專利名稱：偕二氟化c－糖肽、其制備方法及其用于保存生物材料和/或在冷凍外科中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種方法，用于合成偕二氟化(gem-difluorinated)C-糖肽化合物。其特別，但并非排他性地用于制備尤其可用于保存生物材料和用于冷凍外科中的化合物或組合物。
背景技術(shù)：
抗凍生物化合物存在于自然環(huán)境中，特別是糖蛋白。例如在一些魚中存在有一些化合物，使得這些魚能在低溫環(huán)境存活，即，在接近零度或零度以下的溫度存活。
此外，已知當(dāng)水凍結(jié)時(shí)，該現(xiàn)象伴隨體積增加，這是由于冰的三維生長導(dǎo)致的。
這種體積增加以及導(dǎo)致的滲透，在活組織中造成了嚴(yán)重的損傷細(xì)胞膜破裂、血液停止流動(dòng)以及細(xì)胞微結(jié)構(gòu)被擾亂。
很多年來，科學(xué)家們一直在研究如何用從自然環(huán)境(魚、兩棲動(dòng)物、植物、昆蟲)獲得的抗凍化合物對上述現(xiàn)象造成影響，這些化合物尤其是蛋白質(zhì)和糖蛋白。
深入的研究集中于對足夠穩(wěn)定，并且其活性與天然分子的活性至少相等或者甚至更高的類似化合物的合成，以用于商業(yè)應(yīng)用。
由于存在糖苷(osidic)鍵(涉及被稱為處于異頭(anomeric)位置的氧的鍵)，糖蛋白相對多種酶系統(tǒng)(包括糖苷酶)來說是脆弱的，其還對酸堿水解敏感，從而更難以對它們進(jìn)行合成。
因此，為允許這些化合物保持它們的生物學(xué)性質(zhì)，替換糖苷鍵中的氧，使得該鍵不再被任何酶促過程破壞是人們感興趣的。
其中氧被CH2基團(tuán)代替的類似物已被合成，但是盡管有穩(wěn)定性增加以及類似氧的空間阻礙(steric hindrance)，CH2基團(tuán)并不總是證明為糖苷鍵氧的良好模擬物。因此，最初的化合物的生物學(xué)性質(zhì)并沒有總能顯現(xiàn)出來。
為賦予生物培養(yǎng)基中糖綴合物(glycoconjugate)化合物增加的穩(wěn)定性，正在研究其中氧被氮或硫以及更近來地二氟亞甲基替換的其它組的化合物。
CF2基團(tuán)顯示出了對于生物化學(xué)降解過程的特別的抗性，因此允許對不可水解的結(jié)構(gòu)加以合成。
該O/CF2換位看起來特別適合在電子水平上模擬氧；兩個(gè)氟原子作為兩個(gè)不含氧的游離電子對(free doublets)發(fā)揮作用。
所述化合物可能能用于大量應(yīng)用，例如保存細(xì)胞、血小板、組織、器官或者用于冷凍外科。
人們存在強(qiáng)烈的需要，以改進(jìn)對不能代替的活細(xì)胞(包括精子、卵子和胚胎)的貯藏和保存，使得較之目前使用的方法它們經(jīng)歷少得多的損傷。
術(shù)語“保存(preservation)”通常包括在不同溫度下保存，包括低至-196℃的冷凍保存。
因此，用作為佐劑以用于保存并且具有良好穩(wěn)定性的化合物可用于保存生物材料，尤其是-用于沒有時(shí)間地情況下貯藏整個(gè)的人類器官，例如，待移植的腎臟、心臟和肝臟，-用于在最小損傷的情況下以及足夠長時(shí)間地保存脆弱的組織，以允許，可選地，國際運(yùn)送，-用于保存血小板和細(xì)胞，-用于保護(hù)某些生物體、細(xì)菌、病毒或疫苗。
冷凍外科也被稱為冷凍療法，其是用液氮(或氬氣)產(chǎn)生極端的冷以破壞異常組織。
其用于治療外部腫瘤，例如皮膚腫瘤，其還用于治療體內(nèi)腫瘤，尤其是前列腺和肝臟中的。研究者已試著將冷凍外科作為治療手段用于一定數(shù)量的癌癥，包括乳腺癌、結(jié)腸和腎臟癌癥。
此外，一些研究報(bào)導(dǎo)，一定濃度(5-10mg/ml)的抗凍糖蛋白產(chǎn)生針型冰晶，這增加了冷凍期間細(xì)胞破裂和死亡的可能性。如果可與冷凍外科聯(lián)合使用的話，經(jīng)由抗凍糖蛋白和蛋白質(zhì)修飾的冰晶的該性質(zhì)在治療某些癌癥的方面引起強(qiáng)烈的興趣。
基于此，本發(fā)明的目的是解決上面提到的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)此目的，我們提出了一種偕二氟化C-糖肽，其具有通式I 其中N是1至5的整數(shù)，R4＝H、AA1、AA1-AA2，R5＝OH、AA1、AA1-AA2，AA1和AA2是獨(dú)立的，它們代表具有非官能性側(cè)鏈的氨基酸，并且R1、R2、R3是獨(dú)立的基團(tuán)，以及如果R1＝R2＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R3＝
其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，如果R1＝R3＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R2＝
其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，如果R2＝R3＝H、CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R1＝
其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基。
在R4和R5官能基中，氨基酸AA1和AA2是具有非官能性側(cè)鏈的氨基酸，即，非極性的，例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸......
在R6官能基中，糖苷可以是任何糖，例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、......
根據(jù)一種變體，本發(fā)明的偕二氟化C-糖肽化合物是結(jié)構(gòu)式II的 其中N是1至5的整數(shù)，并且R1、R2、R3是獨(dú)立的基團(tuán)，以及如果R1＝R2＝H、CH3，那么R3＝ 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，如果R1＝R3＝H、CH3，那么R2＝ 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，
R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，如果R2＝R3＝H、CH3，那么R1＝ 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基。
根據(jù)第二種變體，所述化合物可以更為精確地是通式III 其中N是1至5的整數(shù)，n是3至4的整數(shù)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氫原子，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，R9＝H、CH3，
R10＝H、CH3，R11是氫原子(H)，或保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)。
當(dāng)處于可能的可藥用堿(base)、對酸的加成鹽、水合物或溶劑化物以及其任何衍生物的狀態(tài)時(shí)，通式I-III的化合物可以以適合使用的不同蓋侖劑型生產(chǎn)，例如作為溶液或混懸劑，可選地為可注射的。
通式II和III的化合物以及通式I的一些化合物可以是通式I的化合物的合成中間體。
一些組合物可含有至少一種通式I、II或III的化合物或者至少一種其衍生物或者至少一種通過向可藥用無機(jī)或有機(jī)酸加成獲得的其鹽。
此外，通式I-III的該化合物可通過具有通式IV的化合物 其中Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)、CH2-糖苷基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，例如烷基、芐基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基與通式V的化合物之間的反應(yīng)來制備， 其中N是1至5的整數(shù)，R15＝H、AA1、AA1-AA2或保護(hù)基，R16＝OH、AA1、AA1-AA2或保護(hù)基，AA1和AA2是獨(dú)立的，它們代表具有非官能性側(cè)鏈的氨基酸，并且R12、R13、R14是獨(dú)立的基團(tuán)，如果R12＝R13＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R14＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整數(shù)，如果R12＝R14＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R13＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整數(shù)，如果R13＝R14＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R12＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整數(shù)。
除了可藥用惰性、無毒賦形劑，例如蒸餾水、葡萄糖、淀粉、乳糖、滑石粉、植物油、乙二醇......之外，由此獲得的組合物還可含有防腐劑。
其它活性成分可加入到上述組合物中。
所述組合物中，根據(jù)本發(fā)明的化合物和其它可選活性成分的量可根據(jù)應(yīng)用、可應(yīng)用的患者的年齡和體重而變化。


下面是對本發(fā)明的化合物的制備的例子，它們作為非限制性的例子，并參考附圖，其中圖1是獲得化合物3的反應(yīng)方程式；圖2是獲得化合物5的反應(yīng)方程式；圖3是獲得化合物1的反應(yīng)方程式；圖4是獲得化合物7的反應(yīng)方程式；圖5是獲得化合物9的反應(yīng)方程式；圖6是獲得化合物10的反應(yīng)方程式；圖7是獲得化合物12的反應(yīng)方程式；圖8是獲得化合物13的反應(yīng)方程式；圖9是獲得化合物14的反應(yīng)方程式；圖10是獲得化合物15的反應(yīng)方程式；圖11是獲得化合物16的反應(yīng)方程式；圖12是獲得化合物19的反應(yīng)方程式；圖13是獲得化合物21的反應(yīng)方程式；圖14是獲得化合物22的反應(yīng)方程式；圖15a、15b、15c是分別獲得化合物23、24、25的反應(yīng)方程式；圖16是獲得化合物26的反應(yīng)方程式；圖17是獲得化合物12或27的反應(yīng)方程式；圖18是獲得化合物28的反應(yīng)方程式；圖19是獲得化合物29的反應(yīng)方程式；圖20是獲得化合物30的反應(yīng)方程式；圖21是4℃時(shí)化合物15對HEK293存活率的影響的示意圖；
圖22是2℃時(shí)化合物15對HEK293存活率的影響的示意圖；圖23是0℃時(shí)化合物15對HEK293存活率的影響的示意圖；圖24是-2℃時(shí)化合物15對HEK293存活率的影響的示意圖；圖25是-4℃時(shí)化合物15對HEK293存活率的影響的示意圖；圖26是-20℃時(shí)化合物15對HEK293存活率的影響的示意圖；圖27是22℃時(shí)化合物15對血小板凝聚的影響的示意圖；圖28是15℃時(shí)化合物15對血小板凝聚的影響的示意圖；圖29是4℃時(shí)化合物15對血小板凝聚的影響的示意圖；圖30是-2℃時(shí)化合物15(單體)對H9c2(2-1)細(xì)胞的影響的示意圖；圖31是-2℃時(shí)化合物30(二聚體)對H9c2(2-1)細(xì)胞的影響的示意圖；圖32是不同時(shí)間對單體15和二聚體30的比較的示意圖；圖33是采用1mg/mL單體15和二聚體30，暴露8小時(shí)后心臟細(xì)胞的存活率的示意圖；圖34是采用1mg/mL單體15和二聚體30，暴露16小時(shí)后心臟細(xì)胞的存活率的示意圖；圖35是采用1mg/mL單體15和二聚體30，暴露22小時(shí)后心臟細(xì)胞的存活率的示意圖；圖36是室溫(22℃)存在1mg/mL單體15和二聚體30時(shí)心臟細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖37是4℃存在1mg/mL單體15和二聚體30時(shí)心臟細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖38是-3℃存在1mg/mL單體15和二聚體30時(shí)心臟細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖39是-10℃存在1mg/mL單體15和二聚體30時(shí)心臟細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖40是3℃存在1mg/mL單體15時(shí)心臟細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；
圖41是3℃以及4.4mM糖蛋白15和30的情況下心臟細(xì)胞的存活率的示意圖；圖42是-3℃以及4.4mM糖蛋白15和30的情況下心臟細(xì)胞的存活率的示意圖；圖43是-3℃時(shí)隨著糖蛋白15和30的濃度增加心臟細(xì)胞的存活率的示意圖；圖44是采用5mg/mL單體15，暴露8小時(shí)后皮膚細(xì)胞的存活率的示意圖；圖45是采用5mg/mL單體15，暴露12小時(shí)后皮膚細(xì)胞的存活率的示意圖；圖46是采用5mg/mL單體15，暴露20小時(shí)后皮膚細(xì)胞的存活率的示意圖；圖47是采用5mg/mL單體15，暴露30小時(shí)后皮膚細(xì)胞的存活率的示意圖；圖48是室溫(22℃)存在5mg/mL單體15時(shí)皮膚細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖49是3℃存在5mg/mL單體15時(shí)皮膚細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖50是-3℃存在5mg/mL單體15時(shí)皮膚細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖51是在化合物15的逐漸增加的濃度下暴露20小時(shí)后皮膚細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖52是在化合物15的逐漸增加的濃度下暴露34小時(shí)后皮膚細(xì)胞的存活率隨時(shí)間的示意圖；圖53是37℃時(shí)低血清培養(yǎng)基(粘附培養(yǎng))中10mg/ml的化合物15對于細(xì)胞存活率的影響的示意圖；圖54是15℃時(shí)低血清培養(yǎng)基中10mg/ml的化合物15對于細(xì)胞存活率的影響的示意圖；圖55是第1天細(xì)胞的示意圖；
圖56是15℃時(shí)培養(yǎng)基中15mg/ml的化合物15對于細(xì)胞存活率的影響的示意圖；圖57是3℃時(shí)培養(yǎng)基中15mg/ml的化合物15對于細(xì)胞存活率的影響的示意圖；圖58是37℃時(shí)H2O2對于用15mg/ml的化合物15處理的細(xì)胞的影響的示意圖；圖59是化合物15對于H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響的示意圖。
具體實(shí)施例方式
使用的縮寫如下所示eq.當(dāng)量 g克Hz赫茲mg毫克MHz兆赫茲min.分鐘 mL毫升mmol毫摩爾μmol微摩爾 nmol納摩爾用于進(jìn)行對本文所述所有化合物的分析的設(shè)備特征在下文中給出1H、13C和19F NMR譜記錄于BRUKER DPX 300和DPX 600波譜儀上。對于1H和13C NMR而言，四甲基硅烷用作為內(nèi)標(biāo)。對19F NMR而言，外標(biāo)是氟三氯甲烷CFCl3?；瘜W(xué)位移以百萬分?jǐn)?shù)(ppm)表示，偶合常數(shù)J以赫茲(Hz)表示。
使用下述縮寫s表示窄的單峰(pour singlet)，bs表示寬的單峰，d表示雙重峰，t表示三重峰，q表示四重峰，m表示多重峰，dd表示兩組雙重峰......
質(zhì)譜在下述型號的質(zhì)譜儀上獲得Micromass TOF-SPEC，E 20 kV，α-氰基。對于MALDI離子化而言JEOL AX500，3 kV，Canon FAB JEOL，Xe，4 kV，courant限10μA，Gly-NBA 5050用于FAB離子化。
通過柱層析進(jìn)行的分離在輕的(light)壓力下按照層析技術(shù)在Kiesel 60硅膠(230-400目，Merck)上進(jìn)行。追蹤通過薄層色譜(TLC)使用Kieselgel 60F-254-0.25mm板來進(jìn)行。比移值(ratio-to-front，Rf)是給定支持物上化合物的移動(dòng)距離與洗脫液移動(dòng)距離之間之比。
下面的圖描述了對具有下述結(jié)構(gòu)式的偕二氟化糖綴合物化合物的制備 對最初的內(nèi)酯1的制備最初，通過對甲基半乳吡喃糖苷(methylgalactopyrannoside)2的芐基化(圖1)、對異頭位的脫保護(hù)(圖2)，接下來是氧化(圖3)來制備內(nèi)酯1。
惰性氣氛下，在含有處于二甲基甲酰胺(dimethylformaldehyde)DMF(250ml)中的甲基-D-吡喃半乳糖苷2(5g；26mmol、1eq.)以及四丁基碘化銨nBu4NI(500mg；1.3mmol；0.05eq.)的燒瓶中，以小份加入氫化鈉NaH(3.7g；0.15mol；6eq.)。然后加入芐基溴BnBr(18ml；0.15mol；6eq.)，混合物在攪拌下保持至少36小時(shí)。
用水水解介質(zhì)(medium)。然后用乙醚對水相進(jìn)行三次萃取。然后收集有機(jī)相，在水中洗幾次，在硫酸鎂上干燥，過濾，然后蒸發(fā)。
在二氧化硅柱上，使用比例為9比1的環(huán)己烷/乙酸乙酯混合物進(jìn)行洗脫，通過層析對獲得的產(chǎn)物加以純化。濃縮收集到的級分(fraction)后，產(chǎn)物3是白色晶體形式，其重量收率為95％。
對產(chǎn)物3的鑒定Rf0.38(環(huán)己烷/乙酸乙酯8/2)。
C35H38O6M＝554.67g·mol-1在含有處于80mL乙酸4中的1-O-甲基-2，3，4，6-四-O-芐基-D-吡喃半乳糖3(5.5g；9.92mmol)的燒瓶中，加入摩爾濃度為3M的11mL硫酸H2SO4。反應(yīng)介質(zhì)被加熱至100℃，1小時(shí)。然后在100mL冷水中對溶液進(jìn)行稀釋。
用100mL甲苯對混合物進(jìn)行四次萃取。收集有機(jī)相，用100mL碳酸氫鈉NaHCO3飽和溶液洗滌，最后用100mL水洗。然后在硫酸鎂上干燥有機(jī)相，過濾及濃縮。
使用比例為8.5比1.5的環(huán)己烷/乙酸乙酯混合物進(jìn)行洗脫，通過二氧化硅柱層析，對獲得的產(chǎn)物加以純化。濃縮收集到的級分后，產(chǎn)物5是白色晶體，其重量收率為75％。
對產(chǎn)物5的鑒定Rf0.65(環(huán)己烷/乙酸乙酯6/4)。
C34H36O6M＝540.65g·mol-1惰性氣氛下，在含有2，3，4，6-四-O-芐基-D-吡喃半乳糖5(4g；7.4mmol)的燒瓶中，加入二甲基亞砜DMSO(25.6mL)和乙酸酐Ac2O(16.8mL)?；旌衔镌跀嚢柘卤３?2小時(shí)。
加入碳酸氫鈉NaHCO3的飽和溶液，然后用乙醚對水相萃取4次。收集有機(jī)相，用水洗5次。然后在硫酸鎂上對該有機(jī)相進(jìn)行干燥、過濾和濃縮。
然后使用比例為8比2的環(huán)己烷/乙酸乙酯混合物作為洗脫劑，在二氧化硅層析柱上對產(chǎn)物加以純化。濃縮收集到的級分后，內(nèi)酯1是無色油的形式，其重量收率為82％。
對產(chǎn)物1的鑒定Rf0.61(環(huán)己烷/乙酸乙酯8/2)。
C34H34O6M＝538.63g·mol-1NMR1H(CDCl3，300 MHz)3.6(m，2H，H6)；3.8(dd，2，1-9，6，1H，H3)；4.1(s，1H，H4)；4.2(m，1H，H5)；4.4-5.1(m，9H，H2；4OCH2Bn)；7.2(m，20H，Har.)NMR13C(CDCl3，75.5 MHz)67.4(C6)；72.4(C5)；72.6(OCH2Bn)；73.5(OCH2Bn)；74.5(C4)；75.1(OCH2Bn)；77.1(C2)；79.9(C3)；127.4-128，3(Car.)；137.2；137.3；137.6(Car.quat.)；169.8(CO)。
對偕二氟酯化合物7的制備使用Reformatsky反應(yīng)將溴二氟酯加入內(nèi)酯1(圖4)。
惰性氣氛下，在含有鋅Zn(1.7g；26mmol；7eq.)(預(yù)先活化并粗磨過的(scoured))的燒瓶中，加入四氫呋喃THF(30mL)。介質(zhì)置于回流下，然后逐滴加入由溶于THF(30mL)中的內(nèi)酯1(2g；3.7mmol；1eq.)和溴二氟乙酸乙酯6(1.42mL；11mmol；3eq.)構(gòu)成的混合物。反應(yīng)在回流下進(jìn)行3小時(shí)?；氐江h(huán)境溫度后，過濾掉鋅，向反應(yīng)介質(zhì)中加入1N鹽酸HCl溶液(60mL)然后加入二氯甲烷(6mL)。
分開水相和有機(jī)相，再用二氯甲烷對水相進(jìn)行兩次萃取。收集有機(jī)相，在硫酸鎂上干燥、過濾以及然后濃縮。
隨后用比例為八比二的環(huán)己烷/乙酸乙酯混合物進(jìn)行洗脫，在二氧化硅層析柱上對產(chǎn)物加以純化。濃縮收集到的級分后，產(chǎn)物7是白色晶體形式，其重量收率為82％。
對產(chǎn)物7的鑒定
Rf0.35(環(huán)己烷/乙酸乙酯8/2)。
C38H40F2O8M＝662.72g·mol-1NMR19F(CDCl3；282.5 MHz)-118.4(d，JF-F＝256Hz)；-120.2(d，JF-F＝256Hz)。
NMR1H(CDCl3，300MHz)1.1(t，7，2，3H，CH3)；3.4-3.5(m，2H，H6)；3.7-3.8(dd，2.5-9.5，1H，H3)；3.8(d，2，1H，H4)；4-4.1(m，3H，H5；CH2)；4.25-4.85(m，9H，H2；4OCH2Bn)；7.2(m，20H，Har)。
NMR13C(CDCl3，75.5 MHz)14.2(CH3)；63.6(CH2)；68.6(C6)；71.7(C5)；73.2(OCH2Bn)；73.9(OCH2Bn)；74.1(C4)；74.9(OCH2Bn)；75.1(C2)；75.8(OCH2Bn)；81.2(C3)；96.9(t，27Hz，C1)；113(t，264Hz，CF2)；128.0-128.9(Car.)；138.2；138.3；138.6；139.1(Car.quat.)；163.3(t，31Hz，CO2Et)。
用于加入肽鏈的第一條途徑肽鍵的加入可通過兩種不同方法來進(jìn)行。第一種用于合成賴氨酸-丙氨酸-丙氨酸單體。首先，加入與二氟酯官能基反應(yīng)的第一個(gè)氨基酸(圖5)。獲得第一個(gè)糖基氨基酸后，賴氨酸的酯被皂化(圖6)，然后通過肽偶聯(lián)加上丙氨酸-丙氨酸單元(圖7)。
然后，由此獲得的單體的N之后O末端官能基被脫保護(hù)(圖8和9)，最后進(jìn)行對半乳糖苷單元的去芐基化(圖10)A)加入第一個(gè)氨基酸(圖5)在惰性氣氛下，含有溶液中的起始物7(50mg；0.075mmol；1eq.)以及二氯甲烷(3mL)中的Boc-賴氨酸-OMe 8的乙酸酯(48mg；0.15mmol；2eq.)的燒瓶中，加入三乙胺Et3N(53μl；0.375mmol；5eq.)。在回流下加熱混合物48小時(shí)，然后用水水解，在二氯甲烷中萃取三次。收集有機(jī)相，在硫酸鎂上干燥，過濾，然后濃縮。
蒸發(fā)溶劑，然后用比例為七比三的環(huán)己烷/乙酸乙酯混合物作為洗脫劑，在二氧化硅柱上通過層析對混合物加以純化。濃縮收集到的級分后，產(chǎn)物9是白色固體形式，其重量收率為84％。
對產(chǎn)物9的鑒定Rf0.58(環(huán)己烷/乙酸乙酯7/3)。
C48H58F2N2O11M＝876.98g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-117.1(d，JF-F＝260Hz)；-121.8(d，JF-F＝260Hz)。
NMR1H(CDCl3，300 MHz)1.1(m，2H，CH2)；1.2-1.5(m，2H，CH2)；1.3(s，9H，(CH3)3C)；1.6(m，2H，CH2)；3.0-3.1(m，2H，CH2NH)；3.4-3.5(m，2H，H6)；3.6(s，3H，OCH3)；3.8(m，2H，H3；H4)；4.1(m，2H，CHNH(Lys)；H5)；4.2-4.9(m，8H，4OCH2Bn)；4.3(d，3.3，1H，H2)；5(s，2H，2NH)；6.7(s，1H，1NH)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)22.9(CH2)；27.3(CH2)；28.7((CH3)3C)；32.4(CH2)；39.4(CH2N)；52.7(OCH3)；53.6(NCH Lys)；68.7(C6)；71.1(C5)；73.4和73.7(2OCH2Bn)；74.5(C4)；75.0(OCH2Bn；C2)；75.8(OCH2Bn)；80.3((CH3)3C)；80.9(C3)；97.1(t，28Hz，C1)；112.8(t；260Hz)；128.0-128.9(Car.)；138.2；138.3；138.7；139.0(Car.quat.)；155.9(CO(Boc))；164.1(t，28Hz，CF2CONH)；173.6(CO2Et)。
B)賴氨酸酯的皂化(圖6)在含有處于THF(10mL)中的起始物9(1.25g；1.43mmol；1eq.)的燒瓶中，加入水(1mL)溶液中的氫氧化鋰LiOH(70mg；2.9mmol；2eq.)，讓混合物反應(yīng)24小時(shí)。然后在二氯甲烷中收集反應(yīng)介質(zhì)。加入1 N的鹽酸HCl(5mL)。在二氯甲烷中對水相進(jìn)行三次萃取。收集有機(jī)相，在水(5mL)中洗，在硫酸鎂上干燥、過濾，然后濃縮。獲得的產(chǎn)物10為白色固體形式，具有定量的重量收率。
對產(chǎn)物10的鑒定C47H56F2N2O11M＝862.95g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-117.2(d，JF-F＝260Hz)；-121.5(d，JF-F＝260Hz)。
NMR1H(CDCl3，300MHz)1.2(m，2H，CH2)；1.3-1.5(m，2H，CH2)；1.3(s，9H，(CH3)3C)；1.6(m，2H，CH2)；3.0-3.1(m，2H，CH2NH)；3.4-3.5(m，2H，H6)；3.8(m，2H，H3；H4)；4.1(m，2H，CHNH(Lys)；H5)；4.2-4.9(m，8H，4OCH2Bn)；4.4(d，3，4，1H，H2)；5.1(d，7.5，1H，NH)；6.6(s，1H，NH)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)22.6(CH2)；27.3(CH2)；28.7((CH3)3C)；32.0(CH2)；39.4(CH2N)；53.7(NCH Lys)；68.7(C6)；71.1(C5)；73.4 et 73.7(2OCH2Bn)；74.4(C4)；74.9(C2)；75.0(OCH2Bn)；75.8(OCH2Bn)；80.5((CH3)3C)；80.9(C3)；97.0(t，28Hz，C1)；112.8(t；260Hz)；127.9-128.9(Car.)；138.1；138.2；138.6；139.0(Car.quat.)；156.2(CO(Boc))；164.0(t，28Hz，CF2CONH)；176.7(CO2H)。
C)通過肽偶聯(lián)加上丙氨酸-丙氨酸單元(圖7)在惰性氣氛下，含有處于二氯甲烷(15mL)中的酸10(520mg；0.6mmol；1eq.)，加入羰基二咪唑CDI(117mg；0.72mmol；1.2eq.)。混合物在攪拌下保持1小時(shí)。然后將在惰性氣氛下制備的、由二氯甲烷(15mL)中的二異丙基乙胺DI EA(347μL；1.99mmol；3.3eq.)、三氟乙酸酯-丙氨酸-丙氨酸-OMe 11(229mg；0.79mmol；1.3eq.)構(gòu)成的溶液加入到該混合物中，反應(yīng)介質(zhì)在攪拌下保持36小時(shí)。然后用水水解混合物，接著在二氯甲烷中萃取三次。收集有機(jī)相，在硫酸鎂上干燥，過濾，然后濃縮。
蒸發(fā)溶劑，然后用比例為三比七的環(huán)己烷/乙酸乙酯混合物作為洗脫劑，在二氧化硅柱上通過層析對混合物加以純化。濃縮收集到的級分后，產(chǎn)物12是白色固體形式，其重量收率為55％。
對產(chǎn)物12的鑒定Rf0.46(乙酸乙酯)。
C54H68F2N4O13M＝1019.13g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-116.9(d，JF-F＝260Hz)；-121.7(d，JF-F＝260Hz)。
NMR1H(CDCl3，300MHz)1.2-1.4(m，10H，2CH3，2CH2)；1.3(s，9H，(CH3)3C)；1.6(m，2H，CH2)；3.0-3.2(m，2H，NHCH2)；3.4-3.5(m，2H，H6)；3.6(s，3H，OCH3)；3.8-3.9(m，2H，H3；H4)；4.0(m，1H，CHNH(Lys))；4.1(t，6，2，1H，H5)；4.2-4.9(m，10H，4OCH2Bn；2CH(Ala))；4.3(d，.，3，1H，H2)；5.3(d，6，4，2H，2NH)；7(m，1H，NH)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)18.3和18.6(2CH3)；22.8(CH2)；28.7((CH3)3C和CH2)；32.1(CH2)；39.3(CH2N)；48.5和49.2(2CH Ala)；52.9(OCH3)；54.8(NCH Lys)；68.7(C6)；71.1(C5)；73.5和73.7(2OCH2Bn)；74.5(C4)；75.0(OCH2Bn；C2)；75.7(OCH2Bn)；80.5((CH3)3C)；80.8(C3)；97.1(t，27Hz，C1)；127.9-128.9(Car.)；138.2；138.3；138.7；139.0(Car.quat.)；156.0(CO(Boc))；164.2(t，28Hz，CF2CONH)；172.3和172.5(2CONH)；173.6(CO2Et)。
D)對獲得的單體的N端官能基脫保護(hù)然后是O端官能基脫保護(hù)(圖8和9)在惰性氣氛下，在含有處于二氯甲烷(10mL)中的起始物12(0.607mg；0.6mmol；1eq.)的燒瓶中，加入三氟乙酸TFA(900μL；12mmol；20eq.)。令混合物反應(yīng)12小時(shí)，然后濃縮反應(yīng)介質(zhì)。用甲苯進(jìn)行四至五次共蒸發(fā)，從而以定量收率獲得無色油形式的產(chǎn)物13。
對產(chǎn)物13的鑒定
C51H61F5N4O13M＝1033.04g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-75.9；-116.9(d，JF-F＝260Hz)；-120.7(d，JF-F＝260Hz)。
NMR1H(CDCl3，300 MHz)1.2-1.4(m，10H，2CH3，2CH2)；1.6(m，2H，CH2)；3.0(m，2H，NHCH2)；3.4(m，2H，H6)；3.5(s，3H，OCH3)；3.8-3.9(m，3H，CHNH(Lys)；H3；H4)；4.1(m，1H，H5)；4.2-4.9(m，11H，4OCH2Bn；2CH(Ala)；H2)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CDCl3，75.5 MHz)17.7和18.1(2CH3)；21.9(CH2)；28.5(CH2)；31.0(CH2)；39.1(CH2N)；48.7和50.0(2CH Ala)；52.8(OCH3)；53.7(NCH Lys)；68.8(C6)；71.2(C5)；73.3和73.8(2OCH2Bn)；74.3(C4)；75.0(OCH2Bn)；75.1(C2)；75.8(OCH2Bn)；80.9(C3)；97.1(t，27Hz，C1)；127.9-128.9(Car.)；138.1；138.3；138.6；138.9(Car.quat.)；162.0(qdt，34Hz，COCF3)；164.2(t，28Hz，CF2CONH)；169.4和172.7(2CONH)；173.6(CO2Et)。
在含有處于THF(5mL)中的起始物13(671mg；0.65mmol；1eq.)的燒瓶中，加入水(1mL)溶液中的氫氧化鋰LiOH(47mg；1.9mmol；3eq.)。令混合物反應(yīng)12小時(shí)，然后在二氯甲烷中收集。加入1N的鹽酸HCl溶液(4mL)，用二氯甲烷對水相進(jìn)行三次萃取。收集有機(jī)相，在水(4mL)中洗滌，然后濃縮。
用甲苯進(jìn)行四至五次共蒸發(fā)，以去除痕量的水，以及以定量收率獲得白色固體形式的產(chǎn)物14。
對產(chǎn)物14的鑒定C48H59ClF2N4O11M＝941.45g·mol-1NMR19F(CD3OD，282.5MHz)-120.4；-120.5。
NMR1H(CD3OD，300 MHz)1.2-1.3(m，12H，2CH3，2CH2)；1.6(m，2H，CH2)；3.0(m，2H，NHCH2)；3.1(m，2H，H6)；3.5(m，3H，CHNH(Lys)；H3；H4)；3.8-3.9(m，1H，H5)；4.2-4.9(m，11H，4CH2OBn；2CH(Ala)；H2)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CD3OD，75.5MHz)17.7和18.1(2CH3)；23.5(CH2)；29.9(CH2)；32.7(CH2)；40.5(CH2N)；49.7和50.0(2CH Ala)；53.7(NCH Lys)；70.2(C6)；72.4(C5)；74.2和74.7(2OCH2Bn)；76.1和76.6(2OCH2Bn)；76.7(C4和C2)；82.1(C3)；98.0(t，27Hz，C1)；111.7(t，260Hz；CF2)；129-130.6(Car.)；139.7；140.1；140.2；140.5(Car.quat.)；165.5(t，28Hz，CF2CONH)；174.0和174.5(CO)。
E)對半乳糖苷單元進(jìn)行脫芐基(圖10)在一刮勺尖(spatula tip)的鈀炭Pd/C存在的情況下，含有處于乙酸CH3CO2H(5mL)、四氫呋喃THF(1.5mL)和水(1.5mL)的混合物中的起始物14(150mg；0.16mmol)的燒瓶被放置于氫氣氛下?；旌衔镌跀嚢柘路胖眠^夜然后濾經(jīng)Millipore過濾器。然后濃縮混合物，以獲得白色固體形式的產(chǎn)物15，收率為70％。
對產(chǎn)物15的鑒定C20H35ClF2N4O11M＝580.96g·mol-1NMR19F(CD3OD，282.5MHz)-120.0(d，JF-F＝258Hz)；-121.3(d，JF-F＝258Hz)；-121.6(d，JF-F＝258Hz)；-123.0(d，JF-F＝258Hz)。
NMR1H(CD3OD，300MHz)1.4(2d，7.7，6H，2CH3)；1.3-1.5(m，2H，CH2)；1.7(m，2H，CH2)；1.9(m，2H，CH2)；3.2(m，2H，NHCH2)；3.7-3.8(m，4H，H6；H5；H3)；4.2和4.4(2m，2H，H2)；3.9(m，1H，CHNH(Lys)；4.3和4.5(2m，2H，2 CH(Ala))。
NMR13C(CD3OD，75.5 MHz)18.7和18.9(2CH3)；23.5(CH2)；30.1(CH2)；32.8(CH2)；40.5(CH2N)；50.9(2CH Ala)；54.7(NCH Lys)；64.7(C6)；72.7(C5)；76.2，77.7(C4et C2)；82.4(C3)；100.6(C1)；115.6(t，260Hz；CF2)；165.5(CF2CONH)；170.7和174.6(CO)。
Mass(FAB+)545(M+-Cl)。
用于制備肽鏈的第二條途徑這包括對偕二氟酯衍生物7的皂化，其隨后與不同的肽偶聯(lián)。
A)對偕二氟酯衍生物7的皂化(圖11)在含有處于THF(5mL)中的酯7(0.5g；1.75mmol，1eq.)的燒瓶中，加入溶解于最小量的水中的氫氧化鋰LiOH(84mg；3.5mmol，2eq.)的水溶液?；旌衔镌跀嚢柘路胖?2小時(shí)，然后用乙酸乙酯收集。用1N鹽酸水溶液對混合物進(jìn)行酸化，然后用乙酸乙酯萃取若干次。收集有機(jī)相，在MgSO4上干燥，過濾并濃縮。
以定量收率獲得白色油形式的產(chǎn)物16。
對產(chǎn)物16的鑒定C36H36F2O8M＝634.66g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-117.3(d，JF-F＝259Hz)；-119.0(d，JF-F＝259Hz)。
NMR1H(CDCl3，300MHz)3.2(dd，4，5Hz和9.8Hz，1H，H6)；3.5(dd，7.7Hz和9，8Hz，1H，H6)；3.7(d，2Hz，1H，H4)；3.8(dd，2.6Hz和9.5Hz，1H，H3)；4(dd，4.5Hz和7.7Hz；1H，H5)；4.3-4.9(m，9H，H2；4OCH2Bn)；7.2(m，20H，Har)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)69.4(C6)；71.7(C5)；73.5(OCH2Bn)；74.0(OCH2Bn)；74.1(C4)；75.0(OCH2Bn)；75.1(C2)；75.9(OCH2Bn)；80.8(C3)；95.4(t，27Hz，C1)；112.5(t，260Hz，CF2)；127.8-129.0(Car.)；137.6；138.0；138.1(Car.quat.)；163.1(t，30Hz，CO2H)。
B)制備將與偕二氟化化合物16偶聯(lián)的不同的肽使用一系列脫保護(hù)反應(yīng)和肽偶聯(lián)，來制備將與偕二氟化化合物16偶聯(lián)的每種肽進(jìn)行兩個(gè)丙氨酸之間的第一次偶聯(lián)(圖12)在惰性氣氛下，在含有處于二氯甲烷(25mL)中的Boc-丙氨酸-OH 17(1g；5.29mmol；1eq.)的燒瓶中，加入羰基二咪唑CDI(882mg；5.44mmol；1.03eq.)?；旌衔镌跀嚢柘卤３?小時(shí)。然后將在惰性氣氛下制備的、由二氯甲烷(15mL)中的Cl-+H3N-丙氨酸-OMe 18(738mg；5.29mmol；1eq.)和二異丙基乙胺DIEA(1.94mL；11.1mmol；2.1eq.)構(gòu)成的溶液加入到該混合物中?；旌衔镌跀嚢柘卤３?6小時(shí)。然后用水水解混合物，用二氯甲烷萃取三次。收集有機(jī)相，在硫酸鎂上干燥，過濾，然后濃縮。
蒸發(fā)溶劑，然后用比例為五比五的環(huán)己烷/乙酸乙酯混合物作為洗脫劑，在二氧化硅柱上通過層析對混合物加以純化。濃縮收集到的級分后，產(chǎn)物19是白色固體形式，其重量收率為82％。
對產(chǎn)物19的鑒定C12H22N2O5M＝274.31g·mol-1NMR1H(CDCl3，300MHz)1.3(2d，7.2，6H，2CH3)；1.4(s，9H，((CH3)3C)；3.7(s，3H，OCH3)；4.2(m，1H，CH)；4.6(m，1H，CH)；5.2(d，7，4，1H，NH)；6.9(s，1H，NH)。
NMR13C(CDCl3，75.5 MHz)18.6和18.8(2CH3)；28.7((CH3)3C)；48.3和50.2(2CH)；52.8(OCH3)；80.4((CH3)3C)；155.80(CO(BoC))；172.8和173.6(CONH和CO2Et)。
獲得的二肽19的O端官能基被脫保護(hù)，然后二肽19與N保護(hù)的賴氨酸氨基酸偶聯(lián)(圖13)1)對二肽單元的脫保護(hù)在惰性氣氛下，在含有處于二氯甲烷(20mL)中的Boc-丙氨酸-丙氨酸-OMe 19(1g；3.8mmol；1eq.)的燒瓶中，加入三氟乙酸TFA(5.6mL；76mmol；20eq.)。用甲苯進(jìn)行四至五次共蒸發(fā)。
2)肽合成在惰性氣氛下，在含有處于二氯甲烷(20mL)中的Boc-賴氨酸(Z)-OH 20(1.32g；3.46mmol；1eq.)的燒瓶中，加入羰基二咪唑CDI(560mg；3.56mmol；1.03eq.)?；旌衔镌跀嚢柘卤３?小時(shí)。然后將在惰性氣氛下制備的、由二氯甲烷(20mL)中的CF3CO2-+H3N-丙氨酸-丙氨酸-OMe(前文反應(yīng)期間獲得的)(3.8mmol；1.1eq.)和二異丙基乙胺DIEA(1.26mL；7.27mmol；2.1eq.)構(gòu)成的溶液加入到該產(chǎn)物中?；旌衔镌跀嚢柘卤３?6小時(shí)。然后用水水解混合物，接著用二氯甲烷萃取三次。收集有機(jī)相，在硫酸鎂上干燥，過濾，然后濃縮。
蒸發(fā)溶劑，然后用乙酸乙酯作為洗脫劑，在二氧化硅柱上通過層析對混合物加以純化。濃縮收集到的級分后，產(chǎn)物21是白色固體形式，其重量收率為66％。
對產(chǎn)物21的鑒定C26H40N4O8M＝536.62g·mol-1NMR1H(CDCl3，300MHz)1.3(d，7.2，6H，2CH3)；1.4(s，9H，((CH3)3C)1.3-1.7(m 6H；3CH2)；3.1(m，2H，NHCH2)；3.7(s，3H，OCH3)；4.1(m，1H，CHLys)；4.6(m，2H，CHAla)；5.0(s，2H，PhCH2)；5.6和5.7(m，2H，2NH)；7.3(m，5H，Har.)；7.4(d，7Hz，14Hz，1H，NH)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)18.1和18.7(2CH3)；22.7(CH2)；28.7((CH3)3C)；29.7(CH2)；32.5(CH2)；40.7(NCH2)；48.4和49.1(2CH)；52.7(OCH3)；54.6(CH Lys)；66.8(OCH2Bn)；80.2((CH3)3C)；128.3-128.8(Car.)；137.1(Car.quat.)；156.2和157.1(CO(Boc)和CO(Z))；172.4，172.7和173.6(2CONH和CO2Et)。
通過氫化對位于化合物21側(cè)鏈的氨基官能團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)(圖14)。然后獲得的化合物22可直接參與與產(chǎn)物16的肽偶聯(lián)，以通過下文段落C)所述的另一合成途徑產(chǎn)生前述化合物12。
在存在一刮勺尖鈀炭Pd/C的的情況下，含有處于甲醇(20mL)中的起始物21(1.6g；3mmol)的燒瓶被放置于氫氣氛圍下?；旌衔镌跀嚢柘路胖眠^夜然后濾經(jīng)Millipore過濾器。然后濃縮介質(zhì)。產(chǎn)物22為白色粉末形式，以定量收率獲得。
對產(chǎn)物22的鑒定C18H34N4O6M＝402.49g·mol-1RMN1H(CD3OD，300MHz)1，4(2d，7，2Hz，6H，2CH3)；1，5(s，9H，((CH3)3C)1，5-1，8(m 6H；3CH2)；2，7(m，2H，NHCH2)；3，7(s，3H，OCH3)；4(m，1H，CHLys)；4，4(m，2H，CHAla)。
在其N端官能基(圖15a)或O端官能基(圖15b)對三肽單元脫保護(hù)，對在其N端官能基被脫保護(hù)的三肽單元和在其O端官能基被脫保護(hù)的三肽單元之間進(jìn)行肽合成(圖15c)N-脫保護(hù)(圖15a)在惰性氣氛下，在含有處于二氯甲烷(40mL)中的Boc-賴氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-OMe 21(2g；3.7mmol；1eq.)的燒瓶中，加入三氟乙酸TFA(5.5mL；75mmol；20eq.)。令混合物反應(yīng)12小時(shí)，然后濃縮。用甲苯進(jìn)行四至五次共蒸發(fā)，以獲得CF3CO2-+H3N-賴氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-OMe 23。
O-脫保護(hù)(圖15b)在惰性氣氛下，在含有處于乙醇(45mL)中的Boc-賴氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-OMe 21(2g；3.7mmol；1eq.)的燒瓶中，加入氫氧化鋰LiOH(107mg；4.5mmol；1.2eq.)在水(2mL)中的溶液。令混合物反應(yīng)12小時(shí)，然后濃縮。之后蒸發(fā)反應(yīng)介質(zhì)，然后用二氯甲烷收集。加入1N的鹽酸HCl水溶液(20mL)。用二氯甲烷對水相萃取三次。收集有機(jī)相，在硫酸鎂上干燥，過濾，然后濃縮以獲得Boc-Lys(Z)-Ala-Ala-OH 24。
肽合成(圖15c)在惰性氣氛下，在含有處于二氯甲烷(50mL)中的Boc-賴氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-OH 24(3.7mmol；1eq.)，加入羰基二咪唑CDI(665mg；4.10mmol；1.1eq.)?；旌衔镌跀嚢柘卤３?小時(shí)。然后向該產(chǎn)物加入在惰性氣氛下制備的、由二氯甲烷(50mL)中的CF3CO2-+H3N-賴氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-Ome 23(3.7mmol；1eq.)和二異丙基乙胺DIEA(1.62mL；9.32mmol；2.5eq.)構(gòu)成的溶液?；旌衔镌跀嚢柘卤３?8小時(shí)。然后用水水解混合物，接著用二氯甲烷萃取兩次，用氯仿萃取兩次。收集有機(jī)相，在硫酸鎂上干燥，過濾，然后濃縮。
蒸發(fā)溶劑，然后用比例為九比一的乙醇/甲醇混合物作為洗脫劑，在二氧化硅柱上通過層析對混合物加以純化。濃縮收集到的級分后，產(chǎn)物25是白色粉末形式，其重量收率為56％。
對產(chǎn)物25的鑒定C46H68N8O13M＝941.08g·mol-1NMR1H(DMSO，300MHz)1.3(d，12H，4CH3)；1.4(s，9H，((CH3)3C)1.3-1.7(m 12H；6CH2)；3.0(m，4H，2NHCH2)；3.6(s，3H，OCH3)；4.1(m，1H，CHLys)；4.3(m，5H，5CHAla et Lys)；5.0(s，4H，PhCH2)；5.0(s，2H，PhCH2)；6.9(m，1H，NH)；7.3(m，5H，Har.)。
NMR13C(DMSO，75.5MHz)17.2、18.3、18.4和18.6(4CH3)；22.8和23.2(2CH2)；28.5((CH3)3C)；29.3和29.5(2CH2)；31.8和32.0(2CH2)；39.5和39.8(2NCH2)；47.8、48.0、48.2和48.5(4CH Ala)；52.2(OCH3)；52.6和54.6(2CH Lys)；65.4(2OCH2Bn)；78.4((CH3)3C)；128.0和128.6(Car.)；137.6(Car.quat.)；155.7和156.4(CO(Boc)和2CO(Z))；171.3、172.3、172.4、172.5和173.3(6CONH和CO2Et)。
通過氫化對位于化合物24側(cè)鏈的氨基官能團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)(圖16)在存在一刮勺尖鈀炭Pd/C的情況下，含有處于甲醇(10mL)中的起始物25(400mg；0.43mmol)的燒瓶被放置于氫氣氛圍下。混合物在攪拌下放置過夜，濾經(jīng)Millipore過濾器。然后濃縮混合物。產(chǎn)物26為白色粉末形式，以定量收率獲得。
對產(chǎn)物26的鑒定C30H56N8O9M＝672.81g·mol-1NMR1H(DMSO，300 MHz)1.2(m，12H，4CH3)；1.4(s，9H，((CH3)3C)1.3-1.7(m 12H；6CH2)；2.6(m，4H，2NHCH2)；3.6(s，3H，OCH3)；3.8(m，1H，CHLys)；4.2(m，5H，5 CHAla和Lys)。
Mass(ES+)696(M+Na)；674(M+H)C)偕二氟化化合物16與肽22的偶聯(lián)(圖17)在惰性氣氛下，在含有處于DMF(50mL)中的酸16(2g；3.15mmol；1.05eq.)、肽22(1.2g；3.0mmol；1eq.)、1-羥基苯并三唑HOBT(425mg；3.15mmol；1.05eq.)和N-甲基嗎啉NMM(346μl；3.15mmol；1.05eq.)的燒瓶中，加入EDCI(604mg；3.15mmol；1.05eq.)。反應(yīng)介質(zhì)在攪拌下放置48小時(shí)，然后蒸發(fā)溶劑，在水-二氯甲烷混合物中收集混合物。用二氯甲烷對水相萃取三次。收集有機(jī)相，在MgSO4上干燥，過濾并濃縮。
以58％的收率獲得產(chǎn)物12。該產(chǎn)物之前已被分析過。
D)偕二氟化化合物16與肽26的偶聯(lián)(圖17)在惰性氣氛下，在含有處于DMF(3mL)中的酸16(200mg；0.32mmol；1eq.)、肽26(105mg；0.16mmol；0.5eq.)、1-羥基苯并三唑HOBT(45mg；0.33mmol；1.05eq.)和N-甲基嗎啉NMM(32μl；0.33mmol；1.05eq.)的燒瓶中，加入EDCI(63mg；0.33mmol；1.05eq.)。反應(yīng)介質(zhì)在攪拌下放置48小時(shí)，然后濃縮。向介質(zhì)中加入水-二氯甲烷混合物。用二氯甲烷對水相萃取三次。收集有機(jī)相，在MgSO4上干燥，過濾并濃縮。
以35％的收率獲得產(chǎn)物27，其為白色粉末形式。
對產(chǎn)物27的鑒定
C102H124F4N8O23M＝1906.11g·mol-119F NMR(CDCl3，282.5MHz)-120.4。
1H NMR(CD3OD，300MHz)1.2(m，12H，4CH3)；1.3(s，9H，((CH3)3C)；1.3-1.7(m，12H；6CH2)；3.0(m，4H，2NHCH2)；3.4(m，4H，H6)；3.6(s，3H，OCH3)；3.8(m，1H，CHNH(Lys))；3.9(m，4H，H3；H4)；4.0(m，2H，H5)；4.1-4.8(m，23H，8OCH2Bn，4CH(Ala)，CHNH(Lys)，2H2)；7.2(m，40H，Har.)。
13C NMR(CD3OD，75.5 MHz)16.1、16.2、16.3和16.7(4CH3)；22.7和22.9(2CH2)；27.4和28；2((CH3)3C和2CH2)；30.8(2CH2)；38.7和39.0(2CH2N)；48.1(OCH3)；48.8. 50.0、50.1、51.4、53.7和55.7(4CH Ala和2NCH Lys)；68.2和68.5(2C6)；70.2和70.7(C5)；72.4(2OCH2Bn)；72.6(C4)；73.0(2OCH2Bn)；74.4(2OCH2Bn)；74.9(C2)；75.0(2OCH2Bn)；79.7((CH3)3C)；80.3(C3)；96.2(t.27Hz.C1)；127.3-128.1(Car.)；138.0-138.9(Car.quat.)；157.0(CO(Boc))；160.2(t，28Hz，CF2CONH)；172.5、173.1、173.2、174.1和174.5(CONH和CO2Me)。
Mass(MALDI+)1929(M+Na)；1945(M+K)E)對獲得的二聚體27的N-端然后是O-端官能基的脫保護(hù)(圖18和圖19)在惰性氣氛下，在含有處于二氯甲烷(2mL)中的起始物27(107mg；0.6mmol；1eq.)的燒瓶中，加入三氟乙酸TFA(89μL；1.2mmol；20eq.)。令混合物反應(yīng)12小時(shí)，然后濃縮反應(yīng)介質(zhì)。用甲苯進(jìn)行四至五次共蒸發(fā)，以定量收率獲得無色油形式的產(chǎn)物28。
對產(chǎn)物28的鑒定C99H117F7N8O23M＝1920.02g·mol-119F NMR(CD3OD，282.5 MHz)
-77.4；-120.2。
1H NMR(CD3OD，300 MHz)1.3(m，12H，4CH3)；1.3-1.7(m，12H；6CH2)；3.0(m，4H，2NHCH2)；3.5(m，4H，H6)；3.5(s，3H，OCH3)；3.7(m，1H，CHNH(Lys))；3.8(m，4H，H3；H4)；4.0(m，2H，H5)；4.2-4.8(m，23H，8OCH2Bn，4CH(Ala)，CHNH(Lys)，2H2)；7.2(m，40H，Har.)。
在含有處于THF(2mL)中的起始物28(115mg；0.06mmol；1eq.)的燒瓶中，加入溶于最少量的水中的氫氧化鋰LiOH(6mg；0.24mmol；4eq.)溶液。令混合物反應(yīng)12小時(shí)，然后在二氯甲烷中收集。加入1N的鹽酸HCl溶液(4mL)，用二氯甲烷對水相萃取三次。收集有機(jī)相，在水(4mL)中洗，然后濃縮。
用甲苯進(jìn)行四至五次共蒸發(fā)，以除去痕量的水，以89％的收率獲得白色固體形式的產(chǎn)物29。
對產(chǎn)物29的鑒定C96H115ClF4N8O21M＝1828.43g·mol-119F NMR(CD3OD，282.5 MHz)120。
1H NMR(CD3OD，300 MHz)1.3(m，12H，4CH3)；1.3-1.7(m，12H；6CH2)；3.0(m，4H，2NHCH2)；3.5(m，4H，H6)；3.7(m，1H，CHNH(Lys))；3.9(m，4H，H3；H4)；4.1(m，2H，H5)；4.2-4.8(m，23H，8OCH2Bn，4CH(Ala)，CHNH(Lys)，2H2)；7.2(m，40H，Har.)。
F)對半乳糖苷單元進(jìn)行脫芐基(圖20)在存在一刮勺尖(spatula tip)鈀炭Pd/C的的情況下，在含有處于乙酸CH3CO2H(2.5mL)、四氫呋喃THF(0.8mL)和水(0.8mL)的混合物中的起始物29(90mg；0.05mmol)的燒瓶被置于氫氣氛下。混合物在攪拌下放置過夜然后經(jīng)Millipore過濾器過濾。濃縮混合物，以以定量收率獲得白色固體形式的產(chǎn)物30。
對產(chǎn)物30的鑒定
C40H67ClF4N8O21M＝1107.45g·mol-11H NMR(D2O，300MHz)1.5(m，12H，4CH3)；1.7-2.0(m，12H；6CH2)；3.4(m，4H，2NHCH2)；3.7-4.5(m，18H，2H6，CHNH(Lys)，2H3，2H4，2H5，4CH(Ala)，CHNH(Lys)，2H2)；7.2(m，40H，Har.)。
13C NMR(D2O，75.5 MHz)16，9 et 17，0(4CH3)；21，7 et 22，6(2CH2)；27，9 et 30，8(4CH2)；39，3 et 39，6(2CH2N)；49，6、49，8 et 50，0(4CHAla)；53，2 et 53，8(2NCH Lys)；61，1 et 62，6(2C6)；67，1、68，9、70，6、70，9、72，4、73，9、75，5、80，2(2C5，2C4，2C2，2C3)；173，9、174，5 et 175，1(CONH etCO2Me)。
Masse(ESI+)1071(MH+)；1093(M+Na)；1109(M+K)本發(fā)明并不被限制于前述實(shí)施例。
對R4中攜帶有二氨基酸單元AA1-AA2的屬于通式I的化合物的合成將通過兩種不同方法容易地獲得，其中使用本文已描述過的非常經(jīng)典的化學(xué)反應(yīng)-起始自糖肽12或22，在對NBoc部分脫保護(hù)之后，AA1-AA2的羧基官能基之間發(fā)生的偶聯(lián)在常規(guī)的N、O脫保護(hù)以及對糖單元的脫芐基之后將產(chǎn)生想要的化合物。
-還可在前一個(gè)步驟，以及尤其是在肽21或25上，引入二氨基酸AA1-AA2，這在通過常規(guī)偶聯(lián)反應(yīng)對Nboc脫保護(hù)之后進(jìn)行。然后對賴氨酸側(cè)鏈的脫保護(hù)以及碳水化合物衍生物16之間的偶聯(lián)反應(yīng)將在常規(guī)脫保護(hù)步驟之后得到糖肽。
對生物材料的初步保存試驗(yàn)初步生物試驗(yàn)在糖蛋白尤其是合成的產(chǎn)物上進(jìn)行。它們使得我們能在不同溫度，以及變化的時(shí)間段，測定這些化合物對不同細(xì)胞培養(yǎng)物的影響。目的是觀察這些化合物是否對細(xì)胞具有保護(hù)作用。
在下文中化合物15和30可被命名為AAGP或AFGP。
A)產(chǎn)物15對于保存HEK 293腎細(xì)胞的影響在75cm2的培養(yǎng)皿中將HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)至100％存活。然后將細(xì)胞稀釋至75,000個(gè)細(xì)胞/mL。隨后，將它們分布到6個(gè)平板上，每個(gè)平板具有6個(gè)3mL的孔。該濃度是在足夠低以預(yù)防自身細(xì)胞毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡的濃度以及足夠高以允許細(xì)胞取樣和計(jì)數(shù)(而無須可能降低它們存活的任何預(yù)濃縮)的濃度之間的良好折中。每個(gè)平板具有兩個(gè)對照孔，其中不含產(chǎn)物15，兩個(gè)孔具有調(diào)節(jié)至0.01mg/mL的產(chǎn)物15濃度，另外兩個(gè)具有0.1mg/mL。然后在下述溫度溫育每個(gè)平板4℃、2℃、0℃、-2℃、-4℃和-20℃。隨后在下述溫育時(shí)間對每個(gè)孔取樣2、8和22小時(shí)。
材料-HEK 293細(xì)胞(Graham et al.)-DMEM cat#D5671，Sigma-Trypsin，Cat#25-052-Cl，MultiCell-PBS，Cat#SH30028.02，HyClone-臺盼藍(lán)，Cat#72-57-1耗材-微量進(jìn)液器槍頭，200μL，Axygen-6孔平板，用于細(xì)胞培養(yǎng)，cat#353046，F(xiàn)alcon-T-瓶，用于細(xì)胞培養(yǎng)，75cm2，cat#430725，Corning-移液管，2mL，5mL，10mL和25mL，F(xiàn)alcon設(shè)備-冰箱，Danby-冷凍箱，F(xiàn)rigidaire-溫育箱，Sanyo-顯微鏡，Zeiss-倒置(inverted)顯微鏡，Olympus-臺面離心機(jī)，IEC-血細(xì)胞計(jì)，Rechter
-可追蹤數(shù)字溫度計(jì)，F(xiàn)isher Scientific-溫度計(jì)，VWR-細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，No.8-004，HOPE結(jié)果細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)互相一致，因?yàn)椴顒e沒有超過10％，只有一個(gè)例外，其中顯示了13％的變化。
用于開始實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)物為100％，顯微鏡下它們的形態(tài)特征顯示了良好的狀態(tài)。
在六個(gè)試驗(yàn)溫度(圖21-26)中的五個(gè)下，以0.10mg/mL(用于本次實(shí)驗(yàn)的最高濃度)存在的產(chǎn)物15導(dǎo)致了最好的細(xì)胞存活率，即使該提高較低。0.01mg/mL的產(chǎn)物15的濃度看起來較之陰性對照對于細(xì)胞存活沒有改進(jìn)。
-20℃時(shí)，2小時(shí)之后，所有孔都結(jié)凍了，介質(zhì)具有膠凍狀外觀。解凍后，顯微鏡觀察顯示，對照細(xì)胞具有虛幻的(phantom)外觀，其立刻吸收臺盼藍(lán)，而有化合物15的細(xì)胞保持球形有折射能力的細(xì)胞的外觀，與活細(xì)胞類似，其不吸收臺盼藍(lán)。因此，在存在產(chǎn)物15時(shí)，保持了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和外形和一些滲透性功能，這與對照的情況不同。
該解凍后，將平板在-20℃重新放置，但是對兩種濃度的產(chǎn)物15而言，在8小時(shí)溫育后類似的程序?qū)е滤屑?xì)胞完全消失。
B)產(chǎn)物15對于保存紅細(xì)胞的影響可通過細(xì)胞膜的破裂來探知紅細(xì)胞的死亡。該現(xiàn)象被稱為溶血。對溶血的探測是本次實(shí)驗(yàn)的主要工具，用于確定不同溫度下產(chǎn)物15對于保存紅細(xì)胞的影響。
實(shí)驗(yàn)計(jì)劃取血樣→分成小份→加入AAGP(化合物15)→多種溫度→觀察溶血在3、0、-3、-5、-10、-15、-23、-78℃的溫度下，對濃度為0mg/mL、0.1mg/mL、1.0mg/mL的產(chǎn)物15加以試驗(yàn)。
從肝素處理過的硼硅酸鹽玻璃試管中的人類血樣，裝滿275μL的微試管。三分之一的微試管裝入2.75μL的產(chǎn)物15(H2O溶液，10mg/mL)，三分之一的微試管裝有27.5μL的產(chǎn)物15(H2O溶液，10mg/mL)。將血液分裝進(jìn)這些試管至滿，以盡可能防止空氣接觸。
在不同溫度溫育微試管不同的時(shí)間，從2小時(shí)到9小時(shí)不等。將微試管在微試管支持物上冷凍，使用緩慢冷凍裝置在-78℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，解凍一直在室溫在微試管架上進(jìn)行。解凍后，通過顛倒若干次使微試管均質(zhì)，取紅細(xì)胞樣。在觀察之前，以及獲得例如下式定義的溶血百分比之前，將紅細(xì)胞(Ery)稀釋于PBS 500x和臺盼藍(lán)2x中。
％溶血＝[1-(Co-Cexp)]*100其中Co是最初的Ery計(jì)數(shù)Cexp是實(shí)驗(yàn)Ery計(jì)數(shù)材料-15mL人類血樣，在肝素處理過的硼硅酸鹽玻璃試管中-PBS，Cat#SH30028.02，HyClone-臺盼藍(lán)，Cat#72-57-1耗材-微量移液器槍頭，200μL，Axygen-200μL PCR微試管-2滅菌肝素處理過的試管，Cat#366480，Becton-Dickinson設(shè)備-Fisher Isotemp低溫溫育箱，F(xiàn)isher Scientific-冰箱，Danby -冷凍箱，F(xiàn)rigidaire-超低溫冷凍箱 -低速冷凍設(shè)備，Nalgene-顯微鏡，Zeiss-數(shù)碼相機(jī)，Olympus-血球計(jì)，Rechter-可追蹤數(shù)字溫度計(jì)，F(xiàn)isher Scientific-溫度計(jì)，VWR -細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，No.8-004，HOPE在表1中，可看出，2至-10℃的溫度范圍內(nèi)沒有溶血。不管有沒有產(chǎn)物15，在這些溫度溫育0至24小時(shí)之后，紅細(xì)胞看起來保持完整。
表1.在不同濃度的產(chǎn)物15以及3、0、-3、-5和-10℃時(shí)％溶血vs.溫育時(shí)間

將血樣在-15℃放置同樣的時(shí)間。在表2中，兩小時(shí)后，可以看出，產(chǎn)物15在0.1mg/mL的濃度能部分保護(hù)紅細(xì)胞，在1.0mg/mL的濃度能完全保護(hù)。在4和9小時(shí)，僅有1.0mg/mL的濃度獲得了完全的保護(hù)。
表2.在不同濃度的產(chǎn)物15以及-15℃時(shí)％溶血vs.溫育時(shí)間

還測試了更極端的條件。在-23℃和-78℃，如果這些溫度迅速達(dá)到的話，紅細(xì)胞會(huì)破裂。
因此，使用緩慢冷卻達(dá)到-78℃來進(jìn)行試驗(yàn)。對沒有產(chǎn)物15的血樣溫育不同的時(shí)間，以測定冷凍點(diǎn)。如可從表3中看出的，冷凍點(diǎn)在40分鐘后達(dá)到。在該點(diǎn)，在％溶血和產(chǎn)物15的濃度之間觀察到了直接相關(guān)性。
表3.在不同濃度的產(chǎn)物15以及-78℃時(shí)％溶血vs.溫育時(shí)間

在大多數(shù)情況下，除了在-15℃溫育2小時(shí)后，觀察到了完整的或者說根本沒有溶血。明顯地，溶血過程非常迅速，并且在凍結(jié)時(shí)發(fā)生。在低于-15℃的溫度沒有觀察到1.0mg/mL的產(chǎn)物15的任何保護(hù)這一事實(shí)可能表示，該化合物通過減少凍結(jié)過程而非通過停止凍結(jié)來保護(hù)紅細(xì)胞，至少在1.0mg/mL時(shí)是這樣。結(jié)晶的現(xiàn)象導(dǎo)致紅細(xì)胞膜的破裂。但是通過降低時(shí)間(少于2小時(shí))可獲得關(guān)于在凍結(jié)點(diǎn)附近溶血?jiǎng)恿W(xué)的更多細(xì)節(jié)。但是，觀察到產(chǎn)物15在-15℃的確能保護(hù)紅細(xì)胞。
C)產(chǎn)物15對于保存血小板的影響目的是測試產(chǎn)物15對于保存血小板的影響，以改善僅能允許保存5天的現(xiàn)有方案。試驗(yàn)在四種不同的溫度進(jìn)行22℃、15℃、4℃以及最終的0℃。血小板試驗(yàn)進(jìn)行21天，以檢查血小板聚集。聚集是血小板降解的第一種并且最確定的指示。在它們的降解期間，血小板變得具有活性，喪失了它們的外形，成為纖維狀，形成聚集體(cluster)，最終變質(zhì)。進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，但是結(jié)果更大程度上取決于聚集的程度。
圖27和29展示了由于存在產(chǎn)物15對血小板聚集的正面影響。在圖27中，22℃時(shí)，對結(jié)果(陰性對照、1mg/mL和4mg/mL的產(chǎn)物15)進(jìn)行比較。觀察到在對照中，幾乎立刻(兩天后)開始發(fā)生聚集，并且繼續(xù)增加，而有糖蛋白15的樣品直到達(dá)到7天之前都沒有顯示出任何聚集。在第13、17和21天的時(shí)間段，發(fā)現(xiàn)了明顯得多的差別，以及由此的通過產(chǎn)物15對血小板聚集的真正的抑制。最濃的樣品(4mg/mL)顯示出了最少的聚集。
圖28在15℃時(shí)顯示了與前述相同的結(jié)果類型。在該溫度的聚集在4天后變得尤其明顯。隨著時(shí)間，在對照組觀察到的聚集要比含有化合物的樣品中所觀察到的增加更多。但是，在該溫度比在22℃時(shí)的聚集要少。
在4℃時(shí)(圖29)，不管是什么濃度，采用產(chǎn)物15時(shí)都幾乎沒有觀察到聚集。在對照中，聚集的數(shù)量也比其它溫度時(shí)要顯著更低。
在0℃時(shí)，不管用沒有糖蛋白15都沒有看到聚集。
D)產(chǎn)物15和30對保存心臟成肌細(xì)胞的影響本實(shí)驗(yàn)的目的是檢查偕二氟化糖蛋白對于心臟組織的細(xì)胞的影響，以及在合成的化合物的單體(產(chǎn)物15)和二聚體(產(chǎn)物30)之間進(jìn)行比較。
試驗(yàn)在大鼠心臟成肌細(xì)胞上進(jìn)行，以考慮這些化合物用于保存器官(例如心臟)以備日后移植之用。
初步實(shí)驗(yàn)1)解凍細(xì)胞，在DMEM培養(yǎng)基中，5％CO2以及37℃下，將其培養(yǎng)直到加倍(doubling)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。
2)在瓶中擴(kuò)增細(xì)胞。
3)將具有100 000個(gè)細(xì)胞的300μL分進(jìn)微試管。
4)向陰性對照管中加入3μL PBS。
5)在三個(gè)微試管中，分別加入0.3、1.5和3μL的100mg/mL的產(chǎn)物15，以獲得0.1、0.5和1mg/mL的濃度。
6)在三個(gè)微試管中，分別加入0.3、1.5和3μL的100mg/mL的產(chǎn)物30，以獲得0.1、0.5和1mg/mL的濃度。
6)在-2℃溫育細(xì)胞。
7)在培養(yǎng)之后0、2、7、20和43小時(shí)時(shí)對細(xì)胞取樣。
主實(shí)驗(yàn)1)在瓶中擴(kuò)增細(xì)胞。
2)將具有100 000個(gè)細(xì)胞的300μL分進(jìn)微試管。
3)向陰性對照管中加入3μL PBS。
4)在四個(gè)試管中，加入3μL產(chǎn)物15，以獲得1mg/mL。
5)在四個(gè)試管中，加入3μL產(chǎn)物30，以獲得1mg/mL。
6)將一組試管(對照-單體15-二聚體30)在室溫(22℃)溫育。
7)將一組試管(對照-單體15-二聚體30)在4℃溫育。
8)將一組試管(對照-單體15-二聚體30)在-3℃溫育。
9)將一組試管(對照-單體15-二聚體30)在-10℃溫育。
10)在培養(yǎng)之后0、8、16和22小時(shí)時(shí)對細(xì)胞取樣，對活細(xì)胞和死細(xì)胞計(jì)數(shù)。
11)僅對-3℃單體15的試管，在0、8、12、16、20和22小時(shí)取樣，對活細(xì)胞和死細(xì)胞計(jì)數(shù)。
材料-H9c2(2-1)細(xì)胞，ATCC編號CRL-1446，來自大鼠心肌組織的粘附(adherent)細(xì)胞系(1，2，3)-DMEM 4mM L-谷氨酰胺-溫育箱，37、22、4、-3、-2和-10℃-移液管 -微量移液器槍頭-血細(xì)胞計(jì)-臺盼藍(lán)-顯微鏡 -細(xì)胞計(jì)數(shù)儀-微試管 -微試管架對初步實(shí)驗(yàn)而言對2℃時(shí)單體15而言(圖30)，0、2和7小時(shí)時(shí)所有濃度的存活百分比都非常接近100％。在20小時(shí)時(shí)，對1mg/mL的，百分比降低至44％，對0.5mg/mL的，降低至28％，而0.1mg/mL與對照相同。這導(dǎo)致猜想保護(hù)作用取決于糖蛋白的濃度。
對二聚體30而言(圖31)，使用同樣的步驟，觀察到相同的結(jié)果。20小時(shí)后，細(xì)胞存活百分比在1mg/mL為25％，0.5mg/mL為11％，0.1mg/mL為6％。
當(dāng)平行比較兩種糖蛋白時(shí)(圖32)，最顯著的結(jié)果是，用1mg/mL時(shí)，20小時(shí)后，觀察到兩種化合物15和30對細(xì)胞的保護(hù)作用為對單體15而言44％的存活率以及對二聚體30而言25％，相比之下，對照僅為8％。
對于主實(shí)驗(yàn)而言這用1mg/mL濃度的單體15或二聚體30在四種不同溫度下進(jìn)行22、4、-3和-10℃。直到8小時(shí)，所有溫度下都沒有顯著不同(圖33)。16小時(shí)后(圖3 4)，在4和-3℃時(shí)，較之陰性對照，在糖蛋白的存在和細(xì)胞存活百分比之間觀察到了強(qiáng)烈的相關(guān)。不幸的是，這些結(jié)果不能推斷出這兩種形式的哪種具有最好的保護(hù)作用；在4℃時(shí)，單體15給出了最佳結(jié)果，而在-3℃時(shí)，二聚體30最好。22小時(shí)后(圖35)，活細(xì)胞的數(shù)量有大的降低。但是，在-3℃時(shí)，二體形式被注意到具有17％的存活率。
在22℃(圖36)，45小時(shí)后，在對照中觀察到了51％的存活，而單體15和二聚體30的情況僅分別降低至65和80％。
在4℃獲得了同樣類型的曲線(圖37)，最終結(jié)果不如45小時(shí)時(shí)顯著，但單體顯示了在整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)期間而言更好的存活百分比。-3℃時(shí)(圖38)，結(jié)果類似于二聚體，特別是8-22小時(shí)的范圍。
-10℃時(shí)(圖39)，對于二聚體和對照觀察到了類似的結(jié)果，而單體略為提高。
圖40在-3℃顯示了存在單體時(shí)活細(xì)胞數(shù)量隨著溫育時(shí)間緩慢降低。
在這些對于成肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)期間，我們發(fā)現(xiàn)，單體和二聚體化合物對這些細(xì)胞具有保護(hù)作用。這表現(xiàn)為●在糖蛋白15和30的濃度增加與細(xì)胞存活率之間有著相關(guān)性，在1mg/mL時(shí)單體15和二聚體30給出了比0.1和0.5mg/mL更好的結(jié)果。
●僅在8小時(shí)之后看到顯著的效果。所有實(shí)驗(yàn)都尤其在8至20小時(shí)之間顯示了令人感興趣的結(jié)果。
●最令人感興趣的保護(hù)作用出現(xiàn)在4℃和-3℃。
●無法驗(yàn)證究竟是單體還是二聚體最有活性。
在3℃和-3℃的溫度，對成肌細(xì)胞進(jìn)行另一試驗(yàn)。這次該實(shí)驗(yàn)的目的是以等摩爾當(dāng)量的方式增加糖蛋白15和30的濃度(二聚體的分子量是單體的2倍)。濃度增加對于單體15來說是2.5mg/mL，對于二聚體30來說是5mg/mL。在通常用于保存細(xì)胞和組織的范圍上選擇溫度。想法是隨后在組織上繼續(xù)進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。
方法1)將細(xì)胞擴(kuò)展于瓶中。
2)用0.2×106個(gè)細(xì)胞/mL來制備具有1.0mL細(xì)胞的三個(gè)試管。
3)向一個(gè)試管中加入25μL的100mg/mL的單體15，以獲得2.5mg/mL(4.3mM)4)向一個(gè)試管中加入50μL的100mg/mL的二聚體30，以獲得5.0mg/mL(4.5mM)。
5)將試管上樣至2×96孔板，其中每孔100μL。
6)一塊平板在3℃培養(yǎng)，另一塊在-3℃。
7)在0、8、12、16、20和24小時(shí)時(shí)對活細(xì)胞和死細(xì)胞計(jì)數(shù)。
圖41和42給出了3℃和-3℃時(shí)8、12、16、20和24小時(shí)后，陰性對照中、存在單體和二聚體時(shí)的細(xì)胞存活比例。
根據(jù)圖41和42，心臟細(xì)胞在-3℃比3℃活得更長。24小時(shí)后，在3℃沒有存活的，而在-3℃，用二聚體時(shí)觀察到了70％的存活率。
在大多數(shù)情況下，單體給出了與二聚體相同的結(jié)果。圖42顯示，在3℃時(shí)，8小時(shí)后對照降低至19％的存活比例，而用單體時(shí)其保持為兩倍高，用二體時(shí)，四倍高。AAGP因此延長了心臟細(xì)胞的存活，尤其是8至12小時(shí)之間時(shí)，但也能達(dá)到24小時(shí)。
在圖43中，來自前面實(shí)驗(yàn)1mg/mL的數(shù)據(jù)已與用于該實(shí)驗(yàn)的最大濃度組合。上述化合物15和30在更高的濃度下具有更好的效果。
這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了與濃度相關(guān)的、化合物15和30對于細(xì)胞存活的保護(hù)作用。最令人感興趣的結(jié)果出現(xiàn)在圖41和42中。24小時(shí)后，成肌細(xì)胞中的大約75％在用二聚體的情況下依然存活，用單體時(shí)為65％，而對照中僅保留了30％。甚至16小時(shí)后，單體和二聚體還保存了大約90％的細(xì)胞。
此外，當(dāng)糖蛋白濃度增加時(shí)，無論單體還是二體，細(xì)胞存活都是一樣的(圖43)。
這些結(jié)果因此顯示，當(dāng)在低溫以及存在產(chǎn)物15和30的情況下保存時(shí)，從成肌細(xì)胞獲得的細(xì)胞是可存活的。
E)產(chǎn)物15對于保存皮膚成纖維細(xì)胞的影響目的是在不同溫度下在皮膚成纖維細(xì)胞上測試產(chǎn)物15。
1)解凍細(xì)胞，在DMEM培養(yǎng)基中，5％CO2以及37℃下，將其培養(yǎng)直到加倍達(dá)到穩(wěn)定。
2)在Petri培養(yǎng)皿中擴(kuò)增細(xì)胞。
3)令細(xì)胞濃度為0.27×106個(gè)細(xì)胞/mL。
4)用90μL AFGP母液(100mg/mL)來完成1.8mL細(xì)胞懸浮液，最終分布進(jìn)四個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)孔100μL。
5)用90μL PBS溶液來完成1.8mL細(xì)胞懸浮液，均勻分布到四個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)孔100μL。
6)一塊板在22℃溫育，另一塊在3℃，另一塊在-3℃，最后一塊在-20℃。
7)在8、12、20和30小時(shí)對細(xì)胞取樣，以使用臺盼藍(lán)排除技術(shù)來繼續(xù)細(xì)胞存活性實(shí)驗(yàn)。
材料-細(xì)胞CCD-27Sk，ATCC編號CRL-1475，來自人類的粘附正常胎兒成纖維皮膚細(xì)胞(1)-DMEM 4mM L -谷氨酰胺-溫育箱， 22、3和-3℃-移液管 -微量移液器槍頭-血球計(jì) -臺盼藍(lán)-顯微鏡 -細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)-微試管 -微試管架-細(xì)胞培養(yǎng)板，Costar 96孔，平底，不針對細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行處理。
在圖44中，在整個(gè)溫度范圍上，用或不用產(chǎn)物15保存的細(xì)胞之間沒有發(fā)現(xiàn)差別。但是，在-20℃，樣品凍結(jié)，導(dǎo)致解凍后細(xì)胞死亡。
12小時(shí)后，在22℃、3℃和-3℃的范圍上仍然沒有觀察到大的差別，另一方面，在22℃和-3℃，用化合物15時(shí)看到了更好的保存效果。
在圖46中，結(jié)果顯示，用單體15較之對照有更好的細(xì)胞存活比例。但是，在-3℃，甚至存在單體時(shí)，存活比例也降低至50％。30小時(shí)后(圖47)，尤其在3℃，受產(chǎn)物15保護(hù)的細(xì)胞展示出明顯的改進(jìn)。在-3℃，即使化合物的存在能提高存活，其仍降低至70％。
如果在同樣的溫度下隨時(shí)間的趨勢繼續(xù)(圖48至50)，應(yīng)當(dāng)注意，對照顯示出在-3℃存活率迅速降低，在3℃降低，在22℃緩慢降低。在存在產(chǎn)物15時(shí)發(fā)現(xiàn)了同樣類型的情況，但比較而言，具有好得多的存活比例。
使用5mg/mL單體15對應(yīng)于8.6mM。這是我們在所述濃度進(jìn)行的第一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果非常樂觀，因?yàn)樵诔?20℃(此時(shí)細(xì)胞凍結(jié)并死亡，無論是否存在單體15)的所有溫度下皮膚成纖維細(xì)胞都展示出更好的保存。最好的改進(jìn)在3℃發(fā)現(xiàn)。
因此決定在3和-3℃進(jìn)行工作，但是使用了高達(dá)15mg/mL的更高的化合物15濃度。
圖51和52清楚地展示，產(chǎn)物15濃度的增加在3和-3℃提高了細(xì)胞存活比例。這些結(jié)果顯示，34小時(shí)后，化合物15對于細(xì)胞具有接近100％的強(qiáng)烈保護(hù)作用。
還在37℃和15℃在成纖維細(xì)胞上對這些化合物(10mg/mL)的潛力進(jìn)行了評估，這對于這些化合物在化妝品中的應(yīng)用可能是有興趣的。
在該實(shí)驗(yàn)中，目的是研究偕二氟化糖蛋白在生理?xiàng)l件下的效果化合物15在37℃即使在四天之后也保存了大約100％的細(xì)胞，而對照中存活比例為20％。這顯示了生理?xiàng)l件下的強(qiáng)烈保護(hù)作用(圖53)。
單體15還能在15℃保存細(xì)胞(46％存活)，而在對照中四天后僅發(fā)現(xiàn)有11％(圖54)。
與該化合物溫育的細(xì)胞保留其球形并且保持了它們的完整性，而在陰性對照中，細(xì)胞丟失了它們的結(jié)構(gòu)形態(tài)，變成粘附性的(圖55)。
關(guān)于化合物15對成人初級皮膚成纖維細(xì)胞的保護(hù)的初步結(jié)果前文結(jié)果顯示，單體15在變化的溫度范圍內(nèi)對于胚胎皮膚成纖維細(xì)胞具有強(qiáng)烈的保護(hù)作用。該試驗(yàn)被延伸至成人初級成纖維細(xì)胞。在下述研究中，在15℃、3℃在成人成纖維細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，還在H2O2下于37℃在胚胎成纖維細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)方案培養(yǎng)條件對于成人成纖維細(xì)胞，使用培養(yǎng)用培養(yǎng)基(富含因子)對于胚胎成纖維細(xì)胞，使用具有0.5mM EDTA的不含血清的培養(yǎng)基，以預(yù)防聚集。用1mM H2O2處理細(xì)胞，以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。對于在成人成纖維細(xì)胞上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，在0、1、2、3、4和6天檢查樣品，在胚胎成纖維細(xì)胞上在2和10小時(shí)檢查。產(chǎn)物15的濃度為15mg/mL。
在成人初級成纖維細(xì)胞上在15℃(圖56)，6天后化合物15能保護(hù)100％的細(xì)胞，而幾乎所有的對照細(xì)胞都死了。在3℃(圖57)，也觀察到了100％的存活，而對照中6天后僅有9％。
在胚胎成纖維細(xì)胞上單體15以大約80％的存活率保護(hù)細(xì)胞，較之對照，其中細(xì)胞在10小時(shí)后全部死亡(圖58和59)。在用AAGP和對照處理的細(xì)胞之間清楚地看到了差別(活細(xì)胞顯示為綠色，死細(xì)胞顯示為紅色)。產(chǎn)物15因此可作為針對氧化應(yīng)激的保護(hù)劑發(fā)揮作用，氧化應(yīng)激是皮膚衰老和皮膚疾病的主要問題。
權(quán)利要求
1.通式I的偕二氟化C-糖肽 其中N是1至5的整數(shù)，R4＝H、AA1、AA1-AA2，R5＝OH、AA1、AA1-AA2，AA1和AA2是獨(dú)立的，它們代表具有非官能性側(cè)鏈的氨基酸，并且R1、R2、R3是獨(dú)立的基團(tuán)，以及如果R1＝R2＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R3＝ 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、芐基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，如果R1＝R3＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R2＝ 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、芐基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，如果R2＝R3＝H、CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R1＝ 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、芐基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，其包含通式II的化合物 其中N是1至5的整數(shù)，并且R1、R2、R3是獨(dú)立的基團(tuán)，以及如果R1＝R2＝H、CH3，那么R3＝ 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、芐基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，如果R1＝R3＝H、CH3，那么 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、芐基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，如果R2＝R3＝H、CH3，那么 其中n是3至4的整數(shù)，Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、芐基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基。
3.如權(quán)利要求1所述的C-糖肽化合物，其特征在于其包含通式III的化合物 其中N是1至5的整數(shù)，n是3至4的整數(shù)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，諸如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氫原子，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，R9＝H、CH3，R10＝H、CH3，R11是氫原子(H)，或保護(hù)基，例如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，其處于可藥用堿、酸的加成鹽、水合物或溶劑化物的狀態(tài)。
5.制備權(quán)利要求1的化合物所需的中間體，其特征在于，其滿足權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)式之一。
6.用于制備根據(jù)權(quán)利要求1-4的偕二氟化化合物的方法，其特征在于，其包括具有通式IV的化合物 其中Y、Y’是獨(dú)立的基團(tuán)，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、芐基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基團(tuán)H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保護(hù)基，例如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保護(hù)基，例如烷基、芐基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氫原子H，或游離的或受保護(hù)的醇官能基，與通式V的化合物之間的反應(yīng) 其中N是1至5的整數(shù)，R15＝H、AA1、AA1-AA2或保護(hù)基，R16＝OH、AA1、AA1-AA2或保護(hù)基，AA1和AA2是獨(dú)立的，它們代表具有非官能性側(cè)鏈的氨基酸，并且R12、R13、R14是獨(dú)立的基團(tuán)，而且如果R12＝R13＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R14＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整數(shù)，如果R12＝R14＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R13＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整數(shù)，如果R13＝R14＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R12＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整數(shù)。
7.組合物，其特征在于，其含有權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的至少一種化合物，或其衍生物之一，或通過與可藥用無機(jī)酸或有機(jī)酸加成獲得的其鹽之一。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，其含有可藥用惰性、無毒賦形劑，例如蒸餾水、葡萄糖、淀粉、乳糖、滑石粉、植物油、乙二醇和/或防腐劑。
9.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物用于制備可用于冷凍外科的化合物或組合物的用途。
10.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物用于制備可用于保存生物材料的化合物或組合物的用途。
11.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物用于制備可用于保存腎臟細(xì)胞的化合物或組合物的用途。
12.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物用于制備可用于保存紅細(xì)胞的化合物或組合物的用途。
13.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物用于制備可用于保存血小板的化合物或組合物的用途。
14.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物用于制備可用于保存心臟細(xì)胞的化合物或組合物的用途。
15.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物用于制備可用于保存成纖維細(xì)胞的化合物或組合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式(I)的偕二氟化C－糖肽化合物，其中，N是1至5的整數(shù)，R
文檔編號A61K38/14GK101090910SQ200580044994
公開日2007年12月19日 申請日期2005年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月2日
發(fā)明者J－C·基里翁, G·卡斯特洛－德利安古－戈德弗魯瓦 申請人:魯昂國家應(yīng)用科學(xué)學(xué)院