專利名稱：抑制哺乳動物細(xì)胞死亡或炎癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及外源施用的蛋白質(zhì)(例如Bcl-2蛋白質(zhì))抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的用途。
背景技術(shù)：
程序性細(xì)胞死亡是哺乳動物發(fā)育的正常和必需部分。例如，人類胎兒各手指的發(fā)育需要發(fā)育中的手指之間的組織的程序性細(xì)胞死亡。然而，引起程序性細(xì)胞死亡的生物化學(xué)過程由多種疾病和損傷觸發(fā)。例如，程序性細(xì)胞死亡可由創(chuàng)傷性損傷、中風(fēng)、心肌梗塞、器官移植以及腸系膜與外周血管疾病觸發(fā)。所述的程序性細(xì)胞死亡進(jìn)一步破壞損傷或患病有機(jī)體的健康。
各種前述類型的疾病和損傷典型地包括當(dāng)先前中斷的血流恢復(fù)至活組織時產(chǎn)生的某些局部缺血和再灌注損傷。例如，冠狀動脈的阻塞由于心臟組織暫時性缺乏血液供應(yīng)可引起心肌死亡。當(dāng)通過施用溶血栓藥物使血流恢復(fù)至心肌時其它的肌肉可死亡。
慢性和急性炎癥也可損害或殺傷哺乳動物的活細(xì)胞。例如，假以時日與肺氣腫相關(guān)的炎癥可引起肺部損傷。炎癥可觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡，或通過某些其它的機(jī)制損傷活組織。因此，持續(xù)需要用于抑制哺乳動物細(xì)胞死亡和/或炎癥的方法和組合物。
發(fā)明概述依照前述，一方面本發(fā)明提供了用于抑制哺乳動物細(xì)胞死亡和/或炎癥的方法，其中所述的方法各自包括將足以抑制哺乳動物細(xì)胞死亡和/或炎癥的量的Bcl蛋白質(zhì)施用于哺乳動物的步驟。本發(fā)明該方面的方法可用于，例如，治療哺乳動物的涉及細(xì)胞死亡的損傷或疾病(如，局部缺血-再灌注損傷)，和/或治療哺乳動物的涉及炎癥的損傷或疾病(如，哮喘)。本發(fā)明該方面的方法也可用于，例如，預(yù)防性地治療哺乳動物以防止或延遲細(xì)胞死亡和/或炎癥的發(fā)作。
另一方面，本發(fā)明提供了當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的鑒定方法，其中本發(fā)明該方面的方法各自包括篩選多個蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用至哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的步驟。本發(fā)明該方面的方法可用于，例如，鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)，以及可用于治療哺乳動物的涉及細(xì)胞死亡和/或炎癥的損傷或疾病的Bcl蛋白質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供了當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的鑒定方法，其中本發(fā)明該方面的方法各自包括分析由實驗獲得的數(shù)據(jù)的步驟，其中篩選多個蛋白質(zhì)以鑒定抑制哺乳動物的細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)。本發(fā)明該方面的方法可用于，例如，鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥以及可用于治療哺乳動物的涉及細(xì)胞死亡和/或炎癥的損傷或疾病的Bcl蛋白質(zhì)。
附圖簡述當(dāng)與附圖一起理解時，本發(fā)明的前述方面和許多伴隨的優(yōu)點將更容易領(lǐng)會，通過參考以下的詳細(xì)描述，變得更容易理解，其中

圖1顯示了在骨髓細(xì)胞中表達(dá)外源性人類Bcl-2(hBcl-2)的十一只轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖(在圖1中標(biāo)記為Bcl-2)，和在骨髓細(xì)胞中不表達(dá)外源性hBcl-2的九只非轉(zhuǎn)基因(對照)C57BL/6小鼠血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖。在所述的小鼠已經(jīng)經(jīng)受如實施例1所描述的局部缺血-再灌注損傷后測量肌酸激酶的濃度。肌酸激酶的濃度以單位/升(U/L)表示(*p＜0.05)。
圖2顯示了已經(jīng)經(jīng)受局部缺血-再灌注損傷的八只對照C57BL/6小鼠(在圖2中標(biāo)記為C57)血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖，和已經(jīng)經(jīng)受局部缺血損傷的八只EμT-Bcl-2小鼠(在圖2中標(biāo)記為EμBcl-2(T細(xì)胞))血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖(*p＜0.05)。
圖3顯示了來自六只對照C57BL/6小鼠(縮寫為C57)，在T細(xì)胞中表達(dá)hBcl-2的五只EμT-Bcl-2小鼠(縮寫為EμT)，在B細(xì)胞中表達(dá)hBcl-2的六只EμB-Bcl-2小鼠(縮寫為EμB)，和在骨髓細(xì)胞中表達(dá)hBcl-2的五只hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠(縮寫為hMRP)的腿肌肉組織中TUNEL陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的柱狀圖。如實施例3所描述，所有的小鼠已經(jīng)經(jīng)受局部缺血-再灌注損傷(*p＜0.05，與C57相比)。
圖4顯示了局部缺血和再灌注后，六只小鼠(標(biāo)記為tg+小鼠)血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖，該六只小鼠在局部缺血前已經(jīng)接受了從在T淋巴細(xì)胞表達(dá)hBcl-2的小鼠中提取的血漿的注射。圖4還顯示了局部缺血和再灌注后，小鼠(標(biāo)記為tg-小鼠)血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖，該小鼠在局部缺血前已經(jīng)接受了從在T淋巴細(xì)胞不表達(dá)hBcl-2的六只同窩出生對照小鼠中提取的血漿的注射(*p＜0.05)。
圖5顯示了已使用表達(dá)hBcl-2的Jaws II白細(xì)胞注射的18只小鼠血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖(通過縮寫詞Bcl-2標(biāo)記)；已使用表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)的Jaws II白細(xì)胞注射的16只對照小鼠血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖(通過縮寫詞GFP標(biāo)記)；和已使用磷酸鹽緩沖液注射的12只對照小鼠血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖(通過縮寫詞PBS標(biāo)記)。在小鼠已經(jīng)經(jīng)受如實施例5所描述的局部缺血再灌注損傷后測量肌酸激酶的濃度(*p＜0.05)。
圖6顯示了局部缺血和再灌注后，十只小鼠(在圖6中標(biāo)記為JAWSII-Bcl-2)血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖，該十只小鼠在局部缺血前已經(jīng)被注射了來自表達(dá)Bcl-2的hBcl-2-Jaws II細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液介質(zhì)。圖6還顯示了局部缺血和再灌注后，九只小鼠(在圖6中標(biāo)記為JAWSII-GFP)血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖，該九只小鼠在局部缺血前已經(jīng)被注射了來自表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)的EGFP-Jaws II細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液介質(zhì)。所述的肌酸激酶濃度有顯著性差異，p＜0.05。
圖7顯示了局部缺血和再灌注后，已在局部缺血和再灌注前接受重組人類Bcl-2注射(每只小鼠1μg)的12只小鼠(標(biāo)記為rBcl-2)血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖；和局部缺血和再灌注后，已在局部缺血和再灌注前接受重組人類泛激素或用于注射重組Bcl-2的載體溶液注射的12只對照小鼠(標(biāo)記為對照)血漿中肌酸激酶濃度的柱狀圖。這兩種類型的對照之間肌酸激酶的濃度沒有差異，因此將這些對照數(shù)據(jù)合并。所述的肌酸激酶濃度有顯著性差異，p＜0.05。
圖8顯示了在骨髓細(xì)胞中表達(dá)hBcl-2的五只hMRP8-Bcl-2小鼠(在圖9中標(biāo)記為Bcl-2/2)和五只C57BL/6對照小鼠的梗死體積(V梗死)占左心室體積(VLV)百分?jǐn)?shù)的柱狀圖；C57BL/6對照小鼠和hMRP8-Bcl-2小鼠的梗死體積(V梗死)占風(fēng)險區(qū)域(area-at-risk)體積(VAAR)百分?jǐn)?shù)的柱狀圖；和C57BL/6對照小鼠和hMRP8-Bcl-2小鼠的風(fēng)險區(qū)域體積(VAAR)占左心室體積(VLV)百分?jǐn)?shù)的柱狀圖。Bcl-2/2小鼠和C57BL/6小鼠之間的V梗死/VLV和V梗死/VAAR有顯著性差異，p＜0.05。
圖9顯示了六只C57BL/6對照小鼠和四只EμT-Bcl-2小鼠(在T細(xì)胞中表達(dá)Bcl-2)的梗死體積(V梗死)占左心室體積(VLV)百分?jǐn)?shù)的柱狀圖；C57BL/6對照小鼠和EμT-Bcl-2小鼠的梗死體積(V梗死)占風(fēng)險區(qū)域體積(VAAR)百分?jǐn)?shù)的柱狀圖；和C57BL/6對照小鼠和EμT-Bcl-2小鼠的風(fēng)險區(qū)域體積(VAAR)占左心室體積(VLV)百分?jǐn)?shù)的柱狀圖；EμT-Bcl-2小鼠和C57BL/6小鼠之間的V梗死/VLV和V梗死/VAAR有顯著性差異，p＜0.05。
圖10顯示了接受表達(dá)外源性人類Bcl-2的CD11b+細(xì)胞注射(在經(jīng)受心肌局部缺血和再灌注前)的七只C57BL/6小鼠(這些小鼠在圖10中標(biāo)為Bcl-2/2)，和已接受來自它們同窩出生小鼠的CD11b+細(xì)胞(未表達(dá)外源性Bcl-2)輸注(在經(jīng)受心肌局部缺血和再灌注前)的六只C57BL/6對照小鼠(標(biāo)記為同窩出生Tg-)的梗死體積(V梗死)占左心室體積(VLV)百分?jǐn)?shù)，梗死體積(V梗死)占風(fēng)險區(qū)域體積(VAAR)百分?jǐn)?shù)，和風(fēng)險區(qū)域體積(VAAR)占左心室體積(VLV)百分?jǐn)?shù)的柱狀圖(*p＜0.05)。
圖11顯示了在盲腸結(jié)扎和穿刺前已使用重組人類Bcl-2(rBcl-2)注射的12只小鼠和在盲腸結(jié)扎和穿刺前沒有使用rBcl-2注射的12只對照小鼠的存活率曲線。所述的存活率曲線有顯著性差異，p＜0.05。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述一方面，本發(fā)明提供了抑制哺乳動物細(xì)胞死亡和/或抑制哺乳動物炎癥的方法。各方法包括將足以抑制哺乳動物細(xì)胞死亡和/或炎癥的量的Bcl蛋白質(zhì)施用于哺乳動物的步驟。
抑制哺乳動物細(xì)胞死亡包括全部或部分抑制哺乳動物細(xì)胞死亡。抑制哺乳動物炎癥包括全部或部分抑制哺乳動物炎癥。
本發(fā)明的方法可在任何哺乳動物中實施，例如靈長類(例如，人類)、犬屬哺乳動物(例如，家犬)、貓屬哺乳動物(例如，家貓)、牛、綿羊、馬、山羊和豬。
在本發(fā)明的實施中，可將一種或多種類型的Bcl蛋白質(zhì)施用于正經(jīng)受細(xì)胞死亡的哺乳動物(例如，經(jīng)受引起細(xì)胞死亡的疾病，或接受引起細(xì)胞死亡的內(nèi)科治療，或正經(jīng)受引起細(xì)胞死亡的損傷)。引起細(xì)胞死亡的疾病，或內(nèi)科治療的實例包括中風(fēng)，心肌梗死，心臟停搏，急性冠脈綜合征/不穩(wěn)定型心絞痛，心肺旁路移植，創(chuàng)傷性休克，器官移植，腸系膜、視網(wǎng)膜和外周血管疾病，燒傷，凍傷，肢體或手指腳趾再植，創(chuàng)傷性腦損傷，癲癇持續(xù)狀態(tài)，帕金森病，亨廷頓病，肌萎縮性側(cè)索硬化癥，阿爾茨海默病，黃斑變性，急性顱內(nèi)出血，急性腎衰竭，急性肺損傷/成人呼吸窘迫綜合征，敗血癥，腦膜炎，急性缺血或酒精性肝損傷，斯耶格倫氏病，放射誘發(fā)的腸炎，和放射誘發(fā)的骨髓衰竭。
在本發(fā)明的實施中，可將一種或多種類型的Bcl蛋白質(zhì)正經(jīng)受炎癥的哺乳動物(例如，正經(jīng)受炎癥性疾病，或正經(jīng)受引起炎癥的損傷，或接受引起炎癥的內(nèi)科治療)。炎癥性疾病的實例包括哮喘，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，肝炎(例如，病毒性慢性肝炎)，銀屑病，異位性皮炎，天皰瘡，腎小球腎炎，動脈粥樣硬化，結(jié)節(jié)病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，韋格納氏(wegener′s)綜合征，古德帕斯丘(Goodpasture’s)綜合征，巨細(xì)胞性動脈炎，結(jié)節(jié)性動脈外膜炎，特發(fā)性肺纖維化，急性肺損傷，慢性阻塞性肺病，流感后肺炎，嚴(yán)重急性呼吸器官綜合癥(SARS)，肺結(jié)核，瘧疾，敗血癥，腦型瘧，恰加斯氏(Chagas)病，血吸蟲病，細(xì)菌和病毒性腦膜炎，囊性纖維病，多發(fā)性硬化癥，阿爾茨海默病，腦脊髓炎，鐮狀細(xì)胞貧血，胰腺炎，移植(例如，宿主介導(dǎo)的移植組織(例如造血干細(xì)胞或器官)的排斥反應(yīng)，移植物介導(dǎo)的宿主反應(yīng)，例如移植物抗宿主病(graft vs.host disease)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，自身免疫糖尿病，甲狀腺炎，和放射性肺炎。
另外，在本發(fā)明的實施中可將一種或多種Bcl蛋白質(zhì)施用于沒有正經(jīng)受炎癥性疾病或與細(xì)胞死亡相關(guān)疾病的哺乳動物。例如，可將一種或多種類型的Bcl蛋白質(zhì)預(yù)防性地施用于哺乳動物以防止細(xì)胞死亡或炎癥的發(fā)作，或降低細(xì)胞死亡或炎癥發(fā)作的可能性，或降低隨后產(chǎn)生的細(xì)胞死亡和/或炎癥的嚴(yán)重性。所述的哺乳動物正經(jīng)受引起細(xì)胞死亡和/或炎癥的疾病，施用所述的Bcl蛋白質(zhì)以防止細(xì)胞死亡或炎癥的發(fā)作，或降低細(xì)胞死亡或炎癥發(fā)作的可能性，或降低隨后產(chǎn)生的細(xì)胞死亡和/或炎癥的嚴(yán)重性。例如，以下范疇的人類患者可受益于防止細(xì)胞死亡或炎癥的發(fā)作，或降低細(xì)胞死亡或炎癥發(fā)作可能性的Bcl蛋白質(zhì)的施用具有中風(fēng)風(fēng)險的經(jīng)受短暫性腦缺血發(fā)作的患者，具有心肌梗死風(fēng)險的不穩(wěn)定型心絞痛患者，具有多器官功能障礙綜合征風(fēng)險的創(chuàng)傷或燒傷患者，以及具有術(shù)后器官功能障礙風(fēng)險的正經(jīng)受心肺旁路移植術(shù)的患者。
如此處所用，術(shù)語“Bcl蛋白質(zhì)”指當(dāng)施用于哺乳動物時抑制哺乳動物細(xì)胞死亡，和/或當(dāng)施用于哺乳動物時抑制哺乳動物炎癥的蛋白質(zhì)，并且其至少是以下蛋白質(zhì)組之一的成員(標(biāo)記為組(a)至(g))。
組(a)包括和下述SEQ ID NO1列出的氨基酸序列至少有35％相同(例如，至少40％，或至少45％，或至少50％，或至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)
RRVGDELEKEYERAFSSFSAQLHVTPTTARELFGQVATQLFSDGNINWGRVVALFSFGGFLALKLVDKELEDLVSRLASFLSEFLAKTLANWLRENGGW(SEQ ID NO1)。
SEQ ID NO1列出的氨基酸序列是蛋白質(zhì)Bcl-2家族成員Bcl結(jié)構(gòu)域的共有序列。
組(b)包括至少12種氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)和由SEQ IDNO2(GenBank登錄號AAH27258)列出的氨基酸序列組成的Bcl-2蛋白質(zhì)片段至少有50％相似(例如，至少55％，至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)與以下的Bcl-2蛋白質(zhì)片段至少有50％相似TGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWD(SEQ ID NO3)。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和由SEQ ID NO2列出的氨基酸序列組成的Bcl-2蛋白質(zhì)的片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。所述的Bcl-2類蛋白質(zhì)是抑制細(xì)胞死亡的細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)蛋白(參見，例如，J.M.Adams和S.Cory，Science 2811322-1326(8月28，1998年)；S.Cory，等，Oncogene 228590-8607，2003)。
組(c)包括至少12種氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)和A-1蛋白質(zhì)(也稱為Bfl-1蛋白質(zhì))的片段至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)，其中所述的A-1蛋白質(zhì)由SEQ ID NO4(GenBank登錄號AAC50438)列出的氨基酸序列組成。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和以下的A-1蛋白質(zhì)片段至少有50％相似FGYIYRLAQDYLQCVLQIPQPGSGPSKTSR(SEQ ID NO5)。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和由SEQ ID NO4列出的氨基酸序列組成的A-1蛋白質(zhì)片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。A-1蛋白質(zhì)是Bcl-2的同源物(homolog)并且是抑制細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)蛋白(參見，例如，A.Karsan等，Blood 87(8)3089-3096，4月15，1996；S.S.Choi等，Mammalian Genome5781-782，1997)。
組(d)包括至少12種氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)和Bcl-X蛋白質(zhì)片段至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)，其中所述的Bcl-X蛋白質(zhì)由SEQ ID NO6(GenBank登錄號Q07817)列出的氨基酸序列組成。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和以下的Bcl-X蛋白質(zhì)片段至少有50％相似MSQSNRELVVDFLSYKLSQKGYSWSQF(SEQID NO7)。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和由SEQ ID NO6列出的氨基酸序列組成的Bcl-X蛋白質(zhì)片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。Bcl-X蛋白質(zhì)是Bcl-2的同源物并且是抑制細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)蛋白(參見，例如，L.H.Boise等，Cell 74(4)597-608，8月27，1993。
組(e)包括至少12種氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)和由SEQ IDNO8(GenBank登錄號AAB09055)列出的氨基酸序列組成的Bcl-W蛋白質(zhì)片段至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和以下的Bcl-W蛋白質(zhì)片段至少有50％相似SAPDTRALVADFVGYKLRQKGYVC(SEQ ID NO9)。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和由SEQ ID NO8列出的氨基酸序列組成的Bcl-W蛋白質(zhì)片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。Bcl-W蛋白質(zhì)是Bcl-2的同源物，并且是抑制細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)蛋白(參見，例如，L.Gibson等，Oncogene 13(4)665-675，8月15，1996)。
組(f)包括至少12種氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)和Mcl-1蛋白質(zhì)片段至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)，其中所述的Mcl-1蛋白質(zhì)由SEQ ID NO10(GenBank登錄號AAF64255)列出的氨基酸序列組成。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和以下的Mcl-1蛋白質(zhì)片段至少有50％相似DLYRQSLEIISRYLREQATG(SEQ ID NO11)。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和由SEQ ID NO10列出的氨基酸序列組成的Mcl-1蛋白質(zhì)片段至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。Mcl-1蛋白質(zhì)是Bcl-2的同源物，并且是抑制細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)蛋白。
組(g)和由以下氨基酸序列組成的BH4結(jié)構(gòu)域至少有50％相似(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相似)的蛋白質(zhì)PRLDIRGLVVDYVTYKLSQNGYEW(SEQ ID NO12)。在某些實施方案中，所述的蛋白質(zhì)和由SEQ ID NO12列出的氨基酸序列組成的BH4結(jié)構(gòu)域至少有50％相同(例如，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同)。BH4(Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域4)是在Bcl-2、Bcl-X和Bcl-W蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的N-末端結(jié)構(gòu)域。SEQ IDNO12列出的氨基酸序列是蛋白質(zhì)Bcl-2家族BH4結(jié)構(gòu)域的共有序列。
如此處所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括具有至少12個氨基酸的蛋白質(zhì)。
如此處所用，結(jié)合本發(fā)明實施中有用的蛋白質(zhì)，術(shù)語“片段”指至少12個相連的氨基酸，并且可包括完整的蛋白質(zhì)氨基酸序列。
兩個蛋白質(zhì)序列上下文中的序列同一性(一般以同一性百分?jǐn)?shù)表示)指當(dāng)所述的兩個序列在特定的對比視窗中進(jìn)行比對以求最大對應(yīng)性時兩個序列中相同的氨基酸殘基數(shù)目(例如，如果將兩個蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，每個蛋白質(zhì)具有100個氨基酸，并且第一個序列中的75個氨基酸與第二個序列中的75個氨基酸相同并且比對，那么所述的同一性百分?jǐn)?shù)是75％)。此處提供的序列同一性值指使用GAP(例如，GCG程序(Accelrys，Inc.，SanDiego，Calif.)version 10)利用以下參數(shù)獲得的值使用GAP加權(quán)50和長度加權(quán)3的同一性百分?jǐn)?shù)。將候選蛋白質(zhì)和參考蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列進(jìn)行比對。GAP使用Needleman&Wunsch J.MoI.Biol.48443-53，1970的運算法則，來找出兩個完整序列最大化匹配數(shù)目和最小化缺口數(shù)目的比對?？墒褂门cGAP相當(dāng)?shù)姆椒āＰg(shù)語“相當(dāng)?shù)姆椒ā敝溉魏蔚男蛄袑Ρ确椒?，例如序列對比程序，其對任意兩個討論的序列所生成的比對與GAP所生成的相應(yīng)的比對相比，具有相同的氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分?jǐn)?shù)。
序列相似性是兩個被比蛋白質(zhì)序列相關(guān)度的統(tǒng)計度量。相似性百分?jǐn)?shù)通過基于化學(xué)相似性(例如，所述的對比氨基酸是否是酸性、堿性、疏水、芳香族等)和/或進(jìn)化距離(其量度為將編碼被比氨基酸對中一個成員的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a所述對中另一個成員的密碼子所需要的堿基對變化的最小數(shù)目)分配數(shù)值至每對被比氨基酸的計算機(jī)程序進(jìn)行計算。在根據(jù)經(jīng)驗將兩個序列進(jìn)行最適比對后，通過反復(fù)對比所有可能的比對而做出計算(參見，例如，Henikoff， S.，和Henikoff，J.G，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA8910915-10919，1992)。例如，序列相似性可使用用于完全比對的ClustalW比對程序進(jìn)行測定，單CPU模式，使用GONNET矩陣，空位開放罰分100，空位封閉罰分-1，空位延伸罰分2和空位分離罰分4。在比對的序列中，相似性定義為兩個氨基酸相同或具有保守取代或具有半保守取代。所述的ClustalW比對程序可在例如因特網(wǎng)上的the European BioinformaticsInstitute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge，CBlO ISD，U.K.網(wǎng)頁上獲得。
在本發(fā)明的實施中有用的Bcl-2蛋白質(zhì)氨基酸序列的代表性實例在通過國家生物技術(shù)信息中心，美國醫(yī)學(xué)實驗室，8600 Rockville Pike，Bethesda，Maryland 20894的Entrez搜索工具得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，于以下的登錄號下列出(此處通過引用將每個鑒定的Bcl-2蛋白質(zhì)氨基酸序列并入本文)AAN17784.1；AAB17352.1；
AAC53460.1；AAK15454.1；AAC53458.1；AAB17354.1；AAA82174.1；AAF88137.1；AAC72232.1；CAC10003.1；AAC53459.1；AAA19257.1；CAA57886.1；AAB17353.1；AAB96881.1；CAA58557.1；AAA82173.1；AAC15799.1；AAA51039.1；AAK15455.1；AAK31308.1；AAK31307.1；CAA80657.1；AAF89532.1；AAK31306.1；BAB85856.2；AAP35872.1；AAH19307.1；BAB71819.1；CAA80061.1；AAF33212.1；AAP36940.1；CAA04597.1；AAB07677.1；AAR92491.1；AAA37281.1；AAH68988.1；AAC60701.2；AAK92201.1；CAB92245.1；AAA37282.1；BAC33767.1；AAP47159.1；AAA77686.1；BAA01978.1；BAC37060.1；AAA77687.1；AAA53662.1；CAA29778.1；AAH27258.1；AAO26045.1；AAB53319.1；BAC24136.1；AAA35591.1；CAA78018.1；BAC81344.1；BAD05044.1；AAA51814.1；AAA51813.1；AAN03862.1；CAA57844.1；AAH40369.1；BAB28740.1；BAB62748.1；AAH44130.1；AAH71291.1；AAK81706.1；AAH74505.1；AAO64470.1；BAD32203.1；CAA57845.1；AAO64468.1；AAH74021.1；AAC64200.1；AAB86430.1；AAB09056.1；BAB29912.1；BAB23468.1；AAB09055.1；BAA19666.2；AAH73259.1；CAF93123.1；AAO13177.2；CAF96873.1；AAL35559.1；AAP21091.1；AAB97953.1；AAG02475.1；AAK55419.1；AAH27536.1；AAB97956.1；AAH28762.1；AAB97954.1；AAO89009.1；AAP35767.1；AAH16281.1；AAC50438.1；AAC50288.1；CAG46735.1；AAP36152.1；CAG02784.1；CAA70566.1；AAF89533.1；AAO22992.1；AAA03620.1；CAG46760.1；BAC40796.1；CAA73684.1；BAC53619.1；AAH55592.1；AAH66960.1；AAC48806.1；AAF71267.1；AAH04431.1；AAO74828.1；AAA93066.1；AAA74466.1；CAA58997.1；CAG33700.1；BAB85810.1；AAH14175.1；AAA03619.1；AAF98242.1；AAM74949.1；CAD10744.1；AAF71760.1；AAD13295.1；AAH78835.1；AAA75200.1；AAC60700.2；AAH53380.1；AAH18228.1；BAB28776.1；AAA03622.1；AAD31644.1；AAF36411.1；AAC26327.1；AAM34436.1；CAE54428.1；AAH03839.1；AAH21638.1；AAH05427.1；AAC31790.1；BAC77771.1；AAA74467.1；AAF64255.1；AAP36208.1；AAP35286.1；AAH71897.1；AAH17197.1；AAF74821.1；AAD13299.1；AAG00896.1；AAH78871.1；AAH30069.1；AAAC53582.1；AAB87418.1；BAC21258.1；AAF09129.1；AAH63201.1；AAK06406.1；AAR84081.1；AAP36565.1；AAP35936.1；AAH06203.1；AAD51719.1；AAD31645.1；和AAC50142.1。
Bcl蛋白質(zhì)包括，例如，天然存在的Bcl蛋白質(zhì)，可引入非天然氨基酸的合成Bcl蛋白質(zhì)，和其中蛋白質(zhì)，肽，氨基酸序列，或其它化學(xué)結(jié)構(gòu)聯(lián)接至Bcl蛋白質(zhì)一個部分(例如，N末端或C末端)的Bcl融合蛋白質(zhì)。可融合至Bcl蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)或化學(xué)結(jié)構(gòu)的代表性實例包括人血清蛋白、免疫球蛋白、聚乙二醇，或其它蛋白質(zhì)或化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如增加Bcl蛋白質(zhì)血清半衰期，或增強(qiáng)Bcl蛋白質(zhì)功效，或降低Bcl蛋白質(zhì)免疫原性的蛋白質(zhì)或化學(xué)結(jié)構(gòu)。
Bcl蛋白質(zhì)抑制哺乳動物細(xì)胞死亡和/或抑制哺乳動物炎癥的能力可在，例如，經(jīng)受局部缺血-再灌注損傷的哺乳動物中進(jìn)行評價。例如，可使用以下的標(biāo)記物和/或試驗中的一種或多種來評價Bcl蛋白質(zhì)抑制經(jīng)受局部缺血-再灌注損傷的哺乳動物細(xì)胞死亡和/或炎癥的能力1.通過骨骼肌局部缺血-再灌注后哺乳動物血漿或血清中肌酸激酶濃度的降低來顯示炎癥和/或細(xì)胞死亡的抑制(參見，例如，此處的實施例9，和Iwata，A.，等，Blood1002077，2002)；2.通過繼哺乳動物心臟或哺乳動物大腦局部缺血-再灌注后梗死尺寸大小的減少來顯示炎癥和/或細(xì)胞死亡的抑制(參見，例如，此處的實施例10，和Palazzo，A.J.，Am.J.Physiol.275H2300，1998；Piot，C，Circulation 961598，1997)；3.通過繼哺乳動物腎臟局部缺血-再灌注后血漿尿素氮(BUN)和/或肌酸的減少來顯示炎癥和/或細(xì)胞死亡的抑制(參見，例如，Daemen，M.，J.Clin.Invest.104541，1999；Vukicevic，S.，J.Clin.Invest.102202，1998)；4.通過繼哺乳動物肝臟局部缺血-再灌注后谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和/或谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的減少來顯示炎癥和/或細(xì)胞死亡的抑制(參見，例如，Cursio，R.，F(xiàn)ASEB J.13253，1999)；5.通過繼哺乳動物肺局部缺血-再灌注后動脈血氧含量的改善來顯示炎癥和/或細(xì)胞死亡的抑制；6.通過繼哺乳動物肺局部缺血-再灌注后肺水腫的減少來顯示炎癥和/或細(xì)胞凋亡的抑制(參見，例如，Kowalski，T.F.，J.Appl.Physiol.65125，1990)；7.通過經(jīng)受局部缺血-再灌注損傷的組織中(例如，骨骼肌，心臟，大腦，肺，腸，腎，或肝臟)細(xì)胞死亡標(biāo)記物的減少(例如，通過由末端轉(zhuǎn)移酶末端標(biāo)記法(TUNEL)評價的DNA鏈斷裂減少，通過半胱天冬酶的活化減少，通過磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞表面的表達(dá)增加，通過電泳后180-200個堿基對的DNA梯度減少)來顯示細(xì)胞死亡的抑制(參見，例如，Iwata等，Blood 1002077，2002；Piot，C，Circulation 961598，1997；Namura，S.，J Neurosci.183659，1998；Noda，T.，Am.J.Physiol.274G270，1998；和Cursio，R.，F(xiàn)ASEB J.13253，1999)。
作為Bcl蛋白質(zhì)施用結(jié)果的炎癥和/或細(xì)胞死亡的抑制也可在經(jīng)受敗血癥(例如，起因于盲腸結(jié)扎和穿刺的敗血癥，起因于細(xì)菌性肺炎的敗血癥，起因于細(xì)菌性腹膜炎的敗血癥)的哺乳動物，或接受引起敗血癥的物質(zhì)(例如，脂多糖、細(xì)菌脂蛋白、脂胞壁酸)注射或輸注(例如，注射或輸注入腹腔，注射或輸注入肺，皮下注射或輸注，真皮內(nèi)注射或輸注)的哺乳動物中進(jìn)行評價。作為Bcl蛋白質(zhì)施用結(jié)果的炎癥和/或細(xì)胞死亡的抑制通過繼注射或輸注引起敗血癥的物質(zhì)引發(fā)敗血癥之后哺乳動物存活率的提高來顯示。
Bcl蛋白質(zhì)的施用通過任何有效的途徑達(dá)到，例如，口服或胃腸外。胃腸外遞送的方法包括局部、動脈內(nèi)、皮下、骨髓內(nèi)、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)施用。Bcl蛋白質(zhì)可連同適宜的藥學(xué)上可接受的載體施用，包括賦形劑及其它有助于將Bcl蛋白質(zhì)施用于哺乳動物受體的化合物。其他詳細(xì)的制劑和施用技術(shù)可見于，例如，最新版的“Remington′SPharmaceutical Sciences”(MaackPublishing Co，Easton PA)。
口服施用的Bcl蛋白質(zhì)可使用本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體，以適于口服施用的劑量進(jìn)行配制。此類載體使得Bcl蛋白質(zhì)能夠配制成適于受體攝取的片劑、藥丸、錠劑、膠囊、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等。
口服使用的Bcl蛋白質(zhì)可以通過下述方法獲得，例如，將一種或多種Bcl蛋白質(zhì)與固體賦形劑組合，任選地研磨所得的混合物，如果需要，在加入適宜的其它化合物后，加工混合物顆粒得到片劑或錠劑的核心。適宜的賦形劑包括碳水化合物或蛋白質(zhì)填充劑。這些包括，但不局限于，糖類，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，或山梨醇，來源于玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素例如甲基纖維素；羥丙甲纖維素，或羧甲基纖維素鈉；和樹膠包括阿拉伯膠和西黃蓍膠；以及蛋白質(zhì)，例如明膠和膠原。如果需要，可加入崩解劑或增溶劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，海藻酸或其鹽，例如海藻酸鈉。
錠劑核心具有適宜的包衣例如濃縮的糖溶液，其也可包含阿拉伯膠，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波普凝膠，聚乙二醇，和/或二氧化鈦，漆溶液，和適宜的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。可將染料或色素加入片劑或錠劑的包衣中用于產(chǎn)品鑒定或表征活性化合物的量(即，劑量)。
可口服使用的Bcl蛋白質(zhì)可以配制成，例如，如由明膠制成的推合式膠囊，以及由明膠和包衣例如甘油或山梨醇制成的密封軟膠囊。推合式膠囊可包含與填充劑或粘合劑例如乳糖或淀粉，潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂，及任選穩(wěn)定劑混合的Bcl蛋白質(zhì)。在軟膠囊中，所述的Bcl蛋白質(zhì)可溶解或混懸于適宜的液體，例如脂肪油，液體石蠟，或具有或沒有穩(wěn)定劑的液體聚乙二醇中。
用于胃腸外施用的Bcl蛋白質(zhì)包括一種或多種Bcl蛋白質(zhì)的水溶液。為了注射，Bcl蛋白質(zhì)可在水溶液，優(yōu)選在生理學(xué)上可相容的緩沖液例如漢克氏(Hank′s)溶液，林格氏(ringer′s)液，或生理緩沖鹽水中配制。注射用水混懸劑可包含增加混懸液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉，山梨醇，或右旋糖酐。另外，Bcl蛋白質(zhì)的混懸液可制備為適宜的注射用油混懸劑。適宜的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或三酸甘油酯，或脂質(zhì)體。任選地，所述的混懸劑也可包含提高化合物溶解度以允許制備高濃度溶液的適宜穩(wěn)定劑或試劑。
為了局部或鼻腔施用，一般將適于透過特定屏障的滲透劑用于所述的制劑中。此類滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的。
Bcl蛋白質(zhì)可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)(例如，通過常規(guī)的混合、溶解、造粒、制備糖衣、磨細(xì)、乳化、封裝、包埋或冷凍干燥方法)被制成適于施用于哺乳動物的形式。所述的Bcl蛋白質(zhì)也可進(jìn)行修飾以提供適宜的釋放特征，例如，通過常規(guī)方式(例如，包衣)的緩釋釋放或靶向釋放。
所述的Bcl蛋白質(zhì)可作為鹽提供并且可與許多酸構(gòu)成，包括但不局限于鹽酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸。鹽比相應(yīng)的游離堿形式更易溶解于水或其它的質(zhì)子性溶劑中。
在已經(jīng)將此類Bcl蛋白質(zhì)在可接受載體中制成制劑后，可將它們放在適當(dāng)?shù)娜萜髦胁①N上標(biāo)簽使用。
再次通過代表性實例的方式，通過將Bcl蛋白質(zhì)施用于能夠吸收蛋白質(zhì)的機(jī)體膜，例如鼻，胃腸道和直腸膜而將其引入動物機(jī)體中。一般將所述的蛋白質(zhì)結(jié)合滲透促進(jìn)劑施用于吸收性膜。(參見，例如V.H.L.Lee，Crit.Rev.Ther.藥物載體系統(tǒng).569，1988；V.H.L.Lee，J Controlled Release13213，1990；V.H.L.Lee，Ed.，肽和蛋白質(zhì)藥物的遞送，Marcel Dekker，NewYork，1991；DeBoer，A.G，等，J Controlled Release 13241，1990)。例如，STDHF是與膽鹽結(jié)構(gòu)相似的類固醇表面活性劑梭鏈孢酸的合成衍生物，并且已作為鼻腔遞送滲透促進(jìn)劑使用(Lee，W.A.，Biopharm.，11月./12月.22，1990)。
可結(jié)合另外的分子，例如脂質(zhì)將Bcl蛋白質(zhì)引入，以保護(hù)所述的蛋白質(zhì)免受酶降解。例如，與聚合物，特別是聚乙二醇(PEG)的共價連接，已用于保護(hù)機(jī)體內(nèi)某種蛋白質(zhì)免受酶水解并因此延長了半衰期(Fuertges，F(xiàn).，等，J Controlled Release 11139，1990)。已報道了許多用于蛋白質(zhì)遞送的聚合物系統(tǒng)(Bae，Y.H.，等，J Controlled Release 9271，1989；Hori，R.，等，Pharm.Res.5813，1989；Yamakawa，L，等，J Pharm.Sci.79505，1990；Yoshihiro，L，等，J.Controlled Release 70195，1989；Asano，M.，等，JControlled Release 9111，1989；Rosenblatt，J.，等，J.Controlled Release 9195，1989；Makino，K.，J.Controlled Release 2235，1990；Takakura，Y.，等，J.Pharm.Sci.75117，1989；Takakura，Y.，等，J.Pharm.Sci.78219，1989.)。
實際的施用量將取決于待施行治療的個體，并且優(yōu)選地是在無顯著副作用下獲得預(yù)期效果的最優(yōu)化的量。有效劑量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。當(dāng)然，所述的技術(shù)人員應(yīng)理解分開的部分劑量也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
對于任意的Bcl蛋白質(zhì)，所述的有效劑量最初可在任何適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?例如，靈長類、大鼠和豚鼠以及其它實驗動物)中進(jìn)行評價。所述的動物模型也通常用于獲得預(yù)期的濃度范圍和施用途徑。然后可使用此類信息確定人類或其它哺乳動物中的有用劑量和施用途徑。
Bcl蛋白質(zhì)的治療功效和可能的毒性可通過實驗動物中的標(biāo)準(zhǔn)藥物規(guī)程(例如，ED50，半數(shù)群體治療有效劑量；和LD50，50％半數(shù)群體致死劑量)進(jìn)行確定。治療作用和毒性作用的劑量比是治療指數(shù)，并且其可以ED50/LD50的比值表示。表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的Bcl蛋白質(zhì)是優(yōu)選的。將由動物研究獲得的數(shù)據(jù)用于制定一個供人類或其它哺乳動物使用的劑量范圍。此類化合物的劑量優(yōu)選地在具有很少或無毒性的包括ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述的劑量通常依賴使用的劑型，患者的過敏性，和施用途徑而在所述的范圍內(nèi)變動。
示例性的Bcl劑量包括在足以抑制哺乳動物細(xì)胞死亡和/或炎癥的時間周期內(nèi)施用至少50ng/kg/天，例如50ng/kg/天至50mg/kg/天，或例如0.5mg/kg/天至50mg/kg/天。典型地，將所述的Bcl蛋白質(zhì)多次施用于哺乳動物(例如，每日地)。例如，在1天至20天，或1天至40天，或1天至60天的周期內(nèi)將Bcl蛋白質(zhì)至少每天一次地施用于哺乳動物?？蓪cl蛋白質(zhì)無限期地施用于哺乳動物受體以治療慢性的醫(yī)學(xué)病癥(例如，在接受治療者剩余的壽命期間各天中至少每天一次)。如恰當(dāng)，“ng”是納克(nanogram或nanograms)的縮寫詞。恰當(dāng)?shù)?，“mg”是毫克(milligram或milligrams)的縮寫詞。恰當(dāng)?shù)?，“kg”是千克(kilogram或kilograms)的縮寫詞。
另一方面，本發(fā)明提供了當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的鑒定方法。本發(fā)明該方面的方法各自包括篩選多個蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的步驟。
在本發(fā)明該方面的實施中，至少篩選兩種蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)。因此，例如，可篩選兩種和100種之間的蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)；或，例如，可篩選100至500種蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)；或，例如，可篩選100至1000種蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)；或，例如，可篩選1000種以上的蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)。
可使用任何有用的試驗來鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)。例如，所述的有用試驗可為體外試驗，或體內(nèi)試驗，或包括體外部分和體內(nèi)部分的試驗。有用試驗的代表性實例包括在前描述的用于評價Bcl蛋白質(zhì)抑制哺乳動物細(xì)胞死亡，和/或在經(jīng)受局部缺血-再灌注損傷的哺乳動物中抑制炎癥能力的試驗。
另一方面，本發(fā)明提供了當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的鑒定方法。本發(fā)明該方面的方法各自包括由其中篩選多個蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的實驗獲得的數(shù)據(jù)的分析步驟。所述的分析可包括對比候選Bcl蛋白質(zhì)在體內(nèi)和/或體外對炎癥和/或細(xì)胞死亡的作用，和對比候選蛋白質(zhì)與非Bcl蛋白質(zhì)，或已修飾(例如，通過定點突變)成無生物學(xué)活性的Bcl蛋白質(zhì)對炎癥和/或細(xì)胞死亡的作用，或與某些其它的對照治療進(jìn)行對比。由候選Bcl蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抑制細(xì)胞死亡或炎癥的數(shù)量，與由對照治療產(chǎn)生的抑制細(xì)胞死亡和/或炎癥的數(shù)量相比具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著增加，說明所述的候選Bcl蛋白質(zhì)抑制了細(xì)胞死亡或炎癥。如果需要，可將所述的Bcl蛋白質(zhì)做進(jìn)一步研究。
此處公開的任何用于篩選多個Bcl蛋白質(zhì)以鑒定抑制哺乳動物細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的方法可用于本發(fā)明的該方面。
在本發(fā)明該方面的實施中，所述的分析數(shù)據(jù)是由其中篩選多個蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的實驗獲得的。例如，可篩選兩種和100種之間的蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)；或，例如，可篩選100至500種蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)；或，例如，可篩選100至1000種蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)；或，例如，可篩選1000種以上的蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)。
以下的實施例僅舉例說明當(dāng)前討論的用于實施本發(fā)明的最佳方式，而不應(yīng)認(rèn)為限制本發(fā)明。此處清楚地將所有引用的文獻(xiàn)通過引用并入本文。
實施例1本實施例顯示了在骨髓細(xì)胞中編碼抗凋亡蛋白質(zhì)、人類Bcl-2(SEQ IDNO14)的cDNA(SEQ ID NO13)的表達(dá)。骨髓細(xì)胞中Bcl-2蛋白質(zhì)(SEQ IDNO14)的表達(dá)減少了繼小鼠后肢長期局部缺血后的損傷。
本試驗使用了在骨髓細(xì)胞中表達(dá)重組人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的小鼠(hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠)，和在骨髓細(xì)胞中不表達(dá)重組人類Bcl-2(SEQID NO14)的對照小鼠。所述的hMRP-骨髓-Bcl-2小鼠以前為Lagasse，E.，和LL.Weissman，J.Exp.Med.1791047，1994所描述，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。這些小鼠是C57BL/6背景，以及對照小鼠是C57BL/6小鼠。
通過將腎動脈的主動脈末梢橫斷鉗閉90分鐘造成小鼠骨骼肌的局部缺血，然后移走夾鉗并將后肢持續(xù)再灌注3小時。再灌注結(jié)束時(移走夾鉗后3小時)將小鼠處死，并測量血漿肌酸激酶(CK)的濃度且用作為損傷的指標(biāo)(作為骨骼肌損傷的結(jié)果，肌酸激酶濃度增加)。
這些實驗的結(jié)果示于圖1。十一只hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠(標(biāo)為Bcl-2)的血漿肌酸激酶濃度顯著地低于九只對照C57BL/6小鼠的血漿肌酸激酶濃度(*p＜0.05)，表明人類Bcl-2(SEQ ID NO14)保護(hù)小鼠免受局部缺血-再灌注損傷。然而，文獻(xiàn)已報道來源于hMRP8-骨髓-Bcl-2的嗜中性白細(xì)胞表現(xiàn)出減少的細(xì)胞凋亡(Lagasse，E.，和Weissman，I.L.，J Exp.Med.1791047，1994)，并且可能所述的嗜中性白細(xì)胞凋亡通過在損傷部位釋放毒性產(chǎn)物而促使形成局部缺血-再灌注損傷。因此，可能Bcl-2防止了嗜中性白細(xì)胞的凋亡，從而減少在骨髓細(xì)胞中表達(dá)Bcl-2的小鼠的局部缺血-再灌注損傷數(shù)量。
然而，由于使用抗CD 18mAb阻止它們遷移進(jìn)入組織中對局部缺血-再灌注損傷沒有影響，因此嗜中性粒細(xì)胞參與長期的90分鐘局部缺血時間的局部缺血再灌注損傷是不太可能的。(Iwata，A.等，Blood，1002077(2002))。此外，如實施例2所示，T淋巴細(xì)胞中人類Bcl-2(SEQ ID NO13)的過量表達(dá)也保護(hù)防御局部缺血-再灌注損傷。因此，骨髓細(xì)胞中人類Bcl-2的過量表達(dá)通過防止白細(xì)胞凋亡保護(hù)肌肉似乎是不可能的。
實施例2本實施例顯示了T淋巴細(xì)胞中人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的過量表達(dá)減少了繼小鼠后肢長期局部缺血后的骨骼肌損傷。
本實驗使用了在Eμ啟動子控制下于T細(xì)胞中表達(dá)外源性人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的，C57BL/6基因背景的轉(zhuǎn)基因小鼠(EμT-Bcl-2小鼠)，和在T細(xì)胞中不表達(dá)外源性Bcl-2(SEQ ID NO14)的八只C57BL/6對照小鼠(C57BL/6小鼠)。所述的EμT-Bcl-2小鼠先前已描述并表現(xiàn)出僅在T淋巴細(xì)胞表達(dá)Bcl-2(SEQ ID NO14)(Strasser，A.，等，Cell 67889，1991，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)。
通過如實施例1所描述的橫斷鉗閉誘發(fā)后肢的局部缺血，并且維持局部缺血90分鐘隨后進(jìn)行3小時的再灌注。在實驗結(jié)束時取血液樣品用于測定EμT-Bcl-2小鼠和C57Bl/6小鼠的肌酸激酶(CK)濃度。如圖2所示，八只EμT-Bcl-2小鼠的血清CK顯著地低于八只C57BL/6對照小鼠的血清CK(標(biāo)為C57)(*p＜0.05)。
實施例3本實施例顯示了白細(xì)胞中Bcl-2(SEQ ID NO14)的過量表達(dá)減少了繼后肢長期局部缺血和再灌注后骨骼肌中的DNA鏈斷裂。
本實驗使用了在Eμ啟動子控制下于T細(xì)胞中表達(dá)外源性人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Eμ-T-Bcl-2小鼠)；在Eμ啟動子控制下于B細(xì)胞中表達(dá)外源性人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Eμ-B-Bcl-2小鼠)(在Strasser，A.，Proc.Natl Acad.Set 558661，1991中報道)；在骨髓細(xì)胞中表達(dá)外源性人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的轉(zhuǎn)基因小鼠(hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠)(在實施例1中描述)；以及不表達(dá)外源性Bcl-2(SEQ ID NO14)的對照小鼠(C57BL/6小鼠)。
已知隨后進(jìn)行骨骼肌再灌注的長期局部缺血導(dǎo)致了DNA鏈斷裂，并且使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑z-VAD的治療防止了所述的鏈斷裂并減少血漿CK濃度(Iwata，A.，等，Blood 1002077，2002)。使用如生產(chǎn)商所描述的TUNEL技術(shù)將來自對照小鼠、Eμ-T-Bcl-2小鼠、Eμ-B-Bcl-2小鼠和hMRP8-骨髓-Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠的腿組織在福爾馬林中固定并染色以鑒定DNA鏈斷裂(In Situ Cell Death Detection Kit，Roche Applied Science，PO Box 50414，9115 Hague Road，Indianapolis，IN46250-0414)。
全部四種類型小鼠的染色陽性(表明存在DNA鏈斷裂)的核數(shù)目占核總數(shù)目的百分?jǐn)?shù)示于圖3。所述的對照C57BL/6小鼠(標(biāo)為C57)與每種轉(zhuǎn)基因菌株相比具有顯著多的陽性核數(shù)目(*p＜0.05)。在一種細(xì)胞類型(在B細(xì)胞中的EμB，T細(xì)胞中的EμT，或骨髓細(xì)胞中的hMRP8)中表達(dá)Bcl-2(SEQID NO14)的小鼠中，在骨骼肌和內(nèi)皮細(xì)胞，而不是表達(dá)Bcl-2(SEQ IDNO14)的其它細(xì)胞中防止了DNA鏈斷裂，表明表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞釋放了保護(hù)細(xì)胞防御DNA鏈斷裂的分子。即，保護(hù)作為“反”作用而發(fā)生。
實施例4本實施例顯示了來自T淋巴細(xì)胞過量表達(dá)hBcl-2(SEQ ID NO14)的小鼠的血漿減少了隨后進(jìn)行再灌注的長期局部缺血后的損傷。
本實驗使用了在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)外源性人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Eμ-T-Bcl-2小鼠)(在實施例2中描述)；和不表達(dá)外源性人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的同窩出生對照小鼠(C57B1/6小鼠)。取EμT-Bcl-2小鼠和它們同窩出生的對照小鼠的血液放入肝素中并通過離心提取血漿。在所述的小鼠經(jīng)受如此處實施例1所描述的90分鐘局部缺血和3個小時再灌注的前一天，將1ml來自EμT-Bcl-2小鼠，或1ml來自同窩出生對照小鼠的血漿，注射入C57BL/6小鼠的腹腔中。再灌注結(jié)束時從所述的小鼠抽取血液并測定血漿CK的濃度。這些實驗的結(jié)果示于圖4。接受來自EμT-Bcl-2小鼠(標(biāo)為tg+)血漿注射的六只小鼠與接受來自未表達(dá)外源性Bcl-2(SEQ ID NO14)的同窩出生對照小鼠(標(biāo)為tg-)血漿注射的六只小鼠相比，具有顯著低的CK濃度(*p＜0.05)。
這些結(jié)果表明hMRP8-Bcl-2小鼠中Bcl-2(SEQ ID NO14)的過量表達(dá)導(dǎo)致了起“反”作用的分子的釋放，其可被轉(zhuǎn)移至空白，對照、受體小鼠中并且保護(hù)受體小鼠防御局部缺血-再灌注損傷。
實施例5本實施例顯示了將轉(zhuǎn)基因Jaws II白血球細(xì)胞(其表達(dá)編碼Bcl-2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO14)的cDNA(SEQ ID NO13))，注射入小鼠與不使用Jaws II白血球細(xì)胞注射的對照小鼠相比，減少了局部缺血-再灌注損傷的數(shù)量。
高效率逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系的最新產(chǎn)生，連同含有允許表達(dá)兩種來自單個mRNA轉(zhuǎn)錄物的基因表達(dá)的內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(IRES)元件的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)的載體的發(fā)展，為基因轉(zhuǎn)錄至哺乳動物細(xì)胞提供了新的工具(參見，例如，Hitoshi，Y.，等，Immunity 8461，1998；Onishi，M.，等，Exp.Hematol.243241 996)。
將編碼hBcl-2(SEQ ID NO14)的cDNA(SEQ ID NO13)在IRES部位的上游插入所述的pBM-IRES-EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，其中在IRES序列的下游克隆增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)的cDNA以生成所述的pBM-hBcl-2-IRES-EGFP載體。使用親嗜性包裝細(xì)胞系Phoenix生成病毒顆粒以轉(zhuǎn)染由ATCC獲得的Jaws II細(xì)胞。所述的Phoenix細(xì)胞系和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為Hitoshi，Y.，等，Immunity 5461，1998，和Onishi，M.，等，Exp.Hematol.24324，1996所描述。
對照J(rèn)aws II細(xì)胞僅表達(dá)EGFP。從所述的hBcl-2-JawsII細(xì)胞或EGFP-JawsII細(xì)胞中挑選出具有EGFP高表達(dá)的細(xì)胞，然后在C57BL/6小鼠經(jīng)受長期局部缺血-再灌注的前一天注射入所述的小鼠中。如圖5所示，使用hBcl-2-JawsII細(xì)胞(標(biāo)為Bcl-2)注射的18只小鼠與使用磷酸鹽緩沖液(標(biāo)為PBS)注射的12只小鼠，或使用EGFP-JawsII細(xì)胞(標(biāo)為GFP)注射的16只小鼠相比，具有顯著低的血漿CK濃度(*p＜0.05)。
實施例6本實施例顯示了與已使用來自表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)(EGFP，EGFP-JawsII細(xì)胞)的Jaws II細(xì)胞體外培養(yǎng)物上清液注射的小鼠血漿CK濃度相比，在已使用來自Jaws II細(xì)胞(其表達(dá)Bcl-2(SEQ ID NO14))體外培養(yǎng)物上清液注射的小鼠中經(jīng)受局部缺血再灌注損傷小鼠的血漿CK濃度較低。所述的hBcl-2-Jaws II細(xì)胞和EGFP-Jaws II細(xì)胞如實施例5所描述。
在培養(yǎng)開始后24小時收集來自hBcl-2-Jaws II細(xì)胞和EGFP-Jaws II細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基且使用具有將近3kD的分子大小截留(cut-off)的離心過濾器濃縮約10倍。在長期局部缺血-再灌注之前24小時將1ml來自hBcl-2-Jaws II細(xì)胞或EGFP-Jaws II細(xì)胞的濃縮培養(yǎng)基注射入C57BL/6小鼠的腹腔內(nèi)。在局部缺血-再灌注后從所述小鼠提取血漿，并測定血漿CK濃度。如圖6所示，使用hBcl-2-Jaws II細(xì)胞上清液(標(biāo)為JAWSII-Bcl-2)注射的十只小鼠的血漿肌酸激酶濃度顯著地低于(p＜0.05)使用EGFP-Jaws II細(xì)胞上清液(標(biāo)為JAWSII-GFP)注射的九只小鼠的血漿肌酸激酶濃度。
實施例7本實施例顯示了培養(yǎng)的JawsII-Bcl-2細(xì)胞將人類Bcl-2(SEQ ID NO14)分泌至培養(yǎng)物上清液中。
將表達(dá)人類Bcl-2(SEQ ID NO14)或增強(qiáng)的綠色熒光蛋白質(zhì)(EGFP)的Jaws II細(xì)胞(如實施例5所描述)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，并分別收集上清液和濃縮10倍。細(xì)胞在蛋白酶抑制劑雞尾酒(cocktail)中裂解然后將溶胞產(chǎn)物和細(xì)胞上清液經(jīng)受Bcl-2的免疫印跡分析。濃縮的培養(yǎng)物上清液和來自JawsII-Bcl-2的溶胞產(chǎn)物均含有Bcl-2蛋白質(zhì)，然而在濃縮的培養(yǎng)物上清液或JawsII-GFP細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物中并沒有檢測到Bcl-2蛋白質(zhì)。
實施例8本實施例顯示了在后腿局部缺血和再灌注前使用修飾的重組Bcl-2(SEQ ID NO15)注射的小鼠中已經(jīng)經(jīng)受后腿局部缺血和再灌注的小鼠血漿肌酸激酶濃度顯著低于在后腿局部缺血和再灌注前沒有使用重組Bcl-2注射的小鼠血漿肌酸激酶濃度。SEQ ID NO15是在羧基末端缺少17個氨基酸，并且在羧基末端包括一連串的10個組氨酸殘基的人類Bcl-2。
在C57BL/6小鼠經(jīng)受如實施例1所描述的后肢局部缺血(90分鐘)和再灌注(180分鐘)的前一天，以每只小鼠1μg的重組人類Bcl-2(rBcl-2)(SEQ IDNO15)或每只小鼠1μg的重組人類泛激素(r泛激素)，或rBcl-2載體溶液對所述小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射。在90分鐘的后肢局部缺血和180分鐘的再灌注后取血液樣品用于血漿肌酸激酶濃度的測定。兩組對照(r泛激素和載體溶液)之間的肌酸激酶濃度沒有差異因此將這些數(shù)據(jù)合并。如圖7所示，在后腿局部缺血和再灌注前使用重組人類Bcl-2(SEQ ID NO15)(標(biāo)為rBcl-2)注射的12只小鼠中已經(jīng)經(jīng)受后腿局部缺血和再灌注的小鼠血漿肌酸激酶濃度顯著地(p＜0.05)低于接受r泛激素或載體溶液(標(biāo)為對照)的12只小鼠血漿肌酸激酶濃度。
實施例9本實施例顯示了受制于骨髓-約束啟動子的人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的過量表達(dá)減少了繼小鼠心臟長期局部缺血后的心肌損傷。
為了確定白細(xì)胞中Bcl-2蛋白質(zhì)的過量表達(dá)是否是在組織而不是骨骼肌中起保護(hù)作用，使用已知為CD18-非依賴性的局部缺血時間考察心肌的局部缺血-再灌注損傷(Palazzo，AJ.，等，Am.J.Physiol.275H2300，1998)。麻醉對照C57BL/6和hMRP8-Bcl-2小鼠，將它們的氣管插管，并將它們進(jìn)行機(jī)械通氣。施行左側(cè)開胸術(shù)，然后將一根8-0縫線從左心耳的尖端左前降支冠狀動脈(LAD)下方2-3mm通過，并阻塞所述的血管。注意不要損壞所述的血管。阻塞通過顏色改變直觀地確定。阻塞1小時后小心地移走結(jié)扎線并按照顏色通過直接目測法確定的再灌注被重新建立。小心閉合胸部以除去胸部空氣，將所述的動物拔管，給予0.5ml的溫鹽水，并放入加熱的培養(yǎng)箱中。兩小時后重新麻醉所述的小鼠，將它們的氣管插管，并將它們進(jìn)行機(jī)械通風(fēng)。通過原先的切口暴露出心臟并將原先的8-0縫線重新打結(jié)。通過放血處死所述的小鼠并將夾鉗橫過主動脈放置，然后通過插入一根30號注射針將1ml的1.5％偶氮藍(lán)注射入主動脈中以便使用染料灌注所述的冠狀循環(huán)。
切除心臟，垂直長軸切成4部分，將其在5ml的1％氯化三苯基四氮唑(TTC)中培養(yǎng)30分鐘。在切除心房和右心室后，將左心室在10％的緩沖甲醛溶液中放置過夜。將各個心臟切片稱重，然后在裝備有CCD照相機(jī)的顯微鏡下顯像。梗死區(qū)域(未著色的)，風(fēng)險區(qū)域(AAR)(未著色部位加上紅棕色部位)以及左心室部位的總面積(AAR加上偶氮藍(lán)染色部位)通過面積法(planimetry)測量。梗死體積通過以下的方程估計
V梗死＝A1W1+A2W2+A3W3+A4W4其中A1、A2、A3和A4分別是1、2、3和4部分中梗死區(qū)域的百分?jǐn)?shù)，W1、W2、W3和W4分別是1、2、3和4部分中梗死區(qū)域的相應(yīng)重量。所述的風(fēng)險體積使用適當(dāng)?shù)膮^(qū)域以相似的方法進(jìn)行計算。
圖8顯示了梗死體積占左心室體積的百分?jǐn)?shù)和占風(fēng)險體積的百分?jǐn)?shù)。通過對比所述的五只hMRP8-Bcl-2小鼠(標(biāo)為Bcl-2/2)與五只C57BL/6對照小鼠的兩種度量，五只hMRP8-Bcl-2小鼠具有減少的梗死體積，并且這兩組之間的風(fēng)險體積與左心室體積的比無差異。hMRP8-Bcl-2小鼠與C57BL/6相比，V梗死/VLV和V梗死/VAAR顯著地減少(p＜0.05)。這兩組之間的風(fēng)險體積與左心室體積的比(VAAR/VLV)無差異。
實施例10本實施例顯示了在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)外源性人類Bcl-2(SEQ ID NO14)的轉(zhuǎn)基因小鼠，比在T淋巴細(xì)胞中不表達(dá)外源性Bcl-2蛋白質(zhì)(SEQ IDNO14)的對照小鼠更少遭受到隨后進(jìn)行再灌注的局部缺血引起的心肌損傷。
另外的心肌局部缺血-再灌注實驗使用在Eμ啟動子控制下于T淋巴細(xì)胞中過量表達(dá)Bcl-2(SEQ ID NO14)的EμT-Bcl-2小鼠，和C57BL/6對照小鼠施行。所述的實驗如實施例9所描述，使冠狀動脈阻塞1小時隨后通過2小時的再灌注施行。將梗死體積(V梗死)作為占左心室體積(VLV)的百分?jǐn)?shù)，或占風(fēng)險區(qū)域體積(VAAR)的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計算。如圖9所示，Eμ-T淋巴細(xì)胞Bcl-2小鼠與C57BL/6小鼠相比，V梗死/VLV和V梗死/VAAR顯著地減少(*p＜0.05)。所述的兩組之間的風(fēng)險體積與左心室體積的比(VAAR/VLV)無差異。
實施例11本實施例顯示了表達(dá)外源性Bcl-2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO14)的骨髓細(xì)胞的過繼性轉(zhuǎn)移減少了繼小鼠心臟長期局部缺血后的心肌損傷。
將hMRP8-骨髓-Bcl-2小鼠和同窩出生的對照小鼠麻醉，處死并從它們的長骨中提取骨髓。使用生產(chǎn)商所描述的磁珠(Miltenyi Biotec，12740Earhart Avenue，Auburn，CA 95602，美國)從提取的骨髓中分離CD11b+細(xì)胞。在后肢局部缺血和再灌注之前18至24小時將接近107的所述細(xì)胞通過腹腔內(nèi)注射施用于C57BL/6對照小鼠。局部缺血過程是1小時，隨后進(jìn)行2小時的再灌注。梗死尺寸大小的測定使用與實施例9描述的相同技術(shù)完成。
圖10顯示了梗死體積占左心室體積的百分?jǐn)?shù)和占風(fēng)險區(qū)域體積的百分?jǐn)?shù)。通過對比接受來自hMRP8-Bcl-2小鼠(標(biāo)為Bcl-2/2)骨髓細(xì)胞的七只小鼠與接受來自同窩出生小鼠(標(biāo)為同窩出生Tg-)骨髓細(xì)胞的六只小鼠的兩種度量(V梗死/VLV和V梗死/VAAR)，前者具有顯著(*p＜0.05)減少的梗死體積。所述的兩組之間風(fēng)險體積與左心室體積的比(VAAR/VLV)無差異。
實施例12本實施例顯示了Bcl-2的過量表達(dá)通過“反”作用在敗血癥小鼠中提供了保護(hù)。
將經(jīng)盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)后的在人類MRP8啟動子控制下于骨髓細(xì)胞表達(dá)外源性Bcl-2(SEQ ID NO14)的轉(zhuǎn)基因小鼠(hMRP8-Bcl-2小鼠)，或在Eμ啟動子控制下于T淋巴細(xì)胞表達(dá)外源性Bcl-2(SEQ ID NO14)的轉(zhuǎn)基因小鼠(EμT-Bcl-2小鼠)與C57BL/6對照小鼠的存活率進(jìn)行對比。100％的hMRP8-Bcl-2小鼠經(jīng)CLP之后存活，而僅有25％的對照小鼠經(jīng)CLP之后存活。在單獨的實驗中，87.5％的EμT-Bcl-2小鼠經(jīng)CLP之后存活，而僅有22.2％的對照小鼠經(jīng)CLP之后存活(p＜0.05)。
將來自hMRP8-Bcl-2小鼠，或來自C57BL/6小鼠的CD11b-陽性骨髓細(xì)胞引入隨后經(jīng)受CLP的C57BL/6小鼠中。100％接受來自hMRP8-Bcl-2小鼠的CD11b-陽性骨髓細(xì)胞的小鼠經(jīng)CLP之后存活，而接受來自C57BL/6小鼠的CD11b-陽性骨髓細(xì)胞的小鼠經(jīng)CLP之后無一存活。
將來自hMRP8-Bcl-2小鼠，或來自C57BL/6小鼠的CD11b-陽性骨髓細(xì)胞引入隨后經(jīng)受CLP的Rag-1-/-小鼠(其無任何成熟的T或B細(xì)胞)中。87.5％的接受來自hMRP8-Bcl-2小鼠CD11b-陽性骨髓細(xì)胞的小鼠經(jīng)CLP之后存活，然而僅有12.5％的接受來自C57BL/6小鼠CD11b-陽性骨髓細(xì)胞的小鼠經(jīng)CLP之后存活。(p＜0.05)。
這些實驗表明hBcl-2(SEQ ID NO14)的表達(dá)在CLP中起保護(hù)作用，并且所述的保護(hù)作用獨立于淋巴細(xì)胞。
實施例13本實施例顯示了腹腔內(nèi)注射重組人類Bcl-2(SEQ ID NO15)提高了經(jīng)受作為盲腸結(jié)扎和穿刺結(jié)果的嚴(yán)重敗血癥的小鼠的存活率。
在經(jīng)受如實施例12所描述的盲腸結(jié)扎和穿刺之前12-24小時，給八只C57BL/6小鼠進(jìn)行每只小鼠1μg的重組人類Bcl-2腹腔注射，給八只C57BL/6小鼠進(jìn)行每只小鼠1μg的重組人類泛激素腹腔注射。在經(jīng)受如實施例12所描述的盲腸結(jié)扎和穿刺之前12-24小時，給另外四只C57BL/6小鼠皮下注射10μg的麥芽糖結(jié)合蛋白-hBcl-2融合蛋白，給四只C57BL/6小鼠進(jìn)行鹽水處理。所述的小鼠每天使用抗生素治療兩次，并且每天使用重組人類Bcl-2或重組人類泛激素或鹽水進(jìn)行另外3天的處理。在10天里通過使用定量的評估形式對不可逆的敗血癥體征進(jìn)行每天兩次的觀察，并且如果認(rèn)為所述的小鼠正經(jīng)受不可逆的敗血癥時將它們處死。圖11是基于這些實驗結(jié)果的存活率曲線，并且清楚地表示了使用重組人類Bcl-2(標(biāo)為rBcl-2)治療的12只小鼠與使用重組人類泛激素或鹽水處理的12只小鼠(標(biāo)為對照)相比，具有顯著(p＜0.05)改善的存活率。
實施例14本實施例顯示了在后腿局部缺血和再灌注前使用修飾的重組人類A1(在羧基末端減去25個氨基酸并加入6個組氨酸的人類A1)(SEQ IDNO16)注射的小鼠中已經(jīng)經(jīng)受后腿局部缺血和再灌注的小鼠血漿肌酸激酶濃度顯著低于在局部缺血和再灌注前使用重組泛激素注射的小鼠血漿肌酸激酶濃度。重組人類A1(SEQ ID NO16)是Bcl-2蛋白質(zhì)。
在C57BL/6小鼠經(jīng)受如實施例1所描述的后肢局部缺血(90分鐘)和再灌注(180分鐘)的前一天，使用重組人類A1(rAl)(SEQ ID NO16)或重組人類泛激素(r泛激素)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射。在180分鐘的再灌注后，取血液樣品用于血漿肌酸激酶濃度的測定。在后腿局部缺血和再灌注前使用rA1(SEQID NO16)注射的12只小鼠中已經(jīng)經(jīng)受后腿局部缺血和再灌注的小鼠血漿肌酸激酶濃度顯著(p＜0.05)低于使用r泛激素注射的12只對照小鼠血漿肌酸激酶濃度。
實施例15本實施例顯示了BH4結(jié)構(gòu)域片段保護(hù)了C57BL/6小鼠后肢防御局部缺血-再灌注損傷。
通過在C57BL/6小鼠后肢使用90分鐘的止血器制造骨骼肌的局部缺血，然后移走所述的止血器并允許另外3小時的再灌注。使用活性肽1(SEQID NO17)或活性肽2(SEQ ID NO18)或活性肽3(SEQ ID NO19)，或使用亂序(scrambled)的(對照)肽(SEQ ID NO20)治療所述的小鼠。肽-1(SEQ IDNO17)來自Bcl-2的BH4結(jié)構(gòu)域。肽-2(SEQ ID NO18)來自A1的第一個α螺旋。肽-3(SEQ ID NO19)來自Bcl-XL的BH4結(jié)構(gòu)域。肽1(SEQ IDNO17)、肽2(SEQ ID NO18)、肽3(SEQ ID NO19)和所述亂序的(對照)肽(SEQ ID NO20)的氨基酸序列在表1中列出。
表1TGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWD肽-1 (SEQ ID NO17)FGYIYRLAQDYLQCVLQIPZPGSGP肽-2 (SEQ ID NO18)MSQSNRELVVDFLSYKLSQKGYSWSQF 肽-3 (SEQ ID NO19)TWHMYGNQRDYIGDRSKIVYKLEYE亂序的肽 (SEQ ID NO20)在3個小時的再灌注結(jié)束時，將所述的小鼠處死，并取血液用于血漿肌酸激酶(CK)濃度的測定。所述的CK濃度用作為肌肉損傷的指標(biāo)。CK濃度的提高表明較高水平的肌肉損傷。來自3個獨立實驗的結(jié)果與對照肽相比表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用(p＜0.05)。肽1(SEQ ID NO17)治療的小鼠CK濃度是19,020+/-5481 IU/L(n＝12)，與之相比，使用對照肽(SEQ ID NO20)的CK濃度是60,530+/-5759 IU/L(n＝12)。肽2(SEQ ID NO18)治療的小鼠CK濃度是33,860+/-5997 IU/L(n＝11)，與之相比，使用對照肽(SEQ IDNO20)的CK濃度是69,430+/-11,170 IU/L(n＝12)。肽3(SEQ ID NO19)治療的小鼠CK濃度是49,500+/-3,901IU/L(n＝5)，與之相比，使用對照肽(SEQID NO20)的CK濃度是80,880+/-11,430 IU/L(n＝6)。
雖然已經(jīng)對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進(jìn)行了舉例說明和描述，但是應(yīng)該理解可對其作出各種變化，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
要求專有權(quán)或特權(quán)的本發(fā)明的實施方案如下述權(quán)利要求所定義。
序列表<110>華盛頓大學(xué)約翰.M.哈爾蘭羅伯特.K.威恩巖石 晶子瓊.塔普約翰.李<120>抑制哺乳動物細(xì)胞死亡或炎癥的方法<130>UWOTL126524<150>US60/714,511<151>2004-10-04<150>US60/709,053<151>2005-08-16<160>20<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>99<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工肽<400>1Arg Arg Val Gly Asp Glu Leu Glu Lys Glu Tyr Glu Arg Ala Phe Ser1 5 10 15Ser Phe Ser Ala Gln Leu His Val Thr Pro Thr Thr Ala Arg Glu Leu20 25 30Phe Gly Gln Val Ala Thr Gln Leu Phe Ser Asp Gly Asn Ile Asn Trp35 40 45
Gly Arg Val Val Ala Leu Phe Ser Phe Gly Gly Phe Leu Ala Leu Lys50 55 60Leu Val Asp Lys Glu Leu Glu Asp Leu Val Ser Arg Leu Ala Ser Phe65 70 75 80Leu Ser Glu Phe Leu Ala Lys Thr Leu Ala Asn Trp Leu Arg Glu Asn85 90 95Gly Gly Trp<210>2<211>239<212>PRT<213>人類<400>2Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met1 5 10 15Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala20 25 30Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile35 40 45Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp50 55 60Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala65 70 75 80
Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr85 90 95Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe100 105 110Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly115 120 125Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp130 135 140Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu145 150 155 160Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp165 170 175Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn180 185 190Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro195 200 205Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala210 215 220Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys225 230 235<210>3<211>25<212>PRT
<213>人類<400>3Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met Lys Tyr Ile His Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp20 25<210>4<211>175<212>PRT<213>人類<400>4Met Thr Asp Cys Glu Phe Gly Tyr Ile Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Tyr1 5 10 15Leu Gln Cys Val Leu Gln Ile Pro Gln Pro Gly Ser Gly Pro Ser Lys20 25 30Thr Ser Arg Val Leu Gln Asn Val Ala Phe Ser Val Gln Lys Glu Val35 40 45Glu Lys Asn Leu Lys Ser Cys Leu Asp Asn Val Asn Val Val Ser Val50 55 60Asp Thr Ala Arg Thr Leu Phe Asn Gln Val Met Glu Lys Glu Phe Glu65 70 75 80Asp Gly Ile Ile Asn Trp Gly Arg Ile Val Thr Ile Phe Ala Phe Glu85 90 95Gly Ile Leu Ile Lys Lys Leu Leu Arg Gln Gln Ile Ala Pro Asp Val
100 105 110Asp Thr Tyr Lys Glu Ile Ser Tyr Phe Val Ala Glu Phe Ile Met Asn115 120 125Asn Thr Gly Glu Trp Ile Arg Gln Asn Gly Gly Trp Glu Asn Gly Phe130 135 140Val Lys Lys Phe Glu Pro Lys Ser Gly Trp Met Thr Phe Leu Glu Val145 150 155 160Thr Gly Lys Ile Cys Glu Met Leu Ser Leu Leu Lys Gln Tyr Cys165 170 175<210>5<211>30<212>PRT<213>人類<400>5Phe Gly Tyr Ile Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Tyr Leu Gln Cys Val Leu1 5 10 15Gln Ile Pro Gln Pro Gly Ser Gly Pro Ser Lys Thr Ser Arg20 25 30<210>6<211>233<212>PRT<213>人類<400>6Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1 5 10 15
Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu20 25 30Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro35 40 45Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala50 55 60Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val65 70 75 80Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu85 90 95Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu100 105 110His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn115 120 125Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe130 135 140Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln145 150 155 160Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp165 170 175His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val180 185 190
Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu195 200 205Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val210 215 220Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys225 230<210>7<211>27<212>PRT<213>人類<400>7Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe20 25<210>8<211>193<212>PRT<213>人類<400>8Met Ala Thr Pro Ala Ser Ala Pro Asp Thr Arg Ala Leu Val Ala Asp1 5 10 15Phe Val Gly Tyr Lys Leu Arg Gln Lys Gly Tyr Val Cys Gly Ala Gly20 25 30Pro Gly Glu Gly Pro Ala Ala Asp Pro Leu His Gln Ala Met Arg Ala
35 40 45Ala Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Phe Arg Arg Thr Phe Ser Asp Leu50 55 60Ala Ala Gln Leu His Val Thr Pro Gly Ser Ala Gln Gln Arg Phe Thr65 70 75 80Gln Val Ser Asp Glu Leu Phe Gln Gly Gly Pro Asn Trp Gly Arg Leu85 90 95Val Ala Phe Phe Val Phe Gly Ala Ala Leu Cys Ala Glu Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Met Glu Pro Leu Val Gly Gln Val Gln Glu Trp Met Val Ala115 120 125Tyr Leu Glu Thr Arg Leu Ala Asp Trp Ile His Ser Ser Gly Gly Trp130 135 140Ala Glu Phe Thr Ala Leu Tyr Gly Asp Gly Ala Leu Glu Glu Ala Arg145 150 155 160Arg Leu Arg Glu Gly Asn Trp Ala Ser Val Arg Thr Val Leu Thr Gly165 170 175Ala Val Ala Leu Gly Ala Leu Val Thr Val Gly Ala Phe Phe Ala Ser180 185 190Lys<210>9<211>24
<212>PRT<213>人類<400>9Ser Ala Pro Asp Thr Arg Ala Leu Val Ala Asp Phe Val Gly Tyr Lys1 5 10 15Leu Arg Gln Lys Gly Tyr Val Cys20<210>10<211>350<212>PRT<213>人類<400>10Met Phe Gly Leu Lys Arg Asn Ala Val Ile Gly Leu Asn Leu Tyr Cys1 5 10 15Gly Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ser Gly Gly Ala Thr Arg Pro Gly20 25 30Gly Arg Leu Leu Ala Thr Glu Lys Glu Ala Ser Ala Arg Arg Glu Ile35 40 45Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ile Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ser50 55 60Pro Pro Ser Thr Leu Thr Pro Asp Ser Arg Arg Val Ala Arg Pro Pro65 70 75 80Pro Ile Gly Ala Glu Val Pro Asp Val Thr Ala Thr Pro Ala Arg Leu85 90 95
Leu Phe Phe Ala Pro Thr Arg Arg Ala Ala Pro Leu Glu Glu Met Glu100 105 110Ala Pro Ala Ala Asp Ala Ile Met Ser Pr0 Glu Glu Glu Leu Asp Gly115 120 125Tyr Glu Pro Glu Pro Leu Gly Lys Arg Pro Ala Val Leu Pro Leu Leu130 135 140Glu Leu Val Gly Glu Ser Gly Asn Asn Thr Ser Thr Asp Gly Ser Leu145 150 155 160Pro Ser Thr Pro Pro Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asp Asp Leu Tyr Arg165 170 175Gln Ser Leu Glu Ile Ile Ser Arg Tyr Leu Arg Glu Gln Ala Thr Gly180 185 190Ala Lys Asp Thr Lys Pro Met Gly Arg Ser Gly Ala Thr Ser Arg Lys195 200 205Ala Leu Glu Thr Leu Arg Arg Val Gly Asp Gly Val Gln Arg Asn His210 215 220Glu Thr Ala Phe Gln Gly Met Leu Arg Lys Leu Asp Ile Lys Asn Glu225 230 235 240Asp Asp Val Lys Ser Leu Ser Arg Val Met Ile His Val Phe Ser Asp245 250 255Gly Val Thr Asn Trp Gly Arg Ile Val Thr Leu Ile Ser Phe Gly Ala260 265 270
Phe Val Ala Lys His Leu Lys Thr Ile Asn Gln Glu Ser Cys Ile Glu275 280 285Pro Leu Ala Glu Ser Ile Thr Asp Val Leu Val Arg Thr Lys Arg Asp290 295 300Trp Leu Val Lys Gln Arg Gly Trp Asp Gly Phe Val Glu Phe Phe His305 310 315 320Val Glu Asp Leu Glu Gly Gly Ile Arg Asn Val Leu Leu Ala Phe Ala325 330 335Gly Val Ala Gly Val Gly Ala Gly Leu Ala Tyr Leu Ile Arg340345350<210>11<211>20<212>PRT<213>人類<400>11Asp Leu Tyr Arg Gln Ser Leu Glu Ile Ile Ser Arg Tyr Leu Arg Glu1 5 10 15Gln Ala Thr Gly20<210>12<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工肽<400>12
Pro Arg Leu Asp Ile Arg Gly Leu Val Val Asp Tyr Val Thr Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Trp20<210>13<211>720<212>DNA<213>人類<220>
<221>CDS<222>(1)..(717)<400>13atg gcg cac gct ggg aga agt ggt tac gat aac cgg gag ata gtg atg48Met Ala His Ala Gly Arg Ser Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met1 5 10 15aag tac atc cat tat aag ctg tcg cag agg ggc tac gag tgg gat gcg96Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala20 25 30gga gat gtg ggc gcc gcg ccc ccg ggg gcc gcc ccc gca ccg ggc ttc 144Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Phe35 40 45ttc tcc tcc cag ccc ggg cac acg ccc cat cca gcc gca tcc cgg gac 192Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp50 55 60ccg gtc gcc agg acc tcg cca cta cag acc ccg gct gcc ccc ggc gcc 240Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala65 70 75 80gcc gcg ggg cct gcg ctc agc ccg gtg cca cct gtg gtc cac ctg acc 288Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr85 90 95
ctc cgc cag gcc ggc gac gac ttc tcc cgc cgc tac cgc cgc gac ttc 336Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe100 105 110gcc gag atg tcc agc cag ctg cac ctg acg ccc ttc acc gcg cgg gga 384Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly115 120 125tgc ttt gcc acg gtg gtg gag gag ctc ttc agg gac ggg gtg aac tgg 432Cys Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp130 135 140ggg agg att gtg gcc ttc ttt gag ttc ggt ggg gtc atg tgt gtg gag 480Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu145 150 155 160agc gtc aac cgg gag atg tcg ccc ctg gtg gac aac atc gcc ctg tgg 528Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp165 170 175atg act gag tac ctg aac cgg cac ctg cac acc tgg atc cag gat aac 576Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn180 185 190gga ggc tgg gat gcc ttt gtg gaa ctg tac ggc ccc agc atg cgg cct 624Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro195 200 205ctg ttt gat ttc tcc tgg ctg tct ctg aag act ctg ctc agt ttg gcc 672Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala210 215 220ctg gtg gga gct tgc atc acc ctg ggt gcc tat ctg ggc cac aag tga 720Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys225 230 235<210>14<211>239<212>PRT<213>人類<400>14
Met Ala His Ala Gly Arg Ser Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met1 5 10 15Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala20 25 30Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Phe35 40 45Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp50 55 60Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala65 70 75 80Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr85 90 95Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe100 105 110Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly115 120 125Cys Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp130 135 140Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu145 150 155 160Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp165 170 175
Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn180 185 190Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro195 200 205Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala210 215 220Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys225 230 235<210>15<211>222<212>PRT<213>人類<400>15Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met1 5 10 15Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala20 25 30Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile35 40 45Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp50 55 60Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala65 70 75 80
Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr85 90 95Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe100 105 110Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly115 120 125Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp130 135 140Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu145 150 155 160Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp165 170 175Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn180 185 190Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro195 200 205Leu Phe Asp Phe His His His His His His His His His His210 215 220<210>16<211>158<212>PRT<213>人類<400>16Met Thr Asp Cys Glu Phe Gly Tyr Ile Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Tyr
1 5 10 15Leu Gln Cys Val Leu Gln Ile Pro Gln Pro Gly Ser Gly Pro Ser Lys20 25 30Thr Ser Arg Val Leu Gln Asn Val Ala Phe Ser Val Gln Lys Glu Val35 40 45Glu Lys Asn Leu Lys Ser Cys Leu Asp Asn Val Asn Val Val Ser Val50 55 60Asp Thr Ala Arg Thr Leu Phe Asn Gln Val Met Glu Lys Glu Phe Glu65 70 75 80Asp Gly Ile Ile Asn Trp Gly Arg Ile Val Thr Ile Phe Ala Phe Glu85 90 95Gly Ile Leu Ile Lys Lys Leu Leu Arg Gln Gln Ile Ala Pro Asp Val100 105 110Asp Thr Tyr Lys Glu Ile Ser Tyr Phe Val Ala Glu Phe Ile Met Asn115 120 125Asn Thr Gly Glu Trp Ile Arg Gln Asn Gly Gly Trp Glu Asn Gly Phe130 135 140Val Lys Lys Phe Glu Pro Lys Ser His His His His His His145 150 155<210>17<211>25<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工肽<400>17Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met Lys Tyr Ile His Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp20 25<210>18<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工肽<400>18Phe Gly Tyr Ile Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Tyr Leu Gln Cys Val Leu1 5 10 15Gln Ile Pro Glx Pro Gly Ser Gly Pro20 25<210>19<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工肽<400>19Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1 5 10 15
Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe20 25<210>20<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工肽<400>20Thr Trp His Met Tyr Gly Asn Gln Arg Asp Tyr Ile Gly Asp Arg Ser1 5 10 15Lys Ile Val Tyr Lys Leu Glu Tyr Glu20 2權(quán)利要求
1.一種用于抑制哺乳動物細(xì)胞死亡或炎癥的方法，所述的方法包括將足以抑制哺乳動物細(xì)胞死亡和炎癥組成的組中的一員的量的Bcl蛋白質(zhì)施用于所述哺乳動物的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中抑制所述哺乳動物細(xì)胞死亡。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中抑制所述哺乳動物炎癥。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中抑制由敗血癥引起的細(xì)胞死亡。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中抑制由局部缺血-再灌注引起的細(xì)胞死亡。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的哺乳動物患有一種包括細(xì)胞死亡或炎癥的疾病。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的哺乳動物是人類。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的Bcl蛋白質(zhì)靜脈施用。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的Bcl蛋白質(zhì)皮下施用。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的Bcl蛋白質(zhì)口服施用。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的Bcl蛋白質(zhì)透皮施用。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的Bcl蛋白質(zhì)選自(a)包含和SEQ ID NO1列出的氨基酸序列至少有35％相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)包含至少12個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)與Bcl-2蛋白質(zhì)片段至少有50％相似，其中所述的Bcl-2蛋白質(zhì)由SEQ ID NO2列出的氨基酸序列組成；(c)包含至少12個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)與A-1蛋白質(zhì)片段至少有50％相似，其中所述的A-1蛋白質(zhì)由SEQ ID NO4列出的氨基酸序列組成；(d)包含至少12個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)與Bcl-X蛋白質(zhì)片段至少有50％相似，其中所述的Bcl-X蛋白質(zhì)由SEQ ID NO6列出的氨基酸序列組成；(e)包含至少12個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)與Bcl-W蛋白質(zhì)片段至少有50％相似，其中所述的Bcl-W蛋白質(zhì)由SEQ ID NO8列出的氨基酸序列組成；(f)包含至少12個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)與Mcl-1蛋白質(zhì)片段至少有50％相似，其中所述的Mcl-1蛋白質(zhì)由SEQ ID NO10列出的氨基酸序列組成；以及(g)與SEQ ID NO12列出的氨基酸序列組成的BH4結(jié)構(gòu)域至少有50％相似的蛋白質(zhì)；
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的Bcl蛋白質(zhì)預(yù)防性地施用于哺乳動物受治療者。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的哺乳動物受治療者患有器官或肢體的局部缺血。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將Bcl蛋白質(zhì)在足以抑制哺乳動物由細(xì)胞死亡和炎癥組成的組中的一員的時間周期內(nèi)以50μg/kg/天至50μg/kg/天的量施用于所述哺乳動物受治療者。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中將所述的Bcl蛋白質(zhì)經(jīng)1天至20天的期間施用于所述的哺乳動物受治療者。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中將所述的Bcl蛋白質(zhì)多次施用于所述的哺乳動物受治療者。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中將所述的Bcl蛋白質(zhì)每天施用于所述的哺乳動物受治療者。
19.一種用于鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的方法，所述的方法包括篩選多個蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的步驟。
20.一種用于鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡或炎癥的Bcl蛋白質(zhì)的方法，所述的方法包括分析由至少一個實驗獲得的數(shù)據(jù)的步驟，在所述實驗中篩選多個蛋白質(zhì)以鑒定當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡的Bcl蛋白質(zhì)。
全文摘要
一方面本發(fā)明提供了抑制哺乳動物細(xì)胞死亡或炎癥的方法，其中所述的方法各自包括將足以抑制哺乳動物細(xì)胞死亡或炎癥的量的Bc1蛋白質(zhì)施用于哺乳動物的步驟。本發(fā)明還提供了當(dāng)施用于哺乳動物時抑制細(xì)胞死亡和炎癥的Bc1蛋白質(zhì)的鑒定方法。
文檔編號A61K38/00GK101072576SQ200580041661
公開日2007年11月14日 申請日期2005年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月4日
發(fā)明者約翰·M·哈爾蘭, 羅伯特·K·威恩, 巖石晶子, 瓊·塔普, 約翰·李 申請人:華盛頓大學(xué)