SigmaM-6536-MPL+TDM)中注射。在第0、28、40和157天給予2xl00yl的四次注射。前三次皮下給予和最后一次注射腹膜內(nèi)給予。第39、48和67天采血并測定抗HSA-Ley的IgG滴度(圖7和8)。BC11I/II和BC11III/IV中看到結(jié)果之間有大的差異。BC11I/II中抗Ley的滴度升高是由于使用佐劑的非特異性效應(yīng)。重復(fù)免疫時，滴度沒有增加而是開始降低。相反，用BC11III/IV,滴度隨加強免疫而增加，證明真實的免疫作用。BC11II用于破傷風(fēng)類毒素致敏的接種。在第0天，給動物皮下注射來自AventisPasteurMSD-Diftavax的2.35IU破傷風(fēng)類毒素(用0.9%鹽水將2小瓶配制成共3.4ml，并給藥IOOjjI)。在第14天，含50jjg納米顆粒的2xl00pl于佐劑(SigmaM-6536)中皮下注射和在第34天，含5(Hig納米顆粒的2x100jj1于佐劑中腹膜內(nèi)注射。在第33和44天采血。圖9顯示了5只小鼠的結(jié)果(不同的動物用不同的符號表示)。第一個箭頭表示破傷風(fēng)類毒素致敏的，第二個箭頭表示用納米顆粒皮下注射和第三個箭頭表示用納米顆粒腹膜內(nèi)注射。實施例2金納米顆粒作為免疫原性結(jié)構(gòu)根據(jù)W002/32404所述技術(shù)制備金納米顆粒的制劑。用各種密度的肽序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA制備比例為alpha-Sialy卜Tn:Lewisy=30:3和3:30的金納米顆粒的不同構(gòu)建體。剩余空間可用Glc-C2封閉?？晒┻x擇地，接頭也可以是序列FKFQILYNSIMG。Sialyl-Tn或Lewisy或兩個接頭組合的比例也可以使用根據(jù)W002/32404的技術(shù)增加。例如，高達數(shù)百個糖類基團可以容易地與核心分子連接。不同配體的比例可以容易地改變?？晒┻x擇地，也可以是與核心分子共價結(jié)合一個單個SialylTn或Lewisy糖類?？贵w作為免疫原性結(jié)構(gòu)SialylTn糖類與HE2的偶聯(lián)SialylTn-0(CH2)3NH(CH2)4C00-pNp與HE2偶聯(lián)。為了增加SialylTn糖類配體的數(shù)量，可以使用本領(lǐng)域熟知的分支接頭將糖類配體偶聯(lián)到抗體上。通過SEC、LDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡和不同的ELISA試驗分析終產(chǎn)物。實驗部分材料和方法HE2Panorex，10mg/ml，Lotl70901SialylTn-O(CH2)3匪(CH2)4COO-pNp，2x5mg，F(xiàn)a.LectinityDMF(N，N-二甲基曱酰胺(無水的，Merck)偶聯(lián)緩沖液0.1MNa2HP04+0.15MNaCl(pH-8)配制緩沖液NaCl0.86°/。+ImMNa2HP04(pH-6.0)。步驟U吏用Slide-A-Lyzer透析盒，將lOOmgHE2(V=IOml;濃度10mg/ml)對著2x700ml偶聯(lián)緩沖液在4t:透析20小時，直至10ml體積，根據(jù)SEC的濃度約10mg/ral。2.用2xlOOjjlDMF(100jjl/瓶)溶解2x5mgSialylTn-0(CH2)3NH(CH2)XOO-pNp。3.SialylTn(在DMF中)溶液添加至~10ml(~lOOmg)冷冰HE2(在偶聯(lián)緩沖液中)。4.用lOOjjlDMF(從小瓶1轉(zhuǎn)移至小瓶2)漂洗SialylTn-小瓶，其也添加至反應(yīng)混合物。5.反應(yīng)混合物在+4t:轉(zhuǎn)動過夜(28小時)。用SEC觀察反應(yīng)動力學(xué)(參見5.3.1和6.3.1)。6.4吏用Slide-A-Lyzer透析盒，將HE2-SialylTn(10ml,~10mg/ml)的終溶液對著2x800ml配制緩沖液在4匸透析20小時。分析大小排阻層析在ZORBAXGF-250柱上于Dionex系統(tǒng)中，通過大小排阻層折(SEC)定量HE2-SialylTn的濃度。用凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)(Fa.BioRAD)測試HPLC系統(tǒng)。HE2用作HE2-SialylTn定量的參考標(biāo)準(zhǔn)。保留時間(與分子量增加有關(guān))縮短與SialylTn與HE2的偶聯(lián)反應(yīng)的效率有關(guān)。收到的數(shù)據(jù)表明偶聯(lián)效率隨在23-27小時反應(yīng)時間達到飽和而增加。LDS-PAGE(十二烷基石危酸鋰PAGE)使用Bis-Tris-Gel(4-12%)"SilverXpressTM-Stain的LDS-PAGE:參見"NuPAGEBis-Tris-Gel"說明小冊子，第13頁。結(jié)果在圖7中示出。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>蛋白質(zhì)印跡使用兔x小鼠IgG2a的蛋白質(zhì)印跡步驟1.含Bis-Tris-Gel(4-12%)的LDS-Gel2.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移參見NuPAGEBis-Tris-Gel說明小冊子第14-20頁(用ImmobUon轉(zhuǎn)移膜P響0.45|jm，F(xiàn)a.Millipore)3.膜顯色材料綴合兔x小鼠IgG2a-HRP，#61-0220，F(xiàn)a.Zymed染色液l:含15mgHRP-ColorReagent(Fa.BioRAD)的5mlMetOH染色液2:含15jjl30%H2O2的25mlPBSdef.lx步驟:用含3。yi脫脂奶粉的PBS室溫下封閉膜1小時。用PBS洗滌膜。與綴合物(1:1000稀釋于PBS中)在室溫下孵育1小時。用PBS洗滌膜。用染色液1+2顯色和用水終止。用抗SialylTnCD175s(IgG型)/大鼠x小鼠IgGl-HRP的蛋白質(zhì)印跡。步驟1.含Bis-Tris-Gel(4-12%)的LDS-Gel2.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移參見NuPAGEBis-Tris-Gel說明小冊子第14—20頁(用Immobilon轉(zhuǎn)泮多膜PVDF0,45pm，F(xiàn)a.Millipore)3.膜顯色材料第二Ab:抗SialylTnCD175s(IgG型),90yg/ml，F(xiàn)a.DAKO，Code.No.M0899,Lot.089(601).綴合大鼠x小鼠IgGl-HRP,Fa.BectonDickinson,Mat.No.559626，Batch:37205。3%脫脂奶粉，于PBSdeflx中。染色液1:含15mgHRP-ColorReagent(Fa.BioRAD)的5mlMetOH。染色液2:含15jjl30歸2的25mlPBS。步驟用含3°/。脫脂奶粉的PBS室溫(RT)下封閉膜1小時。用PBS洗滌膜與第二Ab(濃度10iJg/ml)V-5ml，室溫下孵育1小時。用PBS洗滌膜。與綴合物(1:1000稀釋于PBS中)室溫下孵育1小時。用PBS洗滌膜。用染色液1+2顯色和用水終止。與SialylTn偶聯(lián)后，蛋白質(zhì)印跡并用兔抗小鼠IgG2a-HRP染色證實HE2抗體重鏈分子量的增加。為了顯示(HE2的)抗獨特型結(jié)合活性的多少保留在偶聯(lián)產(chǎn)品中，實施標(biāo)準(zhǔn)ELISA固定的IGN111俘獲抗獨特型HE2，由抗小鼠IgG2a-HRP檢測。表明HE2比HE2-SialylTn的反應(yīng)性高2-3倍，這表明偶聯(lián)后僅發(fā)生結(jié)合的中度損失。實施其它標(biāo)準(zhǔn)ELISA，通過小鼠抗SialylTn-抗體檢測SialylTn。其中起始原料HE2和偶聯(lián)產(chǎn)品HE2-SialylTn被固定。對于檢測，抗SialylTn(小鼠IgG)/大鼠抗小鼠IgGl-HRP用于SialylTn的檢測。結(jié)果表明HE2-SialylTn反應(yīng)產(chǎn)物的確攜帶SialylTn,與偶聯(lián)之前HE2相反。結(jié)論SialylTn已經(jīng)成功與HE2抗體偶聯(lián)在一起。偶聯(lián)反應(yīng)動力學(xué)時間延長，大約24小時后達到飽和。SialylTn已經(jīng)主要與HE2抗體重鏈偶聯(lián)在一起，而輕鏈僅部分與SialylTn偶聯(lián)。HE2-SialylTn偶聯(lián)產(chǎn)品保留了大多數(shù)HE2的獨特型特異性，這個新糖蛋白的SialylTn部分由SialylTn特異性抗體所識別。內(nèi)毒素水平低于檢測極限。參考文獻本文提及的參考文獻全部以其整體明確地引入作為參考。[1〗J.M.deIaFuente，A.G.BarrientosCanada,A.Fernandez,S.Penades,Angew.Chem40，2257.[2]A.G.Barrientos,J.M.deIaFuente，T.C.Rojas，A.Fernandez,S.Penades,Chem.Eur.J.，2003，9，1909.[3]M.LHostetler,J.E.Wingate,C.Z.Zhong，J.E.HarrisR.W.Vachet，M.R.Clark,J.D.Londono，S.J.Green,J.J.StokesG.D.Wignall，G.L.Clish，M.D.Porter,N.D.Evans，R.W.MurrayLangmuir，1998,14，17.[4〗Thismethanoliclayerwasconcentratedunderreducedpressure.The力-NMRspectrumoftheresidueshowedthesameinitialratio,approximately,betweenGlc，STn，LeyandBC11signals.，T.C.Rojas，JInt.Ed.，200權(quán)利要求1.納米顆粒，其包含包括金屬和/或半導(dǎo)體原子的核心，其中該核心與多個配體共價連接，該配體包含至少一種抗原和至少一種佐劑。2.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中至少一種佐劑刺激先天免疫反應(yīng)。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的納米顆粒，其中至少一種佐劑刺激T細"包反應(yīng)。4.權(quán)利要求3的納米顆粒，其中T細胞反應(yīng)包括T輔助細胞反應(yīng)。5.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的納米顆粒，包含是糖類部分的佐劑。6.權(quán)利要求5的納米顆粒，其中糖類部分包括葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和/或N-乙酰葡糖胺。7.上述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，包含是肽部分的佐劑。8.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的納米顆粒，其中該肽部分是活化T輔助細胞的肽。9.權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的納米顆粒，其中該肽部分包含蛋白酶切割位點。10.權(quán)利要求9的納米顆粒，其中該肽包含氨基酸序列FKLQTMVKL麗I醒VA。11.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中抗原是腫瘤特異性抗原。12.權(quán)利要求ll的納米顆粒，其中抗原是糖類抗原。13.權(quán)利要求12的納米顆粒，其中抗原是唾液酸化的。14.權(quán)利要求12的納米顆粒，其中抗原是唾液酸化的。15.權(quán)利要求14的納米顆粒，其中抗原是sialylTn、sialylLewisa、sialylLewis"或sialylLewisy。16.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中抗原是病原體特異性抗原。17.權(quán)利要求16的納米顆粒，其中病原體是細菌、病毒或寄生蟲。18.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中至少一種配體通過接頭基團與納米顆粒連接。19.權(quán)利要求18的納米顆粒，其中接頭基團包括巰基、烷基、二元醇基團或肽基團。20.權(quán)利要求19的納米顆粒，其中接頭基團包括C2-C15烷基和/或C2-C15二元醇。21.權(quán)利要求2G的納米顆粒，其中接頭基團是C2-C15烷基或六甘醇-Cll烷基。22.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中納米顆粒包含標(biāo)記。23.權(quán)利要求22的納米顆粒，其中標(biāo)記是熒光基團、放射性核素、磁性標(biāo)記、染料、NMR活性原子或使用表面等離子體共振能夠檢測的原子。24.權(quán)利要求23的納米顆粒，其中磁性標(biāo)記是順磁基團，包括Mn"、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co2、Ni+2、Fe+2、Fe"或鑭系元素+3。25.權(quán)利要求23的納米顆粒，其中NMR活性原子是Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe"或鑭系元素+3。26.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中納米顆粒是水溶性的。27.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中納米顆粒的核心具有0.5至10nm的平均直徑。28.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中納米顆粒的核心具有1至2.5nm的平均直徑。29.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中包含其配體的納米顆粒具有10至30nm的平均直徑。30.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中核心是金屬核心。31.權(quán)利要求30的納米顆粒，其中金屬核心包含Au、Ag或Cu。32.權(quán)利要求30或權(quán)利要求31的納米顆粒，其中金屬核心是選自Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd的合金。33.權(quán)利要求30至32任一項的納米顆粒，其中納米顆粒的核心是磁性的。34.權(quán)利要求33的納米顆粒，其中納米顆粒在核心中包含惰性金屬原子和磁性金屬原子，其比率是大約5:0.1至大約2:5。35.權(quán)利要求34的納米顆粒，其中惰性金屬是金、鉑、銀或銅，磁性金屬是鐵或鈷。36.權(quán)利要求1至29任一項的納米顆粒，其中核心包含半導(dǎo)體原子。37.權(quán)利要求36的納米顆粒，其中半導(dǎo)體原子能夠充當(dāng)量子點。38.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中配體還包含肽、蛋白結(jié)構(gòu)域、核酸片段、糖脂或糖蛋白。39.前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒，其中配體包含DNA或RNA。40.組合物，包含一種或多種前述任一項權(quán)利要求的納米顆粒的群體。41.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，進一步包含藥物可接受載體。42.免疫原性結(jié)構(gòu)，由與糖類配體和至少一種T細胞輔助肽配體共價連接的核心分子組成。43.免疫原性結(jié)構(gòu)，由與多個糖類配體共價連接的核心分子組成，其中糖類配體包含至少一種新表位結(jié)構(gòu)。44.根據(jù)權(quán)利要求42或權(quán)利要求43的免疫原性結(jié)構(gòu)，其中核心分子選自由金屬或半導(dǎo)體原子核心和抗體或其衍生物或片段組成的納米顆粒。45.根據(jù)權(quán)利要求42至44任一項的載體分子，其中金屬核心包括Au、Ag、Cu,Pd或Al。46.根據(jù)權(quán)利要求42的免疫原性結(jié)構(gòu)，包含新表位結(jié)構(gòu)。47.根據(jù)權(quán)利要求42至46任一項的免疫原性結(jié)構(gòu)，其中糖類配體是Lewis抗原或SialylTn。48.根據(jù)權(quán)利要求47的免疫原性結(jié)構(gòu)，其中Lewis抗原是唾液酸化的。49.根據(jù)權(quán)利要求47的免疫原性結(jié)構(gòu)，其中Lewis抗原是唾液酸化的。50.根據(jù)權(quán)利要求42至49任一項的免疫原性結(jié)構(gòu)，其中T細胞輔助肽配體來源于選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素或匙孔血藍蛋白的類毒素。51.根據(jù)權(quán)利要求42至50任一項的免疫原性結(jié)構(gòu)，其中T細胞輔助肽配體具有氨基酸序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA。52.藥物組合物，包含一種或多種根據(jù)權(quán)利要求42至51任一項的免疫原性結(jié)構(gòu)。53.根據(jù)權(quán)利要求52的藥物組合物，含有至少一種疫苗佐劑。54.根據(jù)權(quán)利要求52或權(quán)利要求53的組合物用于制備免疫治療用藥物的用途。55.權(quán)利要求54的用途，其中藥物用于預(yù)防或治療癌癥。56.根據(jù)權(quán)利要求42至51任一項的免疫原性結(jié)構(gòu)用于分離適于檢測和分離腫瘤細胞的抗體的用途。57.—種通過將至少一種抗原和至少一種佐劑與納米顆粒的核心綴合而制備權(quán)利要求1至39任一項的納米顆粒的方法，該方法包括用接頭衍生抗原；用接頭衍生佐劑；并將接頭衍生的抗原和佐劑與制備納米顆粒的核心的反應(yīng)物反應(yīng)，使得在納米顆粒自裝配過程中，納米顆粒核心與抗原和佐劑通過接頭連接。58.權(quán)利要求57的方法，其中接頭基團包括巰基、烷基、二元醇基團或肽基團。59.權(quán)利要求57的方法，其中接頭基團包括C2-C15烷基和/或C2-C15二元醇。60.權(quán)利要求57的方法，其中接頭基團是C2-C15烷基或六甘醇-Cll烷基。61.權(quán)利要求57至60任一項的方法，其中反應(yīng)混合物包含衍生抗原、衍生佐劑、金屬和/或半導(dǎo)體原子的鹽和還原劑以制備納米顆粒。62.用權(quán)利要求57至61任一項的方法可獲得的納米顆粒。63.權(quán)利要求1至39任一項的納米顆粒，或權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的組合物，用于預(yù)防性或治標(biāo)性治療。64.權(quán)利要求1至39任一項的納米顆粒，或權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的組合物，用作疫苗。65.權(quán)利要求11至15任一項的納米顆粒用于制備治療癌癥用藥物的用途。66.權(quán)利要求65的用途，其中癌癥是結(jié)腸、胰腺、腸、肺、肝、卵巢或膀胱癌。67.權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的納米顆粒用于制備治療傳染病用藥物的用途。68.權(quán)利要求67的用途，其中疾病是瘧疾或結(jié)核。69.權(quán)利要求65至68任一項的用途，其中納米顆粒包含膜易位信號，以便它們能夠滲透細胞膜。全文摘要公開了包含佐劑和抗原的納米顆粒，抗原如腫瘤和病原體抗原，以及它們在一系列應(yīng)用中的用途，如癌癥和傳染病的治療?；诩{米顆粒或抗體的帶有糖類配體的免疫原性結(jié)構(gòu)，以及它們用于治療和預(yù)防目的的用途，和用于分離和檢測對抗該糖類結(jié)構(gòu)的抗體的用途。文檔編號A61K9/51GK101123990SQ200580041147公開日2008年2月13日申請日期2005年9月30日優(yōu)先權(quán)日2004年10月1日發(fā)明者A·G·巴雷恩特斯,G·C·穆德,G·希姆勒,J·L·德帕斯卡雷拉,M·馬丁洛馬斯,R·基歇斯,R·奧赫達馬丁內(nèi)斯德卡斯蒂利亞,S·佩納德斯烏利亞特,T·W·拉德馬赫申請人:Mida科技有限公司;伊格尼昂公司