專利名稱：硼替佐米(ps－341)的脂質(zhì)體制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文描述的主題涉及包含肽硼酸化合物的脂質(zhì)體組合物，具體的說含有肽硼酸化合物硼替佐米(bortezomib)的脂質(zhì)體組合物。
背景脂質(zhì)體或稱脂質(zhì)雙層囊泡，是由同心有序的脂質(zhì)雙層包封(encapsulate)著水相組成的球形囊泡。脂質(zhì)體充當著包含在水相中或脂質(zhì)雙層中的治療性和診斷性藥物的遞送介質(zhì)。視藥物而定，以脂質(zhì)體包載(entrap)形式遞送藥物可提供多種好處，包括例如藥物毒性降低、藥物動力學(xué)改變或藥物溶解性改進。脂質(zhì)體當配制成包括親水性聚合物鏈的表面覆層時，即為所謂的Stealth或長循環(huán)脂質(zhì)體，還提供另外的好處即血液循環(huán)壽命長，這部分是因為單核吞噬細胞系統(tǒng)對脂質(zhì)體的去除減少。脂質(zhì)體要能從注射部位達到其所需的靶區(qū)域或細胞，往往需要具有較長的壽命。
理想的是，這種脂質(zhì)體可制備成包含所包載的治療性或診斷性化合物，同時(i)裝載(load)效率高，(ii)所包載化合物濃度高和(iii)為穩(wěn)定的形式，即貯藏時化合物泄漏極少。
在待包載化合物得以被動地裝載到脂質(zhì)體中的條件下用以形成脂質(zhì)體的方法是眾所周知的。通常，將干脂質(zhì)膜用水相介質(zhì)水化，形成多層囊泡，囊泡在脂質(zhì)體形成過程中被動地將化合物包載?；衔锟蔀榘诟芍|(zhì)膜中的親脂性化合物，或者為包含在水化介質(zhì)中的水溶性化合物。對于水溶性化合物，這種方法的包封效率相當差，通常最終脂質(zhì)體懸浮液中全部化合物只有5-20％為包封形式。如果囊泡要作進一步的加工(即進行擠出)以產(chǎn)生更小更均勻尺寸的脂質(zhì)體的話，可能會失去另外的化合物。較差的包封效率限制了能裝載到脂質(zhì)體中的化合物量，且會造成在制造中化合物回收成本高昂。
還提出了多種其它的用以形成化合物裝載脂質(zhì)體的被動包載方法，包括溶劑注射法和反相蒸發(fā)法(Szoka，F(xiàn).and Papahadjopoulos，D.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA754194-4198，(1978))。這些方法往往會困擾于相對較差的裝載效率和/或困難的溶劑處理問題。
還提出了通過將化合物與預(yù)先形成的脂質(zhì)體一起在化合物相對較可溶的高溫下溫育，使得化合物在此溫度下能平衡進入脂質(zhì)體中，然后降低脂質(zhì)體的溫度以使化合物沉淀在脂質(zhì)體當中，來被動地將化合物裝載到脂質(zhì)體中。這一方法受限于相對較差的包封效率，這是被動裝載方法的特征。而且，化合物在高溫下(例如體溫)可能會快速從脂質(zhì)體中失去。
已證明相對由內(nèi)向外的pH或電化學(xué)脂質(zhì)體梯度的化合物裝載法，可用于將可電離化合物裝載到脂質(zhì)體中。理論上，通過采用合適的梯度(例如2-4個單位的pH梯度)和通過適當選擇初始裝載條件，可獲得非常高的裝載效率(Nichols and Deamer，D.，Biochim.Biophys.Acta455269-171，(1976))。在這種方法下，化合物從脂質(zhì)體的泄漏要在脂質(zhì)體失去離子梯度后才發(fā)生。因此，只要離子梯度得以維持，化合物就會以脂質(zhì)體包封形式穩(wěn)定地得到保持。
研究了這一梯度穩(wěn)定性問題，并通過采用銨鹽梯度進行化合物包載而至少部分加以解決(Haran，G.，et al.，Biochim.Biophys.Acta1151201-215，(1993))。過量的銨離子在脂質(zhì)體中充當質(zhì)子源，起到電池的作用，以補充貯藏過程中損失的質(zhì)子，從而增加質(zhì)子梯度的壽命，從而降低從脂質(zhì)體的泄漏率。這種方法限于可電離的胺化合物。
還這樣解決梯度穩(wěn)定性問題將可電離捕集劑(trapping agent)包括在脂質(zhì)體中，以充當可電離化合物的反荷離子，與可電離化合物形成離子化復(fù)合物和沉淀物(美國專利第6,110,491號)。本領(lǐng)域描述的另一種將含有至少一個羧基的弱酸性化合物裝載和保持在脂質(zhì)體中的方法，是將陽離子包括在脂質(zhì)體中，該陽離子會使化合物鹽析或沉淀出來(美國專利第5,939,096號)。
美國專利第5,380,531號描述了包載著氨基酸或肽的脂質(zhì)體，其中氨基酸或肽的C末端被修飾成非酸性基團如酰胺或甲酯，被修飾的氨基酸或肽相對跨膜離子梯度裝載到脂質(zhì)體中。修飾的氨基酸或肽充當弱堿，化合物由于脂質(zhì)體內(nèi)部低pH和脂質(zhì)體外部高pH這一梯度而被推動進入脂質(zhì)體中?；衔镌谶_到脂質(zhì)體內(nèi)部空間時發(fā)生質(zhì)子化，并以質(zhì)子化形式保持在脂質(zhì)體中。
盡管有這些不同的方法來將治療性化合物裝載到脂質(zhì)體中，但還是有些化合物仍難以裝載到脂質(zhì)體中，特別是出于臨床功效目的要以高的藥物-脂質(zhì)比裝載時。
肽硼酸化合物是通常較短的、在序列的酸性末端即C末端含有氨基硼酸的2-4氨基酸肽的衍生物(Zembower et al.，lnt.J.Pept.ProteinRes.，47(5)405-413(1996))。肽硼酸由于能夠在硼酸基團和活性位點絲氨酸或組氨酸部分之間形成穩(wěn)定的四面體硼酸鹽復(fù)合物，因此是強有力的絲氨酸蛋白酶抑制劑。通過改變肽硼酸的序列和引入非天然氨基酸殘基和其它取代基，這一活性通常得以增強和變得對特定蛋白質(zhì)具有高度特異性。這導(dǎo)致對具有強抗病毒活性(Priestley，E.S.and Decicco，C.P.，Org.Lett.，2(20)3095-3097(2000)；Bukhtiyarova，M.et al.，Antivir.Chem.Chemother.，12(6)367-73(2001)；Archer，S.J.et al.，Chem.Biol.，9(1)79-92(2002)；Priestley，E.S.et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，12(21)3199-202(2002))和細胞活性毒性(Teicher，B.A.et al.，Clin.Cancer Res.，5(9)2638-2645(1999)；Frankel et al.，Clin.Cancer Res.，6(9)3719-3728(2000)；Lightcap，E.S.et al.，Clin.Chem.，46(5)673-683(2000)；Adams，J.，Semin.Oncol.，28(6)613-619(2001)；Cusack，J.C.，Jr et al.，Cancer Res.，61(9)3535-3540(2001)；Shah，S.A.et al.，J. CellBiochem.，82(1)110-122(2001)；Adams，J.，Curr.Opin.Chem.Bio.，6(4)493-500(2002)；Orlowski，R.Z.and Dees，E.C.，Breast Cancer Res.，5(1)1-7(2002)；Orlowski，R.Z.et al.，J Clm.Oncol.，20(22)4420-4427(2002)；Schenkein，D.，Clin.Lymphoma，3(1)49-55(2002)；Ling，Y.H.，etal.，Clin.Cancer Res.，9(3)1145-1154(2003))的肽硼酸的選擇。這些衍生物遭受到與其它短肽相同的問題，最主要是非?？斓那宄筒荒苓_到體內(nèi)靶部位。
一種這樣的化合物是硼替佐米，曾名為PS-341(Velcade，Millennium Pharmaceuticals，Inc，Cambridge，MA)。硼替佐米是合成的二肽硼酸衍生物，為高度選擇性、強效、可逆的蛋白酶體抑制劑，Ki為0.6nmol/L(Adams，et al.，Semi.n Oncol.，28(6)613-619(2001))。使用美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute)的體外篩選法，硼替佐米顯示對多種腫瘤系(Adams，同上)具有細胞毒性，在人前列腺(Frankel et al.，Clin.Cancer Res.，6(9)3719-3728(2000)；DiPaola et al.，Hematol.Oncol.Clin.North Am.，15(3)509-524(2001))和肺癌異種移植模型(Oyaizu et al.，Oncol.Rep.，8(4)825-829(2001))中具有抗腫瘤活性。
將硼替佐米包載到脂質(zhì)體載體中是合乎需要的。但是，在如何有效地裝載這一相對非極性的二肽上存在著一些困難。從其結(jié)構(gòu)和缺乏易于電離的氨基來判斷，這種化合物不大可能通過以上討論的pH梯度或銨梯度方法得以積累在脂質(zhì)體中。被動包封是一種可選方案，但鑒于這種化合物的非極性性質(zhì)，很可能它會容易通過脂質(zhì)膜，這樣包封的藥物隨著時間的推移和在稀釋時會被釋放出來。
前述的相關(guān)領(lǐng)域的實例及其局限性意在出于說明的目的，并不排除存在其它實例及局限性。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本說明書和研究附圖后，會明悉相關(guān)領(lǐng)域的其它局限性。
發(fā)明概述因此，在一個方面，提供包含肽硼酸化合物硼替佐米穩(wěn)定地包載在其中的脂質(zhì)體組合物。
在另一個方面，提供硼替佐米以肽硼酸酯的形式包載在脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體懸浮液。
在一個方面，本文描述的主題涉及包含脂質(zhì)體的組合物，所述脂質(zhì)體由囊泡形成脂質(zhì)(vesicle-fbrming lipid)所形成，其中包載著由硼替佐米和多元醇制備而成的硼酸酯化合物。
在另一個實施方案中，多元醇是具有順式1，2-二醇或1，3-二醇官能度的化合物。示例性的多元醇是聚乙烯醇。另一種示例性的多元醇是兒茶酚(catecol)。其它示例性的多元醇是單糖、二糖、寡糖和多糖。單糖可以是例如麥芽糖、葡萄糖、核糖、果糖或山梨糖醇。多元醇還可以是甘油或聚甘油或氨基多元醇如氨基山梨糖醇。特別地，設(shè)想了乙烯醇和乙烯胺的共聚物。
在另一個實施方案中，脂質(zhì)體還具有內(nèi)部較高/外部較低的離子梯度。離子梯度可以是例如氫離子(pH)梯度。當離子梯度是pH梯度時，脂質(zhì)體的內(nèi)部pH可在約7.5-8.5之間，脂質(zhì)體外部環(huán)境的pH可在約6-7之間。
在另一個實施方案中，脂質(zhì)體還包括約1-20摩爾百分比的用親水性聚合物衍生化的疏水性部分。
在脂質(zhì)體包括共價連接到親水性聚合物的疏水性部分的實施方案中，優(yōu)選的聚合物是聚乙二醇。優(yōu)選的疏水性部分是脂質(zhì)，且優(yōu)選是囊泡形成脂質(zhì)。
在另一個方面，提供治療方法。所述方法由在水溶液中制備脂質(zhì)體的懸浮液和將脂質(zhì)體懸浮液給予患者組成，所述脂質(zhì)體具有包載于其中的由硼替佐米和多元醇反應(yīng)制備而成的硼替佐米硼酸酯。
在一個實施方案中，脂質(zhì)體通過注射給予。
在又一個方面，公開了在進行放射療法的荷腫瘤患者中選擇性破壞腫瘤組織的方法。所述方法包括給予荷腫瘤患者脂質(zhì)體和使患者進行中子放射療法，所述脂質(zhì)體具有包載形式的共價連接到多元醇形成肽基硼酸酯化合物的硼替佐米和硼同位素。
在一個實施方案中，硼的同位素在硼替佐米化合物中，如10B。
除了上述的示例性方面和實施方案外，更多的方面和實施方案在參閱附圖和研究以下描述內(nèi)容后會顯而易見。
附圖簡述

圖1A-1Q顯示各種肽硼酸化合物的結(jié)構(gòu)；圖2說明硼替佐米相對內(nèi)部較高/外部較低的pH梯度向脂質(zhì)體中的裝載，以便與包載著的多元醇反應(yīng)而在脂質(zhì)體內(nèi)部形成硼酸酯化合物。
發(fā)明詳述I.定義“多元醇”意指具有超過一個羥基(-OH)的化合物。
“肽硼酸化合物”意指以下形式的化合物 其中R1、R2和R3獨立選自相互間可相同或不同的部分(moiety)，n是1-8，優(yōu)選1-4。示例性的化合物在圖1A-1Q中提供。
硼替佐米指化學(xué)名為[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧代-3-苯基-2-[吡嗪基羰基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸的單聚硼酸化合物。
“親水性聚合物”意指室溫下在水中有一定量的可溶性的聚合物。示例性的親水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基 唑啉、聚乙基 唑啉、聚羥丙基 唑啉、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羥丙基甲基丙烯酸酯、聚羥乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和親水性肽序列。聚合物可以均聚物或者以嵌段或無規(guī)共聚物的形式使用。優(yōu)選的親水性聚合物鏈是聚乙二醇(PEG)，優(yōu)選為分子量在500-10,000道爾頓、優(yōu)選750-10,000道爾頓、還更優(yōu)選在750-5000道爾頓的PEG鏈。
“內(nèi)部較高/外部較低的pH梯度”是指脂質(zhì)體的內(nèi)部(較高pH)和懸浮脂質(zhì)體的外部介質(zhì)(較低pH)之間的跨膜pH梯度。通常，脂質(zhì)體內(nèi)部pH至少比外部介質(zhì)pH高1 pH單位，優(yōu)選高2-4 pH單位。
“脂質(zhì)體包載的”意指某化合物被隔離在脂質(zhì)體中央含水區(qū)室(aqueous compartment)中、在脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層之間的含水空間中或者就在脂質(zhì)雙層當中。
II.脂質(zhì)體制劑在一個方面，本發(fā)明提供具有以修飾形式肽硼酸化合物包載在脂質(zhì)體中的硼替佐米的脂質(zhì)體組合物。在本節(jié)中，對所述脂質(zhì)體組合物及制備方法進行描述。
A.脂質(zhì)體成分如上指出，脂質(zhì)體制劑由包含包載的肽硼酸化合物的脂質(zhì)體所構(gòu)成。肽硼酸化合物如硼替佐米是在肽序列的酸性末端即C末端含有α-氨基硼酸的肽。一般來說，肽硼酸化合物為以下結(jié)構(gòu)形式 d其中R1、R2和R3獨立選自相互間可相同或不同的部分，n是1-8，優(yōu)選1-4。還設(shè)想了以硼酸為側(cè)鏈的具有天冬氨酸或谷氨酸殘基的化合物。
優(yōu)選R1、R2和R3獨立選自氫、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷基、芳烷氧基、環(huán)烷基或雜環(huán)；或者任何R1、R2和R3可與肽骨架中的相鄰氮原子形成雜環(huán)。烷基，包括烷氧基、芳烷基和芳烷氧基的烷基成分，優(yōu)選為1-10個碳原子，更優(yōu)選1-6個碳原子，可以是直鏈烷基或者支鏈烷基。芳基，包括芳氧基、芳烷基和芳烷氧基的芳基成分，優(yōu)選是單核芳基或雙核芳基(即兩個稠環(huán))，更優(yōu)選單核芳基，如芐基、芐氧基或苯基。芳基還包括雜芳基，即環(huán)中具有一個或多個氮、氧或硫原子的芳環(huán)，如呋喃基、吡咯、吡啶、吡嗪或吲哚。環(huán)烷基優(yōu)選為3-6個碳原子。雜環(huán)指環(huán)中具有一個或多個氮、氧或硫原子的非芳族環(huán)，優(yōu)選為具有3-6個碳原子的5元至7元環(huán)。這種雜環(huán)包括例如吡咯烷、哌啶、哌嗪和嗎啉。環(huán)烷基或雜環(huán)任一者都可與烷基結(jié)合，例如環(huán)己基甲基。
任何上述基團(氫除外)都可用一個或多個選自以下的取代基取代鹵素(優(yōu)選氟或氯)；羥基；低級烷基；低級烷氧基(如甲氧基或乙氧基)；酮基；醛；羧酸；酯；酰胺；碳酸酯或氨基甲酸酯；磺酸或磺酸酯；氰基；伯氨基、仲氨基或叔氨基；硝基；脒基和硫基或烷硫基。優(yōu)選基團至多包括兩個這樣的取代基。
各種肽硼酸化合物在圖1A-1Q中顯示。圖1A-1Q所示的R1、R2和R3的具體實例包括正丁基和新戊基(烷基)；苯基和吡唑基(芳基)；4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基、3-(硝基脒基)丙基和(1-環(huán)戊基-9-氰基)壬基(取代的烷基)；萘基甲基和芐基(芳烷基)；芐氧基(芳烷氧基)和吡咯烷(R2與鄰近的氮原子形成雜環(huán))。
一般來說，肽硼酸化合物可以是單肽、二肽、三肽或更高階(higherorder)的肽化合物。其它肽硼酸化合物在美國專利第6,083,903號、第6,297,217號和第6,617,317號中描述，這些專利通過引用結(jié)合到本文中。
許多肽硼酸化合物缺乏容易電離的氨基，或者極性非常高，因此難以用上述常規(guī)的遠程(remote)裝載方法裝載到脂質(zhì)體中。因此，設(shè)計了一種肽硼酸化合物裝載方法以提供脂質(zhì)體制劑，其中肽硼酸化合物以肽硼酸酯的形式包載在脂質(zhì)體中，現(xiàn)參考圖2描述這種方法。
圖2顯示具有脂質(zhì)雙層膜的脂質(zhì)體10，所述脂質(zhì)雙層膜由單實線12表示?？梢岳斫獾氖?，在多層脂質(zhì)體中，脂質(zhì)雙層膜由多個脂質(zhì)雙層和居間的含水空間所構(gòu)成。脂質(zhì)體10懸浮在外部介質(zhì)14中，所述外部介質(zhì)的pH為約7.0或以下，在一個實施方案中，低于7.0，在其它實施方案中為約5.5-7.0之間，更通常為約6.0-7.0之間。脂質(zhì)體10具有由脂質(zhì)雙層膜所界定的內(nèi)部含水區(qū)室。包載在內(nèi)部含水區(qū)室當中的是多元醇18，其實例在下文中給出。內(nèi)部含水區(qū)室的pH優(yōu)選為大于約7.0，更優(yōu)選為約7.1-9.0之間，還更優(yōu)選為約7.5至約8.5之間。
脂質(zhì)體中還包載著肽硼酸化合物硼替佐米。應(yīng)認識到，硼替佐米當以硼酸酯化合物的形式包載在脂質(zhì)體中時是天然硼替佐米的修飾形式，因為硼替佐米上的一個或多個羥基部分已與多元醇共價反應(yīng)形成酯鍵。本文提到的硼替佐米包括天然形式的硼替佐米和與多元醇反應(yīng)后的修飾形式的硼替佐米。還應(yīng)認識到，多元醇與硼替佐米反應(yīng)后為修飾形式，因為多元醇上的一個或多個羥基除去了一個或多個氫原子。本文提到多元醇為具有超過一個羥基(-OH)的化合物，意指與肽硼酸化合物反應(yīng)前的多元醇，因為反應(yīng)后多元醇可能沒有剩余的羥基、有一個剩余的羥基或有超過一個羥基。修飾的多元醇意指有至少一個氫原子從羥基中除去的多元醇。再參考圖2，圖中顯示化合物硼替佐米在通過脂質(zhì)雙層膜之前在外部含水介質(zhì)中。在外部含水介質(zhì)中，因介質(zhì)有弱酸性，該化合物不帶電荷。該化合物在其不帶電荷的狀態(tài)下能自由滲透通過脂質(zhì)雙層。硼酸酯的形成使平衡發(fā)生偏移，造成更多的化合物從外部介質(zhì)擴散通過脂質(zhì)雙層，導(dǎo)致化合物在脂質(zhì)體中的積累。在另一個實施方案中，外部懸浮介質(zhì)中較低的pH和脂質(zhì)體內(nèi)部稍高的pH連同脂質(zhì)體內(nèi)部的多元醇，促使藥物累積到脂質(zhì)體的內(nèi)部含水區(qū)室中?；衔镆坏┑搅酥|(zhì)體內(nèi)部，就與多元醇反應(yīng)形成硼酸酯。硼酸酯基本上不能夠通過脂質(zhì)體雙層，這樣藥物化合物就以由天然化合物和多元醇形成的硼酸酯的形式在脂質(zhì)體的內(nèi)部積累。
脂質(zhì)體內(nèi)部的多元醇濃度優(yōu)選使得帶電荷基團(例如羥基)的濃度大于硼酸化合物的濃度。例如在最終藥物濃度為100mM的組合物中，聚合物帶電荷基團的內(nèi)部化合物濃度通常至少也有這么高。
多元醇以內(nèi)部高/外部低的濃度存在，也就是說，脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層膜內(nèi)外存在多元醇的濃度梯度。如果多元醇在外部體相(bulk phase)中大量存在，它會與外部介質(zhì)中的肽硼酸化合物反應(yīng)，而減慢化合物在脂質(zhì)體內(nèi)部的積累。因此，優(yōu)選的是如下所述制備脂質(zhì)體，使得組合物在體相(外部水相)中基本上沒有多元醇。
上文提到，本文所用的多元醇意指具有超過一個羥基的化合物。設(shè)想了含有醇羥基的單體化合物和高分子化合物。多元醇可以是脂族化合物、環(huán)狀二醇化合物、多酚等，其實例在下文中給出。
單體多元醇的非限制性實例包括糖、甘油、乙二醇、碳水化合物、氨基糖(特別是氨基山梨糖醇)、糖醇、脫氧山梨糖醇、葡糖酸、酒石酸、沒食子酸等。簡單的糖如麥芽糖、葡萄糖、核糖、果糖和山梨糖醇已知都能形成硼酸酯，它們的酯形成傾向按所列順序遞增(Myohanen，T.A.，Biochem J.，.197(3)683-688(1981))。1-氨基-2-脫氧山梨糖醇具有更高的硼酸酯形成傾向(Shiino，D.et al.，Biomatenals，15121-128(1994))。還設(shè)想可用所列糖之間的反應(yīng)性差異來制備具有包載強度梯度的脂質(zhì)體制劑，從而精細調(diào)整藥物釋放特性。
高分子多元醇的非限制性實例包括乙烯醇和乙酰胺的共聚物、聚醚、聚乙二醇、聚酯、聚醇等。高分子多元醇的具體實例包括但不限于寡糖、多糖、聚甘油(Hebel，A.et al.，J Org.Chem.，67(26)9452-9455(2002))、聚乙烯醇(Kitano，S.etal.，Makromol.Chem.Rapid Commun.，12227-233(1991))。多元醇聚合物是優(yōu)選的捕集劑，因為它們在結(jié)合了一個或數(shù)個藥物分子后，其性質(zhì)如溶解性和通過雙層脂質(zhì)膜的能力不易發(fā)生改變。
多酚作為多元醇也是適合的，特別是帶鄰位二醇的多酚，如兒茶酚(兒茶素(cathechin)、黃烷醇(flavenol))。在一個實施方案中，設(shè)想綠茶多酚單獨或以任何組合方式混合用作多元醇。在綠茶中發(fā)現(xiàn)了至少大約六種兒茶素(cathecin)，其中(-)-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯含量豐富。來自紅酒的多酚也適合。
優(yōu)選的多元醇化合物是具有多個順式1，2-和/或1，3-二醇基團的多元醇化合物。
為鑒定出合適的多元醇，將所選的多元醇(例如具有順式1，2-和/或1，3-二醇官能度的多元醇)以所需的濃度和所選的pH(通常6-8左右)溶解于合適的溶劑(通常是水)中。將所選的硼酸化合物以對應(yīng)于所需的脂質(zhì)體包載濃度的濃度加入到溶解的多元醇中。經(jīng)過合適的溫育時間后，檢查混合物是否形成硼酸酯，例如通過目測檢查是否有沉淀物或通過分析技術(shù)來檢查。在一個實施方案中，設(shè)想了硼酸酯沉淀物在脂質(zhì)體內(nèi)部的形成(弱酸鹽沉淀物除外)。這一鑒定合適的多元醇的方法特別適合于高分子多元醇的鑒定。
組合物中的脂質(zhì)體主要由囊泡形成脂質(zhì)所組成。這種囊泡形成脂質(zhì)是能在水中自發(fā)形成為雙層囊泡的脂質(zhì)(例如磷脂)，其疏水部分與雙層膜的內(nèi)部疏水區(qū)域接觸，而其頭基團部分朝向膜的外部極性表面。能夠穩(wěn)定摻入到脂質(zhì)雙層中的脂質(zhì)如膽固醇及其各種類似物也可用于脂質(zhì)體中。囊泡形成脂質(zhì)優(yōu)選是具有兩條烴鏈的(通常是?；?和頭基團(極性或非極性)的脂質(zhì)。有多種合成的囊泡形成脂質(zhì)和天然的囊泡形成脂質(zhì)，包括磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和神經(jīng)鞘髓磷脂，其中兩條烴鏈通常長度約為14-22個碳原子，且具有程度不等的不飽和度。上述的其脂族鏈具有程度不等的飽和度的脂質(zhì)和磷脂可市售獲得，或者可按照公開發(fā)表的方法制備。其它合適的脂質(zhì)包括糖酯、腦苷脂和固醇如膽固醇。
可選擇囊泡形成脂質(zhì)，以獲得指定程度的流動性或剛性，來控制脂質(zhì)體在血清中的穩(wěn)定性和/或控制脂質(zhì)體中的包載物質(zhì)的釋放速度。具有剛性更強的脂質(zhì)雙層或者說液晶雙層的脂質(zhì)體，可通過摻入相對剛性的脂質(zhì)，例如具有相對較高的相變溫度(如最高達60℃)的脂質(zhì)來獲得。剛性即飽和的脂質(zhì)給脂質(zhì)雙層賦予更高的膜剛性。其它的脂質(zhì)成分如膽固醇也已知能給脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)賦予膜剛性。另一方面，通過摻入相對流動的脂質(zhì)來獲得脂質(zhì)流動性，通常是摻入其脂質(zhì)相具有相對較低的液體-液晶相變溫度(例如為室溫或低于室溫)的脂質(zhì)。
脂質(zhì)體可任選包括共價連接到親水性聚合物的囊泡形成脂質(zhì)。將這種聚合物衍生化的脂質(zhì)包括在磷脂組合物中，可在脂質(zhì)體周圍形成由親水性聚合物鏈組成的表面覆層，這在例如美國專利第5,013,556號中已有描述。與缺乏由親水性聚合物鏈組成的表面覆層的脂質(zhì)體相比，這種覆層能有效增加脂質(zhì)體的體內(nèi)血液循環(huán)壽命。由甲氧基(聚乙二醇)(mPEG)和磷脂酰乙醇胺(例如二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?、二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)或二油?；字Ｒ掖及?構(gòu)成的聚合物衍生化脂質(zhì)可獲自AvantiPolar Lipids，Inc(Alabaster，AL)，其中mPEG可有不同的分子量(350、550、750、1000、2000、3000、5000道爾頓)。mPEG-神經(jīng)酰胺脂聚合物(lipopolymer)也可購自Avanti Polar Lipids，Inc。脂質(zhì)-聚合物綴合物的制備在文獻中也有描述，參見美國專利第5,631,018號、第6,586,001號和第5,013,556號；Zalipsky，S.et al.，Bioconjugate Chem.，8111(1997)；Zalipsky，S.et al.，Meth.Enzymol.，38750(2004)。這些脂聚合物可制備成高純度的完好(well-defined)、均勻的材料，其分子量分散度極低(Zalipsky，S.et al.，Bioconjugate Chem.，8111(1997)；Wong，J.et al.，Science，275820(1997))。脂聚合物還可以是美國專利第6,586,001號中描述的“中性”脂聚合物，如聚合物-二硬脂?；Y合物，該專利通過引用結(jié)合到本文中。
當將脂質(zhì)-聚合物綴合物包括在脂質(zhì)體中時，通常將1-20摩爾百分比的脂質(zhì)-聚合物綴合物摻入到總脂質(zhì)混合物中(參見例如美國專利第5,013,556號)。
脂質(zhì)體還可另外包括經(jīng)修飾包括了配體的脂聚合物，從而形成脂質(zhì)-聚合物-配體綴合物，在本文中也稱為“脂聚合物-配體綴合物”。配體可以是治療性分子，如在體內(nèi)具有活性的藥物或生物分子；診斷性分子，如造影劑或生物分子；或者對結(jié)合伴侶(binding partner)、優(yōu)選細胞表面上的結(jié)合伴侶具有結(jié)合親和性的靶向分子。優(yōu)選的配體對細胞的表面具有結(jié)合親和性，能促進脂質(zhì)體通過內(nèi)在化作用進入細胞的細胞質(zhì)中。包括這種脂聚合物-配體的脂質(zhì)體中存在的配體在脂質(zhì)體表面向外定向，因此可供與其關(guān)聯(lián)受體發(fā)生相互作用。
用以將配體連接到脂聚合物的方法是公知的，其中聚合物可進行官能化，以便隨后與選定的配體進行反應(yīng)。(美國專利第6,180,134號；Zalipsky，S.et al.，F(xiàn)EBS Lett.，35371(1994)；Zalipsky，S.et al.，Bioconjugate Chem.，4296(1993)；Zalipsky，S.et al.，J.Control.Rel.，39153(1996)；Zalipsky，S.et al.，Bioconjugate Chem.，8(2)111(1997)；Zalipsky，S.et al.，Meth.Enzymol.，38750(2004))。官能化的聚合物-脂質(zhì)綴合物也可市售獲得，如末端官能化PEG-脂質(zhì)綴合物(Avanti PolarLipids，Inc.)。配體與聚合物之間的鍵可以是穩(wěn)定的共價鍵，或者是可釋放的鍵，能響應(yīng)刺激如pH的變化或還原劑的存在而裂解。
配體可以是對細胞受體或?qū)υ谘褐醒h(huán)的病原體具有結(jié)合親和性的分子。配體也可以是治療性或診斷性分子，特別是當以游離形式給予時具有較短的血液循環(huán)壽命的分子。在一個實施方案中，配體是生物配體，優(yōu)選對細胞受體具有結(jié)合親和性的配體。示例性的生物配體是對以下物質(zhì)的受體具有結(jié)合親和性的分子CD4、葉酸、胰島素、LDL、維生素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白、選擇蛋白(如E、L和P選擇蛋白)、Flk-1，2、FGF、EGF、整聯(lián)蛋白(特別是α4β1、αvβ3、αvβ1、αvβ5、αvβ6整聯(lián)蛋白)、HER2及其它物質(zhì)。優(yōu)選的配體包括蛋白質(zhì)和肽，包括抗體和抗體片斷如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv(由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成的片斷)和scFv(其中輕鏈和重鏈的可變區(qū)通過肽接頭連接而成的重組單鏈多肽分子)等等。配體還可以是小分子模擬肽(peptidomimetic)。應(yīng)認識到，細胞表面受體或其片斷可充當配體。其它的示例性靶向配體包括但不限于維生素分子(例如生物素、葉酸、氰鈷胺素)、寡肽、寡糖。其它的示例性配體在美國專利第6,214,388號、第6,316,024號、第6,056,973號、第6,043,094號中給出，這些專利通過引用結(jié)合到本文中。
B.脂質(zhì)體制劑的制備通過脂質(zhì)體包載的多元醇上的羥基官能度與硼替佐米之間形成硼酸酯，使化合物硼替佐米在脂質(zhì)體內(nèi)部得到積累和包載。簡言之，將多元醇置于在脂質(zhì)體內(nèi)部，使硼替佐米擴散通過脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層膜，該化合物與被包載的多元醇反應(yīng)形成硼酸酯化合物，從而使硼替佐米(以修飾形式)包載在脂質(zhì)體中。
在一個實施方案中，這個過程由pH驅(qū)動，其中脂質(zhì)體外部較低的pH(例如pH 6-7)和脂質(zhì)體內(nèi)部稍高的pH(pH 7.5-8.5)加上多元醇的存在，促使化合物的積累和裝載。在這個實施方案中，通過配制具有內(nèi)部較高/外部較低的多元醇梯度的脂質(zhì)體來制備組合物。將如上所述選定的多元醇以如上所述確定的所需濃度制備其水溶液。優(yōu)選多元醇溶液的粘度適合于下文描述的脂質(zhì)水化作用。多元醇水溶液的pH優(yōu)選大于約7.0。
將多元醇水溶液用于干脂質(zhì)膜的水化，所述干脂質(zhì)膜從囊泡形成脂質(zhì)、非囊泡形成脂質(zhì)(如膽固醇、DOPE等)、脂聚合物(如mPEG-DSPE)和任何其它所需脂質(zhì)雙層成分混合而成的所需混合物制備得到。干脂質(zhì)膜這樣制備將選定的脂質(zhì)溶于合適的溶劑(通常是揮發(fā)性有機溶劑)中，然后蒸發(fā)溶劑而留下干燥的膜。將脂質(zhì)膜用含有多元醇、pH調(diào)整至大于約7.0的溶液水化，形成脂質(zhì)體。
實施例1描述了由脂質(zhì)即雞蛋磷脂酰膽堿(PC)、膽固醇(CHOL)和聚乙二醇衍生化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)組成的脂質(zhì)體的制備。將各脂質(zhì)以10∶5∶1的PC∶CHOL∶PEG-DSPE摩爾比溶于氯仿中，然后蒸發(fā)溶劑形成脂質(zhì)膜。將脂質(zhì)膜用聚乙烯醇的水溶液(pH7.5)水化，形成多元醇包載于其中的脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體形成后，可將脂質(zhì)體篩分，獲得尺寸范圍基本均勻的脂質(zhì)體群體，所述尺寸范圍通常約為0.01-0.5微米，優(yōu)選0.03-0.40微米。REV和MLV的一個有效篩分方法涉及使脂質(zhì)體的含水懸浮液擠出通過一系列的聚碳酸酯膜，所述聚碳酸酯膜具有選定的統(tǒng)一孔徑大小，范圍在0.03-0.2微米，通常0.05、0.08、0.1或0.2微米。膜的孔徑大小大體上對應(yīng)于擠出通過該膜而產(chǎn)生的脂質(zhì)體的最大尺寸，特別是在兩次或更多次擠出通過相同的膜進行制備的情況下。也可用均質(zhì)方法將脂質(zhì)體向下篩分至100nm或以下的大小(Martin，F(xiàn).J.，in SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY，P Tyle，Ed，Marcel Dekker，New York，pp 267-316(1990))。
篩分后，通過合適的技術(shù)如滲濾、透析、離心、尺寸排阻層析或離子交換將未被包封的體相多元醇除去，以獲得在內(nèi)部多元醇濃度高且優(yōu)選在外部極少有或沒有多元醇的脂質(zhì)體的懸浮液。同樣在脂質(zhì)體形成后，通過滴定、透析等將脂質(zhì)體的外相調(diào)至pH小于約7.0。
然后將硼替佐米加入到脂質(zhì)體分散液中，以便主動裝載到脂質(zhì)體中。假設(shè)包封效率為100％，即所有加入的化合物最終都以硼酸酯的形式裝載到脂質(zhì)體中的情況，則所加入的硼替佐米的量可由所要包封的藥物的總量來確定。
將化合物與脂質(zhì)體分散液的混合物在如下條件下溫育，該條件使得脂質(zhì)體攝入化合物硼替佐米至化合物濃度高出體相介質(zhì)中的化合物濃度數(shù)倍，濃度的高出可例如由脂質(zhì)體中形成沉淀物來證明。沉淀物可例如通過標準的電子顯微鏡術(shù)或X射線衍射技術(shù)來確認。通常，溫育在高溫下進行，優(yōu)選為脂質(zhì)體脂質(zhì)的主相變溫度Tm或以上。例如對于Tm為55℃的高相變脂質(zhì)，溫育可在約55-70℃、更優(yōu)選60-70℃下進行。取決于溫育溫度，溫育時間可從一小時或以下到長達12小時或以上。
在這一溫育步驟結(jié)束時，可對懸浮液作進一步的處理，例如用任何上述的用以將游離聚合物從包載著多元醇的初始脂質(zhì)體分散液中除去的方法來處理，以除去游離的(非包封的)化合物。
實施例2描述了包含由硼替佐米和多元醇形成的硼酸酯化合物的脂質(zhì)體的制備方法，其中多元醇是山梨糖醇。在這個實施例中，制備了由雞蛋PC和膽固醇組成的薄脂質(zhì)膜。將該脂質(zhì)膜用山梨糖醇水溶液水化，形成山梨糖醇包載在內(nèi)部含水區(qū)室中的脂質(zhì)體。未包載的山梨糖醇通過合適的技術(shù)如透析、離心、尺寸排阻層析或離子交換除去，以獲得在內(nèi)部多元醇濃度高且優(yōu)選在外部極少有或沒有多元醇的脂質(zhì)體的懸浮液。然后，將硼替佐米加入到外部介質(zhì)中。處于未電離狀態(tài)的化合物能自由滲透通過脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層?；衔镆坏┑搅酥|(zhì)體內(nèi)部，就與被包載的多元醇反應(yīng)形成硼酸酯，將平衡偏移向更多的藥物能通過脂質(zhì)雙層。這樣，化合物就在脂質(zhì)體中積累和穩(wěn)定地包載在其中。
包括脂質(zhì)-聚合物-配體靶向綴合物的脂質(zhì)體制劑可通過多種方法來制備。有一種方法涉及到制備脂質(zhì)囊泡，所述脂質(zhì)囊泡包含末端官能化的脂質(zhì)-聚合物衍生物，即其中游離聚合物末端具有反應(yīng)性或“活化”的脂質(zhì)-聚合物綴合物(參見例如美國專利第6,326,353號和第6,132,763號)。將這種活化的綴合物包括在脂質(zhì)體組合物中，使活化聚合物末端在脂質(zhì)體形成后與靶向配體反應(yīng)。在另一個方法中，脂質(zhì)-聚合物-配體綴合物在脂質(zhì)體形成時被包括在脂質(zhì)組合物中(參見例如美國專利第6,224,903號、第5,620,689號)。在又一個方法中，將脂質(zhì)-聚合物-配體綴合物的膠束溶液與脂質(zhì)體的懸浮液一起溫育，脂質(zhì)-聚合物-配體綴合物被插入到預(yù)先形成的脂質(zhì)體中(參見例如美國專利第6,056,973號和第6,316,024號)。
III.使用方法在一個實施方案中，使用具有以硼酸酯形式包載的硼替佐米的脂質(zhì)體制劑，來治療荷腫瘤患者。在肽硼酸化合物包括硼的同位素的實施方案中，脂質(zhì)體制劑可用于硼中子捕獲療法。現(xiàn)對這些示例性用途進行描述。
A.腫瘤治療硼酸化合物屬于稱之為蛋白酶體抑制劑的這類藥物。蛋白酶體抑制劑通過其抑制細胞蛋白酶體活性的能力來誘導(dǎo)細胞的凋亡。更具體的說，在真核細胞中，遍在蛋白-蛋白酶體途徑是胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑。蛋白質(zhì)首先通過多遍在蛋白鏈的連接而成為蛋白酶解的目標，然后被蛋白酶體快速降解成小肽，遍在蛋白釋放出來再循環(huán)利用。這一協(xié)調(diào)的蛋白酶解途徑依賴于遍在蛋白綴合體系和26S蛋白酶體的協(xié)同活性。26S蛋白酶體是大的(1500-2000kDa)多亞單位復(fù)合體，存在于真核細胞的細胞核和細胞質(zhì)中。這一復(fù)合體的催化核心稱之為20S蛋白酶體，是由四個含α和β亞單位的七聚體環(huán)組成的圓柱狀結(jié)構(gòu)。蛋白酶體是蘇氨酸蛋白酶，β亞單位的N末端蘇氨酸提供攻擊靶蛋白質(zhì)中肽鍵的羰基的親核體。至少有三種不同的蛋白酶解活性與蛋白酶體有關(guān)糜蛋白酶解、胰蛋白酶和肽酰谷氨酰肽水解。識別和結(jié)合多遍在蛋白化底物的能力由能結(jié)合20S蛋白酶體的每個末端的19S(PA700)亞單位賦予。這些輔助亞單位將底物解折疊并輸送到20S催化復(fù)合體，同時除去連接的遍在蛋白分子。26S蛋白酶體的裝配和蛋白質(zhì)底物的降解都依賴于ATP(Almond，Leukemia，16433(2002))。
遍在蛋白-蛋白酶體體系通過蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)和時序降解調(diào)節(jié)許多細胞過程。通過控制許多關(guān)鍵細胞蛋白質(zhì)的水平，蛋白酶體充當著細胞生長和凋亡的調(diào)節(jié)者，其活性的破壞對細胞周期具有極大的影響。例如，缺陷性凋亡與幾種疾病的發(fā)病機理有關(guān)，這些疾病包括某些癌癥如B細胞慢性淋巴細胞性白血病，其中存在著休眠腫瘤細胞的積累。
蛋白酶體抑制劑作為一類化合物一般是通過抑制蛋白酶體對蛋白質(zhì)的降解起作用的。這一類化合物包括肽醛、肽乙烯砜，它們通過結(jié)合和直接抑制蛋白酶體的20S核心中的活性位點來起作用。但是，肽醛和肽乙烯砜以不可逆的方式結(jié)合20S核心顆粒，以至于它們除去時蛋白酶解活性也不能得到恢復(fù)。相反，肽硼酸化合物能使蛋白酶體受到穩(wěn)定的抑制，但能緩慢地從蛋白酶體解離下來。肽硼酸化合物比其肽醛類似物更強效，并以更具特異性的方式其作用，因為硼和硫之間的相互作用弱意味著肽硼酸酯不會抑制硫醇蛋白酶(Richardson，P.G.et al.，Cancer Control.，10(5)361(2003))。
將多種腫瘤衍生的細胞系暴露于蛋白酶體抑制劑會引起細胞凋亡，可能是由于對幾個途徑，包括細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、p53和核因子κB(NF-κB)的作用所致(Grimm，L.M.and Osborne，B.A.，Results Probl.Cell Differ.，23209-228(1999)；Orlowski，R.Z.，Cell Death Differ.，6(4)303-313(1999))。許多旨在證明蛋白酶體抑制劑介導(dǎo)的細胞凋亡的初步研究使用了造血起源的細胞，包括成單核細胞(Imajoh-Ohmi，S.et al.，Biochem.Biophys.ResCommun.，217(3)1070-1077(1995))、T細胞和淋巴性白血病細胞(Shinohara，K.et al.，Biochem.J.，317(Pt 2)385-388(1996))、淋巴瘤細胞(Tanimoto，Y.et al.，J.Biochem(Tokyo)，121(3)542-549(1997))和早幼粒細胞白血病細胞(Drexler，H. C.，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，94(3)855-860(1997))。對蛋白酶體抑制劑的體內(nèi)抗腫瘤活性的第一次證實使用了人淋巴瘤異種移植模型(Orlowski，R.Z.et al.，Cancer Res.，58(19)4342-4348(1998))。此外，蛋白酶體抑制劑據(jù)報告能誘導(dǎo)患者衍生的淋巴瘤(Orlowski，R.et al.，Cancer.Res.，58(19)4342(1998))和白血病細胞(Masdehors，P.et al.，BrJ Haematol105(3)752-757(1999))的優(yōu)先凋亡，并優(yōu)先地抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖(Hideshima，T.et al.，Cancer Res.，61(7)3071-3076(2001))，而對對照的非轉(zhuǎn)化細胞相對沒有傷害。因此，蛋白酶體抑制劑特別適用作患有難治性血液惡性腫瘤的患者的治療藥物。
在一個實施方案中，包含硼替佐米化合物(以與多元醇所成硼酸酯的形式包載)的脂質(zhì)體制劑用于治療癌癥，更具體的說用于治療癌癥患者的腫瘤。
多發(fā)性骨髓瘤是不能治愈的惡性腫瘤，美國每年有大約15,000人被診斷患有此病(Richardson，P.G.et al.，Cancer Control.10(5)361(2003))。這是一種血液惡性腫瘤，其特征通常是克隆漿細胞在骨髓中的多個部位發(fā)生蓄積。大部分患者能對用化療和放射進行的初步治療作出響應(yīng)，但是由于抗性腫瘤細胞的增殖，大多數(shù)患者最終還是會復(fù)發(fā)。在一個實施方案中，提供治療多發(fā)性骨髓瘤的方法，其中將包含以硼酸酯形式包載的硼替佐米的脂質(zhì)體制劑給予患多發(fā)性骨髓瘤的患者。
脂質(zhì)體制劑在乳腺癌治療上也有效，因為它能幫助克服癌細胞據(jù)以抵抗化療作用的一些主要途徑。例如，通過NF-κB這一凋亡調(diào)節(jié)物和p44/42促分裂原激活的蛋白激酶途徑進行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能具有抗凋亡作用。蛋白酶體抑制劑由于阻斷了這些途徑，就能夠激發(fā)細胞凋亡。因此，提供通過給予包含以硼酸酯形式包載在脂質(zhì)體中的肽硼酸化合物的脂質(zhì)體，來治療具有乳腺癌的患者的方法。此外，由于已證實化療藥物如紫杉烷和蒽環(huán)霉素能激發(fā)一個或兩個這些途徑，將蛋白酶體抑制劑與常規(guī)的化療藥物聯(lián)合使用，能起到增強藥物(如紫杉醇和多柔比星)的抗腫瘤活性。因此，在另一個實施方案中，提供這樣的治療方法，其中將游離形式的或脂質(zhì)體包載形式的化療藥物與脂質(zhì)體包載的肽硼酸化合物(以修飾形式包載在脂質(zhì)體中)聯(lián)合給予。
脂質(zhì)體制劑的劑量和給藥方案須決定于所要治療的癌癥、癌癥的階段、患者的體形大小和健康狀況及醫(yī)護工作者顯而易見的其它因素。此外，用蛋白酶體抑制劑硼替佐米Pyz-Phe-boroLeu(PS-341)進行的臨床研究，能給合適的劑量和給藥方案提供充分的指導(dǎo)。例如，如每周一次或兩次靜脈內(nèi)給予，則實體瘤患者的最大耐受劑量是1.3mg/m2(Orlowski，R.Z.et al.，Breast Cancer Res.，51-7(2003))。在另一個研究中，在3周周期的第1、4、8和11天以靜脈內(nèi)推注的形式給予的硼替佐米，顯示最大耐受劑量為1.56mg/m2(Vorhees，P.M.et al.，Clinical Cancer Res.，96316(2003))。
脂質(zhì)體制劑通常胃腸外給予，優(yōu)選靜脈內(nèi)給予。應(yīng)認識到，制劑可包括任何必需的或適宜的藥物賦形劑以促進遞送。
在上述治療方法中，蛋白酶體抑制劑是具有如下結(jié)構(gòu)的硼替佐米(Pyz-Phe-boroLeu；Pyz2，5-吡嗪羧酸；PS-341) 已證實硼替佐米對多種癌組織(包括乳腺、卵巢、前列腺、肺)和對各種腫瘤(如胰腺腫瘤、淋巴瘤和黑素瘤)具有活性。(Teicher，B.A.etal.，Clin.Cancer Res.，5(9)2638-2645(1999)；Adams，J.，Semin.Oncol.，28(6)613-619(2001)；Orlowski，R.Z.and Dees，E.C Breast CancerRes.，5(1)1-7(2002)；Frankel et al.，Clin.Cancer Res.，6(9)3719-3728(2000)；Shah，S.A.et al.，J.Cell Biochem.，82(1)110-122(2001))。
B.硼中子捕獲療法在另一個方面，提供給予腫瘤硼-10同位素以進行硼中子捕獲療法(10B-NCT)的方法。用以治療癌癥的中子捕獲療法基于10B同位素與熱中子(兩者都相對無害)按以下方程式進行的相互作用10B+1n→7Li+4He+2.4MeV反應(yīng)導(dǎo)致限制在單個或相鄰多個癌細胞的強烈電離輻射。因此，為成功進行治療，需要給腫瘤傳遞足夠量的硼-10同位素。本文描述的脂質(zhì)體制劑提供了將帶有10B同位素的肽硼酸化合物包載在脂質(zhì)體中的方法。如上所討論，帶有10B同位素的肽硼酸化合物以修飾形式，通常以肽硼酸酯的形式包載在脂質(zhì)體中。包含親水性聚合物鏈表面覆層的脂質(zhì)體能優(yōu)先在腫瘤中積累，因為這種脂質(zhì)體的血液循環(huán)壽命長(參見美國專利第5,013,556號、第5,213,804號)。裝載著帶有10B同位素的肽硼酸化合物的脂質(zhì)體，通過兩種獨立的機制來根除腫瘤一是脂質(zhì)體在腫瘤中充當藥物貯庫而在腫瘤中逐漸釋放出抗癌化合物，二是脂質(zhì)體幫助在腫瘤中積累可觀數(shù)量的硼-10同位素，有助于硼中子捕獲療法的功效。
由以上所述，所設(shè)想的本發(fā)明主題的各個方面和特征變得顯而易見。已描述了包含水溶性的脂質(zhì)雙層不透性多元醇化合物及與之結(jié)合的肽硼酸化合物的脂質(zhì)體，多元醇化合物與肽硼酸化合物的結(jié)合形成硼酸酯。例如這樣制備脂質(zhì)體將多元醇包封在脂質(zhì)體的內(nèi)部含水區(qū)室中，從外部介質(zhì)除去任何未包封的多元醇，加入脂質(zhì)雙層可滲透性硼酸化合物，其通過脂質(zhì)雙層膜與多元醇上的羥基部分形成可逆的酯鍵。這樣，通常能自由滲透通過脂質(zhì)雙層的硼酸化合物以硼酸酯化合物的形式被穩(wěn)定地包載在脂質(zhì)體中。肽硼酸化合物向脂質(zhì)體中的積累是在離子梯度不存在下發(fā)生的，但是如有需要也可存在離子梯度。
IV.實施例以下實施例進一步說明本文描述的本發(fā)明，但決不是意在限制本發(fā)明的范圍。
實施例1脂質(zhì)體裝載硼替佐米將聚乙烯醇(分子量2,000，Aldrich Corporation，Milwaukee，WI)溶于水中，用濃聚乙烯醇溶液調(diào)至pH 7.4。將雞蛋磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2,000 Da，Avanti Polar Lipids，Birminghan，AL)以10∶5∶1的摩爾比混合而成的混合物溶于氯仿中，真空蒸發(fā)溶劑，將脂質(zhì)膜在聚乙烯醇溶液中振搖下溫育，使脂質(zhì)分散液在壓力下擠出通過2個孔徑大小為0.2μm的堆積Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用Sepharose CL-4B(Pharmacia，Piscataway，NJ)凝膠色譜法，將外部緩沖液代換成0.14MNaCl(含5mM羥乙基哌嗪-乙磺酸鈉(HEPES)，pH 6.5)，同時除去未包載的聚乙烯醇。向如此獲得的脂質(zhì)體加入硼替佐米。將混合物在37℃振搖下溫育過夜，用Dowex5OW x 4(Sigma Chemical Co，StLouis，MO)處理，用NaCl-HEPES溶液平衡以除去沒有被包封的硼替佐米。使所得脂質(zhì)體濾過0.2μm過濾器進行除菌。
實施例2脂質(zhì)體裝載硼替佐米將山梨糖醇溶于水中，pH調(diào)至7.4。將雞蛋磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2,000Da)以10∶5∶1的摩爾比混合而成的混合物溶于氯仿中，真空蒸發(fā)溶劑。將脂質(zhì)膜用山梨糖醇溶液水化，振搖下溫育以形成脂質(zhì)體。使脂質(zhì)體在壓力下擠出通過2個孔徑大小為0.2μm的堆積Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。處理外部溶液以除去任何未包載的山梨糖醇。接著將硼替佐米加入到外部懸浮介質(zhì)中，所得混合物在37℃振搖下溫育過夜。然后除去任何未包封的化合物。
實施例3脂質(zhì)體包載的硼替佐米的體外活性使多發(fā)性骨髓瘤細胞在微量滴定板上生長至鋪滿。將細胞與按實施例1的描述以不同濃度肽硼酸化合物制備的脂質(zhì)體一起溫育。經(jīng)過24小時溫育后，檢查細胞的凋亡情況。發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體制劑處理的細胞其凋亡發(fā)生率比對照細胞要高。
實施例4脂質(zhì)體包載的硼替佐米的體內(nèi)活性將按實施例1的描述制備的脂質(zhì)體以靜脈內(nèi)推注劑量給予帶有實體瘤的大鼠。將腫瘤大小作為時間的函數(shù)進行測量，發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體制劑處理的動物腫瘤大小減少。
雖然以上討論了多個示例性方面和實施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會確認出這些方面和實施方案的修改、變換、附加和次組合方案。因此，所附權(quán)利要求書及其中的權(quán)利要求應(yīng)意在被解釋為包括落入權(quán)利要求書的真實精神和范圍內(nèi)的所有這些修改、變換、附加和次組合方案。
權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包含由囊泡形成脂質(zhì)所形成的脂質(zhì)體，和包載在所述脂質(zhì)體中的由硼替佐米和多元醇制備而成的硼酸酯化合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多元醇是具有順式1，2-二醇官能度或1，3-二醇官能度的化合物。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多元醇是聚乙烯醇。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多元醇是單糖、二糖、寡糖或多糖。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述多元醇是選自麥芽糖、葡萄糖、核糖、果糖和山梨糖醇的單糖。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多元醇是甘油或聚甘油。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多元醇是氨基多元醇。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述氨基多元醇是氨基山梨糖醇。
9.權(quán)利要求7的組合物，其中所述氨基多元醇是乙烯醇和乙烯胺的共聚物。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述脂質(zhì)體還具有內(nèi)部較高/外部較低的離子梯度。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述離子梯度是氫離子梯度。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述氫離子梯度提供約7.5-8.5的內(nèi)部pH和約6-7的外部pH。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述脂質(zhì)體還包含約1-20摩爾百分比的用親水性聚合物衍生化的疏水部分。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述用親水性聚合物衍生化的疏水部分是用聚乙二醇衍生化的疏水部分。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述疏水部分是脂質(zhì)。
16.一種用于治療惡性腫瘤的組合物，所述組合物包含具有權(quán)利要求1-15中任一項的組合物的脂質(zhì)體。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述惡性腫瘤是血液惡性腫瘤。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物通過注射給予。
19.一種在進行放射療法的荷腫瘤患者中選擇性破壞腫瘤組織的組合物，所述組合物包含具有(i)權(quán)利要求1-15中任一項的組合物和(ii)硼同位素的脂質(zhì)體。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述硼同位素在硼替佐米上。
21.權(quán)利要求19的組合物，其中所述硼同位素是10B。
全文摘要
本發(fā)明描述了具有包載在脂質(zhì)體中的肽硼酸蛋白酶體抑制劑化合物硼替佐米的脂質(zhì)體所構(gòu)成的脂質(zhì)體組合物。硼酸化合物與脂質(zhì)體所包載的多元醇發(fā)生相互作用后以硼酸酯的形式被包載在脂質(zhì)體中。在一個實施方案中，脂質(zhì)體具有親水性聚合物鏈的外覆層，用于治療患者中的惡性腫瘤。
文檔編號A61K47/26GK101094648SQ200580045755
公開日2007年12月26日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者S·扎利普斯基, F·馬丁 申請人:阿爾扎公司