專利名稱：某些[1,4]二氮雜并[6,7,1-ij]喹啉衍生物的代謝產(chǎn)物及其制備方法和用途的制作方法
專利說明某些[1，4]二氮雜并[6，7，1-IJ]喹啉衍生物的代謝產(chǎn)物及其制備方法和用途 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及用作抗精神病和抗肥胖藥物的某些[1，4]二氮雜并[6，7，1-IJ]喹啉衍生物的代謝產(chǎn)物、其制備方法、包含它們的藥物組合物及其使用方法。

背景技術(shù)：
精神分裂癥影響了約500萬人。目前，精神分裂癥最普遍的治療是使用“非典型”抗精神病藥，其拮抗多巴胺(D2)受體和5-羥色胺(5-HT2A)受體。盡管有報(bào)道非典型抗精神藥物在效能和副作用方面優(yōu)于典型抗精神藥物，但是這些化合物不能充分治療精神分裂癥的所有癥狀，并伴有難以處理的副作用包括體重增加(Allison，D.B.，等，Am.J.Psychiatry，1561686-1696，1999；Masand，P.S.，Exp.Opin.Pharmacother.I377-389，2000；Whitaker，R.，Spectrum Life Sciences.Decision Resources.21-9，2000)。有效治療精神分裂癥中的心境障礙或認(rèn)知障礙而不引起體重增加的新型抗精神病藥物將代表精神分裂癥治療的重大進(jìn)步。
5-HT2C激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑代表了精神分裂癥治療的新方法。幾個(gè)方面的證據(jù)表明激動(dòng)5-HT2C受體是一種治療精神分裂癥的方法。對5-HT2C受體拮抗劑的研究表明這些化合物增加突觸多巴胺水平，并且在帕金森氏病動(dòng)物模型中是有效的(Di Matteo，V.，等，Neuropharmacology 37265-272，1998；Fox，S.H.，等，ExperimentalNeurology 15135-49，1998)。由于精神分裂癥的正向癥狀與多巴胺水平升高有關(guān)，具有與5-HT2C拮抗劑相反作用的化合物如5-HT2C激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑應(yīng)降低突觸多巴胺水平。最近的研究已證明5-HT2C激動(dòng)劑降低額前皮質(zhì)和伏核中的多巴胺水平(Millan，M.J.，等，Neuropharmacology 37953-955，1998；Di Matteo，V.，等，Neuropharmacology 381195-1205，1999；Di Giovanni，G.，等，Synapse3553-61，2000)，人們認(rèn)為額前皮質(zhì)和伏核是藥物如氯氮平調(diào)節(jié)關(guān)鍵性抗精神病作用的大腦區(qū)域。相反，5-HT2C激動(dòng)劑不降低紋狀體中的多巴胺水平，紋狀體是與錐體外系副作用最密切相關(guān)的大腦區(qū)域。另外，最近的研究表明5-HT2C激動(dòng)劑降低腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)而非黑質(zhì)中的點(diǎn)燃作用。相對于黑質(zhì)紋狀體通路，5-HT2C激動(dòng)劑在中腦邊緣通路的不同作用表明5-HT2C激動(dòng)劑將具有邊緣選擇性并且?guī)缀醪豢赡墚a(chǎn)生與典型抗精神病藥物相關(guān)的錐體外系副作用。
非典型抗精神病藥物對5-HT2C受體具有高親和力，用作5-HT2C受體拮抗劑或反相激動(dòng)劑。體重增加是與非典型抗精神病藥(如氯氮平和奧氮平)相關(guān)的難以處理的副作用，并且有人認(rèn)為5-HT2C拮抗作用是體重增加的原因。相反地，已知刺激5-HT2C受體引起食物攝入減少和體重降低(Walsh等，Psychopharmacology 12457-73，1996；Cowen，P.J.，等，Human Psychopharmacology 10385-391，1995；Rosenzweig-Lipson，S.，等，ASPET abstract，2000)。因此，5-HT2C激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑將幾乎不可能引起與目前非典型抗精神病藥相關(guān)的體重增加。實(shí)際上，5-HT2C激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑對于肥胖的治療非常有用，肥胖是一種以過量體脂肪和脂肪組織為特征的醫(yī)學(xué)疾病，并同時(shí)伴有如II型糖尿病、心血管疾病、高血壓、高脂血癥、中風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停、膽囊疾病、痛風(fēng)、某些癌癥、某些不育癥和早死。
化合物(9aR，12aS)-4，5，6，7，9，9a，10，11，12，12a-十氫-環(huán)戊[c][1，4]二氮雜[6，7，1-IJ]喹啉(以下為DCDQ)
是有效的5-HT2C激動(dòng)劑。見相關(guān)公開申請WO03/091250和US2004/0009970，其各自全文通過引用并入本文。DCDQ還能有效治療與精神分裂癥相關(guān)的心境障礙或認(rèn)知缺損。在一些體內(nèi)和體外模型中，DCDQ被轉(zhuǎn)化為一些代謝物。由此可見，這些代謝物可用于治療由DCDQ本身或轉(zhuǎn)化為DCDQ的前體藥物可治療的那些疾病、障礙或癥狀。這些代謝物還可以用于進(jìn)一步研究DCDQ的效應(yīng)。本發(fā)明涉及這些以及其它的重要的目標(biāo)。
發(fā)明概述 本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括式I化合物
其中 對于各Rn和Rn′，其中n是1-8 各Rn和Rn′獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O-、-OSO3H或-O-G；或者 Rn和對應(yīng)的Rn′，其中n是2、3、4、6、7或8，與它們連接碳一起結(jié)合形成C＝O；或者 Rn連同對應(yīng)的Rn+1，其中n是1、2、3、4、5或7，一起結(jié)合在其連接的碳之間形成雙鍵，并且各對應(yīng)的Rn′和R(n+1)′獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G； G具有下式
其中用＊標(biāo)記的氮可任選形成N-氧化物； X-Y是CH＝N、CH＝N(O)、CH2N(O)、C(O)NH或CR9HNR10； R9是氫、羥基或-OSO3H； R10是氫、乙?；?、-SO3H、-G或-C(O)-OG； Z是氫、羥基、-OSO3H或-O-G； 條件是當(dāng)Z是羥基時(shí)，那么或者(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10之一不是氫；或者(b)X-Y不是CR9HNR10；并且 另外的條件是當(dāng)X-Y是CHR9NR10時(shí)，那么Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中至少一個(gè)不是H。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的化合物，其中Z和R1～R8中至少一個(gè)是-OH。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的化合物，其中R1～R6、R9、R10和Z中至少一個(gè)是-C(O)-O-G、-O-G或-G。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的化合物，其中R1～R9和Z中至少一個(gè)是-OSO3H。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的化合物，其中X-Y是CR9HNR10，其中R9是H和R10是-SO3H。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的化合物，其中Rn和對應(yīng)的Rn′，與其連接的碳一起結(jié)合形成C＝O。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的化合物，其中X-Y是C(O)NH。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的化合物，其中X-Y是CH＝N。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的化合物，其中至少一個(gè)Rn和其對應(yīng)的Rn+1在與其連接的碳之間一起形成雙鍵，其中n＝1-5，并且各Rn和Rn+1獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I化合物的分離的或基本上純的形式，其純度至少為75％。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純度至少為80％的式I化合物。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純度至少為85％的式I化合物。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純度至少為90％的式I化合物。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純度至少為95％的式I化合物。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括式I化合物的藥物組合物。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療與5HT2C相關(guān)的癥狀、疾病或障礙的方法，通過給予需要這種治療的患者式I化合物或包含式I化合物的藥物組合物。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備式M6化合物的方法
包含 在偶合劑存在下，在充足條件下，化合物6a
其中各L、L1和L2是離去基團(tuán)； 和DCDQ
反應(yīng)得到化合物7
并除去所述的離去基團(tuán)L1和L2形成化合物M6。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法中，其中L具有下式
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法中，其中L1和L2獨(dú)立地選自低級烷基和乙?；?，如L1是甲基和各L2是乙酰基。
優(yōu)選的偶合劑是(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(BOP)、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種進(jìn)一步包含脫保護(hù)化合物7的方法，經(jīng)除去化合物7的葡糖醛酸基部分的L1和L2保護(hù)基團(tuán)，從而形成M6代謝產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述脫保護(hù)步驟在堿存在下，優(yōu)選NaOH、LiOH或KOH存在下，在醇中，優(yōu)選在低級烷基醇中進(jìn)行。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用在MeOH/H2O/THF中的LiOH·H2O，其優(yōu)選的比例約為2.5∶1.0∶0.5。在一些實(shí)施方案中，脫保護(hù)反應(yīng)在0℃進(jìn)行1小時(shí)。
在一些實(shí)施方案中，化合物6與偶合試劑和DCDQ的反應(yīng)在胺，優(yōu)選許尼希氏堿存在下進(jìn)行。這一反應(yīng)優(yōu)選在溶劑如CH2Cl2中進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，化合物7在脫保護(hù)之前經(jīng)柱色譜法純化。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了純化M6代謝產(chǎn)物的方法。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了化合物6a的制備方法，其通過使用催化劑和親核試劑，優(yōu)選嗎啉，除去化合物5
的烯丙基保護(hù)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，所述催化劑是Pd(PPh3)4。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了化合物5的制備方法，其中羧酸2
和DPPA在充足的條件下反應(yīng)得到?；B氮化合物中間體； 在充足的條件下加熱生成的?；B氮化合物中間體得到異氰酸酯3

以及 在充足的條件下用2，3，4-三乙?；?1-羥基葡萄糖醛酯4
處理所述加熱步驟的產(chǎn)物得到化合物5。在一些實(shí)施方案中，此反應(yīng)步驟在堿，優(yōu)選Et3N存在下進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了化合物2的制備方法，在催化劑，優(yōu)選DMAP存在下，經(jīng)聯(lián)苯二甲酸酐和過量的丙烯醇，優(yōu)選丙-2-烯-1-醇反應(yīng)制備。
經(jīng)閱讀本公開內(nèi)容，本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是顯然的。
附圖簡述

圖1是一流程圖，其提出了在體內(nèi)和體外研究中確定的DCDQ的代謝途徑。
圖2是另一個(gè)流程圖，其提出了在大鼠膽汁排泄研究中確定的DCDQ的代謝途徑。
圖3是另一個(gè)流程圖，其提出了在小鼠中確定的DCDQ的代謝途徑。
圖4是另一個(gè)流程圖，其提出了在人血漿中確定的DCDQ的代謝途徑。
圖5描述了如在大鼠膽汁排泄研究中確定的DCDQ、M7、M9和M13的結(jié)構(gòu)及NMR編號圖解。
發(fā)明詳述 一些方面中，本發(fā)明涉及DCDQ的代謝產(chǎn)物、其制備方法和使用它們治療各種疾病的方法。
一些方面中，本發(fā)明提供了式(I)化合物
其中 對于各Rn和Rn′，其中n是1-8 各Rn和Rn′獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G；或者 Rn和對應(yīng)的Rn′，其中n是2、3、4、6、7或8，與其連接的碳一起結(jié)合形成C＝O；或者 Rn連同對應(yīng)的Rn+1，其中n是1、2、3、4、5或7，一起結(jié)合在它們連接的碳之間形成雙鍵，并且各對應(yīng)的Rn′和R(n+1)′獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G； 其中用＊標(biāo)記的氮可任選形成N-氧化物； G具有下式
X-Y是CH＝N、CH＝N(O)、CH2N(O)、C(O)NH或CR9HNR10； R9是氫、羥基或-OSO3H；并且 R10是氫、乙?；?、-SO3H、-G或-C(O)-OG； Z是氫、羥基、-OSO3H或-O-G，條件是當(dāng)Z是羥基時(shí)，那么或者(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10之一不是氫；或者(b)X-Y不是CR9HNR10； 另外的條件是當(dāng)X-Y是CHR9NR10時(shí)，那么Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中至少一個(gè)不是H。
制備DCDQ(即，式I化合物，其中X-Y是CHR9NR10和各Z和R1～R10是H)的方法公開于美國專利申請公開US2004/0009970中，因此其全文通過引用并入本文。DCDQ本身不打算在本文公開的式I化合物之內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的羥基化合物。優(yōu)選地，Z和R1～R8中至少一個(gè)是羥基。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了式I的羥基化合物，其中X-Y是CR9HNR10。這類羥基化合物的一些實(shí)例包括那些化合物，其中 R9和R10各自是H； R7和R8中至少一個(gè)是-OH； R6是-OH； R3和R4中至少一個(gè)是-OH；或者 R1、R5、R6、R7和Z中至少一個(gè)是-OH。
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的羥基化合物，其中X-Y是CR9NHR10和R10是乙酰基。這類羥基化合物的一些優(yōu)選實(shí)例包括那些化合物，其中 R7和R8中至少一個(gè)是-OH； 在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的羥基化合物，其中X-Y是C＝N。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1～R6中至少一個(gè)-OH。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2～R4中至少是-OH。
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的葡糖醛酸基化合物，其中R1～R6、R9、R10和Z中至少一個(gè)是-C(O)-O-G、-O-G或-G。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了葡糖醛酸基化合物，其中X-Y是CR9HNR10。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，R9和R10是H。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，Z、R3和R4中至少一個(gè)是-O-G。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1～R6、R9和Z中至少一個(gè)是-O-G。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的葡糖醛酸基化合物，其中R2連同R3一起結(jié)合在其連接的碳之間形成雙鍵，并且R3′和R4中至少一個(gè)是-O-G。
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I化合物的葡糖醛酸基化合物，其中R10是-C(O)O-G或-G。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步提供了此類化合物，其中R4和R4′與其連接的碳一起結(jié)合形成C＝O。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了葡糖醛酸基化合物，其中X-Y是-CHR9NR10，其中R10是-C(O)-O-G。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I化合物，其中Z、各Rn和Rn′是H，X-Y是-CHR9NR10。在一些這樣的實(shí)施方案中，R9是H。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R9是H且R10是-C(O)-O-G。
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的葡糖醛酸基化合物，其中R10是乙?；Ｔ趦?yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)一步提供了這種衍生物，其中R1～R6、R9和Z中至少一個(gè)是-O-G。在另外其它的實(shí)施方案中，R7和R8中至少一個(gè)是-O-G。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的硫酸酯化合物，其中R1～R9和Z中至少一個(gè)是-OSO3H。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述硫酸酯化合物，其中X-Y是-CHR9NR10。在一些這樣的實(shí)施方案中，R9和R10各自是H。在一些這樣的實(shí)施方案中，R1～R6中至少一個(gè)是-OSO3H。在另外的實(shí)施方案中，R2和R3中至少一個(gè)是-OSO3H。在一些實(shí)施方案中，R3是-OSO3H。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的硫酸酯化合物，其中R9和Z中至少一個(gè)是-OSO3H。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的氨基磺酸酯化合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這種氨基磺酸酯化合物，其中X-Y是CR9HNR10，且R10是-SO3H。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這種氨基磺酸酯化合物，其中至少兩個(gè)Rn及其對應(yīng)的Rn+1在其連接的碳之間形成雙鍵，其中n＝1-5。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的酮類化合物，其中Rn及其對應(yīng)的Rn+1與其連接的碳一起結(jié)合形成C＝O。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，n＝4。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，X-Y是CR9HNR10，并且優(yōu)選地R10是-G。在其它的實(shí)施方案中，R9和R10是H。
根據(jù)式I的酮類化合物的其它實(shí)施方案提供了其中X-Y是C(O)NH的化合物。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式I的亞胺化合物。在一些實(shí)施方案中，X-Y是CH＝N。在一些這樣的實(shí)施方案中，R1～R6中至少一個(gè)是-OH。在其它這樣的實(shí)施方案中，R2～R4中至少一個(gè)是-OH。在另外其它的這種實(shí)施方案中，化合物可以是N-氧化物，其中在R6和R7連接的碳之間的氮形成N-氧化物。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的脫氫化合物，其含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵。在這些實(shí)施方案中，提供了這種化合物，其中Rn及其對應(yīng)的Rn+1一起在其連接的碳之間形成雙鍵，其中n＝1-5，并且各Rn′和R(n+1)′獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，n＝2。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，n＝2，R2′＝H及R3′或R4是-O-G。在另外的實(shí)施方案中，X-Y是CHR9NR10，其中R9和R10優(yōu)選是H。
在其它的實(shí)施方案中，提供了式I的二脫氫化合物，其中至少兩個(gè)Rn，各所述Rn及其對應(yīng)的Rn+1一起在它們連接的碳之間形成雙鍵，其中n＝1-5。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了X-Y＝CHR9NR10的化合物。在另外的實(shí)施方案中，R10是H；且Z或R9是-OSO3H。在另外其它的實(shí)施方案中，X-Y＝CHR9NR10，及R9＝R10＝H。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的這種二脫氫化合物，其中R10是-SO3H或乙酰基。
本發(fā)明的一些方面中，提供了式I化合物的分離的形式。
本發(fā)明的其它方面中，提供了式I化合物的基本上純的形式，其純度至少為75％。在其它的方面，所述化合物的純度至少為80％。在其它方面，所述化合物的純度至少為85％。在其它方面，所述化合物的純度至少為90％。在其它方面，所述化合物的純度至少為95％。
如本文使用的，乙?；侵窩H3-C(＝O)-。
如本文使用的，烷基是指脂肪族烴基鏈，例如含有1-6個(gè)碳原子，并且包括但不限于直鏈和支鏈如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基和異己基。低級烷基是指含有1-3個(gè)碳原子的烷基。
BOP是指(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽。
如本文使用的，氨基甲?；侵?C(＝O)N＜基團(tuán)。
DCC是指N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺。
DIBAH和DIBAL可互換，是指氫化二異丁基鋁。
DMAP是指4-二甲基氨基吡啶。
DPPA是指疊氮化磷酸二苯酯。
EDC是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
如本文使用的，葡糖醛酸基是指下式基團(tuán)
如本文使用的，鹵素(或鹵代)是指氯、溴、氟和碘。許尼希氏堿是N，N-二異丙基乙胺，本文也表示為i-Pr2NEt。
PyBOP是指(苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷 六氟磷酸鹽。
本發(fā)明的化合物含有不對稱碳原子，因此產(chǎn)生旋光異構(gòu)體和非對映體。本發(fā)明包括這些旋光異構(gòu)體和非對映體；以及外消旋和拆分的對映體純R和S立體異構(gòu)體；以及R和S立體異構(gòu)體的其它混合物及其可藥用鹽。
當(dāng)優(yōu)選一種對映體時(shí)，在某些實(shí)施方案中其可以基本沒有對應(yīng)的對映體。因此，基本沒有對應(yīng)對映體的對映體是指通過分離技術(shù)分離的一種化合物或者制備出的沒有對應(yīng)對映體的一種化合物。如本文使用的，“基本沒有”是指該化合物主要由一種對映體構(gòu)成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物的組成中優(yōu)選對映體至少占約90％(重量)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，所述化合物的組成中優(yōu)選對映體至少占約99％(重量)?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，包括高效液相色譜法(HPLC)以及生成并結(jié)晶手性鹽，從外消旋混合物中分離出優(yōu)選的對映體，或通過本文所述的方法制備。參見例如Jacques等，Enantiomers，Racemates and Resolutions(Wiley Interscience，NewYork，1981)；Wilen，S.H.等，Tetrahedron 332725(1977)；EMeI，E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill，NY，1962)；Wilen，S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutionsp.268(E.L.Eliel，Ed.，Univ.of Notre Dame Press，Notre Dame，IN1972)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員也能識別出可能存在的式(I)的互變異構(gòu)體。本發(fā)明包括所有這些互變異構(gòu)體，盡管在式(I)中沒有顯示出來。
本發(fā)明中使用的化合物還包括式(I)化合物的可藥用鹽?！翱伤幱名}”表示經(jīng)加成可藥用堿和式(I)化合物形成的任意化合物，以形成對應(yīng)的鹽。術(shù)語“可藥用”表示可在藥物應(yīng)用中使用而沒有毒理學(xué)作用及不與活性成分發(fā)生不利的相互作用的物質(zhì)?？伤幱名}包括單-和二鹽，是與以下酸形成的鹽有機(jī)和無機(jī)酸例如但不限于乙酸、乳酸、枸櫞酸、肉桂酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、丙二酸、杏仁酸、蘋果酸、草酸、丙酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、乙醇酸、丙酮酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、水楊酸、苯甲酸和類似已知的可接受的酸。
式I化合物的非限制性實(shí)例包括那些經(jīng)本文詳述的體外和體內(nèi)研究所確證的化合物，以及在圖1-4中所述的代謝途徑中顯示的化合物。這些實(shí)例包括下文所示的那些化合物。盡管給出的取代基的連接如方框中所述，但是標(biāo)明的取代基打算可連接于方框中的任意一個(gè)或多個(gè)可用的碳原子上。
羥基代謝物
葡糖醛酸基代謝物
硫酸酯代謝物
氨基磺酸酯代謝物
酮類化合物
亞胺代謝物
脫氫化合物
示范性合成 推薦羥基代謝產(chǎn)物M1的合成
推薦羥基代謝產(chǎn)物M2的合成
推薦N-氧化物代謝產(chǎn)物M5的合成
氨基甲?；咸侨┧峄x產(chǎn)物M6的合成
推薦羥基代謝產(chǎn)物M3和M4、酮類代謝產(chǎn)物M7以及硫酸酯代謝產(chǎn)物M8和M13的合成

推薦硫酸酯代謝產(chǎn)物M8的另外組分的合成
推薦葡糖醛酸基代謝產(chǎn)物M9的合成
推薦羥基代謝產(chǎn)物M10和N-乙?；u基代謝產(chǎn)物M11的合成
推薦氨基磺酸酯代謝產(chǎn)物M12的合成
推薦氨基磺酸酯代謝產(chǎn)物M12、二-脫氫氨基磺酸酯代謝產(chǎn)物M14以及N-乙?；?脫氫代謝產(chǎn)物M21的合成
推薦酮類代謝產(chǎn)物M18的合成
推薦羥基亞胺代謝產(chǎn)物M15和M29-M31的合成
推薦氨基磺酸酯代謝產(chǎn)物M16的合成
推薦亞胺代謝產(chǎn)物P3的合成
這些推薦合成僅僅是示范性的。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)員應(yīng)當(dāng)意識到其它的合成可以用于制備本發(fā)明的各種化合物。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識到在上述任意方案中的中間體可以是根據(jù)式I的一種化合物，并且可以收集和純化，如果需要，無需繼續(xù)下一步。例如，上述氮碳基可以被分離和純化。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識到可以改變這些合成以得到本文所述的式I化合物的相關(guān)化合物。認(rèn)為上述方法、化合物和中間體的這些和其它改變或改進(jìn)在本發(fā)明在此公開的范圍和精神之內(nèi)。
治療方法 DCDQ及相關(guān)化合物的親和力在相關(guān)公開申請WO03/091250和US2004/0009970已被充分證實(shí)，上述各申請通過引用并入。因此，同DCDQ類似，在給予DCDQ后形成的代謝產(chǎn)物也能用于治療精神病和其它疾病。
本發(fā)明的化合物是大腦5-羥色胺受體2C亞型的激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑，因此可用于治療精神疾病，包括精神病，如精神分裂癥包括偏執(zhí)型、錯(cuò)亂型、緊張型以及混合型，精神分裂癥樣精神障礙，情感分裂性精神障礙，妄想性精神障礙，物質(zhì)誘發(fā)的精神病和其它未分類的精神?。籐-DOPA-誘發(fā)的精神?。话柎暮Ｄ习V呆相關(guān)性精神??；帕金森氏病相關(guān)性精神病；Lewy體病相關(guān)性精神?。浑p相性精神障礙如I型雙相性精神障礙、II型雙相性精神障礙和循環(huán)型雙相性障礙；抑郁癥如嚴(yán)重抑郁癥、情緒惡劣性障礙、物質(zhì)誘發(fā)的情感障礙和其它未分類的抑郁癥；情緒發(fā)作如嚴(yán)重抑郁癥發(fā)作、躁狂發(fā)作、混合型發(fā)作和輕度躁狂發(fā)作；焦慮癥如驚恐發(fā)作、廣場恐怖癥、恐慌癥、特定恐懼癥、社交恐懼癥、強(qiáng)迫癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、急性應(yīng)激障礙、泛化性焦慮癥、分離性焦慮癥、物質(zhì)誘發(fā)性焦慮癥和其它未分類的焦慮癥；適應(yīng)障礙如伴有焦慮和/或抑郁性情緒的適應(yīng)障礙；智力缺陷疾病如癡呆、阿爾茨海默氏病和記憶缺陷；進(jìn)食障礙(例如過食癥、神經(jīng)性暴食癥或神經(jīng)性食欲缺乏)以及哺乳動(dòng)物可能出現(xiàn)的上述精神疾病的混合型。例如，心境障礙如抑郁癥或雙相性精神障礙常伴有精神疾病如精神分裂癥。上述精神疾病的更詳細(xì)說明可以參見Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders，第4版，Washington，DC，American Psychiatric Association(1994)。
本發(fā)明的化合物也可用于治療癲癇；偏頭痛；性功能障礙；睡眠障礙；胃腸疾病，如胃腸蠕動(dòng)障礙；以及肥胖及其伴發(fā)病包括II型糖尿病、心血管疾病、高血壓、高脂血癥、中風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停、膽囊疾病、痛風(fēng)、某些癌癥、某些不育癥及早死。本發(fā)明的化合物還能用于治療例如創(chuàng)傷、中風(fēng)和脊髓損傷相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷。因此，在所述疾病或創(chuàng)傷期間或之后，本發(fā)明的化合物可用于改善或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性的進(jìn)一步退化。上述改善包括維持或改善運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)性技能、控制、協(xié)調(diào)和力量。
因此，本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物優(yōu)選人類的上述各種疾病的方法，此方法包括對需要這種治療的哺乳動(dòng)物給予治療有效量的本發(fā)明化合物。本文使用的“治療”表示部分或完全減輕、抑制、預(yù)防、改善和/或緩解疾病。例如，本文使用的“治療”包括部分或完全減輕、抑制或緩解所述癥狀。本文使用的“哺乳動(dòng)物”是指溫血脊椎動(dòng)物，如人。本文使用的“提供”表示直接給予本發(fā)明的化合物或組合物，或者給予將在體內(nèi)形成等量的活性化合物或物質(zhì)的衍生物或類似物。
藥物組合物 本發(fā)明還包括用于治療或控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病狀態(tài)或癥狀的藥物組合物，其包含至少一種式I化合物、其混合物和/或其藥用鹽及可藥用載體。這樣的組合物根據(jù)藥學(xué)上可接受的方法制備，如在Remingtons Pharmaceutical Sciences，第17版，ed.Alfonoso R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA(1985)中所述?？伤幱幂d體是那些與制劑中其它成分相容以及生物學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或結(jié)合常規(guī)藥用載體經(jīng)口服或胃腸外給予，根據(jù)化合物的溶解度和化學(xué)特性、選擇的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)實(shí)踐來確定藥用載體的比例。藥用載體可以是固體或液體。
合適的固體載體可以包括一種或多種物質(zhì)，其也可以作為調(diào)味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、助壓縮劑、粘合劑或片劑崩解劑或包囊劑。粉劑中，載體是與微細(xì)活性成分混合的微細(xì)固體。片劑中，活性成分以適當(dāng)比例與具有必要壓縮特性的載體混合，并壓縮為所需的形狀和大小。粉劑和片劑優(yōu)選含有至多99％的活性成分。合適的固體載體包括例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷、低熔點(diǎn)蠟和離子交換樹脂。
液體載體可用于制備溶液劑、混懸劑、乳劑、糖漿和酏劑。本發(fā)明的活性成分可以溶于或混懸于可藥用液體載體如水、有機(jī)溶劑、兩者的混合物或可藥用油或脂肪中。液體載體可以含有其它合適的藥用添加劑如增溶劑、乳化劑、緩沖劑、防腐劑、甜味劑、調(diào)味劑、懸浮劑、增稠劑、色素、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透壓調(diào)節(jié)劑。口服或胃腸外給藥的合適的液體載體的實(shí)例包括水(特別包含上述添加劑，例如纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，以及油(例如分餾的椰油和花生油)。對于胃腸外給藥，載體還可以是油性酯如油酸乙酯和豆蔻酸異丙酯。無菌液體載體用于胃腸外給藥的無菌液體形式組合物。增壓組合物的液體載體可以是鹵化烴或其它可藥用的推進(jìn)劑。
無菌溶液或混懸液的液體藥物組合物可以經(jīng)例如肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射給藥。無菌溶液還可以經(jīng)靜脈給予。口服給藥可以是液體或固體組合物形式。
本發(fā)明的化合物可以常規(guī)栓劑形式經(jīng)直腸或陰道給予。對于鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)吸入劑或吹入劑，本發(fā)明的化合物可以制成水性或部分水性溶液，然后可將其以氣溶膠形式使用。本發(fā)明的化合物還可以通過使用含有活性化合物和載體的透皮貼劑經(jīng)皮給予，所述載體對于活性化合物是惰性的，對皮膚無毒性，并且可使藥物經(jīng)由皮膚全身吸收入血。載體可以采取許多形式如乳膏和軟膏、糊劑、凝膠和封閉裝置。乳膏和軟膏可以是粘稠液體或者油包水或水包油型半固體乳劑。包含活性成分的分散于石油或親水性石油中的可吸收粉末的糊劑也是合適的。各種封閉裝置可以用于將活性成分釋放入血流中，如半透膜覆蓋的貯庫，所述貯庫中含有活性成分，有或沒有載體，或含有活性成分的基質(zhì)。其它封閉裝置在文獻(xiàn)中是已知的。
優(yōu)選藥物組合物是單位劑型例如片劑、膠囊劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑或栓劑。在這樣的劑型中，組合物細(xì)分為含有適量活性成分的單位劑量；單位劑型可以是包裝的組合物，例如包裝的粉末、小瓶、安瓿、預(yù)灌裝的注射器或含有液體的小藥囊。例如，單位劑型可以是膠囊或片劑本身，或者可以是包裝的適量的任何這樣的組合物。
劑量需要量隨使用的具體組合物、給藥途徑、癥狀的嚴(yán)重程度和受治療患者的具體情況而變化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)測試得到的結(jié)果，活性化合物的預(yù)計(jì)日劑量應(yīng)為約0.02μg/kg-約4000μg/kg，或最高至500mg/day。應(yīng)當(dāng)理解這些劑量范圍只是估算，并且本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將能根據(jù)眾多因素包括患者體重、癥狀的嚴(yán)重程度和其它因素確定合適的劑量。治療的初始劑量通常為小于化合物最佳劑量的小劑量。然后，將劑量增加至達(dá)到這種情況下的最佳效果；經(jīng)口、胃腸外、鼻或支氣管內(nèi)給予的精確劑量由主治醫(yī)師根據(jù)經(jīng)驗(yàn)與受治療個(gè)體的情況而確定。
實(shí)施例 代謝產(chǎn)物化合物 在一些體外和體內(nèi)模型中通過使用放射標(biāo)記的DCDQ，[14C]DCDQ，研究了DCDQ的代謝。這些研究顯示了幾條代謝途徑和一些重要的代謝產(chǎn)物。這些研究在下文的實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)行了更詳細(xì)的說明。
用雄性和雌性CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠、比格犬和交叉性別混合物的人肝微粒體以及冷凍保存的男性人肝細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)研究[14C]DCDQ的代謝。在微粒體培養(yǎng)和人肝細(xì)胞中，DCDQ被轉(zhuǎn)化為氧化代謝產(chǎn)物，包括M1、M2、M3、M4、M5和氨基甲?；咸擒账?M6)。
在四只比格犬中，單次給予[14C]DCDQ鹽酸鹽腸溶膠囊14.1～16.7mg/kg后，進(jìn)一步研究了[14C]DCDQ在體內(nèi)的代謝。在血漿中觀察到的主要代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ(M1、M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、酮類DCDQ(M7)、羥基DCDQ亞胺(M15)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和DCDQ的氨基甲?；咸擒账?M6)。羥基DCDQ的硫酸酯綴合物(M16)和二氮雜?；鵇CDQ羧酸(M17)在血漿中未檢出，在尿樣中可見。羥基DCDQ代謝產(chǎn)物(M2、M3和M19)、酮類DCDQ(M18)和羥基DCDQ亞胺(M15)在糞便排泄物中檢出。DCDQ在犬中被廣泛代謝，氧化代謝是其主要的代謝途徑，盡管也檢測到形成了DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)。
在雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠中，單次經(jīng)口給予(5mg/kg)后，進(jìn)一步研究了[14C]DCDQ的體內(nèi)代謝。在血漿中檢出的代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ代謝產(chǎn)物(M1、M2、M3、M4和M10)、酮類DCDQ(M7)和II相代謝產(chǎn)物DCDQ氨基磺酸酯(M12)、二-脫氫DCDQ氨基磺酸酯(M14)、羥基DCDQ硫酸酯(M8和M13)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙?；牧u基DCDQ(M11)。DCDQ在大鼠中被廣泛代謝為主要氧化代謝產(chǎn)物。
因此，DCDQ的代謝產(chǎn)物經(jīng)幾條代謝途徑產(chǎn)生，其中一些是幾種種屬交叉共有的。這些代謝產(chǎn)物可用于治療由5HT2C受體引起的障礙和疾病和/或那些可通過給予DCDQ治療的障礙和疾病。
合成氨基甲?；咸侨┧峄x產(chǎn)物(M6)
在偶合試劑和CH2Cl2中的胺存在下，M6代謝產(chǎn)物可以通過DCDQ和葡糖醛酸基載體6偶合獲得，以得到化合物7。產(chǎn)物，化合物7可以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法純化，并優(yōu)選通過柱色譜法純化，優(yōu)選用EtOAc/庚烷作為洗脫液。偶合試劑可以選自任意合適的偶合試劑，包括但不限于BOP、DCC和EDC。BOP是優(yōu)選的偶合劑。合適的胺包括但不限于Et3N、吡啶和許尼希氏堿。優(yōu)選許尼希氏堿。葡糖醛酸基載體6可以通過領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法制備。L1是脂肪族的離去基團(tuán)，如但不限于C1～C6烷基、甲基、乙基和丙基，優(yōu)選甲基。各L2是離去基團(tuán)，獨(dú)立地選自乙?；推S基，優(yōu)選乙?；Ｆ咸侨┧峄d體6優(yōu)選是仲胺葡糖醛酸基氨基甲酯6，如那些可以根據(jù)在Ruben G.G.Leeders，Hans W.Scheeren，Tetrahedron Letters 2000，41，9173-9175中討論的Scheeren氏方案設(shè)計(jì)的化合物。
葡糖醛酸基氨基甲?；x產(chǎn)物M6
然后，化合物7被堿水解，導(dǎo)致所有在糖部分2，3，4-位的離去基團(tuán)L2以及L1脫保護(hù)，得到終產(chǎn)物M6代謝產(chǎn)物。堿水解使用堿如NaOH、LiOH和KOH，在C1-C3脂肪醇中進(jìn)行。LiOH是優(yōu)選的堿，且MeOH是優(yōu)選的醇?？梢猿ビ袡C(jī)溶劑并冷凍脫水以得到定量的粗品產(chǎn)物M6。然后，粗品M6的純化可以經(jīng)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。葡糖醛酸基載體，化合物6
化合物6可以經(jīng)化合物5中的烯丙基基團(tuán)脫保護(hù)制備，優(yōu)選使用Pd(PPh3)4催化，并使用嗎啉作為親核基團(tuán)。優(yōu)選新配制的催化劑。另外，N2可以任選在加入催化劑之前吹入反應(yīng)溶液中。這樣，得到定量的粗品葡糖醛酸基載體6，無需進(jìn)一步純化。
化合物5
化合物可以在一鍋反應(yīng)中以高的收率制備。在Et3N的甲苯溶液存在下，化合物2用DPPA、NaN3或TMSN3中之一處理原位生成?；B氮化物10，其經(jīng)加熱，優(yōu)選至80℃加熱1.5小時(shí)，得到異氰酸酯3?；衔?無需分離，接著用1-羥基葡糖醛酸酯4處理，優(yōu)選于室溫下過夜，獲得標(biāo)題化合物5(方案3)?；衔?可以經(jīng)US6,380,166B1所述的方法制備，該專利通過引用并入本文。30℃時(shí)的1H NMR顯示由于圍繞Ar-Ar鍵的旋轉(zhuǎn)受限所有信號都是雙峰。
在化合物4中，L1是脂肪族離去基團(tuán)，如但不限于C1～C6烷基、甲基、乙基和丙基，優(yōu)選甲基。各L2是離去基團(tuán)，其獨(dú)立地選自乙?；推S基。優(yōu)選乙?；?。
化合物2 為了制備一烯丙基酯2，選取聯(lián)苯二甲酸酐作為起始原料，并且在催化劑存在下，用過量烯丙醇處理。合適的催化劑包括Et3N、許尼希氏堿、吡啶、胺、NaOH、LiOH、KPH及其它的無機(jī)堿?？梢缘玫蕉康幕衔?。
化合物5
化合物可以在一鍋反應(yīng)中以高的收率制備。在Et3N的甲苯溶液存在下，化合物2用DPPA、NaN3或TMSN3中之一處理原位生成?；B氮化物10，其經(jīng)加熱，優(yōu)選至80℃加熱1.5小時(shí)，得到異氰酸酯3?；衔?無需分離，接著用1-羥基葡糖醛酸酯4處理，優(yōu)選于室溫下過夜，獲得標(biāo)題化合物5(方案3)?；衔?可以經(jīng)US6,380,166B1所述的方法制備，該專利通過引用并入本文。30℃時(shí)的1HNMR顯示由于圍繞Ar-Ar鍵的旋轉(zhuǎn)受限所有信號都是雙峰。
在化合物4中，L1是脂肪族離去基團(tuán)，如但不限于C1～C6烷基、甲基、以及和丙基，優(yōu)選甲基。各L2是離去基團(tuán)，其獨(dú)立地選自乙酰基和芐基。優(yōu)選乙酰基。
氨基甲?；咸侨┧峄x產(chǎn)物(M6)的示范性合成 DCDQ氨基甲?；咸擒账岽x產(chǎn)物(M6)的示范性合成如方案1中所示
一般方法 在Varian Inova 300上于300MHz(1H和13C)記錄了NMR譜，并且相對于TMS內(nèi)標(biāo)，在ppm級確定了化學(xué)位移。分析和制備型TLCs在得自EM Science的硅膠60F-254預(yù)涂布板上進(jìn)行。使用UV于254nm處或10％KMnO4水溶液指示劑使化合物顯影。HPLC分析在配有PDA(2996型)UV檢測器的Waters Alliance 2695HPLC儀上進(jìn)行。在Finnigan質(zhì)譜儀上記錄質(zhì)譜。
聯(lián)苯基-2，2′-二羧酸2′-烯丙基酯2
向1-L燒瓶中加入聯(lián)苯二甲酸酐(40g，178mmol)、烯丙醇(300mL)和DMAP(2.18g，17.8mmol，10mol％)。將反應(yīng)混合物攪拌12h。在減壓下于40℃蒸發(fā)過量的烯丙醇。殘余物再溶于EtOAc(400mL)中，并用NaHSO4水溶液(0.5N，200mL)、鹽水(200mL×3)和水(200mL×3)洗滌。有機(jī)層用無水Na2SO4干燥，通過硅膠墊(500g)，用EtOAc(1L)清洗，減壓下濃縮至干燥。痕量烯丙醇經(jīng)用庚烷蒸餾除去，以得到一烯丙基酯2(50g，100％)，無色油狀物。1H NMR(300MHz，CDCl3)8.03-7.99(m，2H)，7.56-7.39(m，4H)，7.19-7.16(m，2H)，5.74-5.61(m，1H)，5.17-5.06(m，2H)，4.52-4.49(m，2H)。
3，4，5-三乙酰氧基-6-(2′-烯丙氧基羰基聯(lián)苯-2-基氨甲?；趸?四氫-吡喃-2-羧酸甲酯5
在氮?dú)鈿夥障拢?00-mL燒瓶中加入聯(lián)苯基-2，2′-二羧酸2′-烯丙基酯2(5.2g，18.4mmol)、甲苯(100mL)、DPPA(4.8mL，22.1mmol，1.2eq)和Et3N(3.1mL，22.1mmol，1.2eq)。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌過夜，然后加熱至85℃保持1.5h，以原位生成中間體異氰酸酯3?；旌衔锢鋮s至室溫。向此混合物中加入2，3，4-三乙?；?1-羥基葡糖醛酸甲酯4(3.7g，11mmol，0.6eq)，并攪拌過夜?；旌衔镉肊tOAc(500mL)稀釋，接著用NaHSO4水溶液(0.5N，200mL)、飽和NaHCO3(200mL)、鹽水(200mL×2)和水(200mL)洗滌。有機(jī)層經(jīng)無水NaSO4干燥，并在減壓下濃縮。殘余物(11g)與硅膠(22g)混合，裝載于用硅膠(500g)填充的柱(4.5×50cm)上。此柱用EtOAc/庚烷(2∶8，6L；3∶7，4L；4∶6，4L)沖洗。收集各餾份(60mL/餾份)，并蒸發(fā)溶劑得化合物5(5.5g，82％)。HPLC，RT＝7.73min；純度81.44％。由于圍繞Ar-Ar鍵的旋轉(zhuǎn)受限，所有信號都是雙峰，1HNMR(300MHz，CDCl3)8.03-7.93(m，2H)，7.64-7.48(m，2H)，7.40-7.23(m，2H)，7.18-7.05(m，2H)，6.49，6.42(2s，1H，NH)，5.74，5.73(2d，J＝8.1Hz，1H，β-異構(gòu)體)，5.70-5.57(m，1H)，5.33-5.01(m，5H)，4.54-4.48(m，2H)，4.16(d，J＝9.9Hz，1H)，3.73，3.72(2s，3H)，2.04-1.95(3s，9H)。MSm/z[636M+Na]+。
3，4，5-乙酰氧基-6-(2′-羧基聯(lián)苯-2-基氨基甲酰氧基)四氫吡喃-2-羧酸甲酯6
向500-mL燒瓶中加入3，4，5-三乙酰氧基-6-(2′-烯丙氧羰基聯(lián)苯-2-基氨基甲酰氧基)四氫-吡喃-2-羧酸甲酯5(5.3g，8.65mmol)、THF(400mL)和嗎啉(3.8mL，43.3mmol，5eq)。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌2h，同時(shí)向溶液中吹入氮?dú)?。然后，加入Pd(PPh3)4(300mg，0.26mmol，3mol％)。將反應(yīng)混合物進(jìn)一步攪拌15min，用Et2O(1L)稀釋，并用NaHSO4(0.5N，300mL)、鹽水(300mL×2)、水(400mL×2)洗滌。有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥并蒸發(fā)以獲得化合物6(5.3g，100％，HPLC84％純度)。該化合物無需進(jìn)一步純化就應(yīng)用于下一步中。由于圍繞Ar-Ar鍵的旋轉(zhuǎn)受限，所有信號都是雙峰，1HNMR(300MHz，CDCl3)8.05-7.15(m，8H)，5.72，5.70(2d，J＝8.1Hz，1H)，5.36-5.02(m，2H)，4.18，4.13(2d，J＝9.9Hz，1H)，3.77-3.73(m，1H)，3.72(s，3H)，2.03-1.98(3s，9H)。MSm/z572[M-H]-。
化合物7
向500-mL燒瓶中加入3，4，5-三乙酰氧基-6-(2′-羧基聯(lián)苯-2-基氨基甲酰氧基)四氫吡喃-2-羧酸甲酯6(5.0g，8.7mmol)、CH2Cl2(200mL)和BOP(4.2g，9.6mmol，1.1eq)。在氮?dú)鈿夥障掠谑覝貙⒒旌衔飻嚢枰宰兂扇芤骸?0min內(nèi)向該溶液中逐滴加入DCDQ(2.5g，9.6mmol，1.1eq)和N，N-二異丙基-N-乙胺(7.6ml，43.5mmol，5eq)的CH2Cl2(200ml)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌過夜，并經(jīng)celite過濾。將有機(jī)層用水(200ml)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥并蒸發(fā)。殘余物經(jīng)柱色譜法(柱4.5×50cm，硅膠500g，溶劑EtOAc/庚烷(2/8，4L)，(3/7，8L)，50mL/餾份)純化，得到化合物7(4.0g，HPLC74％)，進(jìn)一步在CH2Cl2中調(diào)成漿液以得到化合物7(3.52g，68.8％，HPLC96％)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)7.12-7.08(m，1H)，6.98-6.96(m，1H)，6.86-6.77(m，1H)，5.81，5.79(2d，J＝8.1Hz，1H，β-異構(gòu)體)，5.10-4.90(m，2H)，4.63-4.36(m，2H)，4.17-4.12(m，1H)，3.88-3.68(m，1H)，3.64，3.59(2s，3H)，3.40-3.21(m，1H)，3.04-2.59(m，4H)，2.30-2.14(m，1H)，2.05-1.95(3s，9H)，1.70-1.20(m，5H)。MSm/z 589[M+H]+. DCDQ的M6代謝產(chǎn)物
將MeOH(319mL)和H2O(70mL)加入化合物7(5.0g，8.5mmol)的THF(64mL)溶液中。將該溶液冷卻至0-5℃(冰水浴)。并在20min內(nèi)逐滴加入LiOH·H2O(2.1g，51mmol，6eq)的H2O(58mL)溶液
。反應(yīng)混合物在N2氣氛下于0-5℃攪拌2小時(shí)。在反相TLC(SiO2-C18 MeCN/H2O，3/7)中監(jiān)測脫保護(hù)進(jìn)程。反應(yīng)混合物用H2O(500mL)稀釋，并于20℃經(jīng)加入HOAc(3.1g，51mmol)中和。溶劑于22℃減壓下濃縮，并將得到的水混懸液低壓凍干，得到M6代謝物粗品(6.2g，100％)。使用Biotage硅膠柱色譜法(Horizon)，2CHCl3/MeOH/H2O作為洗脫液，將粗品化合物(1.2g)進(jìn)一步純化，得到M6(400mg)，純度95％(HPLC)。1HNMR(300MHz，DMSO-d6，D2O交換)7.13-6.99(m，2H)，6.87-6.80(m，1H)，5.09(d，J＝7.8Hz，1H，β-異構(gòu)體)，4.77-4.58(m，1H)，4.19-4.12(m，1H)，3.93(m，1H)，3.40-2.87(9m，9H)，2.68-2.60(m，1H)，2.24-1.99(m，3H)，1.63-1.20(m，4H)；13C(75MHz，DMSO-d6)173.3，173.1，154.6，154.0，147.3，132.5，132.4，130.9，130.6，130.1，127.9，127.7，121.4，121.1，96.9，96.3，77.1，76.9，75.3，73.2，72.9，72.6，56.9，56.1，55.6，50.9，50.4，48.7，41.7，35.0，34.9，32.5，32.3，29.8，24.1；LC/MS(ESI)，m/z 449[M+H]+. 參考文獻(xiàn) 1.HPLC儀器Waters 2690 樣品制備向2mL乙腈中加入2-3滴反應(yīng)混合物，充分振搖得溶液并進(jìn)行HPLC分析。
HPLC條件 柱Alltima C18 3μm 7×53mm 柱溫25℃ 流動(dòng)相溶劑A＝1900mL H2O，100mL CH3CN，1mL H3PO4； 溶劑B＝1900mL CH3CN，100mL H2O，1mL H3PO4 表1W2690梯度表 UV215nm 注射體積10μL 2.最終純化M6的Biotage Flash-12(Horizon)法 流動(dòng)相 ACHCl3∶MeOH∶H2O(8∶2∶0.2) BCHCl3∶MeOH∶H2O(7∶3∶0.5) 經(jīng)柱體積表示的梯度(CV，120mL/CV) 2(CV)A 100％ 5(CV)A 100％→B100％ 3(CV)B 100％ 樣品載荷將1.2g M6粗品溶于8ml流動(dòng)相A中，并傾到入samplet中。
流速40mL/min UV254nm 餾份12mL/餾份，總計(jì)96份餾份 體外/體內(nèi)代謝產(chǎn)物研究 DCDQ是有效的5-HT2C激動(dòng)劑，在一些預(yù)測抗精神病活性的動(dòng)物模型中是有效的，具有非典型抗精神病特性。在這些模型中DCDQ的行為分布與非典型類抗精神病活性一致，并降低錐體外系副作用的易感性。5-HT2C激動(dòng)劑DCDQ還可以有效治療與精神分裂癥相關(guān)的心境障礙或認(rèn)知缺損。
在體內(nèi)和體外模型中確定了一些DCDQ的代謝產(chǎn)物。不限于所述途徑背后理論的限制，圖1-4表明了生成這些化合物的代謝途徑。[14C]DCDQ在小鼠、大鼠、犬和人肝微粒體，以及在冷藏保存的人肝細(xì)胞中的體外代謝 用來自雄性和雌性CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠、比格犬的肝微粒體和交叉性別混合的人肝微粒體，以及冷藏保存的男性人肝細(xì)胞培養(yǎng)來研究[14C]DCDQ的代謝。使用人肝微粒體，形成主要氧化代謝物M1和氨基甲?；咸擒账酠6的Km值分別為10.8和56.1μM。
在DCDQ的代謝中可見種屬差異。在肝微粒體培養(yǎng)中，氧化代謝是DCDQ的主要代謝途徑。DCDQ的一些羥基代謝物(M1、M2、M3和M4)在NADPH存在下可在人肝微粒體中檢出。在其它種屬中未檢出代謝物M1。代謝物M2和M3在犬和大鼠中也可見。代謝物M4也可以在大鼠中檢出，但是在小鼠和犬中未檢出。小鼠中的代謝似乎不如其它種屬廣泛，并且M2是小鼠肝微粒體中唯一可檢出的代謝產(chǎn)物。DCDQ亞胺(M5)的N-氧化物在犬和人中檢出，而在小鼠或大鼠肝微粒體中未檢出。在所有種屬的肝微粒體中DCDQ亞胺(P3)和現(xiàn)在仍不確定的產(chǎn)物P1和P2的形成是非NADPH-依賴性的，并需要進(jìn)一步研究。在小鼠、大鼠和犬微粒體的培養(yǎng)中未觀察到性別差異。
在UDPGA存在下，DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在犬和人中檢出，而在小鼠和大鼠肝微粒體中未檢出。盡管在NADPH和UDPGA存在下，羥基代謝產(chǎn)物的形成是人肝微粒體的主要代謝途徑，但是在人肝細(xì)胞中于50μM DCDQ濃度時(shí)氨基甲?；咸擒账崾侵饕拇x產(chǎn)物。
總之，在微粒體培養(yǎng)和人肝細(xì)胞中，DCDQ轉(zhuǎn)化為氧化代謝產(chǎn)物和氨基甲?；咸擒账?。
引言 本研究研究了在肝微粒體和人肝細(xì)胞中DCDQ的體外生物轉(zhuǎn)化。研究了細(xì)胞色素P450和UDP-葡萄糖苷酸基轉(zhuǎn)移酶的依賴途徑，并且DCDQ代謝產(chǎn)物經(jīng)LC/MS定性。
材料和方法 材料 [14C]DCDQ鹽酸鹽(批號L25073-42)由Wyeth Research(PearlRiver，NY)的放射合成小組合成。[14C]DCDQ的放射性化學(xué)純度為98.9％，且經(jīng)UV檢測的化學(xué)純?yōu)?9.9％。[14C]DCDQ的比活性為222.9μCi/mg(以鹽酸鹽計(jì))。[14C]DCDQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)以在14C標(biāo)記的位置表示。未標(biāo)記DCDQ鹽酸鹽(批號PB3312)化學(xué)純?yōu)?8.6％，由Wyeth Research(Pearl River，NY)合成。除另有說明外，當(dāng)提到DCDQ或[14C]DCDQ時(shí)，均假定為鹽酸鹽。

冷藏保存的人肝細(xì)胞、肝細(xì)胞混懸介質(zhì)和肝細(xì)胞培養(yǎng)基自In VitroTechnologies(Baltimore，MD)處獲得。肝細(xì)胞來自兩位男性個(gè)體(編號070，57歲及編號DRL，44歲)，經(jīng)In Vitro Technologies檢測，其睪酮6β-羥化酶活性分別為55和43pmol/106個(gè)細(xì)胞/min。下表2所列的CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠和比格犬的肝微粒體也自得InVitro Technologies。
表2 小鼠、大鼠和犬肝微粒體的特性 來自受試者3、6、15、17、18和19的人肝微粒體由得自IIAM(Exton，PA)的肝制備。由Dr.Andrew Parkinson制備上述微粒體并定性，描述于Parkinson A中。人肝微粒體的制備和定性，Wyeth-AyerstResearch GTR-25617，1994，通過引用并入本文。微粒體制品以250-500μL等份于約-70℃貯存至使用時(shí)。下表列出了本研究中所使用的人肝微粒體的特性。
表3 個(gè)體人肝微粒體的特性 Ultima Gold、Ultima Flo、Permafluor E+-閃爍雞尾酒和Carbo-SorbE二氧化碳吸收器購自Perkin Elmer(Wellesley，MA)。高效液相色譜(HPLC)級水和乙腈購自EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)。尿核苷5′-二磷酸葡糖醛酸三銨鹽(UDPGA)和EDTA購自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)。乙酸銨和氯化鎂購自MallinckrodtBaker Inc.(Phillipsburg，NJ)。所有其它試劑都是分析級或更高級別的。
方法 培養(yǎng)[14C]DCDQ和小鼠、大鼠、犬和人肝微粒體 [14C]DCDQ同非放射性標(biāo)記的DCDQ在培養(yǎng)基中混合(1∶3或1∶5)。微粒體培養(yǎng)基包括[14C]DCDQ、氯化鎂(10mM)和肝微粒體，后者在0.5mL 0.1M磷酸鉀緩沖液，pH7.4中培養(yǎng)。將[14C]DCDQ(20μL)水溶液加入含有緩沖液、氯化鎂溶液和微粒體的培養(yǎng)試管中。混合后，將試管在振搖的水浴中于37℃預(yù)溫育2分鐘。反應(yīng)自加入U(xiǎn)DPGA或NADPH再生系統(tǒng)開始。將UDPGA以20mM水溶液50μL等份加入培養(yǎng)基中，得到的終濃度為2mM。將NADPH再生系統(tǒng)(30μL)加入培養(yǎng)基中以評估CYP450介導(dǎo)的代謝。NADPH再生系統(tǒng)包括葡萄糖-6-磷酸(2mg/mL)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(0.8單位/mL)和NADP+(2mg/mL)。對照培養(yǎng)基在同樣的條件下進(jìn)行，除不加入NADPH再生系統(tǒng)、UDPGA或微粒體外。所有培養(yǎng)均一式兩份進(jìn)行。培養(yǎng)通過加入0.5mL冰冷的甲醇而停止。將樣品渦旋混合。變性蛋白通過4℃ 4300rpm離心10分鐘分離(T21型超速離心機(jī)，Sorvall)。蛋白片狀沉淀物用0.5mL甲醇提取。將各樣品的上清液合并，混合并在氮?dú)饬飨掠赯ymark TurboVap LV蒸發(fā)儀中(Caliper Life Science，Hopkinton，MA)蒸發(fā)至體積為約0.3mL。將濃縮的樣品離心，將各等份進(jìn)行放射性檢測，并經(jīng)HPLC分析。此方法從反應(yīng)混合物回復(fù)平均92.1％的放射性。
在NADPH或UDPGA存在下，測定了用人肝微粒體培養(yǎng)的DCDQ代謝的初始比例條件。培養(yǎng)時(shí)間曲線研究包含20μM[14C]DCDQ和0.5mg/mL微粒體蛋白，并在37℃培養(yǎng)伴溫和振搖0、5、10、20、30、40、50和60分鐘。蛋白依賴性研究用培養(yǎng)20分鐘的20μM[14C]DCDQ和0、0.1、0.25、0.5、0.75和1.0mg/mL微粒體蛋白進(jìn)行。
Km值用0.5mg/mL人肝微粒體測定，所述微粒體與[14C]DCDQ和NADPH再生系統(tǒng)培養(yǎng)20分鐘或和UDPGA培養(yǎng)10分鐘。使用的[14C]DCDQ的濃度為0.5、1、5、10、25、50、75和100μM。
為在細(xì)胞色素P450-和UGT-介導(dǎo)的代謝中評估種屬差異，將[14C]DCDQ和0.5mg/mL小鼠、大鼠、犬或人肝微粒體蛋白在NADPH再生系統(tǒng)或UDPGA存在下培養(yǎng)20分鐘。測定條件與上述條件相同，并且對于細(xì)胞色素P450-和UGT-介導(dǎo)的代謝，DCDQ濃度分別為12μM和56μM。
樣品通過放射性流檢測和LC/MS分析代謝產(chǎn)物。
人肝細(xì)胞制備 含有冷藏保存的人肝細(xì)胞的小瓶在37℃水浴中融化，并溫和振搖，至冰完全融解。將小瓶從水浴中取出，室溫下繼續(xù)溫和振搖30-60秒直至完全融化。將各小瓶中的肝細(xì)胞混懸液立即轉(zhuǎn)移至預(yù)先冷卻的50mL冰上的燒杯中。向各燒杯中逐滴加入12mL冰冷的肝細(xì)胞混懸介質(zhì)，歷經(jīng)1分鐘，并用手不時(shí)溫和振搖，以防止細(xì)胞沉降。將細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至15mL試管中，并于4℃ 100g力離心3min(T21型超速離心機(jī)，Sorvall)。棄去上清液，并將片狀沉淀重新懸浮于4mL冰冷的肝細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞混懸液含有約3.1×106活性肝細(xì)胞/mL。使用Trypan Blue排除和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定的平均活性為76.0％。
培養(yǎng)[14C]DCDQ和人肝細(xì)胞 細(xì)胞混懸液以1.0mL/孔的濃度分布于12-孔板中。使用來自2位供者的混合肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將[14C]DCDQ的水溶液以終濃度10或50μM加入肝細(xì)胞混懸液中。培養(yǎng)在充入了5％CO2的溫育器中于37℃進(jìn)行4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)通過加入200μL冷甲醇至各孔中停止。將各孔的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并聲處理30秒。與6mL甲醇渦旋混合并離心后，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中并在TurboVap蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至約0.5mL。殘余物經(jīng)HPLC和LC/MS分析。
HPLC分析 裝有自動(dòng)采樣器的Waters 2690型HPLC系統(tǒng)(Waters Corp.，Milford，MA)用于分析。分離在配有筒式濾器(4×2mm)的PhenomenexLuna C18(2)柱(2×150mm，5μm)(Phenomenex，Torrance，CA)上完成?？烧{(diào)波長UV檢測器設(shè)置為250nm檢測，且?guī)в?50μL LQTR流動(dòng)池的Flo-One β型A525放射性流量探測儀(Perkin Elmer)用來獲取數(shù)據(jù)。Ultima Flow M閃爍液的流速為1mL/min，條件是閃爍雞尾酒和流動(dòng)相的混合比率為5∶1。自動(dòng)采樣器的樣品室維持在4℃，而柱溫為室溫，約20℃。流動(dòng)相包括10mM乙酸銨，pH4.5(A)和甲醇(B)，并以0.2mL/min流出。線性梯度條件如下 表4 液相色譜法/質(zhì)譜法 Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)包括自動(dòng)采樣器和二極管陣列UV檢測器，用于LC/MS分析。UV檢測器設(shè)置為200-400nm檢測。對于選擇性LC/MS分析，使用裝配有固態(tài)閃爍流動(dòng)池的β-Ram 3型放射性流量探測儀(IN/US Systems Inc.，Tampa，F(xiàn)L)來獲取放射性色譜圖。在與如上所述相同的條件下，分離在Phenomenex Luna C18(2)柱(2×150mm，5μm)上完成。
用于代謝產(chǎn)物定性的質(zhì)譜儀為Micromass Q-TOF-2極時(shí)間-飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀(Nature Corp.)。所述質(zhì)譜儀配有電噴射離子化(ESI)接口，并且以陽離子模式操作。碰撞能量設(shè)置為5和30eV，分別用于所有MS和MS/MS掃描。質(zhì)譜儀的設(shè)置列于下表中。
表5 數(shù)據(jù)分析 使用Flo-One分析軟件(Perkin Elmer，version 3.6)積分放射性峰。計(jì)算機(jī)程序Microsoft Excel97用于計(jì)算平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并用于進(jìn)行t檢驗(yàn)。Micromass MassLynx軟件(Waters，4.0版)用于收集和分析LC/MS數(shù)據(jù)。
結(jié)果 測定人肝微粒體Km值 測定人肝微粒體中的初始比例條件和由[14C]DCDQ形成的代謝產(chǎn)物的Km值。在時(shí)間-依賴性研究中，形成主要氧化代謝物(M1、M2、M3和M4)的NADPH-依賴性在20分鐘內(nèi)是線性的，并且形成氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)在10分鐘內(nèi)是線性的(數(shù)據(jù)未列出)。在蛋白-依賴性研究中，氧化代謝和氨基甲?；咸擒账嵝问街敝?.5mg/mL微粒體蛋白都是線性的。在人肝微粒體中，主要氧化代謝物M1和氨基甲酰基葡糖苷酸M6形成的Km值分別是10.8和56.1μM。在人肝微粒體中，代謝物M2、M3和M4形成的Km值為8.9～13.8μM。人肝微粒體中，代謝物M5形成的Km值是36.2μM。
[14C]DCDQ通過小鼠、大鼠、犬和人肝微粒體的代謝 對于微粒體培養(yǎng)中的種屬比較，P450-和UGT-介導(dǎo)的代謝的DCDQ濃度分別為12和56μM，該值約與Km值相當(dāng)。在NADPH再生系統(tǒng)存在下，四個(gè)羥基代謝物(M1、M2、M3和M4)用人肝微粒體檢測。代謝物M1在其它種屬中未檢出。代謝物M2和M3用犬和大鼠可觀察到。代謝物M4也可在大鼠中檢出，但在小鼠或犬中未檢出。小鼠似乎沒有其它種屬的代謝廣泛，并且M2是小鼠肝微粒體中唯一可檢出的代謝物。DCDQ亞胺的N-氧化物(M5)在犬和人中檢出，而在小鼠或大鼠中未檢出。三個(gè)其它的峰(P1、P2和DCDQ亞胺P3)也可見于微粒體培養(yǎng)物中。P1、P2和P3的形成不是NADPH-依賴性的。由于這些產(chǎn)物在未加微粒體的對照培養(yǎng)基中未形成(數(shù)據(jù)未列出)，所以它們的形成可以經(jīng)非P450-酶催化。
在UDPGA存在下，DCDQ氨基甲?；咸擒账岬男纬煽稍谌腿烁挝⒘ｓw中檢出，而在小鼠或大鼠中未檢出。當(dāng)DCDQ(20μM)在NADPH和UDPGA都存在下用人肝微粒體培養(yǎng)時(shí)，形成羥基代謝物是主要的代謝途徑，并且僅有少量氨基甲酰基葡糖苷酸被檢出。在小鼠、大鼠和犬的微粒體培養(yǎng)中未觀察到性別差異。
[14C]DCDQ通過人肝細(xì)胞的代謝 當(dāng)DCDQ用人肝細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，DCDQ濃度為50μM時(shí)氨基甲?；咸擒账?M6)是最主要的代謝產(chǎn)物。在DCDQ濃度為50μM時(shí)，也可觀察到氧化代謝產(chǎn)物，盡管相對于氨基甲酰基葡糖苷酸其量較少。含有10μM DCDQ的人肝微粒體培養(yǎng)產(chǎn)生氧化代謝產(chǎn)物，其量接近于氨基甲?；咸擒账?。除在人微粒體培養(yǎng)中形成的代謝物外，還可檢出另一種代謝產(chǎn)物(M7)。在微粒體中形成的DCDQ亞胺(p3)也可以在肝細(xì)胞培養(yǎng)中觀察到。
代謝物經(jīng)LC/MS分析定性 經(jīng)LC/MS和LC/MS/MS分析得到DCDQ及其代謝物的質(zhì)譜。這些化合物的結(jié)構(gòu)確證概括于表6中。
表6 經(jīng)肝微粒體和肝細(xì)胞代謝生成的Dcdq代謝產(chǎn)物 在各研究進(jìn)行的DCDQ及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜定性在下文進(jìn)一步討論。
討論 在DCDQ的代謝中可見種屬差異。在肝微粒體培養(yǎng)中，氧化代謝是DCQ的主要代謝途徑。在NADPH存在下，DCDQ的一些羥基代謝物(M1、M2、M3和M4)可在人肝微粒體中檢出(圖1)。代謝物M2和M3也可在犬和大鼠肝微粒體中觀察到。小鼠沒有其它種屬的代謝廣泛，且M2是小鼠肝微粒體中唯一可檢出的代謝產(chǎn)物。DCDQ亞胺的N-氧化物(M5)可在犬和人微粒體培養(yǎng)基中檢出，而在小鼠或大鼠肝微粒體中未檢出。在UDPGA存在下，DCDQ的氨基甲?；咸擒账?M6)在犬和人中檢出，而在小鼠或大鼠中未檢出。氨基甲?；咸擒账酠6是人肝細(xì)胞中DCDQ濃度50μM時(shí)的主要代謝產(chǎn)物，而羥基代謝物是NADPH和UDPGA二者都存在時(shí)人肝微粒體中的主要代謝途徑。除P450外的酶系統(tǒng)也可以通過形成DCDQ亞胺(P3)和其它產(chǎn)物(P1和P2)促進(jìn)DCDQ代謝。產(chǎn)物P1、P2和P3的形成是非NADPH-依賴性的，并需要進(jìn)一步研究，因?yàn)樗鼈兺ǔ４嬖谟谒懈挝⒘ｓw和肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在小鼠、大鼠或犬的微粒體培養(yǎng)基中未觀察到性別差異。
總之，在微粒體培養(yǎng)基和人肝細(xì)胞中DCDQ轉(zhuǎn)化為氧化代謝產(chǎn)物和氨基甲?；咸擒账?。
單劑量(5mg/kg)口服灌胃給藥后，[14C]DCDQ在雄性和雌性SD大鼠中的體內(nèi)代謝 概要 本研究研究了單劑量口服給藥(5mg/kg)后，[14C]DCDQ在雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠的體內(nèi)代謝。給藥后2、4、8和24小時(shí)從雄性大鼠及給藥后2和8小時(shí)從雌性大鼠采集血液、血漿和腦。給藥后0-8和8-24小時(shí)間隔從雄性大鼠收集尿液和糞便。
在雄性大鼠中，在給藥后2、4、8和24小時(shí)，血漿放射性濃度分別為632±144、659±16.5、465±43.1和46.9±8.30ng當(dāng)量/mL。對于雌性大鼠，給藥后2小時(shí)，平均血漿放射性濃度為658±189ng當(dāng)量/mL，與雄性大鼠相似，而給藥后8小時(shí)的平均血漿放射性濃度為338±60.7ng當(dāng)量/mL，低于雄性大鼠。給藥后2-8小時(shí)的平均血液/血漿比值為約1.1，表明DCDQ及其代謝產(chǎn)物有限分配進(jìn)入血細(xì)胞。
給藥后2-8小時(shí)DCDQ代表平均13％-20％血漿放射性。由于放射性濃度較低，未分析24小時(shí)血漿樣品曲線。代謝物曲線的變化隨時(shí)間不明顯。在血漿中檢出的代謝物包括羥基DCDQ代謝物(M1、M2、M3、M4和M10)、酮類DCDQ(M7)以及II相代謝產(chǎn)物DCDQ氨基磺酸酯(M12)、二脫氫DCDQ氨基磺酸酯(M14)、羥基DCDQ硫酸酯(M8和M13)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)以及乙?；u基DCDQ(M11)。血漿代謝產(chǎn)物特征出現(xiàn)性別相關(guān)性差異。在雌性大鼠中，羥基DCDQ代謝物(M3)、羥基DCDQ硫酸酯(M8)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和DCDQ氨基磺酸酯(M12)是主要的代謝產(chǎn)物，而在雄性大鼠血漿中，羥基DCDQ代謝物(M1、M2和M3)、酮類DCDQ(M7)和羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)是主要代謝產(chǎn)物。主要的性別差異是在硫酸酯或氨基磺酸酯的形成中。
尿排泄是口服給予DCDQ的主要消除途徑，為給藥量的66.7％。在血漿樣品中觀察到的主要代謝產(chǎn)物在尿液中也被檢出，其中DCDQ的量低于給藥量的1％。在尿液中羥基代謝物(M1和M3)、酮類DCDQ(M7)及葡糖苷酸(M9)是主要的代謝產(chǎn)物。給藥量活性平均21.1％在糞便中回復(fù)。在雄性大鼠糞便中可檢出代謝產(chǎn)物M3、M8、M9、M10、M11和僅有痕量的DCDQ。
給藥后2、4和8小時(shí)，腦組織中的放射性明顯高于血漿中的。給藥后2、4、8和24小時(shí)，雄性大鼠腦部的放射性濃度分別為5.12±1.28、4.94±0.44、3.25±0.99和0.037±0.002μg當(dāng)量/g組織，而雌性大鼠給藥后2和8小時(shí)的濃度分別為6.38±2.22和2.85±0.68μg當(dāng)量/g組織。給藥后2-8小時(shí)平均腦/血漿的放射性比率為6.9-9.6，表明被腦組織顯著吸收。給藥后24小時(shí)，平均腦/血漿放射性比率降低至0.8。給藥后2-8小時(shí)，對于雄性和雌性大鼠DCDQ表示有平均超過腦放射性的90％。根據(jù)腦放射性的放射性濃度和色譜分配，估算平均腦/血漿的DCDQ比率為49.9-56.1。給藥后2-8小時(shí)，隨時(shí)間沒有明顯的性別差異或改變。在雄性或雌性大鼠腦中僅檢出少量代謝產(chǎn)物M1、M3、M7、M10和M11。上述數(shù)據(jù)表明DCDQ很容易穿過血腦屏障，而吸收進(jìn)入腦組織的代謝產(chǎn)物是有限的。腦/血漿放射性比率也表明從腦部的清除在給藥后8小時(shí)快速發(fā)生，因?yàn)楸嚷试诮o藥后24小時(shí)從6.9降至0.8。
總之，DCDQ在大鼠中廣泛代謝為主要氧化產(chǎn)物。對于DCDQ及其氧化代謝物的硫酸酯和氨基磺酸酯綴合物，雄性和雌性大鼠的血漿曲線不同。在腦中，DCDQ是相關(guān)成分的主要藥物，而僅檢出少量代謝產(chǎn)物，并且性別差異不明顯。DCDQ很容易穿過血腦屏障，而代謝產(chǎn)物的吸收受限于少量的氧化代謝物。
引言 以前的質(zhì)量平衡研究顯示在大鼠中尿液是主要的排泄途徑，在尿液中給藥量放射性回復(fù)平均為64.3％。肝微粒體的體外研就顯示氧化代謝是大鼠中DCDQ的主要代謝途徑。(Iwasaki K，Shiraga T，TadaK，Noda K，Noguchi H.Age-and sex-related changes in aminesulphoconjugation in Sprague-Dawley strain rats.Comparison withphenol and alcohol sulphoconjugations.Xenobiotica.1986；16717-723.)。本研究研究了大鼠中單劑量口服給予5mg/kg后[14C]DCDQ的代謝。
材料和方法 材料 [14C]DCDQ鹽酸鹽由Wyeth Research(Pearl River，NY)的放射合成小組合成，如在上文討論的體外研究中所述。Ultima Gold、UltimaFlo、Permafluor E+-閃爍雞尾酒和Carbo-Sorb E二氧化碳吸收器購自Perkin Elmer(Wellesley，MA)。聚山梨醇酯80得自Mallinckrodt Baker(Phillipsburg，NJ)，以及甲基纖維素來自Sigma-Aldrich(Milwaukee，Wl)。提取用和色譜分析用溶劑是HPLC或ACS試劑級的，來自EMDChemicals(Gibbstown，NJ)。
方法 藥物給予和標(biāo)本收集 劑量配制、動(dòng)物給藥和標(biāo)本收集在Wyeth Research，Collegeville，PA進(jìn)行。藥物賦形劑包含2％(w/w)吐溫80和0.5％甲基纖維素的水溶液。給藥當(dāng)天，[14C]DCDQ(12.2mg)和未標(biāo)記的DCDQ(36.5mg)溶于賦形劑中以使終濃度為約2mg/mL。
給藥時(shí)，雄性大鼠體重為218-345g，雌性大鼠為227-255g，均購自Charles River Laboratories，Wilmington，MA。未禁食大鼠通過灌胃法一次性給予5mg/kg(～300μCi/kg)DCDQ，體積為2.5mL/kg。給予動(dòng)物Purina大鼠飼料，任意飲水，并分開關(guān)在代謝籠中。雄性大鼠在給藥后2、4、8和24小時(shí)處死。雌性大鼠在給藥后2和8小時(shí)處死。
處死時(shí)，經(jīng)心臟穿刺將血樣收集于含有EDTA(作為抗凝血?jiǎng)?的試管中，并將其置于冰上。取出50μL等份用于氧化并測定放射性含量。將剩余的血液于4℃離心立即得到血漿。用50mL已冷凍的無菌鹽水灌注后，分離腦。給藥后在0-8和8-24小時(shí)間隔在干冰上收集尿樣。給藥后在0-8和8-24小時(shí)間隔于室溫收集糞便，并如前所述制成勻漿。生物標(biāo)本和給藥前后的藥物溶液貯存于約-70℃至分析時(shí)。
放射性測定 血漿(20μL)和尿液(50μL)等份用于分析放射性濃度。用Tri-Carb 3100型TR/LL液體閃爍計(jì)數(shù)器(LSC)(Perkin Elmer)，使用10mL Ultima Gold作為閃爍液，測定藥物、血漿和尿液的放射性。
腦和糞便樣品稱重，并以體重/重量比率分別約為1∶1和5∶1在水中均質(zhì)化。將血液等份(50μL)、腦勻漿(0.1g)和糞便勻漿(0.2g)置于帶有Combusto-墊的Combusto-cone中并氧化。307型Tri-Carb樣品氧化器，配有Oximate-80自動(dòng)取樣器(Perkin Elmer)，用于氧化。釋放的14CO2吸收入Carbo-Sorb E二氧化碳吸收器中，與PermaFluorE+液體閃爍雞尾酒混合，并用Tri-Carb 3100型TR/LL液體閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)計(jì)數(shù)。此氧化劑的氧化效率為98.2％。
帶有250μL LQTR流動(dòng)池的Flo-One β型A525放射性檢測器(Perkin Elmer)用于HPLC的線內(nèi)放射性檢測。Ultima Flow M閃爍液的流速為1mL/min，條件是閃爍雞尾酒/流動(dòng)相的混合比率為5∶1。檢測限為約1ng當(dāng)量/g腦、2ng當(dāng)量/mL血漿、5ng當(dāng)量/g糞便和10ng當(dāng)量/mL尿液。
劑量分析 給藥前后的溶液等份用25％甲醇水溶液稀釋，并如上所述分析放射性濃度。在10μL稀釋液中的約100,000DPM經(jīng)HPLC分析放射性純度和化學(xué)純度。為測定藥物混懸液的比活性，非放射性標(biāo)記的DCDQ溶于甲醇中，用25％甲醇水溶液稀釋，同時(shí)經(jīng)HPLC分析以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋的藥物溶液等份(10μL)注入HPLC柱中，UV檢測后以1分鐘的間隔收集餾份。測定各餾份中的放射性。還收集空白注射的餾份以得到放射性的背景水平。
血漿代謝產(chǎn)物特征 經(jīng)HPLC分析血漿樣品以得到代謝產(chǎn)物。1.5mL血漿等份與3.0mL甲醇混合，置于冰上約10分鐘，然后離心。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中。蛋白片狀沉淀用3.0mL甲醇提取一次。將來自沉淀和提取后的各樣本的上清液合并、混合，并在氮?dú)庀掠?2℃在Zymark TurboVapLV(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)中蒸發(fā)至約0.3mL。將濃縮的提取物離心，測定上清液體積，并通過分析一式兩份10μL等份的放射性測定提取效率。上清液(50-200μL)等份用帶有放射性流檢測器的HPLC分析。血漿提取物也經(jīng)LC/MS分析。
分析糞便和尿液 糞便勻漿用于分析代謝產(chǎn)物。糞便勻漿1g等份與2mL甲醇混合，置于冰上約10分鐘并離心。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中。殘余物用2mL水∶甲醇(3∶7)混合物提取三次。將各樣本的上清液合并，蒸發(fā)至約1mL，并離心。通過分析10μL上清液等份的放射性來測定提取效率。上清液(50-200μL)等份用帶有放射性流檢測器的HPLC分析特征。樣本也用LC/MS分析以定性放射性峰。
通過直接注入HPLC柱中分析尿液的放射性濃度及分析代謝產(chǎn)物特征。也用尿樣進(jìn)行代謝產(chǎn)物鑒別的LC/MS分析。
腦中的代謝產(chǎn)物特征 腦勻漿用于分析代謝產(chǎn)物特征。1g腦勻漿等份與等體積甲醇混合，置于冰上約10分鐘并離心。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中。殘余物用1mL甲醇提取三次。將各樣本的上清液合并，蒸發(fā)至約0.5mL，并離心。通過分析10μL上清液等份的放射性測定提取效率。上清液(100-200μL)等份用帶有放射性流檢測器的HPLC分析特征。樣本也用LC/MS分析以定性放射性峰。
高效液相色譜法 帶有自動(dòng)采樣器的Waters 2690型HPLC系統(tǒng)(Waters Corp.，Milford，MA)用于分析。分離在Phenomenex Luna C18(2)柱(150×2.0mm，5μm)(Phenomenex，Torrance，CA)上完成。自動(dòng)采樣器的樣品室維持在4℃，而柱為室溫約20℃?？烧{(diào)波長UV檢測器設(shè)置為250nm檢測，且上述Flo-One β型A525放射性檢測器用于獲取數(shù)據(jù)。HPLC流動(dòng)相包括10mM乙酸銨，pH 4.5(A)和甲醇(B)，并以0.2mL/min流出。色譜條件A用于藥物分析，而條件B用于分析尿液和血漿，腦和糞便提取物。
表7 條件A 條件B LC/MS分析 Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，Wilmington，DE)包括自動(dòng)采樣器和二極管陣列UV檢測器，用于血樣和尿樣的LC/MS分析。UV檢測器設(shè)置為200-400nm檢測。對于選擇性LC/MS分析，使用裝配有固態(tài)閃爍流動(dòng)池的β-Ram 3型放射性流量探測儀(IN/US Systems Inc.，Tampa，F(xiàn)L)來獲取放射性色譜圖。糞便樣本也使用Waters Alliance 2690型HPLC系統(tǒng)分析。其裝配有內(nèi)置自動(dòng)采樣器和設(shè)置為210-350nm的996型二極管陣列UV檢測器。在Radiomatic 150TR型流量閃爍分析儀(Perkin Elmer)和質(zhì)譜儀之間分裂HPLC流。其它HPLC條件與上述條件B相同。
用于血漿和尿液代謝產(chǎn)物定性的質(zhì)譜儀為Micromass Q-TOF-2四極時(shí)間-飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters)。所述質(zhì)譜儀配有電噴射離子化(ESI)接口，并且以陽離子模式操作。碰撞能量設(shè)置為5和30eV，分別用于所有MS和MS/MS掃描。質(zhì)譜儀的設(shè)置列于下表中。
表8 Micromass Quattro Micro質(zhì)譜儀(Waters)也用于分析糞便樣品。其裝配有電噴射離子化(ESI)接口，并且以陽離子模式操作。質(zhì)譜儀的設(shè)置列于下表中。
表9 在選擇性反應(yīng)-監(jiān)測(SRM)模式(LC/SRM)中的LC/MS/MS用三聯(lián)四極質(zhì)譜儀進(jìn)行以監(jiān)測糞便樣本中的DCDQ及其代謝產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化監(jiān)測列于下表中。
表10 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)評估 使用Flo-One分析軟件(Packard，version 3.6)積分放射性峰。計(jì)算機(jī)程序Microsoft Excel97用于計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并用于進(jìn)行t檢驗(yàn)。Micromass MassLynx軟件(Waters，4.0版)用于收集和分析LC/MS數(shù)據(jù)。
結(jié)果 藥物分析 藥物溶液中[14C]DCDQ的放射性化學(xué)純度和估算的化學(xué)純度(經(jīng)紫外檢測)分別為99.0±0.3％和99.6±0.1％。給藥前后的等份具有相同的純度。藥物溶液中[14C]DCDQ的比活性為48.2μCi/mg(以鹽酸鹽計(jì))。平均藥物濃度為2.48mg/mL(以鹽酸鹽計(jì))或2.14mg/mL(以游離堿計(jì))。DCDQ給予的實(shí)際劑量為5.2-5.4mg/kg(以游離堿計(jì))或6.1-6.3mg/kg(以鹽酸鹽計(jì))。
血漿放射性濃度和代謝產(chǎn)物特性 單劑量口服給予[14C]DCDQ后血液和血漿中的放射性濃度概括于表11中。
表11 單劑量口服給予大鼠[14C]DCDQ 5Mg/Kg后放射性的血液和血漿濃度(ng當(dāng)量/mL) ＊8小時(shí)時(shí)明顯低于雄性，p＜0.05 在雄性大鼠中，給藥后2、4、8和24小時(shí)，平均血漿放射性濃度分別為632、659、465和46.9ng當(dāng)量/mL。雌性大鼠中，給藥后2小時(shí)，平均血漿放射性濃度為658ng當(dāng)量/mL，與雄性大鼠相似，而給藥后8小時(shí)的平均血漿放射性濃度為338ng當(dāng)量/mL，明顯低于雄性大鼠。所有時(shí)間點(diǎn)，血液樣品的放射性濃度稍高于血漿樣品。平均血液/血漿放射性比率是約1.1(雄性和雌性大鼠給藥后2、4和8小時(shí))～約1.5(雄性大鼠給藥后24小時(shí))，表明DCDQ或其代謝產(chǎn)物分布進(jìn)入血細(xì)胞是有限的(表12)。
表12 單劑量口服給予大鼠[14C]DCDQ 5Mg/Kg后血液/血漿的放射性比率 由2、4和8小時(shí)樣品，血漿提取物含有平均82-96％總血漿放射性。由于放射性濃度較低，未獲得24小時(shí)血漿樣本的代謝產(chǎn)物特征。DCDQ在大鼠中被廣泛代謝。母體藥物表示在血漿提取物中平均13-20％總放射性，在雄性和雌性之間或隨時(shí)間無明顯差異(表13和14)。一些羥基DCDQ代謝物(M1、M2、M3、M4和M10)和酮類DCDQ(M7)可在血漿中檢出(圖1)。血漿中可觀察到的II相代謝產(chǎn)物包括DCDQ氨基磺酸酯(M12，僅在雌性血漿中是主要的)、二脫氫DCDQ氨基磺酸酯(M14，僅在雌性血漿中是主要的)、羥基DCDQ硫酸酯(M8和M13)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙?；u基DCDQ(M11)(圖1)。血漿放射性的分配百分比不隨時(shí)間明顯變化，除代謝物M8外，其在給藥后8小時(shí)明顯較低。在雄性大鼠中，代謝物M1、M2、M3、M7和M9是主要的代謝產(chǎn)物，而在雌性大鼠中M3、M8、M9和M12是主要代謝產(chǎn)物，表明在代謝產(chǎn)物特征中的性別差異(表13和14)。許多在血漿提取物中檢出的相對少量的代謝產(chǎn)物未被定性，盡管當(dāng)合并時(shí)代表了19-38％的血漿放射性。根據(jù)分配百分比各代謝產(chǎn)物的血漿濃度列于表4中。DCDQ的濃度通常等于或超過雄性和雌性大鼠血漿中各代謝產(chǎn)物的濃度。在雄性大鼠中，代謝產(chǎn)物M1、M3+M9和M7呈現(xiàn)最高濃度，而在雌性大鼠中，代謝產(chǎn)物M3+M9和M8是較主要的代謝產(chǎn)物。
表13 口服給予[14C]DCDQ(5mg/kg)后，大鼠血漿中放射性的色譜分布(％) a包括10個(gè)以上其它未確定的量少的代謝產(chǎn)物 d明顯不同于雄性，p＜0.01 b標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3) e明顯不同于雄性，p＜0.05 cBOL，定量限(2ng當(dāng)量/mL血漿)下 表14 口服給予[14C]DCDQ(5mg/kg)a后大鼠中DCDQ及代謝產(chǎn)物的估算的血漿濃度(Ng當(dāng)量/M1) a根據(jù)總血漿放射性濃度(表14)和血漿放射性的 d明顯不同于雄性，p＜0.01 分配百分比(表13)估算濃度e明顯不同于雄性，p＜0.05 b標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3) cBOL，定量限(2ng當(dāng)量/mL血漿)下 尿液排泄和代謝產(chǎn)物特性 尿液是排泄的主要途徑，給藥后的第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)在尿樣中，有66.7±5.0％的放射性藥物回復(fù)，0-8小時(shí)期間有32.5％，以及在8-24小時(shí)期間有34.2％。多數(shù)主要血漿代謝產(chǎn)物也在尿液中檢出(表15)。雄性大鼠尿液中的主要代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ代謝物(M1、M2、M3和M4)、酮類DCDQ(M7)和羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)(表15)。0-24小時(shí)內(nèi)尿液的各代謝產(chǎn)物代表約2-16％的給藥量(表16)，而DCDQ代表低于給藥量的1％。0-8小時(shí)和8-24小時(shí)收集的樣本中，代謝產(chǎn)物的分布相似。
表15 口服給予[14C]DCDQ(5mg/kg)后，雄性大鼠尿液中放射性的色譜分布(％) a至少10個(gè)另外的量少的代謝產(chǎn)物 b標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3) 表16 口服給予[14C]DCDQ(5mg/kg)后，大鼠中尿液代謝產(chǎn)物的劑量百分比 a標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3) 糞便排泄和代謝產(chǎn)物特征 在雄性大鼠給藥后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)糞便消除為21.1±2.1％給藥量放射性回復(fù)。8-24小時(shí)糞便樣本的提取效率為64.3％，而在對照糞便勻漿中平均89.5％的放射性是從[14C]DCDQ的培養(yǎng)中提取的。羥基DCDQ代謝物(M3和M4)、羥基DCDQ硫酸酯(M8)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙酰化羥基DCDQ(M11)在8-24小時(shí)糞便提取中是主要代謝產(chǎn)物，而僅檢出痕量母體藥物。因?yàn)槠浞派湫缘?低于給藥量放射性的0.1％)，未獲得0-8小時(shí)糞便樣本中的代謝產(chǎn)物特征。糞便勻漿中的[14C]DCDQ于37℃培養(yǎng)24小時(shí)顯示無可檢出的降解。腦中的放射性含量和代謝產(chǎn)物特征 腦組織中平均84.5％的放射性被提取。給藥后8小時(shí)，腦放射性濃度較血漿高，并且DCDQ在大鼠腦中是主要的藥物相關(guān)性成分。雄性大鼠給藥后2、4和8小時(shí)在腦提取物中，DCDQ表示平均超過90％的放射性，并且雌性大鼠給藥后2和8小時(shí)超過94％(表17)。雄性和雌性大鼠腦中的平均放射性濃度是相似的，且從2小時(shí)(雄性和雌性大鼠分別為5.1和6.4μg當(dāng)量/g)到8小時(shí)(雄性和雌性大鼠分別為3.2和2.8μg當(dāng)量/g)僅輕度降低。24小時(shí)時(shí)，雄性大鼠腦濃度為平均0.04μg當(dāng)量/g，較血漿中低。給藥后2-8小時(shí)平均腦/血漿放射性比率雄性大鼠為6.9-8.2，雌性大鼠為8.7-9.6，且24小時(shí)雄性大鼠的降低至0.8。雄性和雌性大鼠的腦放射含量或腦/血漿放射性比率沒有明顯差異。腦/血漿DCDQ比率較放射性比率高得多(表17)。平均腦/血漿DCDQ比率為49.9-56.1，不取決于時(shí)間或性別。在雄性和雌性大鼠腦中僅檢出少量代謝產(chǎn)物M7、M10和M11，并且各代謝產(chǎn)物表示平均低于4.5％的腦放射性。另外兩個(gè)量少的代謝產(chǎn)物(M1和M3)在雄性大鼠腦中可見。給藥后8小時(shí)，多數(shù)代謝產(chǎn)物檢測不出，且僅可見DCDQ。
表17 口服給予大鼠[14C]DCDQ(5mg/kg)后，相對于血漿濃度，腦中放射性和DCDQ的濃度a a數(shù)據(jù)用平均值±SD表示，N＝3 bDCDQ濃度根據(jù)腦中的總放射性濃度和腦放射性分布百分比估算。
c數(shù)據(jù)未得到，濃度低于特征水平 經(jīng)LC/MS分析定性代謝產(chǎn)物 經(jīng)LC/MS和LC/MS/MS分析DCDQ及其代謝產(chǎn)物獲得質(zhì)譜。這些化合物的結(jié)構(gòu)定性概括于表18中。DCDQ及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜定性與本文中所述的其它研究的定性在下文討論。
表18 經(jīng)LC/MS分析大鼠中Dcdq的代謝產(chǎn)物 aLC/MS保留時(shí)間被標(biāo)準(zhǔn)化為LC/MS數(shù)據(jù)文件GU_071803_0003和GU_081303_0002。
bP＝血漿；U＝尿液；B＝腦；F＝糞便。糞便代謝產(chǎn)物通過選擇性反應(yīng)監(jiān)測檢測。
討論 單劑量口服給予5mg/kg后，DCDQ在大鼠中被廣泛代謝，并且氧化代謝是主要的代謝途徑。DCDQ表示給藥后2-8小時(shí)有平均13-20％血漿放射性，并且在給藥后0-8和8-24小時(shí)總計(jì)有低于2％的尿液放射性。血漿中可見的代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ代謝物(M1、M2、M3、M4和M10)，酮類DCDQ(M7)和II相代謝產(chǎn)物如DCDQ氨基磺酸酯(M12)、二脫氫DCDQ氨基磺酸酯(M14)、羥基DCDQ硫酸酯(M8和M13)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙?；u基DCDQ(M11)(圖1)。血漿中放射性的分布百分?jǐn)?shù)不隨時(shí)間而明顯改變，除代謝產(chǎn)物M8外，其在給藥后8小時(shí)較2和4小時(shí)明顯降低。血漿代謝產(chǎn)物分布在雄性和雌性大鼠中出現(xiàn)差異。在雌性大鼠中羥基DCDQ代謝物(M3)、羥基DCDQ硫酸酯(M8)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和DCDQ氨基磺酸酯(M12)是主要的代謝產(chǎn)物，而在雄性大鼠血漿中羥基DCDQ代謝物(M1、M2和M3)、酮類DCDQ(M7)和羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)是主要的代謝產(chǎn)物。主要的性別差異是在硫酸酯或氨基磺酸酯的形成中。這些性別差異是可預(yù)測的，因?yàn)橐延袌?bào)道稱硫轉(zhuǎn)移酶對乙醇和脂環(huán)族胺的活性在雌性大鼠中較雄性大鼠中明顯升高。(Naritomi Y，Niwa T，Shiraga T，Iwasaki K，Noda K.Isolationand characterization of an alicyclic amine N-sulfotransferase fromfemale rat liver.Biological & Pharmaceutical Bulletin.1994；71008-1011.) 多數(shù)主要血漿代謝物還可在尿液中檢出。0-8小時(shí)和8-24小時(shí)尿樣獲得相似的分布。雄性大鼠尿液中的主要代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ代謝產(chǎn)物(M1、M2、M3和M4)、酮類DCDQ(M7)和羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)。0-24小時(shí)尿液中各分別的代謝產(chǎn)物代表約用藥量的2-16％，而DCDQ代表少于1％的劑量。8-24小時(shí)的糞便樣本中，羥基DCDQ代謝產(chǎn)物(M3和M4)、羥基DCDQ硫酸酯(M8)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和乙?；u基DCDQ(M11)是可觀察到的主要代謝產(chǎn)物，僅有痕量母體藥物可檢出。
給藥后2、4和8小時(shí)，腦組織中的放射性明顯高于血漿中的。DCDQ說明雄性和雌性大鼠有平均高于90％的腦活性。給藥后2-8小時(shí)平均腦/血漿放射性比率為6.9-9.6，表示被腦組織吸收。給藥后24小時(shí)，平均腦/血漿放射性比率降低至0.8。雄性和雌性大鼠之間，腦放射性含量或腦/血漿放射性比率沒有明顯差異。平均腦/血漿DCDQ比率為49.9-56.1，沒有性別差異或給藥后2-8小時(shí)不隨時(shí)間變化。在雄性和雌性大鼠腦中檢出少量代謝產(chǎn)物M7、M10和M11。這些數(shù)據(jù)表明DCDQ很容易通過血腦屏障，而吸收進(jìn)入腦組織的代謝產(chǎn)物是有限的。腦/血漿放射性比率也表明給藥后8小時(shí)很容易發(fā)生從腦中的清除，因?yàn)榻o藥后24小時(shí)比率從6.9降至0.8。盡管放射性分配進(jìn)入腦中是明顯的，但是分配進(jìn)入血細(xì)胞是有限的，給藥后2-8小時(shí)的血液/血漿比率僅為約1.1。
相對于前面的大鼠肝微粒體體外研究，本研究中DCDQ的代謝似乎更廣泛。大鼠肝微粒體研究中僅可觀察到三種氧化代謝產(chǎn)物(M2、M3和M4)，并且未見性別差異。但是，在大鼠中可見的硫酸酯和氨基磺酸酯形成的性別差異在任何體外系統(tǒng)中均未觀察到。除用大鼠肝微粒體可檢出的代謝產(chǎn)物M2、M3和M4外，在大鼠中還觀察到其它氧化代謝產(chǎn)物(M1、M7和M10)及一些II相代謝產(chǎn)物(M8、M11、M12、M13和M14)(圖1)。
總之，DCDQ在大鼠中廣泛代謝為主要的氧化代謝產(chǎn)物。雄性和雌性大鼠中血漿分布的差異在于DCDQ和一些氧化代謝物的硫酸酯和氨基磺酸酯綴合物。DCDQ是腦中與組分相關(guān)的主要藥物，盡管僅可觀察到少量代謝產(chǎn)物，并且性別差異并不明顯。DCDQ很容易穿過血腦屏障，而代謝產(chǎn)物的吸收受限于少量的氧化代謝物。
單劑量(15mg/kg)口服給予膠囊后， [14C]DCDQ在雄性犬中的體內(nèi)代謝 概要 本研究研究了單劑量給予[14C]DCDQ鹽酸鹽腸溶膠囊14.1-16.7mg/kg后，[14C]DCDQ在四只雄性比格犬中的代謝。給藥后2、4、8、24和48小時(shí)收集血漿樣品。糞便和尿液在給藥后0-8、8-24和24-48小時(shí)間隔收集。樣品用于分析放射性含量和代謝產(chǎn)物分布。
給藥后2、4、8、24和48小時(shí)的放射性血漿濃度分別為422±573、564±748、528±566、1340±508和507±135ng當(dāng)量/mL。血漿放射性濃度中可觀察到較大的個(gè)體差異，給藥后2、4和8小時(shí)為4-1640ng當(dāng)量/mL。最高的血漿放射性濃度發(fā)生在24小時(shí)，除2號犬的發(fā)生在給藥后4小時(shí)外。數(shù)據(jù)與在給藥后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)觀察到的放射性排泄物的變化一致。這種差異與DCDQ在一些犬中的吸收緩慢和延長及腸溶膠囊有關(guān)。犬的平均血液/血漿放射性比率為約0.72。
DCDQ在犬中被廣泛代謝。氧化代謝是主要的代謝途徑，盡管也可觀察到DCDQ氨基甲?；咸擒账?。DCDQ代表在2和4小時(shí)的1.9％-21％血漿放射性，在8和24小時(shí)時(shí)低于3％，在給藥后48小時(shí)未檢出。DCDQ說明在所有時(shí)間段尿液放射性平均低于11％。在糞便提取物中，54％-97％的放射性歸于母體藥物。在2和4小時(shí)內(nèi)觀察到的主要代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ(M1、M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、酮類DCDQ(M7)、羥基DCDQ亞胺(M15)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)以及DCDQ的氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)(圖1)。代謝物M3和M9代表給藥后8、24和48小時(shí)的大多數(shù)血漿放射性。代謝物M2、M3、M5和M6在NADPH存在下的犬肝微粒體DCDQ的體外培養(yǎng)中也可觀察到。犬血漿中可觀察到的代謝物在犬尿液中也可檢出，除代謝物M7外。在血漿中未檢出的羥基DCDQ硫酸酯綴合物(M16)和二氮雜?；鵇CDQ羧酸(M17)，在尿樣中可觀察到。羥基DCDQ代謝物(M2、M3和M19)、酮類DCDQ(M18)和羥基DCDQ亞胺(M15)在糞便提取物中檢出。DCDQ的廣泛代謝和延長的口服吸收也許說明在犬中的口服生物利用度相對低，約25.4％。
犬中DCDQ的代謝與大鼠中的有所不同。在大鼠和犬中可觀察到一些不同的氧化代謝產(chǎn)物。氧化代謝產(chǎn)物M15、M16、M17、M18和M19在大鼠中未觀察到，而在大鼠中可觀察到的羥基代謝物M4在犬中未檢出。大鼠中可觀察到的II相代謝物較犬中的多。硫酸酯M8和M13以及氨基磺酸酯M12和M14可在大鼠中觀察到，而在犬中未觀察到。硫酸酯M16可在犬中觀察到，而在大鼠中未觀察到。在犬血漿和尿液中可檢出的DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸，在大鼠血漿或尿液中未觀察到。
總之，DCDQ在犬中被廣泛代謝，氧化代謝是主要代謝途徑，盡管也可觀察到DCDQ氨基甲?；咸擒账岬男纬伞?br> 引言 質(zhì)量平衡研究顯示平均64.3％的口服劑量在大鼠中通過尿液排泄，而在犬尿液中給予腸溶膠囊后劑量的32.7％被回復(fù)。當(dāng)在NADPH和UDPGA存在下，用犬肝微粒體培養(yǎng)時(shí)，[14C]DCDQ被轉(zhuǎn)化為一些氧化代謝物和氨基甲?；咸擒账?。前文大鼠代謝研究顯示DCDQ被廣泛代謝并且氧化代謝是大鼠中的主要代謝途徑。本研究研究了單劑量口服給予犬膠囊后[14C]DCDQ的代謝。
材料和方法 材料 [14C]DCDQ鹽酸鹽由Wyeth Research(Pearl River，NY)的放射合成小組合成，如在上文的體內(nèi)研究中所述。Ultima Gold、Ultima Flo、Permafluor E+-閃爍雞尾酒和Carbo-Sorb E二氧化碳吸收器購自Perkin Elmer(Wellesley，MA)。EDTA得自Sigma-Aldrich(Milwaukee，Wl)。提取用和色譜分析用溶劑是HPLC或ACS試劑級的，來自EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)。
方法 膠囊制備和分析 約11mg[14C]DCDQ鹽酸鹽和940mg未標(biāo)記的DCDQ鹽酸鹽溶于甲醇中，然后在氮?dú)鈿饬飨抡舭l(fā)至干燥。根據(jù)動(dòng)物體重，用精確量(126.7-138.1mg)藥物混合物填充膠囊(#2)。然后手工將已填充的膠囊包腸溶衣。
在額外膠囊中的藥品用于分析放射性化學(xué)純和比活性。一等份藥品溶于DMSO中，用水稀釋，并經(jīng)配有放射性流量檢測和UV檢測的HPLC于250nm處分析。為測定比活性，通過稀釋原溶液的甲醇溶液配制五種不同濃度的未標(biāo)記的DCDQ，并經(jīng)HPLC分析以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將[14C]DCDQ的UV峰積分以計(jì)算DCDQ相對于標(biāo)準(zhǔn)曲線的量。UV檢測后每間隔1分鐘收集[14C]DCDQ峰周圍的餾份。各餾份中的放射性經(jīng)液體閃爍計(jì)數(shù)(LSC)測定。也收集空白注射的餾份以獲得放射性的背景水平。
藥物給予和標(biāo)本收集 四只雄性犬，給藥時(shí)體重為7.6-9.8kg，均來自于內(nèi)部集團(tuán)。各犬給予一粒含有[14C]DCDQ(以鹽酸鹽計(jì))的腸溶膠囊。給藥2小時(shí)前喂食動(dòng)物，并給予Purina犬糧，任意飲水，并分開關(guān)在代謝籠中。
給藥后2、4、8、24和48小時(shí)從頸靜脈收集血樣至含有EDTA鉀(作為抗凝劑)的試管中并置于冰上。取出50μL等份用于氧化并測定放射性含量。將剩余血液于4℃離心立即得到血漿。給藥后0-8、8-24和24-48小時(shí)間隔收集尿樣至干冰上的試管中。給藥后0-8、8-24和24-48間隔于室溫收集糞便樣品，并將其制成勻漿。生物樣品于約-70℃貯存至分析時(shí)。
放射性測定 血漿50μL等份和尿液100-200μL等份用于分析放射性濃度。劑量、血漿和尿液的放射性測定用Tri-Carb 3100型TR/LL LSC進(jìn)行，使用5-10mL Ultima Gold作為閃爍液體。
將糞便稱重，并和水以體積/重量比率為約5∶1制成勻漿。血液等份(200μL)和糞便勻漿(0.25-0.53g)置于帶有Combusto-墊的Combusto-cone中并氧化。307型Tri-Carb樣品氧化器，配有Oximate-80自動(dòng)取樣器(Perkin Elmer)，用于氧化血樣和糞便樣品。釋放的14CO2吸收入Carbo-Sorb E二氧化碳吸收器中，與PermaFluorE+液體閃爍雞尾酒混合，并用Tri-Carb 3100型TR/LL液體閃爍計(jì)數(shù)器(PerkinElmer)計(jì)數(shù)。此氧化劑的氧化效率為98.9％。
對于血漿分布，使用TopCount NXT放射測量全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(Perkin Elmer)來分析收集的HPLC餾份中的放射性。TopCount的檢測限為約1ng當(dāng)量/mL。Flo-One β型A525放射性檢測器(PerkinElmer)，配有250μL LQTR流動(dòng)池，用于獲得尿樣和糞便樣品的數(shù)據(jù)。Ultima Flow M閃爍液體的流速為1mL/min，條件是閃爍雞尾酒/流動(dòng)相的混合比例為5∶1。Flo-One檢測器的檢測限為約200ng當(dāng)量/mL尿液和12ng當(dāng)量/g糞便。
血漿代謝產(chǎn)物分布 血漿樣品用于經(jīng)HPLC分析代謝產(chǎn)物分布。血漿等份與兩倍體積的冷的含有0.1％三氟乙酸(TFA)的甲醇混合，置于冰上約2分鐘，然后離心。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中，并在氮?dú)庀掠?2℃在Zymark TurboVap LV(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)中蒸發(fā)至體積為約0.3mL。將殘余物離心，測定上清液的體積，并通過分析放射性等份20μL一式兩份測定提取效率。200μL等份上清液注入HPLC柱中，并以20秒的間隔將流出液收集至96-孔Lumaplates(PerkinElmer)中。將板在烘箱中于40℃干燥過夜，并用TopCount分析。血漿提取物也經(jīng)LC/MS分析。
糞便和尿液分析 糞便勻漿用于分析代謝產(chǎn)物分布。1g等份糞便勻漿與2mL甲醇混合，置于冰上約10分鐘并離心。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中。殘余物用2mL水∶甲醇(3∶7)的混合物提取三次。合并來自各樣品的上清液，蒸發(fā)至約1mL并離心。通過分析10μL等份上清液的放射性來測定提取效率。一等份(50-200μL)上清液經(jīng)配有放射性流量檢測的HPLC來分析代謝產(chǎn)物分布。樣本也通過LC/MS分析以定性放射性峰。
尿液用于分析放射性濃度，并通過直接注入HPLC柱，經(jīng)配有放射性流量檢測的HPLC來分析代謝產(chǎn)物分布。代謝產(chǎn)物定性的LC/MS分析也采用尿樣進(jìn)行。
高效液相色譜法 帶有自動(dòng)采樣器的Waters 2690型HPLC系統(tǒng)(Waters Corp.，Milford，MA)用于分析。分離在Phenomenex Luna C18(2)柱(150×2.0mm，5μm)(Phenomenex，Torrance，CA)上完成。自動(dòng)采樣器的樣品室維持在4℃，而柱為室溫約20℃?？烧{(diào)波長UV檢測器設(shè)置為250nm檢測，且上述Flo-One β型A525放射性檢測器用于獲取數(shù)據(jù)。流動(dòng)相包括10mM乙酸銨，pH4.5(A)和乙腈(B)，并以0.2mL/min流出。色譜條件A用于藥物分析，而條件B用于分析尿液和血漿，腦和糞便提取物。
表19 條件A 條件B LC/MS分析 Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)包括自動(dòng)采樣器和二極管陣列UV檢測器，用于LC/MS分析。UV檢測器設(shè)置為200-400nm檢測。對于選擇性LC/MS分析，使用裝配有固態(tài)閃爍流動(dòng)池的β-Ram 3型放射性流量探測儀(IN/US Systems Inc.，Tampa，F(xiàn)L)來獲取放射性色譜圖。LC條件與與上述條件B相同。
用于代謝產(chǎn)物定性的質(zhì)譜儀為Micromass Q-TOF-2四極時(shí)間-飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters)。所述質(zhì)譜儀配有電噴射離子化(ESI)接口，并且以陽離子模式操作。碰撞能量設(shè)置為5和30eV，分別用于所有MS和MS/MS掃描。質(zhì)譜儀的設(shè)置列于下表中。
表20 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)評估 使用Flo-One分析軟件(Packard，version 3.6)積分放射性峰。DataFlo應(yīng)用軟件(Perkin Elmer，β0.55版)用于將來自TopCount NXT微量培養(yǎng)板計(jì)數(shù)的ASCII文件轉(zhuǎn)換為CR格式，在Flo-One分析軟件中進(jìn)行處理。計(jì)算機(jī)程序Microsoft Excel97用于計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。Micromass MassLynx軟件(Waters，4.0版)用于收集和分析LC/MS數(shù)據(jù)。
結(jié)果 膠囊含量分析 裝在膠囊中的[14C]DCDQ具有的平均放射性化學(xué)純度為約98.9％，化學(xué)純度(經(jīng)紫外檢測)超過99％。膠囊中的[14C]DCDQ的比活性為2.18μCi/mg(以鹽酸鹽計(jì))。實(shí)際給予的DCDQ的劑量為12.2-14.4mg/kg(以游離堿計(jì))。
血漿放射性濃度和代謝產(chǎn)物分布 單劑量給予[14C]DCDQ膠囊后血液和血漿中的放射性濃度概括于表21中。
表21 單劑量口服給予15mg/kg[14C]DCDQ腸溶膠囊后，犬中放射性的血液和血漿濃度(Ng當(dāng)量/Ml) a犬的數(shù)量 平均血漿放射性濃度為423ng當(dāng)量/mL(給藥后2小時(shí))～1340ng當(dāng)量/mL(給藥后24小時(shí))。最高的放射性濃度通常發(fā)生在給藥后24小時(shí)，除2號犬外，其濃度在給藥后4小時(shí)為最高?？梢娧獫{放射性濃度存在較大的個(gè)體差異，給藥后2、4和8小時(shí)的范圍是4-1640ng當(dāng)量/mL。數(shù)據(jù)與在給藥后第一個(gè)24小時(shí)觀察到的排泄物放射性的巨大的差異一致。這些差異可能與DCDQ在一些犬中的吸收緩慢和延長有關(guān)。血液放射性濃度較血漿放射性水平低，并且平均血液/血漿放射性比率為0.68-0.79(表22)。根據(jù)這些比率，DCDQ及其代謝產(chǎn)物分配進(jìn)入血細(xì)胞是有限的。
表22 單劑量口服給予15mg/kg[14C]DCDQ腸溶膠囊后，犬中的血液/血漿放射性比率 a犬的數(shù)量 b由于放射性濃度較低而未得到數(shù)據(jù)。
提取回收率高于血漿放射性的71％。DCDQ在犬內(nèi)被廣泛代謝(表23和24)。給藥后2和4小時(shí)，DCDQ代表血漿放射性的1.9％-21％。在8和24小時(shí)，DCDQ代表低于血漿放射性的3％，并且在給藥后48小時(shí)未檢出(表23和24)。在2和4小時(shí)血漿中可觀察到的主要代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ代謝物(M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、酮類DCDQ(M7)、羥基DCDQ亞胺(M15)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)以及DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)。由8、24和48小時(shí)的血漿樣品得到相似的分布，盡管在這些后面的時(shí)間點(diǎn)的主要放射性是由于羥基代謝物M3和葡糖苷酸M9，其不能被色譜分離。許多相對少量的代謝產(chǎn)物說明在2和4小時(shí)樣品中血漿放射性的6.2％-42％。這些代謝產(chǎn)物由于濃度低未被定性。
表23 單劑量口服給予15mg/kg[14C]DCDQ腸溶膠囊后，犬血漿中放射性的色譜分布(百分比)a a未得到3號和4號犬2和4小時(shí)，以及4號犬8、24和48小時(shí)的樣品的分布。
b包括未定性的代謝產(chǎn)物 c未檢出 表24 單劑量口服給予15mg/kg[14C]DCDQ腸溶膠囊后，估算的犬內(nèi)DCDQ及代謝產(chǎn)物的血漿濃度(ng當(dāng)量/mL)a a未得到3號和4號犬2和4小時(shí)，以及4號犬8、24和48小時(shí)樣品的數(shù)據(jù)，由于循環(huán)的放射性濃度較低；根據(jù)總的血漿放射性濃度(表21)和放射性的色譜分布(表23)估算濃度。
b定量檢測限(1ng當(dāng)量/mL血漿)以下。
尿液代謝物分布 尿液是DCDQ在犬中消除的主要途徑，盡管糞便排泄高于尿液排泄。多數(shù)代謝產(chǎn)物均可在尿液中檢出。DCDQ代表平均低于所有時(shí)間點(diǎn)的尿液放射性的11％(表25)。主要代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ代謝物(M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、羥基DCDQ亞胺(M15)、羥基DCDQ硫酸酯(M16)、二氮雜?；鵇CDQ羧酸(M17)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)以及DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)(圖1)。
表25 給予含[14C]DCDQ的腸溶膠囊后，犬尿液中放射性的色譜分布(百分比)a a2、3和4號犬的0-8小時(shí)樣品以及4號犬的0-24小時(shí)樣品 c包括許多未定性的代謝產(chǎn)物 沒有足夠的放射性。
d數(shù)據(jù)未得到 bND，未檢出 糞便代謝產(chǎn)物分布 提取平均糞便放射性的70.2％，而在空白糞便勻漿中從[14C]DCDQ培養(yǎng)基提取的放射性平均為88.2％。糞便提取物中，DCDQ是主要的放射性組分，表示總放射性的54.4％-96.7％。糞便中可檢出的代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ(M2、M3和M19)、酮類DCDQ(M18)和未定性峰(M20)。在糞便提取物中，最大量的代謝產(chǎn)物M18表示至多總放射性的16.4％。羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)在糞便中未檢出。糞便勻漿中的[14C]DCDQ于37℃培養(yǎng)24小時(shí)顯示沒有明顯的降解(數(shù)據(jù)未列出)。
經(jīng)LC/MS分析定性代謝產(chǎn)物 通過LC/MS和LC/MS/MS分析DCDQ及其代謝產(chǎn)物獲得質(zhì)譜。這些化合物的結(jié)構(gòu)定性概括于表26中。來自本文所述的各研究的DCDQ及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜特征在下面進(jìn)一步討論。
表26 經(jīng)LC/MS分析確定的犬中DCDQ代謝產(chǎn)物 aLC/MS保留時(shí)間被標(biāo)準(zhǔn)化為LC/MS數(shù)據(jù)文件GU_071803_0003和GU_081303_0002。
b經(jīng)LC/MS檢測和定性的代謝產(chǎn)物基質(zhì)，P＝血漿；U＝尿液；B＝腦；F＝糞便 討論 血漿放射性濃度存在較大的個(gè)體差異，給藥后2、4和8小時(shí)為4-1640ng當(dāng)量/mL。此數(shù)據(jù)與給藥后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)觀察到的排泄物放射性差異一致。給藥后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)，尿液排泄在0-25％之間變化，而糞便排泄為用藥量放射性的0-23％。血漿放射性最大濃度發(fā)生在24小時(shí)除2號犬外，其濃度在給藥后4小時(shí)最大。這種差異與DCDQ在一些犬中的吸收緩慢和延長有關(guān)，并且可能與腸溶膠囊有關(guān)。與給藥后2-8小時(shí)大鼠的約1.1相比，犬的平均血液/血漿放射性比率為約0.72，表明DCDQ及其代謝物吸收進(jìn)入血細(xì)胞在犬中較大鼠中低。
如在大鼠中所見，給予含[14C]DCDQ的腸溶膠囊后，DCDQ在犬中被廣泛代謝(圖1)。氧化代謝是主要的代謝途徑，而在大鼠中未觀察到的DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸的形成也觀察到了。DCDQ在2和4小時(shí)代表血漿放射性的1.9-21％，8和24小時(shí)低于3％，并且在給藥后48小時(shí)未檢出。DCDQ說明在所有時(shí)間點(diǎn)平均低于尿液放射性的11％。在糞便提取物中，放射性的54.4％-96.7％歸于母體藥物。給藥后2和4小時(shí)的血漿代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ(M1、M2和M3)、N-氧化物DCDQ(M5)、酮類DCDQ(M7)、羥基DCDQ亞胺(M15)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)及DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)。給藥后8、24和48小時(shí)的大多數(shù)放射性是由于羥基代謝物M3和葡糖苷酸M9，其未被色譜法分離。在NADPH存在下，DCDQ和犬肝微粒體的體外培養(yǎng)中，也可觀察到代謝產(chǎn)物M2、M3、M5和M6。犬血漿中觀察到的代謝產(chǎn)物在犬尿液中也可檢出，除代謝產(chǎn)物M7外。在血漿中未檢出的羥基DCDQ硫酸酯綴合物(M16)和二氮雜?；鵇CDQ羧酸(M17)在尿樣中可觀察到。羥基DCDQ代謝物(M2、M3和M19)、酮類DCDQ(M18)和羥基DCDQ亞胺在糞便提取物中可檢出。代謝產(chǎn)物M6的形成由于在胃腸道中可能水解而未被評估。DCDQ的廣泛性代謝和延長的口服吸收可能說明在犬中相對較低的口服生物利用度，約為25.4％。
DCDQ在犬中的代謝與大鼠中的有些不同(圖1)。在大鼠和犬中可觀察到一些不同的代謝產(chǎn)物。氧化代謝物M15、M16、M17、M18和M19在大鼠中未觀察到，而在大鼠中可見的羥基代謝物M4在犬中未檢出。硫酸酯M8和M13，以及氨基磺酸酯M12和M14在大鼠中可見，但在犬中未檢出。硫酸酯M16在犬中可見，但在大鼠中未檢出。在犬血漿和尿液中可檢出的DCDQ的氨基甲?；咸擒账嵩诖笫笱獫{和尿液中未觀察到。
總之，DCDQ在犬中被廣泛代謝，氧化代謝是主要的代謝途徑，盡管也可觀察到DCDQ氨基甲?；咸擒账岬男纬?。
經(jīng)LC/MS分析定性代謝產(chǎn)物 經(jīng)LC/MS和LC/MS/MS分析以上研究中確定的DCDQ及其代謝產(chǎn)物得到質(zhì)譜。來自各研究的DCDQ及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜定性在下文討論。
DCDQ 為與代謝產(chǎn)物相比較，檢查DCDQ標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜特性。在DCDQ的LC/MS光譜中，質(zhì)子化的分子離子，[M+H]+，在m/z 229可見。由碰撞誘導(dǎo)解離(CID)得到的DCDQ質(zhì)譜的m/z 229產(chǎn)物離子以及推薦的裂解方案表明從分子離子失去亞甲基胺、亞乙基胺和亞乙基甲基胺分別生成m/z 200、186和171處的產(chǎn)物離子。分子離子失去丙烯基團(tuán)生成m/z 187處的片段，并進(jìn)一步失去亞甲基胺和亞乙基胺生成m/z 158和144處的碎片離子。失去環(huán)戊基-亞甲基胺基團(tuán)生成m/z 132處的碎片離子。
代謝產(chǎn)物M1來自大鼠和犬體內(nèi)體外研究 M1的[M+H]+在m/z 245處可見。M1質(zhì)譜的m/z 245產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明增加了16Da，說明單羥化作用。失去分子離子的丙烯生成m/z 203處的碎片，其較DCDQm/z 187處的對應(yīng)離子高16Da。m/z 171和186處的碎片離子與DCDQ譜中的產(chǎn)物離子相同，表明羥化作用發(fā)生在所示分子的二氮雜部分。因此，認(rèn)為M1是羥基DCDQ。
代謝產(chǎn)物M2來自大鼠和犬體內(nèi)體外研究 M2的[M+H]+在m/z 245處可見。M2質(zhì)譜的m/z 245產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明增加了16Da，說明單羥化作用。失去分子離子的丙烯生成m/z 203處的碎片，其較DCDQm/z 187處的對應(yīng)離子高16Da。這表明環(huán)戊烷環(huán)不是生物轉(zhuǎn)化的位置。m/z 132處的碎片與DCDQ相同，表明二氮雜部分不是生物轉(zhuǎn)化的位置。m/z 169和184處的碎片分別較DCDQm/z 171和186處對應(yīng)的離子低2Da，表明從吡啶環(huán)中失去H2O而導(dǎo)致羥化作用。因此，認(rèn)為M2是羥基DCDQ。
代謝產(chǎn)物M3來自大鼠和犬體內(nèi)體外研究 M3的[M+H]+在m/z 245處可見。M3質(zhì)譜的m/z 245產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明增加了16Da，說明單羥化作用。失去亞乙基生成m/z 202處的碎片，其較SAX-187m/z 186處的對應(yīng)離子高16Da。m/z158和144處的碎片離子與DCDQ譜中產(chǎn)物離子相同。這表明羥基化作用發(fā)生在所示分子的環(huán)戊烷部分。因此，認(rèn)為M3是羥基DCDQ。
代謝產(chǎn)物M4來自大鼠的體內(nèi)體外研究 M4的[M+H]+在m/z 245處可見。M4質(zhì)譜的m/z 245產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明增加了16Da，說明單羥化作用。從分子離子中失去H2O生成m/z 227處的碎片。對于DCDQ也可觀察到m/z 144處的產(chǎn)物離子，表明羥化作用發(fā)生在所示分子的環(huán)戊烷部分。這也和m/z 184存在的產(chǎn)物離子一致，通過失去DCDQm/z 186處對應(yīng)離子的亞乙基胺和H2O生成。測定的這一離子的精確質(zhì)量為184.1120Da，此值在C13H14N的理論質(zhì)量的3.6ppm之內(nèi)。因此，認(rèn)為M4是羥基DCDQ。
代謝產(chǎn)物M5來自體外研究 M5的[M+H]+在m/z 243處可見。測定的M5的精確質(zhì)量為243.1478Da，此值在C15H19N2O理論質(zhì)量的7.9ppm之內(nèi)。與DCDQ的分子式相比較，這符合加上一個(gè)氧而去掉兩個(gè)氫原子。m/z 130處的碎片比DCDQ對應(yīng)的離子少2Da，表明形成了亞胺。在流動(dòng)相中用D2O取代H2O的LC/MS證明M5中不存在可交換的質(zhì)子，表明M5是N-氧化物。因此，認(rèn)為M5是DCDQ亞胺的N-氧化物。
代謝產(chǎn)物M6來自犬的體內(nèi)體外研究 M6的[M+H]+在m/z 449處可見。M6質(zhì)譜的m/z 449產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子失去176Da生成m/z 273處的碎片，表明M5是葡糖苷酸綴合物。從m/z 273處進(jìn)一步失去44Da生成m/z229，其也是DCDQ的分子離子。因此，認(rèn)為M6是DCDQ的氨基甲?；咸擒账帷?br> 代謝產(chǎn)物M7來自大鼠和犬的體內(nèi)體外研究 M7的[M+H]+在m/z 243處可見。M7質(zhì)譜的m/z 243產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子失去亞甲基胺、亞乙基胺生成m/z 214和200處的產(chǎn)物離子，其分別較DCDQ的m/z 200和186處對應(yīng)的離子多14Da。這表明DCDQ加了一個(gè)氧原子并去掉了兩個(gè)氫原子。m/z 132、144和158處的產(chǎn)物離子與DCDQ的相同，表明生物轉(zhuǎn)化發(fā)生在吡啶環(huán)和環(huán)戊烷環(huán)上。在流動(dòng)相中用D2O取代H2O的LC/MS證明M7中僅存在一個(gè)可交換的質(zhì)子，其來自二氮雜環(huán)中的NH基團(tuán)。因此，認(rèn)為M7是酮類DCDQ。
代謝產(chǎn)物M8來自大鼠體內(nèi)研究 M8的[M+H]+在m/z 325處可見。M8質(zhì)譜的m/z 325產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子去掉丙烯生成m/z 283處的產(chǎn)物離子，表明生物轉(zhuǎn)化不在環(huán)戊烷環(huán)上發(fā)生。從m/z 283處的產(chǎn)物離子失去亞甲基胺、亞乙基胺，然后失去硫酸酯基團(tuán)分別生成m/z 158和144處的產(chǎn)物離子。從分子離子中失去亞乙基胺生成m/z 282處的產(chǎn)物離子，然后失去磺酸酯基團(tuán)和H2O分別生成m/z 202和184處的產(chǎn)物離子。m/z 132處的碎片離子與DCDQ中的相同，表明二氮雜部分不是生物轉(zhuǎn)化的位置。因此，認(rèn)為M8是羥基DCDQ的硫酸酯綴合物。
代謝產(chǎn)物M9來自大鼠和犬的體內(nèi)研究 M9的[M+H]+在m/z 421處可見。M9質(zhì)譜的m/z 421產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子失去176Da生成m/z 245處的碎片離子，表明羥基DCDQ的葡糖苷酸化。失去亞乙基胺和葡糖醛酸生成m/z202處的碎片，其較DCDQ中m/z 186處對應(yīng)的離子高16Da。m/z 187處的碎片離子表明生物轉(zhuǎn)化發(fā)生在環(huán)戊烷環(huán)上。因此，認(rèn)為M9是羥基DCDQ的葡糖苷酸。
代謝產(chǎn)物M10 M10的[M+H]+在m/z 245處可見。M10質(zhì)譜的m/z 245產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明增加了16Da，說明發(fā)生了單羥化作用。m/z 171和186處的碎片離子與DCDQ光譜中的產(chǎn)物離子相同，表明羥化作用發(fā)生在所示分子的二氮雜部分。因此，認(rèn)為M10是羥基DCDQ。
代謝產(chǎn)物M11來自大鼠體內(nèi)研究 M11的[M+H]+在m/z 287處可見。M11質(zhì)譜的m/z 287產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子中失去H2O生成m/z 269處的碎片。進(jìn)一步失去42Da得到m/z 227，其表示乙?；饔谩/z 171和186處的碎片離子與DCDQ光譜中的產(chǎn)物離子相同，表明生物轉(zhuǎn)化發(fā)生在所示分子的二氮雜部分。因此，認(rèn)為M11是乙?；牧u基DCDQ。
代謝產(chǎn)物M12來自大鼠體內(nèi)研究 M12的[M+H]+在m/z 309處可見。M12質(zhì)譜的m/z 309產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明失去80Da得到m/z 229處的產(chǎn)物離子，其為DCDQ的分子離子。這表明發(fā)生了硫酸鹽化作用。進(jìn)一步失去亞甲基胺、亞乙基胺生成m/z 200和186處的產(chǎn)物離子，這與DCDQ相同。因此，認(rèn)為M12是DCDQ的N-硫酸酯。
代謝產(chǎn)物M13來自大鼠體內(nèi)研究 M13的[M+H]+在m/z 325處可見。M13質(zhì)譜的m/z 325產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從[M+H]+失去80Da得到m/z 245，其較DCDQ的[M+H]+高16Da。這表明M13是羥基DCDQ的硫酸酯綴合物。因此，認(rèn)為M13是羥基DCDQ的硫酸酯綴合物。
代謝產(chǎn)物M14來自大鼠體內(nèi)研究 M14的[M+H]+在m/z 305處可見。M14質(zhì)譜的m/z 305產(chǎn)物離子、質(zhì)譜m/z 225處的產(chǎn)物離子和計(jì)劃的M14的裂解方案表明從分子離子失去80Da得到m/z 225處的離子，這表明M14是硫酸酯。進(jìn)一步失去亞乙基胺和亞乙基-甲基-胺分別生成182和167處的產(chǎn)物離子，其分別較DCDQm/z 186和171處對應(yīng)的離子少4Da，表明環(huán)戊烷基的代謝。因此，認(rèn)為M14是二脫氫DCDQ的硫酸酯綴合物。
代謝產(chǎn)物M15來自犬的體內(nèi)研究 M15的[M+H]+在m/z 245處可見。M15質(zhì)譜的m/z 245產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明m/z 187處的碎片離子較DCDQ的m/z 171處對應(yīng)的離子高16Da，表明環(huán)戊烷或吡啶環(huán)發(fā)生了羥基化作用。m/z 130處的碎片離子較DCDQ的對應(yīng)離子少2Da，表明形成了亞胺。在流動(dòng)相中用D2O取代H2O的LC/MS證明M15中僅存在一個(gè)可交換的質(zhì)子。因此，認(rèn)為M15是羥基DCDQ亞胺。
代謝產(chǎn)物M16來自犬的體內(nèi)研究 M16的[M+H]+在m/z 325處可見。M13質(zhì)譜的m/z 325產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子失去80Da生成m/z 245處的產(chǎn)物離子，表明發(fā)生了硫酸鹽化作用。從分子離子失去丙烯得到m/z 283處的產(chǎn)物離子，表明生物轉(zhuǎn)化不是在環(huán)戊烷環(huán)上發(fā)生。失去亞乙基胺生成m/z 282處的產(chǎn)物離子，然后失去硫酸酯基和H2O分別生成m/z 202和184處的產(chǎn)物離子。m/z 148處的產(chǎn)物離子，較DCDQ 132處的對應(yīng)離子高16Da，并且m/z 282處的產(chǎn)物離子表明羥基化作用發(fā)生在所示分子的芐基基團(tuán)上。因此，認(rèn)為M16是羥基DCDQ的硫酸酯綴合物。
代謝產(chǎn)物M17來自犬的體內(nèi)研究 M17的[M+H]+在m/z 257處可見。測定的[M+H]+的精確質(zhì)量為257.1292Da，此值在C15H17N2O2的理論質(zhì)量的0.8ppm之內(nèi)。與DCDQ的分子式相比，這符合加上兩個(gè)氧原子并去掉4個(gè)氫原子。從分子離子失去44Da得到m/z 213處的碎片。測定的此碎片的精確質(zhì)量為213.1376Da，此值在C14H17N2的理論質(zhì)量的7.6ppm之內(nèi)。這證明失去的44是來源于CO2的中性失去，表明M17是羧酸。進(jìn)一步從m/z 213失去環(huán)戊烯、戊烷、丙烯和HCN分別生成m/z 145、171和186處的碎片。m/z 130處的產(chǎn)物離子較DCDQ m/z 132處的對應(yīng)離子少2Da，表明形成了亞胺。在流動(dòng)相中用D2O取代H2O的LC/MS證明M17中僅存在一個(gè)可交換的質(zhì)子，其來自羧酸基團(tuán)。因此，認(rèn)為M17是苯并-二氮雜?；?環(huán)戊烷羧酸(二氮雜?；鵇CDQ羧酸)。
代謝產(chǎn)物M18來自犬的體內(nèi)研究 M18的[M+H]+在m/z 243處可見。M18質(zhì)譜的m/z 243產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子失去丙烯和亞乙基胺基團(tuán)生成m/z 158處的產(chǎn)物離子。從分子離子失去亞甲基胺、亞乙基胺得到m/z 214和200處的產(chǎn)物離子，其分別較DCDQm/z 200和186處的對應(yīng)離子多14Da。這表明從DCDQ增加了一個(gè)氧原子并去掉了兩個(gè)氫原子。m/z 146處的產(chǎn)物離子，較DCDQm/z 132的對應(yīng)離子多14Da，并且m/z 200產(chǎn)物離子表明修飾發(fā)生在芐基基團(tuán)上。在流動(dòng)相中用D2O取代H2O的LC/MS證明M14中僅存在一個(gè)可交換的質(zhì)子，其來自二氮雜環(huán)中的NH基團(tuán)。因此，認(rèn)為M18是酮類DCDQ。
代謝產(chǎn)物M19來自犬的體內(nèi)研究 M19的[M+H]+在m/z 245處可見。M19質(zhì)譜的m/z 245產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明增加了16Da，說明發(fā)生了單羥化作用。m/z 216、202和187處的產(chǎn)物離子分別較DCDQm/z 200、186和171的對應(yīng)離子高16Da，表明二氮雜?；鶊F(tuán)不是修飾的位置。從分子離子失去丙烯得到m/z 203處的碎片，并進(jìn)一步失去亞甲基胺和亞乙基胺得到m/z 174和160處的碎片離子。較DCDQ的對應(yīng)離子高16Da，表明在苯基團(tuán)或吡啶基團(tuán)發(fā)生了羥基化作用。因此，認(rèn)為M19是羥基DCDQ。
產(chǎn)物P3來自體內(nèi)研究 P3的[M+H]+在m/z 227處可見。P3質(zhì)譜的m/z 227產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明P3的分子量較DCDQ少2Da，表明形成了雙鍵。m/z130處的碎片離子較DCDQ的對應(yīng)離子少2Da，表明形成了亞胺。因此，認(rèn)為P3是DCDQ亞胺。
單劑量口服給予DCDQ 50mg/kg后， 大鼠尿液中代謝產(chǎn)物M7、M9和M13的鑒別 概要 設(shè)計(jì)本研究是為了得到代謝產(chǎn)物分離的大鼠尿液，以及為了得到DCDQ選擇性代謝產(chǎn)物的更具體的結(jié)構(gòu)確證。單劑量給予三只雄性和三只雌性大鼠DCDQ 50mg/kg。在0-12和12-24小時(shí)間隔收集尿液。通過二階半制備型HPLC法從尿液中分離DCDQ代謝物M7(酮類DCDQ)、M9(羥基DCDQ葡糖苷酸)和M13(羥基DCDQ硫酸酯)，其以低微克足量用于NMR光譜分析。根據(jù)MS和NMR光譜分析，M7和M13的代謝位點(diǎn)在17位。M9的代謝位點(diǎn)在13位。
引言 當(dāng)在NADPH和UDPGA存在下用大鼠肝微粒體培養(yǎng)時(shí)，[14C]DCDQ轉(zhuǎn)化為一些氧化代謝物。以前的大鼠中的代謝研究表明DCDQ被廣泛代謝，并且氧化代謝是大鼠中主要的代謝途徑。II相代謝產(chǎn)物包括羥基DCDQ的硫酸酯和葡糖苷酸，在大鼠中也可檢出。設(shè)計(jì)本研究以獲得大鼠尿液中的分離的代謝產(chǎn)物，并獲得選擇性DCDQ代謝產(chǎn)物的更具體的結(jié)構(gòu)確證。
材料和方法 材料 如上所述，DCDQ鹽酸鹽由Wyeth Research合成。聚山梨醇酯80購自Mallinckrodt Baker(Phillipsburg，NJ)，并且甲基纖維素得自Sigma-Aldrich(Milwaukee，Wl)。提取用和色譜分析用溶劑是HPLC或ACS試劑級的，購自EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)。氘化的二甲亞砜(DMSO-d6)購自Cambridge Isotope Laboratories(Andover，MA)。NMR試管(3mm)購自Wilmad Glass Co.(Buena，NJ)。
方法 藥物給予和樣本收集 劑量配制、動(dòng)物給藥和標(biāo)本收集在Wyeth Research，Collegeville，PA進(jìn)行。藥物賦形劑包含2％(v/v)吐溫80和0.5％(v/v)甲基纖維素的水溶液。給藥當(dāng)天，未標(biāo)記的DCDQ(205.7mg)溶于賦形劑中以使終濃度為約10mg/mL。
給藥時(shí)，三只雄性大鼠體重為413-474g，三只雌性大鼠體重為272-290g，均購自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)。單劑量給予未禁食大鼠DCDQ的目標(biāo)劑量為50mg/kg，通過灌胃法給予的體積為5.0mL/kg。給動(dòng)物提供標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料并任意飲水，并分別關(guān)在代謝籠中。
在0-12和12-24小時(shí)間隔，將尿液收集至干冰上的容器中，并于約-70℃貯存直至餾份收集時(shí)。
通過液相色譜法/質(zhì)譜法分析大鼠尿液 經(jīng)LC/MS分析大鼠尿樣，以確定在用于代謝物分離的大鼠尿樣中存在的DCDQ代謝物。用于LC/MS分析的HPLC系統(tǒng)是Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，其配有二元泵、自動(dòng)采樣器和二極管陣列UV檢測器。自動(dòng)采樣器的溫度設(shè)為10℃。UV檢測器設(shè)為190-400nm檢測。分離使用Supelco Discovery C18柱(250×2.1mm×5μm)來完成。柱溫為20℃。使用的流動(dòng)相梯度程序如下所述。
流動(dòng)相A10mM乙酸銨水溶液，pH4.5 流動(dòng)相B甲醇 表27HPLC梯度 用于代謝物定性的質(zhì)譜是Finnigan LCQ離子收集器質(zhì)譜儀(ThermoElectron Corp.，San Jose，CA)，其配有電噴射離子化(ESl)接口，并在陽性離子化模式中操作。質(zhì)譜儀的設(shè)置列于下表中。
經(jīng)液相色譜法分離代謝產(chǎn)物 用于代謝產(chǎn)物分離的HPLC系統(tǒng)包括Waters Prep LC 4000泵、進(jìn)樣用Waters 2767樣品管理程序、Waters 996二極管陣列UV檢測器和Gilson FC204餾份收集器(Gilson，Inc.，Middleton，WI)。UV檢測器設(shè)為210-450nm檢測。餾份收集器設(shè)為間隔1min收集餾份。HPLC流動(dòng)相梯度如上所述LC/MS分析用梯度，除流速為4.7mL/min外。各HPLC條件的流動(dòng)相如下所述。在餾份收集期間未進(jìn)行質(zhì)譜分析。
使用兩個(gè)HPLC條件來分離代謝產(chǎn)物。HPLC條件1用于從大鼠尿液分離代謝產(chǎn)物。HPLC條件2用于進(jìn)一步純化使用HPLC條件1收集的DCDQ代謝產(chǎn)物餾份。HPLC條件1和2使用的柱和流動(dòng)相列出如下。
HPLC條件1 柱Supelco Discovery C18半制備型柱(250×10mm，5μm)(Supelco，Bellefonte，PA)。
流動(dòng)相A10mM乙酸銨水溶液，pH4.5 流動(dòng)相B甲醇 HPLC條件2 柱Zorbax SB-CN半制備型柱(250×9.4mm，5μm)(AgilentTechnologies) 流動(dòng)相A0.02％三氟乙酸水溶液 流動(dòng)相B0.02％三氟乙酸甲醇溶液 將來自HPLC條件2的含有代謝產(chǎn)物M7、M9和M13的餾份合并，并在氮?dú)庀率褂肸ymark TurboVap(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)蒸發(fā)至干燥。使用干燥的代謝產(chǎn)物進(jìn)行NMR光譜分析。
分離出來的M7、M9和M13的核磁共振(NMR)譜分析 對于NMR譜，分離出來的DCDQ代謝產(chǎn)物M7、M9和M13的樣品各自溶于150μL 100％DMSO-d6中，并在氮?dú)鈿夥障路謩e轉(zhuǎn)移至3mm NMR試管中。在配有Nalorac 5mm z-梯度間接檢測探針(Varian)的Varian Inova 500MHz NMR波譜儀(Palo Alto，CA)上，收集一維(1D)質(zhì)子NMR和二維(2D)NMR(COSY，ROESY)數(shù)據(jù)。
數(shù)據(jù)分析 ThermoFinnigan Xcalibur軟件(1.3版)用于控制LC/MS系統(tǒng)，并分析LC/MS數(shù)據(jù)。使用Micromass MassLynx軟件(4.0版)控制用于餾份收集的HPLC儀器。使用VNMR程序(6.1C版，Varian)，收集、處理并顯示NMR光譜數(shù)據(jù)。
結(jié)果 經(jīng)LC/MS和NMR譜定性DCDQ代謝產(chǎn)物 本研究中，分離足量DCDQ的代謝產(chǎn)物M7、M9和M13，以進(jìn)行NMR譜分析，確定更具體的結(jié)構(gòu)。本報(bào)告中的M7(酮類DCDQ)、M9(羥基DCDQ葡糖苷酸)和M13(羥基DCDQ硫酸酯)的結(jié)構(gòu)確證可以取代那些在前述報(bào)告中的結(jié)構(gòu)確證。DCDQ、M7、M9和M13以及其NMR編號圖解概括于圖5中。經(jīng)質(zhì)譜和NMR譜確證M7、M9和M13在下文討論。
DCDQ 檢查DCDQ標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜和NMR光譜，以和代謝產(chǎn)物比較。在DCDQ的LC/MS譜中，質(zhì)子化分子離子，[M+H]+，在m/z 229處可見。DCDQ質(zhì)譜得自碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，其中m/z 229處的產(chǎn)物離子及推薦裂解方案表明從分子離子失去亞甲基胺和亞乙基胺分別生成m/z200和186處的產(chǎn)物離子。從分子離子失去丙烯得到m/z 187，并進(jìn)一步失去亞乙基生成m/z 144。失去環(huán)戊基-亞甲基胺基團(tuán)得到m/z 132產(chǎn)物離子。
表29概括了DCDQ的1HNMR化學(xué)位移數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)用于和分離的代謝產(chǎn)物比較。
表29在DMSO-d6中DCDQ的1H化學(xué)位移 代謝產(chǎn)物M7 M7的[M+H]+在m/z 243處可見。M7質(zhì)譜的m/z 243產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子失去亞甲基胺、亞乙基胺分別得到m/z214和200處的產(chǎn)物離子，其值分別較DCDQ的m/z 200和186處的對應(yīng)離子高14Da。這表明從DCDQ添加了一個(gè)氧原子并失去了兩個(gè)氫原子。m/z 132、144和158處的產(chǎn)物離子與DCDQ的相同，表明生物轉(zhuǎn)化位置在環(huán)戊烷環(huán)上。
表30列出了M7的化學(xué)位移和分配。使用來自1D NMR譜和2DCOSY譜的信息確定代謝產(chǎn)物。1D 1H NMR譜顯示芳環(huán)與三個(gè)連續(xù)配對的芳香共振一起是完整的。由得到的數(shù)據(jù)來看，不可能區(qū)別H12和H14。二氮雜環(huán)上的質(zhì)子來自于9.10-8.62ppm的鹽共振(H4)。2DCOSY數(shù)據(jù)顯示這些質(zhì)子在3.20ppm(H3)～4.18和4.15ppm(H5)偶合入質(zhì)子。H3質(zhì)子也在3.34和3.06(H2)偶合入質(zhì)子。這些結(jié)果證明二氮雜環(huán)是完整的。
表30在DMSO-d6中代謝產(chǎn)物M7的1H化學(xué)位移 1D1H NMR譜也顯示與DCDQ比較，變化發(fā)生在環(huán)戊基區(qū)域，因?yàn)橛腥齻€(gè)2.5ppm共振高磁場，而DCDQ有7個(gè)共振。剩余原子的分配從H11質(zhì)子開始。根據(jù)與DCDQ的偶合常數(shù)比較，認(rèn)為3.16ppm和3.01ppm的共振是H11。3.01ppm處的共振是三重峰，3.16ppm處的共振是雙聯(lián)體。這些都可以在DCDQ中觀察到。H11質(zhì)子都偶合至2.59ppm(H10)處的共振。H10共振偶合至3.47ppm(H9)處的另一個(gè)共振。H9共振偶合至2.53ppm和1.76ppm(H15)處的亞甲基對。H15共振偶合至2.32ppm和2.14ppm(H16)處的另一個(gè)亞甲基對。沒有可分配至H17的共振，表明C17位是代謝的位置。H16質(zhì)子的低場位移與C17處的羰基氧一致。因此，M7被確定為17-酮類DCDQ。
代謝產(chǎn)物M9 M9的[M+H]+在m/z 421處可見。M9質(zhì)譜的m/z 421產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從分子離子失去176Da生成m/z 245，較DCDQ分子離子高16Da，表明羥基DCDQ發(fā)生了葡糖苷酸化作用。從[M+H]+失去亞甲基胺得到m/z 378。這表明亞乙基部分未發(fā)生變化。從m/z 378失去葡糖醛酸(176Da)得到m/z 202，其值較DCDQm/z 186處的對應(yīng)離子高16Da。這表明消除了環(huán)丙烷環(huán)的三個(gè)亞甲基基團(tuán)，此環(huán)為代謝位置。m/z 203處的產(chǎn)物離子較DCDQ 187處的對應(yīng)離子高16Da。這些數(shù)據(jù)與作為代謝位置的芐基或四氫吡啶基一致。
使用圖5中的編號圖解，表31列出了M9的NMR化學(xué)位移和分配。許多代謝產(chǎn)物可以使用1D NMR譜的信息和2D COSY分析的結(jié)果確定，顯示M9中的穿過-鍵關(guān)聯(lián)，并且ROESY分析顯示M9中的穿過-空間NOE緊密接觸。來自C2上亞甲基質(zhì)子的共振由于重疊而未被確定。其共振位于3.35ppm-3.15ppm。M9DCDQ的NMR譜的高磁場域是相同的。使用COSY試驗(yàn)進(jìn)一步分析這一區(qū)域證明苯環(huán)系統(tǒng)是完整的。在M9的1D1H NMR譜中也可見來自葡糖苷酸的共振。由于譜的重疊，這些共振中的一些不能被清楚地確定。在3.35-3.15ppm區(qū)域有足量未確定的質(zhì)子共振的代謝物。
表31DMSO-d6中代謝產(chǎn)物M9的1H化學(xué)位移 檢查500MHz 1D 1H NMR譜顯示芳環(huán)的共振從DCDQ的NMR譜變化。這些芳香共振中有兩個(gè)仍是來自DCDQ中的三個(gè)。在2.5Hz處這些芳香共振之間的偶合是間位原子之間的特征。這將葡糖苷酸置于C13位。通過ROSEY試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持了葡糖苷酸的位置，該試驗(yàn)表明H12具有H5質(zhì)子的NOEs，并且H14具有H9的NOE。這些結(jié)果在芳環(huán)相反的末端定位了H12和H14。兩個(gè)芳環(huán)質(zhì)子還都具有葡糖苷酸環(huán)的芳香質(zhì)子的NOEs。所有這些結(jié)果都和葡糖苷酸在C13位的結(jié)合一致。
代謝產(chǎn)物M13 M13的[M+H]+在m/z 325處可見。M13質(zhì)譜的m/z 325產(chǎn)物離子和推薦裂解方案表明從[M+H]+失去80Da得到m/z 245，此值較DCDQ的[M+H]+高16Da。這表明M13是羥基DCDQ的硫酸酯綴合物。從分子離子失去亞乙基胺得到m/z 282。在m/z 144和132存在產(chǎn)物離子，在DCDQ中也可見，表明環(huán)戊烷環(huán)的三個(gè)亞甲基位中的一個(gè)是代謝位置。
表32列出了M13的化學(xué)位移和分配。使用1D 1H NMR譜、2DCOSY譜和2D ROESY譜的信息確定代謝產(chǎn)物。M13的1D 1H NMR譜顯示芳環(huán)和7.15ppm(H12)、6.91ppm(H13)和7.23ppm(H14)處的三個(gè)偶合質(zhì)子一起是完整的。分配由觀察到的H12的ROE4.17ppm和4.14ppm處的共振確定，其被確定為H5。確定二氮雜環(huán)的質(zhì)子來自9.04ppm和8.57ppm處的鹽共振(H4)。2D COSY數(shù)據(jù)顯示這些質(zhì)子偶合至3.22ppm和3.20ppm(H3)和4.17和4.14ppm(H5)處的質(zhì)子。H3質(zhì)子也偶合至3.34和3.14(H2)處的質(zhì)子。這些結(jié)果證明二氮雜環(huán)是完整的。
表32DMSO-d6中代謝產(chǎn)物M9的1H化學(xué)位移 1D1H NMR光譜數(shù)據(jù)(表32)顯示變化發(fā)生在環(huán)戊基區(qū)域，因?yàn)镸13有5個(gè)2.5ppm的高磁場共振，而在DCDQ NMR光譜中，有7個(gè)共振。11位的質(zhì)子根據(jù)其與DCDQ中的相似確定。2.68ppm處的三重共振是DCDQ唯一的。此共振偶合至3.23ppm(H11)處的共振，另一個(gè)至2.40ppm(H10)。H10偶合至3.15ppm(H9)處的共振，而弱偶合至4.29ppm(H17)。H9偶合至2.26ppm和1.33ppm(都是H15)處的亞甲基對。此亞甲基對偶合至1.97ppm和1.67ppm(都是H16)處的另一個(gè)亞甲基對。H16亞甲基偶合至H17。環(huán)戊烷環(huán)缺一個(gè)質(zhì)子，剩余質(zhì)子的大低磁場位移指示鄰近的雜原子。所有這些數(shù)據(jù)都和C17位存在的硫酸酯基團(tuán)一致。因此，確定M13是17-羥基DCDQ硫酸酯。
討論 設(shè)計(jì)本研究以獲得大鼠尿液分離的代謝產(chǎn)物，并獲得選擇的DCDQ代謝產(chǎn)物的更具體的結(jié)構(gòu)確證。單劑量給予三只雄性和三只雌性大鼠DCDQ 50mg/kg。在0-12和12-24小時(shí)間隔收集尿液。通過二階半制備型HPLC法，從尿液中分離DCDQ代謝物M7(酮類DCDQ)、M9(羥基DCDQ葡糖苷酸)和M13(羥基DCDQ硫酸酯)，其以低微克足量用于NMR光譜分析。根據(jù)MS和NMR譜分析，M7和M13的代謝位置在17位。M9的代謝位置在13位。通過本研究確定的M7、M9和M13的結(jié)構(gòu)確證進(jìn)一步精確了那些上文所討論的大鼠體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)。
口服給予后，[14C]DCDQ在健康志愿者中的體內(nèi)代謝 健康志愿者單次或重復(fù)服用各種劑量的DCDQ后，確定DCDQ在其血漿和尿液中的代謝分布。此外，在選取的樣品中測定了主要DCDQ代謝物(M6，氨基甲酰基葡糖苷酸)的相對濃度。
鑒別了血漿和尿液中的DCDQ和幾個(gè)DCDQ代謝物。DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)在血漿和尿液中都是主要的藥物相關(guān)性組分。DCDQ亞胺N-氧化物(M5)、未變化的DCDQ、DCDQ亞胺(P3)和其它相對量少的藥物相關(guān)性組分在血漿也觀察到。未改變的DCDQ、DCDQ N-氧化物葡糖苷酸(M40)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M38)、羥基DCDQ氨基甲?；咸擒账?M37)和許多其它相對量少的藥物相關(guān)性組分在尿液中排泄。
血漿中的M6的濃度隨劑量的增加而增加，并可見較大的個(gè)體差異。給藥后6-24小時(shí)血漿M6濃度隨時(shí)間降低。M6/DCDQ血漿濃度的比率在給藥后6小時(shí)高于給藥后12和24小時(shí)。給藥后6小時(shí)，平均比率為35.4-76.6。禁食和進(jìn)食的受試者服用300mg DCDQ，M6濃度和M6/DCDQ比率在二者之間沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。尿液中平均M6/DCDQ比率為84-1018。
結(jié)果顯示DCDQ在口服了DCDQ的健康受試者中進(jìn)行I期和II期代謝，并且氨基甲酰基葡糖苷酸化是主要的代謝途徑。與動(dòng)物研究相反，形成氨基甲?；咸擒账?M6)在人類中是主要的代謝途徑，并且M6在人血漿和尿液中是主要的藥物相關(guān)性代謝物。
材料和方法 方法 DCDQ鹽酸鹽的化學(xué)純度是98.6％，由Wyeth Research(PearlRiver，NY)合成。DCDQ氨基甲?；咸擒账嵊蒞yeth Research的化學(xué)部(Montreal，Canada)合成，其純度為95.5％。內(nèi)標(biāo)物(d8-DCDQ，批號L27347-140-A)由Wyeth Research(Pearl River，NY)的放射合成小組合成。報(bào)告的氘分布為d0-d50％、d60.1％、d72.7％和d897.1％。提取用和色譜分析用溶劑是HPLC和ACS試劑級的，來源于EMDChemicals(Gibbstown，NJ)。
方法 藥物給予和樣本收集 在隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照、增加的單劑量研究中，口服給予健康受試者和精神分裂癥和情感分裂性精神障礙受試者DCDQ，研究其安全性、耐受性、藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)，進(jìn)行藥物給予和樣本收集。樣本貯存于約-70℃至分析代謝物分布及氨基甲?；咸擒账?M6)/DCDQ的比率時(shí)。
樣品制備 在25mg重復(fù)增加劑量的研究中，兩位受試者中等和高暴露于DCDQ中，經(jīng)LC/MS分析代謝產(chǎn)物分布。在第1天和第14天從受試者9和41收集8hr的血漿樣品，進(jìn)行如下所述的處理和分析。內(nèi)標(biāo)不加入分析代謝產(chǎn)物分布用的樣品中。
血漿樣品來自50mg單劑量組禁食受試者25、28和30號，200ng單劑量組禁食受試者50、51和54號，300mg單劑量組中禁食受試者74、76和79號，300mg單劑量組進(jìn)食受試者83、84和86號以及500mg單劑量組禁食受試者92、94、96號，用于分析DCDQ氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)濃度。將內(nèi)標(biāo)d8-DCDQ(25μL 200ng/mL甲醇溶液)加入100μL血漿樣品中，然后加入300μL乙腈。將樣品混合并于14000rpm在Eppendorf 5415C離心機(jī)(Brinkman Instruments Inc.，Westbury，NY)中離心10分鐘。將各樣品的上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中，并在氮?dú)鈿饬髦性赥urboVap LV蒸發(fā)儀(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)中蒸發(fā)至干燥。殘余物再用50μL甲醇溶解，然后加入150μL水。將樣品如上述方法混合并離心。上清液經(jīng)LC/MS/MS分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品用加入了合成M6的對照血漿制備。標(biāo)準(zhǔn)曲線用M6的濃度為0-2500ng/mL血漿。
在單劑量組中來自相同受試者的0-4、4-12和12-24hr尿樣用于分析M6/DCDQ的比率。在尿樣分析中不使用內(nèi)標(biāo)。樣品用對照尿樣稀釋20倍，并直接用LC/MS分析。為估算人尿液中M6/DCDQ比率，對照尿樣加入200ng/mL DCDQ和1000、5000或10000ng/mL DCDQ氨基甲?；咸擒账幔⒔?jīng)LC/MS分析。
液相色譜/質(zhì)譜 在本研究中使用三個(gè)LC/MS系統(tǒng)。LC/MS系統(tǒng)1用于分析血漿和尿液樣品，以定性代謝產(chǎn)物。LC/MS系統(tǒng)2用于提供另外的MS/MS數(shù)據(jù)，以定性尿液中的DCDQ代謝產(chǎn)物。LC/MS系統(tǒng)3用于半制備分析血漿和尿液樣品中的代謝物M6(DCDQ氨基甲?；咸擒账?。
LC/MS系統(tǒng)1 LC/MS系統(tǒng)1用于分析血漿和尿液樣品，以定性代謝產(chǎn)物。使用此LC/MS系統(tǒng)的HPLC儀器包括Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)，其包括自動(dòng)采樣器、二元泵和二極管陣列UV檢測器。UV檢測器設(shè)為210-350nm檢測。HPLC流動(dòng)相包括10mM乙酸銨、pH4.5(A)和甲醇(B)，并以0.2mL/min的速度流出。線性流動(dòng)相梯度(HPLC梯度1)如下所示。LC/MS樣本分析期間，至多6min的起始流速在評估代謝產(chǎn)物之前將質(zhì)譜儀換向。
HPLC梯度1 使用LC/MS系統(tǒng)1的代謝產(chǎn)物定性用質(zhì)譜儀是Finnigan LCQ-Deca離子收集質(zhì)譜儀(Thermo Electron，San Jose，CA)。此質(zhì)譜儀配有電噴射離子化(ESI)接口，并以陽離子模式操作。LCQ質(zhì)譜儀的設(shè)置如下。
LC/MS系統(tǒng)2 LC/MS系統(tǒng)2用于提供另外的MS/MS數(shù)據(jù)，以定性尿液中的DCDQ代謝產(chǎn)物。使用LC/MS系統(tǒng)2的HPLC儀器包括Waters 2695型HPLC系統(tǒng)(Waters Corp.，Milford，MA)。其配有內(nèi)置的自動(dòng)采樣器和996型二極管陣列UV檢測器。UV檢測器設(shè)為210-400nm檢測。HPLC柱、流動(dòng)相、流速、從質(zhì)譜儀流出的轉(zhuǎn)移和梯度如上文LC/MS系統(tǒng)1所述。柱溫為25℃。
使用LC/MS系統(tǒng)2的定性代謝產(chǎn)物用質(zhì)譜儀是MicromassQuattro Micro三聯(lián)四極質(zhì)譜儀(Waters Corp.)，此質(zhì)譜儀配有電噴射接口并以陽離子模式操作。此質(zhì)譜儀的設(shè)置列出如下。
LC/MS系統(tǒng)3 LC/MS系統(tǒng)3用于半制備分析血漿和尿液樣品中的代謝物M6(DCDQ氨基甲?；咸擒账?。使用此LC/MS系統(tǒng)的HPLC儀器包括Thermo Surveyor HPLC(Thermo Electron Corp.，San Jose，CA)，其包括Surveyor MS泵和自動(dòng)采樣器。分離在5微米Phenomenex LunaC18(2)柱，150×2mm(Phenomenex，Torrance，CA)上完成。自動(dòng)采樣器和柱溫分別設(shè)為5℃和40℃。HPLC流動(dòng)相包括10mM乙酸銨(A)和甲醇(B)，并以0.2mL/min的速度流出。線性流動(dòng)相梯度(HPLC梯度2)如下所示。LC/MS樣本分析期間，至多3min的起始流速在評估代謝產(chǎn)物之前將質(zhì)譜儀換向。
HPLC梯度2 使用LC/MS系統(tǒng)3的半定量分析用質(zhì)譜儀是Finnigan TSQQuantum三聯(lián)四極質(zhì)譜儀(Thermo Electron Corp.)。此質(zhì)譜儀配有電噴射接口并以陽離子模式操作。此質(zhì)譜儀的設(shè)置列出如下。
在選擇的反應(yīng)檢測(SRM)模式(LC/SRM)中，使用以下設(shè)置進(jìn)行DCDQ和M6的LC/MS/MS分析。
數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)評估 計(jì)算機(jī)程序Microsoft Excel97用于計(jì)算平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并用于進(jìn)行t-檢驗(yàn)。Xcalibur(1.3版)和MassLynx軟件(4.0版)用于收集和分析LC/MS數(shù)據(jù)。M6/內(nèi)標(biāo)的峰面積比用于定量血漿中的M6。
結(jié)果 血漿中的代謝產(chǎn)物分布和M6濃度 確定了人血漿中的DCDQ和8個(gè)DCDQ代謝物(表33)。在單劑量和多劑量研究中的所有劑量中，DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)是血漿中的主要藥物相關(guān)性組分。在血漿中也可觀察到DCDQ亞胺N-氧化物(M5)、未改變的DCDQ、DCDQ亞胺(P3)和痕量羥基DCDQ、羥基DCDQ亞胺、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)和酮類DCDQ葡糖苷酸(M22)。在所有分析樣品中，代謝產(chǎn)物分布在質(zhì)上是相似的。
血漿M6濃度隨劑量增加而增加，并且可見較大的個(gè)體差異(表34)。在分析的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，M6濃度在給藥后6小時(shí)最高，并在給藥后12和24小時(shí)隨時(shí)間降低。M6/DCDQ的血漿濃度比率也在給藥后6小時(shí)最大，并通常隨時(shí)間降低。給藥后6小時(shí)，平均比率為35.4-76.6。服用了300mg DCDQ的禁食和進(jìn)食志愿者之間M6濃度和M6/DCDQ比率沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
尿液中代謝產(chǎn)物分布和M6/DCDQ比率 確定了尿液中的DCDQ和幾個(gè)DCDQ代謝產(chǎn)物。DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)是尿液中主要的藥物相關(guān)性組分，和血漿一樣。未改變的DCDQ、DCDQ N-氧化物葡糖苷酸(M40)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M38)、羥基DCDQ氨基甲?；咸擒账?M37)和痕量DCDQ亞胺(P3)、羥基DCDQ(M1和M32)、羥基DCDQ亞胺(M29)、酮類DCDQ葡糖苷酸(M22)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M9)、羥基DCDQ氨基甲?；咸擒账?M33、M36和M39)、DCDQ亞胺葡糖苷酸(M34)和二羥基DCDQ亞胺葡糖苷酸(M35)在尿液中也可觀察到。氨基甲?；咸擒账?M6)以較母體藥物高得多的濃度存在于尿液中(表35)。平均M6/DCDQ比率為84-1018；可見較大的差異。500mg劑量組中的比率似乎較其它劑量組低。
經(jīng)液相色譜法/質(zhì)譜法質(zhì)譜定性的代謝產(chǎn)物通過LC/MS和LC/MS/MS分析人血漿和尿液中的DCDQ及其代謝物獲得。表33概括了本研究中定性的DCDQ代謝產(chǎn)物。因?yàn)镸6(DCDQ氨基甲?；咸擒账?是血漿和尿液中主要的DCDQ相關(guān)性組分，所以未改變的DCDQ的相對濃度相對較低。因此，下文更詳細(xì)地討論了DCDQ相關(guān)組分的質(zhì)譜定性，血漿或尿液中存在的DCDQ約與未改變的DCDQ相同或濃度較后者高。
DCDQ 與代謝物相比較，檢查了DCDQ真標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜定性。在DCDQ的LC/MS譜中，質(zhì)子化的分子離子，[M+H]+，在m/z 229處可見。從[M+H]+失去NH3得到m/z 212。從分子離子失去亞甲基胺、亞乙基胺和亞丙基胺分別得到m/z 200、186和171處的產(chǎn)物離子。從分子離子失去丙烯基團(tuán)得到m/z 187，并進(jìn)一步失去亞甲基胺和亞乙基胺得到m/z 158和144。從[M+H]+失去環(huán)戊烯得到m/z 161。失去環(huán)戊基-亞甲基胺基團(tuán)得到m/z 132處的產(chǎn)物離子。
代謝產(chǎn)物M5 代謝產(chǎn)物M5在m/z 243處產(chǎn)生[M+H]+，此值較DCDQ高14Da，并較P3高16Da。這些數(shù)據(jù)表明M5是酮類DCDQ代謝物、羥基DCDQ代謝物、羥基DCDQ亞胺或DCDQ亞胺N-氧化物。從[M+H]+失去NH3和H2O分別得到m/z 226和225，這符合添加了一個(gè)氧原子。認(rèn)為從分子離子失去亞甲基胺得到m/z 213，符合添加了氧原子，并且失去的兩個(gè)氫處存在雙鍵。m/z 130處的產(chǎn)物離子在P3中也可見，并且較DCDQm/z 132的對應(yīng)離子少2Da。這些數(shù)據(jù)表明M5也含有亞胺基團(tuán)，考慮其去掉酮類DCDQ。M5的HPLC保留時(shí)間較DCDQ和P3(DCDQ亞胺)都長，這在體外代謝研究1中也可觀察到，并與N-氧化作用一致。因此，確定M5是DCDQ亞胺N-氧化物。
代謝產(chǎn)物M6 M6的[M+H]+在m/z 449處可見，此值較DCDQ高220Da。從分子離子失去176Da得到m/z 273，表明M6是葡糖苷酸。從m/z 273進(jìn)一步失去44Da得到m/z 229，此也是DCDQ的分子離子。m/z 212和186處的產(chǎn)物離子在DCDQ也可觀察到，與作為DCDQ綴合物的M6一致。因此，確定M6是DCDQ的氨基甲?；咸擒账帷?br> 代謝產(chǎn)物M38 M38的[M+H]+在m/z 421處可見，此值較DCDQ高192Da。從[M+H]+失去NH3得到m/z 404，這表明在二氮雜環(huán)上未改變的氨基基團(tuán)。從分子離子失去176Da得到m/z 245，這也是羥基DCDQ代謝物的分子離子。從m/z 245失去NH3和H2O分別得到m/z 228和227。這些數(shù)據(jù)表明M38是羥基DCDQ的葡糖苷酸。m/z 362處的產(chǎn)物離子較DCDQm/z 186的對應(yīng)離子高176Da，這表明喹啉-環(huán)戊烷部分的葡糖苷酸化。認(rèn)為m/z 362和269處的產(chǎn)物離子包括葡糖醛酸部分，并且是如重排方案中所示的二氮雜、喹啉和環(huán)戊烷重排所致。這些數(shù)據(jù)符合喹啉氮的葡糖苷酸化和二氮雜環(huán)的羥化。因此，確定M38是羥基DCDQ葡糖苷酸。
代謝產(chǎn)物M40 M40的[M+H]+在m/z 421處可見，此值較DCDQ高192Da。從[M+H]+失去H2O得到m/z 403。從[M+H]+未失去NH3，表明修飾的氨基基團(tuán)在二氮雜環(huán)上。從分子離子失去176Da得到m/z 245，這也是羥基DCDQ分子離子。然而，M40m/z 245相對強(qiáng)度較代謝產(chǎn)物M38中觀察到的弱。從m/z 245失去一個(gè)氧原子得到m/z 229，也是DCDQ的分子離子。這些數(shù)據(jù)和m/z 229存在的數(shù)據(jù)組合在一起作為離子收集質(zhì)譜中的基礎(chǔ)峰，而不是如代謝產(chǎn)物M38可見的m/z 245，表明存在N-氧化物。m/z 228、227、212和210處的產(chǎn)物離子分別由從如重排方案所示的m/z 245和229處失去H2O和NH3得到。M40的HPLC保留時(shí)間較M38的長，這也符合M40是N-氧化物。也可見DCDQ中的m/z200和186處的產(chǎn)物離子，并認(rèn)為其是由從M40對應(yīng)的N-氧化物產(chǎn)物離子失去一個(gè)氧原子所致。認(rèn)為m/z 360和271處的產(chǎn)物離子包括葡糖醛酸部分，并且是由如重排方案所示的二氮雜、喹啉和環(huán)戊烷環(huán)重排所致。這些數(shù)據(jù)與二氮雜環(huán)的氨基葡糖苷酸化作用和喹啉氮的N-氧化作用一致。因此，認(rèn)為M40是DCDQ N-氧化物葡糖苷酸。
討論 DCDQ在人體中進(jìn)行代謝。DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)在血漿和尿液中都是主要的藥物相關(guān)性組分。DCDQ亞胺N-氧化物(M5)、未改變的DCDQ、DCDQ亞胺(P3)是血漿中可見的其它主要藥物相關(guān)性組分。未改變的DCDQ、DCDQ N-氧化物葡糖苷酸(M40)、羥基DCDQ葡糖苷酸(M38)、羥基DCDQ氨基甲?；咸擒账?M37)經(jīng)尿液排泄。
血漿M6的濃度隨劑量增加而增加，并且可見較大的個(gè)體差異。M6濃度在給藥后6-24小時(shí)隨時(shí)間降低。M6/DCDQ血漿濃度的比率在給藥后6小時(shí)較12和24小時(shí)高。在給藥后6小時(shí)，平均比率為35.4-76.6。相反，在先前的體外和體內(nèi)研究中檢出的M6的量要低得多。在服用了300mg DCDQ的禁食和進(jìn)食受試者之間M6的濃度和M/DCDQ的比率沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。尿液中平均M6/DCDQ比率為84-1018?？傊?，在健康受試者中，DCDQ進(jìn)行I期和II期代謝，并且氨基甲酰基葡糖苷酸化是主要的代謝途徑。與動(dòng)物研究相反，氨基甲?；咸擒账峄侵饕拇x途徑。與動(dòng)物研究相反，形成氨基甲酰基葡糖苷酸(M6)是人體中的主要代謝途徑，并且M6是人血漿和尿液中的主要藥物相關(guān)性代謝產(chǎn)物。
表33.經(jīng)LC/MS定性人血漿和尿液中的DCDQ代謝產(chǎn)物 a保留時(shí)間，來源于LC/MS數(shù)據(jù) bP＝血漿，U＝尿液 表34健康受試者服用DCDQ后血漿中DCDQ和DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)的濃度(ng/mL) a通過用驗(yàn)證法生物分析人血漿測定DCDQ濃度。4在生物轉(zhuǎn)化中使用由合成的M6得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)非驗(yàn)證性LC/MS法定量DCDQ的濃度。
b標(biāo)準(zhǔn)偏差未計(jì)算； cNA，因?yàn)檠獫{DCDQ水平低于定量水平而未分析。
表35健康受試者服用DCDQ后尿液中DCDQ的濃度(ng/mL)和DCDQ氨基甲?；咸擒账?M6)/DCDQ比率 a通過用驗(yàn)證法生物分析人尿液測定DCDQ濃度。6在生物轉(zhuǎn)化中使用由合成的M6得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)非驗(yàn)證性LC/MS法定量M6的濃度。
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權(quán)利要求
1.式I的化合物或其可藥用的鹽
其中
對于各Rn和Rn′，其中n是1-8
各Rn和Rn′獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G；或者
Rn和對應(yīng)的Rn′，其中n是2、3、4、6、7或8，與其連接的碳一起結(jié)合形成C＝O；或者
Rn連同對應(yīng)的Rn+1，其中n是1、2、3、4、5或7，一起結(jié)合在其連接的碳之間形成雙鍵，并且各對應(yīng)的Rn′和R(n+1)′獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G；
G具有下式
其中用*標(biāo)記的氮可任選形成N-氧化物；
X-Y是CH＝N、CH＝N(O)、CH2N(O)、C(O)NH或CR9HNR10；
R9是氫、羥基或-OSO3H；
R10是氫、乙?；?、-SO3H、-G或-C(O)-OG；
Z是氫、羥基、-OSO3H或-O-G；
條件是當(dāng)Z是羥基時(shí)，那么或者(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10之一不是氫；或者(b)X-Y不是CR9HNR10；并且
另外的條件是當(dāng)X-Y是CHR9NR10時(shí)，那么Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中至少一個(gè)不是H。
2.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中Z和R1～R8中至少一個(gè)是-OH。
3.權(quán)利要求2的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是CR9HNR10。
4.權(quán)利要求2的化合物或其可藥用的鹽，其中R9＝R10＝H。
5.權(quán)利要求4的化合物或其可藥用的鹽，其中R7和R8至少一個(gè)是-OH。
6.權(quán)利要求4的化合物或其可藥用的鹽，其中R6是-OH。
7.權(quán)利要求4的化合物或其可藥用的鹽，其中R3和R4至少一個(gè)是-OH。
8.權(quán)利要求4的化合物或其可藥用的鹽，其中R1、R5、R6、R7和Z至少一個(gè)是-OH。
9.權(quán)利要求2的化合物或其可藥用的鹽，其中R9是H且R10是乙?；?。
10.權(quán)利要求9的化合物或其可藥用的鹽，其中R7和R8至少一個(gè)是-OH。
11.權(quán)利要求2的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是CH＝N。
12.權(quán)利要求11的化合物或其可藥用的鹽，其中R1～R6中至少一個(gè)是-OH。
13.權(quán)利要求11的化合物或其可藥用的鹽，其中R2～R4中至少一個(gè)是-OH。
14.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中R1～R6、R9、R10和Z中至少一個(gè)是-C(O)-O-G、-O-G或-G。
15.權(quán)利要求14的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是CR9HNR10。
16.權(quán)利要求15的化合物或其可藥用的鹽，其中R9和R10是H。
17.權(quán)利要求15的化合物或其可藥用的鹽，其中Z、R3和R4至少一個(gè)是-O-G。
18.權(quán)利要求14的化合物或其可藥用的鹽，其中R1～R6、R9和Z中至少一個(gè)是-O-G。
19.權(quán)利要求14的化合物或其可藥用的鹽，其中R2和R3一起在其相連的碳之間形成雙鍵，并且R3′和R4至少一個(gè)是O-G。
20.權(quán)利要求15的化合物或其可藥用的鹽，其中R4和R4′與其相連的碳一起形成C＝O。
21.權(quán)利要求20的化合物或其可藥用的鹽，其中R10是-G。
22.權(quán)利要求15的化合物或其可藥用的鹽，其中R10是-C(O)O-G。
23.權(quán)利要求15的化合物或其可藥用的鹽，其中R10是乙酰基。
24.權(quán)利要求23的化合物或其可藥用的鹽，其中R1～R6、R9和Z中至少一個(gè)是-O-G。
25.權(quán)利要求23的化合物或其可藥用的鹽，其中R7和R8至少一個(gè)是-O-G。
26.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中R1～R9和Z至少一個(gè)是-OSO3H。
27.權(quán)利要求26的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是-CHR9NR10。
28.權(quán)利要求26或27的化合物或其可藥用的鹽，其中R9＝R10＝H。
29.權(quán)利要求28的化合物或其可藥用的鹽，其中R1～R6中至少一個(gè)是-OSO3H。
30.權(quán)利要求28的化合物或其可藥用的鹽，其中R2和R3至少一個(gè)是-OSO3H。
31.權(quán)利要求28的化合物或其可藥用的鹽，其中R3是-OSO3H。
32.權(quán)利要求26或27的化合物或其可藥用的鹽，其中R9和Z至少一個(gè)是-OSO3H。
33.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是CR9HNR10，而R9是H且R10是-SO3H。
34.權(quán)利要求33的化合物或其可藥用的鹽，其中至少兩個(gè)Rn和對應(yīng)的Rn+1，其中n＝1-5，在其相連的碳之間形成雙鍵。
35.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中Rn和對應(yīng)的Rn′與其相連的碳一起形成C＝O。
36.權(quán)利要求35的化合物或其可藥用的鹽，其中R4和對應(yīng)的R4′與其相連的碳一起形成C＝O。
37.權(quán)利要求36的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是CR9HNR10。
38.權(quán)利要求36或37的化合物或其可藥用的鹽，其中R10是-G。
39.權(quán)利要求36或37的化合物或其可藥用的鹽，其中R9和R10是H。
40.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是C(O)NH。
41.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是CH＝N。
42.權(quán)利要求41的化合物或其可藥用的鹽，其中R1～R6中至少一個(gè)是-OH。
43.權(quán)利要求42的化合物或其可藥用的鹽，其中R2～R4中至少一個(gè)是-OH。
44.權(quán)利要求42的化合物或其可藥用的鹽，其中R6和R7之間的氮形成N-氧化物。
45.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中至少一個(gè)Rn和對應(yīng)的Rn+1，其中n＝1-5，在其相連的碳原子之間形成雙鍵，并且各Rn和R(n+1)′獨(dú)立地是氫、羥基、CH3C(O)-O、-OSO3H或-O-G。
46.權(quán)利要求45的化合物或其可藥用的鹽，其中n＝2。
47.權(quán)利要求45的化合物或其可藥用的鹽，其中R2′＝H，且R3′或R4是-O-G。
48.權(quán)利要求45的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y是CHR9NR10。
49.權(quán)利要求48的化合物或其可藥用的鹽，其中R9＝R10＝H。
50.權(quán)利要求45的化合物或其可藥用的鹽，其中至少兩個(gè)Rn，各所述的Rn和其對應(yīng)的Rn+1，其中n＝1-5，在其相連的碳之間形成雙鍵。
51.權(quán)利要求50的化合物或其可藥用的鹽，其中X-Y＝CHR9NR10。
52.權(quán)利要求51的化合物或其可藥用的鹽，其中R10是H；且Z或R9是-OSO3H。
53.權(quán)利要求50的化合物或其可藥用的鹽，其中R9＝R10＝H。
54.權(quán)利要求45的化合物或其可藥用的鹽，其中R9是H且R10是-SO3H。
55.權(quán)利要求45的化合物或其可藥用的鹽，其中R9是H且R10是乙?；?br> 56.一種制備式M6的化合物的方法
包含
在偶合試劑存在下，在充足的條件下，化合物6a
其中各L、L1和L2是離去基團(tuán)；
和DCDQ
反應(yīng)，生成化合物7
并除去所述離去基團(tuán)L1和L2。
57.權(quán)利要求56所述的方法，其中L具有下式
58.權(quán)利要求56所述的方法，其中L1和L2獨(dú)立地選自低級烷基和乙?；?br> 59.權(quán)利要求56所述的方法，其中L1是甲基且各L2是乙酰基。
60.權(quán)利要求56所述的方法，進(jìn)一步包含
通過除去化合物7葡糖醛酸基部分的L1和L2保護(hù)基團(tuán)將化合物7脫保護(hù)，從而形成所述的M6代謝物。
61.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的偶合試劑選自BOP、DCC和EDC。
62.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的偶合試劑是BOP。
63.權(quán)利要求56所述的方法，其中化合物6和所述偶合試劑及DCDQ的所述反應(yīng)在胺存在下進(jìn)行。
64.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述的胺是許尼希氏堿。
65.權(quán)利要求63所述的方法，其中化合物6和所述偶合試劑及DCDQ的所述反應(yīng)在溶劑中進(jìn)行。
66.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的溶劑是CH2Cl2。
67.權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的化合物7在脫保護(hù)之前經(jīng)柱色譜法純化。
68.權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的脫保護(hù)在堿存在下在醇中進(jìn)行。
69.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的堿選自NaOH、LiOH和KOH。
70.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的醇是低級烷基醇。
71.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的脫保護(hù)用MeOH/H2O/THF中的LiOH·H2O進(jìn)行。
72.權(quán)利要求71所述的方法，其中MeOH/H2O/THF的比率約為2.5∶1.0∶0.5。
73.權(quán)利要求71所述的方法，其中所述的脫保護(hù)在0℃進(jìn)行1小時(shí)。
74.權(quán)利要求60所述的方法，其進(jìn)一步包含純化所述的M6代謝物。
75.權(quán)利要求57所述的方法，其中化合物6a使用催化劑和親核試劑通過除去化合物5的烷基保護(hù)基制備
76.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述的催化劑是Pd(PPh3)4。
77.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述的親核試劑是嗎啉。
78.權(quán)利要求75所述的方法，其中化合物5如下制備在充足的條件下，羧酸2
和DPPA反應(yīng)得到酰基疊氮化合物中間體；
在充足的條件下加熱得到的?；B氮化合物中間體得到異氰酸酯3
并且
在充足的條件下用2，3，4，-三乙?；?1-羥基葡糖醛酸酯4
處理所述加熱步驟的產(chǎn)物，得到化合物5。
79.權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的反應(yīng)步驟在堿存在下進(jìn)行。
80.權(quán)利要求79所述的方法，其中所述的堿是Et3N。
81.權(quán)利要求78所述的方法，其中化合物2在催化劑存在下，經(jīng)聯(lián)苯二甲酸酐和過量的烯丙醇反應(yīng)制備。
82.權(quán)利要求81所述的方法，其中所述的烯丙醇是丙-2-烯-1-醇。
83.權(quán)利要求81所述的方法，所述的催化劑是DMAP。
84.一種選自下式的化合物
或其可藥用鹽。
85.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求84的一種化合物或其可藥用的鹽。
86.一種選自下式的化合物
或其可藥用鹽。
87.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求86的一種化合物或其可藥用的鹽。
88.一種選自下式的化合物
和
或其可藥用鹽。
89.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求88的一種化合物或其可藥用的鹽。
90.一種選自下式的化合物
和
或其可藥用鹽。
91.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求90的一種化合物或其可藥用的鹽。
92.一種選自下式的化合物
或其可藥用鹽。
93.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求92的一種化合物或其可藥用的鹽。
94.一種選自下式的化合物
和
或其可藥用鹽。
95.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求94的一種化合物或其可藥用的鹽。
96.一種選自下式的化合物
和
或其可藥用鹽。
97.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求96的一種化合物或其可藥用的鹽。
98.一種組合物，其包含權(quán)利要求1～55任意一項(xiàng)的化合物或其可藥用的鹽以及一種或多種可藥用載體。
99.一種治療方法，其包含給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，或者含有這一化合物或鹽的組合物，所述患者患有以下疾病精神分裂癥、精神分裂癥樣精神障礙、精神分裂性精神障礙、妄想性精神障礙、物質(zhì)誘發(fā)的精神障礙、L-DOPA-誘發(fā)的精神病、阿爾茨海默氏癡呆相關(guān)性精神病、帕金森氏病相關(guān)性精神病、Lewy體病相關(guān)性精神病、癡呆、記憶缺陷或阿爾茨海默氏病相關(guān)性智力缺陷疾病。
100.權(quán)利要求99所述的方法，其中所述患者患有精神分裂癥。
101.一種治療方法，其包含給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，或者含有這一化合物或鹽的組合物，所述患者患有以下疾病雙相性精神障礙、抑郁癥、情緒發(fā)作、焦慮癥、適應(yīng)障礙或進(jìn)食障礙。
102.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述雙相性精神障礙是I型雙相性精神障礙、II型雙相性精神障礙或循環(huán)情感性精神障礙；所述抑郁癥是嚴(yán)重抑郁癥、情緒惡劣性障礙或物質(zhì)誘發(fā)的情感障礙；所述情緒發(fā)作是嚴(yán)重抑郁癥發(fā)作、躁狂發(fā)作、混合型發(fā)作或輕度躁狂發(fā)作；所述焦慮癥是驚恐發(fā)作、廣場恐怖癥、恐慌癥、特定恐懼癥、社交恐懼癥、強(qiáng)迫癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、急性應(yīng)激障礙、泛化性焦慮癥、分離性焦慮癥或物質(zhì)誘發(fā)性焦慮癥。
103.權(quán)利要求102所述的方法，其中所述的癥狀是抑郁癥、雙相性精神障礙或情緒發(fā)作。
104.一種治療方法，其包含給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，或者含有這一化合物或其可藥用的鹽的組合物，所述患者患有以下疾病癲癇、睡眠障礙、偏頭痛、性功能障礙、藥物成癮、酒精成癮、胃腸道疾病或肥胖癥。
105.一種治療方法，其包含給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，或者含有這一化合物或其可藥用的鹽的組合物，所述患者患有以下疾病創(chuàng)傷、中風(fēng)或脊髓損傷相關(guān)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷。
106.權(quán)利要求1的化合物或其可藥用的鹽，其中Z、各Rn和各Rn′是H；并且X-Y是CR9HNR10。
107.權(quán)利要求106的化合物或其可藥用的鹽，其中R9是H。
108.權(quán)利要求106的化合物或其可藥用的鹽，其中R9是H且R10是-C(O)-OG。
109.一種組合物，其含有一種權(quán)利要求106-108任意一項(xiàng)的化合物或其可藥用的鹽和一種或多種可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及某些[1，4]二氮雜并[6，7，1-IJ]喹啉衍生物的代謝產(chǎn)物及其制備方法和用途。具體而言，本發(fā)明涉及式I化合物，其中各取代基在本文定義。本發(fā)明還提供了包括式I化合物的藥物組合物、制備這些化合物的方法和使用這些化合物的方法。
文檔編號A61K31/551GK101124225SQ200580044953
公開日2008年2月13日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者A·C·貝奇二世, P·S·拉馬穆蒂, 仝澤恩, 志 王, W·德梅奧, R·A·喬丹, G·P·斯塔克, 汪有初 申請人:惠氏公司