專利名稱：：包含非細(xì)胞毒性蛋白酶、尋靶部分、蛋白酶切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的制作方法包含非細(xì)胞毒性蛋白酶、尋靶部分、蛋白酶切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白本發(fā)明涉及非細(xì)胞毒性融合蛋白，及其治療應(yīng)用。毒素按它們對(duì)靶細(xì)胞影響的類型通?？杀环譃閮深?。更具體地說(shuō)，第一類毒素殺死它們自然靶細(xì)胞，因此被稱為細(xì)胞毒素分子(cytotoxictoxinmolecules)。這組毒素的例子是植物毒素例如蓖麻毒素、相思豆毒素，和細(xì)菌毒素例如白喉毒素、假單細(xì)胞外毒素A等等。為了治療細(xì)胞失調(diào)和像癌癥這樣的疾病，細(xì)胞毒性已經(jīng)吸引了很多人設(shè)計(jì)"魔法子彈(magicbullet)"的興趣(例如，免疫偶聯(lián)物(immunoconjugates)，其包括細(xì)胞毒性組分和與耙細(xì)胞上特定標(biāo)志物結(jié)合的抗體)。典型地，細(xì)胞毒素通過(guò)抑制細(xì)胞的蛋白合成過(guò)程殺掉它們的靶細(xì)胞。第二類毒素，其被稱為非細(xì)胞毒素(non-cytotoxictoxins)，并不殺死它們的自然耙細(xì)胞(如它們的名字證實(shí)的)。非細(xì)胞毒素與它們的細(xì)胞毒素對(duì)等物相比，吸引了較少的商業(yè)興趣，非細(xì)胞毒素通過(guò)抑制蛋白合成以外的其它細(xì)胞過(guò)程來(lái)施加它們對(duì)靶細(xì)胞的影響。非細(xì)胞毒素可被多種植物和微生物所產(chǎn)生，這些微生物例如梭菌屬某種(C/oy/,'/^"wsp.)和奈瑟菌屬某種(M^wn'"sp.)。梭菌神經(jīng)毒素(Clostridialneurotoxins)是典型地分子量在150KDa(150,000道爾頓)級(jí)別的蛋白。它們可由多種細(xì)菌產(chǎn)生，特別是梭菌屬(Clostridium),其最重要的為破傷風(fēng)梭菌(C./"""/)，和肉毒梭菌(C.&0^//"娜)、丁酸梭菌(C.6w，/c謂)和阿根廷梭菌(C.wge;W/"m^)的多個(gè)種。目前，有八種不同類別的梭菌神經(jīng)毒素，即破傷風(fēng)毒素和血清型為A、B、Cl、D、E、F、G的肉毒神經(jīng)毒素，它們具有相似的結(jié)構(gòu)和作用方式。梭菌神經(jīng)毒素代表了非細(xì)胞毒素分子的一個(gè)主要類型，它們作為單鏈多肽由宿主細(xì)菌所合成，該多肽通過(guò)蛋白水解切割活動(dòng)被翻譯后修飾進(jìn)而形成被二硫鍵連在一起的兩條多肽鏈。這兩條鏈叫做重鏈(H-chain)和輕鏈(L-chain)，該重鏈的分子量大約為100KDa(100,000道爾頓)，輕鏈的分子量大約為50KDa(50,000道爾頓)。輕鏈具有蛋白酶功能(鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶活性)以及對(duì)與囊泡和/或質(zhì)膜相連且涉及胞吐過(guò)程的蛋白具有高度的底物特異性。源自不同梭菌種類或血清型的輕鏈可水解不同的、但是特異的三種底物蛋白中的一種的肽鍵，這三種蛋白即突觸囊泡蛋白、突觸融合蛋白或SNAP-25。這些底物是神經(jīng)分泌機(jī)制的重要成分。奈瑟菌屬某種(A^^w/osp.)，最重要的為來(lái)自淋病奈瑟菌(W.go"wr/"e)種類，可產(chǎn)生功能相似的非細(xì)胞毒性蛋白酶。這種蛋白酶的一個(gè)實(shí)例是IgA蛋白酶(見(jiàn)W099/58571)。在本領(lǐng)域，已經(jīng)充分證明了毒素分子可重新靶向(retarget)于不是毒素自然靶細(xì)胞的細(xì)胞。當(dāng)發(fā)生所謂的重新靶向吋，修飾的毒素能結(jié)合于期望的耙細(xì)胞并隨后轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞溶膠，從而能夠?qū)Π屑?xì)胞施加其影響。所述的重新靶向通過(guò)用不同的尋靶部分(TargetingMoiety(TM))代替毒素的天然尋靶部分來(lái)完成。在這點(diǎn)上，選擇TM以便其能與期望的靶細(xì)胞結(jié)合，并且允許修飾的毒素隨后進(jìn)入革巴細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體中。修飾的毒素也包含轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，以便能讓非細(xì)胞毒性蛋白酶迸入胞質(zhì)溶膠。該轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可以是毒素的天然轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，或者它也可以是源自于有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的微生物蛋白的不同的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。例如，WO94/21300描述了修飾的梭菌神經(jīng)毒素分子，該分子能調(diào)控存在于靶細(xì)胞表面的膜內(nèi)在蛋白(整合膜蛋白，IntegralMembranceProtein(IMP))的密度。該修飾的神經(jīng)毒素分子因此能控制靶細(xì)胞的細(xì)胞活性(舉例來(lái)說(shuō)，葡萄糖的吸收)。W096/33273和WO99/17806描述了定位于外周感覺(jué)傳入神經(jīng)的修飾的梭菌神經(jīng)毒素分子。該修飾的神經(jīng)毒素分子因此能表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用。WO00/10598描述了定位于粘液分泌過(guò)多細(xì)胞(或者控制所述的粘液分泌過(guò)多細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞)的修飾的梭菌神經(jīng)毒素分子的制備，該修飾的神經(jīng)毒素能抑制所述細(xì)胞的分泌過(guò)多。WO01/21213描述了定位于多種不同類型的非神經(jīng)靶細(xì)胞的修飾的梭菌神經(jīng)毒素分子。該修飾的分子因此能抑制靶細(xì)胞的分泌。在重新靶向的毒素分子的
技術(shù)領(lǐng)域：
里，其它的公布包括WO00/62814、WO00/04926、US5，773,586、W093/15766、WO00/61192和W099/58571。上述的TM替代作用可被傳統(tǒng)的化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)所實(shí)現(xiàn)，這些技術(shù)對(duì)于技術(shù)人員是眾所周知的。在這點(diǎn)上，Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugatetechniques，AcademicPress禾口Wang,S.S.(1991),Chemistryofproteinconjugationandcross-linking,CRCPress,可作為參考。然而，化學(xué)偶聯(lián)(chemicalconjugation)經(jīng)常是不精確的。例如，在偶聯(lián)之后，TM可以在一個(gè)以上的附著點(diǎn)上連接到結(jié)合體的其它部分。化學(xué)偶聯(lián)也難以控制。例如，TM可通過(guò)蛋白酶成分和/或轉(zhuǎn)運(yùn)成分上的附著點(diǎn)連接到修飾的毒素的其它部分。當(dāng)為了治療功效要求僅僅附著于其中一個(gè)所述的成分時(shí)(優(yōu)選地在單一位點(diǎn))，這是有問(wèn)題的。因此，化學(xué)偶聯(lián)導(dǎo)致了修飾的毒素分子的混合群體，這是不想要的結(jié)果。作為對(duì)化學(xué)偶聯(lián)的替代方法，TM替代可通過(guò)單一多肽融合蛋白的重組制備來(lái)實(shí)現(xiàn)(見(jiàn)WO98/07864)。這種技術(shù)是基于細(xì)菌體內(nèi)制備天然梭菌神經(jīng)毒素(也就是全毒素)的機(jī)制，該技術(shù)導(dǎo)致融合蛋白具有以下結(jié)構(gòu)排列氨基-閨白酶成分H轉(zhuǎn)運(yùn)成分HTM]-羧基依照WO98/07864,TM被置于靠近融合蛋白的C-末端的地方。然后融合蛋白通過(guò)使用蛋白酶處理被活化，該蛋白酶的切割位點(diǎn)位于蛋白酶成分和轉(zhuǎn)運(yùn)成分之間。雙鏈蛋白被如此產(chǎn)生了，該蛋白包括蛋白酶成分，其作為單一多肽鏈通過(guò)共價(jià)鍵(通過(guò)二硫橋)與包含轉(zhuǎn)運(yùn)成分和TM的另一條單一多肽鏈相連接。當(dāng)WO98/07864的方法遵照梭菌全毒素的自然表達(dá)的系統(tǒng)時(shí)(依照融合蛋白的結(jié)構(gòu)排列)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這個(gè)系統(tǒng)可以導(dǎo)致某些融合蛋白的生成，這些融合蛋白對(duì)目的耙細(xì)胞具有基本上降低的結(jié)合能力。因此需要一個(gè)替代的或改善的系統(tǒng)去構(gòu)建非細(xì)胞毒性的融合蛋白。本發(fā)明通過(guò)提供單鏈多肽融合蛋白，來(lái)致力于解決一個(gè)或多個(gè)上述的問(wèn)題，所述單鏈多肽融合蛋白包括a.非細(xì)胞毒性蛋白酶，或其片段，該蛋白酶或蛋白酶片段能在靶細(xì)胞里切割胞吐融合器(exocyticfosionapparatus)的蛋白；b.尋靶蛋白，其能結(jié)合于靶細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)能經(jīng)歷內(nèi)吞作用以導(dǎo)入處于靶細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體中；c.蛋白酶切割位點(diǎn)，在該位點(diǎn)融合蛋白可被蛋白酶切割，其中蛋白酶切割位點(diǎn)位于非細(xì)胞毒性蛋白酶或其片段與尋靶部分之間；以及轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，其能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶或蛋白酶片段從內(nèi)體中穿過(guò)內(nèi)體膜并進(jìn)入靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。WO98/07864系統(tǒng)對(duì)于制備含有TM的結(jié)合體進(jìn)行得很好，為了與耙細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生相互作用，該TM需要C-末端結(jié)構(gòu)域。在這點(diǎn)上，WO98/07864提供了具有C-末端結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，該結(jié)構(gòu)域可"自由地"與耙細(xì)胞上結(jié)合位點(diǎn)作用。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)排列并不是適合所有TM。更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)WO98/07864融合蛋白系統(tǒng)對(duì)于需要用于與耙細(xì)胞上結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行相互作用的N-末端結(jié)構(gòu)域的TM并不是最佳的。當(dāng)TM需要特定的N-末端氨基酸殘基，或包括用于與靶細(xì)胞上結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行相互作用的N-末端氨基酸殘基的特定的氨基酸殘基序列時(shí)，這個(gè)問(wèn)題變得特別尖銳。與WO98/07864相反，本發(fā)明提供了用于制備非細(xì)胞毒性偶聯(lián)物的系統(tǒng)，其中偶聯(lián)物的TM成分具有N-末端結(jié)構(gòu)域(或內(nèi)部結(jié)構(gòu)域序列)，其能結(jié)合于耙細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的非細(xì)胞毒性蛋白酶成分是非細(xì)胞毒性蛋白酶或其片段，該蛋白酶或蛋白酶片段能切割三個(gè)底物蛋白之一的不同、但是特異性的肽鍵，這三個(gè)蛋白就是胞吐融合器官的突觸囊泡蛋白、突觸融合蛋白或SNAP-25。這些底物是神經(jīng)分泌系統(tǒng)的重要成分。本發(fā)明的非細(xì)胞毒性蛋白酶成分優(yōu)選為奈瑟菌IgA蛋白酶或其片段，或者梭菌神經(jīng)毒素的輕鏈或其片段。特別優(yōu)選的非細(xì)胞毒性蛋白酶成分是肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)的輕鏈或其片段。本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)成分能讓非細(xì)胞毒性蛋白酶(或其片段)轉(zhuǎn)運(yùn)入靶細(xì)胞，于是蛋白酶活性的功能表達(dá)在靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中進(jìn)行。轉(zhuǎn)運(yùn)成分優(yōu)選在低pH值的條件中能在脂膜上形成離子可滲透孔的成分。優(yōu)選地，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅使用能在內(nèi)體膜內(nèi)形成孔的那部分蛋白分子。轉(zhuǎn)運(yùn)成分可得自微生物蛋白源，特別地得自細(xì)菌或病毒蛋白源。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)運(yùn)成分是酶的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，例如細(xì)菌毒素或病毒蛋白。本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)成分優(yōu)選地是梭菌神經(jīng)毒素的重鏈或其片段。最優(yōu)選地是HN結(jié)構(gòu)域(或其功能成分)，其中HN是指梭菌神經(jīng)毒素的重鏈(H-鏈)的一部份或片段，其大約相當(dāng)于重鏈的氨基-端的那半部分，或者與完整重鏈那一片段相一致的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的TM成分負(fù)責(zé)本將發(fā)明的偶聯(lián)物結(jié)合于靶細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)。因此，TM成分僅僅是一種配體，通過(guò)它，本發(fā)明的偶聯(lián)物與選定的靶細(xì)胞結(jié)合。在本發(fā)明的背景中，靶細(xì)胞可以是任意的靶細(xì)胞，盡管在限制性條文中靶細(xì)胞不是傷害性感覺(jué)傳入神經(jīng)細(xì)胞(nociceptivesensoryafferent),例如初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)細(xì)胞(primarysensoryafferent)。因此，TM可結(jié)合于非神經(jīng)細(xì)胞禾口/或神經(jīng)細(xì)胞。按慣例，需要確定TM是否結(jié)合一種給定的靶細(xì)胞。例如，可使用簡(jiǎn)單的輻射取代實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，在該實(shí)驗(yàn)中，在過(guò)量未標(biāo)記配體存在下，代表耙細(xì)胞的組織或細(xì)胞暴露于標(biāo)記的(例如用氚示蹤的)配體。在該實(shí)驗(yàn)中，非特異性和特異性結(jié)合的相對(duì)比例可以被估計(jì)，因此能夠證實(shí)配體是否與靶細(xì)胞結(jié)合。任選地，所述實(shí)驗(yàn)可包括一種或多種結(jié)合拮抗劑，并且所述實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步包含觀測(cè)配體結(jié)合的喪失。這種類型的實(shí)驗(yàn)的實(shí)例可在Humle，E.C.(1990),receptor-bindingstudies,abriefoutline,pp.303-311,InReceptorbiochemistry,ApracticalApproach,Ed.E.C.Hulme,OxfordUnivesityPress(牛津大學(xué)出版社出版的"受體生物化學(xué)，實(shí)踐方法"中的303到311的一篇名為"受體結(jié)合研究"的概述)中找到。本發(fā)明的融合蛋白，當(dāng)與相應(yīng)的"自由"TM的比較時(shí)，總體上表現(xiàn)了對(duì)靶細(xì)胞減少的結(jié)合親和力(在高達(dá)100倍的區(qū)域)。然而，盡管有這樣的觀測(cè)結(jié)果，本發(fā)明的融合蛋白令人驚奇的展示了良好的功效。這被歸功于兩個(gè)主要的特性。第一，非細(xì)胞毒性蛋白酶成分是有催化性的，因此少許這種分子的治療效果被迅速放大。第二，存在于靶細(xì)胞上的受體僅僅作為治療劑進(jìn)入的入口，不需要為了完成配體受體介導(dǎo)的藥理反應(yīng)而被刺激到一個(gè)期望的水平。因此，本發(fā)明的融合蛋白使用的劑量可低于將被使用的其它類型的治療分子的劑量，后者典型地以高達(dá)微克到毫克的數(shù)量(甚至高達(dá)數(shù)百毫克)被使用。相反，本發(fā)明的融合蛋白可被以低得多的劑量使用，典型地為低至少10倍的劑量，更典型地為低100倍的劑優(yōu)選地，TM包括最多50個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地，最多40個(gè)氨基酸殘基，特別優(yōu)選地，最多為30個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選地，最多為20個(gè)氨基酸殘基。蛋白酶活化的受體配體代表了本發(fā)明的TM的優(yōu)選組，特別是PAR1。PARs代表了7跨膜受體G-蛋白偶聯(lián)受體的獨(dú)特亞型，因?yàn)樗鼈兘?jīng)蛋白水解修飾暴露出一個(gè)新的細(xì)胞外N-末端，其作為錨定的活化配體發(fā)揮作用。已經(jīng)被確定，PAR1的激動(dòng)劑(例如TFLLR)能活化它們的同源受體。甲狀旁腺激素(Parathyroidhormone(PTH))也代表了本發(fā)明的優(yōu)選的TM。PTH由甲狀旁腺釋放并且結(jié)合于PTH-1受體。這種受體分布廣泛，但在主要位于腎臟的PTH靶組織和骨骼中特別豐富。因此，本發(fā)明最優(yōu)選的TM是<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，TM結(jié)合于粘液分泌細(xì)胞，或結(jié)合于控制或引導(dǎo)粘液分泌的神經(jīng)細(xì)胞。更具體地，TM結(jié)合于(a)分泌粘蛋白的細(xì)胞，例如上皮杯狀細(xì)胞和粘膜下腺粘液分泌細(xì)胞，(b)分泌粘液水溶成分的細(xì)胞，例如克拉雷細(xì)胞和漿液細(xì)胞，或者(c)控制或引導(dǎo)粘液分泌的細(xì)胞，例如"感覺(jué)傳入神經(jīng)細(xì)胞"C-纖維或者NANC神經(jīng)系統(tǒng)纖維。在這點(diǎn)上，具體提到的是TMs:-VIP;(32腎上腺素受體激動(dòng)劑；胃泌素釋放肽；和降鈣素基因相關(guān)肽。因此，依照這個(gè)實(shí)施方式，所述的偶聯(lián)物具有治療粘液分泌過(guò)多、哮喘、和/或慢性阻塞性肺病的治療應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，TM結(jié)合于內(nèi)分泌細(xì)胞。這里具體提到的是促甲狀腺激素(thyroidstimulatinghormone(TSH))、胰島素及胰島素型的生長(zhǎng)因子、TSH(促甲狀腺激素)釋放激素(普羅瑞林(protirelin))、FSH/LH釋放激素(格納瑞林(gonadorelin))、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(cortictrophinreleasinghormone(CRH))和ACTH。因此，依照該實(shí)施方式，所述的偶聯(lián)物具有治療包括MEN在內(nèi)的內(nèi)分泌腺腫瘤形成；甲狀腺功能亢進(jìn)和其它依賴甲狀腺分泌過(guò)多的疾病；肢端肥大癥、血中催乳激素過(guò)多、庫(kù)欣病及其它依賴于腺垂體分泌過(guò)多的疾?。恍奂に剡^(guò)多癥、持續(xù)無(wú)排卵和其它與多囊卵巢綜合癥相關(guān)的疾病的治療應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，TM與炎性細(xì)胞結(jié)合。這里具體提到的是(i)對(duì)肥大細(xì)胞的配體，例如FcIgE的C4結(jié)構(gòu)域；(ii)對(duì)嗜曙紅細(xì)胞的配體，例如對(duì)C3a/C4a-R補(bǔ)體受體的配體、與CR4補(bǔ)體受體反應(yīng)的抗原；(iii)對(duì)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的配體，例如巨噬細(xì)胞刺激因子；(iv)對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的配體，例如與iC3b補(bǔ)休受體相連的抗原，或IL8。因此，依照該實(shí)施方式，所述的偶聯(lián)物具有治療過(guò)敏癥(季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎(枯草熱)、過(guò)敏性結(jié)膜炎、血管運(yùn)動(dòng)性鼻炎及食物過(guò)敏)、嗜曙紅細(xì)胞過(guò)多、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性狹窄性小腸結(jié)腸炎、痔、搔癢癥、血管球性腎炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脈管炎、心肌炎、牛皮癬、濕疹、慢性輻射誘導(dǎo)的纖維癥、肺瘢痕化和其它纖維變性的病癥的治療應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，TM結(jié)合于外分泌細(xì)胞。這里具體提到的是垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP-38)。因此，依照該實(shí)施方式，所述的偶聯(lián)物具有治療位于消化道內(nèi)，特別是位于結(jié)腸內(nèi)的粘液分泌細(xì)胞粘液分泌過(guò)多的治療應(yīng)用。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，TM結(jié)合于免疫細(xì)胞。這里提到的是配體愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒片段/表面特性。因此，依照該實(shí)施方式，所述的偶聯(lián)物具有治療重癥肌無(wú)力、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、器官移植、組織移植、體液移植、毒性彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺功能亢進(jìn)、自身免疫性糖尿病、溶血性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜、嗜中性白細(xì)胞減少癥、慢性自身免疫性肝炎、自身免疫性胃炎、惡性貧血、淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、青銅色皮膚病、干燥角膜結(jié)膜炎綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多肌炎、硬皮病、系統(tǒng)性硬化癥、尋常天皰瘡、大皰性類天皰瘡、心肌炎、風(fēng)濕性心炎、血管球性腎炎(古德帕斯徹型)、眼色素層炎、睪丸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、萎縮性胃炎、惡性貧血和1型糖尿病的治療應(yīng)用?！?35]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，TM結(jié)合于心血管細(xì)胞。這里提到的是凝血酶和TRAP(凝血酶受體促效肽)，以及結(jié)合于心血管內(nèi)皮細(xì)胞例如GPlb表面抗原識(shí)別抗體的配體。因此，依照該實(shí)施方式，所述的偶聯(lián)物具有治療心血管疾病和/或高血壓的治療應(yīng)用。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，TM結(jié)合于骨細(xì)胞。這里提到的是結(jié)合于成骨細(xì)胞用于治療選自骨硬化癥和包括降血鈣素的骨質(zhì)酥松的疾病的配體，以及結(jié)合于包括破骨細(xì)胞分化因子的破骨細(xì)胞的配體(例如，TRANCE，或者RANKL或OPGL)。因此，依照該實(shí)施方式，所述的偶聯(lián)物具有治療骨骼疾病的治療應(yīng)用。直線的和環(huán)狀的整合蛋白的結(jié)合序列是本發(fā)明TM的優(yōu)選組。許多整合蛋白識(shí)別精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)的三肽序列(Ruoslahti，1996)。RGD模體在包括纖維結(jié)合蛋白、生腱蛋白、纖維蛋白原和玻璃體結(jié)合蛋白的100多種蛋白中被發(fā)現(xiàn)。RGD-整合蛋白的相互作用作為進(jìn)入細(xì)胞的保守機(jī)制，已被包括柯薩奇病毒(RoivaninenWt/.，1991)和腺病毒(MathiasWa/.，1994)在內(nèi)的許多病原體所利用。PLAEIDIGEL禾BCPLAEIDGIELC，分別為直線肽和環(huán)狀肽的序列，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在表達(dá)整合蛋白的細(xì)胞中，結(jié)合并內(nèi)化DNA(SchneiderWa/.，1999)。本發(fā)明的其它TM包括用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)的TM，特別是那些把人類呼吸道上皮細(xì)胞作為目標(biāo)和被人類呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)化的TM。這包括，直線和環(huán)形的THALWAT(Jost"a/.，2001)、LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)禾BLEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)(Wue/"/.，2003);CDSAFVTVDWGRSMSLC(Florea"a/.，2003);SERS廳F、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP和LQ服SMP(Writer""/.,2004);FSLSKPP、HSMQLST和STQAMFQ肽(Rahim"a/.，2003)。本發(fā)明的蛋白酶切割位點(diǎn)允許在非細(xì)胞毒性蛋白酶成分和TM成分之間的位置切割(優(yōu)選受約束的切割)融合蛋白。該切割反應(yīng)將融合蛋白從一個(gè)單鏈多肽轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I連接的雙鏈多肽。依照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，TM通過(guò)遠(yuǎn)離TM的C-末端結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列進(jìn)行結(jié)合。例如，相關(guān)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括位于接近TM中間(也就是說(shuō)，直線肽序列的中間)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列。優(yōu)選地，相關(guān)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于接近TM的N-末端的位置，更優(yōu)選地在N-末端或靠近N-末端的位置。在一個(gè)實(shí)施方式中，單鏈多肽的融合可包括一個(gè)以上蛋白水解的切割位點(diǎn)。然而，在兩個(gè)或兩個(gè)以上該位點(diǎn)存在的情況下，位點(diǎn)是不同的，因此基本上阻止了單一蛋白酶存在時(shí)多個(gè)切割事件的發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選地，單鏈多肽融合具有單一的蛋白酶切割位點(diǎn)。蛋白酶的切割序列(多個(gè)序列)可在DNA水平用傳統(tǒng)的方法導(dǎo)入，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變導(dǎo)入(和/或去除任意固有的切割序列)。篩選以證實(shí)切割序列的存在，這可通過(guò)手動(dòng)或在計(jì)算機(jī)軟件的幫助下進(jìn)行(例如，DNASTAR,Inc.公司的MapDraw程序)。雖然任意的蛋白酶切割位點(diǎn)可以被使用，但是下面的蛋白酶切割位點(diǎn)是優(yōu)選的腸激酶(DDDDK丄)Xa因子(IEGR丄/IDGR4)TEV(煙草蝕刻病毒)(ENLYFQ丄G)凝血酶(LVPR丄GS)PreScission(LEVLFQ丄GP)其它包括在術(shù)語(yǔ)蛋白酶切割位點(diǎn)中的是內(nèi)含肽(intein)，其是自切割序列。該自我剪接反應(yīng)是可控制的，例如通過(guò)改變存在的還原劑的濃度。在使用中，蛋白酶切割位點(diǎn)被切割，TM的N-末端區(qū)域(優(yōu)選N-末端)暴露出來(lái)。所形成的多肽具有TM，且該TM含有N-末端結(jié)構(gòu)域或基本上沒(méi)有偶聯(lián)物其它部分的內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這樣排列確保了TM的N-末端成分(或內(nèi)結(jié)構(gòu)域)可直接與靶細(xì)胞上結(jié)合位點(diǎn)相互作用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，TM和蛋白酶切割位點(diǎn)在融合蛋白上被至多10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地至多5個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選地O個(gè)氨基酸殘基分隔開(kāi)。因此，在蛋白酶切割位點(diǎn)切割之后，提供了攜帶具有N-末端結(jié)構(gòu)域的TM的偶聯(lián)物，其基本上沒(méi)有偶聯(lián)物的其它部分。這種排列確保了尋耙部分的N-末端成分可直接與耙細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)。與上述的活化步驟相關(guān)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是一旦融合蛋白的蛋白水解切割發(fā)生，TM變得僅僅易于進(jìn)行N-末端降解。另外，特定的蛋白酶切割位點(diǎn)的選擇允許將多肽融合物選擇性活化成為雙鏈構(gòu)象。本發(fā)明的單鏈多肽融合物的構(gòu)建是將蛋白酶切割位點(diǎn)置于TM和非細(xì)胞毒性性蛋白酶成分之間。優(yōu)選地，在單鏈融合物中，TM位于蛋白酶切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)成分之間。這確保了TM連接于轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(也就是，如天然梭菌全毒素發(fā)生的那樣)，盡管在本發(fā)明的一些實(shí)例中，與天然全毒素相比，兩個(gè)成分的順序是相反的。這種排列進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是TM位于融合蛋白中暴露的環(huán)區(qū)域，其最小化了TM對(duì)融合蛋白構(gòu)象的結(jié)構(gòu)影響。在這點(diǎn)上，所說(shuō)的環(huán)被不同地稱作連接子、活化環(huán)、結(jié)構(gòu)域間連接子或者僅僅稱表面暴露環(huán)(Schiavo"a/.,2000，Phys.Rev.，80:717-766和Turton"o/.,2002，TrendsBiochem.，Sci，27:552-558)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在單鏈多肽中，非細(xì)胞毒性蛋白酶成分和轉(zhuǎn)運(yùn)成分被二硫鍵連接在一起。因此在蛋白酶切割位點(diǎn)切割以后，多肽呈現(xiàn)雙鏈構(gòu)象，其中蛋白酶和轉(zhuǎn)運(yùn)成分被二硫鍵保持連接在一起。為了達(dá)到這個(gè)目的，優(yōu)選地，蛋白酶和轉(zhuǎn)運(yùn)成分在單鏈融合蛋白中的距離最大為100個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地最大為80個(gè)氨基酸殘基，特別優(yōu)選地最大為60個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選地最大為50個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，非細(xì)胞毒性蛋白酶成分與融合蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)成分形成二硫鍵。例如，形成二硫鍵的蛋白酶成分的氨基酸殘基位于蛋白酶成分的C-末端的最后20個(gè)氨基酸殘基以內(nèi)，優(yōu)選地在最后10個(gè)氨基酸殘基以內(nèi)。相似的，在形成二硫鍵的第二部分的轉(zhuǎn)運(yùn)成分內(nèi)的氨基酸殘基可位于轉(zhuǎn)運(yùn)成分N-末端的前20個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)，優(yōu)選地在前10個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)。可選地，在單鏈多肽中，非細(xì)胞毒性蛋白酶成分和TM可被二硫鍵連接在一起。在這點(diǎn)上，形成二硫鍵的TM的氨基酸殘基優(yōu)選地位于遠(yuǎn)離TM的N-末端，更優(yōu)選地接近TM的C-末端。在一個(gè)實(shí)施方式中，非細(xì)胞毒性蛋白酶成分與融合蛋白的TM成分形成二硫鍵。在這點(diǎn)上，形成二硫鍵的蛋白酶成分的氨基酸殘基優(yōu)選地位于蛋白酶成分C-末端的最后20個(gè)氨基酸殘基以內(nèi)，更優(yōu)選地，在最后IO個(gè)氨基酸殘基以內(nèi)。相似的，形成二硫鍵的第二部分的TM成分內(nèi)的氨基酸殘基優(yōu)選地位于TM的C-末端的最后20個(gè)氨基酸殘基以內(nèi)，更優(yōu)選地在最后IO個(gè)氨基酸殘基以內(nèi)。上述的二硫鍵排列具有蛋白酶和轉(zhuǎn)運(yùn)成分以相似于天然梭菌神經(jīng)毒素的方式排列的優(yōu)點(diǎn)。作為對(duì)照，參照組成天然梭菌神經(jīng)毒素的一級(jí)氨基酸序列，各自的半胱氨酸殘基間的距離是在8到27個(gè)氨基酸殘基之間——取自Popoff,MR&Marvaud,J-C,1999,Structural&genomicfeaturesofclostridialneurotoxins,Chapter9,inTheComprehensiveSourcebookofBacterialProteinToxins.Ed.AIouf&Freer:-<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>信息僅來(lái)自蛋白水解的菌株融合蛋白可包含一種或幾種純化標(biāo)簽(purificationtags),其位于靠近蛋白酶成分的N-末端和/或靠近轉(zhuǎn)運(yùn)成分的C-末端。雖然任何純化標(biāo)簽都可被使用，但下面的純化標(biāo)簽是優(yōu)選的His-標(biāo)簽(例如6x組氨酸)，優(yōu)選地作為C-末端和/或N-末端標(biāo)簽MBP-標(biāo)簽(麥芽糖結(jié)合蛋白)，優(yōu)選地作為N-末端標(biāo)簽GST-標(biāo)簽(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)，優(yōu)選地作為N-末端標(biāo)簽His-MBP-標(biāo)簽，優(yōu)選地作為N-末端標(biāo)簽GST-MBP-標(biāo)簽，優(yōu)選地作為N-末端標(biāo)簽硫氧還蛋白-標(biāo)簽，優(yōu)選地作為N-末端標(biāo)簽CBD-標(biāo)簽(幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，優(yōu)選地作為N-末端標(biāo)簽。依照本發(fā)明的進(jìn)一歩實(shí)施方式，融合蛋白可包括一種或幾種肽間隔分子。例如，肽間隔可被使用在純化標(biāo)簽和融合蛋白分子的剩余部分之間(舉例來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明的N-末端純化標(biāo)簽和蛋白酶成分之間；禾口/或本發(fā)明的C-末端純化標(biāo)簽和轉(zhuǎn)運(yùn)成分之間)。肽間隔也可被使用在本發(fā)明的TM和轉(zhuǎn)運(yùn)成分之間。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了編碼上述單鏈多肽的DNA序列。在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，DNA序列作為DNA載體的一部分被制備，其中載體包含啟動(dòng)子和終止子。多種不同的間隔分子可被使用在本發(fā)明的融合蛋白的任意一個(gè)中。這種間隔分子的實(shí)例包括GS15、GS20、GS25和Hx27。發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)當(dāng)間隔物的大小被選擇以便(在使用中)TM的C-末端和轉(zhuǎn)運(yùn)成分的N-末端被相互分開(kāi)40到105埃，優(yōu)選地50到100埃，更優(yōu)選地50到90埃時(shí)，本發(fā)明的融合蛋白可以表現(xiàn)出與靶細(xì)胞改良的結(jié)合能力。在另一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的間隔物具有11到29個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，優(yōu)選地15到27個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地20到27個(gè)氨基酸殘基。適當(dāng)?shù)拈g隔物可被常規(guī)地鑒別和獲得，依照Crasto,C丄andFeng,J.A.(2000)May;13(5);pp.309-312—也可參看http:〃www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體具有選自下面的啟動(dòng)子啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑典型的誘導(dǎo)條件tac(雜合物)IPTG0.2mM(0.05-2.0mM)AraBADL-阿拉伯糖0.2%(0.002-0.4%)T7-lac操縱子IPTG0.2mM(0.05-2.0mM)本發(fā)明的DNA構(gòu)建物優(yōu)選地在計(jì)算機(jī)芯片上設(shè)計(jì)，然后通過(guò)傳統(tǒng)的DNA合成技術(shù)進(jìn)行合成。依照將被使用的最終宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)表達(dá)系統(tǒng)，由于密碼子偏愛(ài)(codon-biasing)，上述的DNA序列信息任選地被予以修飾。DNA的骨架被優(yōu)選地篩選以獲得任意固有的核酸序列，當(dāng)其被轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)，將產(chǎn)生與編碼第二肽的序列編碼的蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)相一致的氨基酸序列。這個(gè)篩選可被手動(dòng)或在計(jì)算機(jī)軟件(例如DNASTAR公司的MapDraw程式)的幫助下施行。依照本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式，其提供了制造非細(xì)胞毒性藥劑的方法，其包括a.將本發(fā)明的單鏈多肽融合蛋白與能切割蛋白酶切割位點(diǎn)的蛋白酶相接觸；b.切割蛋白酶切割位點(diǎn)，從而形成雙鏈融合蛋白。這方面提供了雙鏈多肽，其通常模擬梭菌全毒素的結(jié)構(gòu)。更具體而言，所形成的雙鏈多肽典型地具有如此結(jié)構(gòu)，其中a.第一條鏈包含非細(xì)胞毒性蛋白酶或其片段，該蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶細(xì)胞的胞吐融合器的蛋白；b.第二條鏈包含TM和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，該轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域能使蛋白酶或蛋白酶片段從內(nèi)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)內(nèi)體膜并進(jìn)入靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠；以及第一和第二鏈被二硫鍵連接在一起。依照本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了本發(fā)明的單鏈或雙鏈多肽的用途，用于制備治療、預(yù)防或改善以下醫(yī)療疾病的藥物，該疾病選自粘液分泌過(guò)多、哮喘、和/或慢性阻塞性肺病、包括MEN的內(nèi)分泌腺腫瘤形成、甲狀腺功能亢進(jìn)和其它依賴甲狀腺分泌過(guò)多的疾?。恢朔蚀蟀Y、血中催乳激素過(guò)多、庫(kù)欣病及其它依賴于腺垂體分泌過(guò)多的疾??；雄激素過(guò)多癥、持續(xù)無(wú)排卵和其它與多囊卵巢綜合癥相關(guān)的疾病、過(guò)敏癥(季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎(枯草熱)、過(guò)敏性結(jié)膜炎、血管運(yùn)動(dòng)性鼻炎及食物過(guò)敏)、嗜曙紅細(xì)胞過(guò)多、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼裕、盤狀紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性狹窄性小腸結(jié)腸炎、痔、搔癢癥、血管球性腎炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脈管炎、心肌炎、牛皮癬、濕疹、慢性輻射誘導(dǎo)的纖維癥、肺瘢痕化和其它纖維變性的病癥、位于消化道內(nèi)，特別是位于結(jié)腸內(nèi)的粘液分泌細(xì)胞粘液分泌過(guò)多、治療重癥肌無(wú)力、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、器官移植、組織移植、體液移植、毒性彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺功能亢進(jìn)、自身免疫性糖尿病、溶血性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜、嗜中性白細(xì)胞減少癥、慢性自身免疫性肝炎、自身免疫性胃炎、惡性貧血、淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、青銅色皮膚病、干燥角膜結(jié)膜炎綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多肌炎、硬皮病、系統(tǒng)性硬化癥、尋常天皰瘡、大皰性類天皰疫、心肌炎、風(fēng)濕性心炎、血管球性腎炎(古德帕斯徹型)、眼色素層炎、睪丸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、萎縮性胃炎、惡性貧血和1型糖尿病、心血管疾病和/或高血壓和例如骨硬化癥和骨質(zhì)酥松的骨胳疾病。依照相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或改善患者醫(yī)療癥狀或疾病的方法，其包括給所述患者服用治療上有效量的本發(fā)明的單鏈或雙鏈多肽，其中醫(yī)療癥狀或疾病選自粘液分泌過(guò)多、哮喘、和/或慢性阻塞性肺病、包括MEN的內(nèi)分泌腺腫瘤形成、甲狀腺功能亢進(jìn)和其它依賴甲狀腺分泌過(guò)多的疾??；肢端肥大癥、血中催乳激素過(guò)多、庫(kù)欣病及其它依賴于腺垂體分泌過(guò)多的疾??；雄激素過(guò)多癥、持續(xù)無(wú)排卵和其它與多囊卵巢綜合癥相關(guān)的疾病、過(guò)敏癥(季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎(枯草熱)、過(guò)敏性結(jié)膜炎、血管運(yùn)動(dòng)性鼻炎及食物過(guò)敏)、嗜曙紅細(xì)胞過(guò)多、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性狹窄性小腸結(jié)腸炎、痔、搔癢癥、血管球性腎炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脈管炎、心肌炎、牛皮癬、濕疹、慢性輻射誘導(dǎo)的纖維癥、肺瘢痕化和其它纖維變性的病癥、位于消化道內(nèi)，特別是位于結(jié)腸內(nèi)的粘液分泌細(xì)胞粘液分泌過(guò)多、治療重癥肌無(wú)力、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、器官移植、組織移植、體液移植、毒性彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺功能亢進(jìn)、自身免疫性糖尿病、溶血性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜、嗜中性白細(xì)胞減少癥、慢性自身免疫性肝炎、自身免疫性胃炎、惡性貧血、淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、青銅色皮膚病、干燥角膜結(jié)膜炎綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多肌炎、硬皮病、系統(tǒng)性硬化癥、尋常天皰瘡、大皰性類天皰瘡、心肌炎、風(fēng)濕性心炎、血管球性腎炎(古德帕斯徹型)、眼色素層炎、睪丸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、萎縮性胃炎、惡性貧血和1型糖尿病、心血管疾病和/或高血壓和例如骨硬化癥和骨質(zhì)酥松的骨胳疾病。在使用中，本發(fā)明的多肽典型地以與藥物載體、稀釋劑和/或賦形劑相關(guān)聯(lián)的藥物組合物的形成被利用，盡管組合物的精確形式可被修改成適合投藥的模式。優(yōu)選投藥于哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是投藥于人。例如，多肽可被使用，以用于吸入的氣溶膠或霧化溶液的形式或者用于腸胃外投藥、關(guān)節(jié)內(nèi)投藥或顱內(nèi)投藥的無(wú)菌溶液的形式使用。對(duì)于治療內(nèi)分泌目標(biāo)，優(yōu)選靜脈注射、直接注射入腺體或者用于肺部輸送的霧化吸入(aerosolisation);對(duì)于治療炎癥細(xì)胞目標(biāo)，優(yōu)選靜脈注射、皮下注射、表面貼劑投藥或用于肺部輸送的霧化吸入；對(duì)于治療外分泌目標(biāo)，優(yōu)選靜脈注射、直接注射或直接投藥于腺體或者用于肺部輸送的霧化吸入；對(duì)于治療免疫目標(biāo)，優(yōu)選靜脈注射或者直接注射入特定的組織例如胸腺、骨髓或淋巴組織；對(duì)于心血管目標(biāo)的治療，優(yōu)選靜脈注射；以及對(duì)于骨胳目標(biāo)的治療，優(yōu)選靜脈注射或者直接注射。假如用靜脈注射，應(yīng)該也包括泵系統(tǒng)的使用。在用于治療神經(jīng)目標(biāo)的組合物的情況下，可使用脊髓注射(例如硬膜外的或鞘內(nèi)的)或留置泵。本發(fā)明的多肽的給藥的劑量范圍是能產(chǎn)生需要的治療效果的劑量?？衫斫獾氖切枰膭┝糠秶蕾囉诰_的成分性質(zhì)；給藥途徑；制劑性質(zhì)；患者年齡；患者疾病的性質(zhì)、程度或嚴(yán)重度；禁忌癥，如果有的話；以及主治醫(yī)師的判斷。適當(dāng)?shù)娜談┝吭?.0001-1mg/kg的范圍內(nèi)，優(yōu)選地為0.0001-0.5mg/kg，更優(yōu)選地為0.002-0.5mg/kg，以及特別優(yōu)選地0.004-0.5mg/kg。單位劑量能從小于l微克變化到30mg，但是典型地，每劑量在0.01-1mg的范圍，其可每天給藥或優(yōu)選地更低的頻率給藥，例如每周或每六個(gè)月給藥。特別優(yōu)選地給藥方案基于2.5ng融合蛋白作為患者重量每千克lx的劑量。在這點(diǎn)上，優(yōu)選的劑量在lx-100x(即2.5-250ng)的范圍。這個(gè)劑量范圍明顯低于(叩低至少10倍，典型的100倍)將被使用的其它類型的治療分子的劑量范圍。而且當(dāng)同樣的比較在摩爾基礎(chǔ)上進(jìn)行時(shí)，上述的差異被明顯放大，這是因?yàn)楸景l(fā)明的融合蛋白具有比傳統(tǒng)的"小"分子療法大得多的分子量。然而，依賴于精確的成分性質(zhì)以及不同的給藥途徑的不同效率，預(yù)期需要?jiǎng)┝烤哂袑拸V的變化。例如，口服給藥將預(yù)望比靜脈注射給藥需要更高的劑量。在這些劑量水平上的變化可用為了達(dá)到最優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)程序進(jìn)行調(diào)整，這一點(diǎn)在本領(lǐng)域是很容易理解的。適合注射的組合物可以是溶液、懸浮液或乳濁液或者干粉的形式，該干粉在使用前溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)拿浇槲镏?。液體單位劑量形式典型地利用無(wú)熱原的無(wú)菌媒介物進(jìn)行制備。依賴于所使用的媒介物和濃度，有效成分可被溶解或懸浮在媒介物中。溶液可被用于所有形式的腸胃外投藥，并且其特別適用于靜脈注射。在制備溶液中，成份可溶于載體，該溶液被制成等滲壓和無(wú)菌的，其中如果必要的話通過(guò)加入NaCl來(lái)形成等滲壓，在裝入適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌瓶或安瓿以及密封前，使用無(wú)菌技術(shù)通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾進(jìn)行滅菌?？蛇x地，如果溶液的穩(wěn)定性是足夠的，在密封容器中的溶液可用高壓滅菌器進(jìn)行滅菌。有利地，添加劑例如緩沖劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化試劑和/或局部麻醉藥，可被溶于載體中。使用前溶解或懸浮于適當(dāng)載體的干粉，可通過(guò)在無(wú)菌區(qū)域使用無(wú)菌技術(shù)把預(yù)先滅菌的藥物和其它成分裝入無(wú)菌容器進(jìn)行制備?？蛇x地，該成份(即藥品加抑制劑)和其它成分可溶于含水載體，溶液可在無(wú)菌區(qū)域使用無(wú)菌技術(shù)通過(guò)過(guò)濾進(jìn)行滅菌并且被分配入適當(dāng)?shù)娜萜鳌Ｈ缓?，產(chǎn)品被冷凍干燥并且容器被無(wú)菌密封。適合肌肉注射、皮下注射或皮內(nèi)注射的腸胃外懸浮液基本上用相同的方式制備，除了無(wú)菌成分被懸浮于無(wú)菌載體，而不是被溶解于無(wú)菌載體以及滅菌不能用過(guò)濾來(lái)進(jìn)行。該成分可在無(wú)菌狀態(tài)下被分離，或者可選地，該組分可在分離后滅菌例如使用Y輻射。有利地，懸浮劑例如聚乙烯吡咯烷酮，被包括在組合物里，用于促進(jìn)這些成分均勻分布。適合經(jīng)呼吸道給藥的組合物包括氣溶膠、霧化溶液(nebulisablesolution)或用于吹入法的微細(xì)顆粒粉末。在后面的情形里，優(yōu)選顆粒大小小于50微米，特別地，小于10微米。該組合物可用傳統(tǒng)的方式制造并且與傳統(tǒng)給藥器械一起使用。定義部分尋靶部分(TargetingMoiety(TM))指與藥劑相結(jié)合的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)，其在功能上與結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)，從而引起藥劑與靶細(xì)胞表面的物理連接。在本發(fā)明的背景中，靶細(xì)胞是除傷害性感受傳入神經(jīng)細(xì)胞以外的任意細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)TM包含能結(jié)合到靶細(xì)胞上結(jié)合位點(diǎn)的任意分子(即天然存在的分子或其化學(xué)或物理修飾的變體)，該結(jié)合位點(diǎn)能內(nèi)化(例如內(nèi)體(胞內(nèi)體)的形成)——也稱為受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用。TM可具有內(nèi)體膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能；在該情況下，在本發(fā)明的藥劑中，不需要存在單獨(dú)的TM和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域成分。本發(fā)明的TM結(jié)合(優(yōu)選地特異性結(jié)合)到靶細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)非細(xì)胞毒性指正被討論的蛋白酶分子不殺死重新定位的靶細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白酶包含所有自然出現(xiàn)的非細(xì)胞毒性蛋白酶，在真核細(xì)胞中其能切割胞吐融合器的一個(gè)或多個(gè)蛋白。本發(fā)明的蛋白酶優(yōu)選地為細(xì)菌蛋白酶(或其片段)。更優(yōu)選地，細(xì)菌蛋白酶選自梭菌屬(C/o欲W/麵)或奈瑟菌屬(A^/^er/a)(例如梭菌L-鏈或優(yōu)選來(lái)自淋病奈瑟菌的奈瑟菌IgA蛋白酶)。本發(fā)明也含有修飾的非細(xì)胞毒性蛋白酶，其包括不出現(xiàn)在天然和/或合成的氨基酸殘基中的氨基酸序列，只要修飾的蛋白酶仍然表現(xiàn)出上述蛋白酶的活性便可。本發(fā)明的蛋白酶優(yōu)選地表現(xiàn)出絲氨酸或金屬蛋白酶的活性(例如肽鏈內(nèi)切酶活性)。優(yōu)選地，蛋白酶對(duì)SNARE蛋白(例如SNAP-25、突觸囊泡蛋白/VAMP或突觸融合蛋白)具有特異性。特別提到的是神經(jīng)毒素的蛋白酶結(jié)構(gòu)域，例如細(xì)菌神經(jīng)毒素的蛋白酶結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明包括神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)域的用途，其自然出現(xiàn)，也作為所述的天然的神經(jīng)毒素的重組制備形式出現(xiàn)。代表性的神經(jīng)毒素由梭菌所產(chǎn)生，術(shù)語(yǔ)梭菌神經(jīng)毒素包括由破傷風(fēng)梭桿菌(C似a"/)(TeNT)和肉毒梭菌(C.(BoNT)血清型A-G產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，以及由巴氏梭菌(C.6ara/z7)和丁酸梭菌(C.butyricum)產(chǎn)生的緊密相關(guān)的BoNT樣神經(jīng)毒素。上述縮寫貫穿運(yùn)用于整個(gè)本說(shuō)明書。例如，專用術(shù)語(yǔ)BoNT/A表示神經(jīng)毒素的來(lái)源為BoNT(血清型A)。相應(yīng)的專用術(shù)語(yǔ)適用于其它BoNT血清型。術(shù)語(yǔ)L-鏈片段指神經(jīng)毒素L-鏈的成分，該片段表現(xiàn)出金屬蛋白酶的活性以及能蛋白水解性切割與囊泡膜和/或原生質(zhì)膜相結(jié)合的、涉及細(xì)胞胞外分泌的蛋白。轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域是能使蛋白酶(或其片段)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入靶細(xì)胞的分子，這樣蛋白酶活性的功能表達(dá)發(fā)生在靶細(xì)胞的細(xì)胞溶膠之內(nèi)。任何分子(例如蛋白或肽)是否具有本發(fā)明必要的轉(zhuǎn)運(yùn)功能可被許多傳統(tǒng)分析方法中的任意一種所證實(shí)。例如，ShoneC.(1987)描述了使用脂質(zhì)體的體外分析方法，該脂質(zhì)體受到測(cè)試分子的挑戰(zhàn)。必要的轉(zhuǎn)運(yùn)功能的存在被從脂質(zhì)體中釋放的K+和/或標(biāo)記的NAD所證實(shí)，其可被很容易的監(jiān)測(cè)[見(jiàn)ShoneC.(1987)Eur.J.Biochem;vol.167(1):pp.175-180]。進(jìn)一歩的實(shí)例由Bl愿teinR.(1987)所提供，其描述了使用平面磷脂雙層膜的簡(jiǎn)單的體外分析方法。該膜受到測(cè)試分子的挑戰(zhàn)，必要的轉(zhuǎn)運(yùn)功能被所述膜的跨膜電導(dǎo)的增加所證實(shí)[見(jiàn)Blaustein(1987)FEBSLetts;vol.226,no.1:pp.115-120]。另外能進(jìn)行膜融合的評(píng)定因而能進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域適合在本發(fā)明中使用的鑒定的方法，由MethodsinEnzymologyVol220-221,MembraneFusionTechniques:PartsAandB,AcademicPress1993所提供。轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地，能在低pH的條件下，在脂膜上形成離子滲透孔。優(yōu)選地，已發(fā)現(xiàn)僅使用能在內(nèi)體膜上形成小孔的那部分蛋白分子。轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可從微生物蛋白源獲得，特別從細(xì)菌或病毒蛋白源獲得。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域是酶的異位結(jié)構(gòu)域，例如細(xì)菌毒素或病毒蛋白?！┘?xì)菌毒素分子的結(jié)構(gòu)域能形成這些小孔己被充分證明了。某些病毒表達(dá)的膜融合蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域能形成這些小孔也是己知的。這些結(jié)構(gòu)域可被用于本發(fā)明。轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(TranslocationDomain)可以是梭菌來(lái)源，也就是HN結(jié)構(gòu)域(或其功能成分)。HN指梭菌神經(jīng)毒素H-鏈的部分或片段，近似等于H-鏈的氨基酸端的那半部分，或者與完整H-鏈那一片段相一致的結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，H-鏈基本上缺乏H-鏈的Hc成分的天然結(jié)合功能。在這點(diǎn)上，Hc功能可通過(guò)Hc氨基酸序列的缺失(在DNA合成階段，或者合成后階段通過(guò)核酸酶或蛋白酶處理)所除去?？蛇x地，Hc功能可通過(guò)化學(xué)或生物處理而失活。因此，優(yōu)選地，H-鏈能結(jié)合到天然梭菌神經(jīng)毒素(即全毒素)結(jié)合的靶細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域是梭菌神經(jīng)毒素的HN結(jié)構(gòu)域(或其片段)。適當(dāng)?shù)乃缶D(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括肉毒桿菌A型神經(jīng)毒素肉毒桿菌B型神經(jīng)毒素肉毒桿菌C型神經(jīng)毒素肉毒桿菌D型神經(jīng)毒素肉毒桿菌E型神經(jīng)毒素肉毒桿菌F型神經(jīng)毒素肉毒桿菌G型神經(jīng)毒素破傷風(fēng)神經(jīng)毒素氨基酸殘基(449-871)氨基酸殘基(441-858)氨基酸殘基(442-866)氨基酸殘基(446-862)氨基酸殘基(423-845)氨基酸殘基(440-864)氨基酸殘基(442-863)氨基酸殘基(458-879)關(guān)于肉毒梭菌和破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生毒素的遺傳基礎(chǔ)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，我們參考亨德森等(Henderson"a/.)(1997)的TheClostridia:MolecularBiologyandPathogenesis,Academicpress。術(shù)語(yǔ)HN涵蓋天然存在的神經(jīng)毒素的Hn部分，以及修飾的具有如此氨基酸序列的Hw部分，該氨基酸序列不出現(xiàn)在天然和/或合成的氨基酸殘基內(nèi)，只要修飾的Hw部分仍然表現(xiàn)出上述的轉(zhuǎn)運(yùn)功能便可。可選地，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可源于非梭菌(見(jiàn)表1)。源于非梭菌轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括但不限定于白喉毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域、假單細(xì)胞外毒素A型的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域[Prioretal.Biochemisty(1992)31，3555-3559]、炭疽熱毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域[Blankeetal.Proc.Natl,Acad.Sci.USA(1996)93,8437-8442]、轉(zhuǎn)運(yùn)功能的多種促融肽或疏水肽[Planketal.J.Biol.Chem.(1994)269,12918-12924;以及Wagneretal(1992)PNAS,89,pp,7934-7938];以及兩性分子月太[Murataetal(1992)Biochem.,31,pp.l986-1992]。轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可為在天然蛋白中存在的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的鏡像(對(duì)映體，mirror),或者可包括氨基酸變體，只要其不破壞轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運(yùn)能力便可。適合在本發(fā)明中使用的病毒轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的具體的實(shí)例包括病毒表達(dá)的膜融合蛋白的一些轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。例如，瓦格納等(Wagner""/,1992)和村田等(MurataWa/，1992)描述了許多源自流感病毒血凝素的N-末端區(qū)域的促融肽和兩性分子肽的轉(zhuǎn)運(yùn)功能(即膜融合和囊泡化作用)。其它已知具有需要的轉(zhuǎn)運(yùn)活性的病毒表達(dá)的膜融合蛋白是塞姆利基森林病毒(SemlikiForestVirus(SFV))的促融肽的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域、水泡性口膜炎病毒(VSV)糖蛋白G的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域、SER病毒F蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域以及泡沫病毒被膜糖蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。病毒編碼的Aspike蛋白在本發(fā)明的背景中具有具體的應(yīng)用，例如，SFV的E1蛋白和VSF的G蛋白。列于表l中的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的使用包括其序列變體的使用。變體可包含一個(gè)或多個(gè)保守的核酸取代和/或核酸缺失或插入，其條件是變體具有必要的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。變體也可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代和/或氨基酸缺失或插入，其條件是變體具有必要的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>SEQIDNOsSEQID1LC/A的DNA序列SEQID2HN/A的DNA序列SEQID3LC/B的DNA序列SEQID4Hn/B的DNA序列SEQID5LC/C的DNA序列SEQID6HN/C的DNA序列SEQID7CPPAR1-B連接子的DNA序列SEQID8CPPTH-C連接子的DNA序列SEQID9CPPAR1-B融合的DNA序列SEQID10CPPARl-B融合的蛋白質(zhì)序列SEQID11CPPTH-C融合的DNA序列SEQID12CPPTH-C融合的蛋白質(zhì)序列SEQID13CPRGD-C連接子的DNA序列SEQID14CPRGD—C融合的DNA序列SEQID15CPRGD-C融合的蛋白質(zhì)序列SEQID16CP環(huán)RGD-C連接子的DNA序列SEQID17CP環(huán)RGD-C融合的DNA序列SEQID18CP環(huán)RGD-C融合的蛋白質(zhì)序列SEQID19CPTHALWHT-C連接子的DNA序列SEQID20CPTHALWHT-C融合的DNA序列SEQID21CPTHALWHT-C融合的蛋白質(zhì)序列SEQID22CP環(huán)THALWHT-C連接子的DNA序列SEQID23CP環(huán)THALWHT-C融合的DNA序列SEQID24CP環(huán)THALWHT-C融合的蛋白質(zhì)序列SEQID25CPANP-C連接子的DNA序列SEQID26CPANP-C融合的DNA序列SEQID27CPANP-C融合的蛋白質(zhì)序列SEQID28CPVIP-C連接子的DNA序列SEQID29CPVIP-C融合的DNA序列SEQID30CPVIP-C融合的蛋白質(zhì)序列SEQID31胃泌素釋放肽-C連接子的DNA序列SEQID32胃泌素釋放肽-C融合的DNA序列SEQID33胃泌素釋放肽-C融合的蛋白質(zhì)序列'頭施例實(shí)施例1——LC/B和HN/B骨架克隆的制備下面的步驟產(chǎn)生用作成分骨架的LC和HN片段，該成分骨架用于多結(jié)構(gòu)域融合物的表達(dá)。這個(gè)實(shí)施例基于血清型B基克隆(SEQID3禾QSEQID4)的制備，盡管步驟和方法同樣適用于其它血清型(如序列表所列出的血清型A(SEQID1和SEQID2)和血清型C(SEQID5和SEQID6))?？寺『捅磉_(dá)載體的制備pCR4(Invitrogen)是被選定的標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體，其被選擇的原因是由于在載休內(nèi)缺少限制性序列以及鄰近的測(cè)序引物位點(diǎn)，以便構(gòu)建物容易被證實(shí)。表達(dá)載體基于pMAL(NEB)表達(dá)載體，其在多克隆位點(diǎn)內(nèi)正確方位上具有需要的限制性序列，以便構(gòu)建物(5,HI-S"/I-i^I-///"dIII)的插入。表達(dá)載體的片段已被除去以制造不易移動(dòng)的質(zhì)粒，多種不同的融合標(biāo)簽已被插入以增加純化選擇。蛋白酶(例如LC/B)插入物的制備通過(guò)下述兩種方法中的一種制造LC/B(SEQID3):DNA序列通過(guò)LC/B氨基酸序列(使用幾種反向翻譯軟件工具中的一種(例如EditSeq最佳大腸桿菌反向翻譯(DNASTARInc)或者Backtranslation工具v2.0(Entelechon))從免費(fèi)使用的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源例如GeneBank(登錄號(hào)碼P10844)或者Swissport(登錄位置BXB—CLOBO)得到氨基酸序列)的反向翻譯(backTranslation)進(jìn)行設(shè)計(jì)。S鍾HI/Sa/I識(shí)別序列分別引入在序列的5'和3'端，以保持正確的讀碼(閱讀框，readingframe)。篩選(使用軟件例如MapDraw，DNASTARInc.)在反向翻譯期間整合了限制性內(nèi)切酶切割序列的DNA序列。被發(fā)現(xiàn)與克隆系統(tǒng)所需要的序列共有的任何切割序列，都要從計(jì)劃的編碼序列中手動(dòng)除去，以確保共有的大腸桿菌密碼子使用被保持。大腸桿菌密碼子的使用率通過(guò)參考軟件程序例如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)進(jìn)行評(píng)定，而且GC。/。含量和密碼子使用率通過(guò)參考公丌的密碼子使用表(例如GenBankRelease143，2004/09/13)進(jìn)行評(píng)定。然后，該包含LC/B開(kāi)放閱讀框架(ORF)的、優(yōu)化的DNA序列，被商業(yè)上合成(例如被Entelechon、Geneart或Sigma-Genosys)，并且被提供在pCR4載體中?？蛇x的方法是由現(xiàn)有的DNA序列使用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，所述DNA序列具有分別整合入5，和3'端PCR引物的3蘭HI和5^/1限制性內(nèi)切酶序列?；パa(bǔ)的寡核苷酸引物由供應(yīng)商(例如MWG或Sigma-Genosys)化學(xué)合成，以至每個(gè)堿基對(duì)具有與相反鏈雜交的能力，該相反鏈位于梭菌靶DNA片段的側(cè)翼(3'端指向"朝向"彼此)，一個(gè)寡核苷酸用于雙鏈DNA中的每一條。為了產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，將對(duì)梭菌DNA序列具有特異性的短寡核苷酸引物對(duì)，與梭菌DNA模板以及其它反應(yīng)成分相混合，并放入儀器(PCR儀)中，其能自動(dòng)地改變反應(yīng)管的溫育溫度，循環(huán)在大約94°C(用于變性)，55°C(用于寡核苷酸解鏈)和72°C(用于合成)之間進(jìn)行。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增需要的其它試劑包括DNA聚合酶(例如r^或i^聚合酶)、等摩爾量(50-200pm)的DNA的四種核苷dNTP構(gòu)件中的每一種；以及適于酶的緩沖液(其最優(yōu)化Mg^濃度為0.5-5mM)。使用用于r"《PCR產(chǎn)物的TOPOTA克隆或者用于尸/wPCR產(chǎn)物的ZeroBluntTOPO克隆(這兩種試劑盒都是從Iiwitrogen商業(yè)上可獲得的)，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pCR4中。所得的克隆產(chǎn)品通過(guò)測(cè)序檢測(cè)。然后，任何其它的與克隆系統(tǒng)不相容的限制性序列通過(guò)使用定點(diǎn)誘變而被除去(例如使用Quickchange(StratageneInc.))。轉(zhuǎn)運(yùn)(例如Hn)插入物的制備通過(guò)下述兩種方法中的一種制造HN/B(SEQID4):DNA序列通過(guò)HN/B氨基酸序列(使用多種反向翻譯軟件工具中的一種(例如EditSeq最佳大腸桿菌反向翻譯(DNASTARInc)或者Backtranslation工具v2.0(Entelechon))從免費(fèi)使用的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源例如GeneBank(登錄號(hào)碼PI0844)或者Swissport(登錄位置BXB—CLOBO)得到氨基酸序列)的反向翻譯進(jìn)行設(shè)計(jì)。尸M限制性序列被加到N-末端，Xbal-終止密碼子-歷"dII被加到C-末端，以確保正確閱讀框被維持。篩選(使用軟件例如MapDraw，DNASTARInc.)在反向翻譯期間整合了限制性內(nèi)切酶切割序列的DNA序列。被發(fā)現(xiàn)與克隆系統(tǒng)需要的序列共有的任何序列，從計(jì)劃的編碼序列中手動(dòng)除去，以確保共有的大腸桿菌密碼子使用被保持。大腸桿菌密碼子使用通過(guò)參考軟件程序例如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)進(jìn)行評(píng)定，而GC。/。含量和密碼子使用率通過(guò)參考公開(kāi)的密碼子使用表(例如GenBankRelease143，2004/09/13)進(jìn)行評(píng)定。然后，該優(yōu)化的DNA序列被商業(yè)上合成(例如由Entelechon、Geneart或Sigma-Genosys合成)，并被提供在pCR4載體中?？蛇x的方法是由現(xiàn)有的DNA序列使用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，所述DNA序列具有分別整合入5'和3，端PCR引物的？^1/乂&&1-終止密碼子-//,>^111的限制性內(nèi)切酶序列。PCR擴(kuò)增按上面描述的方法施行。PCR產(chǎn)物被插入pCR4載體并且通過(guò)測(cè)序進(jìn)行檢查。然后，任何其它的、與克隆系統(tǒng)不相容的限制性序列，被使用定點(diǎn)誘變除去(例如使用Quickchange(StratageneInc.))。實(shí)施例2——LC/B-PAR1-HN/B融合蛋白的制備連接子-PARl-間隔區(qū)插入物的制備LC-HN連接子可使用現(xiàn)有的連接子序列信息作為模板，根據(jù)第一原理進(jìn)行設(shè)計(jì)。例如，血清型B連接子被定義為結(jié)構(gòu)域間的多肽區(qū)域，該區(qū)域存在于蛋白水解作用發(fā)生的LC和Hw之間的二硫橋的半胱氨酸之間。該序列信息從免費(fèi)使用的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源，例如從GenBank(登錄號(hào)碼P10844)或者Swissport(登錄位置BXB—CLOBO)獲得。在這個(gè)連接子里，腸激酶位點(diǎn)、PAR1和間隔區(qū)被引入；并且使用多種反向翻譯軟件工具中的一種(例如EditSeq最佳大腸桿菌反向翻譯(DNASTARInc)或者Backtranslation工具v2.0(Entelechon)，編碼連接子-配體-間隔區(qū)區(qū)域的DNA序列被確定。然后限制性位點(diǎn)被整合入到該DNA序歹ij，并被排列為^H"HI-SWI-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-PARl-MeI-間隔區(qū)-S^kPwI-Xk/I-終止密碼子-歷"cffll(SEQID7)。重要的是確保對(duì)間隔區(qū)、PARI和限制性序列維持正確的閱讀框，以及確保X6"I序列之前不是堿基TC，其將導(dǎo)致DAM甲基化。DNA序列被篩選，以確保限制性序列的導(dǎo)入，以及任意其它序列被從剩余序列中人工除去，從而確保共有的大腸桿菌密碼子使用被保持。大腸桿菌的密碼子使用通過(guò)參考軟件程序，例如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)進(jìn)行評(píng)定，而且GC。/。含量和密碼子使用率通過(guò)參考公開(kāi)的密碼子使用表(例如GenBankRelease143，2004/09/13)進(jìn)行評(píng)定。然后，該優(yōu)化的DNA序列被商業(yè)上合成(例如由Entelechon、Geneart或Sigma-Genosys合成)，并且被提供在pCR4載體中。LC/B-PAR1-HN/B融合物的制備為了創(chuàng)建LC-連接子-PARl-間隔區(qū)-HN構(gòu)建物(SEQID9)，編碼連接子(SEQID7)的pCR4載體用5畫HI和Sa/I限制性內(nèi)切酶切割。然后，該切割的載體作為用于采用B"mHI和5WI切割的LC/BDNA(SEQID3)的插入和連接的受體載體。然后，所形成的質(zhì)粒DNA用尸M和JK"I限制性內(nèi)切酶切割，并且作為用尸WI和；^al切割的HN/BDNA(SEQID4)的插入和連接的受體載體。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-PARl-間隔區(qū)-HNORF(SEQID9)，用于轉(zhuǎn)移進(jìn)入表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，以產(chǎn)生具有在SEQID10中闡述的序列的融合蛋白。實(shí)施例3——LC/C-PTH-HN/C融合蛋白的制備LC-HN連接子能使用在實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，但是其中使用排列為^6awHI-Sa/I-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-PTH-7Wel-間隔區(qū)-S/d-戶M-力al-終止密碼子-7/,'"dl11(SEQID8)的血清型C連接子。然后LC/C-PTH-HN/C融合被組裝，是通過(guò)使用實(shí)施例1中描述的方法制備的LC/C(SEQID5)和Hn/C(SEQID6)進(jìn)行的，以及使用實(shí)施例2中描述的方法構(gòu)建。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-PTH-間隔區(qū)-HnORF(SEQIDll)，用于轉(zhuǎn)移進(jìn)入表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，以產(chǎn)生具有在SEQID12中闡述的序列的融合蛋白。實(shí)施例4——LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的制備和純化LC-HN連接子能使用在實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，但是其中使用排列為5w"HI-So/I-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-RGD-MeI-間隔區(qū)-5^I-尸M-^&al-終止密碼子-///^1111(8￡(51013)的血清型(連接子。然后通過(guò)使用實(shí)施例1中描述的方法制備的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)以及使用實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行構(gòu)建，組裝LC/C-RGD-Hn/C融合物。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-RGD-間隔區(qū)-HNORF(SEQID14)，其轉(zhuǎn)移進(jìn)入用于表達(dá)的表達(dá)載體，以產(chǎn)生具有在SEQID15中闡述的序列的融合蛋白。為了進(jìn)行重組蛋白表達(dá)，最終的表達(dá)質(zhì)粒pMALLC/C-RGD-HN/C被轉(zhuǎn)移進(jìn)入大腸桿菌BL21。LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的表達(dá)通過(guò)使用下面的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，完成LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的表達(dá)。采用源自LC/C-RGD-HN/C表達(dá)菌株的單一菌落，在250ml的瓶中接種100ml包含0.2%葡萄糖和100嗎/ml氨芐青霉素的改良型TB。使培養(yǎng)物在37'C、225rpm的條件下，生長(zhǎng)16小時(shí)。在2L的瓶中，用10ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種1L包含0.2。/。葡萄糖和100嗎/ml氨芐青霉素的改良型TB。使培養(yǎng)物在37。C條件下生長(zhǎng)，直至OD600nm的值約為0.5，在這時(shí)，降低溫度至16°C。用lmMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物1小時(shí)后，使培養(yǎng)菌在16'C條件下進(jìn)一步生長(zhǎng)16小時(shí)。圖1表示了使用SDS-PAGE分析的、在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白。LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的純化解凍裝有25ml的50mMHEPESpH7.2200mMNaCl和大約10克大腸桿菌BL21細(xì)胞糊(cellpaste)的Falcon管。在冰上，在22微瓦的功率下，以開(kāi)30秒、關(guān)30秒的方式對(duì)細(xì)胞糊進(jìn)行超聲波作用，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，以確保樣品保持冷卻。在18,000rpm、4'C條件下，離心裂解的細(xì)胞30分鐘。將上清液加載到0.1MNiS04填充的螯合柱(20-30ml的柱是足夠的)，且該柱用50mMHEPESpH7.2200mMNaCl進(jìn)行平衡。使用10mM和40mM步進(jìn)梯度(stepgradient)的咪唑洗去非特異性結(jié)合的蛋白，并用lOOmM的咪唑洗脫融合蛋白。在5L的pH7.2含200mMNaCl的50mMHEPES中于4'C過(guò)夜，透析洗脫的融合蛋白；并且測(cè)量透析的融合蛋白的OD值。以每100嗎融合蛋白加1單位的因子X(jué)a，并且在25'C條件下靜置過(guò)夜進(jìn)行溫育。加載到0.1MNiSO4填充的、且用pH7.2含200mMNaCl的50mMHEPES進(jìn)行平衡的螯合柱上(20-30ml的柱是足夠的)。用pH7.2含200mMNaCl的50mMHEPES洗該柱，直到基線水平。使用10mM和40mM步進(jìn)梯度的咪唑洗去非特異性結(jié)合的蛋白，并用100mM的咪唑洗脫融合蛋白。在5L的pH7.2含200mMNaCl的50mMHEPES中于4'C過(guò)夜，透析洗脫的融合蛋白，且濃縮融合蛋白至大約2mg/ml，等分樣品并在-2(TC冷凍。使用0D、BCA和純度分析法檢測(cè)純化的蛋白。圖2顯示用SDS-PAGE分析的純化蛋白。實(shí)施例5——LC/C-環(huán)狀RGD-HN/C融合蛋白的制備可以使用在實(shí)施例2中描述的方法設(shè)計(jì)LC-HN連接子，但是其中使用血清型C連接子，其排列為5"mHI-Sa/I-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-環(huán)狀RGD-A7el-間隔區(qū)-5^1-/^1-^^1-終止密碼子-///"01111(SEQID16)。LC/C-環(huán)狀RGD-HN/C融合然后被組裝，是通過(guò)使用實(shí)施例1中描述的方法制備的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)進(jìn)行的，并使用實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行構(gòu)建。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-環(huán)狀RGD-間隔區(qū)-HNORF(SEQID17)，用于轉(zhuǎn)移進(jìn)入表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，以產(chǎn)生具有在SEQID18中闡述的序列的融合蛋白。為了進(jìn)行重組蛋白表達(dá)，所得的表達(dá)質(zhì)粒pMALLC/C-環(huán)狀RGD-HN/C被轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21。融合蛋白的表達(dá)按照實(shí)施例4的描述進(jìn)行。圖1表示了在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白，如由通過(guò)SDS-PAGE所分析。實(shí)施例6——LC/C-THALWHT-HN/C融合蛋白的制備LC-HN連接子能使用在實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，但是其中使用血清型C連接子，其排列為^^1-&/1-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-丁1^\1^^^11-^^1-間隔區(qū)誦5^IWl-"I-終止密碼子-州"dni(SEQID19)。LC/C-THALWHT-HN/C融合然后被組裝，是通過(guò)使用實(shí)施例1中描述的方法制備的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)進(jìn)行的，并使用實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行構(gòu)建。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-THALWHT-間隔區(qū)-HNORF(SEQID20)，其作用為轉(zhuǎn)移進(jìn)入用于表達(dá)的表達(dá)載體，以產(chǎn)生具有在SEQID21中闡述的序列的融合蛋白。融合蛋白的表達(dá)按照實(shí)施例4中的描述進(jìn)行。圖1表示了在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白，如通過(guò)SDS-PAGE所分析。在本實(shí)施例(SEQIDs19、20和21)中給出的THALWHT肽序列，能用采用噬菌體展示技術(shù)所發(fā)現(xiàn)的其它肽序列進(jìn)行替換。例如，LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)禾卩LEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)(Wu"/，2003);CDSAFVTVDWGRSMSLC(FloreaWa/.,2003);SERS畫F、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP、LQHKSMP(WriterWo/"2004);FSLSKPP、HSMQLST和STQAMFQ肽(Rahimwo/.，2003)。實(shí)施例7-LC/C-環(huán)狀THALWHT-HN/C融合蛋白的制備可以使用在實(shí)施例2中描述的方法設(shè)計(jì)LC-HN連接子，但是其中使用排列為^,"HI-S"/I-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-環(huán)THALWHT-M7eI-間隔區(qū)-5^1-^1-^^1-終止密碼子-///"(1111(SEQID22)的血清型C連接子。LC/C-環(huán)狀THALWHT-HN/C融合然后被組裝，是通過(guò)使用實(shí)施例1中描述的方法制備的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)進(jìn)行的，并使用實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行構(gòu)建。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-環(huán)狀THALWHT-間隔區(qū)-HNORF(SEQID23),其作用為轉(zhuǎn)移進(jìn)入用于表達(dá)的表達(dá)載體，以產(chǎn)生具有在SEQID24中闡述的序列的融合蛋白。融合蛋白的表達(dá)按照實(shí)施例4中的描述進(jìn)行。圖1表示了SDS-PAGE分析的在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白。在本實(shí)施例(SEQIDs19、20和21)中給出的THALWHT肽序列能用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)的其它肽序列進(jìn)行替換。例如，LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)禾卩LEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)(Wu"o/"2003);CDSAFVTVDWGRSMSLC(Florea"a/"2003);SERS畫F、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP、LQHKSMP(Writere,a/"2004);FSLSKPP、HSMQLST和STQAMFQ肽(Rahim"fl/"2003).實(shí)施例8——LC/C-ANP-HN/C融合蛋白的制備LC-Hw連接子可以使用在實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，但是其中使用排列為5"/"1"11-&/1-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-ANP-MzeI-間隔區(qū)-5^I-尸Wl-ZZwI-終止密碼子-///"犯1(SEQID25)的血清型C連接子。LC/C-ANP-HN/C融合然后被組裝，是通過(guò)使用實(shí)施例1中描述的方法制備的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)進(jìn)行，并使用實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行構(gòu)建。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-ANP-間隔區(qū)-HNORF(SEQID26)，其作用為轉(zhuǎn)移進(jìn)入用于表達(dá)的表達(dá)載體，以產(chǎn)生具有在SEQID27中闡述的序列的融合蛋白。實(shí)施例9——LC/C-VIP-HN/C融合蛋白的制備LC-Hw連接子可以用在實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，但是其中使用排列為^wHI-5WI-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-VIP-A^I-間隔區(qū)-^el-尸wn"I-終止密碼子-///"犯1(8￡01028)的血清型(連接子。LC/C-VIP-HN/C融合然后被組裝，是通過(guò)使用實(shí)施例1中描述的方法制備的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)進(jìn)行的，并使用實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行構(gòu)建。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-VIP-向隔區(qū)-HnORF(SEQID29),其作用為轉(zhuǎn)移進(jìn)入用于表達(dá)的表達(dá)載體，以產(chǎn)生具有在SEQID30中闡述的序列的融合蛋白。在SEQID28中給出的VIP序列可被VIP類似物或激動(dòng)劑序列所代替。例如[R15'2°'21，LI7]-VIP或[R15'2Q'21，L17]-VIP-GRR(Kashim。toetal.,1996;Onoueetal.,2004);[A2'8'9'16>19'24]-VIP或[A2'8'9'16'19'24'25]-VIP(Igamshietal.,2005).實(shí)施例10——LC/C-胃泌激素釋放肽-HN/C融合蛋白的制備LC-HN連接子能使用在實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，但是其中使用排列為5,HI-5WI-連接子-蛋白酶位點(diǎn)-胃泌激素釋放肽-A^el-間隔區(qū)-5/^1-/^/1-1"1-終止密碼子-//,>1111(SEQID34)的血清型C連接子。LC/C-胃泌激素釋放肽-HN/C融合然后被組裝，是通過(guò)使用實(shí)施例1中描述的方法制備的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)進(jìn)行的，并使用實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行構(gòu)建。最終的構(gòu)建物包含LC-連接子-胃泌激素釋放肽-間隔區(qū)-HNORF(SEQID35)，其作用為轉(zhuǎn)移進(jìn)入用于表達(dá)的表達(dá)載體，以產(chǎn)生具有在SEQID36中闡述的序列的融合蛋白。實(shí)施例11——LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的功能性的評(píng)定LC/C-RGD-HN/C融合蛋白(依照實(shí)施例4制備)的TM成分的功能性，通過(guò)配體結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)定。為了使配體結(jié)合的評(píng)定容易進(jìn)行，RGD結(jié)合肽以生物素化的和非生物素化的形式合成。通過(guò)使用非生物素化形式的競(jìng)爭(zhēng)分析方法(competitionassay),測(cè)定融合蛋白的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，NCL-H292細(xì)胞被鋪入96孔平板，建立存活的培養(yǎng)物。細(xì)胞和溶液被預(yù)冷至4'C，該溶液使用細(xì)胞飼養(yǎng)培養(yǎng)基加HEPES(50mM)制備。在處理之前，將培養(yǎng)基和細(xì)胞分離，并用培養(yǎng)基加HEPES(500pl每孔)替換，然后其也被除去。標(biāo)記的配體以兩倍于所需的濃度，被加入到所有的孔中(每孔50)il)。融合蛋白以兩倍于所需的濃度，被加入到孔中(每孔5(^1)。4'C中培養(yǎng)1小時(shí)后，培養(yǎng)基被除去，并替換為培養(yǎng)基加HEPES(每孔100W)。該培養(yǎng)基被除去，并替換為培養(yǎng)基加HEPES(每孔10(V1)。細(xì)胞用每孔100^1的0.1%的PBS-Tween，在4'C條件下裂解5分鐘。除去PBS-Tween，細(xì)胞用培養(yǎng)基加HEPES(每孔100W)洗滌。除去該培養(yǎng)基，并替換為每孔100nlPBS和100|xl鏈霉抗生物素-HPR。細(xì)胞在RTP下溫育20分鐘。除去PBS和鏈霉抗生物素，并用PBS-Tween洗滌細(xì)胞。每孔加入lOOplTMB，細(xì)胞在37'C條件下溫育10分鐘。每孔加入50^12MH2S04并在450nM下讀板。用這種方法，確認(rèn)LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的TM成分結(jié)合到細(xì)胞表面的能力。附圖描述圖l——LC/C-RGD-HN/C、LC/C-壞狀RGD-Hn/C、LC/C-THALWHT-Hn/C和LC/C-環(huán)狀THALWHT-HN/C融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)使用在實(shí)施例4中概述的方法，LC/C-RGD-HN/C、LC/C-環(huán)狀RGD-HN/C、LC/C-THALWHT-HN/C和LC/C-環(huán)狀THALWHT-HN/C融合蛋白在大腸桿菌BL21細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。簡(jiǎn)言之，用10ml起始培養(yǎng)物，接種lL含0/。葡萄糖和lOOpg/ml氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37'C下生長(zhǎng)，直到OD600nm達(dá)到大約0.5;在該時(shí)間點(diǎn)，溫度被降低到16°C。在用lmMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物1小時(shí)后，使培養(yǎng)物進(jìn)一步生長(zhǎng)16小時(shí)。電泳泳道l，LC/C-THALWHT-HN/C;電泳泳道2，LC/C-RGD-HN/C;電泳泳道3，LC/C-環(huán)狀THALWHT-HN/C;電泳泳道4，LC/C-環(huán)狀RGD-HN/C。圖2-LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的純化使用在實(shí)施例5中概述的方法，從大腸桿菌BL21細(xì)胞中純化LC/C-RGD-HN/C融合蛋白。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞破裂后得到的可溶性產(chǎn)物，被施加到鎳填充的親和捕獲柱。用lOOmM的咪唑洗脫結(jié)合的蛋白，用因子X(jué)a處理以活化融合蛋白，并且除去麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-bindingprotein(MBP))標(biāo)簽，然后再施加到第二根鎳填充的親和捕獲柱。從純化過(guò)程得到的樣品用SDS-PAGE進(jìn)行評(píng)定。最終的純化材料，在存在和不存在還原劑的情況下，進(jìn)行鑒別，分別在標(biāo)記[-]和[+]的電泳泳道中。參考文獻(xiàn)FloreaWa/"(2003)J.DrugTargeting11:383-390JostWo/.，(2001)FEBSlett.489:263-269Lee""/，(2001)Eur.J.Biochem.268:2004-2012Mathias"a/.，(1994)乂Wra/.68:6811-6814Rahim"a/,,(2003)Biotechniques35:317-324Roi濯inena/.,(1991)■/Wra/.65:4735-4740Ruoslahti(1996)^4朋.Tev.Ce〃"ev.別o/.12:697-715Schneidera/"(1999)FEBSlett.458:329-332Writer"a/"(2004)J.DrugTargeting12:185-193Wue,"/"(2003)GeneTher.10:1429-143權(quán)利要求1.一種單鏈、多肽融合蛋白，其包括a.非細(xì)胞毒性蛋白酶或其片段，該蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶細(xì)胞的胞吐融合器的蛋白；b.尋靶部分，其能結(jié)合到所述靶細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)能經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用而被導(dǎo)入到所述靶細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體中；c.蛋白酶切割位點(diǎn)，在該位點(diǎn)所述融合蛋白可以被蛋白酶切割，其中所述蛋白酶切割位點(diǎn)位于所述非細(xì)胞毒性蛋白酶或其片段與所述尋靶部分之間；以及d.轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，其能轉(zhuǎn)運(yùn)所述蛋白酶或蛋白酶片段從內(nèi)體內(nèi)部穿過(guò)所述內(nèi)體膜，進(jìn)入所述靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其中所述尋靶部分和所述蛋白酶切割位點(diǎn)被至多IO個(gè)氨基酸殘基分開(kāi)，優(yōu)選地至多5個(gè)氨基酸殘基，以及更優(yōu)選地至多0個(gè)氨基酸殘基。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中所述尋靶部分位于所述蛋白酶切割位點(diǎn)和所述轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域之間。4.根據(jù)任意一項(xiàng)前述的權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述非細(xì)胞毒性蛋白酶是梭菌神經(jīng)毒素的L-鏈。5.根據(jù)任意一項(xiàng)前述的權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域是梭菌神經(jīng)毒素的HN結(jié)構(gòu)域。6.根據(jù)任意一項(xiàng)前述的權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述尋靶部分包含至多50個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選地至多40個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少30個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選地至多20個(gè)氨基酸殘基。7.根據(jù)任意一項(xiàng)前述的權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述尋靶部分是PAR配體，優(yōu)選地是配體PAR1。8.根據(jù)權(quán)利要求1到6中的任何一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述尋靶部分是結(jié)合PTH-1的配體，優(yōu)選地是配體PTH。9.根據(jù)任意一項(xiàng)前述的權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括純化標(biāo)簽。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含純化標(biāo)簽，其存在于所述融合蛋白的N-末端和/或C-末端。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含純化標(biāo)簽，其存在于所述融合蛋白的N-末端和/或C-末端。12.根據(jù)權(quán)利要求9到11中的任何一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述純化標(biāo)簽，通過(guò)肽間隔分子，結(jié)合到所述融合蛋白。13.根據(jù)任意一項(xiàng)前述的權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽間隔分子與所述的尋靶部分分開(kāi)。14.一種多肽融合蛋白，其包含SEQIDNOs:10、12、15、18、21、24、27、30和33中的任意一個(gè)。15.—種核酸序列，其編碼根據(jù)任意一項(xiàng)前述的權(quán)利要求所述的多肽融合蛋白。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸序列，其中所述核酸分子包括SEQIDNOs:l墨9、11、14、17、20、23、26、29和32中的任意一個(gè)。17.—種DNA載體，其包括啟動(dòng)子、根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的核酸序列，其中所述DNA序列位于所述啟動(dòng)子的下游，以及終止子，其位于所述DNA構(gòu)建物的下游。18.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述DNA序列的互補(bǔ)DNA鏈。19.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的單鏈多肽融合蛋白的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中，表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的核酸序列，或者表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求17所述的DNA載體。20.—種制備非細(xì)胞毒性劑的方法，其包括a.使根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的單鏈多肽融合蛋白與能切割所述蛋白酶切割位點(diǎn)的蛋白酶相接觸；b.切割所述的蛋白酶切割位點(diǎn)以及，因此形成雙鏈融合蛋白。21.—種非細(xì)胞毒性多肽，其可以通過(guò)權(quán)利要求20所述的方法獲得，其中所述多肽是雙鏈多肽，并且其中a.第一條鏈包含所述非細(xì)胞毒性蛋白酶或其片段，該蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶細(xì)胞的胞吐融合器的蛋白；b.第二條鏈包含TM和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，該轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域能轉(zhuǎn)運(yùn)所述蛋白酶或蛋白酶片段從內(nèi)體內(nèi)部穿過(guò)所述內(nèi)體膜，并進(jìn)入所述靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠；以及所述第一條鏈和第二條鏈被二硫鍵連接在一起。22.根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的融合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求21所述的多肽在制備用于治療、預(yù)防或改善以下醫(yī)療癥狀或疾病的藥物中的用途，所述醫(yī)療癥狀或疾病選自粘液分泌過(guò)多、哮喘、禾n/或慢性阻塞性肺病、包括MEN的內(nèi)分泌腺腫瘤形成、甲狀腺功能亢進(jìn)和其它依賴甲狀腺分泌過(guò)多的疾病；肢端肥大癥、血中催乳激素過(guò)多、庫(kù)欣病及其它依賴于腺垂體分泌過(guò)多的疾?。恍奂に剡^(guò)多癥、持續(xù)無(wú)排卵和其它與多囊卵巢綜合癥相關(guān)的疾病、過(guò)敏癥(季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎(枯草熱)、過(guò)敏性結(jié)膜炎、血管運(yùn)動(dòng)性鼻炎及食物過(guò)敏)、嗜曙紅細(xì)胞過(guò)多、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性狹窄性小腸結(jié)腸炎、痔、搔癢癥、血管球性腎炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脈管炎、心肌炎、牛皮癬、濕疹、慢性輻射誘導(dǎo)的纖維癥、肺瘢痕化和其它纖維變性的病癥、位于消化道內(nèi)，特別是位于結(jié)腸內(nèi)的粘液分泌細(xì)胞粘液分泌過(guò)多、治療重癥肌無(wú)力、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、器官移植、組織移植、休液移植、毒性彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺功能亢進(jìn)、自身免疫性糖尿病、溶血性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜、嗜中性白細(xì)胞減少癥、慢性自身免疫性肝炎、自身免疫性胃炎、惡性貧血、淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、青銅色皮膚病、干燥角膜結(jié)膜炎綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多肌炎、硬皮病、系統(tǒng)性硬化癥、尋常天皰瘡、大皰性類天皰瘡、心肌炎、風(fēng)濕性心炎、血管球性腎炎(古德帕斯徹型)、眼色素層炎、睪丸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、萎縮性胃炎、惡性貧血和1型糖尿病、心血管疾病和/或高血壓和例如骨硬化癥和骨質(zhì)酥松的骨胳疾病。23.—種治療、預(yù)防或改善患者醫(yī)療癥狀或疾病的方法，其包括給所述的患者服用治療上有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的融合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求21所述的多肽，其中所述醫(yī)療問(wèn)題或疾病選自粘液分泌過(guò)多、哮喘、和/或慢性阻塞性肺病、包括MEN的內(nèi)分泌腺腫瘤形成、甲狀腺功能亢進(jìn)和其它依賴甲狀腺分泌過(guò)多的疾??；肢端肥大癥、血中催乳激素過(guò)多、庫(kù)欣病及其它依賴于腺垂體分泌過(guò)多的疾??；雄激素過(guò)多癥、持續(xù)無(wú)排卵和其它與多囊卵巢綜合癥相關(guān)的疾病、過(guò)敏癥(季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎(枯草熱)、過(guò)敏性結(jié)膜炎、血管運(yùn)動(dòng)性鼻炎及食物過(guò)敏)、嗜曙紅細(xì)胞過(guò)多、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性狹窄性小腸結(jié)腸炎、痔、搔癢癥、血管球性腎炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脈管炎、心肌炎、牛皮癬、濕疹、慢性輻射誘導(dǎo)的纖維癥、肺瘢痕化和其它纖維變性的病癥、位于消化道內(nèi)，特別是位于結(jié)腸內(nèi)的粘液分泌細(xì)胞粘液分泌過(guò)多、治療重癥肌無(wú)力、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、器官移植、組織移植、體液移植、毒性彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺功能亢進(jìn)、自身免疫性糖尿病、溶血性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜、嗜中性白細(xì)胞減少癥、慢性自身免疫性肝炎、自身免疫性胃炎、惡性貧血、淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、青銅色皮膚病、干燥角膜結(jié)膜炎綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多肌炎、硬皮病、系統(tǒng)性硬化癥、尋常天皰瘡、大皰性類天皰瘡、心肌炎、風(fēng)濕性心炎、血管球性腎炎(古德帕斯徹型)、眼色素層炎、睪丸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、萎縮性胃炎、惡性貧血和1型糖尿病、心血管疾病和/或高血壓和例如骨硬化癥和骨質(zhì)酥松的骨胳疾病。全文摘要本發(fā)明提供了單鏈、多肽融合蛋白，其包含非細(xì)胞毒性蛋白酶或其片段，該蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶細(xì)胞的胞吐融合器的蛋白；尋靶部分，其能結(jié)合到靶細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)能經(jīng)歷內(nèi)吞作用而被導(dǎo)入到靶細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體中；蛋白酶切割位點(diǎn)，在該位點(diǎn)上融合蛋白可被蛋白酶切割，其中蛋白酶切割位點(diǎn)位于非細(xì)胞毒性蛋白酶或其片段與尋靶部分之間；以及轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，其能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶或蛋白酶片段從胞內(nèi)體內(nèi)部穿過(guò)胞內(nèi)體膜，并進(jìn)入靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠。文檔編號(hào)A61K38/00GK101098885SQ200580046021公開(kāi)日2008年1月2日申請(qǐng)日期2005年12月1日優(yōu)先權(quán)日2004年12月1日發(fā)明者J·查多克,K·福斯特,L·杜勒斯,P·斯坦孔貝,P·馬科斯申請(qǐng)人:健康保護(hù)機(jī)構(gòu)