專利名稱：：經修飾的鏈球菌多糖及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及包含細菌多糖和經修飾的多糖的組合物，和更特別地涉及使用所述多糖在哺乳動物中誘導免疫應答的用途。背景B組鏈球菌是美國和世界其他地方新生兒敗血癥和腦膜炎的主要病因(Anthony和Okada，爿層^#<5(1，28:355-69，1977;Baker，脅/"固ifetf.，25:475-501,1980;DUlion等人，/iW/a""110(1):31-6,1987)。在1990年代以前，實質上所有的攻擊性B組鏈球菌(GBS)感染都是由血清型Ia、Ib、II和III引起的。在1990年代的兒科學文獻中出現(xiàn)新血清型V型感染新生要兒的報導(Greenberg等，J.Pediatr.123(3):494-5，1993;Hervas和Benedi，JPediatr.，123(5):839,1993:RenchandBaker,JPediatr.，122(4):638-40，1993)。由V型GBS引起的感染在1990年代中期前明顯地變得更加普遍，且該血清型現(xiàn)在被認為是新生嬰兒和孕婦中感染的共同病因(Zaleznik等人，Zo尸eW,30(2):276-81，2000)。V型GBS的莢膜多糖及其他GBS的莢膜多糖(CPS)具有共同的結構特征但其抗原性不同(Wessels等人，/chem.,266(11):6714-9，1991)。概述本發(fā)明部分地基于這樣的觀察，即可通過改變多糖的結構例如顯露多糖上的優(yōu)勢免疫表位來增強細菌多糖的免疫原性。我們已發(fā)現(xiàn)經化學修飾從而除去多糖的一個或多個側鏈殘基的GBSV型莢膜多糖(GBSVCPS或GBSVPS)在靈長類動物中引發(fā)有效的IgG反應。在一個方面，本發(fā)明表征了包含經修飾的細菌多糖的抗原組合物。所迷經修飾的細菌多糖可以是結構經修飾以顯露免疫原表位輛如優(yōu)勢免疫表位的多糖形式。多糖的修飾可增強多糖在宿主生物中的免疫原性和/或刺激免疫應答，該免疫應答在保護宿主生物方面比通過未修飾的(例如，天然的)多糖形式誘導的保護作用更有效?？稍鰪娒庖咴缘男揎棸◤亩嗵堑闹麈湚埢ヒ粋€或多個側鏈糖殘基的修飾。在一個實施方案中，經修飾的多糖誘導抗體反應，例如，與該多糖的天然形式相比，增強的抗體反應，例如哺乳動物(例如，靈長類動物)中的保護性抗體反應。在一個實施方案中，多糖誘導IgG反應。多糖可與載體部分例如多肽(例如，細菌多肽)物理結合。經修飾的多糖可包含此處描述的特征(例如，修飾的多糖可以是例如經修飾的B組鏈球菌(GBS)V型多糖，例如，該多糖經修飾以除去一個或多個側鏈糖，例如，經修飾的多糖是脫氨GBSV型多糖或去唾液酸化GBSV型多糖)。在另一個方面，本發(fā)明表征了抗原組合物，其包括(a)經修飾的GBSV型多糖；和(b)與該多糖物理(例如，共價地)結合的部分。可通過從多糖除去一個或多個側鏈糖殘基的處理來修飾該多糖。例如，-末端唾液酸殘基的條件下處理該多糖。在一個實施方案中，多糖是去唾液酸GBSV型多糖。在一個實施方案中，通過在從多糖的主鏈除去三糖側鏈的條件下進行處理來修飾多糖?？赏ㄟ^順序地去唾液酸化、去乙酰化和脫氨作用修飾多糖。在一個實施方案中，所述多糖是脫氨GBSV型多糖。在一些實施方案中，在細菌(例如，GBSV細菌)中產生經修飾的多糖，所述細菌經基因改造以合成以經修飾的形式存在的多糖(例如，細菌對于將側鏈加至多糖的酶的表達是有缺陷的，或細菌表達或過量表達從多糖除去側鏈的酶)。與經修飾的GBS多糖結合的部分是，例如，增強經修飾的多糖對抗原呈遞細胞的結合的化合物，例如多肽，例如細菌多肽，例如細胞表面多肽或分泌的細菌多肽?？芍苯踊蛲ㄟ^結合劑將多肽連接至多糖。在各種實施方象中，所述多肽是GBS多肽，例如細胞表面或分泌的GBS多肽。在各種實施方案中，多肽是GBS多肽，例如細胞表面或分泌的GBS多肽。在各種實施方案中，GBS多肽選自GBSC蛋白(x多肽、GBSC蛋白P多肽、s多肽、R蛋白、oc樣蛋白、b組鏈球菌1的表面蛋白(spbl)、spb2、層粘連蛋白結合蛋白(Lmb)、C5a肽酶、基質粘附(Ema)多肽及其抗原片段和變體。GBS多肽可以是GBSIa、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型的多肽。在一個實施方案中，所述多肽是由Tettelin等人，尸ro"""ca"c/""，99(19):12391-6，2002中的GBSV基因組的序列中筌定的基因產物編碼的多肽，所述文獻的內容在此以其全文引用作為參考。在一個實施方案中，所述多肽是細諒毒素或類毒素，例如破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉突變蛋白可交叉反應性物質(CRM197)或其抗原片段。組合物可包含超過一種類型的載體部分。例如，經修飾的多糖可連接至2、3、4或5個不同的多肽，例如，2種或更多種細菌多肽，例如細菌類毒素和GBSC蛋白a。組合物的多糖組分可以是至少1千道爾頓(kD)、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD或50kD。組合物可具有0，1~SOOjig,例如0.5~100ng、150ng或5~25^g的量的多糖。在一個實施方案中，組合物還包含可藥用載體。在一個實施方案中，組合物還包含佐劑，例如明礬。組合物還可包含第二多糖，例如另一種GBS血清型或非GBS細菌的多糖，例如，除了經修飾的GBSV型多糖外的GBSIa、Ib、II、III、IV、VI、VII或VIII型多糖中的一種或多種多糖。在另一個方案，本發(fā)明描述了在哺乳動物中引發(fā)免疫應答的方法。該方法包括，例如，給哺乳動物施用組合物，該組合物包含(a)經修飾的細菌多糖，例如，經修飾的B組鏈球菌(GBS)V型多糖；和，任選地，(b)與該多糖物理結合的(例如，共價結合的)部分；從而在哺乳動物中引發(fā)免疫應答?？赏ㄟ^在從多糖去除側鏈-末端唾液酸殘基的條餘下進行處理來修飾多糖，例如去唾液酸化的GBSV型多糖?？赏ㄟ^在從多糖的主鏈除去三糖側鏈的條件下進行處理來修飾多糖?？赏ㄟ^順序地去唾液酸化、去乙?；兔摪弊饔脕硇揎椂嗵恰Ｔ谝粋€實施方案中，所述多糖是脫氨GBSV型多糖。與經修飾的GBS多糖結合的部分可以是多肽，例如，細菌多肽，例如細胞表面或分泌的細菌多肽。在各種實施方案中，所述多肽是GBS多肽，例如，細胞表面或分泌的GBS多肽。在各種實施方案中，GBS多肽選自GBSC蛋白a多肽、GBSC蛋白P多肽、s多肽、R蛋白、oc樣蛋白、b組鏈球菌l的表面蛋白l(spbl)、spb2、層粘連蛋白結合蛋白(Lmb)、C5a肽酶、基質粘附(Ema)多肽及其抗原片段和變體。GBS多肽可以是GBSIa、Ib、II、III、IV、VI、VII或VIII型的多肽。在一個實施方案中，所述多肽是細菌毒素或類毒素，例如破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉突變蛋白交叉反應性物質(CRM1")或其抗原片段，所述組合物可包含超過一種類型的栽體部分。例如，經修飾的多糖可連接至2、3、4或5種不同的多肽，例如，2種或更多種細菌多肽，例如細菌類毒素和GBSC蛋白ot。所述組合物的多糖組分可以是至少l千道爾頓(kD)、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD或50kD。在一個實施方案中，所述組合物還可包含可藥用載體。在一個實施方案中，所述組合物還包含佐劑，例如明諷。組合物還可包含第二多糖，例如另一種GBS血清型的多糖或非GBS細菌的多糖，例如，除了經修飾的GBSV型多糖外的GBSIa、Ib、II、III、IV、VI、VII或VIII型多糖中的一種或多種多糖?？山o受試者施用組合物1次或2次或更多次。在一個實施方案中，給哺乳動物施用包含0.1至500pg例如25至100pg的多糖的量的組合物o該方法可在哺乳動物中引發(fā)抗體反應，例如哺乳動物中的增強的抗體反應，例如Ig^抗體反應，例如IgM抗體反應。在一個爽施方案中，所述方法在哺乳動物中引發(fā)保護性反應。該方法還可包括在哺乳動物中評估對GBS細菌的免疫應答(例如，評估體液免疫應答和/或細胞介導的免疫應答)。在一個實施方案中，哺乳動物處于GBS細菌感染的風險中，例如，所述哺乳動物具有免疫妥協(xié)(immunocompromised)或處于變成免疫缺損的風險中，或為老年。在一個實施方案，哺乳動物是靈長類動物，例如人或猴子。在一個實施方案中，給超過10、20、30、40、50、60、65、70、75或80歲的人施用組合物。在一個實施方案中，所述哺乳動物是孕婦。在另一個方面，本發(fā)明描述了給新生兒提供抗體的方法。該方法可包括，例如，給孕婦施用抗原組合物，所述組合物包含(a)經修飾的B組鏈球菌(GBS)V型多糖；和，任逸地，(b)與該多糖物理結合的部分.所迷組合物可以是此處描迷的組合物,在另一個方面，本發(fā)明描述了制備免疫原組合物的方法。該方法包括，例如，提供純化的GBSV多糖；和在修飾多糖的結構的條件下處理該多糖。在一個實施方案中，在除去多糖側鏈的一個或多個殘基的條件下修飾該多糖，例如，在除去多糖的側鏈-末端唾液酸殘基的條件下修飾該多糖，或在除去多糖的三糖側鏈的條件下修飾該多糖。本發(fā)明也表征了包含通過方法獲得的抗血清的組合物，所述方法包括提供純化的GBSV多糖；和在修飾多糖的結構的條件下處理該多糖。在一個實施方案中，在除去多糖的側鏈的一個或多個殘基的條件下修飾該多糖，例如在除去多糖的側鏈-末端唾液酸殘基的條件下修飾該多糖，或在除去多糖的三糖側鏈的條件下修飾該多糖?？芍苽渫ㄟ^此處描述的方法制備的抗體并將其給受試者例如處于GBS感染的風險中或暴露于GBS的受試者施用。在一個實施方案中，給一個或多個哺乳動物(例如，人)施用組合物，該組合物包含(a)經修飾的細菌多糖，例如經修飾的B組鏈球菌(GBS)V型多糖；和(b)與所述多糖物理結合的(例如，共價結合的)部分。從憂試者分離包含抗體(例如，抗血清)的樣品。可將多個樣品混合。以例如足以在受試者中減輕由GBS導致的感染癥狀或感染程度的量給第二哺乳動物(例如，人)施用所述抗血清。"經修飾的細菌多糖"是指經修飾從而具有與該多糖的天然形式(即，在細菌中發(fā)現(xiàn)的該多糖的天然形式)不同的結構的細菌多糖。"純化的"是指基本上和與該多糖天然地結合的各種蛋白和脂質組分分離的多糖物質。純化的寡糖中的殘留的外來組分不干擾所述純化物質作為抗原的用途。術語"純化的"不排除保留其合成的人為產物的合成的寡糖制劑；其也不排除包含一些雜質的制劑，只要所述制劑展示可重復的數(shù)據(jù)，例如，分子量、糖殘基含量、糖鍵、層析術反應和免疫原行為。如此處所用的，"可藥用栽體"包括任何和所有生理可相容的溶刑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲刑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，所述栽體適合用于靜脈內、肌內、皮下，胃腸外、脊柱或表皮施用(例如，通過注射或輸注)?？稍诒Ｗo其免受可使其失活的酸及其他天然化合物的作用的物質中提供所述組合物，即經修飾的GBSVCPS綴合物組合物。本發(fā)明的一個或多個實施方案的詳細內容示于下面的附圖和描述中。根據(jù)描述和附圖以及權利要求，本發(fā)明的其他特征、目的和有利方面將變得明顯。所有引述的專利、專利申請和參考資料(包括參考公共序列數(shù)據(jù)庫條目(entry))對于所有目的都以其全文引用作為參考。U.S.S.N.60/623，907對于所有目的以其全文引用作為參考。附圖描述圖1是GBSV型莢膜多糖的七糖重復單位的結構的圖形描述。圖2A是GBSV型莢膜多糖的七糖重復單位的結構的圖形描述。圖2B是GBSV型莢膜多糖的脫氨基形式的結構的圖形描述。圖2C是GBSV型莢膜多糖的去唾液酸形式的結構的圖形描述。圖3是描述在(l)由大約200個重復單位的聚合物組成的天然V型多糖(實心三角形)；(2)代表通過PS的臭氧處理獲得的尺寸減小的V型寡糖(0S)的化學修飾的V型多糖(空心三角形)；(3)全長去唾液酸V型PS(實心圓)；(4)包含具有單糖側鏈的V型主鏈的脫氨V型PS(實心正方形)；(5)無單糖側鏈的V型PS(其和GBSVII型PS的結構相同)(菱形)；和(6)GBSIV型PS(空心圃)存在的情況下，用GBSV型多糖-破傷風類毒素(GBSV-TT)綴合物疫苗免疫的受試者的人血清的IgG級分對對天然GBSV型的結合的抑制的圖。圖4是描述在GBSV型PS的各種形式存在的情況下，用GBSV型多糖-破傷風類毒素(GBSV-TT)綴合物疫苗免疫的受試者的人血清的IgM級分對天然GBSV型的結合的抑制的圖。圖5是描述用人GBSV型特異性抗體殺死GBSV細菌的條形圖。IgG級分、IgM級分和全血清的結果分別以黑色、具條紋的和白色的條塊顯示。對照血清的結果以灰色條塊顯示。困6是描述在PGA、V型和去唾液酸V型多糖存在的情況下，GBSV綴細菌被GBSV-TT-誘導的人抗血清(IgM級分，白色條塊；IgG鼓分，灰色條塊)調理吞噬殺傷及其生長的條形困。圖7是描述在(1)天然的GBSV多糖(實心三角形)；(2)代表通過PS的臭氧處理獲得的尺寸減小的GBSV型寡糖(0S)的經化學修飾的V型多糖(空心三角形)；(3)GBSIVPS(實心圓)；(4)無單糖側鏈的GBSVPS(其和GBSVII型PS的結構相同)(空心正方形)；(5)去唾液酸V型PS(實心圓)；和(6)包含具有單糖側鏈的V型主鏈的脫氨V型PS(實心正方形)存在的情況下，GBSV-TT誘導的鼠類單克隆IgG對天然GBSV的結合的抑制的圖。圖8是描述獼猴中針對GBSIII-TT疫苗的GBSIII特異性IgM反應的圖表。各線對應于從來自個體猴子的血清獲得的值。圖9是描述獼猴中針對GBSIII-TT疫苗的GBSIII特異性IgA反應的圖表。各線對應于從來自個體猴子的血清獲得的值。免疫由黑色箭頭標示。圖IO是描述獼猴中針對GBSIII-TT疫苗的GBSIII特異性IgG反應的閨。各線對應于從來自今體猴子的血清獲得的值。圖11是描述獼猴中針對GBSV-TT疫苗的GBSV特異性IgM應答的圖。各線對應于從來自個體猴子的血清獲得的值。圖12是描述獼猴中針對GBSV-TT疫苗的GBSV特異性IgA反應的圖。各線對應于從來自個體猴子的血清獲得的值。圖13是描述獼猴中針對GBSV-TT疫苗的GBSV特異性IgG反應的圖。各線對應于從來自個體猴子的血清獲得的值。圖14是描述在用GBSV-TT糖綴合物疫苗進行第一和第二次免疫后，人(hu)和獼猴(靈長類動物)中同種型轉換的GBSV特異性抗體的水平的圖。圖15是描述在用GBS-TT糖綴合物疫苗進行笫一和第二次免疫后，獼猴中誘導的同種型轉換的GBSIII和GBSV特異性抗體的水平的圖。困16是描述在(l)由大約150個重復單位的聚合物組成的天然GBSIIIPS(實心圃)；(2)代表通過PS的臭氧處理獲得的尺寸減小的III型寡雜(OS)的經化學修飾的GBSIII型PS(空心三角形);(3)全長肺炎球菌H型PS(即去唾液酸III型PS,實心正方形)；(4)包含與III型的側鏈相同的三糖側鏈的GBSlaPS(空心圓)；(5)GBSIII-HSA(和包被抗原相同；實心三角型)；和(6)人血清白蛋白(HSA;十字形)存在的情況下，用GBSIII-TT疫苗免疫的獼猴#36992的IgG抗體對天然GBSIII的結合的抑制的圖。圖17是描述在(1)由大約150個重復單位的聚合物組成的天然GBSIIIPS(實心圓)；(2)代表通過PS的臭氧處理獲得的尺寸減小的III型寡糖(OS)的經化學修飾的GBSIII型PS(空心三角形)；(3)全長肺炎球菌14型PS(即去唾液酸III型PS,實心正方形)；(4)包含和III型的側鏈相同的三糖側鏈的GBSlaPS(空心圓)；(5)GBSIII-HSA(和包被抗原相同；實心三角型)；和(6)人血清白蛋白(HSA;十字形)存在的情況下，用GBS111-17疫苗免疫的獼猴#54391的IgG抗體對天然GBSIII的結合的抑制的圖。圖18是描述在(1)由大約200個重復單位的聚合物組成的、綴合至HSA妁天然V型多糖(實心黑圃)；(2)未綴合的GBSV(白色三角形)；(3)去唾液酸V型PS(實心正方形)；(4)包含具有單糖側鏈的V型主鏈的脫氨V型PS(圓)；和(5)PGA(十字形)存在的情況下，獼猴#12092的IgG抗體對GBSV的結合的抑制的圖。圖19是描述在(1)天然V型多糖(實心三角形)；(2)去唾液酸V型PS(實心正方形)；(3)包含具有單糖側鏈的V型主鏈的脫氨V型PS(圃)；和(4)PGA(十字形)存在的情況下，獼猴#25689的IgG抗體對GBSV的結合的抑制的圖。圖20是描述GBSV細菌被各種濃度的來自獼猴，#24589的IgM級分和血清和對照血清殺傷的條形圖。圖21是描述三只用去唾液酸GBSV-TT疫苗免疫的猴子中的GBSV特異性IgM抗體的水平的圖。圖22是描述三只用去唾液酸GBSV-TT疫苗免疫的猴子中的GBSV特異性IgA抗體的水平的圖。困23是描迷三只用去唾液酸GBSV-TT疫苗免疫的猴子中的GBSV特異性IgG抗體的水平的圖。圖24是描述在脫氨(實心正方形)、去唾液酸(空心正方形)和天然GBSVPS(三角形)存在的情況下，來自獼猴#25987的GBSV特異性IgG抗體的結合的抑制的圖。圖25是描述在脫氨(實心正方形)、去唾液酸(空心正方形)和天然GBSVPS(三角形)存在的情況下，來自獼猴#25987的GBSV特異性IgM抗體的結合的抑制的圖。圖26是GBSV細菌被各種濃度的來自獼猴#39393的IgM級分、IgG級分和血清殺死的條形圖。圖27A是描述在6只不同的用每劑0.625pg的GBSV-TT綴合物疫苗免疫的小鼠中誘導的V特異性IgG的水平的圖。顯示在免疫前、第20天和第31天獲得的血清的結果。圖27B是描述在6只不同的用每劑0.625jAg的GBSV-TT綴合物疫苗和每劑0.5mg的明礬一起免疫的小鼠中誘導的V特異性IgG的水平的困。顯示在免疫前、笫20天和第31天獲得的血清的結果。圖27C是描述在6只不同的用每劑6.25ng的GBSV-TT綴合物疫苗免疫的小鼠中誘導的V特異性IgG的水平的圖。顯示在免疫前、笫20天和第31天獲得的血清的結果。圖27D是描述在6只不同的用每劑6.25jig的GBSV-TT綴合物疫苗和每刑0.5mg的明礬一起免疫的小鼠中誘導的V特異性IgG的水平的圖。顯示在免疫前、笫20天和笫31天獲得的血清的結果。不同附圖中的相同參考符表示相同的元素。詳述臨床研究已顯示多糖-蛋白綴合物疫苗在人中是安全的且有免疫原性(Baker等人，//j7/V3W，179:142-150，1999;Baker等人，/!o/e"版，182:1129-1138，2000;Kasper等人，//2^es/.,98:2308-2314，1996)。誘導IgG抗體的疫苗是優(yōu)選的，因為IgG抗體是長效的且穿過胎盤，從而為新生嬰兒提供保護.我們已顯示細菌多糖的經修飾的形式，和該多糖的天然形式相比，fl發(fā)更有效的IgG反應。更特別地，我們已產生了缺少一個或多個側鏈殘基的GBSVPS的經修飾的形式，而且我們發(fā)現(xiàn)包含這些修飾形式(例如，多糖-多肽綴合物)的組合物在靈長類動物中誘導出GBSV特異性IgG抗體。此處描述的經修飾的多糖組合物特別適用于在人中引發(fā)抗體反應。這些組合物可在處于最高感染風險的亞群中(例如，老年人中和通過母體傳遞IgG的新生兒中)提供有益的反應。r型/潛及岸經夢謬^承式。GBS莢膜多糖是包含半乳糖、葡萄糖、N乙酰葡糖胺和唾液酸殘基的重復單位的高分子量聚合物。天然GBSV型CPS的重復單位是包含具有兩個不同側鏈的三糖主鏈的七糖，如圖1和圖2A中通過圖解描述的(參見Wessels等人，/SioJC/e瓜，266(11):6714-9，1991)。GBSVCPS的三糖主鏈具有下列結構—4)-oHMUcp~(l—4)-|3-D-Galj9"(1—4)-|3-D-G1c/j~(1—.abe(Glci是吡喃葡萄糖基，Galp是吡喃半乳糖基。具有下列結枸的三糖分枝通過后者的0-6連接至標有"a"的D-Glc;:ct一D-Neu;NAc-(2卄3)-p一D-Ga—4)-p-D-GlcpNAc(1—。D-Glcp殘基通過后者的0-3連接至標記有"b"的D-Galp。^S^潛時為、席?？墒褂靡阎姆椒◤腉BSV型細菌培養(yǎng)物制備GBSV型CPS。例如，為分離CPS，將GBSV型菌林(例如，CJBlll)以連續(xù)培養(yǎng)的方式生長在化學成分確定的培養(yǎng)基中。通過離心收獲細胞并通過基質提取或用內-N-乙酰胞壁質酶變溶菌素處理取出CPS。在Deng等人(/,AioAC力e瓜，275(11):7497-7504，2000)中描述了使用變溶菌素的CPS的純化。用RM酶A、DNA酶I、RNA酶Tl和鏈霉蛋白酶處理提取物。通過大小排阻層析和離子交換層析分離包含CPS的級分?？扇缑枋龅挠糜贕BSIIICPS的制備的方法(參見，例如，Wessels等人，/謂".，86:1428-1433，1990)—樣進行用于純化的GBSVCPS的制備的方法。^^^r藝多炎時ZJ:。可通過本領域已知的技術修飾GBS多糖。例如，可通過在略微酸性的條件下(例如，在80°C下在O.1M硫酸中進酸GBSV型CPS。通過層析純化所述混合物?？蛇@樣來制備脫氨GBSV型CPS,即首先用堿處理去唾液酸V型CPS以使CPS脫乙?；?例如，2MNaOH和四氬化硼鈉，加熱至IOO。C進行5小時，然后用醋酸進行中和并凍干)。然后使脫乙酰基的CPS脫氨(例如，通過溶解在水中和醋酸水溶液中，然后用亞硝酸鈉水溶液在室溫下處理1.5小時，且通過離子交換層析進行純化；參見Wessels等人，/C力e瓜，266(11):6714-9,1991)。在各種實施方案中，通過在細菌中產生多糖來制備經修飾的多糖，在所述細菌中，已對編碼修飾多糖的酶的核酸序列進行了基因操作(例如，已刪除編碼所述酶的基因、使其喪失功能，或插入或過表達所述基因)。GBSV的編碼修飾多糖的酶的基因描述于，例如Tettelin等人，i^oc」ca""'咖，99(19):12391-6，2002中。可將GBSV綴合物與包舍其他多糖<例如，GBSI、II、rn或iv型)的一種或多種綴合物混合以提供用于免疫的多價組合物?？蛇x擇地，可通過在單一反應中綴合多種類型的多糖來產生用于免疫的多價多糖組合物，^滲#^r費,澥W凝合?？墒褂帽绢I域已知的方法將經修飾的GBS多糖綴合至載體部分.例如，可通過用高碘酸(或相關試劑，例如仲高碘酸或髙碘酸鉀)處理來氧化多糖，從而在具有鄰位二羥基的位置上留下醛末端?？蓪⒔浱幚淼亩嗵呛洼d體部分在通過例如使用連接劑或通過直接偶聯(lián)至所述部分來綴合組分的條件下進行反應。可通過例如還原胺化作用進行對多肽部分的綴合(參見，例如，Schwartz和Gray,A/(c力艦"i。M^.181:542-549，1977)。簡而言之，在氰基硼氫化物離子或另一種還原劑存在的情況下使氣化的CPS和多肽部分反應，所述另一種還原劑既不還原目標物質的還原末端也不負面地影響多肽或莢膜多糖。用于綴合多糖的方法也描迷于例如Wessels等人，/C7iiz，86:1428-1433，1990和Wang等人，racc/je，21(11-12):1112-7，2003中。合適的載體部分對于給哺乳動物(例如，年幼的哺乳動物)的施用是安全的且在免疫上是有效的(例如，其促進針對多糖的T細胞依賴性抗體反應)。示例性載體部分是白喉和破傷風類毒素。一般地，任何化合物可用作載體部分。細菌毒素例如破傷風和白喉毒素結合至哺乳動物細胞表面，從而允許其綴合的多糖更有效地啟動免疫應答。另一個示例性載體多肽CRM197是和天然白喉毒素相比包含單個氨基酸改變的白喉毒素且其在免疫上與天然的白喉毒素無區(qū)別。產生CRM197的棒狀桿菌白喉菌林C7(pl97)的培養(yǎng)物可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Rockville:Md.，在保藏號ATCC53281下獲得的。其他細菌多肽可用作載體部分。在各種實施方案中，使用分泌的或表面表達的細菌多肽(例如，鏈球菌例如GBS細菌的分泌的或表面表達的多肽)。例如，可將經修飾的GBSV多糖綴合至GBSC蛋白oc多肽或其抗原片段。(JBSC蛋白ot是包含達到9個串聯(lián)重復的82個氨基酸單位的表面結合多肽(Michel等人，#a〃Jcad89:10060-10064，1992)。細菌C蛋白oc多肽和使用其進行免疫接種的方法描述于美國專利5,968,521、5，908，629、5，858，362、5，847，081、5,843,461、5，843，444、5，820,860和5，648，241中?？乖慰砂粋€或多個串聯(lián)重復的82個氨基酸的單位。GBSC蛋白p或e多肽(或其抗原片段)可綴合至經修飾的GBSV多糖。GBSC蛋白P、C蛋白s、R蛋白(也稱作Rib和R4)、cx樣蛋白(Alps)、B組鏈球菌1的表面蛋白(spbl)、spb2和Lmb(層粘連蛋白結合蛋白)也可用作栽體蛋白(Heden等人，^/r//邁邊wo丄，21(6):1481-90，1991;Michel等人，/咖肌，l"lJ叫59(6):2023-8;Larsson等人，ii尸e"J咖咖.，64(9):3518-23,1996;Wastfelt等人，/及i'o7C&e瓜，271(31):18892-7,1996;Ferrieri,P.，紐，lO(Su卯l.2):S363-S366，1988;Kong等人，/.C7/i2.，40:620-626,2002;Uch咖ucr等人,戶彥^rtf鵬,97:9630—9635，2000;Spellerberg等人，//7尸eW/邁izw/7.，67(2):871-8，1999;Adderson等人，//z/*eC/鵬w.，71(12):6857-632003)。細菌C5a肽酶或其抗原片段(例如，鏈球菌C5a肽酶，例如，如美國專利6,355,255中所描述的)也可用于與此處描述的經修飾的多糖綴合。鏈球菌基質粘附(Ema)多肽或其抗原片段(美國專利公開號20040071729中描述的)也可用于與多糖綴合。GBS多糖可綴合至多個多肽。例如，經修飾的GBS多糖可綴合至2、3、4或5個不同的細菌多肽?？捎米魟┡渲贫嗵墙M合物。佐劑可增強哺乳動物對多糖的免疫應答，例如增加抗體的產生和/或用更低劑量的多糖誘導免疫反應。佐劑包括水乳液(例如，完全和不完全弗氏佐劑)、油、氧化鐵、海藻酸鈉、氫氧化鋁、鋁鹽和鈣鹽(即，明礬)、未甲基化的CpG基序、葡聚糖、硫酸葡聚糖、細菌提取物(例如，分枝桿菌(mycobacterial)提取物)、QS-21(AquilaBiopharmaceuticals，Inc.,Framingham,Mass.)、MPL(3-G-脫酰單砩酰脂質A;Corixa，H效fflilton，Mont.);529(氨基烷基葡糖胺磷酸化合物，Corixa，Hamilton,Mont.)、N-乙?；?胞壁酰基-L-theron-基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁?；?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(CGP11637，稱作正-MDP)和N-乙酰胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷氛酰胺?；?L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚跣基-sn-甘油-3-羥基磷?；?乙胺)(CGP19835A,稱作MTP-PE),多肽佐劑例如IL-12(GeneticsInstitute,Cambridge,Mass.)和GM-CSF(ImmunexCorp"Seattle,Wash.)也可用于增強對多糖組合物的免疫應答。/^^逸合浙付磁眉?？蓪⒔浶揎椀亩嗵呛投嗵蔷Y合物配制在合適的栽體中以給受試者施用(例如，懸浮在PH6的磷酸鈉緩沖鹽溶液中的0.125M磷酸鋁凝膠的磷酸鈉緩沖鹽溶液(pH7.4)或另一種常規(guī)介質)。合適的藥物栽體在本領域內是已知的，用于給受試者施用的組合物可包含大約0.l至大約500蹄例如大約10至50蹄的多糖組合物，且其可在哺乳動物中誘導出有效的抗莢膜多糖抗體的水平?？赏ㄟ^常規(guī)的劑量/反應實驗確定確切的劑量?？梢砸淮蚊庖叩姆绞交蛞韵盗?，例如在1個月、2個月、3個月或更長的間隔中以2、3或4次劑量的方式施用多糖綴合物組合物?？稍诔醮蚊庖呋虺跗谙盗忻庖吆?年、2年或更多年提供加強免疫。孕婦的示例性免疫接種程序表是在中期妊娠或早晚期妊娠提供的一次劑量。對于非妊娠的成人的免疫接種，可使用一次劑量。成人中隨后的加強劑量的需要可基于多糖組合物的免疫原性和疫苗在引發(fā)免疫應答中的功效的持續(xù)監(jiān)測。實施例實施例1.人血清中的GBSV特異性抗體的表征針對Ia型、Ib型和III型B組鏈球菌(GBS)的未綴合的多糖疫苗或糖綴合物疫苗在人中主要誘導IgG抗體。相反地，V型GBS主要誘導IgM和IgA抗體。IgM和IgA同種型都不能穿過胎盤來保護新生兒抵抗侵入性疾病。誘導強IgG反應的Ia、tb和III型GBS多糖是重復單位的聚合物，所述重復單位在主鏈上具有二糖或三糖，且三糖側鏈在側鏈的末端具有唾液酸殘基。誘導低水平IgG抗體的V型多糖是包含具有2個側鏈的三糖主鏈的重復單位的聚合物，所述側鏈其中之一是直接連接至主鏈的葡萄糖殘基，另一個是三糖側鏈，該側鏈的末端殘基是唾液酸，制備經化學修飾的V型多糖以檢查表位呈遞和確定在人中誘導IgG反應的最佳表位，使用竟爭性酶聯(lián)免疫吸附測定法(竟爭ELISA)確定來自5個人志愿者(在GBSVPS的各種修飾形式存在的情況下用GBSV-破傷風類毒素綴合物(GBSV-TT)免疫的人)的混合血清的IgG級分中的抗體對GBSVPS的反應性。在這些測定中，經修飾的GBSVPS被稱為"抑制劑"，即，對天然GBSVPS的結合的抑制刑。為檢測GBSPS特異性抗體，使抗血清的IgG級分在不同量的溶液中的游離多糖存在的情況下結合包被在塑料96孔板(ELISA板)上的天然GBSVPS-HSA.在這些和下列實施例中報導的所有BLISA實驗中,用作包被抗原的天然多糖是綴合至HSA的形式?？墒褂贸薆LISA外的方法檢測PS特異性抗體，例如，用于評估抗體-抗原相互作用(在溶液中或在固相上)的其他本領域承認的方法。IgG級分對天然GBSVPS-HSA的結合結果顯示于圖3。按對數(shù)標度上沿著X軸描述以jig/ml表示的抑制劑的濃度，按線性標度沿著Y軸描述抗體對結合至ELISA板的PS的結合的百分比抑制率。針對抑制作用進行檢測的多糖是(l)由大約200個重復單位的聚合物組成的天然V型多糖(實心三角形)、(2)代表通過PS的臭氧處理獲得的尺寸減小的V型寡糖(0S)的經化學修飾的V型多糖(空心三角形)、(3)全長去唾液酸GBSVPS(實心圓)、(4)包含具有單糖側鏈的V型主鏈的脫氨GBSVPS(實心正方形)、(5)無單糖側鏈的GBSVPS(其與GBSVIIPS的結構相同)(菱形)；和(6)GBSIVPS(空心圓)。如由這些經化學修飾的多糖的交疊抑制曲線所顯示的，所有疫苗誘導的抗體都識別脫氨(實心正方形)和去唾液酸V型PS(實心圓)。如所預期的，抗體對天然V型PS的結合被天然V型PS抑制(實心三角形)。缺少單糖側鏈的經修飾的V型PS(菱形)不抑制結合。因此，該側鏈對于抗體的優(yōu)勢表位是至關重要的。這些數(shù)據(jù)也顯示優(yōu)勢表位依賴于V型聚合物的大小，因為更長的天然V型PS(204kDa，實心三角形)是比天然V型PS的較短形式(7.8kDa，空心三角形)好得多的抑制劑。各多糖的ICs。示于表l中。表l.多糖對于人V-TT誘導的V特異性IgG級分抗血清的IC抑制劑IC5。(jig/ml)V型PS0.3VII型PS無抑制IV型PS>270去唾液酸V型VPS0.14脫氨V型VPS0.09在針對GBSV的人混合血清中對于疫苗誘導的GBSV特異性抗體的IgM級分觀察到相似由GBS多糖產生的抑制模式，其中去唾液酸、脫氨和更長的天然V型PS(204kDa)比較短的V型PS(7.8kDa)和IV型PS更有效地抑制結合(圖4)。因此，單糖側鏈也是被IgM抗體識別的優(yōu)勢表位。各多糖的ICs。示于表2。對于來自目前為止總共IO個受試志愿者的疫苗誘導的人血清的IgG和IgM級分，獲得相似的結果。表2.多糖對于人V-TT誘導的V特異性IgM級分抗血清的IC<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例2.V型特異性抗體的功能接下來，檢查由GBSV-TT糖綴合物誘導的抗體的功能。在人中，使用稱為抗體依賴性補體介導的調理吞噬殺傷的方法清除GBS。在基于PS的疫苗的情況下，PS特異性疫苗誘導的抗體識別GBS細菌的莢膜多糖上的表位或結合位點.抗體結合導致補體激活和導致激活的補體組分沉積在細菌上。接受條理素作用的細菌上的抗體和補體組分被專職吞噬細菌通過例如Fc受體和補體受體識別，且在稱為調理吞噬的過程中被吸收。被吞噬細胞例如多形核白細胞(PMNL)吞食的GBS通過各種機制例如氧化爆發(fā)(oxidativeburst)被殺死。圖5顯示來自體外測定的數(shù)據(jù)，該測定測量抗體在補體存在的情況下促進由PMNL進行的調理吞噬殺傷的能力。在該測定中，將抗體、補體、細菌和PMNL在體溫下溫育。溫育60分鐘后將對細菌的殺傷記錄為反應混合物中活細菌的損失。GBSV特異性抗體能夠介導(JBS細菌的殺傷。如圖5中所示，標準人混合血清對照的IgG抗體級分(黑色條塊)和IgM抗體級分(具有條紋的條塊)促進GBS的殺傷.在該反應混合物中殺死超過90%的細菌需要3ng/ml濃度的GBSV型特異性IgG，而0.Vg/ml的V型特異性IgM促進殺傷超過90%的細菌。因此IgM級分在促進細菌的殺傷中更有效。在各測定中將被免疫的人的全血清(白色條塊)和未免疫的人血清(灰色條塊)用作對照。然后，就在V型PS、去唾液酸V型PS和不相關的多糖，聚半乳糖醛酸(PGA)存在的情況下的殺傷作用檢測人GBSV-TT誘導的抗體的IgG級分和IgM級分。在產生大約90%的活細菌減少(l對數(shù)滅殺)的濃度上檢測抗體。將GBSV的菌林CJBlll用于該實驗。如圖6中所示，反應混合物中的去唾液酸V型和天然V型PS在V特異性IgM抗體(白色條塊)和V特異性IgG抗體(灰色條塊)存在的情況下完全消除了PMNL對GBS的殺傷，這通過細菌的生長(延伸至X軸上的0.00的左邊的條塊)和殺傷的缺乏(延伸至X軸上的0.OO的右邊的條塊)得到證明。PGA對疫苗誘導的V特異性IgM和V持異性IgG抗體的調理吞噬的刺激沒有任何作用。實施例3.鼠類GBSV特異性抗體的表征表征來自用GBSIII-TT和GBSV-TT糖綴合物疫苗免疫的小鼠的血清。發(fā)現(xiàn)一次劑量的GBSIII-TT和GBSV-TT糖綴合物疫苗都誘導IgM抗體和低水平PS特異性IgG抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。使用任一種糖綴合物疫苗進行的重復免疫導致向PS特異性抗體的IgG的同種型轉換的相當?shù)脑黾?在第2和第3次免疫后GBSV特異性反應更加快速和更加強烈，表明誘導了對抗原的免疫記憶(數(shù)據(jù)未顯示)。在實施例1中描述的竟爭ELISA測定法中檢測GBSV特異性鼠類單克隆抗體。與人IgG相反，鼠類IgG識別天然莢膜多糖但不識別去唾液酸多糖(圖7)。圖7中的圖表顯示，與天然的多糖相比，去唾液酸GBSVPS對鼠類GBSV誘導的IgG的結合要弱得多.在人中是優(yōu)勢表位的脫氨GBSVPS根本不被鼠類抗體識別。計算各多糖的IC5。并示于表3中。對于受試的所有鼠類的單克隆和多克隆血清已獲得相似的結果.表3.多糖對于鼠類V-TT誘導的V特異性IgG級分抗血清的IC<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>這些數(shù)據(jù)顯示，小鼠對GBSIII型和V型的免疫應答與人對同種型轉換、優(yōu)勢B細胞表位和功能性表位的免疫應答不同。實施例4.獼猴中GBSIII型多糖特異性反應用GBS11I型-TT(5(VgPS，肌內注射)免疫接種一組三只年輕非妊娠雌性獼猴(獼猴邊w/"")兩次，免疫接種之間間隔8周。在免疫接種前和免疫接種后每周獲取血清以評估疫苗誘導的PS特異性抗體和栽體特異性(即，破傷風類毒素特異性)抗體的水平、同種型和功能。獼猴對所述疫苗的耐受良好。檢查對III型PS的IgM、IgA和IgG抗體反應。圖8描述了在三只獼猴中在用GBSIII-TT糖綴合物疫苗免疫前和兩次免疫后的GBSIII特異性IgM反應，各線表示來自個體猴子的抗體的水平。在X軸上顯示第一次免疫接種后以周表示的時間，在Y軸上顯示以叫/ml表示的III型特異性IgM抗體的水平.用黑色箭頭標示免疫。在第一次免疫前用GBSIII-TT免疫的三只猴子中有兩只不具有預先存在的針對GBSIII的抗體。在這兩只猴子中，在第一次免疫接種后兩周檢測出GBSIII特異性IgM抗體。兩周后GBSIII特異性IgM的水平達到最高，第二劑GBSIII-TT疫苗沒有免疫加強效應。三只猴子中的一只(猴子#36992,最上面的線)在免疫接種前具有預先存在的針對所述多糖疫苗抗原的IgM抗體*然而，這些抗體對于GBSIIIPS抗原不是特異性的，因為向反應混合物中加入大量過量的純化的GBSIIIPS不影響所迷抗體對BUSA板的結合.由于高水平的預先存在的與GBSIIIPS交叉反應的天然抗體的原因，我們在進一步分析中不考略接種后獲得的值.針對GBSIIIPS的IgA反應顯示于圖9中。三只猴子中的兩只顯示了低水平的針對III型PS的IgA同種型轉換的抗體。第三只猴(猴子#36992，其具有非特異性GBSIII反應性IgM抗體)沒有表現(xiàn)任何對GBSIII特異性IgA抗體的同種型轉換。各猴子的IgG抗體反應顯示于圖10中。三只動物中的兩只在第一劑GBSIII-TT綴合物疫苗接種后作出反應，產生明顯的對GBSIIIPS特異性IgG的同種型轉換。此外，通過用GBSIII-TT糖綴合物疫苗進行的第二次或"加強"免疫喚起的疫苗致敏的GBSIII特異性免疫記憶導致(1)加速的抗體反應和(2)GBSIII特異性IgG抗體水平的顯著增加?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示獼猴中對GBSIII-TT綴合物疫苗的抗體反應包括對IgG的顯著的同種型轉換，其類似于在人中觀察到的同種型轉換。實施例5.獼猴中GBSV多糖特異性反應用GBSV-TT(50pgPS,肌內注射)免疫三只年輕的非妊娠雌性獼猴二次，免疫之間間隔8周。在免疫前和免疫后每周獲取血清以評估疫苗誘導的PS特異性抗體和栽體特異性(即，破傷風類毒素特異性)抗體的水平、同種型和功能。獼猴對GBSV-TT疫苗耐受良好。將三只獼猴中用GBSV-TT糖綴合物疫苗免疫前和兩次免疫后的V型特異性IgM抗體反應繪制于圖11中。各線表示個體猴子中的反應。用GBSV-TT糖級合物疫苗免疫的三只猴子中沒有一只在免疫接種前具有預先存在的針對GBSVPS的IgM抗體。所有三只動物在笫一劑GBSV-TT疫苗后具有明顯的GBSVIgM反應，在免疫接種后笫2至3周展現(xiàn)最髙水平。在用GBSV-TT笫二次免疫后，在三只猴子中的一只中引發(fā)V型特異性IgM水平的進一步增加，V型特異性IgM的最高水平達到95&g/ffli,三只猴中的一只在初次免疫后在其血清中具有低水平的針對GBSV的IgA同種型轉換的抗體(圖12)。在第二次免疫后在所有猴子中觀察到低水平的GBSV轉換的IgA抗體。用GBSV-TT免疫的三只猴子中沒有一只在免疫前具有針對V型PS的預先存在的IgG抗體。在第一次免疫后，IgG轉換的PS特異性抗體水平非常低，但在用GBSV-TT第二次接種后觀察到顯著的IgG反應(圖13)。這些數(shù)據(jù)顯示獼猴中對GBSV-TT糖綴合物疫苗的同種型反應模式(具有(1)顯著的IgM反應和(2)響應一劑GBSV-TT的最低限度的IgG轉換)和人中觀察到的反應相似。比較在用GBSV-TT糖綴合物疫苗初次免疫和二次免疫后人(hu)和獼猴(靈長類動物)中同種型轉換的GBSV特異性抗體的水平(圖14)。在人和非人靈長類動物中一劑GBSV-TT糖綴合物疫苗誘導非常低水平的對IgG的同種型轉換。人和靈長類動物中V型特異性IgG轉換的抗體的中位百分比分別為5%和12%。第二劑GBSV-TT在人和非人靈長類動物中剌激更髙水平的對IgG的同種型轉換。然而，即使在加強接種后，在兩種物種中主要的V特異性抗體仍然是IgM同種型。比較獼猴中由III型-TT和V型-TT疫苗誘導的同種型轉換的抗體的水平(圖15)，結果顯示對于兩種不同的GBS糖綴合物疫苗在PS特異性抗體的同種型轉換中存在顯著的差異。GBSV-TT疫苗在獼猴中誘導低水平的對IgG的同種型轉換，而GBSIII型-TT疫苗誘導顯著的對IgG的同種型轉換。實施例6.獼猴中GBSIII型誘導的IgG抗體的特異性通過竟爭ELISA檢查獼猴中被GBSIII-TT疫苗誘導的抗體識別的B細胞表位，使來自一只用GBSIII-TT免疫的猴子的疫苗誘導的抗體的IgG級分在不同量的溶液中的游離多糖或蛋白存在的情況下與包被在塑料96孔板上的天然GBSIIICPS結合，將結合的結果繪制于圖16中。以對數(shù)標度沿X軸顯示抑制刑的量(pg/ml).以線性標度沿Y軸顯示抗體對結合至BLISA板的多耱的結合的百分比抑制率.用于抑制試驗的受試多糖是(l)由大約150個重復單位的聚合物組成的天然GBSIIIPS(實心圓)；(2)代表通過PS的臭氧處理獲得的尺寸減小的III型寡糖(OS)的經化學修飾的GBSIIIPS(空心三角形)；(3)全長肺炎球菌14型PS(即去唾液酸III型PS，實心正方形)；(4)包含和III型的側鏈相同的三糖側鏈的GBSlaPS(空心圓)；(5)GBSIII-HSA(與包被抗原相同；實心三角形)；和(6)人血清白蛋白(HSA;十字形)。將來自猴子#36992的血清的抑制結果繪制于圖16中，且所述結果代表所有三只猴子。圖16顯示所有疫苗誘導的抗體識別天然的IIIPS(實心圓和實心三角形)，然而只有抗體的亞群識別去唾液酸11I型PS(Pn14，實心正方形)。此外，優(yōu)勢表位依賴于III型聚合物的大小，因為天然GBSIIIPS(實心圓)是遠好于較短的形式(III型OS,空心三角形)的抑制劑。如其在人血清中那樣，識別去唾液酸III型(即Pn14，實心正方形)的III型誘導的抗體群體在猴子血清中是變化的，在人中，大約50%的疫苗具有只識別天然III型PS的疫苗誘導的抗體，而50%具有也識別III型PS的去唾液酸形式的抗體(由未綴合至或綴合至破傷風類毒素的GBSIIIPS誘導的)。在人中，抗體的亞群識別Pnl4，或總抗體群體是交叉反應性的。這對于猴子也是如此。猴子中的一只不具有可檢測的Pnl4-交叉反應性抗體(數(shù)據(jù)未顯示)，一只具有識別Pnl4的亞群(猴子#36992，圖16)，在猴子#54391中，所有疫苗誘導的抗體也和Pnl4交叉反應(圖17)。在所有三只猴子中，III型誘導的抗體的IgM級分具有和IgG級分相同的特異性(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊?，獼猴中觀察到的對于III型疫苗誘導的抗體的B細胞表位模式與人疫苗中觀察到的表位模式相同。實施例7.獼猴中GBSV型誘導的IgG抗體的特異性.通過竟爭BLISA檢查非人靈長類動物中被G郎V型-TT耱綴合物疫苗誘導的抗體識別的B細胞表位。使來自一只用GBSV-TT免疫的獼猴的疫苗誘導的抗體的IgG級分在不同量的溶液中的游離多糖存在的情況下與包被在塑料96孔板上的天然GBSV型多糖結合.將結果繪制于圖18中，以對數(shù)標度沿X軸顯示以^g/m表示的抑制劑的量，以線性標度沿Y軸顯示抗體對結合至ELISA板的PS的結合的百分比抑制率。用于抑制檢測的受試多糖是；(1)由大約200個重復單位的聚合物組成的綴合至HSA的天然V型多糖(實心黑色三角形)；(2)未綴合的GBSV(白色三角形)；(3)去唾液酸V型PS(實心正方形)；和(4)包含具有單糖側鏈的V型主鏈的脫氨V型PS(圓)；和(5)PGA(十字形)。如由這些經化學修飾的多糖和天然V型PS(三角形)的交疊抑制曲線(圖18)所顯示的，所有疫苗誘導的抗體都識別脫氨(圃)和去唾液酸V型PS(正方形)。離此，GBSV型PS的主鏈在獼猴和人中是優(yōu)勢表位。獼猴中對于GBSV-TT疫苗誘導的抗體的優(yōu)勢B細胞表位是多糖的主鏈，包含三糖唾液酸的側鏈不是該表位的部分來自獼猴#25689的竟爭抑制ELISA的結果顯示于圖19中。對于該個體猴子，抗體對脫氨V型PS的結合顯著地優(yōu)于對天然PS的結合。對于所有三只猴子GBSV型誘導的抗體的IgM級分具有與IgG級分相同的特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例8.獼猴中V型特異性抗體的功能如實施例2中所描述的就調理呑噬殺傷能力檢測通過用GBSV-TT疫苗接種獼猴誘導的抗體。GBSV特異性抗體能夠介導GBS細菌的殺傷(圖20)。來自獼猴#25689的血清的IgG抗體級分(灰色條塊)和IgM抗體級分(具有條紋的條塊)都促進GBSV細菌的殺傷，我們發(fā)現(xiàn)1fig/ffll的GBSV特異性IgG和0.l辨/ml的GBSV特異性IgM促進超過9將的存在于^^混合物中的細菌的殺傷*因此IgM級分在倮進細菌的殺傷中更有效。白色和有斑點的條塊是各測定中用作實驗的質量控制的部分的對照。在來自獼猴#25689的血清存在的情況下B組鏈球菌的調理吞噬殺傷的數(shù)據(jù)代表所有三只猴子中誘導的抗體?？傊?，在人和獼猴中獲得的結果顯示V型多糖的三糖側鏈不被免疫系統(tǒng)識別。具有唾液酸的側鏈可能"掩蓋"人和非人靈長類動物中的V型多糖的可識別的優(yōu)勢免疫表位。我們假設提供優(yōu)勢免疫表位可能改善免疫系統(tǒng)的刺激，且允許更好的同種型轉換至保護性PS特異性IgG抗體。我們設計新的實驗GBSV疫苗，其中將化學修飾的去唾液酸GBSVPS綴合至蛋白載體，然后我們檢查這是否允許保護性表位(例如，包含直接結合至主鏈的葡萄糖殘基的V型重復單位的主鏈)的更好的識別，從而允許向保護性V特異性IgG的同種型轉換。實施例9.使用修飾的V型多糖-蛋白綴合物進行的獼猴的接種。使純化的GBSVPS去唾液酸化和氧化以產生用于通過還原胺化作用綴合至單體TT的反應性醛基。去唾液酸V-TT疫苗在小鼠中是無毒的且具有免疫原性。然后，在非人靈長類動物中檢測所述疫苗的免疫原性。用去唾液酸V-TT疫苗注射三只獼猴兩次，其間相隔8周。從所述動物分離血清以表征在動物中誘導的抗體的表位iP、別和功能活性。三只用去唾液酸GBSV-TT疫苗免疫的猴子的GBSV特異性IgM抗體的反應描述于圖21中.各線代表用去唾液酸GBSV-TT疫苗免疫前和兩次免疫后個體動物中的GBSV特異性IgM抗體的水平。沿X軸顯示初次免疫后以周表示的時間，沿Y軸顯示以叫/ml表示的V型特異性IgM抗體的水平。用黑色箭頭標示免疫。在免疫前，用去唾液酸GBSV-TT疫苗免疫的三只猴子中沒有一只具有針對天然V型PS的IgM抗體。在第一劑疫苗后在所有三只動物中觀察到GBSV特異性IgM反應，免疫后3-5周觀察到反應的最高水平。在第二次免疫后GBSV特異性IgM的水平沒有增加。由去唾液酸GBSV-TT疫苗誘導的GBSV特異性IgM的水平比由天然的GBSV-TT疫苗誘導的IgM水平低，由去唾液酸疫苗誘導的(JBSV特異性IgM和由天然疫苗誘導的GBSV特異性IgM的中位水平分別為5fig/ml對30jig/ml。將用去唾液酸GBSV-TT疫苗免疫前和免疫兩次后的GBSV特異性IgA反應描繪于圖22中。在兩種免疫后，在三只猴子中的兩只中觀察到低水平的IgA抗體。GBSV特異性IgG抗體反應描繪于圖23中。在免疫前用去唾液酸V-TT疫苗免疫的三只猴子中沒有一只具有預先存在的對V型多糖的IgG抗體。在第一次免疫后，IgGV特異性抗體的水平顯著，免疫后3-8周獲得最高水平。此外，對于三只猴子都看到在用去唾液酸GBSV-TT二次接種后的顯著加強的應答。因此，去唾液酸V-TT疫苗刺激(1)適度的IgM反應，(2)顯著的IgG轉換，(3)在第二劑后加速的和增加的V特異IgG反應強度，和(4)長效GBSV特異性抗體反應，在第二次接種后10周具有大約10jig/ml的V特異性IgG中位水平。實施例10.由經修飾的V型多糖-蛋白綴合物誘導的IgG抗體的特異性。通過在去唾液酸、脫氨或天然GBSV多糖存在的情況下測量對GBSV多糖的結合的抑制來檢測獲自獼猴并25987的疫苗誘導的血清抗體的IgG級分的特異性。將結果繪制于圖24中，抑制劑的濃度繪制于X軸上，百分比抑制率繪制于Y軸上。如通過這些經化學修飾的多糖和天然V型PS(三角形)的相似的抑制曲線所顯示的，用去唾液酸GBSV-TT疫苗誘導的IgG抗體免疫的獼猴中產生的所有GBSV特異性抗體都識別脫氨(實心正方形)和去唾液酸(空心正方形)多糖。因此，獼猴中對于去唾液酸GBSV-TT疫苗誘導的抗體的優(yōu)勢B細胞表位是具有側鏈葡萄糖的多糖的主鏈。包含三糖唾液酸的側鏈不是該表位的部分。使用來自其他兩只猴子的血清也獲得相同的結果。就來自獼猴的IgM抗體重復實驗。來自獼猴#25987的血清的IgM抗體的結果描述于困25中。如通過這些化學修飾的多糖和天然V型PS(三角形)的相似的抑制曲線所顯示的，疫苗誘導的IgM抗體識別脫氨基(豳)和去唾液酸V型PS(正方形)，園此錄濂中對于去唾液酸V-TT糖綴合物疫苗誘導的抗體的優(yōu)勢B細胞表位是具有側鏈衢萄糖的多糖的主鏈。包含三糖唾液酸的側鏈不是免疫優(yōu)勢B細胞表位的部分。使用來自其他兩只猴子的血清也獲得相同的結果。實施例11.獼猴中V型特異性抗體的功能。就體外調理吞噬殺傷能力檢測來自用去唾液酸GBSV-TT疫苗免疫的獼猴的抗體的IgG和IgM級分。我們發(fā)現(xiàn)在補體和PMNL存在的情況下IgG和IgM級分的抗體都殺死活GBSV鏈球菌(圖26)。已描述了本發(fā)明的許多實施方案。然而，要理解的是可進行各種改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，其他實施方案在下面的權利要求的范圍之內。實施例12.用經修飾的V型多糖-蛋白綴合物和佐劑誘導的IgG抗體《以每次免疫0,625psPS的刺量和每次免疫6.25何gPS的劑量給小鼠腹膜內施用天然GBSV-TT疫苗。在0.5mg明礬存在或不存在的情況下用GBSV-TT綴合物免疫小鼠。在第0天和第21天給每組6只129/J小鼠給藥。在免疫前，第一劑和第二劑之間(在第20天)和第二劑之后(在第31天)從動物獲取血清。通過ELISA確定在各組動物中誘導的V特異性IgG的水平并將該水平繪制于圖27A-27D中.如圖27A中所示，在免疫后31天用低劑量的GBSV-TT組合物誘導的V特異性IgG的濃度在0.01至l叫/ml之間。相反地，明礬的加入導致V特異性IgG的水平在10至100jig/ml之間(圖27B)。類似地，在明礬不存在的情況下高劑量的GBSV-TT誘導0.01-0.05ng/ml的V特異性IgG(圖27C)，而高劑量在明礬存在的情況下誘導10-100ng/ml的水平。這些數(shù)據(jù)顯示明礬可在哺乳動物中增強對GBS綴合物組合物的免疫應答，實施例13.通過被動母體免免疫使新生動物免疫受攻擊的保護使用母體接種和新生兒攻擊的小鼠模型檢查使用血清逃行被動免疫產生的體內保護性功效，所迷血清獲自用去唾液酸GBSV型糖綴合物疫苗免疫的獼猴。該模型描述于Rodewald等人，/J/2/eW，166(3):635-9，1992。簡而言之，給妊娠CD-1小鼠(每組3只動物)腹膜內單次注射0.5ml下列血漿樣品中的一種樣品獲自3只用GBSV-TT免疫的獼猴的混合血清、獲自3只用去唾液酸GBSV-TT免疫之后的獼猴的混合血清、標準的人參照混合血清物(SHRSIII;陽性對照)或混合的免疫前獼猴血漿(陰性對照)。各混合血清/血漿中的GBSV特異性IgG的濃度列于表4中。表4.GBS被動保護模型中受試混合血清/血漿中的GBSV特異性IgG的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>出生前2-3天給小鼠施用血清。在出生的笫一天，用高于在該模型中殺死50%的小鼠的劑量40倍的劑量(40xLDs。)的GBS(菌林CJB111)攻擊小鼠生出的幼崽。出生后在GBS攻擊48小時后存活的幼患的數(shù)目列于表5中。如表5中所示，用血清對妊娠動物進行的被動接種有效地保護其幼崽免受致死劑量的GBS傷害，所述血清來自用去唾液酸GBSV-TT免疫的獼猴。由來自去唾液酸V-TT誘導的動物的血清獲得的保護與由來自V-TT誘導的動物的血清獲得的保護相當。表5.GBS被動保護模型中的幼崽的存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實施例14.通過主動母體免疫使新生動物免受攻擊的保護也使用描述于上面實施例13中的母體接種和新生兒攻擊的小鼠模型確定主動免疫的體內功效。在第0和第21天給雌性CD-1小鼠施用V-TT或去唾液酸V-TT兩次。各劑量包含O.8pg的以吸附至氫氧化鋁的糖綴合物的形式提供的PS。給另一組雌性小鼠施用鹽水和氫氧化鋁，作為對照。在出生的第一天用40倍于在該模型中使50%的小鼠致死的劑量的劑量(40xLD5。)的GBS(菌林CBJ111)攻擊接受免疫的小鼠出生的幼崽。在出生后在GBS攻擊48小時后存活的幼崽數(shù)目列于表6中。這些數(shù)據(jù)顯示用去唾液酸GBSV-TT進行雌鼠的主動免疫保護其新生幼崽免受致死粼量的GBS的傷害。通it用去唾液酸UT主動兔疫獲得的保護和通過用V-TT主動免疫獲得的保護相當。表6.GBS主動保護模型中幼崽的存活率給母體施用的疫苗百分比存活率(存活數(shù)目/總數(shù))去唾液酸V-TT+明礬98%(49/50)V-TT+明鞏100%(71/71)鹽+明礬41%(10/24)其他實施方案已描述了本發(fā)明的許多實施方案。然而，要理解，可進行許多改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，其他實施方案在下列權利要求的范圍之內。權利要求1.一種抗原組合物，其包含(a)經修飾的B組鏈球菌(GBS)V型多糖；和(b)共價地和所述多糖結合的部分。2.權利要求1的組合物，其中通過在從多糖除去側鏈-末端唾液酸殘基的條件下進行處理來修飾所述多糖。3.權利要求2的組合物，其中通過在略微酸性的條件下進行處理來修飾所述多糖。4.權利要求1的組合物，其中所述多糖是去唾液酸GBSV型多糖。5.權利要求1的組合物，其中通過在從多糖主鏈上除去三糖側鏈的條件下進行處理來修飾所述多糖。6.權利要求5的組合物，其中通過順序地去唾液酸化、脫乙?；兔摪被饔脕硇揎椝龆嗵?。7.權利要求1的組合物，其中所述多糖是脫氨GBSV型多糖。8.權利要求l的組合物，其中所述部分是多肽。9.權利要求8的組合物，其中所述多肽是細菌多肽。10.權利要求9的組合物，其中所述多肽是細胞表面或分泌的細菌多狀。11.權利要求9的組合物，其中所述多肽是GBS多肽。12.權利要求11的組合物，其中所述多肽是由在Tettelin等人，JcatfSc/KSJ，99(19):12391-6，2002中鲞定的基園編碼的GBSV多肽。13.權利要求ll的組合物，其中所述GBS多肽選自C蛋白ct多肽、GBSC蛋白P多肽、s多肽、R蛋白、a樣蛋白、b組鏈球菌1的表面蛋白(spbl)、spb2、層粘連蛋白結合蛋白(Lmb)、C5a肽酶、基質粘附(E邁a)多肽及其抗原片段。14.權利要求8的組合物，其中所述組合物包含2、3、4或5種不同的多肽。15.權利要求9的組合物，其中所述多肽是細菌毒素或類毒素。16.權利要求15的組合物，其中所述多肽是破傷風類毒素。17.權利要求15的組合物，其中所述多肽是白喉類毒素。18.權利要求15的組合物，其中所述多肽是白喉突變蛋白交叉反應性物質(CRM197)。19.權利要求1的組合物，其中所述多糖至少為1千道爾頓(kD)。20.權利要求19的組合物，其中所述多糖至少為25kD。21.權利睪求20的組合物，甚中所述多雄至少為50kD，22.權利要求1的組合物，其中所述組合物包含0.1至500ng的量的多糖。23.權利要求l的組合物，其中所述組合物還包含可藥用栽體。24.權利要求l的組合物，其中所述組合物還包含佐劑。25.權利要求24的組合物，其中所述佐劑是明礬。26.權利要求1的組合物，其中所述組合物還包含至少一種其他的多糖。27.權利要求26的組合物，其中至少一種其他的多糖包含細菌多糖。28.權利要求27的組合物，其中所述細菌多糖包含GBS多糖。29.權利要求28的組合物，其中所述細菌多糖包含GBSIa、Ib、II、III、IV、VI、VII或VIII型多糖中的一種或多種。30.用于在哺乳動物中引發(fā)免疫應答的方法，所述方法包括給所述哺乳動物施用組合物，所述組合物包含(a)經修飾的B組鏈球菌(GBS)V型多糖；和(b)共價地和所述多糖結合的部分；從而在哺乳動物中引發(fā)免疫應答。31.權利要求30的方法，其中通過在從多糖除去側鏈-末端唾液酸殘基的條件下進行處理來修飾所述多糖。32.權利要求30的方法，其中所述經修飾的多糖是去唾液酸GBSV型多糖。33.權利要求30的方法，其中通過在從多糖主鏈除去三糖側鏈的條件下進行處理來修飾所述多糖。34.權利要求30的方法，其中所述經修飾的多糖是脫氨GBSV型多糖。35.權利要求30的方法，其中所述部分是多肽。36.權利要求35的方法，其中所述多肽是細菌多肽。37.權利要求36的方法，其中所述多肽是細胞表面或分泌的細菌多肽。38.權利要求36的方法，其中所述多肽是GBS多肽。39.權利要求38的方法，其中所述GBS多肽選自C蛋白a多肽、GBSC蛋白P多肽、s多肽、R蛋白、oc樣蛋白、b組鏈球菌1的表面蛋白(spbl)、spb2、層粘連蛋白結合蛋白(Lmb)、C5a肽酶、基質粘附(Ema)多肽及其抗原片段。40.權利要求35的方法，其中所述組合物包含2、3、4或5種不同的多肽。41.權利要求36的方法，其中所述多肽是毒素或類毒素。42.權利要求41的方法，其中所述多肽是破傷風類毒素。43.權利要求41的方法，其中所述多肽是白喉類毒素。44.權利要求41的方法，其中所述多肽是CRM197。45.權利要求30的方法，其中所迷多糖至少為1千道爾頓(kD)。46.權利要求45的方法，其中所述多糖至少為25kD。47.權利要求30的方法，其中給受試者施用所述組合物兩次或更多次。48.權利要求30的方法，其中給哺乳動物施用包含0.1至500叫的所述多糖的組合物的量。49.權利要求48的方法，其中給哺乳動物施用包含25至100jig的所述多糖的組合物的量。50.權利要求30的方法，其中所述組合物還包含佐劑。51.權利要求50的方法，其中所述佐劑是明礬。52.權利要求30的方法，其中所述方法在哺乳動物中引發(fā)抗體反應。53.權利要求52的方法，其中所述方法在哺乳動物中引發(fā)IgG抗體反應。54.權利要求30的方法，其中所述方法在哺乳動物中引發(fā)保護性反應。55.權利要求30的方法，其中所述哺乳動物處在被GBS細菌感染的風險中。56.權利要求30的方法，其中所述哺乳動物是靈長類動物。57.權利要求56的方法，其中所述靈長類動物是人。58.權利要求57的方法，其中給成人施用所述組合物。59.權利要求58的方法,其中給超過IO歲的人施用所述組合物。60.權利要求59的方法，其中所述人是非妊娠婦女。61.權利要求59的方法，其中給超過50歲的人施用所述組合物,62.權利要求61的方法，其中給超過70歲的人施用所述組合物。63.權利要求59的方法，其中所述人是孕婦。64.權利要求30的方法，其中所述組合物還包含除了經修飾的GBSV型多糖外的至少一種其他的多糖。65.權利要求64的方法，其中至少一種其他的多糖包含GBSIa、ib、ii、in、iv、vi、vn或vin型多糖。66.給新生兒提供抗體的方法，該方法包括給孕婦施用抗原組合物，該組合物包含(a)經修飾的B組鏈球菌(GBS)V型多糖；和O))與所述多糖物理結合的部分。67.用于制備免疫原性組合物的方法，該方法包括提供純化的GBSV多糖；在修飾所述多糖的結構的條件下處理所述多糖。68.權利要求67的方法，其中在除去多糖側鏈的一個或多個殘基的條件下修飾該多糖。69.權利要求68的方法，其中在除去多糖的側鏈-末端唾液酸殘基的條件下修飾該多糖。70.權利要求67的方法，其中在除去多糖的三糖側鏈的條件下修飾該多糖。71.包含通過權利要求66的方法獲得的抗血清的組合物。全文摘要此處提供了經修飾的鏈球菌多糖和使用所述經修飾的多糖的方法。文檔編號A61K39/00GK101107010SQ200580044025公開日2008年1月16日申請日期2005年11月1日優(yōu)先權日2004年11月1日發(fā)明者D·L·卡斯珀,H-K·格特姆森申請人:布里格海姆婦女醫(yī)院公司