專利名稱：含有山奈酚和槲皮素的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有山奈酚(kaempferol，也稱為莰非醇)和槲皮素(quercetin，也稱為五羥黃酮)中的任何一種以上的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物。

背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸是非硫酸化葡萄糖胺聚糖的一種，是葡糖醛酸與N-乙?；咸烟前窔埢磸?fù)連接成鏈狀的線狀的分子量為20萬(wàn)～40萬(wàn)的高分子物質(zhì)。有報(bào)道指出，透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)成成分，不僅與保持水分、保持細(xì)胞之間的間隔、細(xì)胞生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分的保存及擴(kuò)散有關(guān)，還與細(xì)胞的分裂與分化、移動(dòng)等有關(guān)。
有報(bào)道指出存在于哺乳類體內(nèi)的透明質(zhì)酸的50％以上分布在皮膚、特別是表皮細(xì)胞之間的間隔和真皮結(jié)締組織中，已知這種透明質(zhì)酸主要是通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞和纖維芽細(xì)胞而合成的。據(jù)報(bào)道人皮膚中的透明質(zhì)酸的量會(huì)隨著老化而減少，但認(rèn)為皮膚中的透明質(zhì)酸量的減少是伴隨老化的肌膚彈性降低和水分含量減少的直接原因之一(Fleischmajer R.etal.，Biochem Biophys Acta.，279、pp265-275，1972；Longas MO.et al.，Carbohydr Res.，159，pp127-136，1987；Ghersetich I.et al.，Int.J.Dermatol.，33，pp119-122，1994)。
另一方面，人體的關(guān)節(jié)囊由外側(cè)的纖維層和內(nèi)側(cè)的滑膜層構(gòu)成，由滑膜構(gòu)成的滑液含有透明質(zhì)酸和糖蛋白質(zhì)，這兩種成分起到潤(rùn)滑關(guān)節(jié)的作用。有報(bào)道指出，如果發(fā)生退行性關(guān)節(jié)炎，則起到關(guān)節(jié)內(nèi)潤(rùn)滑作用的透明質(zhì)酸的生成會(huì)減少，由蛋白酶導(dǎo)致的破壞會(huì)增加，關(guān)節(jié)內(nèi)的透明質(zhì)酸減少。即，隨著關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸的減少，由于無(wú)法在關(guān)節(jié)中吸收或分散外部沖擊，因此只能惡化關(guān)節(jié)的損傷。因而，1997年美國(guó)FDA確認(rèn)了將透明質(zhì)酸注入到關(guān)節(jié)內(nèi)以緩解關(guān)節(jié)炎的方法，直到現(xiàn)在這種方法還在實(shí)施，但終究還是增大體內(nèi)透明質(zhì)酸的合成的方法可以取得更好的效果。
有報(bào)道指出在皮膚細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下的透明質(zhì)酸的合成由于各種生長(zhǎng)因子、反式視黃酸(transretinoic acid)、N-甲基絲氨酸等而增加(HeldinP.et al.，Biochem.J.，258，pp919-922，1989；Heldin P.et al.，Biochem.J.，283，pp165-170，1992；Suzuki M.et al.，Biochem.J.，307，pp817-821，1995；Tirone E.et al.，J.Biol.Chem.，272，pp4787-4794，1997；Tammi R.et al.，J.Invest.Dermatol.，92，pp326-332，1989；Akiyama H.et al.，Biol.Pharm.Bull.，17，pp361-364，1994；Sakai S.et al.，Skin Pharmacol.Appl.SkinPhysiol.，12，pp276-283，1999)，還有報(bào)道指出涂抹在皮膚上的女性激素(雌二醇)及其類似物會(huì)增加透明質(zhì)酸的合成(Sobel H.et al.，Steroids，16，pp1-3，1970；Bentley JP.et al.，J.Invest.Dermatol.，87，pp668-673，1986；Miyazaki K.et al.，Skin Pharmacol.Appl.Skin Physiol.，15，pp175-183，2002)，但關(guān)于透明質(zhì)酸代謝的詳細(xì)機(jī)理目前還是未知的。僅了解透明質(zhì)酸的合成在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)表面上被透明質(zhì)酸合成酶促進(jìn)，在合成期間穿過(guò)細(xì)胞膜后蓄積在細(xì)胞外的基質(zhì)上(Weigel PH.et al.，J.Biol.Chem.，272，pp13997-14000，1997)。
哺乳動(dòng)物中透明質(zhì)酸合成酶的基因報(bào)道有序列上相似性高的透明質(zhì)酸合成酶1(HAS1)、透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)、以及透明質(zhì)酸合成酶3(HAS3)這3種形態(tài)。與此相關(guān)，有報(bào)道指出當(dāng)在表皮細(xì)胞培養(yǎng)液中添加表皮生長(zhǎng)因子(EGF)時(shí)，透明質(zhì)酸合成酶(HAS)的基因表達(dá)增大(Pienimaki JP.et al.，J.Biol.Chem.，276，pp20428-20435，2001)。但是，實(shí)際情況是關(guān)于透明質(zhì)酸在細(xì)胞和組織中的分布、涉及透明質(zhì)酸的各種因子和酶、例如透明質(zhì)酸合成酶(HAS)或調(diào)控透明質(zhì)酸活性的因子的研究還非常地不充分。
因此，著眼于透明質(zhì)酸的上述適用可能性，正在火熱進(jìn)行可以高效地生產(chǎn)和注入透明質(zhì)酸、或可以使體內(nèi)透明質(zhì)酸的合成增加的方法的相關(guān)研究，但實(shí)際情況是還沒(méi)有特別有價(jià)值的研究結(jié)果。
另一方面，已知作為黃酮類的黃酮醇的一種的以下式I所示的山奈酚和以下式II所示的槲皮素是普通的食用多酚化合物，它們大量地存在于食用植物中，對(duì)健康起著重要的作用。一般來(lái)說(shuō)，具有這種二苯基丙烷骨架的黃酮類還具有抗癌、抗氧化及抗炎、抗過(guò)敏的功能。
化學(xué)式I

化學(xué)式II



發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人等對(duì)于能夠更加有效地將透明質(zhì)酸供給至體內(nèi)的方法進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已知具有抗癌效果、抗氧化效果及抗炎、抗過(guò)敏效果等的作為黃酮類的山奈酚和槲皮素不僅具有上述公知的功能，還可以增大對(duì)人細(xì)胞內(nèi)的透明質(zhì)酸合成酶進(jìn)行編碼的基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)揮促進(jìn)體內(nèi)透明質(zhì)酸生成的效果。
即，如果將山奈酚和槲皮素對(duì)人表皮的皮膚細(xì)胞株進(jìn)行處理，則促進(jìn)利用細(xì)胞的透明質(zhì)酸的生成，體內(nèi)的透明質(zhì)酸的量增加，因此可以用作利用透明質(zhì)酸有用性的各種用途、例如增加皮膚彈性、防止皮膚干燥或防止皮膚老化之類的皮膚改善用途，或者治療或預(yù)防退行性關(guān)節(jié)炎之類的藥物用途，進(jìn)而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的在于提供含有山奈酚和槲皮素作為有效成分的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供山奈酚和槲皮素在利用上述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物的透明質(zhì)酸合成酶的功能的各種用途、例如增加皮膚彈性、防止皮膚干燥或防止皮膚老化之類的皮膚改善用途，或者治療或預(yù)防退行性關(guān)節(jié)炎等用途中的利用可能性。
本發(fā)明提供含有山奈酚和槲皮素中的任何一種以上的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物。
上述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物的特征在于，使透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的表達(dá)增大，并促進(jìn)透明質(zhì)酸生成。
另外，上述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物的特征在于，其為用于增加皮膚彈性的化妝品組合物。
另外，上述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物的特征在于，其為用于防止皮膚干燥的化妝品組合物。
另外，上述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物的特征在于，其為用于防止皮膚老化的化妝品組合物。
另外，上述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物的特征在于，其為用于治療或預(yù)防退行性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物。
本發(fā)明的上述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物優(yōu)選以相對(duì)于該組合物的總重量為0.001～99.9重量％的濃度含有山奈酚和槲皮素中的任何一種以上。這是由于，若上述成分為小于0.001重量％的濃度，則難以獲得其效果，若為超過(guò)99.9重量％的濃度，則在劑型穩(wěn)定性方面有可能產(chǎn)生問(wèn)題，而且由于存在雜質(zhì)，不可能超過(guò)99.9重量％。
作為黃酮類的山奈酚和槲皮素由于具有增大存在于人表皮的皮膚細(xì)胞株中的透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的表達(dá)、促進(jìn)人細(xì)胞的透明質(zhì)酸生成的功能，因此本發(fā)明的含有山奈酚和槲皮素中任何一種以上的組合物為透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，可以用作用于增加皮膚彈性、防止皮膚干燥或防止皮膚老化的化妝品組合物、或者用于治療或預(yù)防退行性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物。



圖1和圖2是為了以mRNA水平嘗試確認(rèn)山奈酚和槲皮素導(dǎo)致的透明質(zhì)酸合成酶的表達(dá)，在人表皮的皮膚細(xì)胞株、即角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞中分別用各個(gè)濃度處理山奈酚和槲皮素后，將透明質(zhì)酸合成酶(HAS)的基因進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR所得到的結(jié)果，圖1為山奈酚導(dǎo)致的結(jié)果圖，圖2為槲皮素導(dǎo)致的結(jié)果圖。
圖3是為了研究山奈酚和槲皮素對(duì)透明質(zhì)酸的生成促進(jìn)，將山奈酚和槲皮素分別以0.1μM、1μM、10μM的濃度對(duì)人表皮的皮膚細(xì)胞株、即角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞進(jìn)行處理后，利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)確認(rèn)透明質(zhì)酸生成的增加，并將其結(jié)果定量化所得到的圖。
圖4是為了研究山奈酚和槲皮素的細(xì)胞毒性，將山奈酚和槲皮素分別以0.1μM、1μM、10μM的濃度對(duì)人表皮的皮膚細(xì)胞株、即角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞進(jìn)行處理后，利用MTT{3，(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑}分析，研究該濃度下對(duì)細(xì)胞毒性產(chǎn)生的影響，并將其結(jié)果定量化所得到的圖。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明中，為了研究作為黃酮類的山奈酚和槲皮素的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)效果，將山奈酚和槲皮素分別對(duì)人表皮的皮膚細(xì)胞株、即角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，確認(rèn)了透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的表達(dá)增大且透明質(zhì)酸生成增加。即，確認(rèn)了經(jīng)過(guò)24小時(shí)山奈酚和槲皮素處理的人表皮的皮膚細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞與未經(jīng)山奈酚和槲皮素處理的細(xì)胞相比，透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)增大。換而言之，山奈酚和槲皮素具有促進(jìn)人表皮的皮膚細(xì)胞內(nèi)的透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)的效果。而且確認(rèn)了人表皮的皮膚細(xì)胞株中的透明質(zhì)酸的量由于山奈酚和槲皮素的處理而增加。
因此，具有增大透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)、并促進(jìn)透明質(zhì)酸生成的功能的山奈酚和槲皮素可以作為利用透明質(zhì)酸有用性的各種皮膚外用劑的有效成分使用。例如，可以添加到增加皮膚彈性、防止皮膚干燥或防止皮膚老化之類的化妝品組合物中。
另外，還可以添加到用于通過(guò)投與透明質(zhì)酸來(lái)治療或預(yù)防疾病、例如退行性關(guān)節(jié)炎之類的疾病的藥物組合物中。但是，并不局限于此。
含有本發(fā)明的山奈酚和槲皮素中的任何一種以上的化妝品組合物除了上述成分之外，還可以在不損害本發(fā)明目的的主要效果的范圍內(nèi)、優(yōu)選含有可以對(duì)主要效果賦予協(xié)同效果的其它成分等。
另外，上述化妝品組合物還可以具有溶液、乳液、粘性混合物等形狀。
本發(fā)明的化妝品組合物的劑型沒(méi)有特別限定，例如可以是乳液、化妝水、面霜、洗液、精華、面膜、凝膠之類的皮膚粘附型化妝品，具有粉、唇膏、底妝、粉底之類劑型的化妝品，可以具有洗發(fā)水、沖洗劑、沐浴露、美容液、潔面泡沫、潔面霜、潔面水、香皂之類洗滌化妝品的劑型。
對(duì)于各劑型的化妝品組合物，上述山奈酚和槲皮素中的任何一種以上以外的成分可以根據(jù)其它化妝品的劑型或使用目的，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就不會(huì)特別困難地適當(dāng)選擇后進(jìn)行混合。
另外，本發(fā)明的化妝品組合物還可以含有選自水溶性維生素、油溶性維生素、高分子肽、高分子多糖、神經(jīng)鞘脂質(zhì)和海藻提取物中的組合物。
本發(fā)明的化妝品組合物中還可以根據(jù)需要與上述必須成分一起混合通常在化妝品中混合的其它成分。
作為還可以另外添加的混合成分，可以列舉出油脂成分、保濕劑、潤(rùn)膚劑、表面活性劑、有機(jī)和無(wú)機(jī)顏料、有機(jī)粉體、紫外線吸收劑、防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑、植物提取物、pH調(diào)整劑、醇、色素、香料、血液循環(huán)促進(jìn)劑、冷感劑、制汗劑、精制水等。
另外，還可以另外添加的混合成分并不局限于這些，而且，上述任何成分可以在不損害本發(fā)明目的和效果的范圍內(nèi)混合，但相對(duì)于總重量?jī)?yōu)選混合0.01～5重量％、更優(yōu)選混合0.01～3重量％。
含有本發(fā)明的山奈酚和槲皮素中的任何1種以上的藥物組合物還可以進(jìn)一步含有在藥物組合物的制造中通常使用的適當(dāng)載體、賦形劑和稀釋劑。
本發(fā)明的山奈酚和槲皮素中的任何1種以上的藥學(xué)給藥形態(tài)可以以它們的藥學(xué)可容許的鹽的形態(tài)使用，也可以單獨(dú)使用，或以與其他藥學(xué)活性化合物的結(jié)合或適當(dāng)集合的形式使用。
含有本發(fā)明的山奈酚和槲皮素中的任何1種以上的藥物組合物可以分別通過(guò)通常的方法以包括散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、氣霧劑之類的口服劑型，洗劑、軟膏、凝膠、霜、貼劑(patch)、噴霧劑之類的經(jīng)皮給藥劑型的相應(yīng)于藥劑學(xué)制劑的任何形態(tài)制成劑型后使用。
本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選給藥量雖然根據(jù)對(duì)象者的年齡、性別、體重、癥狀、疾病程度、藥物形態(tài)、給藥途徑和期間而不同，但只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員即可適當(dāng)選擇。但是，為了得到所需效果，優(yōu)選以0.01～1000mg/天的量投與本發(fā)明的藥物組合物。給藥可以是每天1次，也可以每天分為數(shù)次。另外，其給藥量可以根據(jù)年齡、性別、體重、疾病的程度、給藥途徑等增減。因此，上述給藥量無(wú)論從哪個(gè)方面出發(fā)均非限定本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的山奈酚和槲皮素中的任何1種以上可以由非口服、口服等各種途徑對(duì)大白鼠、小鼠、家畜、人等哺乳動(dòng)物給藥，給藥的所有方式是可以預(yù)想的方式，例如可以通過(guò)口服、直腸或靜脈、肌肉、皮下、子宮內(nèi)硬膜或腦血管內(nèi)注射來(lái)給藥。
實(shí)施例 以下通過(guò)試驗(yàn)例更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅局限于這些試驗(yàn)例。
<試驗(yàn)例1>人表皮的皮膚細(xì)胞株HaCaT中的透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因表達(dá)增大效果 為了研究山奈酚和槲皮素對(duì)人表皮的皮膚細(xì)胞株HaCaT中的透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因表達(dá)增大的效果，將山奈酚和槲皮素分別以各種濃度對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行處理后，為了以mRNA水平確認(rèn)透明質(zhì)酸合成酶的基因表達(dá)，對(duì)透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，如下調(diào)查了山奈酚和槲皮素導(dǎo)致的透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的變化。
1-1.細(xì)胞培養(yǎng) 使用自然產(chǎn)生的永生化的人角化細(xì)胞細(xì)胞株HaCaT，上述細(xì)胞株從Fusenig博士(Dr.N.E.Fusenig，Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)，Heidelberg，Germany)獲得。首先，在含有10％胎牛血清(HyClone)、碳酸氫鈉3.6g/l和抗體(鏈霉素100μg和青霉素100IU/l)(Life Technologies，Inc.)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′smedia)中，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件(37℃、5％CO2、95％空氣)下培養(yǎng)上述細(xì)胞。細(xì)胞每3天更換1次新鮮的培養(yǎng)基，當(dāng)密度達(dá)到最大時(shí)，以1∶5的分割比進(jìn)行傳代培養(yǎng)(secondary cultured)。在處理山奈酚或槲皮素的72小時(shí)前，在每75cm2組織培養(yǎng)瓶中分注1×105個(gè)細(xì)胞，在含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。之后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，分別以0.1μM、1μM、10μM的濃度處理山奈酚和槲皮素，培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)照組是在以1∶1000稀釋并補(bǔ)充有介質(zhì)(二甲基亞砜，DMSO)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在這種對(duì)照組的培養(yǎng)中，未觀察到DMSO對(duì)成長(zhǎng)和分化有任何影響。
1-2.RNA制造 在上述試驗(yàn)例1-1中培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞用磷酸緩沖溶液(LifeTechnologies，Inc.)洗滌2次，所有細(xì)胞的RNA根據(jù)制造商的指示使用Trizol試劑(GibcoBRL Life Technologies，Grand Island，NY)進(jìn)行分離。RNA濃度使用光度測(cè)定法測(cè)定，RNA質(zhì)利用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。
1-3.通過(guò)PCR測(cè)定對(duì)透明質(zhì)酸合成酶的mRNA合成的影響 通過(guò)定量的逆轉(zhuǎn)錄PCR如下所述地測(cè)定了山奈酚和槲皮素對(duì)作為3種透明質(zhì)酸合成酶的亞型同工酶(isoform)的透明質(zhì)酸合成酶1(以下稱為HAS1)、透明質(zhì)酸合成酶2(以下稱為HAS2)、和透明質(zhì)酸合成酶3(以下稱為HAS3)的mRNA合成的影響。
首先，將通過(guò)上述試驗(yàn)例1-2制造的經(jīng)過(guò)定量的RNA逆轉(zhuǎn)錄，接著，在3種透明質(zhì)酸合成酶的亞型同工酶的HAS1、HAS2、HAS3的特異性引物的存在下分別實(shí)施定量的PCR。更詳細(xì)地說(shuō)，將4μg的RNA在含有1μL的M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶(20U/μl、MBI Fermentas)、1μL的RNAse抑制劑(20U/μl)L、4μL的5×反應(yīng)緩沖溶液、2μL的10mM dNTPmix、1μL的oligo(dT)引物(0.5μg/μL)的反應(yīng)混合物2μl中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(MBIFermentas的第一鏈cDNA合成試劑盒、#K1612，按照生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行)。首先，將RNA、oligo(dT)引物及DEPC-H2O混合，達(dá)到總量為11μL，使其在70℃下反應(yīng)5分鐘后放入冰中。之后加入5×反應(yīng)緩沖溶液、RNAse抑制劑、Dntp，在37℃下反應(yīng)5分鐘后，加入M-MuLV，再在37℃下反應(yīng)60分鐘以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。之后，在70℃下加熱10分鐘以除去逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。接著，取出3μl的上述反應(yīng)混合物，供于PCR反應(yīng)。各PCR是在20μl的含有TaKaRa Ex Tag DNA聚合酶(5U/μl、TaKaRa)、10×EX Tag緩沖溶液、MgCl2、dNTP混合物和25pM的適當(dāng)正義或反義PCR引物(參照下述表1)的反應(yīng)混合物中使用Perkin-Elmer Cycler 9600(Perkin-ElmerApplied Biosystems、Foster、CA)實(shí)施的。
表1 另一方面，PCR反應(yīng)條件如下所示。在94℃下經(jīng)過(guò)5分鐘1次的改性循環(huán)后，反復(fù)30次在94℃下1分鐘、55℃下1分鐘和72℃下1分鐘30秒的循環(huán)。將PCR結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠(ethidiumbromide)染色后觀察，結(jié)果示于圖1和圖2中。此時(shí)，將擴(kuò)增GAPDH的結(jié)果作為用于標(biāo)準(zhǔn)化的基準(zhǔn)。
結(jié)果如圖1和圖2所示，在為透明質(zhì)酸合成酶基因中亞型同工酶2基因(HAS2)時(shí)，在對(duì)照組和山奈酚或槲皮素處理組均有表達(dá)。當(dāng)為亞型同工酶3基因(HAS3)時(shí)，雖然對(duì)照組中檢測(cè)出少量，但在經(jīng)過(guò)了1μM和10μM濃度的山奈酚或槲皮素處理的HaCaT細(xì)胞中，與對(duì)照組相比多少有些增加。
<試驗(yàn)例2>人表皮的皮膚細(xì)胞株HaCaT培養(yǎng)培養(yǎng)基中透明質(zhì)酸的增加 為了研究通過(guò)山奈酚和槲皮素實(shí)際上是否會(huì)促進(jìn)透明質(zhì)酸的生成，對(duì)人表皮的皮膚細(xì)胞株HaCaT培養(yǎng)培養(yǎng)基處理各濃度的山奈酚和槲皮素后，使用HA-ELISA試劑盒確認(rèn)并定量透明質(zhì)酸合成被促進(jìn)后排出到培養(yǎng)基中的量。
更具體地說(shuō)，在使用上述試驗(yàn)例1-1的細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)人表皮的皮膚細(xì)胞株HaCaT后，為了研究通過(guò)山奈酚和槲皮素、合成被促進(jìn)后分泌到培養(yǎng)基中的透明質(zhì)酸的量，回收培養(yǎng)基實(shí)施ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)。為了實(shí)施ELISA，購(gòu)入Echelon公司的透明質(zhì)酸酶-結(jié)合免疫吸附劑分析試劑盒(HA-ELISA、產(chǎn)品號(hào)K-1200)。利用HA-ELISA試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的指示對(duì)通過(guò)上述細(xì)胞培養(yǎng)回收的培養(yǎng)基實(shí)施，并對(duì)通過(guò)山奈酚和槲皮素在HaCaT細(xì)胞中合成后排出到培養(yǎng)基中的透明質(zhì)酸的合成量進(jìn)行定量。對(duì)照組在1∶1000稀釋并補(bǔ)充有介質(zhì)(二甲基亞砜、DMSO)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在這種對(duì)照組的培養(yǎng)中，未觀察到DMSO對(duì)成長(zhǎng)和分化有任何影響。其結(jié)果示于圖3中。
結(jié)果如圖3所示可知，為山奈酚時(shí)，在1μM和10μM下，與對(duì)照組相比，分別以95％的可靠性增大了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的7％和8％的合成能。當(dāng)為槲皮素時(shí)，在1μM和10μM下，與對(duì)照組相比，分別以95％的可靠性增大了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的11％和24％的合成能。
<試驗(yàn)例3>確認(rèn)人表皮的皮膚細(xì)胞株HaCaT中山奈酚和槲皮素的各濃度的細(xì)胞毒性 為了研究人表皮的皮膚細(xì)胞株HaCaT中山奈酚和槲皮素的各濃度的細(xì)胞毒性，用各濃度山奈酚和槲皮素對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行處理后，利用MTT分析定量細(xì)胞毒性程度來(lái)進(jìn)行確認(rèn)。
3-1.細(xì)胞培養(yǎng) 使用自然產(chǎn)生的永生化的人角化細(xì)胞細(xì)胞株HaCaT，上述細(xì)胞株由Fusenig博士(Dr.N.E.Fusenig，Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)，Heidelberg，Germany)獲得。首先，在含有10％胎牛血清(HyClone)、碳酸氫鈉3.6g/l和抗體(鏈霉素100μg和青霉素100IU/l)(Life Technologies，Inc.)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′smedia)中，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件(37℃、5％CO2、95％空氣)下培養(yǎng)上述細(xì)胞。細(xì)胞每3天更換1次新鮮的培養(yǎng)基，當(dāng)密度達(dá)到最大時(shí)則以1∶5的分割比進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在處理山奈酚或槲皮素的72小時(shí)前，在組織培養(yǎng)瓶96孔板的每個(gè)孔中分注1×104個(gè)細(xì)胞，在含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。之后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，分別以0.1μM、1μM、10μM的濃度處理山奈酚和槲皮素，培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)照組在以1∶1000稀釋并補(bǔ)充有介質(zhì)(二甲基亞砜、DMSO)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
3-2.MTT分析 用磷酸緩沖溶液洗滌在上述試驗(yàn)例3-1中培養(yǎng)的細(xì)胞，根據(jù)生產(chǎn)商的指示實(shí)施MTT(3，(4，5-二甲基-2-噻唑)2，5二苯基溴化四氮唑、Sigma)分析，其結(jié)果示于圖4中。
結(jié)果如圖4所示，由對(duì)照組的培養(yǎng)中未觀察到DMSO對(duì)成長(zhǎng)和分化有任何影響。在為山奈酚和槲皮素的情況下，在作為與對(duì)照組相比以95％的可靠性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的透明質(zhì)酸合成評(píng)價(jià)濃度的0.1μM、1μM和10μM下也均無(wú)細(xì)胞毒性。
<參考例1>統(tǒng)計(jì)分析 在上述試驗(yàn)例1～3的數(shù)據(jù)分析中使用的對(duì)應(yīng)標(biāo)本t檢驗(yàn)是使用SigmaStat(SPSS，Inc.，Chicago，IL)實(shí)施的。顯著性以p＝0.05基準(zhǔn)來(lái)考慮，數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
由上述結(jié)果可知，當(dāng)將山奈酚和槲皮素對(duì)人表皮的皮膚細(xì)胞株進(jìn)行處理時(shí)，透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)增大，結(jié)果可以確認(rèn)透明質(zhì)酸的生成有所促進(jìn)。
以下說(shuō)明上述組合物的制劑例，但本發(fā)明并不局限于此，僅是用于進(jìn)行具體說(shuō)明而舉例。
制劑例1.調(diào)制香皂 山奈酚1.00(％) 油脂 適量 氫氧化鈉 適量 氯化鈉適量 香料 少量 通過(guò)添加精制水使總量達(dá)到100，以上述配合比調(diào)制香皂。
制劑例2.調(diào)制洗劑 槲皮素 3.00(％) L-抗壞血酸-2-磷酸鎂鹽1.00 水溶性膠原(1％水溶液)1.00 檸檬酸鈉 0.10 檸檬酸 0.05 甘草提取物 0.20 1，3-丁二醇 3.00 添加精制水使總量達(dá)到100，以上述配合比(％)調(diào)制洗劑。
制劑例3.調(diào)制面霜 山奈酚和槲皮素 1.00(％) 聚乙二醇單硬脂酸酯 2.00 自乳化型單硬脂酸甘油酯 5.00 鯨蠟醇 4.00 角鯊烯 6.00 三-(2-乙基己酸)甘油酯6.00 神經(jīng)鞘糖脂質(zhì) 1.00 1，3-丁二醇 7.00 添加精制水使總量達(dá)到100，以上述配合比(％)調(diào)制面霜。
制劑例4.調(diào)制面膜 山奈酚 2.00(％) 聚乙烯醇 13.00 L-抗壞血酸-2-磷酸鎂鹽1.00 月桂?；u基脯氨酸 1.00 水溶性膠原(1％水溶液)2.00 1，3-丁二醇 3.00 乙醇 5.00 添加精制水使總量達(dá)到100，以上述配合比(％)調(diào)制面膜。
制劑例5.調(diào)制美容液 槲皮素 2.00(％) 羥乙基纖維素(2％水溶液) 12.00 黃原膠(2％水溶液)2.00 1，3-丁二醇 6.00 濃甘油 4.00 透明質(zhì)酸鈉(1％水溶液)5.00 添加精制水使總量達(dá)到100，以上述配合比(％)調(diào)制美容液。
制劑例6.調(diào)制散劑 山奈酚 100mg 乳糖 100mg 滑石 10mg 混合上述成分，填充到氣密袋中調(diào)制散劑。
制劑例7.調(diào)制片劑 槲皮素 50mg 玉米淀粉 100mg 乳糖 100mg 硬脂酸鎂 2mg 混合上述成分后，根據(jù)通常的片劑調(diào)制方法壓片，調(diào)制片劑。
制劑例8.調(diào)制膠囊劑 山奈酚和槲皮素 50mg 玉米淀粉100mg 乳糖100mg 硬脂酸鎂2mg 根據(jù)通常的膠囊劑調(diào)制方法混合上述成分，填充到明膠膠囊中調(diào)制膠囊劑。
制劑例9.調(diào)制注射劑 山奈酚和槲皮素50mg 注射用滅菌蒸餾水 適量 pH調(diào)節(jié)劑 適量 根據(jù)通常的注射劑調(diào)制方法按照在每安瓿(2ml)中以上述成分含量進(jìn)行調(diào)制。
制劑例10.調(diào)制液體制劑 槲皮素100mg 異構(gòu)糖10g 甘露醇5g 精制水適量 根據(jù)通常的液體制劑的調(diào)制方法在精制水中添加各個(gè)成分并使其溶解，添加適量的檸檬香料后混合上述成分。之后，添加精制水調(diào)節(jié)至總量100ml，然后填充到褐色瓶中滅菌，調(diào)制液體制劑。
作為黃酮類的山奈酚和槲皮素由于具有增大存在于人表皮的皮膚細(xì)胞株中的透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的表達(dá)、并促進(jìn)人細(xì)胞中透明質(zhì)酸的生成的功能，因此本發(fā)明的含有山奈酚和槲皮素中的任何1種以上的組合物是透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，可以用作用于增加皮膚彈性、防止皮膚干燥或防止皮膚老化的化妝品組合物、或者用于治療或預(yù)防退行性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物。
權(quán)利要求
1.一種透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，其含有山奈酚和槲皮素中的任何1種以上。
2.權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，其特征在于，所述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物使透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的表達(dá)增大，并促進(jìn)透明質(zhì)酸生成。
3.權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，其特征在于，所述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物為用于增加皮膚彈性的化妝品組合物。
4.權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，其特征在于，所述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物為用于防止皮膚干燥的化妝品組合物。
5.權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，其特征在于，所述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物為用于防止皮膚老化的化妝品組合物。
6.權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，其特征在于，所述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物為用于治療或預(yù)防退行性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物。
7.權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，其特征在于，所述透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物以相對(duì)于該組合物的總重量為0.001～99.9重量％的量含有山奈酚和槲皮素中的任何1種以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有山奈酚和槲皮素中的任何1種以上的透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物。本發(fā)明的山奈酚或槲皮素由于具有增大存在于人表皮的皮膚細(xì)胞株中的透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的表達(dá)、并促進(jìn)人細(xì)胞中透明質(zhì)酸的生成的功能，因此本發(fā)明的含有山奈酚和槲皮素中的任何1種以上的組合物是透明質(zhì)酸生成促進(jìn)用組合物，可以用作用于增加皮膚彈性、防止皮膚干燥或防止皮膚老化的化妝品組合物、或者用于治療或預(yù)防退行性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P19/02GK101111244SQ200580047457
公開(kāi)日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2005年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者金昇壎, 姜炳永, 南凱元, 李海光, 文圣濬, 張利燮 申請(qǐng)人:株式會(huì)社太平洋