專利名稱：：緩釋納米顆粒組合物及其使用方法緩釋納米顆粒組合物及其使用方法
背景技術(shù)：
：再狹窄是一種復(fù)雜的過程，認(rèn)為其是由用于減輕動脈阻塞的介入(例如血管成形術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)或支架)繼發(fā)的血管壁損傷引起。導(dǎo)致再狹窄的機(jī)理包括彈性反沖、平滑肌細(xì)胞遷移和增殖、細(xì)胞外基質(zhì)合成血管壁重塑增加和血栓形成(Haudenschild(1993)Am.J.Med.94:40S-44S;Lovqvist,等(1994)J.InterN.Med.233:215-226;Koster，等(1995)Angiology46:99-106;Wilcox(1991)Circulatio畫:432-435;Wilcox(1993)Am.J.Cardiol.72:88E-95E;WilcoxandBlumenthal(1995)J.Nutr.125:631S-638S)。初期成功的動脈粥樣硬化斑塊血管成形術(shù)后的再狹窄仍然是人類中冠狀血管成形術(shù)的主要限制。預(yù)防再狹窄的治療方法集中在介入早期事件或者預(yù)防晚期事件，所述早期事件比如血小板沉積或血栓形成，所述晚期事件即平滑肌細(xì)胞增生和基質(zhì)形成。已經(jīng)在動物試驗(yàn)研究中使用了某些類型的治療劑。這些包括可以阻斷再狹窄發(fā)病中早期事件的抗凝劑、抗炎劑、抗血小板劑和可以抑制其中晚期事件的抗增殖劑(Herrman,等(l993)Drugs46:18-52;Marmur,等(1994)J.Am.Coll.Cardiol.24:1484-1491;Mathias(1991)SemiN.Thromb.Hemostat17:14-20)。治療再狹窄的其它方法包括使用反義寡核苷酸阻斷某些細(xì)胞因子或原癌基因比如c-myc或c-myb的轉(zhuǎn)錄(Wilcox(1993)supra;Bennett,等(1994)J.CliN.Invest93:820-828;Epstein,等(1993)CirculatioN88:1351-1353;Edelman,等(1995)Circ.Res.76:176-182)。也已經(jīng)研究了基因治療策略(Wilcox(1993)supra;Muller(1994)Br.HeartJ.72:309-312;Nabel，等(1990)Science249:1285-1288;Nabel(1995)Cardiovasc.Res,28:445-455;Bennett,等(1994)supra;Epstein,等(1993)supra;Edelman,等(1995)supra;FeldmaNandIsner(1995)J.Am.Coll.Cardiol.26:826-835)。在臨床情況中已經(jīng)使用了通過常規(guī)藥理學(xué)方法或機(jī)械方法(例如支架)來改善再狹窄進(jìn)程(Wilensky，等(1993)TrendsCardiovasc.Med.3:163-170)。藥物治療劑包括抗血小板劑和抗凝劑、釣離子通道拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、皮質(zhì)類固醇和魚油飲食(Herrman,等.(1993)supra)。機(jī)械方法包括將金屬或聚合物支架在動脈中展開以抑制彈性反沖，所述彈性反沖通常存在于血管成形術(shù)過程后數(shù)小時(shí)內(nèi)，且導(dǎo)致動脈腔再狹窄(Herrman，等(1993)supra;DeScheerder,等(1995)Atherosclerosis114:105-114;DeFoley,等(1993)Am.HeartJ.125:686-694;Kuntz，等(1993)J.Am.Coll.Cardiol.21:15-25;Lambert,等，(1994)CirculatioN90:1003-1011;MitchelandMcKay(1995)CathetCardiovasc.DiagN.34:149-154;Buchwald，等(1993)丄Am.Coll.Cardiol.21:249-254)。其它的方法包括經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)、用激光、熱能、P和Y放射線對介入過程后動脈損害的局部治療(Buchwald，等(1992)Am.HeartJ.123:878-885;Kouek,等(1992)Circulatio廳:1249-1256;Israel,等(1991)J.Am.Coll.Cardiol.18:1118-1119),已經(jīng)討論了向動脈損害部位給藥治療劑優(yōu)于全身性給藥(Labhasetwar，等(1997)Adv.DrugDel.Rev,24:63-85)。已使用在再狹窄動物模型中的試驗(yàn)性研究來研究用于預(yù)防再狹窄的治療劑的局部遞送(Lambert,等(1994)supra,Garcia,等(1990)Surg.Gynecol.Obstet171:201-205;Edelman，等(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA87:3773-3777;Edelman，等(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:1513-1517;EdelmaNandKarnovsky(1994)CirculatioN89:770-776;Nathan,等(1995)Proc.NatAcad.Sci.USA92:8130-8134;Okada，等(1989)Neurosurgery25:892-898;Villa,等(1994)J.CliN.Invest.93:1243-1249;Villa,等(1995)Circ.Res.76:505-513)。已經(jīng)討論了向外膜植入藥物(Edelman,等(1990)supra;Villa,等(1994)supra;Simons,等(1992)Nature359:67-70;Simons,等(1994)J.CliN.Invest.93:2351-2356),stents(Lincoff，等(1994)J.Am.Coll.Cardiol.23:18A;Jeong，等(1994)CirculatioN92:137)和基于導(dǎo)管的遞送系統(tǒng)(Steg,等.(1994)CirculatioN90:1648-1656;Fernandez,等(1994)CirculatioN89:1518-1522)。進(jìn)一步，Lanza，等((2002)CirculatioN106:2842)教導(dǎo)了包含紫杉醇的靶向順磁性納米顆粒可用于預(yù)防血管成形術(shù)后的再狹窄。序列號為09/847,945的美國專利申請教導(dǎo)了通過遞送至少一種納米顆粒形式和分散在生物相容性蛋白質(zhì)中的藥物來治療受試者中增生的方法。該參考文獻(xiàn)公開了使用作為適宜的候選藥物的紫杉醇、雷帕霉素、類固醇等來抑制細(xì)胞增殖和遷移。該參考文獻(xiàn)沒有教導(dǎo)嵌段共聚物納米顆粒。美國專利No.6,322,817教導(dǎo)了異種紫杉醇的藥物制劑，其中紫杉醇包嚢在納米顆粒中，所述納米顆粒包括至少一種類型的通過加入交聯(lián)劑的水溶液聚合的兩親性單體。該參考文獻(xiàn)公開了一種在治療細(xì)胞過度增殖引起的病理學(xué)病癥比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或癌癥中有用的兩親性單體和單酯的優(yōu)選組合，所述兩親性單體包括乙烯基吡咯烷酮、N-異丙基丙烯酰胺，所述單酯為聚乙二醇馬來酸酐與雙功能乙烯基衍生物比如N,N'-亞曱基雙丙烯酰胺交聯(lián)的單酯。美國專利No.6,759431公開了一種通過向身體通路的外部部分遞送治療劑來治療或預(yù)防與身體通路相關(guān)疾病的方法，所述治療劑比如包嚢在聚合物載體中的紫杉醇或其類似物或其衍生物。靜脈內(nèi)或口月艮遞送用于預(yù)防疾病或病癥的藥劑通常無效，因?yàn)檫@些途徑的遞送不能長時(shí)期地向靶向部位提供治療劑量的藥劑。因此，本領(lǐng)域存在位點(diǎn)特異性治療劑的需要，其能夠預(yù)防所選疾病或病癥的局部病理生理學(xué)過程。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這一長期需要。發(fā)明概述本發(fā)明為一種緩釋納米顆粒組合物，其由N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和聚乙二醇共軛物的共聚物組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和聚乙二醇共軛物的比例為70-90:9-20:1-10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述N-烷基丙烯酰胺包括N-曱基-N-n-丙基丙烯酰胺、N-曱基-N-異丙基丙烯酰胺、N-丙基曱基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N-異丙基曱基丙烯酰胺、N-環(huán)丙基丙烯酰胺、N-乙基曱基丙烯酰胺、N-曱基-N-乙基丙烯酰胺、N-環(huán)丙基甲基丙烯酰胺或N-乙基丙烯酰胺。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述乙烯單體包括乙烯醇、乙烯醚、乙烯酯、乙烯基卣化物、醋酸乙烯酯或乙烯基吡咯烷酮。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述聚乙二醇共軛物包括PEG基化的馬來酸、PEG基化的乙烯砜(vinylsulfone)、PEG基化的碘乙酰胺或PEG基化的二硫化鄰吡啶(orthopyridyldisulfide)。在特別的實(shí)施方案中，所述緩釋納米顆粒組合物進(jìn)一步包含一種治療劑，比如抗生素、抗再狹窄劑、抗增殖劑、抗腫瘤劑、化療劑、心血管劑、抗炎劑、免疫抑制劑或抗組織5損傷劑。這些納米顆粒組合物通常具有的直徑為20nm至100nm,且局部使用用于預(yù)防或治療疾病或病癥。本發(fā)明也為一種使用緩釋納米顆粒組合物來預(yù)防或治療疾病或病癥的方法。所述方法包括向患有疾病或病癥或有患有疾病或病癥危險(xiǎn)的患者局部給藥有效量的緩釋納米顆粒組合物，從而預(yù)防或治療所述患者中的疾病或病癥。在特別的實(shí)施方案中，所述患者具有再狹窄的危險(xiǎn)，即所述患者已經(jīng)經(jīng)受了血管成形術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)或支架。發(fā)明詳述現(xiàn)在已經(jīng)理解局部給藥包嚢在納米顆粒中的由N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和聚乙二醇(PEG)共軛物組成的治療劑可有效地遞送高濃度治療劑。特別地，使用較高摩爾比率N-烷基丙烯酰胺組分的納米顆?？筛纳浦委焺┻M(jìn)入納米顆粒的負(fù)載效率。包嚢在本文中公開的納米顆粒中的治療劑可緩慢地釋放，如納米顆粒分裂，從而提供緩的釋藥物釋放特征。本發(fā)明的納米顆粒起用于管腔內(nèi)遞送藥物的有效藥物載體的作用，因?yàn)榕c較大的藥物載體系統(tǒng)比如微粒或脂質(zhì)體相比，其納米粒徑范圍可產(chǎn)生較好的藥物攝取和對動脈壁的穿透。為了說明，制備特定的治療劑-納米顆粒組合物來證實(shí)其在再狹窄的大鼠頸動脈模型中的緩釋、生物相容性、動脈定位、抑制細(xì)胞增殖的和預(yù)防增生。說明性的組合物由雷帕霉素和聚合物納米顆粒組成，雷帕霉素為已知用于抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖和遷移的有效的大環(huán)內(nèi)脂類抗菌素，聚合物納米顆粒為使用N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)、乙烯基吡咯烷酮(VP)和PEG基化的馬來酸(PEGMA)(80:15:5)的共聚物合成，所述納米顆粒與N,N'-亞曱基雙丙晞酰胺(MBA)交聯(lián)。當(dāng)與不含PEG的納米顆粒相比時(shí)，發(fā)現(xiàn)向納米顆粒組合物中加入PEG可向納米顆粒提供更大的穩(wěn)定性、減少了聚集和增加了藥物負(fù)載。以重量/重量計(jì)，不含PEG共軛物的納米顆粒(即，包含NIPAM:VP,80:20)包括2.5%的雷帕霉素。相反，預(yù)形成的包含PEG共軛物(即，NIPAM:VP:PEGMA,80:15:5)的納米顆粒包含至多4.5%的雷帕霉素。在體外情況下，負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒顯示出緩釋釋放負(fù)載藥物。釋放速率在初期高，隨時(shí)間呈指數(shù)降低(表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>為了證實(shí)生物相容性，將血管平滑肌細(xì)胞暴露在各種濃度不含雷帕霉素的納米顆粒中(0、10、50、100和1000嗎/ml)48小時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)的MTS試驗(yàn)測定細(xì)胞生存力。所述納米顆粒以至多1000嗎/ml的劑量沒有顯示出對體外血管平滑肌細(xì)胞有毒性效應(yīng)。為了證實(shí)負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒對血管平滑肌細(xì)胞的抗增殖效果，用在溶液中(即，溶于曱醇中，且用細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)稀釋)或裝載在納米顆粒中的多種濃度(1、10、100、1000ng/mL)的雷帕霉素培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞。使用MTS試驗(yàn)測定增殖。盡管在溶液中的雷帕霉素和負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒顯示出對血管平滑肌細(xì)胞增殖的類似劑量相關(guān)性抑制，用負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒的抑制在較晚時(shí)間點(diǎn)明顯地更大。例如，在第5天，在溶液中和在納米顆粒中的雷帕霉素(1ng/mL)顯示出類似的抑制；然而，在第8天，在納米顆粒中的雷帕霉素證實(shí)比在溶液中的抑制多20%(表2)。因此，負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒證實(shí)可緩釋抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過流式細(xì)胞儀分析血管平滑肌細(xì)胞中DNA來測定負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒對細(xì)胞周期的影響。流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)證實(shí)雷帕霉素的抗增殖效果主要應(yīng)歸于抑制了細(xì)胞周期在G!檢查點(diǎn)的進(jìn)程；對負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒，細(xì)胞在G。-G!期的百分比為74.6%,與之相比，未處理組中的為62.7%。類似地，在處理組中增殖的S期的細(xì)l包百分凄t比在對照組中的低(13.5%vs24.25%)。(表3)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒的功效為在再狹窄的大鼠頸動脈模型中i正實(shí)的。動》;K切片的形態(tài)測定分析證實(shí)，與對照納米顆粒相比，局部遞送負(fù)載雷帕霉素的納米顆?？娠@著地減少內(nèi)膜與介質(zhì)(I/M)的比例(I/M=1.60±0.03vs3.15±0.10;P<.006)(表4)。與對照組相比，腹膜內(nèi)給藥相同劑量的負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒證實(shí)對抑制再狹窄有邊緣效應(yīng)(I/M=2.8±0.11vs3.15±0.10;P<.006),表明抑制效應(yīng)主要應(yīng)歸于雷帕霉素的局部遞送。與其它對照相比，局部遞送負(fù)載膠束納米系統(tǒng)而抑制增生導(dǎo)致內(nèi)腔直徑增大(局部給藥負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒組，0.29±0.002mm2;腹膜內(nèi)給藥負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒組，0.14±0.009mm2;局部給藥無藥物空白納米顆粒組，0.17±0.003mm2;P<.006)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>使用抗a肌動蛋白的抗SM抗體(a-SMA)的免疫組織化學(xué)染色顯示出在對照組動脈的新內(nèi)膜和外膜中的SMA陽性細(xì)胞的表達(dá)比在雷帕霉素處理組中的多。使用抗PCNA抗體的免疫組織化學(xué)染色顯示出在對照組新內(nèi)膜和外膜中的PCNA陽性細(xì)胞的數(shù)量比在處理組中的顯著地更多。這些結(jié)果表明雷帕霉素的遞送抑制了VSMCs的增殖。在處理組中的動脈切片證實(shí)與對照相比，受損傷的動脈的再次內(nèi)皮化(reendothelization)明顯地更大(82%vs28%)。進(jìn)一步地，使用負(fù)載6-香豆素?zé)晒馊玖系募{米顆粒和負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒進(jìn)行納米顆粒定位研究。在兩個(gè)頸動脈中，僅僅一個(gè)動脈受損傷和輸注納米顆粒。發(fā)現(xiàn)負(fù)載雷帕霉素和負(fù)載染料的納米顆粒定位于輸注納米顆粒的動脈的動脈壁，而不是對側(cè)動脈。動脈切片的共聚焦顯微鏡分析證實(shí)在第1小時(shí)納米顆粒定位于所有的層(內(nèi)膜、介質(zhì)和外膜)；然而，在第24小時(shí)，所有的熒光活性降低，但是在動脈壁的中層比在內(nèi)膜層降低的更多。當(dāng)定量時(shí)，在給藥后l小時(shí)，每毫克的動脈存在1.5±0.06貼的雷帕霉素(表5)。在非損傷的對側(cè)頸動脈中沒有檢測到雷帕霉素。因此，基于存在于動脈的10-15mm段(3.2至4mg的組織)中雷帕霉素的含量和給藥藥物量，當(dāng)局部經(jīng)由納米顆粒遞送時(shí)，在把向動脈中攝取的雷帕霉素的效率為9.1%。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注意到包嚢在納米顆粒中的治療劑用于局部遞送和預(yù)防疾病比如再狹窄的用途，所述納米顆粒由N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和PEG共軛物組成，本發(fā)明為一種緩釋(即，超過2至3周)納米顆粒組合物和使用其預(yù)防或治療疾病或病癥的方法?？紤]到改善負(fù)載效率與納米顆粒中較高摩爾比率的N-烷基丙烯酰胺組分相關(guān)，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括摩爾比率分別為70-90:9-20:1-10的N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和聚乙二醇共軛物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和聚乙二醇共軛物的摩爾比率分別為75-85:12-18:2-8。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和聚乙二醇共軛物的摩爾比率理想地分別為80:15:5。如本文使用的N-烷基丙烯酰胺為具有C3至C6烷基的疏水性單體。例如，N-烷基丙烯酰胺可以是N-曱基-N-N-丙基丙烯酰胺、N-甲基-N-異丙基丙烯酰胺、N-丙基曱基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N-異丙基曱基丙烯酰胺、N-環(huán)丙基丙烯酰胺、N-乙基曱基丙烯酰胺、N-曱基-N-乙基丙烯酰胺、N-環(huán)丙基曱基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺等。在本發(fā)明的上下文中使用的乙烯單體為具有相對高分子量(例如，約100,000至2,000,000,更典型地為約500,000至1,500,000)的親水性單體。適宜的乙烯單體包括，但不限于乙烯醇、乙烯醚、乙烯酯、乙烯基卣化物、醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮或其共聚物。聚乙二醇共軛物和其制備方法是本領(lǐng)域已知的(Roberts,等(2002)Adv.DrugDeliv.Rev.54:459-476)，其指任意適宜的共扼物都可用于本發(fā)明的納米顆粒。通常，PEG共軛物的PEG部分為具有分子量為2,000至50,000的直鏈化合物。其指可使用任意適宜的PEG部分；然而，PEG部分的分子量直接影響得到的納米顆粒的粒徑(即，分子量越高，納米顆粒的直徑越大)。例如，發(fā)現(xiàn)與不含PEG共輒物的NIPAM/VP納米顆粒的直徑相比，將包含具有分子量為5000的PEG部分的PEG共軛物加入到由NIPAM和VP組成的納米顆粒中會使得到的納米顆粒的直徑增大5-10nm。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG共軛物的PEG部分具有的分子量為3,000至10,000。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG共扼物的PEG部分具有的分子量為4,000至7,000。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，PEG共軛物的PEG部分具有的分子量為5,000。特別適宜的PEG共輒物包4舌，例如PEG基化的馬來酸、乙烯砜(vinylsulfone)、硤乙酰胺或二硫化鄰吡咬。當(dāng)使用選擇的交聯(lián)劑不重要時(shí)，在制備本發(fā)明的納米顆粒中使用的適宜的交聯(lián)劑包括，但不限于N,N'-亞曱基雙-丙烯酰胺或N,N'-胱胺雙丙烯酰胺。本發(fā)明的可生物降解的納米顆粒可以通過如下方法制備在存在交聯(lián)劑下混合在本文指出的單體，且通過利用引發(fā)劑(例如過硫酸銨、苯ii200580048320.3曱?；^氧化物(benzoylperozide)或AIBN(2,2'-偶氮二異丁腈))的自由基聚合來聚合所述混合物。得到的聚合鏈的疏水性部分保留埋入納米顆粒內(nèi)部，其有助于溶化藥物，而親水性部分延伸到納米顆粒的表面外。這些可生物降解的納米顆4立具有的平均直徑為20nm至100nm,其特別適于局部遞送治療劑。如本文使用的治療劑指可以緩解、治愈、治療或預(yù)防疾病或病癥的藥劑。特別想要的是治療劑能夠發(fā)揮其局部效應(yīng)(即，在疾病或病癥部位或其附近)。示例性的治療劑包括，但不限于抗生素、抗再狹窄劑(antirestenotics)、抗增殖劑、抗腫瘤劑、化療劑、心血管劑、消炎藥、免疫抑制劑、抗細(xì)胞凋亡和抗組織損傷劑。在本發(fā)明的上下文中，抗生素是指包括抗菌劑、抗微生劑、抗病毒劑、抗原生動物劑和抗真菌劑。這些藥劑的代表性實(shí)例包括抗生素比如氨基糖苷類(例如鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素)；第一代、第二代和第三代頭孢菌素類(例如頭孢菌素、頭孢克洛、頭孢噻肟、拉氧頭孢、其它半合成的頭孢菌素類比如頭孢克肟)；青霉素類(例如，青霉素G、氨卡西林、阿莫西林)；喹諾酮(例如環(huán)丙沙星、萘咬酸、氧氟沙星、托氟沙星、洛美沙星)；磺酰胺(例如磺胺曱遂二唑、sufisoxazole、柳氮磺吡啶、甲氧千氨嘧啶)；四環(huán)素類(例如多西環(huán)素、美他環(huán)素)；大環(huán)內(nèi)酯類(例如紅霉素)；單環(huán)P-內(nèi)酰胺類(例如氨曲南、氯碳頭孢)；及其它藥劑比如新生霉素、利福平、博來霉素、氯霉素、克林霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、兩性霉素B、多粘菌素E、制霉菌素、多粘菌素B、環(huán)絲氨酸、烏洛托品、甲硝唑、利福布丁、大觀霉素、曱氧千咬、桿菌肽、萬古霉素、其它的(3內(nèi)酰胺抗生素。抗真菌劑包括氟胞嘧啶、氟康唑、灰黃霉素、酮康哇和咪康唑?？共《緞┖涂笰IDS劑包括阿昔洛韋、金剛烷胺、去羥肌苷(以前稱為ddl)、灰黃霉素、氟胞嘧啶、膦曱酸鈉(foscamet)、更昔洛韋、碘苷、咪康唑、克霉唑、乙胺嘧啶、利巴韋林、金剛烷乙胺、司他夫定(以前稱為d4T)、曲氟尿苷、三磺嘧啶、伐昔洛韋、阿糖腺苷、扎西他濱(以前稱為ddC)和齊多夫定(以前稱為AZT)?？乖x藥的代表性的實(shí)例包括噴他脒羥乙基磺酸鹽、奎寧、氯奎和甲氟喹。再狹窄治療劑的代表性的實(shí)例包括，例如抗血管生成劑，比如抗侵入性因子(Eisentem,等(1975)Am.J.Pathol.81:337-346;Langer，12等(1976)Science193:70-72;Horton,等(1978)Science199:1342-1345)、視黃酸及其改變了細(xì)胞外基質(zhì)組分的代謝而抑制血管生成的衍生物、金屬蛋白酶-1的組織抑制劑、金屬蛋白酶-2的組織抑制劑、纖溶酶原活化因子抑制劑-1、纖溶酶原活化因子抑制劑-2和anginex(Griffioen,等(2001)Biochem.J.354(Pt2):233-42);編碼c畫myc或c隱myb的核酸序列；生長因子抑制劑比如曲尼司特、曲匹地爾或血管肽素；抗氧劑比如普羅布考，抗血栓形成劑比如肝素或阿昔單抗，抗增殖劑比如AG-1295(Fishbein，等.(2000)Arterioscler.Thromb.Vase.BioL20:667),酪氨酸磷酸化抑制劑(Banai，等(2005)Biomaterials26(4):451-61),紫杉醇或其它的紫杉烷類(Scheller，等(2004)CirculatioN110(7):810-4)，異黃酮(Kanellakis，等(2004)Atherosclerosis176(1):63-72)，雷帕霉素或其書f生物或其類似物(Schachner，等(2004)AnN.Thome.Surg.77(5):1580-5),長春新堿、長春花堿、HMG-CoA還原酶抑制劑、阿霉素、秋水仙堿、放線菌素D、絲裂霉素C、環(huán)胞菌素或麥考酚酸；消炎劑比如地塞米松(Liu,等(2004)ExpertRev.Cardiovasc.Ther.2(5):653-60)、曱潑尼龍或Y干擾素；及顯示出抗再狹窄(antirestenotic)活性的其它物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明可使用的其它治療劑包括能預(yù)防或治療腫瘤的抗增殖劑型、抗肺瘤劑或化療劑。這些藥劑的代表性的實(shí)例包括雄激素抑制劑；抗雌激素藥和激素(例如氟他胺、醋酸亮丙瑞林、他莫昔芬、雌二醇、雌氮芥、曱地孕酮、己烯雌酚、睪內(nèi)酯、戈舍瑞林、曱羥基孕酮)；細(xì)胞毒素劑(例如六甲蜜胺、博來霉素、白消安、卡鉑、卡氮芥(BiCNU)、順鉑、克拉屈濱、氮烯唑胺、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、雌氮芥、依托泊苦、環(huán)己亞硝脲、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、羥基脲、伊達(dá)比星、干擾素oc-2a和-2b、異環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、絲裂霉素、紫杉醇、鏈脲霉素、替尼泊苷、塞替派、長春花堿、長春新堿、長春瑞濱)；抗代謝物和抗有絲分裂劑(例如氟尿嘧淀脫氧核苷、5-氟尿嘧口定、fluambine、干擾素a-2a和-2b、亞葉酸、琉基噤呤、曱氨蝶呤、米托坦、普卡霉素、硫鳥噤呤、秋水仙堿)；葉酸鹽拮抗劑及其它抗代謝物；長春花生物堿；亞硝基脲；DNA烷基化劑；噤呤拮抗劑及其類似物；嘧啶拮抗劑及其類似物；烷基磺酸鹽；酶(例如門冬酰胺酶、培門冬酶)；及毒素(例如蓖麻毒、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂菌毒素、白樹毒素、美洲商陸抗病毒蛋白、麥芽凝集素、志賀氏桿菌毒素和假單胞菌屬外毒素A)。在本發(fā)明內(nèi)可使用的其它治療劑包括心血管劑比如抗高血壓劑；腎上腺素阻滯劑和刺激劑(例如多沙唑嗪、胍那決爾、胍乙啶、盼芐明、特拉唑。秦、可樂寧、胍那千)；a/p腎上腺素阻滯劑(例如柳胺芐心定)；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑(例如貝那普利、巰甲丙脯氨酸、賴諾普利、雷米普利)；ACE受體拮抗劑(例如氯沙坦)；(3阻滯劑(例如醋丁洛爾、阿替洛爾、卡替洛爾、吲哚洛爾、心得安、噴布洛爾(penbatolol)、萘羥心安)；釣離子通道阻滯劑(例如阿米洛利、千普地爾、硝苯吡啶、維拉帕米、尼莫地平)；抗心律不齊劑(antiarrythmics)，組I-IV(例如溴千胺、利多卡因、美西律、奎尼丁、心得安、維拉帕米、地爾硫卓、三氯甲噻溱、美托洛爾酒石酸鹽、卡替洛爾鹽酸化物)；及其它抗心律不齊劑和強(qiáng)心劑(例如腺苷、地高辛、咖啡因、多巴胺鹽酸化物、洋地黃)。根據(jù)本發(fā)明可使用的其它治療劑包括抗炎劑。這些藥劑的代表性的實(shí)例包括非甾體劑(NSAIDS)比如水楊酸鹽、雙氯芬酸、二氟尼柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、曱滅酸、萘丁美酮、萘普生、吡羅昔康、酮洛芬、酮咯酸、舒林酸、甲苯酰吡啶乙酸。其它抗炎藥物包括甾體藥劑比如倍氯米松、倍他米松、可的松、地塞米松、氟輕松、氟尼縮松、氫化可的松(hydorcortisone)、潑尼松龍和潑尼+>。也包括免疫抑制劑(例如adenocorticosteroids、環(huán)孑包菌素)。其它治療劑包括抗組織損傷劑。這些藥劑的代表性的實(shí)例包括過氧化物歧化酶；免疫調(diào)節(jié)劑(例如淋巴因子、單核因子、干擾素oc和p);及生長調(diào)節(jié)劑(例如IL-2、胂瘤壞死因子、上皮生長因子人蛋氨生長素、粘連蛋白、GM-CSF、CSF、血小板衍生生長因子、生長激素、rG-CSF、表皮生長因子、IGF-I)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述治療劑為抗再狹窄劑比如雷帕霉素(即西羅莫司)或其衍生物或類似物，比如依維莫司或他克莫司(Grube，等(2004)Circulation109(18):2168-71;GrubeandBuellesfeld(2004)Herz29(2):162-6)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑為抗細(xì)胞凋亡劑比如半乳凝素-3;(-)塞利吉林；單胺氧化酶抑制劑(MAO-I)比如司來吉蘭和雷沙吉蘭；雷帕霉素；或querceten。通常，所述治療劑可以在制備納米顆粒的同時(shí)或在制備納米顆粒之后加入。理想地，將所述治療劑裝入預(yù)形成的納米顆粒，其含有向納米顆粒中裝入的至少3%w/w的藥劑。通常，理想地為獲得向納米顆粒中裝入至多10。/。w/w的治療劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及利用在本文中/>開的納米顆粒預(yù)防或治療疾病或病癥的方法。所述方法包纟舌向患有疾病或病癥或有患有疾病或病癥危險(xiǎn)的患者局部給藥有效量的組合物，從而預(yù)防或治療所述患者中的疾病或病癥，所述組合物包含包嚢在由N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和PEG共輒物組成的納米顆粒中的治療劑?；加屑膊』虿“Y的患者通常顯示出一種或多種與所述疾病或病癥相關(guān)的病征。有患有疾病或病癥的危險(xiǎn)的患者指包括具有所述疾病或病癥家族史的患者或由于其它環(huán)境可傾向于發(fā)展為所述疾病或病癥的患者。例如，有發(fā)展為再狹窄危險(xiǎn)的患者將包括具有經(jīng)歷用于減輕動脈阻塞的介入(例如血管成形術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)或支架)的患者和可能發(fā)展為狹窄危險(xiǎn)的患者。當(dāng)局部遞送(例如，在損傷部位或在腫瘤部位)時(shí)，本發(fā)明的組合物可以遞送緩釋治療劑來預(yù)防或治療選擇性疾病或病癥。通常，有效量被認(rèn)為是與其中不存在藥劑的另一種相同的情況相比，能引起與選擇性疾病或病癥相關(guān)的一種或多種病征或癥狀產(chǎn)生可測變化的量。例如，有效量的抗增殖劑將引起與未暴露于抗增殖劑的細(xì)胞相比增生或細(xì)胞增殖產(chǎn)生可測定的降低。進(jìn)一步地，抗生素的有效量將導(dǎo)致有活力的細(xì)菌、霉菌或原生動物細(xì)胞數(shù)量抑制或降低。本發(fā)明的納米顆粒組合物可單獨(dú)給藥或與可藥用或生理學(xué)可接受的載體、賦形劑或者稀釋劑給藥。通常，這些載體應(yīng)當(dāng)為在使用的劑量和濃度對容器無毒。通常，這些組合物的制備需要混合本發(fā)明的納米顆粒組合物與緩沖劑、抗氧劑比如抗壞血酸、低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類包括葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合劑比如EDTA、谷胱甘肽及其它穩(wěn)定劑和賦形劑。如在本文中證實(shí)的，局部藥物遞送有助于以較低劑量延長保留高局部濃度的治療劑，且具有降低的全身毒性。而且，也可以局部遞送具有相對短半衰期的治療劑比如重組體蛋白質(zhì)和肽及其它生物學(xué)非穩(wěn)定的生物分子比如核酸和寡核苷酸，其在靶細(xì)胞或組織攝取之前具有最小的15嚢和遞送高疏水性的治療劑。而且，局部藥物遞送減少了患者與患者的藥物藥代動力學(xué)變異性，其通常與靜脈內(nèi)或口服途徑給藥藥物有關(guān)?？梢灾苿┰诒疚闹刑峁┑募{米顆粒組合物以用于多種不同途徑局部給藥，包括例如在直視(例如在外科手術(shù)或經(jīng)由內(nèi)窺鏡的過程)下直接給藥至所述疾病或病癥部位(例如損傷或腫瘤部位)或經(jīng)由經(jīng)皮藥物遞送至所述疾病或病癥部位的外部(外膜)表面(例如血管周圍的遞送)。作為一種可替換方式，也可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)由導(dǎo)管或套管針遞送小球。血管周圍的藥物遞送包括經(jīng)由超聲、計(jì)算斷層分析、熒光鏡、電子發(fā)射斷層掃描、磁共振成象或內(nèi)窺鏡的指導(dǎo)利用針或?qū)Ч芙?jīng)皮給藥納米顆粒組合物至所述疾病或病癥的部位。另外，所述方法可以在直^f見下或用另外的成像指導(dǎo)于手術(shù)中進(jìn)行。在再狹窄或其它心血管疾病的情況下，這些方法也可以在與血管內(nèi)方法比如血管成形術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊》走切術(shù)或支架一起進(jìn)行或與可操作的動脈方法比如動脈內(nèi)膜切除術(shù)、血管或移植物修復(fù)或移植插入物一起進(jìn)行。例如，在患有股淺動脈變窄的患者中，氣嚢血管成形術(shù)將以常規(guī)方式(即，經(jīng)由導(dǎo)線使氣嚢血管成形術(shù)導(dǎo)管流如動脈，且使球形物充氣穿過損害部位)進(jìn)行。在血管成形術(shù)之前、之時(shí)或之后，在超聲、熒光鏡或CT指導(dǎo)下將針插入穿過皮膚，且將治療劑(例如包嚢進(jìn)入緩釋納米顆粒的雷帕霉素)以圓周方式通過針或?qū)Ч軡B透到動脈狹窄的區(qū)域。這可以在任意動脈、靜脈或移才直物周圍進(jìn)行，但用于該介入的典型地病癥為頸動》:K、冠狀動脈、骼動樂^、大腿總動脈、淺表大腿動脈和胭動脈的和在移才直物-接合部位的疾病。合理的靜脈部位包括其中嵌入留置導(dǎo)管的浸透周圍的靜脈。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定用于預(yù)防或治療選擇性疾病或病癥的適宜治療劑，并最佳化有效劑量和共同給藥方案，如通過個(gè)體患者的良好醫(yī)療實(shí)踐和臨床病癥來測定。與^^藥方式無關(guān)，應(yīng)當(dāng)理解在特定情況下活性劑的實(shí)際優(yōu)選量將可以根據(jù)給藥的特定制劑和方法改變。特定患者的特定劑量取決于年齡、體重、一般的健康狀況、飲食、給藥時(shí)間和途徑、在組合中使用的藥物和應(yīng)用治療劑的特定病癥的嚴(yán)重性。給予受試者的劑量可利用常規(guī)需要考慮的事項(xiàng)來確定，例如，通過常規(guī)比較選擇藥劑和已知藥劑的活性差異，比如利用適宜的常規(guī)藥理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。本發(fā)明將通過下述非限定性實(shí)例進(jìn)行更詳細(xì)地描述。實(shí)施例1:負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒的制備N畫異丙基丙烯酰胺(NIPAM)為購自SigmaChemicalCo(St.Louis,MO),且在聚合前從正己烷中重結(jié)晶純化。N-乙烯基吡咯烷酮(VP)為得自FlukaChemieAG和RdH(LaborchemikalieNGmbH&Co.KG)，且在使用前蒸餾。N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)、硫酸亞鐵銨(FAS)、過硫酸銨(APS)、TWEEN-80和雷帕霉素為購自Sigma(St.Louis,MO)。在制備緩沖劑中使用的鹽來自FisherScientific(Pittsburgh,PA)。所有的7K溶'液為用蒸4留7jc和去離子7jc(Waterproplus,Labconco,KansasCity,MO)制備。納米顆粒為通過任意的自由基聚合制備。總而言之，可以按多種摩爾比率使用水溶性的單體NIPAM、VP和PEG基化的馬來酸酯，然后用MBA交聯(lián)。使用FAS激活聚合反應(yīng)。在一個(gè)典型的最佳試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，將19)iiL新蒸餾的VP、80mgNIPAM和10mgPEG基化的馬來酸酯溶于10ml水中。向該水溶液中加入28|xLMBA(49mg/mL),通入氮?dú)獯┻^該溶液30分鐘以除去溶解的氧。接著，加入50|iL10%FAS和50(nL飽和的APS溶液以啟動聚合反應(yīng)。在氮?dú)庀掠?0。C進(jìn)行聚合反應(yīng)24小時(shí)。利用SPECTROPORE⑧透析袋(分子量篩截12-kD,SPECTRUM,LagunaHills,CA)逆著水透析形成的納米顆粒24小時(shí)，換水兩次以除去未反應(yīng)的單體和電解質(zhì)。凍千(-80。C,〈10nm汞柱壓力，SENTRYTM，Virtis，Gardiner,NY)納米顆粒的水分散體48小時(shí)，獲得千粉末，隨后將其用于負(fù)載藥物。對于負(fù)載雷帕霉素，通過渦流2分鐘將20mg凍干的納米顆粒分散在2mL蒸餾水中。向該分散體中加入250|LiL雷帕霉素的曱醇溶液(4mg/ml),在磁攪拌平皿上恒定攪拌2小時(shí)。這使得雷帕霉素分配進(jìn)入納米顆粒的疏水性內(nèi)芯。通過利用SPECTROPORE⑧透析袋(分子量篩截粒徑12-kD)逆著1L的蒸餾水透析分散體過夜來分離游離的雷帕霉素。然后，如在本文中描述的凍干負(fù)載藥物的納米顆粒。對于定位動脈的納米顆粒，所述制劑包含熒光染料、P-香豆素。將代替藥物溶液的染料溶液(IOOiliL，0.5mg/mL)加入膠束分散體中。定位所述染料，從而對所述納米顆粒進(jìn)行共聚焦顯微鏡檢查。得到的納米顆粒以單體和聚合物的^光譜表示，記錄在VarmN500MHz分光光度計(jì)上。為了證實(shí)聚合是完全的，將納米顆粒溶于D20中。17利用準(zhǔn)彈性光散射設(shè)備(ZETAPLUSTM粒度分析器、BrookhaveNInstmmentCorp，Holtsville,NY)和ZETAPLUSTM粒徑軟件(版本2.07))通過光子相關(guān)光譜學(xué)測定負(fù)載藥物之前和之后納米顆粒的粒徑分布(平均直徑和多分散性指數(shù))。為了測定粒徑，制備納米顆粒在HEPES緩沖劑中的稀分散液(0.1mg/mL，0.001MpH7.0)。利用ZETAPLUSTM使用相同的樣品來測定顆粒的G電勢。也通過透射電子顯微術(shù)(TEM)測定納米顆粒的粒徑。將一滴負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒水溶液置于FORMVAR⑧涂層的銅載網(wǎng)上，接著作用2%(w/v)乙酸雙氧鈾溶液進(jìn)行負(fù)染色。利用Philips201TEM顯微鏡(Philips/FEIInc.,BriardiffManor,NY)5見察顆粒。共聚物的iHNMR光譜證實(shí)不存在單體的乙烯基端基質(zhì)子，表明聚合是完全的。納米顆粒的平均水動力學(xué)直徑為-70nm，具有窄的粒徑分布(多分散指數(shù)=0.11),且在pH7下G電勢(表面電荷)為-8.45mV。負(fù)載藥物后膠束納米系統(tǒng)的粒徑略微增加(平均直徑-70-76nm)。所述納米顆粒在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中形成膠態(tài)分散體。納米顆粒的TEM證實(shí)近似^求形的形狀，具有的平均直徑為61±7nm(平均值土SD;n=20)。用TEM得到的粒徑小于用激光散射測定的，因?yàn)楹笳邷y定了流體動力的直徑，其包括了在納米顆粒外層的PEG水合物。負(fù)載的藥物為4.2%w/w(即100mg的制劑包含4.2mg的雷帕霉素)；具有的包嚢效率為84%(即，84%加入的藥物被俘獲在納米顆粒中)。實(shí)施例2:納米顆粒的藥物釋放為了保持漏槽狀態(tài)，雷帕霉素從體外納米顆粒的釋放為在包含0.1%w/vTWEEN-80的PBS(154mM,pH7.4)中測定的。每個(gè)池的供應(yīng)室充滿2.5mL納米顆粒在緩沖劑中的分散液(2mg/mL),接收室充滿相同的緩沖劑。將具有0.1|Lim孔徑大小的MILLIPORE⑧膜(MilliporeMilliporeCo.，Bedford,MA)放置在兩個(gè)室之間。將所述池放在攪拌器上，保持在37°C，以100rpm旋轉(zhuǎn)(ENVIRON,LabLine,MelrosePark,IL)。在預(yù)定的時(shí)間間隔，完全除去來自接收器旁的溶液，用新的緩沖劑替換。在收集的樣品中雷帕霉素的濃度為通過HPLC(ShimadzuScientificInstrument,Inc.,Columbia,MD)測定。流動相由曱醇:水(9:1v/v)組成，以0.4mL/分鐘的流速遞送(泵ModelLC-IOAT)。用自動注射器(ModelSIL-10A)注射20的樣品，利用NOVA-PARKC-8柱(2x150mm,4,粒徑的填充物；Phenomenex,Torrance,CA)實(shí)現(xiàn)分離。通過UV4全測來定量4f品中雷帕霉素的水平(入=276nm,ModelSPD-10AVP,Shimadzu)。在相同的條件下制備雷帕霉素(0-50昭mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。在體外條件下雷帕霉素從在本文中公開的納米顆粒中的釋放特征證實(shí)在初期具有相對快速的藥物釋放速率(在24小時(shí)中釋放~20%)，之后較緩慢地釋放(在28天中釋放超過80%)。實(shí)施例3:負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒的抗增殖效果在37。C，在使?jié)駶?%C02大氣中，將人血管平滑肌細(xì)胞(CascadeBiologies，Portland,OR)置于補(bǔ)充有平滑肌生長添加劑(CascadeBiologies)的介質(zhì)231上。典型地使用傳代3至4次的細(xì)胞。為了監(jiān)測細(xì)胞增殖，將細(xì)胞接種在5,000細(xì)胞每孔密度的96孔平皿上，使其連接24小時(shí)。使用負(fù)載在納米顆?；蛟谌芤?將溶于甲醇中的雷帕霉素稀釋在介質(zhì)中)中不同劑量的雷帕霉素雷帕霉素(1ng/mL至1,000ng/mL)。保持甲醇介質(zhì)中的濃度為低于0.1%,以便其對細(xì)胞增殖沒有影響。用空的納米顆?；蚪橘|(zhì)處理的細(xì)胞起負(fù)載藥物的納米顆粒或在溶液中藥物的相應(yīng)對照。在第二天和在隔一天改變孔中的介質(zhì)，其后沒有進(jìn)一步加入藥物。利用MTS試驗(yàn)(CELLTITER96AQue0us，Promega，Madison,WI)監(jiān)測藥物的抗增殖活性八天的研究時(shí)間。將MTS試驗(yàn)試劑(20pL/孔)加入到每孔中，在細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱中于37°C培養(yǎng)所述平皿3小時(shí)。利用微板閱讀器(Bio-TekInstrument，Winooski，VT)測定在490nm的色彩強(qiáng)度。對于細(xì)胞周期分析，將細(xì)胞接種在T-75培養(yǎng)jf瓦中，細(xì)胞密度為lx106細(xì)胞/含有10mL生長培養(yǎng)基的燒瓶，使其連接過夜。用負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒在生長培養(yǎng)基中的分散體(雷帕霉素的劑量=50ng/mL)替換每個(gè)燒瓶的介質(zhì)。處理后兩天，用PBS洗滌細(xì)胞單細(xì)胞層，通過胰蛋白酶消化分離細(xì)胞。通過用碘化丙啶染色細(xì)胞進(jìn)行DNA分析，將焚光染料插入DNA堿基對之間。用70%乙醇固定細(xì)胞，培養(yǎng)1小時(shí)，將1mLTelford試劑力口入到細(xì)胞懸浮液中。通過在LysisII(BectoNDickinsoNImmunocytometrySystems，SaNJose，CA)下操作發(fā)熒光的活化的FACSTARPLUS(R)流式細(xì)胞儀來分析細(xì)胞的DNA成分。實(shí)施例4:在大鼠頸動脈中的氣球才羊損傷和局部遞送19用腹膜內(nèi)注射氯胺酮(麻醉藥)(80mg/kg)和曱苯噻嗪(10mg/kg)的混合物麻醉雄性Sprag-Dawley大鼠(240至260克；CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)。通過鈍器解剖法穿過中線頸切口暴露左側(cè)總頸動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。將2FFogarty氣嚢式導(dǎo)管(EdwardsLifeSciences,Irvine,CA)經(jīng)由動月永切開術(shù)引入左側(cè)頸外動脈，前進(jìn)到左側(cè)頸總動脈起始點(diǎn)。充氣所述氣球至足以產(chǎn)生輕微抗性，連續(xù)地撤回(withdrawn)三次至產(chǎn)生左側(cè)頸總動脈全部長度的內(nèi)皮剝蝕。一旦除去氣嚢式導(dǎo)管，將PE10導(dǎo)管插入左側(cè)頸總動脈。暫時(shí)結(jié)扎左側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸內(nèi)動樂;K的中部和遠(yuǎn)側(cè)部。在2個(gè)大氣壓下，經(jīng)5分鐘，將負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒的混懸液(200iuL納米顆粒，包含60pg雷帕霉素當(dāng)量)輸注到損傷的頸動脈(三分鐘，在輸注70pL的混懸液期間有一分鐘，輸注期間有一分鐘)。在輸注納米顆粒后，除去結(jié)扎，恢復(fù)血流。在另一組動物中，腹膜內(nèi)注射相同劑量的負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒納米顆粒以證實(shí)雷帕霉素對再狹窄的抑制效果效果應(yīng)歸于局部藥物遞送。實(shí)施例5:納米顆粒的動脈定位為了測定納米顆粒在動脈壁層(內(nèi)膜、中膜或外膜)的定位，特別地在輸注后時(shí)，如描述的在氣球樣損傷后灌注包含6-香豆素的納米顆粒的制劑。負(fù)載染料的納米顆粒的物理性質(zhì)(粒徑和G電勢)類似于負(fù)載藥物的納米顆^立。在輸注納米顆粒一'J、時(shí)和24小時(shí)后，移除動l^、漂洗并埋入O.C.T.化合物((Tissue-Tek,Sakura,Torrance,CA)，保存在-70°C陰暗處至組織學(xué)評價(jià)。利用轉(zhuǎn)動切片機(jī)(AO820，AmericaNOptical,DelMar,CA)切片冷凍塊，用共焦顯孩i4竟》見察。利用488-nm過濾器((Fluorescein)、568-nmfilter(Rhodamine)和利用裝有氬氣-氪激光器的Zeiss共焦顯孩i4竟LSM410(CarlZeissMicroimaging,Thornwood，NY)的鑒別干涉對比俘獲圖像。為了測定動脈吸收和藥物保留，在給藥負(fù)載雷帕霉素的納米顆粒后不同的時(shí)間點(diǎn)移除兩側(cè)的頸動脈，用生理鹽水洗滌動脈，并利用吸水紙吸千。稱重(濕重)每個(gè)動脈，用剪刀細(xì)細(xì)地切成小塊，在2mL蒸鎦中利用纟且織勻，艮器(BiospaceProductInc,Bartlesville,OK)以1,000rpm均質(zhì)化兩'分鐘，凍干勻漿48小時(shí)。通過在37°C,利用ENVIRON(R)定軌振蕩器以150rpm振搖包含lmL曱醇的每個(gè)樣品48小時(shí)來提取每個(gè)干組織中的藥物。為了除去細(xì)胞碎片，以14，000rpm離心樣品10分鐘(EPPENDORF(R)Microcentrifuge,5417R,BrinkmanNInstmments,^Vestbury,NY)。如本文描述的，通過HPLC分析上層清液確定雷帕霉素含量。利用從沒有接受雷帕霉素的動物中收集的動^K制備標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，以確定藥物回收率。實(shí)施例6:再狹窄的抑制三周后，用腹膜內(nèi)注射氯胺酮(80mg/kg)和曱苯噻嗪(5mg/kg)的混合物麻醉大鼠。在清潔血管內(nèi)系統(tǒng)后，通過經(jīng)5分鐘灌注10%曱醛溶液將壓力固定在120mmHg。收回左頸動脈，浸入相同的固定劑中直至切片。從近端至末端將動脈切成每3mm的片。將這些動脈片埋入用于切片的石蠟中，用蘇木精-伊紅染色雙份載玻片。用計(jì)算機(jī)化的數(shù)字圖像分析系統(tǒng)測定中層和內(nèi)膜區(qū)域及內(nèi)腔區(qū)域。對于免疫組織化學(xué)分析，用I-VIEW抑制劑培養(yǎng)樣品以阻止內(nèi)源性過氧化物酶活動過氧化物酶活動。在PBS中洗滌后，在室溫下用一級抗體培養(yǎng)切片一小時(shí)。使用下述一級抗體能識別oc-SM肌動蛋白的單克隆小鼠1A4抗體(neat，DAKO，Carpenter,CA)和用于鑒定PCNA的單克隆小鼠PCIO抗體(l:25稀釋，DAKO,Carpenter,CA)和用于內(nèi)皮染色的CD31抗體(1:100稀釋，DAKO,Carpenter,CA)、抗切割半胱天冬酶國3(1:200稀釋，CellSignalingTechnology,Beverly,MA)凋亡細(xì)月包，所述凋亡細(xì)l包為通過利用TUNEL系統(tǒng)試劑盒(Promega，Madison,WI)的末端轉(zhuǎn)脫氧核苦酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)法獲得。接著，用I-VIEW生物素和I-VIEW抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶培養(yǎng)切片。利用DAB色原體顯影切片，利用利用I-VIEW銅復(fù)染色。以放大400X計(jì)算PCNA和a-SM肌動蛋白染色的陽性細(xì)胞數(shù)。如用CD31陽性細(xì)胞細(xì)胞覆蓋的內(nèi)腔表面和總內(nèi)腔表面之間的比例計(jì)算內(nèi)皮4匕(Endothelization)。所有數(shù)據(jù)都以平均值±SEM表示。未處理組和處理組之間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過單向ANOVA確定。如果p<0.005，則認(rèn)為差異是顯著性的。權(quán)利要求1.一種緩釋納米顆粒組合物，其包括N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和聚乙二醇共軛物的共聚物。2.權(quán)利要求1的緩釋納米顆粒組合物，其進(jìn)一步包括治療劑。3.—種預(yù)防或治療疾病或病癥的方法，其包4舌向患有疾病或病癥或有患有疾病或病癥危險(xiǎn)的患者局部給藥有效量的權(quán)利要求2的組合物，從而預(yù)防或治療所述患者中的疾病或病癥。全文摘要本發(fā)明為一種組合物和使用其治療或預(yù)防疾病或病癥的方法，所述組合物包括包囊在N-烷基丙烯酰胺、乙烯單體和聚乙二醇(PEG)共軛物的共聚物中的治療劑。文檔編號A61K9/26GK101442991SQ200580048320公開日2009年5月27日申請日期2005年12月12日優(yōu)先權(quán)日2004年12月21日發(fā)明者M(jìn)·K·雷迪,S·K·薩霍,V·D·拉布哈賽特瓦申請人:內(nèi)布拉斯加大學(xué)評議會