專利名稱：主要含有GalGlcNAcMan的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用來生產(chǎn)具有特定N-連接糖基化模式的糖蛋白的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及包含多種具有特定N-聚糖結(jié)構(gòu)的N-聚糖的、免疫球蛋白糖蛋白的組合物，更特別地，涉及含有免疫球蛋白糖蛋白的組合物，其中在調(diào)控譬如促進特定效應功能的免疫球蛋白上有一個或多個占有優(yōu)勢的糖形(glycoform)結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
糖蛋白可在人體和其它哺乳動物中調(diào)控多種基本功能，包括催化作用、信號作用、細胞-細胞通訊、以及分子識別和聯(lián)系。在真核生物中，糖蛋白構(gòu)成了多數(shù)非胞液蛋白(Lis and Sharon，1993，Eur.J.Biochem.2181-27)。已開發(fā)了許多糖蛋白用于治療目的，在過去的20年中，天然存在的糖蛋白的重組載體已經(jīng)成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的主要部分。用于治療的重組糖基化蛋白的例子包括紅細胞生成素(EPO)、治療用單克隆抗體(mAbs)、組織纖維酶原激活物(tPA)、干擾素-β(IFN-β)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、及人絨毛膜促性腺激素(hCH)(Cumming et al.，1991，Glycobiology 1115-130)。由于生產(chǎn)的重組蛋白可作為臨床上預防性及治療性手段，因此重組生產(chǎn)的糖蛋白中糖基化模式的變化近來在科學界中已經(jīng)成為非常引人關(guān)注的主題?？贵w或免疫球蛋白(Ig)是在體液免疫應答中發(fā)揮中心作用的糖蛋白。抗體可視為在體液和細胞防御機制間提供連接的“接頭”分子。
抗體對抗原的特異性識別可引發(fā)形成免疫復合物，其能夠活化多種效應機制，導致復合物的去除及破壞。在免疫球蛋白的通常分類中，可根據(jù)生化及功能區(qū)分為5種類型的抗體——IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，而更為細微的差異集中在特異結(jié)合抗原的可變區(qū)。在這5類Igs中，只有兩種類型的輕鏈，命名為lambda(λ)和kappa(κ)。在具有λ和κ鏈的抗體間沒有功能差異，但兩種類型輕鏈的比例因物種而異。存在5種類型的重鏈或同種型，它們決定了抗體分子的功能活性。免疫球蛋白的5種功能類型是免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)。每種同種型在免疫應答中具有特定功能，它們與眾不同的功能特性是由重鏈的羧基末端部分賦予的，與輕鏈沒有關(guān)系。IgG是血漿中最豐富的免疫球蛋白同種型(參見例如Immunobiology，Janeway etal，6thEdition，2004，Ga rland Publishing，New York)。
免疫球蛋白G(IgG)分子含有一個具有恒定區(qū)和可變區(qū)的Fab(抗原結(jié)合片段)結(jié)構(gòu)域以及Fc(可結(jié)晶片段)結(jié)構(gòu)域。每個重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域在連接N-聚糖與Ig分子的天冬酰胺殘基處含有單個的N-連接糖基化位點，通常是殘基Asn-297(Kabat et al.，Sequences of proteins ofimmunological interest，F(xiàn)ifth Ed.，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)。
由于以下三個主要原因，對N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)與功能特性的分析具有重要的生物學意義(1)CH2結(jié)構(gòu)域的糖基化在進化中得以保留，表明寡糖具有重要的作用；(2)免疫球蛋白分子可作為分析異源寡糖的模式系統(tǒng)(Rademacher and Dwek，1984；Rademacher et al.，1982)；(3)抗體包含以二聚體連接的兩條重鏈，這使得兩個寡糖單元彼此直接接觸，因此免疫球蛋白參與特定的蛋白-糖類以及糖類-糖類相互作用。
已表明Igs的不同的糖基化模式與不同的生物學性狀相關(guān)聯(lián)(Jefferis and Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol.，65111-128；Wright and Morrison，1997，Trends Biotechnol.，1526-32)。不過，僅已知幾個提供期望生物學功能的特定的糖形。例如，已報道一種在N-連接聚糖上具有減少的巖藻糖基化的免疫球蛋白組合物可增強與人FcγRIII的結(jié)合，并因此增強抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)(Shieldset al.，2002，J.Biol Chem，27726733-26740；Shinkawa et al.，2003，J.Biol.Chem.2783466-3473)。并且，據(jù)報道，與異源抗體組合物相比較，在CHO細胞中生成的巖藻糖基化G2(GaI2GIcNAc2-Man3GlcNAc2)IgG組合物可顯著增加補體依賴的細胞毒作用(CDC)活性(Raju，2004，US Pat.Appl.No.2004/0136986)。也表明合適的腫瘤抗體可優(yōu)先結(jié)合以活化Fc受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)，而且對FcγRIIb受體的抑制最小(Clynes et al.，2000，Nature，6443-446)。因此，亟待在Ig糖蛋白上富集特定糖形的能力。
通常，糖蛋白上的糖基化結(jié)構(gòu)(寡糖)依據(jù)表達宿主與培養(yǎng)條件而變化。在非人類宿主細胞生產(chǎn)的治療用蛋白可能含有在人體中引發(fā)免疫應答的非人類糖基化，譬如，酵母中的超甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185440-470)、植物中的α(l，3)-海藻糖和β(l，2)-木糖(Cabanes-Macheteau et al.，1999，Glycobiology，9365-372)、在中國倉鼠卵巢細胞中的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Noguchi et al.，1995.J.Biochem.1175-62)和小鼠中的Galα-l，3Gal糖基化(Borrebaeck et al.，1993，Immun.Today，14477-479)。此外，半乳糖苷化可隨細胞培養(yǎng)條件而變化，這可依據(jù)其特定的半乳糖模式給予某些免疫球蛋白組合物免疫性(Patel et al.，1992.BiochemJ.285839-845)。由非人類哺乳動物細胞所生產(chǎn)的糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)可能與人類糖蛋白中的結(jié)構(gòu)有更近的關(guān)系。因此，絕大多數(shù)商品化的免疫球蛋白均在哺乳動物細胞中生產(chǎn)。不過，哺乳動物細胞作為蛋白生產(chǎn)宿主細胞有幾個嚴重缺點。除了昂貴之外，在哺乳動物細胞中表達蛋白的過程中會產(chǎn)生異源糖形群體、具有較低的容量滴度(volumetric titers)、并需要持續(xù)負載病毒及相當長的時間來產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系。
應理解不同的糖形可顯著影響治療的特性，包括藥物動力學、藥效學、受體相互作用和組織特異性定位(Graddis et al.，2002，CurrPharm Biotechnol.3285-297)。特別是，對抗體而言，寡糖的結(jié)構(gòu)可影響與蛋白酶抗性、FcRn受體介導的抗體的血清半衰期、與誘導補體依賴的細胞毒作用(CDC)的補體復合物C1的結(jié)合，及與負責調(diào)控抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)途徑的FcγR受體的結(jié)合、吞噬作用以及抗體的反饋作用相關(guān)的特性(Nose and Wigzell，1983；Leatherbarrow and Dwek，1983；Leatherbarrow et al.，1985；Walker etal.，1989；Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289)。
由于不同的糖形與不同的生物特性相關(guān)，因此可通過富集一個或多個特定糖形的能力來評估特定糖形與特定的生物功能之間的關(guān)系。若所需的生物功能與某個特定的糖形模式相關(guān)，則可產(chǎn)生富集了有利的糖形結(jié)構(gòu)的糖蛋白組合物。因此，非常需要可產(chǎn)生富集了特定糖形的糖蛋白組合物的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種含多個免疫球蛋白的組合物，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，超過百分之50摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。更優(yōu)選地，超過百分之75摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。最優(yōu)選地，超過百分之90摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。在其它優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)的水平至少比所述多種N-聚糖中占第二優(yōu)勢的N-聚糖結(jié)構(gòu)高出約百分之5到約50摩爾百分數(shù)。
本發(fā)明還提供了通過在免疫球蛋白上富集特定糖形(譬如，GalGlcNAcMan5GlcNAc2)來增加FcγRIIIa和FcγRIIIb受體的結(jié)合以及降低FcγRIIb受體的結(jié)合的方法。一個優(yōu)選的技術(shù)方案提供了一種生產(chǎn)含多個免疫球蛋白的組合物的方法，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成，所述方法包括培養(yǎng)改造或篩選宿主細胞使其表達所述免疫球蛋白或其片段。另一個優(yōu)選的技術(shù)方案提供了生產(chǎn)含多個免疫球蛋白的組合物的方法，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成，所述方法包括培養(yǎng)改造或篩選低等真核宿主細胞使其表達所述免疫球蛋白或其片段。在本發(fā)明的其它技術(shù)方案中，宿主細胞含有編碼免疫球蛋白或其片段的外源基因，改造或篩選所述真核宿主細胞使其表達所述免疫球蛋白或其片段，從而生產(chǎn)含有多種免疫球蛋白的組合物，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。在本發(fā)明另外的其它技術(shù)方案中，低等真核宿主細胞含有編碼免疫球蛋白或其片段的外源基因，改造或篩選所述真核宿主細胞使其表達所述免疫球蛋白或其片段，從而生產(chǎn)含有多種免疫球蛋白的組合物，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，含有多種免疫球蛋白組合物中每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成，其中所述免疫球蛋白具有降低的與FcγRIIb受體的結(jié)合親和性。在本發(fā)明其它優(yōu)選的技術(shù)方案中，含有多種免疫球蛋白組合物中每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成，其中所述免疫球蛋白具有增加的與FcγRIIIa和FcγRIIIb受體的結(jié)合親和性。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，含有多種免疫球蛋白組合物，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成，其中所述免疫球蛋白具有增加的抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)。
在一個技術(shù)方案中，本發(fā)明的組合物含有基本上不含海藻糖的免疫球蛋白。在另一個技術(shù)方案中，本發(fā)明的組合物含有缺少海藻糖的免疫球蛋白。本發(fā)明的組合物還含有藥物組合物及藥學上可接受的載體。本發(fā)明的組合物還含有已純化并包含在試劑盒中的免疫球蛋白的藥物組合物。
因此，本發(fā)明提供了用來生產(chǎn)具有占有優(yōu)勢的糖基化結(jié)構(gòu)的糖蛋白組合物的材料和方法，具體而言，提供具有主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成的N-聚糖免疫球蛋白或者抗體分子。
附圖的簡要描述

圖1.具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的IgG的示意圖。
圖2.在YAS385-1中表達(如實施例2所述)并通過蛋白A柱(泳道1)和苯基瓊脂糖凝膠柱(泳道2)從培養(yǎng)基中純化(如實施例3所述)的JC-IgG的考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE膠。(2.5μg蛋白/泳道)圖3.在YAS385-1中表達(如實施例2所述)并通過蛋白A柱(泳道1)和苯基瓊脂糖凝膠柱(泳道2)從培養(yǎng)基中純化(如實施例3所述)的DX-IgG的考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE膠。(2.5μg蛋白/泳道)圖4A.在YAS385-1中表達的、用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理的主要具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG的MALDI-TOF圖譜。B.在YAS385-1中表達的、用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理的主要具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG的MALDI-TOF圖譜。
圖5A.FcγRIIIb與JC-IgG及Rtuximab的ELISA結(jié)合試驗。B.FcyRIIIB與DX-IgG及Rtuximab的ELISA結(jié)合試驗。(GGM5＝GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)圖6.FcγRIIIa-158F與JC-IgG及Rtuximab的ELISA結(jié)合試驗。(GGM5＝GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)圖7A.FcγRIIb與JC-IgG及Rtuximab的ELISA結(jié)合試驗。圖7B.FcgRIIb與DX-IgG及Rtuximab的ELISA結(jié)合試驗。(GGM5＝GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)序列的簡要描述SEQ ID NO1編碼DX-IgGl輕鏈中鼠可變與人恒定區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO2編碼DX-IgGl重鏈中鼠可變與人恒定區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO3編碼IgGl輕鏈中人恒定區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO4編碼IgGl重鏈中人恒定區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO5至19編碼15個用于通過聚合酶鏈反應(PCR)來合成鼠DX-IgGl輕鏈可變區(qū)的重疊的寡核苷酸。
SEQ ID NO20至23編碼4個用于連接鼠DX-IgGl輕鏈可變區(qū)與人輕鏈恒定區(qū)的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO24至40編碼17個用于通過PCR來合成鼠DX-IgGl重鏈可變區(qū)的重疊的寡核苷酸。
SEQ ED NO41到44編碼4個用于連接鼠DX-IgGl重鏈可變區(qū)與人重鏈恒定區(qū)的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO45編碼核苷酸序列——它可編碼帶有N-末端EcoRI位點的Kar2(Bip)信號序列。
SEQ ID NO46到49編碼4個用于連接Kar2信號序列與DX-IgGl輕鏈和重鏈的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO50編碼與鼠JC-IgGl輕鏈(GenBank#AF013576)中IgGl可變區(qū)相對應的核苷酸序列。
SEQ ID NO51編碼與鼠JC-IgGl重鏈(GenBank#AF013577)中IgGl可變區(qū)相對應的核苷酸序列。
SEQ ID NO52至63編碼12個用于PCR合成鼠JC-IgGl輕鏈可變區(qū)的重疊的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO64至75編碼12個用于PCR合成鼠JC-IgGl重鏈Fab片段的重疊的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO76至87編碼12個用于通過PCR來合成鼠JC-IgGl重鏈Fc片段的重疊的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO88編碼與Fc片段3’末端相對應的3′Kpnl引物。
SEQ ID NO89編碼人血清白蛋白(HSA)的核苷酸序列。
SEQ ID NO90編碼用于本發(fā)明中凝血酶水解的核苷酸序列。
發(fā)明的詳細描述除非在本文中另有定義，否則與本發(fā)明相關(guān)的科學及技術(shù)術(shù)語和短語均為本領域普通技術(shù)人員所一般了解的含義。此外，除非是上下文另有需要，否則單數(shù)術(shù)語將包括復數(shù)、復數(shù)術(shù)語也包括單數(shù)。通常，本文所述的用于與生物化學、酶學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學以及蛋白質(zhì)與核酸化學及雜交等技術(shù)相關(guān)的命名，均為本領域所熟知并常用的。本發(fā)明中的方法和技術(shù)，除非另有說明，通常根據(jù)本領域所熟知的常規(guī)方法來進行，在所引用的多個綜合的及更為具體的文獻中有所描述，并在本技術(shù)說明中進行了討論。參見，例如，Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates(1992，and Supplements to 2002)；Harlow andLane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1 990)；Taylor andDrickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，F(xiàn)reehold，NJ；Handbook of BiochemistrySectionA Proteins，Vol I，CRC Press(1976)；Handbook of BiochemistrySection A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1999)；Immunobiology，Janeway et al，6thEdition，2004，GarlandPublishing，New York)。
本文所提及的所有出版物、專利和其它文獻，均作為參考完整地整合在本文中。
下面的術(shù)語。除非另有說明，應理解為具有以下含義在本文用法中，術(shù)語“N-聚糖”、“聚糖”和“糖形”可替換使用，指的是N-連接的寡糖，譬如，通過N-乙酰氨基葡萄糖殘基與或者曾經(jīng)與蛋白質(zhì)中天冬酰胺殘基的氨基氮相連接的寡糖。在糖蛋白中所發(fā)現(xiàn)的占有優(yōu)勢的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以及唾液酸(譬如，N-乙酰-神經(jīng)氨酸(NANA))。糖基的加工在ER內(nèi)腔中與翻譯同時進行，并在高爾基體中加工成N-連接的糖蛋白。
N-聚糖有一個共有的5糖核心——Man3GlcNAc2(“Man”指的是甘露糖；“Glc”指的是葡萄糖；“NAc”指的是N-乙?；籊lcNAc指的是N-乙酰氨基葡萄糖)。N-聚糖的不同之處在于所含有的外周糖類(譬如，GlcNAc、半乳糖、海藻糖和唾液酸)分枝(突出)的數(shù)目，這些分枝添加到Man3GlcNAc2(“Man3”)核心結(jié)構(gòu)上——該結(jié)構(gòu)也稱為“3甘露糖核心”、“5糖核心”、或“寡甘露糖核心”。N-聚糖根據(jù)其分枝組成進行分類(譬如，高甘露糖、復合或雜合)。“高甘露糖”類型的N-聚糖含有5個或者更多的甘露糖殘基。典型的“復合”型的N-聚糖具有至少一個附在“3甘露糖核心”中1，3甘露糖臂上的GlcNAc，以及至少一個附在“3甘露糖核心”中1，6甘露糖臂上的GlcNAc。復合的N-聚糖也可以含有被唾液酸或衍生物(譬如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指的是神經(jīng)氨酸，“Ac”指的是乙?；?所修飾的半乳糖(“Gal”)或者N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)殘基。復合的N-聚糖也可以具有由“分開的”GlcNAc與核心海藻糖(“Fuc”)所組成的鏈內(nèi)替代。復合的N-聚糖還可以在“3甘露糖核心”上具有多個突出，通常稱之為“多突出聚糖”?！半s合”的N-聚糖在3甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端具有至少一個GlcNAc，在3甘露糖核心的1，6甘露糖臂上有0個或者更多個甘露糖。多種N-聚糖也被稱為“糖形”。
本文所用的縮寫均為本領域的通常用法，參見，例如上述的糖的縮寫。其它常見的縮寫包括“PNGase”或“聚糖酶”或“葡萄糖苷酶”，它們均指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。
“分離的”或者“基本上純的”核酸或多核苷酸(譬如RNA、DNA或混合多聚物)是指從自然情況下在其自然宿主細胞中就含有天然的多核苷酸的其它細胞組分——譬如，天然相關(guān)的核糖體、聚合酶及基因組序列——中充分分離出的核酸或多核苷酸。該術(shù)語指核酸或者多核苷酸(1)已經(jīng)從其天然所處環(huán)境中分離出來，(2)與發(fā)現(xiàn)“分離的多核苷酸”的環(huán)境中的所有或者部分多核苷酸不再有聯(lián)系，(3)能夠有效連接到在自然情況下不與其連接的多核苷酸上，(4)在自然界中不存在。術(shù)語分離的”或者“基本上純凈的”也用來指重組的或克隆的DNA分離物、化學合成的多核苷酸類似物、或者通過異源系統(tǒng)合成的多核苷酸類似物。
不過，“分離的”并不必需要求所描述的核酸或者多核苷酸本身一定要與其天然環(huán)境發(fā)生物理上的分離。例如，如果外源序列被置于內(nèi)源核酸序列附件而使內(nèi)源核酸序列的表達發(fā)生改變，則機體基因組中的內(nèi)源核酸序列在本文中也可被視為“分離的”。在該語境中，異源序列是與內(nèi)源核酸序列自然狀態(tài)下不相鄰的序列，而不管異源序列自身是內(nèi)源的(來自相同的宿主細胞或其后裔)還是外源的(來自不同的宿主細胞或其后代)。作為例子，宿主細胞基因組中基因天然的啟動子的啟動子序列可以被替換(譬如，通過同源重組)，這樣該基因的表達模式會發(fā)生改變。該基因現(xiàn)在就是“分離的”，因為它與至少一部分與其天然相接的序列分離了。
核酸，如果它含有任何基因組中相應核酸天然狀態(tài)不存在的修飾，也可認為是“分離的”。例如，內(nèi)源編碼序列如果含有人工——譬如通過人類干預——引入的插入、缺失或點突變，就可認為是“分離的”?！胺蛛x的核酸”也包括在異源位點整合到宿主細胞染色體上的核酸，以及以游離基因形式參與的核酸構(gòu)建體。此外，當“分離的核酸”是使用重組技術(shù)來進行生產(chǎn)時，基本上不含其它細胞物質(zhì)，或者基本上不含培養(yǎng)基，當通過化學合成來生產(chǎn)時，基本上不含化學前體或者其它化學試劑。
在本文用法中，短語參考核酸序列的“簡并變異體”是指根據(jù)標準遺傳密碼子含有可被翻譯的核酸序列，可提供與參考核酸序列翻譯后-樣的氨基酸序列。術(shù)語“簡并寡核苷酸”或者“簡并引物”用來表示能夠與目標核酸序列雜交的寡核苷酸，它們在序列上不必完全一致，只要彼此直接在一個或多個特定片段有同源性即可。
在文中，術(shù)語核酸序列的“百分比序列同一性”或“同一性”是指兩個序列進行最大對應的比對時其中相同的殘基。序列同一性比較的長度可以是至少約9個核苷酸的一段，通常至少約20個核苷酸，更常見的是至少約24個核苷酸，典型地為至少約28個核苷酸，更典型地為至少約32個核苷酸，優(yōu)選地為至少約36個或更多核苷酸。在本領域有許多已知的不同算法可用來測定核苷酸序列的同一性。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit——它們是Wisconsin Package Version10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序——來比較多核苷酸序列。FASTA可提供查詢序列與搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和百分比序列同一性。Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)(作為參考完整地整合在本文中)。例如，核酸序列之間的百分比序列同一性可通過FASTA用其缺省參數(shù)(字長為6，記分矩陣使用NOPAM因子)、或通過Gap用其由GCG Version 6.1所提供的缺省參數(shù)來確定，作為參考整合在本文中。此外，可使用計算機程序BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Gishand States，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden et al.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)；Zhang and Madden，Genome Res.7649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))來比較序列。
術(shù)語“基本上同源性”或者“基本上相似”，當用來指核酸或其片段時，表明當與另一個核酸(或其互補鏈)進行可有適當核苷酸插入或刪除的最優(yōu)比對時，核苷酸序列的同一性至少為約50％、更優(yōu)選地為60％的核苷酸堿基，通常為至少約70％、更常見的為至少約80％，優(yōu)選的為至少約90％，更優(yōu)選地為至少約95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸堿基，——這些是通過任何已知的序列同一性算法，譬如上述討論的FASTA，BLAST或Gap來測定的。
此外，若核酸或其片段在嚴緊雜交條件下可與另一條核酸、另一條核酸的一條鏈、或其互補鏈雜交，則基本上同源或者相似。在本文中核酸雜交實驗的“嚴緊雜交條件”及“嚴緊洗脫條件”依賴于多個不同的物理參數(shù)。核酸雜交受諸如鹽濃度、溫度、溶劑、雜交種類的堿基組成、互補區(qū)的長度、雜交核酸之間錯配的核苷酸堿基數(shù)這樣的條件的影響，本領域的技術(shù)人員可容易意識到這些。本領域的普通技術(shù)人員了解如何調(diào)整這些參數(shù)以獲得雜交特定的嚴緊度。
通常，在一系列特定的條件下，在比特定DNA雜合子的解鏈溫度(Tm)低約25℃時進行“嚴緊雜交”。在一系列特定的條件下，在比特定DNA雜合子的Tm低約5℃的溫度下進行“嚴緊洗脫”。Tm是50％的目標序列與完全匹配探針雜交時的溫度。參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1 989)，頁碼為9.51，作為參考整合在本文中。在本文用法中，所定義的“嚴緊條件”是針對溶液相雜交的，如在6×SSC(其中20×SSC含有3.0M NaCl和0.3M檸檬酸鈉)、1％SDS的水中雜交(即，不含甲酰胺)，于65℃雜交8-12小時，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中，于65℃洗脫20分鐘，共洗兩次。本領域的技術(shù)人員知道，在65℃的雜交速率并不同，依賴于包括雜交序列長度及百分同一性在內(nèi)的多種因素。
術(shù)語“突變”當用于核酸序列時，指核酸序列中的核苷酸與參考核酸序列相比，可以被插入、缺失或改變。在一個基因座上可以產(chǎn)生單個改變(點突變)，或在單個基因座上插入、缺失或改變多個核苷酸。此外，在核酸序列中的任意數(shù)目個基因座上可產(chǎn)生一個或多個改變?？赏ㄟ^本領域中任何已知方法來突變核酸序列，包括但并不限于諸如“易錯PCR”(在DNA聚合酶的拷貝保真性較低的條件下進行PCR反應的過程，這樣在整個PCR產(chǎn)物的全長范圍內(nèi)可獲得高比例的點突變；參見，例如Leung et al.，Technique，111-15(1989)以及Caldwelland Joyce，PCR Methods Applic.228-33(1992))以及“寡核苷酸定點的突變”(可在任意所需的克隆DNA片段中生成位點特異性突變的過程；參見，例如Reidhaar-Olson and Sauer，Science 24153-57(1988))這樣的突變產(chǎn)生技術(shù)。
本文所用術(shù)語“載體”用來指能夠運輸另一個與之相連的核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)粒”，指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中可連接額外的DNA片段。其它載體包括粘粒、細菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可連接到病毒基因組中(下文將更詳細討論)。某些載體在其所轉(zhuǎn)入的宿主細胞中能夠自主復制(譬如，具有在宿主細胞中可發(fā)揮功能的復制起點的載體)。其它載體在轉(zhuǎn)入宿主細胞后可整合到宿主細胞基因組中，因此與宿主基因組一起復制。此外，某些優(yōu)選的載體能夠指導與其有效連接的基因的表達。這類載體在本文中稱為“重組表達載體”(或者簡單些，“表達載體”)。
在本文用法中，術(shù)語“目標序列“或者”目標基因“是指通常不在宿主細胞中產(chǎn)生的——典型地，編碼蛋白的——核酸序列。本文所描述的方法允許一個或者多個目標序列或者目標基因穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中。目標序列的非限制性例子包括編碼一種或多種具有酶活性的多肽——譬如，諸如甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運子、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、UDP-N-乙酰基半乳糖轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶和海藻糖轉(zhuǎn)移酶這樣的在宿主中影響N-聚糖合成的酶——的序列。
術(shù)語“標記序列”或者“標記基因”是指在宿主細胞中能夠表現(xiàn)出活性從而可對存在或者缺失序列進行陽性或陰性選擇的核酸序列。例如，P.pastoris URA5基因是一個標記基因，因為可根據(jù)含有該基因的細胞能夠在缺少尿嘧啶的環(huán)境中生長的能力來選擇它的存在。也可根據(jù)含有該基因的細胞不能夠在存在5-FOA的環(huán)境中生長的特點來反向選擇它的存在。標記序列或基因不是必須同時具有陽性及陰性選擇性。來自P.pastoris的標記序列或基因的非限制性例子包括ADEl、ARG4、HIS4和URA3。對于抗生素抗性標記基因，卡那霉素、新霉素、遺傳霉素(或G418)、巴龍霉素及潮霉素抗性基因通常用于允許在存在這些抗生素的情況下進行生長。
“有效連接的”表達調(diào)控序列是指一種連接，其中表達調(diào)控序列與目標基因相鄰以控制目標基因，以及跨越或者在一定距離上控制目標基因的表達調(diào)控序列。
在本文用法中術(shù)語“表達調(diào)控序列”是指與編碼序列有效連接、影響其表達所必需的多核苷酸序列。表達調(diào)控序列是控制核酸序列轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后事件及翻譯的序列。表達調(diào)控序列包括合適的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動子及增強子序列；諸如剪接及多聚腺苷酸化信號這樣的RNA加工信號；穩(wěn)定細胞質(zhì)mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(譬如，核糖體結(jié)合位點)；增強蛋白穩(wěn)定性的序列；及若有需要，增強蛋白分泌的信號。這些調(diào)控序列的性質(zhì)依據(jù)宿主機體而有所不同；在原核生物中，這類調(diào)控序列一般包括啟動子、核糖體結(jié)合位點及轉(zhuǎn)錄終止序列。
術(shù)語“調(diào)控序列”是指在最小程度上包括表達所必需的全部組分，也可包括其存在是有利的額外的組分，例如，引導序列和融合部分序列。
本文所用術(shù)語“重組宿主細胞”(“表達宿主細胞”，“表達宿主系統(tǒng)”，“表達系統(tǒng)”，或簡稱“宿主細胞”)，是指其中引入了重組載體的細胞。應理解這些術(shù)語不僅是指特定的受體細胞，而且包括這種細胞的后代。由于突變或者環(huán)境影響在以后的世代中會發(fā)生某些修飾，因此，實際上，這些后代可以與親代細胞不一致，但仍包括在本文所有術(shù)語“宿主細胞”的范疇內(nèi)。重組宿主細胞可以是生長在培養(yǎng)基中的分離的細胞或者細胞系，也可以是位于活體組織或者機體內(nèi)的細胞。
術(shù)語“真核的”是指有細胞核的細胞或者機體，包括昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞及低等真核細胞。術(shù)語“低等真核細胞”包括酵母、真菌、囊鞭毛蟲、微孢子蟲、alveolates(譬如，溝鞭藻類)、發(fā)鞭藻門(譬如，褐藻、原生動物)、紅藻門(譬如，紅藻)、植物(譬如，綠藻、植物細胞、苔蘚)及其它原生生物、酵母和真菌包括，但不限定于畢赤氏酵母(Pichia sp.)，譬如巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、Pichia fnlandica、喜海藻糖畢赤氏酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜蹼畢赤氏酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳畢赤氏酵母(Pichiasalictaria)、Pichia guercuum、皮杰普氏畢赤氏酵母(Pichia pijperi)、具柄(Pichia stiptis)和Pichia methanolica；釀酒酵母(Saccharomycessp.)，譬如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha )、克魯維氏酵母(Kluyveromyces sp.)，譬如乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)；白色假絲酵母(Candidaalbicans)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、木霉Trichoderma reesei、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)，鐮孢菌(Fusarium sp.)，譬如禾谷鐮孢菌(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum；Physcomitrellapatens和粗糙鏈飽霉(Neurospora crassa)。
本文所用術(shù)語“肽”是指短多肽，譬如，典型地小于50個氨基酸長及更典型地小于30個氨基酸長的多肽。本文所用術(shù)語包含具有相似結(jié)構(gòu)及生物功能的相似物與類似物。
術(shù)語“多肽”包含天然存在的和非天然存在的蛋白及其片段、變異體、衍生物和類似物。多肽可以是單體的或者聚合的。此外，多肽可包括某些不同的結(jié)構(gòu)域，每個具有一種或多種獨特的活性。
術(shù)語“分離的蛋白”或“分離的多肽”是指蛋白或者多肽，依據(jù)起源或來源，(1)不與其天然狀態(tài)下所伴隨的相關(guān)組分存在天然狀態(tài)的關(guān)聯(lián)，(2)以自然界所沒有的純度形式存在，其中純度可根據(jù)其它細胞物質(zhì)的存在來認定(譬如，不存在同種類的其它蛋白)，(3)由不同種類的細胞表達，或者(4)在自然界不存在(譬如，在自然界所發(fā)現(xiàn)的是多肽的一個片段，或者它包含自然界所沒有的氨基酸同源物或衍生物，或者是其它標準肽骨架上所沒有的連接物)。因此，化學合成的或者在與其天然來源的細胞不同的細胞系統(tǒng)中合成的多肽，就是從其天然相關(guān)組分中“分離的”。也可以使用本領域所周知的蛋白純化技術(shù)通過分離來使多肽或蛋白基本上不含天然狀態(tài)下的相關(guān)組分。因此按照定義，“分離的”并不要求所述蛋白、多肽、肽或者寡肽要與其天然環(huán)境物理分離。
本文所用術(shù)語“多肽片段”是指有所刪除的多肽，譬如，同全長多肽相比，刪除了氨基末端和/或羧基末端。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，多肽片段是一個連續(xù)的序列，其中片段的氨基酸序列與天然存在的序列中的相應位置相一致。典型地，片段至少有5、6、7、8、9或10個氨基酸長，優(yōu)選地，至少為12、14、16或18個氨基酸長，更優(yōu)選地，至少為20個氨基酸長，更加優(yōu)選地為至少25、30、35、40或45個氨基酸，更加優(yōu)選地為至少50或60個氨基酸長，更加優(yōu)選地是至少70個氨基酸長。
“經(jīng)修飾的衍生物”是指在一級結(jié)構(gòu)上實際同源的多肽或其片段，包括，譬如，體內(nèi)或體外化學及生物修飾或者整合了天然多肽中沒有的氨基酸。這類修飾包括，譬如，乙?；Ⅳ然?、磷酸化、糖基化、泛素化、標記——譬如放射性核，以及多種酶修飾，本領域的技術(shù)人員很容易就會理解這些。標記多肽及替代的多種方法或者用于該目的的標記物在本領域是周知的，包括諸如125I、32p、35S和3H這樣的放射性同位素、可與標記的抗配體(譬如抗體)結(jié)合的配體、熒光團、化學反光試劑、酶、以及可作為標記配體的特異結(jié)合匹配成員的抗配體。標記物的選擇依賴于所需的敏感性、與引物結(jié)合的容易程度、所要求的穩(wěn)定性、以及可用的儀器。標記多肽的方法在本領域是周知的。參見，例如Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，及2002的補充)(作為參考整合在本文中)術(shù)語“融合蛋白”是指含有與異源氨基酸序列相連接的多肽或者片段的多肽。融合蛋白很有用處，因為它們被構(gòu)建成含有來自2個或者多個不同蛋白的2個或者多個所需功能元件。融合蛋白包含至少10個來自所需多肽的連續(xù)的氨基酸，更優(yōu)選地為至少20或30個氨基酸，更優(yōu)選地為至少40、50或60個氨基酸，更優(yōu)選地為至少75、100或125個氨基酸。含有本發(fā)明中整個蛋白的融合是特別有用的。本發(fā)明融合蛋白中包含的異源多肽長度至少為6個氨基酸，通常長度為至少8個氨基酸，有用的長度至少為15、20及25個氨基酸。融合包括諸如免疫球蛋白Fc片段或者免疫球蛋白Fab片段這樣較大的多肽，或者甚至諸如綠色熒光蛋白(“GFP”)含有發(fā)色團的蛋白或具有特定用途的全長免疫球蛋白這樣的整個蛋白?？赏ㄟ^構(gòu)建核酸序列——它所編碼多肽或其片段與編碼不同蛋白或肽的核酸序列在同一個閱讀框內(nèi)、然后表達該融合蛋白的方式來重組生產(chǎn)融合蛋白?；蛘撸赏ㄟ^將多肽或其片段與另一個蛋白相交聯(lián)的方式來化學生產(chǎn)融合蛋白。
在本文用法中，術(shù)語“抗體”、“免疫球蛋白”、“IgG”及“Ig分子”可替換使用。每種抗體具有可使其與特異抗原相結(jié)合的獨特結(jié)構(gòu)，但所有的抗體/免疫球蛋白均具有如本文所述的相同的一般結(jié)構(gòu)。已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單元由亞基的四聚體組成。每個四聚體具有兩對一樣的多肽鏈，每對含有一條“輕”鏈(約25kDa)及一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包含一個約100到110個或者更多氨基酸的可變區(qū)，主要負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分是主要負責效應功能的恒定區(qū)。輕鏈可分為κ或者λ兩類。重鏈可分為γ、μ、α、δ或者ε，并分別確定抗體的類型為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。輕鏈和重鏈可進一步分為可變區(qū)與恒定區(qū)(參見，F(xiàn)undamentalImmunology(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989)，第七章(作為參考將其所有用途完整地整合在本文中)。每條輕/重鏈對的可變區(qū)形成了抗體結(jié)合位點。因此，一個完整抗體具有兩個結(jié)合位點。除了雙功能或者雙特異性抗體外，這兩個結(jié)合位點是相同的。所有的鏈均具有相同的由3個高變區(qū)所連接的相對保守的框架區(qū)(FR)的常規(guī)結(jié)構(gòu)，也稱為補體決定區(qū)或者CDRs。來自每對兩條鏈的CDRs通過框架區(qū)對齊，可以與特異的抗原決定簇結(jié)合。術(shù)語包括天然存在的形式，以及片段和衍生物。包括在術(shù)語的范疇內(nèi)的有Igs類，即，IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。包括在術(shù)語范疇內(nèi)的還有IgGs亞類，即，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。術(shù)語均以最廣義來使用，包括單一的單克隆抗體(包括激動型抗體及拮抗型抗體)以及與多個抗原決定簇或者抗原結(jié)合的抗體組分。術(shù)語明確覆蓋了單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(譬如，雙特異性抗體)、以及抗體片段，只要它們至少含有或者經(jīng)修飾后含有重鏈免疫球蛋白恒定區(qū)——它含有CH2結(jié)構(gòu)域的N-連接糖基化位點——CH2結(jié)構(gòu)域部分，或者其變異體。包括在術(shù)語之內(nèi)的是含有Fc區(qū)的分子，譬如免疫粘著素(美國專利申請No.2004/0136986)、Fc融合分子及抗體類似分子?；蛘?，這些術(shù)語可以指至少Fab區(qū)的抗體片段，其至少含有N-連接糖基化位點。
術(shù)語“Fc”片段是指含有CH2及CH3結(jié)構(gòu)域的抗體C-末端區(qū)域的“結(jié)晶片段”(圖1)。術(shù)語“Fab”片段是指“”含有VH、CH1、VL和CL結(jié)構(gòu)域的抗體的“抗原結(jié)合片段”區(qū)域(圖1)。
在本文用法中，術(shù)語“單克隆抗體”(mAb)是指從一群基本上同源的抗體中獲得的抗體，即，由群體構(gòu)成的單一抗體，除了可能的以較低數(shù)量存在的天然自發(fā)突變外，它們都是一致的。單克隆抗體是高度特異的，針對單一的抗原位點。此外，同常規(guī)的(多克隆)抗體制備——典型地，包括針對不同決定子(抗原決定簇)的不同抗體——相比，每種mAb針對抗原上單一的決定子。除了其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們可通過雜交瘤培養(yǎng)來合成，不受其它免疫球蛋白的污染。術(shù)語“單克隆的”表示抗體的特征，是從基本上同源的抗體群體中獲得的，不應理解為在抗體生產(chǎn)中需要任何特殊的方法。例如，根據(jù)本發(fā)明所使用的單克隆抗體可以通過Kohler et al.，(1975)Nature，256495，or may be made by recombinant DNA methods(see，e.g.，U.S.Pat.No.4,816,567 to Cabilly et al.)首次闡釋的雜交瘤方法來制備。
本文中的單克隆抗體包括通過雜合的及重組的抗體，通過將某個抗體的可變(包括高可變)結(jié)構(gòu)域與恒定結(jié)構(gòu)域(譬如，“人源化”抗體)、或者將輕鏈與重鏈、或者將來自某個物種的一條鏈與來自另一個物種的一條鏈、或者將融合子與異源蛋白進行剪接的方式來生產(chǎn)，而不必考慮物種來源或者所選免疫球蛋白的類群或亞類(參見，譬如，Cabilly et al的美國專利No.4,816,567；Mage and Lamoyi，inMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。本文中的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與抗體所來源的第一個物種中的相應序列一致或同源，或者屬于特定的抗體類群或亞類，而鏈的剩余部分與抗體所來源的其它物種中的相應序列一致或同源，或者屬于不同的抗體類群或亞類，這些抗體的片段也如此，只要它們含有或者修飾后含有至少一個CH2即可。非人源(譬如，鼠)抗體的“人源化”形式是特異嵌合型免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(譬如Fv、Fab、Fab’、 F(ab′)2或者抗體其它的結(jié)合抗原的亞序列)，它們含有源自人免疫球蛋白的序列?？贵w的Fv片段是抗體維持整個分子結(jié)合特征及特異性的最小單位。Fv片段與抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)的異源二聚物是非共價連接的。F(ab′)2片段是含有通過二硫鍵橋相連接的Fab片段的兩個臂的片段。
人源化抗體最常見的類型是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體補體決定區(qū)(CDR)的殘基被來自諸如小鼠、大鼠、或者兔子這樣的非人物種(供體抗體)中具有所需的特異性、親和性及負載的CDR的殘基替換了。在某些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非人源殘基替代。此外，人源化抗體可以含有在受體抗體及引入的CDR或框架序列中所沒有的殘基。產(chǎn)生這些修飾是為了進一步改進及最優(yōu)化抗體性能。通常，人源化抗體基本上含有至少一個、典型地為2個全部的可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或者基本上全部CDR區(qū)與非人源免疫球蛋白的區(qū)域相對應，全部或者基本上全部CDR區(qū)是人免疫球蛋白的一致序列。優(yōu)化的人源化抗體也至少包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分，典型地是人免疫球蛋白的一部分。進一步的細節(jié)參見Jones et al.，1986，Nature 321522-524；Reichmann et al.，1988，Nature332323-327，and Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596.。
在術(shù)語抗體或者免疫球蛋白范疇內(nèi)的“片段”包括通過用多種蛋白酶消化產(chǎn)生的片段、通過化學剪切和/或化學解離產(chǎn)生的片段、以及重組產(chǎn)生的片段——只要片段仍能夠與靶分子特異結(jié)合即可。在這類片段中有Fc、Fab、Fab′、Fv、F(ab′)2，以及單鏈Fv(scFv)片段。
本發(fā)明中抗體所針對的靶包括生長因子受體(譬如，F(xiàn)GFR、PDGFR、EGFR、NGFR及VEGF)及其配體。其它靶有G蛋白受體，包括底物K受體、血管緊張肽受體、α-及β-腎上腺素受體、血清素受體及PAF受體。參見，例如Gilman，Ann.Rev.Biochem.56625-649(1987)。其它靶包括離子通道(譬如，鈣、鈉、鉀通道)、毒蕈堿受體、乙酰膽堿受體、GABA受體、谷氨酸受體及多巴胺受體(參見Harpold，U.S.5,401,629及U.S.5,436,128)。其它靶有諸如整合素、選擇素及免疫球蛋白超家族成員這樣的吸附蛋白(參見Springer，Nature 346425-433(1990).Osborn，Cell 623(1990)；Hynes，Cell 6911(1992))。其它靶有諸如白介素IL-1至IL-13、腫瘤壞死因子α&β、干擾素α、β及γ、腫瘤生長因子Beta(TGF-β)、集落刺激因子(CSF)及粒細胞單核細胞集落刺激因子(GMCSF)這樣的細胞因子。參見Human CytokinesHandbook for Basic & Clinical Research(Aggrawal et al.eds.，BlackwellScientific，Boston，MA 1991)。其它靶有激素、酶、以及諸如腺嘌呤環(huán)化酶、鳥苷酸環(huán)化酶及磷脂酶C這樣的細胞內(nèi)與細胞間信號分子。其它目標靶有諸如CD20和CD33這樣的白細胞抗原。藥物也可以是所需的靶。靶分子可以是人類、哺乳動物或者細菌的。其它靶有諸如來自微生物病原——病毒、細菌及腫瘤——的蛋白、糖蛋白及糖類這樣的抗原。在U.S.4,366,241中描述了其它的靶。
本文討論的免疫Fc受體，可包括FcγRI、FcyRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb及FcRn(新生兒受體)。除非另外有說明，否則術(shù)語FcγRI可指任意FcγRI亞型。除非另外有說明，否則術(shù)語FcγRII可指任意FcγRII亞型。除非另外有說明，否則術(shù)語FcγRIII可指任意FcγRIII亞型。
在術(shù)語范疇內(nèi)的“衍生物”包括在序列中被修飾了的、但仍能夠與靶分子特異結(jié)合的抗體(或其片段)，包括種間嵌合及人源化抗體、抗體融合物、異聚性抗體復合物及抗體融合物，譬如雙價抗體(雙特異性抗體)、單鏈雙價抗體及內(nèi)抗體(參見，譬如IntracellularAntibodiesResearch and Disease Applications，(Marasco，ed.，Springer-Verlag New York，Inc.，1998)。
術(shù)語“非肽類似物”是指與參考多肽具有相似性質(zhì)的化合物。非肽混合物也可稱為“模擬肽”或者“擬肽”。參見，例如Jones，AminoAcid and Peptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung，Combinatorial Peptide and Nonpeptide LibrariesA Handbook，JohnWiley(1997)；Bodanszky et al.，Peptide Chemistry--A Practical Textbook，Springer Verlag(1993)；Synthetic PeptidesA Users Guide，(Grant，ed.，W.H.Freeman and Co.，1992)；Evans et al.，J.Med.Chem.301229(1987)；Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber and Freidinger，Trends Neurosci.，8392-396(1985)；上述所引用的每個參考文獻均作為參考整合在本文中。這類化合物通常借助于計算機處理的分子模型來開發(fā)。與本發(fā)明中有用的肽在結(jié)構(gòu)上相似的模擬肽可用來生產(chǎn)等價效應物，因此可視為本發(fā)明的一部分。
氨基酸替代可包括這些“(1)降低對蛋白酶水解的敏感性，(2)降低對氧化的敏感性，(3)改變對所形成的蛋白復合物的結(jié)合親和性，(4)改變結(jié)合親和性或者酶活性，以及(5)給予或修飾這類類似物的其它物理化學或者功能特性。
在本文用法中，20種常規(guī)氨基酸及其縮寫使用常規(guī)用法。參見Immunology-A Synthesis(Golub and Gren eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.，2nded.1991)，作為參考整合在本文中。20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(譬如，D-氨基酸)、諸如α-，α-雙替代氨基酸這樣的非天然氨基酸、N-羥基氨基酸、以及其它非常規(guī)氨基酸可以是本發(fā)明多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、N-甲基精氨酸、以及其它類似的氨基酸和亞氨基酸(譬如，4-羥脯氨酸)。在本文所用的多肽符號中，在側(cè)末端對應于氨基末端，右側(cè)末端對應于羧基末端，與標準用法和常規(guī)一致。
如果一個蛋白的核酸序列與編碼第二個蛋白的核酸序列有相似序列，則具有“同源性”或者是“同源的”。或者，如果兩個蛋白具有“相似的”氨基酸序列，則該蛋白與第二個蛋白具有同源性。(因此，所定義的術(shù)語“同源蛋白”是指兩個蛋白具有相似的氨基酸序列。)在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，同源蛋白是與野生型蛋白具有至少65％序列同源性的蛋白，更優(yōu)選地為至少70％序列同源性。更加優(yōu)選的是同源蛋白與野生型蛋白具有至少75％、80％、85％或90％序列同源性。在另一個更加優(yōu)選的技術(shù)方案中，同源蛋白具有至少95％、98％、99％或99.9％的序列同一性。在本文用法中，氨基酸序列兩個區(qū)域之間的同源性(尤其是對于預測的結(jié)構(gòu)相似性)可視為在功能上具有相似性。
當“同源性”用來指蛋白或者多肽時，可以認為不同的殘基位置通常有不同的保守氨基酸替代?！氨Ｊ匕被崽娲笔侵感蛄兄械陌被釟埢涣硪粋€其側(cè)鏈(R基團)具有相似化學性質(zhì)(譬如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基所取代。通常，保守氨基酸替代不會使蛋白的功能特性發(fā)生實質(zhì)改變。在由于保守替代使得兩個或者多個氨基酸序列彼此不同的情況下，可向上調(diào)節(jié)百分比序列同一性或者同源程度，以對替代的保守性質(zhì)進行校正。進行這種調(diào)節(jié)的方法對于本領域的技術(shù)人員而言是已知的。參見，譬如，Pearson，1994，Methods MoI.Biol.24307-31 and 25365-89(此處作為參考整合在本文中)。
下面6個組每組所含的是彼此之間為保守替代的氨基酸1)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，丙氨酸(A)，纈氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
多肽的序列同源性，也稱為百分比序列同-性，典型地，可使用序列分析軟件來測定。參見，譬如the Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group(GCG)，University ofWisconsin Biotechnology Center，910 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705。蛋白分析軟件使用同源性測定方法——對各種替代、刪除及其它修飾，包括保守的氨基酸替代進行賦值——來匹配相似序列。譬如，GCG含有諸如“Gap”及“Bestfit”這樣的程序，可使用缺省參數(shù)來確定較近關(guān)系的多肽——譬如來自生物中不同種類的同源多肽或野生型蛋白與其突變蛋白——之間的序列同源性或者序列同一性。參見，例如，GCG Version 6.1。
當將特定的多肽序列與含有大量來自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫進行比較時，一個優(yōu)選的算法就是計算機程序BLAST(Altschul et al.，J.Mol. Biol.215403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden et al.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)；Zhang and Madden，GenomeRes.7649-656(1997))；尤其是blastp或tblastn(Altschul et al.，NucleicAcids Res.253389-3402(1997))。
BLASTp的優(yōu)選的參數(shù)為期望值10(缺省)；過濾seg(缺省)；空位開放代價11(缺省)；空位拓展代價1(缺省)；最大比對100(缺省)；字長11(缺省)；記述數(shù)目100(缺省)；罰分矩陣BLOWSUM62。
進行同源性比較的多肽序列的長度一般至少為約16個氨基酸殘基，通常為至少約20個殘基，更常見的為至少約24個殘基，典型地為至少約28個殘基，優(yōu)選地為多于約35個殘基。當搜索含有大量來自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫時，優(yōu)選地，應比較氨基酸序列。用氨基酸序列進行數(shù)據(jù)庫搜索可通過本領域已知的不同于blastp的算法來進行。例如，可使用FATA——GCG Version 6.1中的程序——來比較多肽序列。FASTA提供了查詢與搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的序列比對及百分比序列同一性。Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)(作為參考整合在本文中)。例如，氨基酸序列之間的百分比序列同一性可以通過FASTA用其缺省參數(shù)(字長為2，使用PAM250記分矩陣)——如GCG Version 6.1中提供的那樣——來確定，作為參考整合在本文中。
“特異結(jié)合”是指在環(huán)境中兩個分子相對于與其它分子結(jié)合的彼此相互結(jié)合的能力。典型地，“特異結(jié)合”通過至少2倍、更典型地為至少10倍、通常為至少100倍來區(qū)分反應中的偶然結(jié)合。典型地，特異結(jié)合反應的親和性或者親和力——通過解離常數(shù)來定量——約為10-7M或更強(譬如，約10-8M、10-9M或者更強)。
本文所用術(shù)語“區(qū)域”是指生物分子一級結(jié)構(gòu)中物理上毗鄰的部分。在蛋白中，區(qū)域通過該蛋白氨基酸序列中毗鄰的部分來確定。
本文所用術(shù)語術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”是指生物分子中具有已知或未知功能的生物分子的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域可以與區(qū)域或其部分具有相同的范疇；結(jié)構(gòu)域也可包括生物分子中獨立的、非臨近的區(qū)域。
本文所用術(shù)語“分子”是指任意化合物，包括但不限定于，小分子、肽、蛋白、糖蛋白、糖、核苷酸、核酸、脂等，這類化合物可以是天然的或者合成的。
本文所用術(shù)語“包括”或者諸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”這樣的詞形變化，應理解為包含一定的整體或者整體組，但不排除任何其它整體或者整體組。
本文所用術(shù)語“基本上由......組成”應理解為包含一定的整體或者整體組，但排除了實際上會影響或者改變給定整體的修飾或者其它整體。關(guān)于N-聚糖的種類，術(shù)語給定的N-聚糖“實際上由給定的N-聚糖組成”應理解為包括N-聚糖，而不管N-聚糖是否在N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)——它直接與糖蛋白的天冬氨酸殘基相連——上發(fā)生了海藻糖基化。
本文所用術(shù)語“占有優(yōu)勢地”或者諸如“主要的”或“是最顯著的”這樣的變型，應理解為是指在糖蛋白用PNGase處理并釋放出通過質(zhì)譜——例如，MALDI-TOF MS——進行分析的聚糖后，在全部N-聚糖中具有最高摩爾百分比(％)的聚糖種類。換言之，短語“占有優(yōu)勢地”定義為一個單獨的實體——譬如一個特定的糖形，它比其它任何單獨的實體具有更高的摩爾百分比。例如，如果某個組分含有40摩爾百分比的種類A，35摩爾百分比的種類B及25摩爾百分比的種類C，則該組分主要含有種類A，種類B是第二有優(yōu)勢的種類。
本文所用術(shù)語“基本上不含”特定的糖基——譬如海藻糖或半乳糖等，是用來表明糖蛋白組分基本上不含有這些殘基的N-聚糖。根據(jù)純度來表述，基本上不含是指含有這些糖基的N-聚糖結(jié)構(gòu)不到10％，優(yōu)選地低于5％，更優(yōu)選地低于1％，最優(yōu)選地低于0.5％，其中百分比是重量或摩爾百分比。因此，基本上本發(fā)明的糖蛋白組合物中所用的N-聚糖結(jié)構(gòu)都不含海藻糖、半乳糖、或這二者。
本文用法中，當無論何時在N-聚糖結(jié)構(gòu)上也沒有可檢測量的某種糖基時，糖蛋白組合物“缺少”或者“沒有”該特定的糖基，譬如海藻糖或半乳糖。例如，在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，糖蛋白組合物通過如上所述的低等真核生物——包括酵母[譬如，Pichia sp.；Saccharomyces sp.；Kluyveromyces sp.；Aspergillus sp.]——來生產(chǎn)，將會“缺少海藻糖”，因為這些生物的細胞沒有產(chǎn)生海藻糖基化的N-聚糖結(jié)構(gòu)所必需的酶。因此，術(shù)語“基本上不含海藻糖”包括術(shù)語“缺少海藻糖”。但是，即使組合物在某個時間含有如上所述的海藻糖基化的N-聚糖結(jié)構(gòu)或者含有有限的、沒有可檢測量的海藻糖基化的N-聚糖結(jié)構(gòu)，也可以是“基本上不含海藻糖”。
本文所用短語“增強的結(jié)合活性”可以與“增強的結(jié)合親和性”替換使用，是指IgG分子與受體或其它已知分子的結(jié)合增加了。本文所用短語“降低的結(jié)合活性”可以與“降低的結(jié)合親和性”替換使用，是指IgG分子與受體或其它已知分子的結(jié)合降低了。
本文所用短語“吞噬作用”是指免疫復合物的清除。吞噬作用是免疫細胞——包括但不限定于巨噬細胞及嗜中性粒細胞——的一種免疫活性。
抗體及抗體-抗原復合物與免疫系統(tǒng)中細胞的相互作用以及各種應答，包括抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)及補體依賴的細胞毒作用(CDC)、免疫復合物的清除(吞噬作用)、通過B細胞產(chǎn)生抗體、以及IgG血清半衰期，均在下列文獻中分別定義Daeron et al.，1997，Annu.Rev.Immunol.15203-234；Ward and Ghetie，1995，TherapeuticImmunol.277-94；Cox and Greenberg，2001，Semin.Immunol.13339-345；Heyman，2003，Immunol.Lett.88157-161；and Ravetch，1997，Curr.Opin.Immunol.9121-125。
除非另有說明，否則本文所用所有技術(shù)和科學術(shù)語均為與本發(fā)明相關(guān)的領域中普通人員通常所理解的含義。下面會描述作為示例的方法及材料，與本文所述相類似的或等價的方法及材料也可用于本發(fā)明實踐中，對于本領域的技術(shù)人員而言這是顯而易見的。所提及的所有出版物和其它參考文獻均作為參考完整的整合在本文中。如有沖突，以本敘述——包括定義在內(nèi)——為準。所給出的材料、方法及示例，只是為了進行闡釋而非進行限定。
重組Ig-GalGlcNAcMan5GlcNAc2分子本發(fā)明提供了含有糖基化的Ig群體的組合物，所述的Ig主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-連接糖形。本發(fā)明還提供了主要含有具備介導諸如受體結(jié)合這樣的抗體效應功能GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-連接糖形的Ig及組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明中的Ig與FcγRIII受體之間的相互作用使直接結(jié)合活性增強了。并且優(yōu)選地，本發(fā)明中的Ig與FcγRIIb受體之間的相互作用使直接結(jié)合活性降低(或沒有)了。在另一個技術(shù)方案中，本發(fā)明的Ig或組合物對通過某種糖形結(jié)構(gòu)的富集/優(yōu)勢所賦予的結(jié)合活性降低了。本發(fā)明的一個突出特征是提供了主要含有特異的糖形——它介導抗體效應功能，譬如增強ADCC活性或者增加B細胞產(chǎn)生的抗體——的Ig及組合物。在另一個技術(shù)方案中，本發(fā)明的Ig或者其組合物通過某種糖形的富集/優(yōu)勢，具有增強的ADCC活性或者增加了B細胞產(chǎn)生的抗體。此外，對于本領域的技術(shù)人員顯而易見的是生產(chǎn)具有占有優(yōu)勢的糖形的Ig的一個有利之處是，這樣避免了生產(chǎn)出具有不想要的糖形的Ig和/或生產(chǎn)出Igs異源混合物——這會引發(fā)意想不到的效應和/或稀釋更為有效的Ig糖形的濃度。因此，可以預期含有主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的Igs的藥物組合物會有更好的特征，包括但不限定于，降低與FcγRIIb的結(jié)合，并增強與FcγRIIIa和FcγRIIIb的結(jié)合，因此在較低劑量時也很有效，具有更高的功效/潛能。
在一個技術(shù)方案中，本發(fā)明的Ig分子在Ig分子介導抗體效應功能的Fc區(qū)域的重鏈CH2結(jié)構(gòu)域的Asn-297含有至少一種GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)在二聚體Ig的每個CH2區(qū)的Asn-297上(圖1)。在另一個技術(shù)方案中，本發(fā)明提供在Asn-297具有基本上為GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)糖基化的Igs的組合物(圖1)。選擇性地，可在Ig分子中刪除和/或增加一個或多個碳水化合物部分，從而增加或降低Ig上糖基化位點的數(shù)目。另外，Ig分子CH2區(qū)的N-連接糖基化位點的位置可通過引入天冬酰胺(ASN)或改變分子中N-聚糖的位點而改變。其中Asn-297是典型的在鼠和人IgG分子中發(fā)現(xiàn)的N-聚糖(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991)位點，該位點不是唯一預期的，而且該位點也不是維持功能必需的。通過已知的突變方法，技術(shù)人員可改變編碼本發(fā)明的Ig的DNA分子，從而刪除Asn-297的N-糖基化位點，而且可以進一步改變DNA分子，從而在Ig分子的其它位點創(chuàng)造一個或多個N-糖基化位點。優(yōu)選地，在Ig分子的CH2區(qū)創(chuàng)造N-糖基化位點。但是，30％血清抗體中的Ig的Fab區(qū)的N-糖基化通常在Asn-75(Rademacher et al.，1986，Biochem.Soc.Symp.，51131-148)。Ig分子Fab區(qū)的糖基化是另外的與Fc區(qū)糖基化聯(lián)合存在的或單獨存在的位點。
在一個技術(shù)方案中，本發(fā)明提供一種重組的Ig組合物，具有主要為 GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖結(jié)構(gòu)，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)存在的水平至少比重組Ig組合物中第二種主要聚糖結(jié)構(gòu)高約5摩爾百分數(shù)。在優(yōu)選技術(shù)方案中，本發(fā)明提供重組的Ig組合物，具有主要為GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖結(jié)構(gòu)，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)存在的水平至少比重組的Ig組合物中第二種主要聚糖結(jié)構(gòu)高約10到約25摩爾百分數(shù)。在更優(yōu)選技術(shù)方案中，本發(fā)明提供重組的Ig組合物，具有主要為GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖結(jié)構(gòu)，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)存在的水平至少比重組Ig組合物中第二種主要聚糖結(jié)構(gòu)高約25到約50摩爾百分數(shù)。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明提供提供重組的Ig組合物，具有主要為GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖結(jié)構(gòu)，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)存在的水平至少比重組Ig組合物中第二種主要聚糖結(jié)構(gòu)高約50摩爾百分數(shù)。在另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明提供重組的Ig組合物，具有主要為GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖結(jié)構(gòu)，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)存在的水平至少比重組Ig組合物中第二種主要聚糖結(jié)構(gòu)高約75摩爾百分數(shù)。在另一個技術(shù)方案中，本發(fā)明提供重組的Ig組合物，具有主要為GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖結(jié)構(gòu)，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)存在的水平至少比重組Ig組合物中第二種主要聚糖結(jié)構(gòu)高約90摩爾百分數(shù)。主要為GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖(59.2％)的JC-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析如圖4A所示。主要為GalGlcNAcMan5GlcNAc2(66％)的DX-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析如圖4B所示。
Ig-GalGlcNAcMan5GlcNAc2與FcγRIII受體結(jié)合的增強Ig與FcγRIIIa和FcγRIIIb相結(jié)合的效應功能，譬如ADCC的激活，是由Ig分子的Fc區(qū)來介導的。通過該區(qū)的不同結(jié)構(gòu)域來介導不同的功能。因此，本發(fā)明提供了Ig分子和組合物，其中Ig分子上的Fc區(qū)域主要含有能夠?qū)崿F(xiàn)效應功能的GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。在一個技術(shù)方案中，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的Fc區(qū)域增強了與FcγRIIIa(圖6)和FcγRIIIb(圖5)的結(jié)合。在另一個技術(shù)方案中，F(xiàn)c主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。對于本領域技術(shù)人員顯而易見的是諸如免疫黏附劑(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends BiotechnoL.1452-60；Ashkenazi and Chamow，1997，CurrOpin.Immunol.9195-200)、Fc融合物及類抗體分子這樣的含有Fc區(qū)域的分子，也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
Ig分子與Fc受體的結(jié)合活性(親和性)可以通過實驗來測定。在實施例6中描述了FcγRIII與IgG結(jié)合實驗的例子。本領域的技術(shù)人員知道該實驗很容易適用于檢驗任意的免疫球蛋白分子。
如圖5A所示，同Rituximab相比，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(一種根據(jù)本發(fā)明制備的Ig)與FcγRIIIb的結(jié)合活性增強了10倍，如圖6所示，與FcγRIIIa的結(jié)合活性高于10倍。如圖5B所示，同Rituximab相比，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(一種根據(jù)本發(fā)明制備的Ig)與FcγRIIIb的結(jié)合活性增強了約10倍。
最有趣地是，F(xiàn)cγRIIIa基因二態(tài)性生成了兩種異型FcγRIIIa-158V和FcγRIIIa-158F(Dall’Ozzo et al.，2004，Cancer Res.644664-4669)。純合的FcγRIIIa-158V基因型與針對Rituximab的更高的臨床應答相關(guān)(Cartron et al.，2002，Blood，99754-758)。不過，絕大多數(shù)人群都攜帶一條FcγRIIIa-158F等位基因，因此使得對于多數(shù)人而言，Rituximab通過結(jié)合FcγRIIIa而引發(fā)ADCC的有效性降低了。然而，當在缺少海藻糖轉(zhuǎn)移酶活性的宿主細胞中表達類Rituximab的抗-CD20抗體時，通過FcγRIIIa-158F以及通過FcγRIIIa-158V的抗體在增強ADCC方面是等效的(Niwa et al,，2004，Clin.Canc Res.106248-6255)。本發(fā)明某些優(yōu)選技術(shù)方案中的抗體是在其N-聚糖上沒有海藻糖的宿主細胞中表達的(譬如P.pastoris——一種缺少海藻糖的酵母宿主；參見實施例1和2)。因此，可以預計，本發(fā)明中缺少海藻糖并可增強與FcγRIIIa-158F結(jié)合的抗體在治療許多針對Rituximab的臨床應答有所降低的病人中尤為有用。
Ig-GalGlcNAcMan5GlcNAc2與FcγRIIIb受體結(jié)合的降低Ig與FcγRIIb相結(jié)合的效應功能，譬如由B細胞所產(chǎn)生的抗體的增加以及ADCC活性的增強，是由Ig分子的Fc區(qū)來介導的。通過該區(qū)的不同結(jié)構(gòu)域來介導不同的功能。因此，本發(fā)明提供了Ig分子和組合物，其中Ig分子上的Fc區(qū)域主要含有能夠?qū)崿F(xiàn)效應功能的GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。在一個技術(shù)方案中，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的Ig的Fc區(qū)域降低了與FcγRIIb受體的結(jié)合。對于本領域技術(shù)人員顯而易見的是諸如免疫黏附劑(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.1452-60；Ashkenazi and Chamow，1997，Curr Opin.Immunol.9195-200)、Fc融合物及類抗體分子這樣的含有Fc區(qū)域的分子，也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
Ig分子與Fc受體的結(jié)合活性(親和性)可以通過實驗來測定。在實施例6中描述了FcγRIIb與IgG1結(jié)合實驗的例子。本領域的技術(shù)人員知道該實驗很容易適用于任意的免疫球蛋白分子。
如圖7A所示，同Rituximab相比，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(一種根據(jù)本發(fā)明制備的Ig)與FcγRIIb的結(jié)合活性降低了約4倍。如圖7B所示，同Rituximab相比，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(一種根據(jù)本發(fā)明制備的Ig)與FcγRIIb的結(jié)合活性降低了約4倍。
抗體依賴細胞介導的細胞毒作用的增加在一個技術(shù)方案中，F(xiàn)cγRIIIa或FcγRIIIb與以GalGlcNAcMan5GlcNAc2為主要N-聚糖的Ig分子或組合物的結(jié)合增強，從而增加FcγRIII介導的ADCC。已非常明確FcγRIII(CDl6)與ADCC活性有關(guān)(Daeron et al.，1997，Annu.Rev.Immunol.15203-234)。在另一個技術(shù)方案中，F(xiàn)cγRIIb與以GalGlcNAcMan5GlcNAc2為主要N-聚糖的Ig分子或組合物的結(jié)合的降低，可增強ADCC(Clyneset al.，2000，同上)。在另一個技術(shù)方案中，本發(fā)明的Ig分子或組合物由于具有占有優(yōu)勢的GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖而增強ADCC活性。
在實施例7中描述了體外實驗檢測B細胞消耗以及熒光釋放ADCC實驗的例子。本領域的技術(shù)人員知道這些所述實驗很容易適用于任意Ig分子。此外，根據(jù)Borchmann et al.，2003，Blood，1023737-3742，Niwa et al.，2004，Cancer Research，642127-2133及實施例7，動物模型中的體內(nèi)ADCC實驗也可用于任意特定的IgG。
B細胞產(chǎn)生抗體的增加已知可通過調(diào)控FcγR途徑而用抗體治療腫瘤(Clynes et al.，2000，Nature，6443-446)。具體地，已知當FcγRIIb與基于諸如B細胞受體(BCR)、FcγRI、FcγRIII和FcεRI這樣的含有(ITAM)受體的激活元件的免疫受體酪氨酸共交聯(lián)時，可抑制ITAM介導的信號(Vivierand Daeron，1997，Immunol.Today，18286-291)。另外，添加FcgRII特異的抗體可阻斷Fc與FcgRIIB的結(jié)合，從而導致B細胞的增殖(Wagle et al.，1999，J of Immunol.1622732-2740)。因此，在一個技術(shù)方案中，本發(fā)明的Ig分子可引發(fā)FcγRIIb受體結(jié)合的降低，導致B細胞——它通過漿細胞催化產(chǎn)生抗體——的活化(Parker，D.C.1993，Annu.Rev.Immunol.11331-360)。在實施例6中描述了一個檢測含IgG1的B細胞產(chǎn)生抗體的實驗的例子。本領域的技術(shù)人員知道該實驗很容易適用于檢測任意的免疫球蛋白分子。
其他的免疫活性已表明改變嗜中性粒細胞上效應細胞分子的表面表達可增強對細菌感染的敏感性(Ohsaka et al.，1997，Br.J.Haematol.98108-113)。進一步表明與FcγRIIIa效應細胞受體結(jié)合的IgG可調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子alpha(TNF-α)的表達(Blom et al.，2004，Arthritis Rheum.，481002-1014)。此外，F(xiàn)cγR誘導的TNF-α也提高了嗜中性粒細胞結(jié)合并吞噬包被IgG的紅細胞的能力(Capsoni et al.，1991，J.Clin.Lab Immunol.34115-124)。因此可以預測本發(fā)明的與FcγRIII的結(jié)合增強的Ig分子及組合物可提高TNF-α的表達。
已表明增強FcγRIII受體的活性可提高溶酶體中β-葡糖苷酸酶以及其它溶酶體酶類的分泌(Kavai et al.，1982，Adv.Exp Med.Biol.141575-582；Ward and Ghetie，1995，Therapeutic Immunol.，277-94)。此外，免疫受體通過其配基接合后的一個重要步驟是它們內(nèi)移并遞送到溶酶體中(Bonnerot et al.，1998，EMBOJ.，174906-4916)。因此可預測本發(fā)明中的與FcγRIIIa及FcγRJIIb結(jié)合增強的Ig分子或組合物可提高溶酶體酶類的分泌。
專一存在于嗜中性粒細胞上的FcγRIIIb在免疫復合物的裝配方面起重要作用，其聚集可激活吞噬作用、細胞脫粒、及呼吸爆發(fā)，引發(fā)易被吞噬細胞吞噬的病原體的破壞。嗜中性粒細胞的活化會導致受體兩個細胞外結(jié)構(gòu)域以蛋白水解剪切的可溶形式來分泌?？扇艿腇cγRIIIb通過FcγR依賴的效應功能及通過與補體受體CR3結(jié)合的競爭性抑制來發(fā)揮調(diào)控功能，導致產(chǎn)生引起炎癥的介導物(Sautes-Fridman et al.，2003，ASHI Quarterly，148-151)。
本發(fā)明因此提供了含有主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成的N-聚糖的免疫球蛋白分子；并提供了含有免疫球蛋白及附在其上的多種N-聚糖的組合物，其中在上述多種N-聚糖中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。在本文所示任一實施例中，免疫球蛋白上所述的占有優(yōu)勢的GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖優(yōu)選地提供了所需的治療效應活性，此外改善了與FcγRIIIa和FcγRIIIb的結(jié)合并降低了與FcγRIIb的結(jié)合。
免疫球蛋白亞類已表明IgG亞類對Fc受體具有不同的結(jié)合親和性(Huizinga et al.，1989，J.of Immunol.，1422359-2364)。每種IgG亞類在本發(fā)明的不同方面具有特定的優(yōu)勢。因此，一方面，本發(fā)明提供了以附著在IgG1分子上的GalGlcNAcMan5GlcNAc2作為主要N-聚糖的IgG1組合物。另一方面，本發(fā)明包含以附著在IgG2分子上的GalGlcNAcMan5GlcNAc2作為主要N-聚糖的IgG2組合物。另外一個方面，本發(fā)明含以附著在IgG3分子上的GalGlcNAcMan5GlcNAc2作為主要N-聚糖的IgG3組合物。另一方面，本發(fā)明包含以附著在IgG4分子上的GalGlcNAcMan5GlcNAc2作為主要N-聚糖的IgG4組合物。
選擇性地，本發(fā)明可應用于全部5種主要的免疫球蛋白種類IgA、IgD、IgE、IgM和IgG。本發(fā)明優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG，并且優(yōu)選地是來自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型中的某一個。更優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫球蛋白為IgG1分子。
介導抗體效應功能與活性的重組免疫球蛋白(Ig)分子的生產(chǎn)一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組Ig分子——它在CH2結(jié)構(gòu)域297位Asn上的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)組成——的方法，其中Ig分子介導抗體效應功能和活性，并且類似地，提供了生產(chǎn)免疫球蛋白的組合物的方法，其中附著在免疫球蛋白上的占有優(yōu)勢的N-聚糖是GalGlcNAcMan5GlcNAc2。
在一個技術(shù)方案中，使用重疊的寡核苷酸合成Ig的重鏈和輕鏈，并分別克隆到表達載體中(實施例1)，在宿主細胞中進行表達。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，在主要催化增加GalGlcNAcMan5GlcNAc2的宿主菌株中表達重組Ig重鏈和輕鏈。在一個技術(shù)方案中，該糖形結(jié)構(gòu)更具體表示為[Gal-(GlcNAcβ1，2-Manα1，3)(Manα1，3 Manα1，6 Manα1，6)Manβ1，4-GlcNAc β1，4-GlcNAc]——它在Ig上Fc區(qū)域297位Asn氨基酸的氮與GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖上的N-乙酰-β-D-葡萄糖胺的羥基基團之間形成一個連接。在另外一個技術(shù)方案中，該占有優(yōu)勢的聚糖可添加到Ig分子內(nèi)不同位點上的天冬氨酸上(除了297位Asn)，或連接在Fab區(qū)域的N-糖基化位點上。
在低等真核生物中生產(chǎn)主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2的Ig本發(fā)明的一個方面提供了重組真核宿主細胞——它可用于生產(chǎn)主要是GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的免疫球蛋白或抗體分子，與在天然生產(chǎn)產(chǎn)量很低的上述糖形的哺乳動物細胞中所表達的糖蛋白組合物相比，它更有優(yōu)勢。
本發(fā)明的另一個優(yōu)勢在于糖蛋白組合物以預先確定的、易于再生的糖基化模式來提供。為了所需的特性，可對這類組合物的性質(zhì)進行評估和優(yōu)化，最小化或者完全避免不利的效應。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)經(jīng)改造或選擇以表達一種或多種核酸——用于生產(chǎn)含有主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成的N-聚糖的Ig分子以及具有占有優(yōu)勢的GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的Ig組合物——的重組宿主細胞的方法。在本發(fā)明某些優(yōu)選的技術(shù)方案中，重組宿主細胞，優(yōu)選地為重組低等真核宿主細胞，用于生產(chǎn)上述主要含GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖的Ig分子和組合物。
在其它優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明包含可從重組宿主細胞或通過本發(fā)明的方法獲得的糖蛋白。
可以用編碼所需Ig區(qū)域的載體、及用編碼一種或多種本文所述與糖基化相關(guān)的酶的載體來轉(zhuǎn)化本發(fā)明中的宿主細胞，然后篩選表達具有占有優(yōu)勢的GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的重組Ig分子或組合物。本發(fā)明的重組宿主細胞可以是諸如動物、植物、昆蟲、細菌細胞或其它類似的真核或原核宿主細胞——它們經(jīng)改造或篩選后可產(chǎn)生主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)的Ig組合物。
優(yōu)選地，本發(fā)明的重組宿主細胞是如本領域所述的常規(guī)改造的低等真核宿主細胞(WO 02/00879，WO 03/056914，WO 04/074498，WO04/074499，Choi et al.，2003，PNAS，1005022-5027；Hamilton et al.，2003，Nature，3011244-1246 and Bobrowicz et al.，2004，Glycobiology，14757-766)。具體地，WO 02/00879和WO 04/074499描述了表達具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白的方法，并描述了將β-1，4半乳糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)入低等真核生物的方法。更具體地，美國申請No.11/108088描述了主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白(包括免疫球蛋白)。
在一個技術(shù)方案中，將編碼IgG1的載體——例如含有JC-IgG1(實施例1)的AOX1/pPICZA載體——轉(zhuǎn)入到酵母P.pastoris YAS385-1菌株中。該YAS385-1菌株與除去K3報告蛋白的YSH44菌株相似(Hamilton et al.，2003，Sclence，3011244-1246)，并含有已描述的(美國專利申請No.11/020808)被敲除的PNO1和MNN4b基因，以及含有已描述的(美國專利申請No.11/108088)導入的β-1，4半乳糖轉(zhuǎn)移酶I基因。ΔpnolΔmnn4b雙敲除會導致喪失甘露糖基-磷酸化作用。可通過在5-氟乳清酸(5-FOA)上培養(yǎng)菌株來刪除如所述關(guān)于YSH44(Hamiltonet al.，2003)那樣導入的側(cè)翼為URA5基因的甘露糖苷酶II基因(Guthrie and Fink，1991，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Vol. 169，Academic Press，SanDiego)。甘露糖苷酶II基因的刪除可維持5甘露糖核心結(jié)構(gòu)——末端的α-1，3和α-1，6甘露糖與α-1，6甘露糖臂相連、α-1，3甘露糖上的β-1，2 GlcNAc及末端β-1，4半乳糖與β-1，2 GlcNAc相連。然后使用UR43敲除質(zhì)粒，它在AMR2基因座上插入了URA3基因而破壞AMR2基因(Guthrie and Fink，1991，同上)，從而刪除了β-甘露糖化(美國專利申請No.11/118008)。該YAS385-1菌株表達主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2及GlcNAcMan5-GlcNAc2的糖蛋白，因此生成了主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2及GlcNAcMan5-GlcNAc2的JC-IgG。用β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理該主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2及GlcNAcMan5-GlcNAc2的JC-IgG(實施例3)，可生成主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(圖4A)。
在另一個技術(shù)方案中，將含有DX-IgG的AOX1/pPICZA中編碼IgG1的載體(實施例1)也導入到酵母P.pastoris YAS385-1菌株中(同上)，純化，然后用β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理(實施例3)，從而得到主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(圖4B)。
選擇性地，本發(fā)明的抗體可通過本領域中已知的多種方法來表達(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.79-97 Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
糖基轉(zhuǎn)移酶的表達以及溫度遺傳整合到低等真核生物中已描述了使用諸如URA3、URA5、HIS4、SUC2、G418、BLA或HBLA這樣的選擇標記來將異源基因?qū)氩⒋_認整合到低等真核宿主菌株(譬如P.pastoris)中的方法。當在低等真核生物中產(chǎn)生表達系統(tǒng)時，可調(diào)整這些方法以生產(chǎn)本發(fā)明的Ig。此外，已描述了考慮到重復使用URA3標記以除去不需要的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的方法。Alaniet al.，1987，Genetics，116541-545及美國專利No.6,051,419描述了基于P.pastoris中URA3基因被破壞的選擇體系。優(yōu)選地，P基于pURA3-或者PpURA5-的破壞盒可用于破壞URA3、URA5或尿嘧啶生物合成途徑中的任意基因，并可基于尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型及對5-氟乳清酸(5FOA)的抗性進行陽性和陰性選擇(Boeke，et al.，1984，Mol.Gen.Genet.，197345-346)。因此，技術(shù)人員知道這個系統(tǒng)通過選擇與反向選擇可插入多個異源基因。
進一步的酶修飾進一步酶法刪除對于分離不含甘露糖磷酸化或者β-甘露糖化——它們在人體內(nèi)可能會引起異常的免疫反應活性——的Ig是有益的或必需的。如上所述，美國專利申請No.11/020808描述了除去甘露糖磷酸化的方法，美國專利申請No.11/118008描述了除去β-甘露糖化的方法。
在其它蛋白表達體系中生產(chǎn)主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)的Ig技術(shù)人員知道對于異源蛋白表達，可以選擇需要或者不需要進行加工以表達含有占有優(yōu)勢的聚糖結(jié)構(gòu)的表達宿主體系(機體)。本文提供的實施例是對在297位Asn具有特定聚糖或者在其它位點具有N-糖基化或者二者皆有的Ig進行表達的方法的示例。本領域的技術(shù)人員可輕易改造發(fā)明中任意蛋白表達體系(機體)的細節(jié)以及實施例。
其它蛋白表達宿主體系——包括動物、植物、昆蟲、細菌細胞及其它類似體系，可用于生產(chǎn)本發(fā)明的Ig分子及組合物?？筛脑旎蚝Y選這類蛋白表達宿主體系以表達占有優(yōu)勢的糖形，或者選擇地，可天然生產(chǎn)具有占有優(yōu)勢的聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。改造生產(chǎn)具有占有優(yōu)勢的糖形的糖蛋白的蛋白表達宿主體系的例子包括基因敲除/突變(Shields etal.，2002，JBC，27726733-26740)、基因工程( et，al.，1999，Nature Biotech.，17176-180))或者二者的組合?；蛘?，某些可天然表達某種占有優(yōu)勢的糖形的特定細胞--例如，雞、人及牛(Raju et al.，2000，Glycobiology，10477-486)。因此，根據(jù)本領域的技術(shù)人員所選擇的至少一種表達宿主體系，可實現(xiàn)本發(fā)明的具有占有優(yōu)勢的某種特定聚糖結(jié)構(gòu)的Ig糖蛋白或組合物的表達。本領域中發(fā)現(xiàn)的用于生產(chǎn)糖蛋白的進一步的表達宿主體系包括CHO細胞——RajuWO9922764A1和Presta WO03/035835A1；雜交瘤細胞——Trebak etal.，1999，J.Immunol.Methods，23059-70；昆蟲細胞——Hsu et al.，1997，JBG，2729062-970；以及植物細胞——Gerngross et al.，WO04/074499A2。
IgG的純化純化及分離抗體的方法在本領域是已知的且已得到描述。參見，例如，Kohler & Milstein，(1975)Nature 256495；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-104(Academic Press，1986)；及Jakobovitset，al.(1993)Proc.Natl.Acad.ScL USA 902551-255與Jakobovits et al，(1993)Nature 362255-258。在一個進一步的技術(shù)方案中，從通過McCafferty et al.(1990)Nature，348552-554(1990)描述的技術(shù)生成的抗體噬菌體文庫中，使用目標抗原篩選合適的抗體或抗體片段，從而分離抗體或抗體片段。
根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的重組Ig分子可根據(jù)實施例3中敘述的方法來純化。圖2所示的是從YAS385-1中純化的JC-IgG的SDS-PAGE考馬斯亮蘭染色凝膠。圖3所示的是從YAS385-1中純化的DX-IgG的SDS-PAGE考馬斯亮蘭染色凝膠。在另一個技術(shù)方案中，純化的Ig抗體以GlcNAcMan5GlcNAc2作為主要的N-聚糖?？赏ㄟ^本領域技術(shù)人員已知的幾種質(zhì)譜方法——包括但不限定于HPLC、NMR、LCMS和MALDI-TOF MS-來分析聚糖并確定其在任意Ig分子上的分布。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，聚糖的分布通過MALDI-TOF MS分析來確定，如實施例5所示。圖4A所示的是從YAS385-1中純化的并用β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理的JC-IgG的MALDI-TOF圖譜(實施例3)。該MALDI-TOF表明約59.2％摩爾比的總N-聚糖為GalGlcNAcMan5GlcNAc2。圖4B所示的是從YAS385-1中純化的并用β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理的DX-IgG的MALDI-TOF圖譜。該MALDI-TOF表明約66％摩爾比的總N-聚糖為GalGlcNAcMan5GlcNAc2。
藥物組合物本發(fā)明的抗體可整合在含抗體的藥物組合物中作為活性治療制劑和各種其它藥學上可接受的組分。參見Remington′s PharmaceuticalScience(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。優(yōu)選的形式依賴于預定的給藥方式和治療用途。根據(jù)所需的配方，該組合物也包括藥學上可接受的、無毒的載體或稀釋液，作為載體，通常用于闡明動物或人給藥的藥物組合物。選擇的稀釋液不影響組合物的生物學活性。這種稀釋液的例子是蒸餾水、磷酸生理鹽水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液及Hank′s溶液。另外，藥物組合物或配方也包括其它載體、佐劑或無毒、無治療性、非免疫性穩(wěn)定劑等。
腸道外給藥的藥物組合物是無菌的，基本等壓的、不含熱源、根據(jù)FDA的GMP或同樣設備制備的?？贵w可以通過該物質(zhì)的溶液或懸浮液進行注射劑量的給藥，該物質(zhì)溶解在具有藥學上載體的生理上可接受的稀釋液中，可以是無菌的液體，例如水、油、鹽、甘油或乙醇中。另外，輔助物質(zhì)，例如加濕劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于組合物中。其它藥物組合物的組包括石油、動物、植物，或者合成來源的，例如，花生油、豆油及礦物油。通常，諸如丙稀乙二醇或者聚乙烯乙二醇這樣的乙二醇是優(yōu)選的液體載體，對于可注射溶液尤為如此?？贵w可以以可持續(xù)釋放活性成分的方式配制的貯存注射劑或者植入制劑的形式給藥。典型地，以液體溶液或者懸浮液的可注射形式制備組合物；也可制備固體形式，它可在注射前溶于或者懸浮于液體載體中。如上所述，制劑也可以是乳化的，或者包裝在脂質(zhì)體膠囊內(nèi)，或者是諸如聚交酯、聚乙二醇這樣的微顆粒，或者是共聚物中，用于增強佐劑的效果(參見Langer，Science 249，1527(1990)以及Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28，97-119(1997))。
診斷性產(chǎn)品本發(fā)明的抗體可包含在多種診斷試劑盒及其它診斷性產(chǎn)品，例如陣列中。通常提供的抗體預先結(jié)合在固相上，例如微孔板的孔中。試劑盒通常也含有檢測抗體結(jié)合和標記以提供指導的試劑。免疫或三明治檢測法是優(yōu)選的診斷試劑盒的形式(參見美國專利4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375)?？贵w陣列描述在，例如，US5,922,615、US 5,458,852、US 6,019,944和US 6,143,576中。
治療性應用本發(fā)明提供在糖蛋白中主要含特定糖形的糖蛋白組合物。本發(fā)明的一個特征是，在優(yōu)選技術(shù)方案中，當給藥哺乳動物包括人時，含新型糖蛋白組合物的藥物成分與其它具有相同基本結(jié)構(gòu)的糖蛋白組合物相比較，利于表現(xiàn)出更好的體內(nèi)特性。因此，本發(fā)明的新型組合物可用作目前所用的糖蛋白藥物制劑，在生產(chǎn)批次上可利于提供改善的特性和增強的一致性。本發(fā)明的制劑根據(jù)特定的藥物或藥劑及其目標領域可作為溶液、單位劑量形式例如片劑和膠囊用于口服，及懸浮液、藥膏等。
在特定方面，本發(fā)明提供糖蛋白藥物制劑、藥物或藥劑的新型組合物，其中糖蛋白包括免疫球蛋白分子，組合物主要包括糖蛋白制劑的特定糖形。根據(jù)本發(fā)明的特定方面，提供的組合物包括此處所述的主要為N-連接寡糖的GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選方面，糖蛋白是抗體，特別是單克隆抗體。本發(fā)明進一步提供生產(chǎn)本發(fā)明的組合物的方法和工具。
本發(fā)明進一步包括含本發(fā)明糖形制劑的藥物組合物。該組合物優(yōu)選地是無菌的。當組合物是水溶液時，優(yōu)選地糖蛋白是可溶的。當組合物是凍干粉時，優(yōu)選地可在合適的溶劑中重溶。
在其它方面，本發(fā)明包括治療疾病的方法，包括給藥所需哺乳動物治療有效劑量的本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的進一步的目標是提供可使用的商品或試劑盒形式的糖形制劑，用于治療疾病或失調(diào)。
本發(fā)明的主要含有GalGlcNAc-Man5GlcNAc2N-聚糖的Ig分子具有治療多種適應癥的用途，例如癌癥、炎癥疾病、感染、免疫疾病、自免疫疾病，包括原發(fā)性血小板減少性紫癜、關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自身免疫性溶血性貧血。
以下實施例用于說明本發(fā)明關(guān)于生產(chǎn)Ig糖蛋白組合物的組合物和方法。這些實施例僅為了說明的目的，并非對本發(fā)明進行限定。技術(shù)人員應理解本發(fā)明的各種修改和擴充包括優(yōu)化是可能的。這種修改或擴充被認為是本發(fā)明的一部分。
實施例1在畢赤酵母中克隆和表達DX-IgGlDX-IgGl(抗CD20 IgGl)的輕鏈(L)和重鏈(H)由小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)組成。輕鏈表示為SEQ ID NO1，重鏈為SEQ ID NO2。重鏈和輕鏈序列是通過購自Integrated DNA Technologies(IDT)的重疊寡核苷酸合成的。對輕鏈可變區(qū)，購買了15條重疊寡核苷酸(SEQID NOs5-19)，用PCR反應中的Extaq(Takada)通過退火而產(chǎn)生具有5′MlyI位點的輕鏈可變區(qū)片段。然后將輕鏈可變區(qū)片段與重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO3)(Gene Art，Toronto，Canada)通過用5′MlyI引物CD20L/up(SEQ ID NO20)、3′可變區(qū)/5′恒定區(qū)引物LfusionRTVAAPS/up(SEQ ID NO21)、3′恒定區(qū)引物LfusionRTVAAPS/lp(SEQ ID NO22)和3′CD20L/lp (SEQ ID NO23)進行重疊PCR而進行連接。然后將最終的MlyI-輕鏈片段(包括5′AG堿基對)插入到pCR2.1 topo載體中(Invitrogen)，得到pDX343。對于重鏈，從IDT購買了17條對應于鼠重鏈可變區(qū)的重疊寡核苷酸(SEQID NOs24-40)，并用Extaq進行退火。然后將該重鏈可變區(qū)片段與重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO4) (Gene Art)以5′MlyI引物CD20H/up(SEQ ID NO41)、5′可變區(qū)/5′恒定區(qū)引物HchainASTKGPS/up(SEQID NO42)、3′可變區(qū)/恒定區(qū)引物HchainASTKGPS/lp(SEQ ID NO43)、3′恒定區(qū)引物HFckpnl/lp(SEQ ID NO44)通過重疊PCR而連接。及最終得到的MlyI-重鏈片段(包括5′AG堿基對)插入到pCR2.1topo載體(Invitrogen)中，得到pDX360。從topo載體中分離全長輕鏈和全長重鏈，作為MlyI和NotI片段。然后將正向輕鏈和重鏈片段通過4個重疊寡核苷酸——P.BiPss/UPl-EcoRI、P.BiPss/LPl、P.BiPss/UP2和P.BiP/LP2(序列分別為SEQ ID NOS46-49)連接到Kar2(Bip)信號序列(SEQ ID NO45)上，然后連接到pPICZA的EcoRI-NotI位點，從而得到攜帶Kar2-輕鏈的pDX344和攜帶Kar2-重鏈的pDX468。然后將來自pDX344的BglII-BamHI片段亞克隆到含用于染色體整合的AOX2啟動子基因的pBK85中，從而得到pDX458。將來自攜帶重鏈的pDX468的BglII-BamHI片段亞克隆到pDX458中，得到位于AOX1啟動子下、同時含CD20重鏈和輕鏈的pDX478。然后將攜帶重鏈的pDX468中的BglII-BamHI片段亞克隆到pDX458中，得到位于AOX1啟動子下、同時含CD20重鏈和輕鏈的pDX478。然后在轉(zhuǎn)化前用SpeI將該質(zhì)粒線性化，以與用Zeocin抗性篩選的轉(zhuǎn)化子一起整合到AOX2位點(參見實施例2)。
在畢氏酵母中克隆和表達JC-IgGJC-IgGl的輕鏈(L)和重鏈(H)由小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)組成。鼠可變輕鏈表示為SEQ ID NO50(GenBank#AF013576)，鼠可變重鏈為SEQ ID NO51(GenBank#AF013577)。重鏈和輕鏈序列是通過購自Integrated DNA Technologies(IDT)的重疊寡核苷酸合成的。對輕鏈，購買了12條重疊寡核苷酸(SEQ ID NOs52-63)，用PCR反應中的Extaq(Takada)通過退火而產(chǎn)生具有5′EcoRI位點和3’KpnI位點的660個堿基的輕鏈。然后將該輕鏈亞克隆到pPICZa載體(Invitrogen)中，得到EcoRI-KpnI片段。對于重鏈，購買了12條對應于Fab片段的重疊寡核苷酸(SEQ ID NOs64-75)，用Extaq退火以產(chǎn)生660堿基的Fab片段。Fc片段用12條重疊寡核苷酸(SEQ ID NOs76-87)通過同樣的重疊PCR反應進行合成。然后將重鏈Fab和Fc片段用對應于重鏈Fab片段5’末端的5’EcoRI引物(SEQ ID NO64)和對應于Fc片段3’末端的3′KpnI引物(SEQ ID NO88)用pFU Turbo聚合酶(Stratagene)進行退火，得到1,330個堿基對的重鏈。用含5′EcoRI和3′KpnI位點的引物將重鏈克隆到pPICZa載體中。將作為整合位點的AOX2引物序列亞克隆到最終的pPICZa載體中，然后，將含AOX1啟動子的BglII-BstBl片段和含來自人肝臟cDNA文庫的HSA序列的BstBl-BamHI片段(SEQ ID NO89)、凝血酶位點(SEQ IDNO90)和JC輕鏈均亞克隆到AOX2/pPICZa載體的BamHI位點。然后，將另一個含AOXl啟動子的BlgII-BstBI片段和含HAS序列、凝血酶位點和JC重鏈的BstIBl-BamHI片段亞克隆到同樣的pPICZa載體的BamHI位點。最終的載體含AOX2整合位點、帶HSA-標簽的JC輕鏈和帶HSA-標簽的JC重鏈，從而得到pJC140。將該表達盒與篩選轉(zhuǎn)化子的零霉素抗性整合到畢氏酵母菌株的AOX2位點(參見實施例2)上。
RituximabRituxan是購自Biogen-IDEC/Genentech，SanFrancisco，CA的抗CD20小鼠/人嵌合型IgGl。
PCR擴增。用Eppendorf Mastercycler熱循環(huán)儀進行所有PCR反應。PCR反應含模板DNA、125μM dNTPs、0.2μM正向和反向引物、Ex Taq聚合酶緩沖液(Takara Bio Inc.)和Ex Taq聚合酶或pFU Turbo聚合酶緩沖液(Stratagene)和pFU Turbo聚合酶。通過30個循環(huán)擴增DNA片段，97℃15秒，55℃15秒，72℃90秒，最初的變性步驟為在97℃進行2分鐘，最后在72℃延伸7分鐘。
通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR樣品，提取DNA帶，用Qiagen的膠回收試劑盒進行提取。所有的DNA純化物在10mM Tris，pH8.0下洗脫，而最終的PCR(所有3個片段的重疊)用去離子水洗脫。
實施例2將IgG載體轉(zhuǎn)化到畢氏酵母菌株YAS385-1中。通過加入醋酸鈉至終濃度為0.3 M而制備DNA。然后向DNA樣品中加入100％冷乙醇至終濃度為70％。通過離心(12000g×10分鐘)使DNA沉淀，并用70％冷乙醇洗滌2次。干燥DNA，并重懸到50μl 10mM Tris，pH8.0中。待轉(zhuǎn)化的YAS385-1酵母培養(yǎng)物(Choi et al.，2003；Hamilton et al.，2003)通過擴大培養(yǎng)BMGY(緩沖基礎甘油100mM硫酸鉀，pH6.0；1.34％酵母氮源，4×10-5％生物素；1％甘油)中的小培養(yǎng)至O.D.為～2～6而制備感受態(tài)細胞。然后將酵母細胞在1M山梨醇中洗滌3次，并重懸在約1-2毫升的1M山梨醇中。將DNA(1-2μg)與100μl感受態(tài)細胞混合，在冰上溫育10分鐘。然后用BTX Electrocell Manipulator600對酵母細胞進行電穿孔，使用以下參數(shù)1.5kV、129ohms和25μF。向電穿孔細胞中加入1ml YPDS(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡聚糖、1M山梨醇)。然后將轉(zhuǎn)化的酵母在含零霉素的選擇性瓊脂糖平板進行轉(zhuǎn)化。
IgG1在畢赤酵母中的培養(yǎng)條件。將用pDX478或pJC140轉(zhuǎn)化的單克隆YAS385-1接種到含10ml BMGY培養(yǎng)基(含1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM硫酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34％酵母氮源、4×105％生物素和1％甘油)的50ml Falcon離心管中。培養(yǎng)物在24℃振蕩培養(yǎng)48小時至培養(yǎng)物飽和。然后向500ml擋板式燒瓶中加入100ml BMGY。然后將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含100ml BMGY培養(yǎng)基的擋板式燒瓶中。將培養(yǎng)物在24℃振蕩培養(yǎng)24小時。將燒瓶中內(nèi)容物輕輕倒入到2個50mlFalcon離心管中，3000rpm離心10分鐘。用不含甘油的20ml BMGY洗滌細胞沉淀1次，然后輕輕重懸在20ml BMMY(BMGY用1％MeOH代替1％甘油)中。將懸浮的細胞轉(zhuǎn)移到250ml擋板式燒瓶中。將培養(yǎng)物在24℃/170-190rpm振蕩培養(yǎng)24小時。將燒瓶中內(nèi)容物輕輕倒入到2個50ml Falcon離心管中，3000rpm離心10分鐘。通過ELISA分析培養(yǎng)物上清，以在蛋白分離前測定大約的抗體滴度(參見實施例3)。
通過酶聯(lián)免疫吸收檢測法(ELISAs)對培養(yǎng)上清中的抗體進行定量用24μg溶在10ml PBS，pH7.4中的羊抗人Fab(Biocarta，Inc，SanDiego，CA)包被高結(jié)合性微孔板(Costar)，4℃放置過夜。除去緩沖液，加入封閉緩沖液(含3％BSA的PBS)，然后室溫溫育1小時。除去封閉緩沖液，用PBS將板洗滌3次。在最后一次洗滌后，加入逐漸增加體積量的抗體培養(yǎng)上清(0.4、0.8、1.5、3.2、6.25、12.5、25和50μl)，室溫溫育1小時。然后用PBS+0.05％Tween 20洗滌板。在最后一次洗滌后，加入溶在1∶2000 PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室溫溫育1小時。然后用PBS-Tween 20將板洗滌4次。用TMB底物試劑盒(Pierce Biotechnology)根據(jù)說明書來分析板。
實施例3IgGl的純化用Streamline蛋白A柱從培養(yǎng)上清中捕獲單克隆抗體。用Tris-甘氨酸pH3.5洗脫抗體，并用1M Tris pH8.0進行中和。用疏水相互作用色譜(HIC)進行進一步的純化。根據(jù)抗體選擇特定類型的HIC柱。對JC-IgG和DX-IgG而言，可使用苯基瓊脂糖柱(也可使用辛基瓊脂糖)，緩沖液為20mM Tris(7.0)，1M(Na)2SO4緩沖液，用線性梯度緩沖液1M到0M(NH4)2SO4洗脫。收集苯基瓊脂糖柱上的抗體組分，并交換到50mM NaOAc/Tris pH5.2緩沖液中，通過陽離子交換柱(SP瓊脂糖快速洗脫柱)(GE Healthcare)進行最終純化。用50mMTris，1M NaCl(pH7.0)對抗體進行線性洗脫。
用β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理YAS385-1中的JC-IgG和DX-IgG將5mg純化的IgG(JC-IgG或DX-IgG)緩沖交換到50mMNH4Ac，pH5.0中。在硅化的管中，向溶在50mM NH4Ac，pH5.0中的純化的IgG中加入0.3U來源于牛奶中的β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(EMDBiosciences，La Jolla，CA)，37℃溫育16-24小時。將該樣品濃縮干燥，重懸到水中，用MALDI-TOF進行分析。然后如上所述通過苯基瓊脂糖純化β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶中的抗體。
實施例4純化的Ig的檢測將純化的JC-IgG或DX-IgG與大約等體積的樣品上樣緩沖液混合，通過預制膠(NuPAGE bis-Tris electrophoresis system；InvitrogenCorporation，Carlsbad，Calif)根據(jù)產(chǎn)品說明書進行十二烷基璜酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。用考馬斯亮蘭染色液(Bio-Rad，Hercules，CA)對凝膠蛋白進行染色。參見圖2和3。
抗體濃度通過Bradford檢測法(Bradford，M.1976，Anal.Biochem.(1976)72，248-254)，以白蛋白(Pierce，Rockford，IL)為標準測定蛋白色譜組分的濃度。
實施例5IgGl碳水化合物分析基質(zhì)輔助激光解吸附電離/飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOFMS)。天冬氨酸連接的寡糖的MALDI-TOF分析用P apac et al.，Glycobiology 8，445-454(1998)修改的程序釋放JC-IgG和DX-IgG中的N-連接聚糖。將抗體樣品還原，并進行羧甲基化，封閉膜，用水將孔洗滌3次。通過加入30ul含1mU N-糖苷酶(EMD Biosciences，La Jolla，CA)的10 mM NH4HCO3(pH8.3)而使IgG蛋白去糖基化。在37℃反應16小時后，通過離心除去含聚糖的溶液，并濃縮干燥。將每個孔中的干燥聚糖溶解在15μl水中，并用0.5μl點樣在不銹鋼樣品板中，與0.5μl S-DHB底物(9mg/ml二羥基苯甲酸/1mg/ml of 5-甲氧基-水楊酸溶在1∶1水/乙腈/0.1％三氟乙酸)混合，并進行干燥。通過脈沖氮激光器(337nm)以4-ns的脈沖時間通過放射而產(chǎn)生離子。該儀器以125-ns延遲的延遲引出模式和加速電壓為20kV進行操作。電網(wǎng)電壓為93.00％，導線電壓為0.1％，內(nèi)部壓力＜5×10-7torr(1torr＝133Pa)，低分子門檻為75 Da。從100-200個激光脈沖中產(chǎn)生光譜，并通過500-MHz數(shù)字轉(zhuǎn)換器獲得光譜。以(Man)5(GlcNAc)2寡糖作為外部分子量標準。所有的光譜是用儀器在陽離子模式下獲得的。
實施例6抗原結(jié)合的ELISA檢測法用溶在PBS，pH7.4中的10ug抗原包被高結(jié)合微孔板(Costar)，4℃過夜。除去緩沖液，加入封閉緩沖液(含3％BSA的PBS)，然后在室溫溫育1小時。除去封閉緩沖液，用PBS將板洗滌3次。在最后一次洗滌后，加入從0.2ng到100ng逐漸增加量的純化抗體，室溫溫育1小時。然后用PBS+0.05％Tween 20洗滌板。在最后一次洗滌后，加入溶在1∶2000 PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室溫溫育1小時。然后用PBS-Tween 20將板洗滌4次。用TMB底物試劑盒(PierceBiotechnology)根據(jù)說明書來分析板。
Fc受體結(jié)合檢測法根據(jù)以前描述的程序?qū)cγRIIb、FcγRIIIa和FcyRIIIb進行Fc受體結(jié)合檢測法(Shields et al.，2001，J.Biol.Chem，2766591-6604)。對FcγRIII結(jié)合在4℃，用溶在PBS中的1μg/ml FcγRIIIb(圖5)和FγRIIb(圖7)融合蛋白或0.8μg/ml FcγRIIIa-LF(圖6)融合蛋白包被ELISA板(Nalge-Nunc，Naperville，IL)48小時。用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在25℃將板封閉1小時。將JC-IgG或DX-IgG與HRP-耦聯(lián)的F(Ab′)2anti-F(Ab′)2以2∶1的摩爾量在25℃混合1小時，從而制備溶在含1％BSA的PBS中的JC-IgG或DX-IgG二聚體復合物。然后將二聚體復合物在1％BSA/PBS中以1∶2系列稀釋，并在25℃，在板上包被1小時。所用底物為3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Vector Laboratories)。根據(jù)儀器說明書讀取450nm處的吸收值(Vector Laboratories)。
B細胞中抗體反饋的ELISPOT檢測法本檢測法根據(jù)Westman，et al.，1997，Scand.J.Immunol.4610-15所述進行。首先將BSA(牛血清白蛋白)與IgG抗體耦聯(lián)，得到BSA-IgG復合物。通過ELISPOT檢測法測定分泌BSA特異的IgG的細胞數(shù)目。從注射的鼠中除去脾臟，在含0.5％正常鼠血清的DMEM(Gibco，NewYork)中制備細胞懸液。將100微升細胞懸液加到BSA包被的微孔板(參見如上ELISA程序)中，在37℃、5％CO2條件下溫育3.5小時。洗滌板，并與溶在PBS-Tween中1/100稀釋的50μl耦聯(lián)堿性磷酸酶的羊抗鼠IgG在4℃溫育。室溫下，在50μl 5-溴-3氯-吲哚基(indoyl)磷酸(Sigma-Aldrich)中將樣品顯色1小時，并在立體顯微鏡下計數(shù)。
實施例7血基質(zhì)研究法(例如B細胞消耗)測定ADCC。如Vugmeyster andHowell，2004，Int.Immunopharm.41117-1124所述。將無血漿和紅細胞(RBCs)的全血在染色緩沖液(含1％BSA和0.1％疊氮鈉的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS))中再生，使白細胞在染色緩沖液中懸浮。然后將全血樣品1000g離心5分鐘，除去上清(血漿)，沉淀用氯化銨裂解(ACL)試劑處理，洗滌，并重懸在等體積的染色緩沖液中。B-細胞消耗檢測法將10μl 100μg/ml抗體溶液或染色緩沖液加到90μl SB底物中，37℃溫育1小時。立即用抗-CD 19-FITC和抗-CD45-PE在25℃對樣品染色30分鐘。然后將樣品在1％甲醛中固定，進行3次重復。通過流式細胞計數(shù)法測定B細胞消耗的量。B細胞消耗的流式細胞計數(shù)分析使用帶自動FACS上樣和細胞計數(shù)軟件的FACS Calibur(BDBiosciences)儀器分析所有樣品。血細胞計數(shù)器QC和設置包括連續(xù)的CaliBrite微球和SpheroTech彩色微球(BD Biosciences)，以驗證儀器的功能和檢測器的線性。在每次檢測中運行同種型和補償對照，以驗證儀器的設置。通過以下門控策略獲得總淋巴細胞中B細胞的百分比。淋巴細胞群標記為正向散射/側(cè)向散射的散射譜，定義為區(qū)域1(R1)。根據(jù)R1中的事件，熒光強度點區(qū)表現(xiàn)為CD 19和CD45標記物。用熒光標記的同種型對照測定CD19和CD45陽性各自的臨界點。用CellQuest測定％B，表示為R1區(qū)域中具有CD19-陽性、CD45-陽性表型的細胞的百分數(shù)。對每個處理組進行3次重復樣品。用公式平均[100*(l-用對照抗體處理的％B/平均[用SB處理的％B]計算B細胞消耗的百分比。熒光梁料釋放ADCC檢測法；PBMC分離在肝素化的采血管(Becton Dickinson Vacutainer Systems，Rutherford，NJ，USA)中收集健康個體或獻血者的外周靜脈血(10-20)。輸液2只鼠約需5ml血。通過OptiPrep根據(jù)說明書通過離心分離外周血單核細胞(BMCs)。用含RPMI 1640、2mM L-谷氨酸、100IU/ml青霉素、l00g/ml鏈霉素(Gibco/BRL)，補加20％胎牛血清的完全培養(yǎng)基(CM)洗滌PBMCs一次，然后重懸在CM中，濃度為1×106/ml，并轉(zhuǎn)移到250ml培養(yǎng)瓶(Falcon，NJ，USA)中，進行單核細胞消耗。在37℃、5％CO2下溫育1小時，收集未貼壁細胞，用培養(yǎng)基洗滌一次，將外周血淋巴細胞(PRLs)調(diào)整濃度為25×1007/ml CM。熒光梁料釋放ADCC。在ADCC檢測法之后的前提是與CD20或CD40抗原呈遞靶細胞(分別為Raji細胞系或BCLl-3B3細胞)結(jié)合的抗體可刺激靶細胞與效應細胞上的Fcγ受體結(jié)合。這反過來可促進呈遞CD20或CD40抗原的靶細胞的裂解，釋放可定量的內(nèi)部熒光染料。用Alamar-blue熒光替代標記51Cr的靶細胞，在96孔組織培養(yǎng)板中，將50ul CD20-呈遞Raji細胞懸液(1×104細胞)與50ul抗-DX-IgG或抗-JC-IgG mAb(各種濃度)及50ul如上所述分離的PBMC效應細胞混合(效應細胞與靶細胞的比例為100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1)，37℃、5％CO2下溫育4小時以利于Raji或BCL1-3B3細胞的裂解。加入50μl Alamar blue，繼續(xù)溫育5小時，使染料被吸收并被代謝為熒光狀態(tài)。在振蕩器上將板冷卻至室溫，在熒光儀中讀取激發(fā)530nm，發(fā)射590nm的熒光值。將相對熒光單位(RFU)與mAb的濃度作圖，從對照抗體，例如Rituximab的標準曲線中計算樣品的濃度。用嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠體內(nèi)檢測ADCC(Niwa et al.，2004，Cancer Research，642127-2133)?？赏ㄟ^移植健康獻血者的人外周血單核細胞(PMBCs)的鼠模型測定體內(nèi)的ADCC活性，包括異源(FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LV)和同源(FcγRIIIa-LV/FcγRIIIa-LV and FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LF)基因型。用該模型系統(tǒng)檢測到，與Rituximab或任何其它對照抗體相比較，主要含N-聚糖的Igs具有增強的ADCC活性。該體內(nèi)ADCC檢測法的詳細程序參見Niwa et al.，2004，同上。
序列表
SEQ ID NO01(小鼠/人嵌合IgG1輕鏈)caatcgtcttgtctcaatccccagctattttgtctgctccccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctcttcctctgtctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttcctctccaaagccatggacctacgctacttccaacttggcttccggtgttccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactctcttaccatctccagagagaagccgaggacgctgctacttactactgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtaccaaattggagattaagagaactgttgctgctccatccgttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttgaacaacttctacccaagagaggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgttactgagcaggattctaaggattccacttactccttgtcctccactttgactttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggtttacgcttgtgaggttacacatcagggtttgtcctccccagttactaagtccttcaacagaggagagtgttaaSEQ ID NO02(小鼠/人嵌合IgG1重鏈)caagtccagttgcaacagcctggtgccgagttggtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgtaaggcttctggttacactttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaatccasstagaggtttggagtggttggtgccatctacccaggtaacggtgacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactcttaccgctgataagtcctcttccaccgcctatcatgcaattgtottccttgacttctgaagattctgctgtttactactgtgctagatccacctactncggtggagactggtacttcaacgtttggggtgctggtaccactgtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatccgtttttccattsgctccatcctctaagtctacttccggtggtactgctgctttgggatgtttggttaaggactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtgttcacactttcccagctgttttgcaatcttccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcagacttacatctgtaacgttaaccacaagccatccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacacatacttgtccaccatgtccagctccagaattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgatgatctccagaactccagaggttacatgtgttgttgttgacgtttctcacgaggacccagaggttaagttcaactggtacgttgacggtgttgaagucacaacgctaagactaagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactgttttgcaccaggattggttgaacggaaaggagtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaagactatciccaaggctaagggtcaaccaagagagccacaggtttactttgccaccatccagagatgagttgactaagaaccaggtttccttgacttgtttggttaaaggattctacccatccgacattgctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaactacaagactactccaccagttttggattctgacggttccttcttcttgtactccaagttgactgttgacaagtccagatggaacagggtaacgttttctcctgttccgttatgcalgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagtaaSEQ ID NO03(隊輕鏈恒定區(qū)IgG1)agaaccgttgctgctccatccgttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttgaacaacttctacccaagagaggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgttactgagcaggattctaaggattccacttactccttgtcctccactttgacttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggttcacgcttgtgaggttacacatcagggtttttcctccccagttactangtccttcaacagaggagagtgttaaSEQ ID NO04(隊重鏈恒定區(qū)IgG1)tctactaagggaccatccgtttttccattggctccatcctctugtctacttccggtggtactgctgctttgggatgtttggttaaggactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtgttcacactttcccagctgttttgcaatcttccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcagacttacatctgtaacgttaaccacaagccatccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacacatacttgtccatgtccagatccagaattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgatgatctccagaactccagaggttacatgtgttgttgttgacgtttctcacgasgacccagaggttaagttcaactggtacgttgacggtgttgaagttcacaacgctaagactaagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactgttttgcaccaggattggttgaacggaaaggagtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaagactatctccaaggctaagggtcaaccaagagagccacaggtttacactttgccaccatccagagatgagttgactaagaaccaggtttccttgacttgtttggttaaaggattctacccatccgacangctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaactacaagactactccaccagttttggattctgacggttccttcttcttgtactccaagttgacttgttgacaagtccagatggaacagggtaacgttttctcctgttccgttatgcatgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagtaa
SEQ ID NO05(CD20LF1)aggagtcgtattcaaatcgtcttgtctcaatccccagctattttgSEQ ID NO06(CD20LF2)tctgcttcccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctctSEQ ID NO07(CD20LF3)tcctctgtctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttccSEQ ID NO08(CD20LF4)tctccaaagccatggatctacgctacttccaacttggcttccggtSEQ ID NO09(CD20LF5)gttccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactctSEQ ID NO10(CD20LF6)cttaccatctccagagttgaagccgaggacgctgctacttactacSEQ ID NO11(CD20LF7)tgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtaccSEQ ID NO12(CD20LF8)aaattggagattaagagaactgttgctgctccatccSEQ ID NO13(CD20LR1)caacagttctcttaatctccaatttggtaccaccaccgaaagttgSEQ ID NO14(CD20LR2)gtgggttagaagtccattgctgacagtagtaagtagcagcgtcctSEQ ID NO15(CD20LR3)cggcttcaactctggagatggtaagagagtaggaggtaccggaacSEQ ID NO16(CD20LR4)agaaccagagaatctaactggaacaccggaagccaagttggaagSEQ ID NO17(CD20LR5)tagcgtagatccatggctttggagaggaacctggcttttgctggaSEQ ID NO18(CD20LR6)ccagtgaatgtaagagacagaggaagaggctctacaagtcatggSEQ ID NO19(CD20tR7)tgaccttctctccaggggaagcagacaaaatagctggggattgagSEQ ID NO20(CD20L/up)aggagtcgtattcaaatcgtcSEQ ID NO21(LfusionRTVAAPS/up)
agaactgttgctgctccatccSEQ ID NO22(LfusionRTVAAPS/lp)ggatggagcagcaacagttcSEQ ID NO23(CD20L/lp)ctggtaccttaacactctcctctgttgaagSEQ ID NO24(CD20HF1)aggagtcgtattcaagtccagttgcaacagcctggtgccgagttgSEQ ID NO25(CD20HF2)gtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgtaaggcttctggtSEQ ID NO26(CD20HF3)tacactttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaactccaSEQ ID NO27(CD20HF4)ggtagaggtttggagtggattggtgccatctacccaggtaacggtSEQ ID NO28(CD20HF5)gacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactcttaccSEQ ID NO29(CD20HF6)gctgaataagtcctcttccaccgcctacatgcaattgtcttccttgSEQ ID NO30(CD20HF7)acttctgaagactctgctgtttactactgtgctagatccacctacSEQ ID NO31(CD20HF8)tacggtggagactggtacttcaacgtttggggtgctggtaccactSEQID NO32(CD20HF9)gtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatccSEQ ID NO33(CD20HR1)tagtagaagcagcggaaacggtgacagtggtaccagcaccccaaaSEQ ID NO34(CD20HR2)cgttgaagtaccagtctccaccgtagtaggtggatctagcacagSEQ ID NO35(CD20HR3)agtaaacagcagagtcttcagaagtcaaggaagacaattgcatgtSEQ ID NO36(CD20HR4)aggcggtggaagaggacttatcagcggtaagagtgcctttccctSEQ ID NO37(CD20HR5)tgaatttttggttgtaagaagtgtcaccgttacctgggtagatgg
SEQ ID NO38(CD20HR6)caccaatccactccaaacctctacctggagtttgcttgacccagtSEQ ID NO39(CD20HR7)gcatgttgtaggaggtgaaagtgtaaccagaagccttacaggacaSEQ ID NO40(CD20HR8)tcttaacagaagcacctggcttgaccaactcggcaccaggctgttSEQ ID NO41(CD20H/up)AggagtcgtattcaagtccagSEQ ID NO42 (HchainASTKGPs/up)gcttctactaagggaccatccSEQ ID NO43(HchainASTKGPs/lp)ggatggtcccttagtagaagcSEQ ID NO44(HFckpnl/lp)ctggtattacttacctggggacaaagacSEQ ID NO45(帶有EcoRI的Kar2信號序列)gaattcgaaacgatgctgtcgttaaaaccatcttggctgactttggcggcattaatgtatgccatgctattggtcgtagtgccatttgctaaacctgttagagctSEQ ID NO46(P.BiPss/UP1-EcoRI)aattcgaaacgatgctgtctttgaagccatcttggcttactttggctgctttgatgtacgctatgcttttSEQ ID NO47(P.BiPss/LP1)ccaaagtaagccaagatggcttcaaagacagcatcgtttcgSEQ ID NO48(P.BiPss/UP2)ggttgttgttccatttgctaagccagttagagctSEQ ID NO49(P.BiPss/LP2)agctctaactggcttagcaaatggaacaacaaccaaaagcatagcgtacatcaaagcagSEQ ID NO50(GenBank#AF013576)gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtgatgaagcttctatttcttgtagatcctctcaatctttggaaaactctaacggtaacactttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaacagattttctggtgttccagatagattttctggttctggttctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttgggtgtttacttctgtttgcaagttactcatgttccatacacttttggtggtggtactactttggaaattaagagaactgttgctgctccatctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggtactgcttctgttgtttgtcttcttaacaacttctacccaagagaagctaaggttcagtggaaggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaacaagattctaaggattctacttactctttgtcttctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaaggtttgtcttctccagttactaagtcctttaacagaggtgaatgttag
SEQ ID NO51(GenBank#AF013577)gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctgttactggttactctattactactaactacaactggaactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttctgaatacaccccatctttgaagaacagagtttctattactagagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactccagaagatactgctacttactactgtgctagattggattactggggtcaaggtacttctgttactgtttcttctgcttctactaagggtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggtactgctgctttgggttgtttggttaaggattactttccagaaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaatcttctggtttgtactctttgtcttctgttgttactgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttgataagagagttgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacatgtccaccatgtccagctcctgaacttctgggtggaccatcagttttcttgttcccaccaaaaccaaaggatacccttatgatttctagaactcctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatgaagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgatggtgttgaagttcataatgctaagacaaagccaagagaagaacaatacaactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaatacaagtgtaaggtctccaacaaagctcttccagctccaattgagaaaaccatttccaaagctaaaggtcaaccaagagaaccacaagtttacaccttgccaccatccagagatgaactgactaagaaccaagtctctctgacttgtctggttaaaggtttctatccatctgatattgctgttgaatgggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctggattctgatggttccttcttcctttactctaagcttactgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactcagaagtctctttccctgtctccaggtaaataaSEQ ID NO52 mh285L-1 cggaattc-gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtgatgaagcttctatttcttgtagSEQ ID NO53 mh285L-2agaaccagttcaagaaagtgttaccgttagagttttccaaagattgagaggatctacaagaaatagaagcttcatSEQ ID NO54 mh285L-3actttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaacagatttSEQ ID NO55 mh285L-4caaagtgaaatcagtaccagaaccagaaccagaaaatctatctggaacaccagaaaatctgttagaaactctgtaSEQ ID NO56 mh285L-5tctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttgggtgtttacttctgtttgcaagttacSEQ ID NO57 mh285L-6caacagttctcttaatttccaaagtagtaccaccaccaaaagtgtatggaacatgagtaacttgcaaacagaagtaaSEQ ID NO58mh285L-7tggaaattaagagaactgttgctgctccatctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggtaSEQ ID NO59 mh285L-8tgaaccttagcttctcttgggtagaagttgttaagaagacaaacaacagaagcagtaccagacttcaattgttcat
SEQ ID NO60 mh285L-9cccaagagaagctaaggttcagtggaaggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaaSEQ ID NO61 mh285L-10ccttagacaaagtcaaagtagaagacaaagagtaagtagaatccttagaatcttgttcagtaacagattcttgagaSEQ ID NO62 mh285L-11ctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaaggtttgtcSEQ ID NO63 mh285L-12ggggtaccctaacattcacctctgttaaaggacttagtaactggagaagacaaaccttgatgagtaacSEQ ID NO64 mh285H-1cggaattc-gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctgSEQ ID NO65 mh285H-2ggaaattgtctaatccagttccagttgtagttagtagtaatagagtaaccagtaacagaacaagtcaaagacaaagSEQ ID NO66 mh285H-3aactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttctgaatacSEQ ID NO67 mh285H-4attggttcatagaagtatctctagtaatagaaactctgttcttcaaagatggggtgtattcagaagtaccatcgtaSEQ ID NO68 mh285H-5gagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactccagaagatactgctacttactactgtgcSEQ ID NO69 mh285H-6agtagaagcagaagaaacagtaacagaagtaccttgaccccagtaatccaatctagcacagtagtaagtagcagtaSEQ ID NO70mh285H-7ctgtttcttctgcttctactaagggtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggtaSEQ ID NO71 mh285H-8gaaacagtaactggttctggaaagtaatccttaaccaaacaacccaaagcagcagtaccaccagaagtagactta
SEQID NO72 mh285H-9tccagaaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaaSEQ ID NO73 mh285H-10ccaaagaagaagatggaacagtaacaacagaagacaaagagtacaaaccagaagattgcaaaacagctggaaaagtSEQ ID NO74 mh285H-11ctgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttgaSEQ ID NO75 mh285H-12tgtatgagttttatcacaagattttggttcaactctcttatcaaccttagtgttagatggSEQ ID NO76Fc-15’gctgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacatgtccaccatgtccagctcctgaacttctgggtggaccatcagtttt 3’SEQ IDNO77 Fc-25’atgtgacttcaggagttctagaaatcataagggtatcctttggttttggtggtgggaacaagaaaactgatggtccacccaga3’SEQ ID NO78Fc-35’ctagaacccctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatgaagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgat3’SEQ ID NO79 Fc-45’taagtagagttgtattgttcttctcttggctttgtcttagcattatgaacttcaacaccatcaacgtaccagttgaactt3’SEQ ID NO80 Fc-55’agaacaatacaactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaataca 3’SEQ ID NO81 Fc-65’agctttggaaatggttttctcaattggagctggaagagctttgttggagaccttacacttgtattccttaccattcagcc 3’SEQ ID NO82 Fc-75’gagaaaaccatttccaaagctaaggtcaaccaagagaaccacaagttttacaccttgccaccatccagagatgaactgac 3’SEQ ID NO83 Fc-85’cagcaatatcagatggatagaaacctttaaccagacaagtcagagagacttggttcttagtcagttcatctctggatggt3’
SEQ ID NO84 Fc-95’tctatccatctgatattgctgttgaatgggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctg 3tSEQ ID NO85Fc-105’tgccatctggacttatcaacagtaagcttagagtaaaggaagaaggaaccatcagaatccagaacaggaggagtagtctt 3’SEQ ID NO86Fc-115’tgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactc 3’SEQ ID NO87 Fc-125’ttatttacctggagacagggaaagagacttctgagtgtaatggttatgcaaag 3’SEQ ID NO88Fc/LP55’ggggtaccttatttacctggagacagggaaagagacttct 3’SEQ ID NO89(人血清白蛋白，HSA)atgaagtgggtacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagSEQ ID NO90(凝血酶位點)ctcgagcccggcggcggcggcggccgcctggttcctcgtggcttcggtacc
序列表<110>GlycoFi，Inc.
Gerngross，Tillman U.
Li，HuijuanWildt，Stefan<120>主要含有GALGLCNACMAN5GLCNAC2糖形的免疫球蛋白<130>GF0018Y<140>PCT/US05/025663<141>2005-07-19<150>60/639,657<151>2004-12-23<150>60/639,698<151>2004-12-23<160>90<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>642<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的人/小鼠嵌合IgG1輕鏈序列<400>1caaatcgtct tgtctcaatc cccagctatt ttgtctgctt cccctggaga gaaggtcacc 60atgacttgta gagcctcttc ctctgtctct tacattcact ggttccagca aaagccaggt 120
tcctctccaa agccatggat ctacgctact tccaacttgg cttccggtgt tccagttaga 180ttctctggtt ctggttccgg tacctcctac tctcttacca tctccagagt tgaagccgag 240gacgctgcta cttactactg tcagcaatgg acttctaacc caccaacttt cggtggtggt 300accaaattgg agattaagag aactgttgct gctccatccg ttttcatttt cccaccatcc 360gacgaacaat tgaagtctgg tacagcttcc gttgtttgtt tgttgaacaa cttctaccca 420agagaggcta aggttcagtg gaaggttgac aacgctttgc aatccggtaa ctcccaagaa 480tccgttactg agcaggattc taaggattcc acttactcct tgtcctccac tttgactttg 540tccaaggctg attacgagaa gcacaaggtt tacgcttgtg aggttacaca tcagggtttg 600tcctccccag ttactaagtc cttcaacaga ggagagtgtt aa 642<210>2<211>1354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的人/小鼠嵌合IgG1重鏈序列<400>2caagtccagt tgcaacagcc tggtgccgag ttggtcaagc caggtgcttc tgttaagatg 60tcctgtaagg cttctggtta cactttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120ccaggtagag gtttggagtg gttggtgcca tctacccagg taacggtgac acttcttaca 180accaaaaatt caagggaaag gctactctta ccgctgataa gtcctcttcc accgcctaca 240tgcaattgtc ttccttgact tctgaagatt ctgctgttta ctactgtgct agatccacct 300actacggtgg agactggtac ttcaacgttt ggggtgctgg taccactgtc accgtttccg 360ctgcttctac taagggacca tccgtttttc cattggctcc atcctctaag tctacttccg 420gtggtactgc tgctttggga tgtttggtta aggactactt cccagagcct gttactgttt 480cttggaactc cggtgctttg acttctggtg ttcacacttt cccagctgtt ttgcaatctt 540ccggtttgta ctccttgtcc tccgttgtta ctgttccatc ctcttccttg ggtactcaga 600cttacatctg taacgttaac cacaagccat ccaacactaa ggttgacaag aaggctgagc 660caaagtcctg tgacaagaca catacttgtc caccatgtcc agctccagaa ttgttgggtg 720gtccatccgt tttcttgttc ccaccaaagc caaaggacac tttgatgatc tccagaactc 780cagaggttac atgtgttgtt gttgacgttt ctcacgagga cccagaggtt aagttcaact 840ggtacgttga cggtgttgaa gttcacaacg ctaagactaa gccaagagag gagcagtaca 900actccactta cagagttgtt tccgttttga ctgttttgca ccaggattgg ttgaacggaa 960aggagtacaa gtgtaaggtt tccaacaagg ctttgccagc tccaatcgaa aagactatct 1020ccaaggctaa gggtcaacca agagagccac aggtttacac tttgccacca tccagagatg 1080
agttgactaa gaaccaggtt tccttgactt gtttggttaa aggattctac ccatccgaca 1140ttgctgttga gtgggaatct aacggtcaac cagagaacaa ctacaagact actccaccag 1200ttttggattc tgacggttcc ttcttcttgt actccaagtt gactgttgac aagtccagat 1260ggaacagggt aacgttttct cctgttccgt tatgcatgag gctttgcaca accactacac 1320tcaaaagtcc ttgtctttgt ccccaggtaa gtaa 1354<210>3<211>324<212>DNA<213>Homo Sapiens<400>3agaactgttg ctgctccatc cgttttcatt ttcccaccat ccgacgaaca attgaagtct 60ggtacagctt ccgttgtttg tttgttgaac aacttctacc caagagaggc taaggttcag 120tggaaggttg acaacgcttt gcaatccggt aactcccaag aatccgttac tgagcaggat 180tctaaggatt ccacttactc cttgtcctcc actttgactt tgtccaaggc tgattacgag 240aagcacaagg tttacgcttg tgaggttaca catcagggtt tgtcctcccc agttactaag 300tccttcaaca gaggagagtg ttaa 324<210>4<211>989<212>DNA<213>Homo Sapiens<400>4tctactaagg gaccatccgt ttttccattg gctccatcct ctaagtctac ttccggtggt 60actgctgctt tgggatgttt ggttaaggac tacttcccag agcctgttac tgtttcttgg 120aactccggtg ctttgacttc tggtgttcac actttcccag ctgttttgca atcttccggt 180ttgtactcct tgtcctccgt tgttactgtt ccatcctctt ccttgggtac tcagacttac 240atctgtaacg ttaaccacaa gccatccaac actaaggttg acaagaaggc tgagccaaag 300tcctgtgaca agacacatac ttgtccacca tgtccagctc cagaattgtt gggtggtcca 360tccgttttct tgttcccacc aaagccaaag gacactttga tgatctccag aactccagag 420gttacatgtg ttgttgttga cgtttctcac gaggacccag aggttaagtt caactggtac 480gttgacggtg ttgaagttca caacgctaag actaagccaa gagaggagca gtacaactcc 540acttacagag ttgtttccgt tttgactgtt ttgcaccagg attggttgaa cggaaaggag 600tacaagtgta aggtttccaa caaggctttg ccagctccaa tcgaaaagac tatctccaag 660gctaagggtc aaccaagaga gccacaggtt tacactttgc caccatccag agatgagttg 720
actaagaacc aggtttcctt gacttgtttg gttaaaggat tctacccatc cgacattgct 780gttgagtggg aatctaacgg tcaaccagag aacaactaca agactactcc accagttttg 840gattctgacg gttccttctt cttgtactcc aagttgactg ttgacaagtc cagatggaac 900agggtaacgt tttctcctgt tccgttatgc atgaggcttt gcacaaccac tacactcaaa 960agtccttgtc tttgtcccca ggtaagtaa 989<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>5aggagtcgta ttcaaatcgt cttgtctcaa tccccagctattttg 45<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>6tctgcttccc ctggagagaa ggtcaccatg acttgtagag cctct 45<210>7<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>7
tcctctgtct cttacattca ctggttccag caaaagccag gttcc45<210>8<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8tctccaaagc catggatcta cgctacttcc aacttggctt ccggt45<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>9gttccagtta gattctctgg ttctggttcc ggtacctcct actct45<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>10cttaccatct ccagagttga agccgaggac gctgctactt actac 45<210>11<211>45
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>11tgtcagcaat ggacttctaa cccaccaact ttcggtggtg gtacc45<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>12aaattggaga ttaagagaac tgttgctgct ccatcc 36<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>13caacagttct cttaatctcc aatttggtac caccaccgaa agttg45<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>14gtgggttaga agtccattgc tgacagtagt aagtagcagc gtcct 45<210>15<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>15cggcttcaac tctggagatg gtaagagagt aggaggtacc ggaac 45<210>16<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>16agaaccagag aatctaactg gaacaccgga agccaagttg gaag44<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>17
tagcgtagat ccatggcttt ggagaggaac ctggcttttg ctgga45<210>18<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>18ccagtgaatg taagagacag aggaagaggc tctacaagtc atgg44<210>19<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>19tgaccttctc tccaggggaa gcagacaaaa tagctgggga ttgag 45<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>20aggagtcgta ttcaaatcgt c 21<210>21<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>21agaactgttg ctgctccatc c 21<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>22ggatggagca gcaacagttc 20<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>23ctggtacctt aacactctcc tctgttgaag 30<210>24<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>24aggagtcgta ttcaagtcca gttgcaacag cctggtgccg agttg45<210>25<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>25gtcaagccag gtgcttctgt taagatgtcc tgtaaggctt ctggt45<210>26<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>26tacactttca cctcctacaa catgcactgg gtcaagcaaa ctcca45<210>27<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>27
ggtagaggtt tggagtggat tggtgccatc tacccaggta acggt45<210>28<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>28gacacttctt acaaccaaaa attcaaggga aaggctactc ttacc45<210>29<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>29gctgataagt cctcttccac cgcctacatg caattgtctt ccttg45<210>30<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>30acttctgaag actctgctgt ttactactgt gctagatcca cctac45<210>31<211>45
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>31tacggtggag actggtacttcaacgtttgg ggtgctggta ccact45<210>32<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>32gtcaccgttt ccgctgcttc tactaaggga ccatcc 36<210>33<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>33tagtagaagc agcggaaacg gtgacagtgg taccagcacc ccaaa45<210>34<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>34cgttgaagta ccagtctcca ccgtagtagg tggatctagc acag 44<210>35<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>35agtaaacagc agagtcttca gaagtcaagg aagacaattg catg 45<210>36<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>36aggcggtgga agaggactta tcagcggtaa gagtagcctt tccct 45<210>37<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>37
tgaatttttg gttgtaagaa gtgtcaccgt tacctgggta gatgg45<210>38<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>38caccaatcca ctccaaacctctacctggag tttgcttgac ccagt 45<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>39gcatgttgta ggaggtgaaa gtgtaaccag aagccttaca ggaca45<210>40<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>40tcttaacaga agcacctggc ttgaccaact cggcaccagg ctgtt45<210>41<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>41aggagtcgta ttcaagtcca g 21<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>42gcttctacta agggaccatc c 21<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>43ggatggtccc ttagtagaag c21<210>44<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>44ctggtattac ttacctgggg acaaagac 28<210>45<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>45gaattcgaaa cgatgctgtc gttaaaacca tcttggctga ctttggcggc attaatgtat 60gccatgctat tggtcgtagt gccatttgct aaacctgtta gagct 105<210>46<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>46aattcgaaac gatgctgtct ttgaagccat cttggcttac tttggctgct ttgatgtacg 60ctatgctttt70<210>47<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>47ccaaagtaag ccaagatggc ttcaaagaca gcatcgtttc g 41<210>48<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>48ggttgttgtt ccatttgcta agccagttag agct 34<210>49<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>49agctctaact ggcttagcaa atggaacaac aaccaaaagc atagcgtaca tcaaagcag 59<210>50<211>660<212>DNA<213>Mus Musculus<400>50gatgctgtta tgactcaaaa cccattgtct ttgcctgttt ctcttggtga tgaagcttct 60atttcttgta gatcctctca atctttggaa aactctaacg gtaacacttt cttgaactgg 120ttctttcaga agccaggtca atctccacaa ttgttgattt acagagtttc taacagattt 180tctggtgttc cagatagatt ttctggttct ggttctggta ctgatttcac tttgaagatt 240tctagagttg aagctgaaga tttgggtgtt tacttctgtt tgcaagttac tcatgttcca 300
tacacttttg gtggtggtac tactttggaa attaagagaa ctgttgctgc tccatctgtc 360ttcatctttc caccatctga tgaacaattg aagtctggta ctgcttctgt tgtttgtctt 420cttaacaact tctacccaag agaagctaag gttcagtgga aggttgataa cgctttgcaa 480tctggtaact ctcaagaatc tgttactgaa caagattcta aggattctac ttactctttg 540tcttctactt tgactttgtc taaggctgat tacgaaaagc ataaggttta cgcttgtgaa 600gttactcatc aaggtttgtc ttctccagtt actaagtcct ttaacagagg tgaatgttag 660<210>51<211>1329<212>DNA<213>Mus Musculus<400>51gatattcaat tgcaacaatc tggtccaggt ttggttaagc catctcaatc tttgtctttg 60acttgttctg ttactggtta ctctattact actaactaca actggaactg gattagacaa 120tttccaggta acaagttgga atggatgggt tacattagat acgatggtac ttctgaatac 180accccatctt tgaagaacag agtttctatt actagagata cttctatgaa ccaattcttc 240ttgagattga cttctgttac tccagaagat actgctactt actactgtgc tagattggat 300tactggggtc aaggtacttc tgttactgtt tcttctgctt ctactaaggg tccatctgtt 360tttccacttg ctccatcttc taagtctact tctggtggta ctgctgcttt gggttgtttg 420gttaaggatt actttccaga accagttact gtttcttgga actctggtgc tttgacttct 480ggtgttcata cttttccagc tgttttgcaa tcttctggtt tgtactcttt gtcttctgtt 540gttactgttc catcttcttc tttgggtact caaacttaca tttgtaacgt taaccataag 600ccatctaaca ctaaggttga taagagagtt gaaccaaaat cttgtgataa aactcataca 660tgtccaccat gtccagctcc tgaacttctg ggtggaccat cagttttctt gttcccacca 720aaaccaaagg atacccttat gatttctaga actcctgaag tcacatgtgt tgttgttgat 780gtttctcatg aagatcctga agtcaagttc aactggtacg ttgatggtgt tgaagttcat 840aatgctaaga caaagccaag agaagaacaa tacaactcta cttacagagt tgtctctgtt 900cttactgttc tgcatcaaga ttggctgaat ggtaaggaat acaagtgtaa ggtctccaac 960aaagctcttc cagctccaat tgagaaaacc atttccaaag ctaaaggtca accaagagaa 1020ccacaagttt acaccttgcc accatccaga gatgaactga ctaagaacca agtctctctg 1080acttgtctgg ttaaaggttt ctatccatct gatattgctg ttgaatggga gtctaatggt 1140caaccagaaa acaactacaa gactactcct cctgttctgg attctgatgg ttccttcttc 1200ctttactcta agcttactgt tgataagtcc agatggcaac aaggtaacgt cttctcatgt 1260tccgttatgc atgaagcttt gcataaccat tacactcaga agtctctttc cctgtctcca 1320ggtaaataa 1329
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<223>合成的寡核苷酸<400>52cggaattcga tgctgttatg actcaaaacc cattgtcttt gcctgtttct cttggtgatg 60aagcttctat ttcttgtag 79<210>53<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>53agaaccagttcaagaaagtg ttaccgttag agttttccaa agattgagag gatctacaag 60aaatagaagc ttcat 75<210>54<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>54actttcttga actggttctttcagaagcca ggtcaatctc cacaattgtt gatttacaga 60gtttctaaca gattt 75
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<223>合成的寡核苷酸<400>57caacagttct cttaatttcc aaagtagtac caccaccaaa agtgtatgga acatgagtaa 60cttgcaaaca gaagtaa 77<210>58
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<223>合成的寡核苷酸<400>58tggaaattaa gagaactgtt gctgctccat ctgtcttcat ctttccacca tctgatgaac 60aattgaagtc tggta75<210>59<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>70ctgtttcttc tgcttctact aagggtccat ctgtttttcc acttgctcca tcttctaagt 60ctacttctgg tggta 75<210>71<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>71gaaacagtaa ctggttctgg aaagtaatcc ttaaccaaac aacccaaagc agcagtacca 60ccagaagtag actta 75<210>72<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>72tccagaacca gttactgttt cttggaactc tggtgctttg acttctggtg ttcatacttt 60tccagctgtt ttgcaa 76<210>73<211>76<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>73ccaaagaaga agatggaaca gtaacaacag aagacaaaga gtacaaacca gaagattgca 60aaacagctgg aaaagt 76<210>74<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>74ctgttccatc ttcttctttg ggtactcaaa cttacatttg taacgttaac cataagccat 60ctaacactaa ggttga 76<210>75<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>75tgtatgagtt ttatcacaag attttggttc aactctctta tcaaccttag tgttagatgg 60<210>76<211>80<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>76gctgaaccaa aatcttgtga taaaactcatacatgtccac catgtccagc tcctgaactt 60ctgggtggac catcagtttt 80<210>77<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>77atgtgacttc aggagttcta gaaatcataa gggtatcctt tggttttggt gggaacaaga 60aaactgatgg tccacccaga 80<210>78<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>78ctagaacccc tgaagtcaca tgtgttgttg ttgatgtttc tcatgaagat cctgaagtca 60agttcaactg gtacgttgat 80<210>79<211>80<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>79taagtagagt tgtattgttc ttctcttggc tttgtcttag cattatgaac ttcaacacca 60tcaacgtacc agttgaactt 80<210>80<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>80agaacaatac aactctacttacagagttgt ctctgttcttactgttctgc atcaagattg 60gctgaatggt aaggaataca 80<210>81<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>81agctttggaa atggttttct caattggagctggaagagct ttgttggaga ccttacactt 60gtattcctta ccattcagcc80<210>82<211>80<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>82gagaaaacca tttccaaagc taaaggtcaa ccaagagaac cacaagttta caccttgcca 60ccatccagag atgaactgac 80<210>83<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>83cagcaatatc agatggatag aaacctttaa ccagacaagt cagagagact tggttcttag 60tcagttcatc tctggatggt 80<210>84<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>84tctatccatc tgatattgct gttgaatggg agtctaatggtcaaccagaa aacaactaca 60agactactcc tcctgttctg 80<210>85<211>80<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>85tgccatctgg acttatcaac agtaagctta gagtaaagga agaaggaacc atcagaatcc 60agaacaggag gagtagtctt 80<210>86<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>86tgttgataag tccagatggc aacaaggtaa cgtcttctca tgttccgtta tgcatgaagc 60tttgcataac cattacactc 80<210>87<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>87ttatttacct ggagacaggg aaagagactt ctgagtgtaa tggttatgca aag 53<210>88<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>88ggggtacctt atttacctgg agacagggaa agagacttct40<210>89<211>1423<212>DNA<213>Homo Sapiens<400>89atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aag1423
<210>90<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>90ctcgagcccg gcggcggcgg cggccgcctg gttcctcgtg gcttcggtac c51
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種含多種免疫球蛋白的組合物，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中超過百分之50摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中超過百分之75摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中超過百分之90摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的水平至少比所述多種N-聚糖中占第二優(yōu)勢的N-聚糖結(jié)構(gòu)高出百分之5到50摩爾百分數(shù)。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白顯示出與FcγRIIb受體的結(jié)合親和性降低。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白顯示出與FcγRIII受體的結(jié)合親和性增加。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述FcγRIII受體是一種FcγRIIIa受體。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述FcγRIII受體是一種FcγRIIIb受體。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白顯示出具有增加的抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)活性。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白基本上不含海藻糖。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白缺少海藻糖。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白與選自生長因子、FGFR、EGFR、VEGF、白細胞抗原、CD20、CD33、細胞因子、TNF-α及TNF-β的抗原結(jié)合。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白含有選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4區(qū)的Fc區(qū)。
14.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1的組合物以及藥學上可接受的載體。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白基本上不含海藻糖。
16.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白缺少海藻糖。
17.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白含有與選自生長因子、FGFR、EGFR、VEGF、白細胞抗原、CD20、CD33、細胞因子、TNF-α及TNF-β的抗原相結(jié)合的抗體。
18.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白含有選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4區(qū)的Fc區(qū)。
19.一種含有權(quán)利要求1中組合物的試劑盒。
20.一種含有編碼免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主細胞，改造或篩選所述真核宿主細胞使其表達所述免疫球蛋白或其片段，從而生產(chǎn)含有多種免疫球蛋白的組合物，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成.
21.權(quán)利要求20的宿主細胞，其中宿主細胞是低等真核宿主細胞。
22.一種在真核宿主細胞中生產(chǎn)含有多種免疫球蛋白的組合物的方法，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中在所述多種N-聚糖中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
23.權(quán)利要求22的方法，其中宿主細胞是低等真核宿主細胞。
權(quán)利要求
1.一種含多種免疫球蛋白的組合物，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中超過百分之50摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中超過百分之75摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中超過百分之90摩爾百分數(shù)的所述多種N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的水平至少比所述多種N-聚糖中占第二優(yōu)勢的N-聚糖結(jié)構(gòu)高出百分之5到50摩爾百分數(shù)。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白顯示出與FcγRIIb受體的結(jié)合親和性降低。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白顯示出與FcγRIII受體的結(jié)合親和性增加。
8.權(quán)利要求7中的組合物，其中所述FcγRIII受體是一種FcγRIIIa受體。
9.權(quán)利要求7中的組合物，其中所述FcγRIII受體是一種FcγRIIIb受體。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白顯示出具有增加的抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)活性。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白基本上不含海藻糖。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白缺少海藻糖。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白與選自生長因子、FGFR、EGFR、VEGF、白細胞抗原、CD20、CD33、細胞因子、TNF-α及TNF-β的抗原結(jié)合。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白含有選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4區(qū)的Fc區(qū)。
15.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1-14任何一條中的組合物以及藥學上可接受的載體。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白基本上不含海藻糖。
17.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白缺少海藻糖。
18.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白含有與選自生長因子、FGFR、EGFR、VEGF、白細胞抗原、CD20、CD33、細胞因子、TNF-α及TNF-β的抗原相結(jié)合的抗體。
19.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述免疫球蛋白含有選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4區(qū)的Fc區(qū)。
20.一種含有權(quán)利要求1中組合物的試劑盒。
21.一種含有編碼免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主細胞，改造或篩選所述真核宿主細胞使其表達所述免疫球蛋白或其片段，從而生產(chǎn)含有多種免疫球蛋白的組合物，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
22.權(quán)利要求21的宿主細胞，其中宿主細胞是低等真核宿主細胞。
23.一種在真核宿主細胞中生產(chǎn)含有多種免疫球蛋白的組合物的方法，每個免疫球蛋白至少含一個與其連接的N-聚糖，因此所述組合物含多種N-聚糖，其中在所述多種N-聚糖中占有優(yōu)勢的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2組成。
24.權(quán)利要求23的方法，其中宿主細胞是低等真核宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及在免疫球蛋白糖蛋白中具有占有優(yōu)勢的可提供特定效應功能的N－聚糖結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白糖蛋白組合物。另外，本發(fā)明涉及含有具有特別富集的N－聚糖結(jié)構(gòu)的抗體的藥物組合物，其中所述N－聚糖結(jié)構(gòu)為GalGlcNAcMan
文檔編號A61K39/395GK101087806SQ200580044453
公開日2007年12月12日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者T·U·格恩格羅斯, H·李, S·維爾德特 申請人:格利科菲公司